MX2010011849A

MX2010011849A - Composiciones de insulina de accion super rapida.

Info

Publication number: MX2010011849A
Application number: MX2010011849A
Authority: MX
Inventors: Gregory I Frost; Igor Bilinsky; Daniel Vaughn; Barry Sugarman
Original assignee: Halozyme Inc
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2010-12-15
Also published as: US9034323B2; PL2300046T3; EP2300046A2; AU2009241795A1; HK1195728A1; US8568713B2; CA2722628A1; CY1116311T1; KR20140093759A; EP2705850B1; RS53945B1; CL2009001014A1; PT2300046E; KR20110021818A; PE20141384A1; EA029502B1; EA201001698A1; BRPI0911782A2; ES2572267T3; AR072250A1

Abstract

Se proporcionan combinaciones, composiciones y kits que contienen una composición de insulina de acción rápida y una composición de enzimas que degrada el hialuronano formulada para administración parenteral. Tales productos se pueden usar en métodos de tratamiento de enfermedades o condiciones que se tratan con insulina. También se proporcionan métodos para la administración de una insulina de acción rápida y una enzima que degrada hialuronano.

Description

COMPOSICIONES DE INSULINA DE ACCION SUPER RÁPID CAMPO DE LA INVENCION Se proveen combinaciones, composiciones y e ontienen una composición de insulina de acción r composición de enzima degradadora de hial iadas para administración parenteral . Dichos pr eden utilizar en métodos para tratar enferme ciones tratables con insulina. También se os para administración de insulina y una dadora de hialuronano.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La diabetes da como resultado hiperglucemia abetes tipo 2 y diabetes gestacional , con el r la respuesta de insulina endógena que se pres iduos normales. La insulina también ha sido admi cientes criticamente enfermos con hiperglucem olar los. niveles de glucosa sanguínea.

Típicamente, a dichos individuos se les adm inas de acción rápida en respuesta a hiperglu anticipación a la hiperglucemia, tal como desp mo de un alimento, lo cual puede dar como r ol glucémico. Sin embargo, las formas actuales d a de las insulinas tienen un retraso en la abso n, y por lo tanto no se aproximan a la acción r sulina endógena. Por lo tanto, dichas formulaci n lo suficientemente rápido para detener la pr ucosa hepática que ocurre poco después de esta de liberación de insulina. Debido al retraso istren a un individuo, lo que lleva a control g fectivo y a una reducción de los efectos sec ivos de la terapia con insulina, tal como gana SUMARIO DE LA INVENCION Se proveen composiciones de insulina de -rápida que pueden actuar más rápidamen mentar la exposición sistémica durante un per o preseleccionado en comparación con las compos ción rápida. Por lo tanto, se proveen composici ina de acción súper-rápida . Las composiciones c antidad terapéuticamente efectiva de una insu n rápida y una cantidad de una enzima degrada ronano para hacer que la composición sea de ina para lograr el control glucémico y reducir el entos hiperglucémicos y/o hipoglucémicos . Las do de insulina utilizadas en las composiciones de i ción súper-rápida pueden reducir el riesgo de eso y obesidad en los individuos diabético siciones se pueden proveer en cualquier conte ulo apropiado, tal como en un frasco estéril, j cho, pluma de insulina, bomba de insulina o ito de sistema de bucle cerrado.

En la presente solicitud se proveen compos sulina de acción súper-rápida que contienen una éuticamente efectiva de una insulina de acción controlar los niveles de glucosa en sangre dad de una enzima degradadora de hialuronano suf hacer que la composición sea una composición de i ción súper-rápida. También se proveen métod mticlad terapéuticamente efectiva de insulina de a es desde o desde aproximadamente 10 U/ml hasta madamente 500 U/ml de insulina, y la iente de una enzima degradadora de hialurona que la composición sea una composición de insu n súper-rápida es fyncionalmente equivalente a o aproximadamente 1 U/ml, 2 U/ml, 3 U/ml, 4 6 U/ml, 7 U/ml, 8 U/ml, 9 U/ml, 10 U/ml, 15 U o 25 U de actividad de hialuronidasa/ml . En los, la cantidad suficiente de una enzima degrad ronano para hacer que la composición sea una com nsulina de acción súper-rápida es funció alente a por lo menos o aproximadamente 30 o 35 tividad de hialuronidasa/ml. Por ejemplo, la can ina de acción rápida en las composiciones puede s roximadamente 10 U/ml, 20 U/ml, 30 U/ml, 40 U 500 U/ml, 600 U/ml , 700 U/ml, 800 U/ml, 900 U/m 2000 U/ml, 3000 U/ml o 5000 U/ml . El volume sición puede ser, por ejemplo, de o de aproximad mi, 5 mi, 10 mi, 20 mi o 50 mi. En algunos ejem sición está formulada para suministro media ma de bucle cerrado, una pluma de insulina o un sulina, y puede estar formulada para administra individual o administración en dosis múltiples.

En algunas modalidades, la C éuticamente efectiva de la insulina de acción rá que la cantidad terapéuticamente efectiva ina de acción rápida requerida para lograr e o terapéutico en ausencia de la enzima degrada ronano . La cantidad de enzima degradadora de hial ficiente para lograr una exposición sistémica a i S por lo menos o aproximadamente 30% mayor a tr imadamente 30% mayor a través de los primeros 0, 120 o 180 minutos después de la administración olismo de la glucosa sistémica a través de do después de la administración parenteral de 1 ina de acción rápida sin una enzima degrada ronano. En todas las composiciones provistas nte solicitud y en los métodos provistos en la itud, las cantidades de cada componente pueden diendo del individuo al que se le administ siciones y/o de la insulina de acción rápida pa zcla de las mismas) que se provea. Si fuera nec antidades se pueden determinar empíricamente.

Se proveen composiciones de insulina que co antidad terapéuticamente efectiva de una insu n rápida y una cantidad de una enzima degrada ronano. La cantidad de enzima degradadora de hial n súper-rápida resultante dé como result mentp del nivel de glucosa en sangre después ros 30, 45, 60, 90, 120 o 180 minutos despué istración parenteral que es por lo me imadamente 20% a 30% menor que el incremento es de glucosa en sangre a través del mismo per o después de la administración parenteral de l ina de acción rápida sin una enzima degrada ronano. El incremento en el nivel de glucosa s ser de por lo menos o aproximadamente 30%, 30 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% menor mento en el nivel de glucosa sanguínea despué istración parenteral de la insulina de acción ráp nzima degradadora de hialuronano.

También se proveen composiciones de insu súper-rápida que contienen una En las composiciones de insulina de acción a provistas en la presente solicitud, los ejem dades de insulina (es decir, la cantidad sición provee para una dosis individual) so madamente de 0.05 Unidades, 0.06 Unidades des, 0.08 Unidades, 0.09 Unidades, 0.1 Unidad des, 0.3 Unidades, 0.4 Unidades, 0.5 Unidade des, 0.7 Unidades, 0.8 Unidades, 0.9 Unidades, 1 idades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidad des, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 U idades o 100 Unidades. Los ejemplos de cantid a degradadora de hialuronano incluyen una c onalmente equivalente a o aproximadamente des, 0.5 Unidades, 1 Unidad, 3 Unidades, 5 Unida des, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 U nidades, 150 Unidades, 200 Unidades, 250 Unidad imadamente 5%, 10%, 20%r 30%, 40%, 50%, 60%, 70 100%, 120%, 140%, 160%, 180%, 200%, 300% o 400 a exposición sistémica después de la adminis teral de insulina en ausencia de la enzima deg ialuronano. Las composiciones de insulina de -rápida provistas en la presente solicitud pueden olismo de la glucosa sistémica (es deci ificación de la remoción de glucosa a partir e expresada ya sea como una tasa (cantidad/ti la cantidad total durante un periodo de terminado) que es por lo menos o aproximadamen 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 140%, 160% 250%, 300%, 350% o 400% mayor que el metabol sa sanguínea después de la administración párent ina sin una enzima degradadora de hialuronano.

Las composiciones de insulina de acción mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 .7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM o Las composiciones de insulina de acción a en la presente solicitud generalmente incluye oncentración de zinc típicamente es de imadamente 0.002 miligramos por cada 100 unid ina (mg/100 U) , 0.005 mg/100 U, 0.01 mg/100 U 0 U, 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0.017 mg mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 026 mg/100 U, 0.28 mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04 05 mg/100 U, 0.06 mg/100 U, 0.07 mg/100 U, 0.08 mg/100 U. En general, las insulinas de acción r lan con zinc; la cantidad utilizada en la itud puede ser una cantidad que conserve l ntración de zinc cuando se combina con la dadora de hialuronano. Las composiciones de iría de acción rápida y EDTA cálcico a una relaci >roximadamente 1:3 a 10:1 con respecto a la insu n rápida.

Las composiciones de insulina de acción a también incluyen opcionalmente un modific idad, tal como, pero sin limitarse a, un ami lcohol, tal como glicerol, y/o una sal, ta ro de sodio. La osmolalidad de la composición pu de aproximadamente 200 mOsm/kg, 220 mOsm/ kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 Osm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg o 400 mOsm/kg. E iado para administración parenteral, tal imadamente o 5.5 a 8.5, particularmente, 6 a aproximadamente o es 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.6, 7.8 u 8. Las composiciones pueden almente un estabilizador para la insulina de , 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 g/ml, 0.8 mg/ml , 0.9 mg/ml o 1 mg/ml. El poli estar incluido, por ejemplo, a una concentraci roximadamente 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, %, 00.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, , 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% o 0.1%. Otros ingre ales incluyen, por ejemplo, un depurador de omo ácido ascórbico, ascorbato, ácido cítrico, c ina, los cuales pueden estar a una concentraci mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM, o 20 mM, y/o albúmina rvador, tal como un compuesto que contenga un tico, por ejemplo, m-cresol o fenol.

La insulina de acción rápida puede se lo, monomérica o multimérica, tal como dimé érica. Entre las insulinas de acción rápida es inas regulares, tal como, pero sin limitarse a, i ácidos indicada como las posiciones de resi ácido 25-54 de SEQ ID NO: 123. La insulina puede ina recombinante o puede ser sintetizada o parci tizada o se puede aislar a partir de una fuente sulina puede ser un análogo de insulina. Los eje gos de insulina es un análogo de insulina ciona de entre una insulina con una cadena ene o que tiene una secuencia de aminoácidos indi D NO: 103 y una cadena B que contiene o que ti ncia de aminoácidos indicada en cualquiera de 147-149. En algunos ejemplos de composicio ina de acción súper-rápida, la insulina de acció na insulina humana de acción rápida. Ademá siciones de insulina de acción súper-rápida er mezclas de insulinas. Las mezclas pued inas de acción rápida, o mezclas de una insu ronidasas, particularmente hialuronidasas s como una PH20, o una forma truncada de la mi puede ser, por ejemplo, una PH20 de ovino, b ada de humano. Se incluyen aquellas que contiene n una secuencia de aminoácidos indicada en cualq D NOS: 1-39 y 67-96 y las formas truncadas de las iantes alélicas, variantes de especie u otras v s mismas. PH20 truncada de humano, particularme s truncadas solubles, incluye cualquiera de éptidos que tienen una secuencia de aminoácidos i alquiera de SEQ ID NOS: 4-9, o variantes alé variantes de las mismas. Las variantes ronidasas típicamente tienen por lo menos 40%, 50 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 6 99% o más de identidad de secuencia con cualqu D NOS: 1-39 y 67-96, particularmente con las S truncadas de las mismas o variantes a ntes de especie y otras variantes de las mism tes típicamente tienen por lo menos 40%, 50%, 60 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 7 más de identidad de secuencia con un pol ado en cualquiera de SEQ ID NOS. 98-100 o oitinasa de tipo silvestre.

Las composiciones de insulina de acción a provistas en la presente solicitud se pueden f administración de dosis múltiples, para dilució osis deseada o para administración de dosis ind ejemplos de cantidades terapéuticamente efect ina dependen de la insulina en la composición iduo al que se le administra la composición, dades de dosis individual, por ejemplo, imadamente de 0.05 Unidades, 0.06 Unidades des, 0.5 Unidades, 1 Unidad, 2 Unidades, 3 Unid des, 5 Unidades, 10 Unidades, 20 Unidades, 30 U idades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidad des, 250 Unidades, 300 Unidades, 350 Unidad des, 450 Unidades, 500 Unidades, 600 Unidad des, 800 Unidades, 900 Unidades o 1000 Unid idad de hialuronidasa .

Las composiciones de insulina de acción a se pueden formular para suministro mediante un roveen sistemas de bucle cerrado para contro es de glucosa en sangre. Los sistemas son cual idos por los expertos en la técnica, pero mod que contengan la insulina de acción rápida y la dadora de hialuronano como las descritas en la itud y apropiados para dosificación o programaci istrar dosis terapéuticas de insulina de acción stema de bucle cerrado para controlar los niv sa en sangre que contiene un depósito que conti ina de acción rápida y un segundo depósito que nzima degradadora de hialuronano.

Los sistemas de bucle cerrado pueden almente uno o más de un detector de glucosa, un uministro para suministrar la enzima degrada ronano y la insulina de acción rápida y amado para integrar las funciones de bombeo y mo el cual se suministran la enzima degradad ronano y la insulina de acción rápida para lo ol glucémico que imite el control glucémico iduo no diabético. Los sistemas de bucle cerrado n contener en un depósito separado o mezclada ina de acción rápida y/o hialuronano, una insu n más lenta, tal como una insulina basal . El puede contener desde o aproximadamente 0.1 U nidades, 0,3 Unidades, 0.4 Unidades, 0.5 Unidad des, 0.7 Unidades, 0.8 Unidades, 0.9 Unidades, 1 idades, 5 Unidades, 10 Unidades, 15 Unidad des, 25 Unidades, 30 Unidades, 35 Unidades, 40 U idades, 100 Unidades, 200 Unidades, 300 Unidad des, 500 Unidades, 600 Unidades, 700 Unidad des, 900 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidade des, 6000 Unidades, 7000 Unidades o más de insul ma de bucle cerrado puede suministrar cuale dades o incrementos de dosis deseadas de insul a degradadora de hialuronano , tal como o aproxim Unidades, 0.1 Unidades, 0.2 Unidades, 0.3 Unidad des, 0.5 Unidades, 0.6 Unidades, 0.7 Unidad des, 0.9 Unidades, 1 Unidad, 2 Unidades, 5 Unida des, 15 Unidades, 20 Unidades, 25 Unidades, 30 U des, 600 Unidades, 700 Unidades, 800 Unidade des, 1000 Unidades, 2,000 Unidades, 3,000 U Unidades, 5,000 Unidades, 6,000 Unidades, des, 8,000 Unidades, 9,000 Unidades, 10,000 U 0 Unidades o más de actividad de hialuronidasa, istrar la enzima degradadora de hialuron mentos de dosis individuales de una cantidad de dadora de hialuronano que es funcionalmente equi aproximadamente a, por ejemplo, 0.3 Unidade des, 1 Unidad, 2 Unidades, 3 Unidades, 5 Unida des, 20 Unidades, 30 Unidades, 40 Unidades, 50 U Unidades, 150 Unidades o más de activi ronidasa.

También se proveen combinaciones que contie ra composición que contiene desde o imadamente 10 U hasta o hasta aproximadamente 5 ronidasa/ml . En algunos ejemplos, la cantidad suf nzima degradadora de hialuronano es funcio alenté a por lo menos o aproximadamente 35 idad de hialuronidasa/ml. Por ejemplo, la cant a degradadora de hialuronano en la segunda com ser funcionalmente equivalente a o aproximadame 2 U/ml, 3 U/ml, 4 U/ml , 5 U/ml, 6 U/ml, 7 U/ml , l, 10 U/ml, 15 U/ml, 20 U/ml, 25 U/ml, 30 U/ml, 3 U/ml, 40 U/ml, 50 U/ml, 60 U/ml, 70 U/ml, 80 ü 100 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ 700 U/ml, 800 U/ml, 900 U/ml, 1000 U/ml, 200 U/ml o 5000 U/ml. En algunos ejemplos, la cant ina de acción rápida en la primera composición roximadamente 10 U/ml, 20 U/ml, 30 U/ml, 40 U 60 U/ml, 70 U/ml, 80 U/ml, 90 U/ml, 100 U/ml, 15 /ml, 250 U/ml, 300 U/ml, 350 U/ml , 400 U/ml, 450 tante sea una composición de insulina de acción a. En otros casos, la cantidad de la enzima deg aluronano es suficiente si se administra ante istración de la primera composición para hacer sición de insulina de acción rápida sea una com sulina de acción súper-rápid .

En las combinaciones provistas en la itud, las insulinas de acción rápida y las dadoras de hialuronano y otros componentes son ibieron anteriormente para las composiciones. Ta en estuches que contienen las combinacion sición de insulina se puede formular para admi osis prandial para un alimento individual, ta sin limitarse a, aproximadamente 0.001 U/kg, 0.00 U/kg, 0.02 U/kg, 0.03 U/kg, 0,04 U/kg, 0.05 U/k 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.09 y/kg, 0.10 U/kg, 0.1 ,000 U, 3,000 U, 4,000 U, 5,000 U o má siciones en la combinación se pueden formul istración subcutánea.

Se proveen métodos en los cuales se administ siciones y combinaciones de insulina de acción a provistas en la presente solicitud. Típicamente istración es administración parenteral, tal como venosa, subcutánea o cualquier vía apropia uiera de los métodos provistos en la presente so sulina de acción rápida y la enzima degrada ronano se pueden administrar por separado, de mitente, o juntas en composiciones separadas iadas . También se proveen métodos para contro es de glucosa en un individuo mediante administr uiera de las composiciones o combinaciones de i ción súper-rápida provistas en la presente solici de un alimento, en menos de o aproximadam os después de un alimento, en los cuales la insu n rápida se coadministra con una cantidad sufici a degradadora de hialuronano para hacer sición de insulina de acción rápida sea una com ción súper-r pida . La insulina de acción rápi a degradadora de hialuronano se pueden co-for er por separado pa a coadministración. En os, al paciente se le puede enseñar a adminis sición de insulina de acción rápida en o aproxim mento de ingestión de un alimento. En algunos ej nstrucciones están por escrito. En otros ejempl ucciones son orales.

Se proveen métodos para controlar los niv sa en sangre en un individuo, administrando iduo una enzima degradadora de hialuronano a en ausencia de una enzima degradadora de hial b) reducir la cantidad de tiempo que se to zar la concentración máxima de insulina en la no más de 80% del tiempo que se toma para alea ntración máxima de insulina en la sangre cu ina de acción rápida se administra en la misma m cia de una enzima degradadora de hialuronano; y/o c) incrementar la concentración de insu os después de la administración en por lo n madamente 50, 60, 70, 80, 90 o 100 pmol/1.

Debido a los métodos, el incremento máxim tración de insulina en la sangre es de por lo imadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 140%, 160%, 180%, 200%, 250%, 300%, 350% o 400 i incremento máximo en la concentración de insu r lo menos o aproximadamente 60 pmol/1, 80 pmol , 120 pmol/1; 140 pmol/1, 160 pmol/1, 180 pmol/1 .

En las modalidades de ejemplo, los in ticos tienen diabetes ya sea Tipo 1 o Tipo 2 dad de insulina de acción rápida administr iduo se reduce en comparación a cuando la insu n rápida se administra en la misma manera en ause enzima degradadora de hialuronano. Por ejemp dad de insulina de acción rápida administrad iduo diabético Tipo 1 se puede reducir en por lo imadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, o má dad de insulina de acción rápida administrad iduo diabético Tipo 2 se puede reducir en por lo imadamente 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60 más . ticos pueden ser obesos o estar en riesgo de obe n tener diabetes Tipo 1, diabetes Tipo 2, cional u otra diabetes. Los ejemplos de in ticos son individuos diabéticos Tipo 2. En un olar o prevenir la obesidad en un individuo diab administrando a un individuo diabético obes iduo diabético en riesgo de obesidad una éuticamente efectiva de una insulina de acción r nación con la enzima degradadora de hialuron sición se puede administrar en o aproximadamen de los alimentos, y a) la cantidad de enzima degradadora de hial ficiente para convertir la insulina de acción istrada en una insulina de acción súper-rápida; y b) la dosis de insulina de acción rápid cialmente el mismo grado de depuración de idades de ejemplo, los individuos diabéticos tes Tipo 2, y la cantidad de insulina de acción istrada al individuo se reduce en comparación a sulina de acción rápida se administra en la misma sencia de una enzima degradadora de hialurona lo, la cantidad de insulina de acción istrada a un individuo diabético Tipo 2 se puede r lo menos o aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o más.

También se proveen métodos para reducir o p ancia de peso asociada con terapia de insulina p istrando por vía subcutánea a un individuo diabé O de ganancia de peso a partir de la terapia de i ial, en o aproximadamente a la hora de los ali omposición de insulina que contenga una insu n rápida y una enzima degradadora de hialuron bilidad de ocasionar ganancia de peso en el in jemplo, a un individuo diabético tipo 2 se l istrar una composición de insulina como la iormente que contiene una cantidad de insulina d a que es por lo menos o aproximadamente 5%, 10 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o 80% menos que la misma insulina de acción rápida requerida para perglucemia cuando se administra en la misma ma cia de la enzima degradadora de hialuronano. En la composición de insulina se administra en un co de terapia de insulina prandial.

En la presente solicitud se proveen métod ir o prevenir la ganancia de peso en un i tico administrando a un individuo diabético en ri cia de peso a partir de la terapia de insulina p rso de terapia de insulina prandial subcutánea a glucemia post-prandial del individuo es menor dad de la misma insulina de acción rápida requeri r la hiperglucemia en ausencia de la enzima deg aluronano. Dicho curso de terapia de insulina dar como resultado menos ganancia de peso que u rapia similar que utilice dosis más altas de ins n rápida en ausencia de enzima degradad ronano .

También se proveen métodos para control es de glucosa en un individuo administrando al i osis prandial de composición de insulina de -rápida, en los cuales: a) la composición de insulina de acción a comprende una cantidad terapéuticamente efec nsulina de acción rápida y una enzima degrada ronano; d) la dosis de la composición de insulina d -rápida tiene por lo menos el mismo efecto ter la insulina regular de acción rápida sin la dadora de hialuronano.

La composición de insulina de acción súpe ejemplo, se administra, o está recomendad istración, en menos de o aproximadamente 20 de un alimento, en menos de o aproximadamente os después de un alimento. Típicamente, la dosi ina de acción rápida en la composición de insu n súper-rápida es menor o igual a la dosis ina de acción rápida administrada mediante la mi sencia de la enzima degradadora de hialuronano.

En la práctica de cualquiera de los stos en la presente solicitud, las composici n administrar mediante cualquier vía aprop ial para un alimento individual y es de imadamente 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg, 0. O U/kg a 0.30 U/kg, tal como 0.05 U/kg, 0.06 U/k 0.08 U/kg, 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0. i y/kg, 0.14 U/kg, 0.15 U/kg, 0.20 U/kg, 0.25 U/k 0.40 U/kg, 0.50 U/kg, 1.0 U/kg, 1.5 /kg o 2 U dad de enzima degradadora de hialuronano adminis iduo es para coadministración (por separado, de mitente, o juntas en composiciones separadas iada) con una dosis prandial de insulina de a para un alimento individual. La cantidad de dadora de hialuronano puede ser o es de aproxim , 0.5 U, 1 U, 2 U, 5 U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U , 150 U, 200 U, 250 U, 300 U, 350 U, 400 U, 450 0 U, 700 U, 800 U, 900 U, 1000 U, 2,000 U, 3 Unidades, 5,000 U o más. istran las composiciones y combinaciones provista te solicitud.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra los perfiles farmacoci álogo de insulina de acción rápida, insulina H la insulina regular de acción rápida, insulina ando se administran por vía subcutánea con o istración de rHuPH20. La concentración de insu a a diversos puntos de tiempo después istración a individuos sanos normales utiliz dimiento de pinza Hiperinsulinémica-Euglucém mina mediante radioinmunoensayo (RIA) .

La figura 2 muestra los perfiles farmacodi álogo de insulina de acción rápida, insulina H DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Sumario A. Definiciones B. "Insulina de "acción súper-rápida" 1. Generalidades de Insulina, Diab ias existentes de insulina de acción rápida 2. Farmacodinámica y farmacocinética sición de insulina de acción súper-rápida C. Polipéptidos y formulación de insulina D. Enzimas degradadoras de hialuronano 1. Hialuronidasas a. Hialuronidasas tipo mamífero b. Hialuronidasas bacterianas c. Hialuronidasas de sanguijuelas, d parásitos y de crustáceos hialuronano para mejorar sus propied farmacocinéticas E. Métodos para producir ácidos nuclei ican para una hialuronidasa soluble y polipéptido 1. Vectores y células 2. Porciones enlazadoras 3. Expresión a. Células procariotas b. Células de levadura c. Células de insecto d. Células de mamífero e. Plantas 4. Técnicas de purificación F. Preparación, formulación y administra ina y polipéptidos de hialuronidasa soluble d. Sistemas de bucle cerrado G. Métodos de evaluación de ac sponibilidad y farmacocinética 1. Farmacocinética, farmacodinámica y tolerabilidad 2. Actividad biológica a. Insulina b. Enzimas degradadoras de hialuro H. Usos terapéuticos 1. Diabetes Mellitus a. Diabetes Tipo 1 b. Diabetes Tipo 2 c. Diabetes gestacional 2. Terapia de insulina para pacientes criticamente enfermos I. Terapias de combinación invención (es ) . Tocias las patentes, solicit te, solicitudes publicadas y publicaciones, se enbank, bases de datos, sitios en la red iales publicados a los que se hace referencia a da la descripción completa en la presente solic que se indique lo contrario, quedan incorporad encia en sus totalidades. En caso que exis Üdad de definiciones para términos en la itud, prevalecen aquellos en esta sección. En e ue se haga referencia a un URL u otro de ificadores o direcciones, se entiende que ificadores pueden cambiar y la información partic nternet puede ir y venir, pero se puede e mación equivalente buscando en la Interne encias en las mismas evidencian la disponibi inación pública de dicha información. ína hacia el retículo endoplasmático (RE) en el la secuencia de señal, lo que da como r sulina (SEQ ID NO: 102) . La proinsulina es p onalmente para liberar el péptido de caden tora de 31 aminoácidos (correspondiente a los inoácido 57 a 87 del polipeptido de prepro ado en SEQ ID NO: 101, y a los residuos de amino del polipéptido de proinsulina indicado en SEQ La insulina resultante contiene una cadena A ácidos (que corresponde a los residuos de aminoá del polipéptido de preproinsulina indicado en 101, y a los residuos de aminoácido 66 a éptido de proinsulina indicado en SEQ ID NO: 102 a B de 30 aminoácidos (que corresponde a los resi ácido 25 a 54 del polipéptido de preproinsulina i Q ID NO: 101, y a los residuos de aminoácido 1 a oinsulina, proinsulina e insulina en formas de idual o de cadena doble, formas truncadas de las tengan actividad, e incluye variantes alél ntes de .especie, variantes codificadas por varia e, y otras variantes, tales como análogos de i endo polipéptidos que tienen por lo menos 40 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97 más de identidad de secuencia con el poli rsor indicado en SEQ ID NO: 101 o la forma madura S . Los análogos de insulina de ejemplo incluyen a ados en SEQ ID NOS: 147-149, 152, y aquell enen una cadena A indicados en SEQ ID NOS: 15 160, 162 y 164 y/o una cadena B indicados en SEQ 153-155, 157, 159, 161, 163 y 165.

Los ejemplos de polipéptidos de insuli los de origen mamífero, incluyendo de origen huma alquiera de los polipéptidos precursores de i ados en SEQ ID NOS: 105-146. La referencia ina incluye insulinas monoméricas y multi yendo insulinas hexaméricas , así como i izadas .

Tal como se utiliza en la presente sol lina de acción rápida" se refiere a cualquier ins sición de insulina de acción rápida para adminis a un individuo diabético en respuesta a una c glucémica real percibida, o anticipada en el i urge al momento de, o dentro de aproximadamente después de la administración de la insulina de a (tal como una condición hiperglucémica prand ta o que se anticipa va a resultar de, consum nto) , con lo cual la insulina de acción rápid r, controlar o mejorar la condición hipergl ina diseñados para ser de acción rápida debido a inoácido. Los ejemplos de preparaciones de ar incluyen, pero no se limitan a, insulinas r mano, tales como aquellas vendidas bajo las ciales Humulin0 R, Novolin R y Velosulin0, a USP, e inyección de insulina humana USP, a laciones ácidas de insulina, tales como, por ina Toronto, Insulina Antigua (Oíd Insulin) , e (Clear Insulin) , e insulinas regulares de cerdo Iletin ??F (insulina porcina) . Los ejemplos de sulina de acción rápida incluyen, por ejemplo, i o (por ejemplo, insulina Humalog ), insulina aspa lo, insulina NovoLog0) , e insulina glulisin lo, insulina Apidra ) la composición de insu n rápida vendida como VIAject y VIAtab® (véa lo, patente E.U.A. No. 7,279,457). Aunque el éptido humano, incluyendo variantes alélicas y S mismas.

Tal como se utiliza en la presente so inas humanas de acción rápida o composicio ina humana de acción rápida incluyen cualquier a o composición de una insulina humana que n rápida, pero excluye las insulinas no humanas la insulina regular de cerdo.

Tal como se utilizan en la presente solicit nos "insulinas de acción basal", o "insulinas fieren a insulinas administradas para mantener u de insulina como parte de un régimen de tra al para tratar una condición crónica tal como di amente, una insulina de acción basal se formu er un nivel de insulina en estado aproxim ante mediante la liberación controlada de i esente solicitud, las insulinas de acción basal ir insulinas que típicamente se entienden como d gada (alcanzando típicamente una concentración ivamente baja, al tiempo que tienen una duración ción de alrededor de 20-30 horas) o de acción in típicamente causan concentraciones de insulina roximadamente 4-12 horas después de la administra Tal como se utiliza en la presente sol osición de insulina de acción súper-rápida" se re omposición de insulina que contenga una insu n rápida y una enzima degradadora de hialurona una hialuronidasa soluble, incluyendo pero sin l eparaciones de rHuPH20) , de modo tal que la com nsulina, a través de los primeros cuarenta és de la administración parenteral a un in a una exposición de insulina sistémica acumulativ Tal como se utilizan en la presente solicit nos "condición hiperglucémica" o "hipergluce ren a una elevación indeseada de glucosa sanguíne Tal como se utilizan en la presente solicit nos "condición hipoglucémica" o "hipoglucem ren a una caída indeseada en la glucosa sanguínea Tal como se utilizan en la presente sol ración de glucosa sistémica" o "metabolismo de mica" se refieren a la remoción de glucosa a pa angre y se puede expresar ya sea como uñ idad/tiempo) o cantidad (cantidad con respect do de tiempo) . La depuración de glucosa .sisté determinar utilizando cualquier método a ido en la técnica. Por ejemplo, la depuración de mica se puede medir utilizando el Procedimiento D insulinémica-Euglucémica bajo condiciones de ayu istración de una composición . de insulina de rápida contra la lograda por una insulina de a, se puede determinar, por lo tanto, utilizando dimientos. La diferencia en la depuración de mica entre insulinas de comparación también s minar midiendo la actividad de reducción de iva de las insulinas de comparación en un det en el tiempo después de una prueba de expos sa. Por ejemplo, se puede utilizar una pr ición a glucosa (tal como, por ejemplo, una pr ancia a la glucosa de 75 g orales o una formula to de prueba normalizado, bien conocidas tos en la técnica) para comparar preparaci ina diferentes. En dichas pruebas de exposic istra una cantidad de glucosa u otro carbohidra iduo, seguido inmediatamente por una adminis ción de glucosa sistémica. Los estudios d iormente para determinar la depuración de mica se pueden efectuar utilizando modelos anima idúos humanos .

Tal como se utilizan en la presente sol ol glucémico o "controlar los niveles de inea" se refieren al mantenimiento d ntraciones de glucosa sanguínea a un nivel amenté entre 70-130 mg/dl o 90-110 mg/dl.

Tal como se utilizan en la presente sol sición a insulina sistémica acumulativa" o "ex mica acumulativa a insulina" se refieren a la c sulina que ha sido absorbida en la sangre despué istración parenteral de la insulina. La exp mica acumulativa a insulina se puede det iando el área bajo la curva para un periodo de yendo una composición de insulina, y un mecahis minar la cantidad de insulina que necesi istrada para lograr el control glucémico. Tipi o tanto, los sistemas de bucle cerrado conti tor de glucosa, un dispositivo para sumini ina, tal como una bomba de insulina, y un con ecibe la información proveniente del detector de vee comandos al dispositivo para suministro de i omandos pueden ser generados por el software olador. El software típicamente incluye un a determinar la cantidad de insulina que neces istrada para lograr el control glucémico, toman los niveles de glucosa sanguínea detectados tor de glucosa o anticipados por el usuario.

Tal como se utiliza en la presente so en de dosificación se refiere a la cantidad de aluronano son las hialuronidasas , y en particu oitinasas y liasas que tienen la capaci limerizar el hialuronano. Los ejemplos de condro on enzimas degradadoras de hialuronano incluyen, mitan a, condroitina ABC liasa (también conoci oitinasa ABC) , condroitina AC liasa (también condroitin-sulfato liasa o condroitin-sulfato el droitina C liasa. La condroitina ABC liasa compr as, condroitin-sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2. oitin-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Los ndroitin-sulfato-ABC endoliasas y condroitin-sul asas incluyen, pero no se limitan a, nientes de Proteus vulgaris y Flavobacterium h ondroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulg a en SEQ ID NO: 98; Sato et al. (1994) Appl . i chnol. 41 ( 1) : 39-46 ) . Los ejemplos de las provenientes de Streptococcus y Flavobacteriu . (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48 (2) : 121-4 Michel 1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. J. Biochem. 262:127'-133) .

Tal .como se utiliza en la presente sol ronidasa se refiere a una clase de enzimas degra hialuronano. Hialuronidasas incluye hialuro rianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuro ientes de sanguijuelas, otros parásitos, y cru 3.2.1.36), y hialuronidasas de tipo mamífe .35). Hialuronidasas incluye cualquiera de or o incluyendo, pero sin limitarse a, múrido, o, leporino, aviar, bovino, ovino, porcino, equ , de ranas, bacterianas, y cualesquiera provenie ijuelas, otros parásitos, y crustáceos. Los ejem ronidasas no humanas incluyen, hialuro 8), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29), cobayo (SEQ Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO ovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68) , Propionib (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae ( (SEQ 18RS21 (SEQ ID NO: 71); serotipo la (SEQ ID N ipo III (SEQ ID NO: 73) , Staphylococcus aureu (SEQ ID NO: 74); cepa MRSA252 (SEQ ID NOS: 75 MSSA476 (SEQ ID NO: 77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID bovina RF122 (SEQ ID NOS: 79 y 80); cepa USA300 l) , Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO: 82); ce 55/R6 (SEQ ID NO: 83); serotipo 2, cepa D39/NC ID NO: 84), Streptococcus pyogenes (serotipo MI) 5); serotipo M2 , cepa MGAS 10270 (SEQ ID N ipo M4, cepa MGAS 10750 (SEQ ID NO: 87); sero ID NO: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID ; serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 91); s (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO: 38), HYAL4 9) , y PH20 (SEQ ID NO: 1) . Entre las hialur én están incluidas las hialuronidasas s yendo, PH20 de ovino y bovino, PH20 soluble de 20 soluble. Los ejemplos de hialuronidasas solu o u ovino comercialmente disponibles son uronidasa de ovino) y Amphadase® (hialuroni o) .

La referencia a enzimas degradadoras de hia ye polipéptidos precursores de enzima degrada ronano y polipéptidos de la enzima degrada ronano madura (tales como aquellos en los cuale ado una secuencia de señal) , formas truncadas s que tengan actividad, e incluye variantes alé tes de especie, variantes codificadas por varia me, y otras variantes, incluyendo polipépti las que contienen modificaciones químicas o cción y aquellas que no contienen modific cas o post- traducción. Dichas modificaciones i no se limitan a, modificación con PEG, modificac ina, glucosilación, farnesilación, carboxi xilación, fosforilación, y otras modificacio éptido conocidas en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente solicit ronidasa soluble se refiere a un poli terizado por su solubilidad bajo con lógicas. Las hialuronidasas solubles se nguir, por ejemplo, por su partición en la fase a solución de Tritón X-114 calentada a 37 °C (Bor (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). Las anc ana, tales como las hialuronidasas ancladas a líp cionan en la fase rica en detergente, p inantes y aquellas contenidas en o purificadas a entes naturales, tales como, por ejemplo, extra culos de carneros o toros. Los ejemplos de ronidasas solubles son PH20 soluble de humano, ronidasas solubles incluyen PH20 de ovino (SEQ 3, 65) y de bovino (SEQ ID NOS: 11, 64).

Tal como se utiliza en la presente solicitu le de humano o sHuPH20 incluye los polipéptidos arecen de todo o de una porción del sitio de u silfosfatidil-inositol (GPI) en el extremo C-term que después de la expresión, los polipépti les. Los ejemplos de polipéptidos de sHuPH20 i éptidos maduros que tienen una secuencia de ami ada en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9 y 47-éptidos precursores para dichos polipéptidos de emplo incluyen una secuencia de señal. Los ejem soluble de PH20 de humano que se expresa de binante en células de ovario de hámster chino 20 soluble es codificada por el ácido nucle ye la secuencia de señal y que se indica en SEQ También se incluyen las moléculas de ADN ntes alélicas de la misma y otras variantes solu nucleico que codifica para rHuPH20 soluble se lulas CHO las cuales secretan el polipéptido o que se produce en el medio de cultivo, ogeneidad en el extremo C-terminal de tal manera cto incluye una mezcla de especies que pueden uiera de una o más de SEQ ID NOS. 4-9 en ancia. También se incluyen las variantes spondientes y otras variantes, incluyendo aquel sponden a los polipéptidos precursores de PH20 de adas en SEQ ID NOS: 50-51. Otras variantes puede idades funcionales incluyen, pero no se lim idad biológica, actividad catalítica o enzi enicidad (capacidad para unirse o competir éptido por la unión a un anticuerpo anti-polipé ogenicidad, capacidad para formar multímeros, idad para unirse específicamente a un receptor o el polipéptido.

Tal como se utiliza en la presente sol idad de hialuronidasa se refiere a la capac izar enzimáticamente el corte del ácido hialurón a para hialuronidasa de la Farmacopea de los s de Norteamérica (USP) XXII determina la activ ronidasa indirectamente midiendo la canti rato de ácido hialurónico de peso molecular más ronano, (HA) que permanece después que se permite a reaccione con el HA durante 30 minutos a 37 a de microturbidez descrita más adelante (ve lo, Ejemplo 3) que mide indirectamente el corte rónico mediante hialuronidasa detectando el prec uble que se forma cuando el ácido hialurónico no e con la seroalbúmina . Se pueden utilizar patr encia, por ejemplo, para generar una curva patr minar la actividad en unidades de la hialuronid siendo analizada.

Tal como se utiliza en la presente sol idad funcionalmente equivalente" o vari ticales de la misma, con referencia a una dadora de hialuronano, se refiere a la cant a. degradadora de hialuronano que logra el mismo l de una cantidad (tal como un número cono des de actividad de hialuronidasa) de una en encia, tal como una hialuronidasa. Por ejemplo, s rio (véase por ejemplo, publicación de patente E. 260186) , y se puede determinar la cantidad de dadora de hialuronano requerida para lograr l dad de difusión que, por ejemplo, 100 unidade n de referencia de hialuronidasa . La cantidad de dadora de hialuronano requerida es, por lo onalmente equivalente a 100 unidades. En otro e ede evaluar la capacidad de una enzima degrada ronano para incrementar el nivel y veloci ción de una insulina co-administrada en in OS, tal como se describe más adelante en el ejemp ede determinar la cantidad de enzima degrada ronano requerida para lograr el mismo increment y velocidad de absorción de insulina que, por e ntidad administrada de rHuPH20, (tal como ación de la concentración máxima de insulina (CmáX ocimiento específico de la molécula de ARNt carg dón de ARNm cognado en humanos .

Tal como se utiliza en la presente so s nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los yendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas s . Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena se oble cadena. Cuando se hace referencia a s adores, los cuales están opcionalmente marcad con una marca detectable, tal como una escente o radiactiva, se contempla moléculas de lia. Dichas moléculas típicamente son de una 1 ue su objetivo es estadísticamente exclusivo o de copias bajo (típicamente menos de 5# por lo de 3) para sondeo o iniciación de una genot nos generales una sonda o iniciador contiene 14 , 16 o 30 nucleótidos contiguos de se ácidos que se presentan en las diversas secuen ácidos provistas en la presente solicitud se ide nformidad con sus abreviaturas de tres letras o conocidas (Tabla 1) . Los nucleótidos que se p s diversos fragmentos de ácido nucleico están des as designaciones de una sola letra normales uti rma acostumbrada en la técnica.

Tal como se utiliza en la presente solici oácido" es un compuesto orgánico que contiene u y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido c más aminoácidos. Para los propósitos de la itud, aminoácidos incluyen los 20 ami trados en la Naturaleza, aminoácidos no natu gos de aminoácido (es decir, aminoácidos en los rbono tiene una cadena lateral) .

Tal como se utiliza en la presente sol l polipéptido. NH2 se refiere al grupo amin nte en el extremo amino terminal de un polipéptid fiere al grupo carboxi libre presente en el xilo terminal de un polipéptido. Para es spondencia con la nomenclatura estándar éptidos descrita en J. Biol, Chem, , 243: 35 ), y adoptada por 37 C.F.R. §§ 1.821-1.82 aturas para los residuos de aminoácido se mues bla 1: TABLA 1 Tabla de correspondencia SIMBOLO 1 letra 3 letras AMINOACIDO Y Tyr Tirosina G Gl Glicina TABLA 1 (cont. ) SIMBOLO letra 3 letras AMINOACIDO V Val Valina P Pro Prolina K Lys Lisina H His Histidina Q Gln Glutamina E Glu Ácido Glutámico Z Glx Glu y/o Gln W Trp Triptófano R Arg Arginina D Asp Acido aspartico N Asn Asparagina B Asx Asn y/o Asp ácido" se define ampliamente para inclu ácidos listados en la Tabla de Correspondencia ( s aminoácidos modificados e inusuales, tale los a los que se hace referencia en 37 C.F.R. §§ , e incorporado en la presente solicitu encía. Asimismo, se debe indicar que un guión al al de una secuencia de residuo de aminoácido in e peptídico a una secuencia adicional de uno uos de aminoácido, a un grupo amino-terminal t a un grupo carboxilo- terminal tal como COOH .

Tal como se utiliza en la presente sol oácidos encontrados en la Naturaleza" se refier aminoácidos presentes en los polipéptidos .

Tal como se utiliza en la presente sol oácido no natural" se refiere a un compuesto o iene una estructura similar a la de un ami tos en la técnica. I ! I Tal como se utiliza en la presente solicit rucción de ADN es una molécula de ADN de cadena i ena doble, lineal o circular que contiene segmé ombinados y yuxtapuestos en una manera no aturaleza. Las construcciones de ADN existé tado de manipulación humana, e incluyen clones S de moléculas manipuladas , ¡ j Tal como se utiliza en la presente solici nto de ADN es una porción de una molécula de e que tiene atributos especificados. Por ejem I I nto de ADN que codifica para un polipéptido espec a porción de una molécula de ADN más grande, tal¡ ido o fragmento de plásmido, el cual, cuando se rección de 5' a 3', codifica para la secue acidos del polipéptido especificado. la presente solicitud en términos de pá ótidos (abreviado "nt") o pares de bases (ab . El término nucleótidos se utiliza para moléc a sencilla o de cadena doble en donde lo per xto . Cuando el término se aplica a moléculas de i Ij éste se utiliza para indicar la longitud general dido como equivalente al término pares de bas tos en la técnica reconocerán que las dos cadena cleótido de cadena doble pueden diferir ligeram tud y. que los extremos de las mismas puede nados; por lo tanto todos los nucleótidos dentro ! ula de polinucleótido de doble cadena podrían ri I ados . Dichos extremos no apareados, en gene an los 20 nucleótidos en longitud.

I Tal como se utiliza en la presente sol I litud" entre dos proteínas o ácidos nucleicos se cias de aminoácido o de nucleótido en una man I I i I zca un nivel máximo de identidad entre las secia tidad" se refiere al grado hasta el cual no var cias de aminoácido o nucleótido. La alineación cias de aminoácido, y hasta cierto grado cias de nucleótido, también puede tom eración las diferencias conservadoras y/o sustijt entes en aminoácidos (o nucleótidos) . Las difje rvadoras son aquellas que conservan las prop I oquímicas de los residuos involucrados. Las aline ser globales (alineación de las secuencias com avés de la longitud completa de las secuen endo todos los residuos) o locales (la alinea orción de las secuencias que incluye solamente la iones más similares) .

"Identidad" per se tiene un significado rep , 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskovj eux, J. , eds . , M Stockton Press, Nueva York, e existe un número de métodos para medir la i dos polinucleótidos o polipéptidos , el ¡ tidad" es bien conocido por los expertos en la ¡ lio, H. S Lipton, D., SIAM J Applied Ma ) ) .

Tal como se utiliza en la presente ogo (con respecto a las secuencias de ácido nucle ácido) significa aproximadamente mayor que o igua mologia de secuencia, típicamente mayor que o 40%, 50%, 60%, 70%, 8 ncia; si fuera nec ntaje preciso. Para itud, los términos encia se utilizan de eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence lecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, j ee Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, JÍ I ckton Press, Nueva York, 1991; Carillo et al.

J Applied Math 45:1073) . Mediante homolp ncia, se determina el número de aminoácidos cons zando programas de algoritmos de alineación está pueden utilizar con penalizaciones por : terminadas establecidas por cada pre I ¡ ncialmente las moléculas de ácido nucleico homól i j dan típicamente a astringencia moderada o a astri I a todo lo largo de la longitud del ácido nucí és. También se contemplan moléculas de ácido I ontienen codones degenerados en lugar de codone I ula de ácido nucleico que se híbrida. j El que cualesquiera dos moléculas tenga Research 12(1) :387 (1984)), BLASTP, BLASTNi I, hul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)) ge Computers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Pré , 1994, y Carillo et al (1988) SIAM J Appli 13) . Por ejemplo, se puede utilizar la función B se de datos del Centro Nacional para Informado I I cnologí para determinar la identidad. Otros p cialmente o públicamente disponibles incluy ama "MegAlign" de DNAStar (Madison, WI) y el p del Grupo de Computadora para Genética I rsidad de isconsin (UWG) (Madison WI) . El por ci ogía o identidad de moléculas de proteínas y/ ico se puede determinar, por ejemplo, compar I i I ación de la secuencia utilizando un progra I tadora GAP (por ejemplo, Needleman et al. (1970) : 48:443, tal como fue revisado por Smith y rada de Gribskov et al. (1986) Nucí. Acids Res. 1 I forma descrita por Schwartz y Dayhoff, eds . , Á iN SEQUENCE AND STRUCTURE, Fundación Nacional tigación Biomédica, pp. 353-358 (1979); (2) un ¡ 0 por cada espacio y un castigo adicional de Ó símbolo en cada espacio; y (3) ningún cast I I ios de extremo. j Por lo tanto, tal como se utiliza en la p í itud, el término "identidad" u "homología" rep omparación entre un polipéptido o polinucleó a y uno de referencia. Tal como se utiliza nte solicitud, el término por lo menos "90% idén I i i fiere a por ciento de identidades desde 90 hasti elación a la secuencia de ácido nucleico o secue I ácido de referencia del polipéptido. La identid de 90% o más es indicativa del hecho que, asumie eta de un polipéptido o éstas pueden estar agrupI I más ubicaciones de longitud variable hasta el ! i sible, por ejemplo, una diferencia de 10/100 ami I I I imadamente 90% de identidad) . Las diferenc ! en como sustituciones, inserciones o deleciones ico o aminoácido. Al nivel de homologías o ide es de aproximadamente 85-90%, el resultado d endiente del programa y de los parámetros de ¡ lecidos; dichos niveles elevados de identidad sej ar fácilmente, con frecuencia mediante alineació I asarse en el software.

Tal como se utiliza en la presente solicit ncia alineada se refiere al uso de homología (si dentidad) para alinear las posiciones correspor a secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típijc: inean dos o más secuencias que están relacionadas I I I I iador" se refiere a una molécula de ácido nucle actuar como un punto de inicio de síntesis ida con plantilla bajo condiciones apropiada ! lo, en presencia de cuatro trifosfatos de nuc entes y un agente de polimerización, tal c erasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa) j ión amortiguadora apropiada y a una tem iada. Se apreciará que algunas moléculas de ico pueden servir como una "sonda" y c iador" . Sin embargo, un iniciador tiene un g ! xilo para extensión. Un iniciador se puede utií ariedad de métodos, incluyendo, por ejemplo, reac a de polimerasa (PCR) , PCR con transcriptasa j I I •PCR de ARN, LCR, PCR multiplex, PCR de m i ola (panhandle) , PCR de captura, PCR de expresio I 5' , PCR in si tu, PCR mediada por ligación i Tal como se utiliza en la presente solicit da específicamente" se refiere a fijación, t arniento de bases complementarias, de una molé I nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) ! I ula de ácido nucleico objetivo. Los expertos ca están familiarizados con los parámetros in vit I I que afectan la hibridación específica, tal como mposición de la molécula particular. Los pa cularmente relevantes para hibridación in vitro ¡ I yen temperatura de fijación y de lavado, composi i I olución amortiguadora y concentración salin los de condiciones de lavado para remoción de m j ido nucleico no unidas específicamente a astri ¡ son 0.1 x SSPE, 0.1% de SDS, 65°C, y a astri son 0.2 x SSPE, 0.1% de SDS, 50 °C. Las condici i ngencia equivalentes son conocidas en la técn ede especificar el porcentaje de complementa amente las dos moléculas se seleccionan de modo se hibriden bajo condiciones de astringencia alt Tal como se utiliza en la presente cialmente idéntico a un producto si j ientemente similar e modo tal que la propi és esté suficientemente sin cambiar de modo que S I zar un producto sustancialmente idéntico en lu cto.

I I Tal como se utiliza en la presente sol én se entiende que los términos "sustanci similar1' varían con el contexto dido por los expertos en la técnica relevante.

Tal como se utiliza en la presente solicit nte alélica o variación alélica hace refere uiera de dos o más formas alternativas de un te alélica de un gen. Típicamente la fo I I encía de gen codifica para una forma de tipo s± I orma predominante de un polipéptido a partir' ción o de un miembro de referencia individual ie. Típicamente, las variantes alélicas, las; en variantes entre y dentro de las especies típli ! I por lo menos 80%, 90% o más de identidad de ami na forma de tipo silvestre y/o predominante prov misma especie; el grado de identidad depende de ue la comparación sea entre especies o den i ies. En términos generales, las variantes alélica ies tienen por lo menos aproximadamente 80%, 85% e identidad o más con una forma de tipo silves I I inante, incluyendo 96%, 97%, 98%, 99% o idad con una forma de tipo silvestre y/o predomin lipéptido. La referencia a una variante alélic que el individuo es homocigoto para dicho gen o o un individuo tiene dos alelos diferentes de un que el individuo es heterocigoto para dicho g s de un gen especifico pueden diferir uno del otir I nucleótido o en varios nucleótidos, y pueden j I 1 icaciones tales como sustituciones, deleci ciones de nucleótidos. Un alelo de un gen tambié a forma de un gen que contenga una mutación.

Tal como se utiliza en la presente sol ntes de especie se refiere a variantes en polip especies diferentes, incluyendo especies ma i I entes, tales como ratón y humano. ¡ Tal como se utiliza en la presente solicit nte de empalme se refiere a una variante que se nte procesamiento diferencial de un transcrito p genómico que dé como resultado más de un tipo d Tal como se utiliza en la presente solici no promotor significa una porción de un gen que ncias de ADN que aseguran la unión de ARN polim icio de la transcripción. Las secuencias de I mente, pero no siempre, se encuentran en la regip icadora de los genes.

Tal como se utiliza en la presente sol éptido o proteína o porción biológicamente activa I i s aislada o purificada está sustancialmente l i ial celular u otras proteínas contaminantes provje I célula o tejido a partir de la cual se obti ína, o sustancialmente libre de precursores quí agentes químicos cuando se sintetiza químicamen raciones pueden ser determinadas como sustaneji ¦ I I S si éstas parecen estar libres de impurezas fá!c I tables tal como se determina mediante métodos !e i estos sustancialmente puros desde el punto d co son conocidos por los expertos en la técni go, un compuesto sustancialmente puro desde el p químico puede ser una mezcla de estereoi casos, la purificación adicional debería increm idad específica del compuesto.

El término sustancialmente libre de ar incluye preparaciones de proteínas en las cu ína está separada de los componentes celulares as a partir de las cuales ésta se aisla o se p recombinante . En una modalidad, el cialmente libre de material celular i raciones de proteínas enzimáticas que tienen m ! i imadamente 30% (en peso seco) de proteí áticas (también referidas en la presente solicit I proteína contaminante) , generalmente men no sustancialmente libre de precursores químicos químicos incluye preparaciones de p áticas en las cuales la proteína está separada rsores químicos u otros agentes químicos qu I cados en la síntesis de la proteína. El término j raciones de proteínas enzimáticas que tienen m ¡ madamente 30% (en peso seco) 20%, 10%, 5% o m rsores químicos o de agentes químicos o compone I I Tal como se utiliza en la presente sol tico, con referencia a, por ejemplo, una molé nucleico sintético o un gen sintético o un , tico se refiere a una molécula de ácido nuc polipéptido que se produce utilizando binantes y/o mediante métodos de síntesis química Tal como se utiliza en la presente vectores típicamente permanecen episómicos, n diseñar para efectuar la integración de uri ón del mismo en un cromosoma del genoma. Tam I mplan vectores que sean cromosomas artificiales cromosomas artificiales de levadura y cr iciales de mamífero. La selección y uso de I ulos son bien conocidos por los expertos en la té Tal como se utiliza en la presente solici r de expresión incluye vectores que pueden expré I I está ligado en forma operativa con se'c adoras, tales como regiones de promotor, que son i I I ectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. ntos adicionales pueden incluir secuencias de pro rminador, y pueden incluir opcionalmente uno nes de replicación, uno o más marcadores susceptji ción, un incrementado , una señal de poliadenila 80 pertos en la técnica e incluyen aquellos que ados en células eucariotas y/o células pro los que permanecen episómicos o aquellos que se 1 del genoma de la célula hospedera.

Tal como se utiliza en la presente sol I también incluye "vectores de virus" o w s". Los vectores virales son virus diseñados qu 1 1 s en forma operativa a genes exógenos para tra vehículos o transportes) los genes exógenos al i I S células . ¡ ¡ Tal como se utiliza en la presente sol en forma operable o ligado en forma operativa I fieren a segmentos de ADN significan que los se acomodados de modo tal que éstos funcionen en co sus propósitos pretendidos, por ejempl cripción inicia corriente abajo del promotor y co sma, presente en la muestra, y también de obt e, relación, porcentaje, valor visual u otr I i ativo del nivel de la actividad. La evaluación ? I I j ta o indirecta y las especies químicas r I i tadas, no necesitan ser, desde luego, el prod ólisis como tal sino que puede ser, por ejem ado de las mismas o alguna otra sustancia adicio lo, la detección de un producto de escisión ína de complemento, tal como mediante SDS-PAGE yj I i oteína con azul de Coomasie. ¡' Tal como se utiliza en la presente sol ±dad biológica se refiere a las actividades in i I ompuesto o las respuestas fisiológicas que ! és de la administración in vivo de un co I I I sición u otra mezcla. Por lo tanto, actividad i a efectos terapéuticos y actividad farmacéut I icos, significa que las dos secuencias en ican para la misma secuencia de aminoácidos o p alentes. Cuando equivalente se utiliza para encía a dos proteínas o péptidos, este significa ! roteínas o péptidos tienen sustancialmente li ncia de aminoácidos solamente con sustituci ácido que no alteran sustancialmente la acti ón de la proteína o péptido. Cuando equival 1 i ré a una propiedad, la propiedad no necesit nte hasta el mismo grado (por ejemplo, dos n exhibir velocidades diferentes del mismo idad enzimática) , pero las actividades por lo ¡ ustancialmente las mismas.

Tal como se utiliza en la presente sol I I I I lar" y "modulación" o "alterar" se refieren a un a actividad de una molécula, tal como una proteí diente del contexto y típicamente la modula ¡ I I ra con un estado designado, por ejemplo, la prot silvestre, la proteína en un estado constitutiv Ína tal como es expresada en un tipo celular o c i nada . j Tal como se utiliza en la presente solicit sición se refiere a cualquier mezcla. Esta puede ión, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuo a o cualquier combinación de las mismas.

Tal como se utiliza en la presente solicit nación se refiere a cualquier asociación entre o I S o más ítems. La combinación puede ser dos ados , tales como dos composiciones o dos ser una. mezcla de los mismos, tal como una! idual de dichos dos o más ítems, o cualquier v s mismas. Los elementos de una combinación ! mplican componentes del ECM.

Tal . como se utiliza en la presente sol ar" un individuo con una enfermedad o có I fica que los síntomas del individuo se alivian pa i as o avance de una enfermedad. Tratamiento : a cualquier uso farmacéutico de una composi I ina de acción süper-rápida provista en la jp I itud.

I I Tal como se utiliza en la presente solici e farmacéuticamente efectivo, incluye cualquier éutico o agentes bioactivos, incluyendo, pe arse a, por ejemplo, anestésicos, vasoconstri o terapéutico significa un efecto que resul miento de un individuo que altera, típicamente m ra los síntomas de una enfermedad o condición o nfermedad o condición. Una cantidad terapéuti iva se refiere a la cantidad de una comp I i ula o compuesto que dé como resultado unj éutico después de la administración a un individú Tal como se utiliza en la presente solici no "individuo" se refiere a un animal, incluy ero, tal como un ser humano.

Tal como se utiliza en la presente solici I nte se refiere á un individuo humano que p as de una enfermedad o trastorno.

Tal como se utiliza en la presente sol amiento de los síntomas de una enfermedad o t'r ¡ cular mediante un tratamiento, tal como I Tal como se utiliza en la presente solicit idad terapéuticamente efectiva" o una j éuticamente efectiva" se refiere a la cantidad e, compuesto, material, o composición que cont esto que es por lo menos suficiente para prod i o terapéutico. Por lo tanto, es la cantidad rie prevenir, curar, mejorar, detener o detener parch ntoma de una enfermedad o trastorno. j Tal como se utiliza en la presente solicit I de insulina terapéuticamente efectiva es la canp ina requerida o suficiente . para lograr mico. Está cantidad se puede determinar empírip I como mediante exposición a glucosa o alimen siciones provistas en la presente solicitud co antidad o concentración de insulina terapéut iva de modo tal que se administren i i Tal como se utiliza en la presente solici i culo de fabricación" es un producto que se elabo . Tal como se utiliza a través de toda esta so I rmino pretende abarcar una composición de insu I rápida y una composición de enzima degrada ronano contenidas en el mismo artículo o en artí ! I ial de empaque separados . ! Tal como se utiliza en la presente sol o se refiere a cualquier composición que pueda i o tanto, fluidos abarca composiciones que están é I I I misólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas,; es, cremas y otras de dichas composiciones.

Tal como se utiliza en la presente solici I che" se refiere a una combinación de compos stas en la presente solicitud y otro ítem I i sito incluyendo, pero sin limitarse a, reconsti Tal como se utiliza en la presente sol 1 incluye cualquier animal, tal como, pero sin li mates incluyendo humanos, gorilas y monos,* r I I I como ratones y ratas; aves de corral, tal ! s; rumiantes, tales como cabras, vacas, venados ,: I s, tales como cerdos y otros animales. Anim os excluye humanos como el animal contempla I as provistas en la presente solicitud provi uier fuente, animal, vegetal, procariota y fúng ía de las enzimas son de origen animal, inc I I n mamífero. j Tal como se utiliza en la presente solici ol se refiere a una muestra que es sustanc I ica a la muestra de prueba, excepto que ésta no s n parámetro de prueba, o, si ésta es una mué a, ésta puede provenir de un voluntario no celulares .

I i I Tal como se utiliza en la presente solicitt valos y cantidades se pueden expresa imadamente" un valor o intervalo part imadamente" también incluye la cantidad exacta. "aproximadamente 5 bases" significa "aproximada " y también "5 bases." j I Tal como se utilizan en la presente sol onal" u "opcionalmente" significan que el e nstancia descrito en forma subsiguiente ocurr e, y que la descripción incluye casos en los; e dicho evento o circunstancia y casos en los no ocurre. Por ejemplo, un grupo opció I tuido significa que el grupo no está sustituid sustituido .

Tal como se utiliza en la presente solicit I I B . Composiciones de insulina de acción súper En la presente solicitud se proveen combinac I I siciones de insulina de acción súper-rápid siciones de insulina de acción súper-rápida se nando, antes, o al momento de la administradl I I I ina de acción rápida y una enzima degradac ronano . También se proveen métodos y usos sición de insulina de acción súper-rápida para ismas enfermedades y condiciones para las cuale n día se han indicado las insulinas de acción ¡ I ejemplo, diabetes mellitus para el cont glucemia y otras enfermedades y condicione inas de acción rápida (por ejemplo insulina; og® e insulina Humulin® R) no imitan de manera co de insulina endógena de la primera fase de li I s lina prandial . Actualmente se ha descubie 1. Generalidades de insulina, diabetes y I sulina de acción rápida existentes I La insulina es una hormona polipeptídica dé al secretada por el páncreas. La insulina es r as células del cuerpo para absorber y utilizar d iva la glucosa proveniente de la sangre. La gl I ustrato de energía predominante para efectú i 1 I ones celulares. Además de ser el modulador prim meostasis de carbohidratos, la insulina tiene : el metabolismo de grasas. Esta puede cam I idad del hígado y tejido adiposo, entre otro ar los depósitos de grasa. La insulina tiene os farmacodinámicos a través de todo el , I I yendo pero sin limitarse a, incremento en la sínt os, reducción en la degradación de lípidos, inc I síntesis de proteínas, regulación de enzimas y esta a una elevación en la glucosa. La insulina é sorción de glucosa al interior de las células, I es al hígado para reducir la producción de glucos rno resultado un retorno de la glucosa sang es normales. En los adultos normales, existen do beración de insulina en respuesta a un alimento. ana es un pico de liberación de insulina que I o de 2-15 minutos después de comer. La libera I I tardía se extiende aproximadamente 2 horas. ¡ ana es responsable de detener la producción de ¡ ica, con lo cual se reducen los niveles de glu I i e y se sensibiliza o señaliza a los tejidos peri incrementen la absorción de glucosa. En el músc enan cantidades grandes de glucosa como glucógen lucógeno es degradado como lactato, el cual el hígado y puede ser convertido de regreso a gl ividad de la respuesta de primera fase ant reducida o ausente, lo que conduce a niveles ele I I sa postprandial . Por ejemplo, el área bajo li de la glucosa sanguínea durante las primeras postprandiales (es decir primeras cuatro horas , r) es 2.5 a 3.0 veces mayor en los diabéticos I diabéticos. Las excursiones de glucosa post ibuyen a hiperglucemia general y niveles elev elevados, y estas excursiones son los contri rios de las elevaciones de HbAlc observadas s tempranas de diabetes tipo 2. i i Muchos pacientes diabéticos requieren tra insulina cuando el páncreas produce ca uadas de insulina, o no puede utilizar la insuí produce, para mantener el control glucémico adec I ina ha sido administrada como un agente terapéuti sulina comerciales se pueden clasificar en funci ión de actividad (véase, por ejemplo, DeFelippis ) Insulin Chemistry and Phar acokinetics, en I I tus de Ellenberg y Rifkin (pp. 481-500) McG I ssional) . Por ejemplo, la insulina se prp laciones de acción rápida, así como en formulaci n intermedia o prolongada, siendo referidas I nte invención las últimas dos clasificacion inas de acción basal. Las formas de acción rápid j icio rápido, típicamente presentando niveles máx ina en 2-3 horas o menos, y no más dé cuatro ho to, las formas de acción rápida de insulina se i I a regulación de glucosa prandial . Otras fo i ina incluyen las de acción intermedia, las1 zan concentración máxima de insulina en aproxim horas después de la administración subcutánea vel de glucosa sanguínea estable a través del nte administración parenteral de la insulina de a antes, durante o poco después del momento de Ii I alimentos. De esta manera, los niveles sanguí ina, se elevan temporalmente para (a) deté cción de glucosa hepática y (b) incrementar la a I ucosa; manteniendo de esta manera el control g te la elevación de la glucosa sanguínea asociada i tión de los alimentos. 1 La insulina recombinante de humanos (por e ina Humulin® R) se utiliza para auto-adminis I I nte inyección antes de¦ la hora de los aliment acia, la insulina recombinante de humano s ^ ,pr_ te .a. del momento de comer con el fin de asegur4ar, í a una elevación en la glucosa sanguínea sin o puedan ser absorbidos a través de los lechos c I sen a la circulación sistémica. La disociac eros en dímeros y monómeros es dependiente^ ntración, ocurriendo solamente a concentració a medida que la insulina se difunde desde el s ción. Por lo tanto, existe un deposito local de i 1 sitio de inyección después de la adminis i tánea de insulina, lo que provee una conce al alta de insulina hexamérica en el sitio de ? i no pueda ser absorbida hasta que dismin I j ntración de insulina (Soeborg et al., (2009) ; . Sci. 36:78-90) . Debido a que la insulina se I I mente desde el sitio de inyección, la concentrá í i ina disminuye a medida que se incrementa la di el sitio de inyección, lo que da como resul I I iación de los hexámeros y absorción de los moñó I Debido a que la insulina en forma monomé I i i bida de manera más rápida, mientras que las insul tado hexamérico son más estables, se han desa S análogas de insulina de acción rápida que p ispciación más rápida de hexamérica a monomérica I a administración subcutánea. Dichas insulil i I ican, tal como mediante cambios de aminoácid mentar la velocidad de disociación, con lo i te una actividad farmacodinámica más rápida des yección. Como se describe en la Sección C, las I gas de acción rápida de la insulina incluyen per I an a, insulina glulisina, insulina aspart, e j I O.

Las formas de acción rápida de las ins J yendo análogos de acción rápida, tienen un retras I ción y acción, y por lo tanto no se aproxima ol glucémico deseado. Aunque es más fácil c o de ingesta de alimento dentro de 15 minutos -60 minutos requeridos para la insulina regular, i esgo de que el paciente pueda comer muy tempran i para proveer el mejor control de glucosa sanguin Además, uno de los efectos secundarios pri tratamiento con cualquier terapia con i i yendo terapias con insulinas de acción rápida; lucemia. La hipoglucemia se define como ínea baja y está asociada con una varié ? lidades que pueden variar desde hambre hasta roblemáticos tales como temblores, sudor, conf ataques, coma diabético y muerte. La hipogluc presentar a partir de falla para comer lo sufi arse comidas, ejercitar más de lo normal i iada insulina o utilizar una preparación de i I I 99 ; 1 lo, como velocidad de infusión de glucosa amente permanecen elevados después que se ha aba de glucosa prandial, amenazando con hipoglucem tos para controlar de manera más adecuada las i as de glucosa incrementando las dosis de én incrementan este riesgo. Además, debido a; lucemia postprandial es un resultado común de la nsulina, ésta con frecuencia ocasiona o hace n I os pacientes consuman bocadillos entre alimento ibuye a la ganancia en peso y obesidad frecue I i ado con terapias con insulina. ¡ 1 I ( 2. Farmacodinámica y farmacocinética sición de insulina de acción súper-rápida En la presente solicitud se descubrió ¡ I nación de una insulina de acción rápida y una I ción rápida en la glucosa sanguínea después I istracion parenteral de bolo (es decir, no intr i como por ejemplo administración parenteral I I tánea (SC) , intramuscular (IM) , intraperitoneal ¡ dérmica (ID) ) .

Aunque sin desear estar limitado a ninguna mbinación de una insulina de acción rápida y una dadora de hialuronano pueda dar como result i ción incrementada de la insulina de acción ráp I ración a cuando la insulina se administra sola, i ambio en el mecanismo de dispersión después I istracion subcutánea. Típicamente, la presen i I ronano de alto peso molecular provee una barrer ujo del fluido global después de la inyección su nsulina sola. Por lo tanto, como se iormente, la insulina se dispersa desde el s¡ las concentraciones suficientemente bajas de i facilitar la disociación y, por lo tanto, la abs mbargo, cuando la insulina se coadministra a degradadora de hialuronano, tal como, por ejemp ronidasa soluble, el hialuronano es degradado I a degradadora de hialuronano, permitiendo el fl o global, el cual es dispersado rápidamente e rcional al gradiente de presión (o conduc i ulica) . A presión fisiológica una hialuronidasa omo rHuPH20 genera un incremento de aproximadam en la conductancia hidráulica. Por lo tanto, cu I inistra con una enzima degradadora de hialurori ina se dispersa rápidamente en una manera medi I cción después de la degradación de la barr ronano . Esta absorción rápida de insulina cu inistra por vía subcutánea con la enzima degradá I I ros 40 minutos. Este perfil farmacocinético mejcp I ja en un inicio y duración del efecto de insul . Esto se puede ejemplificar mediante ¡ I codinámicas , ' tales como mediante velocidades de ÍL j I ucosa en experimentos con pinza euglucémica tal ibe en el ejemplo 1. Por lo tanto, una composí ina de acción súper-rápida es absorbida más ráp a insulina de acción rápida correspondiente, i to interesante, como se indica en las figuras 1 siciones de insulina de acción súper-rápi ! enen una enzima degradadora de hialuronano presei I ción acelerada tanto de insulinas regulares de; a como de análogos de insulina de acción rápida. resultado perfiles farmacodinámicos ( cocinéticos (PK) similares, aun cuando el aná ina de acción rápida sea sustancialmente más ráp e, por ejemplo, figuras 1 y 2) . Por lo tan ja adicional de la composición de insulina de i rápida es la capacidad de lograr 1 cocinéticos y farmacodinámicos comparables ros 40 a 60 minutos después de la administraci en cuenta si la insulina de acción rápida es o I ina regular de acción rápida (por ejemplo, i in® R) o un análogo de acción rápida (tal como o Humalog®,, insulina aspart Novalog® o sina Apidra®) . En algunos casos, tal como cu' I ina de acción rápida en la composición de insu n súper-rápida es un análogo de insulina de a, en vez de una insulina regular, la absorció i ina de acción rápida cuando se administra con la ! dadora de hialuronano (es decir como una composii ina de acción súper-rápida) es más rápida que n del tiempo está desplazada hacia una traciones más altas a tiempos más tempranos (vé lo, figura 1) . Esta velocidad de aparición de i circulación sistémica se describe como la veloc ión, según se distingue de la velocidad de rem de la circulación sistémica, la cual se descri locidad de depuración. Las composiciones de insu súper- rápida tienen una velocidad de absorción e da como resultado una exposición temprana may nsulina de acción rápida correspondiente. As a que la enzima degradadora de hialuronano a transitoria y - localmente en el sitio de administ locidad, de depuración de la composición de insu súper- rápida y su potencia una vez en la circ ica no son materialmente diferentes que las ina de acción rápida correspondiente. Increment elación a la insulina de acción rápida correspo do tal que, después de la administración párent composición de insulina de acción súper-rápi nta una fracción mayor de la exposición a mica acumulativa a través de puntos de tiem anos y una fracción más pequeña de la expos ina sistémica acumulativa se presenta a través de empo posteriores, según se compara con una insul mplemente de acción rápida. Este cambio en la ve sorción permite que la composición de insulina de -rápida imite de manera más cercana la respu ina endógena corporal hacia el aumento repentino es de glucosa sanguínea que ocurre después del alimento.

Un segundo parámetro farmacocinéti endiente, la fracción de la dosis administrada qu ina regular (por ejemplo, insulina Humulin® mento en biodisponibilidad puede ser significat sponibilidad relativa de una composición de insu n súper-r pida como la descrita en la presente s u insulina de acción rápida correspondiente se nte la relación de la exposición sistémica tota ) de las dos composiciones después de administ térales no intravenosas idénticas.

Un aspecto importante adicional d siciones de insulina de acción súper-rápida se r apacidad de lograr una mejora en los pa codinámicos que miden la respuesta fisiológica h ina sistémicamente disponible. Debido a q siciones de insulina de acción súper-rápida desc esente solicitud tienen la misma potencia farma egar a la circulación sistémica que la de la ins cémica representa un parámetro farmacodinámico d ste mide la velocidad de administración de venosa como una función del tiempo requeri er una concentración de glucosa sanguínea ante. En virtud de la ventaja farmacocinética d idad de absorción lograda por una composic ina de acción súper-rápida en comparación ina de acción rápida correspondiente, la composi ina de acción súper-rápida puede cambiar el pe una medida de la respuesta fisiológica a la i velocidades de infusión más grandes (es decir r lógica mayor) en tiempos más tempranos. Para siciones de insulina de acción súper-rápida s existe también un incremento significativo sponibilidad sistémica relativa, se puede obse mento adicional en la respuesta de GIR, aunque iría más natural para la composición de acción a para controlar los niveles de glucosa postpran e es posible con la composición de insulina de a correspondiente sola. La respuesta a insulina uerpo incluye tanto (a) una ráfaga inicial de o de los primeros 10-15 minutos que señaliza el beración de glucosa hepática y provee concent ineas de glucosa mínimas entre los alimentos; y ición a insulina total a través de aproximada la cual se iguala con la composición de carbo alimento ajustando la liberación de insulina lación sistémica como una función de los niv sa a través de un juego complejo de re ales, que incluye tanto respuestas de célul metabolitos sistémicos (predominantemente glucos rmonas de incretina las cuales potencian la secre spondiente . Asimismo, las composiciones de insu n süper-r pida descritas en la presente i én son más capaces de imitar el control nat sa postprandial , al tener una fracción mayor ición a insulina sistémicamente disponible a tr rimeras 2 horas y una reducción correspondient ición a insulina después de 2 horas. Los niv ina elevados que se presentan más de 2 horas des ministración pueden dar como resultado un met mentado de glucosa cuando la absorción de randial es completa, una situación que conduce a lucosa sanguínea bajos o hipoglucemia . De onal, debido a que las composiciones de insu n súper-rápida tienen un inicio de acción simila spuesta de insulina natural, estas composici administrar a la hora de los alimentos, mient ? controlar de mejor manera los niveles de randial que las composiciones de insulina de a correspondiente.

Las insulinas de acción rápida típicame istran a través de un amplio intervalo de dosis s mina el médico u otro proveedor de cuidados de l icado dependiendo de muchos factores incluye es de glucosas reales, el individuo, el tipo de composición del alimento. Típicamente, dichas d ina de acción rápida pueden estar en el inter 0.05 Unidades/kg a 2 Unidades/kg. Debido cocinética y farmacodinámica, las composicio ina de acción súper-rápida se pueden administrar ajas en comparación con la insulina de acción istrada en ausencia de una enzima degradad ronano. El grado hasta el cual se puede dismi ción rápida administrada a pacientes con diabetes o se administra como una composición de insu n súper-rápida. Por ejemplo, en casos en los istran a pacientes con diabetes tipo 1 y diabetes u/kg de insulina de acción rápida para contro es de glucosa postprandial , al paciente diabétic pueden administrar 0.15 u/kg de insulina de a en una composición de insulina de acción súpe lograr el mismo control o un mejor control glucé ciente con diabetes tipo 2 se le pueden administ de insulina de acción rápida en una composi ina de acción súper-rápida para lograr el mismo mejor control glucémico. Por lo tanto, en los, se contempla en la presente solicitud dad de una insulina de acción rápida que se admi ciente diabético tipo 2 para lograr control glucé lograr control glucémico se puede reducir lo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45 60%, 65%, 70% o más cuando se administra con una dadora de hialuronano como una composición de i cción súper-rápida en comparación con la rida para control glucémico cuando se administra a degradadora de hialuronano.

Sin desear estar limitado a ninguna teo reducción en la dosis de insulina de acción rápi ntes con diabetes tipo 2 en comparación con p iabetes tipo 1 cuando la insulina se administra a degradadora de hialuronano como una composi ina de acción súper-rápida es un reflejo entes perfiles glucémicos postprandiales tes tipo 1 y tipo 2, y de la capacidad de la i cción súper-rápida para imitar más cercaname 1 no producen ninguna insulina y por lo tanto de la primera como de la segunda fase de libera ina, de las cuales ésta última es sosten iduos sanos hasta que se logra el control glucémi to, debido a que los diabéticos tipo 2 por lo requieren terapia de insulina principalment ntar la hiperglucemia postprandial , un problema superar en la terapia de insulina prandial en ticos es la ocurrencia de hipoglucemia . La hipog resultar si la propia secreción de insulina re asal del individuo está acoplada con el efecto r ucosa de cualquier exceso de insulina exógena re és que se ha aliviado el aumento repentino prandi empo, las ocurrencias repetidas de dichos ep lucémicos postprandiales pueden contribuir a gana y obesidad. La f rmacocinética y farmacodinámica sa postprandial . Por lo tanto, los pacientes di 2 reciben dosis de insulina que cubren más que s se temprana de liberación de insulina. Las compo sulina de acción súper-rápida provistas en la itud imitan más cercanamente la respuesta de ena. Por lo tanto, a los pacientes diabéticos ti uede administrar una composición de insulina de -rápida a una dosis que cubra solamente la prime beración de insulina, mientras que a los diabétic les puede administrar una composición de insu n súper-rápida a una dosis que cubra todas las f ación de insulina.

Por lo tanto, otro uso de las composici ina de acción súper-rápida provistas en la itud es reducir los efectos secundarios de gana y obesidad asociados con terapia de insulina de ición a insulina sistémica acumulativa a través ras 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5 o 2 horas despué istración. Aunque los pacientes diabéticos tipo 1 den experimentar ganancia de peso como resultad ia con insulina, los pacientes con diabetes tipo riesgo particular de ganancia de peso que co dad. Los diabéticos tipo 2 carecen de la primera ación de insulina, pero siguen liberando le ina con el paso del tiempo. Como resultado, s tempranas de la enfermedad, los niveles de i ena de los diabéticos tipo 2 son muy bajos al in omida y muy alto después de la digestión del a sencia de la primera fase de liberación de insul o no recibe la señal para detener la elabora sa. El hígado continúa produciendo glucosa en un que el cuerpo comienza a producir nueva gl nada y los niveles de glucosa sanguínea deben co Esta cantidad grande de insulina tiene dos diciales. Primero, esto pone una exigencia inde ncreas ya comprometido, lo cual puede conducir a a deterioración y eventualmente hace que el páncr az de producir insulina. Segundo, demasiada i és de la digestión puede contribuir a la gana lo cual también puede exacerbar la co ógica. Cuando a los pacientes con diabetes tipo 2 istra una insulina de acción rápida para contr glucemia postprandial , como se discutió anteri quedar un exceso de insulina después de la di o tanto, los pacientes diabéticos tipo 2 que ia de insulina, pueden tener demasiada insulina digestión, lo cual puede producir a hipoglu cia de peso resultante. La administración -rápida se puede administrar a 20%, 30%, 40%, 50 80% o 90% del nivel en el que la insulina de a tendría que administrarse si no estuviera pres a degradadora de hialuronano. Por tanto, por eje dad de insulina de acción rápida administrada sición de acción súper-rápida típicamente es, imadamente, 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0. O U/kg, 1.0 U/kg, 1.1 U/kg, 1.2 U/kg, 1.3 U/kg, l. /kg, 1.6 U/kg, 1.7 U/kg, 1.8 U/kg, 1.9 U/kg, o 2. rtud de la dosis mas bajas, la duración de ac s insulinas puede disminuirse para reducir al mí cial de hipoglucemia tardía que se presenta debi tración elevada de insulina en plasma que se pr s de varias horas. Por lo tanto, se espera que u ción más rápida de la composición de insulina de -rápida, la cual imita de manera más cercana el o de la insulina administrada y el efecto so es de glucosa observados que el de las composici ina de acción rápida correspondientes, y por l n imitar de manera más adecuada la regulación nat niveles de glucosa postprandial . Por lo ta cocinética modificada de una composición de insu n súper-rápida también beneficia el desempeño a de insulina" existente y de la tecnología de m ucosa continuo (GCM) . Al acortar el tiempo en ción de bolo de insulina postprandial y una r mica sistémica, un control más estricto de los lucosa proveniente de inyecciones subcutáne as repetidas de insulina con GCM podría "ce " en un dispositivo combinado de bom ina/monitoreo de glucosa (es decir sistema d do o páncreas artificial) . o titulado a pH neutro con un ácido o lemente con un componente amortiguador de laciones de insulina de acción rápida con fr yen zinc y un conservador antimicrobiano fenól m-cresol para estabilizarlas estructuralmente o hexamérico más estable. Los quelantes de meta EDTA, se pueden utilizar para ajustar la veloc iación de estos hexámeros, y pueden estar p metales equivalentes tales como calcio para am capacidad quelante. Las enzimas degradado ronano con frecuencia requieren componentes adíe como para proveer estabilidad física y yendo pero sin limitarse a agentes tenso adores de oxígeno, sales, aminoácidos y polialcoh Las composiciones de insulina de acción a pueden estar presentes en un estuche a y la enzima degradadora de hialuron inistran, dicha coadministración puede ser secue uier orden (por ejemplo, la enzima degrada ronano se administra antes que la insulina de -rápida con lo cual la enzima degradadora de nia da el hialuronano en el sitio de inyección ante istración de insulina de acción rápida) ; inistraci n de la insulina de acción rápida y a degradadora de hialuronano puede ser concurre sición de insulina de acción rápida y las compos nzima degradadora de hialuronano se pueden f as o por separado) como un sólido para inyección constituir con un diluyente apropiado, como sol tables, o como suspensiones inyectables.

Las siguientes secciones describen ejemp inas de acción rápida y de enzimas degradad uos de aminoácido que cuyo peso molecular es ns . Esta se produce en las células beta de los gerhans en el páncreas. Un ejemplo de insulina aslada como un polipéptido precursor de 110 amin oinsulina (SEQ ID NO: 101) , que contiene un pép de 24 aminoácidos hacia el RE, la secuencia de s , lo que da como resultado proinsulina (SEQ ID N lécula de proinsulina se convierte posteriormente ina madura mediante acciones de enzimas proteol idas como prohormona convertasas (PCI y PC2) y es de la exoproteasa carboxipeptidasa E. Esto tado la remoción de 4 residuos de aminoácido bási do C de 31 aminoácidos o cadena conector sponden a los residuos de aminoácido 57 a éptido de preproinsulina indicado en SEQ ID NO: 1 ina resultante contiene una cadena A de 21 ami la posición 20 de la cadena A y la posición 1 a B, y un tercero entre las posiciones 6 y 1 a A. La secuencia de la cadena A de una insulina dica en SEQ ID NO: 103 y la secuencia de la cade a en SEQ ID NO: 104.

La referencia a. insulina incluye preproi sulina y polipéptidos de insulina en forma de lia o de cadena doble, formas truncadas de las tengan actividad, e incluye variantes alél ntes de especie, variantes codificadas por varia me y otras variantes, tales como análogos de ins formas convertidas en derivados, inc éptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%, 55 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 dentidad de secuencia con el polipéptido p ado en SEQ ID NO: 101 o la forma madura del mi re de la insulina de humano en los aminoácidos 8 dena A, y en el aminoácido 30 de la cadena ina porcina difiere solamente de la insulina hu inoácido 30 en la cadena B en la cual, al igual cuencia de bovino, existe una sustitución de ala de treonina. Otros ejemplos de variantes de esp ina se indican en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 o de las variantes de insulina también se inclu gos de insulina que contienen una o más modific inoácido en comparación con una insulina humana i Q ID NO: 103 y 104 (cadenas A y B) . Los anál ina de ejemplo (cadenas A y B) , incluyendo las f go de acción rápida y de acción más prolong an en SEQ ID NOS : 147-165, 182-184). Por ejemp gos de insulina incluyen, pero no se limi sina (LysB3, GluB29; indicada en SEQ ID NO: 103 álogos se basa en una descripción de la sustitu ácido en posiciones específicas en la cadena A o ina, nombrada a partir del extremo N-terminal a, en el cual el remanente de la secuencia es e ina humana natural.

Cualquiera de los polipéptidos de i iores incluyen aquellos que son producidos eas de cualquier especie, tal como un humano, y yen insulinas que se producen mediante sínt zando técnicas recombinantes . Por ' ejemplo, c ibe en alguna otra parte en la presente solici ina se puede producir de manera biosintética sión de los genes sintéticos para las cadenas A sulina, mediante expresión de proinsulina com iéndola a los métodos enzimáticos y químicos ap generar una insulina madura, o mediante expresión érica. Sin embargo, la insulina tiene una prope asociarse como dímeros, y en presencia de icos tales como Zn2+ puede asociarse fácilm cturas de orden superior tales como hexámeros. itios de unión simétricos de alta afinidad pa e también se han reportado otros sitios de unión ébiles (véase por ejemplo, DeFelippis et al. n Che istry and Pharmacokinetics, en Diabetes Ellenberg y Rifkin (pp. 481-500) McG ssional) . La auto-asociación es importante ilidad de la molécula para evitar degradación qu turalización física. Por lo tanto, en las vesíc enamiento en las células beta pancreáticas, la i e como un hexámero. Sin embargo, después que se espacio extracelular, se cree que los hexám ina pueden experimentar un cambio en pH promover la auto-asociación como hexámeros . Sin tructura hexamérica desacelera la velocidad de a tas formulaciones después de administración t nea .

Como se discutió en la Sección B, la insu za como un agente terapéutico para control gl como en pacientes diabéticos. Hay varios ti laciones de insulina existen, dependiendo de ina se administra para controlar la glucosa para , para terapia prandial, o para una combinación s . Las formulaciones de insulina se pueden ente como formulaciones de acción rápida, solame laciones de acción basal (es decir, formas de media y/o de acción prolongada) , o como una me ismas (véase por ejemplo, Tabla 2) . Típicamen as contienen una insulina de acción rápida ionadas con el alimento como de insulina basal formulación. Por consiguiente, las formulaci sición de insulina de acción súper-rápida descr esente solicitud incluyen aquellas que pueden almente una insulina de acción basal.

En términos generales, cualquier prepara ina incluye un polipéptido de insulina o varia análogo) de la misma, y difiere solamente en la cias que constituyen la formulación. Por lo tan spectos específicos de la formulación los que ir en la duración de acción de los diferentes t ina. Los ejemplos de sustancias incluidas raciones de insulina, incluyen, pero no se lim es para estabilización tales como zinc, amortigü modificador de tonicidad tal como glicerina; un rvador/anti-microbiano tal como m-cresol; y prot tipo de insulina, su duración de acción, su abs sponibilidad y por lo tanto, su aplicación.

Por ejemplo, la mayoría de preparació ina contienen un ion metálico, tal como zinc, lación, el cual estabiliza la insulina promovi asociación de la molécula. La auto-asociación en éricas puede afectar la absorción de insulina des dministración . Por lo tanto, la relación de es estabilizadores, y la adición de EDTA o EG ina, permiten modulación y control adicionales ción y biodisponibilidad de la insulina, por enciando la predominancia de la estructura d ior presente en el polipéptido. En términos ge reparaciones de insulina regular que son de a contienen zinc en una cantidad que es d imadamente 0.01-0,04 mg/100 Unidades. Los e o se recolectan y se vuelven a suspender en una etato de sodio-cloruro de sodio (pH 7.2 a 7 ben lentamente después de la inyección p tánea y ejercen una acción de larga duració ración cristalina se llama suspensión de zinc e ngada (insulina "ultralente" ) . Otras preparaci ina que contienen zinc incluyen, por ejemplo, i lente" (suspensiones de insulina y zinc ráp inas "lente" (suspensiones de insulina y zin S difieren predominantemente en la concentración zada. Las preparaciones de insulina que contien én incluyen aquellas que están modificadas mina, tal como insulina NPH.

En otro ejemplo, se puede agregar un agen pitación, tal como protamina, a un polipépt ina para generar una suspensión microcris f no, también conocida como insulina NPH. Esta nsión de insulina y protamina y zinc modificada alina. Las concentraciones de insulina, prota están arregladas de modo tal que la preparación t O y una duración de acción intermedia entre lo ina regular y los de la suspensión de; insul mina y zinc.

Además, las diferencias en pH en las prepa en influyen en el tipo y propiedad de la insuli raciones de insulina regular originales se prepar e 2.8 a 3.5, de lo contrario éstas pueden culas a intervalos de pH más alto. Sin embar raciones de insulina altamente purificada se rar a un intervalo de valores de pH. Adem s, el iones amortiguadoras en la preparación de i te que la insulina se pueda preparar en una sol oluble a un pH ácido. Existe un cambio adici ácido en la cadena A (N21G) para evitar la desam erización que resultan de una asparagina sen . La secuencia de la cadena A de insulina glar a en SEQ ID NO: 150, la de la cadena B se indica : 151. Debido a que se presenta exposición lógico después de la administración, se recipitados , los cuales hacen que la glargi ar a una insulina cristalina, de acción prolongad La siguiente tabla 2 presenta en forma r s tipos de insulina, su inicio de acción ación .

TABLA 2 Tipos de insulinas ? Nombre de la Inicio Máximo Duración A lic TABLA 2 (cont.) Las insulinas más comúnmente utilizadas inas de acción rápida, las cuales incluyen ar {es decir insulina original o de tipo sil yendo variantes alélicas y variantes de especi eion rápida y una enzima degradadora de hia le. En términos generales, estas composicio ina de acción súper-rápida se absorben después istración por vía subcutánea y son detectables y icio de acción en la sangre dentro de 30 mi Las insulinas de acción rápida que se pueden obtener una composición de insulina de acción a como la descrita en la presente solicitud ina regular, la cual es la insulina de tipo silv nal. Las insulinas de acción rápida también i gos de insulina. Debido a su velocidad de absorc a en comparación con insulinas de acción bas inas de acción rápida se utilizan predominanteme sitos de control post-prandial . Los ejemp inas de acción rápida se indican en la siguient s insulinas acción rápida también incluyen cu S, una formulación de composición de insulina de -rápida también puede incluir una mezcla de una i ción rápida con una insulina de acción inter ngada, además de una enzima degradadora de hialur TABLA 3 Insulinas de acción rápida e Especie Cadena-A Cadena-B Nombre (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) comerci e . g . Hu ina Humana SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 Novolin® ar Velosuli ina 88-108 de 25-45 de Porcina Iletin ar SEQ ID NO: 123 SEQ ID NO: 123 ina Análoga SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 147 Novolog t humana ina Análoga SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 148 Humalog o humana na Análoga SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 149 Apidra® sina humana lo, 7.0-7.8). Las insulinas regulares también i las que contienen zinc. Típicamente, el conte en las preparaciones de insulina regular varia aproximadamente 0.01-0.04 mg/100 Unidade inas regulares de humano se comercializan como ovolin® R y Velosulin®. La insulina porc cializa como Iletin II®. En términos genera ina regular tiene un inicio de acción de 30 es de la administración por vía subcutánea. Los os un plasma se observan en 1-3 horas y la dura tensidad se incrementa con la dosis. El tiempo en plasma después de la administración p tánea es de aproximadamente 1.5 horas. b . Análogos de acción rápida Los análogos de insulina de acción rápi n una disociación más rápida del estado he ÉS de la administración por vía subcut ración con la insulina. i . Insulina Lispro La insulina lispro de humano es una formula éptido de insulina que contiene cambios de amino osiciones 28 y 29 de la cadena B de modo tal ys en esta posición en la cadena B de insulina stre indicada en SEQ ID NO: 104 se invierten a 1 cuencia de insulina lispro se indica en SEQ ID na A) y SEQ ID NO: 148 (cadena B) . Esta se vende e Humalog®. El resultado de la inversión de es ácidos es un polipéptido con una propensión dismi asociarse, lo cual permite un inicio de acc o. Específicamente, la inversión de secuencia como agentes antimicrobianos (por ejemplo, m-cr para estabilización. No obstante, debido icación de aminoácido, la insulina lispro ac amente que la insulina regular. ii . Insulina Aspart La insulina aspart de humano es una formula éptido de insulina que contiene una sustitu ácido en la posición 28 de la cadena B de a indicada en SEQ ID NO: 104 de una prolina a u tico. La secuencia de insulina aspart se indica : 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 147 (cadena B) . bajo el nombre comercial Novolog®. La modifica ina aspart confiere un grupo carboxilo de cadena carga negativa para crear repulsión de ca tabilizar la interacción monómero-monómero . Ade similares en sus propiedades farmacocinét codin micas respectivas. iii . Insulina Glulisina La insulina glulisina de humano es una for lipéptido de insulina que contiene una sustitu ácido en la cadena B en la posición B3 de aspar a y en el aminoácido B29 de lisina a ácido glutá ración con la secuencia de la cadena B de i a indicada en SEQ ID NO: 104. La secuencia de i sina se indica en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ (cadena B) . Esta se vende bajo el nombre c a®. Las modificaciones hacen que la moléc éptido sea menos propensa a auto-asociac ración con la insulina humana. A diferencia d gos de insulina, el polipéptido se nsulina de acción súper-rápida y combinacio tan de la combinación de una insulina de acción zima degradadora de hialuronano (ácido hialurón os para utilizar dichas composiciones y combi el tratamiento de enfermedades y condiciones insulina. Las enzimas degradadoras de hia yen cualquier enzima que degrade hialuronan los de enzimas degradadoras de hialuronano i no se limitan a hialuronidasas y en pa oitinasas y liasas que tengan la capacidad para ronano. En casos en que los métodos y usos provi esente solicitud describan el uso de una hialu nsulina, se puede utilizar en forma corresp uier enzima degradadora de hialuronano. Los ejem as degradadoras de hialuronano en las composi naciones y en los métodos provistos en la tánea .

Hialuroriano, también llamado ácido hialur ronato, es un glucosaminoglucano no sulfatado q amenté distribuido a través de todos los tivo, epitelial y neural . El hialuronano nente esencial de la matriz extracelular ituyente principal de la barrera interstici izar la hidrólisis de hialuronano, las dadoras de hialuronano reducen la viscosid ronano, con lo cual se incrementa la permeabili o y se incrementa la velocidad de absorción os administrados por vía parenteral . Por lo tan as degradadoras de hialuronano, tal co ronidasas, han sido utilizadas, por ejemplo es para diseminación o dispersión en conjunto co es, fármacos y proteínas para incrementar su dis iciones de disacárido o más de longitud y los p aluronano pueden variar en tamaño desde 5,00 0,000 Da aproximadamente in vivo. Por consiguien as degradadoras de hialuronano para los usos y stos incluyen cualquier enzima que tenga la capac izar el corte de una cadena o polímero de disac ronano. En algunos ejemplos la enzima degrada ronano corta el enlace glucosídico ß-l—>4 en la C ero de hialuronano. En otros ejemplos, la dadora de hialuronano cataliza el corte del Sidico ß-l—>3 en la cadena o polímero de hialuron Como se describe más adelante, las dadoras de hialuronano existen en forma unida a forma soluble. Para los propósitos de la itud, se proveen enzimas degradadoras de hial o una porción de un ancla de GPI . Las dadoras de hialuronano provistas en la p itud también incluyen variantes alélicas o varia ie u otras variantes, de una enzima degrada ronano soluble. Por ejemplo, las enzimas degradad ronano pueden contener una o más variaciones ncia primaria, tales como sustituciones, adició iones de aminoácido. Una variante de una dadora de hialuronano por lo general presenta o aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de se mparación con la enzima degradadora de hialuron ntiene la variación. Puede estar incluida CU ción en la enzima degradadora de hialuronano p sitos de la presente solicitud con la condición a conserve actividad de hialuronidasa, tal como 1. Hialuronidasas Las hialuronidasas son miembros de una e de enzimas degradadoras de hialuronano. H S generales de hialuronidasas: hialuronidasas ero, hialuronidasas bacterianas y hialur nientes de sanguijuelas, otros parásitos y crus S enzimas se pueden utilizar en las composi naciones y métodos provistos. a . Hialuronidasas de tipo mamífero Las hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3. ndo- ß-?-acetil-hexosaminidasas que hidrolizan el sídico ß-1- 4 del hialuronano en varias longit sacárido tales como tetrasacáridos y hexasac enzimas tienen actividades tanto hidrolíticas lucosidasa, ueden de radar hialuronano sulf (SEQ ID NO: 16), ratón (SEQ ID NOS: 17-1 (SEQ ID NOS: 20-21), rata (SEQ ID NOS: 22-2 0 (SEQ ID NO: 25), orangután (SEQ ID NO: 28 olgus (SEQ ID NO: 29) , cobayo (SEQ ID NO: ronidasas de humano. Los ejemplos de hialuronid omposiciones, combinaciones y, métodos provisto nte solicitud son hialuronidasas solubles.

Las hialuronidasas de mamífero también se vidir en aquellas que son neutras minantemente encontradas en extractos de testíc S activas, predominantemente encontradas en como el hígado. Los ejemplos de hialuronidasas as incluyen PH20, incluyendo pero sin limitarse ida a partir de diferentes especies tales com ID NO: 27), bovina (SEQ ID NO: 11) y humano (SEQ H20 de humano (también conocida como SPAM1 o y HYALP1. HYALP1 es un pseudogen, y HYAL3 (SEQ no ha demostrado poseer actividad de enzima squiera substratos conocidos. HYAL4 (poli rsor indicado en SEQ ID NO: 39) es una condroit rita poca actividad hacia hialuronano. HYAL1 {poli rsor indicado en SEQ ID NO: 36) es el proto a acida activa y PH20 (polipéptido precursor indi D NO: 1) es el prototipo de enzima neutra acti ronidasas ácidas activas, tales como HYAL1 éptido precursor indicado en SEQ ID N almente carecen de actividad catalítica a pH neu pH 7) . Por ejemplo, HYAL1 tiene poca ac ítica in vi tro alrededor de pH 4.5 (Frost et al.

Bioche . 251:263-269). HYAL2 es una enzima ácida n actividad específica muy baja in vi tro. Las hialuronidasa también pueden ser caracteriza PH20 PH20, al igual que otras hialuronida ero, es una endo- ß-?-acetil-hexosaminidasa que hi lace glucosídico ß-1->4 del ácido hialuronic sas longitudes de oligosacárido tal como tetras asacáridos . Estas tienen actividades tanto hidro de transglucosidasa y pueden degradar ácido hial fatos de condroitina, tales como C4-S y C6-S. PH cada naturalmente en la adhesión de esperma- al esperma a penetrar la capa de células gr nte digestión del ácido hialuronico. PH20 se loca perficie del esperma, y en el acrosoma deri oma, en donde ésta se une a la membrana acr ior. PH20 de membrana plasmática tiene activ ronidasas solamente a pH neutro, mientras que ana acrosómica interior tiene actividad a Rhesus (SEQ ID NO: 186) de bovino (SEQ ID NOS: 11 I jo (SEQ ID NO: 25), PH20 de ovino (SEQ ID NOS: , de mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 29) , de cobayo O) , de rata (SEQ ID NO: 31) y de ratón (SEQ ID NO PH20 de bovino es un polipéptido precursor ácidos (SEQ ID NO: 11) . La alineación de PH20 de a PH20 de humano muestra solamente homología déb istencia de espacios múltiples desde el aminoác el extremo carboxi terminal respectivo debid cia de un ancla de GPI en el polipéptido de e por ejemplo, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug, 7-440) . De hecho, las anclas de GPI claras n sticadas en muchas otras especies de PH20 además os. Por lo tanto, los polipéptidos de PH20 produ r de ovinos y bovinos existen naturalmente como les. Aunque PH20 de bovino existe en forma déb ácidos (SEQ ID NO : 1; y se replica más adelan ene una secuencia de señal de 35 aminoácidos ino N-terminal (posiciones de residuos de aminoá y una secuencia de señal de unión al an silfosf tidil-inositol (GPI) de 19 aminoácidos mo C- erminal (posiciones de residuos de aminoáci Por lo tanto, la PH20 madura es un polipéptido ácidos indicada en SEQ ID NO: 2. Después del tr olipéptido precursor hacia el retículo endoplasm ión del péptido de señal, el péptido de señal d I C-terminal se corta para facilitar la unión c ancla de GPI al aminoácido C-terminal recién fo sición de aminoácido correspondiente a la posic olipéptido precursor indicado en SEQ ID NO: 1. se produce un polipéptido maduro anclado a GPI ácidos con una secuencia de aminoácido indicada REAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVL FLSQDELVYTFGETVALGASGIV LLLDNYMETIIJtfPYIIOTTLAAKM^ PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMET SATMFIVSILFLIISSVASL PH20 de humano presenta actividad de hialu tanto neutro como ácido. En un aspecto, PH20 de l prototipo de hialuronidasa neutra acti almente está enganchada a la membrana plasm s de un ancla de GPI . En otro aspecto, PH20 se membrana acrosómica interior en donde ést id d de hialuronidasa a pH tanto neutro como e ser que PH20 contiene dos sitios catalít es distintas del polipéptido: las regiones 1 pe eptídica (Cherr et al., (2001) atrix Biology La evidencia sugiere que la región 1 peptídica mo resultado polipéptidos de PH20 con 3% de acti ronidasa o actividad de hialuronidasa no det ctivamente , en comparación con la PH20 de tipo si ng et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814) .

La región 3 peptídica, la cual correspond iones de aminoácido 242-262 del polipéptido ado en SEQ ID NO: 2, y las posiciones 277-ép ido precursor indicado en SEQ ID NO: 1, par tante para actividad de enzima a pH ácido. De región, los aminoácidos en las posiciones 249 y éptido de PH20 maduro parecen ser esenciales idad, y la mutagénesis de cualquiera da como re lipéptido esencialmente carente de actividad (Ar (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814) .

Además de los sitios catalíticos, PH20 ene un sitio de unión a hialuronano. La e ado en SEQ ID NO: 2) a una glicina da como resu éptido con solamente alrededor de 1% de la acti ronidasa del polipéptido de tipo silvestre (Ar (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814) .

Existen siete sitios potenciales de gluco ados en PH20 de humano en N82, NI66, N235, N254 N490 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID o a que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1 ner el dominio de hialuronidasa de PH20 de amente activo, el sitio de glucosilación N-490 requerido para actividad apropiada de hialur en seis puentes de disulfuro en PH20 de huma es de disulfuro entre los residuos cisteína C60 C224 y C238 del polipéptido ejemplificado en SE e corresponden a los residuos C25 y C316, y C189 polipéptido maduro indicado en SEQ ID b . Hialuronidasas bacterianas Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2. 9.I) degradan el hialuronano y, hasta ciertos ulfates de condroitina y sulfatos de dermata ronano liasas aisladas de bacterias difieren ronidasas (provenientes de otras fuentes, por ronoglucosaminidasas , EC 3.2.1.35) en su modo de son endo- ß-?-acetilhexosaminidasas que catali ión de eliminación, en lugar de hidrólisi amiento ß- 1—»4 -glucosldico entre residuos de D-glucosamina y de ácido D-glucurónico en hial e produce tetrasacáridos y hexasacáridos de 3-(4-luc-4 -enuronosil) -N-acetil-D-glucosamina, y p es de tipo disacárido. La reacción da como resul ción de oligosacáridos con residuos de ácido he urado en sus extremos no reductores. Los e em ovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68) , Propionib (SEQ ID NO: 69), Streptococcus agalactiae ( (SEQ 18RS21 (SEQ ID NO: 71) ; serotipo la (SEQ ID N ipo III (SEQ ID NO: 73) , Staphylococcus aureu (SEQ ID NO: 74); cepa MRSA252 (SEQ ID NOS: 75 MSSA476 (SEQ ID NO: 77) ; cepa NCTC 8325 (SEQ ID bovina RF122 (SEQ ID NOS: 79 y 80); cepa USA300 l) , Streptococcus pneumoniae ( (SEQ ID NO: 82) ; ce 55/R6 (SEQ ID NO: 83); serotipo 2, cepa D39/NC ID NO: 84) , Streptococcus pyogenes (serotipo MI) 85); serotipo M2 , cepa MGAS10270 (SEQ ID N ipo M4, cepa MGAS 10750 (SEQ ID NO: 87); sero ID NO: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID ; serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 91); S SEQ ID NO: 92); Streptococcus suis (SEQ ID NOS: o fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: parásitos, y crustáceos (EC 3.2.1.36) son onidasas que generan productos finales d sacárido y hexasacárido . Estas enzimas catali lisis de los enlaces 1—»3 entre los residuos ronato y N-acetil-D-glucosamina en el hialurona los de hialuronidasas provenientes de sangu en, pero no se limitan a, hialuronidasa de Hiru ejemplo, Hirudo medícinalis) , Erpobdellida lo, Nephelopsis obscura y Erpobdella pun iphoniidae (por ejemplo, Desserobdella picta, Hel alisf Glossiphonia complanata, Placobdella o yzon sp.) y Haemopidae {Haemopis marmorata) (Hov (1999) Co p Biochem Physiol B Bioche Mol :319-26) . Una hialuronidasa de ejemplo proveni rias que tiene el mismo mecanismo de acción ronidasa de san ui uela es la ue roviene lo, se pueden utilizar enzimas, inc itinasas y liasas particulares, que tengan la c cortar hialuronano. Los ejemplos de condroitina n degradar hialuronano incluyen, pero no se lim oitina ABC liasa (también conocida como condro condroitina AC liasa (también conocida como con to liasa o condroitin-sulfato eliminasa) y condro . Los métodos para producción y purificación de as para uso en las composiciones, combinaci os provistos son conocidos en la técnica (por e te E.U.A. No. 6,054,569; Yamagata, et al. (1 Chem. 243(7): 1523-1535; Yang et al. (1985) J" 160 (30) : 1849-1857) .

La condroitina ABC liasa contiene dos e oitin-sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2.2.20) y con to-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21) (Hamai et al . ( condroitin-sulfato y dermatan-sulfato, lo que mezcla de oligosacáridos A4-insaturados de entes que finalmente son degradados hasta tetras sac ridos A4-insaturados . La condroitin- sulf asa tiene la misma especificidad de substra na los residuos de disac rido a partir de los eductores tanto de los sulfatos de con éricos como de sus fragmentos de oligos cidos por la condroitin-sulfato-ABC endoliasa (Ha . (1997) J". Biol. Chem. 272:9123-9130). Los ejem oitin-sulfato-ABC endoliasas y condroitin-sulf asas incluyen, pero no se limitan a, ientes de roteus vulgaris ? Flavobacterium h ondroitin-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulg a en SEQ ID NO: 98 (Sato et al. (1994) Appl . Mi chnol 41(1) : 39-46) . (2000) Applied and Environmental Microbiology 6 rnst et al. (1995) Critical Reviews in Bíochemi ular Biology 30(5) .387-444) .

La condroitinasa C corta el condroitin- sulf roduce tetrasacárido más un disacárido insatur tado (delta Di-6S) . Esta también corta el rónico produciendo disacáridos no sulfatados ins a Di -OS) . Los ejemplos de enzimas condroitinasa rias incluyen, pero no se limitan a, ientes de Streptococcus y lavojacte um (Hibi ) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; ichelacci ) J. Biol. Che . 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) em. 262 : 127-133) . 3. Enzimas degradadoras de hialuronano solub En las composiciones, combinaciones y método as, Hyall, PH20 de bovino y PH20 de ovino, v cas de las mismas y otras variantes de las mism lo, entre las enzimas degradadoras de hial les están cualesquiera enzimas degradado ronano que hayan sido modificadas para qu les, incluyendo cualquiera descrita en la s sional E.U.A. No. de serie 61/201,384 (incorpora encia en su totalidad) . Por ejemplo, las dadoras de hialuronano que contienen un ancla de n hacer solubles mediante truncamiento y remo o de una porción del ancla de GPI . En un ejem ronidasa de humano PH20, la cual normalment da a la membrana a través de un ancla de GPI, s soluble mediante truncamiento y remoción de to orción del ancla de GPI en el extremo C-terminal.

Las enzimas degradadoras de hialuronano s ronidasa neutra activa soluble.

Los ejemplos de una hialuronidasa soluble ualquier especie, tal como cualquiera indic iera de SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31, 86, o formas truncadas de las mismas que care o de una porción del ancla de GPI C- terminal, e a hialuronidasa sea soluble y conserve activ ronidasa. También incluidas entre las hialur les están las variantes alélicas u otras varía uiera de SEQ ID NOS : 1, 2, 11, 25, 27, 30 31, 86, o formas truncadas de las mismas. Las v cas y otras variantes son conocidas por el expert ca, e incluyen polipéptidos que tienen 60%, 70 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o idad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOS 5, 27, 30 31, 63-65 y 185-186, o formas truncadas corresponden a los residuos en el polipéptido indicado en SEQ ID NO: 2) de un polipéptido de , o formas soluble del mismo, generalmen iantes y no están alterados. Otros residu eren glucosilación y formación de puentes de di ridos para el plegamiento apropiado también pue iantes .

En algunos casos, la enzima degradad ronano soluble normalmente está anclada con G por ejemplo, PH20 de humano) y se hace soluble m amiento en el extremo C-terminal. Dicho trunc eliminar toda la secuencia de señal de unión a I, o puede eliminar sólo alguna parte de la secue de unión al ancla de GPI . Sin embargo, el poli tante es soluble. En casos en los que la dadora de hialuronano soluble conserva una porció idos en la técnica. Dichos métodos incluyen, per an a, utilizar algoritmos conocidos para pred ncia y ubicación de la secuencia de señal de u de GPI y el sitio ?, y efectuar análisis de sol y después de digestión con fosfolipasa C (PI PLD) especifica de fosfatidilinositol .

Las enzimas degradadoras de hialuronano s didas se pueden producir efectuando truncamie nales a cualquier enzima degradadora de hial da a GPI en forma natural de modo tal que el poli tante sea soluble y contenga uno o más resi ácido provenientes de la secuencia de señal de u de GPI. Los ejemplos de enzimas degradado ronano solubles extendidas que tienen truncamient mo C- terminal pero que conservan una porción ncia de señal de unión al ancla de GPI incluyen, tante es soluble y conserva uno o más resi ácido provenientes de la secuencia de señal de u de GPI . Las variantes alélicas y otras varian idas por el experto en la técnica, e i éptidos que tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92 95% o más de identidad de secuencia con cualqu D NOS: 1 o 2. Los polipéptidos de esPH20 provisto nte solicitud pueden estar truncados en el ext nal en l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ami mparación con el polipéptido de tipo silvestre, t lipéptido con una secuencia indicada en SEQ ID NO 5, con la condición que el polipéptido de tante sea soluble y conserve 1 o más resi ácido provenientes de la secuencia de señal de u de GPI.

Típicamente, para uso en las composi alimentos ingeridos, y debido a que éstas son p ies, todos los pacientes tienen un rie bilización subsiguiente. Por lo tanto, las prepa manas podrían no ser apropiadas para uso crónico preparaciones no humanas, se contempla en la itud que dichos polipéptidos se pueden preparar que tengan inmunogenicidad reducida, icaciones están dentro del nivel del experto ca y pueden incluir, por ejemplo, remoción y/o r 0 o más epítopes antigénicos en la molécula.

Las enzimas degradadoras de hialuronano, inc ronidasas (por ejemplo, PH20) , utilizadas en los a presente solicitud se pueden producir en binante o se pueden purificar o purificar parcial r de fuentes naturales, tales como, por eje r de extractos de testículos . Los métodos binante de humano y se pueden utilizar siciones, combinaciones y métodos descritos nte solicitud. La producción de dichas formas 20 se describe en las Solicitudes de Patente E.U. 40268425; US 20050260186 y US20060104968 ( inco referencia en sus totalidades) , y en los Ejempl nte. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 s yen polipéptidos de variantes truncadas en el ext nal que incluyen una secuencia de aminoácidos en , o que tienen por lo menos 91%, 92%, 93%, 94 97%, 98% de identidad de secuencia con una secue ácidos incluida en SEQ ID NO: 1, conservan activ ronidasa y son solubles. Entre estos polipéptido idos polipéptidos de PH20 soluble que etamente de todo o de una porción de la secue de unión al ancla de GPI . También están inclui 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 9, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 5, 60 o más ami omparación con el polipéptido de tipo silve tud completa, tal como un polipéptido de tipo si ngitud completa con una secuencia indicada en 1 o 2, o variantes alélicas o variantes de es variantes de las mismas.

Los ejemplos de polipeptidos de PH20 de hum amiento en el extremo C-terminal provistos nte solicitud incluye cualquiera que tenga trunc inales para generar polipéptidos que conte ácido 1 hasta el aminoácido 465, 466, 467, 46 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 48 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 49 495, 496, 497, de la secuencia de aminoácidos i EQ ID NO: 1, o posiciones correspondientes 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, cuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: iones correspondientes en una variante alélic ie de los mismos. La tabla 4 provee ejemp ativos de polipéptidos de PH20 truncados en el inal de ejemplo, incluyendo polipéptidos d le truncados en el extremo C-terminal. En la si 4, se proveen la longitud (en aminoácidos) éptidos precursor y maduro, y el identifica ncia (SEQ ID NO) en el cual se indica los ejem ncias de aminoácido de los polipéptidos prec de las proteínas de PH20 truncadas en el ext nal. En la tabla 4 también se incluye el polipép de tipo silvestre para comparación.

TABLA 4 TABLA 4 Precursor Precursor Maduro Ma péptido (aminoácidos) SEQ ID NO (aminoácidos) SEQ l-TLSA 491 194 456 2 l-PSTL 489 195 454 2 l-SPST 488 228 453 2 l-STLS 490 196 455 2 l-ASPS 487 197 452 2 I- ASP 486 229 451 2 l-YNAS 485 198 450 2 l-FYNA 484 199 449 2 l-IFYN 483 46 448 l-QIFY 482 3 447 l-PQIF 481 45 446 1-EP0I 480 44 445 l-EEPQ 479 43 444 l-TEEP 478 42 443 l-ETEE 477 41 442 I -METE 476 200 441 2 l-PMET 475 201 440 2 l-PPME 474 202 439 2 l-KPPM 473 203 438 2 l-LKPP 472 204 437 2 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483 de la secue ácidos indicada en SEQ ID NO: 1. Cuando se exp as de mamífero, la secuencia de señal de 35 ami minal es cortada durante el procesamiento, y se orma madura de la proteína. Por lo tant éptidos solubles maduros contienen los aminoácid 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483 de SEQ ID NO: tes de deleción que terminan en la posic ácido 477 a 483 (correspondientes al poli rsor indicado en SEQ ID NO: 1) presentan a tada más alta de hialuronidasa que la forma an e longitud completa. Por lo tanto, son ejem ronidasas solubles los polipéptidos de PH20 sol o que son de 442, 443, 444, 445, 446 o 447 ami ngitud, tales como los indicados en cualquiera de 4-9, o variantes alélicas o variantes de especie lo, células CHO DG44) . b. rHuPH20 Se han generado formas solubles recombina de humano y se pueden utilizar en las composi naciones y en los métodos provistos en la itud. La generación de dichas formas solubles binante de humano se describen en Solicitudes de . publicadas Nos. US20040268425 ; US 2005026 60104968, y en los ejemplos 2-6, más adelan los de dichos polipéptidos son aquellos gene r de una molécula de ácido nucleico que codifi minoácidos 1-482 (indicada en SEQ ID NO: 3) . ula de ácido nucleico de ejemplo se indica en SEQ l procesamiento posterior a la traducción eli ncia de señal de 35 aminoácidos, dejando u as CHO DG44) . 4. Glucosilacion de enzimas degradado ronano La glucosilacion, incluyendo glucosilacion N cosilación O- ligada, de algunas enzimas degradad ronano, incluyendo hialuronidasas, puede ser imp su actividad catalítica y estabilidad. Aunque alt de glucano modificando una glucoproteína pued os dramáticos sobre el carácter antigénico ina, plegamiento estructural, solubilida ilidad, se cree que la mayoría de enzimas no re lucosilación para actividad enzimática óptima s hialuronidasas, la remoción de glucosilacion N dar como resultado una inactivación casi complet idad de hialuronidasa . Por lo tanto, paira aa-Cys- para coagulación de la proteína C. En , una enzima degradadora de hialuronano, tal c ronidasa, puede contener enlaces tanto N-gluco O-glucosídicos . Por ejemplo, PH20 tiene oligosa dos así como oligosacáridos N-ligados. Existe s potenciales de glucosilacion N- ligada en N82 N254, N368, N393, N490 de PH20 de humano ejempl EQ ID NO: 1. Como se indicó anteriormen ilación N- ligada en N490 no es necesaria p idad de hialuronidasa .

En algunos ejemplos, las enzimas degradad onano para uso en las composiciones, combinacio s provistos están glucosiladas en uno o en to de glucosilacion. Por ejemplo, para PH20 de hu orma soluble de la misma, 2, 3, 4, 5, o 6 de los glucosilacion correspondientes a los aminoácid r adicionales puede incrementar las pro cocinéticas de la molécula, tal como tiempo mejorado y/o actividad mejorada.

En otros ejemplos, las enzimas degradad ronano para uso en las composiciones, combinacio os provistos en la presente solicitud están parci ucosiladas (o polipéptidos parcialmente N-glucosi jemplo, en las composiciones, combinaciones y/o stos en la presente solicitud se pueden u éptidos de PH20 soluble parcialmente desglucosila en todo o una porción de la actividad de hialur a hialuronidasa completamente glucosilada. Los e ialuronidasas parcialmente desglucosiladas i S solubles de de polipéptidos de una PH20 parci cosilada proveniente de cualquier especie, t iera indicada en cualquiera de SEQ ID NOS; 1, rite solicitud también incluyen hialuro almente desglucosiladas híbridas , de fus ricas, y conjugados de hialuronidasa parci ucosilada .

Las glucosidasas , o glucósido hidrolasa as que catalizan la hidrólisis del enlace gluc generar dos azúcares más pequeños . Los tipos pri -glucanos en los vertebrados incluyen glucan nido elevado de mañosa, glucanos híbridos y g ejos. Existen varias glucosidasas que dan como re cosilación sólo parcial de la proteína, incl 1, la cual corta los glucanos con alto . conte a y de tipo híbrido; EndoF2 , la cual corta los g po complejo de dos antenas; EndoF3 , la cua os complejos de dos antenas y de más ramificaci , la cual corta glucanos con contenido elevado de nte digestión con una o más glucosidasas , gene l cosidasa que no elimine todos los N-glucanos s ente desglucosile parcialmente la proteína. Por atamiento de PH20 (por . ejemplo, una PH20 reco nada rHuPH20) con una o todas las gluc iores (por ejemplo, EndoFl, EndoF2 y/o EndoF3) tado desglucosilación parcial. Estos polipépt parcialmente desglucosilados pueden presentar ac ática de hialuronidasa que es comparable c éptidos completamente glucosilados . En contra miento de PH20 con PNGasaF, una glucosidasa qu los N-glucanos, da como resultado la remoción c áos los N-glucanos y de esta manera hace que P áticamente inactiva. Por lo tanto, aunque to s de glucosilacion N-ligados (tales como, por e los en los aminoácidos N82, N166, N235, N254, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% del nivel de glucosila lipéptido completamente glucosilado. Tlpicamen as degradadoras de hialuronano parc ucosiladas, incluyendo polipéptidos de PH20 almente desglucosilados , presentan activid ronidasa que es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300% 1000% o m s de la actividad de hialuronidasa pr 1 polipéptido completamente glucosilado. 5. Modificaciones de las enzimas degradad ronano para mejorar sus propiedades farmacocinéti Las enzimas degradadoras de hialuronano se icar para mejorar .sus propiedades farmacocinétic incrementar su tiempo de vida media in vi idades. La modificación de las enzimas degradad EG incrementa la resistencia a proteólisis, inc empo de vida media en plasma, y reduce el c énico e el carácter inmunogénico . La unión cova unión estable (conjugación) de moléculas poli omo una porción de polietilenglicol (PEG) , a la dadora de hialuronano puede impartir por lo edades benéficas a la composición de enzima-p tante. Dichas propiedades incluyen biocompati ada, extensión del tiempo de vida media de la la actividad enzimática) en la sangre, células tejidos dentro de un individuo, blindaje efectiv ina contra proteasas e hidrólisis, biodist ada, farmacocinética y/o farmacodinámica mejor ilidad incrementada en agua.

Los polímeros de ejemplo que se pueden con zima degradadora de hialuronano, incluyen homop endo polipropilenglicoles (PEG) , metoxipoli es (mPEG) y polipropilenglicoles, éteres d ilo (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazol (C ilenglicoles ramificados (PEGs) , alcohol poliv , policarboxilatos , polivinilpirrolidona, po cidos, polietileno-co-anhídrido de ácido m tireno-co-anhídrido de ácido maléico, de endo carboximetil -dextranos , heparina, a ga, celulosas incluyendo metilce imetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilc ietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa, hidrolis sana, almidones tales como hidroxietil-almid ipropil -almidones, glucógeno, agarosas y deriv ismas, goma guar, pululano, inulina, goma x enina, pectina, hidrolizados de ácido algínico ros . ronano (por ejemplo, a los grupos de unión ficie de la proteína) utilizando una ivamente sencilla.

Las moléculas poliméricas apropiadas para zima degradadora de hialuronano incluyen, pero an a, polietilenglicol (PEG) y derivados de PE metoxi-polietilenglicoles (mPEG) , éteres d dilo (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG icados, y óxido de polietileno (PEO) (véase por e ts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 5 Harris y Zalipsky, S (eds.) 11 Poliethylene g stry and Biological Applications" ACS Symposium 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut . Sci. 36, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2 ry, J Biol. Chem 279 (37) : 38118-24 , 2004). La m érica puede ser de un peso molecular de tipi ,662; E.Ü.A. 6,737,505; y E.U.A. 2004/0235734 cas para modificación con PEG incluyen, pero an a, enlazadoras y químicas de co ializados (véase por ejemplo, Harris, Adv. Drug 54:459-476, 2002) , unión de porciones de PEG múlt io sitio de conjugación (tal como mediante el ramificados; véase por ejemplo, Veronese et al., Chem. Lett. 12:177-180, 2002) , modificación ífica de sitio y/o modificación con mono-PEG (vé lo, Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1 icación enzimática con PEG dirigida a sitio (vé lo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev. , 54:487-504, e, también, por ejemplo, Lu y Félix (1994) de Protein Res. 43:127-138; Lu y Félix (1993) 6:142-6, 1993; Félix et al. (1995) Int. J. Pepti 3-64; Benhar et al. (1994) J. Biol . Chem. 269:133 modificación con PEG. Dichos reactivos incluyen, mit n a, PEG activado con N-hidroxisuccinimidilo imidil-mPEG, mPEG2 -N-hidroxisuccinimida, utanoato de mPEG-succinimidilo, propionato de imidilo, butanoato de mPEG-succinimidilo, imidllico del ácido mPEG-carboximetil-3-h OÍCO, propionato de PEG-succinimidilp homobifun ropionaldehído homobifuncional , PEG-butira ifuncional, PEG-maleimida, PEG-hidrazida, p-nitr ato-PEG, carbonato de mPEG-benzot onaldehido-PEG, mPEG-butiraldehído, mPEG2-butira icado, mPEG-acetilo, mPEG-piperidona, mPEG-metil ida de mPEG "sin enlazadores" , mPEG-vinilsulfona mPEG-ortopiridiltioéster, disulfuro de iridilo# Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfo acrilato de PEG-NHS , fluoresceína-PEG-NHS , y b 5,985,263; E.U.A. 5,990, 237; E.U.A. 6,113,906; ,966; E.U.A. 6,258,351; E.U.A. 6,340,742; ,507; E.U.A. 6,420,339; E.U.A. 6,437,025; ,369; E.U.A. 6,461,802; E.U.A. 6,828,401 ,736; E.U.A. 2001/0021763; E.U.A. 2001/0044526; 046481; E.U.A. 2002/0052430; E.U.A. 2002/O 2002/0156047; E.U.A. 2003/0114647; 0143596; E.U.A. 2003/0158333; E.U.A. 2003/0 2004/0013637; E.U.A. 2004/0235734; E.U.A. 2005/ 2005/0114037; E.U.A. 2005/0171328; 0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 001766 l7; WO 0249673; WO 9428024; y WO 0187925) .

En un ejemplo, la enzima degradadora de hial uso en los métodos, composiciones, y combin stas es una hialuronidasa soluble que está mod EG. En un ejemplo particular, la hialuronidasa dadora de hialuronano indicados en la itud, se pueden obtener utilizando método idos en la técnica para purificación de pro sión de proteína recombinante . Los polipéptidos eden sintetizar químicamente. Por ejemplo, la cad dena B de insulina se pueden sintetizar química és entrelazar mediante puentes de disulfuro a tra jemplo, una reacción de reducción-reoxidación. olipéptidos se producen utilizando medios recombi ede utilizar cualquier método conocido por el exp écnica para identificación de ácidos nucleic ican para genes deseados. Se puede utilizar cu o disponible en la técnica para obtener una molé o clon de ADN genómico de longitud completa (es barque la región codificadora completa) que co una hialuronidasa, tal como a partir de una c ieos y tamizaje de genotecas, incluyendo tamiz dación de ácido nucleico, tamizaje basado en ant zaje basado en actividad.

Los métodos para amplificación de ácidos nu eden utilizar para aislar moléculas de ácido odifican para un polipéptido deseado, incluye lo, métodos de reacción en cadena de polimerasa ede utilizar un material que contenga ácido un material de partida a partir del cual se puede molécula de ácido nucleico que codifica p éptido deseado. Se pueden utilizar preparaciones Im, extractos celulares, extractos de tejidos, i luido (por ejemplo sangre, suero, saliva) , m nientes de individuos sanos y/o enfermos en los plificación. También se pueden utilizar genot nucleico como una fuente de material de part ican para un polipéptido deseado.

Se pueden unir secuencias de nucleótido adic a molécula de ácido nucleico que codific éptido, incluyendo secuencias enlazadoras que co s de endonucleasa de restricción para los propós r el gen sintético en un vector, por ejemplo, un presión de proteína o un vector diseñado ficación de las secuencias de ADN que codifican ína central. Asimismo, las secuencias de nuc onales que especifican los elementos de ADN func eden ligar en forma operativa a una molécula d ico que codifica para polipéptido. Los ejemp S secuencias incluyen, pero no se limitan a, sec omotor diseñadas para facilitar la expresión de p celular, y secuencias de secreción, por cias de señal heterólogas, diseñadas para facil as objetivo específicas, o de alguna otra manera rmacocinética de un producto de un gen sintéti lo, las enzimas se pueden ligar a porciones de PE Adem s, se pueden agregar marcas u otras por jemplo, para ayudar en la detección o purificac dad del polipéptido. Por ejemplo, también se secuencias de residuos de nucleótido adicionale secuencias de bases que especifican una marca de o marcador detectable a moléculas de ácido nucle ican para enzima. Los ejemplos de dichas sec en secuencias de ácido nucleico que codifican p His (por ejemplo, 6xHis, HHHHHH ; SEQ ID NO: 54) (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 55) .

Los ácidos nucleicos identificados y aisl insertar después en un vector de clonación apr ede utilizar un gran número de sistemas vector-ho lificado en la presente solicitud. La inserció r de clonación se puede lograr, por ejemplo, m ion del fragmento de ADN en un vector de clona tiene extremos terminales cohesivos complementar ción se puede efectuar utilizando vectores de el ( INVITROGE , Carlsbad, CA) . Si los sitios de rest ementarlos utilizados para fragmentar el ADN n ntes en el vector de clonación, los extremos ulas de ADN se pueden modificar enzimáticame a alternativa, se puede producir cualquier sitio nte ligación de secuencias de nucleótido (enlaz S extremos terminales del ADN; estos enlazadores n contener . oligonucleótidos químicamente sinte íficos que codifican para las secuenci ocimiento de endonucleasa de restricción. En un nativo, el vector cortado y el gen de proteína se chnol . Prog. 8:469-478). En algunos ejemplos, e ico que codifica para un polipéptido de preproins sulina se inserta dentro de un vector de exp s de la expresión, el polipéptido de preproins sulina se convierte en insulina utilizando ticos o químicos que cortan la secuencia de se tido C, lo que da como resultado que las cadena trelacen mediante puentes de disulfuro a través lo, una reacción de reducción-reoxidación (vé lo, Cousens et al., (1987) Gene 61:265-275, Ch (1993) Diabetes Care 4:147-154). En otro ejem nucleico que codifica para la cadena A y para la una insulina se inserta en uno o dos vect ión para coexpresión como un polipéptido indiv de un vector de expresión o expresión co ptidos a partir de uno o dos vectores de expresi ido nucleico insertado en el vector de expresió ner, por ejemplo, ácido nucleico que codifica a B de insulina, un enlazador, tal como por ejet ador de alanina-alanina- lisina, y la cadena A, lo resultado la expresión de, por ejemplo "caden ina-Ala-Ala-Lys-Cadena A de insulina".

En modalidades especificas, la transforma élulas hospederas con moléculas de ADN recombina poran el gen de proteína aislada, ADNc, o la se N sintetizada permite la generación de copias mú en.- Por lo tanto, el gen se puede obtener en ca es cultivando los transformantes, aislando las mo N recombinante a partir de los transformantes y, ecesario recuperando el gen insertado a partir binante aislado. icadora de proteína insertada. Las seña cripción y traducción necesarias también pue Ístradas por el promotor original para los g a y/o sus regiones de flanqueo.

También se proveen vectores que contienen u ico que codifica para enzima. También se proveen ontienen los vectores. Las células incluyen iotas y procariotas, y los vectores son cu iado para uso en la misma.

Se proveen células procariotas y euc yendo células endoteliales , que contienen los ve S células incluyen células bacterianas, célu ura, células fúngicas, Archea, células ve as de insecto y células animales. Las célu zan para producir una proteína de la misma cul élulas antes descritas bajo condiciones en las cu res se pueden seleccionar para expresión de la p zima en la célula o de modo tal que la proteín a se exprese como una proteína secretada.

Se puede utilizar una variedad de siste dero-vector para expresar la secuencia que codifi oteína. Estos incluyen pero no se limitan a sist a de mamífero infectadas con virus (por ejemplo nía, adenovirus y otros virus) ; sistemas de cé to infectadas con virus (por ejemplo báculo organismos tales como levaduras que contienen v vadura; o bacterias transformadas con bacteriofag e plásmido, o ADN de cósmido. Los elementos de ex los rectores varían en sus concentracio ificidades. Dependiendo del sistema de hospedero zado, se puede utilizar cualquiera de un nú tos de transcripción y traducción apropiados. presión de secuencias de ácido nucleico que co proteína, o dominios, derivados, fragmentos u no misma, puede ser regulada por una segunda secue nucleico para que los genes con fragmentos s se expresen en un hospedero transformado la o moléculas de ADN recombinante . Por ejem sión de las proteínas se puede controlar m ier promotor/ incrementador conocido en la técn odalidad específica, el promotor no es original p para una proteína deseada. Los promotores que se zar incluyen pero no se limitan al promotor t (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981 tor contenido en la repetición terminal larga de sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22 : ) ) , el promotor de timidina cinasa de herpes ( a roc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1441-1445 (1981) tasa (Herrara-Estrella et al, Nature 303:209-213 promotor 35S de ARN del virus del mosaico de la c er et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)) tor de la enzima fotosintética ribulosa bis ilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310: ) ) ; elementos promotores provenientes de lev hongos tales como el promotor Gal4 , el prom I deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol omotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes r ntrol de transcripción de origen animal que pr ificidad de tejido y que han sido utilizadas en a énicos: región de control del gen de elastasa I tivo en células acinares pancreáticas (Swift 35:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Sprlng Quant, Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, He -515 (1987)); región de control del gen para insu 5-495 (1986) ) , región de control del gen para a al es activo en hígado (Pinckert et al., Ge 7:268-276 (1987)), región de control del g fetoproteína el cual es activo en hígado (Krum Mol. Cell, Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer ce 235:53-53 1987)), región de control del g ripsina alfa-1 el cual es activo en hígado (Ke enes and Devel. 7:161-171 (1987)), región de cont ará beta-globina el cual es activo en células mi am et al, ature 375:338-340 (1985); Kollias et a -94 (1986)), región de control del gen para p a de mielina el cual es activo en oligodendroci ro (Readhead et al, Cell 48:103-712 (1987)), re ol del gen para la cadena ligera 2 de miosina el o en músculo esquelético (Shani, Nature 314: ) ) , y región de control del gen para la hor tencia a antibióticos) . Los vectores plásmi lo para transformación de células de E. coli i jemplo, los vectores de expresión pQE (dispon n, Valencia, CA; véase también la literatura pu iagen que describe al sistema) . Los vectores pQE omotor T5 de fago (reconocido por ARN polimeras y un módulo doble de represión del operador l er expresión estrictamente regulada, de alto n inas recombinantes en E. coli, un sitio de oma (RBS II) sintético para traducción eficien ncia codificadora de la marca 6XHis, terminad cripción t0 y- TI, origen de replicación ColEl, y beta-lactamasa para conferir resistencia a ampi ectores pQE permiten la colocación de una marca 6 iera del extremo N- terminal o C-terminal de la p inante . Dichos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30 s plásmidos incluyen ET lia, el cual cont tor T71ac, el terminador de T7, el operador la inducible, y el gen represor de lac; pET 12a- c, ene al promotor T7, terminador T7, y la s ción ompT de E. coli; y pET 15b y pET 19b ( on, WI) , los cuales contienen una secuencia líd para uso en la purificación con una columna de H de corte de trombina que permite el corte despué icación a través de la columna, la región del -lac y al terminador T7.

Los ejemplos de un vector para expresión en mífero es el vector de expresión HZ24. El ve sión HZ24 se obtiene a partir de la estructura b r pCI (Promega) . Este contiene ADN que codifica e resistencia a beta- lactamasa {AmpR) , un or cación Fl , una región de incrementador/ ando los polipéptidos de la cadena A y la caden lazador, tal como, por ejemplo, el extremo C-ter dena B se une al extremo N-terminal de la c nte un enlazador corto . La cadena A y las caden expresar a partir de un polipéptido individ nga un enlazador, o se pueden expresar por sep es unir mediante un enlazador. La porción enlaza ciona en función de las propiedades deseadas. La adora debe ser lo suficientemente rápida ientemente flexible para permitir que la cadena a B imiten la conformación natural de la insuli adores pueden ser cualquier porción apropiada a A y la cadena B. Dichas porciones incluyen, per an a, enlazadores peptídicos; enlazadores de ami éptido, que contienen típicamente entre imadamente 60 aminoácidos; enlazadores químicos ácido. Los enlazadores peptídicos pueden ser cod nera conveniente por ácido nucleico e incorpor ínas de fusión después que se expresan en una dera, tal como E. coli. En un ejemplo, un enlaz na-alanina-lisina (AA ) (SEQ ID NO: 178) se codi ido nucleico entre el ácido nucleico que codifi dena B de insulina y el ácido nucleico que codifi dena A, de modo tal que después de la expres ce un polipéptido "cadena B de insulina-AAK-cade ina" . Los enlazadores pept dicos pueden s ncia de aminoácido espaciadora flexible, ta las conocidas en la investigación de anticue a individual. Los ejemplos de dichas p adoras conocidas incluyen, pero no se limitan a, ID NO: 166) O SSPPPPC (SEQ ID NO: 167) , GGGGS 68), (GGGGS) n (SEQ . ID NO: 169), GKSSGSGSESKS en la cual X es un número entero de 1 a 11 (SEQ Porciones enlazadoras adicionales se describ lo, en Huston et al. (1988) Proc . Nati. Acad. S 79-5883; Whitlow, M. , et al. (1993) Protein Eng -995; Newton et al. (1996) Biochemistry 35:545-mber et al. (1992) Bíoconj . Chem. 3:397- 401; (1997) J. Mol. Blol. 273:330-337; y patente E. ,443.

En algunos ejemplos, los enlazadores peptídi cados por ácido nucleico e incorporados entre l a cadena A después de expresión en una célula hos omo E. coli o S. cerevisíae . En otros ejemp ador peptídico se sintetiza mediante métodos q se puede efectuar en un protocolo separado sis de una o más de las cadenas A y B, despué los componentes se unen, tal como con el adores y enlaces que son apropiados para camente las cadenas incluyen, pero no se lim es de disulfuro, enlaces tipo tioéter, puen furo impedidos, y enlaces covalentes entre ivos libres, tales como grupos amina y tiol. es se producen utilizando reactivos heterobifunc producir grupos tiol reactivos en uno o e éptidos y después se hace reaccionar los grupos lipéptido con los grupos tiol o grupos amina reac uales se pueden unir los grupos maleimido o grup ivos en el otro. Otros enlazadores incluyen, enla ptibles de corte con ácido, tales leimideotoxi-propano, conjugados de transferrina do y di-hidrazida el ácido adípico, se podr dos en compartimientos intracelulares más lazadores que se cortan después de exposición a es heterobifuncionales , descritos más adelan utilizar para efectuar dicha copulación covalen adores peptídicos también se pueden ligar sión del ADN que codifica para el enlazador e a B y la cadena A.

Otros enlazadores que se pueden utilizar pa dena A y la cadena B de la insulina incluyen: sub enzima, tales como substrato para catepsina B, su catepsina D, substrato para tripsina, substra ina, substrato para subtilisina, substrato para y substrato para enterocinasa; los enlazador mentan la solubilidad, flexibilidad, y/o suscepti orte intracelular incluyen enlazadores, tale er)n y (sermgly)n, en los cuales m es 1 a rencia 1 a 4, de manera más preferida 2 a 4, y n e preferencia 1 a 10, de manera más preferida ido por los expertos en la técnica incluyendo mét e in vi tro. Las proteínas deseadas se pueden exp uier organismo apropiado para producir las canti S requeridas de las proteínas, tales como por necesarias para administración y tratamient deros de expresión incluyen organismos procar iotas tales como E, coli, levaduras, plantas, cél to, células de mamífero, incluyendo líneas ce as y animales transgénicos . Los hospederos de e n diferir en sus niveles de producción de prote en los tipos de modificaciones posteriores cción que están presentes en las proteínas exp ección del hospedero de expresión se puede hacer base estos y otros factores, tales como conside atorias y de seguridad, costos de producció idad y métodos de purificación. res de expresión que se utilizan para transf le típicamente tienen un marcador suscepti ción el cual permite la selección y mantenimiento as transformadas. En algunos casos, se puede útil n de replicación para amplificar el número de cop r .

Los polipéptidos de hialuronidasa soluble eden utilizar o expresar como proteínas de fusi lo, se puede generar una fusión de enzima para onalidad adicional a una enzima. Los ejemp ínas de fusión de enzima incluyen/ pero no se li es de una secuencia de señal, una marca tal co ización, por ejemplo una marca his6 o una marca arca para purificación, por ejemplo, una fusión . secuencia para dirigir la secreción y/o asocia ana de la proteína. sión de proteína y para expresar proteínas que p de toxicidad a las células hospederas. Los ejet tores inducibles incluyen el promotor lac, el el promotor tac híbrido, los promotores T7 y SP omotor ???. regulado por temperatura.

Las proteínas, tales como cualquiera provist nte solicitud, se pueden expresar en el iasmático de E. coli. El citoplasma es un tor y para algunas moléculas, esto puede d tado la formación de cuerpos de inclusión insolu n utilizar agentes reductores tales como ditiotr captoetanol y desnaturalizantes, tales como clo anidina y urea para volver a solubilizar las pr strategia alternativa es la expresión de proteína io periplasmático de las bacterias el cual pr no oxidante e isomerasas de disulfuro ti o cha ina. En algunos casos, la expresión peripl te el escape de la proteína expresada hacia el vo. La secreción de proteínas permite la puri a y sencilla a partir del sobrenadante de culti ínas que no son secretados se pueden obtener a eriplasma mediante lisis osmótica. En forma simil sión citoplasmática, en algunos casos las prote n volver insolubles y se pueden turalizantes y agentes reductores para facil ilización y re-naturalización. La temperat ción y crecimiento también puede influenciar los xpresión y solubilidad, típicamente se raturas entre 25 °C y 37°C. Típicamente, las b cen proteínas no glucosiladas . Por lo tanto, ínas requieren de glucosilación para funció silación se puede agregar in vitro después de p nte solicitud. Las levaduras se pueden transfor res de replicación episómicos o mediante inte sómica estable utilizando recombinación ho amente, se utilizan promotores inducibles para presión del gen. Los ejemplos de dichos pro yen GAL1 , GAL7 y GAL5 y promotores de metaloti como CUP1, AOX1 u otro promotor de Pichia ura. Los vectores de expresión con frecuencia i rcador susceptible de selección tal como LEU2 y U A3 para selección y mantenimiento d formado. Las proteínas expresadas en levadu encia son solubles. La coexpresión con chape como Bip e isomerasa de disulfuro de proteín ar los niveles de expresión y solubilidad. De onal, las proteínas expresadas en levadura pue idas para secreción utilizando fusiones de pép ecreción. Las levaduras también son capa silación en los motivos Asn-X-Ser/Thr . c . Células de insecto Las células de insecto, particularmente cu za expresión en baculovirus, son útiles para e éptidos tales como polipéptidos de hialuronida as de insecto expresan niveles altos de proteín es de la mayoría de las modificaciones posterior cción utilizadas por eucariotas superiore ovirus tienen un intervalo restrictivo de hospe mejora la seguridad y reduce preocupaciones regul expresión en eucariotas . Los vectores de e os utilizan un promotor para expresión de alto ni el promotor de polihedrina de baculovirus. Los s culovirus comúnmente utilizados incluyen bac creción de origen mamífero son procesadas con e s células de insecto y se pueden utilizar para S oteína expresada hacia el medio de cultivo. Adem S celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y ppus (DpNl) producen proteínas con patró silación similares a los sistemas de célula de ma Un sistema de expresión alternativo en cél to es el uso de células establemente transformad presión se pueden utilizar líneas celulares tal élulas Schneider 2 (S2) y Kc {Drosophila melanoga élulas C7 (Aedes alb'opictus) . Se puede util tor de metalotioneína de Drosophila para inducir de expresión en presencia de inducción por metal admio o cobre. Los vectores de expresión típicam enen mediante el uso de marcadores suscepti ción tales como neomicina e higromicina. te medios físicos tales como electropora inyección. Los vectores de expresión para eras típicamente incluye un sitio de termina una caja TATA, una secuencia de inicio de tra encia de consenso de Kozak) y element enilación. También se pueden agregar elementos permitir la expresión bicistrónica con otro g un marcador susceptible de selección. Dichos v frecuencia incluyen promotores- incrementador cripción para expresión de alto nivel, por eje tor- incrementador de SV40, el promoto egalovirus (CMV) de humano y la repetición t del virus de sarcoma de Rous (RSV) . Estos prom entadores son activos en muchos tipos cel én se pueden utilizar para expresión promot es incrementadoras de tipo tisular y célul onstrucción de expresión. Los ejemplos de g dor susceptible de selección incluyen, pero an a, higromicina B fosfotransferasa, ad inasa, xantina-guanina fosforribosil trans glucósido fosfotransferasa, dihidrofolato re y timidina cinasa. Por ejemplo, la expresión s uar en presencia de metotrexato para sele mente aquellas células que expresen al gen de D n con moléculas de señalización de superficie como TCR- ? y FCERI-Y puede dirigir la expresión inas en un estado activo sobre la superficie S líneas celulares están disponibles para expré ero incluyendo células de ratón, rata, humano, y hámster. Los ejemplos de líneas celulares i no se limitan a las líneas celulares CHO, Ba MT2, NSO de ratón (no secretora) y otras et al, (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.), disponibles líneas celulares que están adaptad r en medios especiales optimizados para e a. Por ejemplo, las células CHO DG44 están a crecer en cultivo en suspensión en un medio l cto animal, químicamente definido. e . Plantas Se pueden utilizar células vegetales y génicas para expresar proteínas tales como cu ita en la presente solicitud. Las construcci sión se transfieren típicamente a las plantas uti ferencia directa de ADN tal como bombard proyectiles y transferencia mediada por PEG al i os protoplastos , y con transformación media acterium. Los vectores de expresión pueden ina sintetasa, el promotor de ribosa bi xilasa y los promotores de ubiquitina y UB encia se utilizan marcadores susceptibles de s como higromicina, fosfomanosa isomerasa y ne transferasa para facilitar la selección y mante as células transformadas. Las células v formadas se pueden mantener en cultivo como c ados (tejido calloso) o regenerar como etas. Las células de planta transgénica también ir algas diseñadas genéticamente para que p éptidos de hialuronidasa. Debido a que las n patrones de glucosilación diferentes a los as de mamífero, esto puede influir en la elec ína producida en estos hospederos . 4. Técnicas de purificación ican a partir del extracto. Cuando se ismos transgénicos tales como plantas y génicos para1 la expresión, se pueden utilizar te os como material de partida para elaborar un ext a lisada. De manera adicional, la producción de génico puede incluir la producción de polipépt o huevos, los cuales se pueden recolectar, y s ario, las proteínas se pueden extraer y p onalmente utilizando métodos estándar en la técni ínas, tales como polipéptidos de insulina o poli zima degradadora de hialuronano, se pueden p zando técnicas estándar de purificación de idas en el campo incluyendo . pero sin limitarse cromatografía por fraccionamiento de tamaño sión de tamaño, precipitación con sulfato de a tografía de intercambio iónico, tal como int ican por afinidad con anticuerpo para myc, re tión y resina de níquel, respectivamente. La pu evaluar utilizando cualquier método conocido ca, incluyendo electroforesis en gel, métodos oñales, técnicas de tinción y espectrofotométrica F. Preparación, formulación y administrac éptidos de insulina y enzima degradadora de hialu En la presente solicitud se proveen compos céuticas de insulina de acción rápida y dadoras de hialuronano para administración. Las dadoras de hialuronano se coformulan o coadminist laciones farmacéuticas de insulina de acción rápi entar el suministro de insulina de acción rápi e incrementando la velocidad de absorc entando la biodisponibilidad de insulina. La ve amente de la insulina después de adminis teral, tal como, por ejemplo, administración su mparación con métodos convencionales de adminis tánea, para proveer, por ejemplo, una respue te y/o más rápida para una dosis da inistraci n de una enzima degradadora de hialuro nsulina de acción rápida, por lo tanto, puede c insulina de acción rápida en una insulina de -rápida. Las enzimas degradadoras de hialuronano eden utilizar para lograr el control glucémico menor de insulina administrada. La capacidad as degradadoras de hialuronano para incrementar e uido global en y cerca de un sitio de inye ión también puede mejorar otros aspectos de su eológico asociado. Por ejemplo, el incremento f o global puede ayudar a permitir que el vol súper-rápida cuando se administran con una dadora de hialuronano. Las ventajas con respect Ístración de insulina sin una enzima degrada onano es que la enzima degradador ronano/insulina, coadministradas o coformuladas omo resultado regímenes de dosificación más favo jemplo, dosis de insulina más bajas y/o el as de bucle cerrado más efectivos, y uticos mejorados, por ejemplo, control glucém ente y/o reducción del exceso de insulina. Por e isminuir la dosis, se pueden reducir los arios asociados con el exceso de insul lación, como los que se observan con dosis más a ina. Dichos efectos secundarios incluyen, pero n a, hipoglucemia y obesidad.

Las composiciones se pueden formular en Siciones separadas. Cuando se proveen como compos adas, la enzima degradadora de hialuronano y la i ueden empacar para administración juntas, en cial o de manera intermitente. Las combinaci empacar como un estuche. 1. Formulaciones Los compuestos se pueden formular como cuale aciones farmacéuticas apropiadas para adminis teral tales como soluciones, suspensiones, formul iberación sostenida, o polvos. Típicament stos se formulan como composiciones farmac zando técnicas y procedimientos bien conocidos (véase por ejemplo, Ansel Introducti ceutical Dosage Forms, Cuarta Edición, 1985, 12 siciones farmacéuticamente aceptables se prep céu icos apropiados se describen en "Remi aceutical Sciences" by E. W. Martin, iciones pueden contener una cantidad terapéuti iva del compuesto, generalmente en forma purif almente purificada, junto con una cantidad aprop lo para proveer la forma para administración a aciente. Dichos vehículos farmacéuticos pued dos estériles, tales como agua y aceites, inc los de origen petroquímico, animal, vegetal o sin omo aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite m ites de ajonjolí. El agua es un vehículo típico composición farmacéutica se administra po enosa. También se pueden utilizar soluciones sa iones acuosas de dextrosa y glicerol como ve os, particularmente para soluciones inyectabl siciones pueden contener junto con un ingr céuticos apropiados incluyen almidón, glucosa, l osa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, e, estearato de sodio, monoestearato de gl riña, talco, cloruro de sodio, leche descremad rol, propileno, glicol, agua y etanol . Si se d s sición también puede contener cantidades men es humectantes o emulsificantes , o iguadores de pH, por ejemplo acetato, citrato de rina, derivados de ciclodextrina, monolaur tan, trietanolamina acetato de sodio, ole anolamina, y otros de dichos agentes.

Los compuestos farmacéuticos terapéuti S y derivados de los mismos típicamente se for istran en formas de dosificación unitarias o en sificación múltiples. Cada dosis unitaria conti dad predeterminada de compuesto terapéuticamente edor que se van a administrar en formas de dosif ías segregadas. Los ejemplos desformas de dosif ies incluyen frascos, cartuchos, botellas de tab las o botellas de 500 mi o de 3.78 litros. Por lo rma de dosificación múltiple es un múltiplo d ias que no están segregadas en el material de e érminos generales, se pueden preparar for cación o composiciones que contienen ingrediente intervalo de 0.005% a 100% estando el resto cons vehículo no tóxico.

Las composiciones provistas en la p tud típicamente se formulan para adminis te vía subcutánea, aunque se contemplan otras stración, tal como cualquier vía conocida p os en la técnica incluyendo administración uscular, intraperitoneal , intravenosa, intrad ación tópica, por ejemplo en conjunto con un és de la cirugía, mediante inyección, por medi er, por medio de un supositorio, o por medio nte. Las composiciones también se pueden administ agentes - biológicamente activos, ya sea en secue a intermitente o en la misma composición.

La vía más apropiada en cualquier caso dado a variedad de factores, tales como la naturalez medad, la tolerancia del individuo a una istración particular, la gravedad de la enfermeda sición particular que se utiliza. Típicament siciones provistas en la presente solici istran por vía parenteral. En algunos ejemp istran enzimas degradadoras de hialuronano de m llegan al intersticio de la piel o tejidos, con dan el espacio intersticial para suministro subsi ión, la cual se puede facilitar mediante el uso u otro dispositivo similar. También se contempl de administración. Las composiciones farmacéut n formular en forma de dosificación apropiadas p e administración. . presente solicitud se contempla la administrac ubcutánea, caracterizada generalmente por inye ión. Los inyectables se pueden preparar en cionales, ya sea como soluciones líqui siones, formas sólidas apropiadas para solu sión en líquido antes de la inyección, iones. Los excipientes apropiados son, por e solución salina, dextrosa, glicerol o etan iciones farmacéuticas pueden contener otras ca es de sustancias auxiliares no tóxicas tale ido en dichas composiciones depende en gran ma turaleza específica del mismo, así como de la a mpuesto y de las necesidades del individuo. nyectables están diseñados para administración mica. Para los propósitos de la presente solici la administración local para administración dir sticio afectado. Las preparaciones para adminis ía parenteral incluyen soluciones estériles list ción, productos solubles secos estériles, tal s liofilizados , listas para ser combinados te justo antes del gusto, incluyendo tabletas , suspensiones estériles listas para in ctos y solubles secos estériles listas pa nados con un vehículo justo antes del gusto y em iles. La soluciones puede ser acuosas o no acuo reparaciones parenterales incluyen vehículos ulos no acuosas, agentes antimicrobianos, nica os, amortiguadores, antioxidantes, anes es, agentes para suspensión y dispersión, ificantes, agentes secuestra antes o quelantes cias farmacéuticamente aceptables. Los ejemp ulos acuosas incluyen inyección de cloruro de ción de Ringer, inyección de dextrosa is ción de agua estériles, inyección de ring osa y lactato. Los vehículos parenterales no yen aceites no volátiles de origen vegetal, ac la de algodón, aceite de maíz, aceite de ajo e de cacahuate . Se pueden agregar icrobianos en concentraciones bacteriostáti státicas a preparaciones parenterales empaca edores de dosis múltiples, los cuales incluyen ximetilcelulosa de sodio, hidroxipropil metilcel inilpirrolidona. Los agentes emulsificantes orbato 80 (TWEEN 80) . pn agentes secuestrante o nes metálicos incluye EDTA. Los vehículos farma én incluyen alcohol etílico, polietilengl lenglicol para vehículos miscibles en agua e h dio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido ajuste del pH. ncentración del compuesto farmacéuticamente ac a de modo tal que una inyección o infusión pro dad efectiva para producir el efecto farma do, tal como control glucémico. La dosis exacta edad, pese condición del paciente o animal como a técnica. Las preparaciones parenterales de ría se pueden empacar en, por ejemplo, una ampoll ejemplo, la preparación farmacéutica puede e líquida, por ejemplo, soluciones, jarabe siones. Si se proveen forma líquida, las prepar céuticas se pueden proveer como una prep trada que se va a diluir hasta una concen éuticamente efectiva antes de utilizar, raciones líquidas se pueden preparar mediante ncionales con aditivos farmacéuticamente ace como agentes para suspensión (por ejemplo ja tol, derivados de celulosa o grasas come genados) ; agentes emulsificantes (por ejemplo, l cia) ; vehículos no acuosos (por ejemplo, ac dra, ásteres oleosos, o aceites vegetales fraccio servadores (por ejemplo, metil- o propil-p-h atos o ácidos sórbico) . En otro ejempl raciones farmacéuticas se pueden presentar e istración que es edad coadministrada, o se ner separadas y después se coadministran jun ncia o en forma intermitente. En algunos ejemp ina de acción rápida y la enzima degradad ronano se coformulan como composiciones de insu n súper-rápida . Como se discute más adelant siciones se pueden formular para dosis individ ies, en las cuales las dosis se pueden proveer c rción de cantidad de una enzima degradad ronano a insulina administrada. Por e emplo, una adora de hialuronano se puede administrar a 1 Un ronidasa/U de insulina (1:1) a 50:1 o más, por e roximadamente a 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7: 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1 40:1, 45:1, 50:1 o más. En otros ejempl istran relaciones más bajas de enzima degrada Típicamente, la cantidad de enzima degrada ronano en las composiciones co- formuladas o separ nalmente equivalente a o a por lo menos 1 U/ml, l, 4 U/ml, 5 U/ml, 6 U/ml, 7 U/ml, 8 U/ml, 9 U 15 U/ml, 20 U/ml o 25 U/ml de activi ronidasa. En algunos ejemplos, la cantidad de adora de hialuronano en las composiciones co-for aradas es funcionalmente equivalente a o a por l 35 U/ml de actividad de hialuronidasa, tal co 35 U/ml, 37.5 U/ml, 40 U/ml, 50 U/ml, 60 U/ml, 7 i, 90 U/ml, 100 U/ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ 600 U/ml, 700 U/ml, 800 U/ml, 900 U/ml, 1000 U/m 3000 U/ml o 5000 U/ml de actividad de hialuronid Las composiciones de insulina de acción provistas en la presente solicitud pueden conte s amortiguadores de pH (tales como, por e to o EDTA calcico, depurador de oxígeno, t nina, ácido ascórbico/ascorbato, ácido cítrico/ úmina, y/o un conservador, tal como un conserva nga un anillo aromático (por ejemplo, fenol o ejemplos de conservadores que son útiles siciones provistas en la presente solicitud i no se limitan a, m-cresol, fenol y parabeno o c nación de los mismos. En algunos ejemplos, el rega en una cantidad de o de aproximadamente tal como 0.1% a 0.15% (por ejemplo, a o aproxim .1%, 0.11%, 0.12%, 0.13%, 0,14% o 0.15% ntraciones apropiadas de fenol o parabeno incluy , tal como 0.1% a 0.2% (por ejemplo, imadamente de un un 0.1%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, , 0.17%, 0.18%, 0.19% y 0.2%). Típicamente, se u otra sal en las composiciones que contienen un icador de tonicidad y/o para incrementar la vis s composiciones.

Los ejemplos de estabilizadores que son útil omposiciones que contienen una enzima degrada ronano incluyen detergentes o agentes tensoa como polisorbatos y proteínas tales como seroa ano. En algunos ejemplos, se incluyen uno o más activos (por ejemplo, tales como Pluronic F68) siciones, tales como en una cantidad imadamente de 0.001% a 0.1%, típicamente de imadamente 0.005% a 0.03% (por ejemplo, 0.005%, %, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.012%, 0.014%, %, 0.02% o 0.03. Los ejemplos de concentraci lbúmina que son útiles en las composiciones te solicitud incluyen 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 g/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/t nc puede funcionar para estabilizar el hexá ina. El zinc se puede proveer, por ejemplo, com nc, acetato de zinc o cloruro de zinc. El zin presente en una composición provista en la p itud en una cantidad de entre o aproximadamente d mg por cada 100 unidades de insulina, tal com ramos por cada 100 unidades de insulina (mg/ mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 016 mg/100 U, 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 0 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04 mg/100 U, 0.05 mg mg/100 U, 0.07 mg/100 U, 0.08 mg/100 U o 0.1 mg ejemplo, el zinc está presente a 0.017 mg por C insulina. También puede estar presente un te de metal, tal como EDTA calcico (CaEDTA) , t jemplo, a concentraciones de entre aproximadamen lo, a una relación de o de aproximadamente 2: 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, e agente quelante : zinc . También puede estar i ro de calcio en las composiciones, por ejemplo imadamente 0.2 mM a 20 mM.

En algunos casos, cualquiera de uno o más nentes descritos anteriormente están presentes s composición de insulina de acción rápida o sición degradadora de hialuronano, hasta que siciones se coformulen o se suministren al i una composición de insulina de acción súper-rápi lo, la composición de insulina de acción rápid ner zinc en una cantidad entre o aproximadamente g por cada 100 unidades de insulina, tal com ramos por cada 100 unidades de insulina (mg/ mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 M, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 m , 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM o más y sin zinc. , solamente cuando las dos composiciones se mezcl cuando se coformulan o coadministran, es cu sición que contiene insulina también contiene ED sición que contiene una enzima degradad ronano también contiene zinc. En algunos ca sición de insulina de acción rápida y la composi a degradadora de hialuronano iniciales c dades suficientes de zinc o agente q ctivamente, que cuando se mezclan para coformul inistración, el agente quelante está prese dades aproximadamente equimolares (es decir de 0.6 a 1.4) o en exceso molar con respecto tal como por ejemplo, a una relación de imadamente 2:1, 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 40:1 ar el pH para incrementar la solubilidad de la i ción rápida particular utilizada en las insul n súper-r pida provistas en la presente solici os ejemplos/ las composiciones provistas en la itud que contienen una o ambas de una insulina de a y una enzima degradadora de hialuronano tie aridad de o de aproximadamente 100 mOsm/kg, 120 Osm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/ kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 Osm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/ kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 kg, y un pH de o de aproximadamente 6, 6.2, 6. 7, 7,2, 7.4, 7.6, 7.8 u 8. En algunos ejemplos, e desde aproximadamente 6.5 hasta o hasta aproxim tal como 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7. 7.5. ólisis, incrementa el tiempo de vida media en ?? nuye el carácter antigénico e inmunogénico. kos todologías para modificación con PEG son conocido ca (véase por ejemplo, Lu y Félix, Int. J. in Res., 43: 127-138, 1994; Lu y Félix, Peptide , 1993; Félix et al, Int. J. Peptide Res., 46: Benhar et al, J. Biol . Chem. , 269: 13398-404 anu et al, J" Inununol . , 154: 3088-95, 1995; én, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deli :1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 -8S) . La modificación con PEG también se puede suministro de moléculas de ácido nucleico in vi lo, la modificación de adenovirus con PEG mentar la estabilidad y transferencia de genes jemplo, Cheng et al (2003) Pharm. Res. 20(9): 144 iguadora. La solución amortiguadora puede cont ente que mejore la estabilidad u otro co cológico del polvo o solución reconstituida, prep r del polvo. La esterilización por fil guíente de la solución, seguido por liofilizaci ciones estándar conocidas por los expertos en la en la formulación deseada. Brevemente, el lizado se prepara disolviendo un excipiente, t sa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, rina, glucosa, sacarosa u otro agente apropiado iguador apropiado, tal como citrato, Tris, his to de sodio o potasio u otro amortiguador conoc perto en la técnica. Después, se agrega una cionada a la mezcla resultante, y se agita ha se disuelve. La mezcla resultante se esteril ación o se somete a tratamiento para elimi 2. Dosis y administración La enzima degradadora de hialuronano provist nte solicitud se puede formular como compo céuticas para administración de dosis individu múltiples. Por ejemplo, las composiciones provi esente solicitud pueden contener enzima degrada ronano en una relación de 1 U de hialuronida ina (1:1) hasta 50:1 o más, por ejemplo, imadamente en 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7: 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 20:1, 25:1 40:1, 45:1, 50:1 o m s. En otros ejemplos, se iones menores de enzima degradadora de hialur ina en las composiciones, incluyendo, por ejemp aluronidasa/2 U de insulina (1:2), 1:3, 1:4, 1: 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 o 1:20. La enzima degrada ronano seleccionada está incluida en una c (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. iral Res. 32: 9-18; Buffard et al . (1995) Vi 2-59; Bianchi et al . (1996) Anal. Biochem., 23 Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:2 kuhler et al. (1998) Biochem. , 37:8899-8905; D'S (1995) J Gen. Virol . , 76:1729-1736; Takeshita ) Anal. Biochem., 247:242-246; véase tambi lo, Shimizu et al. (1994) J. Virol. 68:840 ani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizu i996) Biochem. Biophys. Res. Commun. , 227: 822-826 i996) Proc. Nati. Acad . Sci (USA), 93:1412-1417; (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) B ys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al. (1 . Meth. 65:201-207) y después se extrapolan a pa ismas para las dosis para humanos. dadora de hialuronano. Los cambios en la conce sulina en sangre o plasma o suero con el tiempo mación in vivo de (1) absorción para adminis teral; (2) distribución, y (3) eliminación de i delo farmacocinético define estos cambios fisi concentración de insulina como una función del decir, (dX)/(dt)) y los caracteriza matemát zando velocidades y volúmenes. Los parámetros del ados de esta manera para insulina perm ivamente constantes hasta que ocurra una pertu odelo farmacocinético bien establecido para proveer predicciones razonables de exposición { cercanamente relacionado con la eficacia idad del fármaco que resulta de farmacología exa ecisiones clínicas sobre la selección de las dos ama de dosificación de insulina se pueden fáci osis de o de aproximadamente 0.3 U, 0.5 U, 1 U, U, 10 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 100 U, 150 U, , 300 U, 350 U, 400 U, 450 U, 500 U, 600 U, 700 0 U, 1000 U, 2,000 U, 3,000 U, 4,000 Unidades, 5, En algunos ejemplos, las dosis se pueden prove elación de la cantidad de una enzima degrada ronano con respecto a insulina administrad lo, una enzima degradadora de hialuronano s istrar a 1 Unidad de hialuronidasa/Unidad de i a 50:1 o más, por ejemplo, en o aproximadamen 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1 14:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, En otros ejemplos, se administran relaciones men a degradadora de hialuronano a insulina, incluyen lo, 1 U de hialuronidasa/2 U de insulina (1:2 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15 O 1:20. Típic 20 U/ml, 25 U/ml, 30 U/ml, 35 U/ml, 40 U/ml , 5 ml, 70 U/ml, 80 U/ml, 90 U/ml 100 U/ml, 150 U/ 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ml, 600 U/ml, 800 U/ml , o se puede proveer en una forma más concentra lo de o de aproximadamente 2000 U/ml, 3000 Unida U/ml, 5000 U/ml, 8000 U/ml, 10,000 U/ml o 20,0 utilizar directamente o para dilución ha tración efectiva antes del uso. La enzima degr aluronano se puede proveer como una formulación filizada .

Las preparaciones de insulina provistas te solicitud se pueden formular como compos éuticas para uso en dosis individual o dosis múl jemplo, en algunos casos, las preparaciones de i rmulan para administración de dosis individual ad suficiente para proveer control gl La insulina se puede proveer en una éuticamente efectiva. Las dosis terapéuti ivas se pueden determinar empíricamente analiza stos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, base factores tales como metabolismo, ingé tos y gravedad de la enfermedad. La concentra nsulina seleccionada en la composición depende lo, las velocidades, de absorción, inactiva sion del complejo, de las características fisicoq omplejo, del programa de dosificación, y de la C istrada así como de otros factores conocidos tos en la técnica. Por ejemplo, se entiende que l atamiento precisa es una función de los niv sa sanguínea en un individuo, y se pueden dét icamente utilizando algoritmos conocidos o m olación a partir de datos de pruebas in viv ajustar con el tiempo de conformidad con la ne ndividuo y el juicio profesional de la pers istra o supervisa la administración d laciones, y que los intervalos de conce ados en la presente invención son solamente e e etenden limitar el alcance de la misma. La cant preparación de insulina seleccionada que se istrar para el tratamiento de una condición diabé determinar utilizando técnicas clínicas es s, se pueden utilizar pruebas in vitro y les para ayudar a identificar los interva icación óptimos.

Por lo tanto, la dosis precisa, la cual s inar empíricamente, puede depender de la prepara ina particular, el régimen y programa de dosif enzima degradadora de hialuronano, la os hasta 5 minutos antes de un alimento, cu ina se suministra sin una enzima degradad ronano. Se entiende que esta dosis se puede inc sminuir según sea apropiado tomando como bas lo, el metabolismo de un individuo particul nido del alimento, y los niveles de glucosa sa én se entiende que se puede cambiar el tiempo al istra la insulina para control glucémico postp que esté más cercano o más alejado del ti tión de un alimento, y, en algunos casos, s ar de modo tal que la insulina se suministre al limento o después del alimento. Por lo tanto iduo se le puede administrar una composición de i ción súper-rápida provista en la presente i te administración de una insulina, tal co ina de acción rápida, - en combinación con una e la dosis particular varia. Las composici ina de acción súper-rápida se pueden administrar ajas en comparación con la insulina de acción istrada en ausencia de una enzima degradad ronano . Como se discutió anteriormente en algú en la presente solicitud, el grado hasta el disminuir la cantidad de insulina de acción istrándola como una composición de insulina de -rápida varia, en función de, por ejemplo, el tes que tiene el paciente. Típicamente, la reduc ntidad de insulina de acción rápida adminis ntes diabéticos tipo 2 cuando se administra c sición de insulina de acción súper-r pida es ma ducción en la cantidad de insulina de acción istrada a pacientes diabéticos tipo 1 cua istra como una composición de insulina de acción administrar 0.10 U/kg de insulina de acción rá omposición de insulina de acción súper-rápi r el mismo control o un mejor control glucémico. , en algunos ejemplos, se contempla en la p itud que la cantidad de una insulina de acción e administra con una enzima degradadora de hial una insulina de acción súper-rápida a un p tico tipo 2 para lograr control glucémico s ir en, por ejemplo, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50 65%, 70%, 75%, 80% o más en comparación con la c ida para control glucémico cuando se administra degradadora de hialuronano, y la cantidad ina de acción rápida que se administra con una adora de hialuronano como una composición de i ción súper-rápida a un paciente diabético tipo control glucémico se puede reducir en, por e olar los niveles ele glucosa sanguínea postpranel desde aproximadamente 0.05 U/kg hasta 0.50 U/ 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/kg, 0.08 U/kg, 0.0 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0.13 U/kg, 0.14 U/k 0.20U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/kg, 0.40 U/kg, 0.50 /kg. La dosis particular y formulación de l de de la enfermedad y del individuo. Si fuera ne sis se puede determinar empíricamente. Para s dosis, los volúmenes de preparaciones de i istrados por vía subcutánea para controlar los ucosa postprandial pueden ser de o de aproximadam 0 µ?, 30µ1, 40 µ?, 50 µ?, 75µ1, 100 µ?, 150 µ?, ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, 800 000 µ? o más. Por ejemplo, una formulación de i 0 U/ml para las indicaciones descritas en la p itud se puede administrar por vía subcutáne requeridas para lograr control glucémico postp embargo, las dosis se pueden incrementar o do como base los niveles de glucosa sanguín los de intervalos de dosis para adminis teral, tal como administración por vía subcutá ina utilizando los métodos y composiciones provi esente solicitud para proveer control glucémico c e o desde aproximadamente 0.001 U/kg a 0.30 U/ 0.001 U/kg, 0.005 U/kg, 0.01 U/kg, 0.02 U/kg, 0. 30 U/kg, tal como 0.05 U/kg, 0.06 U/kg, 0.07 U/k 0.09 U/kg, 0.10 U/kg, 0.11 U/kg, 0.12 U/kg, 0. i U/kg, 0.15 U/kg, 0.20U/kg, 0.25 U/kg, 0.30 U/k 0.50 U/kg o 1.0 U/kg. La dosis particular y for a misma depende de la enfermedad, el tie istración, y del individuo. Si fuera necesario l ede determinar empíricamente. La dosis para un i táneamente con la preparación de insulina. En t ales, la enzima degradadora de hialuronano se ad de o en forma simultánea con la administració ración de insulina para permitir que la dadora de hialuronano degrade el ácido hialurónic io intersticial. En un ejemplo, la composic ina y la composición de enzima degradad ronano se coformulan y, después de esto, se admi táneamente. En otro ejemplo, la composición de dadora de hialuronano se administra antes sición de insulina, tal como 1 minuto, 2 min os, 4 minutos, 5 minutos o más antes istración de la preparación de insulina. En los, la hialuronidasa se administra junto ración de insulina. Como será apreciado por los e . técnica, la proximidad deseada de coadministra n administrar en una o más dosis a través del c iempo de tratamiento por ejemplo a través de os, horas, días, semanas, o meses. En algunos c istración continua es útil. Se entiende que l sa y curso de administración depende de la índic tolerabilidad del paciente.

Además, se entiende que la dosis precisa y ratamiento son una función de la diabetes q o tratada y se pueden determinar empír zando protocolos de prueba conocidos o polacion a partir de datos de prueba in vivo o i be indicar que las concentraciones y valores d én pueden variar con la gravedad de la diabetes res, tales como metabolismo, ingesta de alimento, ral del individuo. También se debe entender q uier individuo particular, los regímenes de dosi os, cada hora, por día, por semana, mensu mente o sólo una vez, dependiendo del individu o diabético. En términos generales, los regim icación se eligen para limitar la toxicidad y/ os negativos, tal como exceso de insulina. ar que el médico encargado debería saber cómo y nar, interrumpir o ajustar la terapia a dosis mas l contrario, el médico encargado también deberí y cuándo ajustar el tratamiento a niveles más a spuesta clínica no es adecuada (descartando los darios tóxicos) .

Modo de administración a . Jeringas Las composiciones provistas en la p itud se pueden administrar por vía parentera ga, tal como cuando las preparaciones de insuli a degradadora de hialuronano se coformulan, o se istrar en forma secuencial utilizando j entes. Las jeringas útiles para administración iciones provistas en la presente solicitud i gas de insulina, las cuales pueden estar diseñad ner concentraciones estándar de preparació ina, incluyendo concentraciones de 100 U raciones de insulina, y tienen marcas en unid ina para facilidad de administración. En otros ej iliza cualquiera de uno o más de una jeringa de i iba de insulina o dispositivo similar para admi ambas de la preparación de insulina y la prepara a degradadora de hialuronano. b. Pluma de insulina entos de, por e emplo, media unidad, una unida des, los cuales generalmente se miden utilizando sificación u otro mecanismo para fijar la dosis jemplo, patentes E.U.A. Nos. 5947934, 6074372, 6 80, 6582404) . La composición después se suminis de una aguja fina unida a la pluma. Las pl ina son bien conocidas en la técnica e incluyen itas en cualquier otra parte, incluyendo, p arse a, aquellas descritas en las patentes E.ü. 34, 4973318, 5462535, 5599323, 5626566, 5 72, 6110149, 6302869, 6379339 y 7241278) . Tam n utilizar otros dispositivos de dosificación si como por ejemplo, los descritos en las patentes 5947394, 6074372, 6110149 y 6379339 para administ siciones provistas en la presente solicitud, ya s coformulación de insulina y enzima degradad zadas, para suministrar las composiciones de i stas en la presente solicitud son bien conocida ca e incluyen, pero no se limitan a, aquellas V los nombres comerciales Autopen® (Owen Mumford, Disetronic (Disetronic Medical Systems) , Pluma Lilly and Company) , Pluma Humalog® Mezcla 75/ and Company) , Pluma Humulin 70/30 (Eli Li y) , Pluma Humulin® N (Eli Lilly and Company) ble Novolog0 (Novo Nordisk) , NovoPen^ 3 (Novo No en* 4 (Novo Nordisk) , NovoPen^ Júnior (Novo No Flexible Novolog Mezcla 70/30 (Novo Nordisk) , Nordisk) , Novolin InnoLet® (Novo Nordisk) , Nordisk) , OptiPen® (Sanofi-Aventis) OptiPen fi-Aventis) , OptiSet® ( Sanofi-Aventis ) y S fi-Aventis) . ene una composición de insulina, una bomba (inc squiera controles, software, módulos de proces aterías) y un equipo para infusión desechab e una cánula o aguja para inyección subcutáne que conecta la cánula o aguja al depósito de i uso con una composición de insulina de acción a, el dispositivo de suministro de insulina er un depósito que contiene composiciones de ins zima degradadora de hialuronano coformuladas , ner uno o más* depósitos, de modo tal q siciones de insulina de acción rápida y de dadora de hialuronano estén contenidas en el ito o en depósitos separados. En tales cas sitivo para suministro de insulina puede sumí composición en forma simultánea o subsiguiente u Por lo tanto, dichos dispositivos se pueden i total de la dosis se bombea inmediatamente. gado es una infusión lenta con respecto al tie una dosis inicial alta y prolonga la acción sición. También se puede administrar un b nación que contiene tanto un bolo estándar como gado utilizando una bomba de insulina u otro sis istro continuo. Los dispositivos para sumini ina son conocidos en la técnica y se describen e parte, incluyendo, pero sin limitarse a, las p . Nos. 6554798, 6641533, 6744350, 6852104, 6 29, 6979326, 6999854, 7025713 y 7109878 sitivos para suministro de insulina también puede tados a un monitor o detector de glucosa, y/o er medios para calcular la dosis de i e dada tomando como base los niveles de ínea, contenido de carbohidratos de un alimento, stos en la presente solicitud. Los sistemas d do se refieren a sistemas con un monitor de nuo integrado, una bomba de insulina u otro sis istro y un controlador que incluye un a ático que constantemente calcula la infusión r sulina para control glucémico basándose en medic o real de los niveles de glucosa en sangre. mas, cuando se optimizan, pueden facilitar un mico constante y muy estricto, similar a la resp ina natural y control glucémico observados iduo sano no diabético. Sin embargo, para q ivos, los sistemas de bucle cerrado requieren un lucosa continuo tanto confiable como exacto, istro de una insulina con una acción r pi io, los retrasos en la absorción y acción de ados con el suministro subcutáneo de insulinas d el máximo de su efecto reductor de glucosa de rka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12). Por lo ez administrada, la insulina continua increment o mensurable durante casi 2 horas. Eso puede c isminución efectiva de la concentración de és de la ingesta de un alimento utilizando un sis cerrado. Primero, se tiene que detectar un in ucosa. Sin embargo, esto típicamente sucede sólo a demora de aproximadamente 10-40 minutos. El determinar que se ha digerido un alimento y adm dosis apropiada de insulina. Por consiguien idad del sistema para compensar respecto a una d ina "mal calculada" queda comprometida por s y por la incapacidad de "retirar" la insulina istrada. Dichos problemas se pueden superar, en parte, utilizando una composición de insu iveles de glucosa sanguínea más rápido que las i ción rápida. Esta velocidad de absorción y de in n incrementada reduce la demora éntrela acció ina y el monitoreo y entrada de glucosa, lo que tado un sistema de bucle cerrado más efectivo qu olar más estrechamente los niveles de glucosa sa iendo las excursiones glucémicas .

Los sistemas de bucle cerrado son bien conoc écnica y se han descrito en alguna otra yendo, pero sin limitarse a, las patentes E.U. 43, 5569186, 6558351, 6558345, 6589229, 6 72, 7267665 y 7354420, las cuales se incorpor encia en la presente solicitud. Eso sistemas y s ares, fácilmente identificables por el experto ca, se pueden utilizar para suministra siciones de insulina de acción súper-rápida provi o responden a cambios en las concentraciones de ínea en el cuerpo. Por lo tanto, el sistema i esta de insulina natural del cuerpo hacia los ni s sanguínea y no solamente hace uso eficient ina, sino que también se encarga de otras f rales debido a que la insulina tiene efecto ólicos como mitogénicos. Además, el control g do utilizando un sistema de bucle cerrado se lo rir de ninguna información acerca del tamaño y ti imento, u otros factores. El sistema se pued ente en mediciones de glucosa sanguínea en tiemp etector de glucosa genera una señal de entativa de los niveles de glucosa sanguínea 0, y provee la señal de detector al controla olador recibe la señal de detector y genera coma omunicados al sistema de suministro de insul zados en la presente solicitud. Dichos sistemas itos en la técnica, incluyendo pero sin limitars itos en las patentes E.U.A. Nos. 5279543, 5 51, 6558345, 6589229, 6669663, 6740072, 726 20. También se han descrito en la técni nentes individuales, de los sistemas, individual contexto de un sistema de bucle cerrado para us ción de control glucémico. Se entiende que los stos en la presente solicitud son solament los, y que se pueden utilizar otros sistemas d do o componentes individuales para suminist siciones de insulina de acción súper-rápida provi esente solicitud.

Los sistemas de bucle cerrado contienen un nitor de glucosa que funciona continuamente. sitivos pueden contener detectores tipo aguja serción en la piel (véase por ejemplo, patentes 5,586,553 y 5,954,643). El detector utilizado a de bucle cerrado puede contener opcionalmen rodos que están expuestos al fluido intersticia tejido subcutáneo. Los tres electrodos incl rodo de trabajo, un electrodo de referencia rodo contador que se utilizan para formar un ci o se suministra un voltaje apropiado a tra rodo de trabajo y del electrodo de referencia, e impedancia entre dos electrodos. Una se ente analógica fluye desde el electrodo de tr s del cuerpo y hacia el contra-electrodo. El vol ectrodo de trabajo generalmente se mantiene a ti ltaje en el electrodo de referencia se puede IT un voltaje fijo, Vfij0 tal como, por ejemplo, en mV. La reacción más prominente estimulada eñal de corriente analógica sea proporcional ntración de glucosa en el ISF que está en conta lectrodos del detector (véase, por ejemplo, . No. 7,354,420) .

En algunos ejemplos, se utiliza más de un medir la glucosa sanguínea. Por ejemplo, se zar detectores redundantes y al individuo se l icar cuando falla un detector mediant terísticas telemétricas de los componente isor del monitor. Un indicador también puede i dividuo cuáles detectores siguen funcionando de detectores que siguen funcionando. En los, las señales del detector se combinan a tr inación de promedios u otros medios. Además, se zar diferentes tipos de detectores. Por ejem utilizar un detector de glucosa interno y un d nos incluyen, pero no se limitan a, los descritos tes E.U.A. Nos. 5,497,772, 5,660,163, 5,7 ,186, 6,895,265. Los ejemplos de un detector de tiliza fluorescencia es el que se describe en la . -No. 6,011,984. Los sistemas de detector de én pueden utilizar otras tecnologías de det yendo haces de luz, conductividad, muestreo a -diálisis, micro-poración, muestreo ultr foresis inversa, u otro método (por ejemplo, . Nos. 5,433,197 y 5,945,676, y Publicación de nacional WO199929230) . En algunos ejemplos, sola rodo de trabajo se ubica en el tejido subcután cto con el ISF, y el contra-electrodo y el elect encia se ubican externos al cuerpo y en contacto El contra-electrodo y el electrodo de refere n ubicar sóbrela superficie de un alojamiento de dancia. El fluido intersticial también se ectar a partir del cuerpo de un individuo y a través de un detector externo que no está im cuerpo.

El controlador recibe alimentación provenie tor de glucosa. El controlador está diseña ar una célula beta (célula ß) pancreática y dos al dispositivo de suministro de insuli dir la cantidad requerida de insulina para mico. El controlador utiliza software con al calcular la cantidad requerida de insulina basán iveles de glucosa detectados por el detector de jemplos de algoritmos incluyen aquellos que mode as ß muy cercanamente, debido a que los algorit señan para reducir al mínimo las excursiones de l cuerpo, sin considerar qué tanta insul eden utilizar controladores derivativos proporci ntrol predictivo de modelo (MPC) en algunos rka et al. (2006) Diabetic Med. 23:1-12) . Los goritmos incluyen, pero no se limitan a, los d ka et al. (Diabetic Med. (2006) 23:1-12), Shii (Front Med Biol Eng (1997) 8:197-211) , Shichiri f. Organs (1998) 22:32-42), Steil et al. ( ?? Ther (2003) 5: 953-964), Kaletz et al., tol. (1999) 36:215) y patentes E.U. A. Nos. 5 86, 6558351, 6558345, 6589229, 6740042, 6 72, 7267665, 7354420 y Publicación de patente E. 243567.

En un ejemplo, se utiliza un controlador PI ma de bucle cerrado. Un controlador PID nuamente la infusión de insulina mediante evalua xcursiones de glucosa desde tres puntos de vi zando los componentes de un controlador propo integral, más derivativo (PID) , (véase por e te E.U.A. No. 7,354,420).

El controlador genera comandos para el su do de insulina. Los sistemas de suministro de i como las bombas de insulina, son conocidos ca y se pueden utilizar en los sistemas d do. Los ejemplos de dispositivos para sumini ina (tales como los descritos anteriormente) i no se limitan a, los descritos en las patentes 4562751, 467840, 4685903, 4373527, 4573994, 33, 6744350, 6852104, 6872200, 6936029, 6 54, 7025713 y 7109878. Los dispositivos para su sulina típicamente contienen uno o más deposit s por lo general son desechables, que contie ración de insulina, tal como una composición de nsulina ele acción rápida y enzima degradad ronano, o puede contener dos o más depósitos, ue las composiciones de insulina de acción rápi a degradadora de hialuronano estén contenid ado en depósitos separados. En tales cas sitivo para suministro de insulina puede sumi composición en forma simultánea o subsiguiente cto a la otra. En algunos ejemplos, las composici istran utilizando un tubo de infusión y una c En otros ejemplos, el dispositivo de infusi directamente a la piel y las composiciones fluye spositivo de infusión, a través de una cánula tamente al interior del cuerpo sin el uso de un t los adicionales, el dispositivo de infusión es erpo y opcionalmente se puede utilizar un ión para suministrar las composiciones. Los sist nación con una enzima degradadora de hialuronano s pruebas se incluyen aquellas que evalú edades farmacocinéticas y farmacodinámicas de istrada por vía subcutánea o por vía intraper yendo biodisponibilidad, y tolerabilidad . Tam evaluar la actividad biológica tanto de la de la enzima degradadora de hialuronano ut as bien conocidas en la técnica. Dichas pru utilizar, por ejemplo, para determinar la iadas de una insulina, tal como una insulina de a, y una enzima degradadora de hialuronano, encia de dosificación, para tratamiento. 1. Farmacocinética, farmacodinámica y tolera Se pueden efectuar estudios de farmacoc codinámica y tolerabilidad, tales como los descr les o individuos humanos sanos. En otros ejempl ios se efectúan utilizando modelos de diabe les, tales como los descritos más adelante, iduos humanos diabéticos . Los procedimientos de S para efectuar estos estudios incluyen técn · de glucosa (Brehm et al (2007) en Clin Diabet ds and Techniques . Ed ichael Rosen, pp 43-76, En el procedimiento de pinza hiperinsuli cémica, se infunde insulina exógena para ntraciones de insulina en plasma hiperinsuli ras que la concentración de glucosa en pía ene constante a nivel euglucémico por medio ión de glucosa exógena variable. La veloci ión de glucosa (GIR) requerida para mantener los ucosa constantes durante el periodo de hiperins una medida del efecto en la insulina infundid mentada de glucosa sanguínea, lo que resulta ne general de la glucosa sanguínea) . Por lo tant dimiento, además de ser utilizado para eval ción de insulina y la resistencia a insulina iduo, también se puede utilizar para evaluar e a las propiedades farmacocinéticas y farmacodiná nsulina, tal como una insulina coadministrada a degradadora de hialuronano.

Se puede evaluar la farmacocinética de istrada por vía subcutánea o intraperitoneal midi 1 de tiempo-concentración de la insulina y ca etros tales como la concentración máxima (p ina en suero (Cmáx) , el tiempo máximo (es decir e la concentración máxima de insulina en suero; ea bajo la curva (es decir el área bajo la curva a al graficar tiempo contra concentración de én se puede calcular la biodisponibilidad relati os tratamientos a través de la misma istración, tal como, por ejemplo, una insulina c inistración con una enzima degradadora de hial omo en el ejemplo 1. Por ejemplo, se puede calc sponibilidad relativa (Frei) cíe la insulina og® administrada por vía subcutánea co-administr 20 y la insulina lispro Humalog® sola administr subcutánea { [ABC (insulina lispro Humalog®/rH (insulina lispro Humalog® sola]} x 100, en la c de insulina lispro Humalog® es la misma, y el la a través del mismo intervalo de tiem ntración de insulina en el plasma después istración por vía subcutánea se puede medir ut uier método conocido en la técnica apropia ar las concentraciones de insulina en mues ra mitad de efecto máximo (tGIRprimera 50%) (minut o metabólico máximo (GIRm¾x) (mg/kg/minuto) ; ABC-G ; ABC-GIR0-120 min (g/kg) ; ABC-GIR0-iao min (g/kg) ; A n (g/kg) ; ABC-GiRo-300 min (g/kg) ; y el ABC-GI ) · Se puede administrar un intervalo de encia de dosificación diferente en los cocinéticos para evaluar el efecto de increm nuir las concentraciones de insulina y/o una dadora de hialuronano en la dosis. También se ar las propiedades farmacocinéticas y farmacod insulina administrada por vía subcutá peritoneal, tal como biodisponibilidad, con inistración de una enzima degradadora de hial jemplo, se puede administrar a animales o in os insulina por vía subcutánea sola o en combina cocinéticas y farmacodinámicas de la istrada por vía subcutánea, administrada con o a degradadora de hialuronano para evaluar el ef inistracion con una degradadora de hialuronan s propiedades de cualquier insulina.

Los estudios para evaluar la segu abilidad también son conocidos en la técnica y se zar en la presente solicitud. Después istración por vía subcutánea de insulina, con inistración de una enzima degradadora de hialuro mbnitorear el desarrollo de cualesquiera re sas . Las reacciones adversas pueden incluir, per an a, reacciones en el sitio de inyección, tal o hinchazón, dolor de cabeza, fiebre, ofríos, bochornos, mareos, comezón, dificult rar o pecho contraído, náusea, vómito, contr 2. Actividad biológica a . Insulina La capacidad de una insulina, tal go de insulina, para actuar como un agente ter ede evaluar in vitro o . in vivo. Por ejemplo, se uar pruebas in vitro y conocidas en el cam ar la capacidad de una insulina para unirse al sulina. En un ejemplo, se efectúa una prueba d titiva en la cual se preparan células de placent una fuente de receptores de insulina y se incu ina humana radiomarcada con o sin el análogo de arcar. Después se detecta la cantidad de insulin da ligada para determinar la capacidad del aná ina de competir por la unión y se calcula la a iva del análogo de insulina por el receptor pla sulina (véase por ejemplo, Weiss et al., (2001) medir la absorción de glucosa estimulada por i cuban adipocitos con glucosa marcada, tal como 2- 63-H] glucosa o D- [U-14C] glucosa con o sin i és se mide la reactividad incorporada para deter dad de absorción de glucosa en presencia o ause ina (Louveau et al . , (2004) J Endocrin. 181:2 roy et al., (2005) Diabetes 54:251-258). Cu a la actividad de un análogo de insulina, tam evaluar la actividad de insulina humana y utiliz ración. También se pueden efectuar pruebas in vi ar la producción de glucosa en células H4 ncia de insulina (Wang et al., (2000) J. 4717- 14721, Duttaroy et al., (2005) Diabetes También se pueden efectuar estudios i zando individuos humanos o modelos animales ? evaluar, por ejemplo, mediante HPLC, ELISA, RI o-ensayo. Los valores normales de HbAlc para in son de aproximadamente 4.0-6.2 por cien ación Norteamericana para la Diabetes recomie deben estar por debajo de 7% (o por debajo d as personas) para pacientes con diabetes para a ir las complicaciones de la diabetes. Los niv ina se pueden medir, por ejemplo, mediante ELISA iveles de glucosa típicamente se miden utiliz tor o analizador de glucosa.

Los modelos animales para diabetes tipo I yendo el ratón diabético no obeso (NOD) y reeding" (BB) (Atkinson et al., (1999) Natu -604) . Los modelos animales para diabetes yen, pero no se limitan a, ratones ob/ob y , los cuales tienen mutaciones en el gen de lepti . Enzimas degradadoras de hialuronano . La actividad de una enzima degradad ronano se puede evaluar utilizando método idos en la técnica. Por ejemplo, la prueba de U hialuronidasa determina la actividad en forma i ndo la cantidad de substrato de ácido hialuró ronano (HA) no degradado que permanece después te que la enzima reaccione con el HA durante 30 °C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United acopeia Convention, Inc, Rockville, MD) . Se zar un patrón de referencia de hialuronidasa (USP ión patrón de hialuronidasa de grado National F en una prueba para establecer la actividad, en u alquier hialuronidasa. En un ejemplo, la activ utilizando una prueba de microturbidez . Esta se rmación de un precipitado insoluble cuando e rato- de hialuronato de sodio es una medida de a ática de hialuronidasa . En otro ejemplo, la acti ronidasa se mide utilizando una prueba de ación en la cual se mide el ácido hialuronico gado con biotina después de incubación con hialu e por ejemplo, Frost y Stern (1997) Anal. 63-269, publicación de patente E.U.A. No. 20050 grupos carboxilo libre en los residuos de rónico del ácido hialuronico se conjugan con bio bstrato de ácido hialuronico conjugado con bio n forma covalente a una placa de micro-tit es de la incubación con hialuronidasa, se dét rato de ácido hialuronico conjugado con biotina zando una reacción de avidina-peroxidasa, y se la obtenida después de la reacción con patr encia de hialuronidasa de actividad conocida. Ta ante azul . de tripano por vía subcutánea con o a degradadora de hialuronano en la piel lateral de ratones desnudos. Después se mide el ante, tal como con un micro-calibrador, para de pacidad de la enzima degradadora de hialuro r como un agente de diseminación (patente E,U 04968) . También se puede evaluar in vivo el ef administración de hialuronidasa con otro agen una insulina, sobre las propiedades farmacociné codinámicas de dicho agente utilizando modelos ndividuos humanos, tal como en el escenario a clínica, como se discutió anteriormente y se á ejemplo 1, más adelante. Se puede . comparar la a onal de una enzima degradadora de hialuronano que ialuronidasa con una hialuronidasa utilizando cu tas pruebas. Esto se puede efectuar para determi a degradadora de hialuronano requerida es, por l onalmente equivalente a 100 unidades de hialuroni H . Usos terapéuticos Los métodos descritos en la presente solic n utilizar para tratamiento de cualquier condici al se utiliza una insulina de acción rápida. La i ede administrar por vía subcutánea, en combinac zima degradadora de hialuronano, para tratar c ción que sea susceptible de tratamiento con i amente, se coadministra una enzima degradad ronano con una insulina de acción rápida. Esta e ejemplos de usos terapéuticos de insulina de a. Los usos terapéuticos descritos más adelante s los y no limitan las aplicaciones de los itos en la presente solicitud. Los usos tera iduos con diabetes para lograr control glucém ina de acción rápida también se puede administ subcutánea o intraperitoneal en combinación a degradadora de hialuronano utilizando una b ina o en el contexto de un sistema de bucle cerra olar continuamente los niveles de glucosa sang S de todo el día y la noche y/o para contro siones glucémicas postprandiales. Está dentro idad de un médico encargado identificar edades o condiciones.

Como se discutió anteriormente, las culares y los protocolos de tratamiento típicam idualizan para cada individuo. Si fuera necesa determinar empíricamente o extrapolar una cular y duración y protocolo de tratamient lo# las dosis de ejemplo de insulina de acción istración, velocidad de expresión, combinac OS, la gravedad y curso de la enfermedad, sición del paciente hacia la enfermedad y el jui encargado. En particular se pueden medir los ucosa sanguínea, tales como los que se miden uti tector de glucosa sanguínea, y utilizar para det ntidad de insulina y de una enzima degrada ronano que se va a administrar para lograr ico. En la técnica se conocen algoritmos que se zar para determinar una dosis tomando como idad de absorción y el nivel de absorción siciones de acción súper-r pida provistas en la p itud y tomando como base también los niveles de ínea. También se pueden calcular o ajustar las d ina para control glucémico postprandial , por e inando el contenido de carbohidrato de un a ben en el intestino y se produce en el híga es de glucosa sanguínea crecientes estimu ación de insulina. El influjo de glucosa post ser 20 a 30 veces más alto que la producción lucosa observada entre alimentos. La liberac ina en fase temprana, que dura 10 minutos más o me la producción de glucosa hepática y anteced más larga (tardía) de liberación, la cual pe o más y cubre el influjo de carbohidrato a la limentos. Entre alimentos, un nivel bajo de nuo, insulina basal, cubre los requeri ólicos continuos, en particular para regu cción de glucosa hepática así como la utiliza sa por parte del tejido adiposo, tejido muscular s objetivo. Los pacientes con diabetes presentan dos de glucosa sanguínea (hiperglucemia) . La dia rita en pacientes con una función disminuida de c pacientes tienen resistencia a insulina o sens ida a insulina, combinada con secreción redu ina. La diabetes Tipo 2 eventualmente se rollar como diabetes tipo 1. En diabetes tam ye la diabetes gestacional. A los pacientes con s puede administrar insulina tanto para mante es de insulina básales como para prevenir exc tnicas, tal como después de un alimento. a . Diabetes Tipo 1 La diabetes Tipo 1 es una enfermedad au diente de célula T caracterizada por infiltració es de Langerhans, la unidad endocrina del pánc ucción de las células ß, lo que conduce iencia en la producción de insulina e hipergluce asma ele o dé aproximadamente 200 mg/dl (11.1 mmo después de una carga de glucosa oral de 75 gra en una prueba de tolerancia a la glucosa, y/o ni sa en plasma aleatorios de , o de aproximadame (11.1 mmol/1) .

El tratamiento primario para pacientes con 1 es la administración de insulina como ter lazo, el cual típicamente se efectúa en conju oreo de glucosa sanguínea. Sin suficiente insu lazo, se puede desarrollar cetoacidosis diabét puede dar como resultado coma diabético o muerte ntes se les puede administrar inyecciones subcut ina de acción rápida utilizando, por ejemp ga o pluma de insulina, o una bomba de insuli ner los niveles de glucosa sanguínea apropiados do el día y también * para controlar los niv s para suministrar insulina, utilizando los itos en la presente solicitud para control amente los niveles de glucosa y de insulina en sa b. Diabetes Tipo 2 La diabetes Tipo 2 está asociada con resist ina y, en algunas poblaciones, también por insul ida de función de célula ß) . En la diabetes tip 1 de liberación de insulina está ausente, y la f ación está retrasada y es inadecuada. El pico ab ación de insulina que ocurre en individuos sanos pués de un alimento está retrasado, es prolonga dad insuficiente en pacientes con diabetes tip esulta en hiperglucemia . A los pacientes con 2 se les puede administrar insulina para contro es de glucosa en sangre (Mayfield et al (2004) raperitoneal mediante jeringa, pluma de insu de insulina, o cualesquiera otros medios útil strar insulina, utilizando los métodos descrito nte solicitud para controlar más rápidamente los ucosa e insulina en sangre. Como se discute en parte en la presente solicitud, la administra siciones de insulina de acción súper-rápida a p ticos tipo 2, adem s de lograr un mejor mico en comparación con la insulina de acción spondiente, puede reducir el riesgo de ganancia sidad y con frecuencia están asociados con ter ina en pacientes diabéticos tipo 2. c . Diabetes gestacional Las mujeres embarazadas que nunca antes han tes pero que tienen niveles elevados de ina probablemente es un defecto post-receptpr, d e ha demostrado unión normal a insulina por parte as sensibles a insulina. El páncreas libera 1. más insulina con el fin de responder al in tante en la resistencia a la insulina. Los pacie ón pancreática normal son capaces de satisface das. Los pacientes con función pancreática al ? dificultad para incrementar la secreción de i onsiguiente producen niveles inadecuados de i o tanto, la diabetes gestacional resulta cuando ción retardada o insuficiente de insulina en p sistencia cada vez mayor a insulina periférica.

A los pacientes con diabetes gestacional administrar insulina para controlar el nivel de ínea. Por lo tanto, a los pacientes con cional se les puede administrar las composici 2. Terapia de insulina para pacientes críti mos La hiperglucemia y resistencia a insul nta frecuentemente en pacientes . críticamente e azones médicas y/o quirúrgicas y han sido asocia lidad y mortalidad incrementadas en paciente ticos como no diabéticos y en pacientes con ática, apoplejía, lesión cerebral anóxica, infart iocardio, cirugía post-cardiaca, y otras edad crítica ( cCowen et al. (2001) Crit Cli 7- 124) . Los pacientes críticamente enferm glucemia han sido tratados con insulina para c iveles de glucosa sanguínea. Dicho tratamient ir la morbilidad y mortalidad entre este grupo [ e et al. (2006) N. Eng. J Med. 354:449-461) . La i amente se administra por vía intravenosa al p glucemia y se reducen la morbilidad y mortalidad.

I . Terapias de combinación Se puede administrar cualquiera d siciones de insulina de acción súper-rápida desc esente solicitud en combinación con, antes de, e mitente con, o subsiguiente a, otros éuticos o procedimientos incluyendo, pero sin l tros compuestos biológicos y compuestos de ña. Para cualquier enfermedad o condición, in las ejemplificadas anteriormente, para las cu a o se ha utilizado una insulina de acción rápid al están disponibles otros agentes y tratamient siciones de insulina de acción súper-rápida se zar en combinación con los mismos. Dependiend medad o condición a ser tratada, las combinaci strar en combinación con, antes de, de trátente con, o subsiguiente a, con una o más d inas, incluyendo insulina de acción rápida, e i ción basal .

J. Artículos de fabricación y estuches Los compuestos farmacéuticos de las compos sulina de acción súper-rápida, las composici ina y/o enzima degradadora de hialuronano provi esente solicitud se pueden empacar como artíc cación que contienen material de empaqu sición farmacéutica que es efectiva para contro es de glucosa en sangre, tal como en in ticos o críticamente, y un marbete que indique siciones de insulina de acción súper-siciones de insulina y/o enzima degradad pora en la presente solicitud en su totalid los de materiales de empaque farmacéuticos i no se limitan a, paquetes de burbuja, botellas, adores, bombas, bolsas, frascos, contenedores, j las, y cualquier material de empaque apropiado p lación seleccionada y modo de administra miento pretendidos. Se contempla un amplio arr laciones de los compuestos y composiciones provi resente solicitud como la son una varie mientos para cualquier enfermedad o t tático .

Lsa composiciones de insulina de acción a, composiciones de insulina y/o enzima degrada ronano también se pueden proveer como estuch hes pueden incluir una composición farmacéutica . presente solicitud y un ítem para administraci ismas . Las composiciones de insulina de acción a, composiciones de insulina y/o enzima degrada ronano y/u otras composiciones farmacéuticas se istrar con un dispositivo para administración, t eringa, una pluma de insulina, una bomba, o un e inserta dentro de una pluma de insulina, una dispositivo de suministro. El estuche puede i nalmente, instrucciones para aplicación que i , regímenes de dosificación e instrucciones p de administración. Los estuches también pueden composición farmacéutica descrita en la itud y un ítem para diagnosis. Por ejemplo, hes pueden incluir un monitor o detector de gluco Los estuches también pueden contener por ariedad de composiciones de insulina de acción rá composición de insulina, incluyendo una o más i K. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para pr rativos únicamente y no pretenden limitar el alc vención.

EJEMPLO 1 ministración de PH20 recombinante de humano (rHu lina de acción rápida que facilita la farmacociné farmacodinámica mejoradas Se administra insulina, incluyendo an lo ina, a individuos con diabetes mellitus para el perglucemia . En un esfuerzo para replicar de man iva la liberación de insulina prandial fisi l observada en individuos sanos, se efectúan e eos para determinar si la coadministración cto a un mejor control glucémico y ganancia ida en individuos con diabetes mellitus. Los eos se diseñan para evaluar seguridad, tolera cocinética (PK) y farmacodinámica (PD) de la in® R y la insulina lispro Humalog® (siend inas de acción rápida como las descritas en la itud) administradas por vía subcutánea ya sea sol nación con rHuPH20.

EJEMPLO la cocinética y farmacodinámica de insulina lispro H ulina Huraulin® R con y sin co-administración de en individuos sanos (no diabéticos) Se efectúa un estudio de 2 brazos, secuene tapas , cruzado, doble ciego, aleatorizado para s individuos reciben primero insulina lispro Hu 20, seguido por insulina lispro Humalog® sola de los individuos reciben primero insulina og® sola, después insulina lispro Humalog® y rHu apa 2, 13 individuos reciben una inyección subcu ina Humulin® R y rHuPH20 y una inyección su ada de insulina Humulin® R sola. Las iny ímente tienen 7 d as de separación, en imadamente la mitad de los individuos reciben in" R y rHuPH20 seguido por insulina Humulin® R tad de los individuos reciben primero insulina a, después insulina Humulin® R y rHuPH20.

Aproximadamente 14 horas antes de cada in uno de los individuos recibe una cena basada en imento de 2000 calorías de la Asociación Nortean la Diabetes con 60 g de carbohidratos. También s in® R o insulina Humulin® R/rHuPH20 2 horas des ar el procedimiento de pinza hiperinsul cémica. Las muestras de sangre se recolectan valos prescritos, como se describe más adelante es de glucosa e insulina se cuantifican dur do de 6 horas .

A. Dosis Como se describió anteriormente, a 12 indiv dministran 20 U de insulina lispro Humalog® y 3 20 en 220 µ?, y 20 U de insulina lispro Humalog r vía subcutánea en el cuadrante abdominal i ior en la primera etapa del estudio. La dosi ina lispro Humalog®/rHuPH20 se prepara desco ro rHuPH20 (1 mg/ml, equivalente a aproxim 00 U/ml en HEPES 10 mM /130 m de NaCl a pH és se aspiran 225 µ? de la mezcla insulina ogVrHuPH20 utilizando una jeringa de insulina de apacidad y se utilizan dentro de 4 hora istración subcutánea a un solo individuo.

Por lo tanto, la mezcla de insulina og®/rHuPH20 que se suministra es de 220 µ? y c de rHuPH20 (2.5 ig) , 20 U de insulina lispro Hu mg de seroalbúmina de humano (proveniente lación Hylenex (funciona para estabilizar a a pérdidas por adsorción y también puede edades de estabilización con relación a la insul r como un depurador de oxidación) ; 3 mg de gl eniente de la formulación de insulina lispro enté como un amortiguador de pH, estabiliz ina y/o modificador de tonicidad); 0.6 mg de i eniente de la formulación de insulina lispro mortiguador de pH) ; 0.017 mg de EDTA, eniente de la formulación Hylenex como un quel con el potencial de ligar iones Zn 2+ y Ca2+) ; 0 oruro de calcio (proveniente de la formulación un complejo con EDTA y puede mejorar el confor ción subcutánea); 0.006 mg de HEPES (de la for uPH20 API, como un amortiguador de pH) ; agua ( nte) y NaOH y/o^HCl para ajuste de pH.

En la etapa 2, como se describió anteriorm dividuos se les administran tanto 20 U de in® R y 240 U de rHuPH20 en 200 µ? así como ina Humulin® R en 200 µ? por vía subcutánea ante abdominal inferior izquierdo. La dosis de ??F R/rHuPH20 se prepara aspirando primero 0.3 partir de un frasco de insulina Humulin® R ut jeringa de insulina de 0.3 cm3 de capac repara utilizando en forma subcutánea una idual .

Por lo tanto, la mezcla de insulina PH20 que se suministra es de 200 µ? y contiene 2 20 USP (2 g) , 20 U de insulina Humulin® R# 0.1 lbúmina de humano (proveniente de la formulac EX, que funciona para estabilizar a rHuPH20 das por adsorción y potencialmente también para edades de estabilización con relación a insul actuar como un depurador de oxidación); 3 rina (proveniente de la formulación de Humulin* como un amortiguador de pH , estabilizador de i modificador de tonicidad); 0.4 mg de eniente de la formulación de Humulin R, que act onservador de crecimiento antimicrobiano pres n"traeiones elevadas para estabilizar la conforma cial de ligar iones Zn2+ y Ca2+) ; 0.048 mg de clo o (proveniente de la formulación 10X Hylenex, un complejo con EDTA y puede mejorar el con ción subcutánea) ; agua (como el solvente) y NaOH ajuste de pH.

B . Procedimiento de pinza hiperinsuli cémico Se evalúa el efecto de co-administración de la farmacocinética y farmacodinámica de insulina og® o insulina Humulin® R administradas p tánea tomando muestras de sangre para medir los sulina (es decir insulina lispro Humalog® o i in® R) y glucosa. Se utiliza un procedimiento d insulinémica-euglucémica para mantener los niv sa en plasma entre 90-110 mg/dl de modo tal azo para infusión de Dextrosa al 20% a través s separados. El otro catéter intra-arterial se c ro brazo para muestrear la sangre de la arter ion de glucosa. La almohadilla de calentamiento s ar del sitio de infusión de glucosa, pero el si er retrógrado se mantiene a 65 °C. Se obtiene una al de sangre para medir la glucosa de línea b os antes de la inyección de las preparaci ina. La sangre se muestrea 10 minutos y 1 minut . inyección de insulina lispro Humalog®, insulina og®/rHuPH2Q, insulina Humulin® R o insulina PH20, después cada 3 minutos durante los prim os, cada 15 minutos desde 60 minutos hasta 3 és cada hora después de esto hasta 6 horas. Se iveles de glucosa de cada individuo a través de dimiento utilizando un analizador de glucosa Y C . Efecto de la co-administración de rHuPH2 rmacocinética de insulina de acción rápida Se miden varios parámetros para determi o de la co-administración de rHuPH20 so cocinética de la composición de insulina de a insulina lispro Humalog® e insulina Humulin0 R en la concentración máxima medida de insulina tervalo de dosificación seleccionado (Cmáx) ; tiemp máx) ; y área bajo las curvas de concentración ? (ABC) , los cuales se evalúan para diversos int empo. 1. Efecto de la co-administración de rH ina Humalog^ sobre la farmacocinética de insulina La concentración de insulina para cada inter después de la administración de insulina I éritos, la cual se determina calculando el cambi geométrica de los niveles de insulina a travé ! I válo de tiempo, al igual que el cambio promedi ¡ ! ente, el cual es un promedio ajustado de tres val ! diente de incrementos .

TABLA 5 oncentración de insulina en la sangre después de i administración de insulina lispro Humalog® TABLA 5 (cont.) Insulina inmunoreactiva (pmol/L) I Pendiente Media ABC i Media Mediana SD SE por Geom. (0-x) incrementos (pmol/ (pmol . (pmol/L) L.min) min/L) 1 1 Í417.0 325.4 343.8 103.6 341.3 11.51 5685 I i ! ,485.4 355.2 419.7 121.2 399.1 19.26 6795 i : ! ;495.2 354.7 381.9 110.3 416.6 5.83 8019 i i 552.6 430.4 408.6 118.0 466.7 16.71 9344 !s53.6 451.4 387.3 111.8 481.1 4.78 10766 1 i 1576.7 483.9 384.9 111.1 505.7 8.2 12246 612.8 504.7 306.3 88.4 555.2 16.5 13837 i ! 594.1 476.6 400.1 115.5 510.5 -14.9 15436 , 551.3 460.1 258.5 74.6 501.4 -3.03 16954 596.4 595.1 214.5 64.7 561.1 3.98 24923 573.6 556.5 193.1 55.8 541.6 -1.3 33193 ! 584.8 575 , 7 131.4 37.9 571.8 2.01 41543 566.4 558.9 92.2 26.6 559.3 -0.83 50026 I I 306 TABLA 6 oncentración de insulina en la sangre después de 1 dministración de insulina lispro Humalog® y rHuP insulina lispro Humalog®/rHuPH20 administrada Io I ambas (todas) ) , y un sumario estadístico que de I I < a j secuencia de dosificación no tiene ningún efect drmacocinética observada. El análisis esta ina el valor p de la diferencia en la farmacoc ada utilizando los diferentes grupos de tratamie nsulina lispro Humalog® sola contra insulina g®/rHuPH20 ) , y la diferencia en la farmacoc I áda utilizando los diferentes secuenci I i i icación (es decir insulina lispro Humalog® I i s la insulina lispro Humalog®/rHuPH20 , con i iria lispro Humalog®/rHuPH20 primero y desp i iría lispro Humalog® sola) . En la tabla también se I ©disponibilidad relativa (Frei) la cual se calcu ! 1 BCo-360 (insulina Humalog®/rHuPH20 ) ] / [ABC0-36o (i j ; g® sola] * 100.

TABLA 9 (cont.) miento Secuencia de dosificación Cmáx tmáx : 2 media 814 102 SD 491 37 SE 200 15 1 Todos media 751 98 1 SD 357 36 SE 103 10 ¡ 1 1 media 1239 48 1 1 SD 456 11 1 SE 186 4 j , 1 2 media 1485 49 ! ¡ 1 ; SD 498 4 20 ¡ SE 203 2 j j 1 ' 2. Efecto de la co-administración de rH ina Humulin® R sobre la farmacocinética de insuli En la etapa 2, los pacientes reciben ya sea ¡ ; I sis de insulina Humulin® R/rHuPH20 y después la d ina Humulin® R sola, o primero la dosis de i I iri® R sola y después la dosis de insulina H PH20 usualmente 7 días después. La concentra i iría en cada punto de tiempo después de la adminis sú jlina Humulin® R o insulina Humulin® R co-admin j HüPH20 se provee en las Tablas 10 y 11, respectiv i ; Cjpara los diferentes intervalos de tiempo (es de I o'a x minutos (ABC(0-Xj); por ejemplo, ABC0-3 minutos I |ABC0-9 minutos, f 1 etc . ) (Tablas 10, 11, y 12), al ig I odisponibilidad relativa (Frei) , la cual se calcu BCo-x (insulina Humulin® R/rHuPH20 ) ] / [ABC0-X (i ir® R sola]*100. También se presenta la pendi I ! TABLA 10 oncentración de insulina en la sangre después de i I administración de insulina Humulin® R Insulina inmunoreactiva (pmol/L) i ! 1 1 Pendiente Media ABC i Media Mediana SD SE por i ¡ Geom . (0-x) i ¦ incrementos < 1 ! 67.4 59.2 29.8 8.3 62.4 62.3 59.5 26.9 7.5 58.3 -1.38 181 1 70.3 62.8 29.7 8.2 65.4 2.37 366 1 ! 70.1 64.9 26.1 7.2 66.0 0.22 564 71.1 66.3 28.8 8.0 66.5 0.15 762 1 ¡ 79.2 74.8 32.3 9.0 73.6 2.38 973 1 ; 89.8 86.8 34.2 9.5 84.1 3.47 1209 1 104.2 103.4 36.5 10.1 98.1 4.68 1482 1 i 123.3 130.5 46.1 13.9 115.3 5.75 1802 i ! '149.8 143.2 57.6 16.0 140.2 8.3 2186 , 179.4 171.3 59.6 16.5 169.5 9.75 2650 1 '. 1 ,208.9 202.8 69.9 19.4 198.0 9.5 3202 1 1 : 223.9 238.6 79.6 22.1 209.9 3.97 3813 1 1 248.3 231.6 78.7 21.8 235.6 8.57 4482 i 1 ' TABLA 10 (cont . ) Insulina inmunoreactiva (pmol/L) TABLA 11 oncentración de insulina en la sangre después de administración de insulina Humulin® R y rHuPH20 Insulina inmunoreactiva (pmol/L) Cambio Pendiente Media ABC la Media Mediana SD SE por Geom . (0-x) pendien incrementos (prom . 55.0 56.9 14.6 4.1 53.2 Insulina inmunoreactiva (pmol/L) TABLA 12 (cont.) ABC (min*pmol/L) ervalo de Tiempo Humulin® con Diferenci Humulin® sola rHuPH20 Porcenta 0-21 1482 4344 193.1 0-30 2650 8356 215.3 0-45 5976 18162 203.9 0-60 10149 30404 199.6 0-75 14829 43268 191.8 0-90 19741 55923 183.3 0-120 30076 77092 156,3 0-150 41445 94116 127.1 0-180 53169 109007 105.0 0-360 109319 149614 36.9 entaje de diferencia: (ABC0,x[rHupH2o] - ABC0.x(gin rHupH2o] ) / (ABC0.X(Sin THUP 3. Comparación de la farmacocinética de i g® e insulina Humulin® R con y sin co-administra 0 os más rápidos) . Por ejemplo la media geométric tración máxima de insulina (CmáX) casi se duplica desde 697 pmol/L) para Humalog0 , y es más de 967 desde 433 pmol/L) para Humulin R en prese 20 con relación al control. De manera simil a del tiempo para alcanzar esta concentración se reduce (desde 105 hasta 48 minutos) para Hu 165 hasta 60 minutos) para Humulin* R en prese 20 con relación al control. Este cambio traciones más altas en puntos de tiempo más te nsistente con una velocidad de absorción increme elocidad de depuración constante. Por lo tanto, istración de rHuPH20 incrementa la veloci ión tanto de insulina lispro Humalog®, un aná ina de acción rápida, como de insulina Humulin® na regular de acción rápida. presentados anteriormente demuestran que la rica de las concentraciones de insulina lis s después de la administración de Húmal entan 70% desde sus niveles previos a la adminis 65 hasta 112 pmol/1) sin rHuPH20, pero despué inistración con rHuPH20, la concentración es ple (desde 64 hasta 264 pmol/L) . Incluso más dra dia geométrica de la concentración de insul enta sólo ligeramente (desde 62 hasta 74 pmol/ ??F R administrada sin rHuPH20, pero de nuevo es ple (desde 53 hasta 251 pmol/L) cuando se coadm HuPH20. Por lo tanto la coadministración con una elevación rápida en las concentracio ina que representan de manera más adecuada la re lina prandial fisiológica temprana en individuos La respuesta prandial natural continúa ol/L) para Humalog0 y (desde 30,000 hasta ol/L) para Humulin0 R en presencia de rHuP ión al control. De manera similar la respuesta p l es efectivamente completa alrededor de 4 s de un alimento, y la exposición a insulina a randiales tardíos puede llevar a excu lucémicas. La exposición correspondiente desde hasta las últimas observaciones a las 6 horas e reducen (desde 31,000 hasta 20,000 min*pmol/ g® y (desde 35,000 hasta 20,000 min*pmol/L ??F R en presencia de rHuPH20 con relación al c o tanto la coadministración con rHuPH20 increm ición a insulina deseable en 175 y 256% y dismi ición a insulina indeseable en 67 y 58%, respect la coadministración con rHuPH20 con relación al c La variabilidad entre pacientes e . El CV de la concentración máxima (Cm¿x) comparad iduos se reduce (desde 48% hasta 35%)' para Hum e 34% hasta 26%) para Humulin R en presencia de relación al control. El CV del tiempo ha tración máxima (tmáx) se reduce (desde 48% has Humalog y. (desde 32% hasta 28%) para Humuli cia de rHuPH20 con relación al control. Lo iores demuestran que el CV del cambio tración de insulina a través de los primeros 15 iores a la administración se reduce (desde 147 para Humalog0 y (desde 165% hasta 40%) para Hu esencia de rH.uPH20 con relación al control. El ición a insulina acumulativa a través de las pri (ABC0-120) se reduce (desde 41% hasta 22%) para sde 34% hasta 26%) para Humulin* R en prese 0 con relación al control. Por lo tanto la varia ción de insulina y los niveles de insulina en s de los primeros 20 minutos son comparables en ipos diferentes de insulina cuando se coadminist 20 (refiérase a las tablas 9 y 13) . En contraste, ministra sin rHuPH20, la insulina Humulin® R exh idad mucho más lenta y nivel reducido de absor ración con la insulina lispro Humalog® en los int empo iniciales. Por lo tanto, la combinación de r nzima degradadora de hialuronano, y una insu n rápida da como resultado composiciones que act o y hasta un grado mayor que la insulina de a sola, y, para tiempo tempranos (es decir meno os posteriores a la administración) , sustanci ndientes del tipo de insulina de acción rápida.

D. Efecto de la co-administración de rHuPH2 hasta el efecto máximo de mitad tardía (tGIR tos) ; el tiempo hasta efecto máximo de mitad niciai5o%) (minutos) ; el efecto metabólico máximo r) ; ABC-GIRo-60min/* ABC-GIRo-i20min ABC-GIRo-l80min/* A ABC-GIR0-3oomin; y el ABC-GIR0-36omin . La GIR se mililitros de dextrosa infundida por hora (ml/ se puede convertir a mg/kg/min utilizando lo sigu (mg/kg/min) = [velocidad de infusión IV (mi tración de dextrosa (g/dL) x 0.0167 / ma iduo (kg) , en la cual la concentración de dex mg/ml. 1. Efecto de la co-administración de rH ina Humalog® sobre la farmacodinámica de GIR Se calcula la velocidad de infusión de gluco intervalo de tiempo después de la administra TABLA 13 Velocidades de infusión de glucosa después de l administración de insulina lispro Humalog® GI (velocidad de infusión IV, ml/hr) Media Mediana SD SE Pendiente por A incrementos (0- (mL/hr) (mL/hr*min) (min* 3.1 0 7.4 2.1 8.4 0 13.6 3.9 1.78 9.8 0 16.3 4.7 0.44 10.8 0 16.0 4.6 0.36 10.8 0 16.0 4.6 0 11.0 0 16.4 4.7 0.06 11.3 0 17.1 4.9 0.08 14.1 9.0 16.3 4.7 0.94 15.9 13.0 15.9 4.6, 0.61 20.9 20.5 19.7 5.7 1.67 TABLA 13 (cont.) GIR (velocidad de infusión IV, ml/hr) dia Mediana SD SE Pendiente por A incrementos (0 (mL/hr) (mL/hr*min) (min* 85.7 75.5 69.4 20.0 * 3.03 97.7 82.5 90.0 26.0 4 112.3 80.0 77.2 22.3 0.97 130.7 93.0 77.3 22.3 1.23 142.3 114.0 73.0 21.1 0.78 155.3 122.0 79 , 7 23.0 0.86 166.4 143.5 76.1 22.0 0.74 170.7 148.0 75.4 21.8 0.28 175.8 151.5 74.6 21.5 0.34 178.4 162.5 73.8 21.3 0.18 184.9 167.0 88.3 25.5 0.11 141.3 130.0 67.4 19.4 -0.73 110.3 105.0 50.8 14.7 -0.52 TABLA 14 (cont.) GIR {velocidad de infusión IV) Media Mediana SD SE Pendiente por ABC incrementos (0-x) (mL/hr) (mL/hr'*min) (min*mL/hr) 8.8 0 13.5 3.9 1.15 21 15.8 10 18.1 5.2 2.31 58 11.8 0 14.8 4.3 -1.31 100 13.6 0 17.2 5.0 0.58 138 17.0 10 18.6 5.6 1.14 184 20.9 25 19.1 5.8 1.3 240 26.3 27 23.6 7.1 1.79 311 33.8 29.5 27.1 7.8 2.52 401 43.9 40 32.7 9.4 3.36 518 53.8 49.5 36.2 10.5 3.31 665 68.1 59 43.5 12.6 4.75 847 82.1 68.5 49.4 14.3 4.67 1073 104.0 80 64.5 18.6 7.31 1352 115.5 89 64.7 18.7 3.83 1681 TABLA 14 (cont.) GIR (velocidad de infusión IV) También se determina la GIRmáx, tmáx, y ABC-G s intervalos de tiempo para estos individuo tan en las tablas 15 y 16. La tabla 17 pr io de los parámetros farmacodinámicos par og®/rHuPH20) , y la diferencia en farmacoc ada utilizando las diferentes secuenci icación (es decir insulina lispro Humalog® és la insulina lispro Humalog® /rHuPH20, contra i Humalog® /rHuPH20 primero y después la insulina g® sola) .

TABLA 15 acodinámica de insulina después de inyección subc nsulina lispro Humalog® con y sin co- administra rHuPH20 ID del miento tGIR 50%GIRmax individuo (min) ( 1 , 137 68.5 83 2 326 163 98 3 247 124 68 4 178 89.0 83 5 119 59.5 68 TABLA 15 (cont.) 1 126 63.0 44 2 320 160 32 3 385 193 44 4 200 100 83 5 149 74.5 50 6 260 130 NC . 7 223 112 26 8 109 54.5 29 9 154 77.0 42 gw .con 10 257 129 38 PH20 11 138 69.0 38 12 336 168 47 TABLA 16 acodinámica de insulina después de inyección subc nsulina lispro Humalog® con y sin co-administrac rHuPH20- Intervalo de GIR-ABC ABC de GIR (min*ml/hr) ID del iento individuo 0-60 0-120 0-180 0-240 min min min min 1 137 240 1040 5400 13200 21400 2 326 150 3300 14000 33100 52200 -3 247 240 1770 13500 27100 41400 4 178 240 1940 8570 18600 29200 5 119 180 1050 5340 11400 18500 6 158 240 752 4780 12600 21800 7 350 60 4920 22100 37600 50900 8 90.0 135 1490 5390 10500 15500 9 115 165 590 4200 10500 17100 10 180 180 2030 9090 18700 29400 11 132 240 2880 8070 14600 22000 TABLA 16 (cont.) ABC de GIR (min*ml/hr) ID del iento individuo GIRmáx -máx 0 - 60. 0 - 120 0 - 180 0 - 240 min min min min 1 126 60 2180 8600 15400 21200 2 320 135 7800 24500 43400 58800 3 385 75 5330 25800 43500 58100 4 200 90 3020 11400 19300 28100 5 149 165 1990 9250 17600 24100 6 260 360 2100 9780 16300 22200 7 223 135 6590 19300 32200 42400 8 109 57 3670 10200 15900 19900 9 154 75 2250 10300 16500 21300 log® 10 257 150 6070 18800 34000 48100 UPH20 11 138 165 3640 10600 18700 26000 12 336 165 5610 19900 38200 56300 N 12 12 12 12 12 12 Media 221 136 4190 14900 25900 35500 TABLA 17 eto de la secuencia de dosificación de insulina I Humalog® sobre la farmacodinámica observada 1 Media 201 160 3930 13080 22650 31330 TABLA 17 (cont.) Los datos farmacodinámicos de veloci ión de glucosa soportan los ha cocinéticos , que muestran que el tiempo ha o máximo (tGIRmáx) se acorta en 36% cuando ntes se les administra insulina lispro Humal una mediana de 68 cuando a los pacientes istra insulina lispro Humalog® sola hasta 42 o a los pacientes se les administra insulina og® en combinación con rHuPH20 (p=0.0006) . 2. Efecto de la co-administración de rH ina Humulin® R sobre la farmacodinámica de GIR En la etapa 2, los pacientes reciben ro la dosis de insulina Humulin® R/rHuPH20 y sis de insulina Humulin® R sola, o primero la d ina Humulin® R sola y después la dosis de i in® R/rHuPH20 usualmente 7 días más tarde. Se locidad de infusión de glucosa para cada inter o después de la administración de insulina Hum o insulina Humulin® R/rHuPH20 y se presenta S 18 y 19, respectivamente. También se calculan TABLA 18 Velocidades de infusión de glucosa después de l administración de insulina Humulin®R GIR I O Media Mediana SD SE Pendiente por ABCÍ ) incrementos ) (mL/hr) (mL/hr*mili) (min 0 8.5 0 11 3.1 3 15.0 7 17 4.7 2.17 6 15.7 12 17.4 4.8 0.23 9 18.0 21 17.8 4.9 0.77 12 18.8 21 17.8 4.9 0.28 15 20.4 21 18.9 5.3 0.51 18 20.5 21 19 5.3 0.05 21 22.2 21 18.5 5.1 0.56 24 22.9 27 18.2 5 0.23 27 24.1 30 18.5 5.1 0.38 30 28.4 30 21 5.8 1.44 TABLA 18 (cont. ) GIR Media Mediana SD SE Pendiente por ABC( incrementos (mL/ r) (mL/hr*min) (min 56,9 63 19.3 5.3 1.79 72.5 77 27.4 7.6 1.04 83.6 85 41.7 11.6 0.74 92.8 97 47.3 13.1 0.62 102.6 99 50.1 13.9 0.65 119.4 105 55.1 15.3 3» · -1.2 127.5 109 57.2 15.9 0.54 138.9 136 55.8 15.5 0.76 146.2 147 61.5 17.1 0.48 178.9 193 61.2 17 0.55 172.0 176 59.1 16.4 -0.12 150.3 164 45,4 12.6 -0.36 TABLA 19 (cont.) GIR O Media Mediana SD SE Pendiente por ABC(O-x) ) incrementos (mL/hr) (mL/hr*min) (min*mL/hr) 3 16.0 12 15 4.2 2.86 35 6 17.5 19 15.2 4.2 0.51 85 9 20.1 24 15.3 4.3 0.85 142 2 21.8 24 14.7 4.1 0.59 205 5 24,8 26 14.4 4 1 275 8 30.6 32 13.2 3.7 1.92 358 1 36.4 35 15.7 4.4 1.92 458 4 48.2 45 13.4 3.7 3.95 585 7 54.8 47 16.2 4.5 2.21 740 0 65.9 66 21.6 6 3.69 921 3 74.3 74 25.8 7.2 2.79 1132 6 82.1 78 28.4 7.9 2.59 1366 9 91.8 87 28.2 7.8 3.26 1627 TABLA 19 (cont.) GIR 3. Comparación de la farmacodinámica de i Humalog® e insulina Humulin® R con y s a marcadamente las velocidades de infusión de una función de tiempo hacia arriba y hacia la iz mparación a cuando las insulinas se administ 20, similar al cambio en las gráficas de concen sulina como una función del tiempo. La veloc ión máxima se incrementa ligeramente desde una m 221 ml/hr para Humalog® y de 187 a 203 ml/ ??F R coadministrada con rHuPH20 con relac 1. De manera similar, el tiempo de GIR máximo se 193 hasta 136 minutos para Humalog y desde 25 inutos para Humulin5 R coadministrada con rHuP ión al control. El inicio de acción, tal como te el tiempo hasta GIR máxima de la mitad niciai5o%) se reduce desde 72 hasta 43 minuto g y desde 113 hasta 83 minutos para Hum nistrada con rHuPH20 con relación al control. s de las primeras 2 horas se incrementa desde 16 1 para Humalog® y desde 112 hasta 226 mi para Hu inistrada con rHuPH20 con relación al control. El etabolismo de glucosa después que se compl tión de los carbohidratos a la hora de la comid r a incidentes hipoglucémicos adversos. El lativo de solución de glucosa suministrada desd las 6 horas disminuye de 289 a 212 mi para Hu 7 a 252 mi para Humulin^ R coadministrada con elación al control. Por lo tanto, la coadministra iera de un análogo de insulina de acción rápid ración de insulin regular de acción rápida con enta la capacidad de disminución de anamente para facilitar la digestión postpra e la actividad de disminución de glucosa cuand idad pudiera conducir a excursiones hipoglucémica ínea, lo que resulta en un decline general de la ínea) . Por lo tanto, estos datos demuestran biológica de cada una de las insulinas se inc cialmente tanto en velocidad (inicio de metabol a) como en extensión cuando se coadminist 20, una enzima degradadora de hialurona ación a cuando las insulinas se administr 0.

En este estudio, se mejoran las prop odinámicas de insulina Humulin® R cuan inistra con rHuPH20 con lo cual la farmacodiná sustancialmente al perfil farmacodinámico de se coadministra con rHuPH20, en contraste dades farmacodinámicas sustancialmente retard ina Humulin® R con relación a insulina lispro H strada en ausencia de rHuPH20. La GIR requeri 1 de GIR que indica una velocidad más lenta de ac ina en comparación con la insulina lispro H se administra sin rHuPH20. Por lo tan ación de rHuPH20, uña enzima degradado onano, y una insulina de acción rápida baj lo, condiciones tales como aquellas descritas io da como resultado composiciones de insulina de -rápida que actúan más rápido y en un grado mayor na de acción rápida sola, y, para los tiempos in decir menos de 60 minutos posteriores stración) , sustancialmente independiente del na de acción rápida.

EJEMPLO Ib armacocinética y respuesta glucémica postprandial ina lispro Humalog® o insulina Humulin®R inyecta ión de rHuPH20, después de un alimento líq tes con diabetes mellitus tipo 1. El estudio de alimento líquido, cruzado, de un solo centro ente desconocido por los pacientes) , que cons erie de desafíos con alimento líquido normaliz tes diabéticos tipo 1 con muestreo de sangre s a la dosificación y 8 horas posteriores cación para los parámetros farmacocinéti odinámicos .

Cada individuo pasa por una serie de visit rimiento de dosis para insulina lispro Huma 0 (visitas 2A-C; hasta tres inyecciones) inar la dosis de insulina individual apropiada - inyecta con rHuPH20 para cubrir el alimento líq l glucémico óptimo (definido como mantener la nea postprandial del paciente dentro de un inter izada se utiliza para un alimento de prueba rto por insulina Humulin®R sin rHuPH20 (visita 5) El estudio permite la comparación de los cocinéticos y de excursiones de glucosa postp o la insulina prandial se administra con o sin én se evalúa la hipoglucemia posterior a los al verificar la relevancia clínica de cuale encías farmacocinéticas observadas .. El objetivo p parar la exposición a insulina inicial tal como zando el punto final farmacocinético primario d insulina lispro Humalog® y de la insulina H tadas por vía subcutánea antes de un alimento sin hialuronidasa recombinante humana (rHuPH20) etros farmacocinéticos de insulina medidos incluy t50% inicial (tiempo hasta la concentración má de la mitad inicial) , t50* (tiempo ha idad de eliminación terminal; se determina sión lineal de los puntos terminales de la c ntración en suero- tiempo logarítmica- lineal ) po de vida media de eliminación, definid /??) ; CL/F (depuración como una función sponibilidad; calculada como Dosis/AB ltimo) (tiempo de residencia promedio desde el t la última observación, el cual de conformidad colo es de 480 minutos después de la dosis) ; o de residencia promedio desde el tiempo 0 ito) , y Vz/F volumen de distribución como una fun disponibilidad) .

Los puntos finales farmacodinámicos s tros de respuesta glucémica postprandial , inc o_4h (en la cual BG representa glucosa sanguí puntos finales farmacodinámicos incluyen ucosa sanguínea de 36 mg/dl y menor de 70 mg/dl. alizan parámetros de seguridad tales como sos, hematología, bioquímica, análisis de es físicos, signos vitales, ECGs, glucosa sa abilidad local en el sitio de inyección, y forma uerpos contra agentes de insulina y contra rHuPH2 A. Selección del paciente Pacientes de género masculino y femeni tes mellitus tipo 1, tratados con insulina duran , son elegibles para inclusión en el estu ere que los pacientes sean de 18 a 65 años de ujeres con potencial de embarazo se despide s normales y efectivos de control de natalidad uración del estudio. Otros criterios de i en: índice de masa ósea (BMI) 18.0 a 29.0 Los diversos criterios de exclusión del en: alergia conocida o sospechada a cu ente de cualquiera de los fármacos de estudio ; reclutamiento previo en la prueba; pacien patía o maculopatía proliferativa, y/o neu , en particular neuropatía del sistema au edad activa clínicamente significativa del sis ntestinal, cardiovascular (incluyendo un histo ias o retrasos en la conducción en ECG) , he lógico, renal, genitourinario, o hematológ tensión no controlada (presión sanguínea diast m de Hg y/o presión sanguínea sistólica > 160 nu és de 5 minutos en la posición supina) ; histo iera padecimiento o enfermedad que pudiera co esultados de la prueba o presentar riesgo ad te la administración de los fármacos de est tante recurrente o desconocimiento hipoglucémico zgue el Investigador; adicción actual al aleo ancias de abuso; donación de sangre (> 500 mi) de semanas previas a la Visita 2A (véase sección te) en el estudio; embarazo, lactancia, inten azadas, o no utilizar medidas anticonceptivas a medidas anticonceptivas adecuadas consist ilización, dispositivo intrauterino [DIU] , onceptivos orales o inyectables o de ba acidad mental, falta de disposición, o barr aje que eviten entendimiento b cooperación ade oparesis sintomática; recepción de cualquier investigación dentro de las 4 semanas de la vi e sección B, más adelante) en este estudio; cu ción (intrínseca o extrínseca) que pudiera int a participación en la prueba o la evaluación de aciones de seguridad para el análisis de puntos f ier paciente que no complete todas las inyeccio CO de estudio especificadas en protocolo y reo suficiente de sangre y evaluaciones de se la visita 5 se remplaza mediante reclutamient te adicional.

B . Métodos de estudio 1. Procedimientos de la visita Cada paciente atiende una visita de se ta 1) para determinar la elegibilidad para partic prueba. Una vez enrolado, cada paciente tiene una y hasta tres visitas 2A-C para descubrimient (insulina lispro Humalog® con rHuPH20) , una visi icación (insulina lispro Humalog® sola), por l hasta dos visitas 4A-B para descubrimiento de l de su primera visita de dosificación.

Cada visita para descubrimiento de dosis a de dosificación se completan en un solo día, a revisión temprana la mañana, los pacientes se o abilizan durante aproximadamente 2 horas uti sa intravenosa y/o insulina según se requie r la glucosa sanguínea hasta un valor objetivo . No se permite infusión de insulina o glucosa O minutos inmediatamente antes de la dosificació ntemente es seguido por dosificación con el artí (es decir insulina lispro Humalog®, insulina g®/rHuPH20, insulina Humulin®R o i in®R/rHuPH20 ) y después el consumo del alimento imadamente a las 8:30 a.m. En todas las vis icación, las evaluaciones farmacocinétic odinámicas proceden durante 8 horas 300. La coagulación de sangre en el catéter y ía se evita purgando con solución salina 0.15 mmo a un segundo catéter de PTFE de calibre 18 en un tebrazo opuesto para infusión de solución de glu solución salina, e insulina según se considere ap te el periodo de pre-dosificación. 60 minutos a sificación, se determina la concentración de inea en los siguientes puntos de tiempo con rel sificación: -60, -30, -20 y -10 min con un analiz sa YSI STAT2300. El promedio de las lecturas de ínea de -30, -20 y -10 minutos se utiliz inar el nivel de glucosa sanguínea en ayu te para cada visita de descubrimiento de dosi icación. Un paciente con diferencias entre los ucosa sanguínea en ayunas iniciar que sean consi randes se vuelve a programar para la visita o se istración IV de glucosa y/o insulina por medio ión de precisión/bomba de jeringa. No se adm ion de insulina o glucosa durante los 30 iatamente antes de la dosificación. Al momento istración del fármaco, el nivel de glucosa sanguí te está en un intervalo entre 80 y 140 mg/dl (el blanco un valor tan cercano como sea posi alo de 100-120 mg/dl) . 4 , Dosificación e ingestión de alimento ar Después del periodo de corrida de dos ho istra la inyección del fármaco de estudio (en e empo 0) mediante inyección subcutánea con una jer iegue de piel levantado de la pared abdomin los de prueba se preparan de la siguiente man firiéndolos a un frasco que contiene 1 mi de rHuP 3000 U/ml) . La solución se mezcla mediante ag La dosis de insulina lispro Humalog® s a aspirando la dosis correcta (según se determin 2) a partir de un frasco de insulina lispro H U/ml; Eli Lilly) utilizando una jeringa de insu m3 de capacidad. La combinación de insulina g®/rHuPH20 se prepara descongelando primero un HuPH20 (1 mg/ml; aproximadamente 1200,000 U atura ambiente durante 1 a 2 horas. Utiliza a de insulina estéril de 0.3 cm3 de capacidad, s cm3 de aire al interior de la jeringa y se expu pacio superior del frasco de rHuPH20, antes de cm3 (0.27 mg; aproximadamente 32400 U) de rHu or de la jeringa. Esto después se tra Se administra una dosis promedio de 5.7 (+ ina lispro Humalog®, con o sin rHuPH20 (0.2 ina) . Se administra una dosis promedio de 6.2 (+ ina Humulin® R, con o sin rHuPH20 (0.2 µ ina) . Los sitios de inyección para las insuli istradas con rHuPH20 son los siguientes: la i la visita 2A es en la región abdominal media izq guíente visita (Visita 2B o Visita 3 si la visit necesario) utiliza la región abdominal media de iguiente visita utiliza la región abdominal erda, y los sitios de inyección subsiguien an en forma correspondiente. La aguja de inyec a un ángulo de 45 grados y se mantiene en el el durante 10 segundos.

Dentro de 10 minutos después de dosifi CO de estudio, los · pacientes consumen un a 5. Muestreo y evaluación Durante el periodo de pre-dosificacion y des sificación, se monitorea la concentración de ínea mediante mediciones de glucosa sanguínea fre zando el analizador de glucosa YSI STAT2300 s de tiempo especificados de -60, -30, -20, -10 12, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 9 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 21 240, 255, 270, 285, 300, 315, 330, 345, 360, 37 420, 430, 445, 460, 475 y 480 minutos.

B . Farmacocinética de insulina Humulin®R ina lispro Humalog® con y sin rHuPH20 La farmacocinética tanto para insulina og®/rHuPH20 como para insulina Humulin®R/ ran exposición acelerada pero en general compar ina con rHuPH20] / [media (geométrica o aritméti farmacodinámico para insulina sola] x 100) , tam e . La media geométrica y el valor p para lo formados a logaritmos para los parámetros Cm¾ ras que los que se basan en la media aritm es no transformados para tm¿x y t50% inicial y tar final primario, exposición total a insulina a tr imera 1 hora (ABC0-6o) / se incrementa 135% para i Humalog®/rHuPH20 en comparación con insulina g® sola (p=0.0197) y 304% para insulina H PH20 con respecto a insulina Humulin® R sola (p=0 nicial se reduce desde 19.9 hasta 12.6 min (p insulina lispro Humalog® y desde 40.1 hast 3) para insulina Humulin® R. tm¾x disminuye des 27.9 minutos (p=.0O2) para insulina lispro Hum 96.7 hasta 52.1 (p=.086) para regular; t50% La tabla 19b presenta un sumario de etros farmacocinéticos para todos los 21 pacien nan el estudio, se muestra la media y la d dar. Los análisis farmacocinéticos en la tabla úan sobre la concentración de insulina lispro Hu ina Humulin®R individual con línea basal sustra línea basal es la medición al tiempo 0) contra o utilizando la estrategia sin compartimientos ( zoide lineal para cálculo de ABC) . Se utili rios de selección de usuario "WinNonlin" minación de ??, la constante de veloci nación, en la cual se basan el tiempo de vida me , MRT, CL, y Vz . Todas las mediciones menores de ustan a cero para propósitos de cálculo farmacoci La adición de rHuPH20 a la inyección de o Humalog® o insulina Humulin®R incrementa la ex ición temprana a insulina Humulin® R en 210% de 2010 min*pmol/L/UI con relación a la administra ol sin enzima. La biodisponibilidad desp inistración con rHuPH20 no se altera signifícat elación a la inyección de control de insulina og® sola: 98% for ABC0-inf y 116% para ABC0-úi sponibilidad relativa es de 120% para ABC0-inf y ABCo-úitimo con la coadministración de insulina Hun HuPH20 con relación a la administración de cont a (datos con línea basal sustraída normalizados de la media simétrica utilizados para esos c no mostrados) . La co-administración tanto de de lispro con rHuPH20 acelera Tmáx y t50% inicial nparación con la inyección de control sin rHuPH20 El tiempo hasta la concentración máxima de s, rápido para la inyección de insulina lispro C . Comparación de la respuesta glucémica al limento después de insulina humana regular e o con y sin rHuPH20 La respuesta glucémica a un desafío con ali a insulina lispro Humalog® o insulina Humul istran con rHuPH20 en comparación a cuando las i ministran zonas. La tabla 19c muestra los pa codinámicos según se miden a partir de 12 pacien ministración de cualquiera de insulina lispro Hu ina Humulin®R con rHuPH20 da como resultado niv sa sanguínea postprandial es reducidos con relaci ción de control sin rHuPH20. La glucosa sanguíne vada en el periodo postprandial de 4 horas se 186 hasta 154 mg/dl cuando la insulina lispro inistra con rHuPH20 en comparación con insulina og® sola (p=0.0213) y desde 212 hasta 166 mg/dl D . Seguridad No se reportaron eventos adversos serios . El so más comúnmente reportado fue glucosa s nuir /hipoglucemia (147 eventos) . De los 147 eve sa sanguínea disminuirá/hipoglucemia, 21 derados posiblemente o probablemente relaciona 20. 17 eventos se calificaron como modera sidad, 4 de los cuales se consideraron posi ionados con rHuPH20. Los 126 eventos remane icaron como ligeros en intensidad. Todos lo os adversos se presentaron con frecuencia menor estudio .

Todos los episodios de hipoglucemia (defini un valor de glucosa sanguínea >70 endientemente de los síntomas se registraro os adversos en este estudio. ficativo en la biodisponibilidad . Esta expos ina más temprana lleva a menos hiper randial, con niveles de glucosa máximos a las idos, niveles de glucosa postprandial a la idos, y menos excursiones hiperglucémicas tal mediante ABC > 140 mg/dl. Las exc lucémicas, tal como se mide mediante ABC < 70 mg/ as y similares para todos los artículos de prue endencia menor hacia área incrementada para o Humalog® y haría reducida para insulina regula lina Humulin® R) después de la coadministrac 20.

EJEMPLO le a de rHuPH2 O : insulina, se administran un inter iones de dosis de rHuPH20 por vía subcutánea ( de insulina regular (insulina Humulin® R) o i o Humalog®, y se evalúa la farmacocinética y la r a de rHuPH20 : insulina determinando tm$x, Cm¾x, A sponibilidad relativa tomando como bas ntraciones de insulina en suero recolectado s de tiempo especificados.

Se evalúa el efecto de la coadministración d les de rHuPH20 sobre la farmacocinét codinámica (o glucodinámica (GD) ) de insulina H ulina lispro Humalog® administradas por vía su do muestras de sangre para medir los niveles de i lucosa. Se utiliza un procedimiento de insulinémica-euglucémica (como el descrito en el ra mantener los niveles de glucosa en plasma en cocinéticos . Se mide la velocidad de infusión de para mantener la euglucemia mientras está en la iliza para determinar los siguientes parámetros x, tGIR50% inicial, tGIR50% tardío, ABC0?t de inal GIR (en los cuales t = 30, 60, 90, 120, 18 y 480 min después de la inyección) , ABC0-»todos ele x, y la variabilidad entre y dentro de los in do como base el coeficiente de variación para to etros de GD. También se evalúa la segur abilidad local de cada una de las iny táneas .

A. Administración de insulina Humulin® R co variables de rHuPH20 A voluntarios sanos se les administran 30 µ ® unidades de rHuPH20. La tabla 19d indica los pa cocinéticos medidos para los individuos que rec des de insulina. Los parámetros farmacoc terísticos de la coadministración de hialuronida al y ti 2máx# ¾? mayor y exposición sistémica jemplo, ABC0-60min) se incrementan en forma co todas las concentraciones de rHuPH20 analiz ración a cuando la insulina se administra so les de velocidad de infusión de glucosa (GIR) pa oncentraciones de rHuPH20 son diferentes del pla 0 q/ml) con un incremento característico idades iniciales y decremento en la infusión de a. A través de las dosis analizadas, tod traciones de rHuPH20 son generalmente efectiva serva dosis no efectiva.

TABLA 19d (cont.) ble Estadística Cantidad de rHuPH20 ades) 0 1.25 5 10 20 g/mL g/mL g/mL pg/mL g/mL N 4 4 4 4 4 Media 121.5 108.8 71.3 93.8 75.0 Aritmética (std) (125.42) (33.26) (14.36) (39.45) (21.21) tos) CV% 103 30.6 20.2 42.1 28.3 Mediana 90.0 105.0 67.5 82.5 82.5 N 4 4 4 4 4 Media 41.3 33.3 22.3 30.4 24.7 Aritmética al (std) (25.67) (9.14) (6.97) (9.58) (3.99) tos) CV% 62.2 27.4 31.2 31.5 16.2 Mediana 30.3 33.5 25.4 29.3 25.0 N 4 4 4 4 4 Media 359.0 196.3 209.8 194.5 210.8 Aritmética O (std) (28.28) (47.35) (47.08) (69.25) (50.09) tos) CV% 7.9 24.1 22.4 35.6 23.8 Mediana 359.0 201.0 204.0 174.5 231.0 N 4 4 4 4 4 B . Administración de insulina lispro Humalo osis variables de rHuPH20 A voluntarios sanos se les administran 3 µ? de insulina lispro Humalog® (diluida ha con una concentración final de cualquier , 0.078 pg/ml, 0.3 g/ml, 1.2 pg/ml, 5 pg/ de rHuPH20 (aproximadamente 0 U/ml, 9.36 U 144 U/ml, 600 U/ml o 2400 U/ml, respectiva o tanto, a los voluntarios se les administran que contienen 1.5 U de insulina lispro Húmal imadamente 0, Q .28, 1.0.8, 4.32., 18 o 72 unid 20., o 120 ,µ? que contienen 6 U de insulina og® con aproximadamente 0, 1-.12, 4.32, 17.28 unidades de rHuPH20. La tabla 19e indi etros farmacocinéticos medidos para los ind eciben 6 U de insulina lispro Humalog®. A tr TABLA 19e etros farmacocinéticos de insulina para 6 U de i lispro Hmnalog® con dosis variables de rHuPH20 ble Estadística Cantidad de rHuPH20 ades) 0 0.08 0.31 1.25 5 pg/mL g/mL g/mL pg/mL g/mL N 4 4 4 4 4 /L) Media 381.8 355.9 435.1 483.7 579.5 Geométrica CV% 13 21 26 23 29 Mediana 385 376 463 506 532 N 4 4 4 4 4 tos) Media 67.5 36.3 33.8 41.3 33.8 Aritmética (std) (8.7) (10.3) (7.5) (14.4) (7.5) CV% 13 28 22 35 22 Mediana 67.5 37.5 30 37.5 30 N 4 4 4 4 4 al Media 25.9 15.6 15.2 17.0 16.0 Aritmética tos) TABLA 19e (cont.) EJEMPLO 2 ración de una línea celular que exprese rHuPH20 s El plásmido HZ24 (indicado en SEQ ID NO: za para transfectar células de ovario de h mste ctura base del vector pCI también incluye ica para el gen de resistencia a ß-lactamasa (A de replicación fl, una regió mentador/promotor inmediato- temprano de Cytomeg , un intrón quimérico, y una señal de poliade a de SV40 (SV40) . El ADN que codifica p rucción de rHuPH20 soluble contiene un sitio Nhe ncia de consenso de Kozak antes del ADN que la metionina en la posición de aminoácido 1 eia de señal de aminoácido 35 original de 0, y un codón de detención después del ADN que la tirosina correspondiente a la posición de am e la hialuronidasa PH20 de humano indicada en SE eguido por un sitio de restricción BamHI . Por l nstrucción pCI - PH20- IRES-DHFR-SV4Opa (HZ24), tado una especie de ARNm individual controlada onic F68/L (Gibco) , a 0.5 x 106 células/ml en u dor como preparación para la transfección. Las ultivan a 37°C en 5% de C02 en una in ificada, agitando a 120 rpm. Las células CHO fectadas que crecen exponencialmente se cto a viabilidad antes de la transcripción. 60 millones de células viables del cul as CHO DG44 no transfectadas se comprimen y se v nder hasta una densidad de 2 x 107 células en 0. ión amortiguadora para transfección 2x (2x HeBS , pH 7.0, 274 mM de NaCl, 10 mM de KC1, 1.4 , 12 mM de dextrosa) . A cada alícuota de célu ndidas, se agregan 0.09 mi (250 pg) del plásmi l (linealizado mediante digestión durante toda l Cía I (New England Biolabs) , y las .solucio as/ADN se transfieren a celdas para electropora mina y 18 ml/1 de Plurionic F68/L (Gibco) , y s r en una cavidad de una placa de cultivo tisul ades sin selección durante 2 días a 37°C en 5% d ncubadora humidificada .

Dos días después de la electroporación, se i del medio de cultivo de tejidos a partir ad y se analizan respecto a la presencia de acti ronidas , utilizando la prueba de microturbidez ejemplo 5. Los resultados se muestran en la tabl TABLA 20 tividad de hialuronidasa iniciada de células CHO transfectadas con HZ24 a las 40 horas después de transfección Activida Dilución Unidades/ sfección 1 1 a 10 0.25 S para cultivo de tejidos de fondo redondo ades. Se agregan 100 yl de medio CD-CHO (GIB ene 4 mM de complemento GlutaMAX™-1 (GIBCO™, In ration) y sin complementos de hipoxantina y tim avidades que contienen células (volumen final 0 entifican diez clones a partir de las 5 pla n sin metotrexato (Tabla 21) .

TABLA 21 tividad de hialuronidasa de los clones identific e Placa/cavidad Hialuronidasa Relativa 261 261 261 243 , 174 103 ensional infinita en la cual las células se dilu fondo de la placa, y 1:3 a través de la zando en 5000 células en la cavidad izquierda s lones diluidos se cultivan en un fondo de 500 G44 no transfectadas por cavidad, para prov res de crecimiento necesarios para los días inici vo. Se preparan 10 placas por subclon, de las s contienen 50 nM de metotrexato y 5 placas no c rexato .

El clon 3D3 produce 24 subclones visuales r del tratamiento sin metotrexato, y 11 a par miento con 50 nM de metotrexato. Se mide la acti ronidasa significativa en los sobrenadantes prov de los 24 subclones (>50 Unidades/ml) , y ones se expanden en matraces de cultivo de te i lones aislados a partir del protocolo de tratami EJEMPLO 3 erminación de la actividad de hialuronidasa de rH soluble La actividad de hialuronidasa de rHuPH20 sol ras tales como cultivos celulares, fraccio icación y soluciones purificadas se determina ut álisis turbidimétrico, que se basa en la formaci pitado insoluble cuando el ácido hialurónico se eroalbúmina . La actividad se mide incubando le con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) riodo de tiempo establecido (10 minutos) y pitando el hialuronato de sodio no digerido ?? de seroalbúmina acidulada. La turbidez de la tante se mide a 640 nm después de un período de minutos. El decremento en turbidez que result ión de diluyente de enzima. La solución de diluy a se prepara disolviendo 33.0 ± 0.05 mg de lizada en 25.0 mi de la solución reguladora de PES 50 mM (140 m de NaCl, 50 mM de PIPES, pH mi de SWFI, y diluyendo 0.2 mi de solución de % en la mezcla y sometiendo a acción de remolino gundos . Esto se realiza dentro de 2 horas del u ena en hielo hasta que se necesite. Las mues en hasta un estimado de 1-2 U/ml . En términos ge lución máxima por etapa no supera 1:100 y el ta ra inicial para la primera dilución no debe ser . Los volúmenes de muestra mínimos necesari uar la prueba son: muestras en el procedi iones FPLC: 80 µ?; Sobrenadantes de cultivo de te aterial concentrado 80 µ?; material purificad final: 80 µ? . Las diluciones se preparan por tri Las cavidades "testigo del reactivo" que conti solución diluyente de enzima se incluyen en l un control negativo. La placa después se cubr nta sobre un bloque de calefacción durante 5 mi Se retira la tapa y la placa se agita dur dos. Después de agitar, la placa se regresa al bl lefacción y el dispositivo para manejo de 1 DROP 384 se ceba con la solución de hialuronato mg/ml caliente (que se prepara disolviendo 10 ronato de sodio (LifeCore Biomedical) en 20.0 Esto se mezcla mediante agitación o mecimiento durante 2-4 horas, o hasta que se etamente) . La placa de reacción se transfi ROP 384 y la reacción se inicia presionando la t o para dispensar 30 µ? de hialuronato de sodio ad. L . placa se retira después del MULTIDROP 3 etatos 500 mM y el H se ajusta a 3.1 co ídrico] en 75 mi de solución amortiguadora de ) . La placa se retira del bloque de calentamien a en el MULTIDROP 384 y se dispensan 240 iones de trabajo de suero en las cavidades. La p a y se agita en una lectora de placas dur dos. Después de 15 minutos adicionales, se dez de las muestras a 640 nm y se determina la a aluronidasa (en U/ml) de cada muestra mediante a rva patrón.

La actividad específica (Unidades/mg) se iendo la actividad de hialuronidasa (U/ml) e ntración de proteína (mg/ml) .

EJEMPLO 4 células viables por mi. los parámetros son p o de temperatura 37 °C, pH 7.2 (punto de in da) , con punto de inicio de oxígeno disuelto de 2 do de aire de 0-100 cm3/min. A las 168 hrs, se i de medio de abastecimiento #1 (CD CHO con 50 sa) . A las .216 horas, se agregan 250 mi de m ecimiento #2 (CD CHO con 50 g/L de glucosa y 1 ato de sodio) , y a las. 264 horas se agregan 25 de abastecimiento #2. Este procedimiento d tado una productividad final de 1600 unidades por ensidad celular máxima de 6 x 106 células/ml. La tirato de sodio incrementa dramáticamente la pr uPH20 soluble en las etapas finales de producción El medio acondicionado proveniente del clo arifica mediante filtración profunda y diafiltra tangencial en HEPES 10 mM pH 7.0. Después se de sulfato de amonio 500 mM y se hace pasar a t sub) columna baja de fenil sefarosa, seguido po las mismas condiciones a una resina de boro o. La rHuPH20 soluble se eluye de la resina d osa en HEPES pH 6.9 después de lavar a pH 9.0 en sin sulfato de amonio. El eluato se carga en una ica de hidroxiapatita a pH 6.9 en fosfato de po CaCl2 1 mM y se eluye con fosfato de potasio 80 on CaCl2 0.1 mM.

La rHuPH20 soluble purificada resultante ?? idad específica mayor de 65,000 Unidades US ína mediante la prueba de microturbidez (eje zando el patrón de referencia USP. sPH20 pur como un pico individual desde los 24 hasta os a partir de una columna de estireno-divinil acia 5RPC con un gradiente entre 0.1% TFA/H20 ente arriba en un cultivo celular en biorreactor s Se utiliza un procedimiento escalado para p eparado rHuPH20 soluble a partir de cuatro entes de célula 3D35M para producir cuatro ados de sHuPH20; HUA0406C, HUA0410C, HUA0 20C. Cada frasco se expande por separado y se cu s de un biorreactor de 125 litros, después se p zando cromatografía en columna. Se toman mué s de todo el procedimiento para evaluar parámetr rendimiento de enzima. La descripción del proce sta más adelante indica especificaciones represe cosas tales como inicio de reactor y volúmenes d astecimiento, densidades celulares de transfere enes de lavado y elusión. Los números exactos 40 mi en el matraz de agitación de 125^ mi. Cu ad celular alcanza 1.5 - 2.5 x 106 células o se expande hacia un matraz giratorio de 125 m n de cultivo de 100 mi. El matraz se incuba a 3 2. Cuando la densidad celular alcanza 1.5 - 2. s/ml, el cultivo se expande hacia un matraz gi 0 mi en un volumen de cultivo de 200 mi, y el ma a 37 °C, 7% de C02. Cuando la densidad celular 2.5 x 106 células/ml, el cultivo se expande h Z giratorio de 1 litro en un volumen de cultivo se incuba a 37 °C, 7% de C02. Cuando la densidad za 1.5 - 2.5 x 106 células/ml, el cultivo se un matraz giratorio de 6 litros en un vol o de 5 litros y se incuba a 37°C, 7% de C02. Cu ad celular alcanza 1.5 - 2.5 x 106 células o se expande hacia un matraz giratorio de 36 li ces giratorios de 36 litros hacia el biorreactor s (Braun) , lo que resulta en un volumen final s y una densidad de sembrado de aproximadamente s/ml, los parámetros son punto de ini ratura, 37 °C; pH : 7,2; oxígeno disuelto: 25% idad del propulsor 50 rpm; presión del recipien 2; roción de 1 L/min. ; capa superficial de air . El reactor se muestra diariamente respecto a ares, verificación de pH, análisis del cción de proteína y retención. Los materia ecimiento de nutrientes se agregan durante la c 6, se agregan 3.4 litros de medio de abastecimi HO + 50 g/L de glucosa + 40 ml/L de GlutaMAX™- 1 ratura de cultivo se cambia a 36.5°C. En el dí an 3.5 litros de medio de abastecimiento #2 (C L de glucosa + 40 ml/L de GlutaMAX™-! + 1.1 ática de 1600 Unidades/ml con una densidad a. de 8 millones de células/ml. En la cose vo se muestrea respecto a micoplasma, carga bio oxina, y virus in vitro e in vivo, micr rónica por transmisión (TEM) respecto a par es, y actividad enzimatica.

La cosecha de células del biorreactor de 100 ltra a través de una serie de filtros de hables que tienen un medio de poliéte orius) : primero a través de una cápsula de 8. didad, una cápsula de 0.65 µp? de profundid la de 0.22 µp\, y finalmente a través de un fi cm Sartopore de 0.22 µp? y al interior de una b enamiento estéril de 100 litros. El cultivo se c utilizando dos TFF con filtros MWCO espira tersulfona de 30 kDa (Millipore) , seguido TABLA 22 atos de monitoreo para cultivo celular, recolecci concentración y pasos de intercambio con solució amortiguadora etro HUA0406C HUA04.010C HUA0415C H desde descongelamiento 21 19 17 inoculación del actor de 100 L ctor (días) ad de inoculación de 0.45 0.33 0.44 (x 106 células/ml) de duplicación en 29.8 27.3 29.2 iento logarítmico (hr) ad celular máxima (x 5.65 8.70 6.07 lulas/mL) idad de la cosecha (%) 41 48 41 de la cosecha (U/ml) 1964 1670 991 en el biorreactor Time 13 13 12 L (días) n de cosecha 81800 93300 91800 icada (mL) de enzima de cosecha 2385 1768 1039 icada (U/mL) de enzima del 22954 17091 8561 trado (U/mL) de enzima del 15829 11649 9915 trado intercambiado con ón amortiguadora (U/mL) de enzima del 21550 10882 9471 trado intercambiado con ón amortiguadora da (U/mL) n del concentrado 10699 13578 12727 10 mM, 20 mM de Na2S04, H 7.5. La cosecha conc ltrada se carga en la columna Q a una velocidad O cm/hr. La columna se lava con 5 volúmenes de is 10 mM, 20 mM de Na2S04/ pH 7.5 y HEPES 10 mM, 5 pH 7.0. La proteína se eluye con HEPES 10 mM, 40 pH 7.0 y se filtra a través de un filtro final interior de una bolsa estéril.

Después se efectúa una cromatografía de int fóbica de fenil-sefarosa (Pharmacia) . Se prep a de fenil-sef rosa (PS) (9.1 L de resina, Altu iámetro = 20cm) . La columna se equilibra con 5 v lumna de 5 mM de fosfato de amonio, 0.5 M de sul o, 0.1 mM de CaCl2, pH 7.0. El eluato de ido anteriormente se complementa con solúci va de sulfato de amonio 2M, fosfato de potasio 1 M hasta concentraciones finales de 5 mM, 0.5 ibrado con 5 volúmenes de columna de fosfato de sulfato de amonio 0.5 M. La proteína se hace s de la columna a una velocidad de flujo de 100 lumna se lava con fosfato de potasio 5 mM, sul o 0.5 M, pH 7.0. La columna se lava después con , 100 ~mM de NaCl, pH 9.0 y la proteína se el 50 mM, 100 mM de NaCl pH 6.9 a través de un il y hacia el interior una bolsa estéril de 20 eluato se analiza respecto a carga bi ntración de proteína y, actividad enzimática.

Se equilibra una columna de hidroxiapatit ad) (1.6 L de resina, altura = 10 cm, diámetro = osfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0. Se recolectan las muestras del lavado y se eto a pH, conductividad y endotoxina (prueba L ína purificada con boronato de aminoilo se com namiento estéril de 5 L-. El elúato se analiza r ga biológica, concentración de proteína y ac tica .

La proteína purificada con HAP se bombea de s de un filtro para remoción de virus de 20 nM m nque de presión. La proteína se agrega al ta ón DV20 y el filtro (Pall Corporation) , hac a través de un filtro Ultipor DV20 con poros d Corporation) hacia una bolsa de almacenamiento 0 L . .El material filtrado se analiza resp ntración de proteína, actividad enzi minación de perfil de oligosacárido, monosac siálico, e impurezas relacionadas c Sarniento. La p'roteína en el material filtrado oncentra hasta 1 mg/ml utilizando un sist ación de flujo tangencial (TFF) por sección de c iguadora final: HEPES 10 mM, 130 mM de NaCl, pH ína concentrada se hace pasar a a través de un 22 m hacia una bolsa de almacenamiento estéri s . La proteína se muestrea y analiza resp tración de proteína, actividad enzimática, idrilo libres, determinación de perfil de oligos olaridad.

Las tablas 23 a 29 proveen datos de m ionados con cada uno de los pasos de puri itos anteriormente, para cada lote de célula 3D351 TABLA 23 Datos de la columna de Q sefarosa etro HUA0406C HUA0410C HUA0415C HU n de carga (mL) 10647 13524 12852 20 ón de volumen de 3.1 4.9 4.5 7. volumen de resina TABLA 24 Datos de la columna de fenil sefarosa TABLA 25 Datos de la columna de boronato aminofenilo etro HUA0406C HUA0410C HUA0415C en de carga (mL)) 16136 17958 16931 TABLA 26 Datos de la columna de idea hidroxiapatita TABLA 27 Datos de filtración en DV20 TABLA 28 Datos de concentración final TABLA 29 atos de intercambio de solución amortiguadora en formulación final etro HUA0406C HUA0410C HUA0415C H en de inicio (mL) 562 407 237 31 en final del ntrado intercambiado 594 516 310 55 ína se hace pasar a través de un filtro de 0.22 omba controlada por operador que se utiliza para raseos utilizando una lectura gravimétrica . Los erran con tapones y se aseguran con tapas plegad os cerrados se inspeccionan visualmente res culas extrañas y después se etiquetan. Des etar, los frascos se congelan instantáneamente sión en nitrógeno líquido por no más de 1 minu enan a < -15°C (-20 ± 5°C) .

EJEMPLO 5 ducción de células Qen2 que contienen PH20 solub humano (rHuPH20 ) La línea celular Geni 3D35M descrita en el adapta a niveles de metotrexato más altos para o de 96 cavidades que contienen medio con 2.0 rexato. Después de aproximadamente 4 seman ifican los clones y se selecciona el clon 3E1 sión. Las células 3E10B se cultivan en medió CD ene 4 mM de GlutaMAX-1™ y 2,0 µ? de metotrexato sajes. Se crea un banco de célula maestra (MCB celular 3E10B y se congela y utiliza para riores .

La amplificación de la línea celular c nte cultivo de células 3E10B en medio CD ene 4 mM de GlutaMAX-1™ y .0 µ? de metotrexato. ecirnosegundo pasaje, las células se congelan en un banco de célula para investigación (RCB) . Un CB se descongela y cultiva en medio que contiene etotrexato. Después de 5 días, la concentra rexato en el medio se incrementa hasta 16.0 µ?, s como un banco de célula para investigación (RC Las células 2B2 resultantes son células C ientes en cuanto a dihidrofolato reductasa (dhf san PH20 soluble recombinante de humano (rHuPH soluble está presente en las células 2B2 en un nú S de aproximadamente 206 copias/célula. El a rn blot de ADN de célula 2B2 genómico digerido ba I- y BamH I/Hind III utilizando una sonda esp rHuPH20 revela el siguiente perfil de diges icción: una banda de hibridación mayor de ~ 7. bandas de hibridación menores (-13.9, -6.6, b) con ADN digerido con Spe I; una banda de hibr de - 5.0 kb y dos bandas de hibridación menores 5 kb) con ADN, digerido con Xba I; y una sola b ación de -1.4 kb que se observa utilizando ADN EJEMPLO 6 A. Producción de rHuPH20 soluble Gen2 en ar en biorreactor de 300 litros Se descongela un frasco de HZ24-2B2 y se matraces agitadores hasta matraces giratorios s en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsba ementado con 20 µ? de metctrexato y Glu trogen) . Brevemente, el frasco de células se de baño de agua a 37 °C, se agrega el medio y las ntri fugan. Las células se vuelven a suspender z de agitación de 125 mi con 20 mi de medio nue an en una incubadora a 37 °C, 7% de C02. Las cél den hasta 40 mi en el matraz de agitación de o la densidad celular llega a más de 1.5 as/ml, el cultivo se expande en un matraz gírat o la densidad celular llega a más de 1.5 as/ml el cultivo se expande en un matraz girator S en un volumen de cultivo de 5000 mi y se i 7% de C02. Cuando la densidad celular llega a 106 células/ml el cultivo se expande en un orio de 36 litros en un volumen de cultivo de 32 incuba a 37 °C, 7% de C02.

Se esteriliza un reactor de 400 L y se agre medio CD-CHO. Antes del uso, el reactor se ins cto a contaminación. Se transfieren aproximadame as desde los matraces giratorios de 36 litros h eactor de 400 litros (Braun) a una densi lación de 4.0 x 105 células viables por mi y un de 260 litros. Los parámetros son punto de in ratura, 37 °C; velocidad del propulsor 40-55 RPM; recipiente: 0.21 kg/cm ; roción de aire sulina) . A las 168 horas (día 7), se agregan 10. dio de abastecimiento #2 (2 x CD-CHO + 33 g/1 de ml/1 de Glutamax-1™ + 167 ml/1 de "Yeastolate" e butirato de sodio) , y la temperatura del cul a a 36.5°C. A las 216 horas (día 9), se agreg d de medio de abastecimiento #3 (1 x CD-CHO + 50 sa + 50 ml/1 de Glutamax-1™ + 250 ml/1 de "Yeast g/1 de butirato de sodio) , y la temperatura del mbia a 36 °C. A las 264 horas (día 11) , se agreg s de medio de abastecimiento #4 (1 x CD-CHO + 33 sa + 33 ml/1 de Glutamax-1™ + 250 ml/1 de "Yeast g/1 de butirato de sodio) , y la temperatura del mbia a 35.5°C. Se observa que la adición del m ecimiento incrementa dramáticamente la produc 20 soluble en las etapas finales de producc or se cosecha a los 14 o 15 días o cuando la vi táltica a través de cuatro módulos de un sis ación Millistak (Millipore) en paralelo, ca ene una capa de tierra de diatomaceas graduada a capa de tierra de diatomáceas graduada a 1.4-do por una membrana de celulosa, después a travé do sistema individual de filtración M ipore) que contiene una capa de tierra de dia ada a 0.4-0.11 y una capa de tierra de dia ada a <0.1 µ??, seguido por una membrana de celu és a través de un filtro final de 0.22 ym ha flexible estéril de un solo uso con una capae litros. El fluido de cultivo celular cosec ementa con 10 mM de EDTA y 10 mM de Tris a un pH ltivo se concentra lOx con un aparato de filtra tangencial (TFF) utilizando cuatro filtros Sa TFF con corte de peso molecular MWCO) a 30 de Tritón X-100, 0.3% de TNBP durante 1 hor iente de reacción de 36 litros de vidrio inmedi de purificación en la columna Q.

B . Purificación de rHuPH20 Gen2 soluble Se prepara una columna de intercambio ióni psa (Pharmacia) (9 litros de resina, Altura = tro = 20 cm) . Las muestras de lavado se recolect eterminación de pH, conductividad y prueba de en . La columna se equilibra con 5 volúmenes de col 10 mM, 20 mM de Na2S04, pH 7.5. Después ivación viral, la cosecha concentrada, diafilt en la columna Q a una velocidad de flujo de 100 lumna se lava con 5 volúmenes de columna de Tris de Na2S04, pH 7.5 y HEPES 10 mM, 50 mM de NaCl , oteína se eluye con HEPES 10 mM, 400 mM de NaCl, a = 29 era, diámetro = 30 cm) . El lavado se reco rea para pH, conductividad y endotoxina (prueba na se equilibra con 5 volúmenes de columna de fos io 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M, 0.1 mM de C El eluato de proteína de la columna Q sefa ementa con soluciones de reserva de sulfato de fosfato de potasio 1 M y CaCl2 1 M para ntraciones finales de 5 mM, 0.5 M y 0 ctivamente. La proteína se carga en la columna' elocidad de flujo de 100 cm/hr y se recolecta e asa a través de la columna. La columna se l to de, potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M y Ca 0 a 100 cm/hr y el lavado se agrega al flujo ectado. Combinado con el lavado de columna, e te se hace pasar a través un filtro final de 0.2 ior de una bolsa estéril. El flujo pasante se fenilo a una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La va con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amo 7.0. La columna se lava con bicina 20 mM, sul o 0.5 M, pH 9.0. La columna se lava con bicina ro de sodio 100 mM, pH 9.0. La proteína se el 50 mM, 100 mM de NaCl, pH 6. y se pasa a travé o estéril al interior de una bolsa estéril. La a se analiza respecto a carga biológica, conce oteína y actividad de enzima.

Se prepara la columna de hidroxiapatit ad) . El lavado se recolecta y analiza pa ctividad y endotoxina (prueba LAL) . La col ibra con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, C pH 7.0. La proteína purificada con boron fenilo se complementa hasta concentraciones fin to de amonio 5 mM y CaCl2 0.1 mM y se carga La proteína purificada con HAP después a través de un filtro para remoción viral. El ilizado Virosart (Sartorius) se prepara primero litros de fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0. A la solución amortiguadora filtrada se muestrea ductividad. La proteína purificada con HAP se nte una bomba peristáltica a través del filt ión viral de 20 nM. La proteína filtrada en fos io 70 mM, pH 7.0 se hace pasar a través de un de 0.22 µp hacia una bolsa estéril. La muestra se analiza respecto a concentración de p idad de enzima, y determinación de per sacárido, monosacárido y ácido siálico. La én se analiza respecto a impurezas relacionadas dimiento .

La proteína en el filtrado después se c ína concentrada en la solución amortiguadora dina 10 ??? , NaCl 130 mM, pH 6.0. Después del int olución amortiguadora, la proteina concentrada a través de un filtro de 0.22 µp\ hacia una b enamiento de 20 litros estéril. La proteína se aliza para concentración de proteína, activ a, grupos sulfhidrilo libres, determinación de p sacárido y osmolaridad.

La proteína a granel estéril, filtrada des nsa asépticamente a 20 mi en frascos de teflón d iles (Nalgene) . Los frascos después se táneamente y se almacenan a -20 ± 5°C.

C . Comparación de la producción y purifica 20 Geni soluble y rHuPH20 Gen2 soluble La producción de purificación de rHuPH2 TABLA 30 iferencia de rHuPH20 Geni soluble rHuPH20 Gen2 s rocedimiento celular 3D35M 2B2 utilizado para Contiene 0.10 µ? de Contiene 20 µ? de dir el inoculo metotrexato (0.045 mg/L) metotrexato (9 mg/ ar en cultivo de Contains 0.10 µ? o contiene metotr ros en adelante methotrexate ces giratorios Sin instrumentación Equipado con L instrumentación qu monitorea y contro oxígeno disuelto, velocidad de flujo de cubierta.

Volumen de operación 20 L Volumen de operaci en final de Aprox. 100 L en un bio- Aprox. 300 L en un ción en el reactor de 125 L (volumen reactor de 400 L ( eactor de cultivo inicial + 65 de cultivo inicial L) de cultivo en Sin rHuInsulina 5.0 mg/L de rHuIns orreactor final en de los Se escala a 4% del Se escala a 4% del ecimientos de volumen de cultivo de cultivo celular celular del biorreactor biorreactor es dec es decir 3.4, 3.5 y 3.7 10.8, 11.2 y 11.7 L, lo que resulta en un resulta en un volu volumen objetivo de objetivo de biorre biorreactor de -92 ' L . -303 L. ecimientos de Medio de abastecimiento Medio de abastecim #1; CD CHO + 50 g/L de 4x CD CHO + 33 g/L Glucosa + 8mM de Glucosa + 32mM de GlutaMAX™-l + 16.6 g/L de Yeas 33 mg/L de rHuInsu TABLA 30 (cont . ) iferencia de ' rHuPH20 Geni soluble rHuPH20 Gen2 s rocedimiento ínea celular 3D35M 2B2 ación del Cuatro filtros de Ia etapa - cuatro VO celular del poliétersulfona {8.0 en paralelo, cada eactor µ??, 0.65 µt?, 0.22 µt? y una capa de tier 0.22 µt?) en serie diatomaceas grad 8 µ?? y una capa de diatomaceas g 1.4-1.1 µp?, segui una membrana cel 2a etapa - módulo individual que c una capa de tier diatomaceas grad 0.4-0.11 µt? y un tierra de diatom graduada a <0.1 seguido por una de celulosa. 3a etapa - filtro µp? de poliétersu Bolsa de almacen Bolsa de de 300 Litros almacenamiento de 100 Litros El cultivo célul cosechado se com con EDTA 10 mM, mM a un pH de 7. ntración e Concentrado con 2 TFF Concentrado útil cambio de con filtro de MWCO de cuatro filtros S TABLA 30 (cont . ) EJEMPLO 7 rminación de contenido de ácido siálico y monosa El contenido de ácido siálico y monos sacá soluble se puede evaluar mediante croma de fase inversa (RPLC) después de hidróli ota de 45 µ? de cada muestra re-suspendida a y se seca, y se agregan a cada uno 10 µ? ión de acetato de sodio 10 mg/ml . Los monos ados se marcan en forma fluorescente mediante la µ? de una solución que contiene 30 mg de ácido ico/ml, 20 mg de cianoborohidruro de s imadamente 40 mg de acetato de sodio/ml y 20 mg o/ml en metanol . La mezcla se incuba durante 30 °C en la oscuridad. La reacción para obten ado se detiene mediante la adición de 440 µ? de A (0.2% (v/v) de n-butilamina, 0.5% (v/v) d rico, 1% (v/v) de tetrahidrofurano) . Un tes Z de agua también se hidroliza y convierte en se describe para la muestra de hialuronidasa ol negativo. Los monosacáridos liberados se nte RPLC utilizando una columna de fase inv nta la relación molar de cada monosacárido por aluronidasa .

TABLA 31 Contenido de monosacárido de rHuPH20 soluble resultados para GalN están por debajo del límite de detección EJEMPLO 8 rogeneidad C- terminal de rHuPH20 soluble provenie células 3D35M y 2B2 Se efectúa la determinación de secuencia C- s lotes de sHuPH20 producidos y purificados a p minales se separan y caracterizan para determ ncia y abundancia de cada población en el lote H el lote HUB0701EB.

Se observa que las preparaciones de rHuPH20 ientes de las células 3D35M y de las célu ntan heterogeneidad, y contienen polipéptid ren de uno al otro en su secuencia C- terminal (T . Probablemente esta heterogeneidad es el resul C-terminal del polipéptido de 447 aminoácidos e ID NO: 4) por las peptidasas presentes en el m vo celular u otras soluciones durante el proce roducción y purificación. Los polipéptidos raciones de rHuPH20 soluble tienen secuenc ácido correspondientes a los aminoácidos 1-447, , 1-444 y 1-443 de la secuencia de rHuPH20 ada en SEQ ID NO: 4. Ia secuencia de aminoácido f EJEMPLO 9 mparación de la actividad de dispersión de difere enzimas degradadoras de hialuronano La capacidad de diferentes enzimas degradad onano para actuar como un agente de disper in vivo. Se utiliza una prueba de disper s para evaluar la capacidad de diferentes adoras de hialuronano para actuar como age rsión de azul de tripano, y también para eva idad de las enzimas para incrementar la efic ina coadministrada en la reducción de los niv sa sanguínea. Las enzimas degradadoras de hial das incluyen rHuPH20, PH20 modificada con P , Hyal 1, Condroitinasa ABC, Condroitinasa AC y 1 tomyces hyalurolyticus . Estas se mezclan con ( H 4.5) para actuar como un agente de dispersión Nueve grupos de ratones homocigotos NCr nu imadamente 10 semanas de edad y con pesos corpor g, con 3 ratones por grupo, se anestesian m ción intraperitoneal de cetamina/xilazina (mezc lución salina) . Después de esto, a los ratones istran 40 µ? de una enzima degradadora de hialur dades/ml de insulina Humulin® con 0.4% del co de Tripano mediante inyección intradérmica en l sobre el extremo caudal de las caja torácica. cluyen grupos de control a los que se les admin ina Humulin® sola, solución amortiguadora ión amortiguadora e insulina Humulin®. Específic atones del grupo 1 sola el control negativo y de tripano con una solución amortiguadora de pH atones del grupo 2 reciben azul de tripano es/ml de Hyal 1; los ratones del grupo 6 recib ipano con 5 Unidades/mi de insulina Humulin es/ml de Condroitinasa ABC (Associates of Cape th, MA) ; los ratones del grupo 7 reciben o con 5 Unidades/ml de insulina Humulin® y 1 un ndroitinasa AC (Associates of Cape Cod, E. Fa. los ratones del grupo 8 reciben azul de tripan es/ml de insulina Humulin® y 100 Unidades/ml d reptomyces hyalurolyticus (Calbiochem) ; los rato 9 reciben azul de tripano con 5 Unidades/ml de i in®. Después se mide la dispersión del colorante o utilizando un calibrador a 2.5, 5, 10, 1 s después de la inyección. El área de dispers nte (mm2) se calcula multiplicando el eje más l itud del frente del colorante) y M2 (anchura del olorante) por 1/4 p ( 1M2 x 1/4 p) . Los niv presentan diseminación mínima, con área de dis aria desde un promedio de aproximadamente 36 m inutos después de la inyección hasta aproximadam los 20 minutos después de la inyección. Cu ante azul de tripano se mezcla y suministra con i in®, Hyal 1, o PEG PH20, no hay un inc ísticamente significativo en el área de disper ración con la observada cuando el colorante se solución amortiguadora solamente. En contras a un incremento significativo en la ¦ dispers nte cuando se mezcla y suministra con r itinasa ABC, Condroitinasa AC o liasa de Stre rolyticus . El área de dispersión promedio del co de tripano cuando se mezcla y suministra con rHu roximadamente 45 mm2, 66 mm2, 80 mm2, 86 mm2 y 10 .5, 5, 10; 15 y 20 minutos después de la iny 5, 10, 15 y 20 minutos después de la in ctivamente. El área de dispersión promedio del o cuando se mezcla y suministra con li to yces hyalurolyticus es de aproximadamente 74 101 mm2, 103 mm2 y 130 mm2 a los 2.5, 5, 10, os después de la inyección, respectivamente.

TABLA 34 rio de la media de grupo de las áreas de dispers colorante (mm2) Artículo de Areas de dispersión de colorante {mm¿) prueba 2.5 min 5 min 10 min 15 min 2 Vehículo/control de solución 36.11 41.63 47.19 52.47 5 amor iguadora de pH neutro Solución amortiguadora de 33.34 34.47 41.88 44.91 5 pH bajo PEG PH20 (10 U/mL) 37.28 47.08 52.40 54.94 5 2. Niveles de glucosa sanguínea La tabla 35 indica la media de los niv sa sanguínea (mg/dl) después de la administra artículo de prueba. Los niveles de glucosa sangu es a los que se les administra colorante y S iguadora solamente, se incrementan desde un prom imadamente 212 mg/dl antes de la inyección imadamente 332 mg/dl a los 5 minutos después ción. Después de esto, los niveles se almente hasta aproximadamente 367 mg/dl a los 20 és de la inyección. Este incremento de glucosa s sencia de insulina se debe a un efecto bien cono anestésicos sobre la glucosa sanguínea en r e, por ejemplo, Saha et al., (2005) Exp. Bio 77-784) . Cuando se administra la insulina Humuli es de glucosa sanguínea se elevan brevemente h 20, PEG PH20, Condroitinasa ABC y liasa de Stre rolyticus parecen reducir los niveles incluso más o observado con la insulina Humulin®R sola.

TABLA 35 rio de la media de grupo de nivel de glucosa san (mg/dl) Artículo de Nivel de glucosa sanguxnea (mg/dL) prueba 0 min 5 min 10 min 15 min Vehículo/control de solución 212.00 332.00 344.00 3.61.33 amortiguadora de 3 pH neutro Solución amortiguadora de 196.67 259.67 249.33 231.33 2 pH bajo PEG PH20 (10 170.00 196.67 110.00 68.33 4 U/mL) rHuPH20 (10 165,67 173, 00 96.00 63.67 3 U/mL) Hyal I (10 155.67 201,33 144.33 77.00 s U mL) EJEMPLO 10 Modificación de rHuPH20 con PEG A. Conjugación de mPEG-SBA-30K a rHuPH20 Con el fin de generar una hialuronidasa sol O modificada con PEG, se conjuga covalentemente ual es de aproximadamente 60 KDa de tamaño) a u roxisuccinimidílico lineal de ácido etilenglicol) -butanoico (mPEG-SBA-30K) , que ti molecular aproximado de 30 kDa. La estructura d e muestra en el siguiente esquema 2: ESQUEMA 2 Una solución de malonato de etilo (2 equiva lto en dioxano se agrega mediante goteo a hid (2 equivalentes) y tolueno bajo una atmósf geno . Se disuelve metansulfonato de mP alente, PM 30 kDa, Shearwater) en tolueno y se mezcla anterior. La mezcla resultante se te aproximadamente 18 horas. La mezcla de reac ntra hasta la mitad de su volumen original, se olución acuosa de ÑaCl al 10%, se extrae co ídrico acuoso al 1%, y se combinan los ex os. Las capas acuosas recolectadas se extra rometano (3x) y la capa orgánica se seca con gnesio, se filtra y se evapora hasta seque uo resultante se disuelve en hidróxido de sodio ene cloruro de sodio y la mezcla se agita du El pH de la mezcla se ajusta hasta aproximadat lve en agua y se extrae con diclorometano ( con sulfato de magnesio, y la solución se co nte evaporación giratoria y después se vierte lico frío. El precipitado se recolecta m ación y se seca al vacío. El compuesto result alente) se disuelve en diclorometano y se ag xisuccinimida (2.1 equivalentes) . . La soluc a hasta 0°C y se agrega mediante goteo una s diciclohexilcarbodi- imida (2.1 equivalente rometano. La solución se agita a temperatura a te aproximadamente 18 horas. La mezcla de reac a, se concentra y se precipita en éter dietíl pitado se recolecta mediante filtración y se para obtener mPEG- SBA- 3 OK .

\. Para elaborar la rHuPH20 modificada con n mPEG-SBA-30K al grupo o grupos amino de ESQUEMA DE REACCION 3 H3CO CH2CH —rHuPH20 rHuPH20 modificado con PEG Para la conjugación, el mPEG~SBA-30K se ag de polvo a rHuPH20 (a una concentración de 10 m 130 mM/HEPES 10 m ; pH 7) . La relación PEG:rHuPH2 (relación molar) . Después que se disuelve el PE ión amortiguadora, la solución se esteriliza m tante, el cual se analiza con respecto a ac tica, como se describe en el ejemplo 2, anter utilizando NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6. r una actividad enzimática final de 100,000 U/ sponde aproximadamente a 2.5 mg de péptido/ml) ial de rHuPH20 modificada con PEG . se utiliz r, en volúmenes de 1 mi, frascos de vidrio de ti con sello de brombutilo, y se almacena co lado durante la noche en una congeladora a s se pone en una congeladora a -20° namiento a plazo más largo) .

B . Análisis de rHuPH20 modificada con PEG El material de rHuPH20 modificada con za mediante electroforesis en gel. Tres lotes de icada con PEG, elaborados como en el ejem icada con PEG, generada mediante conjugación c EG-SBA-30K, contiene una mezcla heterogénea de e uPH20 modificadas con PEG, que incluyen probab ínas modificadas con mono-PEG, di -PEG y tri-cia de una banda visible a 60 KDa sugiere que ina ha reaccionado con el PEG, y que no está 20 original detectable en la mezcla.

EJEMPLO 11 ecto de rHuPH20 sobre la farmacocinética de insu después de administración subcutánea en cerdos Para determinar si un modelo en cerdos pu iado o no para modelar la farmacocinética de i íales coadministradas con hialuronidasa reco ejemplo, rHuPH20) , se evalúa la farmacocinét aleatorizado . Cada animal recibe tres cic miento con todos los cuatro artículos de prue itar la comparación de la reproducibilidad cocinética de insulina a través de una serie de sificación. Se recolecta nuestras de sangre y e valúa para determinar los niveles de i oreactiva (IRI) . Después se determinan etros farmacocinéticos , incluyendo tmáX, Cm¾ al, t50% tardío, y ABCmáx- A . Dosificación y muestreo Se preparan soluciones de dosificación (o ar eba) de 100 U/ml de insulina lispro Humalog® o i in® R, con y sin 4800 U/ml de rHuPH20, de la si . Las 100 soluciones de insulina lispro Humalog® ina Humulin® R sola se preparan a partir d (Halozyme Therapeutics , Lote HUA0703MA) pa tración final de insulina lispro Humalog® de 91 ctividad de hialuronidasa de 5454 U/ml. Para prep ión de insulina Humulin® R/rHuPH20, se mezclan 20 /ml de insulina Humulin® R (Eli Lilly, Lote A3 l del producto farmacéutico rHuPH20 6000 U/ml (H 288004; el producto farmacéutico rHuPH20 contien uPH20 en NaCl 145 mM, Fosfato dibásico sódico ro de calcio 2.7 mM, EDTA Disódico 2.7 mM, 1 m lbúmina de humano, pH 7.4) para una concentració sulina de 100 U/ml y actividad de hialuronidasa 00 U/ml.

Las soluciones que contienen rHuPH20 se est te filtración y se utilizan para llenar fra o tipo I de 2 mi (Wheaton) y se sellan con tap (Stelmi) de 13 mm. Las soluciones que contienen Seis cerdos Yucatán adultos de género ma Farms , Ramona, CA) , pesando cada uno entre 2 ramos al inicio del estudio, se equipan con ca vena yugular o arteria carótida impl gicamente con orificios de acceso vascular ext iados para facilidad de muestreo de sangre a tr el estudio. Los animales se ponen en cuarentena s antes de la instrumentación y tratamiento ies se aleatorizan a dos grupos estudio como se siguiente tabla 36. Los animales se asignan a os grupos, cada uno conteniendo 3 animales por ignación se mantiene para los ciclos 1 y 2. ciclo de dosificación, dos animales se dan a la no patencia de la cánula, y los cuatro a tes se reasignan con sólo 2 animales por gru S de identificación de los animales del grupo ra de sangre de pretratamiento . Los animales ola dosis SC del artículo de prueba apropia el animal se mide antes de cada administraci minar con exactitud la dosis correcta) en un pr da tercer día. Cada animal recibe, una sola d SC de la insulina indicada (es decir, ya sea ins o) a 0.2 U/kg en cualquiera de un vehículo o ulación fresca de rHuPH20. Después istración del artículo de prueba, se extraen e da por lo menos 0.7-1.0 mi de sangre a los 3, 6, 0, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos. rna, un sangrado de pretratamiento (pre- sangrado administración. Las muestras de sangre se iatamente en tubos de suero que no co oagulante, se colocan sobre hielo durante un mí nutos, después se centrifugan a 9500 x g du TABLA 36 colo de dosificación para validación del modelo e Día de Día de Tratamiento del Tratamient dosi icación estudio grupo #1 grupo # 1 0 insulina lispro insulina Hun Humalog® 2 2 insulina insulina 1 Humulin® Humalog®/r R/rHuPH20 3 4 insulina insulina 1 Humulin® R Humalo 4 6 insulina lispro insulina Hu Humalog®/ HuPH20 R/rHuPH 5 8 insulina lispro insulina Hun Humalog® 6 10 insulina insulina 1 Humulin® Humalog®/r R/rHuPH20 7 12 insulina insulina 1 Humulin® R Humalo 8 14 . insulina lispro insulina Hu Humalog®/rHuPH20. R/rHuPH 9 26 insulina lispro insulina Hum Humalog® 10 28 Humulin® R insulina 1 Insulin/rHuPH20 Humalog®/r 11 30 insulina lispro insulina Hu Humalog®/rHuPH20 R/rHuPH istración de insulina lispro Humalog®, insulina og®/rHuPH20 , insulina Humulin® R o insulina PH20. La tabla 37 indicada en los niveles de basal, tal como se miden en las muestras ado. Estas líneas básales se restan después ntraciones de IRI reales medidas en cada punto de determinar la concentración de IRI ajustada par La media de los perfiles de concentración - tiempo para cada tratamiento (como se observa C can en una gráfica con la concentración de IRI en s Y contra el tiempo en el eje de las X) es si s de ciclos múltiples. En todos los cic icación, las farmacocinéticas de insulina og® e insulina Humulin® R se aceleran cua inistran por vía subcutánea en la formulac TABLA 37 Perfiles de concentración de IRI en suero- tiemp Concentraciones de IRI ajustadas con línea basal 0 0 0 0 0 0 8.1 25.2 65.5 79.3 0.7 3.0 113.0 20.6 46.1 110.3 84.6 2.9 7.1 161.6 21.5 40.9 166.0 122.5 3.7 10.9 168.1 40.6 71.6 143.0 99.0 7.3 20.7 166.0 52.3 78.4 262.2 215.5 11.2 32.8 155.6 80.4 125.6 265.3 169.2 22.6 33.7 210.8 93.6 92.5 263.3 190.0. 40.7 48.2 253.0 119.7 116.7 335.2 220.4 61.3 55.1 224.1 193.9 139.7 296.1 183.3 105.6 103.8 253.1 ina (Tabla 37, anterior) se utiliza para calcu entes parámetros farmacocinéticos : incluyendo tm inicial, t50% inicial, y ABCintervaio · Los pa cocinéticos se derivan utilizando an lis rtimental usando el modelo 200 en la versión nlin (Pharsight Corp., Mountain View, CA) . Los C isticos s efectúan utilizando la versión SAS 9.1 tute, Cary, NC) . Todos los análisis se e zando un modelo mixto con efectos fijo iento. Se considera una matriz de covarianza si ompuesto entre observaciones repetidas para cada álisis para CmáX y todos los puntos finales de an utilizando valores transformados logarítmi valores de cero emplazados por 1 antes formación logarítmica (cero en escala logarítmic s finales basados en tiempo se analizan en la ntrol para cada parámetro (% de control calcul a (geométrica o aritmética) del valor PK para i HuPH20] / [media (geométrica o aritmética) del v insulina sola] x 100) . Los cálculos de % de con en la media geométrica y el valor p para lo formados logarítmicamente para los parámetros Cmáx ras que los basados en la media aritmética y val formados para tm¾x y t50% inicial y tardío. N =16 c que se indique lo contrario.

La tabla 39 indica una comparación de par cocinéticos de insulina lispro Humalog® so cto a insulina Humulin® R con rHuPH20. Los cocinéticos se proveen como media ± desviación e También se provee el % de insulina lispro Húmal [media (geométrica o aritmética) del valor ina lispro Humalog® con rHuPH20] / [media (geomé TABLA 38 arámetros farmacocinéticos de insulina después de administración por vía subcutánea con o sin rHuPH intervalo (min x nmol/L) n 0.35 1.77 ± 1961 0.0004 0.06 2.06 ± 43542 + 1.24 ± 1.28 0.64 0.17 n 1.65 5.84 ± 763 0.0198 0.56 5.33 ± 1429 ± 3.59 + 3.30 2.07 0.73 6.7 14.2 ± 214 0.2776 3.4 12.1 ± 246 ± 8.6 ± 7.3 4.8 2.5 o 18.0 26.6 ± 146 0.1195 21.3 26.9 ± 116 ± 14.6 ± 16.0 8.8 12.1 ito 24.3 32.2 ± 117 0.5176 45.0 32.6 ± 88 ± 17. la ± 16.7a 8.6c 41.2c TABLA 39 arámetros farmacocineticos de insulina después de istración por vía subcutánea de insulina lispro H sola o insulina Humulin® R con rHuPH20 e intervalo (min x nmol/L) min 0.35±0.64 2.06±1.28 2698 <0.0001 min 1.65+2.07 5.33+3.32 744 0.0212 r 6.7+4.8 12.1+7.3 189 0.3646 imo 18.0±8.8 26.9±16.0 146 0.1196 inito 24.3+8.6b 32.6±16.6a 128 0.3179 r 12.2±6.8 15.0+10.1 121 0.4801 in® R o insulina lispro Humalog® sola) . Específic posición máxima (Cmáx) se incrementa 163% para i Humalog® (p = 0.0251) y 165% para insulina Hum 0.0218) cuando se administra con rHuPH20 con rel ontroles respectivos. El inicio de acción (t50% i elera desde 36 hasta 11 minutos para insulina g® (p = 0.0182) y desde 61 hasta 10 minut iría Humulin® R (p <0.0001). El tiempo de efecto se acelera desde 58 hasta 39 minutos para i Humalog® (p = 0.1963) y desde 94 hasta 38 minut ina Humulin® R (p = 0.0004). El t50% tardío se 110 hasta 52 minutos para insulina lispro Humalo 2) y desde 170 hasta 70 minutos para insulina Hut 0.0001). La exposición total (ABCinf) no se ficativamente para ninguna de insulina lispro control; p = 0.5176) o insulina Humulin® o Humalog® con rHuPH20 incrementa la veloci ción de insulina hacia el compartimiento vascu ración a cuando la insulina respectiva se su como queda demostrado por una reducción en el concentraciones de IRI en suero máximas (tm al, t50% tardío) , y un incremento en las concent xposición máxima (Cmáx) en comparación con i in® R o insulina lispro Humalog® solas. Ade ición acumulativa temprana (ABC0-30) se increment insulina lispro Humalog® como para insulina Hum o se coadministran con rHuPH20> comparación a cu istran solas.

El incremento en exposición máxima y acelera ición después de. la administración de cualqu ina lispro Humalog® e insulina Humulin® inistración de hialuronidasa se observan ampliame EJEMPLO 12 cocinética de insulina regular a dos dosis admin con y sin rHuPH20 por vía subcutánea Se evalúa la farmacocinética (PK) de i r, cuando se administra por vía subcutánea traciones diferentes, tanto sola como co-admin HuPH20, en el modelo porcino descrito en el ejem ior. Se efectúa un estudio de diseño cruzado de osis múltiples para comparar la farmacocinét ina regular a concentraciones de 20 y 100 U/ml, dministra sola, con las mismas dos concentr és de la co-administración con rHuPH20. En cada c Ístra un total de 0.2 U/kg de insulina.

A. Dosificación y muestreo 0 (designados Insulina-PH20 U20 e Insulina-PH2 tivamente) . El artículo de prueba Insulina a diluyendo insulina Humulin® R (100 U/ml 66A; Eli Lilly) 1:5 con diluyente estéril (Eli tículo de prueba Insulina U100 es insulina Hum /ml; Lote A509721; Eli Lilly) sin diulir. El artí Insulina-PH20 U20 contiene 0.74 mg/ml (20 U ina regular (Lote # SIHR107; Diosynth Biotechnolo /ml (aproximadamente 2400 U/ml) de rHuPH20 en Cl 120 mM, 0.01% de Polisorbato 80, pH 7.3. El a. ueba Insulina-PH20 U100 contiene 3.69 mg/ml (10 insulina regular (Lote .# SIHR107; D hnologies) y 20 yg/ml (aproximadamente 2400 U 0 en Tris 25 mM, NaCl 120 mM, 0.01% de Polisorb .

A seis mini-cerdos Yucatán adultos de i recibe dos ciclos de tratamiento con todos los los de prueba para facilitar la comparación ducibilidad de la farmacocinética de insulina a a serie de ciclos de dosificación.

Los artículos de prueba se administran t nea (SC) en el flanco izquierdo de cada cerdo línea central del cuerpo. Cada animal recibe un io SC individual de la insulina indicada a 0.2 otocolo de cada tercer día. Para los artículos de ina U20 e Insulina-PH20 U20, se administran 10.0 los artículos de prueba Insulina U100 e Insuli se administran 2.0 µ?/kg. Se recolectan mues e (volumen de 0.7-1.0 mi) antes de la adminis sangrado), después a los 3, 6, 9, 12, 15, 20, 0, 90, 120, 180 y 240 minutos post-administraci ras de sangre se colocan en tubos para suero TABLA 40 Protocolo de dosificación B . Niveles de insulina en suero Se determinan las concentraciones de IRI e cada muestra de suero mediante interpolación a pa urva patrón utilizando el software para an l StatLIA® (Brendan Technologies, Carlsbad, Se comparan los perfiles de concentrac ina-tiempo después de cada ciclo de dosificaci grupo de tratamiento. Los perfiles de la m tración de IRI en suero-tiempo para cada arti , tal como se observan cuando se grafican ca con las concentraciones de IRI en el eje d tiempo en el eje de las X) son similares a tr ciclos. En ambos ciclos de dosificaci cocinética de insulina se acelera cuando istra por vía subcutánea con la formulación de ambas concentraciones. Se construyen ísticos adicionales que incluyen efectos fij iento, secuencia, ciclo, la interacción tratamie , y animal dentro de la secuencia para ientes de los ciclos 1 y 2 para par ocinéticos primarios y secundarios (los par les .

TABLA 41 Perfiles de concentración de IRI en suero- tiemp Concentraciones de IRI ajustadas con línea basal 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 139.7 472.2 63.1 73.4 2.2 5.6 49.4 74.2 234.6 178.7 269.3 8.1 17.6 88.8 206.3 594.2 122.0 101.3 12.9 30.9 144.5 93.0 166.7 181.5 150 , 5 36.9 58.0 182.1 83.1 116.2 214.4 151.5 58.6 76.9 225.3 136.3 180.8 367.1 590.3 85.1 109.6 251.8 139.1 147.7 247.3 161, 1 174.5 262.2 285.7 C. Farmacocihética de insulina Se utiliza el perfil de concentración de i o después de sustraer la concentración de insu basal (Tabla 41, anterior) para calcular los sig etros farmacocinéticos : incluyendo tmáx, Cm¾ l, so% rdlO, y ABCintervalo · Los datos de IRI e tiempo se modelan mediante análisis no compart zando inNonlin Professional modelo 200 (Versi ight Corp. , Mountain View, CA) y se calcul tros f rmacocinéticos . Se efectúan cálcul ística y comparaciones estadísticas entre zando SAS versión 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC) nálisis se efectúan utilizando un modelo mi s fijos para tratamiento. Se considera una ma ianza simétrica de compuesto entre observ idas para cada animal. Los análisis para Cmáx e Insulina-PH20 U100. Los diversos par ocinéticos para cada insulina suministrada sol 0 se muestran como Media ± desviación estándar ( bla también se provee el % de control par tros (% de control = [valor farmacocinétic ina con rHuPH20] / [valor farmacocinético para i x 100) . Los cálculos de % de control se basa geométrica y el valor p para datos logarítmi formados para los parámetros Cmáx y ABC, mientras los de % de control se basan en la media aritm s no transformados para tmáx y t5o% inicial y tard dos a menos que se indique lo contrario .

TABLA 42 arámetros farmacocinéticos de insulina después de administración por vía subcutánea con o sin rHuPH TABLA 42 (cont.) lo AUC (min x nmol/L) 11 animales 10 animales 8 animales 9 animales ina con un incremento en la concentración má ina y mayor exposición a insulina acumulativ almente como, en un grado menor, global. Con rel nyecciones de control de 100 U/ml, la reducció ntración hasta 20 U/ml 1) incrementa Cmáx en 91% a a media geométrica de 158 hasta 302 pmol/1; 2) re de t50% inicial desde 35 hasta 23 minutos, tmáx d 57 minutos, y t50% tardío desde 109 hasta 84 mi crementa la media geométrica de ABC0-is en 300% d 80, ABCo-30 en 256% desde 222 hasta 791, y ABC desde 9,021 hasta 20,820 todo en unidades de La co-administración de insulina reg ier concentración con rHuPH20 también resu ción más rápida después de inyección subcutá ión a insulina sola. Sin embargo, a la concentrac la media de t50% inicial desde 35 hasta 12 minu 3), mientras que tmáx y t50% tardío no ficativamente ; y 3) incrementa la media geomét 70 veces desde 20 hasta 1438 (p<0.0001), AB desde 222 hasta 5337 (p = 0.0015), y ABCúitimo 250 hasta 31,905 (p = 0.0038) todos en unidades de , en comparación con la administración de insuli concentración de 100 U/ml.

A la concentración más baja de insulina de 2 oadministración con rHuPH20 da como resulta entes efectos sobre la farmacocinética de insul ración con la administración de insulina sola: 1) tera significativamente con medias geométricas d mol/1 (p=0.84); 2) la media de t50% inicial t desde 23 hasta 12 minutos (p = 0.16), mientras tardío no cambian significativamente; y 3) l ?? 1) y el estudio en cerdo (ejemplo 10) previos tados también demuestran que la cinética de i n se puede acelerar . mediante administración tración más baja, lo cual es consistente con un iación del hexámero de insulina limitante idad lo cual depende de la concentración, (e la insulina se administra por vía subcutáne se absorbe cuando se disocia desde un hexámer ros, un proceso que ocurre a concentraciones má sulina) . Cuando se coadministra con rHuPH20 encia en la concentración de insulina se reduce o incluso se elimina. Por lo tanto, el sante de la hialuronidasa de la coadministra 0 con insulina puede reducir la desacelerac a en la farmacocinética de insulina que se obse ección de insulina a concentraciones más altas. nando rHuPH20 (10 mg/ml en histidina/HCl , H 6. ??) con- seis concentraciones diferentes de NaCl, etilparabeno (Fluka) . Cada formulación contiene 1 uPH20, 25 mM de Tris, pH 7.3, 0.01% de Twee iera de 0, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM o 25 con o sin 0.2% de metilparabeno. Se toman alicu oluciones y se colocan en frascos de vidrio tipo n tapones de hule y se sellan con tapas de te el estudio. Un conjunto de frascos se almacena te cuatro días, y el otro conjunto se mantien gerador a 2-8 °C para que sirva como un control po és las muestras se analizan respecto a activ ronidasa (enzimática) . Para evaluar el ni ados, se efectúa cromatografía por exclusión de utilizando una columna G2000 SWXL (Tosoh Bios siguientes condiciones con PBS IX como s 20 es sensible a la concentración de NaCl . En o las formulaciones se incuban a 40° C, a med uye la concentración de NaCl, disminuye la ac ática de rHuPH20. Sin embargo, cuando se alma gerador a 2-8 °C, la rHuPH20 retiene actividad enz endientemente de la formulación. A temperatura e el NaCl se elimina completamente de la soluc e la actividad completa de rHuPH20, ya sea q te o no metilparabeno. La pérdida de ac tica se reduce a medida que se increme tración de NaCl. Existe una diferencia significa idad enzimática (prueba "t" apareada, P = 0.0228 ras con y sin metilparabeno agregado.

Se observa una correlación similar de concen .Cl y los niveles agregados de rHuPH20. Los niv do se incrementan al disminuir la concentración ficativamente en formulaciones que c parabeno en comparación con las formulaciones enen metilparabeno. Además, dentro del inter ntración de NaCl analizado (0-250 mM) , exis ión directa entre la concentración de NaCl y est tentada de rHuPH20.

TABLA 43 vidades enzimáticas y resultados de SEC de las mu almacenadas 4 días a 40°C y 4°C lación Actividad % de pico % de pic enzimática principal agrega • (U/mL) 4°C 40°C 4°C 40°C 4°C aCl, de MP 12410 <LOD 99.65 0 0.35 50mM, de MP 12470 2990 99.22 2.86 0.78 lOOmM, de MP 12380 3530 100 13.32 0 150mM, de MP 13510 6200 100 26.31 0 EJEMPLO 14 Co-formulaciones de insulina y rHuPH20 Se efectúa una serie de estudios para eva ilidad de rHuPH20 e insulina bajo diversas condi como diversas temperaturas y pH, y formulaciones 1. Efecto de osmolaridad y pH sobre rHuPH20 En el primer estudio, se evalúa el efecto aridad y pH pH sobre la estabilidad de ulada como Hylenex recombinante (Inyecci ronidasa humana) preparando formulacione traciones de sal y valores de pH variables, y e uier pérdida de actividad después de almacenamien ciones refrigeradas (5°C) , aceleradas (25° ciones de estrés (25°C, 35°C y 40°C) hasta por 3 se describió anteriormente. También se deter ido de rHuPH20 mediante RP-HPLC.

No se observan cambios significativos iones de almacenamiento recomendadas (5°C) o ace o 30 °C) para las cuatro soluciones preparadas s de especificación de pH y osmolalidad o la s trol a las condiciones almacenamiento recomenda a que rHuPH20 es estable a pH 7.4 y en t les más estable bajo condiciones ácidas que b omo se evalúa mediante pérdida de actividad de e a de contenido de rHuPH20. El efecto de la es más modesto. A temperaturas elevada laciones que contienen, fuerza iónica más alta igeramente más estables que aquellas con fuerza aja. Existe un decremento significativo en esta 35°C y 40°C.

TABLA 44 (cont.) 2. Efecto del pH sobre rHuPH20 Se evalúa el efecto de variar el pH del iguador sobre la estabilidad de rHuPH20. Se 20 (1,200,000 U/ml, 10 mg/ml) en NaCl 130 mM, hi , con un pH de 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 o 7. laciones se almacenan después a 5°C durante 0, 3, ses; 25 °C con 60% de humedad relativa durante 0, idad enzimática . 3. Efecto del H y conservador sobre iada con análogos de insulina Para evaluar el impacto del pH y conservado tabilidad de rHuPH20 formulada con análogos de i diciones refrigeradas (5°C) , aceleradas (30°C y 3 enamiento (25°C) con agitación hasta por 4 s 20 se combina con insulina lispro Humalog® o i t Novolog® y se evalúa la actividad y esta ática. La estabilidad de insulina se evalúa media Los artículos de prueba se preparan con 10 \i 20, 100 U/ml de análogo de insulina, NaCl 140 mM 0 mM con cualquiera de 0.2% de fenol; 0.2% de m- de parabeno; 0.2% de fenol y 0.1% de F68; o y 1 mM de benzoato. Cada una de estas formulaci nados a 5°C, y 25°C con agitación.

Se observa que la actividad de rHuPH20 no da por el conservador o el pH después de 4 sei Bajo condiciones de estrés con agitación (20 idad de rHuPH20 no se ve afectada cuando se co insulina aspart Novolog® y cualquiera rvadores a cualquiera de los pH analizad aste, en algunas formulaciones con insulina g®, tal como cuando se formula con 0.02% de fe 1 o fenol/benzoato, la actividad de rHuPH20 despu se reduce hasta en un 75%, muy típicamente a med ncrementa el pH. Esta pérdida de activi laciona con la precipitación de insulina g® .

La tabla 45 muestra la actividad de rvada en cada uno los artículos de prueba des macenamiento . Aunque la solubilidad de insulina og® se conserva a pH 7.5 después de 4 semanas a ina lispro Humalog® precipita a pH más bajo (7.0 a temperatura. También se observa precipitaci ciones de estrés con agitación después de 6 horas TABLA 45 vidad de rHuPH20 que se conserva después de 4 sem y 35°.C en formulaciones de análogo de insulina/r lación pH Actividad remanente de rHuPH20 (%) 30°C 35°C insulina insulina insulina ins lispro aspart lispro asp Humalog® Novolog® Humalog® Nov 7.0 92 92 77 74 7.25 89 92 71 69 7.5 91 92 69 60 sol 7.0 82 78 40 29 7.25 85 81 29 21 7.5 77 71 11 9 eno 7.0 90 89 29 34 7.25 90 89 20 22 7.5 81 79 8 10

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento se co novedad y por lo tanto se reclama como propi nido en las siguientes REIVIND CACIONES 1.- Una composición de insulina de acció , que comprende: una concentración terapéuticamente efecti er los niveles de glucosa sanguínea normales ina de acción rápida; y una concentración de una enzima degrada onano suficiente para hacer que la composición ición de insulina de acción súper-rápida des dicación 1, caracterizada porque la concentración de insulina de acción rápid e aproximadamente 10 U/ml hasta o aproximadament /ml de insulina; y la concentración suficiente de una adora de hialuronano para hacer que la composic composición de insulina de acción súper ráp nalmente equivalente a por lo menos o aproximada 2 U/ml, 3 U/ml, 4 U/ml, 5 U/ml, 6 U/ml ,7 U/ml, l, 10 U/ml, 15 U/ml, 20 U/ml o 25 unidades de ac luronidasa/ml . 3. - La composición de conformidad c dicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada ncentración suficiente de una enzima degrada onano para hacer que la composición sea una comp nsulina de acción súper-rápida es funcion tración de insulina de acción rápida es d imadamente 10 U/ml, 20 U/ml, 30 U/ml, 40 U/ml, 5 1, 70 U/ml, 80 U/ml, 90 U/ml, 100 U/ml, 150 U/ 250 U/ml, 300 U/ml , 350 U/ml, 400 U/ml, 450 U/m 6. - La composición de conformidad con cualqu reivindicaciones 1-5, caracterizada porq tración de enzima degradadora de. hialuron onalmente equivalente a o aproximadamente a 1 3 U/ml, 4 U/ml, 5 U/ml, 6 U/ml ,7 U/ml, 8 U/ml, mi, 15 U/ml, 20 U/ml, 25 U/ml, 30 U/ml, 35 U/m 40 U/ml, 50 U/ml, 60 U/ml, 70 U/ml, 80 U/ml, 9 /ml, 200 U/ml, 300 U/ml, 400 U/ml, 500 U/ml, 60 /ml, 800 U/ml, 900 U/ml, 1000 U/ml, 2000 U/m o 5000 U/ml. 7. - La composición de conformidad con cualqu 10. - La composición de conformidad con cua s reivindicaciones 1-6 que se formula para su te una pluma de insulina. 11. - La composición de conformidad con cua s reivindicaciones 1-6 que se formula para sum te una bomba de insulina. 12. - La composición de conformidad con cua as reivindicaciones 1-11/ caracterizada porq es de glucosa sanguínea son niveles de glucosa sa ial. 13. - La composición de conformidad con cua s reivindicaciones 1-12, que contiene una C uticamente efectiva de insulina en una dosis ind s o es de aproximadamente 0.05 unidades, 0.06 un unidades, 0.08 unidades, 0.09 unidades, 0.1 un nidades, 0.3 unidades, 0.4 unidades, 0.5 unidad des, 0.5 unidades, 1 unidad, 2 unidades, 5 unida des, 20 unidades, 30 unidades, 40 unidades, 50 u nidades, 150 unidades, 200 unidades, 250 unidad des, 350 unidades, 400 unidades, 450 unidade des, 600 unidades, 700 unidades, 800 unidade des, 1000 unidades, 2000 unidades, 3000 unidade des o más de actividad de hialuronidasa . 15. - La composición de conformidad con cua S reivindicaciones 1-14, que comprende también un dientes opcionales que se seleccionan a partir de ente quelante, zinc, un estabilizador, un conse urador de oxígeno . 16. - La composición de conformidad con cua S reivindicaciones 1-15, caracterizada porque el sulina se selecciona a partir de entre una insul una cadena A con una secuencia de aminoácidos i 19. - La composición de conformidad con cu s reivindicaciones 1-18, caracterizada porque la dadora de hialuronano es una hialuronidasa. 20. - La composición de conformidad con cua as reivindicaciones 1-19, caracterizada por ronidasa tiene una secuencia de aminoácidos indi iera de SEQ ID NOS: 1-39 o 67-96, o formas trunc ismas o variantes alélicas, variantes de especie tes de las mismas que tienen 60%, 70%, 80%, 90 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de ident cia con el polipéptido indicado en SEQ ID NO: van actividad de hialuronidasa. 21. - La composición de conformidad dicación 19 o la reivindicación 20, caract la hialuronidasa es una hialuronidasa soluble. 22. - la composición de conformidad cia de aminoácidos indicada en cualquiera de 4-9 que tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia éptidos indicados en cualquiera de SEQ ID NOS: onservan actividad de hialuronidasa. 25. - La composición de conformidad con cu as reivindicaciones 21-24, caracterizada por ronidasa es una hialuronidasa soluble provista c sición designada rHuPH20. 26. - La composición de conformidad con cu s reivindicaciones 1-25, caracterizada porque la dadorá de hialuronano es una condroitinasa . 27. - La composición de conformidad ndicación 26, caracterizada porque la condroiti ciona de entre el grupo que consiste de condroit , condroitina AC liasa y condroitina C liasa. ndicaciones 1-27. 31. - Una pluma de insulina, que compre sición de conformidad con cualquiera d ndicaciones 1-27. 32. - Un sistema de bucle cerrado para contro es de glucosa sanguínea en un individuo, que comp una insulina de acción rápida; y una dadora de hialuronano; caracterizado porque la insulina de acción rápida y la dadora de hialuronano están en el mismo depósi itos diferentes. 33. - El sistema de bucle cerrado de conformi ivindicación 32, que comprende también uno o má tor ' de glucosa, un sistema de suministr istrar la enzima degradadora de hialuronano ina de acción rápida, y software programad 35. - El sistema de bucle cerrado de conformi eivindicaciones 32-34 , caracterizado porque la i ción rápida es una insulina humana de acción rápi 36. - El sistema de bucle cerrado de conformi iera de las reivindicaciones 32-35, caract e la insulina de acción rápida es un anál ina . 37. - El sistema de bucle cerrado de conformi ivindicación 36, caracterizado porque el aná ina se selecciona de entre una insulina con una c na secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO adena B con una secuencia de aminoácidos indi iera de SEQ ID NOS : 147-149. 38. - El sistema de bucle cerrado de conformi iera de las reivindicaciones 32-37, que co én una o más insulinas adicionales. des, 0.7 unidades, 0.8 unidades, 0.9 unidades, 1 idades, 5 unidades, 10 unidades, 15 unidad des, 25 unidades, 30 unidades, 35 unidades, 40 u idades, 100 unidades, 200 unidades, 300 unidad des, 500 unidades, 600 unidades, 700 unidad des, 900 unidades, 1000 unidades, 2000 unidade des, 6000 unidades, 7000 unidades o más de insuli 41.- El sistema de bucle cerrado de conformi iera de las reivindicaciones 32-40, caract e el sistema puede suministrar la insulina de a en incrementos de dosis individuales desd imadamente 0.1 unidades, 0.2 unidades, 0.3 unidad es, 0.5 unidades, 0.6 unidades, 0,7 unidade es, 0.9 unidades, 1 unidad, 2 unidades, 5 unida es, 15 unidades, 20 unidades, 25 unidades, 30 un idades, 40 unidades, 50 unidades o más de insulin des, 250 unidades, 300 unidades, 350 unidad des, 450 unidades, 500 unidades, 600 unidad des, 800 unidades, 900 unidades, 1000 unidade des, 3000 unidades, 4000 unidades, 5000 unidade des, 7000 unidades, 8000 unidades, 9000 unidades, des, 20,000 unidades o más de activi ronidasa . 43.- El sistema de bucle cerrado de conformi iera de las reivindicaciones 32-42, caract e el sistema puede suministrar la enzima degrada ronano en incrementos de dosis individuales dad de enzima degradadora de hialuronano onalmente equivalente a o aproximadamente des, 0.5 unidades, 1 unidad, 2 unidades, 3 unid des, 10 unidades, 20 unidades, 30 unidades, 40 u idades, 100 unidades, 150 unidades o más de activ terizado porque la insulina de acción rápida es una i inante de humano o un análogo de insulina. 45.- Un método para mantener los niveles de ínea normales en un individuo, que comprende admi osis unitaria de una composición de conformi iera de las reivindicaciones 1-27 al in terizado porque la composición se administra en oximadamente 20, 10 o 5 minutos antes de un al menos de o aproximadamente 10 minutos después nto o con el alimento. 46.- Un método para mantener los niveles de ínea normales en un individuo, que comprende admi osis unitaria de una composición de conformi uiera de las reivindicaciones 1-27 al in terizado porque la composición se administra en ndicaciones 45-47, caracterizado porque la com dministra al individuo mediante jeringa, bo ina, pluma de insulina o sistema de bucle cerrado 49.- El método de conformidad con cualquiera ndicaciones 45-48, caracterizado porque la com ministra mediante una vía que se selecciona de e subcutánea, intradérmica e intraperitoneal . 50.- Una combinación, que comprende: una primera composición que contiene desde imadamente 10 unidades hasta o hasta aproximadame des de insulina; y una segunda composición que contiene conce iente de enzima degradadora de hialuronano que, ministra con la insulina, hace que la composi ina de acción rápida sea una insulina de acción a; caracterizado porque s de una vía que se selecciona de entre subc eritoneal e intradérmica . 51. - La combinación de conformidad ndicación 50, caracterizada porque la conce iente de enzima degradadora de hialuron onalmente equivalente a por lo menos o aproxima 35 unidades de actividad de hialuronidasa/ml. 52. - La combinación de conformidad dicación 50 o la reivindicación 51, caract e la cantidad de insulina de acción rápida en la sición es de o de aproximadamente 10 U/ml, 20 U 40 U/ml, 50 U/ml, 60 U/ml, 70 U/ml, 80 U/ml, 9 /ml, 150 U/ml, 200 U/ml , 250 U/ml, 300 U/ml, 35 /ml, 450 U/ml o 500 U/ml. 53. - La combinación de conformidad con cua as reivindicaciones 50-52, caracterizada por 54. - El uso de una composición de conformi uiera de las reivindicaciones 1-27, para prep amento para mantener los niveles de glucosa s ies en un individuo. 55. - El uso de una combinación de conformi uiera de las reivindicaciones 50-53, para prep amento para mantener los niveles de glucosa s ies en un individuo. 56.- Un método para mantener los niveles de les en un individuo, que comprende administ nación de conformidad con cualquiera d dicaciones 50-53 l individuo. 57.- Un estuche que comprende la composi rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- ación de conformidad con cualquiera d dicaciones 50-53, y opcionalmente instrucciones.