MX2010012214A - Agente para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad autoinmune y para la formacion de celulas t reguladoras. - Google Patents
Agente para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad autoinmune y para la formacion de celulas t reguladoras.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un agente para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune, un agente para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo, así como diversos métodos, en los que se usan los agentes según la invención.
Description
AGENTE PARA EL TRATAMIENTO Y/O LA PREVENCIÓN DE UNA ENFERMEDAD AUTOIN- MUNE Y PARA LA FORMACIÓN DE CÉLULAS T REGULADORAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un agente para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune, un agente para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo y varios métodos en los cuales se utilizan los agentes de acuerdo con la invención.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las enfermedades autoinmunes se caracterizan por una reacción excesiva del sistema inmunológico contra el tejido propio del cuerpo. El sistema inmunológico reconoce en forma errónea al tejido propio como cuerpo extraño al que debe atacar. De este modo, se producen fuertes reacciones inflamatorias que producen daños a los órganos afectados por ellas.
Un rol importante para la diferenciación entre estructuras propias del cuerpo y extrañas al cuerpo es desempeñado por los linfocitos T y/o las células T, que son "instruidas" en el timo, para que se adhieran a moléculas de la superficie celular, las así llamadas moléculas del MHC y así toleren las estructuras propias del cuerpo. Estos procesos son denominados "deleción clonal" y "selección clonal". En la primera selección en el timo, sobreviven sólo aquellas células T que pueden reconocer a las moléculas del MHC en las membranas celulares propias del cuerpo, en donde la ligadura, sin embargo, no es tan fuerte como para que pueda llevar a la activación de las células T. Las células T que no pueden ligar o reconocer a las moléculas del MHC propias son eliminadas. En la deleción clonal que se produce también en el timo, se eliminan aquellas células T que reconocen y se pueden ligar fuertemente en forma "direccionada" a las moléculas del MHC de tal modo que se activarían, lo que en última instancia llevaría a la destrucción de las células propias del cuerpo. Este proceso es una de las medidas que toma el sistema inmunológico para cuidar lo "propio" y luchar contra lo "extraño".
En las enfermedades autoinmunes, un grupo de las células T se comporta en forma anormal. Aparte de la defensa que aún funciona contra las moléculas y los organismos extraños, ellas
atacan también a estructuras propias del cuerpo. Órganos o tejidos son considerados como extraños. Las consecuencias pueden ser diversas: si se afectan estructuras vitales, entonces una enfermedad autoinmune puede resultar mortal. El sistema inmunológico dirige su defensa contra estas estructuras, se ponen en funcionamiento reacciones de defensa celulares y también humorales, se forman autoanticuerpos, lo que tiene como consecuencia que el órgano afectado deja de funcionar con el transcurso del tiempo. En general, el sistema inmunológico se ve debilitado y el cuerpo es más propenso a padecer todo tipo de enfermedades. En algunos casos, también se ve trastornado el reconocimiento de los cuerpos extraños, no pudiendo limitarse ya en forma efectiva la diseminación de células cancerígenas degeneradas y los afectados son más propensos a padecer enfermedades infecciosas. En el transcurso de la enfermedad, las células de sistema inmunológico destruyen las estructuras propias del cuerpo, mientras que los mecanismos de reparación del cuerpo tratan en lo posible de renovar las partes dañadas de los órganos. Este ataque erróneo del sistema de defensa sigue produciéndose en general durante toda la vida o hasta la destrucción completa de la estructura objeto, si no se realiza un tratamiento.
Las causas exactas de las enfermedades autoinmunes aún no han sido aclaradas, a pesar de una investigación intensiva. Hipótesis reconocidas parten de la base de que las enfermedades autoinmunes son adquiridas por predisposición genética, por ejemplo, por la presencia de ciertos tipos de moléculas del MHC en combinación con influencias externas. Si existen en el cuerpo de la persona afectada tales factores condicionados genéticamente y se agregan además factores am-bientales perjudiciales tales como fuerte estrés, infecciones, embarazo, etc., pueden aparecer enfermedades autoinmunes.
El sistema inmunológico está compuesto por diversas células que pueden luchar contra agentes infecciosos que se han introducido en el cuerpo. El mecanismo de la respuesta inmunoló-gica comprende la activación de células especializadas y la adquisición de funciones efectoras, como la citotoxicidad de determinadas células T, las que expresan la así llamada glucoproteina transmembrana CD8 y, por eso, son denominadas células T CD8+.
Las células T reguladoras (TReg), denominadas antes también células T supresoras, son un subgrupo de células T especializadas. Tienen la función de inhibir la activación del sistema inmu-
nológico y, de este modo, regular la autotolerancia del sistema inmunológico. Evitan de este modo en el organismo sano la aparición de enfermedades autoinmunes. Se han descrito diversas poblaciones de TReg, incluyendo aquellas que expresan a las proteínas CD4, CD25 y Foxp3 y que, por eso, son denominadas células T CD4+CD25+Foxp3+. Además se han descrito TReg que expresan células T CD4 y Foxp3, pero no CD25, las así llamadas células T CD4+CD25"Foxp3+.
Lan et al. (2005), Regulatory T cells: development, function and role in autoimmunity, Au-toimmun. Rev. 4(6), p. 351 a 363, describen un modelo en el ratón, en el cual la depleción de células T CD4+CD25+ reguladoras lleva al desarrollo espontáneo de enfermedades autoinmunes.
Chatila T. A. (2005), Role of regulatory T cells in human diseases, 1 16(5), p. 949 a 959, describen que una deficiencia congénita de células T CD4+CD25+ reguladoras, por una mutación en el gen que codifica para la proteína Foxp3, ayuda al desarrollo de enfermedades autoinmunes.
Un panorama sobre las células T reguladoras se encuentra también en la revista "Nature Immunology", que se publicó en marzo de 2005.
Las enfermedades autoinmunes son tratadas según el órgano afectado. El principio básico de la terapia causal es aquí amortiguar la actividad del sistema inmunológico por medio de la administración de inmunosupresores, por ejemplo, cortisona. Estas sustancias se caracterizan por múltiples acciones colaterales e interacciones sistémicas, por lo que se intentó desarrollar nuevos medicamentos que influyan específicamente sobre los mecanismos que participan en la enfermedad. Ejemplos de ello son natalizumab e infliximab. El Natalizumab es un anticuerpo monoclonal y un inhibidor selectivo de lgG4, una molécula de adhesión, que se encuentra en la superficie de los glóbulos blancos. El Natalicumab inhibe la migración de glóbulos blancos en focos de infección y se usa para el tratamiento de formas especialmente agresivas de esclerosis múltiple que evoluciona con brotes. Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico contra el factor de necrosis tumo-ral a (TNFoc), el que tiene un papel clave en las reacciones inflamatorias autoinmunes. El infliximab se usa en artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad de. Bechterew y psoriasis.
En Ehrenstein et al. (2004), Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arth-ritis and reversal by anti-TNFa therapy, J. Exp. Med., Vol. 200, Nr. 3, pp. 277-285, se describe que infliximab como un anticuerpo monoclonal dirigido contra el TNFa puede mejorar la terapia de la ar-
tritis reumatoide.
Algo similar es propuesto por Nadkarni et al. (2007), Anti-TNF therapy induces a distinct regulatory T cell population in patients with rheumatoid arthritis via TGF-ß, JEM Vol. 204, pp. 33-39.
Bresson et al. (2006) proponen tratar la diabetes tipo I por la administración combinada de un anticuerpo específico anti-CD38 y un péptido proinsulina.
Vandenbark et al. (2008), Therapeutic vaccination with a trivalent T-cell receptor (TCR) peptide vaccine restores deficient FoxP3 expression and TCR recognition in subjects with múltiple sclerosis, Immunology Vol. 123, pp. 66-78, describen una mejora en el control de la respuesta au-torreactiva en la esclerosis múltiple después de la vacunación de los pacientes con determinados péptidos de TCR.
Si bien estas sustancias más nuevas actúan específicamente pueden producir severos efectos colaterales, por ejemplo, la aparición de una leucoencefalopatía multifocal progresiva. Por esta razón, se retiró de nuevo del mercado en los EE. UU. el Natalizumab tan sólo tres meses des-pues de su admisión. Los costos para estas nuevas sustancias activas son muy altos. 300 mg de natalizumab cuestan actualmente más de EUR 2.000,-. 200 mg de infliximab cuestan aprox. EUR 1.700,-.
Ante esta situación, un objeto de la presente invención es proveer un nuevo medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune, con el cual se puedan evitar en lo posible las desventajas del estado de la técnica. Especialmente debería proveerse un medicamento tal que se caracterice por la buena tolerancia y la baja toxicidad.
Otro objeto de la presente invención consiste en poner a disposición un agente para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo.
Estos problemas se solucionan por medio de la provisión de una muteína de interleuquina 2 humana (muteína de hlL-2) o una de sus partes, que está numerada respecto de hlL-2 de tipo salvaje y que presenta una sustitución de aminoácido en al menos una de las posiciones 20, 88 ó 126.
Los inventores hallaron sorprendentemente que tal muteína de hlL-2 o una de sus partes
presenta un elevado potencial terapéutico, que se puede utilizar para el tratamiento y la prevención de enfermedades autoinmunes. De esta manera, pudieron demostrar por ejemplo en distintos enfoques experimentales que la mutetna de hll_-2 en un organismo induce selectivamente la formación de células T reguladoras como CD4+CD25+Foxp3+ y CD4+CD25 oxp3+
De manera sorprendente, la muteína de hlL-2 según la invención muestra una actividad claramente superior sobre las células T reguladoras que la hlL-2 de tipo salvaje. Esto se muestra particularmente en altas concentraciones.
Con referencia a la muteína de hlL-2 según la invención, se divulga en el documento WO 99/60128 que se une de manera más fuerte al receptor de IL-2 tricatenario (IL-2RaPy) que al re-ceptor de IL-2 bicatenario (IL-2RPy). Tal como pudieron mostrar por primera vez los inventores, la muteína de hlL-2 según la invención induce respecto de hlL-2 de tipo salvaje sorprendentemente también de modo potenciado la formación de tales células T reguladoras, a las que les falta la sub-unidad a del receptor de IL-2 (CD25) (CD4+CD25 oxp3+). Esta subpoblación contribuye además a reprimir la activación del sistema inmune, regulando así la autotolerancia del sistema inmune. La muteína de hlL-2 según la invención presenta así una mayor potencia que el principio activo para el tratamiento de enfermedades autoinmunes que la hlL-2 de tipo salvaje.
Los inventores también estaban en condiciones de demostrar que una muteína de hlL-2 induce la formación de células T reguladoras CD8-positivas, como CD3+CD4~CD25+Foxp3+ y CD3+CD4"CD25"Foxp3+ (datos no mostrados), que desempeñan un papel decisivo en la supresión de enfermedades autoinmunes.
Más allá de ello, la muteína de hlL-2 según la invención presenta respecto de hlL-2 de tipo salvaje la ulterior ventaja de que activa selectivamente las células T respecto de las células killer naturales (células NK) y presenta así un perfil de toxicidad reducido y un mayor índice terapéutico. Como resultado, la muteína de hlL-2 según la invención es así esencialmente más tolerable que la hlL-2 de tipo salvaje; véase WO 99/60128.
Además, por medio de las células T CD3+CD8+CD45RO+ citotóxicas se pudo mostrar por primera vez que la muteína de hlL-2 según la invención en contraste con hlL-2 de tipo salvaje, inesperadamente no tiene, o sólo tiene un escaso efecto sobre la proliferación de células T citotóxi-
cas CD8-positivas, que también se describen como células T CD8 "naif, de memoria central, tempranamente diferenciadas" y "tardíamente diferenciadas". Esto es ventajoso porque las células T ci-totóxicas CD8+ se responsabilizan de procesos inflamatorios crónicos persistentes en las enfermedades autoinmunes; comp. Liu et al. (2007), Múltiple Sclerosis, 13, p. 149, y Haegeleet al. (2007), Neuroimmunol, 183, p. 168). La muteína de hlL-2 según la invención impide así respecto de la hlL-2 de tipo salvaje una posterior potenciación de esta reacción inflamatoria causada por las células T CD8+, lo cual representa otra ventaja de tolerancia.
Tal como pudieron mostrar también los inventores, la muteína de hlL-2 según la invención estimula además la actividad de las células inmunes específicas de antígenos. Esto tiene la ventaja de que, por medio de la muteína de hlL-2, se estimulan selectivamente células inmunes específicas de enfermedades y, así, se limita el efecto sistémico de la inmunoterapia. De esta manera, también se impide que, con la administración de la muteína de hlL-2, se induzcan otras enfermedades.
Además, los inventores pudieron mostrar por medio de un modelo murino de diabetes me-llitus de tipo I que se puede impedir la irrupción de una enfermedad autoinmune por medio del tratamiento con la muteína de hlL-2 según la invención.
El objeto en que se basa la invención se soluciona así por completo.
Según la invención, por "tipo salvaje" de la interleuquina 2 humana (hlL-2 de tipo salvaje) se entiende un polipéptido o proteína que presenta la secuencia de aminoácido de 133 aminoáci-dos que está presenta en la IL-2 humana nativa (sin el péptido señal que está compuesto por otros 20 aminoácidos N-terminales). La hlL-2 de tipo salvaje se puede expresar de modo tanto nativo como también recombinante. La secuencia de aminoácidos de hlL-2 de tipo salvaje se describe en Fujita et al. (1983), PNAS USA 80, p. 7437-7441 , y con y sin una metionina adicional N-terminal, que está presente necesariamente cuando la proteína se expresa en E. coli como fracción intrace-lular. La secuencia de aminoácidos de hlL-2 de tipo salvaje está indicada en el posterior listado de secuencias bajo SEQ ID NO. 1. La secuencia de nucleótidos del cADN, que codifica la hlL-2, está indicada en el posterior listado de secuencias bajo SEQ ID NO. 2.
Según la invención, por "muteína" de interleuquina 2 humana (muteína de hlL-2) se en-
tiende un polipéptido o una proteína en la que se hicieron sustituciones específicas respecto de la hlL-2 de tipo salvaje. La identificación de las posiciones en las que se realizaron sustituciones se rige por las posiciones de los aminoácidos en la hlL-2 de tipo salvaje, que se han de extraer, por ejemplo, de la SEQ ID NO. 1. Según ello, en la posición 1 se halla una alanina (A), en la posición 2, una prolina (P), en la posición 133, una treonina (T), etc. El radical de ácido aspártico (D) en la posición 20 ("D20") se puede sustituir, por ejemplo, por un radical de isoleucina (I) o una histidina (H), de modo que se forman IL-2-muteínas que son denominadas hlL-2— D20I ó bien hlL-2-D20H.
Se entiende que la muteína de hlL-2 según la invención puede estar sustituida en varias de las posiciones 20, 88 ó 126, de modo que se producen mutantes de combinación que son parti- cularmente apropiadas para el tratamiento de una enfermedad autoinmune o para la inducción de células T reguladoras.
Según la invención, una muteína de hll_-2 también comprende un polipéptido modificado, p.ej., una muteína de hlL-2 glucosilada. Las muteínas de hlL-2 glucosiladas se divulgan, p.ej., en las solicitudes de patente US 09/310.026 y 10/051.657, que son parte de la presente divulgación.
Por "parte" o "fragmento" de muteína de hlL-2 se entiende según la invención un polipéptido en el que faltan uno o varios aminoácidos respecto de la muteína de hlL-2 N- y/o C-terminal, pero que asimismo aún presenta suficiente actividad biológica de la muteína de hlL-2 para poderlo emplear según la invención para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes. Esta actividad se considera suficiente cuando la parte presenta al menos el 50%, con preferencia al menos el 60%, con mayor preferencia al menos el 70%, más preferentemente al menos el 80%, con mayor preferencia aún al menos el 90% y con máxima preferencia al menos el 95% de la actividad de la muteína de hlL-2 para la inducción de células T reguladoras. La actividad de la muteína de hlL-2 se puede medir por medio de métodos conocidos por el especialista. Un método de este ' tipo se divulga, p. ej., en el documento WO 99/60128, ejemplos 3 a 5. Esta publicación se incorpora a la presente divulgación como referencia.
Se prefiere, según la invención, cuando en el caso de las sustituciones en las posiciones mencionadas no se trata de sustituciones conservativas, con las que se intercambia un aminoácido por otro con propiedades bioquímicas similares.
Con respecto a ello, se prefiere cuando en el caso de la sustitución en la posición 20 no se trata de una en la que el ácido aspártico (D) se intercambia por un ácido glutámico (E). Con preferencia, en el caso de la sustitución en la posición 88 no se trata de una en la que la asparaginá (N) se intercambia por una alanina (A), prolina (P), glicina (G), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T). Además, la sustitución en la posición 126 preferentemente no es un caso en el cual la glutamina (Q) se intercambia por una alanina (A), prolina (P), glicina (G), asparaginá (N), serina (S) o treonina (T). Estas sustituciones no modificarían la actividad biológica de la hlL-2 de tipo salvaje o sólo lo harían de modo no esencial.
Además, se prefiere cuando en las posiciones mencionadas no se realizó ninguna de tales sustituciones, que incorporan sitios para la reticulación intermolecular o enlaces de puentes disulfuro incorrectos. Por ello, en el caso de la sustitución de la muteína de hlL-2 según la invención en la posición 20 no se trata preferentemente de una en la que el ácido aspártico (D) se intercambia por arginina (R), asparaginá (N), ácido aspártico (D), cisteína (C), ácido glutámico (E), glicina (G), leu-cina (L), lisina (K), fenilalanina (F), prolina (P), treonina (T) o triptófano (W). En el caso de la susti-tución en la posición 88, se trata preferentemente no de una en la que se intercambia la asparaginᦠ(N) por ácido aspártico (D), cisteína (C), glutamina (Q), triptófano (W) o prolina (P). En el caso de la sustitución en la posición 126, se trata preferentemente no de una en la que se intercambia la glutamina (Q) por una alanina (A), histidina (H), triptófano (W), cisteína (C), glutamina (Q), ácido glutámico (E) o lisina (K).
La muteína de hlL-2 según la invención se puede preparar por medio de cualquier método apropiado conocido en el estado de la técnica. Estos métodos contienen la construcción de una secuencia de ADN que codifica la IL- muteína según la invención y, por ejemplo, comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 2 y la expresión de esta secuencia en un huésped apropiado. Este método lleva a las muteínas según la invención en forma recombinante. Sin embargo, la mu-teína según la invención también se puede preparar por síntesis química o una combinación de síntesis química y tecnología de ADN recombinante. La preparación de la muteína según la invención se describe extensamente en el documento WO 99/60128, sus ejemplos de realización 1 y 2, que se incorporan a la presente divulgación a modo de referencia.
Una muteína de hlL-2 según la invención de especial preferencia, en la que se intercambia en la posición 88 la asparagina (N) por una arginina (R) (hlL-2-N88R), está a disposición del especialista bajo el nombre BAY50-4798; comp. Shanafelt et al. (2000), A T-cell-selective interleukin 2 mutein exhibits potent antitumor activity and is well tolerated in vivo, Nat. Biotechnol. Vol. 18, p. 1197-1202. La secuencia de aminoácidos de hlL-2-N88R está indicada en el posterior listado de secuencias bajo SEQ ID NO. 3.
Los descubrimientos de los inventores eran particularmente sorprendentes porque en el estado de la técnica no se podían hallar indicios de una actividad tal de la IL-2-muteína.
De esta manera, en el documento WO 99/60128 se divulga para la muteína hlL-2-N88R que puede activar selectivamente células T respecto de las células killer naturales y que está en condiciones de reducir la formación de metástasis en el pulmón.
En el documento WO 02/00243, se describe una formulación estable libre de albúmina y que contiene histidina para la muteína hlL-2-N88R.
En el documento US 2002/0164300, se describe una variante glicosilada de la muteína L-2-N88R.
El uso de la muteína de hlL-2 según la invención para el tratamiento dirigido y/o la prevención de enfermedades autoinmunes o para la activación selectiva de células T reguladoras en un organismo no se describe ni se supone en el estado de la técnica.
Incluso para I L— 2 humana de tipo salvaje no hay reconocimientos pertinentes.
Van der Vliet et al. (2007), Effects of the administration of high-dose interleukin— 2 on ¡m-munoregulatory cell subsets in patients with advanced melanoma and renal cell cáncer, Clin. Cáncer Res. Vol. 13, p. 2100-2108, describen que al administrar altas dosis de IL-2 se reduce su eficacia terapéutica para el tratamiento de tumores.
Ahmadzadeh y Rosenberg (2006), IL-2 administration increases CD4+CD25h'Foxp3+ regu-latory T cells in cáncer patients, Blood, Vol. 107, p. 2409-2414, proponen mejorar la eficacia terapéutica de la IL-2 humana de tipo salvaje eliminando las células T reguladoras de los pacientes. Pero este enfoque no se presentaba promisorio; comp. Powell et al. (2007), Inability to medíate pro-' longed reduction of regulatory T cells after transfer of áutologous CD25-depleted PBMC and ínter-.
leukin-2 after limphodepleting chemotherapy, J. Immunoter. Vol. 30, p. 438-447.
Antony and Restifo (2005), CD4+CD25+ T regulatory cells, Immunotherapy of cáncer, and ¡nterleuk¡n-2, J. Immunother. Vol. 28, p. 120-128, rechazan la IL-2 más bien como inmunoterápico y describen incluso que la administración de IL-2 induce autoinmunidad.
Se dirigen a la misma dirección Knoechel et al. (2005), Sequential development of interleu- kin 2-dependent effector and regulatory T cells in response to endogenous systemic antigen, JEM Vol. 202, p. 1375-1386, y proponen incluso un antagonismo de IL-2, es decir, una inhibición de mecanismos de IL-2 para tratar la fase temprana de las enfermedades autoinmunes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En el estado de la técnica, no se hallan puntos de referencia que hagan suponer la solución según la invención.
De esta manera, los inventores también reconocen que los efectos terapéuticos de la mu- teína de hlL-2 pueden ser diferentes según la indicación y la concentración empleada. Una alta concentración de hlL-2 puede ser ventajosa para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, pero puede estar contraindicada en la terapia de enfermedades tumorales.
En el uso según la invención, se prefiere cuando por sustitución en la posición 88 se inter-- cambia una asparagina por una arginina (hlL-2-N88R), o por una glicina (hlL-2-N88G), o por una isoleucina (hIL— 2— N88I), y/o por sustitución en la posición 20 un ácido aspártico por una histidina (hlL-2-D20H), o por una isoleucina (hlL-2-D20l), o por una tirosina (hlL-2-D20Y), o por sustitución en la posición 126 una glutamina por una leucina (hlL-2-Q126L).
Esta medida tiene la ventaja de que se usa tal muteína de hlL-2 según la invención que se caracteriza porque activa de forma particularmente selectiva células T respecto de células killer naturales y presenta así un alto potencial terapéutico y baja toxicidad. Estas propiedades de las mu- teínas de hlL-2 preferidas según la invención se describen en el documento WO 99/60128, que por referencia es parte integral de la presente divulgación.
Según la invención se prefiere cuando la muteína de hlL-2 o un fragmento de la misma presenta al menos otra sustitución de aminoácido en cualquier posición, salvo las posiciones 20, 88
ó 126, de modo que la muteína de hlL-2 luego sustituida o su parte luego sustituida presenta una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80%, con preferencia en el 85%, con mayor preferencia en el 90%, con mayor preferencia en el 95%, con máxima preferencia en el 99% a la secuencia de aminoácidos de la muteína de hlL-2 o de su parte, que no está luego sustituida respecto de la hlL-2 de tipo salvaje, salvo en al menos una de las posiciones 20, 88 ó 126.
Esta medida tiene la ventaja de que se ponen a disposición estructuras primarias alternativas, que en algunos casos son más fáciles de sintetizar que la muteína de hlL-2, que además de al menos una de las posiciones 20, 88 ó 126 corresponde a la hlL-2 de tipo salvaje. A fin de obtener un polipéptido con la actividad biológica de la muteína de hlL-2 o de su parte y así un medícamentó para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoínmune, no es imperioso poner a disposición un polipéptido que presente una secuencia de aminoácidos que es 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la muteína de hlL-2 según la invención o su parte. Más bien alcanza cuando se da una identidad suficientemente alta, en donde eventualmente son tolerables pérdidas de actividad moderadas, pero preferentemente se mantiene al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de la actividad. Las identidades indicadas se refieren a la parte de la muteína de hlL-2 según la invención con > 10 aminoácidos. El grado de homología se puede calcular fácilmente por medio de Procedimientos conocidos por el especialista, por ejemplo, un análisis BLAST o por medio del módulo MegAlign del programa Lasergene de DNAStar Inc.
Según la invención, también se prefiere cuando en el caso de otra sustitución de aminoáci-dos en cualquier posición, salvo las posiciones 20; 88 ó 126, se trata de una sustitución de aminoácido conservativa.
Esta medida tiene la ventaja de que se ponen a disposición otras vanantes de la muteína de hlL-2 según la invención que presentan una actividad suficientemente alta para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes o bien para la inducción de células T reguladoras en un organismo. También es conocido por el especialista que las sustituciones conservativas no tienen un efecto o tienen un efecto mínimo sobre la estructura secundaria o terciaria de la muteína. Estas sustituciones conservativas comprenden aquellas descritas por Dayhoff en "The Atlas of Pro-tein Sequence and Structure. Vol. 5", Nati. Biomedical Research. A modo de ejemplo, los aminoá-
cidos que pertenecen a uno de los siguientes grupos pueden intercambiarse entre sí, es decir, forman un intercambio conservativo:
alanina(A), prolina(P), glicina(G), asparagina(N), serina(S), treonina(T);
cisteína(C), serina(S), tirosina(Y), treonina(T);
valina(V), isoleucina(l), leucina(L), metionina(M), alanina(A), fenilalanina(F);
lisina(K), arginina(R), histidina(H);
fenilalanina(F), tirosina(Y), triptófano(W), histidina(H); y
- ácido aspártico(D), ácido glutámico(E).
En el caso del agente según la invención para la inducción de la formación de células T reguladoras en un organismo se trata preferentemente de un medicamento que presenta un portador farmacéuticamente aceptable.
Esta medida tiene la ventaja de que el agente se pone a disposición ya en una forma tal que permite una aplicación directa en el organismo, con preferencia un ser humano.
Los portadores farmacéuticamente aceptables se describen abarcativamente en el estado de la técnica; comp. Row et al. (2006), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5.a edición, Phar-maceutical Press and American Pharmasists' Association; Bauer et al. (1999), Lehrbuch der phar-mazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart. Una formulación de particular preferencia es aquella que se divulga en el documento WO 02/00243 que es parte integral de la presente divulgación por referencia. Esta formulación está libre de albúmina y la estabilización de la muteína de hll_-2 o de su parte se realiza con histidina. Con preferencia, la droga terminada presenta los siguientes componentes en las siguientes concentraciones: muteína de hlL-2 o una de sus partes = 0,1-5 mg/ml; histidina = 0,08-1 ,6% en peso; NaCI = 0-0,9% en peso; sacarosa = 1-10% en peso; glicina = 0-0,3% en peso, y presenta un valor pH de aproximadamente 5 a 6,5.
Según una forma de realización especial, la composición farmacéutica presenta adicional-mente un inmunosupresor.
La composición farmacéutica ya se puede emplear como monopreparado para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes en virtud de la particular potencia de la
muteina de hlL-2 según la invención. Un monopreparado de este tipo presenta la muteina de hlL-2 según la invención como único principio activo. Los portadores farmacéuticamente aceptables, solventes (tampones, agua, etc.), excipientes, etc., no son principios activos en este contexto.
Esta medida tiene la ventaja de que el índice terapéutico del medicamento según la inven-ción se incrementa nuevamente por agregado de un inmunosupresor clásico.
Se prefiere cuando el inmunosupresor está seleccionado del grupo compuesto por gluco-corticoide, incluyendo decortina, prednisol; azatioprina; ciclosporina A; micofenolatmofetilo; tacroli-mus; globulina anti-T-linfocítica, anticuerpos anti-CD3, incluyendo muromonab; anticuerpos anti-CD25, incluyendo basiliximab y daclizumab; anticuerpos de anti-TNF-a, incluyendo ¡nfliximab y adalimumab; azatioprina; metotrexato; ciclosporina; sirolimus; everolimus; fingolimod; CelICept; mi-fortic; ciclofosfamida.
Esta medida tiene la ventaja de que se emplea un inmunosupresor de este tipo que presenta una eficacia terapéutica comprobable en las enfermedades autoinmunes y que está a disposición de manera suficiente en el estado de la técnica.
También se prefiere cuando la enfermedad autoinmune está seleccionada del grupo compuesto por: diabetes mellitus de tipo I, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, gastritis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad de Basedow, enfermedad de Bechterew, psoriasis, miastenia gra-vis, hepatitis autoinmune, APECED, síndrome de Chrug-Strauss, colitis ulcerosa, glomerulonefritis, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, liquen sclerolus, lupus eritematoso sistémico, PANDAS, fiebre reumática, sarcoidosis, síndrome de Sjórgren, síndrome de Stiff-Man, esclero-dermia, granulomatosis de Wegener, vitíligo, autoinmunoenteropatía, síndrome de Goodpasture, dermatomiositis, polimiositis, alergia autoinmune, asma y reacción autoinmune después de trasplantes de órganos.
Esta medida tiene la ventaja de que se pone a disposición un medicamento de este tipo que se puede emplear para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades autoinmunes más importantes.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune, que presenta la muteina de hlL-2 según la invención
o una parte de ella.
Las propiedades y ventajas descritas en relación con el uso según la invención, así como las definiciones rigen de la misma manera para la composición farmacéutica según la invención.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un agente para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo, que presenta la muteína de hlL-2 según la invención o una parte de ella.
Las ventajas y propiedades, así como las definiciones del uso según la invención rigen correspondientemente para el agente según la invención.
Otros objetos de la presente invención son métodos para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune en un organismo y para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo, que presentan en cada caso las siguientes etapas: (a) provisión de una muteína de interleuquina humana 2 (muteína de ML-2) o una de sus partes, (b) administración de la muteína de hlL-2 o de su parte en un organismo, y (c) repetición de las etapas (a) y (b) si fuera necesario, en donde en el caso de la muteína de hlL-2 o la parte de ella se trata de la muteína de hlL-2 según la invención o una parte de ella.
El organismo es preferentemente un mamífero, con mayor preferencia un organismo humano.
Las propiedades y ventajas descritas en relación con el uso según la invención, así como las definiciones rigen de la misma manera para los métodos según la invención mencionados pre-viamente para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune en un organismo y para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un método para la formación de células T reguladoras (TReg) in vitro, que presenta las siguientes etapas: (a) provisión de una muteína de in-terleuquina-2 humana (muteína de hlL-2) o una de sus partes, (b) puesta en contacto de la muteí-na de hlL-2 o de su parte con glóbulos rojos mononucleares periféricos (PBMCs), y (c) repetición de las etapas (a) y (b) si fuera necesario, en donde en el caso de la muteína de hlL-2 o su parte se trata de la muteína de hlL-2 según la invención o una parte de ella.
La puesta en contacto de hlL-2 o bien sus partes con los PBMC se puede realizar en cual-
quier medio apropiado para el cultivo de PBMC.
Las propiedades y ventajas descritas en relación con el uso según la invención, así como las definiciones rigen de la misma manera para el Procedimiento según la invención previamente mencionado para la formación de células T reguladoras (TReg) in vitro.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune en un organismo, que presenta las siguientes etapas: (a) provisión de una muteína de ¡nterleuquina-2 humana (muteína de hlL-2) o una de sus partes, (b) puesta en contacto de la muteína de hlL-2 o de su parte con glóbulos rojos mononucleares periféricos provenientes de un primer organismo (PBMC), (c) incubación de la muteína de hlL-2 o de su parte con los PBMC, para obtener una población celular que presenta las células T reguladoras (TReg), y (d) suministro de la población celular en un segundo organismo, en donde es en el caso de la muteína de hlL-2 o su parte se trata de la muteína de hlL-2 según la invención o una parte de ella.
Se prefiere que el primer y el segundo organismos presenten el mismo grupo de sangre, prefiriéndose en especial que el primer y el segundo organismos sean organismos o individuos idénticos.
En este caso, es ventajoso que en el suministro o la reinfusión de la población celular no sé produzca ningún reacción inmune no deseada contra las células y, por ello, el el método tiene particularmente pocos efectos colaterales.
Las propiedades y ventajas descritas en relación con el uso según la invención, así como las definiciones rigen de la misma manera para el método según la invención previamente mencionado para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune en un organismo.
Se entiende que las características previamente mencionadas y las que se explicarán más tarde no sólo se pueden usar en la combinación indicada en cada caso, sino que también se pue-den emplear en otras combinaciones o solas, sin apartarse del marco de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
continuación, se explicará con mayor detalle la invención por medio de ejemplos de
lización, que tienen un carácter puramente ilustrativo y que no restringen el alcance de la invención. En este caso, se hace referencia a las figuras anexas, en las que se representa lo siguiente: Fig. 1 muestra que hlL-2-N88R en voluntarios sanos con una dosis igual o menor en comparación con la proleuquina induce un mayor aumento de las células T CD4+CD25+Foxp3+ reguladoras;
Fig. 2 muestra que hlL-2-N88R en sujetos sanos con una dosis igual o menor en comparación con la proleuquina induce un mayor aumento de las células T CD4 CD25"Foxp3+ reguladoras;
Fig. 3 muestra que NL-2-N88R en pacientes con melanoma con una dosis igual o menor en comparación con la proleuquina induce un mayor aumento de las células T
CD4+CD25+Foxp3+ reguladoras;
Fig. 4 muestra que hlL-2-N88R en pacientes con melanoma con una dosis igual o menor en comparación con la proleuquina induce un mayor aumento de las células T
CD4+CD25 oxp3+ reguladoras;
Fig. 5 muestra que NL-2-N88R en pacientes con esclerosis múltiple con una dosis igual o menor en comparación con la proleuquina induce un mayor aumento de las células T
CD4+CD25+Foxp3+ reguladoras;
Fig. 6 muestra que hlL-2-N88R en pacientes con esclerosis múltiple con una dosis igual o menor en comparación con la proleuquina induce un mayor aumento de las células T CD4+CD25 oxp3+ reguladoras;
Fig. 7 muestra que hlL-2-N88R en pacientes con esclerosis múltiple con una dosis igual o mayor en comparación con la proleuquina induce un menor aumento de las células T
CFSEIow/CD3+CD8+CD45RO+ citotóxicas;
Fig. 8 muéstra que hlL-2-N88R en sujetos sanos con una dosis igual o mayor en compara- ción con la proleuquina induce un menor aumento de las células T CFSE- low/CD3+CD8+CD45RO+ citotóxicas;
Fig. 9 muestra que hlL-2-N88R en el modelo de diabetes de tipo I de ratón en comparación con el hlL-2 de tipo salvaje lleva a un mayor aumento porcentual de las células
FoxP3+ dentro de las células CD4+ (A). Estas células CD4+FoxP3+ presentan, además, una mayor expresión de CD25 (B).
Fig. 10 muestra que hlL-2-N88R en el modelo de diabetes de tipo I de ratón evita la evolución de la diabetes contrariamente al tipo salvaje hll_-2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Ejemplos de realización
1. Material y métodos
1.1 Separación de PBMC de sangre completa para usar in vitro
Se separan glóbulos rojos mononucleares periféricos (PBMC) de voluntarios sanos, pacientes con melanoma o esclerosis múltiple de la sangre por medio de agente separador de lín— focitos (Histopaque, Sigma Aldrich). Para ello, se pasan dos tubitos de sangre (7 ó 10 mi) del mismo voluntario o paciente a un tubito estéril de 50 mi y se llena con RPMI 1640 (InVitrogen, # 14190-69) hasta 30 mi. Luego se colocan 30 mi de la sangre diluida sobre 15 mi de una solución de gradiente de densidad (densidad = 1 ,077; Histopaque, Sigma Aldrich, # 10771 ).
Después de una centrifugación a 400 g durante 40 min a 20°C sin aditivo de detención, se cosechan dos "anillos de glóbulos rojos blancos" y se pasan a un tubito estéril de 50 mi y se lavan dos veces con solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS; InVitrogen # 14 90-169). En el caso de una contaminación con glóbulos rojos, se realiza una lisis RBC ("red blood cells"); se añaden 2 mi de solución de lisis de RBC al pellet celular, bajo un moderado mezclado a temperatura ambiente se realiza una incubación durante 2 min, seguido de un Procedimiento de lavado con un volumen grande de medio completo (RPMI 1640 con 10% de suero fetal de ternero).
Se determina la cantidad de leucocitos vivos por coloración por exclusión por medio de azul de tripano (InVitrogen # 15250-061 ) y un hemocitómetro (FisherBioblock A2759B).
1.2 Marcación de CFSE
Después del recuento, se lavan las células dos veces en PBS y se resuspenden con una concentración de 1 x 106 células/ml en PBS. Se añaden CFSE (InVitrogen # C1 157) con una concentración final de 0,5 µ?. Después de una incubación de 10 minutos en la oscuridad a
37°C,se lavan las células marcadas con CFSE tres veces con medio completo fresco a 4°C y se resuspenden con una concentración de 1 x 106 células/ml en medio completo para el plaqueo. 1.3 Estimulación de los PBMC in vi tro
Los PBMCs quedan ya sea no estimulados o se estimulan con hlL-2 de tipo salvaje (pro-leuquina) o hlL-2-N88R (BAY 50-4798; lote #PR312C008) con o sin un pool de péptidos sintéticos que se derivan de las proteínas específicas de melanoma gp100, TRP-2, MART-1 y tirosinasa o la proteían MOG específica para esclerosis múltiple (MS), en donde cada péptido se añade en una concentración final de 2,5 µ? (péptido de melanoma) o bien 30 pg/ml (péptido de esclerosis múltiple).
El estimulador y el péptido se añaden de acuerdo con las siguientes 23 condiciones:
Condición Estimulador Concentración final
1 hlL-2-N88R 10"" M ningún péptido
(BAY 50-4798;
#PR312C008)
2 hlL-2-N88R 10"" M Péptido
(BAY 50^798;
#PR312C008)
3 hlL-2-N88R 10"M M Ningún péptido
(BAY 50-4798;
#PR312C008)
4 hlL-2-N88R 10"a M Péptido
(BAY 50-4798;
#PR312C008)
5 hlL-2-N88R 10"° M Ningún péptido
(BAY 50-4798;
#PR312C008)
6 hlL-2-N88R 10"" M Péptido (BAY 50-4798;
#PR312C008)
7 hlL-2-N88R 10"' M Ningún péptido
(BAY 50-4798;
#PR312C008)
8 hlL-2-N88R 10"' M Péptido
(BAY 50-4798;
#PR312C008)
9 hlL-2-N88R 10"* M Ningún péptido
(BAY 50-4798;
#PR312C008)
10 hlL-2-N88R 10"" M Péptido
(BAY 50^798;
#PR312C008)
11 hlL-2 de tipo salva10"" M Ningún péptido je
(proleuquina)
12 hlL-2 de tipo salva10"" M Péptido
je
(proleuquina)
13 hlL-2 de tipo salva10"M M Ningún péptido je
(proleuquina)
14 hlL-2 de tipo salva10"M M Péptido
je
(proleuquina)
Tabla 1 : Condiciones para la estimulación de los PBMC
Luego se cultivan las células durante seis días a 37 °C y a una atmósfera con 5% de contenido de C02.
1.4 Ensayo de proliferación v fenotipación en el citómetro de flujo FC500
La coloración de las células con anticuerpos marcados con fluorescencia en moléculas superficiales celulares permite el ensayo de la proliferación de un subgrupo específico de linfocitos (marcadores de memoria y activación, comp. Tabla 2). La inmunocoloración con anticuerpos marcados con fluorocromo (PE: ficoeritrina, ECD: PE-Texas Red, APC: aloficocianina, PC7: PE-Cy7) se realiza antes y después de seis días de cultivo con los estimuladores.
Al sexto día, se realizan las dos primeras coloraciones (1 y l iso) con células no marcadas con CFSE (CFSE: succinimidiléster de diacetato de carboxifluoresceína); las otras coloraciones se realizan en células marcadas con CFSE.
Tabla 2: Esquema de coloración de los PBMCS
CD25-PE, Foxp3-APC y lgG2a-APC de rata provienen de ebiosciences; CD25-APC, CD45RA-APC y CD45RO-APC se obtuvieron de BD Biosciences. Todos los demás anticuerpos provenían de Beckman-Coulter, Francia.
1.5 Modelo de diabetes de tipo I de ratón
Se tratan diariamente ratones NOD ("diabéticos no obesos") de 12 semanas de edad con muteína de hlL-2 o hll_-2 de tipo salvaje. Análogamente, se trataron animales de control negativo con solución fisiológica (solución salina). Los grupos de tratamiento estaban compuestos por 3 - 5 animales. Del día 0 al 15 se aplicó a los ratones una cantidad de unidades 5K o 25K de muteína de hlL-2 o hlL-2 de tipo salvaje. A partir del día 17, se aumentó en los grupos de tratamiento con uni-dades 5K a unidades 100K (= 6,1 12 g). El tratamiento de los otros animales con unidades 25K se mantuvo sin alteración. La última dosificación se realizó el día 31. En un experimento paralelo, se trató del día 0 al día 31 son una dosis fija de unidades 25K. La diabetes se comprobó por medio de monitoreo de los niveles de glucosa en orina. Se tomaron muestras de sangre de los ratones el día 17 y el día 30. Se analizaron la smuestras en FACS por medio de coloración anti-CD4, anti-CD25 y anti-FoxP3 y, de esta manera, se determinó el porcentaje de las células FoxP3+ entre las células T CD4+, así como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la expresión de CD25 sobre células CD4+FoxP3+.
2. Resultados
2.1 Inducción de células T reguladoras por hlL-2-N88R
Como sistema in vitro apropiado para ensayar el efecto de las muteínas según la invención, se usaron glóbulos rojos mononucleares periféricos (PBMC). Los PBMC están compuestos por células T (-75% de CD4- y CD8-positivo) y células B y NK (~ 25% positivo), formando así una población celular que representa bien al sistema inmune.
Los PBMC de seis voluntarios sanos (106 células/ml) se estimularon con IL-2 de tipo salva-je (proleuquina) o IL-2-N88R [BAY 50-4798, lote #PR312C008 ("BAY#C008")] en concentraciones que estaban entre 10"1 y 10-6 M, o en el control positivo con el mitógeno inespecífico fitohemaglu-tinina ("PHA") con una concentración de 5 pg/ml o con medio de cultivo solo ("Med"). El día 0 y el día 6 después de la estimulación, se determinó la proporción de las células T CD4+GD25+Foxp3+
reguladoras dentro de los linfocitos CD3+. El resultado está representado en la Fig. 1 y la siguiente Tabla 3.
Tabla 3: Porcentaje de las células T CD3+CD4+CD25+Foxp3+ después de la estimulación; valores medios de seis voluntarios sanos; D. E.: desviación estándar
De este experimento, se desprende que hll_-2-N88R en concentraciones de 10"7 y 10"6 M lleva a una clara inducción de la subpoblación de las células T CD4+CD25+Foxp3+ reguladoras. La inducción es, en este caso, claramente mayor que en una estimulación de los PBMC por el hlL-2 de tipo salvaje.
En una segunda preparación, se ensayó el aumento de la subpoblación de las células T CD4+CD25"Foxp3+ reguladoras después de la estimulación con hlL-2-N88R en comparación con
el hlL-2 de tipo salvaje. El resultado está representado en la Fig. 2 o bien en la siguiente Tabla 4.
Tabla 4: Porcentaje de las células T CD3+CD4+CD25"Foxp3+ después de la estimulación; valores medios de seis voluntarios sanos
También aquí se muestra que la estimulación con NL-2-N88R lleva a un claro aumento de la subpoblación de las células T CD4+CD25Toxp3+ reguladoras, que es claramente mayor con concentraciones de 10-6 M que con una estimulación con el hlL-2 de tipo salvaje,
2.2 hll_-2-N88R induce células T reguladoras en pacientes con melanoma
Como paso siguiente, se ensayó si la muteína de hlL-2 según la invención N88R también estimula la actividad de las células inmunes específicas de antígenos. Para ello, se estimularon PBMC (106 células/ml) de tres pacientes con melanoma con hlL-2-N88R (BAY 50-4798, lote #PR312C008) o hlL-2 de tipo salvaje (proleuquina) en concentraciones que estaban entre 10"11 y
10"6 M, en presencia o ausencia de un pool de péptidos asociados a melanoma, con 5 pg/ml de PHA o con medio de cultivo solo. Luego se determinaron las subpoblaciones de las células T CQ4+CD25+Foxp3+ o CD4+CD25"Foxp3+ reguladoras. El resultado está representado en la Fig. 3 y en la Tabla 5 o bien en la Fig. 4 y en la Tabla 6.
Tabla 5: Porcentaje de las células T CD3+CD4+CD25+Foxp3+ después de la estimulación; valores medios de tres pacientes con melanoma
Tabla 6: Porcentaje de las células T CD3+CD4+CD25"Foxp3+ después de la estimulación; valores medios de tres pacientes con melanoma
En este caso, se mostró que la administración de hlL-2-88R en pacientes con melanoma también lleva a un claro aumento de las células T reguladoras. Este es, en el caso de la subpobla-ción CD4+CD25+Foxp3+ con una concentración de 10"7 M y 1 CT6 , y en la subpoblación CD4+CD25 oxp3+ con una concentración de 1 CT6 M, claramente mayor que con una estimulación con concentraciones correspondientes de IL-2 de tipo salvaje (proleuquina).
2.3 hlL-2-N88R induce las células T reguladoras en pacientes con esclerosis múltiple
Como paso siguiente, se ensayó si la muteína de hlL-2 según la invención N88R también estimula la actividad de células inmunes específica de antígenos. Para ello, se estimularon PBMC (106 células/ml) de dos pacientes con esclerosis múltiple con hlL-2-N88R (BAY 50-4798, lote #PR312C008) o hlL-2 de tipo salvaje (proleuquina) con concentraciones que estaban entre 10-11 y 10-6 M, en presencia o ausencia de un péptido asociado a esclerosis múltiple, con 5 pg/ml de PHA o con medio de cultivo solo. Luego se determinaron las subpoblaciones de células T CD4+CD25+Foxp3+ o CD4+CD25 oxp3+ reguladoras. El resultado está representa en la Fig. 5 y en la Tabla 7 o bien en la Fig. 6 y en la Tabla 8.
Tabla 7: Porcentaje de las células T CD3+CD4+CD25+Foxp3+ después de la estimulación;
valores medios de dos pacientes con esclerosis múltiple.
Tabla 8: Porcentaje de las células T CD3 CD4 CD25 Foxp3 después de la estimulación;
valores medios de dos pacientes con esclerosis múltiple
Se mostró que la administración de hlL-2-88R en pacientes con esclerosis múltiple también lleva a un claro aumento de las células T reguladoras. Este es, en el caso de la subpoblación CD4+CD25+Foxp3+ con concentraciones de 1 CT8 M y ? 0"7 M, y en una subpoblación CD4+CD25~ Foxp3+ con una concentración de 1 CT6 claramente mayor que con una estimulación con las correspondientes concentraciones de IL-2 de tipo salvaje (proleuquina).
2.4 hll_-2^N88R induce sólo una proliferación mínima de células T CD8+ citotóxicas en pacientes con esclerosis múltiple y en voluntarios sanos
Además, se ensayó la estimulación de células T de memoria central CD8+ citotóxicas. Pa-ra ello, se trataron los PBMC de voluntarios sanos o de pacientes con esclerosis múltiple, tal como se describió en el punto 2.3: Se analizó la Porcentaje de las células T CFSE-low/CD3+CD8+CD45RO+. El resultado está representado en la Fig. 7 y en la Tabla 9, así como en la Fig. 8 y en la Tabla 10.
Tabla 9: Porcentaje de las células T CFSEIow/CD3+CD8+CD45RO+ después de la estimulación; valores medios de dos pacientes con esclerosis múltiple.
Tabla 10: Porcentaje de las células T CFSEIow/CD3+CD8+CD45RO+ después de la estimulación; valores medios de tres voluntarios sanos
hlL-2— 88— R lleva en pacientes con esclerosis múltiple como también en voluntarios sanos, contrariamente a hlL-2 de tipo salvaje, a una proliferación sólo escasa de células T CD8+ de memoria central, en cada concentración ensayada.
2.5 El tratamiento con muteína de hlL-2 impide el desarrollo de diabetes de tipo I en el Modelo Animal
El tratamiento de ratones NOD con hlL-2-N88R lleva, en comparación con hlL-2 de tipo salvaje, a un mayor aumento porcentual de las células FoxP3+ dentro de las células CD4+ (Fig. 9 (A)). Estas células positivas CD4+FoxP3+ presentan, además, una mayor expresión de CD25 (Fig. 9 (B)). La Fig. 10 muestra que el tratamiento con NL-2-N88R en el modelo de diabetes de tipo I de ratón, contrariamente a hlL-2 de tipo salvaje, impide el desarrollo de la diabetes en todos los ratones del grupo de tratamiento.
3. Conclusión
Los experimentos realizados por los inventores dejan en claro que, en el caso de las mu-teínas de hlL-2 según la invención y sus partes, debido a su potencial para la inducción de células T reguladoras (TReg), se trata de sustancias que son apropiadas para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune o bien para la inducción de TReg en un organismo, así como para la formación de TReg in vitro. Esto también es demostrado por los inventores no sólo in vitro sino también in vivo.
Claims (26)
1. Uso de una muteina de interleuquina-2 humana (muteina de hlL-2) o una de sus partes, que está numerada según la hlL-2 de tipo salvaje y que presenta una sustitución de ami-noácido en al menos una de las posiciones 20, 88 ó 126, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 , caracte-rizado porque por sustitución en la posición 88 se intercambia una asparagina por una arginina (hlL-2-N88R), o por una glicina (hlL-2-N88G) o por una isoleucina (ML-2-N88I).
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual por sustitución en la posición 20 se intercambia un ácido aspártico por una histidina (NL-2-D20H) o por una isoleucina (hlL-2-D20H) o por una tirosina (ML-2-D20Y).
4. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual por sustitución en la posición 126 se intercambia una glutamina por una leucina (NL-2-Q126L).
5. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muteina de hlL-2 o su parte presenta al menos otra sustitución de aminoácido en cualquier posición, salvo las posiciones 20, 88 ó 126, de modo que la muteina de hlL-2 luego sustituida o su parte luego sustituida presenta una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80%, con preferencia en el 85%, con mayor preferencia en el 90%, con mayor preferencia en el 95%, con máxima preferencia en el 99% a la secuencia de aminoácidos de la muteina de hlL-2 o de su parte, que no está sustituida luego respecto de hlL-2 de tipo salvaje, salvo en al menos una de las posiciones 20, 88 ó 126.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, que es en el caso de la posterior sustitu-ción en al menos cualquier posición, salvo las posiciones 20, 88 ó 126, se trata de una sustitución de aminoácidos conservativa.
7. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el agente presenta adicionalmente un inmunosupresor.
8. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el in- munosupresor está seleccionado del grupo compuesto por: glucocorticoide, incluyendo decortina, prednisol; azatioprina; ciclosporina A; micofenolatmofetilo; tacrolimus; globulina anti— T— linfocítica, anticuerpos anti-CD3, incluyendo muromonab; anticuerpos anti-CD25, incluyendo basiliximab y daclizumab; anticuerpos anti-TNF- , incluyendo infliximab y adalimumab; azatioprina; metotrexa-to; ciclosporina; sirolimus; everolimus; fingolimod; cellcept; mifortic; ciclofosfamida.
9. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual la enfermedad autoinmune está seleccionada del grupo compuesto por: diabetes mellitus de tipo I, artritis reumatoidea, esclerosis múltiple, gastritis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad de Base-dow, enfermedad de Bechterew, psoriasis, miastenia gravis, hepatitis autoinmune, APECED, síndrome de Chrug-Strauss, colitis ulcerosa, glomerulonefritis, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis de Hashimoto, liquen sclerolus, lupus eritematoso sistémico, PANDAS, fiebre reumática, sarcoido-sis, síndrome de Sjorgren, síndrome de Stiff-Man, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, vitíligo, autoinmunoenteropatía, síndrome de Goodpasture, dermatomiositis, polimiositis, alergia auto-inmune, asma y reacción autoinmune después de trasplantes de órganos.
10. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el medicamento presenta un portador farmacéuticamente aceptable.
1 1. Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune, que presenta la muteina de hlL-2 o una parte de ella según el uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Uso de una muteina de interleuquina-2 humana (muteina de hlL-2) o una de sus partes, que está numerada respecto de hlL-2 de tipo salvaje y que presenta una sustitución de aminoácido en al menos una de las posiciones 20, 88 ó 126, para preparar un agente para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual por sustitución en la posición 88 se intercambia una asparagina por una arginina (hlL-2-N88R), o por una glicina (hll_-2-N88G) o por una isoleucina (hIL— 2— 88I).
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el cual por sustitución en la posición 20 se intercambia un ácido aspártico por una histidina (hlL-2-D20H), o por una isoleucina (hlL-2-D20H), o por una tirosina (hlL-2-D20Y).
15. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 14, en el cual por sustitución en la posición 126 se intercambia una glutamina por una leucina (hlL-2-Q126L).
16. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 15, en el cual la muteína de hlL-2 o su parte presenta al menos otra sustitución de aminoácido en cualquier posición, salvo las posiciones 20, 88 ó 126, de modo que la muteína de hlL-2 luego sustituido o su parte luego sustituida presenta una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80%, con preferencia en el 85%, con mayor preferencia en el 90%, con mayor preferencia en el 95%, con máxima preferencia en el 99% a la secuencia de aminoácidos de la muteína de hlL-2 o de su parte, que no está luego sustituida respecto de hlL-2 de tipo salvaje, salvo en al menos una de las posiciones 20, 88 6 126.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, que es en el caso de la posterior sustitución en al menos una posición cualquiera, salvo las posiciones 20, 88 ó 126, se trata de una sustitución de aminoácido conservativa.
18. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 17, en el cual el agente es una composición farmacéutica y presenta un portador farmacéuticamente aceptable.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el cual la composición farmacéutica presenta adicionalmente un inmunosupresor.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación 19, en el cual el inmunosupresor está se-leccionado del grupo compuesto por: glucocorticoide, incluyendo decortina, prednisol; azatioprina; ciclosporina A; micofenolatmofetilo; tacrolimus; globulina anti— T— I i nf ocítica , anticuerpos anti-CD3, incluyendo muromonab; anticuerpos anti-CD25, incluyendo basiliximab y daclizumab; anticuerpos anti-TNF-a, incluyendo infliximab y adalimumab; azatioprina; metotrexato; ciclosporina; sirolimus; everolimus; fingolimod; cellcept; mifortic; ciclofosfamida.
21. Agente para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo, que presenta la muteína de hll_-2 o una parte de ella según el uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 20.
22. Método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune en un organismo, que presenta las siguientes etapas: (a) provisión de una muteína de interleuquina-2 humana (muteína de hlL-2) o una de sus partes, (b) administración de la muteína de hlL-2 o de su parte en un organismo, y (c) repetición de las etapas (a) y (b)si fuera necesario, en el cual en el caso de la muteína de hlL-2 o su parte se trata de la muteína de hlL-2 o su parte según el uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10.
23. Procedimiento para la formación de células T reguladoras (TReg) en un organismo, que presenta las siguientes etapas: (a) provisión de una muteína de interleuquina-2 humana (muteína de hlL-2) o una de sus partes, (b) administración de la muteína de hlL-2 o de su parte en un organismo, y (c) repetición de las etapas (a) y (b) si fuera necesario, en el cual es en el caso de la muteína de hlL-2 o su parte se trata de la muteína de hlL-2 o su parte según el uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 20.
24. Método para la formación de células T reguladoras (TReg) in vitro, que presenta las siguientes etapas: (a) provisión de una muteína de interleuquina-2 humana (muteína de hlL-2) o una de sus partes, (b) puesta en contacto de la muteína de hlL-2 o de su parte con glóbulos rojos mononucleares periféricos (PBMCs), y (c) repetición de las etapas (a) y (b) si fuera necesario, donde en el caso de la muteína de hlL-2 o su parte se trata de la muteína de hlL-2 o su parte según el uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 12 a 20.
25. Método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad autoinmune en un organismo, que presenta las siguientes etapas: (a) provisión de una muteína de interleuquina-2 humana (muteína de hlL-2) o una de sus partes, (b) puesta en contacto de la muteína de hlL-2 o de su parte con glóbulos rojos mononucleares periféricos provenientes de un primer organismo (PBMC), (c) incubación de la muteína de hlL-2 o de su parte con los PBMC, para obtener una población celular que presenta las células T reguladoras (TReg), y (d) introducción de la población celular en un segundo organismo, en el cual en el caso de la muteína de hlL-2 o su parte se trata de la muteína de hll_-2 o su parte según el uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10.
26. Método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual en el caso del primer organismo y el segundo organismo se trata de organismos idénticos.
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