MX2010011372A

MX2010011372A - Variantes de crig de afinidad madurada.

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Publication number: MX2010011372A
Application number: MX2010011372A
Authority: MX
Inventors: Bing Li; Sachdev S Sidhu; Christian Wiesmann; Menno Van Lookeren Campagne
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2009-05-06
Publication date: 2010-11-12
Also published as: IL249492A0; AU2009244300A2; KR101690590B1; RU2553517C2; JP2011519950A; EP2280996B1; DK2280996T3; JP2015145369A; CA2720685C; IL208379A0; IL208379A; AR071635A1; HUE030092T2; US9234024B2; CY1118240T1; PT2280996T; CN102015763B; KR20110020798A; RU2015117054A; TW200948377A

Abstract

La presente invención se relaciona con variantes de CRIg de afinidad madurada. En particular, la invención se relaciona con variantes de CRIg que tienen afinidad de unión aumentada por C3b y que retienen unión selectiva hacia C3b con respecto a C3.

Description

VARIANTES DE CRIg DE AFINIDAD MADURADA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con variantes de CRIg de afinidad madurada. En particular, la invención se relaciona con variantes de CRIg que tienen afinidad de unión aumentada por C3b y que retienen unión selectiva hacia C3b con respecto a C3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El sistema de complemento El sistema de complemento es una cascada compleja de enzimas constituida de una serie de glucoproteínas séricas que existen normalmente en forma inactiva, como proenzimas. Tres vías principales pueden activar complemento: la vía clásica, la vía alternativa y la vía de lectina que une mañosa, las cuales se unen a nivel de C3 , en donde dos C3 convertasas similares separan C3 en C3a y C3b.

Los macrófagos son células especialistas que han desarrollado una capacidad inata para reconocer diferencias sutiles en la estructura de etiquetas de identificación expresadas en la superficie ' celular, los denominados patrones moleculares (Taylor, et al., Eur J Immunol 33, 2090-1097 (2003); Taylor, et al., Annu Rev Immunol 23, 901-944 (2005)). Aunque el reconocimiento directo de estas estructuras de superficie es un aspecto fundamental de la inmunidad innata, Ref.: 214283 la opsonización permite que los receptores de macrófago genérico medien la inclusión, lo que incrementa la eficiencia y diversifica el repertorio de reconocimiento de los fagocitos (Stuart and Ezekowitz, Immunity 22, 539-550 (2005) ) . El procedimiento de fagocitosis involucra interacciones múltiples ligando-receptor y ahora es claro que diversas opsoninas, que incluyen inmunoglobulinas , colectinas y componentes de complemento, guían las actividades celulares necesarias para internalización de patógenos mediante interacción con receptores de superficie de célula de macrófago (revisado por Aderem y Underhill, Annu Rev Immunol 17, 593-623 (1999) ; Underhill y Ozinsky, Annu Rev Immunol 20, 825-852 (2002)) . Aunque las inmunoglobulinas naturales codificadas por genes de línea germinal puede reconocer una amplia variedad de patógenos, la mayor parte de la IgG opsonizante se genera a través de inmunidad adaptable y por lo tanto, la depuración eficiente a través de receptores eficientes no es inmediat (Carrol!, Nat Immunol 5, 981-986 (2004)) . Por otra parte, el complemento reconoce rápidamente moléculas de superficie de patógeno y ceba la partícula para su captación por los receptores de complemento (Brown, Infect Agents Dis 2, 63-70 (1991)) .

El complemento consiste de más de 30 proteínas séricas que opsonizan una amplia variedad de patógenos para reconocimiento por los receptores de complemento. En base en la activación inicial de la cascada, se pueden distinguir tres vías (revisado por (Walport, N Eng J Med 344, 1058-1066 (2001)). Las tres comparten la etapa común de activar el componente central C3 , pero difieren de acuerdo con la naturaleza y las etapas bioquímicas iniciales que llevan a activación de C3. La vía clásica se activa por anticuerpos unidos a la superficie de patógeno, los que a su vez se unen al componente de complemento Clq, iniciando una cascada de serina proteasa que finalmente separa C3 en su forma activa, C3b. La vía de lectina se. activa después del reconocimiento de motivos de carbohidrato por proteínas de lectina. Hasta ahora se han identificado tres miembros de esta vía: las lectinas que unen mañosa (MBL) , la familia de lectinas SIGN-Rl y las ficolinas (Pyz et al.., Ann Med 38, 242-251 (2006)). Tanto MBL como ficolinas se asocian con serina proteasas las cuales actúan de manera similar a Cl en la vía clásica, activando los componentes C2 y C4 lo que lleva a la etapa C3 central. La vía alternativa contrasta con las vías tanto clásica ..como la de lectina en que es activada debido a reacción directa del éster C3 interno con motivos de reconocimiento sobre la superficie del patógeno. La unión C3 inicial a una superficie activante genera una amplificación rápida ..de deposición de C3b mediante la acción de las proteasas de la vía alternativa, factor B y factor D. De manera importante- C3b depositado ya sea por la vía clásica o la de lectina también puede llevar a amplificación de la deposición de C3b mediante las acciones de los factores B y D. En las tres vías de activación de complemento, la etapa fundamental en la opsonización es la conversión del componente C3 a C3b . La separación de C3 por enzimas de las cascadas de complemento exponen el tioéster a ataque nucleofílico lo que permite unión covalente de C3b sobre superficies de antígeno por medio del dominio tioéster. Esta es la etapa inicial en la opsonización por complemento. La proteólisis subsecuente de C3b unido produce los fragmentos iC3b, C3c y C3dg, que son reconocidos por receptores diferentes (Ross and Medof, Adv Immunol 37, 217-267 (1985)). Esta separación suprime la capacidad de C3b de amplificar adicionalmente la deposición de C3b y activa los componentes tardíos de la cascada de complemento que incluyen el complejo de ataque a membrana, capaz de dirigir el daño a la membrana. No obstante, los receptores fagocíticos de los macrófagos reconocen C3b y sus fragmentos de modo preferencial ; debido a -la versatilidad de la formación del enlace éster, la opsonización mediada por C3 es central para reconocimiento de patógenos (Holers et al., Immunol Today 13, 231-236 (1992)) y receptores para los diversos productos de degradación de C3 por lo tanto juegan un papel importante en la respuesta inmunitaria del hospedador.

C3 en sí~misma es una proteína compleja y flexible que consiste de 13 dominios distintos. El núcleo de la molécula está constituido de los 8 denominados dominios de macroglobulina (MG) los cuales constituyen las cadenas OÍ y ß apretadamente empacadas de C3. Insertada en la estructura se encuentran los dominios CUB (Clr/Cls, Uegf y proteína 1 morfogénica ósea) y los dominios TED, este último contiene la unión tioéster que permite la asociación covalente de C3b con superficies de patógeno. Los dominios restantes contienen C3a o actúan como enlazantes y separadores de los dominios de núcleo.. La comparación de las estructuras C3b y C3c con C3 demuestran que la molécula experimenta rearreglos conformacionales mayores con cada proteólisis, lo cual expone no sólo a TED, sino superficies nuevas adicionales de la molécula que pueden interactuar con receptores celulares (Janssen and Gros, Mol Immunol 44, 3-10 (2007)).

Receptores C3 de complemento en células fagocíticas Existen tres superfamilias de genes conocidas de receptores de complemento: Los módulos de secuencia repetida de consenso corto (SCR) que codifican para CR1 y CR2 , los miembros CR3 y CR4 de integrina ß-2 y el miembro CRIg de la superfamilia Ig de inmunoglobulina .

CR1 es una glucoproteína de 180-210 kDa que consiste de 30 secuencias repetidas de consenso cortas (SCR) y que juega un papel principal en la depuración del complejo inmunitario. Las SCR son estructuras modulares de aproximadamente 60 aminoácidos, cada una con dos pares de enlaces disulfuro que proporcionan rigidez estructural . La unión de alta afinidad tanto de C3b como de C4b se producen mediante dos ciclos distintos, cada uno constituido de 3 SCR) revisado por (Krych-Doldberg and Atkinson, Immunol Rev 180, 112-122 (2001) ) . La estructura del sitio de unión C3b, contenida dentro de SCR 15-17 de CR1 (sitio 2) , se ha determinado por MRI (Smith et al., Cell 108, 769-780 (2002)), lo que muestra que los tres módulos se encuentran en una distribución extendida cabeza a cola con flexibilidad en la unión 16-17. La mutagénesis guiada por estructura identifica una región de superficie cargada positivamente en el módulo 15 que es crítica para la unión de C4b. Este parche, junto con las cadenas laterales básicas del módulo 16 expuestas sobre la misma cara de CR1 , se requiere para unión de C3b. La función principal de CR1, descrita por primera vez como un receptor de adherencia inmunitario (Rothman et al., J. Immunol 115, 1312-1315 (1975)), es captar IC sobre eritrocitos para transporte y depuración por el hígado (Taylor et al., Clin Immunol Immunopathol 82, 49-59 (1997)). Existe un papel en la fagocitosis por CR1 en neutrófilos pero no en macrófagos tisulares (Sengelov et al., J Immuno 153, 804-810 (1994)) . Además de su papel en la depuración de complejos inmunitarios , CR1 es un inhibidor potente de la activación de la vía tanto clásica como alternativa mediante su interacción con las convertasas respectivas (Krych-Goldberg and Atkinson, 2001, supra; Krych-Goldberg et al., J Biol Chem 274, 31160-31168 (1999)). En el ratón, CR1 y CR2 son los dos productos del mismo gen formado por empalme alternativo y se asocian principalmente con linfocitos B y células dendríticas foliculares y funcionan principalmente en la regulación de las respuestas de los linfocitos B (Molina et al., 1996). El , equivalente funcional del ratón de CR1, Crry inactiva las enzimas de las vías clásica y alternativa y actúa como un regulador intrínseco de la activación de complemento en vez de hacerlo como un receptor fagocítico (Molina et al. , Proc Nati Acad Sei EUA 93, 3357-3361 (1992) ) .

CR2 (CD21) une iC3b y C3dg y es el receptor de complemento principal que incrementa la inmunidad de linfocitos B (Carroll, Nat Immunol 5, 981-986 (2004); Weis et al., Proc Nati Acad Sei EUA 81, ' 881-885 (1984)). La captación de antígeno recubierto con C3d con linfocitos B afines resulta en una señal aumentada vía el receptor de antígeno de linfocitos B. De esta manera, el acoplamiento conjunto de correceptor CD21-CD19-CD81 con el receptor de antígeno de linfocitos B disminuye el umbral de activación de linfocitos B y proporciona una señal importante de supervivencia (Matsumoto et al., J Exp Med 173, 55-64 (1991)). El sitio de unión de CR2 en iC3b ha sido mapeado parcialmente en el límite entre los dominios TED-y MGl (Clemenza and Isenman, J Immunol 165, 3839-3848 (2000)).

CR3 y CR4 son heterodímeros transmembranales constituidos de una subunidad (CDllb o M y CDllc o aXí respectivamente) y una cadena ß común (CD18 o ß2) y están involucrados en la adhesión a la matriz extracelular y a otras células así como en el reconocimiento de iC3b. Pertenecen a la familia de integrina y realizan funciones no sólo en la fagocitosis sino también en el tráfico y desplazamiento de leucocitos, formación y coestimulación de sinapsis (revisado por (Ross, Adv Immunol 37 217-267 (2000) ) . La adhesividad de integrina es regulada mediante un procedimiento denominado señalización de adentro hacia fuera, transformando las integrinas de un estado de unión bajo a uno de alta afinidad (Liddington and Ginsberg, J Cell Biol 158, 833-839 (2002)). Además, la unión de ligando transduce señales desde el dominio extracelular al citoplasma. Los sitios de unión de iC3b han sido mapeados a varios dominios sobre la cadena a de CR3 y CR4 (Diamond et al., J Cell Biol 120, 1031-1043 (1993); Li and Zhang, J Biol Chem 278, 34395-34402 (2003); Xiong and Zhang, J Biol Chem 278, 34395-34402 (2001)). Los ligandos múltiples para CR3 : iC3b, ß-glucano e ICAM-1, parecen unirse a sitios que se superponen parcialmente contenidos dentro del dominio I de CDllb (Balsam et al., 1998; Diamond et al., 1990; Zhang and Plow, 1996) . Su reconocimiento específico de la forma proteolíticamente inactivada de C3b, iC3b, se predice en base en estudios estructurales que localizan los sitios de unión CR3 a residuos que se vuelven expuestos ante la desnaturalización del dominio CUB en C3b (Nishida et al., Proc Nati Acad Sci E U A 103 19737-19742 (2006)), lo cual ocurre ante la separación de la cadena a' por la proteasa reguladora de complemento, factor I.

- CRIg es un receptor asociado macrófago con homología por el antígeno A33 y JAMl que es necesario para la depuración de patógenos de la corriente sanguínea. Una proteína CRIg humana fue clonada por primera vez a partir de una biblioteca de ADNc fetal humana utilizando cebadores degenerados que reconocen dominios Ig conservados de JAMl humano. El secuenciado de varios clones muestra un marco de lectura abierto de 400 aminoácidos. Las búsquedas Blast confirman similitud con Z39Ig, una proteína transmembranal tipo 1 (Langnaese et al., Biochim Biophys Acta 1492 (2000) 522-525) . La región extracelular de esta molécula se encontró que consiste de dos dominios similares a Ig que comprenden un dominio .N-terminal V conjunto y un dominio C-terminal C2 conjunto. La proteína humana novedosa se denominó originalmente como un "miembro de la superfamilia Ig de transmembrana único asociado a macrófago" (huSTIgMA por sus siglas en inglés) . (huSTIgMA) . Posteriormente, utilizando cebadores 3' y 5', se clonó una variante de empalme de huSTIgMA, la cual carece del dominio IgC proximal a membrana y que es 50 aminoácidos más corto. En consecuencia, la variante de empalme más corta de esta proteína humana se denominó huSTIgMAshort . La secuencia de aminoácidos de huSTIgMA (denominada como PR0362) y la secuencia polinucleotídica codificante se describen en la patente de E.U.A. No. 6,410,708 expedida el 25 de junio del 2002. Además, tanto huSTIgMA como huSTIgMAshort, junto con las secuencias proteínica y de ácido nucleico de STIgMA murino (muSTIgMA) se describirá en la publicación PCT O 2004031105, publicada el 15 de abril del 2004.

La estructura cristalina de CRIg y un complejo C3b:CRIg se describe en la publicación de solicitud de E.U.A. 2008/0045697, publicada el 21 de febrero del 2008.

Las células de Kupffer (KC) , que se encuentran dentro del lumen de las partes sinusoidales del hígado forman la población más grande de macrófagos en el cuerpo. Aunque los KC tienen marcadores en común con otros macrófagos residentes . en tejido, realizan funciones especializadas dirigidas hacia una depuración eficaz de bacterias derivadas del intestino, residuos microbianos, endotoxinas bacterianas, complejos inmunitarios y células muertas presentes en el drenado de sangre de vena portal desde el sistema microvascular del tracto digestivo (BiLzer et al., Liver Int 26, 1175-1186 (2006)) . La unión eficiente de patógenos a la superficie KC es una etapa crucial en la defensa inmunitaria de primera línea contra los patógenos (Benacerraf et al., J Exp Med 110, 27-48 (1959)). Un papel central para KC en la rápida depuración de patógenos de la circulación se ilustra por la mortalidad, aumentada de manera significativa en ratones en quienes se ha suprimido las KC (Hirakata et al., Infect Immun 59, 289-294 (1991)). La identificación de CRIg resalta aún más el papel crítico del complemento de las KC en la defensa inmunitaria de primera línea contra patógenos circulantes.

Los únicos receptores de complemento C3 identificados en las KC de ratón son CRIg y CR3 (Helmy et al., Cell 124, 915-927 (2006)), mientras que las KC humanas muestran expresión adicional de CR1 y CR4 (Hinglais et al., 1989) . Tanto CRIg como CR3 en las KC contribuyen a la unión a partículas opsonizadas de iC3b in vitro (Helmy et al., Lab Invest 61, 509-514 (2006)). In vivo, es menos claro el papel de CR3 expresado en KC en la unión de patógenos recubiertos con iC3b. Se ha propuesto que CR3 contribuya a la depuración de patógenos indirectamente vía reclutamiento de neutrófilos e interacción con ICAM1 expresado por neutrófilos (Conlan and North, Exp Med 179, 259-268 (1994); Ebe et al., Pathol Int 49, 519-532 (1999); Gregory et al., J Immunol 157, 2514-2520 (1996) ; Gregory and Wing, J Leukoc Biol 72 239-248 (2002) ; Rogers and Unanue, Infect Immun 61, 5090-5096 (1993)). En contraste, CRIg desarrolla un papel directo al capturar patógenos que transitan a través del lumen sinusoidal del hígado (Helmy et al., 2006, supra) . Una diferencia en la biología de CRIg en comparación con CR3 se refleja, en parte, por la diferencia en las características de unión de estos dos receptores. CRIg expresado sobre las KC se une constitutivamente a fragmentos C3 monoméricos mientras que CR3 se une únicamente a partículas opsonizadas iC3b (Helmy et al., 2006, supra) . La capacidad de CRIg para captar eficazment C3b monomérico e iC3b así como partículas recubiertas con C3b/iC3b refleja la avidez aumentada generada por una interacción multivalente entre moléculas CRIg concentradas en la punta de las extensiones de membrana de los macrófagos (Helmy et al., 2006, supra) y los multímeros de C3b e iC3b presentes en la superficie del patógeno. Aunque CR3 se une únicamente a partículas recubiertas con iC3b, CRIg se une adicionalmente a C3b, el primer producto de separación de C3 formado sobre patógenos opsonizados en suero (Croize et al., Infect Immun 61, 5134-5139 (1993)). Dado que un número grande de moléculas C3b unidas a la superficie del patógeno están protegidas de la separación por factor H e I (Gordon et al., J Infect Dis 257, 697-704 (1988)), el reconocimiento de ligandos C3b por CRIg asegura una unión y depuración rápidas. Por lo tanto, aunque CRIg y CR3 se expresan en KC, muestran especificidad de ligando diferente, propiedades de unión distintas y cinética de depuración de patógenos diferentes.

Los ejemplos de patógenos que aprovechan los receptores de superficie celular para entrada celular son virus como el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y bacterias intracelulares como Mycobacterium tuberculosum, Mycobacterium leprae, Yersinia pseudotuberculosis, Salmonella typhimurium y Listeria monocytogenes y parásitos como el prostigomastigote Leishmania major (Cossart and Sansonetti, Science 304 : 242-248 (2004 ) ; Galán, Cell 103,:363-366 (2000); Hornef et al., Nat . Immunol . 3:1033-1040 (2002); Stoiber et al., Mol. Immunol. 42:153-160 (2005)).

Como se describe en lo anterior, CRIg es un receptor C3 de complemento recientemente descubierto expresado en una subpoblación de macrófagos residentes en tejido. Después de funcionar como un receptor de complemento para proteínas C3 , el dominio IgV extracelular de CRIg inhibe selectivamente la vía alternativa del complemento al unirse a C3b e inhibir la activación proteolítica de C3 y C5. La afinidad de unión de CRIg por la subunidad de convertasa C3b es baja (CI50 > 1 µ?) lo que requiere una concentración relativamente elevada de proteína para alcanzar una inhibición— casi completa por complemento. En consecuencia, existe la necesidad por polipéptidos CRIg con eficacia terapéutica mejorada. La presente invención proporciona tales polipéptidos.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se basa, por lo menos en parte, en la construcción de una variante de CRIg con afinidad de unión aumentada. Una proteína CRIg-ECD con sustituciones combinadas de aminoácidos Q64R y M86Y muestra una afinidad de unión aumentada 30 veces y una actividad inhibidora de complemento mejorada 7 veces en comparación con la variante CRIg natural. Además, el tratamiento con la proteína de fusión CRIg de afinidad mejorada en un modelo de ratón de artritis resulta en una reducción significativa en las calificaciones clínicas en comparación con el tratamiento con una proteína CRIg natural.

En consecuencia, la presente invención se relaciona con variantes de CRIg.

En un aspecto, la invención se relaciona con una variante de CRIg que comprende una sustitución de aminoácidos en una región que se selecciona del grupo que consiste de E8-K15, R41-T47, S54-Q64, E85-Q99 y Q105-K111 de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

En una modalidad, la variante se une selectivamente a C3b con respecto a C3 o un fragmento del mismo.

En otra modalidad, la variante tiene afinidad de unión aumentada por C3b con respecto a la secuencia nativa de CRIg humana de la SEC ID NO: 2, en donde la afinidad de unión puede aumentarse, por ejemplo, en por lo menos 2 veces o en por lo menos 3 veces, o en por lo menos 4 veces o en por lo menos 5 veces o en por lo menos 6 veces o en por lo menos 7 veces o en por lo menos 9 veces o en por lo menos 10 veces o en por lo menos 15 veces, o en por lo menos 20 veces, o en por lo menos 30 veces, o en por lo menos 40 veces, o en por lo menos 50 veces, o en por lo menos 70 veces, o en por lo menos 80 veces, o en por lo menos 90 veces, o en por lo menos 100 veces.

En otra modalidad adicional, la variante es un inhibidor más potente de la vía de complemento alternativa en comparación con CRIg humana de secuencia nativa de la SEC ID NO : 2.

En una modalidad adicional, la variante comprende una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de las posiciones 8, 14, 18, 42, 44, 45, 60, 64, 86, 99, 105 y 110 en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

En una modalidad adicional, la variante comprende una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos 60, 64, 86, 99, 105 y 110 en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

En una "modalidad adicional, la variante comprende una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste de E8W, 14F, E84Y/W14F; P45F; G42D/D44H/P45F; Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; M86 , M86F, 86W/Q9R; M86F/Q99R; KllOD, KllN, Q105R/K110N; Q105R/K110Q; y Q105K/K110D.

En otra modalidad, la variante comprende una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste de Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y, Q60I/Q64R/G42D ; Q60I/Q64R/P45F ; · Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q60I/Q64R/K110N; Q60I/Q105R/K110N; M86Y/E8Y; M86Y/G42D/D44H/P45F; M86Y/P45F; M86Y/G42D/D44H/P45F; y M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q195R/M86Y/Q105K/M86Y/Q195R/K110N.

En otra modalidad, la variante comprende una o más sustituciones que se selecciona del grupo que consiste de Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; Q99L; Q105K/K110D; E8W/Q105R/K110N; Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y; Q60I/Q64R/G42D ; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q601/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q601/Q64R/K110N; M86Y/P45F; y M86Y/Q105K.

En una modalidad más específica, la variante comprende una sustitución Q60I/Q64R/M86Y o Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una quimera que comprende una variante de CRIg como se define en la presente.

En una modalidad, la molécula quimérica es una inmunoadhesina .

En otra modalidad, la inmunoadhesina comprende una variante CRIg que es más corta que CRIg de longitud completa de la SEC ID NO: 2.

En otra modalidad adicional, la molécula quimérica comprende un dominio extracelular de CRIg.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una variante de CRIg o una molécula quimérica, por ejemplo una inmunoadhesina de la presente invención, mezclada con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un método para la prevención o tratamiento de una enfermedad o condición asociada con complemento, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una variante de CRIg o una molécula quimérica, tal como una inmunoadhesina que comprende a la variante.

En una modalidad, la enfermedad asociada a complemento es una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria .

En otra modalidad, la enfermedad asociada a complemento se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide (RA) , síndrome de malestar respiratorio adulto (ARDS) , daño a tejido remoto después de isquemia y reperfusión, activación de complemento durante cirugía de derivación cardiopulmonar, dermatomiositis , pénfigo, lupus nefrítico -y glomerulonefritis y vasculitis resultante, derivación cardiopulmonar, disfunción endotelial coronaria inducida por cardioplej ia, glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II, nefropatía IGA, fallo renal agudo, crioglobulinemia, síndrome antifosfolipídico, degeneración macular relacionada con la edad, uveítis, retinopatía diabética, alotransplante , rechazo hiperagudo, hemodiálisis , síndrome de malestar pulmonar obstructivo crónico (COPD) , asma, neumonía por aspiración, urticaria, urticaria idiopática crónica, síndrome urémico hemolítico, endometriosis , choque cardiogénico, daño por isquemia y reperfusión y esclerosis múltiple (MS) .

En otra modalidad adicional, la enfermedad asociada a complemento se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) , lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías , esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias, . idiopáticas (dermatomiositis , polimiositis) , síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia, hemolíti.ca inmunitaria (pancitopenia inmunitaria, hemoglobinuria noctura paroxísmica) , trombocitopenia inmunitaria (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada por sistema inmunitario) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , diabetes mellitus, renopatía mediada por sistema inmunitario (glomerulonefritis , nefritis tubolointerst icial ) , enfermedades desmiel ini zantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía idiopática, enfermedades hepatobi 1 iares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D y E y otros virus no hepatotrópicos ) , hepatitis activa crónica inmunitaria, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas (por ejemplo f ibrosis quística) , enteropatía sensible a gluten, enfermedad de Whipple, enfermedades cutáneas inmunitarias o mediadas por el sistema inmunitario que incluyen enfermedades cutáneas hulosas, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas de los pulmones tales como neumonía eosinofílica , fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis con hipersensibilidad, enfermedades asociadas a transplante que incluyen rechazo de injerto, enfermedad de rechazo inverso (injerto versus hospedador) , enfermedad de Alzheimer, hemoglobinurea nocturna paroxísmica, angiodema hereditario, aterosclerosis y glomerulonefritis membranoproliferat iva tipo II-.

En una modalidad preferida, la enfermedad asociada a complemento es artritis reumatoide (RA) .

- En otra modalidad preferida, la enfermedad asociada a complemento es una condición ocular asociada a complemento.

En una modalidad adicional, la condición ocular asociada a complemento se selecciona del grupo que consiste de todas, las etapas de degeneración macular relacionada con la edad (AMD), uveítis, retinopatías diabéticas y otras relacionadas con isquemia, endoftalmitis . y otras enfermedades neovasculares intraoculares .

En una modalidad adicional, la enfermedad neovascular intraocular se selecciona del grupo que consiste de edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel - Lindau , histoplasmosis del ojo, oclusión de . la vena retinal central (CRVO) , neovascularización de la córnea y neovascularización ret inal .

En otra modalidad adicional, la condición ocular asociada con complemento se selecciona del grupo que consiste de degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , neovascularización coroidal (CNV) , retinopatía diabética (DR) y endoftalmit is en donde AMD incluye AMD húmeda y seca o atrófica.

En una modalidad, el paciente es un mamífero, preferiblemente un humano. .

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para inhibición de la . producción del fragmento de complemento C3b en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una variante de CRIg de la presente invención o una inmunoadhesina que comprende la variante.

En otro aspecto adicional, la invención se relaciona con un método para inhibición selectiva de la vía de complemento alternativa en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una variante CRIg de la presente invención o una inmunoadhesina que comprende la variante.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1A a la figura IB muestran las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de la forma larga de longitud completa de 399 aminoácidos de CRIg humana nativa (huCRIg, SEC ID NOS: 1 y 2, respectivamente) .

La figura 2A a la figura 2B muestran las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de la forma corta de 305 aminoácidos de CRIg humana nativa (huCRIg-short, SEC ID NOS: 3 y 4, respectivamente) .

La figura 3A a la figura 3C muestra las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de CRIg murina nativa de 280 aminoácidos (muCRIg, SEC ID NOS: 5 y 6, respectivamente) .

Las figuras 4A a 4C muestran la actividad de mutantes CRIg en un análisis de unión y un análisis de inhibición. La Figura 4A muestra la afinidad de unión por CRIg se mide como un desplazamiento competitivo de C3b y la actividad biológica se mide por un análisis de inhibición de hemolisis. La Figura 4B muestra un la PUR10680 es un control natural (rojo) , RIL 41 (azul) y RL41 (verde) son dos mutantes. La Figura 4C muestra la optimización paulatina del límite de unión de CRIg.

La figura 5 es una correlación entre ELISA competitivo y un análisis hemolítico.

Las figuras 6A a 6B muestran el CRIg mutante Q64R/M86Y con afinidad de unión mejorada por análisis Biacore. La Figura 6A muestra la Sensogramas SPR generados por inyección de concentraciones en aumento de C3b sobre CRIg wt (natural) recubierto y proteínas CRIg Q64R M86Y. La Figura 6B muestra la análisis en. estado estable de los datos de unión indican una Kd de 0.2 micromolar para el mutante Q64R/M86Y y 1.1 micromolar para CRIg natural.

La figura 7 es CRIg de afinidad mejorada que permanece selectivo por C3b. El análisis competitivo Alpha Screen se utilizó sobre C3 purificado y C3b.

Las figuras 8A a 8B muestran la potencia inhibidora de complemento mejorada de CRIg Q64R M86Y en comparación con CRIg natural. La Figura 8A muestra la inhibición de complemento por CRIg natural y CRIg Q46R M86Y se compararon utilizando un análisis hemolítico selectivo de vía alternativa utilizando eritrocitos de conejo y suero humano carente de Clq. La Figura 6B muestra la inhibición de complemento por CRIg natural y CRIg Q46R M86Y se compararon utilizando un análisis de vía alternativa basado en ELISA con placa de micropozos recubierta con LPS y suero humano carente de Clq.

Las figuras 9A a 9D muestran CRIg 164R M86Y que muestra eficacia mejorada in vivo con respecto a CRIg WT .

La Figura 9A muestra la calificaciones clínicas de ratones inyectados con suero KRN y tratados con diversas concentraciones y versiones de proteínas CRIg humanas y de ratón naturales y recombinantes , maduras en afinidad. Los datos presentan la media de 4-7 ratones por grupo. La Figura - 9B muestra la gráficas de dispersión de calificaciones clínicas de ratones individuales en el día 6 después de la transferencia de suero. La Figura 9C muestra la secciones teñidas con hematoxilina y eosina de ratones tratados con CRIg wt o CRIg Q64R M86Y 6 días después de la transferencia de suero. La Figura 9D muestra gráficas de dispersión de calificaciones histológicas de ratones tratados con CRIg wt o CRIg Q64R M86Y 6 días después de la transferencia de suero.

La figura 10 muesra una . generación paulatina de CRIg de mayor afinidad mediante presentación de fago. Los mutantes seleccionados de CRIg anti-C3b de cinco bibliotecas aleatori zadas suaves. Cada conjunto muestra clones que se seleccionaron de cada biblioteca en base en la afinidad de unión a C3b. La secuencia se indica por el código de aminoácido de una sola letra. Cada conjunto compara los mutantes individuales con secuencias de consenso y naturales (WT) originales. Los residuos han sido coloreados en consecuencia: azul - posición aleatorizada suave; gris - no aleatorizado ; amarillo los residuos- seleccionados, los cuales son diferentes de la forma natural (WT) . La figura 10 describe las SEC ID NOS: 21-63 y 63-67, respectivamente, en orden de aparición .

Tabla 1: Bibliotecas de fagos. Se diseñaron cinco bibliotecas aleatorizadas suaves para cubrir el área de contacto entre CRIg y C3b.

Biblioteca Posición Diversidad Biblioteca 1 E8-K15 1.2 X 1010 Biblioteca 2 R41-T47 1.4 X 1010 Biblioteca 3 S54-Q64 1.6 X 1010 Biblioteca 4 E85-Q99 L2 X 1010 Bihl taca S QI05-K111 1.9 X 1010 Tabla 3: Comparación de afinidades de unión, determinadas por ELISA competitiva e inhibición de hemolisis in vivo para mutantes seleccionados los mutantes con más de cinco veces de aumento en la afinidad de unión o la potencia in vivo se sombrean de amarillo.

ELISA competitiva Inhibición de hemolisis Nombre Mutantes MuCl 50 (nM) WT-P10680(nM) WT/Mu Mu Cl sn WT-P 10680 WT/Mu 1 Ll l E8Y 384 332 0.9X 439 591 IX L12 E8W 142 332 2X 176 657 4X L13 W14F 882 332 0.4X 293 596 2X LI5 E8Y/W14F 1274 332 0.3X 310 528 2X L21 G42D 453 332 0.7X 378 416 IX L22 D44H 338 332 IX 1207 591 0.5X L23 P45F 1266 332 0.3X 358 528 I.5X L24 042D D44 H P45F 238 332 IX 227 498 2X L31 Q60I 388 332 0.9X 78 416 5X L32 Q64R 34 332 I0X 293 549 2X L33 O60I O64R 255 332 IX 51 492 10X L4I M86Y 123 332 3X 124 657 5X L42 M86W 80 332 4X 226 635 3X L43 M86F 604 332 0.5X 185 794 4X L44 Q99 268 332 IX 588 520 IX L43 Q99R 1397 331 0.2X 818 682 0.8X L46 Q 9Y 468 332 0.7X 1715 663 0.4X L47 Q99F 296 332 IX 570 520 0.9X L48 Q99L 1376 332 0.2X 828 682 0.8X L49 M86W/Q99R 55 332 6X 201 635 3X 1410 M86F/Q99R 121 332 3X 273 746 3X un M86W/Q99K 1594 298 02X 1980 747 0.4X L51 Q105R 599 298 0.5X 901 794 0.9X L52 QI05K 491 298 0.6X 696 663 IX L53 K110D 128 298 2X 196 525 3X L56 I 10N 132 298 2X 376 746 I.2X L58 KI 10H 1105 298 0.3X 1393 686 0.5X L59 QI05RK1 ION 127 298 2X 180 525 3X L510 Q105R/K110D 1011 298 0.3X 954 686 0.7X L31 I Q105R KU0Q 166 298 2X 234 592 3X L512 QI05K/K110Q 937 298 0.3X 814 596 0.7X L514 O105 110D 46 298 6X 167 549 3X Tabla 4 : Comparación de afinidad de unión e inhibición de hemólisis in vivo para mutantes de segunda generación (las secuencias originales se muestran en gris) . Los mutantes con más de cinco veces de incremento con respecto al mutante original en la afinidad de unión se resaltan en azul, los mutantes con un incremento mayor de 90 veces en la afinidad de unión se resaltan en amarillo. De manera similar, los mutantes con una potencia in vivo mayor que las secuencias originales se resaltan en naranja.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION I. DEFINICIONES Los términos "CRIg", "PR0362" , "JAM4" y STIgMA" se utilizan intercambiablemente y se refieren a la secuencia nativa y los polipéptidos CRIg variantes.

Una "secuencia nativa" CRIg es un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido CRIg derivado de la naturaleza, sin importar su modo de preparación. Por lo tanto, la secuencia CRIg nativa se puede aislar de la naturaleza o se puede elaborar por medios recombinantes y/o sintéticos. El término "secuencia nativa de CRIg", específicamente abarca las -formas de CRIg que se presentan de manera natural, cortadas o secretadas (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes que se encuentran de manera natural (por ejemplo formas empalmadas de manera alternativa) y variantes alélicas de 'CRIg como se encuentran de manera natural. Los polipéptidos de CRIg " de secuencia nativa específicamente incluyen al polipéptido CRIg humano de 399 aminoácidos de largo, de longitud completa de la SEC ID NO: 2 (huCRIg, mostrado en la figura 1A y en la figura IB con o sin la secuencia de señal en la parte N-terminal, con o sin una metionina iniciadora en la posición 1 y con o sin cualquiera o la totalidad "de los dominios transmembranales aproximadamente en las posiciones de aminoácidos 277 a 307 de la SEC ID NO: 2. En una modalidad adicional, el polipéptido CRIg de secuencia nativa es la forma corta de 305 aminoácidos de CRIg humano (huCRIg-short , SEC ID NO: 4, que se- muestra en la figura 2A y en la figura 2B con o sin una secuencia de señal -en la parte N-terminal, con o sin la metionina iniciadora en la posición 1 y con o sin cualquiera o la totalidad del dominio transmembrana1 aproximadamente en las posiciones 183 a 213 de la SEC ID NO: 4. En una modalidad diferente, el polipéptido CRIg de secuencia nativa es un polipéptido CRIg murino de longitud completa de 280 aminoácidos de largo de la SEC ID NO: 6 (muCRIg, mostrado en la figura 3A a la figura 3C, con o sin.._una secuencia de señal N-terminal, con o sin la metionina iniciadora en la posición G y con o sin cualquiera o la totalidad del dominio .transmembranal en las posiciones de aminoácidos aproximadamente 181 a 211 de la SEC ID NO: 6. Los polipéptidos CRIg de otros animales no humanos incluyen primates superiores y mamíferos, y se incluyen específicamente dentro de esta definición.

. El "dominio extracelular" o "ECD" de CRIg se refiere a una forma del polipéptido CRIg la cual está esencialmente libre de los dominios transmembranal y citoplásmico . de las moléculas de longitud completa respectivas. Habitualmente , el ECD de CRIg tendrá menos de 1% de los dominios transmembranal y/o citoplásmico y, preferiblemente, tendrá menos de 0.5% de los dominios. El ECD de CRIg puede comprender los residuos aminoácidos 1 a aproximadamente 21 a X de la SEC ID NO: 2, 4 ó 6, en donde X es cualquier amionácido desde aproximadamente 271 a 281 en la SEC ID NO : 2, cualquier aminoácido desde aproximadamente 178 a 186 en la SEC ID NO: 4 y cualquier aminoácido desde aproximadamente 176 a 184 en la SEC ID NO: 6.

El término "variante de CRIg", como se utiliza en la presente, significa un polipéptido CRIg activo como se define en lo siguiente que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia nativa del polipéptido CRIg que incluye, sin limitación, huCRIg de longitud completa (SEC ID NO: 2) , huCRIg-short (SEC ID NO: 4) y muCRIg (SEC ID NO: 6) , cada uno con o sin la metionina iniciadora N-terminal, con o sin la secuencia de señal N-terminal, con o sin la totalidad o parte del dominio transmembranal y con o sin el dominio intracelular . En una modalidad particular, la variante CRIg tiene por lo menos aproximadamente 80% de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de longitud completa maduro desde dentro de la secuencia de la SEC ID NO: 2. En otra modalidad, la variante de CRIg tiene—por lo menos aproximadamente 80% de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de longitud completa maduro desde dentro de la secuencia de la SEC ID NO: - 4. En otra modalidad adicional, la variante CRIg tiene por lo menos aproximadamente 80% de homología de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de longitud completa maduro desde dentro de la secuencia de la SEC ID NO: 6. Habitualmente , una variante de CRIg tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos o por lo menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de aminoácidos, o por lo menos aproximadamente 90% de .identidad en la secuencia de aminoácidos, o por lo menos aproximadamente 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos, o por lo menos aproximadamente 98% de identidad en la secuencia de aminoácidos, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos madura desde dentro de la SEC ID NO: 2, 4 ó 6. A través de la descripción, incluyendo los ejemplos, los términos "natural" o "WT" se refiere a la forma corta de longitud completa madura de CRIg humano (CRIg(S)) (SEC ID NO: 4) y la numeración de los residuos aminoácidos en las variantes de CRIg se refiere a la secuencia de la SEC ID NO: 4.

Las variantes de CRIg de la presente invención son agonistas de CRIg como se define en lo siguiente. En particular, las variantes de CRIg. en la - presente mantienen unión selectiva hacia C3b con respecto a C3 , en donde la "unión selectiva" se utiliza para referi-rse a la unión a C3b y una carencia de unión a C3. Además, en una modalidad preferida, las variantes de CRIg de la presente invención presentan afinidad de unión aumentada hacia C3b en relación a un polipéptido CRIg de secuencia nativa, tal como la forma larga humana de CRIg (SEC ID NO: 2) . En diversas modalidades, el incremento en la afinidad de unión es de por lo menos aproximadamente 2 veces o por lo menos aproximadamente 3 veces, o por lo menos aproximadamente 4 veces o por lo menos aproximadamente 5 veces, o por lo menos aproximadamente 6 veces o por lo menos aproximadamente 7 veces, o por lo menos aproximadamente 8 veces, o por lo menos aproximadamente 9 veces, o por lo menos aproximadamente 10 veces, o por lo menos aproximadamente 15 veces, o por lo menos aproximadamente 20 veces, o por lo menos aproximadamente 25 veces, o por lo menos aproximadamente 30 veces , o por lo menos · aproximadamente 35 veces, o por lo menos aproximadamente 40 veces, veces , o por lo menos aproximadamente 45 veces , veces , o por lo menos aproximadamente 50 veces , veces , o por lo menos aproximadamente 55 veces , veces , o por lo menos aproximadamente 60 veces , veces , o por lo menos aproximadamente 65 veces , veces, o por lo menos aproximadamente 70 veces , veces , o por lo menos aproximadamente 75 veces , veces , o por lo menos aproximadamente 80 veces , veces, o por lo menos aproximadamente 85 veces, veces, o por lo menos aproximadamente 90 veces, veces, o por lo menos aproximadamente 95 veces, veces, o por lo menos aproximadamente 100 veces, en relación a la secuencia nativa del polipéptido CRIg humano de la SEC ID NO: 2. En otras modalidades, el incremento en la afinidad de unión hacia C3b en relación a la secuencia nativa del polipéptido CRIg humano de la SEC ID NO : - 2 es de aproximadamente 5- 10 veces , o aproximadamente 5- 15 veces , o aproximadamente 5 -20 veces , o aproximadamente 5-25 veces , o aproximadamente 5 -25 veces , o aproximadamente 5- 30 veces , o aproximadamente 5 -35 veces , o aproximadamente 5-40 veces , o aproximadamente 5 -45 veces , o aproximadamente 5- 50 veces , o aproximadamente 5 -55 veces, o aproximadamente 5- 60 veces , o aproximadamente 5 -65 veces , o aproximadamente 5- 70 veces , o aproximadamente 5 -75 veces , o aproximadamente 5- 80 veces , o aproximadamente 5 -85 veces , o aproximadamente 5-•90 veces , o aproximadamente 5 -95 veces , o aproximadamente 5-100 veces .

El término "por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las variantes de CRIg en la presente se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia variante de CRIg que son idénticos con los residuos aminoácidos en la secuencia CRIg nativa con los cuales se comparan, después de alinear las secuencias e introducir separaciones, si es necesario, para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar sustitución conservadora alguna como parte de la identidad de secuencia. Para secuencias que difieren en longitud, el porcentaje de identidad de secuencia se determina en relación a la secuencia más grande, a lo largo de la longitud completa de las secuencias más grandes. La alineación para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede obtener de diversas maneras que están dentro de la habilidad en el ámbito, por ejemplo, utilizando un programa de computadora disponible públicamente tal como el programa BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en el ámbito pueden determinar parámetros apropiados para medir alineación que incluyen cualquier algoritmo necesario para obtener alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. La identidad de secuencia después se calcula en relación a la secuencia más larga, es decir, incluso si una secuencia más corta muestra 100% de identidad de secuencia con una porción de una secuencia más larga, la identidad de secuencia general será menor de 100%.

El término "por ciento (%) de identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias codificantes para la variante de CRIg identificadas en la presente se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticas con los nucleótidos en la secuencia que codifica para la variante de CRIg, respectivamente, después de alinear las secuencias e introducir separaciones, si es necesario, para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico se puede obtener de diversas maneras que están dentro de la habilidad en el ámbito, por ejemplo, utilizando un programa de computadora disponible públicamente tal como el programa BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en el ámbito pueden determinar parámetros apropiados para medir alineación que incluyen . cualquier algoritmo necesario para obtener la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. La identidad de secuencia después se calcula en relación a la secuencia más grande, es decir, incluso si una secuencia más corta muestra 100% de identidad de secuencia con una porción de una secuencia más grande, la identidad de secuencia general será menor de 100%.

Se incluye en la definición de una variante de CRIg todas las variantes de secuencia de aminoácidos, como se definen en lo anterior, sin importar su modo de identificación o preparación. En la presente se incluyen específicamente variantes que han sido modificadas por sustitución, químicamente, enzimáticamente o por otros medios apropiados con una porción diferente de un aminoácido como se encuentra de manera natural, en la medida en que retengan una propiedad biológica cualitativa de una secuencia nativa de CRIg. La sustitución de aminoácidos que no se encuentra de manera natural, ejemplar, incluye aquellas descritas en lo siguiente.

Los residuos aminoácidos se clasifican en cuatro grupos principales: Acidos: El residuo tiene una carga negativa debido a la pérdida de un ión H a pH fisiológico y el residuo es atraído por solución acuosa de manera que busca las posiciones de superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en solución acuosa ..

Básico: El residuo tiene una carga positiva debido a la asociación con un ión H a pH fisiológico y el residuo es atraído por una solución acuosa de manera que busca las posiciones de superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico.

Neutros/no polares: Los residuos no están cargados a pH fisiológico y el residuo es repelido por la solución acuosa de manera que busca las porciones internas en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido es un medio acuoso. Estos residuos también se denominan "residuos hidrofóbicos " .

Neutros/polares: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, pero el residuo es atraído por solución acuosa de manera que busca las posiciones externas en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso.

Los residuos aminoácidos pueden ser clasificados adicionalmente como cíclicos o no cíclicos, aromáticos o no aromáticos con respecto a sus grupos de cadena lateral, estas designaciones son lugar común para los expertos en la técnica.

Los aminoácidos encontrados habitualmente los cuales no son codificados por el código genético, incluyen al ácido 2-aminoadípico (Aad) para Glu y Asp; ácido 2-aminopimélico (Apm) para Glu y Asp; ácido 2 -aminobutírico (Abu) para Met, Leu y otros aminoácidos alifáticos; ácido 2-aminoheptanoico (Ahe) para Met, Leu y otros aminoácidos alifáticos; ácido 2-aminoisobutírico (Aib) para Gly; ciclohexilalanina (Cha) para Val y Leu e lie; homoarginina (Har) para Arg y Lys ; ácido 2 , 3 -diaminopropiónico (Dpr) para Lys, Arg e His; N-etilglicina (EgGly) para Gly, Pro y Ala; N-etilglicina (EtGly) para Gly, Pro y Ala; N-etilasparagina (EtAsn) aira Asn y Gln; hidroxil-lisina (Hyl) para_ . Lys; alohidroxil-lisina (AHyl) para Lys; 3- (y ) hidroxiprolina (3Hyp, 4Hyp) para Pro, Ser y Thr; alo- isoleucina (Ale) para lie, Leu y Val; rho-amidinofenilalanina para Ala; N- metilglicina (MeGly, sarcosina) para Gly, Pro y Ala; N-metilisoleucina (Melle) para lie; norvalina (Nva) para Met y otros aminoácidos alifáticos; norleuclina (Melle) para Met y otros aminoácidos alifáticos; ornitina (Orn) para Lys, Arg e His; citrulina (Cit) y sulfóxido de metionina (MSO) para Thr, Asn y Gln; N-metilfenilalanina (MePhe) , trimetilfenilalanina , halo (F, Cl, Br e I) fenilalanina, trifluorofenilalanina para Phe.

Como se utiliza en la presente, el término " inmunoadhesina" designa moléculas similares de anticuerpo los cuales combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina . Estructuralmente , las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con especificidad de unión deseada la cual es diferente al reconocimiento de antígeno y sitios de unión de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo" ) , y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contiguos que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (que incluye a IgA-1 e IgA-2) , IgE, IgD o IgM.

El término "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de evitar el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. En consecuencia, el término "tratamiento" se refiere a un tratamiento tanto terapéutico como una profiláctico o medidas preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen a los que ya se encuentran con el trastorno así como aquellos en los cuales se desea evitar el trastorno.

"Mejorar", como se utiliza en la presente, se define en este documento como hacer más o superar.

El término "mamífero" , como se utiliza en la presente se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero que incluye, sin limitación, humanos, primates no humanos, animales domésticos y de granja y de zoológico, de casa o animales de mascota tales como caballos, cerdos, ganado, perros, gatos y hurones, etc. En una modalidad preferida de la invención, el mamífero es un primate superior, de manera más preferible humano.

El término "enfermedad asociada a complemento" se utiliza en la presente en el sentido más amplio e incluye todas las enfermedades y condiciones patológicas cuya patogénesis involucra anomalías de la activación del sistema de complemento tales como, por ejemplo, deficiencias de complemento. El término específicamente incluye enfermedades y condiciones patológicas que se benefician de la inhibición de C3 convertasa. El término incluye adicionalmente enfermedades y condiciones patológicas que se benefician de la inhibición que incluyen inhibición selectiva de la vía de complemento alternativa. Las enfermedades asociadas con complemento incluyen, sin limitación, enfermedades inflamatorias y enfermedades inmunitarias . tales como, por ejemplo, artritis reumatoide (RA) , síndrome de malestar respiratorio agudo (ARDS) , daño a tejido remoto después de isquemia y reperfusión, activación de complemento durante cirugía de derivación cardiopulmona , dermatomiositis , pénfigo, nefritis con lupus y glomerulonefritis y vasculitis resultante, derivación cardiopulmonar, disfunción endotelial coronaria inducida por cardioplej ía, glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II, nefropatía de IgA, fallo renal agudo, crioglobulemia , síndrome antifosfolipídico, degeneración macular relacionada con la edad, uveítis, retinopatía diabética, alotransplante , rechazo hiperagudo, hemodiálisis , síndrome de malestar pulmonar oclusivo crónico (COPD) , asma y neumonía de aspiración. En una modalidad preferida, la "enfermedad asociada a complemento" es una enfermedad en la cual la vía alternativa de complemento juega un papel prominente que incluye artritis reumatoide (RA) , condiciones oculares asociadas con complemento tal como degeneración macular relacionada con la edad, síndrome antifosfolipídico, daño por isquemia-reperfusión intestinal y renal y glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II.

El término "condición ocular asociada con complemento" se utiliza en la presente en el sentido más amplio e incluye todas las condiciones y enfermedades oculares cuya patología involucra al complemento que incluyen las vías clásica y alternativa, y en particular la vía alternativa de complemento. Se incluyen específicamente dentro de este grupo todas las condiciones y enfermedades oculares asociadas con la vía alternativa, la presentación, desarrollo o progreso del cual se puede controlar por la inhibición de la vía alternativa. Las condiciones oculares asociadas con complemento incluyen, sin limitación, enfermedades degenerativas maculares, tales como todas las etapas de degeneración macular relacionado con la edad (AMD) , que incluyen las formas seca y húmeda (no exudativa y exudativa), neovascularización coroidal (CNV) , uveítis, retinopatías diabéticas y otras relacionadas con isquemia, endoftalmitis y otras enfermedades neovasculares intraoculares tales como edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de vena retinal central (CRVO) , neovascularización de la córnea y neovascularización de la retina. Un grupo preferido de condiciones oculares asociadas con complemento incluye degeneración macular relacionada con la edad (AMD) que incluye AMD no exudativa (húmeda) y exudativa (seca o atrófica)., neovascularización coroidal (C V) , retinopatía diabética (DR) y endoftalmitis .

Los términos "enfermedad inflamatoria" y "trastorno inflamatorio" se utilizan de manera intercambiable y significan una enfermedad o trastorno en el cual un componente del sistema inmunitario de un mamífero provoca, media o contribuye de alguna otra manera a una respuesta inflamatoria que contribuye a la morbilidad del mamífero. También se incluyen enfermedades en las cuales la reducción de la respuesta inflamatoria tiene un efecto aminorante en el progreso de la enfermedad. Se incluyen dentro de este término las enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema inmunitorio que incluyen enfermedades inmunitarias .

El término enfermedad "mediada por linfocitos T" significa una enfermedad en la cual los linfocitos T median o contribuyen de alguna otra manera, directa o indirectamente, a la morbilidad en un mamífero. La enfermedad mediada por linfocitos T se puede asociar con efectos mediados por células, efectos mediados por linfocinas, etc. e incluso efectos asociados con linfocitos B si los linfocitos B son estimulados, por ejemplo, por las linfocinas secretadas por los linfocitos T.

Los ejemplos de enfermedades relacionadas con el sistema inmune e inflamatorias, algunas de las cuales son mediadas por linfocitos T incluyen, sin limitación, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) , lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondriloartropatías , esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis , polimiositis) , síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica inmunitaria (pancitopenia inmunitaria, hemoglobinuria nocturna paroxismica) trombocitopenia inmunitaria (púrpura trombocitopenia idiopática, trombocitopenia medida por el sistema inmunitario) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , diabetes mellitus, renopatía mediada por sistema inmunitario (glomerulonefritis , nefritis tubulointersticial) , enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía idiopática, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos) , hepatitis activa crónica inmunitaria, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades de pulmón inflamatorias y fibróticas (por ejemplo fibrosis quística) , enteropatia sensible a gluten, enfermedad de Whipple, enfermedades cutáneas inmunitarias o mediadas por el sistema inmunitario que incluyen enfermedades cutáneas bulosas, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas del pulmón tal como neumonía eosinofílica , fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis de hipersensibilidad, enfermedadés asociadas- con transplante que incluyen rechazo de injerto, enfermedad de rechazo inverso (injerto versus hospedador) , enfermedad de Alzheimer y ateroesclerosis .

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluyen administración simultánea (concurrente) y consecutiva, en cualquier orden.

Los términos "activo" o "actividad" en el contexto de variantes de los polipéptidos de CRIg de la invención se refiere a una o varias formas de polipéptidos las cuales retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas de un polipéptido de la invención nativo o como se encuentra de manera natural. Una actividad biológica preferida es la capacidad para unir C3b y/o alterar el complemento o la activación de complemento, en particular para inhibir la vía alternativa de complemento y/o C3 convertasa. La inhibición de C3 convertasa se puede medir, por ejemplo, al medir la inhibición del recambio de C3 en suero normal durante artritis inducida por colágeno o por anticuerpo, o inhibición de la deposición de C3 en las articulaciones artríticas.

La "actividad biológica" en el contexto de un polipéptido que imita la actividad biológica de CRIg se refiere, en parte, a la capacidad de las moléculas a unir C3b y/o alterar al complemento o la activación de complemento, en particular, para inhibir la vía alternativa de complemento y/o C3 convertasa.

El término "agonista" de CRIg se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica cualitativa (como se define en lo anterior) de una secuencia nativa del polipéptido CRIg.

El término "unido operablemente" se refiere a yuxtaposición, de manera que la función normal de los componente se puede llevar a cabo. Por lo tanto, una secuencia codificante "unida operablemente" a secuencias de control se refiere a una configuración en donde la secuencia codificante se puede expresar bajo el control de estas secuencias y en donde las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Por ejemplo, el ADN para un presecuencia o un líder secretor está unido operablemente a ADN para un polipéptido si se expresa como una proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mej orador está unido operablemente a una secuencia codificante si altera la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está unido operablemente a una secuencia codificante si se coloca de manera que facilita la traducción. El enlace se lleva a cabo por ligación en sitios de restricción convenientes. Sino existen tales sitios, entonces se utilizan adaptadores o enlazantes oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Las "secuencias de control" se refieren a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operablemente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariótas, por ejemplo incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión de ribosoma . Las células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadenilación y mej oradores.

Un "sistema de expresión" se refiere a secuencias de ADN que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control en enlace operable de manera que los hospedadores transformados con estas secuencias, son capaces de producir las proteínas codificadas. Para llevar a cabo la transformación, el sistema de expresión puede incluir un vector; no obstante, el ADN relevante después también se puede integrar en el cromosoma hospedador.

Como se utiliza en la presente, una "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de manera intercambiable y la totalidad de las designaciones incluyen la descendencia. De esta manera, los "transformantes" o "células transformadas" incluyen a la célula objeto primaria y cultivos derivados de la misma sin considerar el número de transferencias. También debe entenderse que toda la descendencia puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN debido a que pueden producirse mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye descendencia mutante que tiene la misma funcionalidad que la analizada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenden designaciones distintas, serán claro del contexto.

Los "plásmidos" se designan por "p" precedida y/o seguida por mayúsculas y/o números. Los plásmidos iniciales en la presente están disponibles comercialmente , son disponibles de manera pública en una base no restringida o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, otros plásmidos equivalentes se conocen en el ámbito y serán evidentes para una persona habitualmente experta en la técnica.

Una "biblioteca de presentación de fago" es una biblioteca de expresión de proteína que expresa una colección de secuencia de proteína clonadas como funciones con una proteína de recubrimiento de fago. De esta manera, la frase "biblioteca de presentación de fago" se refiere en la presente a una colección de fago (por ejemplo un fago filamentoso) en donde el fago expresa una proteína externa (típicamente heteróloga) . La proteína externa es libre para interactúa (unirse a) con otras porciones con las cuales se pone en contacto el fago. Cada fago que presenta una proteína externa es un "miembro" de la biblioteca de presentación de fagos .

El término "fago filamentoso" se refiere a una partícula viral capaz de presentar un polipéptido heterogéneo en su superficie e incluye, sin limitación, a fl, fd, Pfl y M13. El fago filamentoso puede contener un marcador seleccionable tal como tetraciclina (por ejemplo, "fd-tet"). Varios sistemas de presentación de fago filamentoso son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito (véase, por ejemplo, Zacher et al., Gene, 9: 127-140 (1980), Smith et al., Science, 228: 1315-1317 (1985); y Parmley y Smith', Gene, 73 : 305-318 (1988) ) .

El término "análisis sistemático" (panning) se utiliza para referirse a rondas múltiples de procedimientos de cribado para la identificación y aislamiento de fagos que presenten compuestos, tales como anticuerpos, con alta afinidad y especificidad por un objetivo.

La frase "residuos aminoácidos conservados" se utiliza para referirse a residuos aminoácidos que son idénticos entre dos o más secuencias de aminoácidos alineadas entre sí.

El complemento es un componente importante de la respuesta inmunitaria innata y adaptable, aunque los productos de división del complemento generados a través de la activación de cada una de las tres vías de complemento (clásica, alternativa y de lectina) pueden provocar inflamación y destrucción de tejido. De esta manera, la activación no controlada de complemento debido a una carencia de una regulación adecuada del complemento se ha asociado con diversas enfermedades inflamatorias crónicas. Los dominantes en esta cascada inflamatoria son los productos de división de complemento C3a y C5a que funcionan como quimioatrayentes y activadores de neutrófilos y macrofagos inflamatorios vía los receptores C3a y C5a ( ollnes, T.E., .C. Song, and J. D. Lambris. 2002. Complement in inflammatory tissue damage y disease. Trends Immuno1. 23: 61-64.

CRIg es un receptor de complemento descubierto recientemente el cual se expresa en una subpoblación de macrofagos residentes en tejido. Como un receptor funcional, el dominio IgV extracelular de CRIg es un inhibidor selectivo de una vía alternativa de complemento (Wiesmann et al., Nature, 444 (7116) : 217-20, 2006) . Una forma soluble de CRIg se ha demostrado que revierte la inflamación y pérdida ósea en modelos experimentales de artritis al inhibir la vía alternativa de complemento en la articulación. También se ha demostrado que la vía alternativa de complemento no solo es necesaria para la inducción de enfermedad sino también para el progreso de la enfermedad. De esta manera, la inhibición de la vía alternativa de CRIg constituye un camino terapéutico promisorio para la prevención y tratamiento de enfermedades y trastornos cuya patogénesis involucra la vía alternativa de complemento. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, Helmy et al., Cell, 125(1): 29-32 2006) y Katschke et al., J. Exp Med 204(6): 1319-1325 (2007).

No obstante, la afinidad de CRIg por la subunidad de convertasa C3b es baja (en un intervalo micromolar) . Con el fin de generar un inhibidor más potente para desarrollar un reactivo terapéutico, se utiliza la estructura cristalina de CRIg en el complejo con C3b como una guía y utilizamos la tecnología de presentación de fago para generar variantes CRIg con afinidad de unión mejorada por C3b.

Por lo tanto, la presente invención se relaciona con variantes de CRIg con propiedades mejoradas, tal como afinidad de unión mej orada .. por C3b y eficacia inhibidora mejorada.

Identificación de variantes de CRIg maduradas en afinidad Como se describe con mayor detalle en el ejemplo, la presentación de fago de proteína o bibliotecas peptídicas proporciona una metodología útil para la selección de variantes de CRIg con afinidad de unión mejorada por C3b y/u otras propiedades mejoradas tales como actividad biológica mejorada (Smith, G. P., (1991) Curr . Opin. Biotechnol . 2: 668-673) . Las proteínas de alta afinidad, mostradas de una manera monovalente como fusiones con la proteína de recubrimiento M13 del gen III (Clackson, T., (1994) et al., Trends Biotechnol. 12: 173-183) se pueden identificar por clonación y secuenciado del ADN correspondiente empacado en partículas de fagémido después de varias rondas de selección por unión.

La maduración de afinidad utilizando la presentación de fago se ha descrito, por ejemplo, en Lowman et al., Biochemistry 30(45): 10832-10838 (1991), véase también Hawkins et al., J. Mol Biol . 254: 889-896 (1992) y en el ejemplo siguiente. Aunque no se limite estrictamente a la siguiente descripción, este procedimiento se puede describir brevemente como: varios sitios dentro de una región predeterminada se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los mutantes de anticuerpo generados de esta manera se presentan de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas y como fusiones al producto del gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. El fago que expresa los diversos mutantes puede formar ciclos a través de rondas de selección de unión seguido por aislamiento y secuenciado de aquellos mutantes los cuales presentan alta afinidad. El método también se describe en la patente de E.U.A. No. 5,750,373, expedida el · 12 de mayo de 1998.

Un procedimiento modificado involucra presentación de afinidad acumulada se describe en Cunningham, B. C. et al., EMBO J. 13(11), 2508-2515 (1994). El método proporciona un método para seleccionar polipéptidos de unión novedosos que comprende a) construir un vector de expresión replicable que comprende a un primer gen que codifica para un polipéptido, un segundo gen que codifica para al menos una porción de una proteína de recubrimiento de fago natural o silvestre en donde el primer y segundo genes son heterólogos y elemento regulador de transcripción unido operablemente al primero y segundo genes, por lo que se forma una fusión de gen que codifica para una proteína de fusión; b) mutar el vector en una o más posiciones seleccionadas dentro del primer gen por lo que se forma una familia de plásmidos relacionados; c) transformar células hospedadoras adecuadas con los plásmidos; d) infectar las células hospedadoras transformadas con un fago cooperador (helper) que tiene un gen que codifica para la proteína de recubrimiento de fago; e) cultivar las células hospedadoras infectadas transformadas bajo condiciones adecuadas para formar partículas de fagémido recombinantes que contienen por lo menos una porción del plásmido capaces de transformar el hospedador, las condiciones se ajustan de manera que no más de una cantidad menor de partículas de fagémido muestran más de una copia de la proteína de fusión sobre la superficie de la partícula; f) poner en contacto las partículas de fagémido con una molécula objetivo de manera que por lo menos una porción de las partículas del fagémido se unen a la molécula objetivo; y g) separar las partículas de fagémido que se unen de aquellas que no lo hacen. Preferiblemente, el método comprende además transformar células hospedadoras adecuadas con partículas de fagémido recombinantes que se unen a la molécula objetivo y se repiten las etapas d) a g) una o más veces.

Se hace notar que aunque las variantes de CRIg de la presente invención se han identificado utilizando presentación de fagos, también se pueden utilizar otras técnicas y otras técnicas de presentación para identificar variantes de CRIg con propiedades mejoradas que incluyen variantes de CRIg maduradas en afinidad.

Las variantes de CRIg maduradas en afinidad de la presente invención se diseñan para cubrir el área de contacto entre CRIg y C3b, la cual se ha identificado utilizando la estructura cristalina de CRIg y un complejo C3b:CRIg descrito en la publicación de solicitud de E.U.A. No. 20080045697. En particular, como se muestra en la tabla 1, las bibliotecas 1-5 se diseñan para cubrir los residuos E8-K15, R41-T47, S54-Q64, E85-Q99 y Q105-K111, respectivamente de la secuencia nativa de longitud completa de molécula de CRIg de la SEC ID NO : 2.

En una modalidad, las variantes de CRIg en la presente contienen una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de las posiciones 8, 14, 18, 42, 44, 45, 60, 64, 86, 99, 105 y 110 en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

Las variantes de CRIg representativas en la presente se establecen en la -tabla 3.

Preferiblemente, ..la sustitución es en una o más posiciones de aminoácidos 60, 64, 86, 99., 105 y 110 de la secuencia de aminoácidos de CRIg nativo de longitud completa de la SEC ID NO: 2.

Sin limitación, las variantes de CRIg maduradas en afinidad incluyen específicamente una o más de las siguientes sustituciones dentro de la SEC ID NO: 2: E8W, 14F, E84Y/W14F; P45F; G42D/D44H/P45F ; Q60I; Q64R; Q601/Q64R; M86Y; M86W, M86F, M86W/Q9R; M86F/Q99R; K110D, K11N; Q105R/K110N; Q105R/K110Q; Q105K/K110D.

Las variantes adicionales de la secuencia nativa de CRIg de la SEC ID NO: 2 con dos o más sustituciones de aminoácidos se muestran en la tabla 3. Específicamente se incluyen dentro de este grupo Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y, Q60I/Q64R/G42D; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q60I/Q64R/K110N; Q60I/Q105R/ 110N; M86Y/E8Y; M86Y/G42D/D44H/P45F,- M86Y/P45F; M86Y/G42D/D44H/P45F; y M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q195R/M86Y/Q105K/M86Y/Q195R/K110N.

Las variantes de CRIg preferidas en la presente comprenden una mutación que se selecciona -del grupo que consiste de Q60I; Q64R; ' Q60I/Q64R; 86Y; Q99L; Q105K/K110D; E8 /Q105R/K110N; Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y; Q60I/Q64R/G42D ; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q601/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q601/Q64R/K110N; M86Y/P45F; y M86Y/Q105K.

Las variantes particularmente preferidas comprenden las mutaciones Q60I/Q64R/M86Y o Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F .

Las variantes las cuales contienen una o más de las mutaciones incluidas en lo anterior o en las tablas 3 y 4 pero que de otra manera retienen la secuencia CRIg nativa de la SEC ID NO: 2 se incluyen específicamente en la presente. Las variantes se denominarán en la presente mediante el listado de la mutación particular seguido por "CRIg". Así, por ejemplo, una variante la cual difiere de la secuencia nativa de CRIg de la SEC ID NO: 2 únicamente por la mutación E8W se denominará como "E8W CRIg" , una variante la cual difiere de la secuencia nativa de CRIg de la SEC ID NO: 2 únicamente por las mutaciones Q60I/Q64R/M86Y se le denominará como "Q60I/Q64R/M86Y CRIg", etc.

Preparación de variantes de CRIg Están disponibles diversas técnicas las cuales se pueden utilizar para producir ADN el cual puede codificar para proteínas para la síntesis recombinante de variantes de CRIg de la invención. Por ejemplo, es posible derivar ADN basado en secuencias de ADN como se encuentran de manera natural que codifican para cambios en una secuencia de aminoácidos de la proteína resultante. Este ADN mutante se puede utilizar para obtener variante de CRIg de la presente invención. Estas técnicas contemplan, en forma simplificada, la obtención de un gen que codifica para un polipéptido CRIg nativo, modificación de los genes por técnicas recombinantes tales como las descritas en lo siguiente, inserción de los genes en un vector de expresión apropiado, inserción del vector en una célula hospedadora apropiada, cultivo de la célula hospedadora para provocar la expresión de la variante CRIg deseada y purificación de la molécula producida de esta manera .

De una manera ún poco más particular, una secuencia de ADN que codifica para una variante de CRIg de la presente invención se obtiene por construcción sintética de la secuencia de ADN como se describe en libros de texto estándar tales como, por ejemplo, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., (1989) . a . Mutagénesis mediada por oligonucleótidos La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es el método preferido para preparar variantes por sustitución, supresión e inserción de un polipéptido CRIg nativo o un fragmento del mismo. Esta técnica es bien conocida en el ámbito como se describe por Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987). Brevemente, el ácido nucleico que' codifica para la secuencia polipeptídica inicial se altera al hibridizar un oligonucleótido que codifica para la mutación deseada a una plantilla de ADN, en donde la plantilla es la forma de cadena única del plásmido que contiene la secuencia de ADN no alterada o nativo del ácido nucleico codificante. Después de hibridización, se utiliza una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa de la plantilla la cual de esta manera incorporará el cebador oligonucleotídico y codificará para la alteración seleccionada del ácido nucleico inicial.

Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de por lo menos una longitud de 25 nucleótidos. Un oligonucleótido óptimo tendrá 12 a 15 nucleótidos que sean completamente complementarios a la plantilla en ambos lados de uno o varios de los nucleótidos que codifican para la mutación. Este asegura que el oligonucleótido hibridizará apropiadamente con la molécula de plantilla de ADN de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas conocidas en el ámbito tales como se describe por Crea et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 75: 5765 (1978).

Si se utiliza presentación de fago, la plantilla de ADN puede solo ser generada por aquellos vectores que se derivan de vectores de bacteriófago M13 (están disponibles los vectores M13mpl8 y M13mpl9, disponibles comúnmente) o aquellos vectores que contienen un origen de replicación de fago de cadena sencilla como se describe por Viera et al., Meth. Enzymol . 153: 3 (1987) . De esta manera, el ADN que se va a numerar debe ser insertado en uno de estos vectores con el fin de generar una plantilla de- cadena sencilla. La producción de la plantilla de cadena sencilla se describe en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., supra.

Para alterar la secuencia de ADN nativo, el oligonucleótido es hibridizado a una plantilla de cadena sencilla bajo condiciones de hibridización adecuadas. Una enzima polimerizante de ADN, habitualmente el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I después se agrega para sintetizar la cadena complementaria de la plantilla utilizando el oligonucleótido como un cebador para síntesis. De esta manera se produce una molécula heterodúplex de modo tal que una cadena de ADN codifica para la forma mutada de CRIg y la otra cadena (la plantilla original) codifica para la. secuencia no alterada nativa de CRIg. Esta molécula heterodúplex después se transforma en una célula hospedadora adecuada, habitualmente un procariote tal como E. coli JM-101. Después del crecimiento de la células, se siembran en placas sobre placas de agarosa y se criban utilizando el cebador oligonucleotídico radiomarcado con 32fosfato para identificar las colonias bacterianas que contienen el ADN mutado.

El método descrito inmediatamente en lo anterior se puede modificar de manera que se genera una molécula homodúplex en donde ambas cadenas del plásmido contienen una o varias mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleótido de cadena sencilla, se reasocia con la plantilla de cadena sencilla como se describe en lo anterior. Una mezcla de tres desoxirribonucleótidos , desoxirriboadenosina (dATP) , desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTTP) , se combinan con una tio-desoxirribocitosina modificada denominada dCTP- (aS) (Amersham) . Esta mezcla se agrega al complejo plantilla-oligonucleótido . Ante la adición de ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADn idéntico a la plantilla excepto para las bases mutadas . Además, esta cadena nueva de ADN contendrá dCTP- (aS) en vez de dCTP, el cual sirve para protegerlo de la digestión por endonucleasa de restricción. Después de que la cadena de plantilla del heterodúplex de cadena doble es cortado con una enzima de restricción apropiada, la cadena plantilla" se puede digerir con nucleasa ExoIII u otra nucleasa apropiada pasando la región que contiene uno o varios sitios que van a ser . mutagenizados . La reacción después se detiene para dejar la molécula que es de cadena sencilla solo parcialmente. Un ADN de cadena doble completo homodúplex e esta manera se forma utilizando ADN polimeraza en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótido, ATP, y ADN ligasa. Esta molécula homodúplex después se puede transformar en una célula hospedadora adecuada tal como E. coli JM101, como se describe en lo anterior.

Los mutantes con más de un aminoácido que va a ser sustituido se pueden generar de una o varias maneras. Si los aminoácidos se localizan cercanos juntos en la cadena polipeptídica , pueden ser mutados simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica para la totalidad de las sustituciones de aminoácidos deseadas. No obstante, si los aminoácidos se localizan a cierta distancia entre sí (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos) , es más difícil generar un oligonucleótido único que codifique para la totalidad de los cambios deseados. En vez de esto, se pueden utilizar uno o dos métodos alternativos.

En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que se va a sustituir. Los oligonucleótidos después se reasocian con un ADN de plantilla de cadena sencilla simultáneamente y la segunda cadena ADN que es sintetizada de la plantilla codificará para todas las sustituciones de aminoácidos " deseadas . El método alternativo involucra dos o más rondas de. mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es como se describe para los mutantes sencillos: se utiliza ADN natural para la plantilla y el oligonucleótido que codifica para una o varias de las sustituciones del primer aminoácido deseado se reasocian a esta plantilla y después se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como la plantilla De esta manera, esta plantilla contiene de antemano una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica para una o varias de las sustituciones de aminoácidos deseados adicionales después se reasocia a esta plantilla y la cadena resultante de ADN ahora codifica para mutaciones tanto de la primera como de la segunda ronda de mutagénesis. Este ADN resultante se puede utilizar como una plantilla en una tercera ronda de mutagénesis, y así sucesivamente. b . Mutagénesis en cásete Este método también es un método preferido para preparar variantes por sustitución, supresión e inserción de CRIg. El método se basa en lo descrito por Wells et al. Gene 34: 315 (1985). El material inicial es el plásmido (u otro vector) que comprende el gen 1, el gen que se va a mutar. Se identifican uno o varios de los codones que se van a mutar en el ácido nucleico que codifica para la molécula CRIg inicial. Debe existir un sitio de endonucleasa de restricción único en cada lado de uno o varios de los sitios de mutación identificados. Sino existen los mencionados sitios de restricción, se pueden, generar utilizando el método de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrita antes para introducirlos en los lugares apropiados en el gen 1. Después de que se han introducido los sitios de restricción en el plásmido, el . plásmido se corta . en estos sitios para linealizarlos . Un oligonucleótido de cadena doble que codifica para la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene una o varias de las mutaciones deseadas se sintetiza utilizando procedimientos estándar. Las dos cadenas se sintetizan por separado y después se hibridizan juntas · utilizando técnicas estándar. Este oligonucleótido de cadena doble se denomina como un cásete. Este cásete se diseña para tener extremos 3' y 5' que son compatibles con los extremos del plásmido linealizado, de manera que puede ser ligado directamente al plásmido. Este plásmido ahora contiene la secuencia de ADN mutada de CRIg. c . Producción recombinante de variantes de CRIg El ADN que codifica para variantes después se inserta en un plásmido o vector apropiado. El vector se utiliza para transformar una célula hospedadora . En general, los vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicación y control los cuales se derivan de especies compatibles con la célula hospedadora se utilizan en relación con estos hospedadores . El vector habitualmente presenta un sitio de replicación así como secuencias las cuales codifican para proteínas que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas.

Por ejemplo, E. coli se puede transformar utilizando pBR322; un plásmido derivado de una especie de E. coli (Mandel, M. et al., (1970) J. Mol. Biol . 53:154). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y por lo tanto proporciona un medio fácil para selección. Otros vectores incluyen características diferentes tales como promotores diferentes los cuales con frecuencia son importantes en la expresión. Por ejemplo, los plásmidos pKK223-3, pDR720 y pPL-? representan vectores de expresión con los promotores tac, trp o PL que actualmente están disponibles (Pharmacia Biotechnology) .

Se pueden construir otros vectores preferidos utilizando técnicas estándar al combinar rasgos relevantes de los vectores descritos en la presente. Los rasgos relevantes del vector incluyen el promotor, el sitio de unión de ribosoma, el gen variante o fusión de gen, la secuencia de señal, los marcadores de resistencia a antibiótico, el número de copias y los orígenes de replicación apropiados.

Las células hospedadoras adecuadas para clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente incluyen células procarióticas , de levadura o eucariotas superiores. Las procariotas adecuadas . para este propósito incluyen eubacterias tales como, por ejemplo, organismos gramnegativos o grampositivos , enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serattia marescens, y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989) , Pseudomonas tal como P. aeruginosa y Streptomyces . Un E. coli preferido que clona hospedadores es E. coli 294 (ATCC 31,446) aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes.

Además de los procariotes, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o las levaduras son adecuados para la clonación o expresión de hospedadores para vectores que codifican para anticuerpo. Saccharomyces cerevisiae o la levadura de panadero común es el utilizado más comúnmente entre los microorganismos hospedadores eucarióticos inferiores. No obstante, muchos de otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y son útiles en la presente tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Nuerospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y hospedadores Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas baculovirales y variantes así como células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila elanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori se han identificado. Una diversidad de cepas virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y los virus se pueden utilizar como el virus de la presente de acuerdo con esta invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate y tabaco también pueden ser utilizados como hospedadores .

No obstante, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/ -DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (T 4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2) ; células de riñon de perro (MDCK, ATCC CCL 34) ; células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano ( 138, ATCC CCL 75) ; células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y línea de hepatoma humano (Hep G2) . - Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos en lo anterior para la producción de las variantes de CRIg en la presente y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas.

Las células hospedadoras utilizadas para producir las variantes de CRIg de esta invención se pueden cultivar en una diversidad de medios . Son adecuados los medios disponibles comercialmente tales como FIO de Ham (Sigma) , medio esencial mínimo (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) , y medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) , (Sigma) para el cultivo de células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patente de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657;866; 4,927,762; 4,560,655; O 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente de E.U.A. No. Re. 30,985 se pueden utilizar como medios de cultivo para células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede suplementar según se necesite con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como GENTAMYCINMR) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que son conocidas por los expertos en el ámbito. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y similares son aquellas utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para expresión y serán evidentes para una persona habitualmente experta en el ámbito.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes , la variante de CRIg se puede producir intracelularmente , en el espacio periplásmico o se puede secretar directamente al medio. Si la variante de CRIg se produce intracelularmente, como una primera etapa, se separan los residuos particulados, ya sean células hospedadoras o células lisadas, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración . Cuando la variante de CRIg es secretada al . medio, los sobrenadantes de los sistemas de expresión generalmente se concentran primero utilizando filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas precedentes para inhibir la proteólisis y . se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La variante de CRIg preparada a partir de las células se puede purificar por técnicas conocidas utilizando, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y/o cromatografía de afinidad.

Modificaciones adicionales de las variantes de CRIg Las variantes de CRIg de la presente invención también se pueden modificar de manera tal que formen una molécula quimérica que comprende una variante de CRIg, que incluye fragmentos de las mismas, fusionadas a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácido. En una modalidad, la molécula quimérica comprende una fusión de variante de CRIg o un fragmento de la misma, con un polipéptido etiqueta el cual proporciona un epítopo al cual se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta . El epítopo etiqueta generalmente se coloca en la parte amino o carboxilo terminal del polipéptido CRIg variante. La presencia de las formas etiquetadas con epítopo de la variante de CRIg se pueden detectar utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, el suministro de la etiqueta epítopo permite que el polipéptido CRIg sea purificado fácilmente por purificación definida utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta epítopo. Varios polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en el ámbito. Los ejemplos incluyen etiquetas poli -histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poly-his-gly) ; y el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell Biol . , 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4 , B7 y 9E10 para el mismo (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)); y la etiqueta de glucoproteína D de virus de herpes simple (gD) y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6);547-553 (1990)). Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag (Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)); el péptido epítopo KT3 (Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)); el péptido epítopo cuadratura-tubulina [Skinner et al., J. Biol . Chem. , 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta del péptido de proteína gen 10 T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA, 87:6393-6397 (1990)).

En otra modalidad, la molécula quimérica puede comprender una fusión de la variante de CRIg o un fragmento de la misma con una inmunoglobuiina o una región particular de una inmunoglobuiina. Para una forma divalente de la molécula quimérica, la fusión puede ser a la región Fe de una molécula IgG. Estos polipéptidos de fusión son moléculas similares a anticuerpo las cuales combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios. constantes de inmunoglobuiina y con frecuencia se les denomina como inmunoadhesinas . Estructuralmente , las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada la cual- es diferente del sitio de un anticuerpo en donde se produce el reconocimiento y unión del antígeno (es decir, es "heterólogo" ) , y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina . La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (que incluye IgA-1 e IgA-2) , IgE, IgD o IgM.

El diseño de inmunoadhesina más sencillo y más directo combina una o varias de las regiones de unión de la proteína "adhesina" con. las regiones de visagra y Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina. Habitualmente , cuando se preparan las quimeras de CRIg- inmunoglobulina de la presente invención, el ácido nucleico que codifica para el dominio extracelular de CRIg se fusionará, en la parte C-terminal, con el ácido nucleico que codifica para la parte N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunogloublina, no obstante, también. es posible fusiones en la parte N-terminal.

Típicamente, en las fusiones el polipéptido quimérico codificado retendrá los dominios de bisagra y CH2 y CH3 por lo menos funcionalmente activos de la región constante de una cadena pesada de inmunogloublina. Las fusiones también se realizan en la parte C-terminal de la. porción Fe de un dominio constante o inmediatamente a la parte N-terminal de CH1 de la cadena pesada o la región correspondiente de la cadena ligera.

El sitio preciso en el cual se realiza la fusión no es crítico; los sitios particulares son bien conocidos y se pueden seleccionar con el fin de optimizar la actividad biológica, secreción o características de unión de las quimeras de CRIg- inmunoglobulina .

En algunas modalidades, las quimeras de CRIg-inmunoglobulina se ensamblan como monómeros o un heteromultímero u homomultímero y particularmente como dímeros o tetrámeros, esencialmente como se ilustra en el documento WO 91/08298.

En una modalidad preferida, la secuencia de dominio extracelular de CRIg se fusiona a la parte N-terminal de la porción C-terminal de un anticuerpo (en particular, el dominio Fe) que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo inmunoglobulina Gx (IgG 1) . Es posible fusionar la totalidad de la región constante de cadena pesada a la secuencia de dominio extracelular de CRIg. No obstante, de manera más preferible, una secuencia que comienza en la región de bisagra justo corriente arriba del sitio de separación de papaína (el cual define químicamente a IgG Fe; residuo 216, tomando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada que es 114, o sitios análogos de otras inmunoglobulinas) se utiliza en la fusión. En una modalidad particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos de CRIg se fusiona a la región de bisagra y CH2 y CH3 , o a CH1, la región de bisagra, los dominios CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgGl, IgG2 o Ig3. El sitio preciso en el cual se realiza la fusión no es crítico y el sitio óptimo se puede determinar por experimentación sistemática.

En algunas modalidades, las quimeras de CRIg-inmunoglobulina se ensamblan como multímero, particularmente como homo-dímeros o -tetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas. Una unidad básica estructural de cuatro cadenas es a partir de la cual existen IgG, IgD e IgE. Cuatro unidades se repiten en las inmunoglobulinas de peso molecular superior; IgM existe generalmente como un pentámero de cuatro unidades básicas que se mantienen juntas por enlaces" de sulfuro. La globulina IgA y ocasionalmente la globulina IgG también existen en forma multimérica en suero. En el caso del multímero, cada cuatro unidades pueden ser iguales o diferentes.

De manera alternativa, la secuencia del dominio extracelular de CRIg se puede insertar entre las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina de manera que se obtiene una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En esta modalidad, la secuencia de CRIg se fusiona al extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina , ya sea entre el dominio de bisagra y CH2 o entre los dominios CH2 y CH3. Se han reportado construcciones similares por Hoogenboom et al., Mol. Immunol . , 28:1027-1037 (1991).

Aunque no se requiere la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de la presente invención, puede estar presente una cadena ligera de inmunoglobulina ya sea asociada de manera covalente a un polipéptido de fusión de cadena pesada de CRIg-inmunoglobulina o fusionado directamente al dominio extracelular de CRIg. En el primer caso, el -ADN que codifica para la cadena ligera de inmunoglobulina típicamente se coexpresa con el ADN que codifica para la proteína de fusión de CRIg-cadena pesada de inmunoglobulina. Cuando se realiza la secreción, el híbrido de cadena pesada y la cadena ligera se asociarán covalentemente para proporcionar una estructura similar a inmunoglobulina que comprende dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unida a disulfuro. Los métodos adecuados para la preparación de las estructuras se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 4,816,567 expedida el 28 de marzo de 1989.

Composiciones farmacéuticas Las variantes de CRIg de la presente invención se pueden administrar para el tratamiento de enfermedades cuya patología involucra la vía de complemento alternativa.

Se preparan formulaciones terapéuticas para almacenamiento mediante mezclado de la molécula activa que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences décima sexta edición, Osol , A. Ed.

[1980] ) , en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y las concentraciones utilizadas e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol ; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextriñas ; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como T EENMR, PLURONICSMR o polietilenglicol (PEG) .

Las lipofecciones o los liposomas también se pueden utilizar para suministrar el polipéptido, anticuerpo o un fragmento de anticuerpo al interior de la célula. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpo, el fragmento más pequeño el cual se une específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo es el que se prefiere. Por ejemplo, en base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, las moléculas peptídicas se pueden diseñar de manera que retengan la capacidad de unir la secuencia.de proteína objetivo. Los péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o se pueden producir por tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893

[1993] ) .

La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según se necesite para la indicación particular que sea tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se perjudican entre sí. Las moléculas-.están presentes habitualmente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito deseado.

Las moléculas activas también pueden ser atrapadas en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coascervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metacilato de metilo) , respectivamente en sistemas de suministro de medicamento coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Las técnicas se describen en Remington's Pharmaceuticals Sciences décima sexta edición, Osol, A. Ed. (1980) .

Las formulaciones para ser utilizadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que se encuentran en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (metacrilato de 2 -hidroxietilo) o poli (alcohol vinílico) ) , polilactidas (patente de E.U.A. número 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOTMR (microesferas inyectables constituidas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutírico . Aunque los polímeros tales, como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más breves. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o formar agregados como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C lo que resulta en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad . Se han diseñado estrategias razonadas para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se . descubre que el mecanismo de agregación es una formación del enlace S-S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, se puede obtener estabilización al modificar residuos sulfhidrilo, liofilizar a partir de soluciones ácidas, controlar el contenido de humedad, utilizar aditivos apropiados y desarrollar composiciones de matriz polimérica específicas .

Métodos de Tratamiento Como un resultado de su capacidad para inhibir la activación de complemento, en particular la vía de complemento alternativa, las variantes de CRIg de la presente invención encuentran utilidad en la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas con complemento y condiciones patológicas. Las enfermedades y condiciones incluyen, .sin limitación, enfermedades inflamatorias y inmunitarias asociadas con complemento.

Los ejemplos específicos de enfermedades y trastornos asociados con complemento, inflamatorias y relacionadas con el sistema inmunitario que pueden ser el objetivo de las variantes de CRIg en la presente se han incluido anteriormente.

Los detalles adicionales de la invención se -ilustran por los siguientes, ej emplos no limitantes.

EJEMPLO 1 PREPARACION DE VARIANTES CRIg MADURADAS EN AFINIDAD Materiales y Métodos Materiales : Materiales - Enzimas y fago cooperador M13-K07 (New England Biolabs) ; placas de inmuno placa Maxisorp (Nunc. Roskilde, Dinamarca); placa de polipropileno de fondo en U de 96 pozos (COSTAR; Cat . #3365); placa sin unión, de fondo plano de 96 pozos (NUNC; Cat. #269620); conjugado de peroxidasa de rábano/anticuerpo anti-M13 (Pharmacia) ; 3 , 31 , 5 , 51 -tetrametilbencidina, sustrato de H202 peroxidasa (TEB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc) ; Escherichia coli XLl-blue y E. coli. BL21(DE3) (Stratagene) ; albúmina sérica bovina (BSA) y Tween 20 (Sigma) ; Ni-NTA agarosa (Qiagen) ; eritrocitos de conejo (Colorado Serum Company; Cat . #CS1081) ; amortiguador gelatina Veronal (GVB) [100 mi de amortiguador Veronal (Bio hittaker; Cat. #12-624E) ; gelatina (bovina cutánea tipo B; SIGMA; Cat. #G9391-100G) ; suero carente de Clq (CompTech; Cat. #A300) ; proteína fH (Complement Technology; Cat. #A137) ; mAb anti -FLAG-HRP en glicerol 50%, Sigma, Cat. #A-8592 1.1 mg/ml .

Construcción de las bibliotecas CRIg de presentación de fago Un fragmento de ADN que codifica para CRIg se liga en un vector fagémido digerido con Xhol y Spel (p3DvlzPDZ-gD) (Kunkel et al., Methods Enzymol . 154:367-382 (1987)) como control natural y plantilla para el diseño de variantes de CRIg. Después, las plantillas con el codón de detención TAA en cada residuo dirigidas para aleatorización se preparan a partir de células CJ239 de E. coli (Kunkel et al., 1987, supra) . Se utiliza una estrategia de aleatorización suave para selección de variantes de CRIg en las cuales la tasa de mutación de aproximadamente 50% se introduce en la posición seleccionada mediante el uso de una estrategia oligonucleotídica envenenada con mezclas 70-10-10-10 de bases que favorecen nucleótidos naturales. En el diseño de bibliotecas: 5=50% de A, 10% de G, 10% de C y 10% de T; 6 = 50% de G, 10% de A, 10% de C y 10% de T; 7 = 50% de C, 10% de A, 10 de G y 10% de T; 8 = 50% de T, 10% de A, 10% de G y 10% de C.

Se han diseñado cinco bibliotecas.

BCR1, ATC CTG GAA GTG CAA 656 (SEC ID NO: 7) AGT GTA ACA GGA CCT 866 (SEC ID NO: 8) 555 GGG GAT GTG AAT CTT (SEC ID NO: 9) en la biblioteca 1; BCR2 , AAG TGG CTG GTA CAA 768 (SEC ID NO: 10) 668 TCA 657 775 688 577 ACT TTT (SEC ID NO: 11) 786 CGT 657 TCT TCT GGA GAC CAT (SEC ID NO: 12) en la biblioteca 2; BCR3 , TTT CTA CGT GAC TCT (SEC ID NO: 13) 877 668 657 757 588 756 756 678 555 TAC 756 GGC CGC CTG CAT GTVG (SEC ID NO: 14) ; en la biblioteca 3; BCR , CAA TTG AGC ACC CTG (SEC ID NO: 15) 656 586 657 GAC 768 AGC CAC TAC ACG TGT 656 (SEC ID NO: 16) GTC ACC TGG 756 (SEC ID NO: 17) ACT CCT GAT GGC -MC (SEC ID NO: 18) en la biblioteca 4; BCR5, ACT CCT GAT GGC AAC 756 (SEC ID NO: 19) GTC 688 768 657 555 ATT ACT GAG CTC CGT (SEC ID NO: 20) en la biblioteca 5.

La mutagénesis dirigida a sitio para las mutaciones puntuales se lleva a cabo como en lo anterior mediante la utilización -de codones apropiados para producir las mutaciones respectivas y se confirman por secuencia los clones correctos.

Clasificación de biblioteca y cribado para seleccionar variantes de CRIg: Inmunoplacas Maxisorp se recubren durante la noche a 4°C con 5 µ9/p?1 de C3b y se bloquean durante 1 h a temperatura ambiente con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y albúmina sérica bovina (BSA) 0.05% (p/v) . Las bibliotecas de fago se agregan a las placas recubiertas C3b y se incuban a temperatura ambiente durante 3 h. Las placas luego se lavan diez veces y el fago unido se eluye con HCl 50 mM y se neutraliza con un volumen igual de base Tris 1.0 M (pH 7.5) . Los fagos recuperados se amplifican por paso a través de E. coli XLl-blue y se utilizan para rondas adicionales de selecciones por unión. Después de 5 rondas, se seleccionan 12 clones individuales de cada biblioteca y se les hace crecer en un formato de 96 pozos en 500 µ? de caldo 2YT suplementado con carbenicilina y fago cooperador M13-K07. Se agregan directamente sobrenadantes de cultivo diluidos en serie dobles en placas de 384 pozos recubiertas con C3b, anti-gD, BSA y proteína no relacionada como posiciones designadas. Se mide la afinidad de unión para calcular la concentración de fago proporcionándose C3b significativa mayor que anti-gD pero no BSA y proteína no relacionada. Se fija la concentración de fago, se criba aproximadamente 200 clones de cada biblioteca en el mismo formato y se seleccionan 24-48 clones en los cuales se muestra que se unen significativamente a C3b sobre anti-gD desde cada biblioteca, y después se les secuencia para análisis.

ELISA de fago competitiva Para calcular la afinidad de unión se utiliza una prueba de ELISA de fago modificada. Las placas de microtitulación de 96 pozos se recubren con 2 yg/ml de C3b en amortiguador carbonato 50 mM (pH 9.6) a 4°C durante la noche. Las placas después se bloquean con PBS, BSA 0.5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Las variantes de CRIg que presentan fago se diluyen de manera seriada en amortiguador PBT y se mide la unión para calcular la concentración de fago que proporciona 50% de una señal en saturación. Al restar la concentración de fago se fija y preincuba durante 2 h con diluciones seriadas de C3b, y después se transfiere la mezcla a placas de análisis recubiertas con C3b. Después de incubar 15 min, las placas se lavan con PBS, Tween 20 0.05% y se incuba en 30 min con conjugado de peroxidasa de rábano/anticuerpo anti-M13 (dilución 1:5000 en amortiguador PBT) . Las placas se lavan, se revelan con sustrato TMB, se suspenden con H3P04 1.0 M y se leen espectrofotométricamente a 450 nm. Se calcula la afinidad (CI50) como la concentración de C3b competente que resulta en la unión a fagémico semimáxima.

Purificación de proteína Una colonia única de E. coli BL21 (DE3) que alberga el plásmido de expresión se inocula en 30 mi de medio LB suplementado con 50 ug/ml de carbenicilina (medio LB/carb) y se hace crecer durante la noche a 37°C. La bacteria se cosecha, se lava, se resuspende y se inocula en 500 mi de medio LB/carb. El cultivo se hace crecer a 37°C hasta la fase 5 logarítmica media (A60o = 0.8) . La expresión de proteína se induce con isopropil 1-tio- -D-galactopiranósido 0.4 mM y el cultivo se hace crecer durante 24 h a 30°C. Las bacterias se sedimentan por centrifugación a 4000 g durante 15 min, se lavan dos veces con solución salina amortiguada con fosfato 0 (OBS) y se congelan durante 8 h a -80°C. El sedimento se resuspende en 50 mi de PBS y las bacterias se lisan al hacerlas pasar a través de" un equipo procesador de microfluidizador o equipo de sonicado. Las proteínas variantes de CRIg se purifican con 2 mi de agarosa NI-NTA y 5 filtración en gel .

ELISA de unión competitiva de fase fluida para mutCRIg-huFc : Se diluye huCRIg (L) -LFH a 2 g/ml en TBS , pH 7.4 y se recubre sobre placas de fondo plano de 384 pozos MaxisorP 0 (Nunc, Neptune, NJ) al incubar durante la noche (16-18 h) a 4°C (25 µ?/????) . Las placas se lavan 3 veces con ; · amortiguador de lavado (PBS, pH- 7.4, Tween 20 0.05%) y 50 µ?/???? de amortiguador de bloque (PBS, pH 7.4, BSA 0.05%) se agrega a cada pozo. Se permite que las placas se bloqueen 5 durante 1-3 h; esta y todas las incubaciones subsecuentes se realizan en un agitador orbital a temperatura ambiente. Durante la etapa de bloqueo, se diluye C3b (purificado en Genentech) a 20 nM en amortiguador de análisis (PBS pH 7.4, BSA 0.5%, Tween-20 0.05%) y las moléculas mutCRIg-huFc se diluyen de manera seriada en amortiguador de análisis, sobre un intervalo de concentración de 20,000 - 0.34 nM. Las moléculas C3b y mutCRIg-huFc después se mezclan 1:1 y se permite que preincuben durante 0.5-1 h. Las placas bloqueadas se lavan 3 veces (como se describe en lo anterior) y se agregan a las placas de reacción (25 µ?/????) los complejos C3b mutCRIg-huFc . Después de incubación durante 1-2 h, las placas de ELISA se lavan tres veces (como se describe en lo anterior), se detectan C3b unido a placa mediante la adición de anticuerpo anti-C3b humano (clon 5F202, US Biological, Swampscott, MA; 600 ng/ml, 25 µ?/????) . Las placas se incuban durante 1-2 h y se lavan como se describe en lo anterior. Después se agrega IgG anti-Fc murino conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch, West grove, PA) diluido 1:2000 (25 µ?/????) y las placas se incuban durante 1-2 h. Después de un lavado final, se agregan 25 µ?/???? de sustrato TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) a las placas de ELISA. Se- detiene el desarrollo de color después de aproximadamente 8 min al agregar 25 µ?/???? de ácido fosfórico 1.0M. La absorbancia a 450 nm y 650 nm se determina utilizando lectores de placa de microtitulación SpectraMax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) .

Análisis de activación de complemento: Se evalúa la capacidad de mutCRIg-Fc para inhibir la activación de complemento utilizando el equipo de vía alternativa de sistema . de complemento ieslabMR (Alpco Diagnostics, Salem, NH) . Se preparan mutCRIg-Fc diluido de manera seriada (400 a 0.2 nM) y suero humano deficiente en Clq (5%) (Complement Technology, Tyler, TX) a dos veces la concentración deseada final, se mezcla 1:1 y se preincuba durante 5 min en un agitador orbital a 300 rpm antes de agregar a placas de ELISA recubiertas con LPS (100 µ?/????) . El resto del análisis es siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, en las placas de ELISA se incuban durante 60-70 min a 37°C y después se lavan tres veces en amortiguador de lavado (PBS, pH 7.4, Tween 20 0.05%), se agrega a la placa de ELISA 100 µ?/???? de conjugado anti-C5b-9. Después de incubación durante 30 min a temperatura ambiente, la placa de ELISA se lava como se describe en lo anterior y se agregan por pozos 100 µ? de sustrato y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 min adicionales. Se detiene el desarrollo de color al agregar 50 µ?/???? de EDTA 5 mM. La absorbancia a 405 nm se determina utilizando un lector de placa de microtitulación MultiSkan Ascent (Thermo Fisher Scientific, Milford, MA) Análisis de inhibición de hemolisis Se lavan eritrocitos de conejo (Colorado Serum Company, Denver, CO) tres veces con amortiguador Veronal (Sigma, St. Louis, MO) que contiene gelatina cutánea bovina 0.1% (Sigma) (GVB) , se centrifuga a 1500 rpm, 4°C durante 10 minutos para cada lavado. Después de la etapa de centrifugación final, las células se resuspenden en GVB a una concentración final de 2 x 109 células/ml . Los inhibidores de complemento se diluyen de manera seriada en GVB y se agregan en placas de polipropileno de fondo en U de 96 pozos (Costar, Cambridge, MA) a 50 µ?/???? seguido por 20 µ?/???? de eritrocitos de conejo diluidos 1:2 en MgCl2 0.1 M/EGTA 0.1M/GVB. La cascada de complemento en placa se activa por la adición de 30 µ?/???? de suero carente de Clq (Complement Technology, Tyler, TX) , se prediluye 1:3 con GVB. Una o varias de las placas se incuban con agitación ligera durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de detener la reacción con 100 µ?/???? de EDTA 10 mM/GVB. Después de centrifugar una o varias de las placas a 1500 rpm durante 5 minutos los sobrenadantes se transfieren a placas de 96 pozos sin unión, de fondo plano y transparente (Nunc, Neptune, NJ) y se leen las densidades ópticas a 412 nm utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) .

Análisis competitivo de cribado ot La reactividad cruzada potencial de las moléculas CRIg mutantes a C3 se evalúa utilizando el equipo de detección . de histidina AlphaScreenMR (Nikel Chelate) (PerkinElmer, Waltham, A) . C3 y C3b humanos diluidos de manera seriada (3,000 a 0.7 nM) así como concentraciones fijas de iC3b biotinado (30 nM) y tanto CRIg mutante (mutCRIg) como moléculas de CRIg naturales (15-60 nM) se preparan a tres veces la concentración deseada final, se mezclan 1:1:1 y se preincuban a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador orbital a 3000 TPM. Una mezcla 1:1 de esferas donadoras de estreptavidina y esferas aceptoras de quelato de níquel (0.1 mg/ml cada una) se preparan a cuatro veces la concentración deseada final y se agregan a la reacción. La placa de reacción se incuba a temperatura ambiente durante 60 minutos en un agitador orbital a 3000 rpm protegido de la luz. La placa se analiza en un analizador de microplaca AlphaQuestMR-HTS (PerkinElmer, Waltham, MA) .

Resonancia de Plasmón de superficie Las afinidades de C3b por CRIG mutante y natural se determinaron mediante la utilización de mediciones de resonancia de plasmón de superficie en un instrumento BiacoreMR A100 (GE healthcare) . Se utilizó un formato de captación anti-Fc y se calculó KD a partir de las mediciones de unión al equilibrio. Se preparó el chip sensor utilizando el equipo de captación anti-muFc (BR-1008-38) siguiendo instrucciones suministradas por el fabricante. Se diluyó CRIg mutante o natural en amortiguador de corrimiento (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM, Tween-20 0.01%) a 1 µ?/ml y se realizaron inyecciones de 60 µ? de manera que se captaron -100 RU de proteína de fusión en un punto de la superficie del chip. Los sensogramas se registraron para inyecciones durante 10 min de soluciones de concentración variada de C3b sobre el punto CRIg con sustracción de la señal para un punto de referencia que contiene el anticuerpo de captación pero no CRIg. Se obtuvieron los datos de una serie de diluciones dobles de C3b que varían en concentración desde 4 µ? hasta 15.6 nM con el caudal a 10 µ?/min y una temperatura de 25°C. La superficie se regeneró entre los ciclos de unión por una segunda inyección de Gly-HCl 10 mM, pH 1.7. Los valores meseta obtenidos al final de cada inyección de C3b se utilizaron para calcular kD utilizando el algoritmo de afinidad utilizando el programa de evaluación Biacore A100 Evaluation Software vi .1 (Safsten et al. (2006) Anal. Biochem. 353 :181) .

Resultados Diseño de biblioteca de fago ~ Utilizamos la estructura cristalina de CRIg en complejo con C3b para diseñar bibliotecas objetivo. Se diseñaron cinco bibliotecas para cubrir el área de contacto entre CRIg y C3b (figuras 4A a 4C) . Las bibliotecas CRIg se construyeron como una fusión de la proteína de recubrimiento menor g3p en un vector de presentación de fago monovalente (Zhang et al., J Biol Chem 281 (31) : 22299-311 (2006)). Introdujimos codones de detención por mutagénesis en una porción que codifica para CRIg del plásmido fago en cada residuo que , va a ser aleatorizado . Cada construcción que contiene un codón de detención después se utiliza para generar la biblioteca de presentación de fago (véase materiales y métodos) . Se utilizó una estrategia de "aleatorización suave" para seleccionar aglutinantes para mantener una polarización de secuencia natural de manera que las posiciones seleccionadas se mutaran únicamente 50% del tiempo. La totalidad de las cinco bibliotecas se obtuvieron con una diversidad promedio de >1010 secuencias independientes por biblioteca (tabla 1) .

Selecciones con biblioteca de fago CRIg Después de cuatro rondas de selección de unión se obtuvieron 38 clones únicos de las cinco bibliotecas (Figura 10) . En la biblioteca 1, se conservó lisina en la posición 15. Los residuos aromáticos tirosina y triptófano, sustituyen a ácido glutámico en la posición 8. En la posición 14 está ocupada ya sea por triptófano original o una fenilalanina homologa. En la biblioteca 2 se secuenciaron 24 clones y todos ellos mostraron consenso. La posición 42, 46 y 47 se conservaron como forma natural. La asparagina, histidina y fenilalanina sustituyeron a la secuencia natural en la posición 43, 44 y 45. En la biblioteca 3 se aleatorizaron 10 posiciones y las secuencias mostraron conservación completa en la posición 54, 55, 56, 57, 58, 61, 62 y 63. La isoleucina o lisina se ocupo en la posición 60. En la posición 64, la glutamina se sustituyó por arginina o se conservó. En la biblioteca 4 los residuos aromáticos dominaron en la posición 86 y los residuos básicos homólogos, arginina y lisina, dominaron en la posición 99. Las posiciones 85, 87 y 95 también se aleatorizaron de manera suave, pero aparecen altamente conservadas. En la biblioteca 5 dos residuos básicos homólogos significativos, lisina y arginina se prefirieron con respecto a glutamina en la posición 105. Los residuos cargados negativamente, ácido aspártico o residuos ácidos, asparagina dominaron en la posición 110.

Calculamos las afinidades de algunos de los mutantes por ELISA de fago competitiva (datos no mostrados) y encontramos que existen clones en la biblioteca 3 los cuales son aproximadamente ocho veces mejores para unir C3b en comparación con CRIg natural.

Determinación de afinidad de unión in vitro y potencia biológica in vivo Con el fin de identificar residuos críticos al incrementar la afinidad de unión a C3b y la potencia en análisis de inhibición hemolítica, el siguiente enfoque fue diseñar la segunda generación de variantes de CRIg al incorporar mutación dominante única y mantener otras posiciones como natural o al seleccionar clones con 2-3 alta afinidad a partir de las bibliotecas de fago de la primera generación las cuales se determinaron por ELISA de fago. Con el fin de medir con precisión la afinidad y potencia de nuestras mutantes expresamos la totalidad de los variantes y las proteínas aisladas. Los resultados (tabla 3) del análisis de inhibición hemolítica mostraron que L12 de la biblioteca 1, L33 de la biblioteca 3 y L41 de la biblioteca 4 aumentaron de manera significativa la potencia en 4 a 10 veces en comparación con la forma natural en un análisis hemolítico. L32 de la biblioteca 3 mostró una CI50 mejorada 10 veces en comparación con CRIg natural . Los datos también demostraron que la afinidad de unión y la potencia de los análisis basados en celda no están correlacionados.

Combinación de Mutantes En base en los resultados de las bibliotecas de la segunda generación se diseñaron la tercera generación de mutantes con el fin de mejorar aún más la potencia en el análisis hemolítico y en la afinidad de unión. Seleccionarmos tres de los mutantes biológicamente más potentes (L12-8W, L33-Q60I/L32-Q64R y L41-M86Y) y uno de los mutantes de afinidad por unión más altos (L32-Q64R) como una plantilla. Después combinamos estos mutantes con otros clones biológicos potentes obtenidos en la segunda generación de bibliotecas para determinar un conjunto óptimo de mutaciones que incrementen la potencia en el análisis hemolítico y la afinidad de unión. Expresamos y purificamos las variantes de CRIg para análisis detallado. Los datos muestran (tabla 4) que los mutantes combinados de L12 no mejoran la potencia de inhibición e incluso muestran una actividad menor en comparación con el mutante original pese a una afinidad de unión 3-6 veces mayor de los mutantes WL41 y WL59. Dentro de los mutantes de L32, RL41 demostró una afinidad de unión 1.8 veces mejor que la forma natural y una potencia 6 veces mejor en el análisis hemolítico. Todos los mutantes del grupo L33 mostraron la afinidad de unión aumentada significativa; un incremento de aproximadamente 27-226 veces en comparación con la forma natural, aunque la potencia en el análisis de hemolisis no aumentó de manera significativa. También percibimos que 60I-64R y 86Y están involucrados en la mayor parte de los clones combinados mejorados en afinidad.

Afinidad de unión mejorada y actividad inhibidora de complemento del mutante CRIg Q64R M86Y Seleccionamos el mutante Q64R M86Y, el cual tiene la afinidad más grande en la prueba de ELISA competitiva (figuras 4A a 4C y tabla 3) para análisis adicional. Con el fin de determinar la afinidad de unión de CRIg wt y CRIg Q64R M86Y para C3b se realizó el análisis Biacore para CRIg wt y CRIg Q64R M86Y. La afinidad de CRIg Q64R M86Y mejoró 5 veces con respecto a CRIg natural (figuras 6A a 6B) . Los estudios previos han demostrado que CRIg wt se une selectivamente a C3b pero no a C3 nativo (Wiesman et al., Nature 444 (7116) : 217-20 , 2006). Dado que la mutagénesis puede cambiar esta selectividad comparamos la afinidad de CRIg Q64R M86Y para C3b versus C3 en un análisis competitivo en fase fluida -screen. CRIg Q64R M86Y compitió con C3b soluble pero no con C3 soluble, lo que indica que la mutagénesis no altera la selectividad de CRIg por el componente activo C3b (figura 7) . Esta selectividad se confirmó adicionalmente por análisis de estos residuos en la estructura de CRIg Q64R M86Y en complejo con C3b (datos no mostrados) .

Para probar si la afinidad mejorada y la selectividad conservada para C3b se traduce en una eficacia mejorada, se probó CRIg Q64R M86Y versus CRIg wt en un análisis hemolítico basado en eritrocitos selectivo para, la vía alternativa de complemento. CRIg Q64R M86Y mostró una CI50 mejorada 4 veces en comparación con CRIg wt (figura 8A) . Para fundamentar aún más la potencia mejorada hacia la inhibición de complemento de la vía alternativa se comparó la actividad inhibidora de CRIg Q64R M86Y con CRIg wt en un análisis basado en LPS selectivo para la vía alternativa de complemento. Aquí, CRIg mostró una mejoría de 180 veces en la CI50 en comparación con la proteína recombinante natural. CRIg wt y CRIg Q64R M86Y no alteraron la activación de complemento a través de la vía clásica. Por lo tanto, una sustitución de dos aminoácidos en el límite de unión CRIg-C3b resulta en una molécula con afinidad de unión mejorada y actividad inhibidora de complemento superior en dos análisis diferentes con selectividad por la vía alternativa de complemento.

Para determinar adicionalmente si la afinidad de unión aumentada y la potencia se traducen en una eficacia terapéutica mejorada, comparamos el efecto protector de la versión wt y Q64R M86Y de CRIg en un modelo de artritis por transferencia de suero. Estudios previos han demostrado que CRIg inhibe de manera potente la inflamación y destrucción ósea en artritis inducida por colágeno o por anticuerpo (Katschke et al., J. Exp . Med 204 (6) : 1319-1325 (2007)).

Aquí, se probó la eficacia de CRIg en un tercer modelo preclínico de artritis mediada por complejo inmunitario. Un modelo murino espontáneo de artritis reumatoide, K/BxN, imita muchas de las características clínicas e histológicas de la enfermedad humana con artritis. A ratones se. les inyectó .con 50 µ? de suero obtenido de ratones K/BxN en el día 0. Se verificó diariamente a los animales y el grado de enfermedad se clasificó por observación visual. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 6.

Se inyectó a los ratones subcutáneamente con la cantidad indicada ya sea de isotipo control o con las proteínas recombinantes hCRIg-mlgGl o hCRIg-RL41 -mlgl diariamente en ???µ? de solución salina estéril, comenzando en el día -1.

Monitoreo y calificación: Calificación para cada pata 0 = Sin evidencia de eritema e hinchazón 1 = Eritema e hinchazón ligera confinada a la pata media (tarso) o tobillo 2 = Eritema e hinchazón ligera que se extiende desde el tobillo a la parte media del pie 3 = Eritema e hinchazón moderada que se extiende desde el tobillo a las articulaciones metatarsicas 4 = Eritema e hinchazón grave que abarca el tobillo, el pie y los dedos Media de calificación = suma de las calificaciones de las 4 patas Las etapas de enfermedad, enfermedad ligera (media de calificación 1-3), moderada (media de calificación 4-8) y grave (media de calificación 9-superior) . La media de calificación refleja el número de articulaciones involucradas.

En el día 6 se recolecta muestra de sangre por punción intracardíaca bajo anestesia antes de la matanza. La cantidad de proteínas de fusión hCRIG-Fc se mide utilizando el suero. Las articulaciones se recolectaron para evaluación histológica.

La transferencia de suero de ratones KRN a receptores Balb/c resulta en una respuesta inmunitaria rápida y robusta caracterizada por inflamación simétrica de las articulaciones. La inducción de artritis es mediada por autoanticuerpos anti-glucosa-6 -fosfato isomerasa que forma complejos inmunitarios proinflamatorios en las articulaciones (Kouskoff, V., Korganow, A.S., Duchatelle, V., Degott, C, Benoist, C, and Mathis, D. (1996). Organ-specific disease provoke by systemic autoimmunity . Cell 87, 811-822). El desarrollo de artritis depende completamente de una vía de complemento alternativa intacta y de la función del receptor Fe, como se muestra por la carencia de enfermedad en ratones quienes carecen de componentes de complemento de la vía alternativa y en ratones deficientes en la cadena gamma del receptor Fe común (Ji, H., Ohmura, K. , Mahmood, U. , Lee, D.M., Hofhuis, F.M., Boackle, S.A., Takahashi, K. , Holers, V.M., Walport, M.; Gerard, C, et al. (2002). Arthritis critically dependet on innate immune system players. Immunity 16, 157-168) . Debido al inicio rápido y la gravedad de enfermedad, el tratamiento con proteína de fusión CRIg wt-Fc reduce calificaciones de artritis en solo 22% (figura 9A, figura 9B) . El tratamiento con CRIg Q64R M86Y muestra una reducción en las calificaciones de artritis en 66%. El examen histológico muestra una reducción significativa en la infiltración de células inmunitarias que consisten principalmente de neutrófilos y macrófagos en ratones tratados con CRIg Q64R M86Y versus CRIg wt o ratones tratados con proteína de fusión, control (figura 9C, figura 9D) . Las concentraciones en suero de CRIg wt y CRIg Q64R M86Y son similares, lo que indica que la diferencia en las calificaciones de artritis no se. debe a una diferencia en la semivida de CRIg wt versus la proteína CRIg Q64R M86Y. Por lo tanto, demostramos que la afinidad de unión aumentada de CRIg C3b objetivo se traduce en una eficacia terapéutica mejorada de manera significativa.

Todas las referencias de patente y de literatura mencionadas en la presente especificación se incorporan expresamente en la presente como referencia en su totalidad.

Aunque la presente invención se ha descrito con referencia a lo que se consideran como las modalidades específicas, debe entenderse que la invención no se limita a las modalidades, por el contrario, la invención se pretende que abarque diversas modificaciones y equivalentes incluidos dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas.

Se hace contar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una variante de CRIg caracterizada porque comprende una sustitución de aminoácidos en una región que se selecciona del grupo que consiste de E8-K15, R41-T47, S54-Q64, E85-Q99 y Q105-K111 o la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se une selectivamente a C3b con respecto a C3 o un fragmento del mismo.

3. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene una afinidad de unión aumentada a C3b con respecto a la secuencia nativa humana de CRIg la SEC ID NO : 2 .

4. La variante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la afinidad de unión se incrementa en por lo menos 2 veces o por lo menos 5 veces, o por lo menos 10 veces o por lo menos 90 veces.

5. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es un inhibidor más potente de la vía de complemento alternativa que la secuencia nativa humana de CRIg la SEC ID NO: 2.

6. La variante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es por lo menos 2 veces, o por lo menos 5 veces, o por lo menos 10 veces más potente que la secuencia nativa humana de CRIg de la SEC ID NO: 2.

7. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de las posiciones 8, 14, 18, 42, 44, 45, 60, 64, 86, 99, 105 y 110 en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

- 8. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una sustitución de aminoácidos en una o más posiciones de aminoácidos 60, 64, 86, 99, 105 y 110 en la secuencia de -. aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

9. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: (i) una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste de E8W, 14F, E84Y/W14F; P45F; G42D/D44H/P45F; Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; M86W, M86F, M86W/Q9R; M86F/Q99R; K110D, K11N, Q105R/K110N; Q105R/K110Q; y Q105K/K110D; o (ii) una o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste de Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y, Q60I/Q64R/G42D; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q60I/Q64R/K110N; Q60I/Q105R/K110N; M86Y/E8Y; M86Y/G42D/D44H/P45F; M86Y/P45F; M86Y/G42D/D44H/P45F; y M86Y/Q99K/M86Y/Q99R/M86Y/Q195R/M86Y/Q105K/M86Y/Q195R/K110N; o (iii) una- o más sustituciones que se seleccionan del grupo que consiste de Q60I; Q64R; Q60I/Q64R; M86Y; Q99L; Q105K/K110D; E8W/Q105R/K110N; Q64R/M86Y; Q60I/Q64R/E8Y; Q60I/Q64R/G42D; Q60I/Q64R/P45F; Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F; Q60I/Q64R/M86Y; Q601/Q64R/Q105R; Q60I/Q64R/Q105K; Q601/Q64R/K110N; M86Y/P45F; y M86Y/Q105K; o (iv) una sustitución - Q60I/Q64R/M86Y o Q60I/Q64R/G42D/D44H/P45F en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2.

10. Una molécula quimérica caracterizada porque comprende una variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque es una inmunoadhesina .

12. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la variante de CRIg es más corta que CRIg de longitud completa de la SEC ID NO: 2.

13. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende un dominio extracelular de CRlg.

14. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una variante de CRlg de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una inmunoadhesina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Uso de una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una variante de CRlg de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una inmunoadhesina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para elaborar un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad o condición asociada a complemento.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la enfermedad asociada a complemento es una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria .

17. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la enfermedad asociada a complemento se selecciona del grupo que consiste de: (i) artritis reumatoide (RA) , síndrome de malestar respiratorio adulto (ARDS) , daño a tejido remoto después de isquemia y reperfusión, activación de complemento durante cirugía de derivación cardiopulmonar, dermatomiositis , pénfigo, lupus nefrítico y glomerulonefritis y vasculitis resultante, derivación cardiopulmonar, disfunción endotelial coronaria inducida por cardioplej ia, glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II, nefropatía I&A, fallo renal agudo, crioglobulinemia, síndrome antifosfolipídico, degeneración macular relacionada con la edad, uveítis, retinopatía diabética, alotransplante , rechazo hiperagudo, hemodiálisis , síndrome de malestar pulmonar oclusivo crónico (COPD) , asma, neumonía por aspiración, urticaria, urticaria idiopática crónica, síndrome urémico hemolítico, endometriosis , choque cardiogénico, daño por isquemia y reperfusión y esclerosis múltiple (MS) ; o (ii) enfermedad de intestino inflamatorio (IBD) , lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías , esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis , polimiositis) , síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica inmunitaria (pancitopenia inmunitaria, hemoglobinuria nocturna paroxísmica) , trombocitopenia inmunitaria (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada por sistema inmunitario) , tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , diabetes mellitus, renopatía mediada por sistema inmunitario (glomerulonefritis , nefritis tubolointersticial) , enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía idiopática, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D y E y otros virus no hepatotrópicos ) , hepatitis activa crónica inmunitaria, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas (por ejemplo fibrosis quística) , enteropatía sensible a gluten, enfermedad de Whipple, enfermedades cutáneas inmunitarias o mediadas por el sistema inmunitario que incluyen enfermedades cutáneas bulosas, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas de los pulmones tales como neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis con hipersensibilidad, enfermedades asociadas a transplante que incluyen rechazo de injerto, enfermedad de rechazo inverso (injerto versus hospedador) , enfermedad de Alzheimer, hemoglobinurea nocturna paroxísmica, angiodema hereditario, aterosclerosis y glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II; o en donde (iii) la enfermedad asociada a complemento es artritis reumatoide (RA) ; o en donde (iv) la enfermedad asociada a complemento es una condición ocular asociada a complemento.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la condición ocular asociada a complemento se selecciona del grupo que consiste de todas las etapas de degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , uveítis, retinopatías diabéticas y otras relacionadas con isquemia, endoftalmitis y otras enfermedades neovasculares intraoculares .

19. El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde la enfermedad neovascular intraocular se selecciona del grupo que consiste de edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, oclusión de la vena retinal central (CRVO) , neovascularización de la córnea y neovascularización retinal.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la condición ocular asociada con complemento se selecciona del grupo que consiste de degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , neovascularización coroidal (CNV) , retinopatía diabética (DR) y endoftalmitis tal como AMD húmeda o AMD seca o atrófica.

21. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde el sujeto es un humano.

22. Uso de una cantidad eficaz de una variante de CRIg de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una inmunoadhesina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para elaborar un medicamento para inhibición de la producción de un fragmento de complemento C3b en un mamífero.

23. Uso de para una cantidad eficaz de una variante de CRIg de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una inmunoadhesina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para elaborar un medicamento para inhibición selectiva de la vía de complemento alternativa en un mamífero.