MX2008015665A

MX2008015665A - Formulaciones farmaceuticas para la liberacion prolongada de principio (s) activo (s), asi como sus aplicaciones, particularmente terapeuticas.

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Publication number: MX2008015665A
Application number: MX2008015665A
Authority: MX
Inventors: Cecile Bonnet Gonnet; David Chognot; Olivier Soula; Alain Constancis
Original assignee: Flamel Tech Sa
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2007-06-11
Publication date: 2009-01-09
Also published as: EP2043600A2; CA2653537C; IL195269A0; KR20140109512A; BRPI0712142A8; KR101463952B1; IL195269A; WO2007141344A3; JP5351015B2; ZA200809864B; ES2642095T3; WO2007141344A2; BRPI0712142A2; JP2009539810A; WO2007141344B1; EP2043600B1; FR2902007A1; AU2007255367B2; AU2007255367A1; FR2902007B1

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas novedosas a base de suspensiones coloidales acuosas para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) - PA -, en particular protéico(s) y peptídicos(s), así como las aplicaciones, particularmente terapéuticas, de estas formulaciones. Esta formulación comprende una suspensión coloidal acuosa, de baja viscosidad, a base de partículas micrométricas del polímero PO amififilo, biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH) - alfa-tocoferol - y de grupos hidrofílicos ionizables (GI) - Glu -, por lo menos en parte ionizados, dichas partículas que son aptas para asociarse espontáneamente de manera no covalente con un PA, a pH = 7.0, en condición isotónica; y que tienen un tamaño comprendido entre 0.5 y 100 mum. Esta suspensión contiene iones multivalentes (Mg++) de polaridad opuesta a aquella de los grupos GI del PO, el rendimiento r, que responde a la fórmula (A): r = n x [IM]/[GI] (A); donde: n es la valencia de dichos iones multivalentes; [IM] es la concentración molar de iones multivalentes; [GI] es la concentración molar de grupos ionizables GI, que está comprendida 0.3 y 10.

Description

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS PARA LA LIBERACIÓN PROLONGADA DE PRINCIPIO(S) ACTIVO(S). ASÍ COMO SUS APLICACIONES. PARTICULARMENTE TERAPÉUTICAS La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas novedosas a base de suspensiones coloidales acuosas para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) (PA), en particular proteinico(s) y peptídico(s), así como las aplicaciones, particularmente terapéuticas, de estas formulaciones. Estas formulaciones farmacéuticas activas se relacionan también tanto con la terapéutica humana como con la veterinaria. En el dominio de la liberación prolongada de los PA farmacéuticos, particularmente de proteínas terapéuticas, existe una necesidad, en muchos casos, de reproducir en las mejores condiciones en el paciente una concentración plasmática en proteína o en péptido del valor observado en el sujeto sano. Este objetivo se enfrenta a la duración insuficiente de vida de las proteínas en el plasma, lo que conduce a inyectar de manera repetida la proteína terapéutica. La concentración plasmática de proteína terapéutica presenta entonces un perfil "dentado", caracterizado por los picos elevados de concentración y de mínimos de concentración muy bajos. Los picos de concentración, muy superiores a la concentración basal en el sujeto sano, tienen efectos nocivos muy marcados por el hecho de la toxicidad elevada de las proteínas terapéuticas, tales como la interleucina IL2. Por otro lado, los mínimos de concentración son inferiores a la concentración necesaria para tener un efecto terapéutico, lo que entraña una mala cobertura terapéutica del paciente y las consecuencias graves a largo plazo. Tam bién , para reproducir en el paciente una concentración plasmática en proteína terapéutica próxi ma al valor ideal para el tratamiento del paciente, es importante que la form ulación farmacéutica considerada perm ita liberar la proteína terapéutica con una d uración prolongada , a manera de limitar las variaciones de concentración plasmática en el cu rso del tiempo. Por otra parte, esta formulación activa debe satisfacer, de preferencia, la lista de condiciones siguientes, ya conocidas por el experto de la técnica : 1 . Liberación prolongada de una proteína terapéutica activa y no desnaturalizada, por ejemplo humana o sintética , de ma nera que la concentración plasmática sea mantenida al nivel terapéutico; 2. Viscosidad para la inyección suficientemente baja para ser fácilmente inyectable; 3. Forma biocompatíble y biodegradable; 4. Forma que no presenta ni toxicidad , ni inm unogenicidad ; 5. Forma que tiene una excelente tolerancia local. Para i ntentar alcanzar estos objetivos, uno de los mejores enfoq ues propuesto en la técnica anterior señala el desarrollo de formas de liberación prolongada de proteínas terapéutica(s) constituida(s) por suspensiones, líquidas y poco viscosas de nanopartículas cargadas en proteínas terapéuticas. Estas suspensiones han permitido la adm inistración fácil de proteínas terapéuticas nativas. Así, la sociedad Flamel Technologies ha propuesto una ruta, en la cual la proteína terapéutica está asociada a nanopartícuias de un copoiiaminoácido que comprende grupos hidrofóbicos y grupos hidrofílicos. La patente US-B-5,904,936 describe partículas submicrónicas (NPV) - de tamaño mediano comprendido entre 0.01 y 0.5 pm - y partículas micrométricas (MPV) - de tamaño mediano comprendido entre 0.5 y 20 pm - de copolímero amfifilo de poliaminoácidos que comprenden por lo menos dos tipos de aminoácidos, uno que es neutro hidrofóbico, el otro que es ionizable. Proteínas tales como la insulina se adsorben espontáneamente en solución acuosa en estas partículas. El copolímero de poliaminoácido es, por ejemplo, un copolímero de bloque de poli(L-leucina-b-L-glutamato de sodio). Esta patente describe la agregación de NPV en MPV por adición a una suspensión coloidal de poli-Leu/Glu, de sales monocatiónicas (sulfato de amonio) o policatiónicas (Fe2+, Fe3+, Zn2\ Ca2\ Al2\ Al3+ o Cu2+), de ácido (HCI), de polímeros catiónicos (polilisina). La solicitud de patente WO-A-2005/033181 divulga homopoliaminoacidos lineales, amfifilos, aniónicos, que comprenden unidades aspárticas o unidades glutámicas y en donde los extremos son portadores de grupos hidrofóbicos que tienen de 8 a 30 átomos de carbono. En particular, los homopoliaminoacidos telequélicos "modificados hidrofóbicos" son, por ejemplo, un poli[GluONa] con extremos PheOC18/C18 o un poli[GluONa] con extremos PheOCI 8/alfa-tocoferol. Estos homopoliaminoacidos telequélicos "modificados hidrofóbicos" se forman espontáneamente en el agua en una suspensión coloidal de nanopartícuias, las cuales son aptas para asociarse fácilmente en suspensión acuosa con pH 7.4, con por lo menos una proteína activa (insulina). La duración de liberación in vivo de la (o las) proteína(s) activa(s) (por ejemplo insulina) "vectorizadas" por las suspensiones de acuerdo con US-B-5,904,936 y WO-A-05/051416 mejoraría al ser aumentada. El aumento de la duración de liberación se ha obtenido parcialmente por las formas farmacéuticas descritas en la solicitud PCT WO-A-05/051416. En esta solicitud, una suspensión coloidal de nanopartículas (0.001-0.5 pm) de poli(L-glutamato de sodio) modificado a hidrofóbico se inyecta a una concentración tal que después de la inyección subcutánea, se forma in situ en el paciente un gel al contacto con la sueroalúmina endógena. La proteína es liberada lentamente entonces en un periodo típicamente de una semana. Sin embargo puesto que la concentración en proteína terapéutica a administrar es relativamente elevada, como es el caso, por ejemplo, con la hormona de crecimiento humana, la duración de liberación está limitada a solamente algunos días. En todo caso, toda esta técnica anterior sobre los coloides de nanopartículas o de micropartículas de poliaminoácidos modificados a hidrofóbicos no revela formulación que permita: (I) incrementar la duración de liberación de la proteína activa después de la inyección por vía parenteral, por ejemplo subcutánea; cuando centra ción de proteína es elevada. (II) y/o reducir el pico de concentración plasmático de la proteína activa después de la inyección de la formulación que la contiene. En estas condiciones, uno de los objetivos de la presente invención, es por lo tanto proponer una formulación farmacéutica para la liberación prolongada de PA, remediar las carencias de la técnica anterior, y en particular que permita después de la inyección por vía parenteral (por ejemplo subcutánea), obtener una duración de liberación prolongada in vivo para los PA (por ejemplo proteínas, péptidos terapéuticos y moléculas pequeñas) no desnaturalizados, por ejemplo proteínas humanas o sintéticas. Otro objetivo de la invención es proponer una formulación farmacéutica que permita después de la inyección por vía parenteral (por ejemplo subcutánea), obtener una duración de liberación prolongada in vivo para proteínas y péptidos terapéuticos fuertemente concentrados, por ejemplo con varios mg/ml. Otro objetivo de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica de liberación prolongada del PA in vivo, que sea estable en conservación tanto o en el plan fisicoquímico como biológico. Otro objetivo de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica de liberación prolongada del PA in vivo, que presente por lo menos una de las propiedades siguientes: biocom patibilidad, biodegradación, atoxicidad, buena tolerancia local. Otro objetivo de la invención es proponer una formulación farmacéutica para la liberación prolongada lenta de PA in vivo, que comprende partículas micrométricas de polímero (PO) auto-asociables a por lo menos un PA, siendo el PO un polímero biodegradable, hidrosoluble, portador de grupos hidrofóbicos (GH) y de grupos ionízables (Gl), que forman espontáneamente en el agua una suspensión de nanopartículas coloidales. Otro objetivo de la invención es proponer una formulación farmacéutica que comprende partículas micrométricas de polímero PO vide supra, capaz de liberar, después de la inyección por vía subcutánea, una proteína o un péptido terapéutico en una duración más larga que la duración de la liberación obtenida después de la administración de la misma proteína mezclada en medio acuoso del PA con la suspensión coloidal del polímero PO. Otro objetivo de la invención es proponer una formulación farmacéutica de liberación prolongada lenta de PA in vivo, esta formulación que comprende partículas micrométricas de polímero PO auto-asociadas a por lo menos un PA, el polímero PO que es, por ejemplo, un poliaminoácido en donde la cadena principal está formada por los residuos aspárticos y/o residuos glutámicos, por lo menos una parte de estos residuos que están modificados por injerto de por lo menos un grupo hidrofóbico GH, en la cadena y/o al final de la cadena, PO que es que es además biodegradable, hidrosoluble y amfifilo. Otro objetivo de la invención es proponer productos derivados y/o precursores de la formulación de meta de los objetivos antes enunciados. Es del mérito de la solicitante haber descubierto que la agregación de nanopartículas de la formulación de acuerdo con WO 05/051416 en partículas micrométricas que contienen iones multivalentes de polaridad opuesta a aquella de los grupos Gl , en proporciones bien definidas, que conducen a una selección de una población específica de micropartículas que permiten una prolongación significativa de la duración de liberación del PA (por ejemplo proteína o péptído) con el cual están asociadas estas micropartículas. Es igualmente del mérito de la solicitante haber descubierto que ciertos iones multivalentes conducen a una excelente tolerancia de las formulaciones de acuerdo con la invención. De lo que resulta que la invención se refiere a una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de PA, que comprende una suspensión coloidal, acuosa, de viscosidad baja, a base de partículas micrométricas de polímero (PO), i. el polímero PO - que es un copolímero amfifilo, biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH) y de grupos hidrofílicos ionizables (Gl), por lo menos ionizados en parte, y que forman espontáneamente una suspensión coloidal de nanopartículas en el agua, con pH = 7.0, en condición isotónica, ii. dichas partículas que son aptas para asociarse espontáneamente de modo no covalente con por lo menos un principio activo (PA), con pH = 7.0, en condición isotónica, formulación caracterizada porque las partículas micrométricas de PO tienen un tamaño, medido en una prueba T, comprendido entre 0.5 y 100 pm, de preferencia entre 1 y 70 pm, de preferencia entre 2 y 40 pm y por que contiene iones multivalentes de valencia inferior o igual a 4, de preferencia iones divalentes, iones trivalentes o sus combinaciones, de polaridad opuesta a aquella de grupos ionizables Gl del polímero, dichos iones multivalentes que han sido agregados para provocar la agregación de nanopartículas de PO en partículas micrométricas en una cantidad tal que el rendimiento r, medido en una prueba M, responde a la fórmula r = n x [IM]/[GI], donde: n es la valencia de dichos iones multivalentes, - [IM] es la concentración molar en iones multivalentes, [Gl] es la concentración molar de grupos ionizables Gl, está comprendido entre 0.3 y 10, de preferencia entre 0.6 y 5.0 y más preferiblemente aún entre 0.8 y 3.0. Estas partículas micrométricas seleccionadas de acuerdo con la invención son emitidas de la agregación de un gran número de nanopartículas de copolímero amfifilo. Esta agregación es provocada ventajosamente por la presencia de iones multivalentes de polaridad opuesta a aquella de los grupos ionizables Gl (ionizados en parte por lo menos) llevados por el copolímero. Estos iones multivalentes de polaridad opuesta a aquella de los grupos Gl del copolímero, al formar complejos con cadenas de polímeros pertenecientes a nanopartículas distintas, provocan la floculación de las nanopartículas de polímero en la forma de micropartículas. El PA se puede asociar espontáneamente con las nanopartículas de copolímero PO antes de su agregación en partículas micrométricas y/o con estas últimas durante o después de la agregación. Además, las formulaciones de acuerdo con la invención son no tóxicas, bien toleradas localmente. En todo lo expuesto, a diferencia de las micropartículas de tamaño micrométrico (micrónico) de la formulación de acuerdo con la invención, el término "partículas submicrónicas" o "nanopartículas" designa a las partículas de tamaño (medido en una prueba T descrita después en la presente) superior o igual a 1 nm e inferior a 500 nm, de preferencia comprendido entre 5 y 250 nm . En el sentido de la invención, el término "proteína" designa tanto una proteína como un péptido, que se trata de un oligopéptido o de un polipéptido. Esta proteína o este péptido pueden o no pueden ser modificados, por ejemplo, mediante injerto de uno o varios grupos polioxietilénicos. El principio activo está designado por la abreviación PA durante todo presente expuesto; PA alude a por lo menos un principio activo. En el sentido de la invención y en todo lo expuesto, los términos "asociación" o "asociar" empleados para calificar las relaciones entre uno o varios PA y los pol ímeros PO (por ejemplo los poliaminoácidos) significan que el o los PA está(n) ligado(s) a lo(s) polímero(s) PO mediante un enlace no covalente, por ejemplo mediante la interacción electrostática y/o hidrofóbica y/o enlace de hidrógeno y/o fuerza estérica. Las velocidades angulares de centrifugación son expresadas en rpm (revolución por minuto), unidad equivalente a una vuelta por minuto (v/min): con 1 rpm = 2n/60 rad«s"1 Prueba T de medida del tamaño de las micropartícu las por difracción de láser: a - Prueba T1 en el caso donde las micropartículas están bajo la forma de dispersión acuosa. 1 . Material y condiciones operativas.

Granulometría de láser Malvern Mastersizer 2000 Módulo Medio líquido Hydro 2000SM Volumen del fluido vector 150 mi dispersante Longitudes de onda (azul y rojo) 466 y 632 nm Velocidad de agitación 2400 rpm Dominio del análisis 0.02 pm a 2000 pm Modelo óptico (Teoría de partícula negativa) Valores de los índices de refracción utilizados: Fluido dispersante (agua) mtu¡do = 1.33 + i.O Poliestireno látex rripoliestireno látex = 1-59 + ?.0 Valores del obscurecimiento para entre 5% y 20% iniciar el análisis Tiempos de adquisición 10 s 2. Preparación de la muestra. Para preparar la muestra a analizar, es necesario diluir 400 pL de la muestra a analizar en un tubo de ensayo de 5 mL con 600 mL de agua desmineralizada, después pasar la preparación por agitación (vórtice) durante 10 s (10 ± 5). 3. Análisis de la muestra. El fluido circulante almacenado en el sistema de dispersión de medio líquido en reposo es vaciado y remplazado con agua desmineralizada fresca. La agitación del móvil Hydro 2000S M está colocada en 2400 rpm . I niciar la medición con las condiciones experimentales citadas previamente: 1 . ali neación del haz de láser. 2. registro de ruidos de fondo. Después de estas etapas, el operador introd uce la muestra a analizar de la manera siguiente: agregar gota a gota (con pi peta Pasteur) la m uestra diluida justo hasta que el obscurecimiento esté comprendido entre 5% y 20% y lanza r la adquisición . Se obtienen los datos relativos al D50, que es el diámetro por debajo del cual se encuentra el 50% de los objetos analizados . Calcular la media del D50 de 3 medidas hechas en 3 preparaciones diferentes. b - Prueba T2 en el caso donde las micropartículas están en forma seca . 1 . Material y condiciones operativas. Granulometría de láser Malvern Mastersizer 2000 Módulo Medio l íquido Hydro 2000S M Volumen del fluido vector dispersante 1 50 mi Longitudes de onda (azul y rojo) 466 y 632 nm Velocidad de agitación 2000 rpm Domi nio del análisis 0.02 pm a 2000 pm Modelo óptico (Teoría de partícula negativa) Valores de los índices de refracción utilizados: Fluido dispersante (agua) mfu¡d0 = 1.39 + i.O Poliestireno látex ITIpoliestireno látex = 1-59 + ¡.0 Valores del obscurecimiento para entre 5% y 20% iniciar el análisis Tiempos de adquisición 10 s 2. Preparación de la muestra. - preparar una solución de Span 80 al 0.1% en heptano (para pesar 0.01 g de polvo de Span 80 en un frasco de 20 mi, después agregar por pesada de heptano con el fin de obtener al final 10 g). - pesar aproximadamente 6 mg de polvo en un tubo de ensayo de 5 ml_. - agregar 0.7 g de heptano conteniendo 0.1% de Span 80 en el tubo de ensayo. - colocar el tubo de ensayo durante 2 min en un baño de ultrasonido con el fin de dispersar bien el polvo. 3. Análisis de la muestra. El fluido circulante almacenado en el sistema de dispersión de medio líquido en reposo es vaciado y remplazado con heptano. La agitación del móvil Hydro 2000SM está colocada en 2000 rpm. Iniciar la medición con las condiciones experimentales citadas previamente: 1. alineación del haz de láser. 2. registro de ruidos de fondo. Después de estas etapas, el operador introduce la muestra a analizar de la manera siguiente: agregar gota a gota (con pipeta Pasteur) la muestra diluida justo hasta que el obscurecimiento esté comprendido entre 5% y 20% y lanzar la adquisición. Se obtienen los datos relativos al D50, que es el diámetro por debajo del cual se encuentra el 50% de los objetos analizados. Calcular la media del D50 de 3 medidas hechas en 3 preparaciones diferentes. Prueba T de medida del tamaño de tas nanopartículas por difusión casi-elástica que la luz. El diámetro hidrodinámico medio de las partículas de polímero PO de acuerdo con la invención se mide de acuerdo con el modo operativo Md definido aquí más adelante: Las soluciones de PO son preparadas en concentraciones de 1 o 2 mg/ml en medio de NaCI 0.15 M y dejadas en agitación durante 24 h. Estas soluciones se filtran enseguida en 0.8-0.2 pm, antes de ser analizadas en difusión dinámica de la luz gracias a un aparato de tipo Malvern Compact Goniometer System, que funciona con un haz de láser He-Ne de longitud de onda de 632.8 nm y polarizado verticalmente. El diámetro hidrodinámico de las nanopartículas de polímero PO se calcula a partir de la función de autocorrelación del campo eléctrico mediante el método de acumulantes, como se describe en la obra <Surfactant Science Series> volumen 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, cap.3, M. Dekker, 1984. Prueba M de medida de la cantidad en iones multivalentes por cromatografía iónica: Se toma como ejemplo el de la cuantificación del ion multivalente Mg+2. El método es esencialmente el mismo (sólo cambian los testigos) para la determinación de otros cationes. 1 . Material y reactivos. Cromatógrafo iónico. Sistema de cromatografía iónica Dionex ICS2500 equipado con un detector de conductividad, de un supresor catiónico de funcionamiento interno y de cuatro termostatos. Columna (Dionex): columna Ion Pac CS 16 de 5 x 250 mm . Columna de guardia (Dionex): columna de guardia Ion Pac CG 16 de 5 x 50 mm. Supresor catiónico (Dionex): CSRS - ULTRA II - 4 mm. Frasco de plástico para cromatografía iónica (Dionex). Agua desmineralizada (MilliQ). Ácido clorhídrico HCL 0.1 N (Riedel de Háen). Ácido metansufónico (MSA) (AldricrO. Sulfato del ion multivalente: por ejemplo MgS0 (Aldrich). 2. Preparación de las soluciones Disolvente: HCI 0.1 N. En un frasco de 1 L que contiene aproximadamente 500 ml_ de agua MilliQ, introducir 100 ml_ de HCI 0.1 N. Completar a 1 L con agua de MilliQ y colocar bajo agitación magnética. Fase móvil: MSA 30 mM. En un frasco de plástico de 2 L para cromatografía iónica, introducir 2 L de agua MilliQ con la ayuda de una probeta graduada. Agregar 3.89 mide MSA con una pipeta automática. Colocar sobre la cadena y comenzar el burbujeado de helio para mezclar y desgasificar la fase. 3. Preparaciones de testigos y de muestras. Preparación de testigos: Preparar 3 testigos en una gama de concentraciones de M+2 de 1 m/L a 2.6 m/L.

Preparar las disoluciones de las soluciones madres.

Preparación de muestras Para las form ulaciones de micropartículas bien agitadas justo antes de la toma de m uestras y mezclar con la ayuda de la pipeta automática. Efectuar por lo menos una dilución ada ptando la pesada y el volumen de dilución con el fin de obtener una concentración de Mg+2 com prendida entre 1 mg/L y 2.6 mg/L. La dilución se hace en HCI 0.01 N con el fin de precipitar el polímero. Proceder mediante diluciones sucesivas necesario. Colocar en agitación magnética durante por lo menos 30 minutos Filtrar en 0.45 pm antes de meter en frascos. Efectuar dos preparaciones por muestra. 4. Condiciones de cromatografía iónica. 5. Aprovechamiento de los resultados. Determinación de la recta de contraste. La recta de regresión se obtiene considerando todos los testigos de la secuencia. El coeficiente de correlación debe ser >0.99. La ecuación de la recta es la siguiente: Y = aX + b Con: Y = área del pico de magnesio. X = concentración de la solución testigo (mg/L). Determinación de la proporción de ion magnesio en las muestras. M = (Yensayo- ) X Vd/a X Pe M = Proporción de Mg+2 (g/l). Yensayo = área del pico de magnesio para el ensayo, a = pendiente de la recta de calibración, b = ordenada al origen de la recta de contraste. Vd = volumen de dilución (mi). Pe = toma de ensayo de la muestra (mg). El resultado final es la media de 2 ensayos. El coeficiente de variación aceptado generalmente en cromatografía iónica es de 10% más lo que será confirmado luego de la validación del método. Cálculo del rendimiento r. En el protocolo precedente, hemos descrito la determinación de la proporción de magnesio. De la misma manera se determina por un método análogo la proporción T para otros cationes multivalentes (Ca2+, Zn2+, Al3+, etc). Una vez determinado así el valor de M se deduce la concentración molar en ion multivalente IM. [IM] = M/Mion, en donde Mion es la masa molar del ion multivalente en g/mol. Conociendo la estructura del polímero ionizable, en particular su grado de polimerización teórico DP, su masa molar teórica Mp y su tasa de injerto hidrofóbico (es decir la fracción CCH de las funciones modificadas por los injertos hidrofóbicos), se puede calcular la concentración molar de grupos ionizables para una concentración C de polímero (expresado en g/l): Se calcula entonces r = n x [IM[/[GI], donde n es la valencia del ion multivalente. De preferencia, la formulación de acuerdo con la invención está caracterizada porque las partículas micrométricas tienen una densidad aparente dapp de polímero, medida en una prueba D descrita más adelante, comprendida entre 0.05 y 1.0, de preferencia entre 0.07 y 0.7, de preferencia entre 0.1 y 0.5. Prueba D de medida de la densidad aparente d^: La suspensión de micropartículas de concentración C (mg/g) de polímero PO es homogenizada mediante agitación magnética. Se toman 2 mi de muestra de suspensión de micropartículas con la ayuda de una micropipeta y se coloca en un tubo de centrifugación del cual se ha tomado previamente la tara. La suspensión de micropartículas colocada en el tubo se pesa entonces (masa m en g). El tubo se coloca en una centrifugadora y se deja centrifugar durante 30 minutos a 8000 rpm. Se toma muestra del sobrenadante precisamente con las micropipetas adaptadas. Se deduce el volumen del sedimento Vsed (en mi): Vsed = V,ot - Vsobr La densidad aparente dapp de polímero (en g/cm3) está dada por la fórmula: "app y«*¡ La suspensión de partículas micrométricas cargadas en PA permiten una prolongación particularmente interesante de la duración de liberación del PA (por ejemplo proteína terapéutica o péptido) así como una reducción del pico de concentración plasmática. La duración de liberación del PA es aumentada particularmente de manera significativa con relación a aquellas formulaciones de la técnica anterior, en particular aquellas descritas en la solicitud WO 05/051 46. La prolongación de la duración de liberación del PA in vivo inducida por las formulaciones de acuerdo con la invención es además más apreciable que en los PA (por ejemplo proteínas terapéuticas) son siempre plenamente bioactivos y no desnaturalizados. Así, las formulaciones de acuerdo con la invención tienen por característica funcional ventajosa un incremento de la duración Tr de liberación de un PA dado, de manera que medida en una prueba L, con relación a la duración tr de vibración medida en la misma prueba L, de una formulación idéntica que no contiene iones multivalentes, este incremento es de preferencia tal que Tr es superior o igual a 1 .1 x tr y, más preferiblemente aún, tal que Tr es superior o igual a 1 .5 x tr. Prueba L de medida de la liberación del PA a partir de las partículas micrométricas de acuerdo con la invención: Recortar cuadrados de 2 x 2 cm de absorbente de polipropileno. Preparar la solución de tampon de fosfato, considerar el PBS, al disolver 1 tableta de PBS (Aldrich) en 200 mi de agua. Se obtienen 200 mi de una solución que contiene 0.01 M de tampon fosfato + 0.0027 M de cloruro de potasio y 0.1 37 M de cloruro de sodio. Preparar la solución con tampon de albúmina de bovino a 30 mg/g, considerar el BSA al disolver 6 g de albúmina de suero de bovino, fracción V (SAFC) en 294 g de tampón de fosfato PBS preparado anteriormente. Prever dos tubos Falcón de 50 mi conteniendo, uno el PBS y el otro la solución de BSA para empapar los cuadros de absorbente, y conservarlos en el refrigerador. Poner 4 o 5 mi de estas soluciones en tubos herméticos de capacidad de 5 mi (prever 5 muestras para cada uno de los medios). Conservarlos en refrigerador. Después de 15 h de espera, colocar los tubos de 5 mi conteniendo las fases continuas a 37°C una hora antes. Empapar una hora los cuadros, 5 en PBS, 5 en BSA (o más en caso de problemas en el momento de la inyección) a 37°C. Inyectar 0.5 mi de la formulación en 27G (jeringa de 1 mi) en el centro de cada cuadro (paralelamente a su superficie) previamente enjugado ligeramente sobre papel. Reparar el costado por el cual se ha inyectado. Hacer lo mismo para los 10 cuadros, que se sumergirán en seguida en los medios continuos con el fin de sincronizar todas las cinéticas. Colocar los cuadros de manera que la cara por la cual se ha realizado la inyección se encuentre hacia la parte alta del tubo. Colocar las muestras en una gradilla y meter todo a la estufa a 37°C, con agitación. La agitación influye fuertemente sobre la cinética de realargamiento, y por eso debe ser controlada: agitación sobre 40 y 9 cm entre las dos barras de seguridad. Se toman 100 µ? de la fase continua en momentos diferentes. Dosificación de la proteína por cromatografía en fase líquida HPLC. Se utilizan dos fases eluyentes: Fase A: 1260 mi de agua/680 mi de acetonitrilo/60 mi de THF/1.8 mi de TFA.

Fase B: 630 mi de acetonitrilo/340 mi de agua/30 mi de THF/0.8 mi de TFA. La Tabla siguiente reagrupa las condiciones HPLC. Instrumento Agilent 1100 equipado con: - Un pasador de muestras automático refrigerado - Un detector UV y FLD - Una integración automática Columna Keystone BetaBasic-18 - 4.6 x 150 mm - 3 m - tamaño de poros 150 A Gradiente tiempos (min) %A %B 0 100 0 15 50 50 35 10 90 36 100 0 40 100 0 Tiempos de análisis 40 min (+20 min de lavado entre las inyecciones) Producción 1.5 ml/min Temperatura de columna 38°C Temperatura de las muestras Refrigeradas (4°C) Volumen de inyección 100 µ? Detección Absorbancia UV a 280 nm Fluorescencia: - 296 nm (excitación) - 330 nm (emisión) Se traza entonces la concentración de proteína en el medio continuo en función del tiempo. Se lee en la curva la cantidad total de proteína liberada cuando la curva alcanza una plataforma: este valor debe representar por lo menos 40% de la proteína introducida en el inicio para que la prueba sea válida. Se lee entonces en esta curva el tiempo indicado Tr como el que es necesario para alargar 50% del PA introducido. Según una característica preferida, la formulación farmacéutica líquida, de acuerdo con la invención, está caracterizada porque las partículas micrométricas de la suspensión son susceptibles de ser obtenidas espontáneamente en un l íquido acuoso mediante adición, en una suspensión de nanopartículas de polímero PO y eventualmente un PA, de una sal que contiene iones multivalentes, de preferencia iones divalentes, de polaridad opuesta a aquella de los grupos Gl del pol ímero PO. De conformidad con una modalidad preferida, la formulación de acuerdo con la invención comprende un PA asociado a las micropartículas de PO. Esta formulación tiene como ventaja la de ser inyectable por vía parenteral y de ser líquida en las condiciones de inyección. De acuerdo con la invención, los calificativos "líquido", "base" o "muy baja viscosidad" corresponden, ventajosamente, a una viscosidad dinámica a 20°C inferior o igual a 1000 mPa.s. De preferencia, la viscosidad dinámica de la formulación, medida a 20°C, para un gradiente de corte de 1 000 s"\ es de preferencia inferior o igual a 500 mPa.s, de preferencia comprendida entre 2 y 200 mPa.s, por ejemplo, comprendida entre 1 .0 y 100 mPa.s, inclusive entre 1.0 y 50 mPa.s. Medida de la viscosidad dinámica La medida de referencia para la viscosidad dinámica se puede realizar, por ejemplo, a 20°C con la ayuda de un reómetro AR1000 (TA Instruments) equipado con una geometría de cono-plano (4 cm, 2o). La viscosidad v se mide para un gradiente de corte de 1000 s"1. Esta baja viscosidad hace a las formulaciones de la invención fácilmente inyectables por vía parenteral, en particular por vía mucosa, intramuscular, subcutánea, intradermal, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, entre otras. La formulación de acuerdo con la invención puede ser administrada también por vía oral, nasal, pulmonar, vaginal, ocular o bucal. Este estado líquido o esta baja viscosidad de las formulaciones de la invención existe también a temperaturas de inyección que corresponden a temperaturas ambientales, por ejemplo comprendidas entre 4 y 30°C, como a la temperatura fisiológica. Los polímeros PO utilizados en la invención son polímeros biodegradables, hidrosolubles y portadores de grupos hidrofóbicos GH y de grupos Gl ionizables. Los grupos hidrofóbicos pueden estar en número reducido de frente al resto de la cadena y se pueden situar lateralmente a la cadena o intercalar en la cadena, y estar repartidos de manera aleatoria (estadística de copolímero) o repartidos bajo la forma de secuencias o de injertos (copolímeros de bloques o copolímeros de secuencias). De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, los grupos hidrofóbicos GH están situados lateralmente en la cadena.

Sin desear estar limitado, los polímeros PO hidrofóbicos modificados se pueden seleccionar del grupo que comprende: los poliaminoácidos, los (poli)péptidos, las gelatinas, las proteínas, los polisacáridos - de preferencia los bajos - grupo que comprende pullulanes o chitosanes o los mocopolisacáridos o los dextranos o los galactomananes o los polihialuronatos -, o sus mezclas. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, PO se selecciona entre los (co)poliaminoácidos amfifilos. En el sentido de la invención y en todo lo presente expuesto, el término <poliaminoácido> cubre tanto los poliaminoácidos naturales como los poliaminoácidos sintéticos, de manera que los oligoaminoácidos comprenden de 1 0 a 20 residuos de aminoácido igualmente que los poliaminoácidos comprenden más de 20 residuos. De preferencia, los poliaminoácidos utilizados en la presente invención son oligómeros u homopolímeros que comprenden residuos recurrentes de ácido glutámico o aspártico o de copolímeros que comprenden una mezcla de estos dos tipos de residuos de aminoácido. Los residuos considerados en estos pol ímeros son aquellos de aminoácidos que tienen la configuración D, L o D/L y están ligados por sus posiciones alfa o gama para el residuo glutamato o glutámico y alfa o beta para el residuo aspártico o aspartato. Los residuos preferidos de la cadena de poliaminoácido principal son aquellos que tienen la configuración L y un enlace de tipo alfa. De acuerdo con una modalidad aún más preferida de la invención, PO es un poliaminoácido formado por residuos aspárticos o residuos glutámicos, por lo menos una parte de estos residuos que son portadores de injertos que llevan por lo menos un grupo hidrofóbico GH. Estos poliaminoácidos son particularmente del tipo de aquellos descritos en la solicitud de patente PCT WO-A-00/30618. De acuerdo con una primera posibilidad, el (o los) OP de la formulación son definidos mediante la fórmula general (I) siguiente: (l) en la cual: · R1 representa un H, un alquilo lineal de 2 átomos de carbono a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 átomos de carbono a 10 átomos de carbono, un radical de bencilo, un residuo de aminoácido terminal, o -R4-[GH]; • R2 representa un H, un grupo acilo lineal de 2 átomos de carbono a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 átomos de carbono a 10 átomos de carbono, un piroglutamato o -R4-[GH]; • R3 es un H, o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que comprende: cationes metálicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio, cationes orgánicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende: • cationes con base de amina. • cationes con base de oligoamina. · cationes a base de poliamina (siendo particularmente preferida la polietilenimina). • cationes a base de aminoácido(s) seleccionado(s) ventajosamente en la clase que comprende los cationes a base de Usina o de arginina, - o los poliaminoácidos catiónicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende la polilisina o la oligolisina; • R4 representa un enlace directo o un separador a base de 1 a 4 residuos de aminoácido; • A representa independientemente un radical -CH2- (residuo aspártico) o -CH2-CH2- (residuo glutámico); · n/(n+m) se define como la tasa de injertado molar y su valor es suficientemente bajo para que PO puesto en solución en agua con pH = 7 y a 25°C, forma una suspensión coloidal de partículas submicrónicas de PO, de preferencia n/(n+m) está comprendido entre 1 a 25% molar y mejor aún entre 1 y 15% molar; · (n+m) se define como el grado de polimerización y varía de 10 a 000, de preferencia entre 50 y 300; • GH que representa un grupo hidrofóbico. En una modalidad preferida de la invención, la formulación se caracteriza porque el grupo hidrofóbico GH es emitido desde un precursor alcohólico seleccionado del grupo que comprende: octanol, dodecanol, tetradecanol , hexadecanol , octadecanol, oleilalcohol tocoferol o colesterol , y porque R4 representa un enlace directo. De acuerdo con una segunda modalidad , el (o los) PO de la formulación responden a una de las fórmulas generales (II) , (III) y (IV) siguientes: (IV) en las cuales: • GH representa un grupo hidrofóbico; • R30 es un grupo alquilo lineal de 2 átomos de carbono a 6 átomos de carbono; • R3 es un H o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que comprende: - cationes metálicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que com prende: sodio, potasio, calcio, magnesio, - cationes orgánicos seleccionados ventajosamente del subgrupo q ue comprende: • cationes a base de amina , • cationes a base de oligoamina, • cationes a base de poliamina (siendo particularmente preferida la polietilenimina), • cationes a base de aminoácido(s) seleccionado(s) ventajosamente de la clase que comprende cationes a base de Usina o de arginina - o los poliaminoácidos catiónicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende la p o I i I i s i n a o la oligolisina , • R50 es un grupo alquilo, dialcoxi o diamina de 2 átomos de carbono a 6 átomos de carbono; · R4 representa un enlace directo o un espaciador a base de 1 a 4 resid uos de am inoácido; • A representa independientemente un radical -CH2- (residuo aspártico) o -CH2-CH2- (residuo glutámico); • (n' + m') y n" se definen como el grado de polimerización y varían desde 1 0 hasta 1 000, de preferencia entre 50 y 300. Ventajosamente, los n grupos GH del PO representan, cada uno , independientemente unos de otros un radical monovalente de la fórm ula : (GH) en la cual: R5 representa un radical metilo (alanina), ¡sopropilo (valina), isobutilo (leucina), secbutilo (isoleucina), bencilo (fenilalanina); R6 representa un radical hidrofóbico que lleva de 6 a 30 átomos de carbono; I varía de 0 a 6. De acuerdo con una característica notable de la invención, todos o parte de los grupos hidrofóbicos R6 de los PO son seleccionados de manera independiente, del grupo de radicales que llevan: · un alcoxi lineal o ramificado que lleva de 6 a 30 átomos de carbono y que puede llevar por lo menos un heteroátomo (de preferencia O, N o S) o por lo menos una insaturación; • un alcoxi que lleva de 6 a 30 átomos de carbono y que tiene uno o varios carbociclos anillados y que contiene eventualmente por lo menos una insaturación o por lo menos un heteroátomo (de preferencia O, N o S); • un alcoxiarilo o un alriloxialquilo de 7 a 30 átomos de carbono y que puede llevar por lo menos una instauración o por lo menos un heteroátomo (de preferencia O, N o S). En la práctica y sin que esto sea limitativo, el radical hidrofóbico R6 del injerto del PO es emitido de un precursor alcohólico seleccionado del grupo que comprende: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleilalcohol, tocoferol o colesterol. Ventajosamente, la cadena principal del poliaminoácido es: ? un homopolímero de alfa-L-glutamato o de alfa-L-glutámico; ? un homopolímero de alfa-L-aspartato o de alfa-L-aspártico; ? o un copolímero de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato o de alfa-L-aspárt¡co/alfa-L- glutámico. De manera notable, la distribución de los residuos aspárticos y/o glutámicos de la cadena de poliam inoácidos principal del PO es tal que el pol ímero así constituido es ya sea aleatorio, ya sea del tipo de bloque , ya sea de ti po multibloque. De acuerdo con otra manera de definición, el PO en función en la formulación de acuerdo con la invención tiene una masa molar que se sitúa entre 2000 y 1 00000 g/mol, de preferencia entre 5000 y 40000 g/mol. De acuerdo con una variante, el PO de la formulación de acuerdo con la invención es portador de por lo menos un injerto de tipo polialquilén-glicol ligado a un residuo de glutamato o aspartato. Ventajosamente, este injerto es de tipo polialquilén-glicol y de la fórmula (V) siguiente: En la cual : R'4 representa un enlace directo o u n espaciador a base de 1 a 4 resid uos de aminoácido; X es un heteroátomo seleccionado del grupo que comprende oxígeno, nitrógeno o azufre; R7 y R8 representan, independientemente, un H, un alq uilo lineal de 1 a 4 átomos de carbono; n'" varía de 1 0 a 1 0000, de preferencia de 50 a 300.

En la práctica, el polialquilén-glicol es, por ejemplo, un polietilenglicol. Es adecuado, de acuerdo con la invención, que el porcentaje molar de injertado del polialquilén-glicol varíe de 1 a 30 %. Los poliaminoácidos de PO son además extremadamente interesantes por el hecho de que a una tasa de injertado ajustable, se dispersan en agua a un pH = 7.4 (por ejemplo con un tampón de fosfato) para dar suspensiones coloidales. Además, los PA tales como las proteínas, los péptidos o las moléculas pequeñas, se pueden asociar espontáneamente a las nanopartículas que comprenden estos poliaminoácidos de PO. Es conveniente comprender que los PO contienen funciones ionizables que son, de acuerdo con el pH de la composición, ya sea neutros (por ejemplo COOH), ya sea ionizados (por ejemplo COO). Por esta razón, la solubilidad en una fase acuosa es función directamente de la tasa de funciones ionizadas y por lo tanto del pH. En solución acuosa, en el caso de funciones carboxílicas, el contra ion puede ser un catión metálico tal como sodio, calcio o magnesio, o un catión orgánico tal como trietanolamina, tris(hidroximetil)-aminometano o una poliamina tal como polietilenimina. Los PO de tipo poliaminoácido, susceptibles de ser utilizados en la formulación de la invención, se obtienen, por ejemplo, mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Los poliaminoácidos estad ísticos pueden ser obtenidos mediante injertado del injerto hidrofóbico, preferiblemente funcionalizado por el espaciador, directamente en el pol ímero mediante una reacción clásica de acoplamiento. Los PO de poliaminoácidos de bloque o bloques múltiples puede ser obtenidos mediante polimerización secuencial de anhídridos de los N-carboxi-aminoácidos (NCA) correspondientes. Se prepara, por ejemplo, un poliaminoácido, homopoliglutamato, homopoliaspartato o un copolímero de glutamato/aspartato, de bloque, de multibloque o aleatorio, de acuerdo con los métodos clásicos. Para la obtención del poliaminoácido de tipo alfa, la técnica más común está basada en la polimerización de anhídridos de N-carboxi-aminoácidos (NCA), descrita por ejemplo en el artículo de Biopolymers, 1976, 15, 1869, y en el trabajo de H.R.Kricheldorf "Anhídridos de Alfa-Aminoácido-N-carboxi y Heterociclos Relacionados" Springer Verlag (1987). Los derivados de NCA son de preferencia los derivados de NCA-O-Me, NCA-O-Et o NCA-O-Bz (Me = metilo, Et = etilo y Bz = bencilo). Los polímeros son hidrolizados enseguida en las condiciones apropiadas para obtener el polímero en su forma ácida. Estos métodos están inspirados en la descripción dada en la patente FR-A-2 801 226 de la solicitante. Un cierto número de polímeros utilisables de acuerdo con la invención, por ejemplo, del tipo poli(alfa-L- aspártico), poli(alfa-L-glutámico), poli(alfa-D-glutámico) y poli(gama-L-glutámico) de masas variables están disponibles comercialmente. El poliaspártico de tipo alfa-beta se obtiene mediante condensación del ácido aspártico (para obtener una polisuccinimida) seguido de una hidrólisis básica (cf. Tomida et al., Polymer 1997, 38, 4733-36). El acoplamiento del injerto con una función ácida del polímero se realiza fácilmente por reacción del ácido poliamino en presencia de una carbodümida como agente de acoplamiento y, opcionalmente , un catalizador tal como la 4-dimetilaminopiridina y en un solvente a propiado tal como di metilformam ida (DMF), la N-metil pirrolidona ( N MP) o dimetilsulfóxido (DMSO). La carbodümida es por ejem plo la diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida . La tasa de injertado se controla qu ímicamente mediante la estequiometría de los constituyentes y los reactivos en el momento de la reacción. Los injertos hidrofóbicos funcionarizados por un espaciador son obtenidos mediante acoplamiento peptíd ico clásico o mediante condensación directa por catálisis ácida. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos de la técnica . Para la síntesis del copol ímero de bloque o de bloques m últiples, se utilizan los derivados de NCA sintetizados preferiblemente con el i njerto hidrofóbico. Por ejemplo, el derivado NCA-hidrofóbico se copolimeriza con NCA-O-Bz, después se q uita por hidrólisis selectivamente de los radicales bencilo. Para la preparación , el PO o el PA puede estar en la forma sólida (de preferencia en polvo) o en forma líquida (de preferencia en suspensión acuosa coloidal). La asociación de PA/PO significa en el sentido de lo presente expuesto que el (o los) PA está(n) asociado(s) al (a los) pol ímero(s) PO [por ejem plo uno o varios poliaminoácido(s)] por uno o varios enlaces diferente(s) a un (o los) enlace(s) químico(s), covalente(s). Las técnicas de asociación de uno o varios PA a los PO , de acuerdo con la invención , se describen particularmente en la solicitud de patente WO-A-00/3061 8. Consisten en incorporar por lo menos un PA en el med io líquido que contiene las nanopartículas de PO, de manera de obtener una suspensión coloidal de nanopartículas cargadas en o asociadas con uno o varios PA. En el sentido de la invención, el término "iones multivalentes" designa iones divalentes, iones trivalentes, iones tetravalentes y mezclas de estos iones. En el caso donde el PO presenta grupos Gl aniónicos, los iones multivalentes son cationes multivalentes, de preferencia cationes divalentes, más preferiblemente aún seleccionados del grupo que comprende: Mg+2, Ca+2, Zn+2, Fe+2, Cu+2 o sus mezclas, y/o cationes trivalentes, más preferiblemente aún seleccionados del grupo que comprende: ? 3, Fe+3 o sus mezclas. Es posible además tener iones multivalentes, la formulación de acuerdo con la invención contiene iones (por ejemplo cationes) monovalentes, eventualmente activos en la agregación de las nanopartículas en micropartículas. Estos iones multivalentes son introducidos en la formulación de la invención, de preferencia en la forma de solución salina (orgánica o mineral) acuosa, por ejemplo una solución de sulfato, cloruro, acetato, gluconato o glutamato (u otro aminoácido aniónico) de cationes multivalentes. Para mejorar su estabilidad, es preferible que la formulación comprenda por lo menos un estabilizador seleccionado del grupo que comprende: ? nanopartículas de por lo menos un polímero PO, siendo PO un copolímero amfif'ilo biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH) y de grupos idrof ílicos ionizables (Gl), y ionizados por lo menos en parte, y que forman espontáneamente una suspensión coloidal de nanopartículas en el agua, un pH = 7.0, en condición isotónica; ? polialquilén glicoles, de preferencia polietilenglicoles; ? copolialquilenglicoles, de preferencia los copolímeros de etilenglicol, propilenglicol (de tipo Poloxamer o Pluronic o Lutrol); ? polímeros celulósicos y sus derivados, de preferencia carboxialquil-celulosas (por ejemplo carboximetilcelulosas) o alquilcelulosas (por ejemplo metilcelulosas); — ésteres de sorbitán y ácido(s) graso(s), de preferencia los ésteres de polioxialquilén (por ejemplo etilén) glicol y de por lo menos un ácido (por ejemplo ácido oleico), de tipo Tween o polisorbato; ? tensoactivos a base de fosfolípidos y de polialquilén glicoles, de preferencia polietilenglicoles; ? sacáridos hidrogenados o no, tales como trehalosa, sorbitol, manitol, sacarosa; ? polioles tales como propilenglicol o glicerol; ? gelatinas de preferencia hidrolizadas; — » (co)polímeros nitrogenados, de preferencia del grupo que comprende poliacrilamidas, poli-N-vinilamidas, polivinilpirrolidonas (PVP) y poli-N-vinil-lactamas; ? alcoholes polivinílicos (APV); -? y sus mezclas. Uno de los estabilizadores preferidos de acuerdo con la invención está formado por nanoparticulas de por lo menos un polímero PO, idéntico (de preferencia) o diferente al que constituye las micropartículas. La cantidad de estabilizador utilizado en la formulación está comprendida, de preferencia, entre 0.01 y 10% en peso, y más preferiblemente aún entre 0.1 y 5% en peso. Cuando se trata de estabilizadores que comprenden nanoparticulas, son utilizados ventajosamente en la formulación a razón de 1.5 a 3.5% en peso, por ejemplo de 2.0 a 3.0 (=2.5)% en peso. En lo que se refiere al PA, se selecciona de preferencia del grupo que comprende: proteínas, glicoproteínas, proteínas ligadas a una o varias cadenas de polialquilenglicol [de preferencia polietilenglicol (PEG): "proteínas PEGlizadas"], péptidos, polisacáridos, liposacáridos, oligonucleótidos, polinucleótidos y sus mezclas, y, más preferiblemente aún, de subgrupo de eritropoyetina, ocitocina, vasopresina, hormona adrenocorticotrope, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento plaquetario (PDGF), factores de crecimiento hematopoyéticos y sus mezclas, factores VIII y IX, hemoglobinas, citocromos, albúminas, prolactina, hormona de liberación de la hormona luteinizante (LHRH), antagonistas de la LHRH, agonistas de la LHRH, hormonas de crecimiento (GH) humanas, porcinas o bobinas, hormona de liberación de la hormona de crecimiento, insulina, somatostatina, glucagón, interleucinas o sus mezclas (IL-2, IL-1, IL-12), interferones-a, ß o ?, gastrina, tetragastrina, pentagastrina, urogastrona, secretina, calcitonina, encefalinas, endorfinas, angiotensinas, hormona de liberación de la tirotropina (TRH), factores de necrosis tumoral (TNF), factores neurotrópicos (NGF), factor de crecimiento granulocitario (G-CSF), factor de crecimiento de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento de macrófagos (M-CSF), heparinasa, proteina morfogénica ósea (BMP), péptido auricular natriurético (hANP), péptido como glucagón 1 (GLP-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), antígeno recombinante de hepatita G (rHBs), renina, citocinas, bradiquinina, bacitracinas, polimixinas, colistinas, tirocidina, gramicidinas, ciclosporinas y análogos sintéticos, modificaciones y fragmentos de enzimas activos farmacéuticamente, de citocinas, anticuerpos, antígenos y vacunas. De acuerdo con una variante, el PA es una molécula orgánica hidrofóbica pequeña, hidrofílica o amfifila del tipo de aquellas pertenecientes a la familia de las antraciclinas, de taxoides o de camptotecinas o del tipo de aquellas pertenecientes a la familia de los péptidos tales como la leuprolida o la ciclosporina y sus mezclas. En el sentido de la presente exposición, una molécula pequeña es particularmente una molécula pequeña no proteínica, por ejemplo de aminoácidos. De acuerdo con otra variante, el PA se selecciona ventajosamente de entre por lo menos una de las familias de sustancias activas siguientes: los agentes de tratamiento contra el abuso del alcohol, los agentes de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, los anestésicos, los agentes de tratamiento de la acromegalia, los analgésicos, los antiasmáticos, los agentes de tratamiento de alergias, los agentes anticancerosos, los antiinflamatorios, los anticoagulantes y antitrombóticos, los anticonvulsivos, los antiepilépticos, los antidiabéticos, los antieméticos, los antiglaucomatosos, los antihistamínicos, los antünfecciosos, los antibióticos, los antifúngicos, los antivirales, los antiparkisonianos, los anticolinérgicos, los antitusivos, los inhibidores de la anhidrasa carbónica, los agentes cardiovasculares, los hipolipemiantes, los antiarrítmicos, los vasodilatadores, los antianginosos, los antihipertensivos, los vasoprotectores, los inhibidores de colinestarasa, los agentes de tratamiento de desórdenes del sistema nervioso central, los estimulantes del sistema nervioso central, los anticonceptivos, los promotores de fecundidad, los inductores e inhibidores del trabajo uterino, los agentes de tratamiento de la mucoviscidosa, los agonistas de los receptores de la dopamina, los agentes de tratamiento de la endometriosis, los agentes de tratamiento de disfunciones eréctiles, los agentes de tratamiento de la fertilidad, los agentes de tratamiento de trastornos gastrointestinales, los inmunomoduladores y los inmunosupresores, los agentes de tratamiento de trastornos de la memoria, los antimigrañosos, los relajantes de músculos, los análogos de nucleósidos, los agentes de tratamiento de osteoporosis, los parasimpatomiméticos, las prostaglandinas, los agentes psicoterapéuticos, los sedantes, los hipnóticos y tranquilizantes, los neurolépticos, los ansiolíticos, los psicoestimulantes, los antidepresivos, los agentes de tratamientos dermatológicos, los esteroides y las hormonas, las anfetaminas, los anoréxicos, los anti-dolores no analgésicos, los antiepilépticos, los barbitúricos, las benzodiacepinas, los hipnóticos, los laxantes, los psicotrópicos y todas las asociaciones de estos productos. En el plano cuantitativo, es particularmente interesante que la fraction de la masa de PA no asociada con las partículas micrométricas [PA no asociado] en % en peso sea tal que: - [PA no asociado]<1 ; - De preferencia [PA no asociado]<0.5. De acuerdo con una variante, el PA puede ser la hormona de crecimiento humana recombinante hGH, por lo que la dosis está comprendida, por ejemplo, entre 0.2 y 2 mg/kg, y de preferencia entre 0.5 y 1 mg/kg. De acuerdo con otra variante, el PA puede ser insulina, donde la dosis está comprendida, por ejemplo, entre 0.2 y 2 Ul/kg, y de preferencia entre 0.5 y 1 Ul/kg. De acuerdo con otra variante, el PA puede ser interferón a-2b, donde la dosis está comprendida, por ejemplo, entre 20 y 100 pg/kg, y de preferencia entre 40 y 80 pg/kg. Ventajosamente, la formulación de acuerdo con la invención se destina a la preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, mucosa, subcutánea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral o intratumoral, incluso por vía oral, nasal, pulmonar, vaginal u ocular. De acuerdo con otro de sus aspectos, la invención tiene por objetivo un procedimiento de preparación de la formulación antes aludida. Este procedimiento de preparación de la formulación está caracterizado porque consiste esencialmente de: a. Efectuar o preparar una suspensión coloidal de nanopartículas de por lo menos un PO; b. Eventualmente, una mezcla de esta suspensión coloidal de nanopartículas de PO con por lo menos un PA, de preferencia en solución acuosa; c. Eventualmente filtrar la suspensión así obtenida; d. Agregar iones multivalentes (de preferencia en la forma de sal(es)) de polaridad opuesta a aquella de los grupos Gl del polímero PO, dichos iones multivalentes que son agregados en tal cantidad que la proporción r, responde a la fórmula: [IM]' r = nx-, — ¿ [Gl] donde: - n es la valencia de dichos iones multivalentes; - [IM] es la concentración molar de iones multivalentes; [Gl] es la concentración molar de grupos ionizables Gl; está comprendida entre 0.3 y 10, de preferencia entre 0.6 y 5.0 y, más preferiblemente aún, entre 0.80 y 3.0; e. Según sea necesario ajustar el pH o la osmolaridad (por ejemplo mediante diafiltration). La preparación de las formulaciones líquidas de acuerdo con la invención se realiza ventajosamente a temperatura ambiente (25°C por ejemplo). Diferentes modos de asociación del PA con las micropartículas son concebibles (vide supra). Es ventajoso que el PA se asocie con las nanopartículas destinadas a formar las micropartículas por agregación. Es igualmente posible asociar el PA directamente a las micropartículas. Se pueden combinar los dos métodos de asociación. Para la asociación a las nanoparticulas o a las micropartículas, el PA está, ventajosamente, en la forma de suspensión o de solución acuosa para la mezcla con la suspensión coloidal de nanoparticulas o de micropartículas de PO. De acuerdo con una variante, el PA en forma sólida podría ser incorporado después de mezclar con la suspensión de nanoparticulas o de micropartículas. La presente invención enfoca igualmente los productos sólidos, derivados de nanoparticulas y de micropartículas de PO contenido en la formulación de acuerdo con la invención. En la práctica, estos productos derivados pueden estar constituidos particularmente de polvos, geles, implantes o películas, entre otros. Así, la invención contempla productos derivados de la formulación de acuerdo con la invención, tomados como tales, cualquiera que sea su procedimiento de obtención. El producto derivado en cuestión está caracterizado así porque está en forma no líquida y porque comprende partículas micrométricas de polímero (PO), i. el polímero PO - que es un copolímero amfifilo, biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH) y de grupos hidrofílicos ionizables (Gl), - y que forman espontáneamente una suspensión coloidal de nanoparticulas en el agua, con pH = 7.0, en condición isotónica, ii. Dichas partículas que son aptas para asociarse espontáneamente de manera no covalente con por lo menos un PA, con pH = 7.0, en condición isotónica; estas partículas micrométricas de PO que tienen un tamaño, medido en una prueba T, comprendido entre 0.5 y 100 pm, de preferencia entre 1 y 70 pm , de preferencia entre 2 y 40 pm; y por que contiene derivados de iones multivalentes, de preferencia iones divalentes, de polaridad opuesta a aquella de los grupos Gl del polímero, la cantidad r, que responde a la fórmula: donde: - n es la valencia de dichos iones multivalentes; - [I M] es la concentración molar de iones multivalentes; - [Gl] es la concentración molar de grupos ionizables Gl ; está comprendida entre 0.3 y 10, de preferencia entre 0.6 y 5.0 y, más preferiblemente aún , entre 0.80 y 3.0; Este producto derivado puede estar constituido, por ejemplo, por un polvo o por un gel. La presente invención contempla igualmente estos productos derivados de la formulación de acuerdo con la invención como productos intermedios surgidos de la preparación de la formulación de acuerdo con la invención. Esto último concierne también a un procedimiento de preparación de por lo menos uno de estos productos derivados. Este procedimiento está caracterizado porque consiste esencialmente en secar la suspensión de partículas micrométricas, de manera de obtener una forma sólida, de preferencia un polvo de partículas micrométricas, susceptible de ser almacenado o administrado. Tales productos derivados dan acceso a otra vía de preparación de la formulación de acuerdo con la invención. El procedimiento de acuerdo con esta vía está caracterizado porque consiste esencialmente de: - poner en acción por lo menos un producto derivado, obtenido mediante el procedimiento tal como se define anteriormente; - y mezclar este producto derivado con agua o una solución acuosa S de reconstitution. En este último caso, la formulación farmacéutica líquida se reconstituye extemporáneamente por mezcla del producto derivado sólido (por ejemplo polvo) en agua o en S antes de la inyección.. Por ejemplo, S puede comprender una solución acuosa. Se puede tratar simplemente de agua para preparación es injectables. S puede contener además eventualmente: - por lo menos un tampón o por lo menos una sal injectable (tampón de fosfato, tampon de citrato, cloruro de sodio) en concentration, por ejemplo, entre 0.001 M y 0.1 M, de preferencia entre 0.005 M y 0.02 M, este tampón o esta sal injectable permite ajusfar el pH de la solution; - por lo menos un tenso activo inyectable, de preferencia de tipo polisorbato tal como Tween® 20 y Tween® 80 o de tipo poloxamer tal como lutrol® F38, lutrol® F68 o lutrol® F127 en concentraciones comprendidas, por ejemplo, entre 0.01 % y 2%, de preferencia entre 0.05 y 0.5%. S puede contener además agentes densificantes tales como sacáridos, a saber sacarosa, D-manitol o trehalosa, en concentraciones comprendidas entre 0.1 % y 10%, de preferencia entre 0.5 y 5%. La solution de reconstitution puede contener igualmente un pol ímero para aumento de viscosidad inyectable seleccionado del grupo que comprende polisacáridos, polímeros sintéticos (por ejemplo carboximetilcelulosa sódica), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polialquilenglicoles (por ejemplo polietilenglicoles) y sus mezclas. Más generalmente, los excipientes susceptibles de ser agregados a la formulación de acuerdo con la invención, son, por ejemplo, los antimicrobianos, los tampones, los antioxidantes, los agentes que permiten ajustar la isotonicidad que son conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, se puede hacer referencia al trabajo: Inyectable Drug Development, P. K. Gupta et al., Interpharm Press, Denver, Colorado, 1999.

De acuerdo con la invención, es concebible prever una filtration esterilizante en filtros de porosidad igual, por ejemplo, de 0.2 µ?t?, de la suspensión líquida de nanopartículas de la cual son emitidas las partículas micrométricas de la formulación de acuerdo con la invención. La agregación en condiciones estériles de acuerdo con los modos de preparación descritos más adelante permiten también inyectar directamente la formulación a un paciente. Entre las cualidades primordiales de la formulación de acuerdo con la invención figura su capacidad de liberar de manera prolongada el PA en una duración superior a aquella obtenida con una suspensión coloidal de nanopartículas del mismo polímero, administrada al mismo pH, a la misma concentración de proteína como de polímero. La presente invención tiene igualmente por objetivo un procedimiento de preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, mucosa, subcutánea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral, o ¡ntratumoral, incluso por vía oral, nasal, pulmonar, vaginal u ocular, caracterizado porque consiste esencialmente de realizar por lo menos una formulación tal como se define anteriormente per se o una formulación obtenida mediante el procedimiento también definido anteriormente, o cualquier producto derivado o cualquier precursor de dicha formulación. Ya sea que la formulación de acuerdo con la invención sea de preferencia farmacéutica, no excluye todas las formulaciones cosméticas, dietéticas o fitosanitarias que comprenden por lo menos un PO tal como el definido anteriormente y por lo menos un PA. La invención se refiere igualmente a un método de tratamiento terapéutico que consiste esencialmente de administrar la formulación tal como se describe en la presente exposición, por vía parenteral, por mucosa, subcutánea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, incluso por vía oral, nasal, pulmonar, vaginal u ocular. Según una variante particular de la invención, este método de tratamiento terapéutico consiste en administrar la formulación tal como la descrita anteriormente mediante inyección parenteral, subcutánea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral o intratumoral, de preferencia de manera en que forme un depósito en el sitio de la inyección.

La invención será comprendida mejor y sus ventajas y variantes de realización se destacarán bien de los ejemplos que siguen y que describen la síntesis de los PO formados por los poliaminoácidos injertados por un grupo hidrofóbico, su transformación en sistema de liberación prolongada de PA, a saber en formulación de acuerdo con la invención (suspensión coloidal acuosa estable) y la demostración de la capacidad de tal sistema no solamente para asociarse a una proteína terapéutica , sino sobre todo a un gelante/reticulador para liberar de manera muy prolongada, in vivo, la proteína terapéutica. Breve Descripción de la Figura Unica La Figura única es u na curva que da el realargamiento de la hormona de crecimiento humana [hGH en % en relación con la concentración total inyectada] en función del tiempo [t en min] en la prueba L conforme esté incl uida en las nanopartículas de PO [¦ nanopartículas 23 mg/g] o las micropartículas de PO [? micropartículas 73 mg/g] preparadas de acuerdo con el Ejemplo 8. Ejemplos Ejemplo 1 ; Polímero amfifilo PO. S íntesis de un poliglutamato injertado mediante alfa-tocoferol de origen sintético. Se sol ubilizan 1 5 g de un ácido alfa-L-poliglutámico (de masa equivalente a aproximadamente 16900 Da con relación a un estándar de polioxietileno y obtenido mediante polimerización de NCAGluOMe seguido por una hidrólisis como se describe en la solicitud de patente FR-A-2 801 226) en 288 mi de dimetilformamida ( DM F) en calentam iento hasta 80°C justo a la solubilización del pol ímero. Se enfría la solución a 1 5°C y se agregan sucesivamente 2.5 g de D, L-alfa-tocoferol (>98% obtenido de Fluka®) de preferencia solubilizado en 8 mi de DM F, 280 mg de 4-dimetilaminopiridina de preferencia solubilizada en 1 mi de DMF y 1 .6 g de diisopropilcarbodiimida de preferencia solubilizada en 6 mi de DMF. Después de 3 h en agitación, el medio de reacción se vierte en 1200 mi de agua que contiene 15% de cloruro de sodio y de ácido clorhídrico (pH = 2). El polímero precipitado se recupera enseguida mediante filtración, se lava con ácido clorhídrico 0.1 N, con agua y con éter diisopropílico. El polímero se seca en seguida en la estufa bajo vacío a 40°C. Se obtiene un rendimiento del orden de 90%. La masa molar medida mediante cromatografía de exclusión estérica es de 15500 con relación a un estándar de polioxietileno. La tasa de tocoferol injertado, estimado por espectroscopia de RMN del protón, es de 5.1% molar. Se obtiene una suspensión de nanoparticulas del polímero en el solubilizante en agua después de ajustar el pH (neutralización de carboxilatos) a 7±1. Ejemplo 2: Preparación de 100 g de una suspensión coloidal de nanoparticulas del polímero PO caraqado en hGH. 2.1: Preparación de una solución coloidal de polímero amfifilo PO: Se deja una noche el poímero en solución, se controla con termostato a 37°C. Se pesan 35.3 g de polímero PO del Ejemplo 1. Se diluye con 26.65 g de agua estéril para inyección (para un polímero PO de 28.4 mg/g). La solución de polímero se mantiene en agitación magnética. Se ajusta la osmolaridad de la solución a 300±20 mOsm introduciendo 1.89 g de una solución acuosa de NaCI 5.13 M (30% p/p). Se ajusta el pH a 7.4 ± 0.2 mediante adición de 0.38 g de una solución de NaOH 1 N.

Se obtienen así 64.22 g de una solución de pol ímero con 1 5.61 mg/g . 2.2: Asociación de la proteína al polímero: Se descongela a 25°C durante 90 min la solución de hormona de crecimiento humana recom binante, indicada hG H . Se agregan en seguida 35.92 g de solución de hGH (concentrada 3.9 mg/g) a 64. 1 5 g de la solución coloidal de pol ímero preparado anteriormente, bajo agitación. La solución cargada en proteína se deja en maduración d urante 2 h a tem peratura am biente. Después se filtra por 0.8-0.2 pm y se deja en maduración durante una noche . Se obtienen así 1 00 g de una formulación lista para ser inyectada, que contiene 1 .4 mg/g de hGH y 10 mg/g de polímero de tipo PO. Ejem plo 3: Preparación de una suspensión de partículas micrométricas con la ayuda de MqCI?. La suspensión se prepara a partir de una solución preparada de acuerdo con el Ejemplo 2, se ajusta el pH y la osmolaridad y a 1 0.0 mg/g de PO. a . Floculación de la solución mediante adición de una solución de MgCI2 1 M, con agitación (posición No. 9) con una jeringa de empuje que entrega aproximadamente 20 ml/h. El rendimiento que caracteriza la adición de cationes es aquí igual a 3.36. Se obtiene una solución de 8.51 mg/g de PO.

Centrifugación durante 25 min a 2500 rpm. El sobrenadante limpio está a 646 mOsm. Lavado del residuo con 1/8 del volumen de la solución de partida de agua estéril y centrifugación durante 10 min a 2500 rpm. El sobrenadante cristalino está a 350 mOsm. Centrifugación durante 10 min a 2500 rpm. Esta formulación se caracteriza como sigue: Ejemplo 4: Obtención de una suspensión de micropartículas fabricadas con CaCI? y con disminución de pH. La suspensión se prepara a partir de una solución preparada de acuerdo con el Ejemplo 2, que tiene por características finales 1.2 mg/g de gGH y 25.9 mg/g de PO. a) Ajuste a pH = 5.52 de la formulación inicial con HCI 0.1 N, con agitación (600 rpm) con una jeringa de empuje que entrega aproximadamente 70 ml/h. b) Floculación del polímero mediante adición de una solución de CaCI2 1 M con agitación (600 rpm) con una jeringa de empuje que entrega aproximadamente 39 ml/h. El rendimiento que caracteriza la adición de cationes s aquí igual a 1 .68. c) Centrifugación durante 8 min a 2500 rpm. El sobrenadante cristalino está a pH = 4.73 y a 653 mOsm . d) Lavado del residuo con 1 /8 del volumen de la solución de partida de agua milli-Q y centrifugación durante 4 min a 2500 rpm. El sobrenadante cristalino está a pH = 4.72 y a 378 mOsm . e) Concentración del residuo mediante centrifugación durante 4 min a 2500 rpm con el fin de obtener una suspensión concentrada. La suspensión obtenida tiene las caracerísticas siguientes: Ejemplo 5: Obtención de una suspensión de micropartículas fabricadas con CaCI,. La suspensión se prepara a partir de una solución preparada de acuerdo con el Ejemplo 2, que tiene por características finales 1 .2 mg/g de gGH y 26.1 mg/g de PO. a) Floculación de la formulación inicial mediante adición de una solución de CaCI2 1 M con agitación (600 rpm) con una jeringa de empuje que entrega aproximadamente 40.3 ml/h justo hasta alcanzar un rendimiento r = 3.36. Se obtiene una formulación que comprende 0.93 mg/g de hGH para 20.28 mg/g de PO. Centrifugación durante 4 min a 2500 rpm . El sobrenadante cristali no está a pH = 6.34 y a 832 mOsm . c) Lavado del resid uo con 1 /3 del volumen de la solución de partida de agua milli-Q y centrifugación dura nte 8 mi n a 2500 rpm . El sobrenadante cristalino está a pH = 6.56 y a 334 mOsm . d) Concentración del residuo por centrifugación durante 8 mi n a 2500 rpm con el fi n de obtener una suspensión concentrada. Esta form ulación está caracterizada como sigue: Ejemplo 6: Obtención de una suspensión de micropartículas fabricadas con ZnCJ¿. La suspensión se prepara a partir de una solución preparada de acuerdo con el Ejemplo 2, q ue tiene por características finales 1 .4 mg/g de gG H y 1 0.00 mg/g de PO. a) Floculación de la solución mediante adición de una solución de ZnCI2 1 M , con agitación (posición No. 9) con una jeringa de em puje que entrega aproximadamente 20 ml/h justo a la obtención de un rendimiento r = 1 .54. Se obtiene una solución de 9.64 mg/g de PO . b) Centrifugación durante 4 min a 2500 rpm . El sobrenadante cristalino está a 389 mOsm . c) Lavado del residuo con 1 /3 del volumen de la solución de partida de agua estéril y centrifugación durante 8 min a 2500 rpm . El sobrenadante cristalino está a 237 mOsm . d) Lavado del residuo con 1 /8 del volumen de la solución de partida de NaCI 0.9%. Centrifugación durante 8 min a 2500 rpm . El sobrenadante cristalino está a 253 mOsm . La concentración teórica calculada es entonces de 64.97 mg/ml . Esta form ulación está caracterizada como sigue: Ejem plo 7: Obtención de una suspensión de micropartículas fabricadas con MaCI? en las condiciones 1 . La suspensión se prepara a partir de una solución preparada de acuerdo con el Ejem plo 2, que tiene por características finales 0.48 mg/g de gGH y 23.05 mg/g de PO, ajustada en pH y osmolaridad . a) Dilución a 1 0.0 mg/g con NaCI 0.9%. b) Floculación de la solución mediante adición de una sol ución de MgCI2, 6 H20 , 1 M, con agitación (posición No. 1 0), con una jeringa de empuje que entrega aproximadamente 20 ml/h justo a la obtención de un rendimiento r = 6.93. Se obtiene una solución de 8.59 mg/g de PO. Centrifugación durante 10 min a 2500 rpm. El sobrenadante cristalino está a 654 mOsm. Lavado del residuo con 1 /7 del volumen de la solución de partida de agua estéril y centrifugación durante 1 0 min a 2500 rpm. El sobrenadante cristalino está a 291 mOsm. Esta formulación está caracterizada como sigue: Ejemplo 8: Obtención de una suspensión de micropartículas fabricadas con MqCU en las condiciones 2. La suspensión se prepara a partir de una solución preparada de acuerdo con el Ejemplo 2, que tiene por características finales 1 .33 mg/g de gGH y 10.10 mg/g de PO, ajustada en pH y osmolaridad . a) Floculación de la en presencia de un barrido de nitrógeno mediante adición de una solución de MgCI2, 6 H20, 2 M, burbujear nitrógeno con agitación (500 rpm), con una bomba entrega aproximadamente 8 ml/min hasta la obtención de un rendimiento r = 1 0.01 . Se obtiene una solución de 8.98 mg/g de PO a 914 mOsm. b) Maduración de 3 h con agitación. c) Utilización de un módulo Microza (UJP-0047R - Pall) de superficie específica igual a 0.02 m. Este módulo ha sido acondicionado previamente (eliminación del glicerol y de etanol por remojo en agua), despirogenizado (NaOH 7% después enjuague con agua) y en autoclave. d) Acondicionamiento del módulo con una solución de MgCI2 900 mOsm. e) Lavado con 1.04 veces el volumen de la formulación floculada de agua estéril que se agrega a razón de 8 ml/min con el fin de mantener el volumen global constante. La circulación se asegura con una bomba a 25% de su potencia, manteniendo una presión de 0.3 bar. Esta etapa dura 3 h. El filtrado cristalino está en 459 mOsm al final. f) Utilización de un módulo Microza (0.02 m2) donde se asegura la circulación con una bomba a 25% de su potencia. Concentration con un rendimiento de penetración de 4.4 ml/min. Esta etapa dura 160 min. El filtrado está a 324 mOsm al final. Esta formulación, que es una suspensión fluida y blanca, tiene las características siguientes: Osmolaridad 329 mOsm [Mg] 6.8 mg/g [Micropartículas] 43.6 mg/g [hGH] 4.56 mg/g r (según prueba M) 2.30 Tr (según prueba L) 16 h daPp (según prueba D) 0.15 Ejemplo 9: Obtención de una suspensión estable de micropartículas fabricadas con MqCI? en las condiciones 3. a) Preparación de una solución de PO preparada de acuerdo con el Ejemplo 2, denominada a continuación formulación inicial de hGH 1.4 mg/g/ PO 10 mg/g. Una solución de hormona de crecimiento humana recombinante se descongela durante 2 h a 25°C ([hGH] = 3.9 mg/ml, pH = 7.2, 330 mOsm). El polímero PO se diluye y ajusta (300 mOSM, pH = 7.4, 1536 mg/g). La solución de hGH se vierte sobre el polímero, después la mezcla de hGH/PO (1.4/10 mg/g) se desgasifica. La asociación se realiza una noche a temperatura ambiente.

PO M (PO) 2317.90 g pH = 7.4 - 300 mOsm [PO] 15.61 mg/g hGH M (hGH) 1302.30 g [hGH] 3.9 mg/g Formulación inicial M 3497.00 g [hGH] 1.35 mg/g [PO] 10.01 mg/g b) Preparación de las micropartículas hGH 5 mg/g / Mg micropartículas 40 mg/g. La formulación inicial se flocula mediante la adición controlada de MgCI22 M con un rendimiento r = 9.01, después el conjunto se deja reposar durante 1 h (maduración). La suspensión se lava con agua hasta alcanzar una osmolaridad de aproximadamente 300 mOsm mediante microfiltración tangencial (módulo Microza de Pall con una superficie especifica de 0.32 m2). Se concentra después hasta alcanzar una concentración de PO comprendida entre 38 y 41 mg/g.

Formulación inicial M 3458.4 g [hGH] 1.399 mg/g [PO] 10.01 mg/g Floculación M (MgCI2, 2M) 457.6 g Gasto 8.47 g/min M (suspensión) 3883.4 g [PO] 8.84 mg/g Osmolaridad 942 mOsm Lavado M (H20) 4241 g Gasto 42.43 mg/min Osmolaridad 330 mOsm Concentración M (filtrado) 3157 g Gasto 39.46 mg/min M (micropartículas 713.8 g concentradas) [hGH] 5.28 mg/g [PO] 50.9 mg/g Dilución M (MgCI2, 0.1 M) 179.9 g M (micropartículas 893.7 g concentradas) [hGH] 4.22 mg/g [PO] 40.65 mg/g c) Preparación de la formulación mixta hGH 5 mg/g / Mg micropartículas 40 mg/g /PO 23 mg/g. Las micropartículas son estabilizadas mediante la adición de polímero tipo PO en su forma liofilizada. El liofilizado es agregado a la suspensión en agitación. El conjunto se sujeta al vacío (30 mbar) y en agitación hasta el día siguiente.

Suspensión M (micropartículas concentradas) 872.5 g PO liofilizado [H20] 10.125% M agregado 23.175% Formulación final M 895.68 g [hGH] 4.11 mg/g [PO en micropartículas] 39.60 mg/g [PO agregado] 23.00 mg/g PH 6.4 Osmolaridad 409 mOsm [Mg] 4.0 g/l r (según prueba M) 0.94 daPp (según prueba D) 0.14 Tr (según prueba L) 30.56 h Ejemplo 10: Preparación de partículas micrométricas secas cargadas en hGH a partir de una suspensión de micropartículas mediante un primer modo de ejecución del procedimiento de acuerdo con la invención. En primer lugar se fabrica una suspensión de micropartículas cargadas en hGH en las condiciones descritas en las etapas a) a e) del Ejemplo 8 (floculación, maduración, lavado). La suspensión se lava hasta la obtención de una osmolaridad de 280 mOsm aproximadamente. La suspensión con aproximadamente 10 mg/g de polímero se liofiliza enseguida en un aparato de tipo Bioblock ALPHA 1-4 LSC después de haber sido congelada en nitrógeno líquido durante 76 h. Reconstitution y caracterización de la suspensión: A 40 mg de polvo se agrega 1 mi de agua PPI. La solución se agita manualmente durante algunos segundos hasta un mojado homogéneo del polvo. La solución se deja en reposo durante aproximadamente 10 min. Se homogeniza algunos segundos mediante agitación manual y se aspira con ayuda de una aguja 21 G. Se obtiene así 1 mi de una solución lista para inyectar.

Las características de la suspensión se describen a continuación: Ejemplo 11: Preparación de partículas micrométricas secas de polímero cargadas en hGH a partir de una suspensión de micropartículas mediante un segundo modo de ejecución del procedimiento de acuerdo con la invención. En primer lugar se fabrica una suspensión de micropartículas cargadas en hGH en las condiciones descritas en las etapas a) a e) del Ejemplo 8 (floculación, maduración, lavado). La suspensión se lava hasta la obtención de una osmolaridad de 280 mOsm aproximadamente. La suspensión con aproximadamente 10.0 mg/g de polímero se seca en seguida en un aparato de atomización de tipo Buchi B290. La solución líquida es aspirada a una velocidad de 5 ml/min y nebuiizada mediante un tubo de pulverización alimentado con nitrógeno (7 bars - 500 1/h). El gasto de aspiración (aire de secado) es de 40 mVh. La temperatura de entrada se mantiene a 90°C, lo que induce en estas condiciones una temperatura de salida de 45°C. En estas condiciones, el tamaño de las partículas obtenidas (según la prueba T2) es de D(0, 5) = 5 pm (50% del volumen está ocupado por partículas que tienen un diámetro de <5 pm). Reconstítution v caracterización de la suspensión: Se agrega 1 mi de agua PPI a 30 mg de polvo. La solución se agita manualmente durante algunos segundos hasta un mojado homogéneo del polvo. La solución se deja en reposo durante aproximadamente 10 min. Se homogeniza algunos segundos mediante agitación manual y se aspira con la ayuda de una aguja 21G. Se obtiene así 1 mi de una solución lista para inyectar. Las características de la suspensión se describen a continuación.

Ejemplo 12: Farmacocinética de hGH en perro después de invección subcutánea de diversas formulaciones a base de poliaminoácidos amfifilos en forma de nanopartículas y microparticulas. 12 perros Beagle simples (pesos de 7 a 10 kg) fueron tratados con las formulaciones siguientes: La hGH corresponde a una solución de hormona de crecimiento humana recombinante ([hGH] = 4 mg/ml, pH = 7.2, 330 mOsm).

La formulación 1 se prepara de acuerdo con el Ejemplo 2 y la formulación 2 de acuerdo con el Ejemplo 7. La hGH se dosifica mediante una prueba ELISA (paquete DSL 10-1900). Los datos farmacológicos se reagrupan en la Tabla siguiente: donde: - Cmax es la concentración de suero máxima en hGH. - T>5 ng/ml es el tiempo o la concentración de suero en hGH es superior a 5 ng/ml. - AUC representa el área bajo la curva de concentración de suero en hGH en función del tiempo. - RBA representa la biodisponibilidad con respecto a una formulación de Liberación Inmediata. - T5oaUc representa el tiempo necesario para reensanchar 50% del hGH reensanchado en total. La hGH IR presenta un perfil de liberación rápida con una concentración de suero máxima de 582 ± 155 ng/mL obtenida después de un tiempo medio de 2 h. La hGH se elimina después muy rápidamente (T1/2 de alrededor de 2 h) seguido por una disminución mono-exponencial. La hGH circulante ya no es cuatificable después de más de 24 h.

La formulación 1 presenta un perfil de liberación prologada de la hGH con una fase de absorción lenta, antes de alcanzar las concentraciones de suero máximas comparables (44 ± 6 y 37 ± 4 ng/mL, respectivamente) después de un tiempo medio de 24 h. La pendiente de eliminación indica la ausencia de hGH cuantificable más allá de 48 h (la concentración de suero que es de 4.8 ± 3.1 ng/mL). Esta formulación ha mostrado aquí una liberación más lenta de hGH en el compartimiento sanguíneo, ilustrada por el desfasamiento del Cmax centrado en 24 h. Sin embargo este fenómeno no parece prolongar de modo significativo la presencia de la hGH en el suero, puesto que la concentration circulante a 48 h parece nula. El AUC de la formulación 1 aparece ligeramente disminuida con respecto a la referencia IR: la biodisponibilidad es de 80%. La formulación 2 ofrece en cuanto ella una modificación mayor del perfil farmacocinético con una liberación muy lenta, después de un tiempo de latencia (lag-time) de 4 h, después una concentración de suero máxima de 25 ± 5 ng/mL alcanzada después de un tiempo medio de 108 h (duración: 72 - 168 h). Aspecto general de la farmacocinética de la formulación 2 es un perfil muy plano en seudo-plato, tipo perfusión (como infusión). El nivel de hGH circulante regresa a una concentración no cuantificable entre 168 h y 240 h (7 y 10 días). Esta formulación presenta en cuanto a ella un AUC mucho muy baja: pérdida de biodisponibilidad relativa de 45% (RBA = 55%). Ejemplo 13: Farmacocinética de la hGH en el perro después de invección subcutánea de una formulación a base de poliaminoácidos amfifilos en forma de microparticulas. 12 perros Beagle simples (pesos de 7 a 10 kg) fueron tratados con las formulaciones siguientes: La hGH IR corresponde a una solución de hormona de crecimiento humana recombinante ([hGH] = 4.1 mg/ml, pH = 7.2, 330 mOsm). La formulación 3 se prepara de acuerdo con el Ejemplo 9. Los datos farmacocinéticos son reagrupados en la siguiente tabla: donde: - Cmax es la concentración de suero máxima en hGH. - T>1 ng/mL es el tiempo o la concentración de suero en hGH es superior a 1 ng/ml. - AUC representa el área bajo la curva de concentración de suero en hGH en función del tiempo.

- RBA representa la biodisponibilidad con respecto a una formulación de Liberación Inmediata. - T50auc representa el tiempo necesario para reensanchar 50% del hGH reensanchado en total. Las microparticulas realargan la hGH en más de 5 días con una perdida de biodisponibilidad de 23%. Ejemplo comparativo 14: Liberación in vitro (prueba L) de hGH a partir de microparticulas de acuerdo con la invención y de nanopartículas de PO. Se efectúa en la prueba L una comparación de la liberación de hGH a partir de nanopartículas de PO (Ejemplo 8). La fase continua es una solución con tampon de albúmina de 30 mg/g. Se puede leer en la Figura única adjunta el tiempo necesario para realargar 50% de la proteína (hGH) en las condiciones de concentration donde la formulación es inyectable: - nanopartículas a 23 mg/g: tr = 40 min o sea 0.67 h. - microparticulas a 73 mg/g: Tr = 973 o sea 16.22 h. La hGH contenida en las microparticulas se realarga 24 veces más lentamente que aquella contenida en nanopartículas. Ejemplo 15: Preparación de frascos individuales conteniendo un polvo seco liofilizado de microparticulas de polímero PO y de insulina (100 Ul/frasco).

Preparación de 350 g de una solución de insulina concentrada de 500 Ul/s (17.5 mg/g): 6.4 g de insulina humana recombinante (polvo) de actividad 28.6 Ul/g y que contiene 4.5% de humedad se introducen en un frasco de vidrio. Se agregan 157 g de agua y se dispersa la insulina con agitación magnética lenta. Se agregan 46.6 g de HCI 0.1 N hasta la obtención de una solución cristalina de insulina ácida. Se agregan después 69.8 g de sosa 0.1 N de manera de obtener una solución final cristalina que tiene un pH comprendido entre 7 y 8. La solución se diluye hasta la concentration deseada mediante la adición de 70.2 g de agua. Mezcla con la solución de polímero PO: Se vierten lentamente 326 g de la solución de insulina concentrada precedente (con agitación magnética) en 3426 g de solución de polímero PO a 11 mg/g. La mezcla se filtra en 0.2 µs? y se deja con agitación lenta durante una noche. Todas las operaciones que siguen se realizan en condiciones asépticas. Floculación - lavado - concentration: La formulación precedente se flocula mediante adición controlada de 377 g de MgCI22 M (sea, en ese estado, un rendimiento r = 7.2). Después de 1 h de maduración, la suspensión se lava con agua hasta obtener una osmolaridad de aproximadamente 340 mOsm mediante microfiltración tangencial (módulo Microza de Pall con una superficie específica de 0.32 m2) y se concentra a 27 mg/g aproximadamente en polímero PO. El pH se ajusta a 6.5 mediante adición de sosa 1 N (aproximadamente 6 g) a la suspensión. Al final de esta etapa, la suspensión tiene un título de insulina de aproximadamente 100 Ul/g (el valor exacto puede ser obtenido mediante dosificación de HPLC en columna de sílice injertada con C18). Adición de polivinílpirrolidona: Se preparan 200 g de solution madre de polivinílpirrolidona a 40 mg/g aproximadamente a partir de polvo de polivinílpirrolidona de calidad inyectable (Kl 7 por ejemplo) y se filtra en una membrana esterilizante de 0.2 pm. 120 g de la solución así filtrada se agregan entonces de manera estéril a 1200 g de la suspensión precedente y la mezcla se agita durante aproximadamente 15 min. La suspensión resultante contiene aproximadamente 91 Ul/g de insulina. Liofilización: La suspensión précédente se reparte en los frascos individuales a razón de 100 Ul por frasco (es decir aproximadamente 1.1 g de la suspensión precedente por frasco): los frascos son liofilizados de manera estéril durante un ciclo de 72 h. Después de esta etapa, se tapan herméticamente en espera de su utilización. Ejemplo 16: reconstitution de los frascos de micropartículas/insulina obtenidos en el Ejemplo 15. La suspensión se reconstituye de manera extemporánea (antes de la utilización) de acuerdo con el procedimiento siguiente: se introduce 1 mi de agua con la ayuda de una jeringa y de una aguja en un frasco que contiene 100 Ul de insulina obtenida de acuerdo con el ejemplo precedente. El frasco se agita manualmente durante algunos segundos de manera de obtener una suspensión homogénea (de aspecto lechoso): la suspensión se aspira en la jeringa y está lista para ser inyectada a través de una aguja de 30G, por ejemplo. La suspensión reconstituida así contiene: - 23 mg/ml de polímero PO; - 100 Ul/ml de insulina (3.5 mg/ml); - 4 mg/ml de polivinilpirrolidona; - 0.18 mmol/ml de Mg+2 (es decir un rendimiento r = 2.8). La suspensión así reconstituida tiene un pH de 6.5 y una osmolaridad de 300 mOsm. La medida granulométrica del tamaño de las partículas (medida mediante la prueba T1) da un diámetro medio D50 de 15 pm. La densidad aparente medida en la prueba D es de 0.13. La viscosidad dinámica medida a 20°C es de 5 mPa.s. Ejemplo 17: Farmacodinámica de la insulina en el perro después de invección subcutánea de una formulación a base de poliaminoácidos amfifilos en forma de micropartículas. Dos grupos de 6 perros Beagle sanos (pesos de 10.4 ± 0.6) fueron tratados sucesivamente con una de las formulaciones siguientes en el curso de un ensayo cruzado de 2 periodos: La referencia de este estudio, Lantus®, es un análogo de la insulina modificada (insulina glargina) comercializada por Sanofi-Adventis. La modificación de dos residuos aminoácidos sobre la estructura primaria de la insulina humana confiere a Lantus propiedades de liberación prolongada en un periodo de 24 h vía una precipitación in situ. La formulación 4 se prepara de acuerdo con el Ejemplo 16.

La glicemia se dosifica por método enzimático (hexoquinasa) en un autómata de análisis bioquímicos de la sangre (Advia 1650, Bayer Diagnostics). El análisis de los resultados de la farmacodinámica se realiza en el porcentaje de la glicemia basal en función del tiempo. Los resultados farmacodinámicos son reagrupados en la tabla siguiente: donde: - Cmin es el porcentaje mínimo observado de la glicemia basal; - APGD0-36h representa la superficie entre la glicemia basal y el porcentaje de la glicemia basal con el tiempo entre 0 y 36 h después de la dosis; - T501%ApGC representa el tiempo necesario para obtener 50% de la La administración de la referenciada Lantus® conduce a una baja rápida de la glicemia en la primera hora. La acción hipoglicemiante de la insulina glargina se mantiene después durante un periodo comprendido entre 18 y 36 h (regreso de la glicemia a su nivel basal después de 30 h en promedio).

En comparación, la administración de la formulación 4 ha conducido igualmente a una baja rápida de la glicemia desde la primera hora. El porcentaje de la glicemia basal se mantiene después en plataforma hasta 36 h en promedio. La Cmin obtenida con la formulación 4 que es significativamente más alta que aquella de la referencia Lantus® (p<0.005, prueba t de Student unilateral y apareada), lo que deberá permitir reducir considerablemente los episodios de hipoglicemia severa en los pacientes diabéticos. La duración de la acción de la formulación 4 siendo netamente superior a aquella de la referencia de larga acción Lantus®. Esto se ilustra por un valor de T50%APGC significativamente más elevado para la formulación 4 (p<0.0005, prueba t de Student unilateral y apareada). No se ha observado ninguna pérdida de APGC o-36 para la formulación 4 con respecto o a la referencia Lantus®. Ejemplo 18: Obtention de polvo liofilizado de micropartículas de polímero PO y de interferón a-2b. Preparación de una solución que contiene 15 mg/g de polímero y O, 19 mg/g de IFN. 166 g de solución de polímero PO con 16.5 mg/g son introducidos en un frasco de 500 mi. Se agregan 2.3 g de una solución de 0.3 M de metionina a la solución. Se descongela a 25°C durante 1 h una solución congelada de IFN-a-2b concentrada con 2.4 mg/g y se introducen 13 g de esta solución congelada en el frasco que contiene la solución de polímero. La mezcla se deja durante 14 h a temperatura ambiente. La solución se filtra en un filtro esterilizante de 0.2 pm. Todas las operaciones siguientes son realizadas en condiciones asépticas.

Floculación - lavado - concentration 129.5 g de la formulación anterior son floculados mediante adición controlada de 148.5 g de MgCI2 2 M (es decir, en este estado, un rendimiento r = 7.0). La suspensión se reparte en cuatro frascos (37 g por frasco aproximadamente) y se centrifuga durante 15 minutos a 3000 rpm. 30.5 g de sobrenadante son sacados de los frascos teniendo cuidado de no tocar el residuo de centrifugación. Los residuos se retoman enseguida mediante adición de 17 g de agua en cada frasco, con agua estéril. La osmolaridad en esta etapa es de aproximadamente 300 mOsm. Liofilización La suspensión se reparte en recipientes de tipo Lyoguard® (Gore™) que permiten guardar la suspensión stérile luego de la lyophilisation: los recipientes son liofilizados de manera estéril enseguida durante un ciclo de 72 h en un liofilizador de colchón de paja (Christ). Ejemplo 19: reconstitution de una suspensión de micropartículas que contienen interferón a-2b a partir del polvo liofilizado obtenido en el Ejemplo 18. Con el fin de saber la cantidad de polvo a retomar para obtener de manera precisa 0.5 mg/g de interferón en la formulación, se realiza un ensayo preliminar de reconstitution y el interferón a-2b se dosifica en HPLC en columnas de sílica injertadas C18. La suspensión se reconstituye de manera extemporánea (antes de la utilización) de acuerdo con el protocolo siguiente: se agregan 13.58 g de agua a 1.22 de polvo liofilizado y la suspensión se homogeniza con un agitador magnético durante 1 h.

La suspensión resultante es homogénea (de aspecto lechoso): la suspensión es aspirada en la jeringa y está lista para ser inyectada a través de una aguja de 30G, por ejemplo. La suspensión así reconstituida contiene: - 46 mg/ml de polímero PO; - 0.5 mg/ml de interferón a-2b; - 0.34 mmol/ml de Mg+2 (o sea un rendimiento r = 2.6). La suspensión asi reconstituida tiene un pH de 6.1 y una osmolaridad de 705 mOsm. Ejemplo 20: Farmacocinética del IFN en el perro después de invección subcutánea de una formulación a base de poliaminoácidos amfifilos en forma de micropartículas. Ocho perros Beagle simples (pesos de 9 ± 0.6 kg) fueron tratados con las formulaciones siguientes: El IFN IR corresponde a una solución de interferón humano recombinante (PCGen, lote IB05.0516) de concentración ajustada, pH y osmolaridad ([IFN] = 0.5 mg/ml, pH = 6.45 y 354 mOsm). La formulación 5 se prepara de acuerdo con el Ejemplo 19, a partir del mismo lote de interferón (PCGen).

Los resultados farmacocinéticos son reagrupados en la tabla siguiente: donde: - Cmax es ia concentración máxima de suero en IFN; - T>50 pg/ml es el tiempo donde la concentración de suero en IFN es superior a 50 pg/ml; - AUC representa el área bajo la curva de concentración de suero en IFN en función del tiempo; - RBA representa la biodisponibilidad con relación a una formulación de Liberación Inmediata; - T50%AUC representa el tiempo necesario para reensanchar 50% del IFN reensanchado en total. El IFN IR presenta un perfil de liberación rápida con una concentración máxima de suero de 25.2 ± 0.4 ng/mL alcanzada después de un tiempo medio de 5 h (duración: 3 a 5 h). El IFN circulante ya no es cuantificable más allá de 24 h. La formulación 1 ofrece una modificación mayor del perfil farmacocinético del IFN con una liberación muy lenta, y una concentración máxima de suero de 0.9 ± 0.6 ng/mL (28 veces inferior a aquella del IR), alcanzada después de un tiempo medio de 108 h (duración: 66 a 144 h). El aspecto general de la farmacocinética es un perfil plano en seudo-plataforma. El nivel del IFN circulante regresa a una concentración no cuantificable entre 168 h y más de 240 h (7 y más de 10 días). Esta formulación presenta una AUC más baja: pérdida de biodisponibilidad relativa de 41% (RBA = 59%). El T50%auc es de aproximadamente 19 veces superior a aquel del IFN IR.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de PA, que comprende una suspensión coloidal acuosa, de viscosidad baja, a base de partículas micrométricas de polímero (PO), i. el polímero PO - que es un (co)polímero amfifilo, biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH) y de grupos hidrofílicos ionizables (Gl), por lo menos en parte ionizados, y - y que forma espontáneamente una suspensión coloidal de nanopartículas en el agua, con pH = 7.0, en condición isotónica, ii. dichas partículas que son aptas para asociarse espontáneamente de modo no covalente con por lo menos un principio activo (PA), a pH = 7.0, en condición isotónica, caracterizada porque las partículas micrométricas de PO tienen un tamaño, medido en una prueba T, comprendido entre 0.5 y 100 µ?t?, de preferencia entre 1 y 70 pm, de preferencia entre 2 y 40 pm y por que contiene iones multivalentes de valencia inferior o igual a 4, de preferencia iones divalentes, iones trivalentes o sus combinaciones, de polaridad opuesta a aquella de los grupos ionizables Gl del polímero, dichos iones multivalentes que han sido agregados para provocar la agregación de las nanopartículas de PO en partículas micrométricas en una cantidad tal que el rendimiento r, medido en una prueba , responde a la fórmula r = n x [IM]/[GI], donde: n es la valencia de dichos iones multivalentes, - [IM] es la concentración molar en iones multivalentes, [Gl] es la concentración molar de grupos ionizables Gl, está comprendido entre 0.3 y 10, de preferencia entre 0.6 y 5.0 y más preferiblemente aún entre 0.80 y 3.0. 2. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque las partículas micrométricas tienen una densidad aparente dapp de polímero, medida en una prueba D, comprendida entre 0.05 y 1.0, de preferencia entre 0.07 y 0.7, de preferencia entre 0.1 y 0.5. 3. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por un incremento de la duración Tr de liberación de un PA dado, de manera que medido en una prueba L, con respecto a la duración tr de liberación medida en la misma prueba L, de una formulación idéntica inyectable que no contiene iones multivalentes, este incremento es tal que Tr es superior o igual a 1.1 x tr y, de preferencia, tal que Tr es superior o igual a 1.5 x tr. 4. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende por lo menos un PA asociado a las microparticulas de PO. 5. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque su viscosidad dinámica a 20°C, para un gradiente de corte de 1000 s"\ es inferior o igual a 500 mPa.s, de preferencia comprendido entre 2 y 200 mPa.s. 6. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque los grupos hidrofóbicos (GH) están situados lateralmente en la cadena. 7. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el polímero PO se selecciona del grupo que comprende: poliaminoácidos, (poli)péptidos, gelatinas, proteínas, polisacáridos - de preferencia del subgrupo que comprende los pullulanes y/o chitosanos y/o mucopolisacáridos, o sus mezclas. 8. Formulación de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque el polímero modificado hidrofóbico PO se selecciona entre los (co) poliaminoácidos. 9. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el polímero (PO) es un poliaminoácido en el cual la cadena principal está formada por residuos aspárticos o residuos glutámicos, por lo menos una parte de estos residuos que están modificados mediante injertado de por lo menos un grupo hidrofóbico (GH), en la cadena o en el extremo de la cadena. 10. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque el polímero modificado hidrofóbico PO se define mediante la fórmula general (I) siguiente: en la cual: • R1 representa un H, un alquilo lineal de 2 átomos de carbono a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 átomos de carbono a 10 átomos de carbono, un radical de bencilo, un residuo de aminoácido terminal, o -R4- [GH]; • R2 representa un H, un grupo acilo lineal de 2 átomos de carbono a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 átomos de carbono a 10 átomos de carbono, un piroglutamato o -R -[GH]; · R3 es un H, o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que comprende: cationes metálicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio, cationes orgánicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende: • cationes con base de amina. • cationes con base de oligoamina. • cationes a base de poliamina (siendo particularmente preferida la polietilenimina). · cationes a base de aminoácido(s) seleccionado(s) ventajosamente de la clase que comprende los cationes a base de Usina o de arginina, - o los poliaminoácidos catiónicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende la polilisina o la oligolisina; • R4 representa un enlace directo o un separador a base de 1 a 4 residuos de aminoácido; • A representa independientemente un radical -CH2- (residuo aspártico) o -CH2-CH2- (residuo glutámico); • n/(n+m) se define como la tasa de injertado molar y su valor es suficientemente bajo para que el PO puesto en solución en agua con pH = 7 y a 25°C, forme una suspensión coloidal de partículas submicrónicas de PO, de preferencia n/(n+m) está comprendido entre 1 a 25% molar y mejor aún entre 1 y 15% molar; • (n+m) varía de 10 a 1000, de preferencia entre 50 y 300; • GH que representa un grupo hidrofóbico. 11. Formulación de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque el grupo hidrofóbico GH es emitido de un precursor alcohólico seleccionado del grupo que comprende: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleilalcohol, tocoferol o colesterol, y porque R4 representa un enlace directo. 12. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque el (o los) PO responde a una de las fórmulas generales (II), (III) y (IV) siguientes: (IV) en las cuales: • GH representa un grupo hidrofóbico; • R30 es un grupo alquilo lineal de 2 átomos de carbono a 6 átomos de carbono; · R3 es un H o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que comprende: cationes metálicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio, Cationes orgánicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende: • cationes a base de amina, • cationes a base de oligoamina, • cationes a base de poliamina (siendo particularmente preferida la polietilenimina), · cationes a base de aminoácido(s) seleccionado(s) ventajosamente de la clase que comprende cationes a base de Usina o de arginina, - o los poliaminoácidos catiónicos seleccionados ventajosamente del subgrupo que comprende la polilisina o la oligolisina, • R50 es un grupo alquilo, dialcoxi o diamina de 2 átomos de carbono a 6 átomos de carbono; • R4 representa un enlace directo o un espaciador a base de 1 a 4 residuos de aminoácido; • A representa independientemente un radical -CH2- (residuo aspártico) o -CH2-CH2- (residuo glutámico); · (n' + m') o n" se definen como el grado de polimerización y varían desde 10 hasta 1000, de preferencia entre 50 y 300. 1 3. Formulación de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque los n grupos GH del PO representan cada uno independientemente unos de otros un radical monovalente de la fórmula siguiente: (GH) en la cual: - R5 representa un radical metilo (alanina), isopropilo (valina), isobutilo (leucina), secbutilo (isoleucina), bencilo (fenilalanina); - R6 representa un radical hidrofóbico que lleva de 6 a 30 átomos de carbono; - I varía de 0 a 6. 14. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1 3, caracterizada porque todos o parte de los radicales hidrofóbicos R6 de los PO se seleccionan de manera independiente del grupo de radicales que comprende: • un alcoxi lineal o ramificado que lleva de 6 a 30 átomos de carbono y que puede llevar por lo menos un heteroátomo (de preferencia O, N o S) o por lo menos una ¡nsaturación; • un alcoxi que lleva de 6 a 30 átomos de carbono y que tiene uno o varios carbociclos anillados y que contiene eventualmente por lo menos una ¡nsaturación y/o por lo menos un heteroátomo (de preferencia O y/o N y/o S); • un alcoxiarilo o un alriloxialquilo de 7 a 30 átomos de carbono y que puede llevar por lo menos una Instauración o por lo menos un heteroátomo (de preferencia O, N o S). 15. Formulación de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, caracterizada porque el radical hidrofóbico R6 del injerto del PO es emitido de un precursor alcohólico seleccionado del grupo que comprende: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, oleilalcohol, tocoferol o colesterol. 16. Formulación de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la cadena principal del poliaminoácido es un homoplímero de alfa-L-glutamato o de alfa-L-glutámico. 17. Formulación de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la cadena principal del poliaminoácido es un homopolímero de alfa-L-aspartato o de alfa-L-aspártico. 18. Formulación de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque la cadena principal del poliaminoácido es un copolímero de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato o de alfa-L-aspártico/alfa-L-glutámico. 19. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la masa molar del PO se sitúa entre 2,000 y 100,000 g/mol y, de preferencia, entre 5,000 y 40,000 g/mol. 20. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el PO presenta grupos Gl aniónicos y porque los iones multivalentes son cationes multivalentes, de preferencia cationes divalentes, más preferiblemente aún seleccionados del grupo que comprende: Mg+2, Ca+2, Zn+2, Fe+2, Cu+2 o sus mezclas, o cationes trivalentes, más preferiblemente aún seleccionados del grupo que comprende: ? 3, Fe+3 o sus mezclas. 21. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende por lo menos un estabilizador seleccionado del grupo que comprende: ? nanopartículas de por lo menos un polímero PO, siendo PO un copolímero amfifilo biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH) y de grupos hidrofilicos ionizables (Gl) ionizados por lo menos en parte, y que forman espontáneamente una suspensión coloidal de nanopartículas en el agua, a un pH = 7.0, en condición isotónica; ? polialquilén glicoles, de preferencia polietilenglicoles; ? copolialquilenglicoles, de preferencia los copolímeros de etilenglicol-propilén-glicol (de tipo Poloxamer o Pluronic o Lutrol); ? polímeros celulósicos y sus derivados, de preferencia carboxialquil-celulosas (por ejemplo carboximetilcelulosas) o alquilcelulosas (por ejemplo metilcelulosas); ? ésteres de sorbitán y ácido(s) graso(s), de preferencia los ésteres de polioxialquilén (por ejemplo etilén) glicol y de por lo menos un ácido (por ejemplo ácido oleico), de tipo Tween o polisorbato; ? tensoactivos a base de fosfolípidos y de polialquilén glicoles, de preferencia polietilenglicoles; -? sacáridos hidrogenados o no, tales como trehalosa, sorbitol, manitol, sacarosa; ? polioles tales como propilenglicol o glicerol; ? gelatinas, de preferencia hidrolizadas; ? (co)polímeros nitrogenados, de preferencia del grupo que comprende poliacrilamidas, poli-N-vinilamidas, polivinilpirrolidonas (PVP) y poli-N-vinil-lactamas; ? alcoholes polivinílicos (APV); ? y sus mezclas. 22. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el PA se selecciona del grupo que comprende: proteínas, glicoproteínas, proteínas ligadas a una o varias cadenas de polialquilenglicol [de preferencia polietilenglicol (PEG): "proteínas-PEGlizadas"]. péptidos, polisacáridos, liposacáridos, oligonucleótidos, polinucleótidos y sus mezclas, y, más preferiblemente aún, del subgrupo de eritropoyetina, ocitocina, vasopresina, hormona adrenocorticotrope, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento plaquetario (PDGF), factores de crecimiento hematopoyéticos y sus mezclas, factores VIII y IX, hemoglobinas, citocromos, albúminas, prolactina, hormona de liberación de la hormona luteinizante (LHRH), antagonistas de la LHRH, agonistas de la LHRH, hormonas de crecimiento (GH) humanas, porcinas o bobinas, hormona de liberación de la hormona de crecimiento, insulina, somatostatina, glucagón, interleucinas o sus mezclas (IL-2, IL-11, IL-12), interferones-a, ß o ?, gastrina, tetragastrina, pentagastrina, urogastrona, secretina, calcitonina, encefalinas, endorfinas, angiotensinas, hormona de liberación de la tirotropina (TRH), factores de necrosis tumoral (TNF), factores neurotrópicos (NGF), factor de crecimiento granulocitario (G-CSF), factor de crecimiento de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento de macrófagos (M-CSF), heparinasa, proteína morfogénica ósea (BMP), péptido auricular natriurético (hANP), péptido como glucagón 1 (GLP-1), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), antígeno recombinante de hepatita G (rHBs), renina, citocinas, bradiquinina, bacitracinas, polimixinas, colistinas, tirocidina, gramicidinas, ciclosporinas y análogos sintéticos, modificaciones y fragmentos de enzimas activas farmacéuticamente, de citocinas, anticuerpos, antígenos y vacunas. 23. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el PA es una molécula pequeña orgánica, hidrofóbica, hidrofílica o amfifila. 24. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el principio activo se selecciona de entre por lo menos una de las familias de sustancias activas siguientes: los agentes de tratamiento contra el abuso del alcohol, los agentes de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, los anestésicos, los agentes de tratamiento de la acromegalia, los analgésicos, los antiasmáticos, los agentes de tratamiento de alergias, los agentes anticancerosos, ios antiinflamatorios, los anticoagulantes y antitrombóticos, los anticonvulsivos, los antiepilépticos, los antidiabéticos, los antieméticos, los antiglaucomatosos, los antihistamínicos, los antiinfecciosos, los antibióticos, los antifúngicos, los antivirales, los antiparkisonianos, los anticolinérgicos, los antitusivos, los inhibidores de la anhidrasa carbónica, los agentes cardiovasculares, los hipolipemiantes, los antiarrítmicos, los vasodilatadores, los antianginosos, los antihipertensivos, los vasoprotectores, los inhibidores de colinestarasa, los agentes de tratamiento de desórdenes del sistema nervioso central, los estimulantes del sistema nervioso central, los anticonceptivos, los promotores de fecundidad, los inductores e inhibidores del trabajo uterino, los agentes de tratamiento de la mucoviscidosa, los agonistas de los receptores de la dopamina, los agentes de tratamiento de la endometriosis, los agentes de tratamiento de disfunciones eréctiles, los agentes de tratamiento de la fertilidad, los agentes de tratamiento de trastornos gastrointestinales, los inmunomoduladores y los inmunosupresores, los agentes de tratamiento de trastornos de la memoria, los antimigrañosos, los relajantes de músculos, los análogos de nucleósidos, los agentes de tratamiento de osteoporosis, los parasimpatomiméticos, las prostaglandinas, los agentes psicoterapéuticos, los sedantes, los hipnóticos y tranquilizantes, los neurolépticos, los ansiolíticos, los psicoestimulantes, los antidepresivos, los agentes de tratamientos dermatológicos, los esferoides y las hormonas, las anfetaminas, los anoréxicos, los anti-dolores no analgésicos, los antiepilépticos, los barbitúricos, las benzodiacepinas, los hipnóticos, los laxantes, los psicotrópicos y todas las asociaciones de estos productos. 25. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque su fracción de masa de PA no asociado a las partículas micrométricas [PA no asociado] en % en peso es tal que: - [PA no asociado]<1 ; - De preferencia [PA no asociado]<0.5. 26. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el PA es la hormona de crecimiento humana recombinante hGH. 27. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque el PA es insulina. 28. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizada porque el PA es interferón a-2b. 29. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque está destinada a la preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, por mucosa, subcutánea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral o intratumoral, inclusive por vía oral, nasal, pulmonar, vaginal u ocular. 30. Método de preparación de la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque consiste esencialmente de: Efectuar o preparar una suspensión coloidal de nanopartículas de por lo menos un PO; Eventualmente, mezclar esta suspensión coloidal de nanopartículas de PO con por lo menos un PA, de preferencia en solución acuosa; c Eventualmente filtrar la suspensión así obtenida; d. Agregar iones multivalentes (de preferencia en la forma de sal(es)) de polaridad opuesta a aquella de los grupos Gl del polímero PO, dichos iones multivalentes que son agregados en tal cantidad que el rendimiento r, responde a la fórmula: donde: n es la valencia de dichos iones multivalentes; - [IM] es la concentración molar de los iones multivalentes; - [Gl] es la concentración molar de grupos ionizables Gl; está comprendido entre 0.3 y 10, de preferencia entre 0.6 y 5.0 y, más preferiblemente aún , entre 0.80 y 3.0; e. Según sea necesario ajustar el pH o la osmolaridad. 31 . Método de acuerdo con la reivindicación 30, caracterizado porque el PA está en forma de suspensión o de solución acuosa para el mezclado con la suspensión coloidal de nanopartículas o de micropartículas de PO. 32. Método de preparación de un producto derivado de la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, o de la formulación obtenida mediante el método de acuerdo con la reivindicación 30, caracterizado porque consiste esencialmente en secar la suspensión de partículas micrométricas, de manera de obtener una forma sólida, de preferencia un polvo de partículas micrométricas, susceptible de ser almacenado o administrado. 33. Método de preparación de la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque consiste esencialmente de: - elaborar por lo menos un producto derivado cargado o no en PA obtenido mediante el método de acuerdo con la reivindicación 32; - y mezclar este producto derivado con agua o una solución acuosa S de reconstitution. 34. Producto derivado de la formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque está en forma no líquida y porque comprende partículas micrométricas de polímero (PO), i. el pol ímero PO - que es un (co)polímero amfifilo, biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH) y de grupos hidrofilicos ionizables (Gl ), - y que forma espontáneamente una suspensión coloidal de nanopartículas en el agua, con pH = 7.0, en condición isotónica, ii. Dichas partículas que son aptas para asociarse espontáneamente de manera no covalente con por lo menos un PA, con pH = 7.0, en condición isotónica; estas partículas micrométricas de PO que tienen un tamaño, medido en una prueba T, comprendido entre 0.5 y 100 µ??, de preferencia entre 1 y 70 pm, de preferencia entre 2 y 40 pm; y por que dicho producto contiene derivados de iones multivalentes, de preferencia iones divalentes, de polaridad opuesta a aquella de los grupos Gl del polímero, el rendimiento r, que responde a la fórmula: donde: - n es la valencia de dichos iones multivalentes; - [I M] es la concentración molar de los iones multivalentes; - [Gl] es la concentración molar de grupos ionizables Gl ; que está comprendido entre 0.3 y 1 0, de preferencia entre 0.6 y 5.0 y, más preferiblemente aún, entre 0.8 y 3.0; 35. Producto derivado de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizado porque está constituido por un polvo o un gel. 36. Método de preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, por mucosa, subcutánea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intracerebral, o en un tumor, inclusive por vía oral, nasal, pulmonar, vaginal u ocular, caracterizado porque consiste esencialmente en realizar por lo menos una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 y/o una formulación obtenida mediante el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32 y/o cualquier producto derivado y/o cualquier precursor de dicha formulación.