MXPA06005716A - Formulaciones farmaceuticas para la liberacion prolongada de interferones y sus aplicaciones terapeuticas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a novedosas formulaciones farmaceuticas a base de fluidos y suspensiones coloidales acuosas estables para la liberacion prolongada de interferon -IFN- (y uno o mas de otros principios activos opcionales), y a aplicaciones, particularmente terapeuticas, de dichas formulaciones. La invencion esta dirigida a proporcionar una formulacion farmaceutica fluida para la liberacion prolongada de interferon(es) (y uno o mas principios activos), de tal forma que, despues de su inyeccion parenteral, el tiempo de liberacion de interferon in vivo aumenta significativamente, mientras que su concentracion pico en plasma disminuye. Ademas, dicha formulacion tiene que ser estable para el almacenamiento, y ademas, biocompatible, no toxica, biodegradable, no inmunogena y bien tolerada localmente. De acuerdo con la invencion, la formulacion es una suspension coloidal acuosa de baja viscosidad, de particulas submicronicas de polimero biodegradable soluble en agua y portadora de grupos hidrofobos (GH), cuyas particulas estan asociadas de manera no covalente con al menos un interferon (y uno o mas de otros principios activos opcionales) y forman un deposito gelificado sobre el sitio de la inyeccion, dicha gelificacion es ocasionada por una proteina presente en el medio fisiologico.

Description

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS PARA LA LIBERACIÓN PROLONGADA DE INTERFERONES Y SUS APLICACIONES TERAPÉUTICAS La presente invención se refiere a novedosas formulaciones farmacéuticas a base de suspensiones coloidales acuosas estables y fluidas para la liberación prologada de principios activos proteínicos, tales como lo sinterferones (IFN), así como también a las aplicaciones terapéuticas de estas formulaciones. Estas formulaciones farmacéuticas activas también conciernen tanto a la terapéutica humana como a la veterinaria. Los interferones son glicoproteínas que pertenecen a la familia de las citocinas. Son mediadores biológicos que, al fijarse sobre receptores membranales, desencadenan una respuesta celular peliotrópica. Esto tiene como resultado una actividad antiviral, antiproliferativa e inmunomoduladora. Los interferones también han sido reconocidos como agentes anti-tumorales o anticancerosos eficaces. Por interferón, se designa aquí a todas las formas de interferones, tales como los interferones alfa, beta o gamma. El IFN puede ser producido mediante ingeniería genética. Las formulaciones farmacéuticas de liberación prolongada de IFN, están sometidas a la necesidad de reproducir lo mejor posible en el paciente una concentración plasmática de IFN próxima al valor observado en el sujeto sano.

Este objetivo choca con la escasa duración de vida del IFN en el plasma, lo que obliga de manera muy exigente, a inyectarlos de manera repetida. La concentración plasmática en proteína terapéutica presenta entonces un perfil "con dientes aserrados", caracterizado por picos de concentración elevada y por mínimos de concentración muy bajos. Los picos de concentración, muy superiores a la concentración de base en el sujeto sano, tienen efectos nocivos muy marcados a causa de la elevada de los 1FN. Por otra parte, los mínimos de concentración son inferiores a la concentración necesaria para tener un efecto terapéutico, lo que implica una cobertura terapéutica deficiente del paciente, y efectos secundarios graves a largo plazo. También, para reproducir en el paciente una concentración plasmática de interferón próxima al valor ideal para el tratamiento, importa que la formulación farmacéutica considerada permita liberar la proteína terapéutica por encima de una duración prolongada, de forma tal de limitar las variaciones de concentración plasmática en el transcurso del tiempo. Por otra parte, esta formulación activa debe satisfacer de preferencia las siguientes necesidades, las cuales son familiares para los conocedores de la materia: 1. Liberación prolongada de uno o más interferones activos y no desnaturalizados (no modificados), de tal forma que la concentración plasmática se mantenga al nivel terapéutico; 2. Forma líquida suficientemente fluida para ser fácilmente inyectable y esterilizable mediante filtración en filtros en donde el tamaño de los poros es inferior o igual a 0.2 mieras; 3. Forma líquida estable; 4. Biocompatibilidad y biodegradabilidad; 5. No toxicidad; 6. No inmunogenicidad: 7. Excelente tolerancia local. Para intentar cubrir estos objetivos, se han propuesto hasta la fecha numerosos enfoques dentro de la técnica anterior. En el primer enfoque, la proteína terapéutica natural es modificada por injerto covalente de una o de más cadenas de polímero o también por injerto covalente de una proteína tal como la albúmina sérica humana (HSA). La proteína así modificada tiene una afinidad menor por sus receptores, y su tiempo de vida media en la circulación general aumenta considerablemente. La amplitud de la variación de concentración entre los picos y los valles de concentración plasmática en proteína también se reduce considerablemente. A título de ilustración de este primer enfoque, es de hacer notar que la sociedad Schering Plough comercializa bajo el nombre VIRAFÉRON® PEG, un interferón alfa 2b modificado químicamente mediante injerto de una cadena de polietilenglicol de masa 12 kD. Esta modificación química se traduce en un aumento del tiempo de vida media en el paciente de 6.8 a 33 horas. En el mismo tiempo, la bioactividad de la proteína modificada es reducida fuertemente. Por otra parte, la modificación irreversible de la proteína, que no siendo una proteína humana, puede conducir a largo plazo a problemas de toxicidad y de inmunogenicidad. En un segundo enfoque, se ha propuesto aumentar la duración de la acción gracias a formulaciones que contienen al menos un polímero y un principio activo, líquidos con temperatura y atmósfera ambientales, inyectables y que se hacen más viscosos después de la inyección, por ejemplo bajo el efecto de un cambio de pH y/o de temperatura. Igualmente, en este registro, la patente US-B-6,143,314 divulga una solución orgánica polimérica de liberación controlada de PA, que forma un implante sólido después de su inyección. Esta solución contiene: (A) de 10 a 80% por peso de un polímero termoplástico de base, biocompatible, biodegradable e insoluble en agua o en fluidos fisiológicos (por ejemplo, Poli láctico y/o Poli glicólico); (B) un solvente orgánico, tal como N-metil-pirrolidona, que se dispersa en los fluidos fisiológicos; (C) un principio activo (PA); (D) y finalmente de 1 a 50% por peso de un agente de liberación controlada, constituido por un copolímero en bloque de tipo polilácticoglicólico / polietilenglicol. Después de la inyección, (B) se dispersa o se disipa en los fluidos fisiológicos. (A) forma un implante encapsulante (C) , que no está ligado de manera covalente ni a (A) ni a (D), y que se libera entonces lentamente in vivo.

El principal inconveniente de esta técnica es el de utilizar un solvente orgánico (B), potencialmente desnaturalizante para el PA (C) (por ejemplo, proteínas terapéuticas) y tóxico para el paciente.

Por potra parte, la hidrólisis in vivo del polímero (A) genera un ácido que puede conducir a problemas de tolerancia local. Las solicitudes del TCP WO-A-99/18142 y WO-A-00/18221 conciernen a soluciones acuosas de polímeros que contienen un PA bajo forma disuelta o coloidal, que se pueden administrar a animales de sangre caliente, en particular por inyección, y que forman un depósito de PA (por ejemplo, insulina) gelificado in vivo, dado que la temperatura fisiológica es superior a su temperatura de gelificación. El gel así formado libera el PA de manera prolongada. Estos polímeros biodegradables particulares son tribloques ABA o BAB con A = poliláctico - coglicólico (PLAGA) o poliláctico (PLA) y B = polietilenglicol. Las temperaturas de transformación de líquido a gel de estos polímeros tribloques son por ejemplo, de 36, 34, 30 y 26 °C. En el caso de los polímeros (A) de acuerdo con la patente US-B-6,143,314, la hidrólisis de estos polímeros tribloques ABA o BAB in vivo conduce a ácidos que pueden no ser correctamente tolerados localmente. La solicitud del TCP WO-A-98/11874 describe formulaciones farmacéuticas que contienen un principio activo lipófilo, un polímero gelificante (Gelrite® = goma gelano desacetilada o etilhidroxicelulosa) y un agente tensoactivo. La interacción polímero/agente tensoactivo, y eventualmente la sola presencia de electrolitos tales como iones Ca++ en concentración fisiológica, conduce a la formación de un gel constituido por un agregado polímero/agente tensoactivo, al cual se liga de manera no covalente el principio activo lipófilo. Esta formulación está destinada a su administración local en un órgano objetivo (por ejemplo, en el ojo). La asociación agregado/principio activo que se forma in situ, permite la liberación lenta del principio activo en el órgano objetivo. Un tercer enfoque puesto en práctica para intentar prolongar la duración de la acción de una proteína conservando su bioactividad, fue utilizar una proteína terapéutica no desnaturalizada, e incorporarla en micro esferas o en implantes a base de polímeros biocompatibles. Este enfoque está particularmente ilustrado en la patente US-B-6,500,448 y en la solicitud US-A-2003/0133980, que describen una composición con liberación prolongada de hormona de crecimiento humano (hGH), en la cual, la proteína hormonal, previamente estabilizada mediante formación de complejo con un metal, es dispersada a continuación en una matriz polimérica biocompatible. El polímero biocompatible por ejemplo, es un poli(láctico) un poli(glicólico) o un copolímero poli(láctico-co-glicólico). La composición se presenta por ejemplo bajo la forma de una suspensión de micro esferas en una solución de carboximetilcelulosa de sodio. Este enfoque presenta múltiples inconvenientes: en primer lugar, en el transcurso del procedimiento de fabricación de las micro esferas, la proteína se pone en contacto con solventes orgánicos potencialmente desnaturalizantes. Por otra parte, las micro esferas tienen un tamaño grande (1 a 1000 mieras), lo q ue constituye una desventaja en térm inos de inyección y de esterilización fácil sobre filtros. Finalmente, pueden surgir problemas de tolerancia local después de la hidrólisis in situ del polímero. De acuerdo con un cuarto enfoq ue, se han desarrollado formas de liberación prolongada de proteína terapéutica (especialmente de interleucinas), constituidas por suspensiones líquidas de nanopartículas cargadas en proteínas. Estas suspensiones han perm itido la administración de la proteína natural en una formulación líq uida de poca viscosidad. De acuerdo con una primera vía de liberación prolongada, la suspensión de nanopatículas con liberación prolongada está constituida por suspensiones de liposomas en las cuales la proteína terapéutica natural no modificada es encapsulada. Después de la inyección, la proteína es liberada progresivamente de los liposomas, lo q ue prolonga en tiempo de presencia de la proteína en la circulación general. Así, por ejemplo, Frossen y co-autores describen en el artículo Cáncer Res. 43 p 546, 1983, la encapsulación de agentes anti-neoplásicos dentro de liposomas con el fin de aumentar la eficacia terapéutica. La liberación del fármaco, sin embargo, es demasiado rápida como para obtener una real liberación prolongada. La sociedad Liposome Company Inc. , en su patente US-B-5,399,331 , propone mejorar el tiempo de liberación in vitro del interferón 2 en el injerto de forma covalente con el liposoma. Regresamos entonces a través del primer enfoq ue con "proteína modificada" mencionado anteriormente. Con el fin de paliar la falta de estabilidad de los liposomas, manteniendo las ventajas de una formulación líquida en nanopartículas y de base viscosa, la sociedad Flamel Technologies ha propuesto una segunda vía de liberación prolongada, en la cual la proteína terapéutica está asociada con nanopartículas de un polímero hidrosoluble "modificado hidrofóbico", es decir, modificado mediante injerto de grupos hidrofóbicos. Este polímero se escoge, en particular, entre los poliaminoácidos (poliglutamatos o poliaspartatos) portadores de injertos hidrofóbicos. Uno de los beneficios notables de estos pol ímeros modificados hidrofóbicos, es que se aüto-ensambla espontáneamente en el agua para formar nanopartículas. Otro beneficio de estos sistemas es que las proteínas o los péptidos terapéuticos se asocian espontáneamente con las nanopartículas de polímeros modificados hidrofóbicos. Esta asociación es no covalente, y se efectúa sin tener que recurrir a un agente tensoactivo ni a un procedim iento de transformación potencialmente desnaturalizante. No se trata sólo de una encapsulación de la proteína en una micro esfera, tal como se describe en la patente US-B-6,500,448 y en la solicitud US-A-2003/0133980. De manera totalmente diferente, estas nanopartículas de co-poliaminoácidos hidrofóbicos modificados adsoben espontáneamente las proteínas en solución, sin modificarlas químicamente ni desnaturalizarlas, y sin hacerlas sufrir etapas de tratamiento agresivas del tipo "puesta en emulsión" y "evaporación de solvente". Las formulaciones pueden ser almacenadas bajo forma líquida o liofilizada. Después de la inyección, por ejemplo por vía subcutánea, estas suspensiones de nanopartículas cargadas con proteínas liberan progresivamente la proteína no desnaturalizada y bioactiva in vivo. De tales asociaciones no covalentes, el principio activo (PA) proteínico/poli.Glu] o poli[Asp] se describe en la solicitud de patente WO-A-00/30618. Esta solicitud describe en particular suspensiones coloidales con pH 7.4, que comprenden asociaciones de insulina humana con nanopartículas de poliglutamato "modificado hidrofóbico". La tabla siguiente presenta los poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" que se aplican, y los índices de asociación obtenidos en los ejemplos de WO-A-00/30618.

Estas suspensiones coloidales se purifican con 1.4 mg/mL de insulina y 10 mg/mL de poliaminoácido "modificado hidrofóbico". Con respecto a la figura 1 de WO-A-00/30618, se puede ver que la duración de la liberación in vivo de la insulina vectorizada por las suspensiones mencionadas, es de 12 horas. Esta duración de liberación ganaría al ser aumentada. Así pues, aunque esta solicitud del TCP ya representa un progreso considerable, su contenido técnico puede aún optimizarse respecto al pliego de condiciones mencionado anteriormente, y sobre todo respecto a la prolongación de la duración de liberación ín vivo de los interferones. Las solicitudes de patente francesa no publicadas números 02 07008 del 07/06/2002, 02 09670 del 30/07/2002, 03 50190 del 28/05/2003 y 01 50641 del 03/10/2003, se refieren a novedosos poliaminoácidos anfifílicos, hidrosolubles, y comprenden unidades aspárticas y/o unidades glutámicas, en las cuales al menos una parte de estas unidades son portadoras de injertos hidrofóbicos. En el caso de los poliaminoácidos modificados hidrofóbicos descritos en la solicitud WO-A-00/30618, estas novedosas materias primas de polímero forman espontáneamente en medio líquido acuoso, suspensiones coloidales de nanopartículas que pueden ser utilizadas para la liberación prolongada del PA (insulina). Ellas son biocompatibles, biodegradables, y las proteínas, en particular las proteínas terapéuticas, se adsorben espontáneamente en estas nanopartículas sin sufrir modificación química o desnaturalización.

Estas solicitudes se refieren también a novedosas composiciones farmacéuticas, cosméticas, dietéticas o fitosanitarias a base de estos poliaminoácidos. Los poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" anfifílicos de acuerdo con la solicitud de patente francesa número 02 07008, contienen unidades aspárticas y/o un idades glutám icas, portadoras de injertos hidrofóbicos que contienen al menos un motivo alfa-tocoferol, (por ejemplo, polig lutamato o poliaspartato injertado con alfa tocoferol de origen sintético o natural). Esta solicitud no publicada describe específicamente una suspensión coloidal que contiene nanopartículas formadas por asociaciones polímero/proteína activa, y que se obtiene mezclando 1 mg de un poliglutamato injertado con alfa-tocoferol y 7 mg de insulina en 1 mL de agua, con un pH de 7.0. Los poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" anfifílicos de acuerdo con la solicitud de patente francesa número 02 09670, contienen unidades aspárticas y/o unidades glutámicas, portadoras de injertos hidrofóbicos, que contienen al menos un motivo hidrofóbico y enlazadas a las unidades aspárticas y/o glutámicas por intermed io de u na rótula que contiene funciones amida, y más precisamente, mediante un "separador" de tipo lisina u ornitina. Esta solicitud no publicada describe específicamente una suspensión coloidal que contiene nanopartículas formadas por asociaciones polímero/proteína activa y q ue es obtenida mezclando 10 mg de un polig lutamato injertado con ácido palmítico por intermedio de un "separador" lisina y 200 Ul de insulina (7.4 mg) en 1 mL de agua, con un pH de 7.4. Los poliaminoácidos "modificados hidrofóbicos" anfifílicos de acuerdo con la solicitud de patente francesa número 03 50190, contienen unidades aspárticas y/o unidades glutámicas, en donde algunas son portadoras de al menos un injerto enlazado a una unidad aspártica o glutámica, por medio de un "separador" "ácido aminado" a base de Leu, y/o ILeu, y/o Val y/o Phe, un grupo hidrofóbico de 6 a 30 átomos de carbono, que está enlazado por un enlace éster en el "separador". Esta solicitud no publicada describe específicamente una suspensión coloidal que contiene nanopartículas formadas por asociaciones polímero/proteína activa y que se obtiene mezclando una solución acuosa que contiene 10 mg de un poliglutamato enlazado con un injerto -Leu-OC8, -Val-OC12 o -Val-colesteril y 200 Ul de insulina (7.4 mg) por mililitro de agua, con un pH de 7.4. La solicitud de patente francesa número 0150641 describe homopoliaminoácidos lineales, anfifílicos, aniónicos, que contienen unidades aspárticas o unidades glutámicas, y en donde las extremidades son portadoras de grupos hidrofóbicos que contienen de 8 a 30 átomos de carbono. En particular, los homopoliaminoácidos telequélicos "modificados hidrofóbicos" son por ejemplo un poli[GluONa] con extremos PheOC18/alfa-tocoferoI. Esta solicitud no publicada describe igualmente una suspensión coloidal que contiene nanopartículas formadas por asociaciones polímero/proteína activa y que se obtiene mezclando 1 0 mg de uno de los polímeros antes mencionados y 200 U l de insulina (7.4 mg) por mililitro de agua, con un pH de 7.4. La d uración de liberación in vivo de la insulina "vectorizada" por las suspensiones de acuerdo con estas solicitudes no publicadas, ganaría de ser aumentada. En cualq uier caso, toda esta técnica anterior acerca de las suspensiones coloidales de nanopartículas de poliaminoácidos mod ificados hidrofóbicos, no revela form ulación, permitiendo: (I ) aumentar suficientemente la duración de liberación de la proteína activa después de su inyección por vía parenteral, en particular sub-cutánea; (II) y/o reducir el pico de concentración plasmática de la proteína activa después de la inyección de la formulación que la contiene. En estas condiciones, uno de los objetivos esenciales de la presente invención es proponer una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de I FN activo(s), remediando las carencias de la técnica anterior, y en particular permitiendo después de la inyección por vía parenteral (por ejem plo, subcutánea) , obtener una duración de liberación in vivo prolongada, para los interferones no desnaturalizados Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica líquida con liberación prolongada de interferón o interferones in vivo, que sea suficientemente fluida para ser fácilmente inyectable y esterilizable por filtración en filtros con tamaño de poros inferior o igual a 0.2 mieras. Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica líquida con liberación prolongada de ¡nterferón o interferones in vivo, que sea estable para la conservación tanto en el plano físico-químico como en el biológico. Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica líquida con liberación prolongada de interferón o interferones in vivo, que presenta al menos una de las siguientes propiedades: biocompatibilidad, biodegradabilidad, atoxicidad, buena tolerancia local. Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica para la liberación prolongada lenta de interferones in vivo, esta formulación es una suspensión coloidal acuosa de base viscosa, que contiene partículas submicrónicas de polímero PO auto-asociadas al menos a un interferón, el polímero PO es un polímero biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos. Otro objetivo esencial de la invención es proponer una formulación farmacéutica de liberación prolongada lenta de interferones in vivo, esta formulación es una suspensión coloidal acuosa de base viscosa, que contiene partículas submicrónicas de polímero PO auto-asociadas al menos a un interferón, el polímero PO es, por ejemplo, un poliaminoácido formado por unidades aspárticas y/o por unidades glutámicas, al menos una parte de estas unidades son portadoras de injertos que contienen al menos un grupo hidrofóbico (GH), siendo por otro lado el PO biodegradable, hidrosoluble y anfifílico. Otro objetivo esencial de la invención es proponer productos derivados y/o precursores de la formulación aludida en los objetivos mencionados anteriormente. En particular, es del mérito de la sociedad solicitante haber puesto a punto formulaciones farmacéuticas líquidas acuosas de base viscosa a temperatura fisiológica, que de forma sorprendente, forman un depósito gelificado in vivo después de su administración parenteral fácilmente en el hombre o en mamíferos de sangre caliente, la formación de este depósito no se desencadena por un cambio de pH, ni por la temperatura después de la inyección parenteral, ni aún por dispersión de solvente orgánico en el medio fisiológico. El depósito gelificado así formado aumenta de una forma significativa la duración de la liberación del IFN in vivo. De lo anterior se deduce que la invención se refiere a una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de inteferón o interferones. Esta formulación comprende una suspensión coloidal, acuosa, de base viscosa, a base de partículas submicrónicas de polímero (PO) biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH); dichas partículas están asociadas de manera no covalente con al menos un interferón, y eventualmente con al menos otro principio activo (PA), caracterizada porque: - el medio dispersivo de la suspensión está constituido esencialmente por agua, - ella es apta para ser inyectada por vía parenteral y para formar enseguida in vivo un depósito gelificado, esta formación de depósito gelificado: . por una parte, es provocada al menos parcialmente, por al menos una proteína fisiológica presente in vivo, . y permite, por otra parte, prolongar y controlar la duración de la liberación del PA in vivo, más allá de 24 horas después de la administración. - es líquida en las condiciones de la inyección, - es igualmente líquida a la temperatura y/o al pH fisiológicos, y/o en presencia: . de un electrolito fisiológico en concentración fisiológica, . y/o de al menos un agente tensoactivo. Ventajosamente, esta gelificación in vivo no es el resultado de un cambio de pH y/o de temperatura, ni de la presencia de electrolitos (Ca + + , por ejemplo) en concentración fisiológica y/o de al menos un agente tensoactivo, ni de una dispersión in vivo de uno o más solventes orgánicos eventualmente contenidos en la formulación inyectada. Sin querer estar limitado por la teoría, se puede pensar que las proteínas fisiológicas presentes in vivo en concentraciones fisiológicas, permite la agregación de nanopartículas de PO asociadas a al menos un interferón. Una gelificación como esta se lleva a cabo, por ejemplo, en una o más horas, 24, 48 h o 72 h, entre otras. El depósito gelificado obtenido después de la inyección parenteral de la formulación, permite una prolongación interesante de laduración de liberación de la proteína, así como también una reducción del pico de concentración polasmática del interferón o interferones. De conformidad con una forma optimizada de la invención, la concentración de PO es tal, que ella forma un depósito gelificado in vivo, después de la inyección parenteral. De acuerdo con un modo de definición que no está basado ya en un comportamiento in vivo como el indicado anteriormente, sino en un comportamiento in vitro, la invención concierne a una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de principio(s) activo(s) -PA-, esta formulación: - es líquida en atmósfera ambiente, es igualmente líquida a temperatura y/o a pH fisiológicos y/o en presencia: . de electrolito fisiológico en concentración fisiológica . y/o de al menos de un agente tensoactivo, - y comprende una suspensión coloidal, acuosa, de base viscosa, a base de partículas submicrónicas de polímero PO biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos GH, dichas partículas están asociadas de manera no covalente con al menos un interferón (y eventualmente con al menos otro principio activo), y el medio díspersor de la suspensión está constituido esencialmente por agua, caracterizada además porque su concentración de PO está fijada en un valor suficientemente elevado como para permitir la formación del depósito gelificado in vitro, en presencia de al menos una proteína. De preferencia, la formulación farmacéutica líquida de acuerdo con la invención está caracterizada porque su concentración de PO es tal que: - [PO] > 0.9.C1, - de preferencia 20.C1> [PO] > C1, - y aún más preferible 10. C1 > [PO] > C1 donde C1 representa la concentración de "gelificación inducida" de partículas de PO, tal como se miden en una prueba G1. El depósito gelificado obtenido después de la inyección parenteral de la formulación, permite una prolongación interesante de la duración de liberación de la proteína, así como también una reducción del pico de concentración plasmática del interferón o interferones. La duración de la liberación del PA aumenta de manera significativa con respecto a las formulaciones de la técnica anterior, en particular las descritas en la solicitud de patente del TCP publicada WO-A-00/30618 y las solicitudes de patente francesa no publicadas números 02 07008, 02 09670, 0350190 y 01 50641.

La prolongación de la duración de la liberación in vivo inducida por las formulaciones de acuerdo con la invención, es tanto más apreciable cuanto que los interferones liberados son siempre plenamente bioactivos y no desnaturalizados. Los interferones en el sentido de la presente exposición, son indiferentemente interferones no modificados, o interferones modificados, por ejemplo por injerto de uno o de más grupos polioxietilénicos. Entre las proteínas de la familia de los interferones, se puede citar: IFN alfa, IFN beta e IFN gamma. Durante la presente exposición, los arreglos supramoleculares de polímero PO asociado o no al menos a un interferón, y eventualmente al menos a otro principio activo, serán denominados indiferentemente "partículas submicrónicas" o "nanopartículas". Esto corresponde a partículas de diámetro hidrodinámico medio (medido de acuerdo con un procedimiento Md definido más adelante, en los ejemplos), que por ejemplo está comprendido entre 1 y 500 nm, de preferencia entre 5 y 250 nm. Por otra parte, es importante destacar que estas formulaciones son líquidas, es decir, presentan ventajosamente una viscosidad muy reducida, que hace fácil su inyección. Ellas no se pueden gelificar más que in vivo. De acuerdo con la invención, los calificativos "líquido", "base" o "viscosidad muy reducida", corresponden, ventajosamente, a una viscosidad dinámica a 20 °C inferior o igual a 5 Pa.s. La medida de referencia para la viscosidad puede ser realizada, por ejemplo, a 20 °C con la ayuda de un reómetro AR1000 (TA Instruments), equipado con una geometría cono-plano (4 cm, 2o). La viscosidad v se mide por un gradiente de cizallamiento de 10 s"1. Así, la viscosidad de las formulaciones de acuerdo con la invención, por ejemplo, puede estar comprendida entre 1.10"3 y 0.5 Pa.s. Esta viscosidad reducida hace a las formulaciones de la invención no solamente fácilmente inyectables por vía parenteral, en particular por vía intramuscular o sub-cutánea, entre otras, sino también esterilizables fácilmente y a menor costo, mediante filtración sobre filtros de esterilización con tamaño de poro de 0.2 µm. Este estado líquido o esta viscosidad reducida de las formulaciones de la invención existe, tanto a temperaturas de inyección que corresponden a temperaturas ambiente, por ejemplo incluidas entre 4 y 30 °C, como a la temperatura fisiológica. La formulación de acuerdo con la invención, de preferencia es una suspensión coloidal acuosa de nanopartículas asociadas con uno o más interferones, y eventualmente con uno o más de otros PA. Esto significa que, de conformidad con la invención, el medio dispersivo de esta suspensión está formado esencialmente por agua. En la práctica, esta agua representa, por ejemplo, al menos 50% por peso con respecto a la masa total de la formulación. En el sentido de la invención, el término "proteína" se refiere igualmente a una proteína como un péptido. Esta proteína o este péptido podrían ser modificados o no, por ejemplo, por injerto de uno o más grupos polioxietilénicos. Por "proteínas fisiológicas" se entiende, en el sentido de la invención, las proteínas y/o los péptidos endógenos de mamíferos de sangre caliente presentes en el sitio de la inyección. Por "temperatura fisiológica" se entiende, en el sentido de la invención, la temperatura fisiológica de mamíferos de sangre caliente, a saber por ejemplo, alrededor de 37 a 42 °C. Por "pH fisiológico" se entiende en el sentido de la invención, un pH por ejemplo comprendido entre 6 y 7.6. Por "ge!" se entiende, en el sentido de la invención, un estado semi-sólido en el cual se transforma la formulación líquida de acuerdo con la invención, y que espontáneamente, por la sola presencia de proteína(s) fisiológica(s) sin intervención esencial del pH fisiológico y/o de la temperatura fisiológica y/o de la presencia de un electrolito fisiológico (Ca++, por ejemplo), y/o de la dispersión (o disipación) in vivo de un solvente orgánico eventualmente presente en la formulación inyectada. Por "electrolito fisiológico" se entiende, en el sentido de la invención, todo elemento electrolítico (por ejemplo iones Ca++) presente en los mamíferos de sangre caliente. Por "concentración fisiológica" se entiende, en el sentido de la invención, toda concentración fisiológica que se encuentra en los mamíferos de sangre caliente, en el medio fisiológico considerado.

Por otra parte, las formulaciones de acuerdo con la invención son no tóxicas, bien toleradas localmente y estables. Es igualmente del mérito de los inventores haber encontrado en el punto una prueba in vitro Gl que permite seleccionar una población de formulaciones preferidas de acuerdo con la invención y determinar las concentraciones idóneas de PO en las formulaciones. De conformidad con la invención, la prueba Gl de medición de la concentración de gelificación C1 es una prueba de referencia que permite definir la concentración crítica C1, denominada en lo sucesivo concentración de gelificación inducida C1, que caracteriza cada formulación coloidal de acuerdo con la invención. La prueba Gl de determinación de la concentración C1 de gelificación inducida, es la siguiente: Con el fin de determinar la concentración C1, se preparan formulaciones coloidales de concentraciones variables en polímero anfifílico de acuerdo con la invención, y de concentración constante en proteína terapéutica. Para este fin se pone en solución en agua des-ionizada cantidades crecientes de polvo seco de polímero. Las soluciones se mantienen a 25 °C bajo agitación magnética durante 16 horas antes de ser mezcladas con una solución concentrada en proteína terapéutica. El volumen y la concentración de esta solución de proteína terapéutica son ajustados con el fin de obtener la concentración en proteína requerida para la formulación (por ejemplo, 0.3 mg/mL de interferón alfa 2b). Las formulaciones coloidales así preparadas se mezclan con una solución acuosa de albúmina de suero bovino (BSA) concentrada a 30 mg/mL, luego se centrifugan durante 15 minutos a 3000 t/min. Las mezclas se dejan bajo agitación suave durante 24 horas antes de ser recuperadas para ser caracterizadas. Las medidas de viscoelasticidad se efectúan en un reómetro TA Instruments AR 1000, equipado con una geometría cono-plano (diámetro 4 cm y ángulo 1.59°). Una deformación de 0.01 rad, situada en el dominio de viscoelasticidad lineal, es impuesta de manera sinoidal sobre una gama de frecuencia comprendida entre 0.1 y 300 rad/seg. La temperatura de la muestra se mantiene constante a 20 °C por la desviación de una célula Peltier. Los espectros de frecuencia del modelo elástico G' y del módulo de viscosidad o de pérdida, G", permiten definir el tiempo de relajación característico Tr definido aquí como el inverso de la frecuencia a la cual el módulo elástico G' cruza el módulo viscoso G". Se encontrará una exposición detallada de estas cuestiones en la obra Ferry, Viscoelastic Properties of Polymers, J.D. Ferry, J. Wiley, NY, 1980 y en el artículo de J. Regalado y co-autores Macromolecules 1999, 32, 8580. La medición del tiempo de relajación Tr en función de la concentración de polímero de la formulación, permite definir la concentración C1 con la cual este tiempo Tr aumenta un segundo. Los ejemplos de valores de la concentración de gelificación C1 serán proporcionados en el ejemplo 7 más adelante. De la misma forma, se puede definir las concentraciones C0.1 y C10 para las cuales el tiempo de relajación sobrepasa respectivamente 0.1 seg. y 10 seg. Estas concentraciones se clasifican en el orden creciente que sigue: C0.1 < C1 < C10. Siguiendo una variante de la formulación de acuerdo con la invención: [PO] > C0.1, de preferencia [PO] > C1, y aún más preferible [PO] > C10. De acuerdo con una característica adicional ventajosa: [PO] > 20. C1 En el sentido de la invención y en toda la presente exposición, los términos "asociación" o "asociar" empleados para calificar las relaciones entre uno o más principios activos y los polímeros PO (por ejemplo los poliaminoácidos), significan en particular que el o los principios activos están ligados al polímero o polímeros PO (por ejemplo al (o a los) poliaminoácidos) mediante un enlace no covalente, por ejemplo por interacción electrostática y/o hidrofóbica y/o un enlace hidrógeno y/o perturbación esférica. Los polímeros PO de acuerdo con la invención son polímeros biodegradables, hidrosolubles y portadores de grupos hidrofóbicos GH. Los grupos hidrofóbicos pueden ser reducidos en número con respecto al resto de la cadena, y se pueden situar lateralmente en la cadena o intercalados en la cadena, y ser repartidos de manera aleatoria (copolímero estadístico) o repartidos bajo la forma de secuencias o de injertos (copolímeros en bloque o copolímeros secuenciados). Si querer limitarse, los polímeros PO modificados hidrofóbicos pueden ser escogidos del grupo que comprende los copoliaminoácidos anfifílicos, los polisacáridos - de preferencia en el sub-grupo que comprende los pululanos y/o los chitosanos y/o los mucopolisacáridos-, las gelatinas o sus mezclas. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el PO se escoge entre los copoliaminoácidos anfifílicos. En el sentido de la invención, y en toda la presente exposición, el término "poliaminoácido" cubre tanto los oligoaminoácidos que contienen de 1 a 20 unidades "ácido aminadas", como los poliaminoácidos que contienen más de 20 unidades "ácido aminadas". De preferencia, los poliaminoácidos de acuerdo con la presente invención son oligómeros u homopolímeros que contienen unidades recurrentes de ácido glutámico o aspártico, o copolímeros que contienen una mezcla de estos dos tipos de unidades "ácido aminadas". Las unidades consideradas en estos polímeros son ácidos aminados que tienen la configuración D o L o D/L, y están enlazados en sus posiciones alfa o gama, por la unidad glutamato o glutámica y alfa o beta para la unidad aspártica o aspartato. Las unidades "ácido aminadas" preferidas de la cadena poliaminoácida principal son aquellas que tienen la configuración L y un enlace de tipo alfa. De acuerdo con una modalidad aún más preferida de la invención, el polímero PO es un poliaminoácido formado por unidades aspárticas y/o unidades glutámicas, al menos una parte de estas unidades son portadoras de injertos que contienen al menos un grupo hidrofóbico GH. Estos poliaminoácidos en particular son del tipo de los descritos en la solicitud de patente del TCP WO-A-00/30618. De acuerdo con una primera posibilidad, el (o los) PO de la formulación está(n) definido(s) por la siguiente fórmula general (I): 0) en donde: . R1 representa un H, alquilo lineal de 2 a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 a 10 átomos de carbono, bencilo, una unidad ácido aminada terminal o -R -[GH]; . R2 representa un H, un grupo acilo lineal de 2 a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 a 10 átomos de carbono, un piroglutamato o -R4-[GH]; . R3 es un H o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que consiste en: cationes metálicos escogidos ventajosamente del subgrupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio, cationes orgánicos escogidos ventajosamente del subgrupo que comprende: - cationes a base de amina, - cationes a base de oligoamina, - cationes a base de poliamina (la polietilenimina es particularmente preferida), - cationes a base de ácido(s) aminado(s) escogidos ventajosamente dentro de la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina, o los poliaminoácidos catiónicos escogidos ventajosamente del sub-grupo que comprende la polilisina o la oligolisina; . R4 representa un enlace directo o un "separador" a base de 1 a 4 unidades ácido aminadas; . A representa independientemente un radical -CH2-(unidad aspártica) o CH2-CH2- (unidad glutámica); . n/(n + m) se define como la tasa de injerto molar y su valor es suficientemente bajo como para que el PO puesto en solución en el agua con un pH de 7 y a 25 °C, forme una suspensión coloidal de partículas submicrónicas de PO; de preferencia, n/(n + m) está comprendido entre 1 y 25% molar, y más preferiblemente entre 1 y 15% molar; . n + m está definido como el grado de polimerización, y varía desde 10 hasta 1000, de preferencia entre 50 y 300; . GH representa un grupo hidrofóbico. De acuerdo con una segunda posibilidad, el (o los) PO de la formulación responden a una de las fórm ulas generales (I I), (l l l) y (IV) sig uientes: en las cuales: . GH representa un grupo hidrofóbico; . R30 es un grupo alquilo lineal de 2 a 6 átomos de carbono; R3 es un H o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que comprende: cationes metálicos escogidos ventajosamente del sub-grupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio, cationes orgánicos escogidos ventajosamente del subgrupo que comprende: - cationes a base de amina, - cationes a base de oligoamina, - cationes a base de poliamina (la polietilamina es particularmente preferida). - cationes a base de ácido(s) aminado(s) ventajosamente escogidos de la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina, o los poliaminoácidos catiónicos escogidos ventajosamente del sub-grupo que comprende la polilisina o la oligolisina, . R50 es un grupo alquilo, dialcoxi o diamina de 2 a 6 átomos de carbono; R4 representa un enlace directo o un "separador" a base de 1 a 4 unidades ácido aminadas; . A representa independientemente un radical -CH2-(unidad aspártica) o -CH2-CH2- (unidad glutámica); n' + m' o n" se definen como el grado de polimerización, y varían desde 10 hasta 1000, de preferencia entre 50 y 300.

Ventajosamente, los grupos GH del PO representan cada uno independientemente unos de otros, un radical monovalente que tiene la fórmula siguiente: (GB) en la cual: R5 representa metil(alanina), isopropil(valina). isobutil(leucina), secbutil(isoleucina), bencil(fenilalanina); - R6 representa un radical hidrofóbico que contiene de 6 a 30 átomos de carbono; - I varía de 0 a 6. De acuerdo con una característica destacable de la invención, todo o parte de los grupos hidrófobos R6 de los PO se escogen de manera independiente, del grupo de radicales que comprende: - un alcoxi lineal o ramificado que contiene desde 6 hasta 30 átomos de carbono y puede contener al menos un heteroátomo (de preferencia O y/o N y/o S), y al menos una insaturación, - un alcoxi que contiene desde 6 hasta 30 átomos de carbono y que tiene uno o más carbociclos anillados y contiene eventualmente al menos una insaturación y al menos un heteroátomo (de preferencia O y/o N y/o S), - un alcoxiarilo o un ariloxialquilo desde 7 hasta 30 átomos de carbono y que puede contener al menos una insaturación y/o al menos un heteroátomo (de preferencia O y/o N y/o S). En la práctica y sin que sea limitativo, el radical hidrofóbico R6 del injerto de PO es el producto de un precursor alcohólico escogido del grupo que comprende: octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, alcohol oléico, tocoferol, o colesterol. De acuerdo con una primera modalidad de la invención, las cadenas principales de poliaminoácidos son homopolímeros de alfa-L-glutamato o de alfa-L-glutámico. De acuerdo con una segunda modalidad de la invención, las cadenas principales de poliaminoácidos son homopolímeros de alfa-L-aspartato o de alfa-L-aspártico. De acuerdo con una tercera modalidad de la invención, las cadenas principales de poliaminoácidos son copolímeros de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato o de alfa-L-aspártico/alfa-L-glutámico. Ventajosamente, la distribución de las unidades aspárticas y/o glutámicas de la cadena poliaminoácida principal del PO, es tal, que el polímero así constituido es aleatorio, de tipo bloque, o de tipo multibloque. De preferencia, el PO aplicado en la formulación de acuerdo con la invención, tiene una masa polar que se sitúa entre 2,000 y 100,000 g/mol, y de preferencia entre 5,000 y 40,000 g/mol. De acuerdo con una primera modalidad de la formulación, el radical hidrofóbico R6 del injerto de PO es producto de un precursor alcohólico formado por tocoferol: - 1% < [n/(n + m)]x100 < 10% - de preferencia, 3.5%< [n/(n + m)]x100 < 7.5% - n + m varía desde 100 hasta 400, de preferencia entre 120 y 300. De acuerdo con una segunda modalidad preferida de la formulación, el radical hidrofóbico R6 del injerto de PO es producto de un precursor alcohólico formado por colesterol: - 1% < [n/(n + m)]x100 < 10% - de preferencia 3.5% < [n/(n + m)]x100 < 6.5% n + m varía desde 100 hasta 400, de preferencia entre 120 y 300. En estas dos modalidades preferidas de la formulación de la invención, es ventajoso que la concentración de polímero PO esté comprendida entre 15 y 50 mg/mL. De acuerdo con una variante, el PO de la formulación de acuerdo con la invención es portador de al menos un injerto de tipo polialquilen-glicol, enlazado con una unidad glutamato y/o aspartato. Ventajosamente, este injerto es de tipo polialquilen-glicol con la fórmula (V) siguiente. m en la cual: - R'4 representa un enlace directo o un "separador" a base de 1 a 4 unidades ácido aminadas; - X es un heteroátomo escogido del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno o azufre. R7 y R8 representan independientemente un H, un alquilo lineal de 1 a 4 átomos de carbono; n'" varía desde 10 hasta 1000, de preferencia desde 50 hasta 300. En la práctica, el polialquilenglicol es por ejemplo un polietilenglicol. Es deseable, de conformidad con ia invención, que el porcentaje molar de injerto del polialquilenglicol varíe desde 1 hasta 30%. Los poliaminoácidos PO son por otra parte extremadamente interesantes, por el hecho de que tienen una tasa de injerto ajustable, se dispersan en el agua con un pH de 7.4 (por ejemplo con una solución reguladora fosfatada), para dar suspensiones coloidales. Además, los principios activos, que son los interferones u otros PA escogidos entre las proteínas, los péptidos o las moléculas pequeñas, pueden asociarse espontáneamente con nanopartículas que contienen estos poliaminoácidos PO. Conviene comprender que los PO a base de poliaminoácidos contienen funciones carboxílicas que son neutras (forma COOH), o ionizadas (anión COO"), de acuerdo con el pH de la composición. Por esta razón, la solubilidad en una fase acuosa es directamente función de las tasas de COOH libres de PO (no injertadas por el motivo hidrofóbico) y del pH. En solución acuosa, el catión inverso puede ser un catión metálico tal como sodio, calcio o magnesio, o un catión orgánico tal como trietanolamina, tris(hidrox¡metil)-aminometano o una poliamina tal como polietilenimina. Los PO de tipo poliaminoácidos susceptibles de ser utilizados en la formulación de la invención, se obtienen, por ejemplo, por métodos familiares para el conocedor de la materia. Los poliaminoácidos estadísticos pueden ser obtenidos mediante injerto del injerto hidrófobo, especialmente funcionalizado por el "separador", directamente sobre el polímero, mediante una reacción clásica de acoplamiento. Los PO poliaminoácidos en bloque o en bloques múltiples, pueden ser obtenidos mediante polimerización secuencial de los anhídridos de los N-carboxi-aminoácidos (NCA) correspondientes. Se prepara por ejemplo un poliaminoácido, homopoliglutamato, homopoliaspartato o un copolímero glutamato/aspartato, en bloque, multibloque o aleatorio según los métodos clásicos. Para la obtención de poliaminoácido de tipo alfa, la técnica más corriente está basada en la polimerización de anhídridos de N-carboxi-aminoácidos (NCA), descrita, por ejemplo, en el artículo "Biopolymers, 1976, 15, 1869 y en la obra de H. R. Kricheldorf " Alpha-Aminoacid-N-carboxy Anhydrides and related Heterocycles" Springer Verlag (1987). Los derivados de NCA son de preferencia los derivados NCA-O-Me, NCA-O-Et o NCA-O-Bz (Me = metilo, Et = etilo y Bz = bencilo). Los polímeros son hidrolizados enseguida en condiciones apropiadas para obtener el polímero en su forma acida. Estos métodos se inspiran en la descripción que se proporciona en la patente FR-A-2,801 ,226 de la sociedad solicitante. Cierta cantidad de polímeros utilizables de acuerdo con la invención, por ejemplo, de tipo poli(alfa-L-aspártico), poli(alfa-L-glutámico), poli(a?fa-D-glutámico) poli(gamma-L-glutámico) de masas variables está disponible comercialmente. El poliaspártico de tipo alfa-beta se obtiene por condensación de ácido aspártico (para obtener una polisuccinimida) seguida por una hidrólisis básica (véase Tomida y co-autores. Polymer 1997, 38, 4733-36). El acoplamiento del injerto con una función acida del polímero se realiza fácilmente por reacción del poliaminoácido en presencia de una carbodiimida como agente de acoplamiento, y opcionalmente, un catalizador tal como 4-dimetilaminopipdina y en un solvente apropiado tal como dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona (NMP) o dimetiisulfóxido (DMSO). La carbodiimida, por ejemplo, es diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida. La tasa de injerto es controlada químicamente mediante la estequiometría de los constituyentes y reactivos o por el tiempo de reacción. Los injertos hidrofóbicos funcionalizados por un "separador" se obtienen por acoplam iento péptido clásico o por condensación directa mediante catálisis acida. Estas técnicas son familiares para los conocedores de la materia. Para la síntesis de copolímero en bloque o en bloques múltiples, se utilizan derivados de NCA previamente sintetizados con el injerto hidrofóbico. Por ejemplo, el derivado NCA-hidrofóbico es copolimerizado con el NCA-O-Bencilo, luego se suprimen por hidrólisis, selectivamente, los grupos bencílicos. La síntesis de poliaminoácidos PO conduce preferiblemente a suspensiones acuosas de nanopartículas de PO. Tales suspensiones pueden ser transformadas en polvos de nanopartículas de PO por secado, de manera apropiada y familiar para el conocedor de la materia, como por ejemplo: calentamiento (en autoclave, etc. ), al vacío, utilización de disecantes, liofilización, atomización. Estas nanopartículas de PO, en suspensión o en estado pulverulento, forman una materia prima para la preparación de formulaciones de acuerdo con la invención. Para este propósito, puede ser preciso q ue las form ulaciones de acuerdo con la invención sean el resultado de la asociación no covalente de nanopartículas a base de al menos un PO y al menos un PA, en un medio líquido acuoso. Para la preparación , el PO y/o el interferón o interferones (y/o el eventual PA complementario) pueden estar en forma sólida (de preferencia polvo) y/o en forma l íquida (de preferencia suspensión acuosa coloidal). La asociación interferón o interferones/PO significa, en el sentido de la presente exposición, que el interferón o interferones están asociados con polímero(s) PO (por ejemplo, uno o más poliaminoácido(s) por uno o más enlaces distinto(s) de uno (o de unos) enlace(s) químico(s) covalente(s). Las técnicas de asociación de una o de más interleucinas con PO de acuerdo con la invención, están descritas en particular en la solicitud de patente WO-A-00/30618. Ellas consisten en incorporar al menos un interferón (y/o uno o más de otros principios activos eventuales) en el medio líquido que contiene nanopartículas cargadas y/o asociadas con uno o más interferones (y uno o más de otros principios activos eventuales). La invención tiene, pues, igualmente por objeto, un procedimiento de preparación de la formulación antes mencionada. De acuerdo con una primera modalidad preferida de la invención, este procedimiento está caracterizado porque consiste esencialmente en: - aplicar una suspensión coloidal de nanopartículas de al menos un PO. - mezclar esta suspensión coloidal de nanopartículas de PO con al menos un interferón (y uno o más de otros principios actuvis eventuales), de preferencia en solución acuosa, - añadir eventualmente al menos un excipiente, - según sea necesario, ajustar el pH y/o la osmolaridad y, - eventualmente, filtrar la suspensión así obtenida. Ventajosamente, el interferón (y uno o más de otros principios activos eventuales) están bajo la forma de suspensión o de solución acuosa para la mezcla con la suspensión coloidal de nanopartículas de PO. De acuerdo con una segunda modalidad de la invención, este procedimiento está caracterizado porque consiste esencialmente en: - aplicar un polvo de al menos un polímero PO, - mezclar este polvo con una suspensión o solución acuosa de al menos un interferón, de preferencia en solución acuosa, - añadir eventualmente al menos un excipiente, - según sea necesario, ajustar el pH y/o la osmolaridad, y, - eventualmente, filtrar la suspensión así obtenida. Las formulaciones así obtenidas pueden igualmente ser puestas en formas de geles, de polvo o de película mediante los métodos clásicos familiares para los conocedores de la materia, tales como la concentración por diafiltración o evaporación, recubrimiento, atomización o liofilización, entre otros. Estos métodos pueden ser combinados eventualmente. De lo anterior se desprende un tercer modo de puesta en práctica del procedimiento de preparación de las formulaciones líquidas de acuerdo con la invención, este tercer modo consiste esencialmente en : - aplicar un polvo resultante del secado de la formulación líquida de acuerdo con la invención, tal como se define aquí más adelante, - mezclar este polvo con un medio líquido acuoso, de preferencia bajo agitación, - añadir eventualmente al menos un excipiente, - según sea necesario, ajustar el pH y/o la osmolaridad, y - eventualmente, filtrar la suspensión así obtenida. Los excipientes susceptibles de ser añadidos n uevamente, por ejemplo, son antimicrobianos, soluciones reguladoras de pH , antioxidantes, agentes q ue permiten ajustar la isotonicidad , los cuales son familiares para los conocedores de la materia. Por ejem plo, se podrá hacer referencia a la obra: Injectable Drug Development, P. K. Gupta y co-autores, I ntepharm Press, Denver, Colorado 1999. La filtración eventual de la formulación líq uida sobre filtros de porosidad igual, por ejemplo, a 0.2 µm, permite esterilizarla. Ella también puede ser inyectada directamente a un paciente. Todos estos ejemplos de preparación de formulaciones líquidas de acuerdo con la invención son realizadas ventajosamente en atmósfera y a temperatura ambientes (por ejemplo, 25 °C). De acuerdo con u na disposición interesante de la formulación según la invención , su fracción másica en interleucina(s) no asociada(s) a las partículas submicrónicas (interleucina(s) no asociada(s)) en porcentaje por peso, es tal que: - [interferón o interferones no asociado(s) < 1 - de preferencia [interferón o interferones no asociado(s) < 0.5. De conformidad con la invención, el interferón preferido es el interferón alfa. De acuerdo con otro de sus aspectos, la invención engloba todo producto derivado obtenido a partir de la formulación líquida de acuerdo con la invención, tal como se define anteriormente, y que comprende partículas submicrónicas, formadas por asociaciones no covalentes PO/intererón, tales como las definidas aquí más adelante. En la práctica, estos productos derivados pueden estar constituidos en particular por polvos, geles, implantes o películas, entre otros. Por otra parte, la invención concierne a todo precursor de la formulación líquida inyectable, tal como se definió anteriormente. Tratándose de estos productos derivados, se debe subrayar que la invención concierne igualmente a un procedimiento de preparación de un polvo derivado de la formulación tal como se definió anteriormente, este procedimiento está caracterizado porque dicho polvo es obtenido por secado de la formulación, tal como se definió anteriormente. La formulación de acuerdo con la invención, de preferencia es farmacéutica, sin excluir las formulaciones cosméticas, dietéticas o fitosanitarias que contienen al menos un PO tal como el que se definió anteriormente. De acuerdo con la invención, el eventual principio activo complementario distinto a un interferón, puede ser una proteína, una glicoproteína, una proteína ligada a una o más cadenas polialquilenglicol (de preferencia polietilenglicol (PEG): "proteína PEGilada"), un polisacárido, un liposacárido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un péptido. Este principio activo complementario puede seleccionarse entre hemoglobinas, citocromos, albúminas, interferones, citocinas, antígenos, anticuerpos, eritropoyetina, insulina, hormonas de crecimiento, factores VIII y IX, factores estimulantes de la hematopoyesis o sus mezclas. De acuerdo con una variante, el principio activo es una "pequeña" molécula orgánica hidrofóbica, hidrofílica o anfifílica, por ejemplo, péptidos tales como leuprolide o ciclosporina o moléculas pequeñas tales como las que pertenecen a la familia de las antraciclinas, los taxoides o camptotecinas y sus mezclas. Entre las cualidades primordiales de la formulación de acuerdo con la invención, figuran su carácter inyectable y su capacidad para formar un depósito en el sitio de la inyección, in vivo, por gelificación o aún por agregación de nanopartículas, en presencia de proteínas fisiológicas o análogos. La formulación de acuerdo con la invención puede ser inyectada en particular, por vía parenteral, sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor. La formulación de acuerdo con la invención puede ser administrada también por vía oral, nasal, vaginal, ocular o bucal. Ventajosamente, la formulación está destinada a la preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, interperitoneal, intracerebral o en un tumor, ya sea por vía oral, nasal, vaginal u ocular. Si bien la formulación de acuerdo con la invención es de preferencia farmacéutica, esto no excluye las formulaciones cosméticas, dietéticas o fitosanitarias que contienen al menos un PO tal como el definido aquí más adelante, y al menos un principio activo correspondiente. De acuerdo con aún otro de sus aspectos, la invención concierne a un procedimiento de preparación de medicamentos, en particular para administración parenteral, sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, ya sea por vía oral, nasal, vaginal u ocular, caracterizado porque consiste esencialmente en aplicar al menos una formulación definida previamente y/o todo producto derivado y/o todo precursor de dicha formulación. La invención concierne igualmente a un método de tratamiento terapéutico que consiste esencialmente en administrar la formulación tal como las descrita en la presente exposición , por vía parenteral, sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, ya sea por vía oral, nasal, vaginal u ocular. Siguiendo una variante particular de la invención, este método de tratam iento terapéutico consiste esencialmente en administrar la formulación tal como la descrita anteriormente, por inyección parenteral , sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, de preferencia de manera tal que ella forme un depósito gelificado/reticulado sobre el sitio de la inyección. La invención será mejor comprendida, y sus ventajas y variantes de aplicación se desprenderán de los ejemplos que siguen, y q ue describen la síntesis de los PO formados por poliaminoácidos injertados por un grupo hidrofóbico, su transformación en sistema de liberación prolongada de un interferón, a saber en formulación de acuerdo con la invención (suspensión coloidal acuosa estable) y la demostración de la capacidad de tal sistema no solamente para asociarse a un interferón, sino tam bién sobre todo para gelificarse/reticularse para liberar de manera muy prolongada in vivo los interferones.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Curvas de concentraciones plasmáticas de I FN (picogramo/mL) obtenidas de perros después de inyección subcutánea - de la formulación de IFN (A) de acuerdo con la invención (ejemplos 9 y 10): (curva -B-B-) - y de la formulación de IFN (D) de control, fuera de la invención (ejemplo 10): (curva -Á-Á-), en función del tiempo T en horas y con una dosis de IFN de 60 µg/kg.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: POLÍMERO ANFIFILICO P1 SÍNTESIS DE UN POLIGLUTAMATO INJERTADO CON ALFA- TOCOFEROL DE ORIGEN SINTÉTICO Se solubiliza 5.5 g de un alfa-L-poliglutamato (de masa equivalente aproximadamente a 10,000 Da) con relación a un estándar en polioxietileno y obtenido mediante polimerización de NCAGluOMe seguido por una hidrólisis como se describe en la solicitud de patente FR-A-2,801 ,226) en 92 mL de dimetilformamida (DMF), calentando a 40 °C durante 2 horas. Una vez que el polímero está solubilizado, se deja que regrese a la temperatura a 25 °C, y se le añade sucesivamente 1.49 g de D,L-alfa-tocoferol (> 98% obtenido de Fluka®), previamente solubilizado en 6 L de DMF, 0.09 g de 4-dimetilaminopiridina previamente solubilizada en 6 mL de DMF y 0.57 g de diisopropilcarbodiimida, previamente solubilizada en 6 mL de DMF y 0.57 g de diisopropilcarbodiimida previamente solubilizada en 6 mL de DMF. Después de 8 horas a 25 °C bajo agitación, el medio de la reacción se vierte en 800 mL de agua, que contiene 15% de cloruro de sodio y de ácido clorhídrico (pH igual a 2). El polímero precipitado se recupera enseguida por filtración, se lava con ácido clorhídrico, 0.1 N, y después con agua. El polímero enseguida se resolubiliza en 75 mL de DMF, luego se precipita nuevamente en agua, que contiene, igual que anteriormente, sal y ácido clorhídrico con un pH igual a 2. Después de dos lavados con agua, se lava más veces con éter diisopropílico, A continuación, se seca el polímero en autoclave al vacío, a una temperatura menor de 40 °C. Se obtiene un rendimiento en el orden de 85%.

EJEMPLO 2: POLÍMEROS ANFIFILICOS P2, P3, P4. P5 Y P6 Estos polímeros se obtienen en la misma forma que para la obtención de polímero P1. La tabla 1 siguiente resume las características de estos polímeros. Las del polímero P1 se proporcionan a modo de comparación.

TABLA 1 1 En equivalente polioxietileno. 2 Tasa de injerto molar estimada mediante la RMN del protón. De origen sintético EJEMPLO 3: PREPARACIÓN DE 30 ML DE UNA FORMULACIÓN DE INTERFERÓN ALFA 2b MFN) A BASE DE POLÍMERO P6 (A) PREPARACIÓN PE UNA SOLUCIÓN COLOIDAL DE POLÍMERO ANFIFÍLICO: Se introduce dentro de un frasco 1.5 g de polvo liofilizado del poliaminoácido anfifílico P6 del ejemplo 2 anterior. Este polvo se disuelve en 10 mL de agua estéril para inyección. La solución de polímero se mantiene 16 horas a 35 °C bajo agitación magnética, la osmolaridad de la solución se ajusta a 275 ± 20 mOsmol con la ayuda de un osmómetro Fiske Mark 3, introduciendo la cantidad necesaria de una solución acuosa de NaCI 5.13 M (30% peso/peso). El pH se ajusta si es necesario, a un pH de 7.4 ± 0.2 mediante adición de una solución de NaOH 1 N. La concentración de polímero se ajusta a 45 mg/mL añadiendo una solución acuosa estéril de NaCI 0.15 M. La solución de polímero es filtrada enseguida sobre un filtro con tamaño de poro de 0.8 y de 0.2 mieras, luego se almacena a 4 °C.

(B) ASOCIACIÓN DE LA PROTEÍNA AL POLÍMERO: Dentro de un frasco de vidrio, se mezcla a continuación 26.65 mL e la solución coloidal de polímero P6 precedente y 1.85 mL de solución de IFN (PC GEN; solución concentrada a 2.42 mg/mL). La osmolaridad y el pH se reajustan si es necesario a 300 ± 20 mOsmol y pH de 7.4 ± 0.2 añadiendo sosa 0.1 N y cloruro de sodio al 0.9% estéril. La solución cargada de proteína se pone en maduración durante 5 h a 25 °C en el autoclave, luego se filtra enseguida en un filtro de 0.8 - 0-2 mieras. Se obtiene así 30 mL de una formulación lista para ser inyectada que contiene 0.15 mg/mL de IFN y 40 mg/mL de polímero P6.

EJEMPLO 4: PREPARACIÓN DE UNA FORMULACIÓN DE INTERFERÓN MFN) DE ACCIÓN PROLONGADA DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCIÓN. A BASE DE UNO DE LOS POLÍMEROS P1 A P5 La preparación se efectúa como en el ejemplo 3, preparando en un primer tiempo una solución coloidal de polímero a 1.25 veces la concentración final requerida, luego mezclando esta solución con una solución de interferón concentrada a 2.42 mg/mL. El volumen de la solución de proteína está determinado por la escogencia de la relación de la concentración de polímero con respecto a la concentración de proteína deseada. Como en el ejemplo 3, los ajustes de concentraciones y de pH se realizan añadiendo solución de NaCI y de sosa.

EJEMPLO 5: MEDICIÓN DEL DIÁMETRO HIDRODINÁMICO MEDIO DE NANOPARTÍCULAS DE DIFERENTES POLÍMEROS PO DE ACUERDO CON LA INVENCIÓN El diámetro hidrodinámico medio de ias partículas de polímero PO de acuerdo con la invención, se mide según el procedimiento Md definido a continuación: Las soluciones de PO se preparan en concentraciones de 1 o 2 mg/mL en medio NaCI 0.15 M, y se dejan bajo agitación durante 24 horas. Estas soluciones se filtran enseguida sobre 0.8 - 0.2 µm, antes de analizarlas en difusión dinámica de la luz, gracias a un aparato de tipo Brookhaven, que funciona con un haz electrónico láser con longitud de onda 488 nm y polarizado verticalmente. El diámetro hidrodinámico de las nanopartículas de polímero PO se calcula a partir de la función de auto correlación del campo eléctrico por el método de acumulantes, tal como se describe en la obra ""Surfactant Science Series" volumen 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, capítulo 3, M. Dekker, 1984. Se obtienen los resultados siguientes para los polímeros PO P2, P3, P4 y P6 del ejemplo 2: TABLA 2 EJEMPLO 6: ASOCIACIÓN ESPONTANEA DE UNA PROTEINA CON NANOPARTÍCULAS DE POLÍMERO PO Una solución de regulador de pH fosfatado a 25 mM se prepara a partir de polvo de NaH2PO4 (Sigma, Ref. S-0751) y se ajusta con sosa 1 N (SDS Ref. 3470015) con un pH de 7.2. Una suspensión coloidal de nanopartículas de polímero P1 se prepara por disolución durante una noche de polímero liofilizado a 5 mg /mL en la solución reguladora de pH fosfatada precedente. Una solución madre de BSA (Sigma A-2934) se prepara por disolución durante dos horas de proteína a 10 mg/mL en la misma solución reguladora de pH. Las soluciones madres así como también a solución reguladora de pH, se filtran sobre 0.22 µm. Se realizan mezclas añadiendo volúmenes predeterminados de dos soluciones madres y diluyendo en la solución reguladora de pH fosfatada, de manera de tener al final una gama de muestras con una concentración constante en polímero (0.1 mg/mL) y concentraciones crecientes de proteínas (0 a 1.8 mg/mL). Las muestras se dejan durante 5 horas para que se asocien a 25 °C, luego son analizadas mediante electroforesis capilar en un método denominado frontal, en donde es posible visualizar separadamente la proteína y el complejo proteína-polímero. Para más detalles de esta técnica, consúltese el artículo siguiente: Gao, JY, Dublín PL, Muhoberac BB, Anal. Chem. 1997, 69, 2945. Los análisis se realizan en un aparato Agilent G16000A provisto con un capilar con ampolla de sílice fundido (tipo G1600-62-232). La altura de la primera meseta correspondiente a la proteína libre permite determinar la concentración de BSA no asociada. La experiencia muestra que para cantidades de proteínas inferiores a 0.1 g de proteína por g de polímero, la proteína está asociada a las nanopartículas de polímero.

EJEMPLO 8: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE GELIFICACIÓN C1 PARA LOS POLÍMEROS PO P1 A P4 Y P6 La prueba G1 se aplica a formulaciones de IFN y de IL-2 asociadas con los polímeros P1 a P6 de los ejemplos 1 y 2. Las concentraciones de proteínas de estas formulaciones se presentan en la tabla siguiente. La medición del tiempo de relajación de las formulaciones en presencia de BSA (concentración 30 mg/mL) se efectúa de acuerdo con el procedimiento de la prueba Gl. La concentración crítica C1, para la cual el tiempo de relajación excede de 1 seg., se presenta en la tabla 3 para el IFN.

TABLA 3: CONCENTRACIÓN DE GELIFICACIÓN INDUCIDA POR LAS FORMULACIONES DE IFN EJEMPLO 8: FARMACOCINETICA DEL IFN EN PERROS DESPUÉS DE LA INYECCIÓN SUB -CUTÁNEA DE UNA FORMULACIÓN DE IFN QUE PERTENECE A LA SELECCIÓN SEGÚN LA INVENCIÓN Una formulación (A) de IFN (concentración de 0.3 mg/mL) y de polímero anfifílico P1 con una concentración de 30 mg/mL se prepara según el procedimiento descrito en el ejemplo 4. Esta formulación se inyecta por vía sub-cutánea a perros de raza Beagle (n = 3), en una dosis de 60 µg/kg. Se efectúan tomas de muestra de suero en 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 240 horas. La concentración plasmática de IFN es medida en estas muestras por dosificación ELISA (equipo Inmunotech IM 3193). Se obtiene así un perfil de concentración plasmática media tal como el que se representa en la figura 1, que pone claramente en evidencia la liberación prolongada de la proteína en el suero con respecto a una formulación de control (D) fuera de la invención, de IFN (concentración 0.3 mg/mL) y de polímero anfifílico P6 con una concentración de 40 mg/mL (véase la tabla 5, ejemplo 9). En un plano cuantitativo, la prolongación de la liberación de IFN por las formulaciones de acuerdo con la invención, se estima mediante la medición: (a) del tiempo Tmax, mediana del tiempo en el cual la concentración plasmática es máxima, (b) del tiempo T50, mediana del tiempo al cabo del cual el área bajo la curva de concentración plasmática llega al 50% de su valor máximo medido. En el caso de esta formulación, el tiempo Tmax y el T50 toman los valores: Tmax = 48 horas T50 = 54.2 horas EJEMPLO 9: FARMACOCINÉTICA DE IFN EN PERROS DESPUÉS DE LA INYECCIÓN SUB-CUTÁNEA DE DIVERSAS FORMULACIONES DE IFN A BASE DE POLIAMINOÁCIDOS ANFIFÍLICOS Las formulaciones siguientes se preparan de acuerdo con la forma de operación descrita en el ejemplo 4.

TABLA 4 La formulación A tiene una concentración de polímero superior a la concentración de gelificación C1 medida en el ejemplo 6. En otros términos, el tiempo de relajación, medido en la prueba Gl, es superior a 1 segundo. Esta formulación A pertenece pues a la selección según la invención. En cambio, las formulaciones B, C y D tienen concentraciones inferiores a sus concentraciones de gelificación y no pertenecen a la selección según la invención. Estas formulaciones se inyectan en la dosis de 60 µg/kg a perros Beagle. Las tomas de muestra de plasma se efectúan en 1, 5, 11, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 240 horas. La concentración plasmática de IFN se mide como en el ejemplo precedente. Los tiempos Tmax y T50 para las formulaciones A, B, C y d, se presentan en la tabla 5 siguiente.

TABLA 5 Así, la formulación A, que pertenece a la selección de acuerdo con la invención, presenta una duración de liberación considerablemente aumentada con respecto a las formulaciones B, C y D, las cuales no pertenecen a la selección de acuerdo con la invención.

EJEMPLO 10: OBSERVACIÓN DE LA GELIFICACIÓN IN VIVO DE FORMULACIONES DE ACUERDO CON LA INVENCIÓN DESPUÉS DE LA INYECCIÓN SUB-CUTÁNEA El comportamiento sub-cutáneo de las formulaciones de acuerdo con la invención, ha sido estudiado en el puerco doméstico.

Se ha procedido a inyecciones bajo la piel del vientre, a 4 mm de profundidad, de seis puercos domésticos, con 0.3 mL de las formulaciones siguientes: Formulación A: solución acuosa isotónica con un pH de 7.3, del polímero P6 del ejemplo 2 concentrado a 45 mg/mL. Formulación B: solución acuosa isotónica con un pH de 7.3, de polímero P1 del ejemplo 1, concentrado a 20 mg/mL. Los sitios inyectados se extrajeron 72 horas después de la administración. El examen histológico revela la presencia de un depósito gelificado de polímero para la formulación B. Se presenta bajo la forma de zonas uniformemente coloreadas. Este fenómeno no está en contradicción con lo observado para la formulación A, para la cual el polímero se infiltró entre las fibras de colágeno. Se puede destacar que la matriz de polímero B es perfectamente biodegradable porque el tejido vuelve completamente a su estado normal después de 21 días.

Claims (34)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de interferón o interferones, esta formulación comprende una suspensión coloidal, acuosa, de base viscosa, a base de partículas submicrónicas de polímero (PO) biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos (GH), dichas partículas están asociadas de forma no covalente con al menos una interleucina y eventualmente con al menos otro principio activo (PA), caracterizada porque: - el medio dispersivo de la suspensión está constituido esencialmente por agua. - ella es apta para ser inyectada por vía parenteral y para formar enseguida in vivo un depósito gelificado, esta formación de depósito gelificado: . por una parte, es provocada al menos parcialmente por al menos una proteína fisiológica presente in vivo, . y permite, por otra parte, prolongar y controlar la duración de la liberación del PA in vivo, más allá de 24 horas después de la administración, - es líquida en las condiciones de inyección, - es igualmente líquida a la temperatura y/o pH fisiológicos, y/o en presencia: . de electrolito fisiológico en concentración fisiológica, . y de al menos un agente tensoactivo.

2. Una formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque su concentración en [PO] está fijada a un valor suficientemente elevado para permitir la formación de depósito gelificado in vivo, después de la inyección parenteral, en presencia de al menos una proteína fisiológica.

3. Una formulación farmacéutica líquida para la liberación prolongada de interferón o interferones, y eventualmente de otros principio(s) activo(s) -PA-, esta formulación: - es líquida en atmósfera ambiente, - es igualmente líquida a la temperatura y/o al pH fisiológicos y/o en presencia: . de electrolito fisiológico en concentración fisiológica, . y de al menos un agente tensoactivo, - y comprende una suspensión coloidal, acuosa, de base viscosa, a base de partículas submicrónicas de polímero PO biodegradable, hidrosoluble y portador de grupos hidrofóbicos GH, dichas partículas están asociadas de forma no covalente con al menos un principio activo PA y el medio dispersivo de la suspensión está constituido esencialmente por agua, caracterizada porque su concentración de [PO] está fijada en un valor suficientemente elevado como para permitir la formación de depósito gelificado in vitro, en presencia de al menos una proteína.

4. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque su concentración de [PO] es tal que: - [PO] > 0.9.C1, - de preferencia 20.C1> [PO] > C1, - y aún más preferible 10. C1 > [PO] > C1 donde C1 representa la concentración de "gelificación inducida" de partículas de PO, tal como se miden en una prueba G1.

5. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque su viscosidad es ¡nferior o igual a 5 Pa.s.

6. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el polímero (PO) es un poliaminoácido formado por unidades aspárticas y/o unidades glutámicas, al menos una parte de estas unidades son portadoras de injertos que contienen al menos un grupo hidrofóbico (GH).

7. Formulación de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada además porque el (o los) PO están definidos por la fórmula general (I) siguiente: CO en la cual: . R1 representa un H, alquilo lineal de 2 a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 a 10 átomos de carbono, bencilo, una unidad ácido aminada terminal o -R4-[GH]; . R2 representa un H, un grupo acilo lineal de 2 a 10 átomos de carbono o ramificado de 3 a 10 átomos de carbono, un piroglutamato o -R4-[GH]; . R3 es un H o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que consiste en: cationes metálicos escogidos ventajosamente del sub-grupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio, cationes orgánicos escogidos ventajosamente del subgrupo que comprende: - cationes a base de amina, - cationes a base de oligoamina, - cationes a base de poliamina (la polietilenimina es particularmente preferida), - cationes a base de ácido(s) aminado(s) escogidos ventajosamente dentro de la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina, o los poliaminoácidos catiónicos escogidos ventajosamente del sub-grupo que comprende la polilisina o la oligolisina; . R4 representa un enlace directo o un "separador" a base de 1 a 4 unidades ácido aminadas; . A representa independientemente un radical -CH2- (unidad aspártica) o CH2-CH2- (un idad glutámica) ; . n/(n+m) se define como la tasa de injerto molar y varía desde 0.5 hasta 100% molar; . n/(n + m) se define como la tasa de injerto molar y su valor es suficientemente bajo como para q ue el PO puesto en solución en el ag ua con un pH de 7 y a 25 °C, forme una suspensión coloidal de partículas submicrónicas de PO, de preferencia n/(n + m) , está comprendido entre 1 y 25% molar, y más preferiblemente entre 1 y 15% molar; . n + m varía desde 1 0 hasta 1 000, de preferencia entre 50 y 300; . GH representa un grupo hidrofóbico.

8. Formulación de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada además porque el (o los) PO responden a una de las fórmulas generales (I I), (l l l) y (IV) siguientes: (m ) en las cuales: . GH representa un grupo hidrofóbico; . R30 es un grupo alquilo lineal de 2 a 6 átomos de carbono; R3 es un H o una entidad catiónica, de preferencia seleccionada del grupo que comprende: cationes metálicos escogidos ventajosamente del subgrupo que comprende: sodio, potasio, calcio, magnesio, cationes orgánicos escogidos ventajosamente del sub-grupo que comprende: - cationes a base de amina, - cationes a base de oligoamina, - cationes a base de poliamina (la polietilenimina es particularmente preferida). - cationes a base de ácido(s) aminado(s) ventajosamente escogidos de la clase que comprende los cationes a base de lisina o de arginina, o los poliaminoácidos catiónicos escogidos ventajosamente del sub-grupo que comprende la polilisina o la oligolisina, . R50 es un grupo alquilo, dialcoxi o diamina de 2 a 6 átomos de carbono; . R4 representa un enlace directo o un "separador" a base de 1 a 4 unidades ácido aminadas; . A representa independientemente un radical -CH2-(unidad aspártica) o -CH2-CH2- (unidad glutámica); n' + m' o n" se definen como el grado de polimerización, y varían desde 10 hasta 1000, de preferencia entre 50 y 300.

9. Formulación de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, caracterizada además porque los grupos GH del PO representen cada uno independientemente unos de otros un radical monovalente de la fórmula siguiente: (GH) en la cual R5 representa metil(alanina), isopropil(valina), isobutil(leucina), secbutil(isoleucina), bencil(fenilalanina); - R6 representa un radical hidrofóbico que contiene de 6 a 30 átomos de carbono; - I varía de 0 a 6.

10. Formulación de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada además porque todos o parte de sus radicales hidrofóbicos R6 de los PO se escogen de manera independiente del grupo de radicales que comprende: - un alcoxi lineal o ramificado que contiene de 6 a 30 átomos de carbono, y puede contener al menos un heteroátomo (de preferencia O y/o N y/o S) y/o al menos una insaturación, - un alcoxi que contiene de 6 a 30 átomos de carbono y que tienen uno o más carbociclos anillados y contiene eventualmente al menos una insaturación y/o al menos un heteroátomo (de preferencia O y/o N y/o S), - un alcoxiarilo o un ariloxialquilo de 7 a 30 átomos de carbono y que puede contener al menos una insaturación y/o al menos un heteroátomo (de preferencia O y/o N y/o S).

11. Formulación de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, caracterizada además porque el radical hidrofóbico R6 del injerto de PO proviene de un precursor alcohólico escogido del grupo que consiste en octanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, octadecanol, alcohol oleico, tocoferol o colesterol.

12. Formulación de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada además porque el PO está constituido por un homopolímero de alfa-L-glutamato o de alfa-L-glutámico.

13. Formulación de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada además porque el PO está constituido por un homopolímero de alfa-L-aspartato o de alfa-L-aspártico.

14. Formulación de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada además porque el PO está constituido por un copolímero de alfa-L-aspartato/alfa-L-glutamato o de alfa-L-aspártico /alfa-L-glutámico.

15. Formulación de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada además porque en el PO, la distribución de las unidades aspárticas y/o glutámicas portadoras de injertos que comprenden al menos un motivo GH es tal, que el polímero así constituido es aleatorio, de tipo bloque o de tipo multibloque.

16. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además porque la masa molar del PO se sitúa entre 2000 y 100,000 g/mol, y de preferencia entre 5000 y 40,000 g/mol.

17. Formulación de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada además porque el radical hidrofóbico R6 del injerto de PO es producto de un precursor alcohólico formado por tocoferon, y porque: - 1% < [n/(n + m)]x100 < 10% - de preferencia, 3.5%< [n/(n + m)]x100 < 7.5% - n + m varía desde 100 hasta 400, de preferencia entre 120 y 300.

18. Formulación de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada además porque el radical hidrofóbico R6 del injerto de PO es producto de un precursor alcohólico formado por colesterol: - 1% < [n/(n + m)]x100 < 10% - de preferencia, 3.5%< [n/(n + m)]x100 6.5% - n + m varía desde 100 hasta 400, de preferencia entre 120 y 300.

19. Formulación de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, caracterizada además porque la concentración de polímero PO está comprendida entre 15 y 50 mg/mL

20. Formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 19, caracterizado además porque su viscosidad a 25 °C es inferior o igual a 5 Pa.s.

21. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 20, caracterizada además porque los polímeros modificados hidrofóbicos PO se seleccionan del grupo que consiste en poliaminoácidos, polisacáridos, - de preferencia en el sub-grupo que comprende los pululanos y/o los chitosanos y/o los mucopolisacáridos-, las gelatinas o sus mezclas.

22. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hata 23, caracterizada además porque su fracción másica de interferón o interferones no asociado(s) a las partículas submicrónicas (interferón o interferones no asociado(s)) en % por peso, es tal que: - [interferón o interferones no asociado(s)] < 1 de preferencia [interferón o interferones no asociado(s)] < 0.5

23. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 22, caracterizada además porque el interferón es interferón alfa.

24. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 23, caracterizado además porque el (o los) principio(s) activo(s) complementario(s) distintos a la(s) interleucina(s) son una proteína, una glicoproteína, una proteína enlazada a una o más cadenas polialquilenglicol (de preferencia polietilenglicol (PEG): "proteína PEGilada"), un polisacárido, un liposacárido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un péptido, este (o estos) principio(s) activo(s) complementario(s) se seleccionan de preferencia entre hemoglobinas, citocromos, albúminas, intererones, citocinas, antígenos, anticuerpos, eritropoyetina, insulina, hormonas de crecimiento, factores VIII y IX, factores estimulantes de la hematopoyesis o sus mezclas.

25. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 24, caracterizada además porque es inyectable por vía parenteral, sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor.

26. Formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 25, caracterizada además porque está destinada a la preparación de medicamentos, en particular para su administración parenteral, sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intracerebral o en un tumor, ya sea por vía oral, nasal, vaginal u ocular.

27. Procedimiento para la preparación de medicamentos, en particular para su administración parenteral, sub-cutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, ¡ntracerebral, o en un tumor, ya sea por vía oral, nasal, vaginal u ocular, caracterizado además porque consiste esencialmente en aplicar al menos una formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 26.

28. Producto derivado caracterizado porque contiene partículas submicrónicas, formadas por asociaciones no covalentes PO/PA, tales como las definidas en la reivindicación 1, y porque se obtiene a partir de la formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 26.

29. Producto derivado de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizado además porque está constituido por un polvo o por un gel.

30. Procedimiento de preparación de la formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 26, caracterizado además porque consiste esencialmente en: - aplicar una suspensión coloidal de nanopartículas de al menos un PO, - mezclar esta suspensión coloidal de nanopartículas de PO con al menos un interferón (y/o uno o más de otros principios activos eventuales), de preferencia en solución acuosa, - añadir eventualmente al menos un excipiente, - en caso necesario, ajustar el pH y/o la osmolaridad, y - eventualmente, filtrar la suspensión así obtenida.

31. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 30, caracterizado además porque el (o los) PA están bajo la forma de suspensión o de solución acuosa para la mezcla con la suspensión coloidal de nanopartículas de PO.

32. Procedimiento de preparación de la formulación de acuerdo con una cualq uiera de las reivindicaciones 1 hasta 26 , caracterizado además porque consiste esencialmente en: - aplicar un polvo de al menos un polímero PO, - mezclar este polvo con una suspensión o solución acuosa de al menos un ¡nterferón (y uno o más de otros principios activos eventuales), de preferencia en solución acuosa, - añadir eventualmente al menos un excipiente, - de ser necesario, ajustar el pH y/o la osmolaridad y - eventualmente, filtrar la suspensión así obtenida.

33. Procedim iento de preparación de la form ulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 26, caracterizado además porque consiste esencialmente en : - aplicar un polvo proveniente del secado de la formulación líquida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 26, - mezclar este polvo con un medio líquido acuoso, de preferencia bajo agitación, - añadir eventualmente al menos un excipiente, - de ser necesario, ajustar el pH y/o la osmolaridad , y - eventualmente filtrar la suspensión así obtenida.

34. Procedim iento de preparación de un polvo derivado de la formulación , de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 26, caracterizado además porque dicho polvo se obtiene por secado de la formulación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 26.