MX2008016011A - Fragmentos de peptidos para inducir sintesis de proteinas de matriz extra-celular. - Google Patents

Abstract

Tetra-péptidos biológicamente activos cortos se divulgan que están comprendidos de las secuencias GxxG y PxxP donde G (glicina) y P (prolina) se mantienen y x es un aminoácido variable. Los péptidos pueden usarse solos o en combinación para estimular la producción de proteínas de matriz extra-celular en piel. Un método de bajo costo rápido, para producir formulaciones heterogéneas de tetra-péptidos se divulga.

Description

FRAGMENTOS DE PÉPTIDOS PARA INDUCIR SÍNTESIS DE PROTEÍNAS DE MATRIZ EXTRA-CELULAR Campo de la Invención La invención se refiere a tetra-péptidos con el motivo de aminoácido GxxG o PxxP, donde G (glicina) y P (prolina) son mantenidas y x es un aminoácido variable. La invención también se refiere a tetra-péptidos activos de desplazamiento de cuadro que son secuencias de tetra-péptidos desplazadas un cuadro de un tetra-péptido GxxG, PxxP en una proteína ECM. En particular, la invención se refiere a GxxG, PxxP, o péptidos activos de desplazamiento de cuadro que estimulan la producción de proteínas de matriz extra-celular y acrecientan el cierre de heridas de la mono-capa de células epiteliales de la piel humana lesionada por rasguños. Las composiciones de péptidos pueden ser usadas en formulaciones para reparar la piel dañada o para mantener la piel s na . Antecedentes de la Invención Envejecimiento de la piel en comúnmente visto como formación de arrugas y sanado de heridas deteriorado. Una herida se define como un rompimiento en la integridad epitelial de la piel. El sanado de heridas normal involucra una serie de eventos compleja y dinámica pero orquestada de manera extraordinaria llevando a la reparación de tejidos dañados. El mayor componente de la piel normal es la matriz extra-celular (ECM) , una matriz similar a gel producida por las células que rodea. La ECM se compone de dos clases principales incluyendo proteínas estructurales fibrosas y proteoglicanos . Cambios en la composición y estado reticulado de la ECM son conocidos por estar asociados con el envejecimiento y un rango de desórdenes de la piel adquiridos y heredables . Se ha documentado bien que la ECM no solamente proporciona soporte estructural, sino que también tiene influencia en el comportamiento celular tal como diferenciación y proliferación. También, mas y mas investigación sugiere que los componentes de matriz pueden ser una fuente de señales celulares para facilitar la proliferación y migración de células epiteliales y por consiguiente mejoran el sanado de heridas. La clase mas grande de moléculas de ECM fibrosas es la familia de colágeno, la cual incluye por lo menos 16 tipos diferentes de colágeno. El colágeno en la matriz dérmica se compone principalmente de colágenos tipo I (80-85%) y tipo III (8-11%) , ambos de los cuales son colágenos fibrilares, en forma de bastón. La resistencia a la tensión de la piel es debida predominantemente a estas moléculas de colágeno fibrilar, las cuales se auto-ensamblan en microfibrilos en un arreglo lateral de cabeza a cola y lado a lado escalonado. Las moléculas de colágeno se vuelven reticuladas a moléculas de colágeno adyacentes, creando resistencia adicional y estabilidad en fibras de colágeno. Daño a la red de colágeno (v.gr., por enzimas o destrucción física) , o su colapso total ocasiona que el sanado tome lugar por reparación. Varios péptidos bioactivos que estimulan la producción de proteínas ECM han sido reportados en tanto la literatura científica y en patentes otorgadas. Los péptidos históricamente han sido aislados a partir de fuentes naturales y recientemente han sido el sujeto de estudios de relación estructura-función. Péptidos naturales también han servido como puntos iniciales para el diseño de análogos de péptidos sintéticos. Secuencias específicas dentro de proteínas ECM pueden estimular elementos útiles en la piel, tal como colágeno tipo I, colágeno tipo III, y fibronectina (Katayama y colaboradores, J. BIOL. CHEM. 288:9941-9944 (1983)). Katayama y colaboradores identificaron al penta-péptido, KTTKS (SEQ ID NO: 17), dentro del pro-péptido de terminal carboxi (residuos 197-241) del colágeno tipo I. El pro-péptido se separa durante la producción de la proteína de colágeno madura. El pro-péptido separado puede participar en regular la producción de colágeno mediante un mecanismo de retroalimentación de biosíntesis, con el segmento KTTKS jugando un rol activo. Marquart y colaboradores (J. SOC.

BIOL. 193:423-28 (1999)) reportó que los péptidos GHK y CNYYSNS también estimulan la síntesis de ECM. Estas secuencias pueden liberarse durante el cambio de ECM, con ello señalando la necesidad por reparación de ECM. Las secuencias de péptido corto liberadas por cualquier mecanismo son frecuentemente llamadas "matriquinas" ( arquart y colaboradores, J. SOC. BIOL. 193:423-38 (1999) ) . Aunque un número de péptidos naturales y sintéticos existen, hay la necesidad por péptidos biológicamente activos mejorados y métodos para su uso. Compendio de la Invención Tetra-péptidos son divulgados que se caracterizan por el motivo de secuencia de aminoácidos GxxG o PxxP, donde los residuos G (glicina) y P (prolina) se mantienen y x es un aminoácido variable. Los tetra-péptidos se derivan de secuencias que ocurren múltiples veces a través de la secuencia primaria de la proteína de ECM, colágeno tipo IV. Las secuencias divulgadas inducen la producción de todas las formas de colágeno mas que las secuencias de péptidos previamente conocidas, incluyendo KTTKS, comercializada bajo la marca MATRIXYL por SEDERMA SAS (Francia) . Además, una composición comprendiendo una combinación de varias secuencias que se repiten múltiples ocasiones producen una respuesta productora de colágeno aun mayor. Beneficios adicionales se pueden esperar de las combinaciones de péptidos presentes en una variedad de proteínas de ECM. Producir una combinación específica de tetra-péptidos para reconstrucción de ECM puede ser comercialmente prohibitivo en cuanto a costos. Unos medios relativamente simples y efectivos en cuanto a costos para producir una combinación diversa de tetra-péptidos biológicamente activos se divulga. Mediante producir una biblioteca de combinaciones de tetra-péptidos con el motivo GxxG o PxxP, una variedad de tetra-péptidos biológicamente activos se puede generar en la misma corrida de fabricación (v.gr., GEPG, GPEG, GPPG y GEEG) . La combinación de tetra-péptidos puede inducir mas formación de proteína de ECM que péptidos solos. Composiciones comprendiendo los tetra-péptidos divulgados, solos o en combinación, son útiles en mercados de cuidado de la piel incluyendo, pero no limitado a, aquellos que atienden arrugas, tonificación, firmeza, o hundimiento de la piel. La estimulación de colágeno por los tetra-péptidos divulgados puede mejorar significativamente la salud y apariencia de piel dañada y envejecida. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es la SEQ ID NO: 5 la cual es la secuencia de aminoácidos de Colágeno IV ilustrando las ocurrencias de tetra-péptidos GxxG. Todas las secuencias en negritas son subrayadas y secuencias que se traslapan son doblemente subrayadas . La figura 2 es la SEQ ID NO: 46 la cual es la secuencia de aminoácidos de Colágeno III ilustrando las ocurrencias de los activos de cambio de cuadro PGPR y GAGP. Todas las secuencias activas de cambio de cuadro son señaladas en negritas y subrayadas y las secuencias GxxG que ocurren a un cambio de cuadro de distancia son doblemente subrayadas. La figura 3 es también la SEQ ID NO: 45, la secuencia de aminoácidos de Colágeno IV, ilustrando las ocurrencias del tetra-péptido PGPP. Descripción Detallada de la Invención La invención es generalmente dirigida hacia tetra-péptidos que simulan la producción de proteínas ECM y que modulan el sanado de heridas, y usos de tales tetra-péptidos . Péptidos Una forma de realización de la invención se dirige hacia un tetra-péptido aislado que comprende el motivo GxxG o PxxP. En esta forma de realización, G (glicina) o P (prolina) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede generalmente ser cualquier péptido que cae dentro de la descripción anterior, y mas preferentemente es SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, o SEQ ID NO: 16. Otra forma de realización de la invención se dirige hacia un tetra-péptido aislado que comprende el motivo GxPG, donde x es P en cualquier posición variable, o ambos. En esta forma de realización, G (glicina) o P (prolina) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede generalmente ser cualquier péptido que cae dentro de la descripción anterior, y mas preferentemente es SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 7. Otra forma de realización de la invención se dirige hacia un tetra-péptido aislado que comprende el motivo GexG. En esta forma de realización, G (glicina) y E (ácido glutámico) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede generalmente ser cualquier péptido que cae dentro de la descripción anterior, y mas preferentemente es SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 8. Otra forma de realización de la invención se dirige hacia un tetra-péptido aislado que comprende el motivo PGxP. En esta forma de realización, P (prolina) y G (glicina) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede generalmente ser cualquier péptido que cae dentro de la descripción anterior, y mas preferentemente es SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, o SEQ ID NO: 16. Otra forma de realización de la invención se dirige hacia un tetra-péptido aislado que comprende el motivo PExP. En esta forma de realización, P (prolina) y E (ácido glutámico) se mantienen y x es un aminoácido variable. El péptido puede generalmente ser cualquier péptido que cae dentro de la descripción anterior, y mas preferentemente es SEQ ID N0:1 o SEQ ID NO: 9. Otra forma de realización de la invención se dirige hacia un tetra-péptido activo de cambio de cuadro. En esta forma de realización, el tetra-péptido ocurre a un cambio de cuadro de ya sea un tetra-péptido GxxG o un tetra-péptido PxxP en una prote na de ECM. El péptido puede generalmente ser cualquier péptido que cae dentro de la descripción anterior, y mas preferentemente es SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. Cada uno de los péptidos anteriormente descritos pueden comprender aminoácidos D o L. Los péptidos pueden comprender todos los aminoácidos D o aminoácidos L. Los péptidos pueden tener una terminal C de ácido (-C02H) o, de preferencia, una terminal C de amida (-CONH2, -CONHR, o -CONR2) . Los péptidos pueden aumentarse o modificarse además, ya sea químicamente o enzimáticamente . Por ejemplo, los péptidos pueden ser amidados (-NH2) en la terminal C, lo cual puede hacer al tetra-péptido menos susceptible a degradación de proteasa e incrementar su solubilidad comparada con la de formas de ácido libre. Los péptidos también pueden ser lipidados lo cual puede proporcionar para penetración en la piel acrecentada. Los péptidos anteriormente descritos pueden contener los siguientes aminoácidos: R (arginina) , L (leucina) , P (prolina) , F (fenilalanina) , Q (glutamina) , E (ácido glutámico) , I (isoleucina) , K (lisina) , S (serina) , V (valina) , A (alanina) , N (asparagina) , D (ácido aspártico) , T (treonina) , Y (tirosina) y G (glicina) . Los péptidos anteriormente descritos no incluyen los siguientes: M (metionina) , C (cisteína) , H (histidina) o W (triptofano) . De manera acorde, en una forma de realización, x no se selecciona de ya sea M (metionina) , C (cisteína) , H (histidina) o W (triptofano) . Métodos de Uso Una forma de realización adicional de la invención se dirige hacia métodos para usar los péptidos anteriormente descritos . Los métodos de uso pueden involucrar el uso de un solo péptido, o pueden involucrar el uso de dos o mas péptidos en combinación. Una forma de realización de la invención es un método para promover la reparación de piel dañada y el mantenimiento de piel saludable usando tetra-péptidos que estimulan la producción de proteínas de ECM. El método generalmente se dirige hacia poner en contacto células dérmicas (piel) con una composición conteniendo al péptido. Las composiciones pueden ser un aerosol, emulsión, líquido, loción, crema, pasta, ungüento, espuma, u otra formulación farmacéuticamente aceptable. Generalmente, una formulación farmacéuticamente aceptable incluiría cualquier portador aceptable para uso en la piel humana, v.gr., portador cosméticamente aceptable y portador dermatológicamente aceptable. Las composiciones pueden contener otros agentes biológicamente activos tales como retinoides u otros péptidos. Las composiciones pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables o adyuvantes. El paso de poner en contacto puede llevarse a cabo in vivo, in situ, in vitro, o por cualquier método conocido para los técnicos en la materia. Lo mas preferible, el paso de poner en contacto se debe llevar a cabo de manera tópica a una concentración suficiente para producir una respuesta estimulatoria. La concentración del péptido en la composición puede ser de alrededor de 0.01 pg/mL a alrededor de 100 pg/mL, alrededor de 0.1 µg/mL a alrededor de 50 g/raL, y alrededor de 0.1 pg/mL a alrededor de 1 µg/mL. El paso de poner en contacto puede llevarse a cabo en un mamífero, un gato, un perro, una vaca, un caballo, un cerdo, o un humano. Una composición preferida para promover producción de proteínas de ECM comprende SEQ ID NO: 8; lo mas preferible, la composición comprende SEQ ID NO: 8 en una mezcla heterogénea con por lo menos un otro tetra-péptido . En la forma de realización mas preferida, los tetra-péptidos individuales en la composición ocasionarán producción de colágeno sostenida sobre un periodo de por lo menos 48 horas. Una forma de realización adicional de la invención se dirige hacia un método para promover sanado de heridas de piel dañada mediante envejecimiento normal, enfermedad, lesión, trauma, o por cirugía u otro procedimiento médico. El método puede comprender administrar a la herida de un animal una composición, donde la composición comprende cualquiera de los péptidos anteriormente descritos, de manera singular o en combinación. Las composiciones pueden ser un líquido, loción, crema, pasta, ungüento, espuma, u otra formulación farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables o adyuvantes. Las composiciones pueden contener otros agentes biológicamente activos tales como agentes antimicrobianos o factores de crecimiento. Las composiciones también se pueden usar en combinación con otros agentes terapéuticos tales como injertos de tejido, productos de cultivo de tejidos, oxígeno o vendajes. La concentración del péptido en la composición puede ser de alrededor de 0.01 yg/mL a alrededor de 100 g/mL, alrededor de 0.1 µg/mL a alrededor de 50 µg/mL, y alrededor de 0.1 µg/mL a alrededor de 1 µg/mL. La composición se puede administrar a la herida tópicamente. El animal puede generalmente ser cualquier tipo de animal, y de preferencia es un mamífero, y mas preferentemente es un humano, vaca, caballo, gato, perro, cerdo, cabra, u oveja. Una composición preferida para aplicaciones de sanado de heridas en la cual la producción de proteína de ECM se promueve comprende SEQ ID NO: 8, mas preferentemente, la composición comprende SEQ ID NO: 8 en una mezcla heterogénea con por lo menos un otro tetra-péptido . En la forma de realización mas preferida, los tetra-péptidos individuales en la composición ocasionarían producción de colágeno sostenida sobre un periodo de por lo menos 48 horas. Una forma de realización adicional de la invención se dirige hacia un método para reducir la cicatrización de piel dañada por envejecimiento normal, enfermedad, lesión, trauma, o por cirugía u otros procedimientos médicos. El método puede comprender administrar a la herida de un animal una composición, donde la composición comprende cualquiera de los péptidos anteriormente descritos, singularmente o en combinación. Las composiciones pueden ser un líquido, loción, crema, pasta, ungüento, espuma, u otra formulación farmacéuticamente aceptable.' Las composiciones pueden contener otros portadores farmacéuticamente aceptables o adyuvantes. Las composiciones pueden contener agentes biológicamente activos tales como agentes antimicrobianos o factores de crecimiento. Las composiciones también pueden usarse en combinación con otros agentes terapéuticos tales como injertos de tejido, productos de cultivo de tejido, oxígeno o vendajes. La concentración del péptido en la composición puede ser de alrededor de 0.01 µg/mL' a alrededor de 100 µg/mL, alrededor de 0.1 yg/mL a alrededor de 50 g/mL, y alrededor de 0.1 g/mL a alrededor de 1 µg/mL. La composición se puede administrar a la herida tópicamente. El animal puede generalmente ser cualquier tipo de animal, y de preferencia es un mamífero, y mas preferentemente es un humano, vaca, caballo, gato, perro, cerdo, cabra, u oveja. Una composición preferida para aplicaciones de sanado de heridas en las cuales producción de proteínas de ECM se promueve comprende SEQ ID NO: 8; mas preferentemente, la composición comprende SEQ ID NO: 8 en una mezcla heterogénea con por lo menos un otro tetra-péptido . En la forma de realización mas preferida, los tetra-péptidos individuales en la composición ocasionarían producción de colágeno sostenida sobre un periodo de por lo menos 48 horas. Una forma de realización adicional de la invención se dirige hacia un método para producir los tetra-péptidos divulgados en combinación. Los péptidos pueden producirse por cualquier método conocido para los técnicos en la materia tal como aquellos divulgados en Merrifield, R.B., Solid Phase Peptide Synthesis I., J. AM. CHEM. SOC. 85:2149-2154 (1963); Carpino, L.A. y colaboradores, [ (9-Fluorenylmethyl) Oxy] Carbonyl (Fmoc) Amino Add Chlorides: Synthesis, Characterization, And Application To The Rapid Synthesis Of Short Peptides, J. ORG. CHEM. 37:51:3732-3734; Merrifield, R.B. y colaboradores, Instrument For Automated Synthesis Of Peptides, ANAL . CHEM. 38:1905-1914 (1966); o Kent, S.B.H. y colaboradores, High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, en: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson U. , ed.) Alraqvist y Wiksell Int., Estocolmo (Suecia) , pp. 185-188, todas las cuales se incorporan por referencia en la presente en su totalidad. De preferencia, los péptidos serán producidos por una máquina capaz de adición secuencial de aminoácidos a una cadena de péptidos creciente. Sin embargo, los péptidos también se pueden fabricar usando metodología de fase de solución estándar. Se ha observado que la adición de una mezcla de aminoácidos libres en lugar de mezclas de péptidos homogéneas durante la síntesis de cadenas de péptidos resulta en incorporación variada de aminoácidos libres tal que una combinación de péptidos resulte de las reacciones de síntesis. La frecuencia de incorporación relativa de un aminoácido particular incluido en una mezcla de dos o mas aminoácidos añadidos durante la síntesis se puede ajustar. El ajuste se hace posible mediante modificar la relación de un aminoácido libre hecha disponible durante el proceso de síntesis con relación a los otros aminoácidos en la mezcla (esto se denomina una mezcla isocinética) . Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar formas de realización preferidas de la invención. Debería apreciarse por los técnicos en la materia que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas que se descubrió por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por consiguiente pueden considerarse constituyendo los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los técnicos en la materia deberían apreciar, a la luz de la presente divulgación, que muchos cambios se pueden hacer en sus formas de realización específicas que se divulgan y aun obtener un resultado parecido o similar sin salirse del espíritu y alcance de la invención. Ejemplos Ejemplo 1: Identificación de secuencias de tetra-péptido repetidas en colágeno Una relativamente alta proporción de secuencias de repetición de tetra-péptido de colágeno IV tienen el motivo GxxG (donde x es cualquier aminoácido) . Un número de estas se muestran in si tu como parte de la secuencia de colágeno IV completa ilustrada en la figura 1 como SEQ ID NO: 45. Colágeno IV se examinó primero debido a su rol de interacción con otros componentes de ECM especializados (Ver Gregory Schultz y colaboradores, 2005) . Hay once secuencias con el motivo GxxG en colágeno IV que aparecen mas de diez veces (GxxG donde xx es representado por: vp, ek, fp, lp, pp, sp, ep, ip, pk, qp y tp) . De estas secuencias de tetra-péptido, ocho de las once secuencias contienen prolina en la posición 3, dos de las once secuencias contienen p en la posición 2, una de las once secuencias contiene prolina en las posiciones 2 y 3, y una de las once secuencias no contiene prolina. Las secuencias divulgadas son referidas como REPLIKINES. "REPLIKINE" se define como una secuencia corta dentro de proteínas de ECM que ocurre múltiples ocasiones (es decir, se replica) . Esta secuencia puede estar presente en una proteína de ECM (v.gr., colágeno IV). De preferencia, la secuencia está presente en múltiples proteínas de ECM (v.gr., todos los colágenos, elastina, laminina, etc.). La presencia de la secuencia en múltiples proteínas de ECM incrementa la probabilidad de que el fragmento pueda ser capaz de promover síntesis o reparación de ECM. Las once secuencias GxxG que aparecen en colágeno IV enlistadas anteriormente son resaltadas en la secuencia de colágeno IV humano ilustrada en la figura 1. En esta figura, todas las secuencias en negritas son subrayadas y secuencias que se traslapan son doblemente subrayadas . Todas menos una de estas secuencias también aparecen en los colágenos I, II, III, y V. Este hecho contribuye a la habilidad de los péptidos divulgados para estimular la producción de todos los tipos de colágeno, particularmente cuando los péptidos se usan en combinación. La Tabla 1 muestra la frecuencia de varias repeticiones de tetra-péptido en las proteínas de ECM. Secuencias en negritas en la Tabla 1 son aquellas que aparecen en colágeno IV diez o mas veces .

Tabla 1: Frecuencia de tetra-péptidos en proteínas de ECM SEQ Secuencia Colágeno Colágeno Colágeno Colágeno Colágeno Elastina Precursor ID NO. I II III IV V de Elastina 19 GAAG 10 5 7 2 4 20 GA G 3 4 3 5 5 21 GAPG 13 21 25 6 9 22 GDKG 2 2 4 9 3 23 GDRG 2 5 2 4 1 8 GEKG 3 5 4 22 15 5 GEPG 11 15 10 11 4 24 GERG 10 11 14 6 7 2 GFPG 4 8 6 22 5 1 1 GIPG 2 2 6 14 6 5 5 26 G DG 1 4 5 2 2 27 GKPG 2 3 3 4 1 28 GLKG 2 1 1 5 4 29 GKPG 15 10 9 42 15 1 1 GNPG 3 5 3 2 1 31 GPAG 16 20 20 3 6 32 GPKG 3 11 4 12 9 7 GPPG 33 40 40 46 43 33 GPQG 7 11 9 7 5 34 GPRG 11 13 10 4 7 35 GPSG 10 11 5 1 5 36 GPTG 4 3 2 2 6 37 GPVG 9 3 3 2 5 38 GQPG 3 4 6 1 7 39 GRDG 4 2 3 12 40 GRPG 3 3 4 2 5 3 GSPG 4 6 21 16 3 41 GTPG 3 4 2 11 2 42 GVKG 1 3 2 3 1 43 GVPG 1 3 10 1 14 15 44 GYPG 1 1 1 4 2 Como también es evidente a partir de una revisión de la secuencia de colágeno IV, SEQ ID NO: 45, también hay muchas ocurrencias de secuencias teniendo el motivo PxxP. Por ejemplo, la secuencia PGPP ocurre no menos de quince veces como se ilustra en la figura 3. Por lo tanto, esta secuencia divulgada también es referida como una REPLIKINE. De preferencia, esta secuencia está presente en múltiples proteínas de ECM (v.gr. , todos los colágenos, elastina, laminina, etc.) pues la presencia de esta secuencia en múltiples proteínas de ECM incrementa la probabilidad de que el fragmento pueda ser capaz de promover la síntesis o reparación de ECM. Las quince secuencias PGPP que aparecen en colágeno IV enlistadas anteriormente son resaltadas y subrayadas en la secuencia de colágeno IV humano ilustrada en la figura 3. Ejemplo 2: Identificación de activos de cambio de cuadro Además de la relativamente alta proporción de secuencias de repetición de tetra-péptido de colágeno IV con el motivo GxxG, otras secuencias de tetra-péptido que ocurren a un cambio de cuadro de aminoácido de distancia de una secuencia de tetra-péptido GxxG o PxxP han sido identificadas. Estas secuencias pueden repetirse u ocurrir solamente una vez dentro de una proteína de ECM y pueden localizarse a una posición de aminoácidos de distancia de una secuencia de tetra-péptido ya sea GxxG o PxxP como se describe en la presente. Estas secuencias de tetra-péptido son referidas como activos de cambio de cuadro. Tales activos de cambio de cuadro pueden contener de manera acorde ya sea una G o una P en ya sea la segunda o la tercera posición, dependiendo de la dirección del cambio de cuadro. Se ha reconocido además que los activos de cambio de cuadro se pueden combinar con otras secuencias de tetra-péptido divulgadas en esta solicitud formando una combiquina. Un ejemplo de tal una combiquina es H06 y H15. Un ejemplo de un activo de cambio de cuadro es GAGP o H12 (SEQ ID NO: 6) . H12 (GAGP) aparece a un cambio de residuo (o cuadro) del tetra-péptido GxxG GGAG en colágeno III (SEQ ID NO: 46) como se ilustra en la figura 2. En esta figura, todas las secuencias de activo de cambio de cuadro están en negritas y subrayadas y las secuencias GxxG ocurriendo a un cambio de cuadro de distancia están doblemente subrayadas. Mas aun, como se muestra en la Tabla 5, este tetra-péptido (GAGP) logra buenos resultados para producción de colágeno a 48 horas. Otro ejemplo es la secuencia PGPR, la cual es H10 (SEQ ID NO: 4) la cual ocurre once veces en los colágenos I-IV. Como aparece múltiples ocasiones en una proteína de ECM individual, este tetra-péptido ademas sería considerado una REPLIKINE. La figura 2 (SEQ ID NO: 46) ilustra varias instancias de este tetra-péptido con cada una ocurriendo a un cambio de cuadro del tetra-péptido GxxG GPRG. Este activo de cambio de cuadro particular aparece en múltiples proteínas de ECM y por lo tanto incrementa la probabilidad de que el fragmento pueda ser capaz de promover síntesis o reparación de ECM.

Ejemplo 3: Identificación de secuencias de repetición que estimulan la producción de colágeno Varias secuencias identificadas en los ejemplos 1 y 2 se sintetizaron usando química de péptidos estándar y se ensayaron para la estimulación de colágeno a partir de fibroblastos dérmicos. Los péptidos sintetizados fueron amidados en la terminal C, lo cual hizo a los tetra-péptidos menos susceptibles a degradación de proteasa e incrementó su solubilidad comparada con las formas de ácido libre. Fibroblastos dérmicos humanos se incubaron en placas de 96 pozos a 37°C y C02 al 5% por 24 y 48 horas en 150 pL de medio de cultivo celular completo (Cascade Biologics, Portland, Oregon, Estados Unidos : No. Cat . M-106-500) , suplementado con Suplemento de Crecimiento en Suero Bajo (Cascade Biologics, Portland, Oregon, Estados Unidos: No. Cat. S- 003 -10) conteniendo péptidos de muestra a una concentración de péptido final de 50 pg/mL. Cada pozo se sembró con 10,000 células. Siguiendo a la incubación, muestras de medio de 100 se recuperaron de cada pozo y se ensayaron para producción de colágeno. Los ensayos se llevaron a cabo por Tebu-bio Laboratories (Francia) usando el Kit de Ensayo de Colágeno SIRCOL (Biocolor Assays, Reino Unido) siguiendo el protocolo del fabricante. El Ensayo de Colágeno SIRCOL es un método cuantitativo de ligadura de colorante diseñado para el análisis de colágenos solubles liberados hacia el medio de cultivo por células de mamíferos durante cultivo in vi tro. El colágeno de las muestras probadas se liga al colorante SIRCOL aniónico. Los complejos colágeno-colorante se precipitan fuera de la solución y se forman en pelotillas por centrifugación. La pelotilla de colágeno-colorante recuperada se disolvió en una solución alcalina previo a mediciones de absorbancia. Mediciones duplicadas se tomaron a los tiempos de 24 y 48 horas a partir de dos muestras separadas. Las cuatro mediciones para cada muestra se promediaron. La absorbancia de los blancos de reactivo, estándares de colágeno, y muestras se midieron a 560 nm. La absorbancia del blanco de reactivo se restó de la absorbancia de cada muestra a 24 y 48 horas. Dos conjuntos de datos separados se usaron para generar las dos curvas de calibración estándar de colágeno. La primera curva de calibración se generó para propósitos de calcular la cantidad de colágeno en las muestras H6 (combinación de las SEQ ID NOs:l-4), H7-H14 (SEQ ID N0s:l-8, respectivamente) y H15 (combinación de las SEQ ID NOs:5-8). La segunda curva de calibración se generó para calcular la cantidad de colágeno en las muestras H16 (SEQ ID NO:9), H21-23 (SEQ ID NOs:10-12, respectivamente), H25-26 (SEQ ID NOs:13-14, respectivamente), o H29-30 (SEQ ID NOs:15-16, respectivamente), H32 (SEQ ID NO:17), H33 (combinación de las SEQ ID NOs:9-12) , H34 (combinación de las SEQ ID NOS: 11-14) , H35 (combinación de las SEQ ID NOs:13-16) , H36 (combinación de las SEQ ID NOs:l, 6, 5, 8), H37 (SEQ ID NO:17) y H38 (SEQ ID NO : 8 ) a partir de las mediciones de absorbancia se creó mediante trazar la Abs560nm de estándares de colágeno conocidos contra las concentraciones respectivas de estándares de colágeno (en microgramos) cada tiempo que una serie de ensayos se llevó a cabo. Con respecto a cada conjunto de datos, la misma curva de calibración se usó para muestras tomadas en los tiempos de 24 y 48 horas (Tablas 2A y 2B) . De manera acorde, diferentes curvas estándar se prepararon inmediatamente, previo a llevar a cabo cada serie de ensayos . Tabla 2A: Curva de calibración para ensayar producción de colágeno por péptidos H6-H15 Estándares Prueba de Prueba de de colágeno A a 24h A560nm a 48h (pg) 0 0.00 0.00 5 0.08 0.10 10 0.11 0.15 25 0.32 0.35 50 0.66 0.65 Tabla 2B: Curva de calibración para ensayar producción de colágeno por péptidos H16, H21-23, H25-26, y H29-38 Una regresión lineal se llevó a cabo a partir de trazar los valores de Abs560nra contra concentraciones de los estándares de colágeno respectivos usando MICROSOFT EXCEL. La regresión resultó en una línea descrita por la fórmula y=0.013x para ambos tiempos de incubación notados en la Tabla 2A. Como los resultados fueron idénticos, solamente el periodo de tiempo de 24 horas se usó para la segunda serie de curvas de calibración. La fórmula de la línea obtenida en el ensayo de fecha 1 y ensayo de fecha 2 de la segunda serie de muestras fue y=0.0178x y y=0.0162x, respectivamente. El péptido LL-37 (SEQ ID NO: 18) se usó como un control positivo como ha sido reportado ampliamente por tener un impacto sobre sanado de heridas en hombres (Heilborn y colaboradores, The Cathelicidin Anti-Microbial Peptide LL-37 Is Involved In The Re-Epithelialization Of Human Skin Wounds And Is Lacking In Chronic Ulcer Epithelium, J. Invest. Dermato. 120:379-89 (2003)). El límite de detección de ensayo definido por el fabricante es 2.5 La cantidad total de colágeno producido en muestras conteniendo péptidos se calculó a partir de los valores de absorbancia promediados tomados a 24 horas (Tabla 3A) y 48 horas (Tabla 3B) usando la ecuación lineal derivada de la curva estándar. La cantidad total de colágeno producido en muestras conteniendo los péptidos H16 (SEQ ID NO: 9), H21-23 (SEQ ID NOs:10-12, respectivamente), H25-26 (SEQ ID NOs: 13-14, respectivamente), o H29-30 (SEQ ID NOs:15-16, respectivamente), H32 (SEQ ID N0:17), H33 (combinación de las SEQ ID NOs:9-12), H34 (combinación de las SEQ ID N0S.-11-14), H35 (combinación de las SEQ ID NOs .-13-16), H36 (combinación de las SEQ ID NOs.-l, 6, 5, 8) , H37 (SEQ ID NO: 17) y H38 (SEQ ID NO: 8) se calculó a partir de los valores de absorbancia tomados a 24 horas (Tabla 4A) y 48 horas (Tabla 4B) usando la ecuación lineal derivada a partir de la curva estándar. Estos valores se comparan con el péptido LL37 (SEQ ID N0:18), un péptido conocido por estimular colágeno. En cada tabla, las muestras marcadas por un asterisco (*) pueden no ser significativas pues el límite de detección del ensayo es 2.5 Tabla 3A: Mediciones de absorbancia y cuantificación de colágeno en muestras de prueba H6-H15 a 24 horas SEQ ID NO Péptidos Promedio Promedio menos Colágeno blanco ( 9) 18 LL37 0.102 0.136 0.12 0.04 3.0 - H6 0.084 0.140 0.11 0.03 2.5 1 H7 0.098 0.063 0.08 0.00 0.0* 2 H8 0.122 0.078 0.10 0.02 1.5* 3 H9 0.147 0.104 0.13 0.05 3.5 4 H10 0.103 0.146 0.12 0.04 3.4 Hll 0.110 0.168 0.14 0.06 4.5 6 H12 0.063 0.101 0.08 0.00 0.2* 7 H13 0.114 0.093 0.10 0.02 1.8* 8 H14 0.115 0.122 0.12 0.04 3.0 - H15 0.132 0.093 0.11 0.03 2.5 - Blanco 0.074 0.076 0.08 0.00 0.0 Tabla 3B: Mediciones de absorbancia y cuantificación de colágeno en muestras de prueba H6-H15 a 48 horas SEQ ID NO Péptidos Promedio Promedio menos Colágeno blanco 18 LL37 0.262 0.113 0.19 0.07 5.2 - H6 0.086 0.189 0.14 0.02 1.3* 1 H7 0.192 0.189 0.19 0.07 5.4 2 H8 0.137 0.126 0.13 0.01 0.9* 3 H9 0.117 0.061 0.09 0.00 0.0* 4 H10 0.136 0.085 0.11 0.00 0.0* Hll 0.113 0.181 0.15 0.03 2.1* 6 H12 0.113 0.231 0.17 0.05 3.7 7 H13 0.106 0.145 0.12 0.00 0.2* 8 H14 0.100 0.176 0.15 0.03 2.6 - H15 0.132 0.174 0.18 0.06 4.3 - Blanco 0.177 0.115 0.12 0.00 0.0 Tabla 4A: Mediciones de absorbancia y cuantificación de colágeno en muestras de prueba H16, H21-23, H25-26, o H29-38 a 24 horas SEQ ID NO Péptidos Promedio Promedio menos Colágeno blanco ( g) 9 H16 0.133 0.137 0.14 0.06 3.1 H21 0.129 0.119 0.12 0.04 2.5 11 H22 0.192 0.085 0.14 0.06 3.3 12 H23 0.090 0.073 0.08 0.00 0.1* 13 H25 0.129 0.076 0.10 0.02 1.3* 14 H26 0.114 0.149 0.13 0.05 2.9 H29 0.111 0.063 0.09 0.01 0.4* 16 H30 0.099 0.092 0.10 0.02 0.9* 17 H32 0.087 0.055 0.07 -0.01 -0.5* (cristales y toxicidad celular) - H33 0.086 0.125 0.11 0.03 1.4* - H3 0.117 0.120 0.12 0.04 2.2* - H35 0.103 0.090 0.10 0.02 0.9* - H36 0.105 0.128 0.12 0.04 2.1* 17 H37 0.099 0.100 0.10 0.02 1.1* 8 H38 0.103 0.159 0.13 0.05 2.9 - Blanco 0.072 0.086 0.08 0.00 0.0 Tabla 4B: Mediciones de absorbancia y cuantificación de colágeno en muestras de prueba H16, H21-23, H25-26, o H29-38 a 48 horas Debido a que los tamaños de muestras fueron de 100 yL, la concentración de colágeno producida en cada muestra en microgramos por mililitro se determinó mediante multiplicar la cantidad de colágeno detectada por diez . Los resultados de todas las muestras probadas se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5: Síntesis de colágeno inducida por péptidos Todos los tetra-péptidos probados estimularon producción de colágeno soluble. De las secuencias probadas, los tetra-péptidos GxxG con un ácido glutámico en la posición 2 estimulan mejor colágeno en puntos de tiempo de tanto 24 y 48 horas. Estas secuencias son Hll (GEPG; SEQ ID NO:5), H14 (GEKG; SEQ ID NO: 8) y H38 (GEKG; SEQ ID NO: 8) . Los péptidos se clasificaron inicialmente usando una concentración de péptidos de 50 yg/mL. Para buscar la concentración efectiva para estimular producción de colágeno, H14 (SEQ ID NO: 8) se probó también a 0.3 g/mL como H38. Como se muestra en la Tabla 5, la estimulación de colágeno inducida por H38 no se disminuyó a la concentración menor, indicando que la máxima concentración de estimulación de SEQ ID NO: 8 está en o por debajo de 0.3 pg/mL. Para probar su eficacia, la SEQ ID NO: 8 (H14 y H38) se comparó con el péptido, LL37 (SEQ ID NO: 18) , el cual es conocido por estimular producción de colágeno. Con base en la cantidad de colágeno liberada por fibroblastos en respuesta a LL37, 25 pg/mL se consideró una cantidad significativa de colágeno liberado debido a contacto con un tetra-péptido . La SEQ ID NO: 8 indujo alrededor de la misma cantidad de colágeno como LL37 (SEQ ID NO: 18) en 24 horas. De manera importante, colágeno producido como resultado de contacto con la SEQ ID NO: 8 sustancialmente se mantuvo por al menos 48 horas. La SEQ ID NO: 8 también se comparó con un péptido de cuidado de la piel líder conocido por estimular producción de colágeno, KTTKS (SEQ ID NO: 17) (Katayama y colaboradores, J. BIOL. CHEM. 288:9941-9944 (1983)). KTTKS es un ingrediente en el producto MATRIXYL (SEDERMA SAS, Francia) . La SEQ ID NO: 8 estimuló mas producción de colágeno que el péptido KTTKS (SEQ ID NO: 17) (Tabla 5) en 24 y 48 horas. Ejemplo 4: Identificación de combinaciones de péptidos que mejoran de manera sinérgica la estimulación de colágeno COMBIKINES Poblaciones heterogéneas de tetra-péptidos activos pueden estimular la producción de colágeno a un mayor nivel que muestras homogéneas de tetra-péptidos. Los componentes de la composición heterogénea son llamados COMBIKINES. Las COMBIKINES son un grupo de REPLIKINES combinadas para producir un efecto mayor o mas amplio sobre uno o mas tipos de células objetivo. Los péptidos Hll (SEQ ID NO: 5) , H12 (SEQ ID NO: 6) , H13 (SEQ ID NO: 7) , y H14 (SEQ ID NO : 8 ) se combinaron a una concentración final de 50 pg/mL y se ensayaron usando el mismo protocolo como para los péptidos individuales. Como se espera, el resultado obtenido en el punto de tiempo de 24 horas fue equivalente a la media de las calificaciones de inducción individuales. La combinación, de péptidos en 48 horas, sin embargo, indujo colágeno a un nivel de 43 µg/mL. Sorprendentemente, esta cantidad estuvo mucho mas en exceso de la media anticipada (21 g/mL) de los cuatro péptidos individuales (ver Tabla 5) . Por consiguiente, combinaciones específicas de péptidos pueden estimular la producción de colágeno en un mayor grado que los péptidos individuales a la misma concentración. Además, tetra-péptidos a partir de una variedad de fuentes de ECM tales como colágeno, laminina, y elastina pueden producir inducción acrecentada de una variedad de proteínas de ECM (ver Tablas 1 y 5) . Ejemplo 5: Fabricación efectiva en costos de COMBIKINE para acrecentar la estimulación de producción de colágeno El alto costo de la síntesis de péptidos limita la factibilidad de producir composiciones heterogéneas de péptidos bioactivos . La presente invención mayormente mitiga esta limitación. Debido a que las secuencias presentemente divulgadas tienen aspectos comunes (v.gr., una glicina o prolina en ambas terminales) , un rango de tetra-péptidos variados en las posiciones 2 y 3 se pueden sintetizar en una sola corrida de fabricación. Los péptidos sintéticos pueden hacerse por cualquier método conocido en la materia (Benoiton, N. , Chemistry of Peptide Synthesis, CRC (2005)). Durante la fabricación de los péptidos, mezclas de aminoácidos se añaden en lugar de muestras homogéneas. La química para determinar las relaciones correctas de concentraciones de aminoácidos añadidas en las posiciones mixtas para obtener la relación deseada de péptidos resultantes ha sido descrita previamente (Greenbaum y colaboradores, Molecular and Cellular Proteomics 1:60-68, 2002; Krstenansky y colaboradores, Letters in Drug Design and Discovery 1:6-13, 2004; ambas de las cuales referencias son incorporadas en la presente en su totalidad) . Usando esta metodología, una biblioteca de péptidos heterogéneos puede hacerse por casi el mismo costo de sintetizar un péptido. La aplicación de este proceso de fabricación permite la producción efectiva en costos de combiquinas bioactivas. Esto se hace posible por la composición única de los tetra-péptidos divulgados. Las mezclas de tetra-péptidos son mas adecuadas para la incorporación hacia formulaciones de uso tópico que péptidos mas grandes. Debido a su longitud, los tetra-péptidos tienen ventajas prácticas y químicas sobre péptidos mayores, incluyendo las siguientes: incorporación y disolución mas fácil en formulaciones, mayor permeabilidad en la piel y poros, y mayores rendimientos de producción con métodos mas fáciles para fabricar combinaciones de péptidos. Aunque no se requiere, las formulaciones ideales de tetra-péptidos, solos o en combinación, son tetra-péptidos que mantienen producción de colágeno significativa en 24 horas por hasta 48 horas. Mas preferentemente, las formulaciones inducirían síntesis de ECM por el periodo de 48 horas entero tal que mas colágeno se produzca por 48 horas que a 24 horas. Aunque está dentro del alcance de la presente invención, tetra-péptidos que promueven la producción de proteínas de ECM a 24 horas, pero que muestran producción disminuida a 48 horas, son menos favorecidos. En este respecto, la Tabla 6 muestra los resultados de los péptidos actualmente divulgados. Los péptidos preferidos están en negritas.

Tabla 6 : Péptidos divulgados SEQ Péptidos Colágeno Colágeno Liberación Incremento en Disminución en ID NO liberado liberado significativa la liberación la liberación ( g/mL) (ug/mL) de colágeno a de colágeno a de colágeno a 24h 48h 24h y 48h 48h vs. 24h 48h vs . 24h 18 LL37 30 52 / / - H6 25 13 1 H7 0 54 / 2 H8 15 9 3 H9 35 0 / 4 H10 34 0 / 5 Hll 45 21 / 6 H12 2 37 / 7 H13 18 2 8 H14 30 26 / 8 H38 29 28 / - H15 35 43 / ? 9 H16 31 3 / H21 25 29 / 11 H22 33 21 / 12 H23 1 17 / 13 H25 13 7 ? 14 H26 29 35 / 15 H29 4 19 / 16 H30 9 20 / 17 H32 NA 12 (cristales y toxicidad celular) 17 H37 11 22 / - H33 14 21 / - H34 22 34 / - H35 9 23 / - H36 21 36 / Ejemplo 6: Estimuladores de colágeno también sirven como moléculas de efectos múltiples mejorando de manera mas cercana las heridas de células epiteliales de piel Colágenos son componentes clave de todas las fases del sanado de heridas. La estimulación de producción de colágeno refleja que daño ha ocurrido a la red de colágeno (v.gr., por enzimas o destrucción física) . En verdad, el colapso total de la red de colágeno de hecho ocasiona que tome lugar el sanado. Por lo tanto, un estimulador de colágeno también puede servir como una molécula de efectos múltiples orquestando cierta remodelación de matriz y mejorando el sanado de heridas. Experimentos de sanado de heridas se llevaron a cabo en mono-capas de células epiteliales de piel humana (CRL-2592) colocadas en placas de 12 pozos. Las células no fueron alimentadas con suero por 24 horas antes de la experimentación. Mono-capas confluentes de CRL-2592 fueron heridas usando una punta de pipeta P200 (200 L) . Las heridas fueron lavadas y documentadas con fotografía previo a tratamiento con péptidos . Los péptidos fueron añadidos a una concentración final de 20 a 40 pg/ml. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C, C02 al 5%, y humedad al 92%, excepto cuando imágenes estaban siendo capturadas por un periodo corto a temperatura ambiente. El cierre de heridas se siguió en puntos de tiempo de 6 horas y 10 horas. Heridas tratadas con PBS se usaron como controles negativos para propósitos de comparación.

Tabla 7: Efecto de péptidos en el cierre de heridas epiteliales de piel humana in vitro Cierre de heridas mono-capa in vitro es un resultado de migración celular, lo cual es importante en muchos procesos biológicos tales como embriogénesis , angiogénesis , reacciones inflamatorias y reparación de heridas. Se piensa que estos procesos son regulados por interacciones con otras células, citoquinas y proteínas de ECM. Como se muestra en la Tabla 7, la SEQ ID NO: 14 significativamente induce cierre de heridas comparado con los efectos de PBS sola. Tal actividad es específica de péptido así como específica de tipo celular pues la SEQ ID NO: 14 no induce cierre de heridas en una mono-capa de fibroblastos de piel humana (datos no mostrados) . La SEQ ID NO: 5 también es un inductor de colágeno, pero no mejora el cierre de heridas o la migración de células epiteliales en algún buen grado comparado con los efectos de PBS sola. El hecho de que la SEQ ID N0:14 indujo la migración celular o cierre de heridas en una manera específica a células epiteliales de piel (es decir, no recluta fibroblastos) puede añadir una ventaja para usar este péptido para cuidado de la piel, dado que se cree que el reclutamiento de grandes números de fibroblastos activos a un sitio de herida resulta en depósito y contracción en exceso de tejido resultando en formación de cicatrices. Todas las composiciones y métodos divulgados y reivindicados en la presente pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación. Aunque las composiciones y métodos de la invención han sido descritos en términos de formas de realización preferidas, será aparente a los técnicos en la materia que variaciones se pueden aplicar a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente sin salir del concepto, espíritu y alcance de la invención. Mas específicamente, será aparente que ciertos agentes que están tanto químicamente y fisiológicamente relacionados pueden sustituirse por los agentes descritos en la presente mientras que los mismos o similares resultados fueran logrados. Todos tales sustitutos y modificaciones similares aparentes a los técnicos en la materia se consideran estando dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención.

Claims (30)

1. REIVI DICACIONES 1. Un tetra-péptido capaz de inducir producción de proteínas de matriz extra-celular comprendiendo la fórmula GxxG, donde G es glicina y x es un aminoácido variable.
2. 2. El tetra-péptido de la reivindicación 1, donde el tetra-péptido además comprende la fórmula GExG, donde E es ácido glutámico.
3. 3. El tetra-péptido de la reivindicación 2, donde el tetra-péptido es de la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO : 8.
4. 4. El tetra-péptido de la reivindicación 1, donde el tetra-péptido además comprende la fórmula GxPG, donde P es prolina .
5. 5. El tetra-péptido de la reivindicación 4, donde el tetra-péptido se selecciona a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 5 , y SEQ ID NO : 7.
6. 6. El tetra-péptido de la reivindicación 1, donde el tetra-péptido es amidado en la terminal carbpxi .
7. 7. El tetra-péptido de la reivindicación 1, donde x se selecciona a partir del grupo que comprende R, L, P, F, Q, E, I, K, S, V, A, N, D, T, Y y G.
8. 8. El tetra-péptido de la reivindicación 1, donde la proteína de matriz extra-celular es colágeno.
9. 9. Una composición que comprende por lo menos un tetra-péptido de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable .
10. 10. La composición de la reivindicación 9, donde el tetra-péptido está presente en una concentración efectiva variando de alrededor de 0.01 µ /p?1-, a alrededor de 100 g/mL.
11. 11. La composición de la reivindicación 9, donde el tetra-péptido está presente en una concentración efectiva variando de alrededor de 0.1 µ9/p?^ a alrededor de 1 g/mL.
12. 12. La composición de la reivindicación 9, donde la composición está en la forma de un aerosol, una emulsión, un líquido, una loción, una crema, una pasta, un ungüento, o una espuma .
13. 13. Un método para estimular la producción de colágeno en humanos, el método comprendiendo administrar a dicho humano una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 9.
14. 14. El método de la reivindicación 13, donde la concentración terapéuticamente efectiva está en el rango de alrededor de 0.1 µg/mL a alrededor de 50 g/mL de tetra-péptido.
15. 15. El método de la reivindicación 13, donde el administrar a dicho humano una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición promueve sanado de heridas de piel dañada.
16. 16. Un tetra-péptido capaz de inducir producción de proteínas de matriz extra-celular comprendiendo la fórmula PxxP, donde P es prolina y x es un aminoácido variable.
17. 17. El tetra-péptido de la reivindicación 16, donde el tetra-péptido además comprende la fórmula PGxP, donde G es glicina .
18. 18. El tetra-péptido de la reivindicación 17, donde el tetra-péptido se selecciona a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16.
19. 19. El tetra-péptido de la reivindicación 16, donde el tetra-péptido además comprende la fórmula PExP, donde E es ácido glutámico .
20. 20. El tetra-péptido de la reivindicación 19, donde el tetra-péptido es de la SEQ ID NO:l o SEQ ID NO: 9.
21. 21. El tetra-péptido de la reivindicación 16, donde el tetra-péptido es amidado en la terminal carboxi .
22. 22. El tetra-péptido de la reivindicación 16, donde x se selecciona a partir del grupo que comprende R, L, P, F, Q, E, I, K, S, V, A, N, D, T, Y y G.
23. 23. El tetra-péptido de la reivindicación 16, donde' la proteína de matriz extra-celular es colágeno.
24. 24. Una composición que comprende por lo menos un tetra-péptido de la reivindicación 16 y un portador farmacéuticamente aceptable.
25. 25. La composición de la reivindicación 24, donde el tetra-péptido está presente en una concentración efectiva variando de alrededor de 0.1 g/mL a alrededor de 1 pg/mL.
26. 26. La composición de la reivindicación 24, donde la composición está en la forma de un aerosol, una emulsión, un líquido, una loción, una crema, una pasta, un ungüento, o una espuma .
27. 27. Un método para estimular la producción de colágeno en humanos, el método comprendiendo administrar a dicho humano una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 24.
28. 28. El método de la reivindicación 27, donde la concentración terapéuticamente efectiva está en el rango de alrededor de 0.1 g/mL a alrededor de 50 ug/mL de tetra-péptido .
29. 29. El método de la reivindicación 27, donde el administrar a dicho humano una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición promueve sanado de heridas de piel dañada.
30. 30. Un tetra-péptido capaz de inducir producción de proteínas de matriz extra-celular comprendiendo la fórmula PGPR o GAGP.