MX2010010993A - Formulaciones liofilizadas de adn para expresion mejorada de adn de plasmido. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una formulación de ADN liofilizada de una composición que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo.

Description

FORMULACIONES LIOFILIZADAS DE ADN PARA EXPRESIÓN MEJORADA DE ADN DE PLÁSMIDO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una formulación de ADN liofilizada de una composición que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La liofilización frecuentemente es una formulación preferida para materiales terapéuticos debido a la estabilidad de término prolongado de muchos materiales aumenta en el estado liofilizado. Sin embargo, para ADN de plásmido, las formulaciones liofilizadas no son las formulaciones de elección. En la mayoría de las pruebas clínicas usando ADN desnudo (plásmido no hecho complejo) como un vector de entrega, la formulación preferida ha sido una formulación líquida.

Mientras que el ADN de plásmido liofilizado puede ser una forma preferida de almacenamiento, las formulaciones liofilizadas para ADN de plásmido se han considerado que ocasionan una reducción en eficiencia de expresión de gene. La liofilización ocasiona la remoción de la esfera de hidratación alrededor de una molécula. Para ADN, parece que hay aproximadamente 20 moléculas de agua por par de nucleótido ligado más estrechamente a ADN que no forman una estructura semejante a hielo después de enfriamiento a baja temperatura. Durante la deshidratación de ADN sobre sales higroscópicas a 0% de humedad relativa, solamente cinco o seis moléculas de agua permanecen. De esta manera, la liofilización puede aumentar la estabilidad del ADN bajo almacenamiento de término prolongado, pero también puede ocasionar daño durante el proceso de liofilización inicial, potencialmente a través de cambios en la estructura secundaria de ADN o la concentración de elementos reactivos tales como metales contaminantes. Por lo tanto, un mecanismo potencial para pérdida de eficiencia de expresión de gene de ADN de plásmido liofilizado puede ser a través de un cambio estructural bruto al plásmido.

En Poxon y col, Pharmaceutical Development and Technology 5:115-122 (2000), los autores demostraron que la liofilización de un ADN de plásmido (pRL-C V) ) resultó en una pérfida estadísticamente significativa de eficiencia de transfección. Un ensayo de biofuncionalidad, que mide la actividad de transfección, demostró una pérdida de más de 75% de actividad de ADN de plásmido después de la liofilización como se compara con plásmido de control que permaneció en solución. Mientras que Poxon y col usaron carbohidratos para mejorar la actividad de transfección disminuida in Vitro de un plásmido no terapéutico, pRL-CMV que expresa luciferasa de Renilla, almacenado en tampón de IDTA, Poxon y col no dirigieron el uso de formulaciones de ADN desnudo liofilizadas in vivo para tratamiento o prevención de enfermedad.

Por lo tanto, existe una necesidad en el ramo de una formulación liofilizada estable que no afecte la eficiencia de expresión de gene. La presente invención proporciona una formulación liofilizada para ADN de plásmido que no solamente conserva la actividad biológica del gene expresado, sino que, en ciertos casos, es capaz de mejorar la actividad biológica.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a formulación de · ADN liofilizada. En un aspecto de la invención, una formulación de ADN, antes de liofilización comprende un ADN de plásmido, sal y un carbohidrato; y en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo. En otro aspecto de la invención, la formulación de ADN es liofilizada. En otro aspecto de la invención, la formulación de ADN liofilizada se reconstituye.

En una modalidad, el carbohidrato de la formulación de ADN de la presente invención es uno mono-, oligo-, o polisacárido tal como sucrosa, glucosa, lactosa, trehalosa, arabinosa, pentosa, ribosa, xilosa, galactosa, hexosa, idosa, mañosa, talosa, heptosa, fructosa, ácido glutónico, sorbitol, manitol, a-glucopiranosida, maltosa, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, lactona, sorbosa, ácido glucárico, eritrosa, treosa, alosa, astrosa, gulosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, tagatosa, ácido glucorónico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina, ácido neuraminico, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos, levano, fucoidán, carrageenena, galactocarolosa, pectinas, ácidos pécticos, amilosa, pululán, glicogén, amilopectina, celulosa, dextrano, ciclodextrina, postulano, quitina, agarosa, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido alginico, goma de xantano, o almidón.

En ciertas modalidades de la invención, el carbohidrato es sucrosa o manitol.

En otra modalidad, el carbohidrato de la formulación de ADN de la presente invención está en una cantidad seleccionada del grupo que consiste de entre alrededor de 0.05% a alrededor de 30%, entre alrededor de 0.1% a alrededor de 15%, entre alrededor de 0.2% a alrededor de 10%, entre alrededor de 0.5% y 5%, entre alrededor de 0.75% y 3%, entre alrededor de 0.8% y 2%, y entre alrededor de 0.8 a 1.5%. En modalidades particulares, el carbohidrato es sucrosa o manitol. En ciertas otras modalidades, el carbohidrato de la formulación de ADN está .en una cantidad de alrededor de 1.1%.

En otra modalidad, la sal de la formulación de ADN se selecciona del grupo que consiste de NaCl o KC1. En modalidades adicionales, la sal de la formulación de ADN está en una cantidad seleccionada del grupo que consiste de entre alrededor de 0.01% a 10%, entre alrededor de 0.1% a 5%, entre alrededor de 0.1% y 4%, entre alrededor de 0.5% y 2%, entre alrededor de 0.8% y 1.5%, entre alrededor de 0.8% y 1.2% p/v. En ciertas modalidades, la sal de la formulación de ADN está en una cantidad de alrededor de 0.9% p/v.

En otra modalidad, el ADN de plásmido de la invención comprende un gene de HGF, o variante del mismo. En ciertas modalidades, el gene de HGF es un gene de HGF de mamífero o variante del mismo. En modalidades adicionales, el gene de HGFR es un gene de HGF de humano o un variante del mismo. En ciertos aspectos de la invención, el gene de HGF es un gene de HGF híbrido, v. gr., u gene de HGF híbrido que comprende aADN de HGF y un intrón inherente o extraño o fragmento del mismo, v. gr., in intrón 4 inherente o fragmento del mismo del gene de HGF humano. En modalidades particulares, el gene de HGF híbrido comprende HGF-X2 (SEC ID NO: 13), HGF-X3 (SEC ID NO: 14), HGF-X6 (SEC ID NO: 8), HGF-X7 (SEC ID NO: 9) o HGF-X8 (SEC ID NO: 10) . En modalidades adicionales, el ADN de plásmido que comprende un gene de HGF se selecciona del grupo que consiste de: pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGX-X6, pDK-HGF-X7, pCK-HGF-X8, pCP-HGFR-X2, pCP-HGF-X3, pCP-HGF-X6, pCP-HYGF-X7 y pCP-HGF-X8, en donde los HGF-X2, HGF-X3, HGF-X6, HGF-X7 y HGF-X8 corresponden a SEC ID Nos: 13-14 y 8-10, respectivamente.

Las formulaciones de ADN liofilizadas mantienen o mejoran la expresión del ADN de plásmido. En ciertos aspectos, la formulación de ADN liofilizado proporciona actividad biológica mejorada de la proteína expresada. En ciertos otros aspectos de la invención, la expresión mejorada del ADN de plásmido o la actividad biológica mejorada de la proteína expresada se debe a la presencia del carbohidrato en la formulación. En ciertas modalidades, este carbohidrato es sucrosa o manitol.

La invención también proporciona una formulación de ADN de plásmido liofílizado reconstituido. En ciertas modalidades, el ADN liofilizado está reconstituido en una solución farmacéuticamente aceptable . En modalidades adicionales, la solución farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste de agua, PBS, TE, tampón Tris y salina normal.

En otra modalidad, el ADN de plásmido de la formulación liofilizada reconstituida está a una concentración final de alrededor de 1 ng/mL, alrededor de 5 ng/mL, alrededor de 10 ng/mL, alrededor de 50 ng/mL, alrededor de 100 ng/mL, alrededor de 250 ng/mL, alrededor de 500 ng/mL, alrededor de ug>/mL, alrededor de 5 ug/mL, alrededor de 10 ug/mL, alrededor de 50 ug/mL, alrededor de 100 ug/mL, alrededor de 200 ug/mL, alrededor de 300 ug/mL, alrededor de 400 ug/mL, alrededor de 500 ug/mL, alrededor de 600 ug/mL, alrededor de 700 ug/mL, alrededor de 800 ug/mL, alrededor de 900 ug/mL, alrededor de 1 mg/mL, alrededor de 2 mg/mL, alrededor de 2.5 mg/mL, alrededor de 3 mg/mL, alrededor de 3.5 mg/mL, alrededor de 4 mg/mL, alreedor de 4.5 mg/mL, alrededor de 5 mg/mL, alrededor de 5.5 mg/mL, alrededor de 6 mg/mL, alrededor de 7 mg/mL, alrededor de 8 mg/mL, alrededor de 9 mg/mL, alrededor de 10 mg/mL, alrededor de 20 mg/mL, o alrededor de 30 mg/mL. En otra modalidad, la concentración final del ADN de plásmido de la formulación liofilizada reconstituida es de alrededor de 1 ng/mL a alrededor de 30 mg/mL. En ciertos aspectos, la concentración final del ADN de plásmido de la formulación liofilizada reconstituida es de alrededor de 100 ug/mL, a alrededor de 21.5 mg/mL. En aspectos adicionales, la concentración final del ADN de plásmido de la formulación liofilizada reconstituida es de alrededor de 500 ug/mL a alrededor de 1 mg/mL.

La presente invención también está dirigida a un método para tratar o prevenir enfermedad isquémica o de higado en un sujeto, que comprende administrar una composición reconstituida de una formulación de ADN de factor de crecimiento de hepatocito (HGF) liofilizada, en donde la formulación de ADN comprende un ADN de plásmido, sal y un carbohidrato; y en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo. En ciertos aspectos, la composición reconstituida de una formulación de ADN de HGF liofilizada se administra mediante inyección directa.

La presente invención está dirigida a demás a un método para hacer una formulación de ADN de HGF liofilizada que comprende: (a) preparar una formulación de ADN que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo; y (b) liofilizar la formulación de ADN.

Los pasos para liofilización pueden incluir someter una formulación de ADN de la invención al proceso para ser congelada a temperaturas bajo cero (v. gr., -10°C a -50°C) , y luego se somete a uno o más ciclos dé secado que comprende calentar gradualmente la formulación de ADN a una temperatura de alrededor de 20°C a menos que o igual a alrededor de 30°C, en donde la liofilización ocurre durante un periodo de alrededor de 50 a alrededor de 100 horas. En un aspecto adicional de la invención, el método de liofilización comprende: (a) formar una formulación de ADN acuosa que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGFR, o variante del mismo; (b) enfiar la solución de formulación de ADN a una temperatura de alrededor de -10°C a alrededor de -50°C, hasta que se congela; (c) secar la formulación de ADN calentando a una temperatura de alrededor de 20°C a alrededor de 30°C, y (d) recuperar una composición de formulación de ADN liofilizada que tiene un contenido de agua de alrededor de 0.1 por ciento en peso a alrededor de 5 por ciento en peso basado en el peso total de la formulación de ADN recuperada.

En ciertas modalidades, la formulación de ADN se liofiliza bajo condiciones que comprenden (a) alrededor de 30 horas a alrededor de 50 horas a una temperatura mayor que o igual a alrededor de -50°C y menor de alrededor de 0°C, y (b) alrededor de 20 horas a alrededor de 50 horas a una temperatura mayor que o igual a alrededor de 0°C a menos que o igual de alrededor de 30°C, progresivamente, en donde la temperatura más baja (a) es alrededor de -50°C a alrededor de -30°1C y la temperatura más elevada (b) es entre alrededor de 20°C a alrededor de 30°C. En un aspecto, la formulación de ADN se liofiliza bajo condiciones de -50°C durante 4 horas, -40°C durante 12 horas, -30°C durante 6 horas, -20°C durante 6 horas, -10°C durante 6 horas, 0°C durante 6 horas, 10°C durante 6 horas y 30°C durante 24 horas, progresivamente. En otro aspecto, la formulación de ADN se liofiliza bajo condiciones a 5°C durante 1 minuto, -50°C durante 2 horas, -40°C durante 6 horas, -35°C durante 3 horas, -30°C durante y horas, -25°C durante 3 horas, -20°C durante 3 horas, -15°C durante 3 horas, -10°C durante 6 horas, -5°C durante 3 horas, 0°C durante 6 horas, y 30°C durante 17 horas, progresivamente. En otro aspecto, la formulación de ADN se liofiliza bajo condiciones de 5°C durante 1 minutos, -10°C durante 1 minuto, -20°c durante 1 minuto, 30°C durante 1 minuto, -50°C durante 1 minuto, -50°C durante 2 horas, -45°C durante 6 horas, -40°C durante 3 horas, -35°C durante 6 horas, -30°C durante 3 horas, -25°C durante 6 horas, 20°C durante 3 horas, -15°C durante 6 horas, -10°C durante 3 horas, -.5°C durante 6 horas, 0°C durante 12 horas, 10°C durante 3 horas, 20°C durante 6 horas, y 30°C durante 29 horas, progresivamente.

La invención está dirigida además a una formulación de ácido nucleico liofilizada o una formulación de ácido nucleico liofilizada reconstituida como se expone arriba, en donde el ácido nucleico es un RNA que codifica para HGF, o variante del mismo.

BREVE DESCDRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los anteriores y otros objetos y particularidades de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción de la invención, cuando se tome en conjunción con los dibujos que se acompañan, en los cuales: La Figura 1 ilustra una gráfica de barras que compara expresión de HGF in Vitro entre varias formulaciones. Los niveles de expresión de HGF se midieron ELISA en sobrenadantes de cultivo aislados de células 293T transfectadas con un ADN de plásmido liofilizado pCK-HGF-X7 formulado en 0.9% de NaCl a una concentración de ADN final de 0.5 mg/mL, con sucrosa a 0.25% (pista 3), 1.1% (pista 4), 5% (pista 5), 10% (pista 6) o 20% (pista 7) o con manitol a 1.2% (pista 8), 4.85% (pista 9) o 10% (pista 10). Las reacciones de control con un control negativo (pista 1) y ADN no liofilizado (pista 2) se usaron como comparación.

La Figura 2 ilustra una gráfica de barras que compara expresión de HGF in vivo entre pCK-HGF-X7 no liofilizado y liofilizado. Se inyectaron ratones con 100 ug de pCK-HGF-X7 no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl (NL-HGF-X7) o pCK-HGF-X/ liofilizado con 1.1% de Sucrosa y 0.9% de NaCl (L-HGF-X7) hacia el tibialis cranialis. Los niveles de expresión de HGF se midieron usando ELISA en lisados de tejido de músculo después de sacrificar los ratones en el día 7. Los niveles de expresión de HGF se muestran para control negativo (pista 1), pCK-HGF-X7 no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl (NL-HGF-X7; pista 2), y pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.9% de NaCl (L-HGF-X7; pista 3).

La Figura 3 muestra un diagrama esquemático del procedimiento experimental que usa el modelo de enfermedad cardiaca isquémica porcina. NL-HGF-X7 corresponde a pCK-HGF-X7 no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl, L-HGF-X7 corresponde a pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.95% de NaCl.

La Figura 4 ilustra una gráfica de barras que muestra el efecto de pCK-HGF-X7 no liofilizado y liofilizado sobre perfusión de miocardio. El por ciento de mejora de perfusión del miocardio como se compara con la linea de base se encuentra cuando se utiliza modelo de enfermedad cardiaca isquémica porcina. Los resultados se muestran para cerdos inyectados con plásmido solo (pCK; pista 1), pCK-HGF-X7 no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl (NL-HGF-X7; pista 2), y pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.9% de NaCl (L-HGF-X7; pista 3) .

La Figura 5 ilustra una gráfica de barras que muestra el efecto de pCK-HGF-X7 no liofilizado y liofilizado en engrosamiento de pared. El por ciento de mejora en engrosamiento de pared en el área de borde esquemático inyectado del ventrículo izquierdo como se compara con la línea de base se muestra cuando se utiliza el modelo de enfermedad cardíaca isquémica porcina. Los resultados se muestran para cerdos inyectados con plásmido solo (pCK; pista 1), pCK-HGF-X7 no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl (NL-HGF-X/; piksta 2), y pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.9% de NaCl (L-HGF-X7; pista 3).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "ADN" o "ácido nucleico" o "fragmento de ácido nucleico" se refiere a cualquiera uno o más segmentos de ácido nucleico, v. gr., fragmentos de ADN o RNA, presentes en un polinucleótido o construcción. Un ácido nucleico o fragmento del mismo se puede proporcionar en forma lineal (v. gr., mRNA) o circular (v. gr., plásmido) asi como formas de doble hebra o una sola hebra. Mediante ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se pretende una molécula de ácido nucleico, ADN o RNA, que se ha removido de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleotidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o substancialmente) en solución. Las moléculas de RNA aisladas incluyen transcripciones de RNA in vivo o in Vitro de los polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de conformidad con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente.

Como se usa en la presente, una "región de codificación" es una porción de ácido nucleico que consiste de codones trasladados en aminoácidos. Aún cuando un "codón de detención" (TAG, TGA o TAA) no se traslada hacia un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región de codificación, pero cualesquiera secuencias de flanqueo, por ejemplo promotores, sitios de enlace de ribosoma, terminadores de transcripción y lo semejante, no son parte de una región de codificación. Dos o más ácidos nucleicos o fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden estar presentes en una sola construcción de polinucleótido, v. gr., en un solo plásmido, o en construcciones de polinucleótido separadas, v. gr., en plásmidos separados 8diferentes) . Además, cualquier ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico puede codificar un solo polipéptido de HGF o fragmento, derivado, o variante del mismo, v. gr., o puede codificar más de un polipéptido, v. gr., un ácido nucleico puede codificar dos o más polipéptidos . Además, un ácido nucleico puede incluir un elemento regulatorio tal como un promotor, sitio de enlace de ribosoma, o un terminador de transcripción, o puede codificar regiones de codificación heterólogas fundidas a las regiones de codificación de HGF, v. gr., elementos o motivos especializados, tales como un péptido de señal secretoria o un dominio funcional heterólogo .

En el caso de ADN, el polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente también comprende un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traslación operablemente asociados con el fragmento de ácido nucleico que codifica polipéptido. Una asociación operable es cuando un fragmento de ácido nucleico qu3e codifica un producto de gene, v. gr., un polipéptido, está asociado con una o más secuencias regulatorias de tal manera de colocar expresión del producto de gene bajo la influencia o control de las secuencias regulatorias.

Un polinucleótido de ADN de la presente invención puede ser un plásmido o vector circular o hecho lineal, u otro ADN lineal que también puede ser no infeccioso y no integrante (es decir, no se integra en el genoma de células de vertebrado) . Un plásmido linearizado es un plásmido que fue previamente circular pero se ha hecho lineal, por ejemplo, mediante digestión con una endonucleasa de restricción. Como se usan en la presente, los términos plásmido y vector se pueden usar intercambiablemente.

El término "ADN liofilizado" se refiere a cualquier ADN que se prepara en forma seca para congelación y deshidratación rápida, en el estado congelado bajo alto vacio. "Liofilizar" o "liofilización" se refiere a un proceso de congelar y secar una solución. El ADN liofilizado frecuente queda listo para uso mediante adición de agua destilada estéril. ün "vector" se refiere a cualquier vehiculo para la clonación de y/o transferencia de un ácido nucleico hacia una célula huésped, ün vector puede ser una réplica a la que otro segmento de ADN se puede fijar de manera de ocasionar la réplica del segmento ligado. Una "réplica" se refiere a cualquier elemento genético (v. gr., plásmido, fago, cósmico, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de réplica de ADN in vivo, es decir, capaz de réplica bajo su propio control. El térmico "vector" incluye vehículos para introducir el ácido nucleico en una célula in Vitro, ex vivo o in vivo, ün número grande de vectores conocidos en el ramo se pueden usar para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores en genes, etc. Los vectores posibles incluyen, por ejemplo, plásmidos tales como derivados de plásmido pBR322 o pUC, o el vector Bluescript. Por ejemplo, la inserción de los fragmentos de ADN correspondientes a elementos de respuesta y promotores en un vector apropiado se puede lograr ligando los fragmentos de ADN apropiados en un vector seleccionado que tiene términos cohesivos complementarios. Alternativamente, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente o cualquier sitio se puede producir ligando secuencias de nucleótido (enlazadores) hacia los términos de ADN. Estos vectores se puede hacer especialmente para contener genes marcados seleccionadles que proveen la selección de células. Estos marcados permiten la identificación y/o selección de células huésped que expresan las proteínas codificadas por el marcador.

Vectores adicionales incluyen lipolejos (complejo de liposoma catiónico-ADN) , poliplexos (complejo de polímero catiónico-ADN) , y complejos de proteína, A. Además de un ácido nucleico, un vector también puede comprender una o más regiones regulatorias, y/o marcadores seleccionables útiles al seleccionar, medir y supervisar resultados de transferencia de ácido nucleico (transferencia a cuales tejidos, duración de expresión, etc.).

El término "plásmido" se refiere a un elemento extra-cromosomal que frecuentemente lleva un gene que no es parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en la forma de moléculas de ADN de hebras dobles circulares. Estos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias de integración de genoma, secuencias de fago o nucleótido, ADN o RNA de una sola o doble hebra lineales, circulares. o súper enrolladas, derivados de cualquier fuente, en la que un número de secuencias de nucleótido se han unido o recombinado hacia una construcción única que es capaz de introducir un fragmento de promotor y secuencia de ADN para un producto de gene seleccionado con secuencia no trasladada de 3' apropiada hacia una célula. Como se usa en la presente, el término "plásmido se refiere a una construcción hecha de material genético (v. gr., ácidos nucleicos) . Típicamente un plásmido contiene un origen de replicación que es funcional en células huéspedes bacterianas, v. gr., Escherichia coli, y marcadores seleccionables para detectar células huésped bacteriales que comprenden el plásmido.

Los plásmidos de la presente invención pueden incluir elementos genéticos como se describe en la presente dispuestos de manera que una secuencia de codificación insertada se Ueda transcribir y trasladar en células eucarióticas . En ciertas modalidades descritas en la presente, un plásmido es una molécula de ADN circular cerrada.

El término "expresión" se refiere a la producción biológica de un producto codificado por una secuencia de codificación. En la mayoría de los casos, una secuencia de ADN, incluyendo la secuencia de codificación, se transcribe para formar un RNA mensajero (mRNA) . El RNA mensajero luego se traslada para formar un producto de polipéptido que tiene una actividad biológica relevante. Asimismo, el proceso de expresión pede involucrar pasos de procesamiento adicionales al producto de RNA de transcripción, tal como rebanando para remover intrones, y/o procesamiento de post-traslación de un producto de polipéptido.

El término "vector de expresión" se refiere a un vector, plásmido o vehículo diseñado para permitir que la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada que sigue la transformación hacia el huésped. El gene clonado, es decir, la secuencia de ácido nucleico insertada, v. gr., u gene de HGF o variante del mismo, usualmente se coloca bajo el control de elementos de control tales como un promotor, un promotor mínimo, un mejorador o lo semejante. Las regiones de control de inicio o promotores, que son útiles para impulsar la expresión de un ácido nucleico en la célula huésped deseada son numerosos y familiares a aquellos expertos en el ramo. Virtualmente cualquier promotor capaz de impulsar la expresión de estos genes se puede usar en un vector de expresión, incluyendo pero no limitado a, promotores virales, promotores bacteriales, promotores animales, promotores mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores específicos de tejido, promotores relacionados con patogénesis o enfermedad, promotores específicos de desarrollo, promotores inducibles, promotores regulados por luz; incluyendo, pero no están limitados a, la región promotora SV40 temprana (SV40) , el promotor contenido en la repetición de terminar larga 3' (LTR) de virus de sarcoma Rous (RSV) , el E1A o promotor tardía mayor (MLP) de adenoviruses (Ad) , el promotor temperato inmediato de citomegalovirus humano (HCMV) , el promotor de quinasa de timidina (T ) de virus de herpes simple (HSV) , el promotor de dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) , el promotor de quinasa de fosfoglicerado (PGK) , el promotor de ugbiquitina C (Ubc) , el promotor de albúmina, las secuencias regulatorias del promotor de metalotioneina-L de ratón, promotor y regiones de control de transcripción, los promotores ubicuos (HPRT) , vicentina, ß-actina, tubulina y lo semejante) , los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP, y lo semejante) , promotores relacionados con patogénesis o enfermedad, y promotores que exhiben especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos, tales como la región de control de gene elastasa I que es inactiva en células acinares pancreáticas; región de control de gene de insulina activa en células beta pancreáticas, región de control de gene de inmunoglobulina activa en células linfoides, región de control de virus de tumor mamario de ratón activa en células testiculares, de pecho, linfoides y masto, gene de albúmina, regiones de control Apo AI y Apo AII en hígado, región de control de gene de alfa-fetoproteína activa en hígado, región de control de gene de alfa 1-antitripsina activa en el hígado, región de control de gene de beta-globina activa en células mieloides, región de control de gene de proteína básica demielina activa en células de oligodendrocito en el cerebro, región de control de miosina ligera de cadena-2 en músculo esquelético, y región de control de gene de hormona de liberación gonadotrópica activa en el promotor de quinasa de piruvato del hipotálamo, promotor de villina, promotor del ácido graso que liga proteína intestina, promotor de ß-actina de músculo suave, y lo semejante. Además, estas secuencias de expresión se pueden modificar mediante adición de secuencias de mejora o regulatorias y lo semejante. Ejemplos no limitativos de vectores de expresión de la invención incluyen pCK (Lee y col., Biochem. Biophyus. Res. Commmun. 272:230 (2000); O 2000/040737) y pCP (pCDNA3.1, Invitrogen, EUA) .

Una "construcción" como se usa en la presente denota generalmente una composición que no ocurre en la naturaleza. Una construcción se puede producir mediante tecnologías sintéticas, v. gr., preparación de ADN recom inante y técnicas de expresión o sintéticas químicas para ácidos nucleico o aminoácidos. Una construcción también se puede producir mediante la adición o afiliación de un material con otro de modo que el resultado no se encuentre en la naturaleza en esa forma.

Un "gene" se refiere a un polinucleótido que comprende nucleótidos que codifican una molécula funcional, incluyendo moléculas funcionales producidas por transcripción solamente (v. gr., una espacie de RNA bioactivo) o mediante transcripción y traslación (v. gr., un polipéptido) . El término "gene" abarca cADN y ácidos nucleicos de ADN genómico. "Gene" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa un RNA específico, proteína o polipéptido, incluyendo secuencias regulatorias que preceden (secuencias 5' de no codificación) y siguen (secuencias 3' de no codificación) la secuencia de codificación. "Gene nativo" se refiere a un gene como se encuentra en la naturaleza y sus propias secuencias regulatorias. "Gene quimérico" se refiere a cualquier gene que no es un gene nativo, que comprende secuencias regulatorias y/o de codificación que no se encuentran juntas en la naturaleza. Consecuentemente, un gene quimérico puede comprender secuencias regulatorias y secuencias de codificación que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias regulatorias y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a aquella encontrada en la naturaleza. Un gene quimérico puede comprender secuencias de codificación derivadas de diferentes fuentes y/o secuencias regulatorias derivadas de diferentes fuentes. "Gene endógeno" se refiere a un gene nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo un gene "extraño" o gene "heterologo" se refiere a un gene no encontrado normalmente en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia de gene. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgenes" es un gene que se ha introducido en la célula mediante un procedimiento de transferencia de gene .

"ADN heterologo" se refiere a ADN no ubicado naturalmente en la célula, o en un sitio cromosomal de la célula. El ADN heterologo puede influir un gene extr4año a la célula.

Las frases "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está substancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material como se encuentra en su estado nativo. De esta manera, los péptidos aislados de conformidad con la invención de preferencia no contienen materiales normalmente asociados con los péptidos en su ambiente in situ.

Formulaciones Liofilizadas de ADN La formulación de ADN de la invención, antes de la liofilización, se formula con ciertos excipientes, incluyendo un carbohidrato y una sal.

Como se describe en la presente, la estabilidad de una formulación liofilizada de ADN que se va a utilizar como un agente de diagnóstico o terapéutico se puede aumentar formulando el ADN antes de la liofilización con una solución acuosa que comprende una cantidad de estabilización de carbohidrato.

Un carbohidrato de la formulación de ADN de la invención es un mono-, oligo-, o polisacárido, tal como sucrosa, glucosa, lactosa, trahalosa, arabinosa, pentosa, ribosa, xilosa, galactosa, hexosa, isosa, mañosa, talosa, heptosa, fructosa, ácido glucónico, sorbitol, manitol, o¡-glucopiranosida de metilo, maltosa, ácido isoascórbico, ácido ascórbico, sorbosa, ácido glucárico, eritrosa, treosa, alosa, astrosa, gulosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, tagatosa, ácido glucorónico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina, ácido neuramínico, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos, levano, fucoidano, carrageenano, galactocarolosa, pectinas, ácidos pécticos, amilosa, pululano, glicogén, amilopectina, celulosa, dextrano, ciclodextrina, pustulano, quitina, agarosa, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido alginico, goma de xantano, o almidón.

En un aspecto, el carbohidrato es manitol o sucrosa .

La solución de carbohidrato antes de la liofilización puede corresponder a carbohidrato en agua sola, o un tampón se puede incluir. Ejemplos de dichos tampones incluyen PBS, HEPES, TRIS o TRIS/EDTA. Típicamente la solución de carbohidrato se combina con el ADN a una concentración final de alrededor de 0.05% a alrededor de 30% de sucrosa, típicamente 0.1% a alrededor de 15% de sucrosa, tal como 0.2% a alrededor de 5%, 10% o 15% de sucrosa, de preferencia entre 0.5% a 10% de sucrosa, 1% a 5% de sucrosa, 1% a 3% de sucrosa, y más preferiblemente alrededor de 1.1%& de sucrosa.

Una sal de la formulación de ADN de la invención es NaCl o KC1. En ciertos aspectos, la sal es NaCl. En aspectos adicionales, la sal de la formulación de ADN es en una cantidad seleccionada del grupo que consiste de entre alrededor de 0.001% a alrededor de 10%, entre alrededor de 01% y 5%, entre alrededor de 0.1% y 4%, entre alrededor de 0.5% y 2%, entre alrededor de 0.8% y 1.5%, entre alrededor de 0.8% y 1.2% p/v. En ciertas modalidades, la sal de la formulación de ADN es en una cantidad de alrededor de 0.9% p/v.

En la formulación de ADN de la invención, la concentración final de ADN es de alrededor de 1 ng/mL a alrededor de 30 mg/mL de plásmido. Por ejemplo, una formulación de la presente invención puede tener una concentración final de alrededor de 1 ng/mL, alrededor de 5 ng/mL, alrededor de 10 ng/mL, alrededor de 50 ng/mL, alrededor de 100 ng/mL, alrededor de 200 ng/mL, alrededor de 500 ng/mL, alrededor de 1 ug/mL, alrededor de 5 ug/mL, alrededor de 10 ug/mL, alrededor de 50 ug/mL, alrededor de 100 ug/mL, alrededor de 200 ug/mL, alrededor de 400 ug/mL, alrededor de 500 ug/mL, alrededor de 600 ug/mL, alrededor de 800 ug/mL, alrededor de 1 mg/mL, alrededor de 2 mg/mL, alrededor de 2.5 mg/mL, alrededor de 3 mg/mL, alrededor de 3.5 mg/mL, alrededor de 4 mg/mL, alrededor de 4.5 mg/mL, alrededor de 5 mg/mL, alrededor de 5.5 mg/mL, alrededor de 6 mg/mL, alrededor de 7 mg/mL, alrededor de 8 mg/mL, alrededor de 9 mg/mL, alrededor de 10 mg/mL, alrededor de 20 mg/mL, o alrededor de 30 mg/mL de un plásmido. En ciertas modalidades de la invención, la concentración final del ADN es de alrededor de 100 ug/mL a alrededor de 2.5 mg/mL. En modalidades particulares de la invención, la concentración final del ADN es de alrededor de 0.5 mg/mL a 1 mg/mL.

La formulación de ADN de la invención se liofiliza bajo condiciones convencionales conocidas en el ramo. Un método para liofilización de la formulación de ADN de la invención puede comprender (a) cargar un recipiente, v. gr., un vial, con una formulación de ADN, v. gr., una formulación de ADN que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo, hacia un liofilizador, en donde el liofilizador tiene una temperatura de partida de alrededor de 5°C a alrededor de -50°C; (b) enfriar la formulación de ADN a temperaturas bajo cero (v. gr., -10°C a -50°C) ; y (c) secar substancialmente la formulación de ADN. Las condiciones para liofilización, v. gr., temperatura y duración, de la formulación de ADN de la invención se pueden ajustar por una persona de experiencia ordinaria en el ramo tomando en consideración factores que afecten parámetros de liofilización, v. gr., el tipo de máquina de liofilización usada, la cantidad de ADN usada, y el tamaño del recipiente usado.

El recipiente que retiene la formulación de ADN liofilizada luego se puede sellar y almacenar durante un periodo de tiempo prolongado a varias temperaturas (v. gr., temperatura ambiente a alrededor de -180°C, de preferencia alrededor de 2-8 °C a alrededor de -80°C, más preferentemente alrededor de -20°C a alrededor de -80°C, y más preferentemente alrededor de -20°C) . En ciertos aspectos, las formulaciones de ADN liofilizadas de preferencia son estables dentro de una escala de alrededor de 2-8°C a alrededor de -80°C durante un período de cuando menos 6 meses sin perder actividad significativa. Una formulación de ADN de plásmido de almacenamiento estable también pude corresponder a almacenamiento del ADN de plásmido en una forma estable durante períodos de tiempo prolongados antes de uso como tal para investigación o terapia basada en plásmido. El tiempo de almacenamiento puede ser tan prolongado como varios meses, 1 año, 5 años, 10 años, 15 años, o hasta 20 años. De preferencia la preparación es estable por un período de cuando menos alrededor de 3 años.

ADM de Plásmico de HGF La presente invención proporciona una formulación de ADN liofilizada, en donde la formulación de ADN, antes de la liofilización, comprende un ADN de plásmido, y el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo.

El factor de crecimiento de hepatocito (HGF) es una glicoproteina de enlace de heparina conocida también como factor de dispersión o hepatopoietina-A. El HGF humano que codifica gene endógeno está ubicado en el cromosoma 7q21.1 y comprende 18 exones y 17 intrones, que tienen la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 1) Seki . , y col., Gene 102:213-219 (1991)). La transcripción de alrededor de 6 kb se transcribe del gene de HGF y, luego, un precursor de HGF de polipéptido que consiste de 728 aminoácidos (SEC ID NO: 2) se sintetiza del mismo. Simultáneamente, un polipéptido de precursor de dHGF que consiste de 723 aminoácidos también se sintetiza mediante un rebanado alternativo del gene de HGF. Los precursores biológicamente inactivos se pueden convertir en formas activas de heterdimero enlazado con disulfuro mediante proteasa en suero. En los heterodimeros, la cadena alfa que tiene un peso molecular elevado forma cuatro dominios kringle y un lazo de pasador N-terminal como una región de péptido previamente activada de plasminógeno. Los dominios kringle de una estructura de lazo enlazado de disulfuro triple que consiste de alrededor de 80 aminoácidos puede jugar un papel importante en la interacción de proteina-proteina. La cadena beta de bajo peso molecular forma un dominio semejante a proteasa de suero inactivo. El dHHGF que consiste de 723 aminoácidos es un polipéptido con agotamiento de cinco aminoácidos en el primer dominio Pringle de la cadena alfa, es decir, F, L, P, S y S.

El HGF secretado de células derivadas de mesoderma tiene varias funciones biológicas, v. gr., 1) inducir a las células epiteliales hacia una estructura tubular; 2) estimular la vascularización de células endoteliales in Vitro e in vivo; 3) regeneración de higado y riñón, debido a su actividad contra apoptosis; 4) organogénesis de riñón, ovario y testículos; 5) controlar la osteogenésis; 6) estimular el crecimiento y diferenciación de células precursores hematopoyéticas eritroides; y 7) retoño de axón de neuronas (Stella, M.C. y Comoglio, P.MJ., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 31:1357-1362 81999)). Basado en estas diversas funciones el HGHF o un HGF que codifica gene o una variante del mismo, se puede desarrollar como un agente terapéutico para tratar enfermedades isquémicas o de higado. En realidad, in vivo, el HGF puede existir ya sea como HGF o dHGF, y por lo tanto, la coexpresión de HGF y dHGF es importante para maximizar el efecto terapéutico. Un gene de HGF híbrido que puede expresar simultáneamente HGF y dHGF con una eficiencia elevada para terapia de gene es una variante de HGF que sería ventajoso utilizar en la formulación de ADN de plásmido de la presente invención.

El gene de HGF híbrido se ha descrito previamente en la Solicitud Internacional No. WO 03/078568 y Publicación de EUA No. 2005/0079581 Al, los contenidos de cada una de las cuales se incorporan en la presente por referencia. El gene de HGF híbrido se prepara insertando un intrón inherente o extraño entre los exones 4 y 5 en cADN de HGF. El gene de HHF híbrido tiene una eficiencia de expresión superior que el cADN de HGF y simultáneamente expresa dos heterotipos de HGF y dHGF (variante de HGF omitida) .

El término "isoforma de HGF" se refiere a cualquier polipéptido de HGF que tiene una secuencia de aminoácido que es cuando menos 80% idéntico (v. gr., cuando menos 90% o 095% idéntico) a una secuencia de aminoácido de HGF que se produce naturalmente en un animal, incluyendo todos los variantes alélicas. En una modalidad, el término se refiere a isoformas que se sabe que tienen actividad de proliferación de célula. Las isoformas de HGF incluyen, sin limitación, flHGF, dHGF, NK1, N 2 , y NK , v. gr., correspondientes a SEC ID Nos: 2-6, y variantes de la misma (v. gr., variantes de NK", SEC OD NOS: 11-12) .

El término "flHGF" se refiere a la proteina de HGF de longitud completa de un animal, v. gr., un mamífero, v. gr., aminoácidos 1-728 (SEC ID NO: 2) de HGF humano.

El término "dHGF" se refiere a la variante omitida de proteína de HGF producida mediante rebanado alternativo del gene de HGF en un animal, v. gr., un mamífero, v. gr., HGF humano que consiste de 723 aminoácidos (SEC ID NO: 3) con omisión de cinco aminoácidos en el 1e dominio Pringle de la cadena alfa (F, L, P, S y S) para la secuencia de HGF de longitud completa.

El término "NK1" se refiere a una isoforma de HGF de un animal, v. gr., un mamífero, v. gr., un humano, que consiste en los dominios de lazo de pasador N-terminal, Kinglel, y kringle2.

El término "NK4" se refiere a una isoforma de HGF de un animal, v. gr., un mamífero, v. gr., un humano, que consiste de los dominios de lazo de pasador N-terminal, kringlel, kringl2, kringle3, y kringle4.

La estructura y función de HGF se ha estudiado extensamente y uno de experiencia en el ramo tiene conocimiento de los aminoácidos en la secuencia de HGF que son importantes para retener substancialmente toda la actividad biológica de la proteina y que de preferencia no cambian o solo cambian conservadoramente en cualquier variante de secuencia de HGF. Ver, v.- gr., Hartmann y col., Proc. Nati. Acad. Sci, EUA 89:11574 (1992); Lokker y col., EMBO J. 11:2503 (1992), Zhour y col . , Structure 6:109 (1998), Ultsch y col., Structure 6:1383 (1998), Shimizu y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189:1329 81992), Yoshiyama Y col., Biochem, Biophyus. Res. Commun. 175:660 (1991), cada uno incorporado en la presente por referencia en su totalidad. Por ejemplo, parece que los dominios de lazo de pasador N-terminal y krinlel se requieren para actividad de proliferación de célula. Otros aminoácidos que no son críticos a la actividad biológica se pueden omitir y/o substituir más libremente. Uno de experiencia en el ramo puede preparar variantes de isoformas de HGF usando técnicas de mutagénesis de rutina, tales como aquellas descritas en las referencias arriba citas, e identificar variantes que retienen substancialmente toda la actividad biológica de la isoforma de HGF.

Una modalidad de un gene de HGF híbrido de la presente invención que comprende el intrón inherente es de 7113 bp de largo y tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 7.

Un gene de HGF híbrido puede comprender un fragmento de intrón inherente opcionalmente teniendo una secuencia recombinante pequeña insertada en el mismo entre los exones 4 y 5 de cADN de HGF. En la presente, dicho gene de HGF híbrido que comprende un fragmento de intrón inherente se designa "HGF-X". Ejemplos de genes de HGF híbridos incluyen HGF-X2 (SEC ID NO: 13), HGF-X3 (SEC ID NO: 14), HGF-X6 (SEC ID NO: 8), HGF-X7 (SEC ID NO: 9) y HGF-X8 (SEC ID NO: 10) .

Administración y Métodos de Tratamiento Como se describe arriba, HGF tiene varias funciones biológicas, y se basan en estas diversas funciones, HGF, un HGF que codifica gene, o un variante del mismo, se puede desarrollar como un agente terapéutico para tratar enfermedades isquémicas o de hígado. En la presente invención, una formulación de ADN de HGF se administra después de reconstitución de la formulación de ADN liofilizada .

El término "reconstituido" o "reconstitución" se refiere a la restauración de la forma original, v. gr., mediante rehidratación, de una substancia previamente alterada para conservación y almacenamiento, v. gr., la restauración a un estado liquido de una formulación de plásmido de ADN que se ha secado y almacenado previamente . La composición liofilizada de la presente invención se puede reconstituir en cualquier solución acuosa que produzca una solución estable, mono-dispersa apropiada para administración. Estas soluciones acuosas incluyen, pero no están limitadas a: agua estéril, TE, PBS, tampón Tris o salina normal.

La concentración de ADN liofilizado reconstituido en los métodos de la presente invención se ajusta dependiendo de muchos factores, incluyendo la cantidad de una formulación que se va a entregar, la edad y peso del sujeto, el método de entrega y la ruta y la inmunogenicidad del antigeno que se está entregando.

La formulación de ADN liofilizada reconstituida de la invención se puede administrar oralmente o a través de rutas parenterales tales como inyección intravenosa, intramuscular, intraendocardiaca, intramiocardial, intrapericardial, intraventricular, intraarticular, intradérmica, intracerebral, intrarenal, intrahepática, intrasplénica, intralinf tica, subcutánea, intraabdominal, intratesticular, intraovárica, intrauterina, esternal, intratraqueal, intrapelural, intratorácica, intradural, intraespinalk intramedularmente, intramural, intraescoriónica y arterial o infusión, o tópicamente a través de administración rectal, intranasal, inhalación o intraocular. En ciertas modalidades, el método de entrega es intramuscular, intramiocardial, intravenosa, intracerebral o intrarrenal .

Se debe entender que la dosis diaria típica de la formulación de ADN liofilizada reconstituida de la presente invención se debe determinar en la luz de varios factores relevantes incluyendo las condiciones que se van a tratar, la ruta de administración seleccionada, la edad, sexo y peso corporal del paciente individual, y la severidad del síntoma del paciente, y se puede administrar en una sola dosis o en dosis dividida. Por lo tanto, la dosis diaria no debe considerarse como una limitación al alcance de la invención en forma alguna.

El término "tratar", "tratando", o "tratamiento" de una enfermedad isquémica o de hígado, como se usa en la presente, se refiere a la administración a un sujeto de un factor, v. gr., un HGF, v. gr., un HGF híbrido, o variante del mismo, en una cantidad suficiente para resultar en mejora de uno o más síntomas de la enfermedad isquémica o de hígado, o prevenir el avance de la enfermedad isquémica o de hígado.

Una "enfermedad isquémica" se refiere a una enfermedad asociado con un suministro deficiente de sangre a una parte del cuerpo (como el corazón o cerebro) que se debe a obstrucción del flujo entrante de sangre arterial (como angostando las arterias mediante espasmo o enfermedad) . Ejemplos de enfermedades isquémicas incluyen enfermedad de arteria coronaria (CAD) y enfermedad de arteria periférica (PAD) .

El término "enfermedad de hígado" se aplica a muchas enfermedades y desórdenes que ocasionan que el hígado funcione inapropiadamente o deje de funcionar. El HGF es un agente principal que promueve la proliferación de hepatocito, y actúa en concierto con factor alfa de crecimiento de transformación y factor de crecimiento epidérmico de enlace de heparina durante la regeneración de hígado. Adicionalmente, el HGF mejora el daño hepático a través de efectos anti-apoptóticos en modelos animales de falla hepática fulminante, y atenúa la fibrosis hepática en animales y cirrosis de hígado. Consecuentemente, el HGF se considera a no solamente inducir regeneración de hígado, pero también para inhibir la progresión de enfermedad y mejorar la fibrosis hepática en pacientes que sufren de enfermedades de hígado intractables . Con respecto al tratamientote enfermedad de hígado, la formulación de ADN liofilizada reconstituida de la invención se puede administrar de conformidad con los métodos de entrega como se exponen arriba. En ciertas modalidades, el método de entrega en el tratamiento de enfermedad de hígado será intravenosa, intraarterial o intrahepática .

En ciertos aspectos de la invención, la formulación de ADN de HGF reconstituida puede comprender dos o más isoformas de HGF. Las isoformas de HGF se pueden liofilizar previamente de manera separada, o en la misma formulación de ADN. Ambas de estas isoformas liofilizadas, después de reconstitución, se pueden administrar separadamente o al mismo tiempo, es decir, co-administrarse; formulaciones de ADN de plásmido reconstituidas separadas para las dos o más isoformas de HGF se pueden administrar o co-administrar o un plásmido de expresión sencilla que contiene genes para dos o más isoformas de HGF y capaz de expresar los genes para las dos o más isoformas de HGF se pueden administrar. Por ejemplo, las dos isoformas flHGF y dHGF se pueden administrar usando dos plásmidos separados. Alternativamente, los genes que contienen dos plásmidos separados para flhGF y dHGF se pueden usar para co-administración . Finalmente, un plásmido de expresión sencilla que contiene genes para ambos flHGF y dHGF se pueden administrar. En ciertos aspectos de la invención, el flhGF y dHGF en un plásmido de expresión sencilla se codificada por el mismo polinucleótido o mediante polinucleótidos separados.

Existe un número de acercamientos para incluir más de un polinucleótido capaz de expresar una isoforma de HGF en un solo plásmido. Estos incluyen, por ejemplo, el uso de secuencias de Sitio de Entrada de Ribosoma Interna (IRES), cassettes dobles promotores/de expresión, y proteínas de fusión. Las dos o más isoformas expresadas del mismo plásmido o en dos plásmidos separados, como se discute arriba, se seleccionan del grupo que consiste de flhGF, dHGF, N 1, NK2, y NK4 o se seleccionan del grupo que consiste de SEC ID Nos: 2 a 6. Las dos o más isoformas también pueden incluir isoformas de HGF adicionales conocidas por uno de. experiencia ordinaria en el ramo.

En ciertos aspectos de la invención, el ADN de plásmido se administra a través de inyección intracelular directa y, más preferentemente, mediante el uso de una jeringa o un catéter. Los catéteres se han usado para introducir genes recombinantes in vivo (ver, v. gr., E.G. Nabel, y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89, 5157 (1992); E.G. Nabel, y col., Science 249, 1285 82990); E.G. Nabel, y col., Science 244, 1342 (1989); E.G. Nabel, y col., J. Clin. Invest. 91, 1822 81993); G. Palutz, y col., Circ. 83 578 81991); E.G. Nabel, y col., Nature (1993) (en prensa)). La utilización de un catéter proporciona la capacidad de entregar el ADN de plásmido hacia las células que son difíciles de accesar mediante el uso de una jeringa.

El ADN de plásmido se puede administrar a través de inyección intraarterial o intravenosa y, más preferentemente, mediante el uso de una jeringa o un catéter. Por ejemplo, la arteria femoral se puede usar para entregar ADN de plásmido al corazón; la vena portal se puede usar para entregar ADN de plásmido al hígado.

La administración del ADN de plásmido de la invención también se puede lograr mediante transferencia de gene hacia células de meta, in situ, para optimizar la entrega subsecuente de genes in vivo.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología de célula, cultivo de célula, biología molecular (incluyendo PCR) , vacunología, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia del ramo. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manula, 2a Ed. Sambrook y col., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989; DNA Cloning, Volúmnes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984); Mullís y col. Patente de EUA No. 4,683,195: Hibridización de Ácido Nucleico (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcripción y Traslación (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); 1984); Cultivo de Células Animales (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Células y Enzimas Inmovilizadas (IRL Press, 1986) ; B. Perbal, Una Guía práctica a Clonación Molecular (19084); el tratado, Métodos en Enzimología (Academic Press, Inc., N.Y.); Fectores de Transferencia de Gene para Células Mamíferas (J. H. Miller y M. P. Alos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Métodos en Enzimología, Vol . s 154 hy 155 (Wu y col. eds)., Métodos Inmunoquímicos en Biología de Célula y Molécular (Mayer y Walter, eds., Academic Press, Londres, 1987), y en Ausubel y col., Protocolos Actuales en Biología Molecular, John Wileyand Sons, Baltimore, Maryland 81989) . Cada una de las referencias citadas en este párrafo se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan con el propósitos de ilustración solamente, y no se pretenden para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1: Preparación de plásmido El plásmido pCK-HGF-X7 (WO 03/078568) que está diseñado para expresar proteina de factor de crecimiento de hepatocito (HGF) se usó en el experimento.

E. coli (TOP10, Invitrogen, EUA) se transformaron con pCK-HGF-X7, y una sola colonia se aisló. La colonia aislada luego se cultivó en medio LB que contiene 30 ug/mL de kanamicina. El ADN de plásmido se purificó usando un Equipo Giga de Plásmido Libre de Endo (Qiagen, EUA) , y se re-suspensió en salina que contiene 0.9% de NaCl e una concentración de ADN final de 1.0 a 2.0 mg/mL.

Ejemplo 2: Liofilización Las formulaciones de pCK-HGF-X7 se prepararon en salina conteniendo 0.9% de NaCl a una concentración de ADN final de 0.5 mg/mL o 1 mg/mL, con sucrosa (0.25, 1.1, 5, 10 o 20% p/v) o manitol (1.2, 4.85 o 10% p/v) . Los Cuadros Ia y IB muestran el porcentaje de sucrosa y manitol, respectivamente, y las relaciones de carbohidrato/ADN (p/p) correspondientes para las formulaciones de pCK-HGF-X7 probadas Cuadro 1A. Por Ciento de Sucrosa ADN (mg/ml) Sucrosa (%) Sucrosa Relación de (mg/ml) ) sucrosa a . ADN (p/p) 0.5 0.25 2.5 5 0.5 1.1 11. 22 0.5 5 50 100 0.5 10 100 200 0.5 20 200 400 1 0.25 2.5 2.5 1 1.1 11 11 1 5 50 50 1 10 100 100 1 20 200 200 Cuadro IB. Por Ciento de Manitol ADN (mg/ml) Manitol (%) Manitol Relación de (mg/ml) Manitol a ADN (P/P) 0.5 1.2 12 24 0.5 4.85 48.5 97 0.5 10 100 200 1 1.2 12 12 1 4.85 48.5 48.5 1 10 100 100 El AD de plásmido suspendido luego se liofilizó con Production-Master Freeze Dryer (C&H Cooling & Heating Systems, Corea) . La temperatura se redujo a -50°C durante 4 horas a 100 mTorr. Luego, la temperatura se elevó a -40°C durante 12 horas, -30°C durante 6 horas, -20°C durante 6 horas, -10°C durante 6 horas, 0°C durante 6 horas, 10°C durante 6 horas y 30°C durante 24 horas, progresivamente, a 28-29 mTorr. El ADN de plásmido liofilizado se mantuvo a -20°C hasta que se analizó.

El ADN de plásmido suspendido también se liofilizó con Production-Master Freeze Dryer (C&H Cooling & Heating Systems, Corea) . La temperatura se bajó a 5°C durante 1 minutos, y -50°C durante 2 horas a 100 mTorr. Luego, la temperatura se elevó a -40°C durante 6 horas, -35°C durante 3 horas, -30°C durante 6 horas, -215°C durante 3 horas, -20°C durante 3 horas, -15°C durante 3 horas, -10°C durante 6 horas, -5°C durante 3 horas, 0°C durante 6 horas, y 30°C durante 17 horas, progresivamente, á 28-29 mTorr. El ADN de plásmido liofilizado se mantuvo a -20°C hasta que se analizó.

El ADN de plásmido suspendido también se liofilizó con Production-Master Freeeze Dryer (C&H Cooling & Heating Systems, Corea) . La temperatura se bajó a 5°C durante 1 minuto, -10°C durante 1 minuto, -20°C durante 1 minuto, -30°C durante 1 minuto, y -50°C durante 1 minutos a 150 mTorr. La temperatura se mantuvo a -50°c durante otras 2 horas a 150 mTorr. Luego, la temperatura se elevó a -45 °C durante 6 horas, -40°C durante 3 horas, -35°C durante 6 horas, -30°C durante 3 horas, -25°C durante 6 horas, -20°C durante 3 horas, -15°C durante 6 horas, -10°C durante 3 horas, -5°C durante 6 horas, 0°C durante 12 horas, 10°C durante 3 horas, 20°C durante 6 horas, y 30°C durante 29 horas, progresivamente, y 30 mTorr. El ADN de plásmido liofilizado se mantuvo a -20°C hasta que se analizó.

Las formulaciones liofilizadas arriba preparadas se analizaron para eficiencia de expresión de gene in Vitro de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 3. Los resultados in Vitro para estas preparaciones fueron los mismos .

Ejemplo 3: Efectos de liofilización en eficiencia de expresión de gene in Vitro de ADN de plásmido. 1. Materiales y métodos Para determinar los efectos de la liofilización en eficiencia de expresión de gene de AD de plásmido, el ADN de plásmido liofilizado se transfectó en células 293T, y el nivel de expresión de HGF se midió. Como un control, un ADN de plásmido no liofilizado también se transfectó.

Cuatro microgramos de pCK-HGF-X7 en varias formulaciones (como se anota arriba en el Ejemplo 1) se transfectaron de 1 x 106 células 293T usando FuGENE6 (Roche Diagnostics, Alemania) (n = 5) . Antes de la transíección, 1 mg del ADN de plásmido liofilizado se reconstituyó con 2 mi de agua para inyección a la concentración final de 0.5 mg/mL.

Dos días después de la transfección, los sobrenadantes de cultivo se obtuvieron y analizaron para expresión de HGFD usando equipo ELISA de HGF humano (R&D Systems, MN, EUA) , de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Los resultados de ELISA se determinaron estadísticamente mediante la prueba de comparación múltiple de Dunnett usando programa SPSS (versión 13.0, SPSS., Inc, EUA) . 2. Resultados y discusión Loa resultados de expresión de gene de HGF se proporcionan en la Figura 1. Contrario a previos reportes, la liofilización no afectó la eficiencia de expresión de gene in Vitro del ADN de plásmido. Entre varias formulaciones, el nivel de HGF de pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.9% de NaCl fue significativamente superior que aquel de pCK-HGF-X7 no liofilizado (p = 0.001) (Figura 1).

Estos resultados indican que la formulación de liofilización que contiene 1.1% de Sucrosa y 0.9% de NaCl sería más apropiada para pCK-HGF-X7 que una formulación no liofilizada.

Ejemplo 4: Análisis comparativo de expresión de gene in vivo entre pCK-HGF-X77 no liofilizado y liofilizado. 1. Materiales y métodos Trece ratones BALB/c de 5 semanas de edad (machos, Charles River) se obtuvieron para cada grupo, y se proporcionaron con alimento y agua ad limitum. Los ratones se dejaron 7 días de descanso antes de someterse al experimento.

Los ratones se inyectaron con 100 ug de pCK-HGF-X7 no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl (NL-HGF-X7) o pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.9% de NaCl (L-HGF-??7) hacia la tibialis cranialis, y se sacrificaron en el día 7 después del tratamiento. El ADN de plásmido liofilizado se reconstituyó con agua a la concentración final de 0.5 mg/mL antes de la inyección. Para medir el nivel de expresión de proteína de HGF, los músculos inyectados se recogieron y el tejido de músculo se lisó con 500 uL de tampón de lisis de célula (50 mM de NaCl, 0.2% de dodecilsulfato de sodio, 0.5% desoxicolato de sodio, 2% de IGEPAL CA-630, 25 mM de Tirs- HC1, pH7.4, 1 m de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) durante 16 horas a 4°C. Los lisados se centrifugaron a 12, 000 rpn durante 5 minutos, y los sobrenadantes se cosecharon y analizaron para expresión de HGF usando el equipo ELISA de HGF humano (R&D Systems) .

Los resultados de ELISA se determinaron estadísticamente por ANOVA de una vía y Prueba de Tukey subsecuente usando programa SPSS (versión 13.0). 2. Resultados y discusión Un promedio de 246 ng/mL de proteína de HGF se produjeron de los animales administrados con pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.9% de NaCl (L-HGF-X7), mientras que los animales administrados con pCK-HGF-X7 no liofilizado expresaron 76 ng/mL de HGF (Figura 2) . Este resultado indica que pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.95 de NaCl puede expresar proteína HGF más eficientemente que pCK-HGF-X7 no liofilizada (p <0.001).

Ejemplo 5: Anjálisis comparativo de efectos terapéuticos en modelo de enfermedad cardíaca isquémica porcina entre pCK-HGF-X no liofilizado y liofilizado 1. Materiales y Métodos (1) Animales Once Cerdos Yorkshire (machos, 28 a 30 kg. Clinical Research Institute en Seoul JNational üniversity Hospital) se obtuvieron y proporcionaron con alimento dos veces al día y agua ad limitum. Los cerdos se dejaron 7 días de descanso antes de someterse al experimento. El plano experimental total se muestra en la Figura 3. (2) Establecimiento del modelo de enfermedad cardiaca isquémica porcina.

Xilazina (2 mg/kg) , cetamina (20/kg) , y atropina (0.05 mg/kg) se inyectaron intramuscularmente en cada cerdo. Veinte minutos más tarde, se insertó una hoja Meducut de calibre 22 en la arteria femoral superficial para supervisión continua de la presión sanguinea. Sodio de tiopental (10 mg/kg) se inyectó de manera intravenosa, y el entubado endotraqueal se realizó a través de la ruta de orotráquea. La anestesia se mantuvo mediante inhalación de enflurano. Durante la operación, ventilación de presión positiva y una fracción de oxigeno de 30% - 40% se mantuvieron. Los electrocardiogramas, saturación de oxigeno y presión de sangre arterial se supervisaron continuamente.

La toracotomia izquierda luego se realizó. Después de abrir el pericardio seguido por exploración de la arteria coronaria descendente (LAD) anterior izquierda, 2% de lodicaina (1 mg/kg) se inyectó por vía intravenosa y una tercera parte distante de la LAD se ligó durante 3 minutos, dejando la segunda ramificación diagonal tanto como fue posible. La reperfusión (preacondicionamiento isquéimico) se realizó durante 5 minutos usando suturas de polipropileno 5-0 con una pequeña pieza de Nelaton (4 Fr) . Después de este solo preacondicionamiento isquémico, la LAD distante se ligó y la depresión o elevación de segmento ST en el electrocardiograma supervisado se confirmó. Lidocaina adicional (1 mg/kg) se inyectó por via intravenosa 15 minutos después del ligado, y las heridas de pericardio y toracotomia se cerraron. Un solo tubo de pecho 28 Fr conectado a succión de pared se removió inmediatamente después de que suficiente respiración espontánea regresó, seguido por la remoción del tubo endotraqueal .

Todos los protocolos fueron aprobados por el Seoul National University Care and Use Committee. (3) Inyección intramiocardial de plásmidos Veintiocho días después del ligado de la arteria coronaria, se realizó la re-toracotomía . Usando agujas de inyección de insulina de calibre 27, una dosis total de 1 mg de pCK-HGF-X7 liofilizada con 1.% de sucrosa y 0.9% de NaCl (L-HGF-X7, n = 3) o pCK-HGF-X7 no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl (NL-HGF-X7, n = 4) se inyectó hacia la zona de borde isquémico anterolateral que queda entre el área de infarto fibrótico y el miocardio fuertemente normal a lo largo del curso de la segunda rama diagonal. Un total de cinco sitios se inyectaron. Cada sitio se inyectó con 0.2 mg de ADN de plásmido y el intervalo entre los sitios de inyección fue 1.5 cm. El ADN de plásmido liofilizado se reconstituyó con agua a la concentración final de 1 mg/mL antes de la inyección. Como un control, la cantidad idéntica de pCK no liofilizado que contiene 0.9% de NaCl (n = 4) se inyectó en la zona de borde isquémico anterolateral. Los puntos de inyección se marcaron con etiquetas de sutura usando anillos de metal. (4) Tomografia computada de emisión de fotón sencillo de miocardio Veintiséis dias después de la inducción quirúrgica de infarto al miocardio, se realizó tomografia computada de emisión de fotón sencillo de puerta de 99m- . Tc-MIBI (SPECT) (Vwertex epic, Adac Labs, CA., EÜA) para ajustar una linea de base antes de la inyección de plásmido. La SPECT de puerta se repitió 28 dias después (en el Día 24 después de la inducción del infarto al miocardio) .

Un modelo de 20 segmentos se seleccionó para un análisis de segmento. Seis segmentos correspondientes a la base cardiaca se excluyeron del análisis debido a que esta región se pudo influenciar fácilmente por la atenuación diafragmática de algunos artefactos alrededor del corazón; también debido a que la base del corazón estaba alejada de los sitios del ligado de coronaria distante e inyección de plásmido.

Las imágenes de SPECT construidas mediante puerta de electrocardiografía se analizaron mediante un programa de auto cuantificación (AutoQUANT, ADAC Labs, CA., EUA) , que se cree que elimina la posible desviación por cualquier manipulación de técnico asociado.

La cantidad de perfusión de segmento se cuantificó midiendo la admisión de 99mTc-MIBI y se calculó como un porcentaje de la admisión máxima. Cuando la perfusión de segmento calculada de esta manera fue menos de 70%, se definió como un segmento prefundido de manera baja y se usó como la meta de entrega de plásmido. Los segmentos restantes bien prefusionados aún después del ligado coronario también se excluyeron, ya que probablemente no obtendrían beneficio de la angiogenesis terapéutica. El engrosamiento de pared en la fase sistolítica se indicó como un porcentaje de la pared diastólica de extremo en las imágenes computadas. (5) Estadísticas Los datos se presentan como él por ciento de mejora comparado con la linea de base. Todos los datos se analizaron usando SPSS (versión 13.0) . El análisis estadístico de la perfusión de miocardio y el engrosamiento de pared segmental se realizó usando muestras emparejadas Sguden t-test. 2. Resultados Dentro de cada grupo de tratamiento, los cambios en la perfusión segmental antes y después de la inyección de ADN de plásmido se compararon. Los valores de línea de base para el promedio de perfusión segmental medidos en el Día 26 después de ligado de LAD fueron 39.0 + 14.6, 43.4 + 13.4 y 36.9 + 16.3% para pCK, NL-HGF-X7 y grupo de tratamiento de L-HGF-X7, respectivamente. El SPECT medido de 00mTc- IBI conducido en el Día 54 mostró que los valores promedio de la perfusión segmental en los grupos de pCK y NL-HGF-X7 fueron 37.8 + 13.9% y 44.0 + 14.5%, respectivamente, que no fueron significativamente diferentes de los valores de línea de base medidos en el Día 26 (p = 0.320 para pCK y 0.721 para NL-HGF-X7) . En contraste, el valor promedio de la perfusión segmental en el grupo de tratamiento de L-HGF-X7 fue 41.2 + 17.6%, mostrando un aumento significativo sobre el valor de línea de base (p = 0.003) . Cuando la magnitud del por ciento de aumento en la perfusión de segmento del valor de línea de base se comparó entre grupos, el por ciento de aumento de la perfusión de segmento en el grupo de tratamiento de L-HGF-X7 fue 14.74% superior que aquella del grupo de tratamiento de pCK (p = 0.003), mientras que el grupo de tratamiento de NL-HGF-X7 no mostró diferencia significativa del grupo de tratamiento de pCK (p = 0.254) (Figura 4).

En cada grupo de tratamiento, los cambios en el engrosamiento de pared de segmento antes y después de la administración de ADN también se compararon. En el día 26, los valores promedio del engrosamiento de pared de segmento fueron 24.7 + 16.5, 33.4 + 15.9 y 16.5 + 15.9% para pCK, NL-HGF-X7 y el grupo tratado con L-HGF-X7, respectivamente, y no hubo diferencias significativas entre grupo (p = NS) . En el dia 54, el valor promedio de engrosamiento de pared de segmento para los grupos de tratamiento de pCK, NL-HGF-X7 y L-HGF-X7 fue 27.9 + 18.4, 43.1 + 11.8, y 30.2 + 10.7%, respectivamente. Cuando la magnitud del aumento en por ciento en el engrosamiento de pared de segmento del valor de linea de base se comparó entre los grupos de tratamiento, el por ciento de aumento en el grupo de tratamiento de L-HGF-X7 fue 83.54%, que fue significativamente superior a aquel del grupo de NL-HGF-X7 (28.99%) (Figura 5).

Estos resultados indican que la administración de intramiocardio de la comulación liofilizada (L-HGF-X/ puede aumentar más eficientemente el flujo de sangre regional y el engrosamiento de pared en el área de borde isquémico inyectada del ventrículo izquierdeo comparado con la formulación no liofilizada (NL-HGF-X7) . Sin desear estar limitados por la teoría, esto probablemente se debe a actividades angiogénicas y antifibróticas de HGFR-X7 expresado. 3. Resumen La perfusión de segmento y engrosamiento de pared se aumentaron significativamente en el grupo tratado con pCK-HGF-.X7 liofilizado en comparación con aquellos de los grupos tratados con pCK no lliofilizado y pCK-HGF-X7.

Estos resultados demuestran que la administración a intramiocardio de pCK-HGF-X7 liofilizado con 1.1% de sucrosa y 0.9% de NaCl a los cerdos afectados pudo aumentar eficiente y establemente la perfusión regional y el engrosamiento de pared en el miocardio isquémico en comparación con pCK-HGF-X7 no liofilizado.

Mientras que la invención se ha descrito con respecto a las modalidades específicas anteriores, se debe reconocer que varias modificaciones y cambios se pueden hacer a la invención por aquellos expertos en el ramo que también quedan dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones anexas.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1.- Una formulación de ADN que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo.

2. - La formulación de ADN de conformidad con la reivindicación 1, en donde el carbohidrato es un mono-, oligo-, o polisacárido seleccionado del grupo que consiste de sucrosa, glucosa, lactosa, trehalosa, arabinosa, pentosa, ribosa, xilosa, galactosa, hexosa, idosa, mañosa, talosa, heptosa, fructosa, ácido glucónico, sorbitol, manitol, OÍ-glucopiranosida de metilo, maltosa, lactona, sorbosa, ácido glucárico, eritrosa, treosa, alosa, astrosa, gulosa, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, tagatosa, ácido glucurónico, ácido galacturónico, ácido manurónico, glucosamina, galactosamina, ácido neuraminimico, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos, levano, fuoidano, carrageenano, galactocarolosa, pectinas, ácidos , pécticos, amilosa, pululano, glicogen, amilopectina, celulosa, dextrano, pustulano, quitina, agarosa, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido alginico, goma de xantano, almidón, y mezclas de los mismos.

3.- La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-2, en donde el carbohidrato está en una cantidad seleccionada del grupo que consiste de entre alrededor de 0.05% a alrededor de 30%, entre alrededor de 0.1% a alrededor de 15%, entre alrededor de 0.2% a alrededor de 10%, entre alrededor de 0.5% y 5%, entre alrededor de 0.75% y 3%, entre alrededor de 0.8% y 2%, y entre alrededor de 0.8% y 1.5%.

4. - La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-3, en donde el carbohidrato está en una cantidad de alrededor de 0.1% a alrededor de 10%.

5. - La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-2, en donde el carbohidrato se selecciona del grupo que consiste en sucrosa, manitol, y mezcla de los mismos .

6.- La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-5, en donde la sal se selecciona del grupo que consiste en NaCl, KCl, y mezcla de las mismas.

7. - La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-6, en donde la sal está en una cantidad seleccionada del grupo que consiste de entre alrededor de 0.001% y alrededor de 10%, entre alrededor de 0.1% y 5%, entre alrededor de 0.5% y 2%, entre alrededor de 0.8% y 1.5%, y entre alrededor de 0.8% y 1.2%.

8. - La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-7, en donde el gene de HGF o variante del mismo se selecciona del grupo que consiste en flhGF, dHGF, NK1, NK2, NK4, y mezcla de los mismos.

9. - La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-7, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF híbrido.

10. - La formulación de ADN de conformidad con la reivindicación 9, en donde el gene de HGF híbrido se selecciona del grupo que consiste en HGF-X2, HGF-X3, HGGRF-X6, HGF-X7 y HGF-X8.

11. - La formulación de ADN de conformidad con la reivindicación 10, en donde el ADN de plásmido se selecciona del grupo que consiste de: pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, , pCK-HGF-X6, pCK-HGF-X7, pCK-HGF-X8, pCP-HGF-X2, pC>P-HGF-X3, pCP-HGF-Xy, pCP-HGF-X7 yh pCP-HGF-X8.

12. - La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-11, en donde el ADN de plásmido está una concentración de alrededor de 1 ng/mL a alrededor de 30 mg/mL.

13. - La formulación de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1-12, en donde la formulación de ADN está liofilizada.

14. - La formulación de ADN liofilizada de conformidad con la reivindicación 13, en donde la liofilización de la formulación de ADN comprende (a) cargar un recipiente con la formulación de ADN en un liofilizador; (b) enfriar la formulación de ADN a una temperatura bajo cero; Y (c) secar la formulación de ADN.

15. - Un método para tratar o prevenir enfermedad isquémica o de hígado en un sujeto, que comprende administrar una composición reconstituida de una formulación de ADN liofilizada, en donde la formulación de ADN liofilizada comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato; y en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el ADN liofilizado está reconstituido en una solución farmacéuticamente aceptable.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la solución farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en agua, PBS, TE, tampón tris, salina normal, y mezclas de los mismos.

18.- El método de conformidad con las reivindicaciones 15-17, en donde la composición reconstituida se administra mediante inyección directa.

19. - Un método para hacer una formulación de ADN liofilizada, que comprende: (a) preparar una formulación de ADN que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo; y (b) liofilizar la formulación de ADN, haciendo de esta manera la formulación de ADNliofilizada .

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde la liofilización de la formulación de ADN comprende además (a) cargar un recipiente con la formulación de ADN en un liofilizador; (b) enfriar la formulación de ADN a una temperatura bajo cero; y (c) secar la formulación de ADN. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se proporciona una formulación de ADN liofilizada de una composición que comprende un ADN de plásmido, una sal y un carbohidrato, en donde el ADN de plásmido comprende un gene de HGF, o variante del mismo.