MX2010011722A - Composiciones de swolenina y metodos para incrementar la eficiencia de una celulasa. - Google Patents
Composiciones de swolenina y metodos para incrementar la eficiencia de una celulasa.Info
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Abstract
Se describen composiciones y métodos relacionados con el incremento de la eficiencia de celulasas para la producción de azúcar a partir de biomasa celulósica mediante el uso del polipéptido swolenina.
Description
COMPOSICIONES DE SWOLENINA Y METODOS PARA INCREMENTAR LA EFICIENCIA DE UNA CELULASA
Campo de la Invención
Las composiciones y métodos se relacionan con el incremento de la eficiencia de una celulasa en la producción de azúcares a partir de biomasa celulósica mediante el uso del polipéptido swolenina.
Antecedentes de la Invención
El interés en etanol como un combustible renovable es más fuerte que antes. El uso de etanol como un aditivo de combustible ha crecido en los últimos años y se espera que continúe su crecimiento en el futuro previsible. El uso de etanol reduce la dependencia de petróleo del extranjero, reduce las emisiones de gases de invernadero, provee beneficios económicos pata comunidades rurales y establece una base para una economía de base biológica.
Los materiales de alimentación potenciales para etanol celulósico incluyen rastrojo de maíz, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, paja de arroz, pulpa de papel, viruta de madera y biomasa de "cultivo de energía" tales como árboles y pastos de rápido crecimiento (pasto aguja, pasto de praderas, pasto elefante) , que expanden drásticamente el material disponible para la producción de etanol. Aunque la
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biomasa celulósica está disponible en grandes cantidades, el principal desafío para la comercialización es reducir los costos de un proceso de bio-refinería integrado que finalmente produce etanol . A diferencia del almidón, que contiene polímeros homogéneos y fácilmente hidrolizados , los sustratos/materiales de alimentación celulósicos típicos para usarse en la producción de etanol no son de naturaleza homogénea. Además de contener celulosa convertible y hemicelulosa, también contienen lignina y otros componentes que no pueden ser fácilmente convertidos a azúcares fermentables .
Típicamente, la biomasa en bruto debe ser extensivamente pre-tratada químicamente, físicamente o biológicamente para producir un sustrato/material de alimentación adecuado para la producción de etanol. Técnicas de pre-tratamiento físico incluyen uno o más de varios tipos de molienda, trituración, y radiación, vaporización/explosión de vapor e hidrotermólisis . Las técnicas de pre-tratamiento químico incluyen ácido, álcali, solvente orgánico, amoniaco, dióxido de azufre, dióxido de carbono e hidrotermólisis controlada por pH.
Persiste una urgente necesidad de reducir la cantidad de enzima hidrolítica necesaria para convertir la biomasa a azúcar fermentable y/o para disminuir la cantidad de pre-tratamiento necesario para hacer la biomasa accesible
a la enzima hidrolítica.
Sumario de la Invención
En un aspecto, se provee un método para incrementar la eficiencia de una celulosa, el método comprende a) combinar un sustrato celulósico, una cantidad de una celulasa y una cantidad de una swolenina y (b) incubar el sustrato celulósico, composición de celulosa mezclada y swolenina bajo condiciones que conducen a hidrólisis de celulosa. En una implementación preferida, el sustrato celulósico incluye moléculas unidas a hidrógeno. El sustrato celulósico se puede seleccionar del grupo que consiste de madera, pulpa de madera, lodo de fabricación de papel, corrientes de desechos de pulpa de papel, tabla hecha de partículas, rastrojo de maíz,, fibra de maíz, arroz , desecho de procesamiento de papel y pulpa, plantas leñosas o herbáceas, pastos, cáscaras de arroz, paja de algodón, mazorcas de maíz, granos de destilería, hojas, paja de trigo, pelo de coco, pasto aguja y mezclas de los mismos.
En un aspecto relacionado, se provee un método para incrementar la eficiencia de hidrólisis de celulosa mediante el uso de una celulosa, el método comprende: a) combinar un sustrato celulósico, una composición de celulasa y swolenina recombinante , y b) incubar el sustrato celulósico, composición de celulasa y suolanina bajo condiciones que
conducen a hidrólisis de celulosa, en donde la presencia de swolenina recombinante incrementa la eficiencia de hidrólisis de celulosa por la composición de celulasa comparada con aquella obtenida mediante el uso de la composición de celulasa en ausencia de swolenina.
En algunas modalidades, la composición de celulasa es una composición de celulasa entera. En algunas modalidades, la composición de celulasa es una composición de celulasa mixta. En algunas modalidades, la composición de celulasa comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una ß . -glucosidasa .
En algunas - modalidades, la composición de celulasa comprende una o más celulasas primarias. En algunas modalidades, la composición de celulasa consiste esencialmente de una o más celulasas primarias. En modalidades particulares, las celulasas primarias se seleccionan de CBH1, CBH2 , EG1 , EG2 , y ß-glucosidasa .
En algunas modalidades, el método se lleva a cabo en ausencia de enzimas accesorias distintas a la Swolenina.
En algunas modalidades, el método se lleva a cabo en ausencia de EG4 y CIP1. En algunas modalidades, el método se realiza en ausencia de EG4 recombinante o CIP1 recombinante. En algunas modalidades, el método se lleva a cabo en ausencia de EG4 recombinante y CIP1 recombinante.
En algunas modalidades, la relación de celulasas en la composición de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 1:5. En algunas modalidades, la relación de celulasas en la composición de celulasas a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:2. En algunas modalidades, la relación de celulasas en la composición de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 5 : 1 y aproximadamente 1:1.5.
En algunas modalidades, la swolenina y las celulasas están presentes en una cantidad aproximadamente igual (p:p). Cantidades ilustrativas de swoleninas son de aproximadamente 30% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, y de aproximadamente 50%, de las enzimas usadas en el método (p/p) .
En algunas modalidades, el sustrato celulósico se selecciona del grupo que consiste de madera, pulpa de madera, lodo de fabricación de papel, corriente de desechos de pulpa de papel, tabla hecha de partículas, rastrojo de maíz, fibra de maíz, arroz, desechos de procesamiento de papel y pulpa, plantas leñosas o herbáceas, pastos, cáscaras de arroz, paja de algodón, mazorca de maíz, granos de destilería, hojas, paja de trigo, pelo de coco, pasto aguja y mezclas de los mismos. En algunas modalidades, el sustrato celulósico es una madera blanda. En algunas modalidades, el sustrato celulósico es sustrato con alto contenido de lignina. En algunas
modalidades, el sustrato celulósico tiene un número kappa de 80 o superior.
En algunas modalidades, el por ciento de incremento de eficiencia de celulasa es por lo menos aproximadamente 10%, por lo menos aproximadamente 15%, o incluso por lo menos aproximadamente 20%.
En otro aspecto, se provee una composición de enzima, que comprende una composición de celulasa mixta o entera y una swolenina. La relación de celulasa mixta/entera a swolenina (p¡p) puede ser entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 1:5, inclusive. La relación de celulasa mixta a swolenina (p:p) puede ser entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:2, inclusive. La relación de celulasa mixta a swolenina (p:p) puede ser entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 1:1.5, inclusive.
En un aspecto relacionado, se provee una composición de enzima, que comprende: (a) una composición de celulasa mixta que comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una ß-glucosidasa, y (b) swolenina recombinante .
En algunas modalidades, la composición no incluye EG4 o CIP1. En algunas modalidades, la composición no incluye EG4 recombinante o CIP1 recombinante. En algunas modalidades, la composición no incluye EG4 recombinante y no incluye CIP1 recombinante.
En algunas modalidades, la composición de celulasa mixta consiste esencialmente de celulasas primarias.
En oto aspecto relacionado, se provee una composición de enzima, que consiste esencialmente de: (a) una composición de celulasa mixta que comprende una endoglucanasa , una celobiohidrolasa, y una ß-glucosidasa, y (b) swolenina recombinante .
En algunas modalidades, la relación de celulasas en cualquiera de las composiciones de celulasa mixta a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 1:5. En algunas modalidades, la relación de celulasas en cualquiera de las composiciones de celulasa mixta a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:2. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 20-25, en donde la relación de celulasas en cualquiera de las composiciones de celulasa mixtas a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 5:1 y aproximadamen e 1:1.5. En algunas modalidades, la swolenina y las celulasas están presentes en una cantidad aproximadamente igual (p:p) .
En algunas modalidades, la cantidad de swolenina (p:p) en la composición reemplaza una cantidad aproximadamente igual de celulasas (p:p) en la composición, con respecto a eficiencia de celulasa en un sustrato celulósico.
Estos y otros aspectos de las composiciones y métodos serán evidentes a partir de la siguiente descripción.
Breve Descripción de las Figuras
La figura 1 ilustra la producción de glucosa por una composición de celulasa mixta en presencia y ausencia de swolenina .
Las figuras 2A y 2B ilustran el efecto de swolenina sobre hidrólisis de celulosa de varios sustratos celulósicos.
La figura 3 ilustra la producción de glucosa por 30 mg de enzima total por gramo de celulosa en donde la enzima es provista por varias relaciones de celulosa mixta a Swolenina .
La figura 4 ilustra el por ciento de digestión por celulosa de pulpa de madera blanda a diferentes concentraciones relativas de celulasa mixta y swolenina.
Descripción Detallada de la Invención
I. Definiciones
Antes de describir las presentes composiciones y métodos, se definen los siguientes términos y frases. Los términos no definidos deben ser de acuerdo con el significado ordinario como se usa en la técnica.
Como se usa en la presente "swolenina" se refiere a una proteína/polipéptido que tiene la capacidad para
facilitar el debilitamiento de papel filtro y causar el hinchamiento de fibras de algodón sin tener actividad celulolitíca, es decir, actividad catalítica que implica el rompimiento de cadenas de celulosa individuales en monómeros más pequeños (glucosa) u oligómeros (polisacáridos ) . Aunque es útil definir las swoleninas sueltamente en términos de las proteínas expansinas descritas en McQueen- ason et al. (1992) Plant Cell 4:1425-33, también es evidente que las swoleninas microbianas tengan propiedades distintas, por ejemplo, las swoleninas microbianas son proteínas mucho más grandes que las expansinas vegetales y tienen un nivel bajo de identidad de secuencia con expansinas vegetales. Más aún, ciertas proteínas de swolenina microbiana existen junto con un dominio de unión a celulosa y pueden existir además junto con un domino de celulosa catalítica.
Como se usa en la presente, el término "sustrato celulósico" o "material de alimentación celulósico" se refiere a materiales que están compuestos de celulosa, hemicelulosa y ß-glucanos que son entrelazados unos con otros, y con lignina. Esos sustratos celulósicos también pueden contener otros materiales tales como peptinas, proteínas, almidón y lípidos, pero preferiblemente tendrán celulosa hemi -celulosa y ß-glucanos como componentes primarios.
Como se usa en la presente, los términos "purificación" y "aislamiento", con referencia a swolenina, se refieren a la separación de swolenina de algunos o todos los constituyentes que ocurren naturalmente con los cuales está asociada en la naturaleza, o de algunos o todos los constituyentes con los cuales está asociada después de la expresión heteróloga. El término "constituyentes" generalmente se refiere a otras proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, materiales de pared celular y otros componentes celulares.
Como se usa en la presente, el término "valor kappa" se refiere al grado de lignificación de un sustrato celulósico. Los valores kappa se pueden determinar mediante el uso, v.gr. , el documento de la International Organization for Standardization (Organización Internacional para Estandarización) ISO 302:2004.
Como se usa en la presente, el término "celulosa" se refiere a un polisacárido que consiste de unidades de D-glucosa enlazadas a ß(1?4) que tienen la fórmula general (C6H10O5)n. La celulosa es el componente estructural de la pared celular primaria de plantas verdes, muchas formas de algas y oomycetes.
Como se usa en la presente, el término "celulasa" se refiere a una enzima capaz de hidrolizar polímeros de celulosa a oligómeros más cortos y/o glucosa.
Como se usa en la presente, el término "composición/preparación/mezcla de celulasa entera" o similares se refiere tanto a composiciones que ocurren naturalmente como que no ocurren naturalmente que incluyen una pluralidad de celulasas producidas por un organismo, por ejemplo un hongo filamentoso. Un ejemplo de una composición de celulasa entera es un medio (es decir, caldo) en el cual son cultivados hongos filamentosos, que incluyen celulasas secretadas, tales como una o mas celobiohidrolasas , una o mas endoglucanasas, y una o más ß-glucosidasas a una relación predeterminada .
Como se usa en la presente, una "endoglucanasa (EG)" es una enzima (EC 3.2.1.4) que actúa principalmente sobre las partes amorfas de la fibra de celulosa para hidrolizar enlaces ß- 1 , 4 -glucosídicos internos en regiones de baja cristanilidad .
Como se usa en la presente, una "celobiohidrolasas (CBH)" o "exoglucanasas" es una enzima (EC3.2.1.91) que hidroliza celobiosa a partir del extremo reductor o no reductor de celulosa para degradar celulosa cristalina.
Como se usa en la presente, una "ß-glucosidasa" o "ß-D-glucósido glucohidrolasa" es una enzima (EC 3.2.1.21) que actúa para liberar unidades de D-glucosa de celobiosa, celo-oligosacáridos y otros glucósidos.
Como se usa en la presente, "hemicelulosa" es un
componente polimérico de materiales vegetales que contiene monómeros de azúcar distintos de la glucosa, a diferencia de la celulosa que contiene sólo glucosa. Además de la glucosa, la hemicelulosa puede incluir xilosa, mañosa, galactosa, ramnosa y arabinosa, y similares, en donde la xilosa es el monómero de azúcar más común. Las hemicelulosas contienen la mayoría de los azúcares D-pentosa, y ocasionalmente pequeñas cantidades de L-azúcares. Los azúcares en hemicelulosa pueden ser enlazados por enlaces de éster así como enlaces glucosídicos . Formas ilustrativas de hemicelulosa incluyen pero no se limitan a galactano, mañano, xilano, arabanano, arabinoxilano, glucomanano, galactomanano y similares.
Como se usa en la presente, el término "hemicelulasa" se refiere a una clase de enzimas capaces de romper hemicelulosa en sus componentes azúcar o polímeros más cortos, e incluye hidrolasas de endo-acción, hidrolasas de exo-acción y varias esterasas.
Como, se usa en la presente, una "celulasa primaria" o "enzima celulítica primaria" es una celulasa que es requerida para hidrolizar eficientemente la celulosa o para producir glucosa a partir de un sustrato celulósico. Las celulasas primarias incluyen CBH1, CBH2 , EG1, EG2 y ß-glucosidasa .
Como se usa en la presente, el término "enzima accesoria" se refiere a una enzima que se puede incluir en
una composición de celulasa para mejorar la eficiencia de una celulasa (o combinación de celulasas) pero no se requiere para la hidrólisis eficiente de celulosa o la producción de glucosa a partir de un sustrato celulósico. Enzimas accesorias incluyen swolenina, EG4 , proteína inducida por celulosa (CIP1) , y xilanasa.
Como se usa en la presente, una composición "que ocurre naturalmente" es una producida en la naturaleza o por un organismo que ocurre en la naturaleza.
Como se usa en la presente, una proteína
"variante" difiere de la proteína "original" de la cual se deriva por la sustitución, deleción o adhesión de un pequeño número de residuos de aminoácido, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, · o más residuos de aminoácidos. En algunos casos, la proteína original es un polipéptido de "tipo silvestre", . "nativo" o "que ocurre naturalmente" . Varias proteínas se pueden describir como que tienen un cierto porcentaje de identidad de secuencia con una prote ína original , v.gr, por lo menos
80% , por lo menos 81%, por lo menos 82% , por lo menos
83%, por lo menos 84% , por lo menos 85% , por lo menos
86% , por lo menos 87% , por lo menos 88% , por lo menos
89% , por lo menos 90% , por lo menos 91% , por lo menos
92% , por lo menos 93% , por lo menos 94% , por lo menos
95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, e incluso por lo menos 99%, que se pueden determinar mediante el uso de cualquier programa de software adecuado conocido en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al. (eds) (1987) Suplemento 30, sección 7.7.18). Los programas preferidos incluyen los programas VECTOR NTI ADVANCE™ 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) , GCG PILEUP, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Nati, Acad. Sci USA 85:2 44-2448), y BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Nat ' 1. Cent. Biotechnol . Inf . , Nat'l Lib. Med. (NCIB NLM NIH) , Bethesda, Md . , y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) . Otro programa de alineación preferido es ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA) , que usa preferiblemente parámetros por omisión. Otro programa de software de secuencia que encuentra uso es TFASTA Data Searching Program disponibles de Sequence Software Package Versión 6.0 (Genetics Computer Group, University of isconsin, Madison, I) .
El uso del singular incluye el plural a menos que se establezca específicamente de otra manera, y el uso de "o" significa "y/o" a menos que se establezca de otra manera. Los términos "comprenden", "que
comprende", "comprende", "incluyen," "que incluye" e "incluye" no se pretende que sean limitantes. El término "que consiste esencialmente de" significa que otros componentes o pasos pueden estar presentes opcionalmente pero no son esenciales para producir o llevar a cabo un efecto descrito.
Todas las patentes y publicaciones, que incluyen todas las secuencias de aminoácidos y nucleótidos descritas dentro de esas patentes y publicaciones, referidas en la presente son expresamente incorporadas por referencia.
Las siguientes abreviaturas/acrónimos tienen los siguientes significados a menos que se especifique de otra manera:
°C grados centígrados
BSA albúmina de suero de bovino
CBD dominio de unión a carbohidrato
ADNc ADN complementario
CMC carboximet ilcelulosa
CMC carboximet ilcelulosa
dH20 o DI agua desionizada
dlH20 agua desionizada, filtración Mili-Q
DNA ácido desoxiriboucleico
ss o SS contenido de sólidos secos
EDTA ácido et ilendiaminotetraacét ico eq. equivalente
ETOH etanol
g o gm gramo
GA glucoamilasa
Genencor Danisco US Inc, Genencor División, Palo Alto, CA, E.U.A
H20 agua
HPLC cromatografía de líquidos de alta presión/rendimiento
hr hora
IPTG isopropil ß-D- tiogalactósido
IU unidad internacional
KDa kiloDalton
Kg kilogramo
1 litro
M molar
mg miligramo
min y ? minuto
mL y mi mililitro
mm milímetro
mM mil imolar
PM peso molecular
N normal
PCS rastrojo de maíz pre-tratado
PEG polietilenglicol
pl punto isoeléctrico
PNPG p-nitrofenil - oc-D-glucopi ranos ido
ARN ácido ribonucleico
RPM revoluciones por minuto
SDS-PAGE electroforesis de dodecil sulfato de sodio-gel de poliacrilamida
seg y " segundo
sp./spp. especies (singular/plural)
Spz. SPEZYME
U unidad
UFC concentrado ultra-filtrado
v/v volumen/volumen
p/v peso/volumen
p/p peso/peso
%p % en peso
pg microgramo
ih y µ? microlitro
ym miera
µ? micromolar
II. El uso de swolenina para incrementar el rendimiento de azúcar a partir de materiales de alimentación celulósicos
Un aspecto de las composiciones y métodos se refiere a incrementar el rendimiento de azúcar a partir de materiales
de alimentación/sustratos celulósicos al complementar una composición de celulasa con swolenina. En un aspecto, un método para incrementar la hidrólisis enzimática de celulosa se provee, el método comprende: . (a) combinar un sustrato celulósico, una composición de celulasa mixta y swolenina; y (b) incubar el sustrato celulósico, composición de celulasa mixta y swolenina bajo condiciones que conducen a hidrolizar la celulosa. Las composiciones y métodos se basan en la sorprendente observación de que el reemplazo de hasta 50% de una composición de celulasa mixta con una swolenina puede incrementar sustancialmente la cantidad de azúcar fermentable generado a partir de un sustrato celulósico.
Una variedad de proteínas, llamadas "expansinas" han sido identificadas en una variedad de plantas alimenticias. Estas expansinas se cree que incrementan la absorción osmótica de agua, que es la fuerza impulsora de expansión de células vegetales. A medida que el agua entra a la célula, el protoplasto e expande pero es restringido por la pared celular, que es mantenida junta por un complejo rígido de polímeros de microfibrillas de celulosa en bebidas en una matriz de pectinas, hemicelulosas y proteínas en forma de pegamento. La familia de expansina de proteínas encontrada en varias frutas, verduras, granos y avena, funcionan como un factor de "soltura de pared" , que altera las propiedades mecánicas de la pared celular inmadura y permite que pase por un proceso de
alargamiento (véase, v.gr., Shcherban et al. (1995) Proc. Nat'l. Acad. Sci, U.S.A. 92:9245-49; Wang et al. (1994) Biotech. Lett. 16:955-58; Keller et al. (1995) The Plant Journal 8:795-802; Li et al. (1993) Planta, Vol . 191, pp. 349-56) . Las expansinas juegan un papel importante en el crecimiento de células vegetales, reblandecimiento de frutos, abscisión, emergencia de pelos radicales, invasión del tubo polínico del estigma y estilo, función de meristema y otros procesos de desarrollo en donde ocurre soltura de pared celular.
Más recientemente, enzimas similares a expansina han sido identificadas de hospederos microbianos. Una esa de este tipo enzima, llamada swolenina, derivada de Trichoderma reesei, se describe en la patente de E.U.A. No. 6,458,928 (incorporada aquí por referencia) . La secuencia de swolenina se asemeja parcialmente a expansinas vegetales, que se piensa que rompen los enlaces de hidrógeno entre polisacáridos en una pared celular. La secuencia de polipéptido nativa, que incluye el péptido de señal N-terminal, se muestra como, es decir, SEQ ID NO: 1. La secuencia de polipéptido madura se muestra como SEQ ID NO: 2. A diferencia de las expansinas, la swolenina madura incluye en su N-terminal un dominio de unión a celulosa (CBD) que es enlazado mediante una región enlazadora a un dominio similar a expansina. Un CBD de este tipo también ocurre en las celulasas de T. reesei bien conocidas, tales como CBH I y EG
II. A diferencia de la swolenina, las celulasas son hidrolíticas , por lo menos hasta cierto grado.
MetAlaGlyLysLeuIleLeuValAlaLeuAlaSerLeuValSerLeuSerlleGlnGln
AsnCysAlaAlaLeuPheGlyGlnCysGlyGlylleGlyTrpSerGlyThrThrCysCys
ValAlaGlyAlaGlnCysSerPheValAsnAspTrpTyrSerGlnCysLeuALaSerThr
GlyGlyAsnProProAsnGlyThrThrSerSerSerLeuValSerArgThrSerSerAla
SerSerSerValGlySerSerSerProGlyGlyAsnSerProThrGlySerAlaSerThr
TyrThrThrThrAspThrAlaThrValAlaProHisSerGlnSerProTyrProSerlle
AlaAlaSerSerCysGlySerTrpT rLeuValAspAsnValCysCysProSerTyrCys
AlaAsnAspAspThrSerGluSerCysSerGlyCysGlyThrCysThrT rProProSer
AlaAspCysLysSerGlyThrMetTyrProGluValHisHisValSerSerAsnGluSer
TrpHisTyrSerArgSerThrHisPheGlyLeuThrSerGlyGlyAlaCysGlyPheGly
LeuTyrGlyLeuCysThrLysGlySerValThrAlaSerTrpThrAspProMetLeuGly
AlaThrCysAspAlaPheCysThrAlaTyrProLeuLeuCysLysAspProThrGlyThr
ThrLeuArgGlyAsnPheAlaAlaProAsnGlyAspTyrTyrThrGlnPheTrpSerSer
LeuProGlyAlaLeuAspAsnTyrLeuSerCysGlyGluCysIleGluLeuIleGlnThr
LysProAspGlyThrAspTyrAlaValGlyGluAlaGlyTyrThrAspProIleThrLeu
GluIleValAspSerCysProCysSerAlaAsnSerLysTrpCysCysGlyProGIyAla
AspHisCysGlyGluIleAspP eLysTyrGlyCysProLeuProAlaAspSerlleHis
LeüAspLeuSerAspIleAlaMetGlyArgLeuGlnGlyAsnGlySerLeuThrAsnGly
ValIleProThrArgTyrArgArgValGlnCysProLysValGlyAsnAlaTyrlleTrp
LeuArgAsnGlyGlyGlyProTyrTyrPheAlaLeuThrAlaValAsnThrAsnGlyPro
GlySerValThrLysIleGluIleLysGlyAlaAspThrAspAsnTrpValAlaLeuVal
HisAspProAsnTyrThrSerSerArgProGlnGluArgTyrGlySerTrpValIlePro
GlnGlySerGlyProPheAsnLeuProValGlylleArgLeuThrSerProThrGlyGlu
GlnlleValAsnGluC-lnAlalleLysThrPheThrProProAlaThrGlyAspProAsn
PheTyrTyrlleAspIleGlyValGlnPheSerGlnAsn (SEO. ID NO: 1)
GlnGlnAsnCysAlaAlaLeuPheGlyGlnCysGlyGlylleGlyTrpSerGlyThrThr
CysCysValAlaGlyAlaC-lnCysSerPheValAsnAspTrpTyrSerGlnCysLeuAla
SerThrGlyGlyAsnProProAsnGlyThrThrSsrSerSerLeuValSerArgThrSer
SerAlaSerSerSerValC-lySerSerSerProGlyGlyAsnSerProThrGlySerAla'
SerThrTyrThrThrThrAspThrAlaThrValAlaProHisSerGlnSerProTyrPro
SerlleAlaAlaSerSerCysGlySerTrpThrLeuValAspAsnValCysCysProSer
TyrCysAlaAsnAspAspThrSerGluSerCysSerGlyCysGlyThrCysThrT rPro
ProSerAlaAspCysLysSerGlyThrMetTyrProGluValHisHisValSerSerAsn
GluSerTrpHisTyrSerArgSerThrHisP eGlyLeuThrSerGlyGlyAlaCysGly
PheGlyLeuTyrGlyLeuCysThrLysGlySerValThrAlaSerTrpThrAspProMet
LeuGlyAlaThrCysAspAlaPheCysThrALaTyrProLeuLeuCysLysAspProThr
GlyThrThrLeuArgGlyAsnPheAlaAlaProAsnGlyAspTyrTyrThrGlnPheTrp
SerSerLeuProGlyAlaLeuAspAsnTyrLeuSerCysGlyGluCysIleGluLeuIle GlnT rLysProAspGlyThrAspTyrAlaValC-lyGluAlaC-lyTyrThrAspProIle
ThrLeuGluIleValAspSerCysProCysSerALaAsnSerLysTrpCysCysGlyPro
GlyAlaAspHisCysGlyGluIleAspPheLysTyrGlyCysProLeuProAlaAspSer
IleHisLeuAspLeuSerAapIleAlaMetGlyArgLeuC-lnGlyAsnGlySerLeuThr
AsnGlyVallleProThrArgTyrArgArgValGlnCysProLysValGlyAsnAlaTyr
IleTrpLeuArgAsnGlyGlyGlyProTyrTyrPheAlaLeuThrAlaValAsnThrAsn
GlyProGlySerValThrLysIleGluIleLysGlyAlaAspThrAspAsnTrpValAla
LeuValHisAspProAsnTyrThrSerSerArgProGlnGluArgTyrGlySerTrpVal
IleProGlnGlySerGlyProPheAsnLeuProValGlylleArgLeuThrSerProThr
GlyGluGlnlleValAsnGluGlnAlalleLysThrPheThrProProAlaThrGlyAsp
ProAsnPheTyrTyrlleAspIleGlyValGlnPheSerGlnAsn (SEQ ID NO: 2)
En algunas modalidades, la swolenina es una swolenina de T. reesei variante que ocurre naturalmente que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o incluso por lo menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la swolenina se obtiene de un organismo diferente y tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o incluso por lo menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En modalidades adicionales, la swolenina es una swolenina variante genéticamente manipulada, que incluye por menos una sustitución, inserción o deleción que imparte
una característica ventajosa a la swolenina, y en donde el resto de la secuencia de aminoácidos (es decir, sin incluir una o más sustituciones, inserciones o deleciones) tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o incluso por lo menos 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 1. La sustitución, inserción o deleción puede estar en el CBD N-terminal, por lo que afecta la unión a celulosa, o en una porción del polipéptido distinto del CBD, por lo que afecta, v.gr., la alteración de enlaces de hidrógeno en un enlace celulósico. En modalidades relacionadas, la swolenina es un fragmento o dominio de swolenina que retiene la actividad biológica descrita en la presente. En modalidades particulares, el fragmento carece de CBD.
Los sustratos celulósicos adecuados para usarse con swolenina incluyen madera, pulpa de madera, lodo de fabricación de papel, corrientes de desechos de pulpa de papel, tabla hecha de partículas, rastrojo de maíz, fibra de maíz, arroz, desechos de procesamiento de papel y pulpa, plantas leñosas o herbáceas, pastos, cáscaras de arroz, paja de algodón, mazorcas de maíz, granos de destilería, hojas, paja de trigo, pelo de coco, pasto aguja y mezclas de los
mismos. Un aspecto de las presentes composiciones y métodos es el descubrimiento de que la adición de swolenina a celulasa incrementa la producción de azúcar en sustratos leñosos y herbáceos. Por otra parte, no se cree que la swolenina sea ventajosa para usarse con sustratos a base de grano o a base de frutas. Generalmente, debido a la capacidad de la swolenina para interrumpir el enlace de hidrógeno, cualquier sustrato en el cual el enlace de hidrógeno es predominante (v.gr., celulosa cristalina) es probablemente susceptible a la actividad de swolenina, y por lo tanto son sustratos adecuados. Los sustratos celulósicos ilustrativos tiene un alto contenido de lignina, como en el .caso de, v.gr., maderas suaves. En algunos casos, el sustrato celulósico tiene un número kappa de 80 o superior, por ejemplo, 80, 81, 82 o superior.
El sustrato celulósico se puede usar directamente (es decir, pre-tratamiento) , o puede ser sometido a pre-tratamiento mediante métodos convencionales que son conocidos en la técnica. Los pre-tratamientos ilustrativos son pre- tratamientos químicos, físicos y biológicos. Las técnicas de pre-tratamiento físico incluyen, sin limitación, varios tipos de molienda, trituración, vaporización/técnicas explosión de vapor, y radiación e hidrotermólisis . Las técnicas de pre- tratamiento químico incluyen, sin limitación, hidrotermólisis controlada por ácido diluido, material alcalino, solvente
orgánico, amoniaco, dióxido de azufre, dióxido de carbono y pH. Las técnicas del tratamiento biológico incluyen, sin limitación aplicar microorganismos solubilizantes de lignina al sustrato.
La hidrólisis enzimática de celulosa preferiblemente se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 45°C a aproximadamente 75°C, y un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7.5. La concentración inicial de celulosa en el reactor de hidrólisis, antes del inicio de la hidrólisis, es preferiblemente de aproximadamente 4% (P/P) a aproximadamente 15% (P/P) . La dosis combinada de todas las enzimas celulasa primarias puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 miligramos de proteína por gramo de celulosa. La hidrólisis se puede llevar a cabo durante un tiempo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 200 horas. Preferiblemente, la hidrólisis se lleva a cabo durante un periodo de 15 horas a 100 horas. Cabe apreciar que las condiciones de reacción no pretenden limitar la reacción de ninguna manera y se pueden ajustar según lo desee el experto en la técnica.
El proceso de hidrólisis preferiblemente convierte aproximadamente 80% a aproximadamente 100% de la celulosa a azucares solubles, o cualquier intervalo entre los mismos. Muy preferiblemente, el proceso de hidrólisis enzimática convierte de aproximadamente 90% a aproximadamente 100% de la
celulosa a azúcares solubles, o incluso de aproximadamente 98% a aproximadamente 100% de la celulosa a azucares solubles .
La hidrólisis que usa la composición de celulasa mixta y swolenina puede ser hidrólisis intermitente, hidrólisis continua o una combinación de las mismas. La hidrólisis puede ser agitada, no mezclada o una combinación de las mismas. La hidrólisis típicamente se lleva a cabo en un reactor de hidrólisis. Las enzimas celulasa primaria y swolenina se añaden al material de alimentación celulósico de tratado (también referido como el "sustrato") antes, durante o después de la adición del sustrato al reactor de hidrólisis. La celulasa y swolenina se pueden añadir simultáneamente o secuencialmente a la hidrólisis. Durante el periodo extendido de hidrólisis, se añade celulasa y/o swolenina adicional al sustrato celulósico parcialmente digerido .
La swolenina puede ser aislada de una cepa microbiana que lo produzca naturalmente, pero preferiblemente -, se produce por un organismo genéticamente modificado, en donde un gen que codifica swolenina o un fragmento activo de la misma, es operablemente enlazado a un promotor fuerte para sobreexpresar la proteína. El constructo de gen resultante (es decir, secuencia de ácido nucleico) , que incluye por lo menos parte del gen que codifica swolenina, se usa para
transformar una célula hospedera heteróloga u homologa, que es subsecuentemente cultivada bajo condiciones para expresar la proteína deseada. Los métodos de expresión de proteína recombinante son conocidos en la técnica. Las células hospederas adecuadas incluyen, por ejemplo, hongos filamentosos, tales como Trichoder a ssp o Aspergillus ssp., y levadura. Un modo preferido para preparar swolenina es mediante la transformación de una célula hospedera de Trichoderma ssp. Con un constructo de ADN que comprende por lo menos un fragmento de ADN que codifica una porción o toda la swolenina que es funcionalmente unida a un promotor. La célula hospedera trasformada después se hace crecer bajo condiciones para expresar la proteína deseada.
La swolenina preferiblemente se produce como una proteína extracelular que es secretada en medio de cultivo, que se puede usar como una fuente de swolenina directamente (v.gr., como un caldo), o se puede usar para aislar y/o purificar adicionalmente la swolenina mediante el uso de métodos conocidos en la técnica de proteína. Alternativamente, en donde la swolenina se expresa como una proteína intracelular, las células son alteradas, seguido por aislamiento y/o purificación de la swolenina intrace-lular.
En donde se desea obtener la proteína swolenina en ausencia de actividad celulolítica , es útil obtener, por ejemplo, una cepa de célula hospedera de Trichoderma que
tenga uno o más genes de celulasa deletados antes de la introducción de un constructo o plásmido de ADN que contenga el fragmento de ADN que codifica la swolenina. Esas cepas pueden ser preparadas por el método descrito en la patente de E.U.A. No 5,246,853 y O 92/06209, cuyas descripciones son incorporadas aquí por referencia. Al expresar una swolenina en un microorganismo hospedero que esta carente de uno o más genes de celulasa, los procedimientos de identificación y purificación subsecuente son simplificados. Sin embargo, para usarse en la presente invención, no es necesario excluir completamente las enzimas celulolíticas de la swolenina purificada.
En modalidades particulares, la swolenina o un derivado de la misma, es recuperada en forma activa de la célula hospedera después de crecer en medio líquido. La swolenina puede incluir procesamiento de post-traducción apropiado. La swolenina expresada puede ser recuperada del medio por técnicas convencionales que incluyen separaciones de las células del medio por centrifugación, filtración y precipitación de las proteínas en el sobrenadante filtrado con una sal, por ejemplo, sulfato de amonio. Alternativamente o adicionalmente , los procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio de iones o cromatografía de afinidad se pueden usar. Anticuerpos (policlonales o monoclonales) , se pueden producir contra swolenina
purificada, fragmentos de swolenina purificada o péptidos sintéticos correspondientes a porciones de swolenina.
En algunas modalidades, las proteínas de swolenina son aisladas o purificadas de otros componentes en los cuales esta naturalmente asociada u otro componente de células usado para expresar la swolenina. Una swolenina purificada no necesita estar desprovista de todos los demás componentes, si no que tiene una relación más alta de swolenina a proteínas extrañas (y/u otros componentes) que las encontradas en el estado natural, en medio de cultivo o en células lisadas. La purificación se puede lograr mediante técnicas de separación reconocidas, tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, separación hidrofóbica, diálisis, tratamiento con proteasa, sulfato de amonio u otra precipitación alternativa, centrifugación, cromatografía de exclusión de tamaño, filtración, microfiltración, electroforesis de gel o separación en un gradiente para remover células enteras, residuos de células, impurezas, proteínas extrañas (que incluye enzimas) que no son deseadas en la composició final. Además, es . posible añadir después componentes a una composición que contenga swolenina, que provea beneficios adicionales, por ejemplo, agentes activadores, agentes anti-inhibición, iones, compuestos para controlar pH, u otras enzimas tales como celulasa.
La cantidad de swolenina añadida a una mezcla
hidrolítica puede variar de conformidad con la biomasa que ha de ser tratada, pero es típicamente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 mg/g de celulosa, preferiblemente aproximadamente 2 mg/g a aproximadamente 20 mg/g de celulosa, y muy preferiblemente aún de aproximadamente 5 mg/g a aproximadamente 15 mg/g de celulosa. Alternativamente, la cantidad de swolenina usada en la presente invención se puede determinar con base en el sustrato celulósico total o biomasa en bruto o pre-tratada total. El tratamiento de swolenina se lleva a cabo a aproximadamente 20 a aproximadamente 80°C, preferiblemente a aproximadamente 30 a aproximadamente 50°C, a un intervalo de pH a aproximadamente 3 a aproximadamente 10, preferiblemente, a aproximadamente 4 a aproximadamente 6, durante aproximadamente 0.1 a aproximadamente 24 horas, preferiblemente a aproximadamente 2 a aproximadamente 6 horas, a aproximadamente 1% a aproximadamente 30% de carga de sólidos (secos) , preferiblemente aproximadamente 15% a aproximadamente 25%.
Típicamente, las enzimas se usarán en una relación de 5:1 a aproximadamente 1:5 de celulasa : swolenina . Muy preferiblemente, las enzimas se usan en una relación de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2 de celulasa : swolenina . La relación relativa de enzima puede variar según el tipo de sustrato celulósico. En algunos casos, la swolenina representa una cantidad aproximadamente
igual de enzima en una composición para tratar una material celulósico, en comparación con la cantidad de celulasa en la composición. Una cantidad aproximadamente igual significa que aproximadamente 40-60% de las enzimas son swolenina, v.gr. , aproximadamente 50%. El sustrato celulósico microcristalino (es decir, pulpa de madera blanda) rico en enlace de hidrógeno puede requerir más swolenina que para un sustrato amorfo (es decir, celulosa hinchada con ácido fosfórico) con grado de unión a hidrógeno relativamente más bajo.
Una composición de celulasa mixta para usarse como se describe puede tener tres actividades celulolíticas sinergísticas : actividades de endo-4^-D-glucanasa, exo-1,4-ß-glucosidasa, y ß-D-glucosidasa . Cada una de estas actividades se puede proveer por una de las enzimas celulasa, que representan las celulasas primarias (y actividades de las mismas) en las presentes composiciones y métodos. Cualquier enzima celulasa en la composición de celulasa mixta puede proveer una o más de las tres actividades celulolíticas. Las celulasas primarias ilustrativas incluyen CHB1 , CBH2 , EG1 , EG2 , y ß-glucosidasa . La composición de celulasa puede ser una proteína de solución acuosa en agua, una suspensión un polvo sólido o granulo, o un gel . Una mezcla que comprende enzima celulasa puede incluir aditivos, tales como reguladores de pH, detergentes, estabilizadores, llenadores, u otros de esos aditivos familiares para los expertos en la
técnica.
En algunas modalidades, las presentes composiciones y método no requieren una enzima accesoria adicional (es decir, otras distintas a la swolenina) en combinación con una celulasa primaria o combinación de celulasas, como se puede encontrar en un caldo de celulasa entero. Esas enzimas accesorias de adición incluyen EG4, CIP1 , y/o xilanasa. Por lo tanto, en ciertas modalidades, las presentes composiciones y métodos consisten esencialmente de swolenina y una o más celulasas primarias en ausencia de enzimas accesorias tales como EG4 , CIP1, y/o xilanasa. En modalidades particulares, las composiciones y métodos consisten esencialmente de swolenina y una o más celulasas primarias en ausencia de EG4 o CIP1. En una modalidad más particular, las composiciones y métodos consisten esencialmente de swolenina y una o más celulasas primarias en ausencia de EG4 y CIP1.
La celulasa y/o swolenina se puede derivar de orígenes microbianos, y particularmente de origen fúngico o bacteriano. Los microorganismos que poseen capacidades celulolíticas pueden ser fuentes tanto de proteína celulasa como swolenina. En algunas modalidades, la celulasa y/o swolenina se deriva de Trichoderma ssp., particularmente Trichoderma reesei (longibrachiatum) . Sin embargo, la celulasa y/o swolenina también se puede derivar de un hongo, tal como Absidia spp; Acremonium spp; Agancus spp;
Anaeromyces spp; Aspergillus spp, que incluye A. auculeatus ,
A. awamon, A. flavus, A. foetidus , A. fumaricus , A. fu igatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus y A. versicolor, Aeurobasidium spp; Cepha/osporum spp; Chaetomium spp; Chrysosporium spp; Coprinus spp; Dactyllum spp; Fusarium spp; que incluye F. conglomerans, F. decemcellulare, F. javanicum, F. lim, Foxysporum y F. solani; Gliocladium spp;
Humicola spp; que incluye H. insolens y H. lanuginosa;
Mucorspp; Neurospora spp; que incluye N. crassa y N. sitophila; Neocallimastix spp; Orpinomyces spp; Penicillium spp; Phanerochaete spp; Phlebia spp; Piromyces spp;
Pseudomonas spp; R izopus spp; Schizophyllum spp; Trametes spp; Tri choderma spp; que incluye T reesei, T reesei
(longibrachiatum) y T. vinde; y Zygorhynchus spp. De manera similar, se contempla que la swolenina y/o ADN que codifica
Swolenina se puede encontrar en bacterias celulolíticas tales como Bacillus spp; Cellulomonas spp; Clostridium spp;
Myceliophthora spp; Thermomonospora spp; Streptomyces spp; que incluyen S. olivochromogenes ; específicamente bacterias ruminales degradadoras de fibra tales como Fibrobacter succinogenes ; y en levadura que incluye Candida torresn; C. parapsllosis ; C. sake; C. zeylanoides, Pichia minuta;
Rhodotorula glutinis; R. mucilaginosa, y Sporobolomyces ho/saticus .
Aspectos de las presentes composiciones y métodos
pueden ser entendidos adicionalmente a la luz de los siguientes ejemplos, que deben considerarse como limitantes. Las modificaciones a materiales y métodos serán evidentes para los expertos en la técnica.
Ej emplos
Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar las composiciones y métodos.
Ejemplo 1
Evaluación de Swolenina en Pulpa de Madera Blanda
Pulpa de madera blanda equivalente 0.1 g de celulosa se añadió a un vial de escint ilación de vidrio de 20 mi para cada prueba. Cada vial se llevó a un volumen total de 10 mi, menos la cantidad de enzima que ha de ser añadida en cada prueba, mediante la adición de agua destilada. Los contenidos de cada vial se llevaron a 50°C al calentar en la incubadora fijada a 50° + 1°C. A cada vial, 1 ó 2 mg de una composición de celulasa entera obtenida de Trichoderma (es decir, SPEZYME® CP, actividad específica = 3200-4110 IU/g; Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, E.U.A) se añadió a una concentración de celulasa final de 10 mg de celulasa por g de celulosa o 20 mg de celulasa por g de celulosa (como se describe en la tabla 1) .
Swolenina purificada o albúmina de suero de bovino (BSA, Sigma) , como un control, se añadió a una concentración final de 10 mg/g de celulosa (Tabla 1) . La swolenina se preparó, se purificó y se caracterizó de conformidad con el procedimiento descrito por Saloheimo et al. (2002) Eur . J. Biochem 269:4202-11 (véase ejemplo 5, más adelante) . La concentración de proteínas swolenina se estimó por electrofores i s de gel y fue aproximadamente 3 mg/ml en ambas preparaciones.
Los viales se cerraron y se incubaron con rotación suave a (180 RPM) a 50°C durante un periodo de 24 horas. Se tomó una alícuota para análisis. Los sólidos se removieron por centrifugación. El sobrenadante se sometió a análisis de glucosa mediante el uso ya sea de un analizador de glucosa YSI o un sistema Waters Alliance HPLC . Los resultados se muestran en la tabla 1 y la figura 1. La celulasa cuando se complementó con swolenina incrementó la concentración de glucosa para sustratos de madera blanda y PCS en 24 hr . Bajo las mismas condiciones de varga de proteína total (20 mg) , 10 mg de swolenina fue esencialmente capaz de reemplazar 10 mg de celulasa. La proteína de control (BSA) no produjo el mismo efecto.
Tabla 1
Ejemplo 2
Selectividad de sustrato de swolenina
Carboximet ilcelulosa (CMC), 1%; solka Floc (una celulosa microcristalina pura, sintética), 1%; madera blanda (valor kappa = 0) ; madera blanda (valor kappa = 82) ; madera dura mixta (kappa = 81) ; madera blanda (kappa = 80) ; y pulpa de desecho (kappa = 60) ; se probaron para producción de glucosa incrementada bajo adición de swolenina. Cada sustrato celulósico en una cantidad equivalente a 0.1 g de celulosa se añadió a 20 mi de vial de escintilación de vidrio para cada prueba. 5.0 mi de una solución que contenía regulador de pH de citrato de sodio 0.1 M (pH 4.8), 40 µ? (400 µg) de tetraciclina , y 30 µ? (300 µg) de cicloheximida se añadió a cada vial. Cada vial se llevó a un volumen total de 10 mi, menos la cantidad de enzima que se ha de añadir a cada prueba, mediante la adición de agua destilada. El contenido de
cada vial se llevó a 50°C al calentar en una incubadora fijada a 50° ± 1°C. A cada vial, una composición de celulasa entera obtenida de Trichoderma (es decir, SPEZYME® CP, actividad específica = 3200-4110 IU/g; Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, E.U.A) se añadió a una concentración de celulasa final de 20 mg de celulasa por g de celulosa. Además, se añadió ß-glucosidasa a una concentración final de 64 pNPG U/g de celulosa .
Swolenina semipuri ficada se añadió a una concentración final de 10 mg/g de celulosa (con referencia a la tabla 1) . Igual que antes, la swolenina se preparó, se purificó y se caracterizó de conformidad con el procedimiento descrito por Saloheimo et al. (2002) £ur. J. Biochem. 269:4202-11 (véase ejemplo 5, más adelante) . La concentración de proteína swolenina se estimó mediante electroforesis de gel y fue aproximadamente 2 mg/ml en ambas preparaciones.
Los viales se cerraron y se incubaron con rotación suave (180. RPM) a 50°C durante un periodo de 24 horas. Una alícuota se tomó para análisis. Los sólidos se removieron por centrifugación. El sobrenadante se sometió a análisis de glucosa mediante el uso de analizador de glucosa YSI o un sistema Waters Alliance HPLC. Los resultados se muestran en la tabla 2 y en las figuras 2A y 2B.
Tabla 2
Comparado con sustrato sintético tal como CMC o Solka Floka, un mayor beneficio de la presencia de swolenina se obtuvo al usar un sustrato celulósico tal como pulpa de madera blanda o madera dura, como se evidencia por la observación de que más azúcar de glucosa fue liberada del sustrato. El efecto es más pronunciado en un sustrato con alto contenido de lignina (v.gr, pulpa de madera blanda, valor kappa = 82) un sustrato con cero lignina (v.gr, pulpa de madera blanda, kappa=0) . Por lo tanto, la adición de swolenina puede ser más benéfica en el caso de un sustrato altamente recalcitrante, v.gr., en donde el proceso de pre - tratamiento de sustrato no ha sido optimizado. El contenido de lignina es alto y/o los enlaces de hidrógeno en el sustrato son aún intactos e interrumpidos.
Ejemplo 3
Evaluación de Swolenina sobre el Rendimiento Hidrolítico de
Celulasa en Pulpa de Madera Blanda
La pulpa de madera blanda no blanqueada con un valor kappa de 82 se obtuvo de Smurft Facture (Biganos, FR) . La pulpa no blanqueada fue derivada del proceso Kraft, lavada y después secada con aire. Cada muestra se preparó para proveer una composición final que contenía 4% de celulosa (glucano) en peso seco en un volumen de 10 mi de mezcla de reacción. Se añadieron enzimas a sustrato de muestra (como se expone en la tabla 2) en viales de escintilación de 20 mi a un volumen de líquido total de 10 mi, que incluía regulador de pH de citrato de sodio 50 mM (pH 4.8) y antibióticos ( tetracicl ina y ciclohexamida) . Una composición de celulasa entera obtenida de Trichoderma (es decir, SPEZYME® CP, Genencor International, Inc., Palo Alto, CA, E.U.A) se usó como fuente de celulasa en los experimentos de hidrólisis. La actividad específica de SPEZYME CP es 3200-4110 IU/g.
Las suspensiones fueron incubadas con agitación suave (180 rpm) a 50°C durante 72 horas. El análisis de contenido de glucosa se realizó después de 24 y 72 horas después de procedimientos estándares. Los resultados se muestran en la tabla 3 y figura 3.
Tabla 3
Ejemplo 4
Curva de Dosis de Swolenina sobre Sustrato de Pulpa y Papel
Dos muestras de pulpa de madera blanda no blanqueada se obtuvieron de Smurft Facture (Biganos, FR) . Una (designada "alto contenido de lignina") tuvo un contenido de lignina alto (-15%) y un valor kappa (grado de lignificación) de 82. La segunda (designada "bajo contenido de lignina") tuvo un contenido de lignina bajo (-5%) y un valor kappa (grado de lignificación) de 12. La pulpa no blanqueada fue derivada a través del proceso Kraft, lavada y después secada con aire. Cada muestra se peso para obtener una composición final que contenía 4% de celulosa (glucano) en peso seco en un volumen de 10 mi de mezcla de reacción.
La pulpa de madera blanda usada se pesó de modo que cada muestra tenía exactamente 0.4 g de celulosa (glucano) en peso seco y dosificada como muestra en la tabla 3. Se
añadieron enzimas al sustrato de muestra en vial de escintilación de 20 mi a un volumen de líquido total de 10 mi, que incluía regulador de pH de citrato de sodio 50 mM (pH 4.8) y antibióticos (tetraciclina y ciclohexamida) . Un complejo de enzima celulasa producido a partir de una cepa genéticamente modificada de Trichoderma reesei. (es decir, Accellerase 1000™, Genencor) se usó como una fuente de celulasa en los experimentos de hidrólisis de enzima, se usó swolenina como una preparación purificada, como antes, y como se describe en el ejemplo 5. La concentración de swolenina se estimó que era aproximadamente 2 mg/ml con base en electroforesis de gel . El extracto purificado se sabe que no tiene actividad de celulasa. La carga de sólidos es de 0.4 g de celulosa en volumen de líquido total de 10 mi, lo que da una carga de celulosa (glucano) de 4%.
La mezcla de reacción se incubó con agitación suave (200 rpm) a 50°C durante 72 hr. Se realizó análisis de concentraciones de glucosa y celobiosa mediante el uso de un sistema Waters HPLC (Alliance system, Waters Corp., Milford, MA) . La columna de HPLC usada para análisis de azúcar se compró de BioRad (Aminex HPX-87H, BioRad Inc., Hercules, CA) . Se midió tanto la producción de glucosa como de celobiosa. El por ciento de digestión de celulosa (glucosa generada más celobiosa generada dividida entre la entrada de celulosa) se resume en la tabla 4 y figura 4. Bajo las mismas condiciones
de carga y proteína total (30 mg) , la swolenina fue esencialmente capaz de reemplazar 50% de la celulasa de Spezyme CP (tabla 3). Al complementar ACCELLERASE con swolenina produjo un efecto benéfico mediante el uso tanto de sustratos con alto contenido de liginina como con bajo contenido de lignina (tabla 4) .
Tabla 4
Ejemplo 5
Purificación de Swolenina
Regulador de pH (50 mM Tris, pH 7.0 ) y cloruro de sodio (200 mM) se añadieron a 2 1 del concentrado ultraf iltrado (UFC) de un cultivo de una cepa de T. reesei en la cual las cuatro celulasas principales (CBH1, CBH2 , EG1 y EG2 ) fueron deletadas y el gen de swolenina sobreexpresado bajo control del promotor cbhl,
mientras se mezclaba. El pH se ajustó a pH .7.0. A esta mezcla se añadieron 50 mi de un agente de purificación de afinidad con dominio de unión a celulosa (CDB) (es decir, Cbind 200 resina, Parte No. 70121, Novozymes A/S, Bagsvaerd, DK) , seguido por mezclado durante 1 hr. Esta mezcla después se filtró mediante el uso de una unidad de filtro de vidrio concrecionado y el material no unido fue recolectado. La resina con swolenina ligada se lavó dos veces mediante el uso de 2 1 de Tris 50 mM, pH 7.0 y cloruro de sodio 200 mM . La swolenina se eluyó de la resina mediante mezclado de la resina con swolenina ligada con agua MilliQ (2 1) durante 0.5 hr y después se filtró la mezcla, mediante el uso de una unidad de filtro de vidrio concrecionado, en un receptor de 2 1. Este proceso de elución con agua se repitió para asegurarse de que la swolenina fuera completamente eluida .
El material eluido se concentró mediante el uso de un sistema de ultraf iltración con un corte de 10K MW . El concentrado (800 mi) estaba listo para análisis y uso posterior. La concentración de proteína de swolenina se estimó que era de aproximadamente 3 mg/ml con base en electroforesis de gel . Cabe notar que los extractos prepurif icados se sabe que no tiene actividad de celulasa significativa.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (30)
1. Un método para incrementar la eficiencia de hidrólisis de celulosa mediante el uso de una celulasa, caracterizado porque comprende: (a) combinar un sustrato celulósico, una composición de celulasa, y swolenina recombinante, y (b) incubar el sustrato celulósico, composición de celulasa y swolenina bajo condiciones que conducen a hidrólisis de celulosa, en donde la presencia de swolenina recombinante incrementa la eficiencia de hidrólisis de celulasa por la composición de celulasa comparada con aquella obtenida mediante el uso de la composición de celulasa en ausencia de swolenina.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de celulasa es una composición de celulasa entera.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de celulasa es una composición de celulasa mixta.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de celulasa comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una ß-glucosidasa .
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de celulasa comprende una o más celulasas primarias.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de celulasa consiste esencialmente de una o más celulasas primarias.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque las celulasas primarias se seleccionan de CBH1, CBH2 , EG1, EG2 y ß-glucosidasa .
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque se realiza en ausencia de enzimas accesorias otras distintas de la swolenina.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque se realiza en ausencia de EG4 y CIP1.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque se realiza en ausencia de EG4 recombinante o ClPl recombinante .
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la relación de celulasas en la composición de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 1:5.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la relación de celulasas en la composición de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:2.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la relación de celulasas en la composición de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 1:1.5.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la swolenina y las celulasas están presentes en una cantidad aproximadamente igual (p:p) .
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque el sustrato celulósico se selecciona del grupo que consiste de madera, pulpa de madera, lodo de fabricación de papel, corrientes de desecho de pupa de papel, tabla hecha de partículas, rastrojo de maíz, fibra de maíz, arroz, papel y desecho de procesamiento de pulpa, plantas leñosas y herbáceas, pastos, cáscaras de arroz, paja de algodón, mazorcas de maíz, granos de destilería, hojas, paja de trigo, pelo de coco, pasto aguja y mezclas de los mismos.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque el sustrato celulósico es una madera blanda.
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 ó 16, caracterizado porque el sustrato celulósico es un sustrato con alto contenido de lignina.
18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, 16 ó 17, caracterizado porque el sustrato celulósico tiene un número kappa de 80 o superior.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque el por ciento de incremento en eficiencia de celulasa es por lo menos aproximadamente 10%.
20. Una composición de enzima caracterizada porque comprende : (a) una composición mixta de celulasa que comprende una endoglucanasa , una celobiohidrolasa y una ß-glucosidasa, y (b) swolenina recombinante .
21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque no incluye EG4 o CIP1.
22. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque no incluye EG4 recombinante o CIP1 recombinante.
23. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque no incluye EG4 recombinante y no incluye CIP1 recombinante.
24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-23, caracterizada porque la composición mixta de celulasa consiste esencialmente de celulasas primarias.
25. Una composición de enzima caracterizada porque consiste esencialmente de: (a) una composición mixta de celulasa que comprende una endoglucanasa, una celobiohidrolasa y una ß-glucosidasa, y (b) swolenina recombinante .
26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, caracterizada porque la relación de celulasas en la composición mixta de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 1:5.
27. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, caracterizada porque la relación de celulasas en la composición mixta de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:2.
28. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, caracterizada porque la relación de celulasas en la composición mixta de celulasa a swolenina (p:p) es entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 1:1.5.
29. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, caracterizada porque la swolenina y las celulasas están presentes en una cantidad aproximadamente igual (p:p).
30. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20-25, caracterizada porque la cantidad de swolenina (p:p) en la composición reemplaza una cantidad aproximadamente igual de celulasas (p:p) en la composición, con respecto a la eficiencia de celulasa en un sustrato celulósico.
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