MX2009000685A - Metodo para detectar y/o cuantificar hepcidina en una muestra. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para aislar y/o analizar hepcidina mediante espectrometría de masas y métodos para cuantificar hepcidina.

Description

METODO PARA DETECTAR Y/O CUANTIFICAR HEPCIDINA EN UNA MUESTRA CAMPO DE LA INVENCIÓN Los métodos descritos aquí están relacionados con aislamiento de hepcidina, detección de hepcidina, y cuantificaciones de niveles de hepcidina en muestras biológicas. En particular, los métodos descritos aquí permiten el aislamiento eficiente de hepcidina de una muestra y la medición cuantitativa de niveles de hepcidina en la muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hierro es un microelemento esencial requerido para crecimiento y desarrollo de todos los organismos vivos. Por ejemplo, el hierro es indispensable para la síntesis de ADN y en un amplio intervalo de procesos metabólicos. Las perturbaciones de metabolismo de hierro han sido implicadas en varias enfermedades significativas de mamíferos, en las que se incluyen pero no se limitan, entre otras a anemia por deficiencia de hierro, hemosiderosis , y enfermedad por sobrecarga de hierro: hemocromatosis (Andrews, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet . 1:75 (2000); Philpott, Hepatolog^ Ref.198721 (2002); Beutler et al., Drug-Metab . Dispos. 29:495 (2001)). El contenido férrico en mamíferos es regulado por un control de la absorción, predominantemente en el duodeno y el yeyuno superior, que es el único mecanismo por el cual los Ref.: 198721 depósitos de hierro son fisiológicamente controlados (Philpott, Hepatology 35:993 (2002)). Después de la absorción, el hierro es unido a la transferrina en circulación y proporcionado a tejidos durante todo el cuerpo. El hígado es el sitio de mayor almacenamiento de hierro. Hay un mecanismo de retroalimentación que intensifica la absorción de hierro en pacientes deficientes en hierro y esto reduce la absorción de hierro en pacientes con una sobrecarga del mismo (Andrews Ann. Rev. Genomics Hum. Genet . 1:75 (2000); Philpott, Hepatology 35:993(2002); Beutler et al., Drug-Metab. Dispos. 29:495(2001)). El mecanismo molecular por el cual el intestino responde a modificaciones en requerimientos de hierro corporal sólo ha sido elucidado recientemente. En este contexto, hepcidina, un polipéptido de mamífero recientemente identificado (Krause et al., FEBS Lett. 480:147 (2000); Park et al., J. Biol. Chem. 276:7806 (2001)), ha sido demostrado para ser un componente de señalización clave que regula la homeostasis de hierro (Philpott, Hepatology 35:993 (2002); Nicolás et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 99:4396 (2002)). La hepcidina fue aislada como polipéptido de 25 aminoácidos (aa) en plasma de humano y orina, mostrando actividad antimicrobiana (Krause et al., FEBS Lett. 480:147 (2000); Park et al., J. Biol. Chem. 276:7806 (2001)). Un ADNc de hepcidina que codifica para un precursor de 83 aa en ratones y un precursor de 84 aa en la rata y humano, incluyendo un supuesto péptido de señal de 24 aa, fue identificado posteriormente cuando la búsqueda de genes específicos para el hígado que son regulados por hierro (Pigeon et al., J. Biol. Chem. 276:7811 (2001) ) . La asociación de hepcidina con la respuesta inmunitaria innata deriva de la observación de una sólida regulación de la expresión génica de hepcidina después de estímulos inflamatorios, como infecciones, que inducen la respuesta de fase aguda de los sistemas inmunitarios innatos de vertebrados. En ratones, se mostró que la expresión génica de hepcidina es regulada aceleradamente por lipopolisacárido (LPS) , trementina, adyuvante completo de Freund, e infecciones adenovíricas . Los estudios llevados a cabo con hepatocitos primarios de humano indicaron que la expresión génica de hepcidina respondió a la adición de interleucina 6 (IL-ß), pero no a interleucina la (IL-1 a) o factor de tumor de necrosis tumoral a (TNF-a) . Concordante con esta observación, la infusión de voluntarios de humano con IL-6 causó la escalada rápida de niveles de péptido de hepcidina bioactivos en suero y orina, y fue paralela por una disminución en hierro de suero y saturación de transíerrina . Una correlación fuerte entre expresión de hepcidina y anemia por inflamación también fue encontrada en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo infecciones bacterianas, fúngicas, y virales. Estas conclusiones, conjuntamente con datos de murino similares, llevaron a la conclusión que la inducción de hepcidina durante la inflamación depende de IL-6, y que el eje de hepcidina-IL-6 es responsable de la respuesta hipoferrémica y restricción subsecuente de hierro de patógenos de transmisión sanguínea. La función central de hepcidina y sus funciones clave en la regulación de hierro y en la respuesta inmunitaria innata a la infección, muestra necesidad de métodos y herramientas de diagnóstico informativas para la cuantificación de formas maduras, bioactivas de hepcidina en muestras biológicas y para la regulación de la producción de hepcidina. Mediante una purificación parcialmente de hepcidina de muestras de orina, se demostró que la secreción de hepcidina en la orina es aumentada entre 10 y 100 veces con relación a niveles normales en afecciones de inflamación (Park et al., J. Biol. Chem. 276(11) :7806 (2001)). En estudios de ratón, el único método para detectar regulación por incremento de hepcidina se basó en el análisis de ARN, que no puede guardar correlación a niveles circulantes de hepcidina en sangre. Hasta ahora, ningún método está disponible para cuantificar exactamente niveles de hepcidina en suero o plasma. El método urinario descrito anteriormente muestra niveles absolutos de hepcidina hemática. Otros ensayos desarrollados para cuantificar niveles séricos son ya sea semicuantitativos (Tomosugi et al., Blood, pre publicación de abril de 2006) o sólo capaces de detectar prohepcidina, una especie que no guarda correlación con la inducción de hepcidina (Kemna et al., Blood 106:1864-1866 (2005)). Un ensayo para permitir la cuantificación exacta de niveles de hepcidina es critico para identificar a pacientes que pueden beneficiarse de estrategia que bloquea hepcidina para tratar la anemia por inflamación u otros trastornos relacionados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Describimos métodos para aislar y/o determinar la concentración de hepcidina en una muestra. En particular, se describe un método para cuantificar hepcidina en una espectrometría de masas utilizando una muestra biológica y un método para purificar y/o separar hepcidina de una muestra biológica . Por lo tanto, un aspecto de la invención es proporcionar un método para determinar la presencia o concentración de hepcidina en una muestra que comprende someter a la muestra a una espectrometría de masas ( S) para producir un espectro de masas que tiene una señal que corresponde a hepcidina; medir la intensidad de la señal; y correlacionar la intensidad de señal a una curva estándar o de distribución normal de concentraciones de hepcidina. En algunas modalidades, la hepcidina es una forma de prepropéptido de hepcidina que tiene aproximadamente 84 residuos de aminoácidos. En otras modalidades, la hepcidina es una forma de propéptido de hepcidina que tiene aproximadamente 61 residuos de aminoácidos. En todavía otras modalidades, la hepcidina es una forma procesada de hepcidina que tiene de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. En algunas modalidades, hepcidina es un péptido que tiene una secuencia de SEQ. ID NO: 3; SEQ. ID NO: 4; SEQ. ID NO: 13; SEQ. ID NO: 14; SEQ. ID NO: 15 o una combinación de los mismos. La hepcidina es ionizada durante el análisis del espectro de masa, y la carga resultante de hepcidina puede ser +1, +2, +3, +4, o una mezcla de los mismos. El análisis del espectro de masa puede ser por cromatografía liquida-espectrometría de masas y/o espectro de masas en tándem. En algunas modalidades, la hepcidina es separada adicionalmente de la muestra antes del análisis del espectro de masa. La separación puede ocurrir a través de la cromatografía, como cromatografía líquida y extracción de fase sólida. Otro aspecto de la invención es proporcionar un método para determinar la presencia o concentración de hepcidina en una muestra que comprende la separación de hepcidina de una muestra; someter la hepcidina a MS para producir un espectro de masas que tiene una señal que corresponde a hepcidina; medir la intensidad de la señal de hepcidina y correlacionar la intensidad de señal en el espectro de masas a una curva estándar o de distribución normal de concentraciones de hepcidina para obtener una cantidad de hepcidina en la muestra. En algunas modalidades, la separación de hepcidina de la muestra es a través de cromatografía, como cromatografía líquida, extracción de fase sólida o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la hepcidina es una forma de prepropéptido de hepcidina que tiene aproximadamente 84 residuos de aminoácidos. En otras modalidades, la hepcidina es una forma de propéptido de hepcidina que tiene aproximadamente 61 residuos de aminoácidos. En todavía otras modalidades, la hepcidina es una forma procesada de hepcidina que tiene de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. La hepcidina es ionizada durante el análisis del espectro de masas y la carga resultante de hepcidina puede ser +1, +2, +3, +4, o una mezcla de las mismas. Aún otro aspecto de la invención es proporcionar un método para separar hepcidina de una muestra, que comprende la introducción de la muestra a una columna de fase inversa y tratamiento de la columna de fase inversa con un solvente que eluye, donde el eluyente resultante comprende hepcidina. En algunas modalidades, el solvente que eluye comprende metanol, agua o una mezcla de los mismos. En ciertas modalidades, la columna de fase inversa comprende un C18, C8, o columna de fase inversa C3 o C18 polarmente modificado, C8, o columna de fase inversa C3. Las columnas están disponibles de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo Waters, Agilent, y lo similar. En cualquiera de los aspectos de la invención descrita aquí, la muestra puede ser de un mamífero y en modalidades específicas, el mamífero es un humano. En ciertas modalidades, el humano es sano, mientras en otras modalidades, el humano muestra una homeostasis de hierro interrumpida. En modalidades específicas, la homeostasis de hierro está por debajo de la normal, mientras en otras modalidades, la homeostasis de hierro está por encima de la normal. En una modalidad específica, los índices de hierro o los criterios hematológicos del paciente están fuera de los intervalos normales como es indicado en la Tabla I a continuación. En diversas modalidades, un paciente humano padece de anemia y es hiposensible a la terapia de eritropoyetina o una terapia eritropoyética . En una modalidad específica, la terapia eritropoyética comprende un análogo de eritropoyetina como la darbepoetina alfa. En cualquiera de los aspectos de la invención descrita aquí, el humano puede padecer de o se puede sospechar que padece una afección inflamatoria o relacionada de la afección inflamatoria. Las afecciones incluyen sepsis, anemia por inflamación y anemia por cáncer, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad renal en etapa terminal, anemia por deficiencia de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis, diabetes, artritis reumatoide, arteriesclerosis, tumores, vasculitis, lupus sistémico eritematoso, y artropatia. En otras modalidades, el humano puede padecer de o se sospecha del padecimiento de una afección no inflamatoria. Las afecciones no inflamatorias incluyen deficiencia de vitamina B6, la deficiencia de vitamina B12, deficiencia de folato, pelagra, mielosis funicular, seudoencefalitis, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, cardiopatia isquémica y enfermedad arterial oclusiva periférica. En todavía otras modalidades, el humano puede padecer de o se sospecha del padecimiento de una reacción de fase aguda. Las reacciones de fase aguda incluyen sepsis, pancreatitis, hepatitis y enfermedades reumatoides . En otro aspecto de la invención, los métodos son proporcionados para mejorar el tratamiento de un paciente humano que padece de anemia al medir las concentraciones de hepcidina utilizando los métodos descritos aquí. En diversas modalidades, la concentración de hepcidina es de aproximadamente 10 ng/ml o menos, aproximadamente 5 ng/ml o menos, aproximadamente 2 ng/ml o menos o aproximadamente 1 ng/ml o menos. En otras modalidades, la concentración de hepcidina es de aproximadamente 25 ng/ml o mayor o 30 ng/ml o mayor. En ciertas modalidades, la terapia de anemia del paciente es modificada y/o reevaluada con base en supervisar de su o su concentración de hepcidina.

Otro aspecto de la invención es un kit que comprende dos o más artículos útiles para llevar a la práctica un método de la invención, envasada conjuntamente. Por ejemplo, en una variación, el kit comprende una pluralidad de recipientes de hepcidina, cada recipiente tiene una cantidad conocida y diferente de hepcidina, un recipiente convencional e instrucciones para preparar una curva estándar o de distribución normal de concentraciones de hepcidina al patrón y para evaluar una muestra de prueba para la concentración de hepcidina. En ciertos casos, el patrón comprende una hepcidina isotópicamente marcada, mientras en otros casos, el patrón es un péptido que tiene retención similar como hepcidina y una masa de aproximadamente ± 750 Da de aquella de hepcidina. En algunas modalidades, hepcidina comprende SEQ. ID NO: 4. En una modalidad específica, la hepcidina comprende SEQ. ID NO: 4 y el patrón comprende SEQ. ID NO: 4 isotópicamente marcado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A muestra un árbol de decisiones de índices de hierro y estados de enfermedad para la evaluación de un paciente, sin una cuantificación de niveles de hepcidina; La Figura IB muestra un árbol de decisiones para la evaluación de un paciente al utilizar la cuantificación de niveles de hepcidina; La Figura 2 muestra que la formación de iones de hepcidina en un espectro de masas es predominantemente el estado de carga +4 (m/z 698.5) y +3 (m/z 930.8); La Figura 3 muestra el espectro de hepcidina de MS/MS del +3 estado de carga; La Figura 4 muestra el espectro de hepcidina de MS/MS del estado de carga +4; La Figura 5 muestra la optimización de pH para la extracción de fase sólida (SPE) de hepcidina; La Figura 6 muestra la espectrometría de masa por cromatografía de hepcidina de humano (estados de carga +3 y +4) extraído del suero de humano en blanco; La Figura 7 muestra la espectrometría de masa por cromatografía de hepcidina de humano (estados de carga +3 y +4) y patrón interno extraído de un paciente con la sepsis; La Figura 8 muestra una curva estándar o de distribución normal de la concentración contra el área de analito: el área del patrón interno creado de cantidades de hepcidina conocidas ; La Figura 9 muestra la estabilidad de hepcidina con el tiempo en afecciones de incubación; La Figura 10 muestra un cromatograma de cromatografía líquida de pico base de una solución de incubación a período de tiempo 0; La Figura 11 muestra la espectrometría de masa por cromatografía correspondiente de hepcidina a un período de tiempo de incubación de 0; La Figura 12 muestra el cromatograma de pico base de una solución después de 4 horas de incubación; La Figura 13 muestra la espectrometría de masa por cromatografía correspondiente de hepcidina en un período de tiempo de incubación de 4 horas; La Figura 14A muestra la comparación de niveles de hepcidina de suero en 20 donadores voluntarios en comparación con 40 pacientes con una variedad de cánceres y hemoglobina menores que 10 g/dl, donde dos lecturas elevadas en los donantes de control guardaron correlación con Tsat elevado o infección; y La Figura 14B muestra la sub clasificación de los pacientes de anemia por cáncer a fin de identificar a aquellos con inflamación probable (AI), anemia por deficiencia de hierro (IDA) o una mezcla de los dos (anemia mixta). Cualquier paciente que no se encuentra en ninguna de estas clases fue denominado "otro". Los índices utilizados para clasificar a pacientes son CRP, proporción de ferritina de sTfR/log, Tsat y ferritina (como es observado en la Figura IB) . Las líneas representan el valor promedio. La Figura 15 muestra una espectrometría de masa por cromatografía de hepcidina de humano truncada Hepc-20 (SEQ ID NO: 15), que muestra Hepc-20 tanto en un estado de carga +3 como en +4.

La Figura 16 muestra una espectrometría de masa por cromatografía de hepcidina de humano truncada Hepc-22 (SEQ ID NO: 16) , que muestra Hepc-22 tanto en un estado de carga +3 como en +4. La Figura 17 muestra una espectrometría de masa por cromatografía de hepcidina de humano Hepc-25 (SEQ ID NO: 4), que muestra Hepc-25 tanto en un estado de carga +3 como +4. La Figura 18 muestra curvas de calibración para la concentración (ng/ml) de Hepc-25, Hepc-22, y Hepc-20 por la intensidad de señal de MS .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La hepcidina, designada debido a su sitio de producción, es un péptido importante unido al metabolismo de hierro. Las perturbaciones en el metabolismo de hierro pueden ser evaluadas a una medición de niveles de hepcidina, luego se comparan los niveles de hepcidina cuantificados con niveles normales. Las comparaciones pueden facilitar el diagnóstico, pueden evaluar regímenes de tratamiento o pueden monitorear el progreso de un paciente con el tiempo. Los métodos descritos proporcionan un promedio de aislar hepcidina de y/o analizar hepcidina en una muestra biológica. Antes de esta descripción, ni la espectrometría de masas ni el aislamiento de hepcidina de una muestra eran suficientemente eficientes o exactos para guardar correlación con una cuantificación absoluta de hepcidina en la muestra. Las técnicas de espectrometría de masas y/o de de separación ineficaces, o técnicas de espectrometría de masas y/o de separación inconsistentes, dificultan la capacidad de alguien de comparar conjuntos de datos individuales. Con el descubrimiento de técnicas de espectrometría de masas y separación eficientes, diversos conjuntos de datos pueden ser comparados, ambos del mismo paciente con el tiempo o de pacientes en diferentes períodos de tiempo. La hepcidina, en parte debido a su secuencia de aminoácidos, no es fácilmente fragmentada para el análisis del espectro de masa. Las descritas aquí son métodos para la ionización y fragmentación muy competente de hepcidina, que da como resultado espectros de MS adecuados para la cuantificación de hepcidina utilizando un patrón interno y comparaciones de curva estándar o de distribución normal. Los informes previos de análisis del espectro de masa de hepcidina utilizaron técnicas de espectrometría de masas que no permiten con eficacia la cuantificación de hepcidina en una muestra. (Ver, p.ej, Kemna et al., Blood, 106:3268 (2005).). Los métodos descritos aquí también pueden ser aplicados para la cuantificación de defensinas (Kluver et al., J. Peptide. Res. 59:241 (2002)). Como se utiliza aquí, los términos "cuantitativo" "o cuantificación" se refieren al suministro de una cuantificación absoluta de hepcidina en una muestra que puede ser comparado con cuantificaciones consideradas en un periodo de tiempo diferente o de una fuente diferente. Las mediciones cuantitativas son valiosas con diversos objetivos además de cuantificaciones relativas que sólo pueden ser comparadas con otras cuantificaciones consideradas al mismo tiempo que puede producir la información como una proporción. Como se describe con mayor detalle a continuación, el uso de una cantidad cuantificada de un patrón interno permite el cálculo cuantitativo de hepcidina en una muestra. Como se utiliza aquí, la palabra "muestra" significa cualquier muestra biológica adecuada para el análisis de hepcidina por los métodos descritos aquí. La fuente de las muestras puede ser suero, sangre, plasma, orina u otro liquido corporal, o un filtrado de un liquido corporal de un paciente de prueba. El paciente de prueba es un animal, preferentemente mamífero y más preferentemente un humano. Como se utiliza aquí, "un marcador de hierro" es un metabolito, proteína u otra biomolécula que es implicada en niveles de hierro o metabolismo. Una interrupción de metabolismo de hierro significa una deficiencia o desviación de valores normales de uno o varios marcadores de hierro, como aquellos enlistados en la Tabla I u otros parámetros clínicos del hierro, como aquellos enlistados en la Figura 1A o la Figura IB. Las proteínas, además de parámetros clínicos del hierro, que pueden controlar niveles de hierro, incluyen ferroportina , hemojuvelina soluble, proteínas morfogénicas óseas (BMP) y miembros de familia relacionados. Al medir los niveles de hepcidina en una muestra biológica de un paciente, la información puede ser extrapolada acerca del metabolismo de hierro del paciente. Adicionalmente, los datos pueden ser generados acerca de las tendencias en niveles de hepcidina con respecto a diversos trastornos o afecciones de metabolismo de hierro. Las afecciones inflamatorias que son implicadas en una interrupción del metabolismo de hierro incluyen, pero no se limitan a, sepsis, anemia por inflamación ( eiss et al., N. Engl . J. Med. 352:1011 (2005)), anemia por cáncer, artritis inducida por colágeno (CIA) , insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) , enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) (Kulaksiz et al., Gut, 53:735 (2004)), deficiencia de hierro, hemocromatosis (Ganz, Blood, 102(3) :783 (2003)), diabetes, artritis reumatoide (Jordán, Curr. Opin. Rheumatology , 16:62 (2004)), arteriosclerosis, tumores, vasculitis, lupus sistémico eritematoso y enfermedad o falla renal. Las afecciones no inflamatorias que son implicadas en una interrupción del metabolismo de hierro incluyen, pero no se limitan a deficiencia de vitamina B6, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de folato, pelagra, mielosis funicular, seudoencefalitis , la enfermedad de Parkinson (Fasano et al., J. Neurochem. 96:909 (2006) y Kaur et al., Ageing Res. Rev., 3:327 (2004) ) , enfermedad de Alzheimer, cardiopatia isquémica, osteopenia y osteoporosis (Guggenbuhl et al., Osteoporos. Int. 16:1809 (2005) ) , hemoglobinopat ias y otros trastornos del metabolismo celular rojo ( Papanikolaou et al., Blood 105:4103 (2005) ) y enfermedad arterial oclusiva periférica. Las afecciones de reacción de fase aguda que son implicadas en una interrupción de metabolismo de hierro incluyen, pero no se limitan a pancreatitis, hepatitis (Brock, Curr. Opin. Clinic. Nutrition. Metab. Care, 2:507 (1999) ) , y enfermedades reumatoides . Por ejemplo, los valores de referencia para la hepcidina cuantificada están dentro el intervalo de 0 a aproximadamente 2000 ng/ml, particularmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ng/ml. Un intervalo de referencia particularmente preferido es de aproximadamente 200 a aproximadamente 260 ng/ml. Cualquier valor dentro del intervalo de referencia puede usarse como un valor umbral para la cuantificación, por ejemplo, un valor en el intervalo de 0 a aproximadamente 1000 ng/ml. Una cuantificación menor que aproximadamente 10 ng/ml puede indicar la supresión de hepcidina, mientras el intervalo "normal" de niveles de hepcidina sea menor que aproximadamente 25 ng/ml. En la Tabla I se enumeran índices de hierro y sus intervalos normales concentración. Tabla I El índice de hierro hemático de un paciente fuera de los intervalos normales enumerados en la Tabla I es un desencadenante para cuantificar el nivel de hepcidina de dicho paciente. Como la hepcidina es un componente clave del metabolismo de hierro, los niveles de hepcidina se correlacionan con una interrupción de metabolismo de hierro y/o los índices de hierro. Los niveles de hepcidina elevados se correlacionan con niveles de hierro en suero menores a los intervalos normales indicados en la Tabla I, con hemoglobina y hematocrito bajos, con un Tsat reducido o normal y valores de ferritina elevados o normales, y con una afección inflamatoria elevada como es cuantificada con la elevación de proteína C reactiva (CRP) . La detección de la interrupción del metabolismo de hierro incluye la evaluación, la formación de imágenes, o bien, el establecimiento de la presencia, ausencia o concentración de hepcidina o un precursor de hepcidina. El término "detección" abarca aplicaciones de diagnóstico, de pronóstico y de monitorización para hepcidina. El término "hepcidina", como se utiliza aquí, incluye prepropéptidos de 83 u 84 secuencias de aminoácidos en el ratón (SEQ. ID NO: 1); en la rata (SEQ ID NO: 2), y en el humano (SEQ ID NO: 3) ; las secuencias de hepcidina de 25 aa (aminoácidos) de la hepcidina de humano (SEQ. ID NO: 4); la hepcidina de mono cinomolgo (SEQ. ID NO: 5) ; la hepcidina de mono verde (SEQ. ID NO: 6) ; la hepcidina de conejo (SEQ. ID NO: 7); la hepcidina de rata (SEQ. ID NO: 8); la hepcidina de ratón (SEQ. ID NO: 9), o la hepcidina canina (SEQ. ID NO: 10), (SEQ. ID NO: 11), o (SEQ. ID NO: 12). Los péptidos de hepcidina también incluyen un propéptido de humano de 60 aminoácidos (SEQ. ID NO: 13) y (SEQ. ID NO: 14), asi como una secuencia de 20 aminoácidos (SEQ. ID NO: 15) y , una secuencia de 22 aminoácidos (SEQ. ID NO: 16) . El término "espectrometría de masas" o " MS", como se utiliza aquí, se refiere a métodos para la filtración, detección y medición de iones con base en su proporción de masa con respecto a la carga o " mz". En términos generales, una o varias moléculas del interés son ionizadas, y los iones son introducidos posteriormente en un instrumento espectrográfico de masas donde, debido a una combinación de campos magnéticos y eléctricos, los iones siguen un camino en el espacio que es dependiente de la masa ("m") y de la carga ("z"). Ver, p.ej., la Patente Estadounidense Número 6 204 500; 6 107 623; 6 268 144; 6 124 137; 6 982 414; 6 940 065; 5 248 875; Wright et al., Prostate Cáncer and Prostatic Diseases 2:264 (1999); y Merchant and einberger, Electrophoresis 21:1164 (2000), cada uno de los cuales está por este medio incorporado por referencia en su totalidad. Por ejemplo, en un instrumento "de trampa iónica cuadrupolo" o " cuadrupolo", los iones en un campo de radiofrecuencia oscilante (RF) experimentan una fuerza proporcional al potencial de corriente directa (corriente continua) aplicada entre electrodos, la amplitud de la señal de RF y m/z. El voltaje y la amplitud pueden ser seleccionados de tal manera que sólo los iones que tienen un m/z particular recorran la longitud del cuadrupolo, mientras todos los demás iones son desviados. Asi, los instrumentos del cuadrupolo pueden actuar tanto como "un filtro de masas" como "un detector de masas" para los iones inyectados en el instrumento . El espectrómetro de masas cuadrupolar triple en modo de monitorización de reacción de ión múltiple (MRM) se usa preferentemente para la cuantificación de hepcidina. Esto implica dos espectrómetros de masas cuadrupolar independientes, separados por una célula de colisión cuadrupolar. El primer cuadrupolo es usado para seleccionar iones de analito del interés (precursor) , que es fragmentado en la célula de colisión por la disolución inducida por la colisión. Los fragmentos resultantes son analizados mediante el segundo cuadrupolo analítico. Como los iones del precursor se separan en la célula de colisión de manera muy específica, la monitorización del ión de fragmento exclusivo del precursor da como resultado una gran mejora de la especificidad y de la relación señal/ruido. Esto, por lo tanto, puede usarse para el análisis cuantitativo en muestras complejas como el suero. Además, la resolución de las técnicas de espectrometría de masas puede ser potenciada con el empleo de una "espectrometría de masas en tándem" o "MS/MS". En este método, un ión de precursor o un grupo de iones generados de una molécula (o moléculas) del interés son filtrados en un espectrómetro de masas, y estos iones de precursor son fragmentados posteriormente para producir uno o varios iones de fragmento que, entonces, son analizados en un segundo procedimiento de MS . Por medio de una selección cuidadosa de iones de precursor, sólo los iones producidos por ciertos analitos del interés son pasados a la cámara de fragmentación, donde se lleva a cabo la colisión con átomos de un gas inerte para la producir los iones de fragmento. Ya que tanto el precursor como los iones de fragmento son producidos de una forma reproducible bajo un grupo determinado de afecciones de ionización/fragmentación, la técnica MS/MS puede proporcionar un instrumento analítico muy potente. Por ejemplo, la combinación de filtración/fragmentación puede ser usada para eliminar sustancias de interferencia y puede ser particularmente útil en muestras complejas, como las muestras biológicas . Los espectrómetros de masas utilizan varios métodos de ionización diferentes. Estos métodos incluyen, entre otros, fuentes de ionización de fase de gas, como impacto de electrones, ionización química e ionización de campo, así como fuentes de desorción, como desorción de campo, bombardeo de átomo rápido, desorción/ionización láser asistida por matriz y desorción/ionización por láser de superficie (SELDI, por sus siglas en inglés) . Además, los espectrómetros de masas pueden ser conectados a medios de separación como la cromatografía de gas (GC) y la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) . En algunos casos, se emplea la ionización por electroaspersion. Se usa la ionización por electroaspersion en el modo de ión positivo (ESI) para conectar la separación de HPLC y la detección de hepcidina por el espectrómetro de masas. La ionización ocurre bajo presión atmosférica. Esto implica rociar el efluente de un análisis LC o de una muestra en sí mismo a partir de una pequeña aguja, a la cual se le aplica una alta tensión. Este proceso genera pequeñas gotitas cargadas, y el solvente de fase móvil es entonces evaporado manteniendo la molécula de muestra ionizada y en la fase de gas. Después, estos iones de fase de gas generados son "barridos" en el espectrómetro de masas para la detección. Otros métodos de ionización pueden ser empleados también, como la ionización química, pero ESI es el mecanismo de ionización preferido. Debido a que el espectro de masas se designa en unidades de m/z, el grado de ionización afectará el pico resultante correspondiente al péptido de hepcidina. La carga de hepcidina puede ser +1, +2, +3, +4, o una combinación de estos, según el método de ionización empleado. En algunas modalidades, el MS se combina con una etapa de cromatografía líquida a fin de aumentar la sensibilidad de las cuantificaciones resultantes. La HPLC de fase inversa es un método de separación que implica la transferencia de masas entre dos fases inmiscibles inmóviles apolares y móviles relativas polares. Los componentes de una mezcla, primero, son disueltos en un solvente, luego se introducen en la fase móvil y fluyen por una columna cromatográfica donde la fase inmóvil es inmovilizada en el material de embalaje. En la columna, la mezcla es resuelta en sus componentes según la interacción del soluto con fases móviles e inmóviles. Cada uno de los componentes resueltos es detectado entonces por el espectrómetro de masas. La cuantificación de hepcidina en una muestra se logra añadiendo un patrón interno a las muestras y comparando la proporción de hepcidina y el patrón interno a proporciones obtenidas de una serie de muestras donde las cantidades conocidas de hepcidina y el patrón interno son añadidas a la matriz en blanco (una curva estándar, ver, p.ej., la Figura 8) . El uso de este método permite la determinación de los niveles de hepcidina en pacientes sanos normales, asi como también el nivel de hepcidina de pacientes que padecen sepsis u otras afecciones inflamatorias. Los patrones internos apropiados son aquellos que tienen un peso molecular distinto (es decir, señal de espectro de masas) al de la hepcidina, pero dentro de un intervalo de ± 750 (m/z) . En algunas modalidades, el patrón interno es un péptido de hepcidina isotópicamente marcado, donde uno o varios átomos de H, C, N u O son sustituidos por un isótopo estable que tiene una masa diferente (p.ej., 2H, 13C, 15N, 170 o 180) . En diversas modalidades, el patrón interno es un péptido que tiene retención similar y/o características cromatográficas como la hepcidina y un peso molecular distinto, dentro de ± 50 m/z. En una modalidad específica, el patrón interno es un péptido de SEQ. ID NO: 17. La cuantificación de los niveles de hepcidina en una muestra permite comparaciones entre conjuntos de datos. Esta capacidad de comparar cuantificaciones de muestra diferentes permite tanto el diagnóstico como la monitorización de capacidades. Los métodos de cuantificación para la hepcidina según las modalidades de la presente invención pueden ser ventajosamente utilizados al diagnosticar el grado del metabolismo de hierro o la interrupción de homeostasis de hierro en pacientes dentro de una clínica de diagnóstico. El diagnóstico podría ser usado, como resultado, por clínicos para seleccionar y poner en práctica terapias de tratamientos apropiados y preventivos que incluyen la quelación de hierro, la terapia con hierro, la supresión inflamatoria o la terapia eritropoyética . En una clínica de diagnóstico, los métodos y cálculos anteriores son interpretados de tal modo que se puede tomar la acción a seguir más adecuada considerado los niveles de concentración de hepcidina, sola o combinada con otros parámetros como aquellos enumerados en la Tabla I. Como se utiliza aquí, el término "homeostasis de hierro" se refiere a un proceso para coordinar todos los aspectos del metabolismo de hierro en el cuerpo para mantener un equilibrio entre la absorción de hierro, la pérdida de hierro, y la movilización de hierro y su almacenamiento, dando como resultado el control de los niveles séricos de hierro dentro del intervalo normal. La homeostasis de hierro con un equilibrio negativo (menor del normal) comprendería situaciones donde los niveles séricos de hierro se mantuvieran por debajo del intervalo normal, el equilibrio entre la absorción de hierro y la pérdida diera como resultado la pérdida neta de hierro en el cuerpo, o que ocurriera una distribución deficiente de hierro tal, que las reservas de hierro mermaran. La homeostasis de hierro con un equilibrio positivo (mayor al normal) comprendería situaciones donde los niveles séricos de hierro se mantuvieran por arriba del intervalo normal, el equilibrio entre la absorción de hierro y la pérdida diera como resultado una ganancia neta de hierro en el cuerpo, o que ocurriera una distribución deficiente de hierro tal, que las reservas de hierro aumentaran . A fin de facilitar el diagnóstico de pacientes, los árboles de decisión, como el de la Figura IB, pueden ser usados para interpretar el nivel de hepcidina, y que es utilizado para asistir al usuario o intérprete en la determinación de un curso de tratamiento y la relevancia de la lectura de la concentración. Los valores de hepcidina son pronosticados como elevados en pacientes con sobrecarga de hierro de inflamación y enfermedad de ferroportina y suprimidos en pacientes con hemocromatosis , hemoglobinopatias y otros trastornos celulares rojos. El árbol de decisiones de la Figura IB muestra cómo la cuantificación de niveles de hepcidina simplifica el diagnóstico y/o la evaluación de un paciente que se sospecha tiene trastornos del metabolismo de hierro. La Figura 1A muestra la evaluación del árbol de decisiones sin una cuantificación de niveles de hepcidina. En diversas modalidades, los niveles de hepcidina pueden ser usados para mejorar el tratamiento de un paciente con anemia. Al analizar la concentración de niveles de hepcidina en un paciente, el médico en cuestión puede evaluar mejor un tratamiento particular bajo consideración o emprendido actualmente por el paciente. En términos particulares, los pacientes que son hiposensibles a tratamientos típicos para la anemia, como la eritropoyetina o sus análogos (Epoetina alfa, Epoetina beta, darbepoetina alfa, cualquier proteína estimulante eritropoyética o péptido o pequeña molécula con actividad estimulante eritropoyética) , o cualquier otra clase de terapia eritropoyética, se benefician de análisis rápidos y/o exactos de tratamientos alternativos para la anemia. En algunas modalidades, el tratamiento contra la anemia es adaptado para un paciente individual con base al monitoreo de los niveles de hepcidina del paciente en respuesta a cada tratamiento contra la anemia. El término "moléculas estimulantes de eritropoyesis" o " terapia eritropoyética" , como se utiliza aquí, incluye la eritropoyetina de humano o una variante biológicamente activa, el derivado o el análogo de la misma, incluyendo un derivado químicamente modificado de la proteína o análogo o cualquier pequeña molécula que estimula la eritropoyesis. La eritropoyetina incluye, entre otros, un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ. ID NO: 18 o SEQ. ID NO: 19. Los aminoácidos 1 a 165 de SEQ ID NO: 18 constituyen la proteína madura de cualquier molécula designada como- una epoetina, p.ej., epoetina alfa, epoetina beta, epoetina gamma, epoetina zeta y las similares. Además, una epoetina también incluye cualquiera de las epoetinas ya mencionadas que están químicamente modificadas, p.ej., con uno o varios polímeros hidrosolubles como el polietilenglicol . También se encuentran contemplados los análogos de la eritropoyetina, con 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad con la SEQ. ID NO: 18 o la SEQ. ID NO: 19, y todavía capaces de retener actividad eritropoyética. Las secuencias ejemplificantes, la elaboración, la purificación y el uso de la eritropoyetina de humano recombinante se describen en varias publicaciones de patente, incluyendo entre otras a Lin, Patente de E.U. 4 703 008 y Lai et al. de la Patente de E.U. 4 667 016, cada una de las cuales está incorporada aquí por referencia en su totalidad. La darbepoetina es un análogo de eritropoyetina hiperglucosilado que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de rHuEPO que aseguran dos cadenas de carbohidrato adicionales. Más expresamente, la darbepoetina alfa contiene dos cadenas adicionales de carbohidrato ligadas a N, en residuos de aminoácidos 30 y 88 de SEQ ID NO: 18. Las secuencias ejemplificantes, la elaboración, la purificación y el uso de darbepoetina y otros análogos de eritropoyetina son descritos en varias publicaciones de patente, incluyendo Strickland et al., WO 91/05867, Elliott et al., WO 95/05465, Egrie et al., O 00/24893 y Egrie et al. WO 01/81405, cada uno de los cuales está incorporado aquí por referencia en su totalidad. Los derivados de polipéptidos de origen natural o sus análogos incluyen a aquellos que han sido químicamente modificados, por ejemplo, para unir polímeros solubles hídricos (p.ej., pegilado) , radionúclidos u otras porciones de diagnóstico, con acción selectiva hacia el objetivo o terapéuticas. El término "actividad eritropoyética" significa la actividad para estimular la eritropoyesis como es demostrada en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo en ratones exhipóxicos policitémicos . Ver, p.ej., Cotes and Bangham, Nature 191:1065 (1961) .

En diversas modalidades de los métodos descritos, la hepcidina es aislada de una muestra antes de, o en el lugar de, MS o análisis de LC-MS. La extracción de fase sólida (SPE) es un medio preferido de aislamiento de hepcidina. El uso de la SPE permite la extracción y el aislamiento de hepcidina de la muestra biológica (como suero, plasma y orina) para la separación de la HPLC subsecuente y la detección espectrométrica de masas. La SPE es un método cromatográfico para preparar muestras antes de la realización del análisis químico cuantitativo, como el MS . El objetivo de la SPE es aislar analitos con especificidades de objetivo de una matriz de muestra compleja que contiene interferencias no deseadas, que tendrían un efecto negativo en la capacidad de llevar a cabo el análisis cuantitativo. Los analitos con especificidades de objetivo aislados son recuperados en una solución que es compatible con el análisis cuantitativo. Esta solución final que contiene el compuesto con especificidad de objetivo puede usarse para el análisis directamente, o evaporado y reconstituido en otra solución de un volumen menor para la concentración adicional del analito con especificidad de objetivo, y transformarlo en más dispuesto a detección y cuantificación . El análisis de muestras biológicas, como el plasma y la orina, a través de la cromatografía líquida (LC) generalmente se beneficia de la SPE antes del análisis tanto para eliminar materia insoluble como interferencias solubles, y también del preconcentrado de compuestos con especificidades de objetivo para la sensibilidad de detección potenciada. Muchas matrices de muestra descubiertas en las bioseparaciones contienen amortiguadores, sales o surfactantes , que pueden ser particularmente molestos cuando se usa la detección en base al espectrómetro de masas. La SPE también puede ser usada para llevar a cabo un fraccionamiento simple de una muestra con base en diferencias en la estructura química de las partes componentes, reduciendo así la complejidad de la muestra para ser analizada. Los métodos de la SPE comunes contienen una secuencia de etapas, cada una con un objetivo específico. La primera etapa, referida como la etapa "de acondicionamiento", prepara el dispositivo, comúnmente una columna de cromatografía, para recibir la muestra. Para la SPE de fase inversa, la etapa de acondicionamiento implica primero enjuagar el dispositivo de la SPE con un solvente orgánico como metanol o acetonitrilo, que actúa humedeciendo las superficies tanto del dispositivo como del sorbente,'y también enjuaga cualquier contaminante residual del dispositivo. Este enjuague inicial generalmente es seguido de un enjuague por solvente muy acuoso, que a menudo contiene amortiguadores de pH u otros modificadores, que prepararán el sorbente cromatográfico para retener preferentemente los componentes de muestra con especificidades de objetivo. Una vez condicionado, el dispositivo de la SPE está listo para recibir la muestra. La segunda etapa, referida como la etapa "de carga", implica pasar la muestra por el dispositivo. Durante la carga, los componentes de la muestra, junto con muchas interferencias son adsorbidos en el sorbente cromatográfico . Una vez que la carga está completa, se usa una etapa "de lavado" para enjuagar los componentes de la muestra de interferencia, mientras se permite que los compuestos con especificidades de objetivo permanezcan retenidos en el sorbente. Con poca o ninguna pérdida de hepcidina, la cuantificación resultante de hepcidina refleja con exactitud la cantidad actual de la misma en la muestra . Para lavar la muestra que contiene hepcidina, se prefiere un pH mayor de 7, se prefiere aún más un pH mayor de 8 , y el de mayor preferencia es un pH de aproximadamente 10 o con mayor cantidad. El lavado que utiliza un sistema solvente en este intervalo de valores de pH permite que los contaminantes y otras biomoléculas en la muestra sean eliminadas de la hepcidina, con poca o ninguna pérdida de hepcidina en si misma. Los amortiguadores utilizados para ajusfar el pH del solvente de lavado incluyen, entre otros, hidróxido de amonio, fosfato, carbonatos, y similares. El hidróxido de amonio es el amortiguador preferido. La cantidad del amortiguador presente en el sistema solvente afectará el pH resultante, pero por lo común está presente en la cantidad de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente ' 10 %, es de mayor preferencia aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 %, y el más preferente, de aproximadamente 1.5 hasta aproximadamente 3 %. En una modalidad especifica, el hidróxido de amonio es el amortiguador y está presente en una cantidad de aproximadamente 2 %. El solvente de lavado por lo común es una mezcla de agua y metanol. El metanol está presente en cantidades de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 70 % de la mezcla, y es de mayor preferencia, de aproximadamente 40 hasta aproximadamente 50 %. El equilibrio del sistema solvente es el agua. La etapa de lavado, entonces, es seguida de una etapa "de elución", que por lo común utiliza un liquido que contiene un porcentaje elevado de un solvente orgánico, como metanol o acetonitrilo . El solvente de elución es seleccionado para liberar con eficacia los compuestos con especificidades de objetivo del sorbente cromatográfico, y en un recipiente de muestra adecuado. El solvente que eluye, por lo común, tiene un pH de menos de aproximadamente 8, es de mayor preferencia un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6, y el más preferente es de aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 5.5. Un pH de aproximadamente 5 es un pH muy preferido para el solvente de elución. Los amortiguadores usados para ajusfar el pH del solvente que eluye incluyen, entre otros, acetato, citrato, malato, formato, succinato y similares. La selección del amortiguador depende del pH deseado. El solvente que eluye, por lo común, es una mezcla de agua y metanol. El metanol está presente en cantidades mayores de 70 % de la mezcla, y es de mayor preferencia que sea de más de aproximadamente 75 %, y el más preferente que sea mayor aproximadamente de 80 %. El equilibrio del sistema solvente es el agua. La elución con concentraciones elevadas del solvente orgánico requiere que las medidas adicionales sean tomadas antes del análisis. En caso del análisis cromatográ fico (LC o LC-MS), es preferible para las muestras que estén disueltas en una mezcla acuosa y orgánica en vez de un solvente orgánico puro, como metanol o acetonitrilo . Los métodos de la SPE y los materiales se describen en las Patentes Estadounidenses Núms . 5 368 729; 5 279 742; 5 260 028; 5 242 598 ; 5 230 806; 5 137 626; y 5 071 565, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad. Los materiales de sorbente para las columnas de la SPE incluyen, entre otros, C18, C8, intercambio catiónico y materiales de copolimero equilibrados lipofilicos hidrofilicos . Las columnas de la SPE están comercialment e disponibles de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo Waters (p.ej., Oasis HLB y MCX) , Varían (p.ej., C18 y C8) y Millipore (p.ej., C18, C8 y MPC catiónico de fase mixta ) . Se proporcionan los ejemplos que siguen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Debería ser apreciado por expertos en la técnica que los métodos descritos en los ejemplos que siguen representan métodos descubiertos por los inventores, que funcionan bien en la práctica de la invención, y así se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, bajo la luz de la presente descripción, deberían apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se encuentran descritas y todavía así, obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. EJEMPLOS Instrumentación Todos los experimentos de cuantificación fueron realizados en un espectrómetro de masas cuadrupolar triple API4000 (SciEx) de Applied Biosystems (Foster City, CA) con fuente de Turbo ESI. El sistema es controlado por el programa Analysis 1.3.1. Los experimentos de identificación del producto de degradación y estabilidad fueron realizados en Finnigan LTQ (Thermo-Electron) controlado por el Software Xcalibur 1.3.

La separación es llevada a cabo en una columna de 5 µp?, Polaris C18A (2.1 x 50 mm, Varían). La velocidad de flujo es determinada a 300 µ?/min. El solvente de elución A es de 5:95 metanol:agua (v/v) , y el solvente B es 95:5 metanol : agua, ambos conteniendo 0.1 % de ácido fórmico. Dos métodos cromatográficos diferentes fueron desarrollados. Para el análisis cuantitativo y estudio de estabilidad de hepcidina, el sistema de HPLC está compuesto de un automuestreador de LEAP Technologies (Carrboro, NC) HTS PAL y una bomba binaria de Rheos . Las afecciones de gradiente fueron establecidas como sigue: 0-0.1 minutos, 2% B isocrático/98% A; 2% B a 95% B a 0.1-4.5 minutos; 95% B a 4.5-4.9 minutos; 95% B a 2% B a 4.9-5.0 minutos; 5.0-6.0 minutos, 2% B isocrático. El solvente para el lavado de la aguja es metanol:agua (50:50, v/v). Para la identificación del producto de degradación enzimática de hepcidina, el sistema de HPLC comprendió un dispositivo configurado Agilent 1100 completamente equipado (Agilient Technologies, Palo Alto, CA) con el grupo de automuestreador termorregulado a 4 ° C. Un gradiente lineal va de 5 % a 95% B en 18 minutos, luego fue mantenido a 95% B durante 2 minutos después de los cuales el gradiente regresó a las afecciones iniciales y fue equilibrado durante 10 minutos antes de la siguiente serie. El volumen de inyección de muestra es 20 µ? para todos los experimentos.

Preparación de soluciones patrón La solución madre de hepcidina de humano (SEQ. ID NO: 4) con la concentración de 1 mg/ml es preparada en 10 mM de amortiguador de acetato de sodio (pH de aproximadamente 5) . 1 mg/ml de la solución madre del patrón interno (SEQ. ID NO: 17) es preparado en agua. SEQ. ID NO: 17 tiene una secuencia de Ac-Lys-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-CpG-Ser-DTic-CpG, donde Ac es acetilo, Lys es lisina, Arg es arginina, Pro es prolina, Hyp es trans 4-hidroxi-prolina, Gly es glicina, CpG es ciclopentilglicina, Ser es serina, y DTic es ácido D-l, 2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico . Ambas soluciones madre fueron almacenadas a -70 ° C. La concentración final de 100 pg/ml de la solución activa de hepcidina es preparada diluyendo la solución madre con 10 mM de amortiguador de acetato de sodio. La solución de patrón interno final con la concentración de 100 ng/ml es preparada diluyendo la solución madre de patrón interno en agua. Los patrones de calibración fueron preparados recientemente al clavar el suero en el blanco con la solución activa de hepcidina (SEQ. ID NO: 4) , dando como resultado concentraciones de 10 , 25, 50 , 100, 250, 500 y 1000 ng/ml del suero. Tres concentraciones diferentes (20, 200, 800 ng/ml) de muestras de control de calidad (QC) fueron preparadas junto con los patrones de calibración.

Preparación de Muestra para Identificación de Producto de Degradación y Estabilidad. Un estudio de estabilidad de hepcidina de humano es realizado al incubar hepcidina (SEQ. ID NO: 4) en 10 % del suero de humano a temperatura ambiente. Incubación comienza cuando mezclado 20 µ? de la solución activa de hepcidina (100 yg/ml) con 1980 µ? de 10% agua de suero en una probeta de prueba de 5 mi, dando como resultado 1 g/ml de la concentración inicial. Una solución de 100 µ? es repartida en partes alícuotas de la solución de incubación a los puntos temporales de 0 h, 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 3 h, 4 h y 5 h. Cada parte alícuota es extraída por SPE inmediatamente y almacenada a 4 ° C hasta el análisis.

Extracción de fase sólida La extracción de fase sólida es realizada en la placa de 96 pocilios de Oasis HLB (Waters, Milford, MA) . Solvente de lavado: 30% metanol/agua con pH de aproximadamente 10 ajustado con hidróxido de amonio. Solvente de elución: solución de 90% metanol/agua con pH de aproximadamente 5 ajustado con ácido acético. Después de activar y acondicionamiento, 100 µ? de la muestra de suero y 200 µ? del patrón interno fueron cargados en la placa SPE, lavada con agua y 350 µ? del solvente de lavado. La elución se llevó a cabo utilizando 100 µ? del solvente de elución y se diluyó con 100 µ? de agua. Los 200µ1 resultantes del eluato están listos para el análisis de LC-MS.

Optimización de ESI-MS/MS. Precursor e iones de producto para hepcidina de humano (H-hep; SEQ. ID NO: 4) fueron determinados por la infusión directa de 10 µg/ml de hepcidina en 50:50 metanol : agua (v/v) conteniendo 0.1% ácido fórmico. Ya que la hepcidina es un péptido básico, un modo de ionización positiva por ESI es utilizado. Como se muestra en la Figura 2, la formación de iones de hepcidina con el estado de carga + 4 (m/z 698.5) y +3 (m/z 930.8) es predominante. Después de la decircunvolución de carga, una masa promedio de 2788 , con 8 Da menos que la masa calculada de la secuencia de hepcidina, indica cuatro enlaces de disulfuro formados entre los ocho aminoácidos de cisteina. La Figura 3 y 4 muestra los espectros de MS/ S para ambos estados de carga. La disociación asistida por colisiones de los iones de precursor de hepcidina a m/z 698 y m/z 931, produjo iones de producto mayores a m/z 110 que corresponde al ión imonio de histidina y a m/z 120 que corresponde al ión imonio de fenilananina . Los parámetros de ESI-MS/MS para transiciones de ión dan como resultado a m/z 110 iones de producto que fueron optimizados para la cuantificación de hepcidina como se muestra en Tabla II.

Tabla II - Método MS Ql - cuadrupolo 1; Q3 - cuadrupolo 3; DP - potencial de desagrupación; CE - energía de colisión; CXP - colisión compensada; CAD - gas de colisión; CUR- gas cortina; GS1 - gas de fuente iónica 1; GS2 - gas de fuente iónica 2; IS - voltaje de atomización iónica; TEM - temperatura; Ql RES - resolución de cuadrupolo 1; Q3 RES - resolución de cuadrupolo 3 para la optimización de Extracción de fase sólida para la cuantificación de hepcidina Incluso aunque la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) ofrece gran especificidad para la detección del analito del interés, la competencia para la ionización en la interfase LC-MS de componentes de interferencia co-eluidos de la separación LC puede causar el efecto significativo e inconsistente de la matriz que da como resultado efectos indeseables, como la supresión del ión y ruidos químicos. Así, la limpieza de la muestra de separación LC previa tiene gran impacto en LC-MS/bioanálisis de MS debido a la complejidad de matrices biológicas y el poder de resolución limitado de HPLC, especialmente para la separación rápida de LC. La extracción de fase sólida es usada para el bioanálisis de hepcidina mediante el cual la hepcidina es extraída y preconcentrada, en tanto que la cantidad de los componentes de interferencia es enormemente reducida. La extracción de fase sólida de hepcidina del suero humano es llevada a cabo en una placa aters Oasis HLB. El sorbente es un polímero equilibrado hidrofílico/lipofílico que tiene la capacidad de retención más elevada que C18. Debido a que la hepcidina es un péptido básico, el desempeño de extracción es enormemente influenciado por el pH así como la concentración orgánica de los solventes de elución y de lavado. La Figura 5 muestra las curvas de elución de cantidades fijas de hepcidina utilizando solventes de metanol/agua con un pH de aproximadamente 10 ajustado por hidróxido de amonio y solventes con un pH de aproximadamente 5 ajustados por el ácido acético. El lixiviado fuera de la hepcidina a partir del sorbente SPE ocurre incluso con agua en afección ácida. En contraste, un máximo de 50% metanol en afección básica no causa la elución de hepcidina a partir del sorbente SPE. Un 30 % de metanol con pH de aproximadamente 10 es seleccionado para el lavado y el 90 % de metanol con pH de aproximadamente 5 es utilizado para la elución de hepcidina SPE.

LC-MS / MS de hepcidina de Humano en extracto de suero La Figura 5 muestra un cromatograma MRM de hepcidina de humano extraída del suero de humano en blanco. La transición del ión de m/z que 930.60 —> 110.15 proporciona un fondo mucho más limpio y menos interferencia de la matriz de suero que la transición de ión m/z 698.10 —» 110.15, entonces es seleccionado para la cuantificación de hepcidina. La Figura 6 muestra el cromatograma de hepcidina y patrón interno extraídos del suero de paciente con sepsis.

Características de curva de calibración, exactitud y precisión Una curva de calibración lineal es obtenida para hepcidina de humano en suero en el intervalo de 10 a 100 ng/ml, las desviaciones para todos los siete patrones son distintos a cero (10, 25, 50 100, 200, 500 y 1000 ng/ml) en duplicados están todos dentro del 15 % como se muestra en la Figura 7. La exactitud, expresada como el porcentaje de desviación de lo calculado para la concentración nominal (%RE) , es evaluada a tres concentraciones: QC1 (20 ng/ml), QC2 (200 ng/ml) y QC3 (800 ng/ml) . Todas las tres muestras de control de calidad tienen desviaciones menores de 10 %. La precisión también fue evaluada en los tres QC y todos los valores de %RSD fueron menores a 10 % como se muestra en la Tabla III.

Tabla III El método es aplicado para evaluar niveles de hepcidina en suero de paciente con sepsis y muestras de paciente con anemia de los donantes. La Tabla IV muestra los resultados del nivel de hepcidina en sueros de pacientes con sepsis.

Tabla IV Estabilidad de Hepcidina de Humano Se sabe que los péptidos son susceptibles degradación por las enzimas endógenas dentro de las matrices biológicas. Además de hepcidina de humano de 25 péptidos, se ha informado sobre hepcidina de 20 péptidos N-terminalmente truncada y hepcidina de 22 péptidos que también existen en la orina de humano. Asi, la evaluación de la estabilidad de hepcidina y la identificación del producto de degradación son importantes en el desarrollo de método. La estabilidad de hepcidina es evaluada al incubar hepcidina en 10% suero/agua de humano a temperatura ambiente con una concentración inicial de 1 g/ml, seguido de LC- S /análisis MS . La proporción del pico de área de la hepcidina al patrón interno es usada para evaluar la estabilidad y todos los datos fueron normalizados al valor en el punto temporal a 0 h. Los datos de estabilidad (Figura 8) indicaron que la hepcidina de humano es relativamente estable. A cinco horas de incubación, la hepcidina mostró menos de 10% de degradación. El producto de degradación es identificado por LC-MS/método de MS dependiente de datos utilizando el instrumento de Finnigan LTQ. La Figura 9 muestra el cromatograma de pico base de la solución de incubación en el punto temporal a 0 h. La secuenciación de péptidos con base en el espectro de masa de tándem confirma que el pico en el periodo temporal de retención a 8.18 minutos es hepcidina de humano (Figura 10) . Debido a los cuatro enlaces internos de disulfuro de cisteina, los iones principales de fragmento son pequeños iones b (b3, b4) asi como iones grandes y (y21, y22, y23 e y24). La Figura 11 muestra el cromatograma de pico base de la solución después de cuatro horas de incubación. Un nuevo pico en el periodo temporal de retención de 7.53 minutos es detectado e identificado como hepcidina de humano con una metionina oxidada (M21) mediante MS/MS (Figura 12) .

Cuantificaciones de Nivel de Hepcidina en Pacientes Las muestras de pacientes que padecen de anemia por cáncer (obtenido de ProteoGenex) o de voluntarios (control) fueron recolectadas. 100 µ? de cada muestra, los blancos de suero y los patrones de calibración que consisten de siete concentraciones distintas a cero en duplicados (10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/ml) fueron extraídos por SPE utilizando una placa de 96 pocilios de Oasis HLB mElution (Waters, Milford, MA) . El solvente de lavado es 30 % de metanol/agua con un pH de aproximadamente 10 ajustado con hidróxido de amonio. El solvente de elución es 90 % de solución metanol/agua con un pH de aproximadamente 5 ajustado con ácido acético. La placa de SPE es activada con 500 µ? de metanol y condicionada con 500 µ? de agua, luego 100 µ? de la muestra de suero y 200 µ? del patrón interno fueron cargados en la placa de elución, lavados con 350 µ? de agua y 350 µ? del solvente de lavado. La elución se lleva a cabo utilizando 100 µ? del solvente de elución y diluido con 100 µ? de agua. Los 200 µ? resultantes del eluato fueron analizados mediante LC-MS/MS. 20 µ? de cada muestra extraída se inyectaron en una columna de HPLC Polaris C18A, 5 µ?t? (2.1 x 50 mm, Varían) . La velocidad de flujo de LC fue determinada a 300 µ?/min. El HPLC de fase A móvil fue 5:95 de metanol/agua y la fase móvil B fue 95:5 de metanol/agua, ambos conteniendo 0.1 % de ácido fórmico. Las afecciones de gradiente fueron establecidas como sigue: 0-0.1 minutos, 2% B isocrático /98% A; 2% B a 95% B a 0.1-4.5 minutos; 95%B a 4.5-4.9 minutos; 95% B a 2% B a 4.9-5.0 minutos; 5.0-6.0 minutos, 2% B isocrático. UN espectrómetro de masas cuadrupolar triple Sciex API4000 de Applied Biosystems (Foster City, CA) con fuente Turbo ESI se usa para la detección de hepcidina en modo MRM con la transición de ión de m/z 930.60 a m/z 110.15. La cuantificación es lograda al comparar la proporción de las áreas de pico LC de hepcidina y el patrón interno a las proporciones obtenidas de una serie de patrones donde las cantidades de hepcidina y el patrón interno eran conocidas. Este experimento permitió la determinación de los niveles séricos de hepcidina en una población de control supuesta de contener un gran número de pacientes sanos, así como el nivel sérico de hepcidina de pacientes que padecen anemia por cánceres (AOC) . Los resultados son mostrados en la Figura 14A. Después de la identificación de niveles elevados de hepcidina, una muestra es luego analizada para otras concentraciones del índice de hierro para determinar si un paciente tiene inflamación o anemia por deficiencia de hierro (Figura 14B) . Los parámetros fueron cuantificados como sigue: hierro en suero, UIBC, ferritina y CRP fueron cuantificados en un analizador de laboratorio clínico Olympus AU400 utilizando procedimientos convencionales; sTfR es cuantificado utilizando un método ELISA convencional (R&D sistemas).

Separación y Determinación de Hepcidina 20, Hepcidina 22, y Hepcidina 25 en una Muestra Los niveles relativos y/o absolutos de hepcidina 20, hepcidina 22, y hepcidina 25 en una muestra pueden ser relevantes para la actividad biológica que es esperada. Se cree que hepcidina 20 y hepcidina 22 son productos de degradación del péptido maduro de cadena completa. Se ha demostrado que Hepcidina 20 es inactiva en un ensayo biológico, probablemente debido a la incapacidad de unir la ferroportina . Por lo tanto, hepcidina 20 y potencialmente hepcidina 22 pueden ser componentes inactivos del fondo de hepcidina en sangre. Ya que en ciertos estados de enfermedad como la enfermedad renal crónica, la autorización normal de hepcidina puede ser afectada, la abundancia relativa de formas diferentes puede ser afectada. Por esta razón, hay ventajas de desarrollar métodos de detección que permiten la estimación del material de cadena completa (hepcidina 25) con relación a hepcidina 22 y hepcidina 20.

El precursor y los iones de producto para hepcidina de humano truncada N-terminal Hepc-20 (SEQ. ID NO: 15), Hepc-22 (SEQ ID NO: 16) y Hepc-25 intacto (SEQ ID NO: 4) fueron determinados por la infusión directa de 10 yg/ml de hepcidina en 50:50 metanol : agua (v/v) que contiene 0.1 % de ácido fórmico. Se utiliza un modo de ionización positiva por ESI. Como se muestra en las Figuras 15-17, la formación de estados de carga de iones 4 + y 3 + para los tres péptidos de hepcidina es predominante. La disociación asistida por colisiones del Hepc-20, Hepc-22 e iones precursores de Hepc-25 produjo iones de producto exclusivos que fueron optimizados y utilizados para la cuantificación de Hepc-20, Hepc-22 y Hepc-25 como se muestra en Tabla V. El isótopo marcó Hepcidina Hepc-25* es usado como el patrón interno.

Tabla V Compuesto Ql Q3 Tiempo DP CE CXP (mseg) Hepc-25* IS 700.58 35 .05 150 76 41 26 Hepc-22 610.01 763.95 150 41 27 12 Hepc-20 548.88 693.55 150 36 21 10 Hepc-25d 698.08 354.05 150 76 41 26 CÜR GS1 GS2 IS TEM CAD 40 70 50 5000 450 10 Ql - cuadrúpedo 1; Q3 - cuadrupolo 3; DP - potencial de desagrupación; CE - energía de colisión; CXP - colisión compensada; CUR - gas cortina; GS1 - gas de fuente iónica 1; GS2 - gas de la fuente iónica 2; IS - voltaje de atomización iónica; TEM - temperatura; DAO - gas de colisión; La separación de tres hepcidinas en cada muestra es llevada a cabo en una columna Polaris C18A, 5ym (75 2.0 mm x, Varían). La velocidad de flujo es determinada a 400 µ?/min. El solvente de elución A es 5:95 metanol:agua (v/v) y el solvente B es 95:5 metanol : agua, ambos conteniendo 0.1 % de ácido fórmico. El sistema de HPLC es compuesto de un automuestreador LEAP Technologies (Carrboro, NC) HTS PAL y una bomba binaria de Rheos. Las afecciones de gradiente fueron establecidas como sigue: 0-0.5 minutos, 2% B isocrático/98% A; 2% B a 95% B a 0.5-4.0 minutos; 95% B a 4.0-5.4 minutos; 95% B a 2% B a 5.4-5.5 minutos; 5.5-6.5 minutos, 2% B isocrático. El volumen de inyección de muestra es de 20 µ? para todos los experimentos.

Los patrones de calibración fueron preparados recientemente al enriquecer el suero en blanco con péptidos de hepcidina de humano, dando como resultado concentraciones de 2.5, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ng/ml de Hepc-20, Hepc-22 y Hepc-25 en patrones de suero. Tanto Hepc-20 como Hepc-22 mostraron un intervalo lineal excelente de 2.5 a 500 ng/ml, mientras Hepc-25 mostró un intervalo lineal excelente de 5 a 500 ng/ml (Figura 18) .

La extracción de fase sólida es realizada en la placa de 96 pocilios de Oasis HLB (Waters, ilford, MA) . El solvente de lavado es 30% metanol en agua a pH 10 ajustado con hidróxido de amonio. El solvente de elución es 90 % de metanol en la solución hidrica a pH 5 ajustado con ácido acético. Después de activación y acondicionamiento, 100 µ? de la muestra de suero y 200 µ? del patrón interno fueron cargados en la placa de SPE, luego se lavaron con agua y 350 µ? del solvente de lavado. La elución fue llevada a cabo utilizando 100 µ? del solvente de elución y diluida con 100 µ? de agua. Los 200µ1 resultantes del eluyente están listo para el análisis de LC-MS. Nueve muestras de sepsis fueron analizadas utilizando el protocolo anterior. Las concentraciones de Hepc-20, Hepc-22, y Hepc-25 fueron determinadas utilizando la curva de calibración, con BQL indicando que el nivel está por debajo del nivel cuantificable (ya sea 5 ng/ml para Hepc-25 o 2.5 ng/ml para Hepc-20 y Hepc-22) . Los resultados son mostrados a continuación en la Tabla VI.

Tabla VI Muestra de sepsis Hepc-25 Hepc-22 Hepc-20 Blanco de suero humano BQL BQL BQL Blanco de suero BQL BQL BQL humano Blanco de suero BQL BQL BQL humano 1 1260 33.4 68.4 2 1220 33.9 78.7 3 350 5.59 11.2 4 18.2 BQL BQL 5 26.5 BQL BQL 6 20 2.82 16.3 7 790 7.22 105 8 216 6.25 40.1 9 BQL BQL BQL BQL: <LLOQ = BQL: <LLOQ = BQL: <LLOQ = 5 ng/ml 2.5 ng/ml 2.5 ng/ml Los pacientes con sepsis fueron usados para el análisis debido a sus niveles de hepcidina elevados, permitiendo la cuant i f icación exacta de especies de hepcidina menos abundantes como hepcidina 22 y hepcidina 20. Estos resultados demuestran que la detección exacta de las formas menos abundantes puede ser observada utilizando este ensayo. Por lo tanto, la utilización de este método permitirá la evaluación de la proporción de hepcidina activa a hepcidina total en poblaciones enfermas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para determinar una presencia o concentración de hepcidina en una muestra caracterizado porque comprende sometimiento de la muestra a espectrometría de masas para producir un espectro de masas que tiene una señal de hepcidina; la medición de una intensidad de la señal de hepcidina; y correlacionar la intensidad de señal a una curva estándar o de distribución normal de concentraciones de hepcidina para determinar la presencia o concentración de la hepcidina en la muestra. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hepcidina comprende aproximadamente 84 residuos de aminoácidos. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hepcidina comprende aproximadamente 61 residuos de aminoácidos. . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hepcidina comprende aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hepcidina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; y cualquier combinación (es) de lo(s) mismo(s). 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hepcidina tiene una carga +4 o +3. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hepcidina tiene una carga +2 o +1. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además, comprende separar la hepcidina de la muestra antes de someter la hepcidina a espectrometría de masas. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la separación comprende cromatografía. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cromatografía es cromatografía líquida. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la cromatografía es una extracción de fase sólida. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la espectrometría de masas comprende el análisis de cromatografía liquida-espectrometría de masas. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la espectrometría de masas comprende espectrometría de masas en tándem. 14. Un método para determinar la presencia o concentración de hepcidina en una muestra caracterizado porque comprende la separación de hepcidina de la muestra; someter la hepcidina a espectrometría de masas para producir un espectro de masas que tiene una señal de hepcidina; cuantificar la intensidad de la señal de hepcidina; y correlacionar la intensidad de señal en el espectro de masas a una curva estándar o de distribución normal de concentraciones de hepcidina para obtener una cantidad de hepcidina en la muestra . 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la separación comprende cromatografía. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cromatografía es cromatografía líquida. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cromatografía es una extracción de fase sólida. 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la hepcidina comprende aproximadamente 84 residuos de aminoácidos . 19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la hepcidina comprende aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25 residuos de aminoácidos. 20. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la hepcidina tiene una carga de +4 o una de +3. 21. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la hepcidina tiene una carga de +2 o una de +1. 22. Un método para separar la hepcidina de una muestra caracterizado porque comprende la introducción de la muestra a una columna de fase inversa y someter a tratamiento la columna de fase inversa con un solvente eluyente, donde un eluyente resultante comprende hepcidina. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el solvente que eluye comprende metanol, agua, o mezclas de los mismos. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la concentración de metanol es de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 % por volumen. 25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la columna de fase inversa es seleccionada del grupo que comprende C3, C8, C18, y combinaciones de los mismos . 26. El método de conformidad con la reivindicación 1, 14, o 22, caracterizado porque la muestra es una muestra plasmática o una muestra de suero. 27. El método de conformidad con la reivindicación 1, 14, 22, o 26 caracterizado porque la muestra es de un mamífero. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el mamífero es un humano. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el humano no padece sepsis o una afección inflamatoria. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la homeostasis de hierro es interrumpida. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la homeostasis de hierro está por debajo de lo normal. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la homeostasis de hierro está por encima de lo normal . 33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque uno o varios índices de hierro son mayores que un intervalo enlistado en la Tabla I. 34. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque uno o varios índices de hierro están fuera de un intervalo enlistado en la Tabla I. 35. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el humano padece de o es sospechoso del padecimiento de una afección inflamatoria o relacionada del modo inflamatorio . 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la afección es seleccionada del grupo que comprende sepsis, anemia por inflamación, anemia por cáncer, anemia inflamatoria crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, trastorno renal en etapa terminal, enfermedad renal crónica, anemia por deficiencia de hierro, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis, diabetes, artritis reumatoide, arteriosclerosis, tumores, vasculitis, lupus sistémico eritematoso, hemoglobinopatias, trastornos eritrociticos, y falla renal. 37. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el humano padece de o es sospechoso del padecimiento de una afección no inflamatoria. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la afección no inflamatoria es seleccionada del grupo que comprende deficiencia de vitamina B6, deficiencia de vitamina B12, deficiencia de folato, pelagra, mielosis funicular, seudoencefalitis , enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, cardiopatia isquémica, y enfermedad arterial oclusiva periférica. 39. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el humano padece de o es sospechoso del padecimiento de una reacción de fase aguda. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la reacción de fase aguda es seleccionada del grupo que comprende sepsis, pancreatitis, hepatitis, y enfermedades reumatoides . 41. ?1 método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el humano es hiposensible a la terapia de eritropoyetina o una terapia eritropoyética . 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la terapia eritropoyética es la darbepoetina alfa. 43. Un método para tratar a un paciente que padece de anemia, la mejora que comprende la determinación de una concentración de hepcidina en una muestra del paciente, caracterizado porque la determinación comprende separar la hepcidina de la muestra; someter la hepcidina a espectrometría de masas para producir un espectro de masas que tiene una señal de hepcidina; la medición de intensidad de la señal de hepcidina; y correlacionar la intensidad de señal en el espectro de masas a una curva estándar o de distribución normal de concentraciones de hepcidina para obtener una cantidad de hepcidina en la muestra. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la concentración de hepcidina es aproximadamente 10 ng/ml o menos. 45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la concentración de hepcidina es aproximadamente 5 ng/ml o menos. 46. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la concentración de hepcidina es aproximadamente 2 ng/ml o menos. 47. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la concentración de hepcidina es aproximadamente 1 ng/ml o menos. 48. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la concentración de hepcidina es aproximadamente 30 ng/ml o más. 49. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la concentración de hepcidina es aproximadamente 50 ng/ml o más. 50. Un kit caracterizado porque comprende: a) una pluralidad de recipientes, cada recipiente comprende una cantidad conocida y diferente de una hepcidina; b) un recipiente que comprende un patrón para mezcla con cada recipiente de (a) y mezcla con una muestra de prueba; y c) instrucciones para (1) preparar una curva estándar o de distribución normal de (a) y (b) y (2) evaluar la muestra de prueba para la concentración de una hepcidina en la muestra de prueba utilizando la curva estándar o de distribución normal. 51. El kit de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el patrón comprende un patrón isotópicamente marcado. 52. El kit de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el patrón comprende SEQ ID NO: 4. 53. El kit de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la hepcidina comprende SEQ ID NO: 4.