MX2010007344A

MX2010007344A - Furina recombinante substancialmente libre de proteina animal y metodos para la produccion de la misma.

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Publication number: MX2010007344A
Application number: MX2010007344A
Authority: MX
Inventors: Manfred Reiter; Artur Mitterer; Meinhard Hasslacher; Simone Von Fircks; Barbara Plaimauer; Leopold Grillberger; Roland Geyer
Original assignee: Baxter Int
Priority date: 2007-12-31
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2010-11-09
Also published as: CN110066782B; NZ586411A; US9127264B2; EP3521422A1; ES2897561T3; CN101910401A; SG10201805749QA; EP3521422B1; AU2008346817A1; JP2011507550A; KR20100114057A; AR113492A2; WO2009088713A1; BRPI0821467B8; DK2240578T3; JP5806465B2; JP2015154790A; EP2240578B1; CA2710260C; PL2240578T3

Abstract

La presente invención se refiere a furina recombinante (rFurina) y métodos para producir la rFurina. Más específicamente, la presente invención se refiere a rFurina substancialmente libre de proteínas animales y los métodos para producir la rFurina substancialmente libre de proteína animal.

Description

FURINA RECOMBINANTE SUBSTANCIAL MENTE LIBRE DE PROTEÍNA ANIMAL Y MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE LA MISMA Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud relama la prioridad sobre la solicitud provisional de Patente Norteamericana No. 61/018,152, presentada en Diciembre 31, 2007, la cual está incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia. Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente a furina recombinada (rFurina) y métodos para la producción de rFurina. Más específicamente, la presente invención se refiere a rFurina substancialmente libre de proteína animal y métodos para producir rFurina substancialmente libre de proteína animal. Antecedentes de la Invención Las proteínas activas o maduras generalmente están presentes en cantidades muy pequeñas en los organismos vivos. Por lo tanto, sus pro-proteínas o pro-enzimas preferentemente son activadas in vitro poniéndolas en contacto con enzimas de activación (por ejemplo, proteasas). Las proproteínas (o precursor de proteína) son proteínas desactivadas que se convierten en activas por una o más modificaciones posteriores a la traducción y, en particular, por la disociación de un pro-péptido de la pro-proteína. Los ejemplos de las pro- proteínas incluyen, por ejemplo, pro-insulina, pro-trombina, el Factor pro-von Willebrand (pro-VWF), y similares. El Factor Von Willebrand (VWF) es una glicoproteína de la sangre comprendida en la coagulación. La VWF es deficiente o defectuosa en la enfermedad de von Willebrand y está involucrada en un gran número de otras enfermedades, incluyendo, la púrpura trombótica trombocitopénica , síndrome de Heyde y posiblemente el síndrome hemol ítico-urémico. La VWF es una glicoproteína en circulación en el plasma como una serie de multímeros en un rango de tamaño de aproximadamente 500 a 20,000 kD. Las formas multiméricas de la VWF están compuestas de subunidades de polipéptido de 250 kD enlazados juntos por enlaces disulfuro. La VWF es portadora de la adhesión inicial de plaquetas para el sub-endotelio de la pared de los vasos dañada, y se considera que solamente los multímeros más grandes de la VWF exhiben una actividad hemostática. Los multímeros de VWF que tienen masas moleculares más grandes son almacenados en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células del endotelio y son liberados al momento del estímulo. Las VWF liberadas entonces son procesadas adicionalmente por las proteasas del plasma para que resulten en formas de bajo peso molecular de la VWF. Los humanos, la remoción del pro-péptido es casi completa, mientras que las líneas de células de mamíferos con un grado alto de expresión de la VWF recombinante, este proceso no es muy eficiente. Por lo tanto, los sobrenadantes del cultivo celular de dichas líneas de células recombinantes generalmente comprenden una mezcla de VWF maduras y VWF precursoras, como pro-VWF. Con el objeto de obtener la VWF madura, por lo tanto es necesario convertir los precursores de VWF en particular pro-VWF, en VWF maduras. Este proceso generalmente es logrado disociando el pro-péptido con una proteasa. Los métodos convencionales actuales producen la VWF madura por cualquiera ya sea incubando su pro-forma con proteasas en una fase líquida, por medio de la cual se maduran ellas mismas (por ejemplo, la disociación del pro-péptido de la pro-proteína) ocurre en una condición no enlazada en solución libre, o como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/49047, inmovilizando la proteasa en un portador sólido, el cual se pone en contacto y es incubado con una preparación que comprende pro-VWF (ver por ejemplo, el documento WO 00/49047). Sin embargo, estos métodos comprenden varias desventajas sobre los métodos de acuerdo con la presente invención. Industrialmente, la VWF y en particular, la VWF recombinante (rVWF) es sintetizada y expresada junto con el Factor VIII recombinante (rFVIII) en la línea de células del ovario de Hámster Chino (CHO) diseñadas genéticamente. La función de las rVWF co-expresadas es estabilizar el rFVIII en el proceso de cultivo celular. El rVWF es sintetizado en la célula en la pro-forma, con un contenido de un pro-péptido grande enlazado a la terminal N. Al momento de la maduración en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, el pro-péptido es disociado mediante la acción de la furina de proteasa celular y la proteína madura es secretada como un homopolímero de subunidades idénticas, consistentes de dímero de la proteína expresada. Sin embargo, la maduración es generalmente incompleta, conduciendo a un producto que comprende una mezcla de pro-VWF y VWF madura. Las publicaciones anteriores han mostrado que la pro-VWF puede ser convertida en VWF mediante tratamiento in vitro con furina o proteasas similares a furina (Schlokat y asociados, Biotechnol. Appl. Biochem. 24: páginas 257 a 267, 1996; Preininger y asociados, Cytotechnology 30: páginas 1 a 15, 1999; y la Patente Europea EP 0775750A). En particular, la Patente Europea EP 0775750A sugiere la co-expresión de la furina y la VWF recombinante de modo que la maduración de la VWF pueda ocurrir en el sitio. La furina recombinante (rFurina) transforma la pro-rVWF (factor de von Willebrand pro-recombinante) a rVWF mediante la disociación del enlace péptido Arg741 -Ser742. Este paso de maduración es parte del proceso de producción de rVWF para el tratamiento de la Enfermedad de von Willebrand Tipo B y parte del proceso de manufactura para el Factor VIII - vida promedio recombinante (rFVIII-HL). La furina pertenece a la familia de las convertasas de pro-proteína y depende del calcio (Ca2 + ). La furina específicamente se disocia en el enlace péptido de la terminal C de arginina dentro de una secuencia específica, que contiene arginina en las posiciones -1 y -4. Esta secuencia se puede encontrar en numerosas proteínas humanas, mostrando que la furina juega un rol importante en la maduración de un número de pro-proteínas humanas. La producción de proteínas activadas es de alta importancia clínica y de diagnóstico. Por ejemplo, las proteínas activas o maduras, como la VWF madura pueden ser utilizadas para controlar la coagulación de la sangre. La presente invención proporciona una furina recombinante mejorada (rFurina) la cual es una rFurina substancialmente libre de proteína animal para la producción posterior de proteínas activadas. Más específicamente, la presente invención proporciona rFurina substancialmente libre de proteína animal para transformar la pro-VWF en VWF madura. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona furina recombinante (rFurina), la cual es una furina recombinante substancialmente libre de proteína animal (rFurina), y métodos para la producción de la misma. Dicha rFurina es substancialmente libre de otras proteínas las cuales pueden generalmente estar asociadas por la producción de rFurina, tales como proteínas en suero y proteínas de la célula huésped. Esta rFurina permite la producción posterior de proteínas maduras con una actividad alta específica y de alta pureza sin efectos secundarios asociados con el contaminante de la proteína en la preparación de la rFurina. Más específicamente, esta rFurina permite la producción de VWF, como una actividad alta específica y alta pureza. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para la selección y adaptación de células huésped recombinantes para un medio definido químicamente, la expresión de rFurina la cual es secretada en el sobrenadante de cultivo celular y la purificación de la rFurina después de la remoción celular. La rFurina substancialmente libre de proteína animal de la presente invención incluye preparaciones o composiciones de rFurina que comprenden la proteína de la célula huésped en una concentración que se encuentra en un rango de aproximadamente 0.1 a 0.6 ng de proteína o menos/actividad de unidad de furina o entre aproximadamente 2 y 11 pg de proteína o menos/mL y que carece esencialmente de proteínas contaminantes del suero en el medio de cultivo. En un aspecto la furina substancialmente libre de proteína animal comprende preparaciones de rFurina y que comprenden ADN de células huésped contaminantes en una concentración entre un ADN de aproximadamente 0 a 0.4 pg o menos/actividad de unidad de furina o entre un ADN en aproximadamente 0 y 24 ng o menos/mL y que carece esencialmente de proteínas contaminantes del suero en el medio de cultivo. La presente invención incluye composiciones que comprenden furina recombinante substancialmente libre de proteína animal en una actividad de por lo menos 10000 U furina/mL y la proteína de célula huésped de una concentración menor de aproximadamente 11 pg proteína/mL. Dichas composiciones pueden también comprender proteínas de la célula huésped en una concentración menor de aproximadamente 1.0 ng de proteína/unidad de actividad de furina. En un aspecto, la proteína de la célula huésped es de una célula CHO. En otro aspecto, la presente invención incluye composiciones que comprenden la furina recombinante substancialmente libre de proteína animal en una actividad de por lo menos 10000 U fur¡na/mL y el ADN de la célula huésped en una concentración menor de aproximadamente 14 ng de ADN/mL. En varios aspectos, dichas composiciones también comprenden ADN de la célula huésped de una concentración menor de aproximadamente 0.5 pg de ADN/unidad de actividad de furina. En un aspecto, el ADN de la célula huésped es de una célula CHO. La presente invención también incluye composiciones que comprenden la furina recombinante substancialmente libre de proteína animal en una actividad de furina específica de por lo menos aproximadamente 100 U/ g y una proteína de célula huésped en una concentración menor de aproximadamente 11 proteína/mL. Dichas composiciones también pueden comprender proteína de la célula huésped desde una concentración menor de aproximadamente 1.0 ng de proteína/U de actividad de furina. En un aspecto, la proteína de la célula huésped es de una célula CHO. La presente invención incluye además composiciones que comprenden la furina recombinante substancialmente libre de proteína animal en una actividad de furina específica de por lo menos aproximadamente 100 U/ g y ADN de la célula huésped en una concentración menor de aproximadamente 14 ng ADN/mL. Dichas composiciones también pueden comprender el ADN de la célula huésped en una concentración menor de aproximadamente 0.5 pg ADN/U de actividad de furina. En un aspecto, el ADN de la célula huésped es de una célula CHO. La presente invención incluye también métodos para la elaboración de una composición que comprende la furina recombinante substancialmente libre de proteína animal aquí descrita. Dichos métodos comprenden el paso de adaptación de las células huésped para cultivarse en el medio con concentraciones crecientemente inferiores de suero hasta que todas fueron removidas del medio. En otro aspecto, los métodos comprenden el paso de transferir la célula huésped del medio de cultivo que comprende suero para que crezca en un medio libre de suero. En un aspecto de ejemplo, la célula huésped es una célula CHO. La presente invención incluye métodos de uso de una composición que comprende la furina recombinante substancialmente libre de proteína animal aquí descrita. Dichos usos comprenden el paso de poner en contacto una pro-proteína con la composición bajo condiciones para disociar un pro-péptído de la pro-proteína para formar una proteína madura. La rFurina puede ser utilizada en la formación de cualquier proteína madura de una pro-proteína que es disociada mediante la furina. En un aspecto, la proteína madura es el Factor de von Willebrand. En otro aspecto, la proteína madura es el Factor VIH. Además, la presente invención contempla que la rFurina de la presente invención es útil tanto para el procesamiento in vitro como in vivo de cualquier pro-proteína que disocia. Breve Descripción de los Dibujos Una ilustración adicional de la presente invención se proporciona haciendo referencia a los dibujos adjuntos, los cuales se establecen a continuación en las figuras de la 1 a la 18. La figura 1 ilustra una construcción de proteasa de rFurina activa expresada en una modalidad de la presente invención. La construcción de rFurina es truncada en la terminal en el extremo de la terminal C en los aminoácidos AA 577 para remover la transmembrana rica en Cys y de los dominios de citosol. La figura 2 ilustra un pedigree de la generación del clon CHO/rFurina #488-3. La figura 3 muestra un pedigree de la generación de un clon CHO/rFurina #289-20. La figura 4 establece una comparación de la distribución gráfica de los productores de rFurina en la población celular de PMCB#01 y PMCB#04. El 80.74% de las células en el PMCB#04 expreso en la rFurina; el 74.06% de las células en el PMCB#01 expreso en la rFurina. La figura 5 muestra una "Matriz de Doehlert" en donde se combinaron cinco temperaturas con tres valores de pH, dando como resultado siete combinaciones de temperatura y pH. La figura 6 muestra un análisis de una gráfica de la superficie de los datos haciendo referencia a la productividad volumétrica. Las coordenadas de los datos en la figura 6 son marcadas como puntos. La superficie muestra la correlación asumida de los datos sencillos. La figura 7 muestra una gráfica del contorno la cual ¡lustra la influencia de la temperatura y el pH en la productividad volumétrica. Los puntos indican las condiciones (pH/temperatura) que habían sido probadas experimentalmente.

La figura 8 muestra una gráfica de superficie la cual es una ilustración tridimensional que demuestra la influencia fuerte de la temperatura y la influencia débil del pH en la productividad volumétrica. La figura 9 muestra una gráfica de superficie que ilustra la correlación diseñada tridimensionalmente; que demuestra la relación cuadrática y muestra claramente un máximo para el índice de crecimiento en una temperatura de 36.5°C. La figura 10 establece un análisis de los datos haciendo referencia a la productividad específica. Existe una correlación similar de la productividad específica con la temperatura y el pH como se puede observar de la productividad volumétrica. La figura 11 muestra que disminuyendo una temperatura de 37°C a 35.1°C, la productividad volumétrica podría ser aumentada desde aproximadamente 200 kU/L/d a 540 kU/L/d. La figura 12 muestra el SDS-page y la tinción de plata para la rFurina. Los patrones de la banda de los eluidos Capto-MMC de la campaña ORFU06002 y ORFU07002 se correlaciona con un alto grado, todas las muestras ilustran una banda de Furina prominente en aproximadamente 60 kDa. Es visible una tendencia a pesos moleculares ligeramente inferiores de las bandas de furina en las muestras de la campaña ORFU06002 de los lotes MMC01 a MMC08 (figura 12, columnas 1-8). La figura 13 muestra un análisis Western blot de las muestras utilizando el anticuerpo monoclonal anti-Furina. La figura 14 muestra los patrones de banda específica para la rFurina del enfoque isoeléctrico (IEF) y el Western blotting posterior de las muestras de rFurina de la campaña ORFU06002. La figura 15 muestra un patrón de banda específico para la rFurina del enfoque isoeléctrico (IEF) y el Western blotting posterior de las muestras de rFurina de la campaña ORFU07002. La figura 16 muestra los resultados del Western blot para la rFurina del enfoque isoeléctrico (IEF) y el Western blotting posterior de las muestras de rFurina de la campaña ORFU07002. La figura 17 muestra un HPLC de Fase Inversa de Furina para las muestras de la campaña ORFU06002 (eluidos Capto-MMC). Las muestras fueron probadas con HPLC C4 RP con el objeto de establecer un patrón de indicios para la rFurina. La figura 18 muestra un HPLC de Fase Inversa de Furina para las muestras de la campaña ORFU07002 (eluidos Capto-MMC). Las muestras fueron probadas con HPLC C4 RP con el objeto de establecer un patrón de indicios para la rFurina. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere al desarrollo y producción de una línea de células huésped recombinantes que tienen la capacidad de crecer en un medio libre de suero y secretar furina recombinante activa (rFurina) en el sobrenadante del cultivo celular. La línea de célula huésped seleccionada para la transfección de un plásmido que codifica la furina recombinante se encuentra en un aspecto de la misma como se utilizó para la expresión del Factor VIII recombinante y la VWF recombinante. La rFurina resultante entonces es purificada de modo que es substancialmente libre de proteína animal. La furina, también conocida como PACE, PACE4, PC1/PC3, PC2, PC4 y PC5/PC6, pertenece al grupo de las proteasas de serina similares a subtilisina, el cual juega un rol importante en la disociación de las proproteínas, especialmente la síntesis de secreción (Van de Ven y asociados, Crit. Rev. Oncogen. 4: páginas 115 a 136, 1993). Las pro-proteínas son procesadas intracelularmente después de la traducción a su forma madura por las proteasas endógenas en el aparato de Golgi. El sitio de disociación de una proteasa comprende una secuencia de reconocimiento en la cual se caracteriza por la secuencia de aminoácidos Arg-X-Lys/Arg-Arg . La furina de la proteasa disocia las proproteínas específicamente después de esta secuencia de consenso (Hosaka y asociados, J. Biol. Chem. 266: páginas 12127 a 12130, 1991). El ADN y la secuencia de aminoácido de la furina humana y múrida, así como las proteínas adicionales con la función de proteasa similar a subtilisina han sido identificadas (Roebroek y asociados, en Mol. Biol. Rep. 11: páginas 117 a 125, 1986; Roebroek y asociados, en EMBO J. 5: páginas 2197 a 2202, 1986; Barr y asociados, en DNA Cell Biol. 10: páginas 319 a 328, 1991; Van den Ouweland y asociados, en Nucleic Acids Res. 17: páginas 7101 a 7102, 1989; Van den Ouweland y asociados, en Nucleic Acids Res. 18: página 664, 1990; Smeekens y asociados, 1990, en J. Biol. Chem. 265: páginas 2997 a 3000; Smeekens y asociados, en Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 88; páginas 340 a 344, 1991; Kiefer y asociados, en ADN Cell Biol. 10: páginas 757, 1991; Nakayama y asociados, en J. Biol. Chem. 267: páginas 5897 a 5900, 1992; y Hatsuzawa y asociados, en J. Biol. Chem. 265: páginas 22075 a 22078, 1990). El gen de furina humana codifica una proteína que consiste de 794 aminoácidos, siendo distribuido en ciertas funciones para regiones características individuales; un centro catalítico, un dominio medio, una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico (Van de Ven y asociados, Crit. Rev. Oncogen. 4: páginas 115 a 136, 1993). En un aspecto, el polipéptido de furina humano es establecido en el GenBank No: de Acceso EAX02111 (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, MD). Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que cualquier proteína que tiene una actividad biológica de furina, por ejemplo, la capacidad para disociar las pro-proteínas (por ejemplo, pro-VWF para producir la VWF madura) puede ser producido mediante los métodos aquí descritos. La furina intacta es incorporada en el sistema de membrana del aparato de Golgi en donde es activa funcionalmente (Bresnahan y asociados, en J. Cell Biol. 111: páginas 2851 a 2859, 1990). Una forma truncada de la furina natural sobre-expresada de 75 a 80 kD podría ser detectada en el sobrenadante celular como proteína secretada (Wise y asociados, en Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 87: páginas 9378 a 9382, 1990). Esta furina secretada naturalmente es conocida como "furina pérdida" (Vidricaire y asociados, en Biochem. Biophys. Res. Comm. 195: páginas 1011 a 1018, 1993) y es disociada en la terminal N de la porción de trans-membrana (Vey y asociados, en J. Cell Biol. 127: páginas 1829 a 1842, 1994). El truncado de furina mediante diseño genético, en el cual la parte codificadora de los dominios transmembrana y citoplasmático han sido eliminados, también puede ser expresada y secretada de manera correspondiente. Dichas eliminaciones de la terminal N se han descrito para los aminoácidos del 714 al 794 (Leduc y asociados, en J. Biol. Chem. 267: páginas 14304 a 14308, 1992, Molloy y asociados, en J. Biol. Chem. 267: páginas 16396 a 16402, 1992); para los aminoácidos del 716 al 794 ("Sol-PACE") (Wasley y asociados, en J. Biol. Chem. 268: páginas 8458 a 8465, 1993; y Rehemtulla y asociados, en Blood 79: páginas 2349 a 2355, 1992); y para los aminoácidos del 705 al 794 (Hatsuzawa y asociados, en J. Biol. Chem. 267: páginas 16094 a16099, 1992). Los mutantes de furina comprenden adicionalmente una eliminación de la región rica en cisteína que también ha sido descrita (Hatsuzawa y asociados, en J. Biochem. 101: páginas 296 a 301, 1992; Creemers y asociados, en J. Biol. Chem. 268: páginas 21826 a 21834, 1993). La actividad endoproteolítica de la furina y su selectividad para los aminoácidos básicos fue determinada primero en experimentos con el factor pro-von Willebrand (pro-vWF). El pro-vWF consiste de un propolipéptido con 741 aminoácidos y el factor maduro de von Willebrand (vWF) con 2050 aminoácidos (Verweij y asociados, en EMBO J. 5: páginas 1839 a 1847, 1986). La liberación de vWF del pro-vWF es el resultado de una disociación proteolítica después del Arg763. La transfección de cADN del pro-vWF en vectores de expresión eucariótica tienen como resultados la producción de cantidades equimolares del 360 kD pro-vWF y de la vWF madura de 260 kD en el sobrenadante del cultivo celular. El vWF es probablemente procesado en su forma madura en células transfectadas, mediante la furina que ocurre de manera endógena (Wise y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 87: páginas 9378 a 9382, 1990, Van de Ven y asociados, Mol. Biol. Rep. 14: páginas 265 a 275, 1990). Entre las pro-proteínas adicionales que son disociadas por la furina y por las enzimas similares a subtilisina, respectivamente, se encuentra una serie de hormonas y factores de crecimiento (por ejemplo, proactivina A, factor de crecimiento de hepatocitos), proteínas de plasma (albúmina, factor VII, factor IX, factor X), receptores (pro-receptor de insulina), proteínas virales (por ejemplo, HIV-1 gp160, hemaglutinina del virus de influenza) así como proteínas bacteriales (toxina de difteria, toxina de ántrax) (Decroly y asociados, J. Biol. Chem. 269: páginas 12240 a 12247, 1994; Stieneke-Grober y asociados, EMBO J. 11: páginas 2407 a 2414, 1992; Barr, Cell 66: páginas 1 a 3, 1991, Wasley y asociados, J. Biol. Chem. 268: páginas 8458 a 8465, 1993; Klimpel y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89: páginas 10277 a 10281, 1992; Tsuneoka y asociados, J. Biol. Chem. 268: páginas 26461 a 26465, 1993; Bresnahan y asociados, J. Cell. Biol. 111: páginas 2851 a 2859, 1990; Hosaka y asociados, J. Biol. Chem. 266: páginas 12127 a 12130, 1991; y Vey y asociados, J. Cell. Biol. 127: páginas 1829 a 1842, 1994). La rFurina de la presente invención está contemplada para utilizarse para la disociación de estas pro-proteínas también. Mediante la co-expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican la furina intacta y la pro-proteína en los cultivos de células eucarióticas, como un procesamiento aumentado de las pro-proteínas ha sido logrado in vivo. Esto ha sido demostrado, por ejemplo, por el pro-factor IX (Wasley y asociados, J. Biol. Chem. 268: páginas 8458 a 8465, 1993) y para pro-vWF (WO 91/06314; Van de Ven y asociados, Mol. Bio. Rep. 14: páginas 265 a 275, 1990; y Rehemtulla y asociados, Blood 79: páginas 2349 a 2355, 1992). La presente invención contempla que la rFurina de la presente invención es útil tanto para el procesamiento in vitro como in vivo de cualquier pro-proteína que disocia. Además de la co-expresión de la furina intacta con pro-proteínas, la furina truncada ha sido expresada junto con las pro-proteínas. Los mutantes de eliminación de furina se han mostrado como activos enzimáticamente cuando son coexpresados in vivo y como son secretados; la actividad enzimática de dichos mutantes de eliminación podría ser detectada entre otras cosas en el procesamiento del pro-factor IX (Wasley y asociados, J. Biol. Chem. 268: páginas 8458 a 8465, 1993) y pro-vWF (Rehemtulla y asociados, Blood 79: páginas 2349 a 2355, 1992). Los experimentos de co-expresión con los mutantes de eliminación de furina mostraron que la transmenbrana y las partes citoplasmáticas de la proteína no son esenciales para la función catalítica (Rehemtulla y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89: páginas 8235 a 8239, 1992). El documento WO 91/06314 describe la expresión recombinante de la furina en células procarióticas y eucarióticas, y la preparación de las proteínas de fusión de furina, eliminación de mutantes y fragmentos, la purificación de la furina preparada de manera recombinante y el uso potencial de la furina purificada para el procesamiento de pro-proteínas in vitro en general. El documento WO 92/09698 describe la expresión de PACE (furina), la co-expresión de los precursores inactivos de las proteínas, tales como, por ejemplo pro-vWF, así como la preparación de proteínas de fusión. Stieneke-Grober y asociados, (EMBO J. 11: páginas 2407 a 2414, 1992) describe la disociación in vitro de la proteína HA del virus de la influencia por medio de la furina purificada. Decroly y asociados (J. Biol. Chem. 269: páginas 12240 a 12247, 1994) describe la disociación in vitro de HIV gp160 por medio de la furina. En experimentos con furina acortada en la terminal C, la disociación de la pro-albúmina y el complemento Pro-C3 (Oda y asociados, Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: páginas 1353 a 1361, 1992), toxina del ántrax (Klimpel y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci E.U.A. 89: páginas 10277 a 10281, 1992), la toxina de la difteria (Tsuneoka y asociados, J. Biol. Chem. 268: páginas 26461 a 26465, 1993) y el pro-factor IX (Wasley y asociados, J. Biol. Chem. 268: páginas 8458 a 8468, 1993, Bristol y asociados, Biochemistry 33: páginas 14136 a 14143, 1994) han sido llevados a cabo exitosamente in vitro. La rFurina de la presente invención, por lo tanto está contemplada para utilizarse en el procesamiento in vivo e in vitro de las pro-proteínas como se describieron anteriormente. En un aspecto, la rFurina de la presente invención es especialmente útil en el procesamiento in vitro de la pro-VWF y el pro-factor IX. Sin embargo, su uso no deberá ser interpretado como que limita el procesamiento de dichas proteínas. En un aspecto adicional, la rFurina de la presente invención es particularmente útil en el procesamiento ¡n vitro de las proproteínas recombinantes. Un aspecto adicional de la presente invención, es el co-cultivo de células las cuales expresan la pro-vWF y rFurina. Por lo tanto, la pro-vWF en el sobrenadante del cultivo celular es disociado ¡n vitro en su forma activa por la rFurina la cual también está presente en el sobrenadante del cultivo celular. La vWF procesada es aislada subsecuentemente del cultivo y purificada, como se explica en la Patente Norteamericana No. 6,210,929, incorporada a la presente descripción como referencia. Para el co-cultivo, todos los sistemas de expresión común pueden ser utilizados, y varios sistemas para expresar la pro-vWF y la rFurina pueden ser combinados entre ellos. En un aspecto, un sistema de expresión es utilizado en el cual ambas de la pro-vWF y la rFurina son expresadas en las células huésped del mismo origen. El término "célula huésped" se utiliza para referirnos a una célula la cual ha sido transformada, o tiene la capacidad de ser transformada como una secuencia de ácido nucleico y luego de expresar un gen de interés seleccionado. El término incluye la progenie de la célula de origen, siendo o no idéntica a la progenie en morfología, o en la conformación genética a la célula original, siempre que el gen seleccionado esté presente. La presente invención incluye cualesquiera células huésped o huéspedes conocidas en la técnica para la producción de proteínas recombinantes. Por lo tanto, las células de la presente invención pueden ser derivadas de cualquier fuente. En un aspecto, la presente invención incluye células huésped, eucarióticas y procarióticas. En otro aspecto, la presente invención incluye células de plantas, células de animales, células de peces, células de anfibios, células de aves, células de insectos, y células de levadura. En un aspecto, las células de levadura de ejemplo incluyen Pichia, por ejemplo P. pastoris, y Saccharomyces por ejemplo S. cerevisiae, así como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, K. Zactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans, y K. marxianus; K. yarrowia; Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Neurospora, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus, A. nidulans, A. niger, Hansenula, Candida, Kloeckera, Torulopsis, y Rhodotorula. Las células de insecto de ejemplo incluyen Autographa californica y Spodoptera frugiperda, y Drosophila . En un aspecto adicional, las células huésped son células de mamífero, incluyendo células primarias del epitelio (por ejemplo, queratinocitos, células del epitelio cervical, células del epitelio bronquial, células del epitelio traqueal, células del epitelio del riñon, y células del epitelio de la retina) y las líneas celulares establecidas y sus cepas (por ejemplo, las células embrionarias de riñon 293, células BHK, células del epitelio cervical HeLa, y células de la retina PER-C6, células MDBK (NBL-1), células 911, células CRFK, células DCK, células CHO, células BeWo, células Chang, células Detroit 562, células HeLa 229, células HeLa S3, células Hep-2, células KB, células LS 180, células LS 174T, células NCI-H-548, células RPMI 2650, células SW- 3, células T24, células WI-28 VA13. 2RA, células WISH, células BS-C-I, células LLC-MK2, células de Clon M-3, células del 1 al 10, células RAG, células TCMK-1, células Y-1, células LLC-PKi, células PK(15), células GH,, células GH3, células L2, células LLC-RC 256, células ??,?,, células XC, células MDOK, células VSW, y células TH-I, células B1, o derivados de las mismas), las células del fibroblasto de cualquier tejido u órgano (incluyendo pero sin limitarse a, del corazón, hígado, riñon, colon, intestinos, esófago, estómago, tejido neural (del cerebro, espina dorsal), pulmón, tejido vascular (arterias, venas, capilares), del tejido linfoide (glándulas linfáticas, adenoides, amígdalas, médula ósea y sangre), del bazo y líneas celulares del fibroblasto y similares a las del fibroblasto. Las células de ovario de hámster Chino (CHO), células TRG-2, células IMR-33, células Don, células GHK-21, células de citrulinemia, células Dempsey, células Detroit 551, células Detroit 510, células Detroit 525, células Detroit 529, células Detroit 532, células Detroit 539, células Detroit 548, células Detroit 573, células HEL 299, células I MR- 90, células MRC-5, células WI-38, células WI-26, células MiCh, células CV-1, células COS-1, células COS-3, células COS-7, células Vero, células DBS-FrhL-2, células BALB/3T3, células F9, células SV-T2, células M-MSV-BALB/3T3, células K-BALB, células BLO-11, células NOR-10, células C.sub.3H/IOTI/2, células HSDM1C3, células KLN205, células McCoy, células Ratón L, células de la Cepa 2071 (Ratón L), células de la cepa L-M (Ratón L), células L-MTK (Ratón L), NCTC clones 2472 y 2555, células SCC-PSA1, células Suiza/3T3, células Indias muntjac, células SIRC, células C.sub.ll, y células Jensen, o derivado de las mismas). Las células de mamífero de ejemplo incluyen variedades de CHO, BHK, HEK-293, NSO, YB2/3, SP2/0, y células humanas tales como PER-C6 ó HT1080, así como VERO, HeLa, COS, MDCK, NIH3T3, Jurkat, Saos, PC-12, HCT 116, L929, Llk-, WI38, CV1, TM4, W138, Hep G2, MMT, una célula leucémica, una célula madre embrionaria, o una célula de huevo fertilizado. En un aspecto de la presente invención, una célula huésped de ejemplo es una célula CHO. En un aspecto adicional de la presente invención, el medio es utilizado para cultivar células CHO en suspensión. Las células huésped pueden ser diseñadas para expresar una proteína de una variedad de medios conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a la inserción de ácido nucleico exógeno que codifica la proteína deseada, opcionalmente como parte de un vector de expresión, inserción de una secuencia de control de expresión exógena de modo que ocasiona la expresión aumentada del gen endógeno de las células huésped que codifican la proteína deseada, o la activación de la secuencia de control de expresión endógena de las células huésped para aumentar la expresión del gen endógeno que codifica la proteína deseada. Los cultivos de células huésped pueden ser preparados de acuerdo con cualesquiera métodos conocidos en la técnica, y métodos de cultivo tales como células huésped y la recuperación de proteínas recombinantes producidas por las células, ya sea de las células o del medio de cultivo son conocidos en la técnica. Dichos métodos de cultivo pueden comprender la adición de inductores químicos de producción de proteínas al medio de cultivo. Las células huésped de ejemplo y procedimientos se describen más adelante. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de furina es insertado en un vector de expresión apropiado utilizando las técnicas estándar de biología molecular. En un aspecto, el ácido nucleico codifica el polipéptido de furina humana como se establece en el GenBank No: de Acceso EAX02111 (National Center for Biotech nology Information, U.S. National Library of Medicine, Bethesda, MD), sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que cualquier proteína que tenga actividad biológica de furina, es decir, la capacidad para disociar la pro- VWF para producir VWF madura, puede ser producida por los métodos aquí descritos. En un aspecto adicional, se diseñó una rFurina secretada completamente, y truncada en la terminal C, eliminando nucleótidos que codifican los aminoácidos del 578 al 794 que comprende los dominios transmembrana, ricos en cisteína y citoplásmico. Todavía en un aspecto adicional, se puede agregar una cola de aminoácidos para ayudar en los procesos de purificación. Todavía en otro aspecto, la cola de 10 residuos de histidina fue agregada después del aminoácido 577, con o sin cuatro residuos de glicina interyacentes que sirven como un enlazador flexible. Los vectores de expresión opcionalmente pueden incluir un promotor, una o más secuencias mejoradoras, un origen de duplicación, una secuencia de terminación de transcripción, una secuencia de intrones completa que contiene un sitio de empalme donante o aceptador, una secuencia que codifica un líder o secuencia de señal para la secreción de polipéptidos, un sitio de enlace del ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poli-enlazador para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que va a ser expresado, y/o un elemento marcador que se puede seleccionar. Cada una de estas secuencias se explican más adelante. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia codificadora de "etiqueta", por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos localizados en el extremo 5" o 3* y la secuencia de codificación del polipéptido de furina; la molécula del oligonucleótido codifica el polyHis (tal como hexaHis), u otra "etiqueta" tal como FLAG, HA (virus de influenza de hemaglutinina) o myc para el cual existen anticuerpos que se consiguen comercial mente. Esta etiqueta generalmente es fusionada al polipéptido al momento de la expresión del polipéptido, y puede servir como un medio para la detección o purificación de afinidad del polipéptido de furina de la célula huésped. Los vectores adecuados incluyen, pero no están limitados a, cósmidos, plásmidos, o virus modificados, pero se podrá apreciar que el sistema del vector debe ser compatible con la célula huésped seleccionada. En un aspecto, el vector es un plásmido. En un aspecto adicional, el plásmido es un vector de clonación basado en pUC. Otros vectores que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen vectores de expresión, vectores de duplicación, vectores de generación de muestras, vectores elaboradores de secuencia y vectores retrovirales. Los vectores contemplados por la presente invención incluyen pero no están limitados a microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófagos, plásmidos, fagémidos o vectores de expresión ADN cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insectos infectadas con los vectores de expresión viral (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transfectados con vectores de expresión del virus (por ejemplo, el Virus de Mosaico de la Coliflor, CaMV; y Virus de Mosaico de Tabaco, TMV), o transformados con vectores de expresión bacterial (por ejemplo, con el plásmido Ti o pBR322); o hasta los sistemas de células de animales. Los vectores de expresión de mamíferos generalmente comprenden un origen de duplicación, un promotor adecuado, y también cualesquiera sitios de enlace del ribosoma necesarios, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptadores de empalme, sitios de terminación de transcripción y secuencias no transcritas que flanquean el extremo 5'. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, el origen SV40, promotor temprano, el aumentador, el empalme y los sitios de poliadenilación pueden ser utilizados para producir los elementos del control de expresión requeridos. Los vectores eucarióticos de ejemplo incluyen pcADN3, pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, y pVITR03. El ácido nucleico puede ser transferido en las células huésped por cualesquiera medios conocidos en la técnica, por ejemplo, a través de la transferencia portada por liposomas, la transferencia portada por el receptor (complejo ligando-ADN), electroporación, microinyección de ADN, fusión de células, DEAE-dextrano, cloruro de calcio, precipitación de fosfato de calcio, bombardeo de micropartículas, infección con vectores virales, lipofección, transfección o recombinación homologa. El término "transformado" o "transfectado" como se usa en la presente descripción se refiere a una célula huésped modificada para que contenga un polinucleótido exógeno, el cual puede ser integrado en el cromosoma de la célula huésped o mantenido como un elemento del episoma. Se contempla que en ciertos aspectos de los métodos proporcionados, la célula huésped es transfectada en un "paso de transfección". El método puede comprender sitios múltiples de transfección. Además, otros métodos conocidos en la técnica para introducir los polinucleótidos exógenos en las células huésped, incluyendo por ejemplo, la electroporación y la fusión celular los cuales no son técnicamente (transformación) y se encuentran dentro de la definición del término "transformación" para propósitos de la presente descripción. La presente invención también proporciona métodos de cultivo, por ejemplo el cultivo de células huésped bajo condiciones que dan como resultado la expresión de la proteína rFurina. Dichos métodos incluyen el paso de la recuperación de la rFurina producida por las células huésped del medio de cultivo. En un aspecto de ejemplo, las células huésped son cultivadas en un medio libre de suero definido químicamente. Debido a que el suero es un material indefinido bioquímicamente, contiene muchos componentes los cuales no han sido completamente identificados, difiere de lote a lote y es frecuentemente contaminado con microorganismos, tales como virus y microplasmas, la presencia del suero en la producción recombinante de rFurina no es deseable. Además, la presencia de proteínas animales en el suero en el medio de cultivo puede requerir procedimientos de purificación muy largos. La presente invención por lo tanto proporciona un medio de cultivo definido bioquímicamente esencialmente libre de proteínas animales, para cultivar las células de manera recombinante transfectadas con el gen de furina humano. Los componentes del medio en su mayor parte son orgánicos, sintéticos o recombinantes y como tales no son obtenidos directamente de fuente animal alguna. El medio de cultivo de células de la presente invención puede comprender uno o más compuestos de reemplazo y puede comprender uno o más compuestos de reemplazo los cuales pueden ser compuestos de enlace de metal y/o pueden comprender uno o más complejos que comprenden uno o más compuestos de reemplazo. En algunas modalidades, el medio puede comprender uno o más complejos, comprendiendo dichos complejos uno o más elementos de transición o sales o iones de los mismos formados en complejos de uno o más compuestos de reemplazo los cuales pueden ser compuestos de enlace de metal. En algunas modalidades, el medio tiene la capacidad de soportar el cultivo de las células in vitro y permite la transfección de células cultivadas en el mismo.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el elemento de transición preferentemente es seleccionado del grupo consistente de escandio, titanio, vanadio, cromo, manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, zinc, itrio, circonio, niobio, molibdeno, tecnetio, rubidio, rodio, paladio, plata, cadmio, lantano, hafnio, tántalo, tungsteno, renio, osmio, iridio, platino, oro, mercurio, y actinio, o sales de iones de los mismos, y preferentemente es una sal de hierro. Las sales de hierro adecuadas incluyen pero no están limitadas a, FeCI3, Fe(NOa)3 o FeS04 u otros compuestos que contienen iones de Fe + + + o Fe + + . Los compuestos de enlace de metal en el medio incluyen cualesquiera macromoléculas las cuales pueden interactuar con o enlazarse con los elementos de transición y facilitar su asimilación por las células. Dicha interacción/enlace puede ser de naturaleza covalente o no covalente. El compuesto de enlace de metal utilizado en este aspecto de la presente invención preferentemente es seleccionado del grupo consistente de un poliol, un derivado de hidroxipiridina, un 1 ,3,5-N,N',N"-tris(2,3-dihidroxibenzoil)amino-metilbenceno, un ácido etilendiamin-?,?'-tetrametilenfosfónico, trisuccina, un sacárido ácido (por ejemplo, gluconato ferroso), un glucosaminoglicano, un ácido dietilentriaminpentaacético, un ácido nicotínico, un ácido N-óxido, 2-hidroxi-nicotínico, mono-, bis-, o tris-substituido por 2,2'-bipiridina, un derivado de hidroxamato (por ejemplo, ácido acetohidroxámico), y un derivado de aminoácido, deferoxamina, ferrioxamina, forfina básica de hierro y derivados de la misma, DOTA-lisina, texafirina, safirina, un ácido poliaminocarboxílico, un ácido alfa hidroxicarboxílico, un polietilencarbamato, etil maltol, 3-hidroxi-2-piridina, y IRC011. En un aspecto, el compuesto de enlace de metal es un poliol tal como sorbitol o dextrano, y particularmente sorbitol. En un aspecto relacionado, el compuesto enlazador del metal es un derivado de hidroxipiridina, tal como 2-hidroxipiridina-N-óxido, 3-hidroxi-4-pirona, 3-hidroxipipirid-2-ona, 3-hidroxipirid-2-ona, 3-hidroxipirid-4-ona, 1 -hidroxipirid-2-ona, 1 , 2 -d i m e t i I - 3 -hidroxipirid-4-ona, 1-metil-3-hidroxipirid-2-ona, 3-hidroxi-2(1H)-pirídinona, etil maltol o piridoxol isonicotinil hidrozona. Los compuestos de enlace de metal de la presente invención también se pueden enlazar a cationes divalentes tales como as Ca + + y g + + . El medio de cultivo de la presente invención puede comprender uno o más ingredientes seleccionados de grupos consistentes de adenina, etanolamina, D-glucosa, heparina, un agente de regulación, hidrocortisona, insulina, ácido linoleico, ácido lipoico, fenol rojo, fosfoetanolamina, putrescina, piruvato de sodio, tri-yodotironina , timidina, L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L-glutámico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L- triptofano, L-tirosina, L-valina, N-acetil-cisteína, biotina, cloruro de colina, D-Ca++-pantotenato, ácido f ó I ico , i-inositol, niacinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, vitamina B12, Plurónico F68, insulina recombinante, sal de calcio, CuS04, FeS04, FeCI3, Fe(N03) 3, KCI, una sal de magnesio, una sal de manganeso, acetato de sodio, NaCI, NaHC03, Na2HP0 , Na2S04, una sal de selenio, una sal de silicón, una sal de molibdeno, una sal de vanadio, una sal de níquel, una sal de estaño, ZnCI2, ZnS04 u otras sales de zinc, en donde cada ingrediente es agregado en una cantidad que soporta el cultivo celular in vitro. En otro aspecto, el medio de cultivo de la presente invención puede comprender opcionalmente uno o más suplementos seleccionados del grupo consistente de uno o más de citocinas, peptona de soya, uno o más péptidos de levadura, uno o más péptidos de plantas (más preferentemente uno o más de arroz, aloe vera, soya, maíz, trigo, chícharo, calabaza, espinacas, zanahoria, papas, papa dulce, tapioca, aguacate, cebada, coco y/o, ejotes y/o una o más de otras plantas), ver la Solicitud Internacional No. PCT/US97/18255, publicada en el documento WO 98/15614. El medio de cultivo de la presente invención también puede incluir opcionalmente uno o más agentes de regulación para mantener el pH óptimo. Los agentes de regulación adecuados incluyen pero no están limitados a ácido N-[2- h¡droxietil]-piperazin-N'-[2-etansulfónico (HEPES), MOPS, MES, fosfato, bicarbonato y otros agentes de regulación adecuados para utilizarse en aplicaciones de cultivo celular. Un agente de regulación adecuado es uno que proporciona la capacidad de regulación sin citotoxicidad substancial para las células cultivadas. La selección de los agentes de regulación adecuados se encuentra dentro del ámbito de los expertos en la técnica del cultivo celular. Los componentes del medio anteriormente descritos cuando son mezclados juntos en solución forman un medio de cultivo completo de la presente invención. Un medio de cultivo completo es adecuado para utilizarse en el cultivo de una variedad de células de mamífero, como se describe con mayor detalle más adelante. Basados en la información aquí obtenida y el conocimiento poseído por los expertos en la técnica, un experto en la técnica puede obtener las formulaciones de medios operativos sin experimentación indebida. Inicialmente y antes de la adaptación para el cultivo en un medio libre de suero definido químicamente, las células huésped pueden ser cultivadas en medios estándar bien conocidos para los expertos en la técnica. Los medios contendrán usualmente todos los nutrientes necesarios para el cultivo y sobrevivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células eucarióticas son, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio 1640 (RPMI 1640), Medio Esencial Mínimo (MEM), y/o Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), DMEM/F12, y el medio ExCell 325, todos los cuales pueden ser suplementados con suero y/o factores de crecimiento según sea indicado por la línea celular particular que está siendo cultivada. Sin embargo, de manera notable la presente invención prevé que el suero en el medio sea entonces removido del cultivo para obtener células huésped que puedan cultivarse en un medio libre de suero. Por lo tanto, la presente invención proporciona medios óptimos para el cultivo de células huésped bajo condiciones libres de suero para la producción mínima de rFurina. En un aspecto adicional, las células son cultivadas en un medio libre de suero en un cultivo en suspensión. Las recetas para los diferentes medios de la presente invención se proporcionan en los Ejemplos de la misma. En un aspecto, un antibiótico u otro compuesto útil para el cultivo selectivo de las células transformadas es agregado al medio como un suplemento. El compuesto que va a ser utilizado será indicado por el elemento marcador que se puede seleccionar presente en el plásmido con el cual la célula huésped fue transformada. Los marcadores que se pueden seleccionar que confieren resistencia a los fármacos particulares que son generalmente tóxicos a una célula de animales pueden ser utilizados en los métodos y composiciones de la presente invención. Por ejemplo, en donde el elemento del marcador que se puede seleccionar es la resistencia a la canamicina, el compuesto agregado al medio de cultivo será canamicina. Otros compuestos para el cultivo selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina, geneticina, neomicina, zeomicina (zeo); puromicina (PAC); Blasticidina S (BlaS), y GPT. Los marcadores adicionales que se pueden seleccionar son conocidos en la técnica y útiles en las composiciones y métodos de la presente invención. Las enzimas metabólicas que provienen de la sobrevivencia de las células o la muerte inducida de las células bajo las condiciones prescritas también pueden ser utilizadas en los métodos y composiciones de las invenciones. Los ejemplos incluyen pero no están limitados a: reductasa de dihidrofolato (DHFR); cinasa de timidina del virus de herpes simplex (TK), fosforibosiltransferasa de hipoxantina-guanina (HGPRT), y fosforibosiltransferasa de adenina (APRT), los cuales son genes que pueden ser empleados en las células que carecen de TK, HGPRT o APRT, respectivamente. El experto en la técnica apreciará, sin embargo, que el producto de rFurina de la presente invención será especialmente libre de estas proteínas agregadas. El medio puede ser utilizado para cultivar cualesquiera células huésped y huéspedes conocidos en la técnica para la producción de proteínas recombinantes. En un aspecto de la presente invención, una célula huésped de ejemplo es una célula CHO. En un aspecto adicional de la presente invención, el medio es utilizado para cultivar células CHO en suspensión. Cuando la proteína recombinante de interés es secretada en el medio por las células huésped, el medio puede ser cultivado periódicamente de modo que las mismas células huésped puedan ser utilizadas a través de varios ciclos de recolección. El medio de cultivo puede ser agregado en un proceso de lote, por ejemplo, en donde el medio de cultivo es agregado una vez a las células en un solo lote, o en un proceso de lote alimentado en el cual los lotes pequeños del medio de cultivo son periódicamente agregados. El medio puede ser recolectado al final del cultivo o varias veces durante el cultivo. Los procesos de producción perfundidos continuamente también son conocidos en la técnica, y comprenden la alimentación continua de medio fresco en el cultivo, mientras que el mismo volumen es retirado continuamente del reactor. Los cultivos perfundidos generalmente logran densidades celulares más altas que los cultivos en lote y pueden ser mantenidos por semanas o meses con recolecciones repetidas. Por lo tanto, los cultivos de quimiostato y los cultivos de reducción en lotes ambos son adecuados para la manufactura de rFurina, y son otros métodos de cultivo conocidos en la técnica. Una variedad de sistemas de cultivo son conocidos en la técnica, incluyendo los matraces-T, los matraces con barras y agitadores, las botellas con rodillos y bio-reactores de tanque agitado. El cultivo de botellas de rodillos generalmente se lleva a cabo sembrando las células de las botellas de rodillos que generalmente son parcialmente llenadas (por ejemplo, con una capacidad del 10% al 30%), con medio y lentamente girado, permitiendo que las células se enlacen a los lados de las botellas y cultivados a la confluencia. El medio celular es recolectado decantando el sobrenadante el cual es reemplazado por un medio fresco. Las células dependientes de ajnclaje también pueden ser cultivadas o en microportadores, por ejemplo, esferas poliméricas que son mantenidas en suspensión en los bio-reactores de tanque agitado, alternativamente las células pueden ser cultivadas en una suspensión de una sola célula. La cantidad de rFurina producida por la célula huésped puede ser evaluada utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen sin limitación, el análisis Western blot, la electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis de gel de no desnaturalización, separación por Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC), inmunoprecipitación, el análisis de ELISA, y/o ensayos de actividad tales como el cambio del gel de enlace de ADN. La presente invención también contempla que la productividad específica (expresada como cantidad de proteína/célula/día) de rFurina puede ser evaluada utilizando métodos estándar como es conocido en la técnica y como aquí se describen. "rFurina substancialmente de proteína animal" es definido como que comprende preparaciones de rFurina que comprenden proteína de célula huésped y una concentración la cual se encuentra en un rango de entre aproximadamente 0.1 a 0.6 ng de proteína o menos/unidad de actividad de furina o entre aproximadamente 2 y 11 pg de proteína o menos/mL y, que carecen esencialmente de proteínas contaminantes del suero en el medio de cultivo. En un aspecto, la rFurina substancialmente libre de proteína animal comprende preparaciones de rFurina que comprenden ADN de células huésped en una concentración la cual se encuentra en un rango de entre aproximadamente 0 a 0.4 pg de ADN o menos/unidad de actividad de furina o entre aproximadamente 0 y 24 ng de ADN o menos/mL y que carecen esencialmente de proteínas contaminantes del suero en el medio de cultivo. En un aspecto, las células huésped que expresan la rFurina son cultivadas en un medio libre de suero definido químicamente. Alternativamente, las células pueden ser cultivadas en un medio con suero y purificadas de acuerdo con los métodos aquí proporcionados. Las células huésped que expresan la rFurina son cultivadas en suspensión en un medio libre de substancias derivadas de animales (incluyendo humanos), bajo condiciones quimiostáticas. Las células son removidas por filtración y el sobrenadante del cultivo de células que contiene rFurina es concentrado por ultrafiltracion y purificado por cromatografía de intercambio de iones para que resulte en una solución de rFurina con una actividad de por lo menos aproximadamente 1000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 2000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 3000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 4000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 5000 Unidades/ml , de por lo menos aproximadamente 6000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 7000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 8000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 9000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 10000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 15000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 20000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 25000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 30000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 35000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 40000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 45000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 50000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 55000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 60000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 65000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 70000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 75000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 80000 Unidades/mi, de por lo menos aproximadamente 85000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 90000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 95000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 100000 Unidades/ml,, de por lo menos aproximadamente 120000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 140000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 160000 Unidades/ml , de por lo menos aproximadamente 180000 Unidades/ml, de por lo menos aproximadamente 200000 Unidades/ml, y de i por lo menos aproximadamente 500000 Unidades/ml, y hasta más de 500000 U/ml. En otro aspecto la solución purificada de furina recombinante de la presente invención tiene una actividad específica de por lo menos aproximadamente 10 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 20 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 30 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 40 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 50 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 60 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 70 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 80 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 90 U/pg de proteína , por lo menos aproximadamente 100 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 120 U/pg de proteína, por lo menos aproximadamente 140 U/pg de proteína , por lo menos aproximadamente 160 U/pg de prol eína, por lo menos aproximadamente 180 U/pg de prol eína, por lo menos aproximadamente 200 U/pg de prol eína, por lo menos aproximadamente 250 U Mg de prol eína, por lo menos aproximadamente 300 U/pg de prol eína, por lo menos aproximadamente 350 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 400 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 450 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 500 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 550 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 600 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 650 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 700 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 750 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 800 U/pg de prol teína, por lo menos aproximadamente 850 U/pg de pro teína, por lo menos aproximadamente 900 U/pg de pro teína, por lo menos aproximadamente 950 u/pg de proteína, y por lo menos aproximadamente 1000 U/pg de proteína. En otra modalidad, la solución purificada de rFurina en la invención contiene proteína de célula huésped en una concentración menor de aproximadamente 20.0 pg/ml, menos de aproximadamente 19.0 pg/ml, menos de aproximadamente 18.0 pg/ml, menos de aproximadamente 17.0 pg/ml, menos de aproximadamente 16.0 pg/ml, menos de aproximadamente 15.0 pg/ml, menos de aproximadamente 14.0 pg/ml, menos de aproximadamente 13.0 pg/ml, menos de aproximadamente 12.0 pg/ml, menos de aproximadamente 11.0 pg/ml, menos de aproximadamente 10.5 pg/ml, menos de aproximadamente 10.0 pg/ml, menos de aproximadamente 9.5 pg/ml, menos de aproximadamente 9.0 pg/ml, menos de aproximadamente 8.5 pg/ml, menos de aproximadamente 8.0 pg/ml, menos de aproximadamente 7.5 pg/ml, menos de aproximadamente 7.0 pg/ml, menos de aproximadamente 6.5 pg/ml, menos de aproximadamente 6.0 pg/ml, menos de aproximadamente 5.5 pg/ml, menos de aproximadamente 5.0 pg/ml, menos de aproximadamente 4.5 pg/ml, menos de aproximadamente 4.0 pg/ml, menos de aproximadamente 3.5 pg/ml, menos de aproximadamente 3.0 pg/ml, menos de aproximadamente 2.5 pg/ml, menos de aproximadamente 2.0 pg/ml, menos de aproximadamente 1.5 pg/ml, menos de aproximadamente 1.0 pg/ml, menos de aproximadamente 0.5 pg/ml, menos de aproximadamente 0.4 pg/ml, menos de aproximadamente 0.3 pg/ml, menos de aproximadamente 0.2 pg/ml, menos de aproximadamente 0.1 pg/ml, y aproximadamente 0 pg/ml. En otro aspecto, la solución purificada de rFurina en la presente invención contiene proteína de célula huésped en una concentración menor de aproximadamente 1.0 ng de proteína/U rFurina, menos de aproximadamente 0.95 ng de proteína/U rFurina, menos de aproximadamente 0.90 ng de proteína/U rFurina, menos de 0.85 ng de proteína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 80 ng de prol eína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 75 ng de prol eína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 70 ng de prol eína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 65 ng de prol eína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 60 ng de prol eína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 55 ng de prol teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 50 ng de prol teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 45 ng de prol teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 40 ng de prol teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 35 ng de prol teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 30 ng de prol teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .25 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .20 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .15 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .10 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .05 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .04 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .03 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0 .02 ng de pro teína/U rFurina, menos de aproximadamente 0.01 ng de proteína/U rFurina, y aproximadamente 0 ng de proteína/U rFurina. Los ejemplos que se encuentran a continuación demuestran la presente invención utilizando células huésped CHO para producir rFurina, sin embargo, los expertos en la técnica encontrarán que cualquier tipo de célula huésped puede ser adaptada de manera similar para producir la rFurina de la presente invención. Las células CHO han sido ampliamente utilizadas en la producción de proteínas recombinantes, y las células CHO diseñadas (aquellas en las cuales la línea de célula CHO es transfectada con un producto de gen y un gen marcador que se puede seleccionar) son cultivadas rutinariamente en el medio de cultivo que contiene suero. Sin embargo, el uso del suero posee una cantidad de problemas. El suero es un producto generalmente costoso, el cual no está fácilmente disponible en las cantidades requeridas para la producción comercial. El suero también es un material no definido bioquímicamente y contiene muchos componentes los cuales no han sido completamente identificados ni sus acciones determinadas. Por lo tanto el suero diferirá de lote a lote, y requiriendo posiblemente la prueba de niveles para determinar los diferentes componentes y su efecto en las células. Además, el suero frecuentemente es contaminado con microorganismos tales como virus y micoplasmas muchos de los cuales pueden ser peligrosos, pero todavía representan un factor desconocido adicional. Además, la presencia de proteínas animales en el medio de cultivo puede requerir procesos de purificación prolongados. En particular, la presencia de anticuerpos bovinos en albúmina de suero bovina (BSA) hace extremadamente difícil la purificación de los anticuerpos deseados expresados por las células CHO recombinante. La remoción del anticuerpo bovino del medio antes de utilizarse es posible, pero esta remoción y la prueba requerida del producto adicional después de la remoción agrega bastante al costo de producción del producto. Por consiguiente, existen beneficios de utilizar un medio de cultivo desprovisto de componentes animales el cual soportará el cultivo celular, especialmente de células CHO. Aunque las células CHO no se cultivan fácilmente en condiciones libres de suero, la presente invención proporciona el cultivo de rFurina en células CHO bajo condiciones libres de suero. Las células CHO diseñadas también son difíciles de cultivar en suspensión. Es altamente deseable lograr el cultivo en suspensión cuando se utilizan las células para expresar un producto como la rFurina. Para la producción de dicha proteína biológica en una escala comercial, es deseable poder soportar el cultivo en fermentadores de un tamaño considerable. Un medio adecuado también es requerido para soportar las células de modo que se puedan cultivar en condiciones de producción grande. Dichos medios de cultivo son establecidos en los Ejemplos de la presente descripción. El experto en la técnica apreciará que cualesquiera métodos para cultivar células en la técnica puede ser utilizado en el cultivo de células huésped que comprenden rFurina como se establece en la presente invención. Los ejemplos no limitativos de los métodos de cultivo se proporcionan en los Ejemplos de la presente invención. La invención también proporciona métodos de purificación que se llevan a cabo después de que las células son cultivadas en un medio libre de suero para eliminar las proteínas de las células CHO de la rFurina. Un experto en la técnica apreciará que cualesquiera métodos de purificación de proteina conocidos en la técnica pueden ser utilizados en la purificación de rFurina del medio de cultivo. Los ejemplos no limitativos de los métodos de purificación se proporcionan en los presentes ejemplos. Por consiguiente, puede ser producida la rFurina la cual está esencialmente libre de todas las proteínas de fuente animal. La rFurina es substancialmente libre de proteínas animales y es opcionalmente almacenada congelada hasta su uso. EJEMPLOS Los aspectos y detalles adicionales de la presente invención podrán ser apreciados a partir de los siguientes ejemplos, los cuales pretenden ser ilustrativos en vez de limitativos. El Ejemplo 1 describe la construcción del plásmido de expresión de rFurina y la transfección de la célula huésped; el Ejemplo 2 describe los procesos de adaptación de los clones de células CHO que expresan la rFurina para el cultivo en condiciones libres de suero; el Ejemplo 3 describe un proceso de optimización para la manufactura de rFurina en un medio libre de proteínas animales; el Ejemplo 4 describe la purificación de rFurina; el Ejemplo 5 establece el procesamiento descendente (concentración y purificación) y el análisis de la producción en gran escala de rFurina; y el Ejemplo 6 demuestra las pruebas de seguridad, esterilidad, y estabilidad que se realizan para determinar y mantener la calidad del banco de células huésped. EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO DE EXPRESIÓN DE FURINA RECOMBINANTE Y LA TRANSFECCIÓN DE LA CÉLULA HUÉSPED Una descripción detallada de los plásmidos progenitores de furina utilizada para construir un plásmido de expresión de rFurina designado #556 se establece en la tabla 1. Expresado bajo el control del promotor de citomegalovirus constitutivo (CMV), la rFurina madura contiene el dominio catalítico, el dominio P, y una pequeña porción del dominio rico en cisteína mientras que las regiones localizadas en la terminal C para el aminoácido 577 son eliminadas conduciendo a una proteasa activa secretada completamente. Una descripción de la construcción del vector DHFR utilizado como el plásmido de selección se ilustra en la tabla 2. Para el desarrollo de los clones de células de CHO/rFurina se expresan designados de manera estable # 488-3 y # 289-20, las células CHO que carecen de un gen DHFR endógeno funcional fueron co-transfectadas con plásmidos # 556 y # 73 empleando la co-precipitación de fosfato de calcio. Los clones que secretan altos niveles de rFurina fueron seleccionados en varias rondas de clonación y amplificación utilizando el sistema de selección DHFR/MTX. Tabla 1. Descripción de la generación del plásmido de furina # 378 Derivado del plásmido #229. La codificación de 12 bps para 4 Furina truncada después de la glicina glicinas localizadas en el fragmento 577 que contiene 10 histidinas pero Saúl /Hind III fueron removidas por sin 4 glicinas PCR. El fragmento modificado entonces se volvió a ligar en la estructura del plásmido. #556 Derivado del plásmido #378. La furina La eliminación de 30 bps que codifican truncada después de la glicina 577 los 10 residuos de histidina por PCR. está desprovista de cualquier El fragmento Saul/Hind III modificado secuencia heteróloga adicional. que es relegado dentro de la estructura del plásmido.

T a b l a 2. D es c r i p c i ó n d e l a g e n e ra c i ó n d e l p l ás m i d o D H F R Plásmido Descripción Comentarios # 29 El plásmido original denominado Construido fuera de Baxter. pAdD26SV(A)-3 es obtenido de H.J. Hauser (GBF, Braunschweing, Alemania). Este plásmido contiene el cADN de la reductasa del dihidrofolato múrido de longitud completa (DHFR) detrás de un promotor tardío principal de adenovirus. # 73 cADN-DHFR múrido bajo el control El fragmento PsTI que comprende el del promotor temprano SV40. cADN de DHFR y la señal de poliadenilación SV40 del plásmido #29 fue clonado en el sitio Pstl del plásmido #53. Debido a la estrategia de clonación, el plásmido #73 contiene dos señales de poliadenilación. # 53 El vector de expresión eucariótico de El cassette de Notl de ß-galactosidasa Clontech (Palo Alto, CA, E.U.A.) el fue removido y un sitio de clonación cual ha sido modificado para que múltiple fue insertado en vez del mismo contenga un sitio de clonación para que tenga entre otros sitios de múltiple en vez del cADN de ß- restricción también un sitio único para galactosidasa. El plásmido el Pstl. proporciona el virus 40 de simio (SV40) que es un promotor del gen temprano y aumentador, las señales de empalme de ARN del genoma SV40 consistentes de un donante de empalme de un gen de proteína viral tardío 16s/19s,y secuencias del aceptador, y la señal de poliadenilación de SV40. El vector original pSV40p es un derivado de pUC 9 que contiene el cADN de E. coli ~ 3.4 kbp ß-galactosidasa insertado en el sitio A/oí/.

Las células CHO transfectadas fueron cultivadas en un medio DHFR, compuesto de DMEM NUT MIX F12 (1:1) aproximadamente hipoxantina, timidina y glicina suplementados con Hepes, L-glutamina, Penicilina-Estreptomicina, y dializado en un 5% ó 10%, de FBS irradiado gamma (DHFR al 5%, DHFR al 10%). El FBS irradiado gamma y dializado fue comprado en Life Technologies, y la documentación completa de los certificados de análisis, el origen y la irradiación. La preparación de la solución de tripsina gamma (1 mg/ml) fue realizada en el Baxter en Orth, Austria, por el departamento de Preparación de Medios/PCC. Un pedigree de la generación del clon CHO/rFurina # 488-3 se ilustra en la figura 2. El clon de CHO/rFurina # 488-3 fue obtenido de los clones iniciales los cuales pasaron por dos rondas de subclonacion del medio de selección de DHFR al 10% suplementado con 100 nM de MTX en el cual se realizó una ronda de subclonacion en la concentración de MTX sin cambios que contiene el medio. El clon # 448-3 fue expandido para la congelación. El clon CHO/rFurina # 289-20 fue preparado y expandido de un modo similar. Sin embargo, el clon #289-20 es un clon sucesor derivado del clon #488-3. Un pedigree de la generación del clon CHO/rFurina # 289-20 se ilustra en la figura 3. La actividad de furina fue medida en un medio acondicionado de clones los cuales fueron cultivados durante 24 horas en un medio DHFR libre de suero. Los clones de las células que mostraron alta actividad de furina (U/106 células por 24 horas) fueron seleccionados. Los clones de alta producción seleccionados fueron expandidos para la preparación de ampolletas de material congelado, y utilizados para el empalme para la siguiente ronda de clonación. El aislamiento e identificación de las células de alta producción de los clones se realizó. Las densidades de las células fueron analizadas utilizando el contador de células Casy. Los niveles de expresión de furina de hasta 200 a 300 U/106 células por 24 horas fueron logrados para el clon # 488-3. Los niveles de expresión de furina de hasta 400 U/106 células por 24 horas fueron logrados para el clon # 289-20. EJEMPLO 2: ADAPTACIÓN DE LOS CLONES DE CÉLULAS QUE EXPRESAN LA PURINA RECOMBINANTE PARA EL CULTIVO EN CONDICIONES LIBRES DE SUERO La estrategia para la adaptación y la selección de la línea de células es adaptar la línea de células a una línea de células libre de proteína y suero ya sea en dilución gradual o en forma de pasos o abruptamente. El propósito de este estudio fue encontrar la población de células CHO que se cultivan bajo condiciones libres de suero, la cual fue la rFurina de producción estable. Las células CHO del clon #488-3 fueron utilizadas como material de partida. El clon CHO #488-3 de las células que expresan la rFurina fue cambiado en las condiciones libres de suero en tres adaptaciones conducidas en paralelo como se establece detalladamente más adelante. El proceso de agotamiento del suero inició en los matraces de agitador con el uso de microportadores para encontrar un medio para detener las células en la fase de adaptación, ya que en esa fase las células generalmente muestran un crecimiento lento. Utilizando este método, fue posible evitar, durante los cambios de medios posteriores, diluir las células a dichas concentraciones en donde el crecimiento o podría ser inhibido.

Las tres variantes de un medio de desarrollo doméstico BAP, BAS, y BCS, (como se muestra en la tabla 3) fueron utilizadas durante el curso de este estudio. Tabla 3: Formulaciones de desarrollo doméstico de BAP, BAS y BCS Concentración de L-Glutamina en BCS: 0.900 g/kg 2 Concentración de Sinperonic F68 en BCS: 1.00 g/kg Dependiendo del propósito del experimento respectivo estas variantes del medio fueron proporcionados con diferentes suplementos, de acuerdo con la lista de la tabla 4. Tabla 4: Medios y sus suplementos 2L-Glutamina 3 Sinperonic F68 4 Heptahidrato de sulfato de hierro (II) 5 Heptahidrato de sulfato de zinc (II) Las siguientes tablas nos muestran una vista general de los medios y los reactivos, los cuales fueron utilizados en el curso de este estudio. La tabla 5 resume los medios y reactivos los cuales fueron utilizados para el establecimiento de los clones del banco de células pre-maestro PMCB#01 y el PMCB#04.

Tabla 5: Medios y Reactivos Utilizados para el Establecimiento de PMCB#01 y el PMCB#04 olamente aplicado al PMCB#01 2solamente aplicado al PMCB#04 La tabla 6 resume los medios y reactivos que fueron utilizados en el curso de la sub-clonación y el establecimiento de los bancos de células de evaluación correspondiente (ECBs) de los subclones #488-3/C J06- 19/5F10 (5F10) y #488-3/CJ06- 19/1 E8 (1 E8).

Tabla 6: Números de lote de medios y reactivos utilizados para el establecimiento de los subclones 5F10 y 1E8 Los números de lote de todos los suplementos que son agregados a los medios tienen referencia en el protocolo de manufactura apropiado del medio correspondiente. Otros aditivos del medio se encuentran en la lista de la tabla 7.

Tabla 7: Aditivos de Otros Medios Materiales derivados de animales: para certificado referirse al apéndice Ingredientes para "el medio DHFR al 10%", utilizado solamente al inicio del experimento SF05-80 La adaptación en las condiciones libres de suero se realizó en los matraces T o matraces de agitador en conjunto con la retención de células (centrifugación y similares), separando las células del suero fetal bovino (FBS). Los cultivos de suspensión en los matraces T fueron incubados a una temperatura de 36°C ± 2°C y 7.5% ± 1.0% de C02- El cultivo en los matraces de agitador se realizó en los agitadores Techne y Bélico sin vehículos operando a una temperatura de 36°C ± 2°C con 80 rpm y 130 rpm, respectivamente. La subclonación del clon de las células CHO/rFurina #488-3, posterior a su adaptación a las condiciones del medio libre de suero, dio como resultado el clon de la célula CHO, que se cultiva en suspensión en un medio doméstico libre de suero, la producción estable de rFurina en una cantidad grande. El procedimiento estaba basado en el método de dilución limitada. Brevemente, la suspensión de células fue diluida de modo que 100 µ? de la suspensión contiene una célula. Los depósitos de la placa de 96 depósitos fueron llenados con 100 µ? de esta suspensión. En teoría cada depósito contiene una célula para el desarrollo de los clones. Conforme estas células simples comienzan a crecer, se desarrollan los clones. Por lo tanto, cada célula recientemente generada puede ser rastreada de regreso a la primera célula original en el depósito. Los clones fueron expandidos en placas de 24 depósitos, y luego en matraces T25, luego matraces T75, y posteriormente matraces T175. Durante el cultivo, se realizaron los controles en proceso (IPC) para monitorear las condiciones del crecimiento y para medir la expresión de rFurina. Las densidades de las células durante el cultivo fueron medidas utilizando un instrumento Casy. El instrumento contador del Núcleo fue aplicado para la detección de los núcleos de la célula después de la extracción del CTX. La determinación de la densidad de la célula y la variabilidad después de descongelarla fue realizada con el método de exclusión de azul tripano utilizando un hemacitómetro. La densidad de la célula y la viabilidad también fue analizada utilizando un método de exclusión de azul tripano automático realizado por el instrumento Cedex. Los sobrenadantes de los cultivos celulares fueron utilizados para determinar la cantidad y actividad de la rFurina expresada. El análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) fue utilizado para ver la proporción de células productoras a no productoras en una población de células determinada. La morfología y el comportamiento de crecimiento de las células fueron determinados mediante el control óptico. Adicionalmente, el sobrenadante de los cultivos celulares también fueron examinados para monitorear las condiciones del medio, tales como la determinación del valor de pH y la concentración residual de glucosa, glutamina, lactato y amonio. Estos análisis fueron realizados por medio de un instrumento NOVA. En el curso de este estudio, dos bancos de células pre-maestras (PMCBs) PMCB#01 y PMCB#04 fueron producidos y dos líneas de clones de células fueron establecidos como se establecen más adelante. La evaluación de los bancos de células (ECB) también fue generada (ver Tabla 15).

Preparación y prueba de control de calidad de las células PMCB#01 Un frasco de células CHO/rFurina #488-3 (ECB#01) fue descongelado en un medio BAS que contiene los aditivos (Put, Glut, Synp y Fe) y FBS al 5%. Las células fueron cultivadas durante cinco días en el matraz T175. Las células entonces fueron adaptadas a las condiciones libres de suero como se establece más adelante. Las células fueron preparadas en 150 mi de medio de cultivo (BAS con Put, Glut, Synp y Fe) con un contenido de FBS al 5%, 0.2 g/l. Los portadores de citoporo 2 fueron utilizados para la adaptación de las condiciones libres de suero. Habían inoculado la suspensión de células de cinco días de edad resultando en una densidad de partida de las células de aproximadamente 2.0 x 105 células/ml, las células se enlazaron a los portadores porosos dentro de las primeras horas. Por lo tanto, se mantuvieron las células en el matraz del agitador, mientras que el medio de cultivo fue intercambiado para reducir la concentración en el suero, en dos pasos, del 5% al 3.8% al 0% en el día 05. Durante el siguiente período de cultivo las células se llegaron a adaptar a las condiciones libres de suero. Las células se separaron de la superficie de los portadores y continuaron su crecimiento en la suspensión. La densidad de las células y la viabilidad de las células en suspensión aumentó continuamente. De cada dos a tres días las células en suspensión fueron divididas en una proporción de 1:2. Entonces se preparó un banco de células de evaluación (ECR). En el día 28 del cultivo, las células que tienen una viabilidad mayor del 60% fueron transferidas a un nuevo experimento. El cultivo fue cultivado en un medio BAS en una cantidad de 200 a 300 mi (con Put, Glut, Synp y Fe) en un agitador Bélico sin portadores. De acuerdo con la densidad de las células determinadas por CASY, el cultivo en suspensión fue dividido de cada dos a tres días a una densidad de células de partida de aproximadamente 2.0 x 105 células/ml. Después de 16 días, cuando el cultivo celular alcanzó una viabilidad mayor del 80%, el banco de células de evaluación (ECB) consistente de seis frascos de células fue producido. Un frasco del ECB fue descongelado en un nuevo experimento. Las células fueron cultivadas durante cuatro días en un matraz T175 en un medio BAS con Put, Glut, Synp, Fe y Zn. Entonces las células fueron transferidas al agitador Bélico con un contenido de hasta 600 mi del medio BAS con Put, Glut, Synp, Fe y Zn. Nuevamente, de cada dos a tres días, el cultivo en suspensión fue dividido a una densidad de las células de partida de aproximadamente 2.0 x 105 células/ml. En el día 13 del cultivo, se removieron 143 mi de la suspensión de células para la preparación del PMCB#01, consistente de 20 frascos. Las células fueron expandidas y las pruebas de control de calidad fueron realizadas en las células PMCB#01.

Preparación y prueba de control de calidad de las células PMCB#04 Un frasco del clon CHO/rFurina #488-3 (ECB#01) fue descongelado en el medio BAS con un contenido de Put, Glut, Synp, Fe y FBS al 5%. A la mitad del cultivo de seis días de edad se transfirió un nuevo experimento para la adaptación a las condiciones libres de suero. En este caso, la adaptación a las condiciones libres de suero no fueron realizadas paso por paso, sino más bien fueron realizadas de manera abrupta. El matraz del agitador Bélico fue preparado con medio BAS (con adición de Put, Glut, Synp y Fe) sin contenido de FBS ni portadores. Las células fueron inoculadas con una densidad de células de partida de aproximadamente 2.5 x 105 células/ml. Debido a las condiciones libres de suero repentinas, el tiempo de duplicación de las células disminuyó a un nivel más bien bajo. Para evitar la dilución de las células a dicha concentración que posiblemente se inhibiera en el cultivo, el medio fue cambiado mediante la agitación más lenta de la suspensión de células. El gránulo de las células fue suspendido de nuevo en un medio de cultivo fresco. Las divisiones del cultivo fueron realizadas cuando la densidad de las células fue mayor de 4.0 x 105 células/ml. Después de haber alcanzado una viabilidad mínima de aproximadamente el 50% en el día 15 del cultivo, las células comenzaron a recuperarse y, a partir del día 32 del cultivo en adelante, su viabilidad aumentó a entre 85% y 90%. En el día 61 del cultivo, las células adaptadas fueron congeladas como un ECB consistente de 15 frascos. Un frasco del ECB fue descongelado en un nuevo experimento en un medio BAS libre de suero que comprende Put, Glut, Synp y Fe. Después de que fue cultivado el cultivo en los matraces T175 durante siete días, se transfirió al Agitador Bélico, en donde las células crecieron durante dos días adicionales. Luego, se probó la adición de Zn. Aproximadamente 100 mi de la suspensión de células centrifugadas fueron suspendidas de nuevo en el medio BAS libre de suero con un contenido de Put, Glut, Synp, Fe y Zn. La suspensión fue cultivada en un Agitador Bélico. De acuerdo con la densidad de las células CASY determinada, cada dos o tres días el cultivo en suspensión fue dividido a una densidad de inicio de las células de aproximadamente 2.0 x 105 células/ml. Para la preparación del inoculo y para poder producir una cantidad grande de una suspensión homogénea de células para la generación del PMCB#04, el cultivo celular fue escalado hasta 1000 mi en un Agitador Bélico. En el día 02 del cultivo, 465 mi de la suspensión de células fue utilizado para producir el PMCB#04, consistente de 20 ampolletas. Las células fueron expandidas y se realizaron las pruebas de control de calidad en las células PMCB#04. La figura 4 establece una comparación de la distribución gráfica de los productores de rFurina en las poblaciones de células de PMCB#01 y PMCB#04. El 80.74% de las células en PMCB#04 expresan rFurina. El 74.06% de las células en PMCB#01 expresan rFurina. Los subclones CHO/rFurina #488-3, CJ06-19/5F10 y CJ06- 19/1E8 entonces fueron generados. Una ampolleta del clon CHO/rFurina #488-3 fue descongelado y el cultivo fue pasado a un matraz T175. En el día 17 del cultivo, se probaron tres medios diferentes, el medio BAP (desarrollado por Baxter), CD-CHO (proporcionado por Gibco) y las células CHO del ExCell 325PF (producido por JRH), cada uno contenía FBS al 5%. Después de cuatro días de cultivo en los matraces T175, las células cultivadas en el medio ExCell fueron adaptadas a condiciones libres de suero. Las células fueron separadas del suero en pasos pequeños. El procedimiento total se encontró en un rango de tres experimentos. Primero, las células dependientes de anclaje fueron inicialmente cultivadas en matraces T175 en células CHO ExCell 325PF con un contenido de FBS al 5%. El suero fue entonces reducido lentamente al 0.5% en el día 13 del cultivo. Durante los siguientes 13 días de cultivo se realizaron dos divisiones, en donde la concentración del suero fue reducida adicionalmente a 0.25% y la viabilidad disminuyó a menos del 70%. Las células perdieron su comportamiento dependiente del anclaje, mostraron más y más forma esférica, y comenzaron a crecer en suspensión. El último paso de la reducción del suero ocurrió en un Agitador Techne en un medio de CHO ExCell 325PF con un contenido de FBS al 0.25% y sin portadores. Después de un período de cultivo de 23 días, la concentración en el suero alcanzó el 0%. Las células fueron divididas y cultivadas para mantener todos los parámetros importantes en un rango determinado. La densidad de las células movida entre el 0.15 y el 0.9 x 106 células/ml. La viabilidad descendió a menos del 40% durante la primera semana, pero luego regresó a los valores mayores del 90%. En el día 42 del cultivo, las células adaptadas fueron congeladas en el ECB/CJ06-20 consistente de 20 frascos. Entonces las células fueron subclonadas. Una suspensión de células fue diluida con el medio CHO ExCell 325PF previamente acondicionado de un modo tal, que 100 µ? de suspensión contenían teóricamente de 0.5 a 1.0 células. En el experimento de subclonación, se llenaron cinco placas de 96 depósitos con 100 µ? de esta suspensión de células por depósito. El día después de la siembra de las células, se buscó en los depósitos las células solas bajo el microscopio. Los depósitos que contienen una célula fueron marcados y observados adicionalmente. La adición y el intercambio de células CHO ExCell 325PF previamente acondicionadas se realizaron cuando fue necesario. Cuando las células murieron o en ausencia de la división de células durante las siguientes dos semanas, el depósito relevante fue excluido del experimento. Dos células simples mostraron crecimiento. Los clones evolucionaron, habiendo alcanzado un tamaño apropiado, cuando fueron transferidos a un depósito en una placa de 24 depósitos. Aquí, el intercambio de las células CHO ExCell 325PF previamente acondicionado se realizó de acuerdo con el crecimiento y los requerimientos del cultivo. Los subclones CJ06-19/5F10 y CJ06-19/1E8 fueron transferidos al matraz T25 en el día 07 y en el día 10 del cultivo, respectivamente. Los ECBs fueron preparados en el medio ExCell. Estos ECBs presentan el material fuente para investigaciones adicionales con respecto a dos subclones, tales como una readaptación de los medios comprados de manera costosa a una formulación más económica, auto-desarrollada por Baxter. El ECB del subclon CJ06-19/5F10, CJ06-42, fue expandido en el medio CHO ExCell 325PF de un matraz T25, a un matraz T75, a un matraz T175, y luego a un Agitador Bélico. El ECB/CJ06-63 consistente de 10 frascos fue congelado de un cultivo de los matraces T175 en el día 21. El ECB del subclon CJ06-19/1E8, CJ06-43, también fue expandido en el medio CHO ExCell 325PF. El cultivo fue expandido dé un matraz T25, a uno T75, a uno T175, y luego al Agitador Bélico. El ECB/CJ06-64 consistente de 10 frascos fue congelado de un cultivo del matraz T175 en el día 18.

Los ECBs (Subclones 5F10 y 1E8) fueron adaptados al medio BCS como se establece más adelante. El subclon CJ06-19/5F10 del clon CJ06-19 del ECB fue descongelado en el experimento CJ06-66, y luego mediante la adición del medio BCS al medio ExCell en un volumen creciente, las células fueron separadas del medio ExCell y adquirieron la capacidad de crecer en el medio BCS. El subclon CJ06-19/1E8 del clon CJ06-19 de ECB fue simultáneamente adaptado al medio BCS de una manera similar. La Tabla 8 muestra los bancos de células libres de suero los cuales fueron preparados en el curso de este estudio.

Tabla 8: Resumen de bancos de células libres de suero del En la Tabla 9 se establece una comparación de PMCB#01 y PMCB#04 y los subclones 5F10 y 1E8.

Tabla 9: Comparación de PMCB#01, PMCB#04 y los Subclones 5F10 y 1E8 Las poblaciones de células cultivadas en los experimentos CJ06-69 así como SK06-49 y SK06-63 representan los cultivos precursores de las líneas de células para los PMCBs. Estas células fueron cultivadas en un medio BAS (con la adición de Put, Glut, Synp, Fe y Zn), y fueron congelados como PMCB#01 y PMCB#04, respectivamente. Los subclones 5F10 y 1E8 fueron cultivados en un medio que se consigue comercialmente CHO ExCell 325PF proporcionado por JRH. Debido a la capacidad de crecimiento en el medio basado en la formulación BAS era el preferido, se seleccionaron las células PMCB#01 y PMCB#04 para la producción adicional de rFurina. Como se presenta en la Tabla 10, las células de PMCB#04 mostraron un mejor comportamiento de crecimiento en comparación con las células PMCB#01. Las viabilidades e índices de crecimiento fueron mayores en las células PMCB#04, y los tiempos de generación de duplicación fueron más lentos.

La proporción de rFurina específica de las células así como la proporción de producción volumétrica fue mayor en todo el período de tiempo evaluado. En un experimento adicional, los datos con respecto a las viabilidades fueron confirmadas. Una ampolleta de cada uno de los medios PMCBs fue descongelada en un matraz T175 con un contenido de medio BCS con Zn como aditivo. Como se muestra en la Tabla 10, la viabilidad de las células PMCB#04 nuevamente fue mayor que la de las células PMCB#01. Tabla 10: Experimentos de descongelado de células PMCB#01 y PMCB#04 Por lo tanto, las células PMCB#04 fueron seleccionadas como el material de fuente para la producción futura de un Banco Maestro de Células de rFurina (MCB) y todos los bancos de células en desarrollo adicionales (WCBs). El PMCB#04 consistente de 20 frascos fue establecido en cumplimiento con los reglamentos actuales de la Práctica de Buenos Tejidos. El Control de Calidad (QC) fue realizado de acuerdo con las solicitudes de las Instrucciones Q5D del ICH. Las células PMCB#04 fueron seleccionadas para producir la rFurina en los procesos de manufactura. El medio de cultivo es libre de substancias derivadas de humanos o animales y es auto-desarrollado. Habiendo removido las células mediante filtración, el sobrenadante que contiene rFurina es concentrado mediante ultrafiltración. Después de la purificación por la cromatografía de intercambio, la actividad de la solución de rFurina tiene por objetivo que sea de por lo menos 200 Unidades de rFurina/ml. La prueba del micoplasma, los virus, agentes extraños, esterilidad, y eficiencia de expresión fue realizada. Los criterios para la selección de la alta actividad de Furina (por ejemplo, proteína de Furina, ELISA) y la homogeneidad de la población de células en la inmunofluorescencia (FACS), es realizada en diferentes subclones en comparación con los clones iniciales #488-3 y #289-20, respectivamente. Además, los perfiles de impureza tienen que ser comparados de manera cualitativa (por ejemplo, mediante los patrones de pico UV y después del HPLC RP o mediante las técnicas SDS-PAGE/Coomassie). EJEMPLO 3: OPTIMIZACIÓN PARA LA MANUFACTURA DE FURINA RECOMBINANTE EN UN MEDIO LIBRE DE PROTEÍNA ANIMAL Este ejemplo describe el desarrollo y el proceso de optimización para el cultivo del clon de CHO #488-3 que expresa la rFurina. Se llevaron a cabo la optimización del medio específico con respecto a los aminoácidos, glucosa y concentración de NaHC03, los cuales dieron como resultado índices de crecimiento de células aumentados y productividades más altas del proceso de fermentación. La optimización de los parámetros de los procesos controlados en línea se llevó a cabo con la formulación de medio optimizado para p02 (10%, 20% y 50%), y un experimento factorial se llevó a cabo para determinar el pH óptimo (rango de 7.1 a 7.3) y temperatura (rango de 35.1°C a 37.9°C), los cuales resultaron en una mejora del rendimiento importante para el clon de CHO #488-3 cuando la fermentación se llevó a cabo en temperaturas más bajas entre 35°C y 36°C. Como modos de producción posibles, los cultivos de quimiostato y los cultivos de lotes de producción fueron comparados, indicando que ambos tipos de procesos eran adecuados para la manufactura de rFurina, y dieron rendimientos comparables con ajustes de parámetro idénticos. Los experimentos específicos se llevaron a cabo para investigar la influencia de los tipos de agitación y los índices en diferentes preparaciones del bio-reactor. Como se muestra que en los índices de crecimiento específicos y los índices de expresión, las densidades de las células y por lo tanto las productividades volumétricas son influenciadas de manera fuerte por las variaciones en la preparación del bio-reactor, y que bajo condiciones de índices de agitación aumentados los rendimientos podrían ser significativamente aumentados. Junto con esto, la influencia de los parámetros principales de los procesos ascendentes de rFurina son bien caracterizados con respecto a su efecto, y un proceso de alto rendimiento podría ser transferido a una planta piloto para la manufactura preclínica y clínica. Los detalles se establecen más adelante. Un subclon #488-03 fue desarrollado en el lugar el cual fue adaptado a un medio libre de insulina y suero. Los siguientes experimentos se llevaron a cabo en un medio libre de insulina y libre de FBS (medio BACD), como la formulación básica del medio (ver Tabla 11). Tabla 11: Componentes del medio básico (medio BACD) Con el objeto de mejorar el cultivo celular y producir condiciones óptimas para la propagación de las células, un análisis de aminoácidos del sobrenadante del cultivo quimiostático fue realizado (ver Tabla 12). Como resultado, se agregaron tres aminoácidos esenciales al medio, es decir, metionina (10 mg/L), leucina (40 mg/L) y fenilalanina (10 mg/L).

La fermentación se realizó en un bio-reactor de 1.5 L a una temperatura de 37°C, pH 7.15 y un pOz del 20%. Tabla 12: Análisis de aminoácidos por HPLC BACD_24_06_01 _026... medio básico (s. materiales y métodos) FUR_06/10_M04_K06... Lote de fermentación, 6to. día de cultivo FUR_06/10_M04_K07... Lote de Fermentación, 7mo día del cultivo. El área pico del aminoácido respectivo en el diagrama HPLC del medio básico fue ajustado en 100%. Mediante la comparación con el área pico obtenida en los días 6 y 7 del cultivo quimiostato, fue determinada la disminución del aminoácido respectivo. Debido a las bajas concentraciones de glutamina en el sobrenadante del cultivo, se agregó glutamina al medio (300 mg/L) para dar una concentración final de glutamina de 900 mg/L. Después de la adición de glutamina al medio, el índice de crecimiento aumentó de 0.55 d"1 a 0.67 d"1 (ver Tablas 13 y 14). Mediante la adición de estos tres aminoácidos mencionados anteriormente (es decir, metionina (10 mg/L), leucina (40 mg/L) y fenilalanina (10 mg/L) al medio, el índice de crecimiento de las células podría haber aumentado nuevamente (0.69 d"1) (ver Tabla 15). La productividad volumétrica subió a aproximadamente 267 kU/L/d (= + 13%), y la productividad específica mostró un aumento del 16%. La suplementación del medio con glutamina, metionina, leucina y fenilalanina mostró un efecto positivo en el crecimiento celular, y la actividad volumétrica y específica, y por lo tanto fue retenida para la preparación adicional del medio. Tabla 13: Datos de fermentación del cultivo de quimiostato FUR 06/10-M04 del día 6 al día 9 del cultivo Tabla 14: Datos de fermentación del cultivo de quimiostato FU R_06/10-M04 después de la suplementación del medio con 300 mg/L de glutamina en el día 12 Tabla 15: Datos de fermentación del cultivo de quimiostato FU R 06/10-M04 después de la adición de metionina (10 mg/L), leucina (40 mg/L) y fenilalanina (10 mg/L) en el día 22 al medio Para revisar si las cantidades suplementadas de los aminoácidos en el medio eran suficientes, se realizaron otros análisis de aminoácidos del cultivo del quimiostato (10 L). El cultivo ha sid^) suministrado con 300 mg/l de glutamina y las cantidades respectivas de los tres aminoácidos. Las muestras fueron conducidas en el día 7 y 15 del cultivo, y las condiciones del cultivo fueron similares a las mencionadas anteriormente. Los resultados (ver Tabla 16 fueron solamente los datos para metionina, leucina y fenilalanina los que se muestran) confirmaron que las cantidades suficientes de los aminoácidos suplementados estaban presentes en el caldo de fermentación.

Tabla 16: Cantidad relativa de metionina, leucina y fenilalanina en un cultivo de quimiostato (FUR 06/17_F04) suplementado con glutamina (300 mg/L), metionina (10 mg/L), leucina (40 mg/L) y fenilalanina (10 mg/L) La reducción de la concentración de NaHC03 y el aumento de la concentración de glucosa. La influencia de las concentraciones de CO2 altamente disueltas en el cultivo celular en el crecimiento y productividad fueron investigados. Debido a la producción en gran escala en un bio-reactor, se podía esperar una concentración mayor de C02 en el cultivo de las células que en los bio-reactores de 2.5 a 32 L. Por lo tanto, se llevaron a cabo dos rondas de fermentación en paralelo, una ronda con una concentración de CO2 de aproximadamente 7.5% y la otra con una concentración de C02 de aproximadamente 12%. La concentración de C02 fue ajustada variando la fracción de C02 en el flujo del espacio de la cabeza. La concentración de C02 en el cultivo de células fue medido analizando las muestras conducidas con un instrumento NOVA. La fermentación se llevó a cabo a una temperatura de 37°C, en un pH de 7.15 y con un p02 del 20%.

Una concentración de C02 del 11% al 12% tuvo una influencia negativa en el crecimiento y productividad de las células. En esta concentración de C02, un índice de crecimiento de 0.29 d"1 fue alcanzado en un intervalo de 12 días en una cuenta de células de 1.1 x 106 células/mL y un índice de dilución de 0.30 d"1. En la ronda de fermentación con aproximadamente 7.5 % de C02, se alcanzó un índice de crecimiento de 0.52 d"1 en una cuenta de células de 1.49 x 106 células/mL y un índice de dilución de 0.53 d"1 en el mismo intervalo. En concentraciones más altas de C02, la viabilidad fue reducida a 86.1%, comparada con 95.9% en una concentración de 7.5% de C02. Adicionalmente, la productividad volumétrica fue reducida a aproximadamente 36% y la productividad específica al 50%. Debido a la alta concentración de C02, el índice de asimilación de glucosa específica fue disminuido también (-39%). La influencia negativa de una concentración de C02 aumentada (del 11% al 12%) en el crecimiento y productividad de las células fue bastante obvia, y por lo tanto, es óptima para llevar a cabo la fermentación en C02 al 7.5%. Como se establece anteriormente, los experimentos mostraron que cuando la concentración de C02 era aumentada a 12% en el bio-reactor de 1000 L, se podía esperar una disminución fuerte en el funcionamiento del clon de CHO-Furina 488-3. Por lo tanto, se decidió reducir la concentración de NaHC03 en el medio de 2 g/L a 1.5 g/L. Una cantidad menor de NaHC03 en el medio también disminuyó la capacidad del regulador del medio y, por lo tanto, se compararon dos rondas de fermentación (10 L), una con 3.15 g/L de glucosa y 2 g/L de NaHC03 en el medio (FU R_06/24_F01 ) y otra con 4.65 g/L de glucosa y 1.5 g/L de NaHC03 (FUR_06/26_F04). Para simular las condiciones de un bio-reactor de gran escala (1,000 L), la concentración del C02 disuelto durante la fermentación fue ajustada a una concentración del 7% al 8% en el termentador con 2 g/L de NaHC03 y del 6% al 7% en el termentador con una concentración de 1.5 g/L de NaHC03 mediante la gasificación constante del CO2 en el espacio de la cabeza. Los índices de crecimiento de ambos cultivos fueron similares (0.58 y 0.56 d"1) y los cultivos mostraron productividades volumétricas y viabilidades comparables. Sin embargo, el índice de asimilación específico de glucosa fue ligeramente más alto en el cultivo con una concentración inferior de NaHC03 (0.83 mg/106 células/d contra 0.67 mg/ 06 células/d). Por lo tanto, una concentración de glucosa de 4.65 g/L fue considerada que era razonable y fue retenida en una preparación adicional del medio. La investigación de la concentración de Synperonic F68 en el medio de Furina. La concentración regular de Synperonic F68 en el medio de cultivo de las células fue ajustada a 0.25 g/L. El propósito del Synperonic F68 en el medio es proteger las células del daño debido a la oxigenación sumergida. Por lo tanto, se llevó a cabo un experimento en bio-reactores de 2 x 10 L, en donde una concentración aumentada de Synperonic F68 de 1.0 g/L contra la concentración regular de 0.25 g/L fue investigada. La fermentación se llevó a cabo a una temperatura de 35.8°C en un pH de 7.30 y con un p02 del 20%. Con una concentración creciente de Pluronic (Synperonic F68), podría ser logrado un índice de crecimiento específico y una densidad celular ligeramente más altos. Por lo tanto, debido a la productividad específica aumentada, se podría lograr una productividad volumétrica proporcionalmente mayor de 365 contra 378 kU/L/d. Los sobrenadantes de estos experimentos fueron recolectados y filtrados con un filtro de profundidad (Cuno Cart.Z08P4A30SP 4 discos) seguido por un filtro de membrana (Pall Fluorodyne II KA2DFLP2). Los sobrenadantes filtrados fueron concentrados por ultraf iltración (Sartorius 30S1463901E--SG PSU 10 KD, 0.2 m2) y diafiltrados contra el regulador de diafiltración de Furina. El concentrado filtrado estéril (Sartorius Sartobran P 523130748-00 0.45/0.2 µ) fue purificado en una columna Capto MMC. Los resultados de estos experimentos de purificación revelaron que el Synperonic F68 aumentado no tuvo influencia perjudicial en la calidad y/o pureza de la rFurina purificada. No se podrían encontrar concentraciones elevadas de Synperonic F68 en el eluido de la columna Capto MMC, los cuales fueron de <0.15 mg/mL en ambos eluídos. A pesar de estos resultados la concentración de Synperonic F68 en el medio de rFurina fue mantenida en el 0.25 g/L originales. Sin embargo, en el caso de problemas de escala descendente debido a la oxigenación sumergida, una concentración creciente de Synperonic de hasta 1.0 g/L podría ser considerada, con el potencial de rendimientos aumentados sin una influencia perjudicial en el producto final de Furina. Composición de Medio Final para la Producción de rFurina en la Fermentación. Basados en los experimentos de optimización del medio, la siguiente composición del medio se muestra como óptima para la fermentación del clon de CHO 488-3 en los cultivos del bio-reactor para la producción de rFurina.

Tabla 17: Componentes del medio básico y el medio fermentación optimizado La influencia de los puntos de ajuste de p02 diferentes en el índice de crecimiento y productividad también fue investigada. Tres puntos de ajuste diferentes de p02 fueron probados, por ejemplo, 10%, 20% y 50%. Los experimentos se llevaron a cabo en bio-reactores de 1.5 L con la gasificación por medio del espacio a la cabeza. Todas las rondas de fermentación fueron llevadas a cabo a una temperatura de 35.1 °C en un pH de 7.20. La comparación de las rondas de fermentación del 10%, 20% y 50% de p02 mostraron un ligero aumento de los índices de crecimiento (0.59, 0.62 y 0.65 d" ) con puntos de ajuste crecientes de p02. De un modo similar, la productividad volumétrica fue mayor en el 50% de p02. Las cuentas de células promedio de las diferentes rondas de fermentación fueron muy similares. Por lo tanto, el aumento en la productividad volumétrica fue el resultado del índice de crecimiento creciente. Por consiguiente, un punto de ajuste de p02 del 50% pareció influir en el índice de crecimiento de manera positiva, y como resultado la productividad volumétrica fue de aproximadamente 4% mayor que en condiciones estándar ( = 20% p02). No se observó efecto en la viabilidad. Por lo tanto, se podría confirmar un punto de ajuste de p02 = 20% y un rango para la regulación entre el 10% y el 50% como adecuados para la fermentación del clon de CHO #488-3. Optimización de temperatura y pH para maximizar la productividad volumétrica. La influencia del pH y la temperatura en el funcionamiento del clon CHO-Furina fue investigada. Utilizando un "diseño de métodos de experimento", se combinaron diferentes temperaturas con diferentes valores de pH para asegurar las condiciones que tuvieran como resultado la productividad volumétrica máxima. Cinco temperaturas fueron combinadas con tres valores de pH de acuerdo con la "Matriz de Doehlert", dando como resultado siete combinaciones de temperatura y pH, como se muestran en la figura 5. La combinación de una temperatura de 36.5°C y un pH de 7.20 fue seleccionada como el punto central, la cual fue aplicada a dos lotes de fermentación. La Tabla 18 establece las condiciones de cultivo utilizadas en los diferentes lotes de fermentación. Tabla 18: Preparación experimental de la Matriz de Doehiert: Condiciones de cultivo de los diferentes lotes de fermentación Tabla 19: Valores promedio de los datos de fermentación de las fermentaciones de FUR_06/40-B01 , -B03, -B04, -B06, -B08 y FUR_06/43-B02, -B05, -B07 ' la productividad volumétrica promedio y la actividad específica promedio en 5 días de cultivo fueron calculadas formando los valores de promedio de las productividades simples. Los datos fueron analizados estadísticamente con la Metodología de Superficie de Respuesta (RSM), utilizando el software "Minitab". El RSM explora las relaciones entre varias variables explicatorias y una o más variables de respuesta. La idea principal del RSM es utilizar un conjunto de experimentos diseñados para obtener una respuesta óptima. El análisis se enfocó en la productividad volumétrica y específica así como en el índice de crecimiento. Análisis de los datos con referencia a la productividad volumétrica. Como un primer paso, la gráfica de superficie fue creada (figura 6). Las coordenadas de los datos en la figura 6 son marcadas como puntos. La superficie muestra la correlación supuesta de un solo conjunto de datos. Las gráficas de la superficie suponen una correlación lineal entre los parámetros de temperatura/pH y la productividad volumétrica de respuesta. La gráfica indica un aumento de la productividad volumétrica con una temperatura descendente. La influencia del pH es considerada como débil. Los cálculos posteriores mostraron una correlación lineal de los datos (cálculos no mostrados). Mediante el análisis de la variación, se generó una ecuación la cual describe la correlación entre el pH, la temperatura y la productividad volumétrica: P = 7693.1 - 162.4*Temp - 202.8* pH Basados en el modelo matemático se generó una gráfica del contorno (figura 7) la cual ilustra la influencia de la temperatura y el pH en la productividad volumétrica. Los puntos indican las condiciones (pH/temperatura) que habían sido probados experimentalmente. La gráfica de contorno muestra que el área, en donde puede ser esperada la productividad volumétrica máxima, es en una temperatura de 35.1°C y un pH de aproximadamente 7.10. Ambos valores se encuentran en el extremo del diseño experimental lo cual significa que el máximo real podría ser encontrado todavía debajo de estos valores. Además, la gráfica de contorno muestra que la influencia del pH en la productividad volumétrica es marginal y ligeramente más alta en los valores bajos de pH. La gráfica de superficie (figura 8) la cual es una ilustración tridimensional del modelo matemático, da los mismos resultados que la gráfica del contorno: la influencia fuerte de la temperatura y la influencia débil del pH en la productividad volumétrica. Análisis de los datos en referencia con el índice de crecimiento en µ. La correlación del índice de crecimiento con la temperatura y pH se describe en una ecuación cuadrática. Nuevamente, pueden ser encontradas una influencia fuerte de la temperatura y una influencia débil del pH. Una variación fuerte en el índice de crecimiento obstaculizan el diseño del modelo matemático. El análisis de variación y regresión produjo la siguiente ecuación: P = -103.539 + 5.706*Temp - 0.079*Temp2 - 0.233*pH -0.020*pH2 La influencia del pH en el índice de crecimiento no se puede asegurar estadísticamente, como lo indica un valor-P alto para los términos de pH el cual fue calculado que era de 0.99 (cálculo no mostrado). La gráfica de la superficie (figura 9) ilustra la correlación diseñada tri-dimensionalmente, y demuestra la relación cuadrática y muestra un índice de crecimiento máximo en una temperatura de 36.5°C. El análisis de los datos muestra una correlación similar de la productividad específica con la temperatura y el pH como se puede ver en la productividad volumétrica (figura 10). La correlación se describe como una ecuación lineal. La influencia del pH nuevamente es baja como lo aprueba el análisis de variación (cálculo no mostrado): qP = 4261.40 - 93.35*temp - 93.77*pH En resumen, los experimentos para optimización de la temperatura y pH y el análisis posterior de los datos dio un resultado bastante claro. La productividad volumétrica más alta, la cual es considerada como el parámetro más importante para la optimización del proceso, fue lograda mediante el cultivo en la temperatura más baja (35.1CC) y el pH más bajo (7.10). La influencia del pH estadísticamente es difícilmente importante, y el valor de pH entre 7.10 y 7.30 daría resultados muy similares. Disminuyendo la temperatura de 37°C a 35.1°C, podría ser elevada la productividad volumétrica de aproximadamente 200 kU/L/d a 540 kU/L/d la cual es 2.7 veces mayor (figura 11). Basado en estos resultados, los nuevos puntos de ajuste para la temperatura y el pH para el cultivo del clon de CHO-Furina en el modelo de quimiostato, fue determinado como 35.1°C y 7.15. Comparación de la modalidad de quimiostato con la modalidad del lote de producción. El cultivo del clon de CHO-Furina en el modo de quimiostato a una temperatura baja (35.1°C) dio como resultado altos rendimientos en experimentos de escala pequeña (1.5 L, 2.5 L y 32 L) y fue considerada como que era un método de cultivo apropiado para el cultivo en gran escala para la producción de rFurina. Sin embargo, las rondas de fermentación inicial en gran escala (bio-reactor de 1200 L en la instalación PP1) mostraron una disminución fuerte en el índice de crecimiento en la modalidad de quimiostato. Como una alternativa, para obtener índices de crecimiento más altos, el modo de lote de producción fue preparado en gran escala. Los experimentos en la escala de un bio-reactor de 10 L fue llevado a cabo para comparar el crecimiento y productividad del modo de quimiostato con el modo del lote de producción. Las células fueron cultivadas a una temperatura de 36.5°C en un pH de 7.15 y un p02 del 20%. El lote fue dividido a una cuenta celular de 0.6 a 7 x 106 células/mL cada segundo día del cultivo. El quimiostato- y las fermentaciones del lote de producción fueron operadas en paralelo, utilizando el mismo cultivo de células como inoculo. Las células fueron cultivadas en el modo de quimiostato hasta el día 6. Entonces una ronda de fermentación fue cambiada a una modalidad de lote de reducción (FU _06_50-F03) mientras que la otra continuó en el modo de quimiostato (FUR_06_51 -F04). El cultivo del modo de lote de reducción dio como resultado una cuenta promedio de las células de 2.22 x 106 células/mL al final del lote, con un índice de crecimiento de 0.64 d"1 (Tabla 20). En el modo de quimiostato, un índice de crecimiento de 0.50 d"1 fue obtenido con una cuenta de células promedio de 1.67 x 106 células/mL. Debido a la cuenta de células y el índice de crecimiento más altos en el modo de lote de reducción, la productividad volumétrica fue mayor también (238 vs. 197 kU/L/d). Los datos indican que el modo de lote de reducción es un método de cultivo preferible para el clon CHO-Furina en una escala de 10 L, lo cual dio como resultado, productividades volumétricas aún todavía ligeramente más altas que en el modo de quimiostato (a una temperatura de 36.5°C y un pH de 7.15). Sin embargo, en el modo de lote de reducción, la recolección y los procesos descendentes adicionales son restringidos a ciertos intervalos, mientras que en el modo de quimiostato, la recolección puede ser realizada continuamente. Por lo tanto, cada método tiene sus ventajas. No se realizaron experimentos de optimización para los parámetros del modo de lote de reducción como para las cuentas de células óptimas al final de un lote o para la proporción de división mejor. Tabla 20: Valores promedio de los datos de fermentación para las rondas de fermentación FUR_06_51 -F04 (Quimiostato) y Fur_06_50-F03 (Lote de Reducción) ' Valor promedio de las cuentas de células al final de cada lote (2 lotes) 2) Valor promedio de las productividades al final de cada lote (2 lotes) Investigaciones de escala ascendente. La comparación de los impulsores del tipo de bola contra los del tipo Rushton en diferentes índices de agitación. La influencia del tipo de agitador en el índice de crecimiento y productividad fue investigada. El ajuste estándar utilizado en los bio-reactores para experimentos con el clon CHO-Furina comprendieron un impulsor Rushton y cuatro placas de deflectores. El bio-reactor de 1,000 L para la producción de rFurina fue equipado con tres pares de impulsores de bola sin placas deflectoras algunas. Por lo tanto, se llevó a cabo un experimento de prueba de tres ajustes diferentes en bio-reactores de 10 L: un reactor estaba equipado con el ajuste estándar, y el otro reactor con dos pares de impulsores de bola sin placas deflectoras, y un tercer reactor fue ensamblado como un estándar pero el índice de agitación fue reducido de 170 rpm a 90 rpm. La Tabla 21 da una vista general de los ajustes del bio-reactor. El índice de agitación de 60 rpm con los impulsores de bola dio una velocidad de punta similar a la del impulsor Rushton en 90 rpm (ver Tabla 21). Sin embargo, las velocidades de la punta no pueden ser ecualizadas entre ellas debido a la geometría diferente de los impulsores (forma, diámetro). Tabla 21: Preparaciones del bio-reactor de 10 L para el experimento de índice de agitación/impulsor Las condiciones de fermentación fueron las siguientes: 37°C, pH 7.15, p02 de 20% y pC02 de 6% a 7%. (Medio: 4,65 g/L Glc, 1,5 g/L NaHC03). La comparación de los datos de fermentación mostraron que el funcionamiento en el bio-reactor con la preparación estándar, por ejemplo, equipado con un impulsor Rushton y agitado en una cantidad de 170 rpm, fue más alta que en los bio-reactores con otras preparaciones (Tabla 22). El uso de los impulsores de bola en una velocidad de 60 rpm dio como resultado un índice de crecimiento algo más bajo (0.57 vs. 0.61 d-1), un volumétrico más bajo (197 vs. 227 kU/L/D) comparado con el impulsor Rushton en 170 rpm. La viabilidad por lo tanto fue difícilmente afectada. El uso del bio-reactor agitado por un impulsor Rushton en un índice de agitación de 90 rpm en vez de 170 rpm disminuyó claramente el índice de crecimiento (0.54 vs. 0.61 d-1), la productividad volumétrica (175 vs. 227 kU/L/D) y la productividad específica de la célula (115 vs. 138 U/106 células/día). Los datos de este experimento mostraron que ambos, el impulsor de bola en 60 rpm y los impulsores Rushton en un índice de agitación reducido, dieron como resultado un funcionamiento declinado del clon de CHO-Furina comparado con los impulsores Rushton en 170 rpm. No obstante, los resultados también revelaron que es posible utilizar el impulsor de bola para el cultivo del clon de CHO-Furina. Entre las preparaciones que fueron probadas, la preparación con el impulsor Rushton en 170 rpm más cuatro placas deflectoras mostró las condiciones más rudas. Sin embargo, de manera notable no se observó disminución en la viabilidad de las células bajo estas condiciones, lo cual indica una resistencia mecánica alta del clon de CHO-Furina investigado. Tabla 22: Valores promedio de los datos de fermentación de tres rondas de fermentación del clon de CHO-Furina en bio-reactores con diferentes preparaciones (tipo de impulsor, placas deflectoras) Comparación de diferentes índices de agitación con impulsores de cuchillas inclinadas en bio-reactores de 32 L. Para la ronda GMP de la campaña ORFURFB07002 en el PP1 el bio-reactor (volumen de trabajo 950 L) fue equipado con un tipo de impulsor de cuchilla inclinada (2 piezas, d = 700 mm) en vez de los impulsores tipo bola utilizados anteriormente. Los ciclos de los lotes de reducción de 2 días se llevaron a cabo durante esta campaña. Con el objeto de evaluar este cambio comparado con las campañas anteriores, se preparó el bio-reactor de 32 L con un tipo similar de impulsores de cuchilla inclinada (1 pieza, d = 140 mm), y las fermentaciones se llevaron a cabo utilizando la suspensión de la célula de la instalación PP1 y el medio para asegurar los materiales comparables que se iban a utilizar. Un proceso del lote de reducción similar se llevó a cabo, en donde los ciclos de lotes de 2 a 3 días consecutivos fueron iniciados con una densidad de células de partida de 0.5 x 10E06 células/mL. El experimento se llevó a cabo en 2 índices de agitación diferentes, (por ejemplo, 55 rpm y 120 rpm). Las condiciones de cultivo fueron idénticas a las condiciones de cultivo utilizadas en el PP1: pH-SP 7.15, Temp-SP 35.5°C, p02-SP 20%. Los datos del último lote fueron comparados después de la adaptación a las condiciones de agitación respectivas. Tabla 23: índice de crecimiento, cuenta de células y productividad volumétrica de los lotes de la ronda FUR_07/06-F07 con impulsores de cuchilla inclinada con el bio-reactor de 32 L 1) cuenta de células al final de cada lote 2) índice de división teórica para ser aplicada en un proceso de reducción de 2 lotes: proporción de división = eA(2 x M) 3) calculó de la productividad volumétrica: P = (1-( /proporción de división)) x título del producto / 2 días El experimento demostró nuevamente el efecto de las condiciones de agitación en los índices de crecimiento específicos del clon CHO #488-3. Los índices de crecimiento crecientes condujeron a densidades de la célula final mayores al final del lote, cuando se aplica en las mismas densidades de células de partida. Las productividades volumétricas aumentaron de 276 kU/L/D a 445 kU/L/D (+ 61%), mientras que la densidad de las células final aumentó en un 30% (1.95 vs. 1.5 x 10E06 células/mL). Estos resultados indican que el índice de agitación aumentado tenía un impacto positivo en la productividad específica de las células. También se podría concluir que esas rondas de fermentación, las cuales dieron como resultado productividades promedio de alrededor de 200 kU/L/D fueron principalmente un resultado de los índices de agitación baja aplicados de 20 rpm, y no debido al diseño mismo del impulsor. En este caso se podría demostrar, que los impulsores de cuchilla inclinada pueden dar como resultado rendimientos de >400 kU/L/D, si los índices de agitación son ajustados de manera correspondiente. EJEMPLO 4: PURIFICACIÓN DE LA FU Rl NA RECOM Bl N ANTE (rFURIN A) Este ejemplo proporciona métodos para la filtración y purificación de la rFurina. Los sobrenadantes de cultivo de células recolectados fueron filtrados primero en filtros de profundidad (filtros Cuno Zetaplus) para hacer que quedaran libres de células y libres de partículas, seguido por la filtración de membrana en 0.45 µ?p filtros PVDF (PALL Fluorodyne II). El sobrenadante del cultivo de células filtrado con un contenido de rFurina entonces fue concentrado por ultrafiltración en los cassettes 10 K PES UF de Sartorius (Sartocon PESU 10 kDa) con factores de concentración en un rango de 10 a 50. Los concentrados de Furina (con una actividad de Furina en un rango de 290 a 1700 Unidades/ml) entonces fueron almacenados en alícuotas de < -60°C. En un esfuerzo para obtener una preparación de rFurina más homogénea para utilizarse en el proceso de maduración de VWF, se realizaron experimentos para purificar parcialmente la rFurina del sobrenadante del cultivo de las células. Un reactivo de rFurina parcialmente purificado es más fácil de utilizar para las pruebas de caracterización y liberación. También da como resultado una presencia reducida de las proteínas de las células huésped CHO en el proceso de maduración de VWF. Un procedimiento de purificación en una resina de intercambio de aniones fue desarrollado de modo que requería una conductividad de carga de <5 mS/cm (RT) para el enlace eficiente de la rFurina. La elución entonces se llevó a cabo como un procedimiento del paso en una resistencia iónica de aproximadamente 500 a 300 mM de NaCI y durante la fase de selección, una elución de gradiente hasta de 300 mM de NaCI fue aplicada (ver la vista general en la Tabla 24). El pH original de los reguladores de 6.7 (RT) fue aumentado a 7.5 para mejorar el enlace de la rFurina durante la carga, en particular en una carga de alta proteína e índices de flujo de recubrimiento altos (ver resumen de reguladores importantes en la Tabla 25). Los experimentos de purificación se realizaron en las resinas de intercambio de aniones EMD TMAE (Merck) y CaptoQ (GE Healthcare) que difirieron en la estabilidad del rango de flujo máximo y empacado para operar. Los datos analíticos resumidos en la Tabla 26 muestran que la rFurina puede ser concentrada del sobrenadante de los cultivos de células hasta por 362 veces con rendimientos de rango del 20% al 71%. Las actividades de la rFurina en los conjuntos de eluidos fueron entre 639 Unidades/ml y 27651 Unidades/ml dependiendo de la carga aplicada. El nivel de impureza del CHO en el eluido fue encontrada en un rango entre 10 y 134 ng de la proteína CHO/Unidad de rFurina e índices de reducción hasta de 12.3 con un funcionamiento ligeramente mejor en la reducción de CHO encontrada para la resina CaptoQ. En resumen, la purificación de la rFurina mediante cromatografía de intercambio de aniones probó ser una opción para la concentración, la cual es importante para el almacenamiento del reactivo de rFurina en < -60°C. Además, una ligera reducción de CHO por un factor de 3 a 12 es importante para reducir la concentración de proteínas CHO en la preparación del VWF.

Tabla 24: Procedimiento aproximado para la purificación de la rFurina en la resina de intercambio de aniones. Para EMD TMAE (Merck) el índice de flujo aplicado fue de 150/75 cm/h, para CaptoQ (GE Healthcare) el índice de flujo fue de 600/300.

Tabla 25: Reguladores para la purificación de Furina resina de intercambio de aniones Regulador formulación Regulador de 50 mM HEPES, 1 mM CaCI2l equilibrio (FEQ) pH=6.7-7.5enRT En altas cargas del pH de los reguladores fue aumentada para Regulador de mejorar el enlace elución 50 mM HEPES, 1 mM CaCI2, 1 (FEL) M aCI, pH=6.7-7.5en T Regulador NaCI 2 M NaCI Regulador CIP 0.5 M NaOH Tabla 26: Resumen de los experimentos importantes de purificación de rFurina en la resina de intercambio de aniones. El contenido total de proteína fue determinado utilizando un ensayo Bradford. El índice de reducción de CHO es calculado como la proteína de CHO cargada dividida entre la proteína de CHO total encontrada en el conjunto del eluido. 500 m NaCI 013 4016 2259 n.d. 33 57 51 3.0 TMAE; RT, elución 400 mM NaCI 015 4403 2007 n.d. 41 46 50 3.8 TMAE; RT, elución 300 mM NaCI 018 10635 2584 n.d. 65 37 41 6.5 TMAE; RT, elución 300 mM NaCI 021 8684 3550 n.d. 126 20 59 5.5 TMAE; RT, elución 300 mM NaCI 024 4151 903 n.d. 19 54 38 6.3 CaptoQ; RT; elución 300 mM NaCI 6185 n.d. 45 10 12.3 02 E 15696 5 1 1068 n.d. 12 n.d. n.d. CaptoQ; RT; gradiente E de elución 2 10237 14138 51 8 10.1 02 E 31316 1868 n.d. 6 1 17 n.d. n.d. CaptoQ;4°C; gradiente E de elución 2 028 32635 27651 10011 288 68 19 3.6 TMAE; 4°C; elución 300 mM NaCI 029C 23682 12642 7789 176 71 14.4 6.9 CaptoQ; RT; elución 300 mM NaCI 029T 23806 14922 2671 362 30 65.1 3.3 TMAE; RT, elución 300 mM NaCI 033 20625 6843 4568 n.d. 35 n.d. 4.6 CaptoQ; RT; elución 300 mM NaCI; carga UF/DF conc. 035 26244 13209 6967 n.d. 78 n.d. 1.9 TMAE; RT, elución 300 mM NaCI; carga UF/DF conc.

EJEMPLO 5: CONCENTRACIÓN. PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE rFURINA Este ejemplo describe otros métodos utilizados en la concentración y purificación (por ejemplo, el procesamiento descendente) de la rFurina a gran escala. Dichos métodos de procesamiento incluyen ultrafiltración, diafiltración y cromatografía capto-MMC, que fue realizada en la producción de la rFurina substancialmente libre de proteína animal. También describe métodos para analizar la concentración de proteínas, la actividad específica y la contaminación de la proteína de la célula huésped y el ADN. Ultrafiltración. El sobrenadante (de aproximadamente 800 a 1200 kg en las campañas de Quimiostato, y aproximadamente 550 a 700 kg en las campañas de RFB) fue separado de las células y concentrado a un volumen final de 35 a 45 L mediante ultrafiltración. Los parámetros y puntos de ajuste del Sistema de Ultrafiltración/Diafiltración (UFS) durante el paso de concentración se encuentran en la Tabla 27.

Tabla 27: Parámetros de Operación y Puntos de Ajuste para el Paso de Concentración Diafiltración. Inmediatamente después de acabar el paso de concentración, se inició la diafiltración del retenido. Los parámetros y puntos de ajuste del UFS durante el paso de diafiltración se encuentran en la Tabla 28. Tabla 28: Parámetros de Operación y Puntos de Ajuste para el Paso de Diafiltración Parámetro Punto de Ajuste Presión del Retenido 0.7-1.2 bars Presión del Impregnado 0 - 0.1 bars Presión Transmembrana 0.7-1.1 bars Rango de Flujo Cruzado Específico (Rango de flujo de alimentación) 300-600 L/h/m2 Rango de Flujo de Permeado Específico 7-20 L/h/m2 Conductividad Objetivo < 2 mS/cm índice de diafiltración ( Vpermeado /v retenido ) 4-5,5 Tiempo de Procesamiento1' 0.75- 1.25 h Cuando la conductividad del retenido descendió por debajo de 2 mS/cm (determinado con la muestra de conductividad en línea del UFS), este paso del proceso fue terminado. Esta baja conductividad es requerida para asegurar un enlace cuantitativo de la rFurina al gel cromatográfico en el paso de purificación posterior. El producto diafiltrado fue transferido y el valor de pH del producto diafiltrado fue ajustado a 6.0 agregando una solución de ácido acético 1 M. El producto fue almacenado a temperatura ambiente (RT) antes de aplicarlo a la columna Capto-MMC. Cromatografía Capto-MMC. El gel de Capto-MMC, un intercambiador multimodal de cationes, fue utilizado para enlazar la rFurina y para eliminar la vasta mayoría de contaminantes del producto diafiltrado. Después del equilibrado del gel de cromatografía, el producto diafiltrado es cargado a la columna. Se instaló una cápsula de 0.22 µ?? de filtro para realizar la filtración en línea del producto diafiltrado. Los pasos cromatográficos adicionales se encuentran enumerados y detallados en la Tabla 29. Tabla 29: Pasos de Cromatografía Capto-MMC ' CV = volumen de la columna: volumen de la resina empacada en la columna de cromatografía En el procesamiento descendente, no se observaron problemas. Los pasos descendentes (Filtración, UF, DF) podrían ser llevados a cabo en las mismas condiciones utilizadas para las recolecciones del cultivo de Quimiostato. Las actividades promedio totales de rFurina tienen rendimientos de 91% (Campaña de ORFU06002), 66% (Campaña de ORFU07001 ) y 84% (Campaña de ORFU07002) que podrían ser logrados. Solamente los cambios menores son proporcionados por el hecho, de que el volumen de partida para el paso UF es algo más bajo comparado con el cultivo continuo. Pero este cambio no tiene efecto en la calidad del producto purificado. (Ver datos sobre la actividad total, el ADN de la Célula Huésped, Proteína de la Célula Huésped; ver Tabla 30). Los valores promedio de todas las tres campañas para la Proteína de la Célula Huésped y el contenido del ADN de la Célula Huésped revelan más bien valores máximos promedio bajos de 8.55 µg/ml (en un rango de 2.2 a 10.4 µg/ml) y 13.48 ng/ml (en un rango de 0.0 a 23.9 ng/ml), respectivamente (ver Tabla 30). El paso cromatográfico pudo reducir la contaminación específica a los niveles máximos de promedio bajo de 0.35 ng Proteína de CHO/U de Actividad de rFurina (en un rango de 0.13 a 0.52 ng de Proteína CHO/U) y 0.148 pg ADN de Célula Huésped/U de Actividad de rFurina (en un rango de 0.0 a .365 pg de ADN/U de Actividad de rFurina).

Tabla 30: Resultados de la impureza de Cromatografía Capto-MMC - Campaña de comparación Caracterización de Furina. La calidad y funcionalidad de la rFurina fue evaluada mediante los siguientes métodos bioquímicos/biofísicos (Tabla 31). Tabla 31: Métodos analíticos para la rFurina Ensayo de Actividad de Furina. Los lotes de rFurina purificada (conjuntos de eluido Capto-MMC) fueron probados por la actividad enzimática de la Furina. El substrato es un péptido corto sintético que contiene una secuencia de reconocimiento dibásica enlazada a un grupo de coumarina amino-metilo fluorescente (AMC), que es liberado después de la disociación (BOC-RVRR-AMC). El grupo fluorogénico liberado puede ser detectado mediante la excitación a 380 nm y la medición posterior de la luz emitida en 435 nm. Una unidad de actividad es definida como la liberación de 1 pMol de AMC por minuto a una temperatura de 30°C. Dependiendo de la eficacia de la fermentación y purificación, los valores medidos de la actividad de rFurina fueron en el rango de aproximadamente 10000 U/ml hasta más de aproximadamente 100000 U/ml, con un valor promedio de aproximadamente 69000 U/ml (Tabla 32, Tabla 33 y Tabla 34). Un aumento de la actividad de rFurina para las campañas del modo RFB fue observado, especialmente cuando se comparan los valores promedio de la campaña de Quimiostato ORFU06002 (47737 U/ml) con los valores promedio de las campañas RFB ORFU07001 (77653 U/ml) y ORFU07002 (93178 U/ml). (En general, la actividad de rFurina se encuentra en un rango de aproximadamente 10000 a más de 100000 U/ml; no se muestran todos los datos). La actividad específica de la Furina es expresada como la actividad en U^g de proteína (ver Tablas de la 32 a la 34). La actividad específica promedio para la campaña ORFU06002 fue de 269U^g de proteína, aumentando a 500 U^g para ORFU07001 y 563 U^g para ORFU07002, respectivamente. (En general, la actividad específica se encontró en un rango de 124 a 620 \ /µg de proteína; datos no mostrados). Por lo tanto, la actividad específica duplicó las dos campañas RFB, un resultado de la actividad enzimática más alta de la rFurina del RFB comparado con los lotes producidos en el modo Quimiostato. Tabla 32: Conjunto del Eluido Capto-MMC de la Campaña ORFU06002 Tabla 33: Conjunto del Eluido Capto-MMC de la Campaña ORFU07001 Tabla 34: Conjunto del Eluido Capto-MMC de la Campaña ORFU07002 Actividad de la Prueba de Uso de Furina. La Prueba de Uso de Furina está diseñada para cuantificar la eficacia de la rFurina para procesar el pro-VWF en rVWF maduro. La eficacia de maduración es expresada como la cantidad de unidades de Furina requeridas para la maduración de una unidad de Antígeno 1 VWF (U Furina/U VWF). El substrato es una preparación proVWF/VWF que ha sido purificada en una escala Piloto de acuerdo con el procedimiento actual de manufactura pero omitiendo la maduración de Furina y el paso de purificación final en Superóse 6. La concentración del substrato rVWF fue de 100 U Ag/ml (F8HL_24_01 UF02-R). Cuatro diluciones de la muestra fueron probadas en un Tubo Eppendorf de 1 mi para cubrir las concentraciones específicas de Furina de, por ejemplo, 0.25-2.0 U/U VWF. La reacción y el regulador de dilución fue de 100 mM de HEPES, 1 mM de CaCI2, pH 7.0 y el experimento de maduración fue realizado durante 16 horas a una temperatura de 37°C bajo agitación ligera. Después de la incubación la reacción enzimática es detenida mediante la adición del regulador de muestra de SDS y calentando las muestras durante 5 minutos a una temperatura de > 90°C. Entonces las muestras son analizadas por SDS-PAGE en geles al 8% utilizando la tinción de plata de los polipéptidos separados. La actividad específica de Furina requerida para obtener una eficacia de maduración de > 95% es evaluada mediante la inspección visual de los geles (la banda de proVWF debe representar menos del 5% comparada con la banda de VWF madura) es entonces reportada y utilizada como un atributo de calidad de la rFurina aprobada. Tabla 35: Conjunto de Eluido Capto-MMC Campaña ORFU06002 Tabla 36: Conjunto de Eluido de Capto-MMC Campaña ORFU07001 Tabla 37: Conjunto de Eluido de Capto-MMC Campaña ORFU07002 La actividad buena y consistente de maduración de VWF se encontró para todos los lotes de rFurina probados. Los valores promedio de las campañas son debajo de 1.0 U de Furina/U de WVF:Ag el grado de maduración excede el 95% en todos los casos. (Tablas 35 a 37). Las actividades de maduración de todos los lotes de rFurina son comparables y, con referencia a los valores promedio calculados de las campañas ORFU06002, ORFU07001 y ORFU07002, casi no se pudieron encontrar diferencias entre la rFurina producida en el modo de Quimiostato y en el modo RFB. SDS-PAGE de Furina y Tinción de Plata. El SDS-PAGE al 8% con tinción de plata y un análisis Western blot se realizaron para todos los lotes de rFurina para asegurar la calidad consistente y visualizar el grado de impureza. Como se puede observar en la figura 12, los patrones de la banda de los eluidos Capto-M C de la campaña ORFU06002 y ORFU07002 que correlacionan hasta un alto grado; todas las muestras ilustran una banda prominente de Furina en aproximadamente 60kDa. Una tendencia a un peso molecular ligeramente más bajo de las bandas de Furina es más visible que las muestras de la campaña ORFU06002 de los lotes MMC01 a MMC08 (figura 12, columnas de la 1 a la 8). Las muestras de estos lotes fueron desglicosiladas con el efecto de que la tendencia no fue visible ya en SDS-PAGE posteriores a la tinción de plata (datos no mostrados), soportando la suposición de que durante la campaña ORFU06002, la rFurina fue glicosilada ligeramente diferente en un grado menor en el curso de la fermentación en progreso. Esta tendencia no fue observada en la campaña ORFU07002 del RFB, sugiriendo una glicosilación constante de la rFurina durante toda la campaña. Las impurezas en los lotes de ORFU06002 y ORFU07002 casi fueron completamente la misma, sin embargo, las muestras de la campaña ORFU07002 del modo RFB muestran bandas menos intensas en la región de 40kDa, polipéptidos que fueron particularmente enriquecidos de manera fuerte en las muestras de la campaña ORFU06002. Western Blot de SDS-PAGE. El análisis Western blot de todas las muestras fue realizado utilizando un anticuerpo monoclonal anti-Furina (figura 13). La banda prominente en ~60kDa puede ser identificada como la banda de Furina y se encuentra en todas las muestras. La capacidad de comparación de las muestras es muy alta. Las variaciones ligeras en la intensidad de la banda se deben a las concentraciones diferentes de Furina en las muestras. En general, el análisis SDS-PAGE subraya la comparabilidad de la rFurina producida en Quimioestato y en la modalidad RFB. Para soportar el SDS-PAGE convencional, se realizó el Enfoque Isoeléctrico, (IEF) en las muestras de las campañas ORFU06002 y ORFU07002. El IEF fue realizado en un pH entre 7.0 y un pH de 3.0, utilizando el IEF vertical. Los polipéptidos fueron visualizados con tinción de Coomassie y el análisis Western blot. El IEF los análisis Western blotting subsecuentes de las muestras de rFurina de la campaña ORFU06002 proporcionaron los patrones de banda específica de Furina (ver figura 14). Hasta siete bandas separadas en la región de pH 4.5 a pH 5.5 pueden ser identificadas, con al menos cinco bandas presentes en todas las muestras. Los IEF de las muestras de la campaña ORFU07002 se llevaron a cabo utilizando la tinción Coomassie y el análisis Western blot para la visualización. La tinción de Coomassie revela el patrón de banda específica exhibiendo todas las muestras cinco bandas separadas mínimas en el rango de pH 4.5 y hasta pH 5.5, y hasta ocho bandas pueden ser identificadas (ver figura 15, Columna 3). El análisis Western blot (ver figura 16) corrobora estos resultados, exhibiendo algunas muestras no todas las bandas visibles en el gel de Coomassie (ver figura 17), probablemente debido a la transferencia incompleta de las proteínas del gel a la membrana de tinción. HPLC de Fase Inversa de Furina. Las muestras de las campañas ORFU06002 y ORFU07003 (eluidos Capto-MMC) fueron probadas con HPLC C4 RP con el objeto de establecer un patrón de indicios para la rFurina. Los patrones pico de las muestras de las dos campañas fueron comparados (ver figura 17 y figura 18). Los cromatogramas de todas las muestras probadas muestran un pico principal característico en un tiempo de retención de aproximadamente 13 minutos, el cual puede ser asignado a la Furina. Las alturas de los picos se correlacionan bien con la concentración de Furina en las muestras. Se pueden ver otras impurezas de la proteína como picos menores en el rango de 8 minutos a 17 minutos. Todas las muestras de la campaña ORFU07002 muestran picos significativamente más pequeños de impurezas que aquellos del ORFU06002. Este hecho está bien de acuerdo con los resultados de SDS-PAGE, como en la modalidad de la campaña ORFU07002 RFB en un número más pequeño y se encontraron cantidades disminuidas de impurezas. Los datos analíticos obtenidos de los métodos de caracterización explicados anteriormente prueban muy bien la capacidad de comparación de la rFurina producida tanto en el modo de Quimiostato como en el modo RFB. No se podrían detectar diferencias mayores en la calidad de la rFurina de los datos disponibles, sin embargo, los lotes de rFurina producidos en el modo RFB mostraron una actividad específica más alta y menos impurezas comparadas con la producción del modo Quimiostato. El paso cromatográfico toma en cuenta una Proteína de Células Huésped muy baja y el contenido de ADN de la célula Huésped en la Substancia del Fármaco a Granel (BDS). Por lo menos un proceso de producción completo consistente de la fermentación RFB y el procesamiento completo descendente de (Filtración UF/DF, cromatografía Capto-MMC) puede ser más fácil de ser implementado para la producción comercial de la rFurina, por ejemplo, en sistemas de uso de un Solo Bio-rreactor (SUB). EJEMPLO 6: PRUEBA DE SEGURIDAD. ESTERILIDAD. Y ESTABILIDAD Este ejemplo describe las pruebas de seguridad, esterilidad, y estabilidad que se realizan para determinar y mantener la cantidad del banco de células CHO. La prueba en la esterilidad/micoplasma tiene que ser realizada de acuerdo con las solicitudes de las Instrucciones Q5D de ICH. La calidad del banco de células tiene que ser revisada mediante la determinación de la viabilidad y densidad de las células promedio de las células descongeladas y el índice de proliferación posterior de los cultivos. Las células fueron probadas por su seguridad viral (Tabla 38), estabilidad genética (Tabla 39), e identidad (Tabla 40). Se descubrió que las células eran estériles, libres de micoplasma, libres de agentes extraños, libres de retrovirus, negativos para el virus MVM, negativos para los virus adventicios, negativos para virus de roedores, libres de virus porcinos y bovinos, y libres de virus del Cache Vallley (CW). Los bancos de células fueron examinados con respecto al productor de Furina/proporción sin productor del análisis FACS. También se probaron por su estabilidad a largo plazo (capacidad para producir Furina por un período de tiempo). Además, la Furina secretada producida bajo condiciones libres de suero tiene que ser investigada con respecto a las isoformas generadas. Todos los datos deben indicar que el crecimiento estable y la producción de Furina pueden ser logrados utilizando estos bancos de células. Las células del MCB/WCB deben mostrar el crecimiento estable y la expresión de Furina en el proceso de producción completo.

Tabla 38. Programa de Seguridad Viral (x) la prueba viral no ha sido realizada en el WCB del cual ha sido preparado el MEPC Tabla 39. Programa de Estabilidad Genética Tabla 40. Programa de Identidad La presente invención ha sido descrita en términos de modalidades particulares descubiertas o propuestas para que comprendan las modalidades preferidas de la práctica de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica podrán apreciar a la luz de la presente descripción, numerosas modificaciones y cambios que se pueden hacer a las modalidades particulares ejemplificadas sin salirse del alcance pretendido de la presente invención. Por lo tanto se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubren todas dichas variaciones equivalentes que se encuentran dentro del alcance de la invención que ha sido reivindicada.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende una furina recombinante substancialmente libre de proteína animal.
2. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 10000 U de furina/mL y la proteína de célula huésped CHO en una concentración menor de aproximadamente 11 pg de proteína/mL
3. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 10000 U de furina/mL y la proteína de célula CHO huésped en una concentración menor de aproximadamente 1.0 ng de proteína/U de actividad de furina.
4. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 10000 U de furina/mL y el ADN de la célula huésped CHO en una concentración menor de aproximadamente 14 ng de ADN/mL.
5. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 10000 U de furina/mL y ADN de célula huésped CHO en una concentración menor de aproximadamente 0.5 pg de ADN/U de actividad de furina.
6. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 100 U/pg y la proteína de la célula huésped CHO en una concentración menor de aproximadamente 11 pg de proteína/ml_.
7. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 100 U/pg y proteína de célula huésped CHO en una concentración menor de aproximadamente 1.0 ng de proteína/U de actividad de furina.
8. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 100 U/pg y ADN de célula huésped CHO en una concentración menor de aproximadamente 14 ng de ADN/mL.
9. La composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque comprende furina recombinante en una actividad de por lo menos aproximadamente 100 U/pg y ADN de célula huésped CHO en una concentración menor de aproximadamente 0.5 pg de ADN/U de actividad de furina.
10. Un método para hacer una furina recombinante substancialmente libre de proteína animal, el cual comprende el paso de cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un polinucleótido que codifica la furina en un medio libre de suero bajo condiciones que permiten la secreción de la furina dentro del medio.
11. El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque comprende el paso de adaptar la célula huésped para cultivarse en un medio con concentraciones crecientemente más bajas de suero hasta que todo el suero es removido del medio.
12. El método tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque comprende transferir la célula huésped del cultivo en el medio que comprende el suero para la proliferación en un medio libre de suero
13. El método tal y como se describe en la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque la célula huésped es una célula CHO.
14. Un método para utilizar la composición tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el paso de poner en contacto una pro-proteína con la composición bajo condiciones para disociar un pro-péptido de la pro-proteína para formar una proteína madura.
15. El método tal y como se describe en la reivindicación , caracterizado porque la proteína madura es el Factor de Hebra nd.
16. El método tal y como se describe en la reivindicación , caracterizado porque la proteína madura es el Factor VIII.