MX2008015164A - Vacuna contra organismos de tipo rickettsia. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona al uso de bacterias del género Streptococcus para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por organismos tipo Rickettsia.

Description

VACUNA CONTRA ORGANISMOS DE TIPO RICKETTSIA Descripción de la Invención La presente invención se refiere al uso de bacterias del género Streptococcus para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por organismos de tipo Rickettsia . La infección de varios peces salmónidos y no salmónido con organismos de tipo Rickettsial/Rickettsia se ha reportado durante décadas, el primer reporte se origina desde 1939 en donde un organismo de tipo Rickettsia fue encontrado en Tetrodon fahaka del río Nilo. Sin embargo fue hasta 1975 que se hizo una primera observación de la presencia de un organismo de tipo Rickettsia en células tisulares teñidas por Ozel M. y Schwanz-Pfitzner, I., (Zentralblatt fur Bacteriologie, Microbiologic und Hygiene, I abt Origínate A 1975; 230: 1-14 (1975)). La importancia real de Piscirickettsia salmonis como patógeno se ha esclarecido dramáticamente en 1989, cuando en Chile 1.5. millones de salmones Coho de tamaño comercial murieron por entonces un agente infeccioso desconocido. (Bravo, S. and Campos, M. FHS/AFS Newsletter 17:3 (1989), Cvítanich y col., FHS/AFS Newsletter 18:1-2 (1990), Fryer y col., Físh Pathol. 25: 107-1114 (1990)). Se encontró que agente infeccioso fue Piscirickettsia salmonis. La infección por Piscirickettsia salmonis de la lobina blanca ha sido mostrada recientemente por Arkush, K.D. y col., en Diseases of Aquatic Organisms 64: 107-119 (2005). Los organismos tipo Rickettsia, también referidos más adelante como RLOs, ahora se ha descrito entre otros en Tilapia (Chern, R.S. and Chao, C.B., Fish Pathology 29: 61-71 (1994), Chen, S.C. y col., J. Fish Diseases 17: 591-599 (1994), Mauel y col., Diseases of aquatic organisms, 53: 249-255 (2003) , Fryer, JX and Mauel, MJ., Emerging Infectious Diseases 3: 137-144 (1997)), mero, (Chen, S.C. y col., Journ. Fish Dis. 23: 415-418 (2000)), pleco ojo azul (Khoo, L. y col., J. Fish Diseases 18:35-48 (1995)) y lobina (Comps, M. y col., Bull. Europ. Ass. Fish Pathol. 16, 30-33 (1996)). Estas especies de peces son peces tropicales o mediterráneos. Recientemente, se mostró que los RLOs también infectaron especies atlánticas. Fue mostrado por Nylund y col., que RLOs causa mortalidad en el bacalao noruego. Se han explicado de manera suficiente las diferencias entre la Rickettsia verdadera, es decir Piscirickettsia salmonis según lo descrito por Fryer, JX y col., (Int. J. Syst. Bacterid 42: 120-126 (1992)) y los organismos tipo Rickettsia tales como Tilapia-RLO descritos hace una década por Chern (ver arriba). En su revisión, Mauel y Miller una vez más describen las diferencias (Veterinary Microbiology 87: 279-289 (2002)). A pesar de los esfuerzos anteriores, no existe ninguna vacuna basada en Rickettsia o RLO realmente eficaz contra Rickettsia o RLO. Las vacunas actualmente usadas son experimentales, y comparten como una característica común que ofrecen solamente una protección moderada. Además, su nivel de protección es inconsistente (Mauel y Miller, ver arriba). Se han publicado solamente dos Solicitudes de Patente, WO 01/68865 y CA 2,281,913, referentes a las vacunas de Piscirickettsia salmonis. Requieren varias vacunas subunitarias de Piscirickettsia . Un ensayo de campo con una vacuna a base de bacterina de Piscirickettsia salmonis, en salmones Coho, se ha descrito por Smith y col., (Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 15(4): 137-141 (1995)). Sin embargo hasta ahora los resultados con las bacterinas de Piscirickettsia salmonis han sido variables, no muy consistentes y frecuentemente están por debajo de los estándares de protección de vacuna aceptables. Estos problemas son reflejados por el hecho de que actualmente ninguna vacuna comercial basada en Rickettsia o RLO es completamente efectiva contra Rickettsia u organismos de tipo Rickettsia en el mercado. Actualmente, el tratamiento con antibióticos, específicamente quinolonas, es el único tratamiento contra la infección por RLO. En gran medida la mayor parte del uso de los antibióticos es terapéutico. El tratamiento profiláctico entre otros incluye la inyección i.p. del pez antes de desovar, y la incorporación de antibióticos en el agua durante el endurecimiento de los huevos. El uso de los antibióticos sin embargo no es el método preferido desde un punto de vista ecológico, debido a si existe el hecho de que se ha reportado la resistencia contra varios antibióticos. Está claro que hay realmente una necesidad de vacunas de RLO nuevas y más efectivas. Es un objetivo de la presente invención proporcionar tales vacunas. Ahora fue encontrado asombrosamente, que las bacterias del género Streptococcus, es decir las bacterias gram-positivas no RLO, son capaces de proporcionar un alto nivel de protección duradera contra la infección por RLO. Esta protección es conferida por las bacterias de tipo Streptococcus cuando se administran como bacterina y/o cuando se administran en una forma viva atenuada. El mecanismo de trabajo detrás de este hallazgo inesperado es actualmente desconocido. Sin embargo se asume que un componente presenta en o unido a la superficie celular, y común para todas las bacterias de tipo Streptococcus, es un estimulador potente de la inmunidad inter-específica en peces contra RLO. La inter-especificidad a este respecto significa que no es inducido por RLO pero sin embargo proporciona protección contra RLO. Por lo tanto, la invención se relaciona al uso de una bacteria del género Streptococcus para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por RLO. Para la fabricación de tal vacuna, el estado de la bacteria; viva o inactivada, no es realmente importante. Los importante es el hecho de que el estimulador de la inmunidad inter-específica en peces contra RLO aún esté presente. Esto puede ser asegurado usando todas las preparaciones bacterianas. Según lo mencionado arriba, no es importante si la bacteria en la preparación está viva, murta o incluso fragmentada (por ejemplo presionándola a través de una French Press). Lo importante es que los componentes que componen la bacteria aún estén presentes en la vacuna. Las bacterias vivas atenuadas son muy convenientes, debido a que por definición contiene el factor que estimula la inmunidad inter-específica contra RLO. Y las bacterias atenuadas tienen ventaja sobre las bacterinas, con respecto a que pueden ser administradas fácilmente sin un adyuvante. Por otra parte se auto-reproducen hasta el punto en el cual el sistema inmunológico las detiene, se pueden administrar como resultado de su número inferior de células. Por lo tanto, en una forma preferida, la invención se relaciona al uso de bacterias de tipo Streptococcus atenuadas vivas para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por organismo de tipo Rickettsia de acuerdo a la invención. Por otra parte, el factor que estimula la inmunidad inter-específica contra RLO también está presente en bacterias cuando estas bacterias están en forma de bacterina. Las bacterinas tienen ventaja sobre las bacterias atenuadas vivas con respecto a que son muy seguras.

Por lo tanto, en otra forma preferida, la invención se relaciona al uso de un bacterina de tipo Streptococcus para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por organismos tipo Rickettsia de acuerdo a la invención. El género Streptococcus comprende entre otros el Streptococcus iniae, Streptococcus difficile y Streptococcus agalactias. Las vacunas para el uso de acuerdo a la invención pueden ser preparadas a partir de un cultivo bacteriano de acuerdo a las técnicas bien conocidas por el médico experto. Las revisiones referentes a las vacunas de peces y su fabricación son entre otras por Sommerset, L, Krossoy, B., Biering, E. y (2005), por Buchmann, K., Lindenstrom, T. y Bresciani, en J. Acta Parasitológica 46: 71-81 (2001), por Vinitnantharat, S., Gravningen, K. y Greger, E. en Advances in veterinary medicine 41 : 539-550 (1999) y por Anderson, D.P. en Developments in Biological Standardization 90: 257-265 (1997). Una bacteria viva atenuada es una bacteria que es menos patógena que sus contrapartes de tipo silvestre, aunque sin embargo inducen una inmunorespuesta efectiva. Las cepas atenuadas se pueden obtener a través de rutas clásicas, es decir a través de la técnica tal como mutagénesis química, radiación UV y similares, o por mutagénesis de sitio objeto. Un bacterina se define en la presente como bacterias en una forma inactiva. El método usado para la inactivación parece ser no relevante para la actividad de la bacterina. Los métodos clásicos para la inactivación tal como el tratamiento térmico, tratamiento con formalina, etilenimina binaria, timerosal y similares, todos bien conocidos en la técnica, son igualmente aplicables. La inactivación de bacterias por medio de la tensión física, usando por ejemplo una French Press proporciona una materia prima igualmente conveniente para la fabricación de una vacuna de acuerdo a la invención. Las vacunas de acuerdo a la invención comprenden básicamente una cantidad efectiva de una bacteria para el uso de acuerdo a la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El término "efectiva" según lo utilizado en la presente se define como la cantidad suficiente para inducir una inmunorespuesta en los peces objeto. La cantidad de células administradas dependerá de la especie de Streptococcus usada, presencia de un adyuvante, ruta de administración, momento de administración, edad de los peces que se vacunarán, salud general, temperatura del agua y dieta. Cuando se inicia a partir de las vacunas comercialmente disponibles, el fabricante proporcionará esta información. De lo contrario, el experto en la técnica encontrará suficiente guía en las referencias mencionadas antes y en la información proporcionada abajo, especialmente en los ejemplos.

Hablado en términos generales, las vacunas para el uso de acuerdo a la invención que se basan en bacterinas se pueden administrar generalmente a una dosificación de 103 a 1010, preferiblemente 106 a 109, más preferiblemente entre 108 y 109 bacterias. Una dosis que excede de 1010 bacterias, aunque tnmunológicamente sea conveniente, será menos atractiva por razones comerciales. Las vacunas de acuerdo a la invención que se basan en bacterias atenuadas vivas se pueden administrar a una dosis más baja, debido al hecho de que las bacterias continuarán reproduciéndose durante algún tiempo después de la administración. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables que son convenientes para el uso en una vacuna para el uso de acuerdo a la invención son agua estéril, solución salina, amortiguadores acuosos tales como PBS y similares. Además una vacuna de acuerdo a la invención puede comprender otros aditivos tales como adyuvantes, estabilizadores, antioxidantes y otros, según lo descrito más abajo. Las vacunas para el uso de acuerdo a la presente invención, especialmente las vacunas que comprenden un bacterina, pueden en una presentación preferida también contener una sustancia inmunoestimulante, una llamada adyuvante. Los adyuvantes en general comprenden sustancias que elevan la inmunorespuesta del hospedador de una manera no específica. Un número de diversos adyuvantes se conoce en la técnica. Los ejemplos de adyuvantes usados con frecuencia en el cultivo de peces y crustáceos son muramildipéptidos, lipopolisacáridos, varios glucanos y glicanos y Carbopol®. Una descripción extensa de los adyuvantes convenientes para las vacunas de peces y crustáceos es dada en el documento de revisión de Jan Raa ((Reviews in Fisheries Science 4(3): 229-288 (1996)). La vacuna también puede comprender un llamado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al cual la bacteria se adhiere, sin unión covalente. Tales vehículos son bio-microcápsulas entre otros, micro-alginatos, liposomas y macrosoles, todos conocidos en la técnica. Una forma especial de tal vehículo, en el cual el antígeno se integra parcialmente en el vehículo, es el llamado ISCOM (Patentes Europeas EP 109,942, EP 180,564, EP 242,380). Además, la vacuna puede comprender uno o más compuestos tensoactivos o emulsificadores convenientes, por ejemplo Span o Tween. Los adyuvantes de aceite convenientes para el uso en emulsiones de agua-en-aceite son por ejemplo aceites minerales o aceites metabolizables. Los aceites minerales son por ejemplo Bayol®, Marcol® y Drakeol®. Un ejemplo de adyuvantes no minerales de un aceite es por ejemplo Montanide-ISA-763-?. Los aceites metabolizables son por ejemplo aceites vegetales, tales como aceites de cacahuete y aceite de soya, aceites animales tales como escualano de aceite de peces y escualeno, y tocoferol y sus derivados. Los adyuvantes convenientes son por ejemplo emulsiones w/o y emulsiones dobles w/o/w. Las emulsiones w/o muy convenientes por ejemplo se obtienen a partir de 5-50% p/p de fase de agua y 95-50% p/p aceite adyuvante, más preferiblemente 20-50% p/p de fase de agua y 80-50% p/p adyuvante de aceite. Un ejemplo de un adyuvante de nanopartículas a base de agua es por ejemplo Montanide-IMS-2212. La cantidad de adyuvante agregada depende de la naturaleza del adyuvante por sí mismo, y la información con respecto a tales cantidades será proporcionada por el fabricante.

Frecuentemente, la vacuna se mezcla con estabilizadores, por ejemplo para proteger las proteínas propensas a degradación contra la degradación, para mejorar el período de validez de la vacuna, o para mejorar la eficacia de deshidratación por congelación. Los estabilizadores útiles son entre otros SPGA (Bovarnik y col.; J. Bacteriology 59:509 (1950)), carbohidratos por ejemplo sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sucrosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o sus productos de degradación, y amortiguadores, tales como fosfatos alcalinos-metálicos. Además, la vacuna se puede suspender en un diluyente fisiológicamente aceptable. Es evidente, que otras formas de adyuvantes, agregando compuestos de vehículo o diluyentes, emulsionando o estabilizando una proteína también se incorporan a la presente invención .

Muchas maneras de administración, conocidas todas en la técnica se pueden aplicar. Las vacunas de acuerdo a la invención se administran preferiblemente a peces vía inyección, inmersión, sumergimiento u oralmente. Se debe tener presente sin embargo que la ruta de administración depende altamente de la manera en la cual la vacuna estreptocócica para el uso de acuerdo a la invención se administra generalmente. Simplemente como un ejemplo, si la bacteria de tipo Streptococcus ahora usada para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por RLO es por ejemplo una bacteria viva atenuada, la vacuna podría entre otras ser administrada por baño de inmersión o vacunación, debido a la facilidad de administración. Tales vacunas son aplicadas frecuentemente por vacunación de inmersión. Si por una parte la bacteria de tipo Streptococcus ahora usada para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por RLO está en forma de bacterina, el uso oral y por ejemplo el uso intraperitoneal son formas de administración atractivas. Hablado generalmente, si la vacuna puede ser mejorada mezclando un adyuvante, la manera de administración sería preferiblemente la ruta intraperitoneal. Desde un punto de vista inmunológico, la vacunación intraperitoneal con un bacterina es una ruta muy efectiva de vacunación, especialmente debido a que permite la incorporación de adyuvantes. El protocolo de administración se puede optimizar de acuerdo con la práctica de vacunación estándar. El experto sabría de que manera hacer esto, o encontraría la guía en los documentos mencionados anteriormente. La edad de los peces que se vacunarán no es crítica, aunque claramente se desea vacunarlos contra RLO tan pronto como sea posible, es decir antes de la posible exposición al patógeno. Para las vacunas basadas en bacterias de tipo Streptococcus descritas arriba, generalmente hablado éstas se administran en el momento en el cual se administrarían normalmente para la protección contra la infección de Streptococcus. A partir de ese momento, los peces entonces serían protegidos adicionalmente contra RLO. La vacunación por inmersión sería la vacunación de elección especialmente cuando los peces aún son pequeños, por ejemplo entre 2 y 5 gramos. Los peces de 5 gramos y más puede también vacunarse por medio de inyección. Para la administración oral la vacuna se mezcla preferiblemente con un portador conveniente para la administración oral es decir celulosa, alimento o una sustancia metabolizable tal como alfa-celulosa o diversos aceites de origen vegetal o animal. También un método atractivo es la administración de vacuna a altas concentraciones de organismos de alimentación vivos, seguido por la alimentación de organismos de alimento vivos a los peces. Los portadores particularmente preferidos de alimento para el suministro oral de la vacuna de acuerdo a la invención son organismos de alimento vivos que pueden encapsular la vacuna. Preferiblemente, la bacteria de tipo Streptococcus para el uso de acuerdo a la invención es de la especie Streptococcus iniae, agalactiae o difficile. Más preferiblemente, la bacteria para el uso de acuerdo a la invención es de la especia Streptococcus difficile. Generalmente las vacunas para el uso de acuerdo a la invención serán preferiblemente vacunas que protejan contra RLO y además contra más de un microorganismo patógeno no RLO. Sería beneficioso utilizar, además de las bacterias de tipo Streptococcus para la fabricación de la vacuna, también por lo menos otro microorganismo o virus patógeno de pez, un antígeno de tal microorganismo o virus o material genético que codifique tal antígeno, en una vacuna de combinación. La ventaja de tal vacuna es que no sólo proporciona protección contra RLO y contra la infección de tipo Streptococcus, sino también contra otras enfermedades. Por lo tanto, una forma preferida de esta modalidad se relaciona a una vacuna en donde la vacuna comprende por lo menos otro microorganismo o virus que sea patógeno de pez, u otro antígeno o material genético que codifique el otro antígeno, en donde el otro antígeno o material genético se deriva de un virus o microorganismo patógeno de pez. Los ejemplos de patógeno de pez comercialmente importantes en peces tropicales y/o mediterráneos son Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae, subespecies piscicidae, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garvieae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, virus de necrosis viral, iridovirus y virus del herpes Koi. Los ejemplos de patógeno de pez de agua . fría comercialmente importantes son Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicidae, Vibrio salmonicidae, Moritella viscosa, Vibrio ordalii, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Streptococcus sp., Lactococcus garvieae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, Piscirickettsia salmonis, virus de enfermedad pancreática de salmón, virus de la enfermedad del sueño, virus de la necrosis nerviosa viral, virus de necrosis pancreática infecciosa e iridovirus. Los parásitos de infección de salmónidos son entre otros Lepeophtherius salmonis, Caligus elongatus, Cryptobia salmositica, Myxobolus cerebralis y Kudoa thyrsites. Un parásito que infecta los peces de agua dulce es por ejemplo Ichthyophthirius multifiliis. Los parásitos de Tilapia son por ejemplo Dactylogyrus spp. y Trichodina spp. Los peces marinos pueden sufrir entre otros del parásito Benedenia seriolae. Por lo tanto, en una forma más preferida de esta modalidad, el otro microorganismo o virus se selecciona del siguiente grupo de patógeno de pez: Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subspecies piscicidae, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garvieae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, virus de necrosis viral, iridovirus y virus del herpes de Koi, Aeromonas salmonicidae, Vibrio salmonicidae, Moritella viscosa, Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis, virus de enfermedad pancreática de salmón, virus de enfermedad del sueño, virus de necrosis nerviosa viral, virus de necrosis pancreática infecciosa, iridovirus, Lepeophtherius salmonis, Caligus elongatus, Cryptobia salmositica, Myxobolus cerebralis, Kudoa thyrsites, Ichthyophthirius multifiliis, Dactylogyrus spp. , Trichodina spp. y Benedenia seriolae. Los ejemplos dados abajo proporcionan la guía amplia de cómo utilizar las bacterias del género Streptococcus para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por organismos tipo Rickettsia. Ejemplos. Ejemplo 1 : En este ejemplo se proporciona una comparación entre la eficacia de vacunas basadas en RLO, vacunas basadas en Streptococcus y una vacuna gram-negativa de tipo no Streptococcus Vacunas: 1) Vacunas basadas en RLO Una cepa de RLO aislada originalmente de tilapia enferma, cultivada en Indonesia que mostró signos comunes de enfermedad por RLO, fue utilizada como cepa de vacuna y como cepa de desafío. Esta cepa fue sub-cultivada en agar de chocolate y se inoculó posteriormente y creció en un caldo líquido en un agitador orbital a 26°C - 150 rpm. Después de la incubación de aproximadamente 24 h el cultivo alcanzó un OD660nm de 0.674 y se inactivo por la adición de 0.5% formalina y se transfirió a un nuevo recipiente. La cantidad total de células bacterianas en el cultivo inactivado fue de 3.7 x 109 células/ml. 60 mi de cultivo inactivado durante la noche fueron centrifugados a 3.000 rpm durante 30 minutos a 4°C y el gránulo fue suspendido nuevamente en 20 mi de sobrenadante dando por resultado una concentración celular efectiva de 1.11 x 1010 células por mi. Este antígeno fue utilizado para la preparación de vacuna. 2) Vacunas basadas en Vibrio anguillarum Las vacunas de V. anguillarum fueron preparadas a partir de una cepa del serotipo 02 A de V. anguillarum Fueron aplicados los métodos estándar del desarrollo de V. anguillarum . Fueron preparadas las vacunas que comprendieron 2.4 x 109 y 1.0 x 1010 células. 3) Vacunas basadas en Streptococcus iniae/S. difficile El cultivo de S. iniae y el cultivo de S. difficile fueron mezcladas con el amortiguador estándar y se llevaron a un conteo total de 5 x 109 células por cada mi. Dos vacunas separadas fueron preparadas de cada mezcla inicial, la vacuna a base de agua fue derivada de las mezclas anteriores diluyéndola a 1.0 x 1010 células por mi con amortiguador estándar mientras que una vacuna de adyuvante de aceite fue preparada a una concentración celular final de 2.4 x 109 células por mi de vacuna. Una descripción de las vacunas usadas se presenta en la tabla 1. Cepa de desafío Los RLO usados para el desafío se desarrollaron según lo descrito en la preparación del material de desafío. Horario de vacunación y desafío La vacunación fue hecha por inyección IP de Tilapia con 0.1 mi de las vacunas respectivas (ver la tabla 1). Los peces fueron mantenidos durante 3 semanas después de la vacunación y fueron desafiados posteriormente con un cultivo viable de RLO. Los peces desafiados fueron mantenidos separados y la mortalidad fue seguida durante un 1 período de una semana después del desafía. La eficacia fue evaluada por la expresión de la supervivencia relativa porcentaje de peces vacunados con respecto a los controles. Tabla 1: Composición de vacuna con respecto al número de células y a la presencia de adyuvante.

Preparación del material de desafío Un recipiente de RLO sembrado con solución de glicerol se descongeló e inoculó sobre agar de chocolate e incubó a 26°C durante 24 horas. El crecimiento de las placas fue recolectado e inoculado como crecimiento sólido en 100 mi de caldo líquido e incubó en un agitador orbital (150 rpm) a 26°C. Después de aproximadamente 24 horas de desarrollo la pureza del cultivo fuera comprobado y el OD6eo fue medido. Una suspensión de desafío fue preparada en correspondencia a OD660 = 0.250/10 con 0.9% estéril (peso/volumen) de solución salina. Esta suspensión fue utilizada directamente para el desafío. La pureza de la suspensión de desafío fue evaluada sembrando una porción de la suspensión de desafío sobre agar de chocolate, seguida de una incubación subsecuente a 26°C. Desafío Los grupos de aproximadamente 15 peces fueron tomados de los tanques e inyectados con la suspensión de desafío como se describió anteriormente. Los peces fueron desafiados IP por inyección con 0.1 mi de suspensión. El mismo procedimiento fue seguido para todos los grupos. Después del desafío los peces fueron transferidos a diversos tanques y fueron mantenidos para observación y determinar la ocurrencia de la mortalidad. Observaciones de la mortalidad Después del desafío, los peces fueron monitoreados dos veces al día y los peces muertos fueron retirados del tanque, el peso y longitud fueron registrados y los órganos internos, notablemente el riñon y bazo fueron evaluados para determinar la presencia de granulomas comunes. De un número representativo de peces, las muestras del bazo fueron colocadas en placas sobre agar de chocolate para confirmar la presencia del organismo de desafío y de tal modo comprobar la causa de mortalidad. Resultados Mortalidad después del desafio La mortalidad comenzó en todos los grupos desafiados el día 2 después del desafío y aumentó rápidamente en la mayoría de los grupos. Los peces que murieron durante los primeros 3 días todos exhibieron una acumulación de líquido en la cavidad corporal y generalizaron la licuación de los órganos internos. Hacia el final del período de observación sin embargo, algunos peces mostraron signos comunes de enfermedad asociados a infecciones de RLO según lo observado en el campo, es decir formación de granuloma en riñon y bazo. Al observar la mortalidad el día 3 después del desafío es evidente que una distinción se puede hacer entre la mayoría de las vacunas a base de agua y los controles con respecto a todas las vacunas a base de aceite. Las vacunas de adyuvante de aceite exhiben una mortalidad retrasada con respecto a las vacunas a base de agua, sin embargo, PBS-aceite sin las bacterias no muestra esta mortalidad retrasada.

La mortalidad observada por grupo fue utilizada para el cálculo de los valores de RPS. Una descripción de los valores de RPS, según lo expresado contra el grupo de control de PBS se da en la tabla 1. Los resultados muestran que: a) Asombrosamente, una vacuna que contiene antígenos de Streptococcus es capaz de proteger a los peces contra la infección por RLO. b) Una vacuna de RLO que contiene la cepa de desafío, es decir una vacuna homologa, es sorprendentemente menos eficientes que las vacunas basadas en antígenos de Streptococcus. c) Las vacunas de adyuvante de aceite funcionan mejor que las vacunas a base de agua d) Incluso que una vacuna de Streptococcus a base de agua proporciona una mejor protección que una vacuna basada en aceite basada en RLOs e) Según lo esperado una elección aleatoria es una vacuna gramnegativa pero no de Streptococcus, en este caso la cepa patógena 02 A de Vibrio anguillarum de los peces no proporciona la protección contra la infección por RLO. Conclusiones Se encontró que las vacunas probadas fueron seguras. Un desafío de peces vacunados fue realizado 3 semanas después de la vacunación IP con RLOs desarrollados en medios artificiales. La enfermedad así como las muestras comunes de la enfermedad se pudo reproducir y el organismo de desafío se pudo aislar nuevamente de los peces muertos. Siguiendo directamente a la figura 1, la Tilapia se puede proteger contra las infecciones por RLO con la vacunación por inyección IP con vacunas de tipo aceite-Sfrepfococcus y a base de agua. Asombrosamente, el funcionamiento incluso de las vacunas de tipo Streptococcus a base de agua es asombrosamente mejor que el funcionamiento de las vacunas basadas en aceite-RLO. Por otra parte, las vacunas de tipo Streptococcus con adyuvante de aceite superan las vacunas sin adyuvante. Los valores relativamente bajos de RPS en este experimento son el resultado de la dosis muy alta de desafío de RLO aplicada en este experimento específico. Ejemplo 2: El objetivo de este experimento fue evaluar si la protección contra las infecciones por RLO es obtenida cuando la Tilapia se vacuna con las vacunas bivalentes a base de aceite que contienen el Streptococcus iniae y S. difficile. También, la relación entre el nivel de protección y el número de bacterias presentes en la vacuna basada en Streptococcus fue determinada en este ejemplo. Dos diversas vacunas, que contienen el Streptococcus iniae y S. difficile a diversas concentraciones en una emulsión no mineral de agua-en-aceite fueron inyectadas IP en la Tilapia juvenil. Los niveles de antígeno en las vacunas fueron de 6.8 x 108 y 1.7 x 108 células de cada antígeno por mi de vacuna. Tres semanas después de la vacunación, los peces de cada grupo vacunado y los grupos de control no vacunados fueron desafiados con una suspensión de bacterias de tipo Rickettsia . Diseño experimental Los grupos de Tilapia que se originaron del mismo lote fueron vacunados con una de dos vacunas experimentales de adyuvante de aceite. Las vacunas probadas contuvieron S. iniae y S. difficile pero las dos vacunas se diferenciaron en la concentración celular. Un grupo de peces no fue vacunado y fue mantenido como control. Tres semanas después de la vacunación, se desafiaron a todos los grupos con una inoculación de desafío estandardizada de bacterias de RLO y los peces fueron mantenidos para observación durante un período de 2 semanas después del desafío. Diariamente los peces muertos fueron retirados y la bacteria causante fue aislada nuevamente de un número representativo de peces que habían muerto. La eficacia de las vacunas fue expresada como la supervivencia porcentual relativa (RPS) en los grupos vacunados con respecto a los controles .

Las vacunas fueron preparadas a partir de un cultivo fermentador S. iniae y un cultivo fermentador de S. difficile. Todas las formulaciones de vacunas fueron preparadas en un adyuvante de agua-en-aceite no mineral. Las vacunas usadas en el estudio se presentan en la tabla 2.

Tabla 2: Vacunas usadas en el estudio Las concentraciones de antígeno especificadas en la tabla 2 representan la concentración de vacuna final, es decir después de mezclarse con la emulsión de PBS/aceite. Vacunación Los peces se sometieron a inanición durante 48 h antes de la vacunación para asegurar el vaciado completo de la zona intestinal y de tal modo la reducción de la posibilidad de dañar los órganos internos en la inyección. La vacunación fue realizada por inyección IP. El experimento incluyó 3 grupos experimentales (2 grupos de vacuna y 1 grupo de control), cada uno consistió de 25 peces. Cada pez de los grupos de vacuna fue inyectado con 0.1 mi de vacuna de acuerdo a la tabla 2. El pez de control no fue inyectado. Preparación de cultivo de desafío Un frasco de una semilla de solución de glicerol de RLO se descongeló e inoculó sobre agar de chocolate e incubó a 26°C durante 48 horas. El desarrollo de las placas fue recolectado e inoculado como desarrollo sólido en 100 mi de caldo líquido y se incubó en un agitador orbital (150 rpm) a 26°C. Después de aproximadamente 48 horas de crecimiento la pureza del cultivo fue comprobado y el OD660 fue medido. Las suspensiones de desafío fueron preparadas a partir de este cultivo por dilución del cultivo a OD660 = 0.027 con 0.9% (peso/volumen) solución salina estéril. Esta suspensión entonces fue utilizada directamente para el desafío. La pureza de la suspensión de desafío fue evaluada sembrando una porción de la suspensión de desafío sobre agar de chocolate y seguido por la incubación subsecuente a 26°C. Desafío El desafío fue realizado por inyección. Los peces fueron sometidos a inanición durante 48 horas antes del desafío para asegurar el vaciado completo del tracto gastrointestinal. De todos los grupos de vacuna y del grupo de control, 20 peces fueron inyectados con 0.1 mi de una suspensión bacteriana estandardizada. Para esto cada grupo fue obtenido, anestesiado en Aqui-S hasta que se sedaron e inyectaron de manera intraperitoneal en el del cuerpo apenas detrás de la punta del extremo de la aleta pectoral. Inmediatamente después de la inyección los peces fueron transferidos a su tanque asignado y la recuperación fue seguida. Observación de mortalidad Después del desafío, los peces fueron monitoreados dos veces al día y los peces muertos fueron retirados del tanque, el peso y la longitud fueron registrados y los órganos internos, notablemente riñon y bazo fueron evaluados para determinar la presencia de granulomas comunes. De algunos peces, las muestras del bazo fueron colocadas en placas sobre agar de chocolate para confirmar la presencia del organismo de desafio y de tal modo comprobar la causa de la mortalidad. Resultados Mortalidad después del desafío La mortalidad observada en los diversos grupos de vacuna y en los grupos de control se presenta en la figura 2 y en la figura 3. Las vacunas se representan en la gráfica con referencia a la concentración (células/ml) de cada antígeno en la vacuna final. El re-aislamiento fue realizado en los peces que murieron después del desafío. Estos peces mostraron un re-aislamiento positivo claro. Evaluación de eficacia De acuerdo con las figuras de la mortalidad obtenidas, los valores de RPS fueron calculados por la condición. Los resultados se expresan en la figura 2 y 3. Los peces vacunados IP con una vacuna de estreptococo de adyuvante de aceite bivalente que contiene S. iniae y S. difficile mostró protección contra los desafíos de RLO. Por otra parte, los resultados sugieren un tipo de reacción a cierta dosis de reacción en la cual una vacuna de alta dosis proporciona una mejor protección que una vacuna de dosis baja. Un RPS de 73% fue obtenida con una vacuna que contuvo 6.8 x 108 células de S. iniae y 6.8 x 108 células de S. difficile. La mortalidad en los peces de control no vacunados fue del 75%. Ejemplo 3: En este experimento fue probada la eficacia de una vacuna de Streptococcus difficile monovalente en una emulsión no mineral de agua-en-aceite. Los grupos de Tilapia fueron vacunados con una vacuna monovalente de Streptococcus difficile que comprendió 6.8 x 107 células de Sd en una emulsión no mineral de agua-en-aceite, o se dejaron sin vacunar como grupo de control. Las vacunas fueron preparadas según lo descrito en los ejemplos 1 y 2. Los siguientes desafíos con RLO fueron realizados: a) 10 días después de la vacunación se realizó un desafío de cohabitación. El momento del desafío de diez días fue elegido puesto que éste representa la situación de campo normal. La cohabitación fue elegida puesto que este modelo mostró el desarrollo de los signos comunes de la enfermedad en el momento apropiado según los visto en los brotes de campo en el experimento previo al desafío. b) En la vacunación después de 6 semanas se realizó un desafío por inyección. Conclusión total: El desafío de la cohabitación hecho a 10 días PV y el desafío de inyección realizado a 6 semanas PV, mostraron que una vacuna de adyuvante de aceite monovalente que contiene Streptococcus difficile proporciona la protección contra la infección por RLO. El valor de RPS después de la vacunación en el experimento del desafío de cohabitación fue del 89%.

La figura 4 muestra, que a 6 semanas después de la vacunación con una vacuna monovalente de Streptococcus difficile seguido por el desafío de inyección, la mortalidad acumulativa en peces de control alcanzó el 90%, mientras que los peces vacunados solamente el 20% murieron. Esto da lugar a un RPS del 78%.

Leyenda de las figuras. Figura 1: Valores de RPS por grupo de vacuna según lo calculado en comparación a grupo de control vacunado con PBS-placebo. Figura 2: Mortalidad porcentual acumulativa en un cierto periodo de tiempo, con referencia a la dosis de vacuna dada. El efecto del número de células en la vacuna sobre la supervivencia porcentual relativa después de que se da el desafío de RLO. Figura 3: Supervivencia porcentual acumulativa final (comparar la figura 2), con referencia a la dosis de vacuna dada.

Figura 4: Porcentaje relativo de supervivencia de los peces vacunados con una vacuna monovalente de Streptococcus difficile que comprende 6.8 x 107 células de Sd en una emulsión no mineral de agua-en-aceite.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una bacteria del género Streptococcus para la fabricación de una vacuna para combatir la infección por organismos tipo Rickettsia .

2. Uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria es una bacteria viva atenuada.

3. Uso de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizado porque la bacteria está en forma de bacterina.

4. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la bacteria del género Streptococcus es de la especie Streptococcus iniae, agalactiae o difficile.

5. Uso de acuerdo a las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la bacteria del género Streptococcus es de la especia Streptococcus difficile.

6. El uso de acuerdo a las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la vacuna comprende por lo menos otro microorganismo o virus que es un patógeno de pez, u otro antígeno o material genético que codifique el otro antígeno, en donde el otro antígeno o material genético se deriva de un virus o microorganismo de patógeno de pez.

7. El uso de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque el otro microorganismo o virus se selecciona del grupo que consiste de Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subspecies piscicidae, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garvieae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, virus de necrosis viral, iridovirus, virus del herpes de Koi, Aeromonas salmonicidae, Vibrio salmonicidae, Moritella viscosa, Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis, virus de enfermedad pancreática de salmón, virus de la enfermedad del sueño, virus de necrosis nerviosa viral, virus de necrosis pancreática infecciosa, iridovirus, Lepeophtherius salmonis, Caligus elongatus, Cryptobia salmositica, Myxobolus cerebralis, Kudoa thyrsites, Ichthyophthirius multifiliis, Dactylogyrus spp., Trichodina spp. y Benedenia seriolae.