MX2010011874A - Astrovirus aviar novedoso. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a campos de virología e inmunología veterinaria. En particular la invención se refiere a un Astrovirus aviar novedoso; a anticuerpos o fragmentos de los mismos en contra del virus novedoso; a preparaciones antigénicas, proteínas y moléculas de ADN del Astrovirus aviar novedoso; a vacunas del virus novedoso o sus preparaciones antigénicas, proteína, o ADN; a métodos para la fabricación de estas vacunas y a kits de diagnóstico.

Description

ASTROVIRUS AVIAR NOVEDOSO Descripción de la Invención La presente invención se refiere a campos de virología veterinaria e inmunología. En particular la invención se refiere a un astrovirus aviar novedoso; a anticuerpos o fragmentos de los mismos en contra del virus novedoso; a preparaciones antigénicas, proteínas y moléculas de ADN del Astrovirus aviar novedoso; a vacunas del virus novedoso o sus preparaciones antigénicas, proteínas o ADN; a métodos para la elaboración de éstas vacunas y kits de diagnóstico.

Los astrovirus son virus pequeños, redondos, no desarrollados que tienen un solo genoma de ARN de sentido positivo. La mayoría de los astrovirus han sido relacionados porque causan un tipo de enteritis, que se desarrolla en diarrea, vómito, mala absorción, malestar general y retraso en crecimiento. La infección puede ser letal en humanos o animales que son menos fuertes, tales como individuos jóvenes, maduros o inmunocomprometidos. Ver: Matsui y Greenberg (en: Fields virology, 3ra edición., B. Fields y col., ISBN: 781702534, capítulo 26), y: Moser y Schultz-Cherry (2005, Viral Immunology, vol. 18, p.4-10).

Asimismo, la severidad de patología inducida por Astrovirus puede variar resultando de diferencias en virulencia entre las especies de Astrovirus o las cepas mismas. Esto ha creado la creencia que algunos de los Astrovirus actúan como patógenos secundarios, los cuales causan únicamente una enfermedad sub-clínica, mientras las síntomas clínicas completas de la enfermedad se manifiestan únicamente cuando hay una causa adicional de enfermedad de otro patógeno.

El mecanismo por el cual se obtiene una infección en contra de Astrovirus no es tampoco completamente claro; anticuerpos que neutralizan el virus parecen jugar una parte de la defensa y memoria inmunológica, pero no son probablemente los únicos efectores de una respuesta inmune en contra de la infección con Astrovirus. Esto es revisado por M. Koci (200.5, Viral Immunology, vol. 18p. 11-16).

Los astrovirus han sido detectados en el mundo entero y fueron aislados de una amplia variedad de animales. A su vez, en contra de las especies de Astrovirus que infectan un cierto tipo de animal objetivo, algunos serotipos han sido descubiertos. De manera taxonómica, la familia Astroviridae es dividida en dos géneros principales, los Astrovirus mamíferos; Mamastrovirus y los Astrovirus aviares; Avastrovirus. Al momento el género Avastrovirus comprende las especies formalmente reconocidas: Virus Nephritis Aviar 1 y 2 (ANV1, 2)(de los pollos), y el Astrovirus 1 y 2 de los pavos (TAstvl, 2).

Algunos Astrovirus aviar adicional han sido extractos de los patos, pollos, avestruces y pavos. Por ejemplo, el astrovirus 2 de pollo (CAstV2) ha sido descubierto por Baxendale y Mebatsion (2204, Avian pathology, vol. 33, P. 364-370); y en la solicitud de patente internacional WO2004/027053) y Todd y col., describió un CAstV3 (WO 2007/077464), el cual es relacionado muy de cerca con CAstV2. Estos Astrovirus todavía no han sido formalmente clasificados, como fue revisado por Koci y Schultz-Cherry (2002, Avian Pathology vol. 31, p. 213-227).

Los Astrovirus son muy estables en el ambiente, por ejemplo pueden resistir a los solventes de lípidos comunes y detergentes, tienen una tolerancia amplia al pH, y son comparativamente termoestables. Estos, combinados con su alta inefectividad y fácil transmisión por vía fecal-oral, explican porque los Astrovirus o anticuerpos en contra de los mismos pueden encontrarse en muchos humanos y animales en todo el mundo.

La clasificación y nombramiento de estos pequeños virus de ARN han sido sujetos a cambio frecuente, cuando la actualización fue requerida para ajustarse a la información experimenta. Por ejemplo, el Astrovirus de pato (DAstV) fue anteriormente clasificado como un virus Picorna, y fue originalmente llamado virus de hepatitis de pato de tipo II, debido a que causa hepatitis. ANV1 fue anteriormente descrito como Picornavirus, en particular un Enterovirus, pero fue re-clasificado a Astrovirus (Imada y col., 2000, J. Virology, vol. 74, p. 8487-8493). ANV1 es también llamado: Astrovirus 1 de pollo (CAstV) y causa nefritis.

La re-clasificación de estos virus fue llamada por la disponibilidad de nueva información en la secuencia y organización de su genoma viral. Particularmente para Astroviridae, ha sido mostrado que las características físicas y bioquímicas a menudo no satisfacen para diferenciar el Astroviridae de otros así llamados "virus redondos pequeños", o "virus similares a enterovirus" tales como Picorna, Calici-, o Hepeviridae (virus similar a Hepatits E), o aún virus de ARN empacados tales como Reo-, Rota-, o Coronavirus que causan síntomas de enfermedad que se parecen mucho a los Astrovirus. Esto es a causa de que los resultados de estas características varían con el método y las condiciones utilizadas. Por lo tanto aquellos que con son bastante consistentes para hacer la justa determinación.

Por otro lado, la característica biológica molecular tales como genotipado, en combinación con característica inmunológíca es detallada y reproducible para asignar un microorganismo al propio grupo taxonómico (Van Regenmortel y col., 2000, en Virus Taxonomy, 7mo reporte de ICTV. Academic Press, New York). Por lo tanto idealmente estas determinaciones son basadas en secuenciado de nucleótido, ensayos de reacción de cadena de polímerasa (PCR) y ensayos de tipología serológica.

El genoma de ARN del Astroviridae es ampliamente aproximadamente 7kb en medida, con un organización de genoma que es típica para esta familia de virus, a ver: Jiang y col., (1993, PNAS-USA, vol. 90, p. 10539-10543) y Koci y col. (2000, J. of Virology, vol. 74, p. 6173-6177). De acuerdo con el presente entendimiento, el genoma incorpora tres marcos de lectura abierta claramente reconocible (ORF, por sus siglas en inglés), de 5' a 3': ORF 1a: es de aproximadamente 3 kb en medida, codifica una proteína no estructural que tiene un motivo de proteasa de serina.

ORF 1b: es de aproximadamente 1.5 kb en medida, parcialmente se solapa con ORF1a y codifica una polimerasa de ARN dependiente del ARN no estructural.

ORF 2: codifica las proteínas virales estructurales, a través del ARN subgenómico de aproximadamente 2 kb. La poliproteína expresa es probablemente clivada en partes más pequeñas antes del conjunto viral y comprende la proteína cápsido- o de recubrimiento.

De los tres ORF, el ORF1b tiene la secuencia de nucleótido mejor conservada en comparación con las secuencias de nucleótido de astrovirus que son públicamente disponibles, y ORF2 es el ORF más variable en secuencia.

Algunos problemas de enfermedad en particular fueron observados entre 1987 y el presente, en operaciones con aves de corral en los Países Bajos, Alemania y Emiratos Árabes Unidos, con pollos y pavos sufriendo de diarrea, reducción en conversión de comida y crecimiento, así como problemas con hinchamiento y dolores de las coyunturas y tendones de las piernas. Estos problemas fueron encontrados en broiler, criadores y aves de tipo tapa, de varias edades, y de diferentes granjas que no tienen conexión mutua aparente.

La renguera fue observada en aves en su primera semana de edad, hasta algunos meses de edad. Los animales presentaros coyunturas (tobillo) hinchadas y el eje del tendón de la pierna baja, ambos llenos de un líquido ligeramente viscoso y síntomas de artritis. Una reducción del uso de alimento y el rango de crecimiento fueron observados en estas aves, pero como resultado de los problemas locomotores. En los peores casos las aves no fueron más capaces de moverse y de esta manera conseguir alimento o líquido, resultó en mortalidad. Estas anormalidades en las piernas fueron más preeminentes en aves de tipo broiler más pesados, sin embargo el daño económico sostenido fue considerable en todos los tipos de aves.

Aún más impacto tuvo la diarrea que fue observada, principalmente en aves más jóvenes, pero también en aves de edad de poner aves. Los síntomas variaron desde indigestión a enteritis claro, y resultó en reducción o conversión de alimento; depresión de crecimiento o aún pérdida de peso; caída en la producción de huevo ("caída de huevo"); incremento en números de huevos de mala calidad; y mortalidad.

En algunas granjas los problemas fueron observados en algunos años, resultando en figuras de producción baja sostenida son causa definida.

Después de investigaciones post mortem, en algunos casos las partes del cuerpo las partes del cuerpo diferentes a los intestinos o coyunturas de piernas fueron también encontradas ser afectadas, tales como las mostradas por erosión de mollejas o hinchamiento del hígado.

Para detectar la causa de estos síntomas, aspectos de manejo y dieta fueron investigados pero no pudieron ser relacionados con los problemas observados en estos casos. Los patógenos fueron investigados que pudieron ser responsables, en particular una infección por Reovirus, puesto que el virus está bien conocido para causar mala absorción y problemas de unión. Sin embargo, a pesar del uso de una variedad de ensayos, en muchos casos no se pudo detectar ningún Reovirus.

Algunos otros patógenos fueron también investigados sea rutinario o específicamente siendo conocidos a causar problemas similares, tales como bacterias: Salmonella, Mycoplasma, Haemophilus y Pasteurella; y los virus; Adenovirus, virus de Bronquitis infecciosa (IBV), virus de Enfermedad de Newcastle (NDV) Síndrome de Caída de Huevo (EDS) y virus de influenza aviar (AIV).

Hasta ahora, ningún agente causativo pudo ser relacionado con problemas de piernas o intestinales que fueron observados, a pesar de su severidad, los problemas para el bienestar del animal, y el rendimiento malo resultante de las operaciones de aves de corral.

Posteriormente exista una necesidad de identificar un agente conectado a los síntomas de enfermedad y proporcionar las vacunas y diagnósticos, que proporcionan una prevención de la enfermedad e identificación del agente causativo.

Sorprendentemente un nuevo virus ha sido encontrado en pollos y pavos que sufren de enfermedades intestinales y locomotoras. El virus podría ser extracto de aves de enfermedad de varias edades, tipos y orígenes, ambos de coyunturas y tendones así como de varios órganos internos. El virus extracto a su vez indujo síntomas similares de enfermedad después de la infección de animales de prueba sanos, y podrían ser re-extractos de los animales de prueba enfermados, por lo tanto cumpliendo con los postulados de Koch.

El nuevo virus puede ser utilizado para desarrollar ensayos diagnósticos y vacunas para detectar y combatir el virus y los problemas de la enfermedad que causa en aves de corral, en particular enfermedad de coyunturas y tendones así como del tracto gastrointestinal.

El virus novedoso fue analizado en un número de maneras, y fue sorprendentemente identificado como un Astrovirus. A causa de su prevalencia en pollos y pavos es calificado tentativamente como un Astrovirus aviar.

Entre muchas otras características, el hecho de que el nuevo virus como se describe no es desarrollado seguido de los resultados de dos extracciones consecutivas con cloroformo, después de que la muestra de virus extraída fue capaz de causar un efecto patogénico específico en huevos SPF de pollo embrionados.

La presencia de un genoma de ARN en el nuevo virus seguido del hecho que el ácido nucleico utilizable para análisis posterior podría obtenerse después de la extracción de ARN y RT-PCR, no después de aislamiento de ADN y PCR regular.

Sorprendentemente, los parientes más cercanos (aún distinguible) fueron encontrados ser virus de tipo ANV1, por lo tanto los Astrovirus aviar novedoso aquí descrito representa un grupo novedoso de virus de nefritis aviar, tentativamente clasificado como virus ANV3.

Sin embargo, los inventores han encontrado sorprendentemente un número de características que distingue los Astrovirus aviar novedoso aquí descritos e ANV1 y virus (Astro-) y únicamente caracteriza los diferentes extractos del Astrovirus aviar novedoso como perteneciendo a un grupo novedoso y separado del mismo.

La característica principal se refiere a la presencia de una secuencia de nucleótido específico que es identificable por análisis de secuencia de nucleótido y ensayo de reacción en cadena de polimerasa.

Los síntomas patológicos distintos inducidos después de infección de embriones fueron también observados. Las diferencias inmunológicas específicas fueron detectables por serotipo utilizando VN-o ensayos IFT. Todo esto será descrito con los resultados experimentales y detalles.

La invención se refiere a un Astrovirus aviar novedoso extracto que tiene una región genómica de marco de lectura abierta (ORF)1a, caracterizado porque el ORF1a del Astrovirus aviar, cuando se compara con el ORF1a del virus 1 de nefritis aviar, contiene un inserto de 12 nucleótidos, dicho inserto siendo ubicado entre nucleótidos que corresponden a los nucleótidos numerados 2485 y 2486 de SEC ID NO: 1.

Los organismos "aviares" preferidos son aves de corral; organismos aviares más preferidos son seleccionados del grupo que consiste de pollo, pavo, pato y ganso. Los más preferidos son los pollos.

El término "Astrovirus" indica la relación del grupo de nuevos virus de acuerdo con la invención a virus que son actualmente descritos y/o clasificados como perteneciendo al a familia taxonómica del Astroviridae. Sin embargo, el experto en la técnica realizará que la clasificación taxonómica puede cambiar con el tiempo como nuevas perspicacias podría llevar a reclasificación en nuevos grupos taxonómicos. Sin embargo, puesto que no se alteran las características del virus de acuerdo con la invención pero únicamente su clasificación, estos organismos re-clasificados estar dentro del alcance de la invención.

En particular la invención abarca todos los virus sub-clasificados del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención en una sub-especie, cepa, extracto, genotipo, serotipo, variante o subtipo y similares.

Por consiguiente, para la invención, un "Astrovirus" es un virus que tiene las características de un virus clasificado como un Astrovirus. Estar características se relacionan, con ejemplo, con las características moleculares, bio-químicas y biológicas; por ejemplo tener un genoma de ARN ramificado de sentido positivo que comprende ORF identificable como 1a, 1b y 2; siendo un virión no desarrollado de aproximadamente 28-30 nm; y que causa una enteritis.

El término "región genómica" es significado para indicar una parte del material genético del Astrovirus aviar novedoso de acuerdo con la invención. Una tal región consistirá de un ácido nucleico; en el caso del Astrovirus aviar novedoso de acuerdo con la invención, el ácido nucleico es ARN. El genoma del Astrovirus aviar novedoso de acuerdo con la invención comprende, como lo hacen todos los Astroviridae, regiones reconocibles y que corresponden a ORF 1a, 1b y 2.

Sin embargo, fue sorprendentemente que el Astrovirus aviar novedoso tiene algunos nucleótidos en su región genómica ORF 1a de ANV1 o de cualquier otro tipo de Astrovirus (aviar). Estos nucleótidos son presentes en la forma de una unión lineal y continua de 12 nucleótidos, y cuando se compara con la secuencia ORF 1a de ANV1 representa un inserto en esta región. El inserto de 12 nucleótidos fue presente en la ORF de todos los extractos probados del grupo de Astrovirus aviar novedosos aquí descritos.

La ubicación en donde el inserto de 12 nucleotidos es presente en el ORF 1a de los extractos del Astrovirus aviar novedoso aquí descrito, es indicado por referencia a la numeración como se describe para la secuencia genómica de la cepa de referencia ANV1, que fue descrita por Imada y col., (2000, J. of Virology, vol. 74, p. 8487-8493). La secuencia ADNc de la secuencia genómica de la cepa ANV1 es también disponible de la información de nucleótido interno de los Institutos Nacionales Americanos de la Salud, conocidos como GenBank, bajo número de acceso: AB033998, y aquí se representa como SECX ID NO: 1.

Para todos los extractos de los Astrovirus aviares novedosos de acuerdo con la invención, el inserto de 12 nucleotidos en ORF 1a fue ubicado entre los nucleotidos que corresponden a los nucleotidos numerados como 2485 y 2486 de la SEC ID NO: 1.

Actualmente no se conoce, o como, este inserto de 12 nucleotidos en ORF 1a del Astrovirus aviar novedoso de acuerdo con la invención, que no está presente en ORF 1a de ANV1, influencia el comportamiento de este Astrovirus aviar novedoso. Sin ser relacionado con ninguna teoría, los inventores asumen que el hecho de que el inserto existe de 12 nucleotidos, 4 tripletes que mantienen el marco de traslación del intacto ORF1a, hace que los 4 aminoácidos adicionales codificados sean incorporados en las proteínas no estructurales que son expresados del ORF 1a. Es muy posible que esto influencie el comportamiento pato-biológico de los virus, por ejemplo su virulencia y su capacidad para causar enfermedad del intestino así como de piernas, coyunturas y tendones.

Sin embargo, el hecho de que estoy 12 nucleótidos son presentes en la región genómica ORF 1a del Astrovirus aviar novedoso aquí descrito, pero no en el ORF 1a de ANV1 u otros Astroviruses (aviares), proporciona una marcador positivo para este grupo novedoso de virus.

Como bien se conoce en la técnica, un marcador genético es una característica de un material genético de organismos, situado en una ubicación genómica particular, que es útil para hacer una cierta distinción de correlación, y es detectable por medios técnicos. Cuando una característica es presente en un grupo para ser identificado, es un marcador genético "positivo" para este grupo.

La secuencia de nucleótido del inserto de 12 nucleótidos que caracteriza los Astrovirus aviares novedosos de acuerdo con la invención, no es idéntico para todos los extractos del Astrovirus aviar novedoso aquí descrito, sin embargo la medida y ubicación fueron idénticas. El consenso de la secuencia de nucleótido del inserto de 12 nucleótido es: 5'TCYGGDMARYYT-3' , representada como SEC ID NO. 2.

Por consiguiente, en una modalidad preferida la invención es caracterizada porque el inserto de 12 nucleótidos tiene una secuencia de ácido nucleico como se presenta en la SEC ID NO: 2.

El experto en la técnica sabrá que la secuencia de la SEC ID NO: 2 es la secuencia de cebador llamada "desnaturalizada", indicando que hay posiciones (aquí, Y, D, M y R), en donde puede ser presente un número de nucleótidos. El código comúnmente utilizado para indicar bases desnaturalizadas es el código UlPAC (publicada en Biochem. J., 1985, vol. 229, p. 281-286), en donde R = G o A; Y=T o C; M=A o C; K=G o T; S=G o C; W=A o T; H=A, C o T; B = G, T o C; V=G, C o A; D = G , A o T; y N = G , A, T o C.

Para el Astrovirus aviar novedoso aquí descrito, la presencia de este marcador genético detectable permite la identificación del virus novedoso y su grupo novedoso por detección por ejemplo, a través del secuenciado de ADN o reacción en cadena de polimerasa.

El secuenciado de ADN es una técnica muy bien conocida; protocoles estándar y equipo, por ejemplo, para secuenciado automatizado de alta velocidad son ampliamente disponibles. Los protocoles más comunes utilizan "secuenciado de ciclo" con base en reacción en cadena de polimerasa, seguido por la electroforesis de alta definición.

Para el secuenciado de ácido nucleico de virus de ARN tales como Astroviridae, el ácido nucleico para ser investigado necesita estar en forma de ADN de copia (ADNc), como el secuenciado de ARN no es factible. Para la preparación de ADNc muchos protocoles estándar y kits comerciales son disponibles. Estos protocoles utilizan una enzima de transcriptasa inversa. Comúnmente un cebador es utilizado para iniciar el proceso de copiado.

Un ejemplo de un cebador apropiado para la reacción RT es el oligonucleótido de ADN aquí presentado como SEC ID NO: 3, siendo: 5'-TCG WTS CTA CYC-3'. Los inventores se refieren a este cebador como cebador 17.

Este cebador hibridiza la región 3' del genoma de muchos Astrovirus aviares, empezando con el nucleótido que corresponde al número de nucleótido 6731 de SEC ID NO: 1, y procede en dirección inversa.

En la Figura 1 es muestra una alineación múltiple de la secuencia de ADNc de una sección de ORF 1a de un número seleccionado de extractos de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención. Las mismas son alineadas a la parte correspondiente del genoma de un virus de referencia ANV1 , como se representa en la SEC ID NO: 1. Como es claramente visible en el área encajada, todos los extractos posee una región de 12 nucleótidos, que no está presente en ANV ORF 1a. La SEC ID NO. de la secuencia de ADN de ORF 1a de los extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención sin enlistadas en la Tabla 1.

Similarmente, la Figura 2 muestra una alineación múltiple de las secuencias de aminoácido putativo, como es preparado por la traducción de computadora de las secuencia de ADNc enlistadas en la Figura 1. Como es visible en el área encajada, la proteína codificada por ORF de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención contiene 4 aminoácidos, que no son presentes en la proteína codificada por ORF 1a de ANV1. Las SEO ID NO. de la secuencia ORF 1a traducida de los extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención son enlistadas en la Tabla 1.

Con relación a los extractos de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención: un gran número de extractor de campo fueron recolectados con el tiempo de los pollos y pavos que sufren de enfermedad de piernas y/o intestinal como se describe anteriormente. De estos extractos muchos fueron analizados, lo cual llevo a la invención del grupo novedoso de los Astrovirus aviares como aquí se describe. Sin embargo, solamente una selección de todos los extractos analizados son aquí presentes, para definir el Astrovirus aviar novedoso en el contexto de la variación que ocurre en este grupo.

La Tabla 1 presenta una descripción de los extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, que aquí son descritos. Asimismo la Tabla 1 enlista la SEC ID NO. del ADNc y las secuencias de proteína putativa de ORF 1a, 1b y 2 de una selección de extractos.

Tabla 1: Características de una selección de extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención; asimismo SEC ID NO. de regiones de ADNc secuenciado ("nt") y proteínas codificadas putativas ("aa"). "nt"=secuencia de nucleótido; "aa"=secuencia de aminoácido; "-"=no conocido Un extracto de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención puede obtenerse de aves que sufren de problemas intestinales o de pie tomando una muestra de uno o más órganos, o de uniones o tendones de los pies. Las muestras pueden ser homogenizadas cuando se requieren o por ejemplo pueden mezclarse con una solución salina apropiada, preferiblemente que contiene antibióticos.

Para amplificar el título viral de estos extractos, diferentes sustratos pueden utilizarse, tales como líneas celulares aviares o huevos aviares embrionizados. Cuando se utilizan huevos, la suspensión puede ser inoculada en y cultivada en huevos aviares embrionados. Las diferentes vías de inoculación son posibles, tales como membrana corio-alantóica (CAM), o en el saco de la yema, o la cavidad de fluid alantóico. Preferiblemente, las primeras varias rondas de inoculación son en el saco de la yema, y posteriormente (si se requiere) puede ser en el fluido alantoico. Aproximadamente 5-7 días de edad, los huevos SPF de pollo embrionados pueden utilizarse. Estas técnicas son muy bien conocidas por los expertos en la técnica, y los huevos de pollo SPF de calidad y edad apropiada son comercialmente disponibles, por ejemplo, de Spafas ® o Lohmann®.

Después de incubación por 2-7 días bajo condiciones apropiadas, el embrión, CAM o (preferiblemente) el fluido alantoico puede ser recolectado. Si se requieren más rondas de amplificación en huevos pueden llevarse a cabo, por inoculación en el saco de la yema o el fluido alantoico. Finalmente el fluido alantoico puede ser recolectado que contiene grandes cantidades del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Para secuenciado de reacción en cadena de polimerasa de ambas cadenas de una parte representativa de ORF 1a los siguientes cebadores pueden ser convenientemente utilizados: SEC ID NO: 28: 5'-AAA GGK AAG ACD ARR RAC MG-3', y SEC ID NO: 29: 5'-TCG CCT TCT GGA AGG TCT TCA-3'. Los inventores se refieren a aquellos cebadores de secuenciado como cebadores F-ll y R- 11-3 respectivamente.

SEC ID NO: 20 h ibrid iza empezando en los nucleótidos que corresponden a nt2171 y posteriormente de ANV1 (SEC ID NO: 1), SEC ID NO; 29 hibridiza a nucleótidos que empiezan en nt 2640 de SEC ID NO: 1, y procede en dirección inversa (ver Tabla 4). De esta manera la región de genoma de ORF 1a del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención que comprende los 12 nucleótidos no presente en ANV1 es cubierta por la parte de ORF 1a que es secuenciada.

Para análisis de computadora de las secuencias de ADN determinada, las mismas son recortadas de manera que no contienen las secuencias desnaturalizadas de los cebadores mismos. Asimismo las secuencias comparadas necesitan ser de longitud igual para alcanzar las alineaciones representativas. Así, las alineaciones se deben de hacer de longitud completa de las secuencias recortadas. Esto significa, por ejemplo, en el caso de utilizar los cebadores SEC ID NO: 28 y 29, que la longitud de secuencia para ser comparada es de aproximadamente 400-425 nucleótidos.

Un programa de computadora conveniente para estar manipulaciones y alineaciones es Clone Manager™ (por: Scientific and Educational software™), alternativamente programas son disponibles por el internet: "ClustalW para múltiples alineaciones, y "Traducir" para tradu8cciones, ambos accesibles a www.expasy.org o los programas "Blast" en www.ncbi.nlm.nih.gov. Preferiblemente los parámetros de marcación predeterminados son utilizados.

El secuenciado de ADNc utilizando cebadores SEC ID NO: 28 y 29 se hizo para muchos secuenciados para muchos extractos de los Astroviruses aviares de acuerdo con la invención. Una selección de las secuencias de nucleótido recortadas, resultantes son presentadas aquí como SEC ID Nos: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26, como se representa en la Tabla 1.

Estas secuencias fueron alineadas una a la otra, utilizando como referencia la secuencia de un extracto de un pollo, numerado 161319, al cual los inventores se refieren como al "extracto 19". Asimismo, varias secuencias de ADN de las partes correspondientes de ORF 1a de otros Astrovirus disponibles en GenBank fueron alineados, por ejemplo ANV1 (AB033998, SEC ID NO: 1), Astrovirus 1 de pavo (TAstVI )(Y15936), Astrovirus 2 de pavo (AF206663), Astrovirus de oveja (Y15937), Astrovirus de visón (AY179509), y astrovirus humano (Z25771); entre guiones son los números de acceso de GenBank respectivos.

De estos otros Astrovirus de secuencias ORF 1a, únicamente ANV1, en particular la parte de nt 2213-2607 de la SEC ID NO: 1, tuvo una identidad de secuencia que fue significante, que significa un porcentaje de identidad de secuencia de nucleótido de aproximadamente 50%. De los otros Astrovirus restantes, únicamente TAstVI (GenBank acc. nr: Y15936) tuvo una secuencia detectable, pero difícilmente significante en la parte de los nucleótidos nr. 2450-2856. Esto se representa en la Tabla 2.

Tabla 2: Lista de identidad de secuencia de nucleotido de porcentaje entre SEC ID NO: 4 (siendo una parte de ORF 1 del extracto 19) y la secuencia de la parte correspondiente de ORF 1a de otros extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, así como de otros Astrovirus.

Un árbol dendrográfico de los resultados de estas alineaciones de secuencia de nucleótido es presentado en la Figura 3.

Por consiguiente, fue sorprendentemente encontrado que el grupo de Astrovirus aviar novedoso de acuerdo con la invención se queda fuera de los demás Astrovirus, aviares o de mamíferos en donde comparten una identidad de secuencia de nucleótido de 88% o más cuando se compara con una región de secuencias de ADN de ORF 1a que corresponden a la SEC ID NO: 4.

Por consiguiente, en una modalidad preferida, la invención se refiere al Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, caracterizado porque ORF 1a del Astrovirus aviar comprende una región que tiene una identidad de secuencia de nucleótido de al menos 88% con la SEC ID NO:4.

Más preferiblemente, la invención se refiere a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, caracterizado porque el ORF 1 1a del Astrovirus aviar comprende una región que tiene una identidad de secuencia de nucleótido de al menos 89% con SEC ID NO: 4, aún más preferiblemente identidad de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% en la orden de preferencia.

Seguido a la SEC ID NO: 4, cualquiera de las secuencias de nucleótido ORF 1a parcial descrito en SEC ID NO: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26, pueden servir para caracterizar el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención en otras modalidades preferidas.

Similar a la alineación múltiple de las secuencias de nucleótido de ORF 1a como se presenta en la Tabla 2, las alineaciones pueden hacerse de las secuencias de aminoácido putativo de las secuencias de ácido nucleico recortadas de la Tabla 2, la SEC ID Nos: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26. Las secuencias de aminoácido resultante traducías por computadora son aquí presentadas como SEC ID NO: 5, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 , 25 y 27. La secuencia de referencia es SEC ID NO: 5, la secuencia de aminoácido putativo de parte de ORF 1a del extracto 19. La alineación también se hizo utilizando el programa Aling + , alineando en la longitud completa de SEC ID NO: 5. Los resultados son presentados en la Tabla 3.

Tabla 3: Lista de identidad de secuencia de aminoácido de porcentaje entre SEC ID NO: 5 (siendo una traducción de una parte de ORF 1a del extracto 19), y la secuencia de la parte correspondiente de ORF 1a de otros extractos de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, así como ANV1 y TAstV2.

La alineación de aminoácido detallada es representada en la Figura 2.

El resultado del análisis de secuencia de aminoácido, muestra un resultado comparable a los resultados en la Tabla 2: las secuencias de aminoácido de los extractos de Astrovirus aviar de acuerdo con la invención son más relacionadas entre las mismas, que cuando se compara con los otros astrovirus aviares. Los porcentajes de identidad de secuencias de aminoácido de varios extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención a la SEC ID NO: 5, son entre 93 y 99%, mientras la identidad a ANV1 es menos, en 88%.

Por consiguiente, en una modalidad preferida, la invención se refiere a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, caracterizado porque ORF 1a del Astrovirus aviar codifica una secuencia de aminoácido que comprende una región que tiene una identidad de secuencia de aminoácido de al menos 93% con SEC ID NO: 5.

Más preferiblemente, la invención se refiere a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, caracterizado porque ORF 1a del Astrovirus aviar codifica una secuencia de aminoácido que comprende una región que tiene una identidad de secuencia de aminoácido de al menos 94% con SEC ID NO: 5, aún más preferiblemente identidad de 95, 96, 97, 98, 99 o 100%), en la orden de preferencia.

Seguido a la SEC ID NO: 5, cualquiera de las secuencias de nucleótido traducidas putativamente de ORF 1a parcial descrita en la SEC ID Nos: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27, pueden servir para caracterizar el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención en modalidades preferidas posteriormente.

Además del secuenciado de nucleótido y alineación, el marcador genético positivo de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención pueden identificarse utilizando una prueba de reacción en cadena de polimerasa para detectar la presencia de los 12 nucleótidos en la región ORF 1a de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, que no son presentes en el ORF 1a del ANV1, por ejemplo en muestras de aves que sufren de enfermedad intestinal o locomotor.

Por consiguiente, en una modalidad posteriormente preferida, el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención es caracterizado en forma que el ORF 1a del Astrovirus aviar un producto de reacción en cadena de polimerasa de aproximadamente 260 nucleótidos puede ser reproducido en un ensayo de reacción en cadena de polimerasa utilizando un set de cebadores representados en la SEC ID NO: 30 y 31.

Los cebadores de reacción en cadena de polimerasa para utilizarse son: SEC ID NO: 30: 5'-GTY CTY ACC GAR GAR GAR TAY C-3' SEC ID NO: 31; 5'-AAD GTT ATY CTC CTA RGB TKH C-3' La invención se refiere a estos cebadores como cebadores 29 y 30, respectivamente. Estos cebadores hibridizan a nucleótidos que corresponden al nucleótido ANV1 (SEC ID NO:1) número 2252 y posterior, y al número de nucleótido 2499 y procede en inverso...

El producto de reacción en cadena de polimerasa que fue producido fue visible en un gel como una banda de aproximadamente 260nucleótidos (esto incluyendo la longitud de los cebadores mismos). Esta banda es producida únicamente cuando el material principiante contiene el ADN que comprende la región ORF 1a de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, puesto que únicamente comprende los 12 nucleótidos que no son presentes en ORF 1a ANV1. Una representación gráfica de la unión específica de cebadores SED ID NO: 31 y 31, en relación a la ubicación de una región de 12 nucleótidos es presentada en la Figura 4.

En estos ensayos de reacción en cadena de polimerasa la especificidad y la sensibilidad es determinada por los cebadores PCT específicos utilizados, en particular por la secuencia de cebador y longitud. La optimización de selectividad y sensibilidad puede ser alcanzada por adaptación por condiciones de reacción y oscilación, tales como temperatura y duración de las etapas de reacción, como es bien conocido por un experto en la técnica.

Por lo tanto, y otras técnicas biológicas moleculares son explicadas en gran detalle en los libros de texto estándar como Sambrook & Russell: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2202, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubel y col., en: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc, NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach & G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (CSHL Press, ISBN 0879696540); y "PCR protocols", por J. Bartlett y D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).

Convenientemente, la reacción en cadena de polimerasa utilizando los cebadores SEC ID NO: 30 y 31 es combinada con, y directamente sigue la reacción RT requerida para producir ADNc; haciendo el ensayo combinado en un ensayo RT-PCR como se describe en los ejemplos.

Un ensayo RT-PCR como se describe, ha sido aplicado por los inventores en una variedad de muestras; los resultados positivos fueron obtenidos con muestras de los extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención; un resultado DE reacción en cadena de polimerasa "positivo" siendo la visualización de un producto de reacción de 260 pares bases después de electroforesis, en relación con las muestras de control negativo y positivo apropiadas. Sin embargo, las muestras RT-PCR preparadas de los Astrovirus aviares relacionados ANV1 y Astrovirus 2 de pollo (CAstV) fueron consistentemente encontrados ser negativos en la reacción de cadena de polimerasa utilizando los cebadores de SEC ID NO: 30 y 31.

Un ejemplo de un resultado de prueba de reacción en cadena de polimerasa es representado en la Figura 5, mostrando una foto de bromuro de Etidio manchado, iluminado por luz UV, gel de agarosa en el cual los productos fueron obtenidos de una reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores SEC ID NO: 30 y 31. Únicamente una muestra de extracto 19 reaccionado positivo, las muestras que contiene ANV1 o CAstV2 fueron negativas, como los controles fueron negativos.

Sorprendentemente, un efecto patológico remarcable y de impacto fueron observados después de la infección e incubación de huevos aviares embrionados con un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, los embriones afectados mostraron un manchado de rojo claro de las piernas y las alas. Esto nunca se ha observado o descrito anteriormente. Además, los embriones infectados mostraron otras características, pero menos distintivas; un manchado ligeramente rojo, edema del abdomen, y un hígado que fue considerablemente hinchado y después se volvió obscuro a un rojo obscuro/púrpura.

La patología específica fue observada aproximadamente 2-7 días antes de la infección de huevos de pollo SPF embrionados, y casi siempre llevo a una mortalidad del embrión, dependiendo del título de virus que fue inoculado.

Para comparación, la inoculación de ANV12 en huevos embrionados se hizo utilizando condiciones de prueba similares. ANV1 también indujo el hinchamiento del hígado, pero en este caso los hígados fueron aún más obscuros en color, y el color general del embrión fue rojo obscuro. Sin embargo, ANV1 nunca indujo la coloración rojo clara específica de las piernas y las alas que fue vista para los extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Por consiguiente, en una modalidad posteriormente preferida, el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención es caracterizado porque es capaz de inducir una coloración roja de las piernas y las alas de embriones de pollo, después de la inoculación en huevos SPF de pollo embrionados de aproximadamente 5-7 días de edad, seguido por la incubación por 2-7 días o aún más largo cuando es apropiado.

Como se describe, los huevos de pollo SPF embrionados y el equipo para su incubación son comercialmente disponibles, Típicamente, la incubación de huevos de pollo embrionados se hace a aproximadamente 35-39°C, en incubadoras de atmósfera humidificada. La patología específica fue observada aproximadamente 2-7 días después de la infección de huevos de pollo SPF embrionados y casi siempre lleva a mortalidad del embrión, dependiendo del virus que fue inoculado.

Para comparación, la inoculación de ANV1 en huevos embrionados fue hecha utilizando condiciones de prueba similares. ANV1 indujo el hinchamiento del hígado, pero en este caso los hígados fueron aún más obscuros en color, y el color general del embrión fue rojo obscuro.

Sin embargo, ANV1 nunca indujo la coloración rojo clara de las piernas o extremo de ala de pollo que fue vista para los extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Por consiguiente, en una modalidad preferida posterior, el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención es caracterizado porque es capaz de inducir una coloración roja de las piernas y de las puntas de ala de pollo de embriones de pollo, después de la inoculación en huevos SPF de pollo embrionados de aproximadamente 5-7 días de edad, seguido por incubación de 2- 7 días, o aún más largo cuando es apropiado.

Como está descrito,. Los huevos de pollo SPF embrionados y el equipo para su incubación son comercialmente disponibles. Típicamente, la incubación de huevos de pollo embrionados se hace a aproximadamente 35-39°C en incubadoras de atmósfera humidificada.

La inoculación puede ser por cualquier vía conveniente, por ejemplo CAM, saco de yema o vía alantoica.

Como apreciará un experto en la técnica, la coloración roja clara de las piernas y las puntas de las alas puede fallar para ser visibles en casos incidentales en donde, por ejemplo la cantidad de virus que fue inoculada es extremadamente baja (no permitiendo "la toma" del virus) o extremadamente alto (causando mortalidad antes de que la coloración podría ocurrir); o cuando los embriones no son de calidad suficiente para permitir la replicación viral. En general la coloración rojo claro específica puede ser observada después de la inoculación de entre 10 y aproximadamente 10?6 EID507huevo (EID50= 50% de dosis infecciosa de huevo).

Un extracto particular de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, nombrado extracto 19, fue posteriormente purificado y amplificado para servir como muestra de referencia y para ser depositado. El extracto fue purificado por dilución limitante en células de hígado de embrión de pollo (CEL). Cada vez la dilución más alta que aún inducía cape en células CEL fue pasada. Siguiente el virus purificado fue amplificado por tres vueltas de amplificación viral y en la cavidad alantoica de. huevos de pollo SPF embrionados. El fluido alantoico fue recolectado y almacenado congelado. Este virus purificado fue titulado en huevos SPF de pollo embrionados y fue encontrado tener un título de 6.1 Log10 EID50/ml. Este material fue secado por congelación en una solución de estabilizador estándar y almacenado a 20°C. La esterilidad fue confirmada. Las muestras de este material de virus fueron después depositadas en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" (CNCM del Institut Pasteur, en Paris, Francia, bajo el número de depósito: CNCM 1-3895, el 23 de Enero 2008.

Por consiguiente, en una modalidad preferida posterior, el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención es un virus como es depositado bajo el número CNCM 1-3895 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur en Paris, Francia.

Aunque la muestra que fue purificada, amplificada y depositada fue el extracto nombrado "extracto 19", sin embargo, uno de los extractos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, descrito en la Tabla 1, puede servir como muestra de referencia para el grupo novedoso de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención.

Para cultivos en vitro y para pruebas de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, varios sistemas de cultivo pueden utilizarse; por ejemplo líneas de célula (aviares), tales como las células de cebador como CEL o células de riñon de embrión de pollo pueden ventajosamente utilizarse. La preparación de cultivos de célula CEL o CEK de huevos SPF de pollo embrionados a un experto en la técnica.

Especialmente las células CEK son muy apropiadas para monitorear el crecimiento viral, y medir la cantidad viral y viabilidad. Aún cuando el efecto sicopático (cape) que al Astrovirus aviar de acuerdo con la invención produce en estas células son células infectadas, típicas pueden ser claramente vistas como células redondas, que se ondulan de las mono capas, y progresan hacía la lisis de célula.

Por lo tanto los ensayos de titulación pueden ser divididos utilizando diluciones progresivas de muestras virales, y marcando la dilución del virus más alto que aún produce cape. El título viral puede ser expresados como dosis infecciosa de cultivo de tejido de 50% (TCID50) por milímetro como se calcula por el método Spearman-Kárber (descrito en: D. Finney; Statistical method in biological assay, C. Griffin & Co. Londen, ISBN 01952205677). Estas técnicas son bien conocidas por un experto en la técnica.

De esta manera el virus puede ser cultivado en frascos de cultivo de tejido o placas de microtitulación para una variedad de pruebas y propósitos. Comúnmente es benéfico para primeramente adaptar los virus extractos del campo al cultivo en vitro en células, aplicando unos pasajes en cada célula, antes utilizar pruebas en virus o titulaciones.

Alternativamente, las pruebas y titulaciones pueden llevarse a cabo en huevos embrionados, preferiblemente huevos SPF de pollo. Por ejemplo la titulación de virus puede hacerse por inoculación de diluir incrementando las muestras en el saco de la yema de huevos de pollo SPF embrionado de 6 días de edad. Después de la marcación el número de embriones infectados o muertos, el título resultante de la muestra se pudo expresar en EID50 por milímetro, por ejemplo utilizando el método Spearman-Kárber (supra).

Para el virus depositado su capacidad para causar patología para pollos y pavos incubados fue confirmado bajo condiciones de laboratorio en un número de pollos de prueba extraordinarios. La inoculación fue a través de múltiples vías: intramuscular, oral y ocular. Algunos de los pollos inoculados desarrollaron signos de enfermedad, en donde los pollos infectados con moquillo fueron si síntomas. Los síntomas observados fueron mortalidad, depresión general y diarrea media a severa. Después de histopatología, nefritis y enteritis fueron observadas. Ninguna enfermedad de las piernas o coyunturas fueron observadas, sin embargo, esto no se podría esperar puesto que los pollos utilizados para estos experimentos fueron muy jóvenes (3-6 semanas), y/o no demasiados difíciles (pollos SPF de tipo capa) para manifestar estos problemas.

De los virus depositados, la secuencia de nucleótido de regiones adicionales del genoma es presentada para caracterización posterior; ORF 1b y ORF 2. El nucleótido respectivo y las secuencias de aminoácido putativo son presentados como SEC ID NO: 5-8, ver Tabla 1.

Los diferentes cebadores que fueron utilizados para determinar estas secuencias de nucleótido adicionales son presentados aquí como SEC ID NO: 32-34 y son descritos en la Tabla 4; para conveniencia esta tabla también incluye otros cebadores de secuenciado de reacción en cadena de polimerasa aquí descritos.

AAstV=Astrovirus aviar. rev= inverso. fwd=adelante Otro método para proporcionar una caracterización adicional de los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, con la muestra de virus depositado como referencia, es determinando sus características inmunológicas por serotipado, preferiblemente utilizando ensayos VN- o IFT-.

En todas las pruebas, el Astrovirus aviar novedoso probó ser inmunológicamente distinto de otros virus aviares, puesto que podría ser neutralizado, y no fue específicamente unido por, anticuerpos específicos para una variedad de otros virus aviares: Reovirus, Adenovirus Aviar (tipos 1,2,4,5 y 8), virus de bronquitis infecciosa, virus de enfermedad de Newcastle, virus de enfermedad Bursal infecciosa, Enterovirus aviar (extractos 1821/9 y FP3), síndrome de caída de huevo y virus de influenza aviar. Este fue también el caso de los anticuerpos específicos para los Astrovirus aviar ANV1 o CAstV2, mientras el suero efectivamente neutraliza sus virus donadores: ANV1y CAstV2 hasta 1:640 o 1: 10240 de dilución respectivamente.

Sin embargo, una muestra del extracto 19 depositado fue efectivamente y selectivamente neutralizó por un antisuero de pollo generado en contra del extracto 19 en pollos SPF que fueron experimentalmente infectados con el virus del extracto 19. Después de dar inoculaciones de refuerzo, un antisuero específico podría obtenerse. La falsa lectura utilizada para la neutralización de virus en este ensayo fue la prevención de embriopatologia por la neutralización.

Los resultados de los experimentos inmunológicos en donde los anticuerpos específicos solamente reconocidos y neutralizaron los Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, demuestran que estos virus perteneces a un serotipo viral nuevo y único.

Esto puede poner en práctica, por ejemplo, en una modalidad posterior, en donde el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención es caracterizado porque el dicho Astrovirus aviar puede ser neutralizado en un ensayo de neutralización de virus, por anticuerpos dirigidos en comparación con un muestra de Astrovirus como es depositado bajo el número CNCM 1-3895 en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM); del Instituto Pasteur en Paris, Francia.

Un alcance alternativo a la generación de anticuerpos utilizando el virus depositado de acuerdo con la invención es también posible. Por ejemplo, una muestra de virus que se debe investigar para ser (derivado de) un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención debe utilizarse para inducir anticuerpo que pueden ser probados para su capacidad de enlazarse, o aún neutralizar, un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Convenientemente estos anticuerpos pueden ser probados en una muestra del virus depositado de acuerdo con la invención.

Para este propósito, el virus de prueba o una fracción o preparación del mismo puede ser inoculado en un animal. El animal utilizado para generación de estos anticuerpos puede, en principio, ser cualquier animal, pero preferiblemente un ratón, una rata, conejo, hámster, cabra o pollo es utilizado. Los anticuerpos producidos de esta manera pueden ser probados para enlace o neutralización a un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, por ejemplo, convenientemente ordenando una muestra del virus depositado de acuerdo con la invención del CNCM. El mismo puede ser cultivado, por ejemplo, en huevos, células CEK o CEL u otros sustratos y finalmente incubados con el anticuerpo que se obtuvo con la muestra del virus de prueba. La detección de enlace de anticuerpo puede hacerse, por ejemplo por IFT o ensayo VN.

Esto constituye un método para la identificación y caracterización de un virus vivo o inactivo, o de una fracción o preparación del mismo, como si fuera o siendo derivado de un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Por consiguiente, en una modalidad preferida posterior, la invención proporciona un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, el cual es caracterizado porque el virus es capaz de inducir anticuerpos que pueden neutralizar una muestra del Astrovirus depositado de acuerdo con la invención en un ensayo VN.

Los protocolos para llevar a cabo un ensayo VN son bien conocidos en la técnica, y están dentro de la capacidad de rutina de un experto en la técnica. Las preferencias y detalles para ensayos VN son anteriormente descritos.

Como es evidente de los resultados de los ensayos inmunológicos utilizando anticuerpos específicos para el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, la invención también proporciona un anticuerpo que puede enlazarse y puede ser neutralizar un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención es un anticuerpo o fragmento del mismo que puede neutralizar el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, en un ensayo de neutralización de virus.

Estos anticuerpos de acuerdo con la invención pueden obtenerse y producirse en una variedad de maneras, todas bien conocidas y disponibles a un experto en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser producidos en animales experimentales por inoculación (repetida) como se describe anteriormente.

Alternativamente los anticuerpos pueden producirse por células de B-linfocito inmortalizadas, como en la tecnología de hibridoma. Las mejorías modernas a la tecnología de hibridoma clásica han hecho esta técnica más eficiente y productiva, por ejemplo, aumentando la cantidad de células de bazo deseada antes de la fusión, por selección positiva (paneo), seguido por expansión en cultivo con una mezcla de citocinas. Asimismo la técnica de fusión ha sido mejorada, cambiando de la fusión de polietilenglicol clásica a electrofusión.

En un alcance alternativo posterior, los anticuerpos pueden obtenerse a través del uso de técnicas biológicas moleculares y expresión en sistemas de expresión recombinantes.

Las técnicas biológicas moleculares permiten la adaptación de estos anticuerpos para mejor coincidir con la firma de anticuerpos de las especies objetivo que se deben tratar, o el diseño de los anticuerpos que tiene dos regiones de enlace con diferentes especificidades. El desarrollo del sistema de expresión permite establecer los sistemas de expresión de volumen, tal como la expresión en plantas.

Los sistemas de expresión recombinantes son bien conocidos en la técnica y por ejemplo utiliza células bacterianas (por ejemplo Escherichia coli, Salmonella Bacillus, Caulobacter etc)., levadura (por ejemplo Saccharomyces), insecto (Spodoptera, Trichoplusia), mamíferos (por ejemplo ovario de hámster chino), o planta /tabaco, papa, etc). Estas células pueden ser transformadas con un constructo de expresión que lleva la secuencia heteróloga para ser expresada. Asimismo, los sistemas combinados son conocidos, utilizando ' un microorganismo recombinante que comprende el ácido nucleico para ser expresado, el cual microorganismo puede ser cultivado en células en vitro para producir la proteína deseada en la escala deseada. Un ejemplo es el sistema de expresión de célula de baculovirus/insecto. Finalmente, los sistemas de expresión libre de células son disponibles comercialmente para la expresión libre de células de una molécula de ARN recombinante apropiada.

El término "un anticuerpo o un fragmento del mismo" es destinado para indicar que ambos completan moléculas de inmunoglobulina o partes de las mismas que están consideradas dentro del alcance del anticuerpo de acuerdo con la invención. Los fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención son moléculas de proteína que pueden todavía enlazarse a un epítope de un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Los ejemplos son fragmentos FAB, scFv, Fv, dAb o Fd, todos bien conocidos en la técnica.

Tales fragmentos se pueden obtener de los anticuerpos intactos por ejemplo la digestión química o enzimática. Tales fragmentos se pueden por ejemplo obtener alternativamente de un sistema recombinante de expresión, por ejemplo un sistema de la exhibición de bacteriófago.

Como es bien sabido por un experto en la técnica, el enlace de un anticuerpo o fragmento del mismo a un virus abarca el reconocimiento de epítopes en la partícula del virus. Estos epítopes son formados por conformaciones lineares o tridimensionales de las moléculas exhibidas en la partícula viral. Como consecuencia, las preparaciones de un virus o fracciones de las mismas podrían enlazarse por anticuerpos o fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención, mientras estas preparaciones o fracciones todavía contengan y presenten los epítopes correctos en la forma correcta. En el caso del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención la proteína viral presentada lo más prominente posible al sistema inmune es la proteína del cápsido codificado de ORF 2.

El experto en la técnica también aprecia que cuando el anticuerpo de acuerdo con la invención fue producido vía inoculación de un animal, el suero animal obtenido es un antisuero policlonal, significando que el antisuero contiene una mezcla de anticuerpos que puede enlazarse a una gran variedad de epítopes. Esto proporciona en la práctica las interacciones múltiples, que permiten el enlace eficiente de preparaciones o de fragmentos de la proteína viral, aunque éstas pueden no poseer, o pueden no presentar correctamente, todos los epítopes que estén normalmente disponibles en una partícula viva intacta de virus.

Alternativamente, el anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser un anticuerpo monoclonal, por ejemplo de acuerdo con lo producido por la tecnología de hibridoma, o el anticuerpo de acuerdo con la invención puede ser un fragmento del anticuerpo tal como un fragmento Fab. En este caso el anticuerpo o el fragmento tienen una capacidad mucho más reducida de reconocer diversos epítopes, pues enlazará normalmente específicamente a un solo epítope. Por lo tanto cuando este epítope particular no es presente o no se exhibe en el fragmento o la preparación del virus, no puede ser enlazado en totalidad por un anticuerpo tan monoclonal o un fragmento del anticuerpo.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden utilizar en una variedad de maneras; para la caracterización del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, para los diagnósticos, para la terapia, y/o para los propósitos de garantía de calidad.

La invención proporciona la producción del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención en una escala industrial. Esto puede obtenerse cultivando el dicho virus en las células huésped en vivo o en sistemas en vitro. Los sistemas en vitro comprenden variedades de células primarias o inmortalizadas. Los ejemplos de células primarias son células CEK o CEL. Un ejemplo de una variedad de células inmortalizadas es la variedad de células LMH (Kawaguchi y col., Cáncer Res., vol. 47, p. 4460-4464). Los ejemplos de sistemas en vivo son cultivos en huevos aviares embrionados, o en pájaros inoculados. Especialmente las cultivos en las células o los huevos se pueden escalar arriba de lo convenientemente; por ejemplo, los cultivos celulares se pueden mantener en envases de diversos tamaños, tales como frascos, botellas rodantes, o aún fermentadoras. Las técnicas y el equipo para la tecnología de cultivo de célula en cualquier escala son conocidos y fácilmente disponibles por proveedores comerciales.

Por lo tanto la invención proporciona en un aspecto posterior que una célula huésped infectada con un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

También, la invención proporciona un método para producir un Astrovirus aviar de acuerdo con la invención que comprende la multiplicación del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención en un sistema apropiado, y recolectando el material del virus.

Las caracterizaciones descritas del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención no sólo se refieren a los Astrovirus aviares en un intacto, forma competente de la réplica. Como apreciará un experto en la técnica, la actual invención proporciona preparaciones de este virus en muchas diversas formas. Esto comprende, por ejemplo, preparaciones en donde el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención se ha desactivado, o las preparaciones en donde el virus se ha fraccionado de una o más maneras, (bio) químicamente o físicamente, por ejemplo por la extracción, el Usado, la digestión, la homogeneización, o la sonicación.

Los métodos para desactivar el virus son bien conocidos y por ejemplo incluyen la inactivación química o física, tal como la inactivación con la formalina, beta-etanolimina, o la beta-propiolactona; también el calentamiento o irradiación con la luz Ultravioleta, las radiografías, o la radiación radiactiva.

Los métodos para el fraccionamiento también se conocen en multitud, por ejemplo la extracción o el Usado con un detergente tal como Tritón® X-100; digestión con tripsina; homogeneización por el helado-deshielo o la prensa de célula francesa; o sonicación por ultrasonido.

La materia prima para tales preparaciones puede ser (viva o desactivada) un Astrovirus aviar purificado de acuerdo con la invención, pero también una célula huésped de acuerdo con la invención, o una célula-cultivo o parte de eso que comprende una célula huésped o un astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Por ejemplo tal parte de una célula-cultivo puede ser un sobrenadante o una pastilla de una célula-cultivo centrifugada. Evidentemente estos cultivos de célula o partes de las mismas se pueden ellas mismas convertirse en preparaciones tales como un extracto, Usado, digestión, homogenado, o sonoricen de acuerdo con lo descrito.

Tales preparaciones del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención contienen uno o más antígenos y epítopes del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Por lo tanto en otro aspecto, la invención se relaciona con una preparación antigénica obtenible del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

La preparación antigénica de acuerdo con la invención se puede limitar por los anticuerpos o las piezas de los mismos de acuerdo con la invención, o se puede utilizar para inducir el enlace o la neutralización de anticuerpos o partes de los mismos. Esto se puede aplicar ventajosamente en vacunas y diagnósticos como los descritos a continuación.

Las preparaciones antigénicas de acuerdo con la invención, son por ejemplo proteínas del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, o las partes de tales proteínas. Estas proteínas o partes de las mismas se pueden obtener por el aislamiento del virus. Sin embargo, estas proteínas o partes de las mismas se pueden también producir convenientemente por técnicas de expresión de ARN recombinante usando los ácidos nucleicos del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Por ejemplo secuencias del ácido nucleico de parte de las regiones ORF 1a como se describe en cualquiera de las SEC id no: 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 o 26 pueden ser utilizados; mientras que las secuencias de ADNc se relacionan porque tienen identidad de secuencia de nucleótido de al menos 88% con la SEC ID NO: 4.

Por lo tanto la invención proporciona en otro aspecto una molécula de ADN que comprende una región teniendo una identidad de secuencia de nucleótido de por lo menos 88% con SEC ID NO.4.

Asimismo los ácidos nucleicos de ORF 1b o de ORF 2 se pueden utilizar como se describe en la SEC ID NO: 6 o 8.

Tales secuencias de ácido nucleico y fragmentos de ADNc se pueden reproducir y expresar usando las técnicas del recadan bien conocidas en la técnica, por ejemplo sobreproducción en una molécula de ADN recombinante para manipulación posterior. La molécula recADN puede ser un vector tal como un plásmido bacteriano. El ácido nucleico del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención se liga operativamente a una secuencia de control de la expresión, tal como un promotor, permitiendo su expresión en un sistema apropiado de la célula huésped o de la expresión. Alternativamente el ácido nucleico, el ADNc, o la molécula ADN recombinante se pueden introducir en microorganismos recombinantes vivos de un portador tales como una bacteria o un virus.

En analogía, basada en las secuencias de aminoácido supuestas descritas en la SEC ID NO: 5, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, y 27, y su conexidad, la invención proporciona un otro aspecto una proteina que comprende una región teniendo una identidad de la secuencia de aminoácido de por lo menos 93% con SEC ID NO: 5.

Estas modalidades tienen gran utilidad práctica y ventajosa en el uso de vacunas y de diagnósticos como serán descritos a continuación.

Una vacuna puede ser preparada de patógenos microbiologicos vivos o desactivados, tales como virus, o de los fragmentos de tales microorganismos. Estos microorganismos son producidos comúnmente industrialmente en volúmenes más pequeños o más grandes, por la incubación en las células, órganos o tejidos, huevos embrionados, o en animales huéspedes. Después de recolectar una suspensión que comprende el microorganismo, esta suspensión se formula en una vacuna y se empaca el producto final. Después de la prueba extensa para la calidad, la cantidad y la esterilidad tales productos de vacuna son liberados para la venta.

Las técnicas y las consideraciones generales en vacunología son bien conocidas en la técnina y se describen por ejemplo en regulaciones gubernamentales y en manuales por ejemplo: "Vacunología veterinaria" (Pastoret y otros., ed 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681), y: "Remington: la ciencia y la práctica de la farmacia" (2000, Lippincot, los E.E.U.U., ISBN: 683306472).

Una vacuna es comúnmente conocida en la técnica para representar una composición farmacéutica que comprende un compuesto inmunogenético en un portador farmacéuticamente aceptado. El compuesto inmunogenético son microorganismos vivos o desactivados, o una subunidad de los mismos, capaces de inducir una activación de un sistema inmune de objetivos.

Fue encontrado asombrosamente que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, y las preparaciones antigénicas, las células huésped, los anticuerpos, los ácidos nucleicos, las proteínas, así como los métodos para su preparación, cultivo, identificación y cuantificación se pueden aplicar en vacunas y propósitos de diagnóstico. Tales vacunas sirven para proteger un animal objetivo contra la infección con el Astrovirus aviar, o reducen la réplica del virus o los síntomas de la enfermedad que causa. Tales análisis de diagnóstico permiten la detección del virus o de sus antígenos, por ejemplo en las muestras en el campo de animales o las preparaciones virales.

La combinación de las vacunas y los diagnósticos permiten la identificación y la defensa contra la infección y/o la enfermedad por el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

La capacidad de la vacuna fue demostrada por los experimentos con animales descritas, en los cuales los pollos fueron inoculados con el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Esto llevó a la producción de anticuerpos altamente específicos. Por otra parte estos anticuerpos fueron demostrados que pueden neutralizar específicamente el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Como bien se conoce en la técnica, la inducción de anticuerpos de neutralización es un paso importante en la viabilidad de una vacuna efectiva e inmunoprotectora.

Las inoculaciones repetidas de los animales de prueba no sólo proporcionaron un aumentador de presión a los niveles del anticuerpo producidos, pero también sirvieron como infecciones desafiantes, que podrían ser toleradas y superadas por una gran cantidad de pájaros en la prueba.

El Astrovirus aviar de acuerdo con la invención - o las partes de la misma se pueden formular así en una composición farmacéutica apropiada, y se apliquen a las aves como vacuna.

Está dentro del alcance de un experto en la técnica para optimizar posteriormente esta vacuna, por ejemplo adaptando con precisión la eficacia y la seguridad de la vacuna, de modo que proporcione la suficiente protección en un nivel aceptable de reacción de la vacunación. Esto puede hacerse adaptando la dosis de vacuna, o usando una vacuna en otra forma o formulación, o adaptando los otros componentes de la vacuna (por ejemplo el estabilizador o el coadyuvante), o por el uso a través de una diversa ruta.

Las variantes bien conocidas de una vacuna para la invención por ejemplo pueden utilizar el Astrovirus aviar nuevo en una forma viva o desactivada; puede ser una vacuna de subunidad al usar la preparación antigénica y/o la proteína de acuerdo con la invención; puede estar en forma de vacuna pasiva al usar el anticuerpo o fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención; o puede estar bajo la forma de vacuna de ADN al usar la molécula de ADN de acuerdo con la invención.

Por lo tanto otro aspecto de la invención proporciona una vacuna que comprende el Astrovirus aviar, el anticuerpo o fragmento del mismo, la preparación antigénica, la molécula de ADN, o la proteína, todos de acuerdo con la invención, y un portador farmacéuticamente aceptado.

En analogía, la invención se relaciona en otros aspectos con un compuesto o una composición para el uso en una vacuna para las aves de corral, en donde el compuesto o la composición es el Astrovirus aviar, el anticuerpo o fragmentos del mismo, la preparación antigénica, la molécula de ADN, o la proteína, todos de acuerdo con la invención.

En un aspecto posterior, la invención se relaciona con el uso de un compuesto o de una composición para la fabricación de una vacuna para las aves de corral, en donde el compuesto o la composición es el Astrovirus aviar, el anticuerpo o fragmento del mismo, la preparación antigénica, la molécula de la DNA, o la proteína, todos de acuerdo con la invención.

En un aspecto posterior, invención se relaciona con un método para la fabricación de una vacuna para las aves de corral, en donde un compuesto o una composición se mezcla con un portador farmacéutico apropiado, y en donde el compuesto o la composición es el Astrovirus aviar, el anticuerpo o el fragmento del mismo, la preparación antigénica, la molécula de ADN, o la proteína, todos de acuerdo con la invención.

Un "portador farmacéuticamente aceptado" puede por ejemplo ser agua estéril, una solución de sal fisiológica, o un almacenador intermediario conveniente para el propósito. En una forma más compleja el portador puede por sí mismo comprender otros compuestos, tales como un coadyuvante, un antígeno adicional, un citocina, etc.

La vacuna de acuerdo con la invención puede ser utilizada para el tratamiento profiláctico y para terapéutico.

El término "vacuna" implica la presencia de una cantidad inmunológico eficaz del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, y la presencia de un portador aceptado farmacéuticamente.

Qué constituye "la cantidad inmunológicamente eficaz" para la vacuna de acuerdo con la invención es dependiente en el efecto deseado y en características del Astrovirus aviar y del organismo objetivo. La determinación de la cantidad eficaz está en conformidad con las habilidades del médico rutinario, por ejemplo supervisando la respuesta inmunológica después de la vacunación, o después de que una infección desafiante, por ejemplo supervisando las muestras clínicas de las objetivos de la enfermedad, de parámetros serológicos, o por el re-aislamiento del patógeno, con respecto a las respuestas consideradas en animales sin vacunar.

El uso de cantidades muy altas del Astrovirus aviar, de la preparación antigénica, el anticuerpo o fragmentos del mismo, la molécula de ADN, o la proteína de acuerdo con la invención en una vacuna aunque inmunológicamente sea muy eficaz, será menos atractivo por razones comerciales. Una cantidad preferida de ninguno de estos compuestos o composiciones de acuerdo con la invención, comprendida en una vacuna de acuerdo con la invención, está entre 0,1 y el 90% del volumen final de la vacuna. Preferiblemente la cantidad está entre 1 y el 50%, 1 y el 25%, y 1 y 10%, en esa orden de la preferencia.

En caso de una vacuna desactivada o de la subunidad, el compuesto o la composición de acuerdo con la invención se puede expresar en unidades de ELISA. Cantidades de unidades de ELISA que son efectivas necesitan de ser determinadas en relación con la unidad de Elisa de una muestra estandarizada que da cierta eficacia.

En caso de una vacuna viva de acuerdo con la invención, una cantidad de pfu (unidades que forman placa), el cfu (unidades de formación de colonias), TCID50, EID50, o ELD50 (dosis mortal de 50% del embrión) se pueden utilizar, dependiendo de cuál es una manera conveniente de cuantificar la dosis aviar de la vacuna de Astrovirus. Por ejemplo una dosis de vacuna aviar viva de Astrovirus en una gama entre 1 y 10?6 EID50 por dosis de vacuna puede ser utilizada ventajosamente; preferiblemente una gama entre 10 y 10?5 EID50/dosis, preferiblemente entre 10?2 y 10?4 EID50/dosis.

En una modalidad preferida la invención se relaciona con la vacuna de acuerdo con la invención en donde el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención está en forma viva.

Las vacunas vivas en general tienen las propiedades ventajosas que solamente pequeños inoculo están requeridos, puesto el microorganismo se replica. También esto induce generalmente a una inmunorespuesta sólida y eficaz, con memoria inmunológica adecuada.

Como se conoce en la técnica, las vacunas vivas pueden ser aplicadas convenientemente puesto que las vacunas vivas atenuadas, significando el virus vaccíneo tienen una virulencia o una patogenicidad reducida comparada con el extracto viral original. Los métodos para la atenuación viral son bien conocidos en la técnica y comprenden por ejemplo: el pasaje continúo de los animales a través de animales o sobre cultivos de célula; atenuación química; o atenuación por técnicas biológicas moleculares.

En una modalidad preferida adicional la invención se relaciona con la vacuna de acuerdo con la invención en donde el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención se desactiva.

Los métodos y los materiales para la inactivación viral se han descrito anteriormente. Tales vacunas desactivadas en general tienen la ventaja de ser entonces vacunas vivas más seguras, puesto que no exponen el anfitrión a ningún Astrovirus aviar vivo de replicación potencialmente patógeno.

En otra modalidad preferida, la vacuna de acuerdo con la invención comprende además un coadyuvante.

Un coadyuvante es una sustancia inmunoestimulante que impulsa la inmunorespuesta del anfitrión de una manera no específica. Muchos diversos coadyuvantes se conocen en la técnica. Los ejemplos de coadyuvantes usados con frecuencia son muramildipéptidos, los lipopolisacáridos, varios glucanos o glicanos, Carbopol®, Aluminio-hidróxido (AI(OH)3). Éstos se pueden combinar con diversas emulsiones, tales como agua en del aceite (sin), o/c emulsiones de y emulsiones dobles. Los coadyuvantes de aceite convenientes para el uso en emulsiones aceitosas son por ejemplo aceites minerales o aceites metabolizables. Los aceites minerales son por ejemplo Bayol®, Marcol® y Drakeol®; los aceites metabolizables son por ejemplo, aceites vegetales, tales como aceites de aceite de cacahuete y aceite de soja, o animales tales como el escualeno del aceite de pescado. Un solubilizado de vitamina E (tocoferol) de acuerdo con lo descrito en EP 382.271 puede ser utilizado alternativamente.

Las emulsiones o/w muy convenientes por ejemplo se obtienen a partir de la fase de agua del 5-50% w/w y se utiliza el coadyuvante de aceite de 95- 50% w/w, preferiblemente fase de agua de 20-50% w/w y coadyuvante de aceite de 80- 50% w/w.

La cantidad de coadyuvante añadida depende de la naturaleza del coadyuvante mismo, y de la información en cuanto a las cantidades proporcionadas por el fabricante.

Considerando que es práctica común utilizar los coadyuvantes conjuntamente con vacunas desactivadas, varias vacunas vivas han mostrado también ser benéficas de la inclusión de un coadyuvante. Por lo tanto esta encarnación está también dentro del alcance de la invención.

En otra modalidad preferida la vacuna de acuerdo con la invención comprende además un estabilizador.

Un estabilizador se puede añadir a la vacuna de acuerdo con la invención por ejemplo para protegerla contra la degradación, para aumentar el período de validez, o para mejorar la eficacia de secado por congelación. Los estabilizadores útiles son entre otros SPGA (Bovarnik y otros, 1950, J. Bacteriology , vol. 59, P. 509), leche desnatada, gelatina, albúmina del suero vacuno, carbohidratos por ejemplo sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sucrosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de la degradación de la misma, almacenadores intermediarios, tales como fosfatos alcalinos-metálicos, y poliaminas tales como espermina.

También los conservadores se pueden añadir, por ejemplo thimerosal, merthiolate, o gentamicina.

Además, la vacuna puede comprender uno o más compuestos o emulsores tensioactivos convenientes, por ejemplo Span® o Tween®.

La vacuna puede también comprender un así llamado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al cual el polipéptido o la proteína de acuerdo con la invención se adhiere, sin covalentemente unirse a él. Tales vehículos son entre otros bio-microcápsulas, micro-alginatos, liposomas y macrosoles, conocidos en la técnica. Una forma especial de tal vehículo es un complejo estimulante inmune (ISCOM).

Es evidente que mezclando otros estabilizadores, los portadores, diluyentes, emulsiones, y similares a las vacunas de acuerdo con la invención están también dentro del alcance de la invención. Estos aditivos se describen en manuales bien conocidos tales como: "Remington", y "Veterinary Vaccinology" (ambos supra).

Es muy eficiente formular la vacuna de acuerdo con la invención como vacuna de combinación, como de esta manera los agentes inmunológicos múltiples se pueden administrar inmediatamente, proporcionando la reducción del tiempo y los costes de la mano de obra, así como la reducción del malestar a los animales vacunados objetivo.

Estas vacunas de combinación son obtenidas combinando la vacuna de acuerdo con la invención con otro compuesto antigénico, tal como un virus (vivo o inactivado), una bacteria, un parásito, o partes del mismo, tales como una proteína, un carbohidrato, o un ácido nucleico capaz de codificar un antígeno. Mientras que la vacuna de acuerdo con la invención es destinada para los animales aviares objetivo, se combina ventajosamente con un antígeno adicional es decir, o se deriva de, otro patógeno de las aves de corral.

Por lo tanto, en otra modalidad preferida, la vacuna de acuerdo con la invención está comprendiendo por lo menos un antígeno adicional obtenible de un microorganismo patógeno a las aves de corral.

Son conocidos muchos patógenos aviares, no obstante son algunos de los patógenos económicos veterinarios más relevantes: - virus: virus bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, gripe aviar, Adenovirus, virus del síndrome de caída de huevo, virus de enfermedad bursal infecciosa (es decir Gumborovirus), virus de anemia de pollo, virus aviar de encefalomielitis, virus de la difteria aviar, virus de la rinotraqueítis del pavo, virus de plaga de pato (Enteritis de virus de pato), virus de difteria de la paloma, la enfermedad de Marek, virus aviar de leucosis, virus infeccioso del laringotraqueítis, pneumovirus aviar, y Reovirus; bacterias: Escherichia Coli, espec. Salmonella, Ornitobacterium rhinitracheale, Haemophilis paragallinarum, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, especie Erysipelas, espec. Mycoplasma, y espec. Clostridium; - parásitos: Eimeria; - hongos: por ejemplo Aspergillus, etc.

También concebible es la combinación en la vacuna de acuerdo con la invención de dos o más Astrovirus aviares de acuerdo con la invención, por ejemplo para formar una vacuna de combinación que es más ampliamente eficaz contra variantes del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Los ejemplos de Astroviruses aviar que se pueden utilizar para formar la vacuna de combinación son los extractos descritos en el figura 1.

Una vacuna de acuerdo con la invención puede tomar cualquier forma que sea conveniente para la administración a las aves de corral, y que coincide con la ruta deseada del uso y efecto deseado.

La preparación de una vacuna de acuerdo con la invención es realizada por los medios bien conocidos por el experto en la técnica. La vacuna de acuerdo con la invención se formula preferiblemente en una forma conveniente para la inyección, tal como una suspensión, solución, dispersión, emulsión, y similares. Tales vacunas son comúnmente preparadas estériles.

Muchas vías de la administración pueden ser aplicadas, todas conocidas en la técnica. Las vacunas de acuerdo con la invención cuando están desactivadas, se administran preferiblemente por inyección; las vacunas vivas, son administradas preferiblemente por un método de uso total por ejemplo vía la alimentación, el aerosol o el agua potable.

El protocolo para la administración de la vacuna de acuerdo con la invención es idealmente integrado en horarios existentes de vacunación de otras vacunas.

El objetivo preferido para la vacuna de acuerdo con la invención es un animal aviar. Más objetivos preferidos se seleccionan del grupo que consiste de pollo, pavo, pato y ganso. El objetivo más preferido es el pollo.

El esquema de dosificación para aplicar la vacuna de acuerdo con la invención a un organismo objetivo puede estar en las dosis solas o múltiples, que se pueden administrar al mismo tiempo o secuencialmente, de una forma compatible con la formulación de la vacuna, y en una cantidad de manera que sea inmunológicamente eficaz.

La edad, el peso, el sexo, la situación inmunológica, y otros parámetros del objetivo aviar que se vacunará no son críticos, aunque sea evidentemente favorable vacunar objetivos sanos, y vacunar tan pronto como sea posible para prevenir una infección en el campo. Por ejemplo las aves de corral pueden por lo tanto ser vacunadas en el día de trama, o aún anterior, mientras que aún en ovo en 3-4 días antes de la portilla; por ejemplo en 18 días de desarrollo embrionario (ED) para los pollos o en 24 días ED para los pavos.

Por razones de estabilidad o economía una vacuna de acuerdo con la invención puede ser liofilizada. En general esto permitirá el almacenamiento prolongado en las temperaturas bajo cero °C. Los métodos para la liofilizacion son conocidos por los expertos en la técnica, y el equipo para la liofilizacion a diversas escalas está disponible comercialmente.

Por lo tanto, en una modalidad preferida, la vacuna de acuerdo con la invención está en una forma liofilizada.

Para reconstituir una composición de vacuna liofilizada, se suspende en un diluyente fisiológico aceptable. Tal diluyente puede por ejemplo, estar tan simple como el agua estéril, o solución de sal fisiológica tal como (fosfato salino) salino, o el diluyente puede contener ya un compuesto adyuvante, tal como un tocoferol, de acuerdo con lo descrito en EP 382.271. En una forma más compleja la vacuna liofilizada puede ser suspendida en una emulsión por ejemplo de acuerdo con lo descrito en EP 1, 140,152.

Por lo tanto en otra modalidad preferida, la invención se relaciona con una composición de vacuna que se obtiene por reconstitución de una vacuna liofilizada de acuerdo con la invención.

Además de las diversas aplicaciones de los compuestos y de las composiciones de acuerdo con la invención en vacunas, éstos se pueden también aplicar ventajosamente en diagnósticos, para detectar el virus de acuerdo con la invención o sus ácidos del antígeno o nucleicos por ejemplo en las muestras animales del campo o las preparaciones virales.

Esto también es demostrado por los resultados de los experimentos de serotipado por análisis de IFT y del VN como se describe anteriormente, en donde los antisueros contra el Astrovirus aviar depositados de acuerdo con la invención fueron aplicados para discriminar entre los virus que caían dentro del alcance de la invención (los extractos de acuerdo con lo descrito en la Tabla 1) y los que no lo hicieron (entre muchos otros: ANV1, CAstV2, reovirus etc.). Igualmente, los experimentos de reacción en cadena de polimerasa demostraron la capacidad para identificar selectivamente el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Como un experto en la técnica apreciará, ésta no sólo aplica a los anticuerpos de acuerdo con la invención, pero también para los otros compuestos y composiciones de acuerdo con la invención. Estos análisis de diagnóstico por ejemplo utilizan los anticuerpos o los fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención para probar el antígeno; o antígeno de uso (el virus, la preparación antigénica, o la proteína de acuerdo con la invención) a probar para los anticuerpos en contra de los mismos; o ácido nucleico de uso (ARN del virus, o la molécula de ADN de acuerdo con la invención) para establecer la hibridación o análisis de la reacción en cadena de polimerasa.

Por lo tanto, en un aspecto posterior, la invención se relaciona con un equipo de diagnóstico que comprende el Astrovirus aviar, la preparación antigénica, el anticuerpo o fragmento del mismo, la molécula de ADN, o la proteína, todo de acuerdo con la invención.

El término "equipo de diagnóstico" implica características referentes a un paquete para la venta comercial, por ejemplo comprendiendo un número de componentes y de materiales desechables para realizar una prueba de diagnóstico y una hoja de instrucciones; todos en una forma comercialmente posible del paquete.

Un equipo similar de diagnóstico, por ejemplo comprende así los materiales requeridos para un ELISA del anticuerpo. En tal prueba, por ejemplo, los pozos de una placa de ELISA han estado cubiertos con el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, para formar un equipo de ELISA del anticuerpo, para la detección de anticuerpos contra el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención o las preparaciones o las proteínas de eso. Después de la incubación con la muestra de prueba, etiquetada los anticuerpos reactivos etiquetados con las inmunoglobulinas de la muestra de prueba (sí es presente) se agregan a los pozos. Una coloración entonces revela la presencia en la muestra de la prueba de anticuerpos específicos.

Igualmente, un equipo ELISA de antígeno se puede idear, comprendiendo, por ejemplo las placas de microtitulación cubiertas con el virus, la preparación antigénica, o la proteína de acuerdo con la invención.

El diseño de tales inmunoensayos puede variar. Por ejemplo, el inmunoensayo se puede basar sobre la competencia, en vez del enlace directo. Además, tales pruebas pueden también utilizar el material de partículas o celular, en vez del soporte sólido de un dispositivo. La detección del complejo anticuerpo-antígeno formado en la prueba puede implicar el uso de anticuerpos etiquetados, en donde las etiquetas pueden ser, por ejemplo, enzimas o fluorescentes, las moléculas quimio-luminiscentes, radiactivas o moléculas de tinte.

Ventajosamente, las vacunas y los diagnósticos de acuerdo con la invención pueden ahora ser utilizados en cooperación para idear un alcance para la erradicación del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención en cierta región o población de animales.

Leyenda a las figuras: Figura 1: exhibe una alineación múltiple de las secuencias del ADNc de una sección de ORF 1a de un número seleccionado de extractos del Astroviruses aviar de acuerdo con la invención. La referencia es la secuencia del extracto 19. La referencia exterior es la parte correspondiente de la secuencia del ADNc del genoma de un virus de la referencia ANV1 (SEC ID NO:1). El área encajonada marca la región de 12 nucleótidos, que no está presente en el ANV1 ORF 1a.

Figura 2: exhibe una alineación múltiple de las secuencias de aminoácido supuestas, de acuerdo con lo preparado por la traducción por ordenador de las secuencias de ADNc enumeradas en el figura 1. El área encajonada marca los 4 aminoácidos, que no están presentes en la proteína codificada por ORF 1a de ANV1.

Figura 3: exhibe un árbol dendrográfico de los resultados de las alineaciones de la secuencia de nucleótido de acuerdo con lo presentado en el figura 1.

Figura 4: presenta una representación gráfica de las áreas de hibridación de la SEC ID NO: 30 y 31, en relación con la ubicación de la región de 12 nucleótidos (representada en negrita) que es única para los Astrovirus aviares de la invención.

Figura 5: muestra una fotografía de un bromuro de etidio manchado, Luz ultravioleta iluminada, el gel de la agarosa, en el cual la electroforesis empezó con los productos de un análisis de reacción en cadena de polimerasa usando los cebadores SEC ID NO: 30y 31 en número de muestras de ADNc. El producto previsto de una reacción en cadena de polimerasa positiva, una banda de aproximadamente 260 bases pares es claramente visible, en la línea 5 solamente. Las reacciones precedentes del RT habían sido hechas con el cebador de SEC ID NO: 3.

Línea 1: Control negativo (ningún ADNC en la reacción de la reacción en cadena de polimerasa) Línea 2: Homogenado de hígado del pollo no infectado Línea 3: ANV1; un extracto alemán de 1991, amplificado 1 x CAN, 4x saco de yema, líquido alantoico recolectado.

Línea 4: CAstV2; derivado del virus de acuerdo con lo depositado en el CNCM bajo número CNCM 1-2932, fluido alantoico.

Línea 5: Extracto 19 del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, fluido alantoico M: Línea del marcador del tamaño del ADN: bandas en 200, 400, 600, 800, 1000 bp, etc.

La invención ahora será descrita más detalladamente con referencia a los siguientes ejemplos, no limitativos.

Ejemplos: Ejemplo 1: Aislamiento de un Astrovirus aviar de muestras del campo: Muchos extractos de Astrovirus aviar de acuerdo con la invención se han extracto de pollos y de pavos, de diversas granjas en los Países Bajos y la Alemania. Como ejemplo típico, el aislamiento de la muestra. 161319 ("extracto 19") se describe aquí detalladamente.

El extracto 19 Astrovirus fue extracto de una piscina de tráqueas a partir de las gallinas de 4 capas de 36 semanas de edad, en una granja holandesa, presentando un descenso en el consumo de alimentación, descenso en la producción del huevo y el aumento de huevos de segundo grado. También generalmente sufriendo de la indigestión, de la diarrea, y de problemas de movilidad .

Tejido reunido (0.5 - 1.0 g) de tráqueas de los 4 pájaros fueron mezclados con cerca de 10 mi de "medio aclarador" (que contiene: 500 mi HBSS [solución de sal básica de Hank] + 2 mi de sodio bencílico de penicilina (1.000.000 ES DECIR /mi) + 8 mi estreptomicina (250 mg/ml) + 0.5 mi Fungizona (2.000 [MU] g/ml) + 2 mi de NaHC03 7.5%) y homogeneizado usando un peto durante 2 minutos. La suspensión fue centrifugada durante 15 minutos a 2000 xg a 2-8 0°C. El sobrenadante entonces fue filtrado usando un filtro de 450 nanómetros.

El fluido resultante fue inoculado en la cavidad alantoica de cuatro 8-9 huevos de polio SPF embrionados de 8-9 días (1 mi por el huevo), de la yema de huevo de cuatro huevos SPF de 5-6 días (1 mi por huevo), y CAM de cuatro huevos SPF embrionados de 9 días (0.5 mi por huevo) e incubado de 36.5 a 38.5 °C en humedad de 40 a 55%. Los huevos fueron mirados al trasluz diariamente. La muerte embrionaria que ocurría en el plazo de un día de inoculación era considerada ser no específica.

Los embriones de los huevos inoculados de saco de yema de no mostraron que cualquier anormalidad en 7 días p.i. El fluido de yema fue recolectado y se utilizo para un segundo pasaje.

Cuatro mi del líquido de yema de huevo cosechado del primer paso (1 mi por huevo) fueron mezclados con 0.5 mi de "medio de paso" (que contiene: HBSS 90 mi + 2 mi de sodio bencílico de penicilina (1.000.000 ES DECIR /mi) + 8 mi estreptomicina (250 mg/ml) + 0.5 mi Fungizona (2.000 [MU] g/ml) + 2 mi de NaHC03 7.5%). De esta mezcla 1 mi por huevo fue inoculado en la yema de huevo de cinco huevos SPF embrionados de 5 días e incubados de 36.5 a 38.5 °C con la humedad de 40 a del 55%. Los huevos fueron mirados al trasluz diariamente.

En el sexto día después de la inoculación, un embrión había muerto y mostró rojez del cuerpo. El líquido alantoico de este huevo fue probado para el reovirus en análisis de precipitación de gel (AGP) de agar; fue negativo para reovirus.

Cerca de 4 a 5 mi de yema de huevo de este huevo con el embrión anormal fueron cosechados y utilizados para otros pasos, de la misma forma que el segundo paso.

En el tercer paso, en el quinto día después de la inoculación, tres embriones habían muerto y dos de ellos mostraron la rojez del cuerpo. El líquido alantoico reunido fue negativo en el AGP para reovirus, y para el tipo 1 de adenovirus.

En otros pasos el título del extracto incrementó, como el embrión murió o mostró síntomas pronto después de la inoculación. En el 6t0 y 7mo paso la coloración roja brillante típica de las piernas y de los extremos del ala llegó a ser evidente. Constantemente, el líquido alantoico era negativo en las pruebas para IBDV, Reovirus, Adenovirus, NDV, AIV e IBV. También un análisis de reacción en cadena de polimerasa para IBDV fue negativo.

CAM cosechado y los líquidos alantoicos fueron almacenados congelados a 80°C, y utilizados para la caracterización adicional.

Ejemplo 2: Aislamiento viral de ARN: Para el aislamiento del ARN viral total, un QlAamp® Viral RNA mini kit (QiaGen™) fue utilizado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En corto: 140 µ? de líquido viral, tal como líquido alantoico, o un homogenado de tejido o de embrión (típicamente en cantidades entre el peso/volumen de 5-50%), fueron mezclados con la solución salinade4 extracción preparada el ARN portador. El mismo fue incubado a temperatura ambiental por 10 minutos. A continuación, etanol puro (96 - el 100%) fue agregado, mezclado, y la mezcla fue aplicada a la mini columna giratoria QlAamp (en un tubo de colección de 2 mi). Este fue centrifugado por 1 Min. a 6000 x G. El flujo intermedio fue desechado. La columna fue lavada con el almacenador intermediario del lavado que contenía etanol puro. Finalmente, la columna fue enjuagada con 60 µ? de solución salina de elución. El aislamiento del ARN fue seguido comúnmente directamente por la producción de ADNc vía la reacción RT.

La presencia de ARN de Astroviral fue verificada por electroforesis estándar de gel de ARN de agarosa/formamida.

Ejemplo 3: Producción de ADNc vía la reacción RT: La síntesis de la primera cadena de ADNc fue hecha usando Amersham-Pharmacia™ Ready-To-Go® You-Prime First-Strand Beads, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En corto: 29 µ? del ARN enjuagado del aislamiento de ARN viral total, fueron desnaturalizados por 10 minutos a 65 °C, y 2 minutos en el hielo. El mismo fue añadido a un tubo que contenía dos gotas, y 4 µ? cebador 17 (SEC ID NO. 3) fue agregado, a un volumen fina de 33 µ?. Este fue incubado por 1 minuto a temperatura ambiental, mezclado cuidadosamente por pipeteo, e incubado por 1 hora en el ADNc de 37°C. fue almacenado congelado debajo de -20 °C hasta que sea posteriormente utilizado.

Ejemplo 4: Reacciones de reacción en cadena de polimerasa: La reacción en cadena de polimerasa fue utilizada para preparar la ADN trenzada (ds) doble de ADNc fuera de reacción RT. También la reacción en cadena de polimerasa fue utilizada como un tipo de análisis de diagnóstico de detección para identificar específicamente si el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención estaba presente en una muestra.

Los ingredientes de la reacción de la reacción en cadena de polimerasa eran de HT Biotechnolgy™ Ltd.: solución salina Supertaq® (10 x conc.) usado en Ixconc; enzima de polimerasa Supertaq® Plus(5 U/µ?) usado en 1 U/µ?, y los dNTP premezclados (10 milímetros), usados en 2mM. Éstos fueron mezclados en agua destilada, agua libre de ARN.

Los cebadores utilizados fueron aquellos enlistados en la tabla 4. Los cebadores fueron sintetizados por Invitrogen (TM), los Países Bajos, y la solución común de cebador fue hecha en una solución salina TE (pH 8.0) en una dilución de 10 µ? dilución para uso directo.

Para una reacción en cadena de polimerasa estándar, los siguientes ingredientes fueron utilizados: 27 µ? Aqua dest, 5 µ? 10x solución salina Supertaq Plus; 1 µ? (iguales 1 unidad) enzima Supertaq plus; 5 µ? 2 Mm de mezcla dNTP; 5 µ? cada uno de cebador derecho e inverso (en 10 µ?); y finalmente 2 µ? de ADNc de la mezcla de reacción RT; alcanzando un volumen total de 50 µ?· Condiciones típicas de reacción, por ejemplo, para amplificar ORF 1a con cebadores F-IL y R-ll-3 (SEC ID NO: 28, 29), u ORF 1b usando los cebadores 20 y 21 (SEC ID NO. 32, 33) eran: - 1 Min. a 95°C, - 40 ciclos de: 30 seg. a 94°C; 1 Min. a 48°C; y 40 seg. en 72°C, - 10 Min. a 72°C - mantener a 20°C.

NOTA: todas las temperaturas de la reacción en cadena de polimerasa están + - de aproximadamente 1°C .

Durante optimizaciones, algunas variaciones fueron aplicadas: 45 en vez de 40 ciclos, y variaciones a la temperatura de recocido y - tiempo en el paso de ciclo: las temperaturas entre 46 y 53°C fueron utilizadas, en duraciones de 30 seg. o de 1 minuto.

Para la detección específica del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, usando cebadores 29 y 30 (SEQ ID NO. 30, 31) las condiciones óptimas usadas para la fase de ciclo eran: 45 ciclos, con un paso de recocido de 30 seg. a 51°C. Otras condiciones estaban en cuanto a los cebadores 20/21 de reacción.

Las reacciones de reacción en cadena de polimerasa para las reacciones de secuenciado de ciclo tenían una disposición esencialmente diversa: 25 ciclos de: 10 seg. a 96°C; 5 seg. a 50 °C; y 2 min. a 60°C, vistos a continuación.

Ejemplo 5: Análisis de DNA por electroforesis de gel de agarosa, purificación y sobreproducción: La electroforesis de gel de agarosa fue utilizada para la detección y la visualización de productos de reacción en cadena de polimerasa producidos. También esto sirvió para purificar productos de reacción en cadena de polimerasa por la supresión y extracción, permitiendo la secuencia, o sobreproducción de estos productos extractos de reacción en cadena de polimerasa.

En fin, los geles de agarosa de 0.8% (tipo de electro-endosmosis baja) fueron incluidos en la solución salina TAE (pH 8.0), conteniendo cerca de 50 µ? de 0.5 mg/ml solución del Etidio-Bromuro por 100 mi de solución de agarosa. Una muestra de producto de reacción en cadena de polimerasa fue mezclado 1:10 con solución salina de carga de muestra estándar (azul de glicerol/SDS//bromofenol). Una línea del marcador fue típicamente incluida usando SmartLadder® de Eurogentec™. La electroforesis, sumergida en solución salina TAE, fue realizada típicamente por 1 hora en 100 V para 20 x 20 x 1 cm gel, o hasta que el tinte azul alcanzó el extremo del agar. La visualización estaba al lado de la luz UV. Los geles fueron fotografiados con una cámara digital.

La electroforesis de gel de agar también fue utilizada para estimar la concentración de ADN de una banda suprimida y purificada; en este caso una muestra fue funcionada junto con un número de líneas que llevaban a cabo diversas cantidades de la escalera del marcador de ADN.

La purificación de bandas específicas de los productos de la reacción en cadena de polimerasa de un gel de agarosa fue hecha usando el QIAquick (R) Gel Extraction kit (QiaGen™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando una micro-centrifugadora o el QIAvac® múltiple de vacío.

Las bandas de ADN recortadas y purificadas de gel de agarosa fueron sobreproducidos en plásmidos bacterianos para el uso adicional, tal como reproducción, secuencia, expresión, o análisis de la hibridación-detección. Los fragmentos de la DNA fueron reproducidos en el plásmido pCR2.1 usando un TOPO-TA® vector y TOPO-TAR® equipo de clonación (Invitrogen™), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 6: Secuenciado de ADN: El secuenciado de ADN fue realizado por reacción en cadena de polimerasa de secuenciado en ciclo, usando un Big Dye® Mezclador de Reacción Listo Terminador (ABI Prism™), y un aparato de secuenciado automatizado ABI Prism™ 310, todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Típicamente 20 a 70 ng de ADN (el producto purificado de reacción en cadena de polimerasa, o fragmento reproducido en vector) fue utilizado en una reacción de secuenciado, con 8 pl Big Dye® Mezcla de Reacción Lista Terminadora de reacción, 1 µ? de cebador, en agua destilada a un volumen total de 20 µ?. Los cebadores usados para secuenciado fueron generalmente iguales a aquellas usadas en la reacción en cadena de polimerasa para preparar el producto de la ADN del ADNc.

La reacción en cadena de polimerasa de secuenciado de ciclo fue de 25 ciclos de: 10 seg. a 96°C, 5 seg. a 50°C, y 2 min. a 60°C.

Después de la reacción en cadena de polimerasa, las muestras fueron purificadas usando columnas giratorias DyeEx® (QiaGen™), para el retiro del Dye-Terminator, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando los tubos de Eppendorf® y una micro-centrifugadora. El eluído final fue suspendido de nuevo 1:2 a un volumen total de 40 µ? con agua destilada.

La determinación del secuenciado entonces fue hecha por el análisis en un analizador genético de ABI Prism® 310, con software versión 1.0.4 en análisis de secuenciado, software versión 3.

El análisis de secuenciado fue hecho usando un número de programas, la mayoría usados eran Sequencher® (Gene Codes™), y Clone Manager® (SCi. Ed. Software™). El principio y las secuencias finales fueron recortadas para remover lecturas de nucleótido que fueron introducidas se basaron en los cebadores desnaturalizados de reacción en cadena de polimerasa que fueron utilizadas.

Las secuencias de ADN presentaron aquí en la SEC ID NO: 4-26 (aún números), son las secuencias de consenso derivadas de reacciones de secuenciado múltiples. La mayoría de las veces las secuencias también fueron leídas de los ambos estándar, usando cebadores derechos e inversos; únicamente SEC ID NO: 8 fue determinada de solamente una cadena. La redundancia media fue de aproximadamente 4 x por nucleótido.

Ejemplo 7: Titulación de Astrovirus en huevos embrionados del pollo Las diluciones en serie de diez pliegues de suspensión de Astrovirus fueron inoculados en el saco de yema de huevos de pollo SPF embrionados de seis días de edad usando una aguja 23G 1". Posteriormente, los huevos fueron incubados por siete días a 37°C en una incubadora de huevos.

Los huevos fueron mirados al trasluz diariamente. La mortalidad que ocurría en el plazo de 24 horas después de la inoculación era considerada no específica y por lo tanto tales huevos que contenían embriones anteriormente muertos fueron desechados y excluidos del cálculo del título de la contagiosidad.

Los embriones que morían de 2 a 7 días después de la inoculación fueron examinados para la presencia de lesiones características para infección con Astrovirus de acuerdo con la invención; esto era el caso si los embriones muertos exhibieron piernas y puntas de alas ligeramente rojos, y un hígado rojo oscuro hinchado. El título de la contagiosidad fue calculado usando un programa de computadora basado en el método de Spearman & Karber y fue expresado en ELD50 por mi.

Ejemplo 8: Producción de Astrovirus en huevos embrionados de pollo.

Los huevos embrionados de pollo SPF de nueve días fueron inoculados con 10?5 ELD50 de Astrovirus por huevo en el saco de yema de huevo usando una aguja de 22G 1½. Posteriormente, los huevos fueron incubados a 37°C en una incubadora de huevos.

Después de 24 horas de incubación los huevos fueron mirados al trasluz. La muerte que ocurría en el plazo de 24 horas era considerada no específica, estos huevos fueron eliminados.

Después de 48 horas de incubación el líquido alantoico de todos los huevos restantes fue cosechado. El líquido alantoico fue almacenado congelado debajo de -60°C.

El título de contagiosidad fue establecido por la titulación en huevos embrionados de pollo o en las células como se describe anteriormente.

Ejemplo 9: Producción de células primarias: Las células CEL fueron preparadas a partir de huevos embrionizados viejos de pollo SPF de 14-16 días, aislando el hígado del embrión. El hígado fue lavado con rojo de PBS/fenol, e incubado por 8-10 minutos en la temperatura ambiente en una solución que contenía tripsina en PBS. El sobrenadante se cosecha a través de una gasa de 100 µ?. Esto se repite dos veces más, la siguiente célula es recogida por la centrifugación y suspendida de nuevo en un medio de cultivo rico de cultivo que contiene el suero fetal de becerro de 5% (FCS).

Las células CEK fueron preparadas de una manera similar, usando los ríñones de aproximadamente embriones de pollo SPF viejos de aproximadamente 18 días. Los ríñones fueron pelados, lavados, y tripsinizados suavemente una vez, por 20 minutos a temperatura ambiental. Después, las células CEK fueron filtradas y tomadas en el medio de cultivo+FCS.

Ejemplo 10: Análisis IFT: Las pruebas de inmunofluorescencia (IFTs) fueron utilizadas para investigar la especificidad de cruce de especies de algunos antisueros, así como para la titulación del virus. IFT fue realizado comúnmente en las células primarias en placas del microtitulación .

Cuando las células CEK fueron utilizadas para un IFT, éstas fueron sembradas en 10?5 células/100 µ? en placas de 96 placas de microtitulación. Las células estaban en un medio de cultivo rico estándar, con el FCS de 2% y los antibióticos, e incubadas a 37°C en atmósfera del C02 de 5%. El siguiente día, el virus fue inoculado en las células.

Para los propósitos de la titulación, las diluciones en serie de virus fueron utilizadas. Las placas entonces fueron incubadas por 2 días más. Entonces, el sobrenadante fue removido, y las células fueron fijadas con etanol puro a -70°C. Las placas se podían almacenar a -20°C hasta su uso. Para visualizar el virus para la titulación, las placas fueron manchadas con el antisuero específico. Por lo tanto, las placas fueron adaptadas a temperatura ambiental, el alcohol fue vaciado y las placas fueron lavadas con PBS. Una dilución de suero anti-Astrovirus fue preparada con una fuerza que fue conocida para obtenerse una buena fluorescencia, solamente no demasiado a fondo. Este primer antisuero después fue llevado sobre las placas e incubado por 1 hora a 37°C en una atmósfera húmeda. Las placas entonces fueron lavados 3x con PBS. Después la segunda conjugación de anticuerpo fue preparada, un conjugado IgG-FITC de cabra antipollo (Nordic™). El mismo fue llevado en las placas en la dilución requerida, e incubado otra vez por 1 hora a 37°C. Después de esta incubación las placas fueron otra vez lavadas 3x con PBS, después de lo cual una mezcla 1:1 de PBS: el glicerol fue añadida. Las placas entonces fueron almacenadas en la oscuridad a 4°C hasta la lectura por el microscopio de fluorescencia. Una señal positiva es la detección de fluorescencia específica, correlacionando a las muestras de cpe en la capa de célula.

Para la caracterización de suero, y las pruebas de reacción de cruce de especie, las placas de micro-titulación fueron preparadas de una manera similar, usando las células CEK o CEL. Éstas fueron infectadas el día siguiente con los diversos virus que se probarán, por ejemplo los extractos de Astrovirus de acuerdo con la invención, pero también ANV1, y CAstV2, así como otros patógenos aviares: Reovirus, IBV, NDV, FPV, Adenovirus, AIV, etc. La cantidad de virus fue una cantidad fija o una dilución en lo que fuera conveniente. Las placas fueron incubadas por 2-3 días.

Para probar la capacidad de cierto antisuero de unirse a diversos virus, el suero fue incubado en las placas, y la señal fue aumentada por la incubación con conjugado. Para la optimización de enlace - contra señal de fondo, un número de diluciones de los antisueros en PBS fueron probadas en diversas diluciones de los diversos virus.

Ejemplo 11: Infección de pollos con Astrovirus El Astrovirus aviar de acuerdo con la invención fue probado en pollos en una disposición experimental para reproducir los síntomas de la enfermedad observados en el campo, y para re-aislar el microorganismo de estos animales infectados secundariamente. Esto sirvió para cumplir con los postulados de Koch para establecer el extracto probado como un microorganismo patógeno y virulento y agente infeccioso causativo de los síntomas observados en el campo.

También, los pollos fueron infectados en varias ocasiones para probar la eficacia de vacunación por un inoculo vivo, contra infecciones subsiguientes desafiantes.

Finalmente, el suero total fue extracto de manera experimental de pollos infectados para obtener el antisuero policlonal específico contra el Astrovirus inoculado.

A este propósito, los pollos de tipo capa SPF, de raza de Leghorn blanca y de ambos sexos, fueron transferidos a un extractor de presión negativa en tres semanas de edad. Los animales fueron asignados a los grupos del tratamiento por la selección al azar, y etiquetados individualmente por bandas dobles en ala. La comida estándar y el agua potable eran disponibles como lo deseen.

A intervalos regulares durante el experimento se tomaron las muestras de sangre, también en el día cero, para determinar la situación inmune. Después 15 pollos fueron inoculados por tres rutas: con 0.2 mi cada uno por vía ocular y por vía intramuscular, así como con 0.5 mi por la vía oral, en dosis de 10?5 EID50/0.2 mi, y la dosis de 10?5.4 EID50/0.5 mi. El inoculo era el extracto -19 Astrovirus de acuerdo con lo depositado, suspendido de nuevo en agua para la inyección. 5 pollos, colocados en el mismo extractor no fueron inoculados para servir como controles, y centinelas. Los animales fueron examinados diariamente para las muestras clínicas de enfermedad o de mortalidad.

En el día 20 después de la inoculación (p.i.), un número de pollos sangraron y fueron sometidos a un examen histopatológico post-mortum. En el día 23 p.i. los otros pollos (previamente inoculados) fueron impulsados con una dosis similar del inoculo.

Después de otros 23 días, el experimento fue terminado, los animales vivos fueron sangrados y examinados.

Algunos pájaros quedaron sin ser vacunados inicialmente pero fueron contenidos en los mismos extractores como las aves inoculadas/infectadas; como fue esperado estos pájaros se infectaron con la extensión horizontal del Astrovirus.

Ejemplo 11a: Resultados de histopatología: Los resultados histopatológicos de los ensayos animales eran como sigue: 2 pollos habían muerto, y 5 animales, cuyo 3 controles tenían diarrea. Sobre la histopatología varios animales demostraron más o menos patología severa al riñon y a la zona intestinal a partir del día 7 p.i. Los ríñones presentaron una nefritis intersticial severa, y degeneración tubular como la mayoría de los síntomas más prominentes. El timo y Bursa mostraron linfocitosis; el páncreas mostró apoptosis y atrofia acinar; y el duodeno mostrado embotó y fundió las vellosidades.

La infección horizontal de los pollos de control sin vacunación demostró la virulencia y la contagiosidad del inoculo Astroviral.

Ejemplo 11 b: Resultados de reacción en cadena de polimerasa: Las muestras del riñon de todos los pollos fueron probadas por la reacción en cadena de polimerasa para las muestras del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Después de la homogeneización, y aislamiento de ARN, las muestras RT fueron hechos. Las mismas fueron probadas por la reacción en cadena de polimerasa con los cebadores de la SEC ID NO: 30 y 31. Todas las muestras de animales infectados mostraron positivo, presentando la banda de 260 bp específica que identificaba el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Los controles positivos y negativos apropiados eran incluidos.

Esto demostró que el agente causativo de la mortalidad y de las muestras histopatológicas fueron el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Los síntomas observados, la nefritis y la diarrea, concurrieron con los considerados en el campo. Los problemas con los pies no pudieron ser reproducidos; muy probablemente las aves utilizadas fueron de complexión muy delgada para mostrar estos problemas, y/o condiciones de los pollos SPF en un extractor no mímico suficientemente la presión contagiosa múltiple que un pájaro en el campo experimentó.

Ejemplo 11 c: Resultados del VN: Las cantidades fijas del extracto 19 de Astrovirus fueron incubadas con los antisueros de pollo a partir del día 0, del día 20 y del día 46 p.i., para 1 hora a 37°C. Estas muestras de virus posteriormente fueron inoculadas en huevos embrionados SPF de 6 días de edad, e incubadas por varios días. En 4 días después de la inoculación del huevo, el virus de recepción del embrión tratado con suero en el día 0 había muerto, y las muestras típicas mostraron signos de infección por el Astrovirus aviar de acuerdo con la infección.

Sin embargo, el virus incubado con el suero tomado en el suero del día 20, o del día 46 no había afectado a los embriones. Esto demuestra que el virus del extracto 19 puede ser neutralizado con eficacia por un antisuero específico de pollo.

También esto prueba que los antisueros eficaces con capacidad del VN se pueden inducir en pollos en la inoculación viva con el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Ejemplo 11 d: Resultados de IFT: Los resultados de los análisis de reacción cruzada IFT usando los antisueros policlonales de pollo demostraron que un antisuero anti-extracto 19 no reconoció ningún virus con excepción de los extractos del virus del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención.

Similarmente, los antisueros específicos para ANV1 o para CAstV2 reconocieron igualmente solamente el virus específico contra el cual habían sido aumentados. Igualmente importante fue que ni el anti-ANV1 ni el suero anti-ChAstV2 se enlazan a un virus-extracto de Astrovirus aviar de acuerdo con la invención. Este aplica incluso a las cantidades más altas de anticuerpo ensayado (las muestras menos diluidas).

Asimismo, ninguno de los antisueros contra otros patógeno aviares, más relevante posible es el reovirus, podría enlazarse a los extractos de virus del Astrovirus aviar de acuerdo con la invención, o viceversa.

Esto demostró que el Astrovirus aviar de acuerdo con la invención es un serogrupo nuevo y único, que confirmaron así las diferencias biológicas moleculares únicas identificadas.

Las placas con células CEK fueron infectadas con el extracto 19 Astrovirus, 3er paso, en las diluciones de pliegue de la serie 10 del virus. Después de dos días, las placas fueron fijadas y manchadas con diversos antisueros: - piscina de suero anti extracto 19 del día 33 después de la inoculación, 1 : 20 en PBS, - anti ANV1 (SE-027/2) de la tensión, generado en pollos; 1: 20 en PBS (ANV1 es un extracto alemán ANV1, el cual en el secuenciado de ADN de regiones específicas, parecieron ser muy vinculados de cerca al secuenciado ANV 1 de la referencia de GenBank, que aquí se utiliza). - anti CAstV2 (cepa TS9L), generado en pollos, 1: 500 en PBS (CAstN 1 fue derivado de la muestra que había sido depositada en el CNCM en París, Francia, bajo número de depósito 1-2932). - control negativo, solamente PBS.

Después de la conjugación con IgG anti-pollo de cabra, las placas fueron leídas: Virus? Extracto 19 ANV1 CAstV2 Células CEK 1 Antisuero negativas Anti Positivo Negativo Negativo Negativo Extracto 19 Anti ANV1 Negativo Positivo Negativo Negativo Anti CAstV2 Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Ejemplo 12: Pruebas de vacunación posteriores Vacuna desactivada: Los pavos y los pollos serán vacunados con una vacuna adyuvada de Astrovirus desactivado de acuerdo con la invención, optimizar la dosis de antígeno.

El extracto 19 de Astrovirus fue cultivado en CEL de acuerdo con lo descrito, y se desactiva usando la beta-propiolactona (BPL) bajo control de temperatura y del pH, de acuerdo con protocolos estándar. Astrovirus desactivado se homogeniza en un estándar sin la emulsión que consiste de un aceite mineral ligero y emulsores apropiados, usando protocolos estándar.

Los pavos y los pollos serán albergados en unidades aisladas: 120 pavos convencionales de dos semanas de edad serán asignados a 6 grupos separados (grupo 1 - 6) como vienen a la mano de manera que cada grupo contenga 20 animales. A tres semanas de la edad, los pavos en el grupo 1 - 4 serán vacunados por la ruta intramuscular con/o sin la vacuna de la emulsión, que contiene el extracto desactivado 19 de Astrovirus. Los pavos en el grupo 5 serán vacunados por la ruta subcutánea con la misma vacuna sin emulsión y los pavos en el grupo 6 no serán vacunados para servir como controles.

Semejantemente, 180 pollos SPF tipo capa de un día de edad serán asignados a 9 grupos separados (grupo 7-15) como vienen a la mano de manera que cada grupo contenga 20 pollos.

En tres semanas de edad los pollos del grupo 7 - 10 serán vacunados por la ruta intramuscular con a sin la vacuna de la emulsión, conteniendo el tipo desactivado 3 virus Astro. Los pollos en el grupo 11 - 14 serán vacunados con la misma vacuna por la ruta subcutánea y los pollos en el grupo 15 no serán vacunados para servir como controles.

Antes de que comience el experimento, y en 4, 8, y 12 semanas después de la vacunación, las muestras de sangre fueron tomadas de todos los pavos y pollos. Los sueros serán examinados para la presencia de anticuerpos específicos para el Astrovirus de acuerdo con la invención y sus títulos, por IFT en las células CEL, o por análisis VN.

Este protocolo se puede modificar fácilmente para incluir una duración de estudio de inmunidad si es relevante; por ejemplo manteniendo los pájaros vacunados en extractores por otros 6 - 12 meses más y entonces apliquen una infección desafiadora con un Astrovirus de acuerdo con la infección.

Vacuna viva: Los pollos serán vacunados con una dosis de Astrovirus vivo de acuerdo con la invención, y desafiados posteriormente con Astrovirus, para optimizar la ruta de uso para una vacuna viva de Astrovirus. 100 pollos de criadero de 1 día de edad MDA+ comerciales del anuncio publicitario MDA+ (anticuerpo maternalmente derivado positivo) serán asignados a 5 grupos separados de modo que cada grupo contenga 20 pollos. En un día de edad los pollos en el grupo 1 - 4 serán vacunados con el extracto vivo 19 de Astrovirus de líquido alantoico, a través de gotas en el ojo, aerosol grueso, spray de aerosol, o agua potable. Los pollos en el grupo 5 no serán inoculados para servir como controles sin vacunar. 4 semanas después de la vacunación todos los pollos serán desafiados con un Astrovirus de acuerdo con la invención. Durante tres semanas después del desafío todos los pollos serán observados diariamente para el acontecimiento de las muestras clínicas características para la infección con Astrovirus y/o mortalidad. Veintiún días después del desafío poste-desafíos de los días todos los pollos restantes serán sacrificados, y sometidos al examen histopatológico.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Astrovirus aviar que tiene una región genómica de cuadro de lectura abierta (ORF) 1a, caracterizado porque ORF1a de tal Astrovirus aviar, cuando está comparado al ORF 1 a de virus 1 de de nefritis aviar, contiene un inserto de 12 nucleótidos, dicho inserto siendo colocado entre nucleótidos que corresponden a los nucleótidos numerados 2485 y 2486 de SEC ID NO. 1.

2. Astrovirus aviar de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el inserto de 12 nucleótidos tiene una secuencia de ácido nucleico como se presenta en la SEC ID NO. 2.

3. Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 2, caracterizado porque ORF 1a del Astrovirus aviar dicho comprende una región que tiene una identidad de secuencia de nucleótido de al menos 88% con SEC ID NO: 4.

4. Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 3, caracterizado porque ORF 1a del Astrovirus aviar un producto de reacción en cadena de polimerasa de cerca de 260 nucleótidos se pueden producir en un ensayo de reacción en cadena de polimerasa usando un sistema de los cebadores representados en SEC ID NO: 30 y 31.

5. Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 4, que es un virus como es depositado bajo número CNCM I-3895 en la Colección Nacional de Cultivos de Micro-organismos (CNCM), del instituto Pasteur en París, Francia.

6. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que pueden neutralizar el Astrovirus aviar de las reivindicaciones 1 - 5, en un análisis de neutralización de virus.

7. Preparación antigénica obtenible del Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 5.

8. Una molécula de ADN que comprende una región teniendo una identidad de secuencia de nucleótido de al menos 88% con la SEC ID NO: 4.

9. Una proteína que comprende una región que tiene una identidad de secuencia de aminoácido de al menos 93% con SEC ID NO: 5.

10. Una vacuna que comprende el Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, la preparación antigénica de acuerdo con la reivindicación 7, la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, o la proteína de acuerdo con la reivindicación 9, y un portador farmacéuticamente aceptable.

11. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende al menos un antígeno adicional que se obtiene de un microorganismo patógeno a las aves de corral.

12. Compuesto o composición para el uso en una vacuna para las aves de corral, en donde el compuesto o la composición es el Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 5, el anticuerpo o fragmentos del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, la preparación antigénica de acuerdo con la reivindicación 7, la molécula ADN de acuerdo con la reivindicación 8, o la proteína de acuerdo con la reivindicación 9.

13. Uso de un compuesto o de una composición para la fabricación de una vacuna para las aves de corral, en donde el compuesto o la composición es el Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, el anticuerpo o fragmentos del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, la preparación antigénica de acuerdo con la reivindicación 7, la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, o la proteína de acuerdo con la reivindicación 9.

14. Método para la fabricación de una vacuna para las aves de corral, en donde un compuesto o una composición se mezcla con un portador farmacéutico apropiado, y en donde el compuesto o la composición es el Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, el anticuerpo o fragmentos del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, la preparación antigénica de acuerdo con la reivindicación 7, la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, o la proteína de acuerdo con la reivindicación 9.

15. El equipo de diagnóstico que comprende el Astrovirus aviar de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, el anticuerpo o fragmentos de los mismos de acuerdo con la reivindicación 6, la preparación antigénica de acuerdo con la reivindicación 7, la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 8, o la proteína de acuerdo con la reivindicación 9.