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MX2010010088A - Uso de un sustituto carbono para la produccion de levaduras. - Google Patents

Uso de un sustituto carbono para la produccion de levaduras.

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Publication number
MX2010010088A
MX2010010088A MX2010010088A MX2010010088A MX2010010088A MX 2010010088 A MX2010010088 A MX 2010010088A MX 2010010088 A MX2010010088 A MX 2010010088A MX 2010010088 A MX2010010088 A MX 2010010088A MX 2010010088 A MX2010010088 A MX 2010010088A
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MX
Mexico
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glycerol
strain
mixture
yeast
sucrose
Prior art date
Application number
MX2010010088A
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English (en)
Inventor
Anne-Dominique Quipourt-Isnard
Georges Rene Marcel Parasie
Emmanuel Poilpre
Gilles Georges Albert Stien
Jean-Luc Fuentes
Original Assignee
Lesaffre & Cie
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Filing date
Publication date
Application filed by Lesaffre & Cie filed Critical Lesaffre & Cie
Publication of MX2010010088A publication Critical patent/MX2010010088A/es

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevas cepas de Saccharomyces que pueden producirse en un sustrato carbonado que permite reemplazar total y/o parcialmente la utilización de azúcar, y su utilización para la producción de levaduras, especialmente a escala industrial. Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de producción de levaduras de tipo Saccharomyces en un sustrato carbonado que permite reemplazar total o parcialmente la utilización de azúcar.

Description

USO DE UN SUSTITUTO DE CARBONO PARA LA PRODUCCIÓN DE LEVADURAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a la producción de levadura, especialmente a escala industrial. La presente invención se refiere a la utilización de un sustrato de carbono para sustituir parcialmente o totalmente el uso de azúcar para la producción de levadura, especialmente a escala industrial.
Antecedentes de la Invención La producción de levadura requiere la contribución de diferentes nutrientes que puedan asegurar su crecimiento. Estos nutrientes son especialmente carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, minerales y vitaminas. Entre los medios naturales pueden utilizarse para la producción de levadura, la melaza ocupan un lugar destacado. De hecho, la melaza es relativamente capaz de asegurar la plena contribución de estos nutrientes. La composición de la melaza es en promedio de la siguiente manera: 66% a 73% de azúcar, 15% a 23% de compuestos orgánicos y 10% a 12% de compuestos inorgánicos (como porcentajes de sólidos totales). La fuente de carbono proporcionada por la melaza se compone esencialmente de sacarosa o azúcares derivados de su hidrólisis (glucosa y fructosa).
Sin embargo, la escasez de melaza de caña y remolacha, especialmente vinculados a su utilización para la producción masiva de bioetanol, pone en peligro este tipo de producción. Es particularmente necesario encontrar nuevos sustratos de carbono en sustitución de la sacarosa suministrados por la melaza.
La producción de levadura también se puede realizar en jarabes de glucosa o fructosa, por ejemplo, de la hidrólisis del almidón y, en particular, a partir de cereales (maíz, trigo, arroz) o papas. Sin embargo, estos jarabes son relativamente caros y no representan una solución económicamente viable para sustituir a la sacarosa de la melaza a través de una producción industrial de la levadura.
El género se levadura Saccharomyces puede sintetizar glicerol anaeróbicamente o bajo tensión pronunciada, por ejemplo, en caso de tensión osmótica o calor. La levadura Saccharomyces también es capaz de degradar el glicerol, pero en un metabolismo oxidativo y exclusivamente en la ausencia de represión catabólica por los azúcares. Por lo tanto, la levadura Saccharomyces, puesta en la presencia de glicerol y azúcar en una carga de cultivo, no es capaz de consumir glicerol, de tal forma que queda azúcar residual en el medio.
Por otra parte, en el metabolismo oxidativo, la levadura Saccharomyces cultivada en un sustrato de carbono que consiste sólo de glicerol, el glicerol se consume de forma extremadamente lenta, que no es compatible con una producción de levadura a escala industrial. (Lages y Lucas, 1997, Biochimica et Biophysica Acta).
Por lo tanto, hay una necesidad real de nuevas cepas para la producción de levadura que pueda sustituir total o parcialmente el azúcar como un sustrato de carbono, con rendimientos de producción de levadura compatibles con la explotación económica e industrial, y/o sin pérdida de calidad de la levadura producida.
Breve Descripción de la Invención La presente invención tiene por objeto proporcionar nuevas cepas de Saccharomyces capaces de ser producidas en un sustrato de carbono para reemplazar total y/o parcialmente el azúcar.
Un objeto de la invención es el uso de estas cepas para la producción de levadura, especialmente a escala industrial.
Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para producir levaduras Saccharomyces sobre un sustrato de carbono para sustituir parcial o totalmente el uso de azúcar, tal procedimiento también permite obtener un rendimiento similar al de una producción de un sustrato de azúcar y/o que permita obtener levaduras de calidad similar.
La presente invención se refiere a una cepa de Saccharomyces, caracterizado porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, en condiciones aeróbicas, que consume al menos el 80% del gliceroi de dicha mezcla, la mezcla comprende una proporción de gliceroi de al menos 20% de sacarosa, la suma de las proporciones del gliceroi de la mezcla y azúcar es igual al equivalente del 100% de sacarosa.
La presente invención se refiere también a una cepa según la definición anterior, caracterizada porque consume el 85% mezcla de gliceroi, de preferencia al menos el 90% de gliceroi de la mezcla, preferiblemente por lo menos el 95% del gliceroi de la mezcla, aún más preferiblemente al menos el 98% del gliceroi de la mezcla.
La presente invención se refiere también a una cepa según la definición anterior, caracterizada porque dicha mezcla comprende una proporción de gliceroi de al menos 30% de equivalente de sacarosa, preferentemente al menos 40% de equivalente de sacarosa, preferiblemente 50% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 60% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 70% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 80% sacarosa aún más preferiblemente al menos el 90% sacarosa.
La presente invención se refiere en particular a una cepa según la definición anterior, caracterizado porque se elige entre la especie cerevisiae, boulardii, carlsbergensis y uvarum.
La presente invención se refiere a una cepa según se define arriba, en donde se selecciona a partir de una variante natural y/o una cepa genéticamente modificada.
La presente invención se refiere particularmente a una cepa, según se define arriba, la cual se selecciona de la cepa depositada el 20 de diciembre 2007 ante CNCM con el número de CNCM 1-3886, la cepa depositada el 20 de diciembre de 2007 ante CNCM con el número de CNCM 1-3887, la cepa depositada el 20 de diciembre de 2007 ante CNCM con el número CNCM 1-3888, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4132 y la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4133.
La presente invención se refiere particularmente a una cepa, según se define arriba, en donde se selecciona la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número I-4129, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4130 y la cepa depositada 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4131.
La presente invención se refiere también a la utilización de una cepa según la definición anterior para la producción de la levadura en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que comprende una proporción de glicerol del al menos el 5% de equivalente de azúcar La suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar que es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura de al menos una cepa de Saccharomyces, en donde la cepa consume al menos el 80% del glicerol de dicha mezcla, dicha mezcla comprende una proporción de glicerol al menos el 5% sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar que es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para producir la levadura que comprende las etapas de: introducción de una cepa de levaduras del género Saccharomyces en un termentador, y multiplicación de dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, la mezcla consiste de una proporción de glicerol de al menos el 5% de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento según se define arriba, caracterizado porque al menos el 80% del glicerol de la mezcla se consume en esa cepa, preferentemente al menos el 85% del glicerol de dicha mezcla, preferiblemente por lo menos 90% de glicerol dicha mezcla, aún más preferiblemente al menos el 95% del glicerol de dicha mezcla, aún más preferiblemente al menos el 98% del glicerol de dicha mezcla.
La presente invención se refiere a un procedimiento según se define arriba, que se caracteriza porque la multiplicación de la cepa se realiza de una manera semi-continua o continua.
La presente invención se refiere también a un procedimiento según se define arriba, caracterizado porque dicha mezcla comprende una cantidad de glicerol de al menos 8% de equivalente de sacarosa, preferiblemente al menos 10% de equivalente de sacarosa, preferiblemente en 12% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 15% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 17% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 20% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento según se define arriba, caracterizado porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol al 30% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere a un procedimiento según se define arriba, caracterizado porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol de 40% de equivalente de sacarosa, preferentemente al menos el 50% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 60% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 70% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 80% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 90% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere a un procedimiento según se define arriba, caracterizado porque dicha cepa de levadura es una cepa según la definición anterior.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : Esquema del cartucho de expresión utilizada para integrar el gen STL1 en el genoma de las cepas de levadura.
El gen STL1 está bajo el control del promotor pADH1 y es seguido por la terminación CYCL de levadura. Dos fragmentos recombinogénicos (BUD5-A y BUD5-B) de 500 nucleótidos cada flanco del cartucho de expresión, para garantizar la integración por recombinación homologa del cartucho en el genoma de la levadura después del tratamiento en el lugar BUD5 (YCR038c) localizado en el cromosoma III. El gen que confiere resistencia a geneticina kanMX se inserta adelante del gen, flanqueado por dos sitios loxP.
Figura 2: Nivel de expresión de los genes STI1 en cepas genéticamente modificadas para expresar el gen STL1, después del cultivo en presencia de azúcar.
El gráfico representa la relación entre los niveles de ARNm de las cepas de levaduras que expresan genes mutados STL1 sobre los niveles de ARNm de la correspondiente cepa no mutada (ordenadas). 1 : Relación de los niveles de ARNm de la cepa depositada en CNCM con el número I-3887 de la cepa mutada NCYC 996, 2: Relación de los niveles de ARNm de la cepa depositada en CNCM con el número 1-3888 en la cepa no mutada NCYC 995, 3: Relación de los niveles de ARNm de la cepa depositada en CNCM con el número 1-3886 de la cepa mutada 1-3399.
Figura 3: Cantidad residual de glicerol, después del cultivo semi-continuo de la cepa 1-3887 en comparación con el de la cepa no mutada NCYC 996, en función del tiempo. La mezcla contiene 20% de equivalente de sacarosa glicerol. El eje de la izquierda muestra la cantidad de glicerol (g) y el eje Y a la derecha la cantidad de etanol (en gramos) en el medio libre de levadura. El eje horizontal indica el tiempo (horas). La curva de triángulo representa la cantidad residual de glicerol en el medio libre de levadura en el cultivo de la cepa no mutada NCYC 996 y la curva de cuadros de la cepa 1-3887. La curva de círculo representa la cantidad residual de etanol en el medio libre de levadura en el cultivo de la cepa no mutada NCYC 996 y la curva en forma de diamante de la cepa 1-3887.
Figura 4: Cantidad residual de glicerol, después del cultivo semi-continuo de la cepa 1-3888, en comparación con la cepa no mutada NCYC 995, en función del tiempo. La mezcla contiene 20% glicerol en equivalente de sacarosa. El eje de la izquierda muestra la cantidad de glicerol (g) y el eje Y a la derecha la cantidad de etanol (en gramos) en el medio libre de levadura. El eje horizontal indica el tiempo (horas). La curva de triángulo representa la cantidad residual de glicerol en el medio libre de levadura en el cultivo de la cepa no mutada NCYC 995 y la curva de cuadros de la cepa 1-3888. La curva de círculos representa la cantidad residual de etanol en el medio libre de levadura en el cultivo de la cepa no mutada NCYC 995 y la curva en forma de diamante de la cepa 1-3888.
Figura 5: El rendimiento y la concentración de glicerol residual después del cultivo en el modo de quimiostato de la cepa 1-3887 y la cepa NCYC 996, dependiendo de la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar en el medio de alimentación.
El eje de la izquierda muestra el rendimiento de la cepa como porcentaje en relación con el rendimiento de la cepa 996 NCYC cultivado en ausencia de glicerol. El eje de la derecha muestra la concentración residual de glicerol en el medio libre de levadura (ppm). El eje X muestra la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y de azúcar equivalente de sacarosa. El rendimiento de la producción está representado por cuadros y la concentración residual de glicerol por círculos. Los resultados de la cepa no mutada NCYC 996 (de control) son de color blanco y los de la cepa mutante correspondiente 1-3887 son negros.
Figura 6: El rendimiento y la concentración de glicerol residual después del cultivo en el modo de quimiostato de la I-3888 y cepa NCYC 995, dependiendo de la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar en el medio de alimentación .
El eje de la izquierda muestra el rendimiento de la cepa como porcentaje en relación con el rendimiento de la cepa 995 NCYC cultivado en ausencia de glicerol. El eje de la derecha muestra la concentración residual de glicerol en el medio libre de levadura (ppm) El eje X muestra la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y de azúcar en equivalente de sacarosa. El rendimiento de la producción está representado por cuadros y la concentración residual de glicerol por círculos. Los resultados de la cepa no mutada NCYC 995 (de control) son de color blanco y los de la cepa mutante correspondiente 1-3888 de color negro.
Figura 7: Porcentaje de glicerol consumido después del cultivo en el modo de quimiostato cepa 1-3887 y cepa NCYC 996, dependiendo de la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar en el medio de alimentación.
El porcentaje de consumo de glicerol (ordenada) se administra de acuerdo a la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar en equivalentes de sacarosa (abscisa). El porcentaje de glicerol consumido por la cepa no mutada NCYC 996 (de control) se muestra en blanco y el de la cepa mutante correspondiente 1-3887 en negro.
Figura 8: Porcentaje de glicerol consumido después del cultivo en el modo de quimiostato de la cepa 1-3888 cepa y cepa NCYC 995, dependiendo de la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar en el medio de alimentación.
El porcentaje de consumo de glicerol (ordenada) se administra de acuerdo a la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar en equivalentes de sacarosa (abscisa). El porcentaje de glicerol consumido por la cepa no mutada NCYC 995 (de control) se muestra en blanco y la de la cepa mutante correspondiente 1-3888 en negro.
Figura 9: Porcentaje del glicerol consumido después del cultivo en el modo semi-continuo de variantes naturales en la presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contiene 20% de glicerol en equivalente de sacarosa.
El porcentaje de consumo de glicerol (ordenada) está indicado para diferentes variantes naturales probados (1-53). El porcentaje de glicerol consumido por la cepa no mutada cuyas variantes naturales (denotadas como T) también están indicadas.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a una cepa de Saccharomyces, caracterizada porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, en condiciones aeróbicas, que consume al menos el 80% de glicerol de dicha mezcla, la mezcla comprende una proporción de glicerol de al menos el 20% sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
Sorprendente e inesperadamente, los inventores han obtenido cepas de levadura Saccharomyces capaces de consumir al menos el 80% del glicerol de una mezcla de glicerol y azúcar, junto con su consumo de azúcar, en condiciones aeróbicas en un cultivo semi-continua o continuo.
Los inventores han demostrado que la levadura de panadería industrial convencional, como las cepas depositadas en la NCYC (Colección Nacional de las Culturas de levadura) con los números NCYC996 y NCYC995, consumen glicerol sólo parcialmente en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar en cultivos semi-continuos y/o en cultivos continuos (ver ejemplo 2). Al final del cultivo, el medio de cultivo libre de la levadura a continuación contiene una gran cantidad de glicerol residual que se acumuló durante el cultivo.
Las cepas de la invención se caracterizan por el hecho de que en presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar que consumen al menos el 80% del glicerol de dicha mezcla, el porcentaje dado en peso. En otras palabras, la cepa de la invención utiliza al menos el 80% de la masa total de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar.
La presente invención se refiere a una determinada cepa de Saccharomyces, caracterizado porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, en condiciones aeróbicas, consume por lo menos un 80% del glicerol de dicha mezcla, la mezcla comprende una proporción de glicerol al 20% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa. La determinación del consumo de glicerol se puede hacer mediante la medición de la cantidad residual de glicerol en el medio de cultivo después de un cultivo semi-continuo, o mediante la medición de la cantidad residual de glicerol en el medio extraído en el caso de un cultivo continuo.
En el caso de un cultivo semi-continuo, la medición de la cantidad residual de glicerol en el medio de cultivo se realiza al final del cultivo.
Por "fin del cultivo" se designa el momento en que el suministro de azúcar se detiene.
La duración del cultivo, en particular, es menor o igual a la duración de un cultivo de la misma cepa en una mezcla que contiene 100% de azúcar en equivalente de sacarosa.
La duración del cultivo es particularmente menor a 24 horas.
La duración del cultivo es particularmente mayor a 20 horas.
La duración del cultivo es, por ejemplo 22 horas.
En el caso de un cultivo continuo, la cantidad residual de glicerol se mide en cualquier momento, una vez que el estado de equilibrio se alcanza.
El estado de equilibrio se alcanza cuando las concentraciones en el termentador son estables durante al menos 3 veces de residencia, el tiempo de residencia es la relación 1 /[dilución].
Convencionalmente, las condiciones de cultivo son tales que el metabolismo de la cepa de levadura es principalmente respiratoria y/o de tal manera que prácticamente no hay producción de etanol.
El término "esencialmente" significa que estas condiciones se comprueban en la duración total del cultivo, pero en ocasiones es posible que estas condiciones no sean verificadas por el modo semi-continuo, por ejemplo, durante las primeras horas del cultivo, particularmente durante un período que va desde 1/4 a 1/3 del período de cultivo, especialmente durante las primeras 5 horas del cultivo semi-continuo.
En un modo en quimiostato, las condiciones de cultivo son tales que el metabolismo de la cepa de levadura es respiratoria y/o de tal manera que no hay producción de etanol en el estado estacionario se alcanza.
El término "el metabolismo de la cepa de levadura es esencial para respirar" significa que el carbono se oxida, y no fermenta, la duración total del cultivo, una parte del carbono que pueden ser fermentados de forma transitoria.
La expresión "esencialmente no hay producción de etanol" significa que la concentración de etanol al final del cultivo es inferior al 1%, preferiblemente menor al 0.1%, más preferiblemente inferior al 0,01%, y más preferiblemente menor de 0.001%.
El experto sabe cómo ajustar el cultivo de una determinada cepa de levadura para que las condiciones de cultivo son tales que el metabolismo de la cepa es principalmente respiratorio y/o de tal manera no hay esencialmente producción de etanol.
La cantidad residual de glicerol se mide preferentemente en el medio de cultivo libre de levadura. La cantidad residual de glicerol en el medio de cultivo es, por ejemplo, medida por HPLC o GC, ensayo enzimático u otro procedimiento apropiado.
Las cepas de levadura de la invención son particularmente interesantes, ya que son capaces de consumir glicerol ininterrumpidamente durante un período de producción que sea compatible con una actividad industrial.
El término "capaz de consumir el glicerol de forma continua" significa que esencialmente no hay acumulación de glicerol en la duración total del cultivo, sino un punto de acumulación es posible si el metabolismo de la levadura no es principalmente respiratoria y/o existe una producción de alcohol.
La expresión "mezcla de glicerol y azúcar": designa una mezcla de glicerol y azúcar en proporciones variables, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual a 100% sacarosa.
La mezcla de glicerol y azúcar es la única fuente de azúcar y de glicerol en el medio de cultivo.
La mezcla de glicerol y azúcar se prepara preferiblemente antes de su introducción en el medio de cultivo.
El glicerol, también llamado glicerina o propan-1 ,2,3-triol es un poliol. El glicerol puro se presenta en forma de un líquido viscoso y transparente y es soluble en agua. El glicerol según la invención puede ser utilizado en forma pura y/o en la forma de un producto que contiene glicerol y/o se facilitará en cualquier forma capaz de producir glicerol.
El azúcar es preferiblemente un azúcar disponible de inmediato en la levadura, incluyendo un azúcar simple como la glucosa, fructosa, sacarosa y/o una mezcla de estos azúcares.
El azúcar puede hacerse en forma de jarabe de glucosa y/o jarabes de fructosa y/o hidrolizados de almidón y/o en forma de melaza y/o en forma de una sustancia capaz de dar azúcares asimilables por la cepa de levadura y/o bajo la forma de una mezcla de los mismos.
El azúcar se hace preferiblemente en forma de melaza. La mezcla de glicerol y azúcar es al menos el 90% de la fuente de carbono para la levadura, de preferencia al menos el 95% de la fuente de carbono, preferiblemente por lo menos el 98% de la fuente de carbono. La fuente de carbono en el medio de cultivo, que no sea la mezcla de glicerol y azúcar, por ejemplo, incluye aminoácidos, lípidos, ácidos orgánicos presentes naturalmente en la melaza o hidrolizados crudos de origen agrícola.
La expresión "suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar que es igual al 100% en equivalente de sacarosa" significa que cuando la proporción de glicerol se expresa en términos de equivalente de sacarosa es de x%, la proporción de azúcar en la mezcla, expresada en equivalente sacarosa es (100-x)%.
La equivalencia se define en relación con el metabolismo de la glucólisis, por el que un mol de sacarosa se convierte en un mol de fructosa y un mol de glucosa es convertido a cuatro moles de piruvato (ver Principes de la Biochimie, Lehninger, 1994).
Un mol de glucosa se convierte en dos moles de piruvato y un mol de fructosa en dos moles de piruvato.
De acuerdo con el metabolismo de la misma, un mol de glicerol se convierte en un mol de piruvato.
Por lo tanto, cuatro moles de glicerol corresponden a un mol de equivalente de sacarosa.
Dos moles de glucosa corresponden a un mol de equivalente de sacarosa.
Dos moles de fructosa corresponden a un mol de equivalente sacarosa. 1.076 g de glicerol aquí corresponden a un gramo de sacarosa. Por ejemplo, un kilogramo de una mezcla que contiene al final 250 g/kg de sacarosa y una proporción equivalente de sacarosa, 20% glicerol equivalente de sacarosa se compone de 50 g de sacarosa en forma de glicerol y 200 g de equivalente de sacarosa en forma de azúcar. Dada una melaza bruta con un contenido de azúcar de 500 g/kg equivalente de sacarosa, para preparar un kilogramo de esta mezcla se a mezclar 50 * 1.076 g = 54 g de glicerol puro (que corresponde a 50 g de sacarosa en forma de glicerol) y 400 g de melaza cruda (lo que equivale a 200 g de sacarosa en forma de azúcar), entonces el agua pura se agrega para obtoner una masa final de mezcla de 1 kilogramo.
El medio de cultivo se llama aquí un medio de cultivo fresco donde no ha habido presencia de cepas de levadura.
El medio de cultivo se llama aquí medio de reacción cuando se pone en la presencia de en cepas de levadura.
La cepa de levadura de acuerdo con la invención es la presencia de medio de cultivo en condiciones aeróbicas.
Preferiblemente, la cepa de levadura de acuerdo con la invención es la presencia de medio de cultivo en un fermentador apto para la producción de levadura. El volumen del fermentador puede variar desde unos pocos milímetros a varios metros cúbicos.
El fermentador es también conocido como reactor a partir de este momento.
El fermentador es preferentemente adecuado para el cultivo en condiciones aeróbicas.
La cepa de levadura se pone en la presencia de medio de cultivo en el marco de un cultivo en un modo semi-continuo y/o en modo continuo.
Por el término "cultivo en modo semi-continuo" o "cultivo semi-continuo" o "modo semi-continuo", también llamado ""alimentación por cargas" significa aquí que un cultivo en un fermentador se alimenta progresivamente por el medio de cultivo, pero ninguna cantidad de medio es retirada del mismo. En este procedimiento, el volumen de cultivo es variable (y en general cada vez mayor) en el fermentador. La velocidad de avance en un cultivo en modo semi-continuo es constante o variable.
Un ejemplo de cultivo semi-continuo es un cultivo realizado bajo las condiciones descritas en el libro de referencia "Yeast Technology", capítulo 6, 2a edición, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
Por el término "cultivo continuo" o "cultivo en modo continuo" o "modo continuo" se entiende aquí un cultivo en un fermentador en el que el fermentador se alimenta con medio de cultivo fresco y una parte de la reacción es retirada. En un cultivo continuo, el volumen de cultivo en el fermentador es variable o constante.
Según un modo de realización particular del cultivo en el modo continuo, la velocidad de avance y la tasa de extracción son iguales. Un ejemplo de cultivo continuo es un cultivo realizado bajo las condiciones descritas en el libro de referencia "Yeast Technology", capítulo 6, 2a edición, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
El cultivo en quimiostato es una forma especial de cultivo continuo. En un cultivo en el modo de quimiostato, diversos parámetros tales como oxígeno disuelto, concentración de nutrientes, pH, densidad celular, se mantienen constantes. El medio de cultivo incluye componentes tales como la mezcla de glicerol y azúcar y otros elementos necesarios para el crecimiento de la levadura.
Otros elementos necesarios para el crecimiento de la levadura son: por lo menos una fuente de nitrógeno, por lo menos una fuente de azufre, por lo menos una fuente de fósforo, por lo menos una fuente de vitaminas y/o por lo menos una fuente de minerales.
Estos otros componentes se hacen en cantidades suficientes como para no ser un factor limitante para el crecimiento de la levadura y para mantener un metabolismo principalmente respiratorio.
La fuente de nitrógeno, por ejemplo, siempre está en forma de sulfato de amonio, hidróxido de amonio, fosfato diamonio, amoníaco, urea y/o una combinación entre ellos.
La fuente de azufre, por ejemplo, se provee en forma de sulfato de amonio, sulfato de magnesio, ácido sulfúrico y/o una combinación de ambos.
La fuente de fósforo, por ejemplo, se presenta en forma de ácido fosfórico, fosfato de potasio, fosfato diamónico, mono-fosfato de amonio y/o una combinación de los mismos.
La fuente de vitaminas se da por ejemplo en forma de melaza, hidrolizado de levadura, solución de vitaminas puras o una mezcla de vitaminas puras y/o una combinación de éstos.
La fuente de vitaminas en la levadura aporta todas las vitaminas en cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en la literatura. Varias fuentes de vitaminas pueden estar asociadas.
La fuente de minerales como se proporciona por ejemplo en forma de melaza, una mezcla de minerales y/o su combinación.
La fuente de minerales aporta a la levadura todos los macronutrientes y micronutrientes en cantidades al menos equivalentes a las recomendadas en la literatura. Varias fuentes de minerales se pueden asociar.
La misma sustancia puede aportar muchos elementos diferentes.
Las cepas de levadura de la invención son especialmente elegidas entre las cepas que permiten producir cepas de levadura de panadería, levadura de cerveza, levadura de vino, de la levadura para producir alcohol, y/o de levadura para la producción de proteínas recombinantes, por ejemplo, para la producción de proteínas terapéuticas.
El consumo de glicerol de una cepa de Saccharomyces puede, por ejemplo, medirse en las condiciones descritas en el Ejemplo 2, para determinar si esa cepa en presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, en condiciones aeróbicas, consume al menos un 80% del glicerol de la mezcla, tal mezcla comprende una proporción de glicerol de 20% en equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones de mezcla de glicerol y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere también a una cepa de Saccharomyces, caracterizada porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, en condiciones aeróbicas, consume por lo menos un 80% del glicerol de dicha mezcla, tal mezcla comprende una proporción de glicerol de 30% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere también a una cepa de Saccharomyces, caracterizado porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, en condiciones aeróbicas, consume de por lo menos un 80% del glicerol de dicha mezcla, la mezcla comprende una proporción de glicerol de 40% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente a una cepa, según la definición anterior, caracterizada porque consume el 85% del glicerol de la mezcla, de preferencia al menos el 90% del glicerol de la mezcla, preferiblemente por lo menos el 95% de mezcla de glicerol, aún más preferiblemente al menos el 98% del glicerol de la mezcla.
La presente invención se refiere particularmente a una cepa, según la definición anterior, caracterizada porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol del 30% de equivalente de sacarosa, preferentemente al menos el 40% de equivalente de sacarosa, preferiblemente 50% de equivalente de sacarosa, más preferiblemente al menos el 60% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 70% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 80% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 90% de equivalente sacarosa .
La presente invención se refiere también a una cepa según la definición anterior, caracterizado porque la proporción de glicerol en dicha mezcla es mayor a 95% de equivalente de sacarosa, preferiblemente 90% de equivalente de sacarosa, más preferiblemente 85% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente a una cepa, según se define arriba, que se caracteriza porque la proporción de glicerol en la mezcla está comprendida entre 20% a 90%, de preferencia de 20% a 80% de equivalente de sacarosa, más preferentemente de 30% a 70% de equivalente de sacarosa, preferiblemente el 30% a 60% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere a una cepa según la definición anterior, caracterizada porque se elige entre la especie cerevisiae, boulardii carlsbergensis y uvarum.
Una cepa preferida de la invención es una cepa de Saccharomyces cerevisiae .
La presente invención se refiere a una cepa según se define arriba, en donde se selecciona a partir de una variante natural y/o una cepa genéticamente modificada.
El término "variante natural" significa aquí una variedad obtenida por cruzamiento y/o la hibridación de las cepas de levadura y/o los obtenidos por mutación espontánea o por mutagénesis espontánea, por ejemplo después de la exposición a condiciones de tensión, el tratamiento UV o el tratamiento con mutágenos.
El patrimonio genético de una variante natural no ha sido modificado por ingeniería genética.
Dos procedimientos de mutagénesis espontánea pueden ser usados por ejemplo para obtener variantes naturales de la invención (véase también el ejemplo 3). El primer procedimiento consiste en una selección de variantes naturales en función de su consumo de glicerol y el rendimiento directamente después de la exposición a la radiación UV seguido por el aislamiento de los clones.
El segundo procedimiento incluye: - Una primera etapa de exposición a la radiación UV, una segunda etapa del cultivo en el modo de quimiostato en presencia de una mezcla de azúcar y glicerol, - Una tercera etapa de aislamiento de los clones, y - Una cuarta etapa de la selección de variantes naturales basado en el consumo de glicerol y el rendimiento.
Este segundo procedimiento se utiliza para enriquecer el cultivo en las variantes naturales que consumen glicerol en presencia de azúcar, antes de iniciar la etapa de selección.
La invención particularmente tiene por objeto la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número de CNCM 1-4129, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4130 CNCM y la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número de CNCM 1-4131.
Estas tres cepas se obtuvieron por mutagénesis espontánea después del tratamiento UV y una selección sobre la base del consumo de glicerol y el rendimiento (véase el ejemplo 3).
La presente invención se refiere a una variante natural según se define arriba, que se caracteriza porque es la cepa número CNCM 1-4129.
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol de 20% equivalente sacarosa, la cepa de levadura CNCM 1-4129 consume más del 95% del glicerol de la mezcla.
En cultivo continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar, la cepa de levadura CNCM I- 4129 consume más del 80% del glicerol de la mezcla, cuando la proporción de glicerol en la mezcla varía de 20% a 50%.
La presente invención se refiere a una variante natural según se define arriba, que se caracteriza porque es la cepa número CNCM 1-4130.
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol de 20% de equivalente de sacarosa, la cepa de levadura CNCM 1-4130 consume más del 95% del glicerol de la mezcla .
En cultivo continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar, la cepa de levadura CNCM I- 4130 consume más del 80% del glicerol de la mezcla, mientras que la proporción de glicerol en la mezcla es de 20% a 50 %.
La presente invención se refiere a una variante natural según se define arriba, que se caracteriza porque es la cepa número CNCM 1-4131.
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol del 20% de equivalente de sacarosa, cepa de levadura CNCM 1-4131 consume más del 95% del glicerol de la mezcla.
En cultivo continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar, la cepa de levadura CNCM I-4131 consume más del 80% del glicerol de la mezcla donde la proporción de glicerol en la mezcla varía de 20% a 50 %.
La expresión "cepa modificada genéticamente " o cepa GM denota una cepa cuyo material genético ha sido modificado por ingeniería genética.
Una cepa genéticamente modificada puede haber sido modificada a partir de su ADN endógeno, por ejemplo, mediante mutación puntual, parcial o total de los genes. La mutación puede consistir en una inserción, eliminación y/o sustitución de al menos un nucleótido.
La mutación provoca de preferencia un cambio del producto después de la transcripción y/o traducción de genes. La mutación puede dar lugar al truncamiento del producto genético, un cambio de al menos un aminoácido en la secuencia del producto genético y/o un cambio del marco de lectura durante la transcripción.
Una cepa genéticamente modificada puede comprender un ADN exógeno, integrado o no en al menos uno de los cromosomas de la levadura y/o por lo menos en un plásmido de levadura.
Una cepa modificada genéticamente tiene un ADN exógeno preferido integrado en al menos uno de los cromosomas de la levadura.
El ADN exógeno puede ser un fragmento de ADN - por ejemplo, un fragmento del gen, un cartucho de expresión completo o parcial - y/o un plásmido.
Cuando la cepa genéticamente modificada comprende un ADN exógeno integrado, se trata de una integración única o de una integración de múltiples copias.
La presente invención se refiere particularmente a una cepa, según la definición anterior, caracterizada porque se trata de una cepa genéticamente modificada en al menos un gen implicado en al menos una vía metabólica del glicerol.
La presente invención se refiere a una cepa según la definición anterior, caracterizado porque se trata de una cepa genéticamente modificada en al menos un gen implicado en el catabolismo de glicerol o en la regulación del catabolismo del glicerol.
La presente invención se refiere más concretamente a una cepa según la definición anterior, caracterizado porque se trata de una cepa genéticamente modificada en al menos un gen seleccionado entre los genes STL1, GUPI, GUP2, GUT1 , GUT2, FPS1 y/o ADR1 y/o un gen implicado en la represión de la glucosa y/o una combinación de éstos.
Una cepa genéticamente modificada de la invención presenta en particular un aumento sobre todo de la expresión de un gen y/o disminución de la expresión de un gen y/o expresión constitutiva y/o la expresión diferencial de un gen y/o expresión de un gen ausente en la cepa de levadura original.
La presente invención se refiere más concretamente a una cepa según la definición anterior, caracterizado porque se trata de una cepa genéticamente modificada en al menos un gen seleccionado entre los genes STL1, GUPI, GUP2, GUTL, GUT2 y/o una combinación de los mismos.
La modificación de las cepas de la invención se realiza utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia (ver Molecular Cloning 3a. edición, Sambrook y Russell).
Una cepa de levadura genéticamente modificada de acuerdo con la invención de preferencia consume más del 90% del glicerol del glicerol de la mezcla y azúcar.
El gen STL1 codifica la permeasa a glicerol lo que, en particular, permite la entrada de glicerol en la célula.
Una cepa de la invención modificada genéticamente en el gen STL1 expresa el gen STL1 en la presencia de azúcar.
Una cepa genéticamente modificada en el gen STL1 preferida de acuerdo con la invención sobre-expresa el gen STL1 en presencia de azúcar en comparación con la cepa no mutada correspondiente.
El gen STL1 en la cepa genéticamente modificada de la invención está, por ejemplo bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducido por la glucosa.
Una cepa genéticamente modificada en el gen STL1 preferida de acuerdo con la invención tiene una tasa de transcripción de genes, por lo menos STL1 multiplicado por 100 en comparación con los correspondientes la cepa no mutada, preferiblemente por lo menos, multiplicado por 200 más preferiblemente por lo menos 250, la tasa de transcripción se calcula después de una PCR cuantitativa al ADNc obtenido por transcripción inversa.
El gen GUPI codifica a una proteína de membrana involucrada en el transporte activo del glicerol en la célula.
Una cepa de la invención genéticamente modificada al nivel de GUP1 expresa el gen GUP1 en presencia de azúcar.
El gen codifica una proteína de membrana GUP2 involucrada en el transporte activo de glicerol en la célula.
Una cepa de la invención genéticamente modificada al nivel de GUP2 expresa el gen GUP2 en presencia de azúcar.
El gen FPS1 o YLL043W codifica una proteína de la membrana de transporte que permite en particular la exportación del glicerol.
Una cepa de la invención genéticamente modificada al nivel FPS1 no expresa el gen FPS1, por ejemplo debido a una eliminación del gen.
El gen ADR 1 o YDR216W codifica un activador transcripcional implicado en la expresión de genes implicados en las vías de uso de etanol, glicerol y ácidos grasos. Estos genes están regulados por la represión de la glucosa.
Una cepa de la invención genéticamente modificada a nivel ADR1 expresa el gen ADR1 en presencia de azúcar.
El gen GUT1 O YHL032C codifica una cinasa de glicerol, que convierte el glicerol a glicerol-3-fosfato.
Una cepa de la invención genéticamente modificada al nivel de GUT1 expresa el gen GUT1 en presencia de azúcar.
El gen GUT2 O YIL155C codifica la deshidrogenasa de glicerol-3-fosfato, que convierte el glicerol-3-fosf ato de DHAP (fosfato de dihidroxiacetona).
Una cepa de la invención genéticamente modificada al nivel de GUT2 expresa el gen GUT2 en presencia de azúcar.
Una cepa de acuerdo con la invención es, por ejemplo, modificada por la transformación con un cartucho de expresión que permite la expresión de un gen según se define arriba, especialmente en presencia de azúcar.
El cartucho de expresión comprende un promotor, un gen de interés y un terminador. El terminador es una secuencia o una secuencia de terminación artificial de levadura.
El promotor es un promotor constitutivo o inducible.
Un promotor preferido de esta invención es el promotor pADHI inducible por la glucosa.
La presente invención se refiere a una cepa según la definición anterior, que se caracteriza porque es la cepa depositada el 20 de diciembre de 2007 ante CNCM con el número de CNCM 1-3886.
El número cepa de levadura CNCM 1-3886 se obtuvo mediante la integración del cartucho de expresión que se muestra en la figura 2 en el genoma de la cepa depositada en CNCM con el número CNCM 1-3399.
La cepa de levadura número CNCM 1-3886 expresa el gen STL1 fuertemente en la presencia de azúcar (los niveles de ARNm de más de 270 veces los de la cepa mutada I-3399).
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol del 20% de equivalente sacarosa, la cepa de levadura CNCM I-3886 consume más del 95% del glicerol de la mezcla.
En el cultivo continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar, la cepa de levadura CNCM I-3886 consume más del 90% del glicerol de la mezcla, mientras que la proporción de glicerol en dichos rangos de mezcla varía de 20% a 80 %.
La presente invención se refiere a una cepa según la definición anterior, que se caracteriza porque es la cepa depositada el 20 de diciembre de 2007 ante CNCM con el número de CNCM 1-3887.
El número cepa de levadura CNCM 1-3887 se obtuvo mediante la integración del cartucho de expresión que se muestra en la figura 2 en el genoma de la cepa depositada en la NCYC (Colección Nacional de Cultivos of Levaduras) con el número NCYC 996.
La cepa de levadura número CNCM 1-3887 expresa el gen STL1 fuertemente en la presencia de azúcar (los niveles de ARNm son más de 270 veces mayores que los cepa no mutada NCYC 996).
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol 20% en equivalente de sacarosa, la cepa de levadura CNCM 1-3887 consume más del 95% del glicerol de la mezcla .
En el cultivo continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar, la cepa de levadura CNCM 1-3887 consume más del 90% del glicerol de la mezcla siendo la proporción de glicerol en la mezcla de 20% a 80 %.
La presente invención se refiere a una cepa según la definición anterior, que se caracteriza porque es la cepa depositada el 20 de diciembre de 2007 ante CNCM con el número de CNCM 1-3888.
La cepa de levadura número CNCM 1-3888 se obtuvo mediante la integración del cartucho de expresión que se muestra en la figura 2 en el genoma de la cepa depositada en la la NCYC (Colección Nacional de Cultivos of Levaduras) con el número NCYC 995.
La cepa de levadura número CNCM 1-3888 expresa el gen STL1 fuertemente en la presencia de azúcar (niveles de ARNm de más de 300 veces mayor que los de la cepa no mutada NCYC 995).
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol del 20% de equivalente de sacarosa, la cepa de levadura CNCM 1-3888 consume más del 95% del glicerol de la mezcla.
En cultivo continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar, la cepa de levadura CNCM I-3888 consume más del 90% del glicerol de la mezcla, donde la proporción de glicerol en la mezcla de 20% a 80 %.
La presente invención se refiere a una cepa según la definición anterior, que se caracteriza porque es la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número de CNCM 1-4132.
La cepa de levadura CNCM 1-4132 se obtuvo mediante la integración del cartucho de expresión que se muestra en la figura 2 en el genoma de la cepa depositada el 04 de septiembre 2008 en el CNCM con el número 1-4072.
La cepa de levadura número CNCM 1-4132 expresa el gen STL1 fuertemente en la presencia de azúcar (niveles de ARNm mayor a 200 veces los de la de la cepa mutada I-4072).
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivo que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol del 20% de equivalente de sacarosa, la cepa de levadura CNCM 1-4132 consume más del 80% del glicerol de la mezcla.
La presente invención se refiere a una cepa según la definición anterior, que se caracteriza porque es la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número de CNCM 1-4133.
La cepa de levadura CNCM 1-4133 se obtuvo mediante la integración del cartucho de expresión se muestra en la figura 2 en el genoma de la cepa depositada el 04 de septiembre 2008 en el CNCM con el número 1-4071.
La cepa de levadura CNCM 1-4133 número expresa el gen STL1 fuertemente en la presencia de azúcar (los niveles de ARNm de más de 200 veces la de la cepa mutada 1-4071).
En el cultivo semi-continuo en un medio de cultivó que contiene una mezcla de glicerol y azúcar con una proporción de glicerol del 20% de equivalente de sacarosa, la cepa de levadura CNCM 1-4133 consume más del 80% del glicerol de la mezcla.
La presente invención se refiere también a una cepa de Saccharomyces derivada de la cepa CNCM I-3886, de la cepa CNCM I-3887, la cepa CNCM I-3888, la cepa CNCM 1-4132, la cepa CNCM 1-4133, la cepa CNCM 1-4129, la cepa CNCM I-4130 o la cepa CNCM 1-4131, caracterizado porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar que consume por lo menos el 80% de glicerol de la mezcla, la mezcla contiene una proporción de glicerol de al menos el 20% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones de glicerol de la mezcla y azúcar es igual a 100% equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere también a una cepa de Saccharomyces derivada de la cepa CNCM 1-3886, de la cepa CNCM 1-3887, la cepa CNCM 1-3888, de la cepa CNCM 1-4132, la cepa CNCM 1-4133, la cepa CNCM 1-4129, de la cepa CNCM 1-4130 o de la cepa CNCM 1-4131, caracterizada porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, que consume al menos el 80% del glicerol de dicha mezcla, la mezcla contiene una proporción de glicerol de al menos el 20% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones de glicerol de la mezcla y azúcar es igual a 100% equivalente de sacarosa.
Con la expresión "cepa derivada" se entiende una cepa obtenida por cualquier medio, por ejemplo, uno o más cruces y/o por la mutación y/o la transformación genética.
La presente invención se refiere también a la utilización de una cepa de levadura según se define arriba, para la producción de la levadura en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar, la mezcla dicha comprende una proporción de glicerol de al menos el 5% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones de mezcla de glicerol y azúcar es igual a 100% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente al uso de una cepa de levadura según se define arriba, para la producción industrial de levadura en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar.
La presente invención se refiere a la utilización de una cepa de levadura según se define arriba, para la producción de la levadura, la producción se realiza de acuerdo con un esquema convencional bien conocido por los expertos en la materia, pero que se realiza en condiciones aeróbicas y el uso de una mezcla de glicerol y azúcar como fuente de carbono.
La presente invención se refiere también al uso de una >mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura de al menos una cepa de Saccharomyces, caracterizado porque la cepa consume al menos el 80% de la mezcla de glicerol, la mezcla e comprende una proporción de glicerol de al menos el 5% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol y el azúcar de la mezcla es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
Estas operaciones son de particular interés para la producción de levadura a escala industrial.
La expresión por lo menos una cepa de Saccharomyces significa que la producción de levadura se puede hacer de varias cepas de levaduras diferentes de la misma especie o de especies diferentes.
Preferiblemente, la producción de levadura se hace de una sola cepa de la levadura. La mezcla de glicerol y azúcar es como se definió anteriormente.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizada porque la producción de levadura se realiza de acuerdo con modo semi-continuo o continuo.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizado porque la producción de levadura se realiza en condiciones aeróbicas.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizado porque la producción de levadura se realiza durante un período de preferencia menor a 48 horas, más preferiblemente menor a 36 horas, preferiblemente menor a 24 horas.
Ventajosamente, la duración de la producción es de 10 a 24 horas.
La duración de la producción es, por ejemplo es de 22 horas.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizada porque el rendimiento de la producción es similar a la obtenida con una cepa de levadura producida de forma estándar en ausencia de glicerol.
Por ejemplo, el rendimiento de la producción de las levaduras de la invención es superior al 85%, preferiblemente superior al 90%, preferiblemente superior al 95% de rendimiento de una cepa estándar producida en ausencia de glicerol .
Con el término cepa estándar se designa por ejemplo la levadura para pan depositada ante el NCYC con el número NCYC 995.
Con el término "rendimiento" o "rendimiento de la producción" o "rendimiento de la producción de biomasa" se designa la relación entre el peso de la levadura producida en la masa de sacarosa utilizada.
La masa equivalente de sacarosa utilizada se compone de la masa equivalente de sacarosa consumida y no consumida.
El medio de cultivo es como se definió anteriormente.
En otro procedimiento de realización, la presente invención tiene por objeto la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizada porque el medio de cultivo incluye otra fuente carbono asimilable por la cepa de levadura. Otra fuente de carbono asimilado por la cepa de levadura es, por ejemplo etanol. En tal modo de realización, la mezcla de glicerol y azúcar es al menos el 70% de la fuente de carbono para la levadura, de preferencia al menos el 80% de la fuente de carbono para la levadura, preferiblemente por lo menos el 90% de la fuente de carbono para la levadura.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizada porque el medio de cultivo completo no está en la presencia de la cepa levadura al comienzo del cultivo.
El medio de cultivo es preferentemente llevado a la cepa de levadura para escalonada en el tiempo a una velocidad constante o variable, los distintos componentes del medio de cultivo se pueden introducir simultáneamente o por separado.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizada porque la mezcla de glicerol y azúcar se introduce en el medio de cultivo de forma escalonada en el tiempo.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizado porque la mezcla de glicerol y azúcar se introduce en el medio de cultivo por separado de los otros componentes del medio de cultivo.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según la definición anterior, caracterizado porque la mezcla de glicerol y azúcar se prepara antes de su introducción en el medio el cultivo y/o se forma en el medio de cultivo cuando el glicerol y azúcar se introducen por separado.
La presente invención se refiere a la utilización de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura según se define arriba, que se caracteriza en que la cepa se cultiva en presencia de todo el glicerol y/o la totalidad de la mezcla de azúcar desde el principio del cultivo.
La presente invención se refiere particularmente al uso según se define arriba, con una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura de al menos una cepa de Saccharomyces, en donde la cepa consume menos del 85% del glicerol de la mezcla, de preferencia menos del 90% del glicerol de la mezcla, preferiblemente por lo menos 95% del glicerol de la mezcla, aún más preferiblemente al menos el 98% del glicerol de la mezcla.
La presente invención se refiere también al uso según se define arriba, con una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura, caracterizado porque dicha mezcla comprende una cantidad de glicerol de al m3enos 8% del equivalente sacarosa, de preferencia al menos el 10% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 12% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 15% equivalente de sacarosa, aún más preferiblemente al menos 17% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 20% sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente al uso según se define arriba, con una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura, que se caracteriza porque la proporción de glicerol en la mezcla está comprendido entre 8% y 30% de equivalente de sacarosa, de preferencia del 10% al 20% de equivalente de sacarosa, preferiblemente del 12% al 17% de sacarosa.
La presente invención se refiere también al uso según se define arriba, de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura, caracterizado porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol de al menos 30% o equivalente de sacarosa, de preferencia al menos el 40% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 50% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 60% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 70% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 80 % de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 90% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere también al uso según se define arriba, de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura, que se caracteriza en que la proporción de glicerol en dicha mezcla es más del 95% equivalente sacarosa, preferiblemente el 90% de equivalente de sacarosa, todavía más preferiblemente 85% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente al uso según se define arriba, con una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura, que se caracteriza porque la proporción de glicerol en la mezcla asciende a de 30% a 90% de equivalente de sacarosa, de preferencia del 40% al 80% en peso de equivalente de sacarosa, preferiblemente del 50% al 70% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere al uso según se define arriba de una mezcla de glicerol y la producción de azúcar de la cepa de levadura, en donde la cepa se ha seleccionado entre las especies de cerevisiae, boulardii, carlsbergensis y uvarum.
La presente invención se refiere al uso según se define arriba, de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura de al menos una cepa de Saccharomyces, en donde la cepa se selecciona de un variante natural y /o una cepa genéticamente modificada.
La presente invención se refiere al uso según se define arriba, de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura de al menos una cepa de Saccharomyces, en donde la cepa se selecciona del la cepa depositada el 20 de diciembre 2007 en el CNCM con el número de CNCM 1-3886, la cepa depositada 20 de diciembre 2007 en el CNCM con el número de CNCM 1-3887, la cepa depositada el 20 de diciembre 2007 en el CNCM con el número CNCM 1-3888, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4132, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4133, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4129, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número I-4130 o la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número del N 0 1-4131, o una mezcla de los mismos.
La presente invención se refiere también a la levadura obtenida por el uso según se define arriba, con una mezcla de glicerol y azúcar.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para producir la levadura que comprende las etapas de: introducción de una cepa de levaduras del género Saccharomyces en un fermentador, y multiplicar dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, la mezcla contiene una proporción de glicerol de al menos el 5% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar que es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
La mezcla de glicerol y azúcar es como se definió anteriormente.
El medio de cultivo es como se definió anteriormente.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de levadura según se define arriba, que se caracteriza en que la multiplicación de la cepa se realiza de un modo continuo o según un modo continuo, los modos semi-continuo y continuo son según se define arriba.
El tiempo de cultivo del procedimiento de producción de levadura de la invención es preferiblemente menor a 48 horas, preferiblemente menos de 36 horas, preferiblemente menos de 24 horas.
Ventajosamente, la duración del procedimiento de crecimiento para la producción de levadura de la invención está comprendida entre 10 y 24 horas.
La duración de la producción es por ejemplo 22 horas. El pH se ajusta preferiblemente a un valor de 4 a 6.5, por ejemplo mediante la adición simultánea de ácidos o bases.
La temperatura se ajusta preferiblemente a un valor de 30°C a 34°C, por ejemplo, al calentar o enfriar el termentador.
Ventajosamente, el procedimiento de producción de levadura de acuerdo con la invención da rendimientos similares a los obtenidos con las cepas de la levadura normal en ausencia de glicerol.
Por ejemplo, el rendimiento de la producción de las levaduras de la invención es superior al 85%, preferiblemente superior al 90%, preferiblemente superior al 95% de rendimiento de una cepa estándar producida en ausencia de glicerol.
Como la cepa estándar se pueden citar, por ejemplo la levadura de pan, depositada ante NCYC con el número NCYC 995.
Con "rendimiento" se designa la relación entre el peso de la levadura producida en la masa de la aplicación equivalente de sacarosa.
La masa de equivalente de sacarosa utilizada se compone de la masa equivalente de sacarosa consumida y la no consumida.
Las cepas de levaduras obtenidas mediante el cultivo de la invención en la presencia de una mezcla de glicerol y azúcar y/o levaduras obtenidas por el procedimiento de producción de la levadura de la invención tienen cualidades similares a las levaduras convencionales utilizadas y producidas sobre un sustrato de carbono tipo azúcar (en ausencia de glicerol).
Con el término "calidad", nos referimos tanto a la calidad funcional y a la calidad de conservación.
Por ejemplo, las levaduras tienen cualidades similares en términos de resistencia a la deshidratación que, en términos de eficiencia de la producción, en términos del poder de fermentación de la levadura de pan, en términos de producción de alcohol y/o resistencia a altas concentraciones de alcohol por la levadura de alcohol convencionalmente utilizada y producida sobre un tipo de sustrato de carbono de azúcar (en ausencia de glicerol).
Las cepas de levaduras obtenidas mediante el cultivo de la invención en la presencia de una mezcla de glicerol y azúcar y/o levaduras obtenidas por el procedimiento de producción de la levadura de la invención tienen una concentración intracelular de glicerol, preferiblemente menor de 1.5% de sólidos en peso, más preferiblemente menos del 1%. Esta baja concentración de glicerol intracelular refleja la falta de acumulación de glicerol en el medio y por lo tanto que se metaboliza.
En una realización particular, el medio de cultivo comprende otra fuente de carbono asimilable por la cepa de levadura. Otra fuente de carbono asimilado por la cepa de levadura es, por ejemplo etanol. En tal modo de realización, la mezcla de glicerol y azúcar es al menos el 70% de la fuente de carbono para la levadura, de preferencia al menos el 80% de la fuente de carbono para la levadura, preferiblemente por lo menos el 90% de la fuente de carbono para la levadura.
En una realización preferida, el medio de cultivo completo no está en la presencia de la cepa de levadura al comienzo del cultivo. El medio de cultivo preferentemente se pone en la presencia a la cepa de levadura de manera escalonada a una velocidad constante o variable, los distintos componentes del medio de cultivo se pueden introducir simultáneamente o por separado.
En una realización preferida de la invención, la mezcla de glicerol y azúcar se introduce en el medio de cultivo de forma secuencial en el tiempo.
En una realización preferida de la invención, la mezcla de glicerol y azúcar se introduce en el medio de cultivo por separado de otros componentes del medio de cultivo. La mezcla de glicerol y azúcar se puede preparar antes de su introducción en el medio de cultivo y/o se forman en el medio de cultivo cuando el glicerol y azúcar se agregan por separado.
En una realización preferida de la invención, la cepa se cultiva en presencia de la totalidad del glicerol y/o de la totalidad del azúcar de la mezcla desde el principio del cultivo.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para producir la levadura tal como se define anteriormente, que comprende los pasos de: Introducir una cepa de levadura del género Saccharomyces en un fermentador, - Opcionalmente multiplicar dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que no contienen glicerol, - Multiplicando dicha cepa en condiciones aeróbicas, según un modo semi-continuo o continuo, en un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, el cual comprende una proporción de glicerol de al menos el 5% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar que es igual a 100% de equivalente de sacarosa, - Opcionalmente multiplicar dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que no contiene glicerol.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de levadura que comprende las etapas de: introducción de una cepa de levaduras del género Saccharomyces en un fermentador, posiblemente multiplicando dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que no contienen glicerol, multiplicar dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, la mezcla dicha comprende una proporción de glicerol al menos el 5% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol y azúcar de la mezcla es igual al 100% de equivalente sacarosa, eventualmente multiplicar dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que no contiene glicerol, y separación centrífuga de la levadura de panadería así producida en su medio de cultivo, con la obtención de una "crema de levadura" líquida que contiene aproximadamente entre 14 a 25% de materias secas o de materia seca superior si la crema de levadura se mezcla con productos osmótica.
La presente invención se refiere también al procedimiento de producción de levadura tal como se define anteriormente, incluyendo las etapas ulteriores eventuales de: - filtrar la crema de levadura líquida obtenida, por lo general en un filtro rotatorio al vacío, y la obtención de una levadura fresca deshidratada que contiene aproximadamente 26-35% de materia seca, - mezclar la levadura fresca para obtener una masa homogénea , - extruir la levadura así obtenida y la obtención de un resultado de levadura comprimida bajo la formas de piezas de levadura fresca o la levadura fresca desmenuzada, vendida con aproximadamente 30% de materia seca, o si la levadura está destinada a ser seca, en forma de fideos, - el secado de una manera controlada, en una corriente de aire caliente, por ejemplo por fluidización, las partículas de levaduras obtenidas por extrusión, y - empacado.
La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento para la producción de levadura tal como se define arriba, caracterizado porque al menos el 80% del glicerol de la mezcla que se consume en esa cepa, preferentemente al menos el 85% del glicerol de dicha mezcla, más preferiblemente al menos el 90% del glicerol de dicha mezcla, aún más preferiblemente al menos el 95% del glicerol de dicha mezcla, aún más preferiblemente al menos el 98% del glicerol de dicha mezcla.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para producir la levadura según se define arriba, caracterizado porque dicha mezcla comprende una cantidad de glicerol de al menos 8% de equivalente de sacarosa, de preferencia al menos un 10% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 12% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 15% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 17% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 20% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento para la producción de levadura según se define arriba, que se caracteriza porque la proporción de glicerol en dicha mezcla asciende a 8% a 30% de equivalente de sacarosa, preferentemente de 10% a 20% de equivalente de sacarosa, preferiblemente del 12% al 17% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento para la producción de levadura según se define arriba, caracterizado porque dicha mezcla presenta una proporción de glicerol del 30% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere más particularmente a un procedimiento para producir la levadura según se define arriba, caracterizado porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol de 40% del equivalente de sacarosa preferentemente al menos el 50% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 60% de equivalente de sacarosa, más preferiblemente por lo menos el 70% de equivalente de sacarosa, aun más preferiblemente por lo menos el 80% de equivalente de sacarosa, y lo más preferiblemente por lo menos el 90% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere también a un procedimiento para producir la levadura según se define arriba, que se caracteriza en que la proporción de glicerol en dicha mezcla es mayor al 95% de equivalente de sacarosa, de preferencia más del 90% de equivalente de sacarosa, preferiblemente mayor de al 85% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento para la producción de levadura según se define arriba, que se caracteriza en porque la proporción de glicerol en la mezcla es de 30% a 90% de equivalente de sacarosa, preferentemente 40% al 80% de equivalente de sacarosa, preferiblemente de 50% al 70% de equivalente de sacarosa.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de levadura según se define arriba, en donde la cepa de levadura se ha seleccionado entre las especies de cerevisiae, boulardii carlsbergensis y uvarum.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de levadura según se define arriba, en donde la cepa de levadura se ha seleccionado de una variante natural y/o una cepa genéticamente modificada.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de levadura según se define arriba, en donde la cepa de levadura se ha seleccionado de la cepa depositada el 20 de diciembre 2007 ante CNCM con el número CNCM 1-3886, la cepa depositada el 20 de diciembre de 2007 ante CNCM con el número de CNCM 1-3887, la cepa depositada el 20 de diciembre 2007 con el CNCM con el número de CNCM 1-3888, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número CNCM 1-4132, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4133, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4.129, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 de la CNCM con el número I-4130 o la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4.131, o una mezcla de las mismas.
La presente invención se refiere particularmente a un procedimiento según se define arriba, caracterizado porque dicha cepa de levadura es una cepa según la definición anterior.
La presente invención se refiere también a las levaduras que se pueden obtener mediante la aplicación del procedimiento de producción de levadura tal como se define más arriba.
En una realización particular de la invención, el glicerol residual es reciclada para ser utilizada en una mezcla de glicerol y azúcar.
En otra realización, la mezcla de glicerol y azúcar puede incluir una proporción de glicerol de hasta el 99.9% de equivalente de sacarosa o casi el 100% de equivalente de sacarosa.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitarla.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Obtención de cepas de levadura genéticamente modificada de la invención Materiales y Procedimientos El gen STL1 (YDR536w) codifica a la permeasa activa de glicerol. Este gen se amplificó a partir del ADN genómico de levadura industrial y se formo la secuencia.
La secuencia del gen STL1 amplificado, compuesto de 1710 nucleótidos, se alineó con la secuencia de nucleótidos de ORF YDR536w de la levadura S288C (banco SGD). La alineación reveló la presencia de 7 de nucleótidos diferentes en toda la secuencia, que corresponde a un porcentaje de identidad de 99.6%.
La traducción de la secuencia de nucleótidos del gen STL1 procedentes de la levadura industrial, conduce a una proteína de 570 aminoácidos. La alineación de la secuencia de la proteína del gen STL1 procedente de la levadura industrial con la secuencia de la proteína ORF YDR536w producido por la levadura S288C mostró la presencia de tres aminoácidos diferentes, lo que corresponde a un porcentaje de identidad de 99.5%.
La construcción de cepas de levaduras industriales modificadas genéticamente sobre la base de una herramienta molecular adecuada para la levadura industrial fabricada por el solicitante.
Esta herramienta permite en particular: la clonación de un gen de interés, aquí el gen STL1 , entre el promotor ADH1 y el terminador de la levadura CYCL, permitiendo la expresión de este gen en la levadura, la presencia de ambos lados de la cartucho de expresión de 2 fragmentos recombinogénicos (BUD5-A y BUD5-B, de 500 nucleótidos cada uno), que permite la inserción por re combinación homologa del cartucho en el genoma de la levadura, después de su transformación, al nivel del ocus BUD5 I (YCR038c) localizado en el cromosoma III, la presencia del marcador de selección KanMX, flanqueado por dos sitios loxP, lo que permite la selección de clones de levadura que tengan integrados en su genoma el cartucho de expresión que contiene el gen STL1 y estos mismos clones se transformaron después con un plásmido portador del gen que codifica la recombinasa Cre bajo el control del promotor de Gail, después de la inducción de la expresión de este gen mediante el cultivo en medio que contiene galactosa, la acción de la recombinasa inducirá la pérdida de un fragmento de ADN que contiene el marcador seleccionable kanMX.
El cartucho de expresión se muestra en la figura 1.
Las 5 cepas de partida utilizadas son las siguientes: - la cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada ante CNCM con el número I-3399, - La cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada ante CNCM con el número NCYC996, - La cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada ante CNCM con el número NCYC995, - La cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada ante CNCM con el número 1-4072, y - La cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada ante CNCM con el número 1-4071.
Cada una de las cepas de partida se transformó con el cartucho de expresión. Los clones resistentes a geneticina fueron seleccionados. Entonces, para cada clon seleccionado, la integración del cartucho de expresión en el genoma de la levadura en el lugar correcto se verificó mediante PCR. Los clones seleccionados se transforman con un plásmido portador del gen Cre que codifica a la recombinasa bajo el control del promotor de Gal1. Después de la inducción de la expresión de este gen Cre por medio de cultivo que contiene galactosa, la acción de la recombinasa puede inducir la pérdida de un fragmento de ADN que contiene el marcador seleccionable KLANMX. A continuación, comprueba la pérdida del marcador de selección KanMX en el lugar de la integración en el cromosoma por PCR, la presencia del cartucho de expresión que contiene el gen STL1 en el genoma de la levadura en el lugar correcto por PCR, y la pérdida de resistencia a la geneticina. La pérdida del plásmido Cre es verificado por la pérdida de resistencia a la nourseotricina.
Por último, la transcripción del gen STL1 en la presencia de azúcar en la cepa genéticamente modificada se verificó mediante la medición de la tasa de ARNm producido durante la transcripción de genes STL1 bajo el control del promotor DHLA. Con este fin, la cepa modificada se cultiva en presencia de azúcar (medio de cultivo de medio laboratorio YPG que contiene 2% de glucosa). El ARNm se extrae de las cepas y el nivel de ARNm correspondiente a la transcripción del gen STL1 se mide mediante PCR cuantitativa. Los niveles de ARNm de la cepa mutante se expresa entonces en términos de niveles de ARNm de la cepa correspondiente no mutada (fijado en 1). Resultados Las cepas genéticamente modificadas para expresar el gen STL1 así obtenidos fueron depositadas en el CNCM con los siguientes números: - la cepa número I-3886, producida por la cepa de partida depositada en CNCM con el número I-3399, - la cepa número I-3887, producida por la cepa inicial depositada en NCYC con el número NCYC996, - la cepa número 1-3888, producida por la cepa de partida de Saccharomyces cerevisiae depositada en NCYC con el número NCYC995, - la cepa número 1-4132, producida por la cepa de partida depositada en CNCM con el número I-4072, y - la cepa número 1-4133, producida por la cepa de partida depositada en CNCM con el número 1-4071.
Las tasas de transcripción que se muestra en la figura 2 muestran un fuerte aumento (de 270 a 300 veces) de la transcripción del gen STL1 en las tres cepas genéticamente modificadas I-3886, I-3887 y I-3888 cultivadas en presencia de azúcar, en comparación con el nivel de la transcripción de genes en las cepas de control sin mutación cultivado correspondientes en el mismo medio.
En cuanto a la tasa de transcripción de las cepas 1-4132 y 1-4133 cultivadas en presencia de azúcar, un gran aumento (más de 200 veces) en la transcripción de genes STL1 también se evidencia, en comparación con el nivel de la transcripción del gen de la cepa de control sin mutación correspondiente cultivado en el mismo medio.
Ejemplo 2: La producción de cepas de levadura genéticamente modificada de acuerdo con la invención de una mezcla de glicerol y azúcar.
Material y Procedimientos (i) Modo semi-continuo La producción semi-continua de levadura fresca se realiza como se describe en el libro "Yeast Technology", capítulo 6, 2a edición, 1991, G. Reed y T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
El fermentador utilizado fue llenado con un cierto volumen inicial de agua con un poco de nitrógeno y fósforo, nutrientes tales como vitaminas y minerales. Antes de inocular el fermentador con una cierta cantidad de cepas de levaduras vivas, un poco de melaza se agrega al inicio del cultivo. El pH y la temperatura se ajustan a un rango de pH de 3.5 a 7 (con la aportación simultánea de ácido o base según sea necesario), y de 30 a 34°C de temperatura (con un calentamiento o enfriamiento del fermentador, según sea necesario). El cultivo en modo semi-continuo llamado alimentación por cargas se inicia por la adición de melaza o de una mezcla de melaza y glicerol que contiene una proporción equivalente de sacarosa al 20% de glicerol. La velocidad de fundición de la melaza o de una mezcla de glicerol y melaza determina la velocidad de crecimiento de la levadura. Esta velocidad de fundición variable se fija en el tiempo para que la sacarosa agregada con el tiempo pueda ser totalmente respirada (oxidada) por la levadura. En tales condiciones, la producción de etanol por la levadura con el tiempo es cero, o limitado en las primeras horas de la prueba. Para cumplir con estas condiciones, el cultivo es, por ejemplo, realizado a una tasa de crecimiento promedio de 0.16 por hora para las cepas I-3886, I-3887, I-3888 y las cepas correspondientes no modificados genéticamente, y a un ritmo de crecimiento promedio de 0.13 por hora para las cepas 1-4132 y 1-4133 y las correspondientes cepas no modificadas genéticamente.
El medio se airea y se mezcla lo suficiente para no limitar el oxígeno.
Además de melaza o de una mezcla de glicerol y melaza, una fuente continua de nitrógeno como la urea y el fósforo como ácido fosfórico permite responder a las necesidades de la levadura para la síntesis de proteínas y otros componentes celulares.
La adición de melaza o de una mezcla de glicerol y la melaza se mantiene durante 22 horas para obtener la cantidad deseada de la levadura, tomando cuenta los equipos utilizados.
Durante las últimas horas del cultivo, la adición de melaza o una mezcla de glicerol y la melaza se disminuye gradualmente para reducir la tasa de levaduras germinantes en el termentador.
De acuerdo con este procedimiento de ejecución, el suministro de sustrato de carbono (por ejemplo, mezcla de glicerol y melaza que comprende una proporción de glicerol del 20% de equivalente de azúcar) puede multiplicar la biomasa inicial en un 40 durante 22 horas del cultivo, mientras que el mantenimiento de un metabolismo predominantemente respiratorio y garantizar una tasa de germinación del cultivo a menos de un 5-10%. La cantidad total de carbono fundido del sustrato depende de la capacidad de transferir oxígeno y calorías del fermentador.
La concentración de biomasa final es de entre el 5 y el 7% y el contenido de nitrógeno de la biomasa entre 6 y 9%.
Durante el cultivo y al final del cultivo, la cantidad de glicerol en el medio de cultivo se midió por HPLC y se comparo con la cantidad de glicerol introducido.
Al final del cultivo, la levadura se cosechó por centrifugación y se midió la masa de levadura cosechada.
La levadura produce (en g de MS) es la diferencia entre la levadura cosechada (en g de MS) y la levadura inoculada (en g de MS) (MS significa de materia seca).
El porcentaje de rendimiento se obtiene con la relación "levadura producida (g de MS)"/"sustrato de carbono introducido en el equivalente de sacarosa (g)" y multiplicando por 100.
El porcentaje de glicerol consumido se calcula como la relación "cantidad de glicerol medida al final del cultivo (g)" / "cantidad de glicerol durante el cultivo (g)" y multiplicando por 100. (ii) Modo de quimiostato El fermentador se alimenta con una fuente de carbono compuesto de una mezcla de glicerol y azúcar, una fuente de nitrógeno, una fuente de la fuente de azufre y fósforo. Las vitaminas y los minerales se proporcionan en exceso.
Las mezclas de glicerol y glucosa contienen de 0% a 80% de glicerol en equivalente de sacarosa se probaron.
El fermentador se coloca en una escala que controla una bomba de drenaje y para mantener el volumen constante en el fermentador a través del control de su peso. El cultivo es limitado por el sustrato de carbono (glucosa y glicerol), otros componentes se agregan en exceso. El medio está suficientemente ventilado y se mezcla para nunca estar limitado de oxígeno.
El medio se agrega continuamente a una velocidad constante para obtener una tasa de dilución ( = caudal/ volumen) de 0.15h"1 y por lo tanto a un ritmo constante de crecimiento de 0.15 h"1.
La concentración de equivalentes de sacarosa en el medio de la alimentación es igual a 19 g/kg.
El rendimiento y la cantidad residual de glicerol se midieron en el cultivo en el estado de equilibrio.
El estado de equilibrio se alcanza cuando las concentraciones en el termentador son estables durante al menos 3 tiempos de residencia, el tiempo de residencia es la relación 1/[tasa de dilución].
El rendimiento de producción de biomasa de azúcar fundida es la proporción de la biomasa producida por el azúcar fundido. En estado estacionario, la biomasa producida por unidad de tiempo es igual a la tasa de retiro, multiplicada por la concentración de biomasa en el termentador (determinado al filtrar un volumen conocido de mosto de levadura y pesando la pasta de levadura previamente lavada y secada).
Al momento de determinar la eficiencia una muestra de masa de levadura se retira e inmediatamente se filtra para eliminar la biomasa. El filtrado se analizó por HPLC para cuantificar la cantidad residual de glicerol.
Resultados (i) modo semi-continuo Las cepas no mutadas 1-3399, NCYC 996, NCYC 995, I-4072 y 1-4071 y las cepas mutantes correspondientes, I-3886, I-3887, I-3888, 1-4132 y 1-4133, respectivamente, fueron producidos de acuerdo con el esquema de ejecución descritos anteriormente, con la fuente de carbono de melaza o una mezcla de glicerol pura y melaza, que contiene una proporción de glicerol del 20% de equivalente de sacarosa.
Las figuras 3 y 4, y las tablas 1, 2, 3, 4 y 5 muestran los resultados obtenidos con las cepas no-mutantes y las cepas mutantes correspondientes.
El rendimiento de la producción se determina para cada cepa no mutada en la presencia de la melaza pura (sin glicerol). En las tablas 1, 2, 3, 4 y 5, los valores en la línea de "rendimiento" corresponden con el porcentaje del rendimiento en comparación con el rendimiento de la cepa no mutada producida con melaza pura.
La tabla 1 muestra los resultados de las pruebas con la cepa no mutada NCYC 996 y la cepa mutada correspondiente I-3887.
La Tabla 2 muestra los resultados de las pruebas con la cepa no mutada 1-3399 y la cepa mutada correspondiente I-3886.
La Tabla 3 muestra los resultados de las pruebas con la cepa no mutada NCYC 995 y la cepa mutada correspondiente I-3888.
La tabla 4 muestra los resultados de las pruebas con la cepa no mutada 1-4072 y la cepa mutada correspondiente I-4132.
La tabla 5 muestra los resultados de las pruebas con la cepa no mutada 1-4071 y la cepa mutada que corresponde I- 4133.
Al interpretar estas tablas, constatamos con que en una producción de una mezcla de glicerol y la melaza (incluyendo una proporción de glicerol del 20% de equivalente de sacarosa,) como fuente de carbono, el rendimiento de producción obtenido con las cepas mutantes es significativamente menor que el rendimiento obtenido en la producción de melaza pura. Esta reducción del rendimiento está ligada a la falta de uso de una porción significativa del equivalente de sacarosa agregada en forma de glicerol, el glicerol se acumula en el medio de cultivo como se indica en los resultados en la línea "glicerol agregado consumido".
En estas tablas se muestran los resultados de las pruebas con cepas mutantes cuando la fuente de carbono agregada es una mezcla de melaza y glicerol. Las mediciones indican que el consumo de glicerol es casi total para las tres cepas mutantes 1-3887, 1-3886 y 1-3888 (consumo de glicerol mayor al 99%), que se traduce en rendimientos de producción por lo menos equivalentes a los obtenidos con las cepas no mutadas producidas con melaza pura (Tablas 1-3).
En cuanto a las cepas mutadas 1-4132 y 1-4133, el consumo de glicerol agregado es superior al 80% y el rendimiento es superior al 90% del rendimiento obtenido con la cepa no OGM en ausencia de glicerol (Tablas 4 y 5).
Esta diferencia en el consumo de glicerol por las cepas no mutadas y las cepas mutadas correspondientes se ilustra en las figuras 3 y 4, que muestran la acumulación de glicerol en el tiempo durante las pruebas de producción en una mezcla de glicerol y la melaza que comprende la proporción de glicerol del 20% de equivalente de sacarosa.
La curva de triángulos en la figura 3 representa la cantidad residual de glicerol en el medio libre de levadura en el cultivo de la cepa no mutada NCYC 996 y la curva de cuadros de la cepa mutada 1-3887.
La curva de triángulos 4 muestra la cantidad residual de glicerol en el medio libre de levadura en el cultivo de la cepa no mutada NCYC 995 y la curva de cuadros de la cepa mutada 1-3888.
La diferencia de consumo entre las cepas no-mutantes y las correspondientes cepas mutantes es importante después de las primeras cinco horas del cultivo. Durante las primeras cinco horas del cultivo, la capacidad respiratoria de las cepas mutantes y las cepas no mutadas está saturada por el azúcar producida (efecto "crabtree"), este fenómeno está acompañado por la producción de etanol. Cuando este fenómeno desaparezca, es decir, cuando la levadura tiene la capacidad respiratoria para oxidar todo el azúcar y el glicerol agregados, las cepas mutadas consumen esencialmente todo el glicerol vertido al mismo tiempo que la azúcar, mientras que las cepas sin mutación acumulan glicerol.
Tabla 1 Tabla 2 0% de glicerol 20% de glicerol 1-3399 I-3399 I-3886 Rendimiento (en porcentaje de 100.0 93.8 108.1 rendimiento de la cepa de control en la ausencia de glicerol) Glicerol agregado / 48.9 99.1 consumido (en %) Tabla 3 0% de glicerol 20% de glicerol NCYC 995 NCYC 995 I-3888 Rendimiento (en porcentaje de 100.0 93.8 108.1 rendimiento de la cepa de control en la ausencia de glicerol) Glicerol agregado / 48.9 99.1 consumido (en %) Tabla 4 0% de glicerol 20% de glicerol I-4072 I-4072 1-4132 Rendimiento (en porcentaje de 100.0 78.7 93.3 rendimiento de la cepa de control en la ausencia de glicerol) Glicerol agregado / 22.7 83.9 consumido (en %) Tabla 5 (ii) Modo Continuo En las figuras 5 y 6, cada punto corresponde a un estado estacionario obtenido con un medio de alimentación en el cual la proporción de glicerol en la mezcla de glicerol y azúcar es del 0%, 20%, 50% o 80% de equivalente de azúcar.
Con un medio de alimentación, cuya única fuente de carbono es la glucosa (ausencia de glicerol), el rendimiento de la producción de biomasa de la cepa mutada (CNCM 1-3887) y la de la cepa no mutada (NCYC 996) son idénticos. La mutación del gen STL1 no altera el rendimiento de la biomasa de la glucosa.
La sustitución del 20%, 50% o 80% de glucosa por equivalente de sacarosa por el glicerol en la mezcla de glicerol y la alimentación de azúcar se acompaña, para la cepa no mutada de una creciente acumulación de glicerol en el medio de reacción (figuras 7 y 8). Esta cantidad de glicerol que se acumula en el medio de reacción provoca una disminución pronunciada de la producción de la producción de biomasa en el reparto de azúcar equivalente (figuras 5 y 6). Por lo tanto, a una tasa del 50% de sustitución, el rendimiento de la producción de cepas no mutantes cayó más del 25% en comparación con el desempeño de la misma cepa producida en un medio que contiene glucosa solamente.
El consumo de glicerol de las cepas no mutadas es inferior al 57% con una tasa de sustitución del 20%, inferior del 38% a una tasa de sustitución del 50% e inferior a 22% a una tasa de sustitución del 80% (Figuras 7 y 8).
En contraste, las cepas mutantes consumen casi la totalidad del glicerol, a la vez con el azúcar, como lo demuestra la concentración de glicerol residual muy baja medida en el medio de reacción. Por lo tanto, las cepas mutantes consumen más del 95% del glicerol de la mezcla, hasta una tasa de sustitución del 80% (Figuras 7 y 8). En consecuencia, el rendimiento de la producción en la mezcla de azúcar equivalente no está o se ve poco afectado por la tasa de sustitución del azúcar por glicerol. El rendimiento de la producción de la cepa mutada es siempre mayor que el correspondiente a la cepa no mutada en la presencia de una mezcla que contiene glicerol (figuras 5 y 6).
Por otra parte, en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contienen 20% o 50% de equivalente de sacarosa, glicerol, el rendimiento de la producción de cepas mutadas es superior al 90% en comparación con el de la cepa mutada cultivada en el ausencia de glicerol, y es más del 85% en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contiene 80% glicerol en equivalente de sacarosa (figuras 5 y 6).
EJEMPLO 3: Obtención de variantes naturales de la invención Materiales y Procedimientos (i) Clasificación directa Una población de células de una cepa de levadura de panadería se somete a una radiación UV estándar de 1200 a 2000 J/cm2 que conduce a una pérdida de la viabilidad del 99.9%.
Las variantes naturales obtenidas son aisladas en un medio no selectivo (YPG), y se clasifican en base a su rendimiento y su consumo de glicerol en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar.
La clasificación se realiza después del cultivo semi-continuo, en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contiene 20% de glicerol en equivalente de sacarosa en fermentadores de 1 litro y 7 litros.
Las condiciones experimentales de cultivo semi-continuo son como se describe en el ejemplo 2 durante un período de 22 horas, con una tasa de crecimiento promedio de 0,16 h" . (ii) Clasificación después de su enriquecimiento en quimiostato Una población de células de la misma cepa que antes de la salida se somete a niveles crecientes de radiación UV (400 a 4400 J/cm2) Que conducen a la pérdida de viabilidad de 80 a 99.98%.
Las variantes naturales sometidas a estos diferentes niveles de radiación se agrupan a continuación, y algunos se utilizan para inocular un cultivo en el modo de quimiostato.
La fuente de carbono del cultivo consiste en una mezcla de glicerol y glucosa que contiene 50% de glicerol en equivalente de sacarosa.
El cultivo se realiza hasta aproximadamente 220 generaciones de células.
El consumo de glicerol se midió en el cultivo.
Las muestras del cultivo se toman periódicamente para la detección de variantes naturales.
Las variantes naturales a partir de muestras diferentes se encuentran aisladas en un medio no selectivo (YPG), y se clasifican sobre la base de su rendimiento y su consumo de glicerol en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar.
La clasificación se realiza después del cultivo semi-continuo, en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contiene 20% de glicerol en equivalente de sacarosa en fermentadores de 1 litro y 7 litros.
Las condiciones experimentales de cultivo semi-continuo son como se describe en el ejemplo 2 durante un período de 22 horas, con una tasa de crecimiento promedio de 0.16.
Resultados Las variantes naturales de la clasificación directa o clasificación después de su enriquecimiento en quimiostato son los perfiles de consumo de glicerol y rendimiento muy variados.
Un ejemplo del resultado obtenido de 53 variantes naturales de la selección después de su enriquecimiento en quimiostato se muestra en la figura 9. El consumo de glicerol de la cepa de partida (T) también se indica.
Un número de variantes naturales tiene un mayor consumo de glicerol al 80% en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contiene 20% de glicerol y el rendimiento de equivalente de sacarosa igual o superior al 85% de la cepa de partida. Entre ellas se encuentran las variantes naturales depositados en el CNCM con los números 1-4129 (variante natural NO. 4), 1-4.130 (variante natural NO. 20) y 1-4131 (variante natural NO. 2), que fueron obtenidos por la clasificación después de su enriquecimiento en quimiostato de las muestras correspondientes a la obtención de aproximadamente 145 generaciones de células en el quimiostato.
Se observa que el análisis del consumo de glicerol en el cultivo de quimiostato muestra que durante las primeras 100 generaciones, el glicerol residual ha disminuido de manera constante, lo que sugiere una adaptación del cultivo a la mezcla de glicerol y azúcar.
Además, los niveles de ARNm correspondientes a la transcripción de genes STL1 se miden por RT-PCR, como se describe en el Ejemplo 1, en diferentes variantes naturales de la invención. Los niveles de ARNm obtenido se compara con los de la cepa de partida que no ha sido objeto de tratamiento UV.
De acuerdo con las variantes naturales, se observó un ARNm similar al de la cepa de partida o multiplicado por un factor de 2 a un factor de 7.
La capacidad de las cepas de la invención para el uso del glicerol en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar no está necesariamente vinculada a la sobreexpresión del gen STL1.
EJEMPLO 4: Producción de levadura de variantes naturales de la invención en una mezcla de glicerol y azúcar Material y Procedimientos Los cultivos en modo semi-continuo se realizaron como en el ejemplo 2 durante un periodo de 22 horas, con una tasa de crecimiento promedio de 0.16 h"\ Resultados Las variantes naturales 1-4129, 1-4130 e 1-4131, y la cepa de levadura de la que se derivan son producidas de acuerdo con el esquema de ejecución descrita anteriormente, con la fuente de carbono de la melaza pura o una mezcla de glicerol y la melaza que comprende una proporción de glicerol al 20% o 40% de equivalente de sacarosa.
El rendimiento de la producción se determina para la cepa inicial en la presencia de melaza pura (sin glicerol). En las tablas 6 y 7, los valores en la línea de "rendimiento" coincide con el porcentaje de rendimiento en relación al rendimiento de la cepa de partida producida con la melaza pura.
Tablas 6 y 7 muestran los resultados de las pruebas con las variantes naturales y la cepa inicial (T) en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contiene, respectivamente, 20% y 40% de glicerol.
Tabla 6 0% de 20% de glicerol glicerol T T 1-4129 1-4130 1-4131 Rendimiento (en porcentaje de 100.0 86.5 98.9 100.3 100.6 rendimiento de la cepa de control en la ausencia de glicerol) Glicerol agregado 1 38.5 99.6 99.6 99.5 consumido (en %) Tabla 7 Las mediciones indican que el consumo de glicerol se da casi total para las tres variantes naturales en la presencia de una mezcla de glicerol y azúcar que contiene 20% de glicerol en equivalente de sacarosa (consumo de glicerol por encima del 99%), mientras que el consumo de la cepa de partida es inferior al 40% (Tabla 6).
En presencia de una mezcla de glicerol y azúcar con 40% de glicerol en equivalente de sacarosa, las mediciones indican que el consumo de glicerol proporcionado es prácticamente total para la variante natural 1-4129, por encima del 85% para una variante natural 1-4130 y por encima del 90% para la variante 1-4131.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Cepa de Saccharomyces, caracterizada porque en la presencia de un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, en condiciones aeróbicas, que consume al menos el 80% de glicerol de dicha mezcla, la mezcla comprende una proporción de glicerol de al menos el 20% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
2. Cepa según la rei indicación 1, caracterizada porque consume el 85% del glicerol de la mezcla, de preferencia al menos el 90% de glicerol de la mezcla, preferiblemente por lo menos el 95% de glicerol de la mezcla, más preferiblemente al menos 98 % del glicerol de la mezcla.
3. Cepa según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol en su equivalente en sacarosa 30%, preferentemente al menos el 40% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 50% de equivalente de sacarosa, sin embargo, más preferiblemente al menos el 60% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 70% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 80% de equivalente de sacarosa aún más preferiblemente al menos el 90% de equivalente de sacarosa.
4. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque se elige entre las especies de cerevisiae, boulardii, carlsbergensis y uvarum.
5. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque se selecciona de una variante natural y/o una cepa genéticamente modificada.
6. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque se selecciona de la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4129, la cepa depositada el 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número I-4130 y la cepa depositada 03 de marzo 2009 ante CNCM con el número 1-4131.
7. Cepa según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque se selecciona de la cepa depositada una de las reivindicaciones 1 a
8. Uso de una cepa según una de las reivindicaciones 1.a 7 para la producción de levadura en presencia de una mezcla de glicerol y azúcar, la mezcla contiene una proporción de glicerol de al menos 5% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
9. Uso de una mezcla de glicerol y azúcar para la producción de levadura de al menos una cepa de Saccharomyces, en donde la cepa consume al menos el 80% de glicerol de dicha mezcla, la mezcla contiene una proporción de glicerol de al menos 5% de equivalente de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
10. Procedimiento para la producción de levadura que comprende las etapas de: introducción de una cepa de levaduras del género Saccharomyces en un termentador, y multiplicación de dicha cepa en condiciones aeróbicas en un medio de cultivo que comprende una mezcla de glicerol y azúcar, la mezcla consiste de una proporción de glicerol de al menos el 5% de sacarosa, la suma de las proporciones del glicerol de la mezcla y azúcar es igual al 100% de equivalente de sacarosa.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque al menos el 80% del glicerol de la mezcla se consume en esa cepa, preferentemente al menos el 85% del glicerol de dicha mezcla, preferiblemente por lo menos 90% de glicerol dicha mezcla, aún más preferiblemente al menos el 95% del glicerol de dicha mezcla, aún más preferiblemente al menos el 98% del glicerol de dicha mezcla.
12. Procedimiento según la reivindicación 9-11, caracterizado porque dicha mezcla comprende una cantidad de glicerol de al menos 8% de equivalente de sacarosa, preferiblemente al menos 10% de equivalente de sacarosa, preferiblemente en 12% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 15% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 17% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 20% de equivalente de sacarosa.
13. Procedimiento según la reivindicación 9-12, caracterizado porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol al 30% de equivalente de sacarosa.
14. Procedimiento según la reivindicación 9-13, caracterizado porque dicha mezcla comprende una proporción de glicerol de 40% de equivalente de sacarosa, preferentemente al menos el 50% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos 60% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 70% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 80% de equivalente de sacarosa, preferiblemente por lo menos el 90% de equivalente de sacarosa.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque dicha cepa de levadura es una cepa de según una de las reivindicaciones 1 a 7.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2953857B1 (fr) * 2009-12-15 2012-10-12 Lesaffre & Cie Nouvelles souches de levure pour la production d'alcool
FR2991340B1 (fr) * 2012-06-01 2016-02-19 Lesaffre & Cie Procede d'obtention de souches de levure ameliorees par modification genetique et croisement
WO2015023989A1 (en) * 2013-08-15 2015-02-19 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Methods for the improvement of product yield and production in a microorganism through glycerol recycling
FR3015985B1 (fr) * 2013-12-30 2017-06-16 Lesaffre & Cie Souches de levures pour la production d'ethanol de premiere generation

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008006037A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Integrated Genomics, Inc. Compositions and methods for enhancing glycerol utilization
US20090269832A1 (en) * 2007-11-05 2009-10-29 Modular Genetics, Inc. Growth of Microorganisms in Media Containing Crude Glycerol

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