MX2010010027A - Agente para tratar enfermedad. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar un enfermedad autoimmune, que comprenden un portador farmacéutico aceptable y un agente capaz de activar células T CD4+CD25+ regulatorias, en donde la composición se va a administrar a un sujeto cuando más cada 3 días.

Description

AGENTE PARA TRATAR ENFERMEDAD La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades autoinmunes. La invención involucra un agente tal como un anticuerpo monoclonal humanizado con un efecto a largo plazo que puede administrarse a pacientes en terapia menos frecuentemente que las previamente descritas. Es particularmente benéfico para pacientes que tienen enfermedades o características que no · pueden retirarse a corto plazo, o requieren tratamiento indefinido para efectivo alivio de síntomas. La invención prevé usos y métodos - de tratamiento que emplean composiciones y medicamentos que comprenden el agente. : La autoinmunidad es la falla de un organismo en reconocer sus propias partes constituyentes (hasta niveles sub-moleculares ) como "propias", lo que resulta en una respuesta inmune contra sus propias :células y tejidos. Cualquier enfermedad que resulta de esta respuesta inmune aberrante, se denomina una enfermedad autoinmune. Las enfermedades autoinmunes incluyen esclerosis múltiple (MS = múltiple sclerosis ) , artritis reumatoide (RA = rheumatoid arthritis), psoriasis, artritis psoriática, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, miastenia gravis (MG = myasthenia gravis), síndrome poliglandular autoinmune tipo II (APS-II), tiroiditis de Hashimoto (HT) , diabetes tipo 1 (T1D) , lupus sistémico eritematoso (SLE) y síndrome autoinmune linfoproliferativo (ALS) .

La enfermedad autoinmune ocurre cuando las células T reconocen y reaccionan con las moléculas "propias", esto es, moléculas producidas por las células del hospedero. La activación de las células T "auto-reactivas" por presentación de autoantigenos procesados por células que presentan antigeno (APC =: antigen presenting cells) lleva a su expansión clonal :y migración a los tejidos específicos, en donde inducen inflamación y destrucción de tejido.

Normalmente, las células T son tolerantes respecto' a tejido autólogo y solo reaccionan ante presentación de estructuras heterólogas. La tolerancia central y tolerancia periférica comprenden los dos mecanismos por los cuales el sistema inmune impide que células T auto-reactivas induzcan sus funciones nocivas. La tolerancia central está mediada a través de selección negativa. Este proceso involucra la eliminación, a través de deleción clonal de células T auto-reactivas, durante desarrollo ontogénico en el timo.

La tolerancia periférica es el respaldo disponible si la tolerancia central falla y células auto- reactivas escapan el timo. Este mecanismo de tolerancia ocurre en forma continua por toda la vida, manteniendo a las células auto-reactivas comprobadas a través de ignorancia inmune (anergia) , deleción periférica y/o supresión activa.

Las células regulatorias T (Tregs = T regulatory cells, anteriormente también designadas "células supresoras") como parte de supresión activa, mantienen tolerancia periférica y regulan la autoinmunidad (Suri-Payer et al., J Immunol. 157: 1799-1805 (1996); Asano et al., J Exp. Med. 184:387-396 (1996); Bonomo et al., J. Immunol. 154: 6602-6611 (1995); illerford et al., Immunity 3: 521-530 (1995); Takahashi et al.,- Int. Immunol. 10: 1969-1980 (1998); Salomón et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Read et al., J Exp. Med. 192: 295-302 (2000) . En general, las células T regulatorias inhiben la activación y/o función de células efectoras tipo auxiliar T 1 (TH1) y TH2. La desregulación en frecuencia: de células Treg o funcionamiento puede llevar a enfermedades autoinmunes debilitantes (Baecher-Allan et al., Immunol. Revie 212: 203-216 (2006); Shevach, Annu . Rev. Immunol. 18: 423-449 (2000); Salomón et al., Immunity 12: 431-440 (2000); Sakaguchi et al., Immunol. Rev. 182: 18÷32 (2001)) .

Varios sub-conj untos de células T regulatorias se han caracterizado. La familia de Tregs consiste de dos sub-conjuntos clave: de origen natural, por ejemplo Tregs CD4 CD25+ y Tregs inducidas periféricamente Trl y Th3. Además, NKTregs y Tregs CD8+ se han descrito en humanos y roedores (Fehérvari et al., J. Clin. Investigation 114: 1209-1217 (2004) ) .

Células Treg derivadas de timo (CD4+CD25+Treg de origen natural) son las células regulatorias principales involucradas en regular autoinmunidad o respuestas inmunes patogénicas . i) son células T CD4+ y constituyen 5-10% de las células T CD4+ periféricas ii) maduran en el timo iii) en general se caracterizan por la expresión combinada del receptor IL-2 (CD25) , la isoforma molecular baja de la molécula CD45, CD152 (CTLA-4), y el factor de transcripción FoxP3.

El papel de Tregs se ejemplifica mejor por experimentos que involucran reconstitución de ratones desnudos inmunodeficientes con células CD4+ que se agotan de células CD25+. Ratones desnudos reconstituidos con CD4+CD25~ desarrollan diversas enfermedades autoinmunes especificas de órgano, tales como gastritis, ooforitis, orquitis y tiroiditis ( Suri-Payeret al'.; J. Immunol. 160: 1212-1218 (1998) ) .

La inclusión del sub-conj.unto CD4+CD25+ en experimentos de reconstitución con ratones desnudos, evita el inicio de estas enfermedades (Sakaguchi et al., J Immunol. 155: 1151-1164 (1995)). El . alor protector de células CD4 CD25 contra autoinmunidad especifica de órgano también se ha mostrado en varios otros modelos de autoinmunidad (por ejemplo gastritis autoinmune, prostatitis, ooforitis, glomerulonefritis , epidimitis y tiroiditis) provocado por timectomia neonatal realizada 3 dias del nacimiento (d3Tx) o enfermedad intestinal inflamatoria provocada por reconstitución de ratones SCID con CD45RBhigh, células CD4+CD25" T. La administración de anticuerpo anti-CD25 in vivo en ratones también induce enfermedad autoinmune localizada de órgano.

: El descubrimiento de la importancia de los reguladores de transcripción FoxP3 en la función de células regulatorias T CD4+CD25+ de ratón y- las observaciones previas que pacientes con síndrome IPEX (desregulación inmune, : poliendocrinopatía, enteropatía, y herencia vinculada con X) , una enfermedad inflamatoria severa similar a aquella vista en ratones deficientes en células regulatorias CD4+CD25+ (síndrome scurfy) , tienen mutaciones en FoxP3, proporcionan una correlación directa entre un modelo de animal autoinmune, células T regulatorias de ratón, y una enfermedad autoinmune humana (Sakaguchi et al., J Immunol. 155: 1151-1164 (1995)).

El mecanismo farmacéutico de células T regulatorias no es completamente claro. CD4+CD25+ Tregs inhiben activación de células T policlonales y específica de antigeno. La supresión está mediada por un mecanismo dependiente de contacto celular que requiere activación de CD4+CD25+ Tregs mediante TCR pero Tregs no muestra una respuesta proliferativa en activación TCR o estimulo con anticuerpos mitogénicos (anérgicos) (Shevach, Nature Rev. Immunol 2: 389 (2002) . Una vez estimulados, son competentes para suprimir en una forma independiente de antigeno la respuesta de células T CD4+ T y células T CD8+ asi como- inhibir la activación de célula B y su expansión clonal.

Hay datos adicionales que indican que la actividad supresora de CD4+CD25+ Tregs parcialmente también se basa en citoquinas anti-inflamatorias como TGF-ß (Kingsley et al., J Immunol. 168: 1080 ; (2002 ) ; Nakamura et al., J Exp. Med. 194: 629-644 (2001)). La significancia funcional de secreción TGF-ß además está soportada por los hallazgos de que ratones deficientes en TGF-ß desarrollan enfermedad autoinmune y que la administración de anticuerpos neutralizantes a TGF-ß abroga in vivo la prevención de autoinmunidad de actividad que induce tolerancia de células T CD4+ en algunos modelos.

Dentro del sub-conjunto de células T CD4+ al menos 2· tipos más diferentes de células con función supresora pueden existir, que se inducen después de exposición a antigeno exógeno especifico (denominadas "células T adaptativas o regulatorias inducibles" ) : células regulatorias T Tipo 1 (Trl) y células Th3. Estos tipos de células parecen ser distinguibles de CD4+CD25+ Tregs con base en sus perfiles de producción de citoquina. Sin embargo, la relación entre estos diferentes tipos no es clara y los modos de acción se superponen.

Las células Trl se inducen por estimulo repetitivo de TCR en la presencia de IL-10 y se muestra que primordialmente reducen a la baja las- respuestas inmunes por la producción de altos niveles de IL-10 junto con cantidades moderadas de TGF-ß (Chen et al., J. Immunol. 171: 733-744 (2003) ) .

Las células Th3 (identificadas en un modelo de EAE después de suministro oral de antigeno) producen altas cantidades de TGF-ß y cantidades variables de IL-4 y .IL-10. IL-4, mismo, se mostró que un factor clave para diferenciación de células Th3, en contraste con células Trl que se ' diferencian con IL-10 (Chen et al., Science 265:1237-1240 (1994)).

La supresión de la función de células T al utilizar- drogas o fármacos inmunosupresores es una estrategia terapéutica principal que se ha empleado exitosamente para tratar enfermedades: autoinmunes. Sin embargo, estas drogas inducen una inmunosupresión general debido a su deficiente selectividad, resultando en inhibición no solo de la función nociva del sistema inmune, sino también de útiles. Como consecuencia, pueden ocurrir varios riesgos como infección, cáncer y toxicidad de droga.

Agentes que interfieren con la función de célula T son soportes principales terapéuticos para diversas enfermedades autoinmunes. : El enfoque de utilizar agentes dirigidos a la activación de células T regulatorias -para la terapia de enfermedades autoinmunes ha sido hasta el momento probado que es extremadamente difícil. La activación de Tregs por TCR utilizando el anticuerpo anti-CD3 agonista OKT-3 (Abramowicz et al, N Engl. J Med. 1992 Sep 3; 327 (10) : 736) o mediante la molécula co-estimulatoria CD28 utilizando el anticuerpo anti-CD28 super-agonista -TGN 1412 lleva a completo agotamiento de la población de células T regulatorias así como otras células T convencionales y la inducción sistémica y liberación de cantidades excesivas de citoquinas pro-inflamatorias incluyendo IFN-?, TNF- . IL-1 y IL-2, resultando en un síndrome relacionado a citoquina clínicamente aparente (CRS) en humanos (Suntharalingam et al, N Engl. J Med. 2006 Sep 7; 355 (10) : 1018-28) .

Después de las primeras dos a tres inyecciones de 5 mg del anticuerpo monoclonal 0KT3, : la mayoría de los pacientes desarrollan un síndrome de liberación de citoquina con altos niveles de factor de necrosis de tumor-alfa, interleucina-2 , y gama-interferona que aparece dentro de 1-2 horas en la circulación de recipientes de transplante de riñon. (Abramowicz et al., Transplantation. 1989 Apr; 47 (4 ) : 606-8 ) . Esto resulta en una estrecha ventana terapéutica que limita la utilidad de este anticuerpo en el tratamiento de enfermedad autoinmune.

Tratamiento con una dosis total de 5-10 mg de TGN1412 (0.1 mg de anti-CD28 por kilogramo de peso corporal) , lleva a respuesta inflamatoria sistémica con falla de múltiples órganos dentro de 90 minutos después de recibir una sola dosis intravenosa de TGN 1412 (Suntharalingam et al, N Engl . J Med. 2006 Sep 7 ; 355 (10) .1018-28) .

En general se conviene que células T CD4 juegan una parte principal para iniciar y mantener la autoinmunidad. De acuerdo con esto, se ha propuesto utilizar: mAbs contra moléculas de superficie de células T CD4, y' en particular anti-CD4 mAbs, como agentes inmunosupresores . Aunque numerosos estudios clínicos confirman el interés potencial de este enfoque, también desarrollan varios aspectos a resolver a fin de hacer anti- CD4 mAbs' más adecuados para utilizar en.' la práctica clínica rutinaria .

Varios mecanismos diferentes · de acción para CD4 mAbs se han propuesto incluyendo: (1) antagonismo de interacciones CD4-MHC II que resultan en inhibición de activación de células T, (2) modulación de receptor CD4 como se determina por una disminución en expresión de superficie celular de CD4, (3) señalización parcial a través del receptor CD4 en la ausencia de entrelazamiento de receptor de células T, que puede suprimir activación de célula T subsecuente y activar la muerte apoptósica de célula T CD4, (4) citotoxicidad dependiente de-complemento mediada por Fe (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) que lleva a agotamiento de células T CD4, y (5) estimulo de células T regulatorias .

La citotoxicidad dependiente de complemento mediada por Fe (CDC) o la citotoxicidad' celular dependiente de anticuerpo (ADCC) que llevan a agotamiento de células T CD4 es el mecanismo observado principal y en especial se demuestra para anticuerpos de la sub-clase IgGl. Solo unos cuantos anticuerpos CD4 se han atribuido a los otros mecanismos como TRX-1, TNX-355, IDEC-151, OKTcdr4A con solo TRX-1 que es un IgGl ( Schulze-Koops et al., J Rheumatol. 25(11): 2065-76 (1998); Masón et al., J Rheumatol. 29(2): 220-9 (2002); Choy et al., Rheumatológy 39(10): 1139-46 (2000); Herzyk et.al., Infect Immun. 69(2): 1032-43 (2001); Kon et al., Eur Respir J. 18(1): 45-52 (2001); Mourad et al., Transplantation 65(5): 632-41 (1998); Skov et al., Arch Dermatol. 139(11): 1433-9 (2003); Jabado et al., J Immunol. 158(1): 94-103 (1997)).

Agotamiento dependiente de dosis de células T CD4+ a dosis "altas" (múltiples ciclos con dosis > 100 mg) y secuestro transitorio (agotamiento de vida corta) a dosis "menores" (múltiples ciclos con dosis >10 mg) , se observa con varios anticuerpos CD4 (Masón et al., J. Rheumatol . 29 (2): 220-229 (2002); Kon et al., Eur. Respir J. 18(1): 45-52 (2001) ) y HuMax-CD4 (Skov et al., Aren Dermatol. 139(11): 1433-1439 (2003), Choy et al., Rheumatology 41 (10): 1142-8 (2002) ). A pesar de su actividad de dilución, mAbs a CD4 falló en proporcionar el beneficio clínico y eficacia consistente en enfermedades autoinmune's investigadas, por ejemplo artritis reumatoide (Strand et al., Nature Reviews 6: 75-92 (2007)). Mayor agotamiento de células T CD4+ en general se considera como escenario, que puede provocar una inmunosupresión severa. : El anticuerpo B-F5 (IgGl murino. anti-humano CD4) se probó en diferentes enfermedades autoinmunes.

Una pequeña cantidad de pacientes con severa psoriasis se ha tratado con el anticuerpo B-F5 murino y algunos efectos positivos se describieron (Robinet et al., Eur J Dermatol 1996: 6: 141-6, y Robinet et al., J A Acad Dermatol 1997; 36: 582-8).

En pacientes de artritis reumatoide, los resultados observados en una prueba controlada por placebo con dosis diarias de B-F5 no indican una mejora significante (Wendling et al. J Rheumatol; 25 ( 8 ) : 1457-61 , 1998) .

En pacientes de esclerosis múltiple (MS) , se observaron algunos efectos positivos después de 10 días de tratamiento en pacientes con formas de remisión-relapso, algunos de los cuales todavía estaban libres de relapso al sexto mes posterior a terapia (Racadot et al., J Autoimmun, 6(6) -.771-86, 1993) . Se observaron efectos similares por Rumbach ét al. (Mutt Scler; 1 ( 4 ) : 207-12 , 1996) .

En enfermedad de Crohn severa, no se observó mejora significante en pacientes que reciben B-F5 por 7 días consecutivos (Canva-Delcambre et al., Aliment Pharmacol Ther 10 (5) : 721-7, 1996) .

Para prevenir rechazo de aloinjerto, se reportó que la biodisponibilidad de B-F5 no fue suficiente para permitir su uso para profilaxis de rechazo de aloinjerto (Dantal ét al. Transplantation, 27; 62 ( 10) : 1502-6, 1996) .

Aparece de lo anterior que un primer aspecto a resolver" es la necesidad por utilizar altas dosis a más largo plazo de mAb para obtener una mejora clínica. En general, ' el uso a largo plazo de agentes terapéuticos que modifican la enfermedad resulta en números incrementados de eventos adversos o pérdida de efectos clínicos, requiriendo un aumento de dosis ("escalamiento de dosis") para mantener respuesta (Strand et al., Nature Reviews Drug Discovery 6: 75-92, (2007)) debido a inmunogenicidad . Entre menores y/o menos frecuentemente se administren agentes terapéuticos que modifican la enfermedad, serán menores los eventos adversos, más hay un efecto benéfico inmediato para los pacientes que requieren menores y/o menos dosis del agente terapéutico .

Otra desventaja de la terapia con anticuerpos monoclonales en humanos es que estos anticuerpos en general se obtienen de células de ratón, y provocan respuestas anti-ratón en los recipientes humanos. Esto no solo resulta en una menor eficiencia del tratamiento y aún más de cualquier tratamiento futuro - con anticuerpos monoclonales de ratón, sino también en un riesgo incrementado de anafilaxis.

Esta desventaja, en principio puede evitarse por el uso de anticuerpos humanizados, que se obtienen por injerto de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) , de un anticuerpo monoclonal de ratón que determina la especificidad de enlace de antigeno, en las . regiones marco (FRs) de . una molécula de inmunoglobulina humana. El objetivo de humanización es obtener un anticuerpo recombinante que tiene las mismas propiedades de enlace de antigeno que el anticuerpo monoclonal de ratón del cual se derivaron las secuencias CDR, y bastante menos inmunogénico en humanos.

En algunos casos, el sustituir CDRs del anticuerpo de ratón por las CDRs humanas en marcos humanos es suficiente para transferir las propiedades de enlace de antigeno (incluyendo no solo la especificidad, sino también la afinidad por antigeno) . Sin embargo, en muchos anticuerpos, algunos residuos FR son importantes para enlace de antigeno, debido a que hacen contacto directo del antigeno. en el complejo anticuerpo-antigeno, o debido a que influencian la conformación de las CDRs- y de esta manera su desempeño de enlace de antigeno.

De esta manera, en la mayoría de los casos, también es necesario sustituir uno o varios residuos marco del anticuerpo de ratón por los residuos FR correspondientes humanos. Ya que el · número de residuos substituidos debe ser lo más pequeño posible a fin de evitar reacciones anti-ratón, la cuestión es determinar que residuo ó residuos amino ácidos son críticos para retener las propiedades de enlace de antigeno : Se han propuesto diversos métodos para pronosticar los sitios más apropiados para substitución. Aunque proporcionan principios generales que pueden ser de cierta ayuda en las primeras etapas de humanización, el resultado final varía de un anticuerpo a otro. De esta manera, para un anticuerpo determinado, es muy difícil anticipar que substituciones proporcionan el resultado deseado.

Previamente, la humanización de B-F5 de ratón se ha intentado, y el éxito se ha logrado en producir B-F5 humanizado (a continuación referido como hB-F5) que tiene propiedades de enlace CD4 similares al ratón precursor B-F5.

De esta manera, en WO 2004./08324 , el anticuerpo humanizado BT061 (B-F5 humanizado, o simplemente hB-F5) se ha encontrado que es útil para tratar enfermedades autoinmunes, tales como psoriasis y artritis reumatoide. Este anticuerpo es un anticuerpo que es capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+. La solicitud de patente describe composiciones para la administración parenteral, formuladas para permitir la administración de una dosis desde 0.1-10 mg, de preferencia de 1-5 mg. Regímenes de dosis previstos son 1 mg intravenoso por día de dosis y una dosis de 5 mg cada segundo día para pacientes de artritis reumatoide sobre un periodo de 10 días.- De esta manera, la dosis más grande descrita es 5 mg en un tiempo y 25 mg sobre el curso de 10 días.

El estudio también se describió por Wijdenes et al., en un extracto y cartel presentado en la conferencia EULAR, junio 2005. El tratamiento de 11 pacientes que sufren de artritis reumatoide se describió. Los pacientes fueron tratados con 5 infusiones intravenosas de 5 mg de BT061 cada día salteado con tratamiento concomitante con 150 mg de Diclophenac.

El anticuerpo descrito en este estudio no se describe conveniente para utilizar a . dosis superiores o dosis al más largo plazo, y todavía es conveniente encontrar tratamientos a dosis de más largo plazo para tratar una mayor cantidad de pacientes..

Las células T regulatorias CD4+CD25+ son capaces de mantener tolerancia periférica y regular autoinmunidad al inhibir la proliferación y producción de citoguina tanto de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno.

Estudios previos en ratones demostraron gue células -T CD4+CD25+ murinas suprimen tanto proliferación como producción de IFN-? por células T CD8+ inducidas ya sea por estímulos policlonales o específicos de Ag . Además, células T CD4+CD25+ inhiben la activación de respondientes CD8+ al inhibir la producción de IL-2 y regulación por incremento de expresión de cadena IL-2R (CD25) (Piccirillo et al., J. Immunol. 167: 1137-1140 (2001)). En contraste, las células T regulatorias, las células T convencionales expresan CD25 sólo ante activación por un estímulo de inmunógeno .

En humanos, las células T CD4+CD25+ preactivadas por anticuerpo anti-CD3 o anti-CD28 afectan células T CD8+ al llevar a reducida proliferación en respuesta a estímulo policlonal y alogeneico y reducida producción de IFN-?. Células T CD8+ suprimidas mantienen su fenotipo anérgico a pesar de múltiples re-estimulos con su antigeno cognado e IL-2 por hasta 3 semanas. (Cámara et al., Eur. J. Immunol . 33:3473 - 3483 (2003), Dieckman et al., Immunology.115 (3) : 305-14 (2005)) .

Considerando la técnica previa anterior, el objetivo de la presente invención es tratar pacientes que tienen enfermedades autoinmunes con dosis menores y/o inferiores. En particular, un objetivo de la presente invención es encontrar tratamientos autoinmunes que pueden ser aplicados a pacientes a baja frecuencia durante una terapia a largo plazo a fin de reducir el número de inyecciones requeridas para obtener un beneficio clínico.

En forma sorprendente, los inventores han observado que BT061 estimula específicamente Tregs CD4+CD25+ que suprime la proliferación de células T CD8+ al inhibir la producción de IL-2 y IFN-? por células T CD8 + aloreactivas . Además, BT061 preactiva Tregs CD4+CD25+ hace que células T CD8+ suprimidas sean aces de expresar CD25 ante re-estímulo por hasta 10 días, permitiendo por primera vez un efecto terapéutico a largo ' plazo para tratar pacientes con este anticuerpo, ya que la expresión CD25 es una de las características de activación de estas células T CD8+. La falla en expresar CD25 de esta manera resulta en una reducción de activación indeseada del sistema inmune.

De acuerdo con esto, la invención proporciona una composición farmacéutica para tratar una enfermedad autoinmune que comprende un portador farmacéutico aceptable y un agente capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+, en donde la composición se va a administrar a un sujeto cuando más cada 3 días.

De preferencia el periodo entre administraciones es de al- menos 4 semanas, al menos 12 semanas, al menos 24 semanas, al menos 6 meses calendario o al menos 1 año. En una modalidad, el periodo de tratamiento es mayor que un año y la composición se administra anualmente durante un periodo de 1, 2, 3, 4 ó 5 años.

En particular, la composición se va a administrar más cada 6 dias de preferencia cuando más cada 10 días. Típicamente, el medicamento puede administrarse a un sujeto cada 3-31 días, más preferible cada 3-10 días, o cada 3 a 6 días .

La naturaleza a largo plazo de la terapia no está limitada especialmente, siempre que seas prolongada que el tiempo requerido para tratamiento inmediato/agudo del paciente involucrado. Sin embargo, períodos de al menos 6 meses 1 año, 18 meses, 2 años y 5 años .se prevén, así como períodos indefinidos (por ejemplo la vida del paciente o hasta que el paciente se cure, o no exhiba síntomas) .

Cuando se tratan pacientes con un agente capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ pueden demostrarse tanto un efecto terapéutico inmediato - como un efecto terapéutico a largo plazo. Sin estar limitados por teoría, se considera que es debido al hecho de que el agente estimula Tregs CD4+CD25+ que no sólo directamente inhiben células T CD8+ sino que también hacen que las células T CD8+ sean incapaces de expresar CD25 ante re-estímulo. Se considera que los efectos a largo plazo son adicionalmente mediados por una combinación de efectividad a bajos niveles y un lento declive de la concentración efectiva de anticuerpo dada en un entorno clínico, resultando en períodos prolongados a un nivel efectivo del agente.

Se apreciará de. los regímenes anteriores que los inventores han encontrado que, de manera sorprendente, el anticuerpo humanizado BT061 (B-F5 humanizado, o simplemente hB-F5) no modula substancialmente ni induce la liberación de citoquinas pro-inflamatorias en comparación con otros anticuerpos que interactúan con células T, (e.g. anticuerpos anti-CD3) , pero estimula Tregs CD4+CD25+ que directamente inhiben células T CD8+ más también hace que las células T CD8+ sean incapaces de expresar CD25 ante reestímulo." Con base en la investigación, de los inventores, pueden administrarse dosis a más grandes intervalos y por un periodo más prolongado que los descritos previamente en La concentración del agente no se limita especialmente, siempre que esté presente en una concentración que sea apropiada para el paciente. Sin embargo, para altas dosis, de preferencia, la concentración del agente es desde 10 a 150 mg/ml, de 15 a 150 mg/ml, de 15 a 100 mg/ml, de 15 (o mayor que 10) a 75 mg/ml, o de 20 a 60 mg/ml. Más preferible, la concentración del agente (es aproximadamente) cualquiera de 10 mg/ml > 12.5 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml o 100 mg/ml.

En modalidades preferidas alternas para menores dosis, la concentración del agente es- de 0.1 µg/ml· a 30 µ9/p?1 o, 0.1 a 1000 g/ml, y más preferiblemente de 1-500 µg/ml y 2-250 µg/ml. Más preferiblemente, la concentración del agente es (aproximadamente) cualquiera de 15 µg/ml, 25 pg/ml, 125 250 pg/ml, o 500 µ?/ml, 1 mg/ml, 12.5 mg/ml o 25 mg/ml. La invención también proporciona el uso de un agente como se define aquí para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedad autoinmune, en donde el agente se va a administrar a un sujeto en un régimen de dosis aqüi descrito. Además, la invención proporciona a un agente como se define aquí para utilizar en el tratamiento de enfermedad autoinmune en donde el agente se va a administrar a un sujeto en un régimen de dosis aquí descrito .

El volumen de dosis aplicado a un sujeto que utiliza la composición no se limita especialmente siempre que se suministre sobre un largo plazo en comparación con regímenes ya conocidos y por lo tanto es adecuado para tratar individuos que pueden beneficiarse de terapia de largo plazo tal como, pero no limitadas a casos severos con una larga historia de la enfermedad e insuficiente respuesta a las terapias, actuales. La concentración del agente dentro de los volúmenes de dosis puede variarse a fin de proporcionar las dosis requeridas, que se describen en esta solicitud.

El volumen de dosis variará dependiendo del método de administración. Se prefiere administración parenteral. Ejemplos de administración parenteral son administración intramuscular, administración intravenosa o administración subcutánea. Cuando la composición se va a administrar por infusión intravenosa, el volumen de dosis puede ser de 0.1 o 0.5 mi hasta 500 mi, de preferencia entre 15 y 25 mi, y típicamente aproximadamente 20 mi. Cuando la composición se va a administrar por inyección subcutánea o intramuscular, el volumen de dosis puede estar entre 0.1 a 3 mi, de preferencia entre 0.5 y 1.5 mi, y típicamente aproximadamente 1 mi.

Sin embargo, en algunas modalidades, la composición puede proporcionarse en forma concentrada y diluirse a la concentración requerida para los individuos involucrados. De preferencia, en estas situaciones, la composición se proporciona en volúmenes relativamente pequeños de aproximadamente 1, 2, 3, 4 ó 5 mi . En modalidades alternas, la composición se proporciona a la concentración y volumen de dosis requeridos anteriormente descritos (es decir, lista para administración) . En una modalidad especifica, las composiciones farmacéuticas para administración subcutánea se proporcionan en una forma lista para administración que no requiere dilución, de manera tal que puedan administrarse fácilmente por personal no médico.

Como se ha mencionado previamente, no se conocía que los agentes capaces de tratar enfermedades autoinmunes pudieran' administrarse en las terapias a largo plazo a bajas frecuencias que se conciben por la presente invención. Mientras que dosis conocidas de los agentes capaces de tratar enfermedad autoinmune, son efectivas en algunos individuos o tipos de enfermedades, el darse cuenta que pueden ser efectivas por más largos períodos de tiempo y tolerarse por más largos períodos de tiempo, ha abierto el camino para un tratamiento más efectivo de algunas enfermedades autoinmunes y clases de pacientes.

• La invención será ilustrada a manera de ejemplo solamente, con referencia a las siguientes Figuras, en donde : La Figura 1 muestra el efecto de BT061 en la síntesis de citoquina de cultivos de ' sangre entera de 3 donadores sanos. Los cultivos fueron estimulados en experimentos separados con 4 diferentes tipos de activadores: (CD3 = anti-CD3 antibodies) anticuerpos CD3 = anti-CD3; LPS lipopolisacárido; PHA = fitohaemaglut inina + anticuerpos anti-CD28; SEB=enterotoxina- B de estafilococos + anticuerpos anti-CD28. Diferentes citoquinas se determinó que miden efectos en diversas sub-poblaciones de leucocitos: células Treg (CD3: TGF-ß, IL-10); monocitos/macrófagos (LPS: IL-10, TNF , · IL-?ß) ; células Th2 (PHA: IL-4, IL-5, IL-13); células Thl (SEB: IL-2, IFNy) ; La Figura 2 muestra el efecto de BT061 en cultivos' de sangre entera humana (donadores con artritis reumatoide) en síntesis de citoquina activada por diferentes estimulantes; • La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la región VH B-F5 de ratón (SEQ ID No: 5); ¦ La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la región Vk B-F5 de ratón (SEQ ID No: 6) ; La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 3) de un fragmento del plásmido que codifica la región VH de BF-5 humanizado. La secuencia que codifica la región V está sub-rayada y la secuencia de polipéptidos correspondiente (SEQ ID No: 17) se indica abajo de la secuencia de nucleótidos; La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 4) de un fragmento del plásmido que codifica las regiones VK de BF-5 humanizado. La secuencia que codifica la región V está sub-rayada y la secuencia de polipéptidos correspondiente (SEQ ID No: 2) se indica abajo de la secuencia de nucleótidos; La Figura 7 muestra que BT061 (Tregs CD25+ activados con (anti-CD4 mAb) suprimen síntesis de citoquina y re-expresión CD25 de células T CD8+. Superior: Tregs CD25+ activados por CD4 suprimen la síntesis de citoquina de células T CD8+ coactivadas. Fondo: Tregs CD25+ activados con CD4 suprimen la re-expresión de CD25 de células T CD8+. Los trazos de puntos muestran sólo células T CD8+ controladas. Un resultado representativo de tres se muestra. Números indican porcentajes de células positivas.

• Las Figuras 8A y 8B respectivamente muestran la liberación de TFN y IL-6 observada en: una prueba clínica con BT061 (infusión intravenosa sencilla o inyección subcutánea) en voluntarios sanos en comparación con los niveles reportados con los anticuerpos monoclonales anti- CD3. Niveles de dosis y tiempo para recuperación se incluyen en las figuras. Resultados para TRX4 indicados en las Figuras como "2)" reportados por Keymeulen et al., 2005 N. Engl. J. Med. Type 1 Diabetes patients. Resultados para Teplizumab indicados en Figuras como "3) " reportados en Herold et al., 2002 N. Engl. J. Med. Type I Diabetes patients. Valores normales indicados en las Figuras como "4)" reportados en Straub et al., 2007, Athr. & Rheumat . "*)" representa una sola dosis, "**) " representa una dosis acumulativa inyectada hasta que se alcanzó concentración pico .

La Figura 9 muestra niveles .de IL-2 y IFN-? en plasma después de administración de una sola dosis intravenosa o subcutánea de BT061 en voluntarios sanos. ULN = límite superior de normal; LLN =: límite inferior de normal.

La Figura 10 muestra una cinética de conteos celulares CD4 (células por mi de plasma) en voluntarios tratados con una sola dosis intravenosa: de BT061. Valores promedio de 3 pacientes por grupo de dosis se muestran. Líneas punteadas indican el límite superior de (ULN) normal y el límite inferior normal (LLN) .

La Figura 11 muestra una cinética de conteo celular CD4 (células por mi de plasma) en voluntarios tratados con una sola dosis subcutánea - de BT061. Valores promedio de 3 pacientes por grupo de dosis se muestran. Líneas punteadas indican el límite superior de normal (ULN) y el limite inferior de normal (LLN) .

La Figura 12 partes A a H proporcionan gráficas que muestran datos de las pruebas clínicas con pacientes de psoriasis de grupo de dosis I como se describe en el en Ejemplo 8, en donde los pacientes son tratados con una inyección intravenosa de 0.5 mg de BT061 o un placebo. Las partes de A a H de la Figura 8 proporcionan gráficas de las calificaciones PASI de pacientes 1 a 8. del grupo de dosis I, respectivamente.

: La Figura 13 partes A a H proporcionan gráficas que muestran datos de las pruebas clínicas con pacientes de psoriasis del grupo de dosis II como se describe en el Ejemplo ;8, en donde los pacientes son tratados con una inyección intravenosa de 2.5 mg de BT061 o un placebo. Las partes A- a H de la Figura 9 proporcionan gráficas de las calificaciones PASI de los pacientes 1 a 8 del grupo de dosis II, respectivamente.

La Figura 14 partes A y B proporcionan fotografías de la prueba clínica con pacientes de psoriasis como se describe en el Ejemplo 8. Las fotografías son del mismo paciente que era un miembro del grupo de dosis II. La fotografía mostrada en la parte A fue tomada antes del tratamiento. La fotografía mostrada en la parte B se tomo 28 días después de tratamiento.

La Figura 15 proporciona resultados para la prueba clínica con pacientes de artritis reumatoide como se describe en el Ejemplo 9. La figura muestra una gráfica de barras del porcentaje de pacientes de los grupos de dosis que reciben 1.25 mg, 6.25 mg, 12.5 mg y 25 mg de BT061 subcutáneo logrando al menos una respuesta ACR20. Seis pacientes en cada grupo recibieron la dosis de anticuerpo mientras- que dos pacientes recibieron un placebo.

Las Figuras 16A y 16B proporcionas resultados de la prueba clínica con pacientes de artritis reumatoide, como se describe en el Ejemplo 9. La Figura 16A muestra una gráfica de barras del número de articulaciones sensibles para pacientes del grupo de dosis que recibe 25 mg de BT061 subcutáneos. La Figura 16B muestra una gráfica de barras del número de articulaciones sensibles en pacientes del mismo grupo de dosis. Seis pacientes en cada grupo recibió la dosis de anticuerpo mientras que dos recibieron un placebo.

Las Figuras 17A y 17B proporciona resultados de la prueba clínica con pacientes de artritis reumatoide, como se describe en el Ejemplo 9. Las Figuras muestran los cambios de parámetros individuales (en ;%) para un paciente respondedor (Figura ??) y un paciente no respondedor (Figura 17B) del grupo de dosis de 25 mg subcutáneos. En las Figuras "Pat's GA" y "Phy's GA" se refieren a la evaluación global del paciente y evaluación global del médico, respectivamente. El término "PA de dolor" se refiere a la evaluación del dolor del paciente.

Las Figuras 18A y 18B proporcionan adicionales resultados de la prueba clínica con pacientes de artritis reumatoide, como se describe en el Ejemplo 9. Las Figuras muestran el número de articulaciones sensibles en pacientes del grupo de dosis subcutáneas de 1.25 mg (Figura 18A) y del grupo de dosis subcutáneas de 6.25 mg (Figura 18B) .

' Las Figuras 19A y 19B proporcionan adicionales resultados de la prueba clínica con pacientes de artritis reumatoide como se describe en el Ejemplo 9. Las Figuras muestran el número de articulaciones sensibles en pacientes del grupo de dosis subcutáneas de 50 mg (Figura 19A) y del grupo de dosis intravenosas de 6.25 mg (Figura 19B) .

· La Figura 20 muestra el alineamiento de las secuencias de polipéptidos de B-F5 VK murino (SEQ- ID No: 8), FK-001 (SEQ ID Nos: 9, 10, 11 y 12), L4L (SEQ ID No: 18), y 'L4M (SEQ ID No: 2) en el diseño de la forma humanizada del B-F5 (es decir BT061) .

La Figura 21 muestra el alineamiento de las secuencias de polipéptidos de B-F5 VH murino (SEQ ID No: 7) , M26 (SEQ ID Nos: 13, 14, 15 y 16), H37L (SEQ ID No: 1), y H37V (SEQ ID No: 17) en el diseño de la forma humanizada del B-F5.

La invención ahora se describirá con más detalles .

Los agentes que son adecuados para utilizar en la presente invención son aquellos que son capaces de activar células T CD4+CD25+ regulatorias . El agente puede ser un polipéptido, una proteina o un anticuerpo. Cuando el agente es un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. De preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD4 monoclonal. El anticuerpo también de preferencia puede ser un anticuerpo IgGl y puede ser un anticuerpo IgGl sin modificar. : En un aspecto preferido de la. invención el agente no provoca un aumento substancial al :nivel de citoquinas pro-inflamatorias en el plasma de sangre en el sujeto después de administración en comparación con anticuerpos anti-CD3-. En particular, los niveles de IFN-?, TNF-a, IL-6 y/o IL-2 después de administración del agente no se elevan substancialmente en comparación con ' niveles de plasma medidos en sujetos sanos (ver Tabla Al) . Específicamente, si el ULN para una citoquina específica dada en la Tabla Al se toma como X, entonces dentro de 96 horas después de administración del agente de la invención puede haber menos de un incremento de 20 veces en X. D preferencia, puede haber ménos de un incremento de 10 veces en X. Más preferiblemente, estos niveles son durante el periodo de 10 minutos después del inicio de administración a 96 horas después de completar la administración.

Es posible que en pacientes autoinmunes, los niveles de citoquina antes de administración del agente ya son superiores a aquellos observados en sujetos sanos (ULN dado en la Tabla Al) por ejemplo debido a un estado de activación modificado de células inmunes en comparación con el estado de activación de las células en sujetos sanos. En aquellos casos, la concentración para una citoquina especifica directamente antes de administración del agente se toma como X y dentro de 96 horas después administración del agente de la invención puede haber menos de un aumento de 20 veces en X. De preferencia puede haber menos de un incremento de 10 veces en X. Más preferiblemente estos niveles son durante el periodo de 10 minutos después del inicio de administración a 96 horas después de completar la administración.

Tabla Al: Los niveles de citoquina medidos en plasma de voluntarios sanos. El ULN (limite superior de normal) se calcula con base en valores promedio medidos en 39 sujetos individuales + 2 x desviación estándar.

En un aspecto preferido adicional de la invención el agente no provoca una disminución de larga duración substancial en el conteo celular de linfocitos CD4+ en el plasma sanguíneo del sujeto. Específicamente, dentro del periodo de 72 a 96 horas después de administración el conteo celular de linfocitos CD4+ en el plasma sanguíneo del sujeto puede estar sobre 250 células/µ? (o al menos 250 células/µ? ) .

De preferencia, los efectos de citoquina y linfocito CD4+ descritos anteriormente se ven en al menos 80% de los pacientes tratados.

Para evitar impacto negativo en el sistema inmune, por ejemplo en la disminución en el conteo de células de linfocitos o inducción de liberación de citoquina, se conoce en la técnica el utilizar anticuerpos (en especial anticuerpos de interacción de célula T) de la subclase · IgG2 , IgG3 o IgG4 debido a que los anticuerpos de la subclase IgGl exhiben superiores interacciones de receptor Fe. También se conoce en la técnica el modificar anticuerpos (en especial anticuerpos que interactúan con células T) por mutación Fe, desglicosilación, glicomodificación o glicoingeniería para reducir interacciones de receptor Fe.

Los presentes inventores han encontrado que evitar anticuerpos de la subclase IgGl y modificaciones no esn necesario para el agente de la presente invención. En particular, datos presentados en esta solicitud de patente indican que el agente de la presente invención no exhibe agotamiento de células CD4+ substancial y de larga duración o induce liberación de citoquina substancial en comparación con los anticuerpos anti-CD3.

De acuerdo con esto, en un aspecto preferido de la invención, el agente es un anticuerpo IgGl no modificado, es decir un anticuerpo que no incluye una mutación' Fe, y no ha sido sometido a desglicosilación, glicomodificación o glicoingenieria para reducir interacciones de receptor Fe o un fragmento o derivado del mismo.

Los anticuerpos que son más convenientes para utilizar en la presente invención son anticuerpos anti CD4 humanizados o sus fragmentos o derivados, que son capaces de activar células T regulatorias CD4+CD25+. Ejemplos de anticuerpos que son capaces de activar células T regulatorias CD4+CD25+ se discuten por Becker et al., (European Journal of Immunology (2007), Vol. 37: pages 1217-1223) .

En general, el anticuerpo- empleado en la invención además comprende una región constante humana (Fe) . Esta región constante puede seleccionarse entre dominios constantes de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA y IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGl, IgG2, IgG3 y IgG4. Regiones constantes preferidas se eligen entre dominios constantes de IgG, en particular IgGl.

La presente invención también incluye cualquier fragmento del anticuerpo que comprende sus regiones V. Esto comprende en particular los fragmentos- Fab, Fab', F(ab) '2/ Fv y scFv.

En un aspecto particularmente preferido de la presente invención el anticuerpo es anticuerpo anti-CD4 humanizado o su fragmento o derivado, derivado del anticuerpo B-F5 anti-CD4 monoclonal de ratón. Un ejemplo de este anticuerpo es el anticuerpo BT061..

. El anticuerpo BT061, sus fragmentos y derivados.

El anticuerpo humanizado BT061 (hB-F5) se deriva de B-F5 mAb de ratón, y tiene dominios V definidos por las siguientes secuencias de polipéptidos : - dominio V cadena H: EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQA PGKGLEWIGVISVKSENYGANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQ NSLKTEDTAVY YCSAS YYRYDVGAWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 1) - dominio V cadena L: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQ KPGQPPKLLIYLASILESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELP T FG QGTKVEIK (SEQ ID NO: 2).

Derivados de este anticuerpo también son adecuados para utilizar en la presente invención. Derivados incluyen aquellos con dominios V ' definidos por las secuencias de polipéptidos que tienen al menos 80%, de preferencia al menos 90%, más preferiblemente al menos 95% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID No: 2.

Anticuerpos particularmente preferidos son aquellos que comprenden las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) del B-F5 mAb de ratón, y recibe la capacidad hB-F5 para activar células regulatorias CD4+CD25+. La ubicación de las CDRs dentro de los dominios VH y VK se muestran en las Figuras 20 y 21. Estos anticuerpos opcionalmente pueden tener variaciones en la secuencia de las CDRs que no afectan¦ substancialmente la especificidad y/o afinidad de enlace.

En general, el anticuerpo hB-F5 empleado en la invención además comprende una región constante humana (Fe). Como se indicó anteriormente, esta región constante puede seleccionarse entre los dominios constantes de cualquier clase de inmunoglobulinas , incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA y IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgGl, IgG2, IgG3 y IgG . Regiones constantes preferidas se eligen entre dominios constantes de IgG, en particular IgGl.

La presente invención también incluye cualquier fragmento de un anticuerpo BT061 que comprende sus regiones V. Esto comprende en particular los fragmentos Fab, Fab', F ( ab ) 12, Fv y scFv.

Un polinucleótido que codifica el dominio V de la cadena H o de · la cadena L de un anticuerpo BT061 puede fusionarse con un polinucleótido que codifica la región constante de una cadena H o L humana, con el propósito de expresar las cadenas H y L completas obtenidas de esta manera; una secuencia que codifica un péptido de señal que permite la secreción de la proteína, también puede agregarse.

La invención también utiliza :casetes de expresión en donde un polinucleótido como se describe anteriormente se enlaza a las secuencias del control apropiadas permitiendo la regulación de sus trascripción y traducción en una célula hospedera selecta, y vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido o un . cásete de expresión de la invención.

Estas construcciones de ADN recombinante pueden obtenerse e introducirse en células hospederas por la técnica bien conocida de ADN recombinante e ingeniería genética .

La invención también utiliza una célula hospedera, transformada por un polinucleótido de la invención. Células hospederas útiles dentro del marco de la presente- invención pueden ser células procarióticas o eucarióticas . Entre células eucarióticas convenientes, se mencionarán a manera de ejemplo, células de plantas, células de levaduras tales como Saccharomyces, células de insectos tales como Drosophila, o Spodoptera , y células de mamífero tales como HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc.

La construcción de vectores de expresión empleados en la invención, y la transformación de células hospederas, puede hacerse por las técnicas estándar de biología molecular.

El anticuerpo BT061 (hB-F5) empleado en la invención, puede obtenerse al cultivar una célula hospedera que contiene un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al anticuerpo, bajo condiciones adecuadas para su expresión, y recuperar el anticuerpo del cultivo de célula hospedera.

; Construcción de B-F5 humanizado Diseño de regiones VH y VK B-E5 humanizadas Secuencias de ADN que codifican las regiones VH y VK B-F5 de ratón se muestran respectivamente en la Figura 3 y la Figura 4 y bajo identificadores .de secuencia SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. VH y VK humanas en las cuales las CDRs de ratón se injertan, se seleccionaron al buscar bases de datos para VH humana más semejante a VH y VK B-F5 de ratón original. La región VH de un anticuerpo, humano ( 26; Número de Acceso A36006) tuvo la más alta homología con VH de B-F5. La región VK de otro anticuerpo humano (FK-001; ???????? et al., Biotechnology , 7 (1989), 805-810)) tuvo la más alta homología con VK de B-F5.

Dos tipos de VK difieren entre ellas en que el 4° residuo fue Leucina o Metionina se construyeron y diseñaron como L4L y L4M. Dos tipos de VH que difieren entre ellas en que el 37° residuo amino ácido fue Leucina o Valina, se construyeron y diseñaron como H37L y H37V. El alineamiento de las secuencias de polipéptidos de B-F5, FK-001, L4L, y L4M se muestra en la Figura 20. El alineamiento de las secuencias de polipéptidos de B-F5, M26, H37L, y H37V se muestra ' en la Figura 21. Los residuos FR previamente reportados como importantes para el empaque de CDRs (Chothia et al., Nature 342(1989), 877; Foote et al., J. Mol. Biol., 224(1992), 487), están encasillados.

Al combinar estas VH y VK, se diseñan 4 versiones de regiones V.

Expresión de B-F5 humanizado Las etapas subsecuentes para · la producción de B- F5 humanizado fueron las mismas que aquellas descritas en la patente de los E.U.A. Número 5,886,152 para B-B10 humanizado .

Brevemente, plásmidos de expresión para la cadena H (región humanizada VH fusionada a la región constante de una cadena humana y-1 (TAKAHASHI et al., Cell, 29 (1982), 671-679)) y la cadena L (región humanizada VK fusionada a la región constante de la cadena K FK-001) de B-F5 humanizado se construyeron por separado. En estos plásmidos, la expresión de B-F5 humanizado es desplazada por el promotor/mej orador del gen de IgM monoclonal humano FK-001. Las Figuras 5 y 6 respectivamente muestran los fragmentos de los plásmidos que codifican las regiones VH y V de BF-5 humanizado. Las secuencias que codifican la región V están subrayadas y las secuencias de polipéptidos correspondientes, se indican bajo la secuencia de nucleótidos. Ambos plásmidos y pSV2neo se introdujeron simultáneamente en el mieloma de ratón Sp2/0 (ATCC CRL- 1581) utilizando Lipofectin111. Transíectomas que producen IgG humano se seleccionaron por ELISA, utilizando un anticuerpo anti-humano IgG (cadena y) ¦ y un anticuerpo de cadena IgK anti-humano.

Caracterización de las diferentes versiones de B- F5 humanizado .

¦ Estimación de actividad de enlace CD4.

Sobrenadantes de cultivo de transíectomas que producen las cuatro versiones de hB-F5, se recolectaron y concentraron. Los diferentes anticuerpos se purificaron de sobrenadantes de cultivo por cromatografía de afinidad utilizando proteína A Sepharose y : estimaron por su actividad de enlace CD4 al medir, mediante ELISA competitivo, sus actividades inhibitorias contra el enlace de mB-F5 biotinilado a CD4 soluble revestido en placas de microtitulacion. El tiempo de incubación es de 2 horas por 37 °C y durante la noche por 4°C.

Las actividades de enlace relativas de hB-F5s (actividad de enlace de mB-F5 se toma como 100%) se ilustran en la Tabla A siguiente: Tabla A 37 10 H37V/L4M 4 10-20 37 10 De los resultados mostrados en la Tabla A, parece que el 37° residuo de Leucina es critico para mantener la actividad de enlace de CD4 de hB-F5, debido a que la actividad de enlace CD4 es varias :veces reducida por conversión de 37Leu a 37Val. Por el contrario, el 4o residuo de VK se encuentra que no es tan importante para la actividad de enlace de CD4. Como la diferencia estructural entre 37Leu y 3 Val de VH no se demuestra claramente por modelado molecular, la superioridad de H37L a H37V en la actividad de enlace CD4 fue inesperada.

H37L/L4L y H37L/L4M se seleccionaron para evaluación .

Investigación de las actividades biológicas in vitro de B-F5 humanizado .

Las actividades biológicas in vitro de B-F5 de ratón y B-F5s humanizado (H37L/L4M IgGl y H37L/L4L IgG 1) se evaluaron. B-F5s humanizados de tipo IgG2 (H37L/L4M IgG2 y H37L/L4L IgG2) también se probaron.

Las actividades biológicas in vitro de mB-F5 y los cuatro tipos de hB-F5s se evaluaron utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donadores sanos. PBMCs se activaron por ConA (2.5 pg/ml, 3 días) o PPD (10 pg/ml, 4 días) en la presencia de murino o hB-F5s, y se supervisaron por sus respuestas proliferativas por incorporación de 3H-timidina.

Murinos y hB-F5s pudieron inhibir moderadamente la proliferación inducida por ConA, pero las actividades variaron de anticuerpo en anticuerpo y/o de donador a donador. También murinos y hB-F5s fueron capaces de inhibir proliferación de PBMC especifica de Ag inducida por PPD.

El tipo IgGl de hB-F5 inhibe la proliferación inducida por PPD más efectivamente (tan alta como inhibición al 70%) que mB-F5. El tipo :IgGl parece ser más efectivo que el tipo IgG2 del cual la actividad inhibitoria fue casi la misma que mB-F5. Para el tipo IgGl, H37L/L4M fue más efectivo que H37L/L4L. El tipo IgG2. de H37L/L4M y H37L/L4L tuvo casi las mismas actividades inhibitorias. En breve, las actividades inhibitorias de B-F5s contra proliferación PBMC inducida por PPD fueron como sigue: H37L/L4M IgGl > H37L/L4L IgGl > H37L/L4M IgG2 = H37L/L4L IgG2 = mB-F5.

Considerando la eficacia ' de la actividad biológica in vitro y el número menor de aminoácidos de ratón, H37L/L4M IgGl se eligió para mayor evaluación y es este anticuerpo que se nombra BT061 y se emplea para demostrar la presente invención en los ejemplos que se proporcionan en esta aplicación.

Composiciones y usos Como se ha mencionado, la composición farmacéutica y medicamentos empleados en la presente invención, de preferencia son capaces de tratar una enfermedad autoinmune en pacientes que se benefician de terapias' a más largo plazo.

En algunas modalidades (dosis superiores) las dosis preferidas del agente son aquellas de 10 mg a 100 mg, 10 mg a 80 mg, 15 mg a 80 mg, 20 mg a 7-5 mg, de preferencia de 20 mg' a 60 mg más preferiblemente de 25 mg a 60 mg .

En forma alterna, la dosis puede definirse con base en la dosis acumulativa sobre una prioridad de dosis. En particular, para una pluralidad de dosis sobre un periodo de 10 días se prefiere que la dosis acumulativa esté entre mayor a 25 mg pero menor que o igual a 200 mg, más preferiblemente entre 28 mg y 100 mg, y más preferible entre 30 mg y 100 mg. Además, la dosis acumulativa sobre un periodo de 5 días de preferencia es mayor que 15 mg pero menor que o igual a 100 mg, más preferible entre 18 mg y 100 mg y' más preferiblemente entre 20 mg y 100 mg . En este aspecto de la invención, se prefiere .particularmente que las dosis se administren en forma subcutánea.

En una modalidad alterna (dosis inferiores), las dosis preferidas son aquellas de 0.2 mg a 30 mg, 0.2 a 20 mg por dosis, 0.3 mg a 7.5 mg, 0.3 a 5 mg por dosis o de preferencia 0.3 a 1 mg por dosis.

En forma alterna, la dosis puede definirse con base en la dosis acumulativa sobre una prioridad de dosis. En particular para una pluralidad de dosis sobre un período de 10 dias, se prefiere que la dosis acumulativa este entre 0.2 a menos que 25 mg, más preferible entre 0.2 y 20 mg y más preferiblemente entre 0.2 a menos que 10 mg . Además, la dosis acumulativa sobre un período de 5 días deberá estar entre 0.2 a menos que 15 mg, de preferencia entre 0.2 y 12 mg, y más preferiblemente entre 0.2 a menos que 5 mg.

En este aspecto de la invención, se prefiere que, cuando la dosis se va a administrar en forma intravenosa, las dosis sobre un periodo de 10 días están entre 0.2 a menos que 10 mg, más preferiblemente entre 0.2 y 7.5 mg . En forma alterna, cuando las dosis se van a administrar en forma subcutánea o intramuscular, se prefiere que las dosis sobre un período de 10 días estén entre 1 mg a 30 mg, más preferiblemente entre 5 mg y 30 mg.

La dosis también puede calcularse en base al peso corporal del sujeto o área superficial del cuerpo (BSA = Body Surface Área) del sujeto. El área superficial del cuerpo (BSA) puede calcularse de acuerdo con cualquier método conocido. Ejemplos de métodos de cálculo de BSA son como sigue: Fórmula Mosteller: BSA (m2) = ( [Altura (cm) x Peso(kg)]/ 3600 )½ (Mosteller RD: Simplified Calculation of Body Surface Area. N Engl J Med 1987 Oct 22 ; 317 ( 17 ) : 1098 ) Fórmula de DuBois y DuBois: BSA (m2) = 0.20247 x Altura (m) 0.725 x Peso ( kg) 0.425 (DuBois D; DuBois EF: A formula to estímate the approximate surface área if height and weight be known . Arch Int. Med 1916 17:863-71.

Fórmula de Haycock: BSA (m2) = 0.024265 x Altura (cm) °"3964 x Peso (kg) °-5378 (Haycock G.B., Schwartz G . J . , Wisotsky D.H. Geometric method for measuring body surface área: A height weight formula validated in infants, children and adults. The Journal of Pediatrics 1978 93:1:62-66) Fórmula de Gehan y George: BSA (m2 ) = 0.0235 x Altura (cm) °'42246 x Peso ( kg) °'51456 (Gehan EA, George SL, Estimation of human body surface área from height and weight. Cáncer Chemother Rep 1970 54:225-35) Fórmula de Boyd: BSA (m2) = 0.0003207 x Altura (cm) °'3 x Peso ( gramos' (0'7285 - ( 0.0188 x LOG (gramos)) De acuerdo con las modalidades de dosis superiores de la invención, la dosis del agente al sujeto en términos de peso corporal es de 0.1 a 2 mg/kg, de preferencia 0.15 a 1.5 mg/kg, y más preferiblemente 0.2 a 1 mg/kg. ?? términos de BSA, la dosis del agente al sujeto es desde 5 a 60 mg/m2 de BSA, de preferencia de 6 a 50 mg/m2, y más preferiblemente 8 a 40 mg/m2.

' En estos aspectos de la invención, cuando la dosis se basa en el área superficial del cuerpo o el peso corporal' del sujeto, se prefiere que las dosis sobre un periodo de 10 días estén entre 10 mg/m2 y 120 mg/m2, más preferible entre 16 mg/m2 y 120 mg/m2, o entre 0.2 mg/kg y 4 mg/kg, más preferible entre 0.4 mg/kg y 4 mg . kg . En particular se prefiere que las dosis se administren subcutáneamente.

De acuerdo con las modalidades de dosis inferiores de la invención, la dosis del agente al sujeto en términos de peso corporal es de .1 a 500 pg/kg, de preferencia 2 a 400 g/kg, más preferiblemente 2 a 250 pg/kg y más preferiblemente 2.5 a 20 pg/kg. En términos de BSA, la dosis del agente al sujeto es de 0.12 a 15 mg/m2, más preferiblemente 0.20 a 10 mg/m2 y más preferiblemente 0.30 a 0.50 mg/m2.

En estos aspectos de la invención, en donde la dosis se basa en el área superficial del cuerpo o el peso corporal del sujeto se prefiere que, cuando la dosis se va a administrar intravenosamente, las dosis sobre un periodo de 10 dias están entre 0.20 a 10 mg/m2, más preferiblemente entre 0.20 a 4 mg/m2, o entre 2 a 250 más preferiblemente entre 2 a 100 µg/kg. En forma alterna, cuando las dosis se van a administrar en forma subcutánea o intramuscular, se prefiere que las dosis sobre un periodo de 10 dias estén entre 0.30 a 20 mg/m2, más preferiblemente entre 0.5 a 20 mg/m2, o entre 2.5 a 500 pg/kg más preferiblemente entre 20 a 500 g/kg.

La frecuencia de administración no está limitada especialmente, siempre que produce las ventajas del tratamiento de largo plazo. En la invención, se prefiere que la pluralidad de dosis se administren en al menos una de las siguientes bases: las siguientes bases: 3 diariamente, semanalmente, cada cuatro semanas, cada 6 semanas, cada 12 semanas, cada 24 semanas, cada mes calendario, cada 3 meses calendario, cada seis meses calendario o anualmente. De esta manera, las dosis pueden estar separadas por al menos tres dias. o en forma alterna por al menos una semana, por al menos 10 dias, por al menos un mes, por al menos 3 meses, por al menos 6 meses o por al menos un año (lo que significa que las dosis se toman al menos cada 3 días, cada semana, cada 10 días, cada mes, cada 3 meses, cada 6 meses o cada año) . En una alternativa adicional, la pluralidad de dosis se toma de cada 3 a 31 días, cada 3 a 10 dias, cada 3 a 6 días o de cada 1 a 12 meses .

La invención también proporciona un equipo para uso como se definió anteriormente, en donde el equipo comprende una pluralidad de dosis de medicamento como se definió anteriormente para administración simultánea, secuencial o separada a un sujeto.

También se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, este método comprende administrar un medicamento, como se definió anteriormente, en una forma como se definió anteriormente, a un sujeto.

¦ Como ya se ha mencionado, la composición farmacéutica y los medicamentos empleados en la presente invención, de preferencia son capaces de tratar una enfermedad autoinmune en pacientes que se benefician de terapias de más largo plazo. Estos pacientes incluyen pero no están limitados a casos severos con una larga historia de la enfermedad.

En general, la composición farmacéutica y los medicamentos empleados de acuerdo con la invención son para tratar una enfermedad autoinmune. De preferencia, la enfermedad autoinmune se elige de psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo 1, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad de Crohn, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis autoinmune, miastenia gravis autoinmune, lupus sistémico eritematoso, colitis · ulcerativa, dermatitis atópica, miocarditis y enfermedades relacionadas a transplante tales como reacciones de injerto-contra-hospedero u hospedero-contrainjerto, ;o en general aspectos de tolerancia de órganos.

En un aspecto particularmente preferido de la invención, las composiciones farmacéuticas son para tratar la enfermedad autoinmune psoriasis. Eh particular, estas composiciones farmacéuticas se van a administrar en forma intravenosa o subcutánea en las dosis aquí especificadas.

La psoriasis es un desorden que provoca lesiones o placas¦ psoriásicas en la piel de quien la padece.

La Calificación del Área de psoriasis e índice de Severidad (PASI = Psoriasis Area and Severity Index) se emplea comúnmente para evaluar y registrar el nivel de psoriasis exhibido por quienes la sufren. La calificación PASI involucra la evaluación de eritema (E) , infiltración (I), y descamación (D) , y participación del área de superficial corporal (A) sobre 4 regiones del cuerpo (cabeza (h) , tronco (t) , extremidades superiores (u) e inferiores (1) ) . La Tabla B siguiente muestra como funciona el sistema de calificación.

TABLA B - Sistema de Calificación PASI Debido a que la cabeza, · las extremidades superiores, el tronco y las extremidades inferiores corresponden aproximadamente a 10, 20, 30, y 40% del área superficial corporal respectivamente, la calificación PASI se calcula por la fórmula: PASI = Ó.1 (Eh+Ih+Oh)Ah + 0.2 (EU+IU+DU)AU + 0.3 (Et+It+Dt) At + 0.4 (EJ+IJ+DJJAI La calificación PASI está en el intervalo de 0-72. Una calificación de 0 significa que no hay psoriasis, mientras que una calificación de 72 representa la psoriasis más severa.

En una modalidad preferida de este aspecto, la composición farmacéutica de la presente invención es capaz de tratar psoriasis al proporcionar al menos 40%, de preferencia al menos 50% de mejora en la calificación PASI del paciente. De preferencia, el sujeto tiene una calificación PASI de al menos 10 antes de tratamiento. Estos efectos pueden verse al menos 56 dias después de administración de una sola dosis del anticuerpo, más preferiblemente al menos 75 dias después de administración de una 'sola dosis del anticuerpo. En particular, estos efectos pueden verse en al menos 80% de. los pacientes.

En un aspecto adicional de la presente invención, las composiciones farmacéuticas son para tratar artritis reumatoide .

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmuñe que provoca inflamación crónica de las articulaciones y tejidos circundantes y también puede afectar a otros tejidos y órganos del cuerpo.

La mejora en artritis reumatoide exhibida por un paciente" tratado se estima en forma común utilizando el conjunto de parámetros núcleo del Colegio Americano de Reumatologia (ACR = American College of Rheumatology) (Felson et al., Arthritis & Rheumatism, 1995, 38(6), 727-735) . Este sistema define un valor de ACR 20 como una mejora del 20% en recuentos de articulaciones sensibles e hinchadas y 20% de mejora en 3 de 5 medidas del conjunto núcleo ACR restante: evaluaciones globales de paciente y médico, dolor, incapacidad y un reactivo de fase aguda, tal como proteina reactiva C (CRP = C-Reactive Protein) .

En particular, las composiciones farmacéuticas para tratar artritis reumatoide de preferencia se van a administrar en forma intramuscular o: subcutánea en las dosis aquí especificadas.

El presente tratamiento de artritis incluye drogas d fármacos de primer linea para controlar dolor e inflamación clasificadas como drogas anti-inflamatorias no esferoidales (NSAIDs= Non Steroidal¦ Anti Inflammatory Drugs), por ejemplo, aspirina, ibuprofen, naproxen, etc.. Tratamiento secundario de artritis incluye corticosteroides (por ejemplo prednisona y dexametasona ) , drogas antireumáticas de acción lenta (SAARDs = Slow Acting Antirheumatic Drugs) o drogas anti-reumáticas que modifican la enfermedad (DMARDs = Disease Modifying Antirheumatic Drugs), por ejemplo, metotrexato, penicilinamina, ciclofosfamida, sales de oro, azotipoprina, leflunomida, etc .

Los corticosteroides, las versiones sintéticas de la hormona cortisona del cuerpo, se emplean para inhibir el avance de RA (por ejemplo prednisona y dexametasona) .

Otro grupo de fármacos denominados modificadores de respuesta biológica (BRMs = Biological Response Modifiers) también se desarrollaron para el tratamiento de RA incluyendo antagonistas a TNF-alfa (adalimumab, infliximab, etanercept) que funcionan a través de enlace a su receptor o directo a enlace a la proteina TNF-alfa.

En una modalidad de este aspecto de la invención, las composiciones se van a administrar en combinación con fármacos actualmente empleados para tratar artritis reumatoide. En particular, las composiciones se van a administrar con uno de los fármacos anteriormente mencionados, de preferencia metotrexato.

Fármacos conocidos tales como metotrexato y la composición farmacéutica de la presente invención, pueden administrarse en forma simultánea, secuencial o separada.

La invención ahora se describirá adicionalmente en relación a las siguientes modalidades especificas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 - Investigación .de las capacidades inmuno-moduladoras de BT061 respecto a proliferación de células T.

Método Cultivos de sangre entera se realizaron con sangre periférica recientemente extraída. Brevemente, utilizando agujas 19G se recolectó sangre de tres voluntarios sanos en jeringas heparinizadas . La sangre fue sembrada en placas de cultivo de 96 pozos no más tarde que 60 minutos después de donación.

El anticuerpo empleado en la invención (BT061, lote 40588, o lote 70A0013B) se agregó a los cultivos antes de estímulo de los leucocitos a 5 diferentes concentraciones (ver a continuación "Sustancias de prueba"). Se deja que las células interactúen con el anticuerpo por 90 min a 37 grados C, C02 al 5% en atmósfera humidificada, después se agregaron cuatro diferentes estimulantes a cultivos separados: (a) anticuerpos anti-CD3 (R&D Systems; 50 ng/ml) (b) fitohemaglutinina (PHA, Biochrom KG; 3 pa/ml) junto con anticuerpos anti-CD28 (Becton-Dickinson; 1 pg/ml) ; (c) lipopolisacárido (LPS, subtipo .055:B15 de Sigma Aldrich; 1 µg/ml) ; (d) SE-B (Bernhard-Nocht-Institut; 25 ng/ml) junto con anticuerpos anti-CD28 (Becton-Dickinson; 1 yg/ml) .

Todos los cultivos de sangre entera se incubaron por 24 horas a 37 grados C, C02 al 5% (atmósfera humidificada) . Después, los sobrenadantes de cultivo se recolectaron para la determinación de los puntos extremo de citoquina, excepto por cultivos estimulados con PHA/antiCD28 , que se incubaron por 48 horas a fin de obtener un estimulo suficiente de células Th2.

Los resultados se establecen én la Figura 1.

Resultados BT061 no exhibió efecto significante en las actividades principales de monocitos/macrófagos y en Thl asi como actividades Th2 en cultivos de sangre entera de voluntarios sanos. Hubo un efecto dependiente de concentración en células Treg (demostrado como un incremento en liberación de TGF-beta) .

En particular, los resultados : confirman que: • ' No hay modulación de la citoquina inflamatoria IL-2 a concentraciones de hasta 50 g/ml correspondiente a aplicación de altas dosis de hasta 150 mg en pacientes • No hay inducción de la citoquina inflamatoria IFN-gamma a concentraciones de : hasta 50 pg/ml correspondientes a aplicación de altas dosis de hasta 150 mg en pacientes No hay modulación de las citoquinas Thl/Th2 a concentraciones de hasta 50 g/ml correspondientes a aplicación a altas dosis en pacientes Ocurre solo regulación por incremento muy esporádica de IL-6 por un incremento marginal, las implicaciones de lo cual se discuten en forma controversial Incremento en la liberación de TGF-beta (células Treg) Sin efecto significante en las mayores actividades regulatorias de monocitos/macrófagos y actividades Thl y Th2.

EJEMPLO 2 - Prueba de BT061 por su influencia en PBMCs humanos cultivadas cebadas para una respuesta de toxoide anti-tétano y ensayo de citoquina Método Ensayo de proliferación PBMC recientemente aisladas se cultivaron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pozos en un volumen de 200 µ?/???? (4 x 105 células/pozo) . El ítem de prueba · (Anti CD4 mAb BT061) se empleó en las concentraciones de 20 pg/ml, 4 pg/ml y 0.8 pg/ml (adicionalmente 40 pg/ml dentro de la pre-prueba) ; Toxoide de Tétanos se emplea en concentraciones de 25 pg/ml, 5 pg/ml y 1 pg/ml. Para control negativo se tomó medio de cultivo 'celular. Todos los cultivos se dispusieron como triplicados.

Para el estimulo conA, se empleó una concentración de 2.5 pg/ml y un volumen de 200 pl/pozo. La PBMC se ajustó a una densidad de 1 x 106/ml y surtió en un volumen de 100 pl por pozo.

Al final del periodo de cultivo, se detectó proliferación celular al agregar 0.4 Ci de 3H timidina por pozo por dieciséis horas. Al final del periodo de cultivo, las células se desprendieron de la superficie utilizando solución EDTA y recolectaron en filtros de fibra de vidrio utilizando un recolector de células scatron. La cantidad de radioactividad incorporada en ADN en cada pozo se midió en un contador de centelleo y es proporcional al número de células proliferantes, que a su vez es una función del número de leucocitos que se estimulan para entrar a la fase S del ciclo celular. El parámetro de lectura fue recuentos por minuto (cpm) y el índice de estímulo (SI = stimulation índex) por cada concentración definido como cpmcompounci / cpmblank .

Ensayos de Citoquina : Todas las citoquinas se cuantificaron en los sobrenadantes de cultivo utilizando . equipos de ELISA comerciales, de acuerdo con instrucciones respectivas de los fabricantes. Los reactivos empleados se establecen en la Tabla 1 siguiente: Tabla 1 Sustancia Fuente código Lote Equipo IFN-? BD 555142 MF31099 OptEIA Humano Biosciences Equipo IL-1 Bender BMS243/2MST n . a .

ELISA Humano Equipo IL-4 BD 555194 MF10142 OptEIA Humano Biosciences Equipo IL-5 BD 555202 MF31662 OptEIA Humano Biosciences Equipo IL-6 BD 555220 MF25815 OptEIA Humano Biosciences Equipo IL-10 BD 555157 MF24968 OptEIA Humano Biosciences Equipo TGF-ß BD 559119 47704 OptEIA Humano Biosciences Equipo TNF- BD 555212 MF31447 OptEIA Humano Biosciences * material adicional, requerido para ELISA de Interleuquina-1 Niveles de interleuquina (IL)-l en sobrenadantes de cultivo se determinaron utilizando el equipo de prueba human IL-1 ELISA Set A (Bender) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El intervalo de la prueba, predeterminado por la norma suministrada con el equipo, se especificó a 1.3 a 130 pg/ml para muestras sin diluir.

Los niveles IL-4, 5, 6 y 10 en sobrenadantes de cultivo asi como factor de crecimiento de transformación (TGF = transforming growth factor) ß? y factor de necrosis de tumor (TNF = tumour necrosis factor) , se determinaron utilizando el equipo de prueba OptEIA (BD biosciences) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El intervalo de las pruebas predeterminado por las normas suministradas con los equipos se especificó a 3.8 a 330 pg/ml para IFN-?, 6,3 a 616 pg/ml (para IL-4, 5, 10 y TNF), midiendo muestras sin diluir y 7:.6 a 660 pg/ml para IL-6 utilizando diluciones dobles de las muestras.

Dos determinaciones de citoquina (para cultivos de monocito) u ocho (para cultivos PBMC) por ELISA, cada una de micro-cultivos independientes, se incluyeron en el cálculo de desviación estándar y promedio. Títulos sobre el intervalo superior de la prueba (por ejemplo 616 pg/ml en el caso de TNF) se ajustaron a este -valor para cálculo. El intervalo inferior de la prueba se substrajo de cada valor promedio antes de cálculo.

Resultados BT061 (también denominado B-F5 humanizado, o simplemente hB-F5) es capaz de suprimir en forma dependiente de dosis, la proliferación de célula T específica de toxoide-tétanos ; no ha habido efecto en el número total de células T. Supresión general de liberación de citoquina se ha demostrado.

La Tabla 2 siguiente muestra la influencia del anti CD4 mAb BT061 en un ensayo de proliferación de células T especifico de toxoide tétanos medido en triplicado.

Se exhiben los promedios y SD de la incorporación 3H-Tdr, medido en triplicado asi como el índice de estímulo (SI, definido como cpmcompound / cpm nil) para cada concentración y el nivel de significancia en la prueba t de dos lados no apareada contra el medio de control (n.s. : no significante; *: p< 0.05; **: p< 0.01; ***: p< 0.001) .

Tabla 2 Tabla 3 Esta tabla muestra la influencia de anti CD 4 mAb BT061 en la producción de citoquina de cultivos PBMC de toxoide-tétano . Promedio y SD de ocho micro cultivos individuales se dan.

Tabla 3 (continúa) Tabla 3 (continúa) Tabla 3 (continúa) Tabla 4 Esta tabla muestra la influencia de anti CD4 mAb BT061 en la producción de cultivos de monocitos estimulados por LPS, citoquinas inflamatorias. Se dan Promedio y SD de dos micro cultivos individuales.

Tabla 4 (continúa) Tabla 4 (continúa) Los datos en las Tablas .2-4 demuestran lo siguiente: • Una supresión dependiente de dosis de proliferación de células T inducidas por toxoide-tétanos (respuesta de memoria) se ha demostrado incluso a altas dosis de BT061, mostrando que BT061 no abroga todas las respuestas inmunes. Dosis empleadas aplican a una aplicación de alta dosis correspondiente de hasta 60 mg en pacientes.

• . Supresión general de liberación de citoquina (reducción dependiente de dosis de IFN-gamma, IL-5 y TNF-alfa, sin cambio en IL-1, IL-4, IL-6, IL-10) y sin afectar el balance Thl/Th2.

• Un aumento en liberación de TGF-beta EJEMPLO 3 - Una prueba citométrica de flujo para ADCC (citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo) inducida por BT061 (anti CD4 mAb) Células diana HuT 78 se etiquetaron con BT061 (hB-F5) e incubaron con células PBMC como efectores. Células muertas pueden detectarse debido a la absorción del colorante de ADN yoduro de propidio después de un tiempo de incubación de 30 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Los datos en la tabla demuestran que no hubo inducción de ADCC por BT061 (hB-F5) incluso a altas concentraciones EJEMPLO 4 - ApoptOSÍS En una prueba citométrica de flujo para apoptosis inducida' por BT061 (anti CD4 mAb) , PBMCs de sangre entera se incubaron con BT061 o el control positivo.

Después de un tiempo de incubación de 7 días, la detección de células apoptosicas se: realizó al teñir células apoptosicas con Anexina-V-Fluoresceína . Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Los datos demuestran que no hubo inducción de apoptosis incluso a altas concentraciones de BT061.

EJEMPLO 5 - Enlace de complemento En una prueba citométrica de flujo para ligar el factor de complemento ClqPBMCs se ha aislado e incubado con BT061 (anti CD4 mAb) , seguido por una incubación con Clq recombinante purificado.

ATG (Tecelac) sirvió como el control positivo.

Se realizó detección con un anticuerpo de detección etiquetado con FITC contra Clq. Resultados se muestran en la Tabla 7 siguiente.

Tabla 7 Concentración de anti CD4 mAb Control anticuerpo [pg/ml] BT061 positivo Intensidad de flourescencia promedio 150 199 782 75.0 200 766 37.5 205 732 Los datos muestran que no puede verse enlace complemento, incluso a altas concentraciones.

EJEMPLO 6 - Tregs CD25+ activados por CD4 suprimen síntesis de citoqüina y CD25 re-expresión de células T CD8+ La Figura 7 muestra que Tregs. CD25+ activados por CD4 suprimen la síntesis de citoqüina y re-expresión de CD25 de células T CD8+. Superior: Tregs CD25+ activados por CD4 suprimen síntesis de citoqüina :de células T CD8+ coactivadas.

Método Tregs CD25+ se estimulan con/sin anti-CD3 mAb o anti-CD4mAb (B-F5, 1 g/ml cada . una) por 48 h. Posteriormente, se co-cultivaron células con PBMC singénico agotado de célula T irradiado y células T CD8+ alogénicas (proporción 1:1). Producción de citoquinas se analizó el día 7. Células T CD8+ aloreactivas se re-estimularon con ???/??? por 5h en la presencia de monensina, fijaron y tiñeron con anti-CD8 y mAbs específicos de citoqüina de acuerdo con las instrucciones respectivas de fabricante (todas BD PharMingen) . Síntesis de citoquina se analiza por citometría de flujo trazando una compuerta en linfocitos CD8+. Re-expresión de CD25 por células T CD8+ se mide de acuerdo con el siguiente procedimiento: Tregs CD25+ se estimula con/sin anti-CD3 Ab o anti-CD4mAb (B-F5, 1 µg/ml cada uno) por 48 h. Posteriormente, las células se co-cultivaron con células T CD8+ alogénicas y PBMC singénicas agotadas' de células T. En el día 10, las células T CD8+ se re-estimülaron con PBMC agotadas CD3 alogénicas del mismo donador como se emplea para estímulo primario (proporción 1:1) y re-expresión CD25 de células T CD8+ se analiza 24 h después de re-estímulo de citometría de -flujo.

Resultados Tregs CD25+ activadas no sólo suprimen la proliferación de células T convencionales sino también inhiben la producción de citoquinas y la capacidad de las células T CD8+ en expresar la cadena a del receptor IL-2, CD25. Como se muestra en la figura 7, Tregs CD25+ activadas por CD4 e inhiben efectivamente la producción de IL-2 y IFN-a de células T CD8+ aloreactivas , similar a Tregs CD25+ estimuladas anti-CD3. Simultáneamente, hacen a las células T CD8+ suprimidas incapaces de expresar CD25 ante reestímulo (Figura 7). En conjunto, estos datos demuestran que el estímulo CD4 activa completamente las propiedades supresivas de Tregs CD25+.

EJEMPLO 7 - Seguridad y tolerabilidad de dosis en escala de BT061 Un estudio se conduce para supervisar la seguridad y tolerabilidad de BT061 utilizando dosis escaladas del anticuerpo en voluntarios masculinos y femeninos sanos entre las edades de =18 a = 75 años.

Treinta voluntarios recibieron BT061 por administración intravenosa en grupos de 10 dosis, con 3 voluntarios por grupo. Además, 15 voluntarios recibieron BT061 por administración subcutánea en 5 grupos de dosis también con 3 voluntarios por grupo. La administración de BT061 en forma intravenosa se ilustra en la Tabla 8 a continuación: : TABLA 8 - Dosis intravenosa :de BT061 Administración de BT061 Cada dosis se diluye con 0/9% de inyección de cloruro de sodio al 0.9% hasta un volumen total de 20 mi. La dosis se administra como una infusión intravenosa continua¦ sencilla durante 2 horas.

La administración de BT061 subcutáneamente se ilustra en la Tabla 9 siguiente: TABLA 9 - Dosis subcutánea de BT061 Administración de BT061 i Dosis Volumen de Volumen de Volumen de i total de BT061- BT061- BT061- BT061 mab 12.5 mg 25 mg 50 mg i 5 mg 0.4 mi — ¡ 10 mg 0.8 mi — — 20 mg — 0.8 mi — 40 mg — — 0.8 mi. 60 mg — 1 mi + 0.2 ! mi \ Cada dosis se inyecta como una inyección de un solo bolo.

Los voluntarios se estimaron sobre un periodo de 3 meses después de inyección.

Para aplicación subcutánea se tomaron muestras de plasma antes de administración y a 3, 6, 12, 24, 36, 48, 56, 72, 88, 96, 120, 144 y 168 horas después de administración y en el día 75.

Para aplicación intravenosa, muestras de plasma se tomaron antes de administración y a 30 minutos, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 horas después de administración.

Las muestras de plasma se analizaron utilizando metodología ELISA estándar para establecer niveles de citoquina. Las citoquinas relevantes analizadas incluyeron: IFN-?, TNF-a, IL-6 y IL-2.

Las muestras de plasma también se analizaron utilizando métodos estándar de citometria de flujo para medir el número de linfocitos CD4+.

Resultados Se encontró que las dosis intravenosas y subcutáneas de hasta 60 mg en general fueron bien toleradas .

Niveles de citoquina Inducción de liberación de citoquina es una complicación inmediata común que ocurre con el uso de anticuerpos terapéuticos que interactúan con célula T, tales como ATG, OKT3, CAMPATH-1H y anti-CD3 mAbs humanizado (TRX4, . Visilizumab y Teplizumab) . Los síntomas primordialmente incluyen fiebre moderada, dolores de cabeza y manifestaciones gastrointestinales auto-limitantes. Los efectos laterales correlacionados con inducción de citoquina después de administración de anticuerpo requieren la aplicación de fármacos adicionales tales como la antihistámina hidrocloruro difenhidramina y/o el agente anti-inflamatorio ibuprofen.

Con el uso de OKT3 (muromonab-CD3) , un anticuerpo monoclonal terapéutico específico de CD3 murino, incluso se han reportado muertes, y varios efectos- secundarios limitan el uso clínico de este anticuerpo primordialmente a pacientes inmunosuprimidos .

Aunque anticuerpos monoclonales específicos de CD3 sin-enlace a FcR humanizados que actualmente se emplean en la clínica para el tratamiento de enfermedad autoinmune (Teplizumab y TRX4) exhiben reducidos efectos secundarios inducidos por la activación de célula T y/o por activación de células que expresan receptor Fe después de la primera dosis, en comparación con anticuerpos '-específicos CD3 que ligan FcR tales como 0KT3, cierto grado de activación e inactivación de células T de células que expresan receptor Fe todavía se observa que lleva a liberación de citoquina generalmente conectada con efectos secundarios dependientes de citoquina.

En el presente estudio, se encontró de manera sorprendente que la inducción de citoquina observada en voluntarios sanos después de aplicación intravenosa o subcutánea de BT061 fue baja y transitoria en comparación con anticuerpos anti-CD3. La inducción de citoquina generalmente aumenta al incrementar la dosis. Sin embargo, incluso las más altas dosis de 40 a 60 mg la inducción de citoquina es mucho menor que la que se ve con otros anticuerpos monoclonales que interactúan con célula T (Figuras 8A y B) .

Las concentraciones pico promedio para las citoquinas observadas en cualquier punto en tiempo dentro de 96 horas después de administración utilizando las más altas dosis (40 mg a 60 mg de BT061) se ilustran en las Figuras 8 y 9.

La concentración pico promedio o mediana para cada citoquina se calcula como sigue: La mediana de las concentraciones de citoquina más altas observadas después de administración del anticuerpo.

Las Figuras 8? y B muestran que la liberación de TNFa y IL-6 observada en voluntarios sanos después de administración intravenosa o subcutánea de BT061 en comparación con aquellas liberadas después de administración de anticuerpos mono.clonales anti-CD3, Teplizumab y TRX . Los valores .normales de estas citoquinas se tomaron de Straub et al., (2007, Arthr. & Rheumat.). La Figura 8 muestra los niveles de plasma IL-2 y IFN-? después de administración de BT061 intravenoso y subcutáneo. Los niveles picos medianos o promedios se calcularon de los grupos de dosis de 40 y 60 mg medido dentro de 4 días después de inyección: de anticuerpo. El limite superior de lo normal (ULN) se calcula con base en niveles de citoquina medidos en 39 sujetos sanos, en donde ULN = valor promedio + 2 x desviación estándar.

En comparación con Teplizumab y TRX4 (resultados tomados de Herold et al., 2002, New Engl . J. Med, y Keymeulen et al., 2005 New Engl. J. Med, respectivamente), BT061 induce solo liberación de citoquina marginal y transitoria. Niveles de TNF-a y IL-6 se aumentaron ligeramente. La Figura 7 muestra que los valores pico medianos de IL-6 y los niveles de citoquina TNFa detectados en plasma después de aplicación de BT061 (40 y 60 mg) son menores que aquellos vistos después -de tratamiento con anticuerpos terapéuticos específicos de CD3 Teplízumab y TRX4.

Además, en contraste con los anti-CD3 mAbs, BT061 no lleva a niveles substancialmente incrementados de IFN-? y IL-2 (Figura 8) como se reportó para la aplicación de TRX4 (Keymeulen et al. 2005) .

' Linfocitos CD4+ Además, la prueba también incluye un estudio de los números de linfocitos CD4 -positivos en muestras de plasma recolectadas.

Los resultados de la administración intravenosa se muestran a continuación en las Tablas 10, 11 y 12. La Tabla 13 muestra los resultados de la prueba con administración subcutánea. Los resultados se ilustran gráficamente en las Figuras 10 y 11.

TABLA 10 Conteos celulares CD4+ en voluntarios sanos individuales después de administración intravenosa de 3.5 g a 2.5 ig de BT061 TIEMPO DOSIS 3.5 \ig 3.5 g 3-5 20 \Lq 20 \ig Predosis 998 878 1025 955 1209 3h 1098 746 1020 708 1121 6h 922 710 1063 746 1091 12h 898 1183 942 1016 1667 24h 868 825 769 699 1043 36h 948 1035 1148 861 1549 48h 798 542 .834 566 1119 72h 798 626 766 622 942 96h 469 715 838 583 978 120h 736 643 843 604 942 144h 663 593 766 635 1200 168h 753 576 695 616 1012 Dia 14 716 615 625 696 867 Dia 21 941 378 707 637 971 Dia 28 821 569 840 652 863 Dia 42 922 442 784 676 1044 Dia 56 573 597 828 839 871 Dia 75 1821 512 692 659 1058 Dia 90 Recuento celular mínimo (72 h a dia 75) 469 378 625 583 863 Reducción máxima de células 1 CD4+ (%) 53.0 56.9 39.0 39.0 28.6 Tabla 10 (continúa) 144h 510 372 573 432 705 168h 505 348 646 426 740 Dia 14 645 400 771 451 713 Dia 21 633 391 805 404 651 Dia 28 649 497 775 503 752 Día 42 700 569 758 455 700 Dia 56 553 489 607 441 674 Dia 75 553 466 735 459 645 Día 90 Recuento celular mínimo (72 h a día 75) 472 348 573 400 645 Reducción máxima de células CD4+ (%) 29.1 70.1 28.4 26.3 15.0 Tabla 10 (continúa) TIEMPO DOSIS 500 pg 500 g 2.5 mg 2.5 mg Pre-dosis 493 1240 891 782 3h 566 1058 392 461 6h 381 1115 487 512 12h 643 1505 669 881 24 439 1017 521 701 36 688 1542 976 1207 48h 509 1108 574 815 72h 484 969 537 689 96h 390 1026 499 785 120h 488 1168 501 782 144h 394 953 518 745 168h 475 1073 568 773 dia 14 600 1398 663 883 dia 21 533 1241 530 758 día 28 445 1109 590 914 dia 42 617 1120 770 901 día 56 616 1311 634 1017 día 75 522 1026 731 1032 día 90 - Recuento celular mínimo (72 h a día 75) 390 953 499 689 Reducción máxima de células CD4+ (%) 20.9 23.1 44.0 11.9 TABLA 11 Recuentos celulares CD4+ en voluntarios sanos individuales después de administración intravenosa de 2.5 mg a 20 mg de BT061 TIEMPO DOSIS 2.5 mg 5 mg 5 mg 5 mg Pre- dosis 1080 1116 623 1160 3h 488 313 108 111 6h 514 445 164 246 12h 699 763 346 573 24h 726 617 282 539 36h 985 1102 505 721 48h 738 807 390 687 72h 711 736 419 700 96h 680 791 395 806 120h 649 669 438 750 144h 662 723 407 676 168h 579 777 309 652 Dia 14 726 692 354 475 Dia 21 601 811 480 514 Dia 28 874 681 339 602 Dia 42 923 843 300 694 Dia 56 847 450 571 Dia 75 1239 365 627 Dia 90 721 Recuento celular mínimo (72 h a dia 75) 579 669 300 475 Reducción máxima de células CD4+ (%) 46.4 40.1 51.8 59.1 Tabla 11 (continúa) TIEMPO DOSIS 10 mg 10 mg 10 mg 20 mg Pre- Dosis 840 835 1281 700 3h 104 143 132 63 6h 122 82 120 110 12h 297 285 366 199 24h 470 496 772 351 36h 414 985 1417 677 48h 388 794 942 493 72h 440 830 919 504 96h 516 641 918 538 120h 543 674 1002 558 144h .448 549 942 579 168h 473 525 876 510 Dia 14 357 701 908 484 Dia 21 481 654 978 618 Dia 28 414 755 887 496 Dia 42 507 614 889 639 Dia 56 551 805 1006 420 Dia 75 685 853 1080 537 Dia 90 Recuento celular mínimo (72 h a día 75) 357 .525 876 420 Reducción máxima de células CD4+ (%) 57.5 37.1 31.6 40.0 En particular, la Figura 10 muestra que los recuentos de células CD4 (células por mi de plasma) en voluntarios tratados con la dosis intravenosa sencilla de BT061. " Los puntos de datos representan, los valores promedio- de 3 pacientes en cada grupo de dosis. Líneas punteadas indican el límite superior de lo normal (ULN) y el límite inferior de normal (LLN) . ULN y LLN (valor promedio + (o -) la desviación estándar) se calcularon, con base en recuentos celulares de voluntarios sanos, como 443 células CD4 por µ? (límite inferior de :normal; LLN) y 1324 células CD4 por µ? (límite superior de normal; ULN) .

La Figura 11 muestra los recuentos celulares CD4 (células- por mi de plasma) en voluntarios tratados con la dosis subcutánea sencilla de BT061. Como con la Figura 10, los puntos de datos representan los valores promedio de 3 pacientes en cada grupo de dosis. Lineas punteadas indican el límite superior de lo normal (ULN) y el límite inferior de lo normal (LLN) .

TABLA 12 Recuentos celulares CD4+ en voluntarios sanos individuales después de administración intravenosa 20 mg a 60 mg de BT061 TIEMPO DOSIS 20 mg 20 mg 40 mg 40 mg Pre-dosis 843 1233 1152 789 3h 69 186 72 137 6h 83 245 87 147 12h 214 469 262 221 24h 266 490 208 222 36h 562 1019 489 475 48h 359 792 460 455 72h 392 909 591 545 96h 468 755 567 545 120h 391 795 578 517 144h 347 897 548 523 168h 331 853 630 577 dia 14 334 899 683 495 día 21 396 1077 744 487 dia 28 579 1030 637 458 dia 42 346 847 439 472 dia 56 337 947 556 557 dia 75 597 824 986 440 dia 90 Recuento celular mínimo (72 h a dia 75) 331 755 439 440 Reducción máxima de células CD4+ (%) 60.7 38.8 61.9 44.2 2 (continúa) TIEMPO DOSIS 40 mg 60 mg 60 mg 60 mg Pre-dosis 976 900 989 2539 3h 48 63 55 71 6h ' 69 81 78 109 12h 212 360 276 182 24h 292 315 285 313 36h 707 561 569 48h 703 413 500 565 72h 625 709 688 806 96h 733 717 737 774 120h 636 718 685 646 144h 760 714 732 606 168h 720 656 822 662 dia 14 675 851 546 423 dia 21 711 627 639 867 dia 28 582 466 757 1376 dia 42 619 1179 814 1607 dia 56 570 686 686 1298 dia 75 813 648 748 1199 dia 90 Recuento celular mínimo (72 h a día 75) 570 466 546 423 Reducción máxima de células CD4+ (%) 41.6 48.2 44.8 83.3 TABLA 13 Recuentos celulares CD4+ en voluntarios sanos individuales después de aplicación subcutánea de BT061 120h 823 566 712 653 673 144h 890 543 809 744 767 168h 894 450 437 686 655 dia 10 951 606 690 1213 724 dia 14 719 647 948 969 724 dia 21 859 552 750 655 708 dia 28 894 546 758 778 653 dia 42 854 461 1009 1235 805 dia 56 806 560 958 977 665 dia 75 852 592 772 1268 679 Recuento celular mínimo (72 h a dia 75) 719 450 437 589 653 Reduc-ción máxima de células CD4+ (%) 31.7 18.6 34.1 38.8 6.3 3 (continúa) TIEMPO DOSIS 10 mg 20 mg 20 mg 20 mg 40 mg Pre-dosis 891 863 692 621 689 24h 615 537 535 500 177 36h 1019 762 666 944 268 48h 537 628 599 587 354 72h 610 700 587 596 299 96h 579 643 665 589 283 120h 659 642 528 633 323 144h 784 603 620 627 239 168h 516 620 550 581 262 dia 10 928 683 616 778 354 dia 14 859 843 642 1033 307 dia 21 685 904 605 752 293 dia 28 766 757 680 768 298 dia 42 785 775 469 634 308 dia 56 753 801 589 531 342 dia 75 906 714 688 551 340 Recuento celular mínimo (72 h a día 75) 516 603 469 531 239 Reduc-ción máxima de células CD4+ (%) 42.1 30.1 32.2 14.5 65.3 Tabla 13. (continúa) TIEMPO DOSIS 40 mg 40 mg 60 mg 60 mg 60 mg Pre-dosis 946 840 1114 719 1345 24h 326 379 580 470 333 36h 463 870 503 527 487 48h 586 686 739 735 551 72h 719 734 860 813 539 96h 605 653 852 743 608 120h 835 629 873 639 555 144h 626 568 801 924 591 168h 515 569 1010 843 820 dia 10 715 809 757 1123 836 dia 14 705 541 1198 1359 527 dia 21 1097 630 1074 901 750 dia 28 861 667 880 578 dia 42 678 709 568 1149 854 dia 56 541 948 1126 945 505 dia 75 551 659 Recuento celular mínimo (72 h a día 75) 515 541 568 639 505 Reduc-ción máxima de células CD4+ (%) 45.6 35.6 49.0 11.1 62.5 Muchos anticuerpos monoclonales específicos de CD4 conocidos en la técnica (tales como aquellos revisados por Strand et al., 2007) lograron inmuno-supresión mediante agotamiento de linfocitos positivos CD4. La desventaja de estos anticuerpos es que los individuos tratados se volvieron inmuno-comprometidos y son susceptibles a otras infecciones .

En contraste, este estudio mostró que BT061 no induce agotamiento de larga duración masivo de células CD4-positivas. Sin embargo, un declive transitorio de linfocitos CD4-positivos se observa con una recuperación a los valores normales en la sangre periférica dentro de 72 h después de administración del anticuerpo.

: En el punto en tiempo de. 72 h después de aplicación de BT061, recuentos de células CD4 en cuatro voluntarios de los grupos de dosis intravenosas mostraron niveles CD4 que fueron inferiores a estos valores de norma como sigue: 1 voluntario de la dosis intravenosa de 100 µg: 400 células CD4 por µ?; 1 voluntario del grupo 5 mg: 419 células :CD4 por µ?; 1 voluntario del grupo 10 mg: 440 células CD4 por µ?; y 1 voluntario del grupo 20 mg: 392 células CD4 por µ?.

Sin embargo, estos valores solo fueron ligeramente por debajo de valor de norma. Recuentos celulares CD4 en los 26 voluntarios restantes de los grupos de dosis intravenosas, estuvieron dentro de los valores de norma 72 horas después de administración de BT061.

En los grupos de dosis subcutáneos, después de 72 horas, solo uno de 15 voluntarios mostró recuentos de células CD4 por debajo de los vaLpres de norma.

En conclusión, en contraste a agotar mAbs específicos de CD4, incluso a altas dosis de BT061 solo inducen un declive transitorio de células CD4 -positivas seguido por una recuperación general. Del declive transitorio y recuperación general rápida a valores de norma se concluye que una redistribución transitoria de las células CD4-positivas se ha llevado a cabo, en vez del agotamiento de estas células.

De esta manera, los datos soportan el uso de BT061 como un agente para administrarse en una pluralidad de dosis sobre un prolongado periodo de: tiempo.

EJEMPLO -'8 - Prueba clínica de BT061 en pacientes con psoriasis moderada a crónica severa La capacidad de hB-F5 ??06? para tratar una enfermedad autoinmune se prueba en 56 pacientes que sufren de psoriasis moderada a crónica severa. La prueba comprende un estudio de escala de dosis sencilla para estimar la seguridad y eficacia de hB-F5.

Las condiciones de la prueba son como sigue: Los 56 pacientes se dividen en siete grupos de dosis, cada grupo comprende ocho individuos. Cinco grupos de dosis (grupos de dosis I a V) van a recibir el anticuerpo o placebo por administración intravenosa y dos grupos de dosis (grupos de dosis VI y VII) van a recibir el anticuerpo o placebo por administración subcutánea. Dos pacientes en cada grupo de dosis reciben un placebo, mientras que los seis pacientes restantes en cada grupo de dosis reciben una dosis de BT061. En el grupo de dosis I, los seis pacientes recibieron 0.5 mg de BT061 intravenoso. En los grupos de dosis II a V, los seis pacientes recibieron 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, o 20 mg de BT061, respectivamente. En los grupos de dosis VI y VII en donde la administración es subcutánea, los seis pacientes recibieron 12.5 mg o 25 mg de BT061, respectivamente.

Para administración intravenosa, el anticuerpo/placebo se va a someter a infusión en la vena del ante-brazo de acuerdo con procedimientos médicamente aceptados. En el caso presente, el volumen total se administra como una infusión intravenosa continua sencilla sobre un: periodo de 2 horas mediante una bomba de infusión (perfusor) (Fresenius Pilot C, Fresenius AG, Alemania) . Cada dosis del anticuerpo se diluye con una inyección de cloruro de sodio a 0.9% (B. Braun Melsungen AG, Alemania) hasta un volumen total de 20 mi.

Para administración subcutánea, el anticuerpo se va a administrar como una inyección subcutánea sencilla. El mismo procedimiento aplica para el placebo.

El nivel de psoriasis exhibida por cada paciente se registra utilizando la calificación de Área de Psoriasis e índice de Severidad (PASI) . Como se describió anteriormente, calificaciones superiores de PASI corresponden a un nivel superior de psoriasis. Pacientes que participan en la prueba tienen psoriasis moderada a crónica severa, es decir una calificación PASI de 10 o superior.

La calificación PASI del paciente se estima antes de la prueba para proporcionar un valor de "linea base" el día 0, y repetidamente durante la prueba en los días 5, 7, 14, 21, 28, 42, 56 y 75.

Grupo de Dosis I Seis pacientes del grupo de dosis I recibieron una aplicación intravenosa sencilla de 0.5 mg de BT061, mientras que dos pacientes del grupo de dosis 1 recibieron el placebo. La dosis por peso y -la dosis por área superficial del cuerpo (BSA) por cada paciente se ilustran en la Tabla 14. El área superficial del cuerpo se calculó de acuerdo con la fórmula Mosteller descrita aguí.

Las calificaciones PASI para los pacientes en el grupo de dosis I se muestran en la Tabla 14 junto con la mejora en por ciento en la calificación PASI de línea base.

Grupo de Dosis II Seis pacientes del grupo de dosis II recibieron una sola inyección intravenosa de 2.5 mg de BT061 mientras que dos pacientes del grupo de dosis 2 recibieron el placebo. La dosis por peso y la dosis por área superficial del cuerpo (BSA) para cada paciente se ilustran en la Tabla 15.

Las calificaciones PASI para los pacientes en el grupo de dosis II se ilustran en la Tabla 15 junto con la mejora porcentual en la calificación PASI de linea base. Grupo de Dosis III Seis pacientes del grupo de dosis III recibieron una sola inyección intravenosa de 5.0 mg de BT061, mientras que dos pacientes del grupo de dosis. III recibieron el placebo. La dosis por peso y la dosis por área superficial del cuerpo (BSA) por cada paciente se ilustran en la Tabla 15B. : : Las calificaciones PASI de los pacientes en el grupo de dosis III se ilustran en la Tabla 15B junto con el por ciento de mejora en la calificación PASI de línea base. Grupo de Dosis IV : Seis pacientes del grupo de dosis IV reciben una sola inyección intravenosa de 10.0 mg de BT061 mientras que dos pacientes del grupo de dosis IV reciben el placebo. La dosis por peso y la dosis por área superficial de cuerpo (BSA) para los pacientes se ilustran en la Tabla 15C.

Las calificaciones PASI para los pacientes en el grupo de dosis IV se ilustran en la Tabla 15C junto con el por ciento de mejora en la calificación PASI de linea base.

TABLA 14 - Calificaciones PASI para los pacientes en el grupo de dosis I (dosis intravenosa 0.5 mg) sobre el curso de la prueba 6.5 6.4 Día 28 8.2 (32%) 6.4 (58%) (48%) (47%) 6.1 5.5 Día 42 7.9 (35%) 5.5 (55%) (52%) (55%) 5.7 5.3 Día 56 7.9 (35%) 5.3 (56%) (55%) (56%) 5.1 5.4 Día 75 9.6 (21%) 7.8 (49%) (60%) (55%) TABLA 15A - Calificaciones PASI para los pacientes en el grupo de dosis II (2.5 mg de dosis intravenosa) sobre el curso de la prueba 10.8 15.5 3.9 11.1 Dia 14 (37%) (+12%) . (64%) (40%) 9.7 12.2 3.9 13.7 Día 21 (43%) (12%) (64%) (26%) 8.6 9.4 1.5 7.6 Dia 28 (50%) (32%) (86%) (59%) 8.8 8.5 1.3 10.2 Dia 42 (49%) (38%) (88%) (45%) 6.3 8.3 1.3 Dia 56 - (63%) (40%) (88%) 6.0 5.6 1.9 9.2 Dia 75 (65%) (59%) (83%) (51%) 4A (continúa) Paciente 5 6 7 8 Dosis Reí. I^g/kg] / 28.4 / 39.4 / 26.5 / 28.4 / [mg/m2] 1.19 1.49 1.17 1.19 Calificación PASI (cambio relativo / mejora de linea base) Linea base 15.0 12.6 13.9 13.5 12.1 12.6 19.5 15.6 Día 5 (19%) (0%) (+40%) (+16%) 14.0 13.0 17.0 14.8 Día 7 (7%) ( +3%) (+22%) (+10%) TABLA 15B - calificaciones PASI para los pacientes en grupo de dosis III (5.0 mg de dosis intravenosa) sobre curso de la prueba Linea 15.8 14.1 17.4 12.4 base 13.0 27.2 17.7 Día 5 12.0 (3%) (18%) (+93%) (+2%) 14.3 18.9 15.6 11.1 Día 7 (9%) (+34%) (10%) (10%) 13.5 30.3 14.0 Dia 14 9.3 (25%) (15%) (+115%) (20%) 10.1 23.1 14.4 Día 21 9.2 (26%) (36%) (+64%) (17%) 9.6 23.1 13.4 10.2 Dia 28 (39%) (+64%) (23%) (18%) 9.2 20.1 14.4 10.2 Dia 42 (42%) (+43%) (17%) (18%) 10.0 20.1 Dia 56 15.8 (9%) - (37%) (+43%) 12.8 22.5 Dia 75 16.0 (8%) 9.0 (27%) (19%) (+60%) Tabla 15B (continúa) Paciente 5 6 7 8 Dosis Reí. [ g/kg]/ 52.4 / 56.8 / 71.4 / 66.2 / [mg/m2] Calificación PASI (cambio relativo / mejora de linea base) Linea base 17.3 12.4 13.5 10.4 16.8 10.6 Día 5 - - (3%) (15%) 17.6 11.4 8.2 Dia 7 11.0 (19%) (+2%) (8%) (21%) 14.4 13.0 7.6 Dia 14 9.4 (30%) (17%) (+5%) (27%) 14.7 11.6 Dia 21 9.4 (30%) - (15%) (6%) 13.8 11.2 8.6 Dia 28 8.3 (39%) (20%) (10%) (17%) 13.2 12.6 Dia 42 8.3 (39%) - (24%) (+2%) 13.2 10.6 Dia 56 9.6 (20%) - (24%) (15%) 13.2 13.2 Dia 75 13.4 (1%) 9.6 (8%) (24%) ( +6%) TABLA 15C - Calificaciones PASI para los pacientes en el grupo de dosis IV (10.0 mg dosis intravenosa) sobre el curso de la prueba 11.0 9.4 22.6 18.8 Día 42 (25%) (15%) ( +5%) (15%) 11.4 9.8 Día 56 (22%) (11%) Día 75 Tabla 15C (continúa) Paciente 5 6 7 8 Dosis Reí. [pg/kg] / 119.6/ 108.8/ 75.9/ 106.6/ [mg/m2] Calificación PASI (cambio relativo / mejora de línea base) Línea base 19.0 11.6 14.0 12.4 11.2 14.2 11.4 Día 5 18.8 (1%) (3%) ( +1%) (8%) 11.2 14.2 8.4 Día 7 18.2 (4%) (3%) ( +1%) (32%) 16..7 Día 14 (12%) Día 21 17.3 (9%) Día 28 Día 42 Dia 56 Dia 75 Además, las calificaciones PASI contra el tiempo para pacientes individuales, se ilustran en la forma de gráfica en las Figuras 12A a 12H y en las Figuras 13A a 13H. Las gráficas ilustradas en las' Figuras 12A a 12H representan calificaciones PASI para pacientes del grupo de dosis I, mientras que las gráficas mostradas en las Figuras 13A a 13H representan calificaciones PASI para pacientes del grupo de dosis II.

Como puede verse de los resultados mostrados en las Tablas 14 y 15, 75% de todos los pacientes del grupo de dosis I y el grupo de dosis II muestran. una clara mejora en sus calificaciones PASI, es decir al menos 40% de mejora sobre el. valor de linea base, después de una sola dosis. Habrá de notarse que 25% de los pacientes en el grupo de dosis I y el grupo de dosis II recibieron un placebo.

De hecho, en ambos grupos de dosis, 50% de los pacientes mostraron al menos 50% de mejora en sus calificaciones PASI, con solo un paciente en el grupo de dosis II ;que muestra una mejora del 88% en la calificación PASI al dia 56, (es decir, el paciente: 3 en la Tabla 15) . Además, el efecto terapéutico es de larga duración incluso a estas bajas dosis, con las mejoras que aún se ven en muchos pacientes al final de la prueba, 75 días después de administración .

Pacientes en el grupo de dosis III también mostraron una mejora en su calificación PASI, con seis de ocho pacientes que muestran una mejora mayor al 20% y dos de estos seis que muestran una mejora mayor al 30%, después de tratamiento. Sin embargo, la mejora no fue tan significante como la que se ve en pacientes del grupo de dosis I y el grupo de dosis II que reciben una menor dosis del anticuerpo. Cierta eficacia también se ve en los pacientes del grupo de dosis IV. : En particular los pacientes 1, 4, 5 y 8 en este grupo de dosis (como se ilustra en la Tabla 15C) muestran una clara mejora en sus calificaciones PASI, aunque esto está limitado en comparación con los pacientes de los grupos de dosis I a III .

El número de pacientes que muestran al menos 40%, 50%, 60% y 75% de mejora en calificación PASI, se ilustra en la Tabla 16.

TABLA 16 - Resumen de Resultados de íos Grupos de Dosis I a III Grupo de Grupo de Grupo de dosis I* dosis II* dosis III* 0.5 mg BT- 2.5 mg BT- 5.0 mg 061 061 BT061 Mejora > 6/8 6/8 1/8 40% pacientes pacientes pacientes Mejora > 4/8 4/8 0/8 50% pacientes pacientes pacientes Mejora > 1/8 2/8 0/8 60% pacientes pacientes pacientes Mejora > 0/8 1/8 0.8 75% pacientes pacientes pacientes * por grupo de dosis: 75% de pacientes recibieron BT061, 25% de pacientes recibieron placebo Las Figuras 14A y 14B proporcionan evidencia fotográfica de la mejora en el nivel de psoriasis antes y después de tratamiento. La Figura 14A: muestra un área de psoriasis en la piel de un paciente en el grupo de dosis II antes de administración. La Figura 14B muestra la misma área de psoriasis 28 días después de administración. Las áreas de mejora están marcadas en la Figura 14B con casillas negras.

De estos resultados, puede verse claramente que BT061 proporciona tratamiento efectivo de psoriasis moderada y severa crónica.

Los resultados de este estudio, en combinación con aquellos anteriormente descritos en el Ejemplo 7 que muestran que incluso altas dosis del anticuerpo de la invención en general son bien toleradas en humanos, demuestran la capacidad de las composiciones farmacéuticas de la invención para proporcionar tratamiento a largo plazo de enfermedades autoinmunes con los regímenes de dosis aquí descritos .

EJEMPLO '9 - Prueba clínica de BT061 en pacientes con artritis' reumatoide La capacidad de BT061 en tratar artritis reumatoide se prueba en pacientes que sufren de esta enfermedad. La prueba comprende un estudio de dosis múltiple' que involucra 96 pacientes, divididos en 12 grupos. - En cada grupo, dos pacientes reciben un placebo mientras que 6 pacientes reciben BT061.. Los pacientes se dosifican una vez a la semana por un periodo de 6 semanas.

Los pacientes se dividen en aquellos que reciben el anticuerpo en forma subcutánea y aquellos que reciben el anticuerpo en forma intravenosa. Los grupos de dosis subcutáneas son: 1.25 mg, 6.25 mg, 12.5 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg y 100 mg. Los grupos de dosis intravenosas son: 0.5 mg, 2 mg, 6.25 mg, 12.5 mg y 25 mg.

En el grupo de dosis subcutáneas de 1.25 mg, los pacientes son numerados 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 y 108. En el grupo de dosis subcutáneas de 6.25 mg, los pacientes son numerados 201-208. En el grupo de dosis subcutáneas de 12.5 mg, los pacientes son numerados 301-308. En el grupo de dosis subcutáneas de 25 mg, los pacientes se numeran 401-408. En el grupo de dosis subcutáneas de 50 mg, los pacientes se numeran 501-508. En el grupo de dosis intravenosas de 6.25 mg, los pacientes son numerados 601-608.

El procedimiento de administración intravenosa y subcutánea fue el mismo que el descrito en el Ejemplo 8 para la prueba de psoriasis.

- El nivel de artritis reumatoide se registra semanalmente al estimar los parámetros ACR y en particular estudiar el número de articulaciones sensibles e hinchadas y seguir los niveles de proteina reactiva C (CRP) y la velocidad de sedimentación de eritrocitos (ESR) . Estos parámetros se estiman antes de la prueba para proporcionar un valor de "linea base" o de referencia en el dia 0, y repetidamente durante el periodo de prueba y posteriormente a 8, 22 y 43 dias después que el periodo de administración se termina (es decir seguimiento (FU = follow up) dia FU 8, dia FU 22 y dia FU 43) .

Las Tablas siguientes proporcionan los datos obtenidos de la prueba. Específicamente, las Tablas 17 a 22 proporcionan el número de articulaciones sensibles e hinchadas durante el curso de la prueba.

Tabla 17 - Recuentos de articulaciones sensibles e hinchadas del grupo de dosis subcutáneas de 1.25 mg.

Visitas Pacientes ArticuDía Dia Dia Dia - 1.25 mg lacioVisi1 8 15 22 grupo de nes ta de SeSeSeSedosis SC (no.) Criba mana mana mana mana 1 2 3 4 Sensible 34 34 32 - - 101 Hinchada 10 10 18 - - sensible 25 26 22 16 16 102 hinchada 12 13 9 10 9 sensible 11 12 12 9 8 103 hinchada 7 8' 8 6 6 sensible 17 10 4 3 20 104 hinchada 8 6 0 0 0 sensible 24 23 22 23 35 105 hinchada 14 14 14 17 18 sensible 20 21 20 13 8 106 hinchada 9 12 9 10 5 sensible 14 14 11 10 16 107 hinchada 8 9 8 8 5 sensible 11 12 10 10 7 108 hinchada 10 11 7 11 10 Tabla 17 (continúa) 14 14 14 11 11 107 5 5 6 6 6 4 8 8 2 13 108 9 11 7 6 8 Tabla 18 - Recuentos de articulaciones sensibles e hinchadas del grupo de dosis subcutáneas de 6.25 mg .

Visitas Pacientes ArtiDia Dia Dia Dia - 6.25 mg culaVisi1 8 15 22 grupo de ciones ta de SeSeSeSedosis SC (no.) Criba mana mana mana mana 1 2 3 4 sensible 16 17 15 14 12 201 hinchada 9 10 7 6 6 sensible 14 10 10 10 8 202 hinchada 10 8: 6 6 4 sensible 15 1 10 8 10 203 hinchada 11 11 10 9 9 sensible 19 22 16 0 0 204 hinchada 10 10 5 0 0 sensible 21 21 0 0 14 205 hinchada 9 9: 0 0 14 sensible 16 16 15 13 13 206 hinchada 10 12 12 10 14 sensible 17 28 28 11 9 207 hinchada 11 12 13 7 10 sensible 13 12 9 8 9 208 hinchada 10 10 9 9 10 Tabla 18 (continúa) Visitas Pacientes Dia Dia - 6.25 mg 29 36 Dia FU Dia FU Dia FU grupo de SeSe43 57 78 dosis SC mana mana SemaSemaSemana 5 6 na 7 na 9 12 15 13 11 9 9 201 .5 6 5 6 6 8 8 8 9 13 202 4 4 4 4 6 10 8 7 5 5 203 10 7 7 6 7 10 2 l-fl 11 0 204 4 0 0 10 0 30 10 37 - 12 205 16 6 25 - 8 17 19 - - 5 206 11 11 - - 4 15 17 14 18 22 207 11 8 10 11 10 11 10 - - 12 208 10 9 - - 8 Tabla 19 - Recuentos de articulaciones sensibles hinchadas del grupo de dosis subcutáneas de 12.5 mg .

Visitas Pacientes - 12..5 ArtiDía Dia Dia Dia mg grupo culaVisi1 8 15 22 de dosis ciones ta de SeSeSeSe¬ SC (no.) Criba mana mana mana mana 1 2 3 4 sensible 18 18 16 16 16 301 hinchada 8 8 8 8 8 sensible 36 36 34 35 31 302 hinchada 20 20 19 19 17 sensible 20 ¦ 19 19 16 15 303 hinchada 10 11 12 13 13 sensible 10 10 10 10 10 304 hinchada 6 6 6 6 6 sensible 16 16 14 14 13 305 hinchada 8 8 8 8 6 sensible 27 27 18 18 12 306 hinchada 14 14 20 11 16 sensible 25 23 23 17 17 307 hinchada 8 8 8 8 8 sensible 20 20 18 8 8 308 hinchada 12 12 8 6 6 Tabla 19 (continúa) 13 13 12 10 10 305 6 6 6 4 4 23 28 - - 29 306 13 17 - - 24 17 17 15 13 11 307 8 8 6 6 4 8 8 8 8 4 308 5 6 6 : 6 4 Tabla 20 - Recuentos de articulaciones sensibles e hinchadas del grupo de dosis subcutáneas de 25 mg.

Visitas Pacientes ArtiCriDia Dia Dia Dia - 25 mg culaba de 1 8 15 22 grupo de ciones VisiSe- SeSeSedosis SC (no.) ta man mana mana mana a 1 2 3 4 sensible 16 17 19 22 13 401 hinchada 10 11 8 9 12 sensible 23 21 10 10 10 402 hinchada 8 11 5 6 6 sensible 10 10 10 8 8 403 hinchada 8 8' 8 6 5 sensible 17 16 15 15 13 404 hinchada 9 11 10 6 7 sensible 10 10 8 8 8 405 hinchada 6 6 4 4 4 sensible 11 11 11 11 11 406 hinchada 6 6 6 6 5 sensible 13 20 16 18 4 407 hinchada 7 10 6 8 0 sensible 11 11 8 8 7 408 hinchada 9 9 5 5 4 Tabla 20 (continúa) 10 10 7 6 8 403 5 5 5 5 5 14 14 16 404 7 7 7 8 8 10 - 10 405 4 4 6 - 6 12 8 8 6 8 406 5 3 3 2 4 2 0 4 14 407 0 0 0 8 5 4 4 - 8 408 6 6 3 - 6 Tabla 21 - Recuentos de articulaciones sensibles adas del grupo de dosis subcutánea de 50 mg Visitas Pacientes ArtiCri¬ - 50 mg culaba Dia Dia Dia grupo de ciones de 1 Dia 8 15 22 dosis SC (no.) ViSeSeSe - Sesita mana mana mana mana 1 2 3 4 sensible 10 10 12 15 12 501 hinchada 10 10 10 10 10 sensible 14 15 11 16 12 502 hinchada 5 9 10 10 7 sensible 13 13 11 7 7 503 hinchada 8 8 8 6 6 sensible 11 12 10 8 7 504 hinchada 8 8 8 6 7 sensible 12 13 8 2 1 505 hinchada 7 7 5 0 0 sensible 36 48 32 506 finchada 8 8 4 sensible 507 hinchada sensible 508 hinchada Tabla 21 (continúa) Visitas Pacientes - Dia 50 mg grupo Día 36 Dia FU Dia FU de dosis SC 29 SeDia FU 57 78 Semamana 43 Semana Semana na 5 6 Semana 7 9 12 15 16 - - 15 501 13 13 - - 13 7 8 502 4 5 6 6 5 5 503 3 3 2 3 11 11 13 504 7 7 8 505 506 507 508 Tabla 22 - Recuentos de articulaciones sensibles das del grupo de dosis intravenosas de 6.25 mg .

Visitas Pacientes ArtiCriDía Dia Dia Dia - 6.25 mg culaba de 1 8 15 22 grupo de ciones VisiSeSeSeSedosis IV (no.) ta mana mana mana mana 1 2 3 4 sensible 23 20 24 39 33 601 hinchada ' 13 15 15 25 26 sensible 41 43 33 15 12 602 hinchada 13 12 8 10 10 sensible 26 22 28 22 24 603 hinchada 10 4 8 4 4 sensible 28 26 31 27 14 604 hinchada 8 8 8 10 6 sensible 34 38 38 36 605 hinchada 22 18 22 20 sensible 12 14 606 hinchada 8 9 sensible 27 27 607 hinchada 17 19 sensible 608 hinchada Tabla 22 (continúa) 30 17 19 14 602 6 5 5 7 24 603 6 10 11 7 9 604 2 2 3 1 605 606 607 608 La Figura 15 muestra el por ciento de pacientes de los grupos de dosis que reciben 1.25 mg, 6.25 mg, 12.5 mg y -25 mg subcutáneos de BT061 logrando cuando menos un 20% de mejora de parámetros ACR relevantes durante el curso de la prueba, y el por ciento de pacientes que logran al menos una respuesta ACR20 en la semana 7.

En particular, puede verse que el 50% de los pacientes en el grupo de dosis subcutáneas de 25 mg (es decir 4 de los 8 pacientes en donde 2 de los pacientes reciben un placebo) logrando al menos un 20% de mejora de parámetros ACR relevantes en · la semana 6. Estas cifras aumentan a 5 de los 8 pacientes en la semana 7, es decir 5 de 8 pacientes lograron al menos ACR20. Un paciente en este grupo de dosis logró una mejora del más del 50% de parámetros ACR relevantes en la semana 5 y 6 (conjunto complete de datos no mostrado) .

• Resultados positivos también se obtuvieron por pacientes en otros grupos de dosis. Un paciente en el grupo de dosis subcutáneas de 6.25 mg, logró al menos un 50% de mejora de parámetros ACR relevantes en la semana 4, o mientras que otro logró al menos un 70% de mejora de parámetros ACR relevantes en la semana 3 (conjunto de datos completo no se muestra) .

Las Figuras 16A y 16B muestran resultados para el número de articulaciones sensibles e hinchadas que exhiben pacientes del grupo de dosis subcutáneas BT061 de 25 mg durante un periodo de seis semanas.1 Varios pacientes exhibieron una reducción en el número de articulaciones sensibles e hinchadas sobre un periodo del tratamiento. Los resultados de un paciente que responde o respondiente y un paciente no respondiente de este . grupo de dosis se muestra en las Figuras 17A y 17B, respectivamente. El respondiente muestra una mejora significante en el número de articulaciones sensibles e hinchadas y en niveles de dolor .

Una reducción en los números de articulaciones sensibles e hinchadas también se ve en pacientes de los otros grupos de dosis. Las Figuras 18A, 18B, 19A y 19B muestran los números de articulaciones sensibles en los grupos de dosis subcutáneas de 1.25 mg, 6.25 mg subcutáneas, 50 mg subcutáneas y 6.25 mg intravenosa respectivamente, sobre el curso de la prueba y en las semanas posteriores.

Estos resultados demuestran la eficacia del agente de la presente invención en el tratamiento de artritis reumatoide dentro de los intervalos de dosis aquí descritos .

Claims (41)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para tratar una enfermedad autoinmune caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un agente capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+, en donde la composición se va a administrar a un sujeto cuando más cada 3 días.

2. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1,. caracterizada porque el periodo entre administraciones es de al menos cuatro semanas.

; 3. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el periodo entre administraciones es de al menos doce semanas.

4. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el periodo entre administraciones es de al menos veinticuatro semanas.

5. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el periodo entre administraciones es de al menos 6:meses calendario.

6. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el periodo entre administraciones es de al menos 1 '¦ año .

7. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición se va a administrar a un sujeto anualmente durante un periodo de 1 a 5 años.

8. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la composición se va a administrar a un sujeto en una dosis del agente de 0.2 mg a 200 mg por dosis.

9. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la composición se va a administrar a un sujeto en una dosis del agente de 0.1 a 60 mg/m2 de área superficial del cuerpo del sujeto.

10. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la composición se va a administrar a un sujeto en una dosis del agente de 1 pg/kg a 2 mg/kg.

11. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el agente está presente en una : concentración desde 10 g/ml' a 150 mg/ml .

12. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la enfermedad autoinmune se elige de psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo 1, enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad de Crohn, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis autoinmune, miastenia gravis autoinmune, lupus sistémico eritematoso y enfermedades relacionadas al trasplante tales como injerto-contra-hospedero o aspectos de tolerancia a órganos en general.

13. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la enfermedad autoinmune es psoriasis.

14. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la enfermedad es artritis reumatoide.

15. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la composición es para administración parenteral.

16. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la composición es para administración intramuscular, administración intravenosa o administración subcutánea.

17. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la enfermedad es psoriasis y la composición es para administración intravenosa o subcutánea.

18. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la composición es para administración : intravenosa y la composición se va a administrar en una dosis de 0.3 mg a 25 mg .

19. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la enfermedad es artritis reumatoide y la composición es para administración intravenosa o subcutánea.

20. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier . reivindicación precedente, caracterizada porque dentro del periodo de 10 minutos después del inicio de la administración a 96 horas después de completar la administración, el nivel de una citoquina en el plasma de sangre del sujeto es menor a 20 veces de incremento del nivel inmediatamente antes de administración y en donde la citoquina se elige de IFN-?, TNF-a, IL-6 y IL-2.

21. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque dentro del periodo de 10 minutos después del inicio de administración a · 96 horas después de terminar la administración, el nivel de una citoquina en el plasma de sangre del sujeto es menor a¦ un incremento de 20 veces el limite superior de valor normal (ULN) , en donde la citoquina se elige de IFN-?, TNF-a, IL-6 y IL-2, y en donde el valor ULN es 3.8, 2.8, 4.4, y 19.4 pg/ml respectivamente .

22. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque dentro del periodo de 72 a 96 horas después de administración, el recuento celular de linfocitos CD4+ en el plasma de sangre del sujeto es al menos 200 células/µ?.

23. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el recuento celular de linfocitos CD4+ en el plasma de sangre del sujeto es al menos 250 células/µ?.

24. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el agente es un anticuerpo monoclonal humanizado o su fragmento o derivado.

25. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el agente es un anticuerpo anti-CD4 o su fragmento o -derivado.

26. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el agente es un anticuerpo anti-CD4 humanizado o su fragmento o derivado que tiene dominios . V definidos por las siguientes secuencias de polipéptidos : - dominio V cadena H: EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLEWIGVISVKSENYG ANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAY GQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 1) - dominio V cadena L : DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIYWYQQKPGQPPKLLIYLASILE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: 2) o dominios V que comprenden secuencias polipéptido que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

27. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el agente es un anticuerpo anti-CD4 humanizado derivado del anticuerpo B-F5 anti-CD4 monoclonal de ratón.

28. Un método de tratamiento de una enfermedad autoinmune, este método comprende administrar un medicamento a un sujeto, en donde el medicamento comprende un agente capaz de activar células T regulatorias CD4+CD25+ y en donde el medicamento se administra al sujeto en una pluralidad de dosis.

29. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el medicamento se administra al sujeto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

30. Un método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el medicamento se administra al sujeto en la dosis especificada en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

31. Un método de tratamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

32. Un método de tratamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque el agente es un anticuerpo anti-CD4 humanizado o su fragmento o derivado, derivado del anticuerpo B-F5 anti-CD4 monoclonal de ratón. 1

33. Un método de tratamiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque el agente es un anticuerpo anti-CD4 humanizado o su fragmento o derivado, que tiene dominios V definidos por las siguientes secuencias polipéptido: - dominio V cadena H: EEQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDCRMYWLRQAPGKGLE IGVISVKSENYG ANYAESVRGRFTISRDDSKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCSASYYRYDVGAWFAYWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 1) - dominio V cadena L: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIY YQQKPGQPPKLLIYLASILE SGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRELPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 2) o dominios V que comprenden secuencias polipéptido que tienen al menos 80% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

34. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque dentro del periodo de 3 a 6 horas después de administración, el recuento celular de linfocitos CD4+ en el plasma de sangre del sujeto es inferior a 250 células/µ?.

35. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizada porque dentro del periodo de 72 a 96 horas después : de administración, el recuento celular de linfocitos CD4+ en el plasma de sangre : del sujeto es igual a o superior a 50% del recuento celular del sujeto inmediatamente antes de administración.

36. Una composición farmacéutica de conformidad con la- reivindicación 13, caracterizada porque la composición es capaz de tratar psoriasis al proporcionar al menos una mejora del 40% en la calificación del área de psoriasis e índice de severidad (PASI) del paciente.

37. Una composición farmacéutica de conformidad con la- reivindicación 13, caracterizada porque la composición es capaz de tratar psoria-sis al proporcionar una mejora de al menos 50% en la calificación de área de psoriasis e índice de severidad (PASI) del paciente.

38. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, caracterizada porque la mejora se ve a 56 días después de administración de una sola dosis de la composición.

39. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36 o 37, caracterizada porque la mejora se ve a 75 días después de administración de una sola dosis de la composición.

40. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, caracterizada porque la dosis del agente es 0.5 mg .

41. Una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, caracterizada porque la dosis del agente es 2.5 mg.