MX2010010759A

MX2010010759A - Mutantes de estreptocinasa y sus formas covalentemente modificadas.

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Publication number: MX2010010759A
Application number: MX2010010759A
Authority: MX
Inventors: Shekhar Kumar; Neeraj Maheshwari; Girish Sahni
Original assignee: Council Scient Ind Res
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2011-03-03
Also published as: US20150344861A1; US8093032B2; WO2009122442A8; US9695408B2; IL208391A0; TW200944218A; RU2013126581A; RU2542392C2; US9115210B2; CL2009000793A1; RU2010144493A; EP3124496A1; EP2274336A2; US20100034804A1; CN102089328B; CN103627690A; US20120213763A1; AR071169A1; WO2009122442A2; EP3124496B1

Abstract

La presente invención proporciona nuevos mutantes de estreptocinasa, sus fragmentos funcionales y formas covalentemente modificadas. Se proporcionan métodos para la preparación de la proteína de activador bacteriano de plasminógeno, estreptocinasa, sus muteínas, variantes de especie y sus variantes covalentemente modificadas que se caracterizan por propiedades terapéuticas, mejoradas, tal como estabilidad proteolítica incrementada, vidas medias extendidas en plasma, inmunorreactividad reducida y especificidad, mejorada de coágulo de fibrina. El método comprende ya sea incorporar residuos adicionales de cisteína, o sustituir residuos de cisteína para aminoácidos que se presentan de manera natural en regiones no esenciales, de la proteína tal que permanezca en su mayor parte inalterada la actividad catalítica de la proteína resultante. Estas variantes de cisteína se modificaron adicionalmente por unión covalente de un polímero reactivo a cisteína tal como polietilenglicol (PEG) o porciones reactivas a sulfhidrilo de un grupo que incluye fluoroforo, marcas de giro u otros pequeños conjugados. Las descripciones en la presente son conjugados biológicamente activos, específicos de sitio, de estreptocinasas y sus variantes covalentemente modificadas.

Description

OTANTES DE ESTREPTOCINASA Y SUS FORMAS COVALENTE MODIFICADAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a mut ptocinasa y sus formas covalentemente modific nte invención utiliza · la modificación p énea, específica de sitio y definida, de estre s variantes relacionadas con sustituciones, a siones o construcciones de fusión de domi tir su uso en la forma de productos tera icos , ' mejorados .

La presente invención se refiere a l ente de PEG a variantes de cisteína de estrep muteínas, variantes de especie o productos de f na, usando reactivos de PEG sensibles a tiol. otro activador de plasminógeno de un ilocinasa (SAK) muestra una fuerte similitud -dominio de SK aunque los dos no tengan ficativa de secuencia a nivel de aminoácidos al., 1997). Esto indica que los activad inógeno de diferentes fuentes retienen el mismo ctural aún si difieren mucho en su secue éptido. Se espera la restricción evolutiva para integridad estructural debido a que los ac rianos de plasminógeno son co- factores p izan por lo tanto múltiples puntos de contacto r la activación conformacional de zimógeno. Esta ctural extiende el alcance de esta invención ional debido a que los métodos practicados en e ueden aplicar a activadores bacterianos de pía tro género o especie que compartan los dominios de elegir de los residuos expuestos en superfi ya sea en el asa o hélice o en las láminas tes de las regiones estructurales y flexibl rminar la accesibilidad de superficie, se usó el SSP. El programa de DSSP ( absch et al., 1983) ctura secundaria, las características geométri sición a solvente de las proteínas, dadas las co eas en el formato Protein Data Bank. El DSSP in sición de residuo en términos de Angstroms cuad ifró la accesibilidad en superficie de los res oácido de estreptocinasa a partir de la e talina de alta resolución de la estreptoc lejo de microplasmina (Wang et . al. 1998, PDB las regiones que estuvieron ausentes en esta e -181 y 252-262) se usó la estructura crista nio beta, aislado (Wang et . al., 1999, PDB ID I de manera más particular, la invención se refi cción de derivados de estreptocinasa, crea iería, para el uso en composiciones farmacéuti r trastornos circulatorios.

Antecedentes de la Invención El desarrollo de trombos (coágulos sanguí istema circulatorio puede provocar bloqueo vasc ce a condiciones fatales. El desarrollo del coá lución es un proceso altamente controlado stasis. Cualquier desviación de una hemostasi ce a varias condiciones clínicas tal como lia pulmonar, trombosis de venas profundas e al miocardio. Las condiciones patofisiológ en de la hemostasis fallida necesitan atención iata. La intervención médica más practicada pa s es la administración intravenosa de lección. En cuanto a lo que se refiere a la e ca, tanto la estreptocinasa como t derablemente buenos pero debido al bajo costo p y una vida media in vivo ligeramente m ptocinasa es el trombolítico más preferido al (Sherry y Marder, 1991, Wu et al., 1998). Ta de tPA es ligeramente más probable que provoque fecto secundario principal de ambos f rmacos. Si streptocinasa, que es una proteína bacterian aleza antigénica y puede dar lugar a compl eas tal como respuesta alérgica o hemorragia. la trombosis efectiva (Wu et al., 1998) no es s vida media en circulación (15-30 minutos) ptocinasa .

A pesar de todo esto, en años recientes, l olítica con agentes fibrinolíticos , ta , que entonces circula en el sistema y actú na para degradar esta última en productos sol dación. Se puede mencionar aquí que PN, por sí az de activar PG a PN; esta reacción se cata asas altamente específicas, tal como TPA, el asminógeno, y UK, todos los cuales pos rencia inusualmente estrecha a substratos p íficamente una propensión a escindir el enlace dible en PG de una manera altamente especí . Sin embargo, diferente de UK y de TPA, la SK í misma actividad proteolítica, y activa "indire PN, es decir, al formar primero, un complejo equ afinidad con PG, conocido como el complejo sado por Castellino, F. J., 1981) . El complejo ces actúa como una proteasa que escinde otras bstrato.de PG a PN. eptídicos que no son de origen humano. Este as a en general por Roberts et. al; 2002. Se s intentos para superar estos inconvenientes cos polipeptídicos, tal como alterando la secu cidos para reducir la proteólisis o la antig I nando los polipéptidos a dominios de glob ina para mejorar la vida media, etc. (Osborn ) . Estos métodos proporcionan poca ayuda al pr n junto con una carga asociada. El principal a área fue el método de PEGilación de prote rcionó la solución única a múltiples problemas ietilenglicol) se forma al polimerizar varias su titivas de etilenglicol para dar lugar a ales o ramificados de PEG de masas moleculares a vez conjugada covalentemente con PEG, la prote é tido muestran ro iedades farmacocinét un amplio intervalo de pH y cambios de te fardini et al. 1995). El uso de PEG se aprobó productos terapéuticos y no muestra vir idad y se elimina intacto del cuerpo ya sea es o en las eses. Las características benéfic gación de PEG se pueden impartir potencialme hacerla un trombolítico más efectivo y más segu ratura (Rajagopalan et. al., 1985) se reporta el EGilación de SK usando una reacción de mod ea, relativamente no especifica. Los usos ter Stas modificaciones fueron severamente limitado idad altamente comprometida de activa inógeno. También, se definió pobremente la natu odificación y es de naturaleza heterogénea. L esta heterogeneidad fue la química usada ficación de PEG ue no selecciona como ob Se conoce que se pueden utilizar, ducción de PEG, diferentes grupos funcionales a proteína. Las técnicas más comúnmente emple atización de residuos de lisina o residuos de a proteína. También se puede aprovechar el gru o en el N- terminal para la conjugación homogénea en proteínas (Baker et . al., 2006), Sin embargo esiduos de cisteína para que tengan los gr rporados es particularmente ventajoso pues cialmente, se pueden seleccionar como obje os-SH en un modo específico del sitio, particula roteína tiene o se hace que tenga un número muy esiduos de cisteína. No es una exageración afirm gación con PEG llega a ser una técnica c eína está desprovista de cualquier cisteína pu un lienzo virtual en blanco para la adición, in ción. En el caso de SK, un gran número de res na están uniformemente esparcidos a todo lo l éptido y por lo tanto limitan la posibil ugación homogénea de PEG específica del sitio. D interesante, no hay Cisteína natural present cula de Estreptocinasa (Malke et. al., 1985), ha modo posible general varias variantes de cis eptocinasa. Aquí no hay cisteínas libres en las lentes nativamente plegadas, de SK, derivadas p dominios de unión a fibrina (ref. Patente de lo os No. 7,163,817). Esto da la posibilidad de as variantes que contienen cisteína l eptocinasa específica de coágulo, sin i mente con el replegado normal de la proteína abu eína (todos los residuos de cisteína que se acop ación de enlaces de disulfuro) . Las cisteína ^dadores heterologos, adecuados, la SK es muy efe costo y de eta manera es un fármaco tro ripal, particularmente para mercados consien o f a nivel mundial. Se ha encontrado que la S tiva en el tratamiento clínico de infarto ardió después de trombosis coronaria (ISIS-.3, ó como un agente trombolítico durante más as. Sin embargo, parece de varias desventajas, la plasmina producida a través de la activación estreptocinasa, de plasminógeno, descomp ptocinasa tan pronto después de su gopalan et. al., 1985, Wu et . al., 1998). Esto media in vivo de la estreptocinasa a aproximad os (Wu et. al., 1998). Aunque la estre vive en circulación significativamente más tiem lo hace otro fármaco trombolítico de elección, nece como el fármaco de elección particularment s en desarrollo debido a su relativamente po ejemplo, aproximadamente 50 dólares americanos tratamiento en comparación a casi 1500 dólares a TPA) .

Se reportó primero que la estreptocinasa s de coágulos sanguíneos por Tillet y Garner (1 go, más tarde se estableció que la inolítica de la S se corigina de su capaci ar plasminógeno humano (HPG) , revisado por Ca ) . La estreptocinasa se segrega principalmente ptococos ß-hemolíticos el grupo A, C y G. La ador de PG humano aunque en sí misma no es una más bien se une a PG humano/PN y recluta otras PG como substrato y convierte estas en el prod última circula en la corriente sanguínea. La rados de SK.

Actualmente se está usando de manera exten omo un fármaco trombolítico a nivel mundial pues isolvente eficiente de coágulos de fibrina, y propias limitaciones. La SK que es una proteina estreptococos ß-hemolíticos , su uso en humano nogenicidad (McGrath y Patterson, 1984; McGrat ; Schweitzer et al, 1991) . Los altos tí noglobulinas (Ig) anti-SK generadas después de l nistración de SK, se sabe que persisten en nte varios meses a unos pocos años (Lee et al, manera, los anticuerpos anti-SK limitan sever como terapia futura de repetición ya sea al ne n la administración (Spottal y Kaiser, 1974; is, 1990) o al provocar una variedad de r icas McGrath Patterson 1984 McGrath et al resivamente mayores de la proteína (para su da neutralización basada en anticuerpos) ementar severamente la probabilidad de r gicas, haciendo esencialmente inefectiva y pelig nistración repetida. Los intentos para solucio lemas, en general, están bien documentados ratura donde se ha mostrado que varias alt eas y químicas son útiles para la generación de péuticos mejorados, ver, por ejemplo, Mateo, . Lyczak, J. B. & Morrison, S. L . 1994, Syed, S , Alien, T. M. 1997. Lo más promisorio de es a es el planteamiento de la modificación de péuticas por unión covalente de polímeros de alquileno, particularmente polietilenglicoles ( es un polímero inerte, no antigénico, y se ementa la vida media en circulación de las pro 9,337 describe el uso de PEG o propilenglicol a eínas para proporcionar una composición de pol ble en agua, no inmunogénica, fisiológicament ue la química de conjugación a PEG es princ rica, pero la colocación estratégica de polímer una proteína terapéutica es de importancia sup ar resultados exitosos. La disponibilidad de in uctural tridimensional con zonas prob ionales, marcadas a través de varios est ción, ayuda a diseñar un plan de transforma ener intacta la funcionalidad.

La secuencia completa de aminoácidos rminó por análisis de degradación secuencial de mentos de SK generados por métodos enzimátic uro de cianógeno (Jackson y Tang, 1982) . Los blecieron que la molécula de Mr 47,408 Da, con ra efectiva este gen en la producción se sptocinasa en microbios relativamente no patógeno Sumario de la Invención El objeto principal de la presente inve orcionar mutantes de estreptocinasa con potenc iencia incrementada debido a acción exte orreactividad reducida.

Otro objeto de la invención es modificar ctiva estreptocinasa para mejorar sus pr acocinéticas y habilitarla con trom éuticamente útiles y estabilidad pro ementada y vida media in vivo mejorada.

Aún otro objeto de la presente inve ficar de manera selectiva la estreptocinasa par propiedades biológicas deseables, exhibidas cula no modificada.

Por consiguiente, la presente invención pr tes de estreptocinasa, sus fragmentos funci ías covalentemente modificadas. Las variantes c péptidos relacionados a SK donde se sustituyen duos de Cisteína por uno o más aminoácidos no e las proteínas. De manera preferente, las renden un residuo de Cisteína sustituido oácido seleccionado de los aminoácidos en las re los extremos de las alfa-hélices y aún en las ndarías formadoras de estructura, o regiones en duo de Cisteína se adiciona en el N-terminal o C las proteínas con o sin extensiones adicio oácidos .

La presente invención comprende los rales para la selección, producción y eptocinasas que muestran estabilidad pro eptocinasa, conjuntamente con exc bilizadores y portadores adecuados como se cono ica para diseminación efectiva en el cuerpo amiento de diversos trastornos circulatorios, Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1D muestran SDS-PAGE que antes purificadas de cisteina de estreptocina tos de PEG . La Figura 1A muestra la variante de dominio alfa (SEQ ID NO: 30) de estreptocinasa, eemplazado el aspartato presente en la 95ava po asa flexible 88-97 con cisteina. Esta cistei rada de esta manera se ha PEGilado con polime tivo a tiol, metoxi-PEG-maleimida de 20 KDa se ficación para dar un aducto homogéneo de proteín ra IB muestra la variante de cisteina del domini (SEQ ID NO: 49) donde la serina en la 258-ava po culado con metoxi-PEG-maleimida de 20 KDa par to de proteína-PEG de mayor peso molecular. La tra la variante bi-pegilada de estreptocinasa (S , donde se ha colocado cisteína en cada uno inal y C-terminal de la secuencia orig eptocinasa. El imitante doble de cisteína, gen modo, se ha modificado con PEG de peso molecula La Figura 2 representa el mapa circular de el vector de expresión empleado para la exp eptocinasa en E. coli. El mapa circular resa S sitios seleccionados únicos de RE en el vector vector de expresión basado en el promotor de merasa (Studier et al., 1990) y el gen incorp fica para SK que se usó para la construcción y K y sus muteínas .

La Figura 3 muestra las curvas espectroscó iejo preformado de la estreptocinasa bi-PEGilada plasmina anula el retraso de tiempo visto en la tablece de este modo la dependencia de plasmin cidad normal de activación de plasminógeno p lada que es contraste a nSK que no muestra un r a la ausencia/presencia de plasmina en la reacc Descripción Detallada de la Invención La presente invención se basa en los rimentales que la unión covalente de una o más PEG a los residuos estratégicamente susti ionados de cisteína en la estreptocinasa da por estreptocinasa PEGilada, biológicamente ac bilidad proteolítica incrementada y vida media p eliminación junto con depuración reducida, orreactividad en comparación a la estreptocinas itio y tamaño de la conjugación con PEG se pued emos de la proteína de SK) . La sustitución, a rción de una o más cisteínas en la estrepto péptidos de estreptocinasa específicos de co g conveniente adicionar PEG de diferentes masas .mo ubicación deseada del polipéptido con la cond sustituciones y/o adiciones se lleven a cabo ra "estratégica" que evita limpiamente la pé Cterísticas funcionales, y da por resultado la g uevas propiedades benéficas no presentes en la va, no modificada. La elección de la colocación ñó en base a la accesibilidad superficial d ccionado y su pertinencia a la estructura- función Las estreptocinasas PEGiladas de la nción tienen mayor utilidad como productos ter como mayor conveniencia de uso en comparaci culas nativas debido a que en tanto que aración a las proteínas nativas (no PEGiladas) .

Por lo tanto, las estreptocinasas PEGilad enté invención son útiles para tratar suj tornos circulatorios tal como trombosis v riales, infarto de miocardio, etc., con las ven que las estreptocinasas PEGiladas de la entan el potencial de eficiencia incrementada de ?? extendida e inmunorreactividad reducida, ite la posibilidad de administración repetida de ma antigenicidad. El número, tamaño y ubicació os de PEG se puede emplear de una manera señar las estreptocinasas para que posean vid renciales para hacer su uso conducente al requis torno/síndrome clínico particular, o un sujeto p tratamiento.

La presente invención comprende la mod ias hospedadoras , procarióticas , tal como E. las hospedadoras, eucarióticas , tal como feras o de levadura, usando métodos y m -encionalmente usados, conocidos en la téc rmación de secuencia de ADN para la estre ficada de diferentes especies, se puede ob rmación publicada. Se ha estudiado el polimorfi eptocinasa y se explican (Malke H, 19 icaciones para la patogénesis. También se ha un estudio epidemiológico molecular para dete ribución del gen de estreptocinasa en l eptococales del grupo A de diferentes tipos M y cies estreptococales . La mayoría de las cepas e ste estudio muestra actividad positiva de estre el ensayo de traslape de caseína-plasminóg ltados totales de estos estudios indican rales. Las estreptocinasas producidas por la exp células hospedadoras , genéticamente manejadas, pueden purificar, y se desea, se pueden for osiciones farmacéuticas por métodos convencionale Como un aspecto preferido de esta invenc eptocinasas expresadas por medios recombinantes cionar con los agentes deseados, reactivos a t iciones que permitan la unión de la porción r al grupo sulfhidrilo de los residuos introd eína en las estreptocinasas.

El término reactivo a tiol se define en la cualquier compuesto que tenga, o se a capa ado para tener, un grupo reactivo capaz de f n covalente al grupo sulfhidrilo (-SH) del r eína. Incluidos entre estos compuestos están como polipropilenglicol y PEG, polímeros ba o que se conserven las propiedades funcionales, a proteína.

Por consiguiente, la presente invención pr polipéptido mutante de estreptocinasa que encia de aminoácidos seleccionada del grupo que EQ ID NO: 1-24, en donde se sustituye o inserta residuo de cisteína. La Tabla 34 muestra res esponden a los residuos de SEQ ID NO: 1 ablemente intolerantes a mutación y sustitución.

En una modalidad de la presente inven nte de estreptocinasa, preparado, es un ional de estreptocinasa que tiene SEQ ID NO: 2-6.

En una modalidad de la presente invenc ntes de estreptocinasa preparados, son mut eptocinasa que tienen SEQ ID NO: 7-19.

En una modalidad de la presente inven 'eptocinasa, seleccionada del grupo que consist 48-64, asa 88-97, la región 103-106, o 119-ón formadora de hélice 196-207 o la región for 170-181 o la región formadora de asa 254-264 o spiral enrollada 318-347 o la región 360-372 d 1 o sus muteínas o sus fragmentos funcionales, variante tiene actividad biológica como se mi ?? normal .

En otra modalidad, el polipéptido mu eptocinasa que comprende de una a tres sustitu eína, en donde la sustitución de cisteína está l a en al menos una región que corresponde a la va de aminoácidos de estreptocinasa (SEQ ID NO on que se selecciona del grupo que consiste de residuos 48-64 de aminoácido, la asa de los res de aminoácido, la región de los residuos 10 esponde a, se usa para querer decir posiciones e ro de la proteína de referencia, por eptocinasa tipo silvestre (SK) o SEQ ID NO: 1, y ciones en la proteina consultada (por ejemplo, se alinean con las posiciones de la pro rencia. De esta manera, cuando la secue oácidos de una presente SK, por ejemplo, SEQ ID , 5, etc., se alinea con la secuencia de amino SK de referencia, por ejemplo, SEQ ID NO: oácidos en la secuencia de la presente responden a" ciertas posiciones enumeradas encia de SK de referencia son aquellos que se al s posiciones de la secuencia de SK de referencia ariamente en estas posiciones numéricas, exact encia de SK de referencia. Por ejemplo, un 4C s en SEQ ID NO: 4 "corresponderá" a un mutante árrafo anterior, en donde el dominio de unión conecta a la estreptocinasa mutante medi opéptido conectador, flexible.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde la estreptocinasa mutante ás al menos una sustitución adicional de amino itución de aminoácido que corresponde a una su minoácido que se selecciona del grupo que co 0Ala, Hisl07Ala, Serl08Ala, Asp227Tyr, A 40Ala, Arg244Ala, Lys246Ala, Leu260Ala, 79Ala y Asp359Arg de SEQ ID N0:1.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde la estreptocinasa mutante supresión, la supresión que corresponde a una minoácido que se selecciona del grupo 1 que co 0, Asp227 y Asp359.

, L321, L326, A333, D347, D360 O R372 de SEQ ID N En otra modalidad, el mutante como se riórmente, en donde la estreptocinasa mutante menos dos mutaciones de cisteína en una posi esponde G49, S57, A64, 188, S93, D95, D96, DI , K121, D122, E148, K156, D173, D174, L179, D1 , 1254, N255, K256, K257, S258, L260, E281, K2 , L321, L326, A333, D347, D360 o R372 de SEQ ID N En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde la estreptocinasa mutante enos tres mutaciones de cisteína en una posi esponde a G49, S57, A64, 188, S93, D95, D96, DI , 121, D122, E148, K156, D173, D174, L179, D1 , 1254, N255, K256, K257, S258, L260, E281, K2 , L321, L326, A333, D347, D360 o R372 de SEQ ID N En otra modalidad, el mutante como se echamiento de al menos una arteria coronaria.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, que comprende además una porción re eína sustituida en al menos uno de los mut eína.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde la porción reactiva a cis etilenglicol (PEG) .

En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde el PEG es un polímero ficado de tamaño molecular que varía de 5000 d 00 daltones.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde el mutante tiene es eolítica incrementada, en comparación eptocinasa mutante no PEGilada. péptido de fusión, el polipéptido de fusión que ominio de estreptocinasa y un dominio de unión a dominio de estreptocinasa que comprende de un ituciones de cisteína, en donde la sustit eína está localizada en el dominio de unión a enos una región que corresponde a la secuencia oácidos de Estreptocinasa (SEQ ID NO: 1) , la r selecciona del grupo que consiste de la asa duos 48-64 de aminoácido, la asa de los residuos oácido, la región de los residuos 102-106 de am egión de los residuos 119-124 de aminoácido, adora de hélice de los residuos 196-207 de amino on formadora de asa de los residuos 170- oácido, la región formadora de asa de los resi de aminoácido, la región de espiral enrollad duos 318-347 de aminoácido, la re ión de los ona al N-terminal del dominio de estreptocin péptido de fusión comprende al menos una mut eína seleccionada del grupo que consiste de G80, G166, S157, A181, 1205, S210, D212, D2 , D237, K238, D239, E265, K273, D290, D291, L2 , 1371, N372, K373, K374, S375, L377, E398, 3 , L438, L443, A450, D464, D477 y R489 de SEQ ID En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde el dominio de unión a f ona al C-terminal del dominio de estreptocin péptido de fusión comprende al menos una mu eína seleccionada del grupo que consiste de 188, S93, D95, D96, D102, S105, D120, K121, D1 , D173, D174, L179, D181, S205, A251, 1254, N2 , S258, L260, E281, K282, F287, D303, L321, L3 , D360, R372, H401, A402, D447 G465 de SEQ ID D564 y G582 de SEQ ID NO: 24.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde el mutante es capaz de t rmedad o trastorno seleccionado del grupo que co rto de miocardio, trombosis vasculares, embolia ue, un evento vascular, angina, embolia pulmona émico transitorio, trombosis de venas profun sión trombótica subsiguiente al procedimi rvención coronaria, trombosis vascular pe gía del corazón, cirugía vascular, falla del rome X y un trastorno en el cual se pre echamiento de al menos una arteria coronaria.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, que comprende además una porción r eína sustituida en al menos uno de los mut eína . eolítica incrementada, en comparación eptocinasa mutante, no PEGilada.

En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde el mutante tiene anti inuida e inmunogenicidad in vivo dismin aración a una estreptocinasa mutante, no PEGilada En otra modalidad, el mutante como se riormente, en donde el mutante tiene depuraci a y vida media in vivo incrementada, en comparac eptocinasa mutante, no PEGilada.

En aún otra modalidad de la presente inven NOs : 22-24 son polipéptidos híbridos coval ficados que comprenden al menos un fragmento fun eptocinasa (SK) y dominios 4 y 5 de unión a nios 1 y 2 de unión a fibrina (FBDs) de fib na .

D95, D96, D102, S105, D120, K121, D122, E14 , D174, L.179, D181, S205, 'A251, 1254, ?255, ?2 , L260, E281, ?282, F287, D303, L321, L326, ?3 , R372, en donde la variante tiene actividad se mide por un ensayo normal .

En aún otra modalidad de la presente inve duo de cisteina se sustituye por al menos un at ccionado del grupo que consiste de: H16, A17, , S157, A181, 1205, S210, D212, D213, D219, D2 , D239, E265, K273, D290, D291, L296, D298, S3 , K373, K374, S375, L377, E398, 399, F404, D4 , A450, D464, D477, R489, de la SEQ ID NO. 22, ariante tiene actividad biológica como se mid yo normal .

En aún otra modalidad de la presente inve duo de cisteina se sustitu e or al menos un a ccionado del grupo que consiste de: H16, A17, , S157, A181, 1205, S210, D212, D213, D219, D2 , D239, E265, K273, D290, D291, L296, D298, S3 , K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D4 , A450, D464, D477, R489, H518, A519, D564, G5 ID NO. 24 que tiene actividad biológica como se nsayo normal .

En aún otra modalidad de la presente inve duo sustituido de cisteína se modifica con un tiva a cisteína.

En aún otra modalidad de la presente inve duo sustituido de cisteína se modifi etilenglicol , En aún otra modalidad de la presente inve cula de PEG señalada anteriormente es un políme amificado de tamaño molecular que varía de En aún otra modalidad de la presente inve ante descrita anteriormente tiene depuración ren lo tanto vida media in vivo incrementada en comp contrapartes originales, no modificadas.

En aún otra modalidad de la presente inve osición farmacéutica comprende al menos una antes de cisteína opcionalmente junto con ex acéuticamente aceptables.

En aún otra modalidad de la presente inve osición farmacéutica es útil para tratar una enf torno seleccionado del grupo que consiste de i ardio, trombosis vasculares, embolia pulmonar, a to vascular, angina, embolia pulmonar, ataque sitorio, trombosis de venas profundas, re-bótica subsiguiente a procedimiento de int rifér cir ía de ones de unión a fibrina de la fibronectin ccionadas de los dominios de unión a fi onectina humana (por ejemplo, el par de dominios nios 1 y 2, o formas modificadas de los mismos), los activadores híbridos de plasminógeno p cidad de unirse con fibrina de manera indepe ar a ser de este modo específicos de coágulo de idad mejorada para la sustancia del coágulo s eíficamente fibrina (Patente de los Estados U 3, 817) .

Proporciona variantes mono- o bi- o multi-isteína de estreptocinasa, o sus formas truncada sólo activas con respecto a la capacidad de acti- sino que exhiben un nuevo inesperado atributo f ejemplo, la variante bi-PEGilada de cisteína de olocan cisteínas adicionales en las dos extremi activada inmediatamente (como es el caso con S odificada, que activa PG virtualmente en el con da a un modo de acción, dependiente de plas raste, la SK nativa no requiere ninguna plasmina vada, sino que se activa virtualmente tan pront ve compleja con PG. De esta manera, despué cción en el cuerpo, esta variante de SK hará s es del sistema vascular en tanto, que aún es do inactivo, o parcialmente activo. Sin embargo r preferencialmente activada en la vecindad inme ulo, en el momento que haga contacto con el co onoce que es abundante en plasmina en tanto que irculación en general (la plasmina libre que se damente en la circulación "abierta" debido a la erpinas [inhibidores de serina-proteasa] espec mina tal como alfa- 2 -anti lasmina resultado una generación total disminuida de e en la circulación general sino también la cap el trombolítico se administre repetidamente pa s circulatorios en una dosis relativamente menor evita reacciones inmunitarias, indeseadas . El debe ser una fibrinólisis continua y más eficie tivo o diana, sostenida por dosis terapéu tivas, considerablemente disminuidas, del bolítico con efectos secundarios reducidos al m inmunorreactividad disminuida, y mitigación licaciones hemorrágicas vistas frecuentemente c al .

La invención proporciona variantes PEGi eína de estreptocinasa o sus muteínas o de un ido de plasminógeno , que comprende un enlace e estre tocinasa (SK) , o formas modificadas vación de plasminógeno sólo después de un pe aso de más de 5 minutos después de la exposi vador de plasminógeno a un plasminógeno humano uado .

La invención proporciona células procari rióticas, transformadas o transíectadas con ve esión en los cuales se clonan genes para eptocinasa, sus proteínas o formas coval ficadas, y son capaces de expresar variantes de streptocinasa o sus muteínas o los activadores lasminógeno. Para la expresión eficiente, se op secuencias de ADN que codifican para la estrep muteínas y formas covalentemente modificad erencias de codón de hospedadores de expresión b erias o levaduras .

La invención detalla un método para la p ica de ADN, o su combinación tal que se re vidad del activador de plasminógeno.

La invención toma en cuenta las vari eína de SK o sus formas truncadas que se PEG ién poseen dominios adicionales de unión a onados a través de enlaces polipeptídicos , de quimeras/polipéptidos de fusión, resultantes, rar capacidades de activación de plasminógeno, tran características de unión a fibrina. Las e los dominios de unión a fibrina y SK pu etas, pero también pueden ser a través de region éptidos ligadores que comprenden un tramo de sec oácidos que no es conformacionalmente rígida, ible, tal como aquellas compuestas predominant Ser, Asn, Gln y aminoácidos similares.

Las variantes de cisteína de SK o sus mu antes de especie o formas covalentemente modif esan en el sistema de expresión de levadur midos normales donde el péptido de señal N-te miza para secreción extracelular eficie péptido maduro. La información de secuencia p idos de señal se puede obtener de las etorias del sistema de expresión de ionalmente, esta información también se puede o otras proteínas recombinantes que se hiper-se ienen una secuencia optimizada de señal.

La invención proporciona un método, en dos celulares, crudos, obtenidos usando ya se icos, mecánicos o enzimáticos, de células que t antes individuales, dobles o triples de cisteín polipéptidos quiméricos de SK, se someten a lítica con reactivos de tiol -disulfuro o antes individuales, dobles, triples o múlt eína de formas covalentemente modificadas de ten a oxidación y replegado usando una m ationa reducida y oxidada, u otros reactivos útiles para estas reacciones de plegado oxi és de intercambio de tiol-disulfuro, por eína y cistina, de un potencial adecuado de r ación que permite que las formas coval ficadas de SK se replieguen a sus confo ógicamente activas en tanto que dejan las ionales libres para modificaciones químicas, re hidrilo .

Las variantes de cisteína de SK, sus m as covalentemente modificadas, se expresan en o rióticos tal como levaduras o células an tales usando métodos enéticos normales a pia trombolítica, o como profilaxis para varias ulares. El activador se puede formular de ac edimientos de rutina como composiciones * farm tadas para la administración a seres humanos, uir, pero no se limita a, estabilizadores mina de suero humano, manitol, etc., bilizadores , o agentes anestésicos tal como lig lares, así como otros agentes o combinacione os que estabilizan y/o facilitan la distrib antes in vivo.

La invención proporciona una co acéutica que comprende variantes PEGiladas de K o activador híbrido de plasminógeno y estábi incluyen, pero no se limitan a, albúmina de suer tol, etc., y agentes solubilizantes , agentes ane ados de origen humano o no humano. dos Generales Usados en. los Ejemplos En general, se utilizarán los métodos y culares bien conocidas en el área de biología mo cia de proteínas. Estos están fácilmente dispo as fuentes estándar tal como textos y man ocolo que corresponden a este campo de la téc pio, Sambrook et al., Molecular Cloning: A L al (II.sup.nd edition, Cold Sparing Harbor Pre 1989; McPherson, M. J. , Quirke, P., y Taylor ] PCR: A Practical Approach, IRL Press, Oxfo ent Protocols in Protein Science, publicado y & sons, Inc. Para experimentos inmunológ ere a manuales de protocolo y texto de Immun ocols, Hudson L, Hay FC (1989) 3ra ed. ntific. Sin embargo, esto no limita la ex eríchia coli, obtenida de Novagen Inc. (Madison, polimerasa termoestable (Pfu) , las endonucle ricción, la T4-ADN-ligasa y otras enzimas modi DN se adquirieron de New England Biolabs (Beve uministran cebadores de oligonucleotido por uno asic, Inc., Canadá, Integrated DN technologies -Aldrich, US. Las purificaciones de ADN y la e roductos amplificados por PCR de geles de ag izó usando equipos disponibles de Qiagen GmbH (A ealizó la secuenciación automatizada de ADN usan rescentes en el secuenciador de ADN, de 16 capi izador genético de Applied Biosystems 3130x1. minógeno ya sea se compró de Roche Diagnost zberg, Alemania) o se purificó de plasma hu atografía de afinidad (Deutsch y Mertz , 1 enciación de aminoácidos N-terminales se realiz vados de SK por el traslape de caseína y pía o en agar blando. El método original de etti, 1984; se modificó donde se transfirió dir urificada (0.5 gramos) en depresiones marcadas gar LB-Amp. La placa entonces se incubó a 37 °C d tos; posteriormente, se traslaparon caseína-HP erter suavemente la mezcla de las soluciones A e superior de la placa que contiene los pu ción A se preparó al calentar 1 g de leche descr i de Tris-Cl 50 mM, (pH 7.5), después de lo uvo a 37 °C en un baño de agua hasta el uso adic ción B se preparó al calentar 0.38 g de agarosa ris Cl 50 mM (pH 7.5) a 50°C. Después de en ción a 37°C, se adicionaron 3 µ? de TritonX-1 y 200 µ? de HPG. La placa entonces se incubó a rvó ara la eneración de zonas de de uración ( sinada tanto para la prueba como para el co sfirieron en placas de agar LB-Amp y se vidad residual después del traslape de minógeno de las placas .

Análisis por SDS-PAGE de proteínas: Se lle PAGE, esencialmente de acuerdo a Laemmli, U. modificaciones menores, como se necesite. De for repararon muestras de proteína al mezclar con u l de dos veces el amortiguador de muestra (Tris 6.8; 6% de SDS; 30% de glicerol; 15% aptoetanol y 0.01% de tinte Azul de Bromofen PAGE no reductora, no se incluyó beta-mercapto mortiguador de muestra. Antes de cargar en el tras se calentaron en un baño de agua hirviente tos . El sistema de gel discontinuo tiene usua centración de acrilamida) en el a ilamiento l ionalmente con yodo a través de un métod rrollado por Kurfürst (Kurfürst MM. , 1992) eíficamente las moléculas de PEG. Para la ti de variantes purificadas de PEG, brevemente d electroforesis, el gel se remoja en una sol araldehído al 5% (Merck) durante 15 minutos a te ente para fijación. Posteriormente, el gel se como sigue. Primero, el gel se puso en 20 mi lórico (0.1 M) durante 15 minutos, y luego se ad de una solución de cloruro de bario al 5% y 2 ción de yodo 0.1 M (Merck, Titrisol 9910). Las eína PEGilada teñida aparecieron en el espacio S minutos. Para la tinción dual de SDS-PAGE, dos de yodo se tiñeron adicionalmente por Azul usando el protocolo Laemmli como se describe en Se usaron ensa os cinéticos (Shi et. al., contiene substrato cromogénico 0.5-1 mM y NaCl 0. trato cromogénico usado (S-2251, Roche Diagnosti ania) fue específico de plasmina y da un pro r amarillo en la escisión que se puede monitoriz Las alícuotas de proteínas se adicionaron despu ion de todos los otros componentes en la conc do la primera absorbancia espectrofotométrica io en la absorbancia a 405 nm entonces se midió ion del tiempo en un lector de placa, ajustable olécula Devices EUA. Se usan diluciones aprop eptocinasa de S. ' equisimilis obtenida fordshire, R.U. como una norma de referen bración de unidades internacionales en la pr onocida . yo para determinar las constantes cinéticas d bl ara actividad de activador de HPF d ees se midió de manera espectrofotométrica nte un período de 10-40 minutos a 25 °C. Ent ularon los parámetros cinéticos para la activaci gráficas inversas, de Michaelis -Mentón, por ales (Wohl et. al., 1980).

Varias SK PEGiladas o sus muteí as y la radio-yodaron con yodo125 (I125) obtenido de Pe apore Pte Ltd. Usando el método de Yodogen acloro- 3a- ßa-difenilglucolurilo) (Fraker y Spec acuerdo al método usado por Fraker y Speck, gen se disuelve en cloroformo y se reviste en la ubo de vidrio de borosilicato al evaporar el sol rsión de gas nitrógeno. Para la yodación, se ión de proteína en solución Salina Amortig ato (PBS) al tubo revestido con Yodogen y se m Después de aproximadamente 10-30 minutos, la ) , seguido por la subclonación en pET-23d, un esión que contiene un sitio altamente eficiente ibosoma de la proteína cápside principal de dier y Moffatt, 1986) y modificación adici emo 5' del gen para reducir al mínimo la propen formación de estructura secundaria. Ti aposición en cuadro de un codón de iniciación pa enzo del cuadro de lectura abierto que codifica expresar la proteína como Met-SK. Para deta e hacer referencia a Sahni et . al; 2007 (Patent dos Unidos No. 7,163,817).

También se diseñaron muteínas de SK u tilla renovada como en el caso de SK para ob capacidad de expresión intra-celular . El mapa ET-23d-SK se ha representado en la Figura. 2. E roducir derivados truncados de SK se ex lica brina de fibronectina humana y su clonación y E. coli se explican en detalle en la Patent dos Unidos No. 7,163,817. De forma breve, los do n a fibrina se fusionan a estreptocinasa en el N el C-terminal o tanto en el N-TERMINALcomo el C . generar varias formas covalentemente modifi eptocinas . plos plo 1 cción de residuos o las regiones de proteína par antes de cisteína de estreptocinasa La selección de residuos para susti esión es crucial para mantener la funcionalida péptidos modificados. Por lo tanto, el génesis de cisteína requiere tanto in uctural resente en la estructura de cristal su pertinencia funcional. La selección de resi génesis de cisteína se basó parcialmente rminación de la accesibilidad en superficie dúos. También se limitó el sitio de inserción de giones flexibles de la estreptocinasa. Para dete sición en superficie, se usó el programa uentemente se usa el código DSSP para descr ucturas secundarias de proteína con un código de a. DSSP es un acrónimo para "Diccionario de E ndaria de Proteína", el programa DSSP (Kabsch ) define la estructura secundaria, las caract étricas y la exposición en solvente de proteín coordenadas atómicas en el formato de Protein D SSP indica la exposición de cada residuo en té troms cuadrados. La corrida del programa DSS ivo dado de PDB roduce un resultado abrev que están ausentes en la estructura crist rtaron en la estructura experimentalmente obten rminó la conformación más preferida a tr amientas de modelado molecular. Los resi sariamente detectados en la estructura pero altamente accesibles puesto que residen en l ible también se eligieron para mutagénesis de abia 1 muestra los valores de accesibilidad en s diferentes variantes de cisteína de SK (SEQ I se sustituyeron con cisteína. Sin embargo, la ta el alcance de sustitución con cisteína para oácidos que se presenta de manera natural de l res de accesibilidad calculados por el programa ron directamente como la medida de la expos rficie. El programa DSSP listó muchos residuos su erficie. Pero se realizó una selección cui eptocinasa se pueden reemplazar con cisteína y osamente con reactivos sensibles a tiol.

A pesar de la diversidad de secue eótidos y de polipéptido, existe una fuerte uctural entre los diferentes activadores bacte minógeno. La estafilocinasa de un dominio tiene uctural con el dominio alfa de estreptocinasa . T vador bovino de dos dominios de plasminógeno ob ptococcus uberis muestra similitud estructural nios alfa y beta de estreptocinasa. La con utiva de la estructura tridimensional de la e los diferentes activadores bacterianos de pía factible planificar modificaciones con cisteína antes de estreptocinasa que se aislan de d cies bacterianas. lo 2 ocols: Current Methods and Applications" editad hite, 1993., Humana Press, Inc., Totowa, N.J., ujeron casetes de expresión de bacterias y lev rtar la molécula de ADN que codifica eptocinasas deseadas en un vector adecuado (o al DN de plantilla de origen en el vector y al mu secuencia como se describe en la presente sformando las células hospedadoras con el c esión usando métodos convencionales conocido ica. Se introdujeron mutaciones específicas trucciones deseadas usando una variedad de proce como técnicas de mutagénesis de PCR (Innis ) , equipos de mutagénesis tal como aquellos ven tagene (equipo "Quick-Change Mutagénesis", Sa f.) o Promega (equipo Gene Editor, Madison ral, se diseñaron oli onucleótidos ara i la inserción de residuos de cisteína entre cual aminoácidos seleccionados de la Estreptoc quiera de sus formas representadas por las entes en la Tabla 2. Usando los métodos nor raron los correspondientes mutantes que eína en varias formas de SK. Los clones tran . diferentes mutantes entonces se examinaron y co secuenciación automatizada de ADN usando rescentes en un secuenciador de ADN de 16 capi izador genético Applied Biosystems 3130x1.

La Tabla dos lista diferentes construcc péptido que expresan una de las si eptocinasa; sus muteínas; variantes de especie; gentemente modificadas. La secuencia na péptido de longitud completa de estreptocina nado a SEQ ID NO: 1. La forma truncada de SK inales se ha dado por SEQ ID NO: 6. El polipé itud completa de SK (residuos .1-414) que itución de alanina para Asparagina 90 en el dom epresenta por SEQ ID NO: 7. El polipéptido mu nio beta de la SK de longitud completa q itución de Tirosina en lugar de Alanina se ha ID NO: 8. De manera similar SEQ ID NO: 9 repr nte del dominio beta de SK donde el residuo de a 238-ava posición se sustituye con Alanina. SE e asigna al mutante de beta-dominio de estre e el Glutamato en la 240-ava posición se susti ina. SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 repres ción de Arginina por Alanina, y Lisina por Alan ésimo y 246-ésimo residuos, respectivamente, en itud completa. El mutante de la asa 250 del dom K donde el residuo de Leucina en la 260-ava o nio alfa, Aspartato en la 227-ava posición en e o Aspartato en la 359-ava posición del domino suprimido, serán por SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: TO : 19, respectivamente. Las formas maduras y a están disponibles de varias especies y vari specie del género Streptococcus. Para val ibilidad de la mutagénesis de cisteína y la P iguiente a través de las diferentes formas de SK eleccionaron variantes de SK derivadas de las ptococcus, específicamente pyogenes y dysgalac ante de especies de SK derivad de Streptococcus a por SEQ ID NO: 20 y la obtenida de Stre alactiae se da por SEQ ID NO: 21. La forma coval ficada de SK donde están presentes dominios de iña en el N- terminal de SK se da por SEQ ID N ucto de fusión de C- terminal del dominio de gentemente modificadas.

Las variantes de cisteína, generadas en d as de la SK, mencionadas en la Tabla 2 se han as SEQ ID únicos. Las Tablas 3 a 28 listan viduales junto con sus SEQ ID únicos. a 3 : variantes que diseñaron en la SK nativa de leta (SEQ ID NO: 1). Tabla 4: variantes que se a SK 1-383 truncada (SEQ ID NO: 2). Tabla 5: se diseñaron en la SK 16-414 truncada (SEQ ID a 6: variantes que se diseñaron en la SK 16-383 ID NO: 4) . Tabla: 7: variantes que se diseñaron 14 truncada (SEQ ID NO: 5). Tabla 8: variante ñaron en la SK 60-383 truncada (SEQ ID NO: 6) antes que se diseñaron en el polipéptido de S ID NO: 7) . Tabla 10: variantes que se dis é tido de SK mutante SE ID NO: 8 . Tabla 11: olipéptido de SK mutante (SEQ ID NO: 15) . T antes que se diseñaron en polipéptido de SK mut NO: 16). Tabla 19: variantes que se dise péptido de SK mutante (SEQ ID NO: 17). T antes que se diseñaron en polipéptido de SK mut NO: 18).' Tabla 21: variantes que se dise péptido de SK mutante (SEQ ID NO: 19) . T antes de cisteína de Streptococcus pyogenes ID NO 20). Tabla 23: variantes de cis ptocoecus dysgalactiae subsp. equisimilis (SE Tablea 24: variantes de cisteína de SK con onado N-terminal de unión a fibrina (SEQ ID NO: Tabla 25: variantes de cisteína de SK con onado, C-terminal de unión a fibrina (SEQ ID a 26: variantes de Cisteína de SK tanto con onados N- terminal C- terminales de unión a fib da la aplicabilidad de esta invención a cualqu SK para mutagénesis de cisteína y mod iguiente con agentes reactivos a tiol.

Las construcciones obtenidas en el Ejem izaron en todos los experimentos adicionales 1 para arribar a la presente invención. Sin em entender que la lista de variantes de cis eptocinasas es solo de ejemplo y no exclusiva. íntesis de variantes alternativas y adició eína de las estreptocinasas , de acuerdo nción, está bien dentro de la presente habilid ica. La síntesis de estas variantes se puede enientemente usando técnicas y métodos convenció ipio 3 eexpresión ?_ purificación de Estrep ó icamente Activas mi de medio LB-Amp a 2-10% v/v y se dejó crec , a 180-280 rpm a una O.D60o nm (densidad óptica nanómetros) de 0.5-1.0. En esta etapa, se indujo centración final de 0.5-1.0 milimol) (Chaudhary ; Dhar et al., 2002); y se cultivo adicionalment nte 6-12 horas bajo condiciones agitadas. En lectaron las células por centrifugación a 600 nte 10 minutos. El sedimento entonces se lavó amortiguador enfriado con hielo (concentracione 100-150 mM, Tris-Cl 10-50 mM, pH 8.0, y EDTA ometió a tratamiento con ultrasonido {Heat Syst ) a 4°C, bajo condiciones de impulsos sónic ndos intercalados con períodos iguales de des do celular entonces se centrifugó a altas rp 0 g) durante 15 minutos. El análisis por SDS-PAG más de 90% de la roteína deseada se ha diri -SepharoseMR (GE-Amersham Biosciences) . Las frac eína después de HIC se mezclaron y se adicionó T a una concentración final de Tris-Cl 20 mM, desp se cargó en una columna empacada con DEAE-jo Rápido) pre-equilibrada con Tris-Cl 20 mM ( ués de lavados con amortiguador que contiene T pH 7.5), la protelna unida se eluyó usando un al de sal (NaCl 0-0.5 M) en Tris-Cl 20-25 eínas de S eluidas fueron en general más de 9 se analiza por SDS-PAGE. La cantidad de proteín ción se midió usando el método de Bradford de e roteína (Bradford. , 1976) y se confirmó por Ab nm. Todos los pasos cromatográficos se llevaron Las fracciones que contienen la proteína se a SDS-PAGE junto con SK normal y marcadores cular. Se mezclaron de manera conservadora las f usión se diluyeron a una concentración final de mg/ml usando agua destilada; junto con la adici ientes componentes adicionales (se d entraciones finales en la mezcla diluida) : Tri 50 mM; NaCl 100-150 mM; EDTA 1-5 mM; m ationa reducida y oxidada 1.25 mM:0.5 mM. La egada se separó y purificó en una columna emp tas de fibrina-sefarosa. Para una descripción repliegue, purificación y caracterización de la egada, referirse a Sahni et. al; 2007 (Patent dog Unidos No. 7,163,817). plo 4 ugación covalente de variantes de cist eptocinasas con Polietilenglicol Los grupos tiol de las variantes de ci ar a temperatura ambiente durante 1.5-4 horas, y eacción se retuvo al adicionar 1 mM de DTT. La lada del PEG libre y la SK sin reaccionar se pur atografía de intercambio aniónico en una columna arose (GE-Amersham Biosciences) . La mezcla de re yó 10-15 veces con amortiguador de Fosfato de so H 7.4 después de lo cual se cargó en una columna DEAE- Sepharose (Flujo Rápido) pre-equilibrad o amortiguador. Después de los lavados con amo contiene Fosfato de Sodio 25 mM, la proteína 6 usando un gradiente lineal de sal (NaCl 0-0 ato de Sodio 25 mM. De manera alternativa, si a derivados PEGilados falló en separarse del cionar, limpiamente por intercambio iónico ciones se sometieron a cromatografía de excl ño en Se hadex 75 Amersham Biosciences) u usión de tamaño en Sephadex 75 y pueden ser úti eptocinasa monomérica para usos terapéuticos deb tamaño y depuración lenta.

La reticulación de PEG, en todos los c irmó por SDS-PAGE. La electroforesis en gel mo a proteína PEGilada en las fracciones que se o ués de la remoción de la proteína sin reacció tivo de PEG libre. Las Figuras 1A-1D muestr antes mono- y bi- PEGiladas de SK. La figura 1 de las variantes PEGiladas representativa (D95C 30) de cisteína del dominio alfa de estreptocin ha reemplazado el residuo naturalmente pre rtato con cisteína y se ha conjugado con me imida de masa molecular de 20 KDa. La f esenta una de las variantes PEGiladas repres 8C SE ID NO: 49 de cisteína del dominio isteína de SK (SEQ ID NO: 493) donde se co eína en cada uno del N-terminal y C- termina cula y se conjuga con metoxi-PEG-maleimida cular de 20 KDa. La conjugación de PEG en emos de SK se llevó a cabo con la premisa que d minosos de PEG encerrarán la proteína en un ible y extienden su supervivencia in vivo du odo prolongado. Al mismo tiempo, el enmasc nsivo de las regiones inmunodominantes puede a oreactividad insignificante de la molécula iny ujeto. Las fracciones que contienen la proteína ezclaron y formularon para ensayos de activid nos casos, se caracterizaron adicionalme ctrometría de masa MALDI-TOF . La espectrometría ién confirmó la masa molecular esperada del aduc stre tocinasa sus formas covalentemente modific nte 10 minutos; posteriormente, se traslapó cas osa al verter suavemente la mezcla de las soluci la parte superior de la placa que contiene lo olución A se preparó al calentar 1 g de leche d 5 mi de Tris-Cl 50 mM (pH 7.5), después de lo uvo a 37 °C en un baño de agua hasta el uso adic ción B se preparó al calentar 0.38 g de agarosa ris-Cl 50 mM (pH 7.5) a 50°C. Después de ent ción a 37 °C, se adicionaron 3 µ? de TritonX-10 y 100-200 iq de HPG y se mezclaron suavem mación. La placa entonces se incubó a 37 °C du s y se observó para la generación de zonas de d mación de halo) debido a la hidrólisis de ido por activación de HPG . El área de la zona ?) que circunda la concavidad en el medio de a en consideración para comparar la capac ína-HPG con actividad de PEG conjugado ificación de una pérdida en la capacidad de acti minógeno. Todas las variantes modificadas con PE eptocinasas mostraron capacidad sustancial de a plasminógeno bajo ensayo caseinolítico .péuticamente útiles. Sin embargo, una combinació ida media adecuada que es clínicamente requeri inmunorreactividad reducida, hacen a algunos útiles que otros. La actividad comparativamente algunos casos se puede compensar bien por es eolítica incrementada y vida media in vivo de lo EG-proteína .

De manera alternativa, también se cidad de activación de plasminógeno como se e 6] y

[0047] . La Tabla 29 muestra la activ vador de HPG las constantes cinéticas ara u que están desprovistas del péptido N-term esponde a la región 1-59 son pobres activa minógeno y muestran actividad incrementada >lementación de ya sea la fibrina o péptido de S ezcla. de reacción para capacidades amidoliticas activación de plasminógeno (Nihalani et . al., mova et. al., 2004). Los derivados PEGilados de ienen 1-49 o péptidos N-terminales más cortos, dencia a fibrina para la activación de plasminó anto, sus acciones se restringen a coágulos, ha cipalmente específicos de coágulo. lo 6 bilidad proteolítica de variantes PEGiladas de streptocinasas Para la estabilidad proteolítica, 50 micro derivado PEGilado la SK nativa como co ionó tripsina en la reacción o solo SK o híbrid dicionaron en la reacción. En este caso, tambié isis en el traslape de agarosa se midió para ca estreptocinasas PEGiladas, tripsinadas o sus lentemente modificadas. El área de la zona de li r una medida directa de la capacidad de acti minógeno residual para la estreptocinasa protegi antes. Este ensayo muestra protección significa diferentes variantes de SK bajo este estudio ugaron con porciones individuales, dobles o t y se incubaron con tripsina o plasmina. Se en emento multiplicado en la estabilidad proteolíti n de más de un grupo de PEG a las variantes de SK De manera alternativa, también se confir ciones de actividad residual para estre v ogénico 0.5-1 m y NaCl 0.1 M) . Las alie einas se adicionaron después de la adición de s componentes en la concavidad. El cambio rbancia a 405 nm entonces se midió como una fu ?? en un lector de microplaca, ajustable, mode de Molecular Devices Inc., EUA. Los resultados ravés de este método estuvieron en consona ilos obtenidos a través del ensayo caseinolí ntró que la actividad funcional significativa odas las formas PEGiladas de estreptocinasa y s lentemente modificadas cuando se incuba sina. Las estreptocinasas no pegiladas cuando s ndiciones similares muestran actividad es ctable y son propensas a digestión con tripsina.

También se examinaron muestras some sinización en SDS-PAGE de reducción para ?? (5-180 min) en SDS-PAGE al 10% y se analiz eína intacta, protegida. Los resultados obtenido cicio también corroboraron el presente examen as proteínas tripsinadas. La capacidad de acti minógeno más residual, bajo condiciones de ién reflejó más protección de la proteína c inó para ausencia de daño físico en el SDS-PAGE. antes N-terminal y C-terminalmente extendidas de as modificadas con PEG A fin de establecer que una extensión arbi pocos aminoácidos tanto en el N-terminal o el C estreptocinasa o sus variantes producirá d riable el mismo resultado como aquel obtenid raparte no extendida, la SK o sus variantes de r sea n N-terminal o C-term proteína N-terminalmente extendida con seis am ionales. Para incorporar las extensiones oácidos, los casetes que codifican para la S antes se transformaron de pET 23d a pET 15b ( 1-3, Novagen, Inc. US). La colocación del case 15b da una extensión N-terminal de 20 aminoá uye un tramo de seis residuos de histidina y un sión de trombina. La escisión de la extensión N polipéptido se puede efectuar con trombina. Est tramo de marca de histidina y produce un po esado con solo la secuencia de aminoácidos de S 496 muestra la secuencia de aminoácidos de S VO debido a la clonación en pET 15b.

Para generar el producto C-terminal, exte ionó un tramo de seis residuos de histidina just último aminoácido de SK o sus variantes u ional y la estabilidad proteolítica produjo r lares como aquellos obtenidos con sus contrap didas. Esto da una fuerte evidencia para la c otros productos extendidos de N-terminal o C-te SK o sus variantes producirá resultados simil rto en la técnica puede pensar innumerables posi . extender tanto el N-TERMINALcomo el C- terminal variantes para producir formas funcion eptocinasa que se pueden usar para la sus rción o adición de cisteína y sus subs ficaciones de tiol con PEG u otros agentes re hidrilo . olo 8 vación de plasminogeno después de que se volvió plasmina, mostró cinética normal (es decir, va) de activación de plasminogeno (ver Figur pacidad para ser auto-activada inmediatamente (c con la SK nativa, no modificada que ac ualmente al contacto) es debido al modo de s ndiente de plasmina. En contraste, la SK n iere nada de plasmina para ser activada, sin va virtualmente tan pronto como se vuelve com En experimentos donde se retiraron las muestra ciones a diferentes puntos de tiempo en las reso de activación de plasminogeno, es decir, d temprana (en el periodo de retraso) , la vación rápida, etc., y se analizaron con SDS-ir el tipo de producto, se observó que la a ió cercanamente la eneración de fra mentos tru ractúen con el plasminógeno justo como nSK y la damente. Por lo tanto, claramente, la presenci os PEG en los términos, aparte de conferir una i bilizadora contra la proteólisis, inmunorrea , esperada a pesar de la posición, también itado la creación inesperada de un "int ndiente de plasmina, que tiene efectos rosos en la terapia trombolítica.

El atributo funcional de la dependencia a ecir, el "interruptor de plasmina" integrado se e otras variantes bi-PEGiladas de cisteína d cada, donde se colocaron cisteína adicionales e emidades del polipéptido, es decir, en el N-term inal, que exhiben una propiedad inesperada con r características de activación de plasminógeno tiene una velocidad inicial notablemente más inal naturalmente presente como después del amin nal para generar un doble mutante de cisteína 3 denota la variante truncada de SK donde ionado cada cisteína antes del aminoácido N-ter resenta de manera natural, y después de los tres ecutivos de glicina que se colocan próximos al oácido. Los datos muestran que ambas varía ladas muestran un retraso inicial pronunciado ar a ser completamente funcionales. Los p ticos, cuando se calculan de las fases 'lineale as de progreso de reacción después de la anulaci de retraso, mostraron qué una vez completamente ués del término del retraso inicial, ambas vari iadas llegaron a ser significativamente ac inos de sus capacidades de activación de aración a SK. Se obtuvieron resultados similares ica que un atributo funcional también se puede i olécula por cualquier modificación en y alreded términos (tal como una cadena lateral adecuada d ién conducirá a un retraso dependiente de plasmi cterísticas de activación de plasminógeno d esamiento proteolítico de la estreptocinasa S grupos "bloqueadores" pueden ser porciones S dominios de proteína, proteínas intactas mina, etc., se remueven por proteólisis, permit esto del polipéptido llegue a ser funcionalmen relación a la activación de plasminógeno. Por an a esperar efectos similares cuando se unen l en los términos usando cualquier química onible. Una química utiliza el valor diferenci grupo alfa-amino en el N-terminal para eíficamente ru os PEG, reactivos a amina, en erencialmente activada en la vecindad inmed ulo en el momento del contacto con el coágulo ce que es abundante en plasmina en tanto que no ulación (la plasmina libre que se inactiva rápid irculación "abierta" debido a la presencia de cíficas de plasmina (inhibidores de serina-prot alfa-2 -antiplasmina y alfa-2-macroglobulina) , este modo o reduciendo significativamente al vación sistémica de PG, coincidente con la admin SK natural que activa inmediatamente PG nistración y los efectos secundarios consecue hemorragia y destrucción a gran escala d onentes proteicos del sistema vascular. Esta p ecir, la activación dependiente de plasmina, jun media extendida de eliminación, y la baja re no énica anti énica dará or resultado no Una mejora adicional con respecto a este impartir la dependencia a fibrina en la molé iada al colocar los grupos PEG en los dos extrem antes SK 50-414 o SK 60-383. Este resultado e do a que la supresión de un "interruptor ca iduos 1-59) de SK altera la conformación del dom K y convierte estos fragmentos truncados en un lasminógeno dependiente de fibrina como se re et al., 1999 y Sazonova et al., 2004. El rado de diseñar estas variantes bi-PEGiladas es ndencia a plasmina como una dependencia/afinidad ibrina. Estos dos atributos, es decir, de mina y la afinidad/selectividad de fibrina h cula un activador de PG que es altamente dirig ulos de fibrina. Estas moléculas pueden ivamente el roblema de activación de PG si OS derivados mono-PEGilados de SK que re rporación de cisteína en cada dominio, y la o control) se radio-yodaron con 125I usando el geno (Fraker & Speck, 1978) , y se separaron de r e al caer pasar a través de columna de desa adex G-25. Se anestesiaron ratones CD1 (23-25 iso-fluorano y se indujo vasodilatación mode sición de la cola a una lámpara fluorescent os. Entonces los ratones se inyecta imadamente 7 microgramoas de proteína radio-ción salina estéril, mediante la vena de la c lectaron muestras de sangre entera de aproximad oL con el paso del tiempo usando transacción seno retro-orbital y mantenidas en tubos ados con heparina. Las muestras se procesa ucir plasma y se evaluaron para actividad de 1 proteína fragmentada, se aspiró de cada mue mentó resultante precipitado de TCA se analizó vidad de 125I. En general, se procesaron icadas y se promediaron los calores.

La radioactividad residual precipitable en rentes muestras de plasma después de la inye antes PEGiladas de cisteína de estreptocinasa s eterminación de la vida media ín vivo. Los r estudio de vida media muestran grados vari nción ín vivo para las diferentes variantes do se conjugaron con porciones individuales o les de PEG. Los resultados muestran que con la ás de un grupo PEG, también se amplifican l as resultantes. La vida media para las pocas iadas seleccionadas de SK se resumen en la Tabl tran que en promedio hay un incremento de 5 a ivo. Las variantes de PEG de dominio gamma mues ncremento de 4-5 veces en la vida media in ral, todas las estreptocinasas PEGiladas emento de múltiples veces en la vida m aración a la SK nativa (12-15 minutos) . Esto ncremento considerable en la vida media in vi ante PEGilada de cisteína, y. demuestra el tiem ndida de la SK PEGilada. Se obtuvieron r lares con otras variantes de cisteinilo de SK d PEGilación. Es bien conocido que un tiem ndida de la variante PEGilada es un resulta ión de PEG y no es dependiente de la ubica mero de PEG en la SK. De esta manera, la uni ión de PEG mediante un residuo de cisteína ltado una SK PEGilada o variante quimérica d cterísticas de tiempo-acción extendida permitie pio 10 orreactividad de variantes PEGiladas de cis eptocinasas Mediante un método basado en ELISA se e tividad de nSK y variantes PEGiladas de cisteína formas covalentemente modificadas contra anti-s (policlonales) formulados en conejos. El proc ELISA fue como sigue. 1. La SK y las variantes PEGiladas d yeron primero en amortiguador de bicarbonato 0 para producir 100 microlitros de solución que microgramos a 1.75 microgramos de proteína y Íonó a cada concavidad de la placa de mi roplacas de 96 concavidades, Nunc, Cole-Parme 2. La placa revestida con antígeno se c r n la 5. La solución primaria de anticuerpo s ero en PBS para dar un factor de dilución de 5 el anticuerpo diluido se adicionó a cada conca a entonces se incubó a temperatura ambiente dura tos bajo agitación suave.

. La placa se vació nuevamente y se la s con amortiguador de lavado. 7. El anticuerpo marcado con enzima de p ábano, contra antígeno, se diluyó apropiadament dicionaron 100 µ? de esta dilución a cada concav baron a temperatura ambiente durante 1 hora. 8. La placa se vació nuevamente y se l s con 1 x PBS. 9. A cada concavidad, se adicionaron 100 (sustrato Liquido de Tetrametilbenzidina, Sigma la laca se de ó durante 10 minutos a te dominios de SK reduce su reactividad a por deba ra los sueros policlonales de SK. La conjugació os PEG de 20 KDa, es decir, uno en el N-termi en el C-terminal de SK redujeron su reactiv jo de 10% contra sueros policlonales de ugación de tres grupos PEG de 20 KDa, es decir dominio de SK volvió la reactividad a samente detectables. Por lo tanto, es claro ugación de las porciones de PEG a diferentes re reduce significativamente su reactividad contr clonales de SK. Las pruebas in vitro que tividad reducida de anticuerpo establecieron cción reducida de respuesta inmunitaria se pre que la proteína PEGilada se inyecta en el animal a 33 lista el porciento de inmunorreactividad re variantes PEGiladas de SK en tanto ue se sitio a las variantes de cisteína descritas, nción imparte varias propiedades terapéuticas út cula de estreptomicina tal como estabilidad pro ementada, vida media in vivo mejorada orreactividad. De manera más particular, la inv ere a la producción de derivados de estrep jados por ingeniería, para el uso en comp acéuticas para tratar trastornos circulatorios. a 1 res de accesabilidad de solvente para varios am ccionados para sustitución de cisteína variante Ubicación de mutación de Accesa cisterna I 88 asa 88-97 de dominio alfa S 93 asa 88-97 de dominio alfa variante Ubicación de mutación de Accesa cisterna alfa y beta K 156 Región ligadora de dominio 1 alfa y beta D 173 Asa entre ß? y ß2 de dominio 1 beta D 174 Asa entre ß? y ß2 de dominio 1 beta L 179 ß2 de dominio beta D 181 En el extremo de ß2 de dominio beta S 205 Hélice OÍ (a3 , 4 ) de dominio N 255 beta variante Ubicación de mutación de Accesa cisterna L 321 ß? de dominio gamma 1 Enrollado, región de espiral L326 de domino gamma Enrollado, región de espiral A 333 de domino gamma Enrollado, región de espiral D 347 de domino gamma R 372 ß4 de dominio gamma ß7 de dominio gamma 2 a 2 rentes construcciones de SK, sus muteinas y pol usión que se usaron para mutagénesis de cisteína cula Modificación cula Modificación ID NO 10 SK Glu 240 Ala (1-414) ID NO 11 SK Arg 244 Ala (1-414) ID NO 12 SK Lys 246 Ala (1-414) ID NO 13 SK Leu 260 Ala (1-414) ID NO 14 SK Asp 359 Arg (1-414) ID NO 15 SK His, Ser 92, 93 Ala, Ala (1-41 ID NO 16 SK Lys, Lys 278, 279 Ala, Ala (1- ID NO 17 SK Asn 90 del (1-413) ID NO 18 SK Asp 227 del (1-413) ID NO 19 SK Asp 359 del (1-413) ID NO 20 SK (1-406) Streptococcus pyogen 10270, ABF34818 .1 ID NO 21 SK (1-414) Streptococcus dysg subsp. Equisimilis, AAC60418 ID NO 22 Fn SK (1-531) cula Modificación ID NO 28 lie 88 Cys ID NO 29 Ser 93 Cys ID NO 30 Asp 95 Cys ID NO 31 Asp 96 Cys ID NO 32 Asp 102 Cys ID NO 33 Ser 105 Cys ID NO 34 Asp 120 Cys ID NO 35 Lys 121 Cys ID NO 36 Asp 122 Cys ID NO 37 Glu 148 Cys ID NO 38 Lys 156 Cys ID NO 39 Asp 173 Cys ID NO 40 Asp 174 Cys ID NO 41 Leu 179 Cys cula Modificación ID NO 51 Glu 281 Cys ID NO 52 Lys 282 Cys ID NO 53 Phe 287 Cys ID NO 54 Asp 303 Cys ID NO 55 Leu 321 Cys ID NO 56 Leu 326 Cys ID NO 57 Ala 333 Cys ID NO 58 Asp 347 Cys ID NO 59 Asp 360 Cys ID NO 60 Arg 372 Cys ID NO 61 lie 88 Cys, Ser 205 Cys ID NO 62 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys ID NO 63 Asp 102 Cys, Arg 372 Cys ID NO 64 Ser 105 Cys, y Phe 287 Cys ID NO 65 L s 121 C s, Asp 360 Cys a 4 itución de cisteína individual en polipéptido SEQ ID NO 2) : 1-383 cula Modificación ID NO 71 Gly 49 Cys ID NO 72 Ser 57 Cys ID NO 73 Ala 64 Cys ID NO 74 lie 88 Cys ID NO 75 Ser 93 Cys ID NO 76 Asp 95 Cys ID NO 77 Asp 96 Cys ID NO 78 Asp 102 Cys ID NO 79 Ser 105 Cys ID NO 80 Asp 120 Cys ID NO 81 Lys 121 Cys ID NO 82 Asp 122 C s cula Modificación ID NO 91 lie 254 Cys ID NO 92 Asn 255 Cys ID NO 93 Lys 256 Cys ID NO 94 Lys 257 Cys ID NO 95 Ser 258 Cys ID NO 96 Leu 260 Cys ID NO 97 Glu 281 Cys ID NO 98 Lys 282 Cys ID NO 99 Phe 287 Cys ID NO 100 Asp 303 Cys ID NO 101 Leu 321 Cys ID NO 102 Leu 326 Cys ID NO 103 Ala 333 Cys ID NO 104 Asp 347 Cys cula Modificación ID NO 114 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Phe 287 ID NO 115 Asp 102 Cys, Leu 260 Cys , Arg 372 ID NO 116 Ser 105 Cys, Leu 260 Cys,. Phe 287 a 5 itución de cisteína individual en polipéptido tr SEQ ID NO 3) : 1 .-414 cula Modificación ID NO 117 Gly 49 Cys ID NO 118 Ser 57 Cys ID NO 119 Ala 64 Cys ID NO 120 lie 88 Cys ID NO 121 Ser 93 Cys ID NO 122 Asp 95 Cys cula Modificación ID NO 132 Asp 174 Cys ID NO 133 Leu 179 Cys ID NO 134 Asp 181 Cys ID NO 135 Ser 205 Cys ID NO 136 Ala 251 Cys ID NO 137 lie 254 Cys ID NO 138 Asn 255 Cys ID NO 139 Lys 256 Cys ID NO 140 Lys 257 Cys ID NO 141 Ser 258 Cys ID NO 142 Leu 260 Cys ID NO 143 Glu 281 Cys ID NO 144 Lys 282 Cys ID NO 145 Phe 287 Cys cula Modificación ID NO 155 Asp 102 Cys, Arg 372 Cys ID NO 156 Ser 105 Cys, y Phe 287 Cys ID NO 157 Lys 121 Cys, Asp 360 Cys ID NO 158 lie 88 Cys, Ser 205 Cys, Arg 372 ID NO. 159 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Asp 347 ID NO 160 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Phe 287 ID NO 161 Asp 102 Cys, Leu 260 Cys, Arg 372 ID NO 162 Ser 105 Cys, Leu 260 Cys, Phe 287 a 6 itución de Cisteína individual en polipéptido tr SEQ ID NO 4)': 16-383 cula Modificación ID NO 163 Gly 49 Cys ' cula Modificación ID NO 173 Lys 121 Cys ID NO 174 Asp 122 Cys ID NO 175 Glu 148 Cys ID NO 176 Lys 156 Cys ID NO 177 Asp 173 Cys ID NO 178 Asp 174 Cys ID NO 179 Leu 179 Cys ID NO 180 Asp 181 Cys ID NO 181 Ser 205 Cys ID NO 182 Ala 251 Cys ID NO 183 lie 254 Cys ID NO 184 Asn 255 Cys ID NO 185 Lys 256 Cys ID NO 186 Lys 257 Cys ID NO 187 Ser 258 Cys cula Modificación ID NO 197 Asp 360 Cys ID NO 198 Arg 372 Cys ID NO 199 lie 88 Cys, Ser 205 Cys ID NO 200 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys ID NO 201 Asp 102 Cys, Arg 372 Cys ID NO 202 Ser 105 Cys, y Phe 287 Cys ID NO 203 Lys 121 Cys, Asp 360 Cys ID NO 204 lie 88 Cys, Ser 205 Cys, Arg 372 ID NO 205 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Asp 347 ID NO 206 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Phe 287 ID NO 207 Asp 102 Cys, Leu 260 Cys, Arg 372 ID NO 208 Ser 105 Cys, Leu 260 Cys, Phe 287 a 7 itución de Cisteína individual en polipéptido tr Modificación 16 Asp 120 Cys 17 Lys 121 Cys 18 Asp 122 Cys 19 Glu 148 Cys 20 Lys 156 Cys 21 Asp 173 Cys 22 Asp 174 Cys 23 Leu 179 Cys 24 Asp 181 Cys 25 Ser 205 Cys 26 Ala 251 Cys 27 lie 254 Cys 28 Asn 255 Cys 29 Lys 256 Cys 30 Lys 257 Cys cula Modificación ID NO 240 Asp 347 Cys ID NO 241 Asp 360 Cys ID NO 242 Arg 372 Cys ID NO 243 lie 88 Cys, Ser 205 Cys ID NO 244 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys • ID NO 245 Asp 102 Cys, Arg 372 Cys ID NO 246 Ser 105 Cys, y Phe 287 Cys ID NO 247 Lys 121 Cys, Asp 360 Cys ID NO 248 lie 88 Cys, Ser 205 Cys, Arg 372 ID NO 249 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Asp 347 ID NO 250 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Phe 287 ID NO 251 Asp 102 Cys, Leu 260 Cys, Arg 372 ID NO 252 Ser 105 Cys, Leu 260 Cys, Phe 287 Modificación Asp 96 < Zys Asp 102 Cys Ser 105 Cys Asp 120 Cys Lys 121 Cys Asp 122 Cys Glu 148 Cys Lys 156 Cys Asp 173 Cys Asp 174 Cys Leu 179 Cys Asp 181 Cys Ser 205 Cys Ala 251 Cys lie 254 Cys cula Modificación ID NO 281 Leu 321 Cys ID NO 282 Leu 326 Cys ID NO 283 Ala, 333 Cys ID NO 284 Asp 347 Cys ID NO 285 Asp 360 Cys ID NO 286 Arg 372 Cys ID NO 287 lie 88 Cys, Ser 205 Cys ID NO 288 Ser 93 Cys/ Asn 255 Cys ID NO 289 Asp 102 Cys, Arg 372 Cys ID NO 290 Ser 105 Cys, y Phe 287 Cys ID NO 291 Lys 121 Cys, Asp 360 Cys ID NO 292 lie 88 Cys, Ser 205 Cys, Arg 372 ID NO 293 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Asp 347 ID NO 294 Ser 93 Cys, Asn 255 Cys, Phe 287 ID NO 295 Asp 102 Cys, Leu 260 Cys, Arg 372 a 10 antes de Cisteína de muteína de SK (1-414) ID NO 8) a 11 antes de Cisteína de muteína de SK (1-414) ID NO 9) Molécula Modificación Molécula Modificación SEQ ID NO 307 Leu 260 Cys SEQ ID NO 308 Asp 347 Cys a 13 antes de cisteína de muteína de SK (1-414) , Arg ID NO 11) a 14 antes de cisteína de muteína de SK (1-414) , Lys ID NO 12) Molécula Modificación SEQ ID NO 315 Asp 102 Cys SEQ ID NO 316 Asn 255 Cys SEQ ID NO 317 Asp 347 Cys a 16 antes ele cisteína de muteína de SK (1-414), Asp ID NO 14) a 17 - a 18 antes de cisteína de muteína de SK (1-414), Lys, Ala, Ala: (SEQ ID NO 16) de cisteína de muteína de SK (1-413), As 17) Molécula Modificación SEQ ID NO 327 Asp 101 Cys SEQ ID NO 328 Leu 259 Cys SEQ ID NO 329 Asp 346 Cys a 21 antes de cisteína de muteína de S (1-413) , Asp ID NO 19) teína de Streptococcus pyogenes NO 20) Molécula Modificación SEQ ID NO 336 lie 80 Cys SEQ ID NO 337 Ser 85 Cys SEQ ID NO 338 Asp 94 Cys Molécula Modificación SEQ ID NO 343 Ser 93 Cys SEQ ID NO 344 Asp 102 Cys SEQ ID NO 345 Leu 260 Cys SEQ ID NO 346 Asp 347 Cys SEQ ID NO 347 Arg 372 Cys a 24 antes de cisteína de polipéptido donde el do ina se fusiona al N- terminal de SK (SEQ ID NO 22) Molécula Modificación SEQ ID NO 348 His 16 Cys SEQ ID NO 349 Ala 17 Cys SEQ ID NO 350 Asp 62 Cys SEQ ID NO 351 Gly 80 Cys Molécula Modificación SEQ ID NO 361 Asp 237 Cys SEQ ID NO 362 Lys 238 Cys SEQ ID NO 363 Asp 239 Cys SEQ ID NO 364 Glu 265 Cys SEQ ID NO 365 Lys 273 Cys SEQ ID NO 366 Asp 290 Cys SEQ ID NO 367 Asp 291 Cys SEQ ID NO 368 Leu 296 Cys SEQ ID NO 369 Asp 298 Cys SEQ. ID NO 370 Ser 322 Cys SEQ ID NO 371 lie 371 Cys SEQ ID NO 372 Asn 372 Cys SEQ ID NO 373 Lys 373 Cys SEQ ID NO 374 Lys 374 Cys SE ID NO 375 Ser 375 C s Molécula Modificación SEQ ID NO 384 Asp 464 Cys SEQ ID NO 385 Asp 477 Cys SEQ ID NO 386 Arg 489 Cys SEQ ID NO 387 His 16 Cys, lie 205 Cy SEQ ID NO 388 His 16 Cys, Ser 322 Cy SEQ ID NO 389 His 16 Cys, Leu 377 Cy SEQ ID NO 390 His 16 Cys, Arg 489 Cy a 25 antes de cisteína de polipéptido donde el do ina se fusiona al C-terminal de SK (SEQ ID NO 23) Molécula Modificación SEQ ID NO 391 Gly 49 Cys SEQ ID NO 392 Ser 57 Cys SEQ ID NO 393 Ala 64 C s Molécula Modificación SEQ ID NO 403 Glu 148 Cys SEQ ID NO 404 Lys 156 Cys SEQ ID NO 405 Asp 173 Cys SEQ ID NO 406 Asp 174 Cys SEQ ID NO 407 Leu 179 Cys SEQ ID NO 408 Asp 181 Cys SEQ ID NO 409 Ser 205 Cys SEQ ID NO 410 Ala 251 Cys SEQ ID NO 411 lie 254 Cys SEQ ID NO 412 Asn 255 Cys SEQ ID NO 413 Lys 256 Cys SEQ ID NO 414 Lys 257 Cys SEQ ID NO 415 Ser 258 Cys SEQ ID NO 416 Leu 260 Cys SEQ ID NO 417 Glu 281 Cys Molécula Modificación SEQ ID NO 427 His 401 Cys SEQ ID NO 428 Ala 402 Cys SEQ ID NO 429 Asp 447 Cys SEQ ID NO 430 Gly 465 Cys SEQ ID NO 431 lie 88 Cys, His 401 Cys SEQ ID NO 432 Ser 205 Cys, His 401 Cy SEQ ID NO 433 Leu 260 Cys, His 401 Cy SEQ ID NO 434 Arg 372 Cys, His 401 Cy teína de polipéptido donde dominio usiona tanto a N-TERMINALcomo a C-terminal de S 4) : 1-619 lécula Modificación Q ID NO 435 His 16 Cys lécula Modificación Q ID NO 445 Asp 213 Cys Q ID NO 446 Asp 219 Cys Q ID NO 447 Asp 222 Cys Q ID NO 448 Asp 237 Cys Q ID NO 449 Lys 238 Cys Q ID NO 450 Asp 239 Cys Q ID NO 451 Glu 265 Cys Q ID NO 452 Lys 273 Cys Q ID NO 453 Asp 290 Cys Q ID NO 454 Asp 291 Cys Q ID NO 455 Leu 296 Cys Q ID NO 456 Asp 298 Cys Q ID NO 457 Ser 322 Cys Q ID NO 458 lie 371 Cys Q ID NO 459 Asn 372 Cys a 28 antes de cisteína de SK donde Cys se coloca inos de SK o su fragmento funcional con o sión peptídica cula Modificación ID NO 489 Cys en posición N-1 en SK ID NO 490 Cys en posición C+1 en SK ID NO 491 Cys en posición N-1 y C+1 en SK ID NO 492 Cys en posición C+1 de SEQ ID (1- de SK) ID NO 493 Cys en posición N-1 y C+1 en SK G3) ID NO 494 Cys en SK marcada N-terminalmente ID NO 495 Cys en SK marcada C-terminalmente ID NO 496 Cys con marca adicional de 20 aa 15b antes de lie JEQ ID NO Proteína % de Plasminógeno activadora activación ID NO 489 N-Cys 88±5 0.4±0.0 ID NO 30 SK D95C 96±6 0.5±0.0 ID NO 31 SK D96C 98+4 0.5+0.0 ID NO 32 SK D102C 74±4 0.5+0. ID NO 33 SK S105C 76±5 0.5±0.1 ID NO 35 SK K121C 95±5 0.4+0.1 ID NO 39 SK D173C 72+4 0.4+0.1 ID NO 41 SK L179C 22 + 3 0.5+0.1 ID NO 46 SK N255C 98±3 0.4±0.1 ID NO 48 SK N257C 92+4 0.4±0.1 ID NO 49 L258C 100±6 0.5±0.1 ID NO 50 L260C 100+6 0.6+0.1 ID NO 492 C-383 Cys 92±4 0.4±0.0 ID NO 490 C-Cys 95 + 5 0.4±0.0 antes de Molécula Lag Km (µ?) % de Acti de SBQ ID (min) Plas i NO ID NO 22 SK Fn 10 0.25-0.6 80- ID NO 23 Fn SK 08 0.24-0.63 60- ID NO 24 Fn SK Fn 18 0.4811.0 60- parámetros se calcularon de las fases lineale as de progreso de reacción después de la anulac lag resado con relación a la actividad de SK n ptococcus s . (ATCC 12,499),. tomado como 100 % a 31 metros cinéticos de estado estable para activaci SK y variantes de SK bi-pegiladas . La activid ' apacidad de activación de plasminógeno cuando ante se pre -volvieron complejas con plasmina producir complejo de enzima SK.PN a 32 media in vivo en ratones para diferentes ladas de SK y SK específica de coágulo ID ] NO Molécula Sitio de Mutación Vi D NO 1 nS D NO 489 N-cys Justo después de metionina de codón de inicio D NO 30 D 95 C asa 88-97 de dominio alfa D NO 31 D 96 C asa 88-97 de dominio alfa D NO 48 K 257 C asa 250 de dominio beta D NO 49 S 258 C asa 250 de dominio beta D NO 50 L 260 C asa 250 de dominio beta ID NO Molécula Sitio de Mutación Vi C-terminal D NO 491 NC 1-414 Cisteína tanto en el N- bi-pegilada TERMINALcomo en el C-terminal D NO 493 NC 1-383 Cisteina en el N-terminal y en bi-pegilada el C-terminal donde .la cisteína se coloca después de tres Gly después del truncamiento en 383 a 33 variantes de cisteína PEGi SEQ ID NO Variante de PEG Inmunorreac ID NO 30 D95C 15+2 ID NO 31 D96C 14±2.5 ID NO 37 E148C 16+5 SEQ ID NO Variante de PEG Inmunorreac ID NO 67 S93C, N255C, D347C 2.5±.02 ID NO 68 S93C, N255C, F287C 2±.05 <1 <1 e midieron las inmunorreactividades contra an -SK formulados en conejos. Los valores se prese eactividad retenida en tanto que se toma la re silvestre como 100 %. dúos altamente incorporados de estreptocinasa in sustitución y modificación adicional (SEQ ID NO; Residuo No. Aminoácido Accesibilid en SEQ ID NO 1 superfic Residuo No. Aminoácido Accesibilid SEQ ID NO 1 superfic 97 Y 9 124 S 0 127 L 0 133 Q 7 135 F 0 137 L 4 141 V 3 143 V 2 155 A 4 158 V 0 160 V 1 162 Y 1 169 L 8 Residuo No. Aminoácido Accesibilid SEQ ID NO 1 superfic 270 I 5 272 E 1 274 Y 4 276 V 3 295 F 1 297 I 0 299 Y 0 313 L 3 315 T 2 324 R 3 331 D 0 335 L 1 337 Y 2 rencias Abuchowski, A; Kazo G.M., Verhoest, C.R., Kafkewitz, D . , Nucci, M. L. , Viau, A. T. y Da er Biochem. Biophys. 1984; 7: 175-186.

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ant ama como propiedad lo contenido en las s indicaciones : 1. Polipéptido de estreptocinasa mutante secuencia de aminoácidos seleccionada del g iste de SEQ ID NO: 1-24 , caracterizado p ituye o se inserta al menos un residuo de cisteín 2. Mutante de estreptocinasa de conformid indicación 1, caracterizado porque SEQ ID NO: mentos funcionales de estreptocinasa. 3. Mutante de estreptocinasa de conformid indicación 1, caracterizado porque SEQ ID NO: ínas de estreptocinasa. 4. Mutante de estreptocinasa de conformid esiduo de cisteína por al menos un aminoácido l l menos una región de estreptocinasa selecció o que consiste de: la asa 48-64, asa 88-97, l 106, o 119-124 o la región formadora de hélice egión formadora de asa 170-181 o la región for 254-264 o la región de espiral enrollada 318-ón 360-372 de SEQ ID NO : l o sus muteína mentos funcionales, en donde la variante tiene ógica como se mide por un ensayo normal. 7. Mutante de estreptocinasa de conformida indicación 1, caracterizado porque SEQ ID NO: 22 péptido híbrido covalentemente modificado que enos un fragmento funcional de estreptocinas nios 4 y 5 de unión a fibrina, dominios 1 y 2 d iña (FBD) de fibronectina humana. 8. Mutante de estreptocinasa de conformida ) que consiste de: G49, S57, A64, 188, S93, , S105, D120, K121, D122, E148, K156, D173, D1 , S205, A251, 1254, N255, K256, K257, S258, L2 , F287, D303, L321, L326, A333, D347, D360, e la variante tiene actividad biológica como se nsayo estándar. 11. Estreptocinasa mutante de la SEQ ID N ormidad con la reivindicación 1, caracterizada ituye un residuo de cisteína por al menos un a ccionado del grupo que consiste de: H16, A17, , S157, A181, 1205, S210, D212, D213, D219, D2 , D239, E265, K273, D290, D291, L296, D298, S3 , K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D4 , A450, D464, D477, R489, en donde, la varía vidad biológica como se mide por un ensayo normal 12. Estreptocinasa mutante de la SEQ ID ormidad con la reivindicación 1, caracterizada ituye un residuo de cisteína por al menos un a ccionado del grupo que consiste de: H16, A17, , S157# A181, 1205, S210, D212, D213, D219, D2 , D239, E265, K273, D290, D291, L296, D298, S3 , K373, K374, S375, L377, E398, K399, F404, D4 , A450, D464, D477, R489, H518, A519, D564, e, la variante tiene actividad biológica como se sayo normal . 14. Mutante de estreptocinasa de confor reivindicaciones 1-13, caracterizado porque el ituido de cisteína se modifica con una porción r eína . 15. Mutante de estreptocinasa de confor reivindicaciones 1-14, caracterizado porque e ituido de cisteína se modifica con polietilenglic las reivindicaciones 15-17, caracterizada porq genicidad disminuida e inmunogenicidad in aración a sus contrapartes originales, no modific 19. Variante de cisteina PEGilada de co las reivindicaciones 15-17, caracterizada porq ración renal lenta, por lo tanto vida media ementada en comparación a sus contrapartes origi ficadas . 20. Composición farmacéutica, caracteriza rende al menos una de las variantes de cistein ndica en las reivindicaciones 1-19, opcionalme excipientes farmacéuticamente aceptables. 21. Composición farmacéutica de conformida indicación 20, caracterizada porque es par rmedad o trastorno seleccionado del grupo que co rto de miocardio, trombosis vascular, embolia cterizado porque" la sustitución de cisteí lizada en al menos una región que correspon encia nativa de aminoácidos de estreptocinasa (S la región que se selecciona del grupo que consi de los residuos 48-64 de aminoácido, el as duos 88-97 de aminoácido, la región de los resi de aminoácido, la región de los residuos 11 oácido, la región formadora de hélice de los 207 de aminoácido, la región formadora de as duos 170-181 de aminoácido, la región formadora residuos 254-264 de aminoácido, la región de liada de los residuos 318-347 de aminoácido y os residuos 360-372 de aminoácido, en donde e e activar el plasminogeno. 23. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 22, caracterizada porque además com 26. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 22, caracterizada porque ionalmente al menos una sustitución adici oácido, la sustitución de aminoácido que corre sustitución de aminoácido que se selecciona del iste de Asn90Ala, Hisl07Ala, Serl08Ala, A 38Ala, Glu240Ala, Arg244Ala, Lys246Ala/ L 78Ala, Lys279Ala y Asp359Arg de SEQ ID NO: 1. 27. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 22, caracterizada porque compre esión, la supresión que corresponde a una sup oácido que se selecciona del grupo que consiste 21 y Asp359. 28. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 22, caracterizada porque además ás una extensión de N-terminal y/o C-ter indicación 22, caracterizada porque comprende mutaciones de cisteína en una posición que corr S57, A64, 188, S93 , D95, D96, D102, S105, D12 , E148, K156, D173, D174, L179, D181, S205,. A25 , K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D30 , A333, D347, D360 O R372 de SEQ ID NO: 1. 31. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 22, caracterizada porque compren ciones de cisteína en una posición que correspon A64, 188, S93, D95, D96, D102, S105, D120, K12 , K156, D173, D174, L179, D181, S205, A251, 12 , K257, S258, L260, E281, K282, F287, D303, L3 , D347, D360 o R372 de SEQ ID NO: 1. 32. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 22, caracterizada porque es capaz d enfermedad o trastorno seleccionado del g indicación 22 , caracterizada porque además, comp ion reactiva a cisteína sustituida en al menos u ntes de cisteína.. 34. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 33, caracterizada porque la porción r eína es polietilenglicol (PEG) . 35. Estreptocinasa mutante de conformida ndicación 34, caracterizada porque el PEG es un al o ramificado de tamaño molecular que varía d ones-40,000 daltones . 36. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 34, caracterizada porque tiene es eolítica incrementada, en comparación eptocinasa mutante no PEGilada. 37. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 34, caracterizada porque tiene anti sustituciones de cisteína, en donde la susti eína está localizada en el dominio de unión a enos una región que corresponde a la secuencia oácidos de estreptocinasa (SEQ ID NO: 1) , la r selecciona del grupo que consiste de la asa duos 48-64 de aminoácido, la asa de los residuos oácido, la región de los residuos 102-106 de am egión de los residuos 119-124 de aminoácido, adora de hélice de los residuos 196-207 de amino ?? formadora de asa de los residuos 17 oácido, la región formadora de asa de los resi de aminoácido, la región de espiral enrollad duos 318-347 de aminoácido y la región de los 372 de aminoácido de SEQ ID NO: 1, en donde e e activar el plasminógeno y unirse a fibrina. 40. Polipéptido de fusión de conformida G80, G166, S157, A181, 1205 D237, K238, D239, E265, ?273 , 1371, N372, K373, K374 , S375, L438, L443, A450, D464, D477 y TO : 22. 42. Polipéptido de fusión de conformida indicación 40, caracterizado porque el dominio d ina se fusiona al C-terminal del dom eptocinasa y el polipéptido de fusión comprende mutación de cisteína seleccionada del grupo que , S57, A64, 188, S93, D95, D96, D102 , S105, D1 E148, K156, D173, D174, L179, D181, S205, A2 K256, K257, S258, L260, E281, K282, F287, D3 A333, D347, D360, R372, H401, A402, D447 y G4 Polipéptido de fusión de conformida 44. Estreptocinasa mutante de conformida ¦indicación 39, caracterizada porque es capaz enfermedad o trastorno seleccionado del g iste de infarto de miocardio, trombosis vascular onar, ataque, un evento vascular, angina, onar, ataque isquémico transitorio, trombosis undas, re-oclusión trombótica subsiguiente edimiento de intervención coronaria, trombosis férica, cirugía cardiaca, cirugía vascular, insu iaca, Síndrome X y un trastorno en el cual se pr echamiento de al menos una arteria coronaria. 45. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 39, caracterizada porque además comp ión reactiva a cisteína sustituida en al menos u ntes de cisteína. 46. Estreptocinasa mutante de conformida eptocinasa mutante no PEGilada. 49. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 45, caracterizada porque tiene anti inuida e inmunogenicidad in vivo disminu aración a una estreptocinasa mutante, no PEGilada 50. Estreptocinasa mutante de conformida indicación 45, caracterizada porque tiene d l, lenta y vida media in vivo incremen aración a una estreptocinasa mutante, no PEGilada