MX2008016248A - Vacuna combinada estreptococica. - Google Patents
Vacuna combinada estreptococica.Info
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Abstract
Esta invención se refiere a vacunas combinadas para la protección de peces contra infecciones estreptocócicas y a métodos para la preparación de tales vacunas combinadas.
Description
VACU NA COM BI NADA ESTREPTOCOCICA
Campo de la Invención Esta invención se refiere a una vacuna combinada para la protección de peces contra infecciones por estreptococos y a la preparación de métodos para la combinación de tales vacunas. Antecedentes de la Invención Varias especies del genero de bacterias estreptocócicas es conocido actualmente produce infecciones en peces, más específicamente en peces mantenidos en acuicultura. Ejemplos de tales especies son Streptococcus iniae, S. difficile, S. agalactiae, S. dysgalactiae y S. phocae. Últimamente ha habido algunos cambios de opinión sobre la nomenclatura correcta del Streptococcus difficile y Streptococcus agalactiae. Vandamme et al . ( Int. J . Syst. Bacteriology 47: 81 -85 ( 1 995)) han sugerido que el Streptococcus difficile es en realidad un Streptococcus agalactiae no hemolitico (el Streptococcus agalactiae es una bacteria ß-hemolitica). Por razones de conveniencia, aquí se usa la nomenclatura tradicional : Streptococcus iniae , S. difficile, S. agalactiae. El Streptococcus iniae se encuentra frecuentemente en Tilapia , trucha arco-iris, robalo europeo de mar, besugo , róbalo asiático de mar, corvinón ocelado , pez conejo , platija japonesa , lenguado platija ó rodaballo de cola amaril la y róbalo rayado hí brido. El impacto anual de las infecciones de Streptococcus
iniae en la acuicultura excede 1 00 millones de dólares americanos. Streptococcus difficile se halla frecuentemente en róbalo asiático de mar, Tilapia, especie de pez comestible y en el gato-pez. El Streptococcus agalactiae actual mente i nfecta principalmente hallado en Tilapia. Las vacunas para combatir la infección estreptococica en pescados son conocidas la técnica. M uchas de las vacunas estreptocócicas se basan en células enteras muertas. Vacunas de Streptococcus agalactiae están , entre otras, descritas en la solicitud de Pat. US N° 2005/0208077. Vacunas contra Streptococcus iniae se hallan descritas, entre otras, en la Pat. US N ° 6.379.677. También se hallan disponibles comercialmente vacunas contra Streptococcus iniae. Un ejemplo es la Norvax Strep Si , una vacuna contra el Streptococcus iniae comercializada por I ntervet I nt. B .V. Eldar et al . han descrito (Vaccine, 1 3: 867-870, ( 1 995)) una vacuna contra Streptococcus difficile a partir de células enteras muertas. Debido al hecho de que el Streptococcus iniae y el
Streptococcus difficile son frecuentemente la causa de enfermedades en peces, más específicamente en Tilapia y róbalo asiático de mar, es atractivo combinar las vacunas contra Streptococcus iniae y Streptococcus difficile durante la ad ministración .
Sin embargo, inesperadamente se encontró que cuando se administraban las vacunas contra Streptococcus iniae y Streptococcus difficile en combinación, el nivel de protección contra Streptococcus iniae está altamente deteriorado. Pero si se administra intraperitonealmente (IP) la vacuna contra el Streptococcus iniae sin Streptococcus difficile, la protección contra el Streptococcus iniae es como se espera. Parece que la presencia de Streptococcus difficile en una vacuna combinada es, altamente sorpresiva, del desarrollo de la respuesta inmune anti-Streptococcus Iniae por razones que no se conocen. Un objetivo de esta invención es hallar una solución a este problema. Ahora se ha descubierto por sorpresa que si una vacuna combinada para la protección de peces contra infección estreptococia comprende una cantidad de de inmunizador de células de Streptococcus difficile y una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae en la que la proporción de células de Streptococcus difficile a las células de Streptococcus iniae es igual o mayor que a 40 a 10, este problema de supresión del desarrollo de una respuesta auto-inmune a Streptococcus iniae ocurre en cualquier nivel aceptable, o no se ve en todos. Como se dijo antes, la presencia de una cantidad de de inmunizador de células de Streptococcus difficile y una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus inae es desde luego, necesaria para inducir una respuesta inmune a cada una de las
especies bacterianas . La cantidad de células de Streptococcus difficile en la vacuna debe ser por lo menos cuatro veces la cantidad de células de Streptococcus iniae. Así , una primera modalidad de la presente i nvención se refiere a una vacuna combinada para la protección de peces contra la infección de estreptococica que tiene como característica una vacuna combinada que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae en tanto la proporción de células de Streptococcus difficile a células de Streptococcus iniae es igual o mayor que 40 a 1 0. Como resultara claro a partir de los Ejemplos , una vacuna combinada en la que la cantidad de cél ulas de Streptococcus difficile en la vacuna es cuatro veces mayor que la cantidad de células de Streptococcus iniae incluso menos supresión del desarrollo de una respuesta anti-inmune contra of Streptococcus iniae. Por lo tanto, una vacuna combinada donde la proporción de células de Streptococcus difficile a células de Streptococcus iniae es igual o mayor que 40 a 8 es preferida , y una proporción sea igual o mayor que 40 a 6 , 40 a 4, 40 a 2 y 40 a 1 , en ese orden se prefiera progresivamente más . Así , formas preferidas de esta modalidad se relacionan con una vacuna combinada , según la invención , donde la proporción es igual o mayor que 40 a 8, más preferiblemente igual o mayor que 40 a 6 , aun más preferiblemente igual o mayor que 40 a 4,
todavía aún más preferiblemente igual o mayor que 4 a 2 , y más preferiblemente 40 a 1 . Tradicionalmente, muchas vacunas asiáticas para peces, si es posible en todos, determinante como vacuna base de agua. No comprenderon una fase del aceite. Sin embargo, hay una tendencia actualmente a usar emulsiones de agua en aceite, agua en aceite en agua, o aceite en agua. Tales vacunas-em u lsiones tienen la ventaja de ser más eficaces que sus contrapartes base-agua . Por otra parte , las vacunas de la emulsión permiten usar menores cantidades de antígeno. Por lo tanto , otra forma preferida de esta modalidad se relaciona con una vacuna combinada según la invención donde la vacuna es una vacuna agua en aceite. Aún otra forma preferida de esta modalidad se relaciona con una vacuna combinada según la invención que es una vacuna aceite en agua . De nuevo otra forma preferida de esta modalidad se refiere a una vacuna combinada según la invención donde la vacuna es una vacuna agua en aceite en agua . El problema a solucionar, por ejemplo el problema es la presencia de Streptococcus difficile en una vacuna combi nada es altamente represiva del desarrollo de una respuesta inmune anti Streptococcus iniae, se encuentra tanto en vacunas de base agua y en emulsiones basadas en agua y aceite. La solución presentada arriba es una solución del problema .
En caso de que una emulsión de agua y aceite para la vacuna, se encontró otra solución factible, posiblemente en combinación con la solución dada arriba. Ahora fue encontrado asombrosamente, que si las células de Streptococcus difficile y de Streptococcus iniae estén presentes en gotitas de agua separadas en una emulsión agua en aceite, el problema es menos significativo hasta insignificante. En ese caso, en un principio no hay ni necesidad de mantener la proporción de células de células Streptococcus difficile a Streptococcus iniae igual o mayor que 40 a 8. Una emulsión agua en aceite en la cual las células de Streptococcus iniae y Streptococcus difficile están presente en gotitas de agua separadas en la emulsión es relativamente fácil de hacer. El procedimiento normal para hacer una emulsión básica agua en aceite se basa en la mezcla de una cantidad individual de una fase acuosa, una fase de aceite y una cantidad de células bacterianas. La fase acuosa puede ser, por ejemplo nada más agua, un almacenado basado en agua o similares. La fase oleosa puede ser un aceite mineral o no mineral (ver abajo). Adicionalmente, se pueden agregar uno o más emulsificantes y detergerte. Los métodos para hacer tales emulsiones y los componentes pare usar en tales emulsiones son bien conocidos en la técnica. Este método presente difiere del método común en que en vez de una sola fase acuosa se usan dos fases acuosas; una que comprende células de Streptococcus iniae y la otra que
comprende células de Streptococcus difficile. Cada una de las dos fases acuosas se emulsiona con una cantidad de fase aceite y, luego de hacer las emulsiones separadas agua en aceite, se mezclan las dos emulsiones agua en aceite. Una variante de este método es, por ejemplo; hacer una emulsión agua en aceite que comprenda de uno ó dos tipos de células estreptococica y agregar el otro tipo de células en fase acuosa, por ejemplo durante el proceso de emulsionar. Haciendo esto, la mayor parte de las células del otro tipo de estreptococica quedará automáticamente integrada en nuevas gotitas de agua en la emulsión agua en aceite. No precisa decirse que emulsiones agua en aceite en las que células de Streptococcus iniae y Streptococcus difficile se hallan presentes en gotitas de agua separadas de la emulsión siempre caen dentro del alcance de la invención sin importar la manera en que se hacen. Entonces, otra modalidad de esta Invención se refiere a una vacuna combinada para la protección de peces contra infecciones de estreptococica donde la vacuna por ser una vacuna agua en aceite que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y de Streptococcus difficile en la que las células de Streptococcus iniae y de Streptococcus difficile están presentes en gotitas de agua separadas de tal emulsión agua en aceite. Otra posibilidad es hacer uso de una emulsión agua en
aceite en agua , en la que la cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y Streptococcus difficile está presente en gotitas separadas de tal emulsión agua en aceite en agua. Tal emulsión comprende gotitas acuosas, presentes dentro de pequeñas gotitas de aceite, que están a su vez rodeadas por una fase acuosa. Entonces, otra forma de este modalidad implica una vacuna combinada para la protección de peces contra i nfecciones de estreptocócicas que se caracteriza por ser una vacuna agua en aceite en agua que comprende una cantidad de inmunizador de Streptococcus iniae y Streptococcus difficile en la que el componente Streptococcus iniae y el componente Streptococcus difficile están presentes en gotitas de agua separadas de tal emulsión agua en aceite en agua . Otra posibilidad más de mantener separadas las células de
Streptococcus iniae y las células de Streptococcus difficile en una emulsión agua en aceite en agua , es hacer primero una emulsión agua en aceite en la que la fase acuosa comprenda solamente las células de Streptococcus iniae o las cél ulas de Streptococcus difficile. En una siguiente etapa, este emulsión agua en aceite puede entonces emulsionarse en una fase acuosa que comprenda otro de los dos componentes bacteriano, es decir las células de Streptococcus difficile o las células de Streptococcus iniae. Otra forma más de esta modalidad se refiere a una vacuna combinada para la protección de peces contra i nfecciones de
estreptococias, donde tal vacuna es una vacuna agua en aceite en agua que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y células de Streptococcus difficile donde las células de Streptococcus iniae están presentes gotitas de agua encapsuladas en aceite tal emulsión agua en aceite en agua, y las células de Streptococcus difficile están presentes en la fase acuosa libre de tal emulsión agua en aceite en agua. Así, otra forma más de esta modalidad se refiere a una vacuna combinada para la protección de peces contra Infección de estreptococia, donde indica una vacuna por ser una vacuna agua en aceite en agua que comprende una cantidad inmunizador de células de Streptococcus iniae y Streptococcus difficile en la que las células de Streptococcus difficile están presentes en las gotitas de agua encapsuladas en el aceite de tal emulsión agua en aceite en agua, y las células de Streptococcus iniae están presentes en la fase acuosa libre de emulsión agua en aceite en agua Tales emulsiones como agua en aceite y agua en aceite en agua descritas arriba pueden tener, luego de cierto tiempo, una tendencia a sedimentar, o una consistencia cremosa, o ambas cosas, y en el peor de los casos, a cortarse. Este fenómeno depende, entre otras cosas, del tamaño, del tiempo y de la temperatura de las gotitas del almacenaje, de los emulsionantes usados, etc. Entonces, las mejores resultados se obtendrán con vacunas
combinadas en las que la proporción de células de Streptococcus difficile a células de Streptococcus iniae es mayor o igual que 40 a 8 y adicionalmente los dos componentes bacterianos están separados adicionalmente en gotitas diferentes, o en diferentes fases acuosas como se indica arriba. Tales vacunas tienen una doble seguridad: aun si la emulsión se rompiera, la proporción de células de Streptococcus difficile a células de Streptococcus iniae salvaguarda la eficacia de la vacuna. Por lo tanto, otra modalidad de esta invención se refiere a una vacuna combinada pare la protección de peces contra infección de estreptococica caracterizada porque tal vacuna comprende una cantidad de inmunizador de células de Sfrepfococcus difficile y células de Streptoccccus iniae y la proporción de células de Streptococcus difficile a células de Streptococcus iniae es mayor o igual que 40 a 10, 40 a 8, 40 a 6, 40 a 4, 40 a 2 ó 40 a 1 , en este orden de preferencia, y en la que las células de Streptococcus difficile y las células de Streptococcus iniae están presentes en gotitas de agua separadas de tal emulsión agua en aceite ó agua en aceite en agua. Otra forma de esta modalidad se refiere a agua en aceite en agua una vacuna combinada para le protección de peces contra infección de estreptococica, caracterizada por una vacuna que comprende una cantidad inmunizador de células de Streptococcus difficile y células de Streptoccccus iniae donde la proporción de
células de Streptococcus difficile a células de Streptococcus iniae es mayor o igual que 40 a 10, 40 a 8, 40 a 6, 40 a 4, 40 a 2 ó 40 a 1, en este orden de preferencia, y esta modalidad se caracteriza también porque la vacuna combinada para !a protección de peces contra infección de estreptococica en la que las células de Streptococcus iniae estén presentes en las gotitas de la fase acuosa encapsuladas en aceite de tal emulsión agua en aceite en agua, y las células de Streptococcus difficile están presentes en la fase acuosa libre de tal emulsión agua en aceite en agua. Otra forma de modalidad se refiere a una vacuna combinada agua en aceite en agua para la protección de peces contra infección de estreptococica, caracterizada tal vacuna comprende una cantidad Inmunizador de células de Streptococcus difficile y una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae donde la proporción de células de Streptoccccus difficile a células de Streptococcus iniae es mayo o igual que 40 a 10, 40 a 8, 40 a 6, 40 a 4, 40 a 2 ó 40 a , en este orden de preferencia, y en la que la vacuna combinada para la protección de peces contra infección de estreptococica en la que las células de Streptococcus difficile están presentes en las gotitas de la fase acuosa encapsuladas en aceite de tal emulsión agua en aceite en agua y las células de Streptococcus iniae están presentes en la fase acuosa libre de emulsión agua en aceite en agua. Vacunas combinadas según esta invención pueden contener
también en una presentación preferida una sustancia inmunoestimulante, llamada adyuvante. Los adyuvantes en general comprenden sustancias que fomentan la respuesta inmune del huésped de una manera no específica. Un número diferente de adyuvantes son conocidos en esta técnica Ejemplos de adyuvantes frecuentemente usados en la cría de peces y crustáceos son muramildipeptidos, lipopolisacáridos, varios glucanos y glicanos y Carbopol® (un homopolimero). Una revista extensa de adyuvantes adecuados para vacunas pare peces y crustáceos se da en un escrito de Jan Raa (Review in Fisheries Science 4(3):229-288(1996). La vacuna también puede comprender un llamado vehículo, es un compuesto a la cual se adhiere la bacteria, sin tener un enlace covalentemente con esa sustancia. Tales vehículos son, entre otros, bio-microcápsulas, micro-alginatos, liposomas y macrosoles, todos conocidos en la técnica. Una forma especial de tal vehículo, en el cual el antígeno está parcialmente incrustado en el vehículo, es el llamado ISCOM (PE 109.942, PE 180.564, PE 242.380). Además, la vacuna puede comprender uno o más compuestos o emulsificantes tensoactivos convenientes, por ejemplo palmo o entre. Adyuvantes oleosos adecuados para usar en emulsiones agua en aceite, agua en aceite en agua o aceite en agua son, por ejemplo, aceites minerales o aceites metabolizable. Aceites
minerales son, p. ej., Bayo®, Marcol® y Drakeol®. Aceites metabolizable son, p.ej., aceites vegetales, tales como aceite de maní y aceite de soja, aceites animal como los aceites de pescado escualeno y escualeno, y tocoferol y sus derivados. La cantidad de adyuvante agregada depende de la naturaleza del mismo adyuvante, y la información con respecto a tales cantidades será proporcionada por el fabricante. A menudo, la vacuna se mezcla con estabilizadores, por ejemplo para proteger a las bacterias contra la degradación, para realzar el periodo de validez de la vacuna, o para mejorar la eficiencia del proceso de secado bajo congelación. Los estabilizadores útiles son, entre otros, SPGA, carbohidratos por ejemplo: sorbitol, manitol, trehalose, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa; proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de eso, e intermediarios tales como fosfatos de metales alcalinos. Como se dijo antes, la vacuna anti-estreptococos puede administrarse, por ejemplo, por inyección, usualmente inyección intraperitoneal (referida como inyección IP). Desde el punto de vista de la protección, la inyección IP es la preferida porque da una buena y duradera protección. Esto es especialmente al tratarse de vacunas inactivadas. Las vacunas de esta invención comprenden básicamente una cantidad de inmunizador de una bacteria y un transportador
farmacéuticamente aceptable. El término " inmunizador" , según se usa aqu í , se define como la cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en el pez objeto . Un transportador farmacéuticamente aceptable puede ser tan simple como agua o un intermediario o una emulsión . La cantidad de células administradas dependerá de la especie de estreptococica usada , la presencia de un adyuvante, la vía de administración , el momento de administración , la edad del pez a vacunar, el estado de salud general , temperatura del agua y la dieta. Cuando se comience a comercializarse las vacunas, el fabricante proveerá esta información . Lo hablado generalmente, las vacunas a usarse según la invención se basan sobre las bacterias se pueden dar en general dosis de 103 a 1 01 0 , preferiblemente 106 a 1 09 , más preferiblemente entre 1 08 y 109 bacterias . Una dosis que exceda a 101 0 bacterias , aunque inmunológicamente adecuada , será menos atractiva por razones comerciales. Las vacunas según la invención está basada en bacterias vivas atenuadas , se pueden dar en dosis más bajas debido a que las bacterias continuaran replegando por cierto tiempo después la administración . En general , las vacunas para su uso según esta invención , serán preferiblemente vacunas que protejan contra una infección estreptococica y, adicionalmente contra uno ó más de un virus o microorganismo patógeno para los peces.
Así, sería beneficioso utilizar, después las bacterias estreptococos para la fabricación de la vacuna, también por lo menos otro virus o microorganismo patógeno para los peces, un antígeno de tal virus o microorganismo o material genético que codifique tal antígeno en una vacuna combinada. La ventaja de tal vacuna reside en que brinda protección no solo contra estreptococica sino también contra otras enfermedades de los peces. Por consiguiente, una forma preferida de esta modalidad se refiere a una vacuna en donde esa vacuna comprende por lo menos uno u otro virus o microorganismo que sea patógeno para los peces, o un u otro antígeno o material genético que codifique otro antígeno, y donde otro antígeno o material genético se derive de un virus o microorganismo patógeno pare peces. Ejemplos de patógenos comercialmente importantes en peces tropicales y/o Mediterráneos son Vibrio anguillarum, Photobacteritun damselae subespecie piscicida, Tenacibaculum maritimum, Fiavobacterium sp., Flexibacter sp, Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, virus de la necrosis viral, iridovirus, Spring Virernia de la carpa y herpesvirus Koi. Ejemplos de patógenos comercialmente importantes en peces de aguas frías son Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicidae, Vibrio salmonicidae, Moritella viscosa, Vibrio ordalii", Fiavobacterium sp., Flexibacter sp., Streptococcus sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri,
Piscirickettsia salmonis, virus de la enfermedad pancreática del salmón, virus de la enfermedad del sueño, virus de la necrosis nerviosa viral, virus de la necrosis pancreática infecciosa, virus de la necrosis hematopoyética Infecciosa, virus de la anemia infecciosa del salmón, virus de la septicemia hemorrágica viral y iridovirus. Parásitos que infectan a salmónidos son , entre otros, Lepeophterlus salmonis, Caligus elongatus, Cryptobia salmositica, Myxobolus cerebralis y Kudoa thyrsites. Un parásito que infecta a peces de agua dulce es, por ejemplo ; Ichthyophthirius muttifiliis. Parásitos de la Tilapia son , por ejemplo , Dactylogyrus spp. y Trichodina spp. Peces marinos pueden sufri r del parásito Benedenia seriolae, entre otros. Entonces, en una modalidad más preferida de la invención , los otros virus o microorganismo se elige del grupo formado por los siguientes patógenos de peces: Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subespecies piscicida, Tenacibaculum maritimum, Flavobacterium sp. , Flexibacter sp. , Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. Ictaluri, virus de la necrosis viral, virus de la viremia de primavera de la carpa, iridovirus, virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, virus de la anemia infecciosa del salmón'", virus de la septicemia hemorrágica viral y herpesvirus Koi, Aeromonas salmoniciclae. Vibrio salmonicidae, Moritella viscosa, Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis, virus de la enfermedad pancreática del salmón, virus de la enfermedad del
sueño, virus de la necrosis nerviosa viral, virus de la necrosis pancreática infecciosa, iridovirus, Lepeophterius salmonis, Caligus elongatus, Cryptobia salmositica, Myxobolus cerebralis, Kudoa thyrsites, Ichthyophthirius multifiliis Dactylogyrus spp., Trichodina spp. y Benedenia seriolae. Además, la invención se refiere a métodos de preparación de una vacuna combinada para la protección de peces contra infección de estreptococica, la cual es una vacuna agua en aceite o agua en aceite en agua que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y de células de Streptococcus difficile, y donde las células de Streptococcus iniae y de Streptococcus difficile están presentes en gotitas de agua separadas de tal emulsión agua en aceite o agua en aceite en agua, donde el método comprende las etapas de hacer una emulsión de agua en aceite o una emulsión agua en aceite en agua que comprenda una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y una emulsión agua en aceite o una emulsión agua en aceite en agua que contenga una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus difficile seguida por la etapa de mezclar dos emulsiones. La invención también se refiere a métodos para la preparación de una vacuna combinada para la protección de peces contra infección de estreptococica, donde tal vacuna es una emulsión de agua en aceite en agua que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y de
células de Streptococcus difficile, estando las células de Streptococcus iniae presentes en gotitas de agua encapsuladas por el aceite de la emulsión agua en aceite en agua y las células de Streptococcus difficile están en la fase acuosa libre de tal emulsión agua en aceite en agua, comprendiendo tal método las etapas de hacer una emulsión agua en aceite en la que la fase acuosa comprende solamente las células de Streptococcus iniae o las células de Streptococcus difficile, seguida esta etapa por la de emulsionar esta emulsión agua en aceite en una fase acuosa que comprende el otro de los dos componentes bacterianos, es decir las células de Streptococcus iniae o de Streptococcus difficile . Ejemplos Ejemplo 1 Evaluación de la eficacia de los antígenos de S. iniae y S. difficile formulados en proporción variable en vacunas pare Tilapia. Variedades enfrentadas Las variedades enfrentadas fueron una variedad salvaje de S. difficile y una variedad salvaje de S. inae. Vacunas Todos los cultivos bacterianos usados para la preparación de estas vacunas se inactivaron con formalina y están derivadas de variedades salvajes de S. difficile y S. iniae. Como adyuvante oleoso para la preparación de las vacunas se usa ISA 736A VG
disponible comercialmente. Se probaron seis vacunas diferentes en las cuales variaba la proporción de los dos antígenos. La composición de las vacunas se da en la Tabla 1. Tabla 1. Detalles de la composición de las vacunas y composición de cada antígeno usado en varias formulaciones
Diseño experimental Agrupación Se usaron un total de 315 peces de tamaño similar para este experimento y se dividieron en 7 grupos cada uno consiste de 45 peces. Vacunación Todos los peces fueron mantenidos sin alimentación por 48 horas previas a la vacunación, para asegurar que tuviesen vacio el tracto gastrointestinal. Seis grupos de 45 peces cada uno
fueron vacunados con una de las vacunas cada uno y un grupo de 45 peces no se trato para servir como control . Cada grupo de pescados fue anestesiado e inyectado a mano con las vacunas designadas a razón de 0,05 mi per pez. Cada pez fue inyectado peritoneal mente en el lado del cuerpo justo detrás de la punta de la aleta pectoral . La observación post-vacunación se prolongo por 24 d ías. Desafío cultivarte Streptococcus ¡niae Un frasco de la semilla del desafío fue tomado del congelador a menor o igual que 55°C, se descongelo y el contenido se inoculó en 1 00 ,0 mi de tríptico extracto de soja . El cultivo se incuba a 32°C, se puso en un agitador orbital con una velocidad de 1 50 rpm . Después de 23 horas de incubación , el cultivo produjo un OD66 o de 0,804. Se preparo una suspensión bacteriana con OD6eode 0,71 5 usando una solución 0.9% N aCL y se dejó a temperatura ambiente 2 horas antes de usar como material de desafío . Streptococcus difficile U n frasco de la semilla del desafío fue tomado del congelador a menor o igual que 55°C , se descongelo y el contenido se i noculó en 1 00 ,0 mi de desarrollo medio de estreptocócicas. Se puso en un agitador orbital con una velocidad de 1 50 rpm . Después de 24 horas de incubación , el cultivo produjo un OD6eo valor de 0, 1 76. Se preparo una suspensión
bacteriana con OD660 de 0,133 usando una porción del cultivo y solución de NaC1 al 9%, y luego se diluyo 100 veces, usando tal suspensión como material desafío. Desafío Todos los peces fueron privados de alimento por 48 horas antes de la inoculaci6n asegurando el vaciado completo del tracto gastrointestinal. La inoculación se realizo por medio de inyección IP. Todos los peces fueron sedados y se les inyecto peritonealmente justo detrás de la punta de la aleta pectoral con 0,1 mi de la suspensión bacteriana estandarizada. Después de la inoculación todos los peces se transfirieron a sus tanques designados y se inicie su recuperación del tratamiento anestésico.
Tabla 2 muestra los contajes viables de las suspensiones de desafío
-RESULTADOS Seguridad No se observo la mortalidad en los periodos de 24 días siguiente a la vacunación. El promedio de ganancia de peso de los peces en cada uno de los grupos en los periodos 24 días siguientes a la vacunación se muestra en la Tabla 3. Tabla 3. Ganancia de peso promedio por pez en periodo de 24 días siguientes a la vacunación.
Prototipo Peso promVpez Peso prom^pez Ganancia peso Diferencia de antes de después de prom. En 24 ganancia de vacunación inoculación días después peso entre de vacunación grupos A 13.5 21.4 6.4 B 13.0 20.2 6.2 C 12.9 21.1 6.5 D 12.9 22.7 6.7 + 0.3 g
E 13.1 22.0 6.8 F 12.7 20.2 6.5 Control 13.6 21.4 6.3
Eficacia de las vacunas La eficacia de las 6 vacunas bivalentes se evalúa y expresada en términos de % PRS ( Porcentaje relativa de supervivencia). En la Tabla 4 se muestran datos del % RPS para cada variedad de infección en cada uno de los grupos vacunados. La mortalidad registrada para todos los peces infectados se basa en re-aislamientos positivos de las bacterias desafiadas. Tabla 4 muestra el % PRS para cada tensión del desafío en cada uno de los grupos vacunados y la mortalidad del porcentaje en los grupos de control desafiados con un patógeno específico .
S. difficUe 5 inlae Prototipo
A 0 71.43 B 64.29 71.43 c 71.43 71.43 D 64.29 57.14 E 71.43 42.86 F 50.00 14.29 % Control en mortalidad 9333 46.67
Las figuras 1 y 2 muestran los valores de PRS de cada una de las vacunas con respecto a los resultados obtenidos luego de la infección con una variedad específica de bacteria a los 24 días después de la vacunación. La Fig. 1 muestra la eficacia de las vacunas cargadas con S. difficile. La mortalidad vinculada con el aislamiento positivo de la bacteria usada en el grupo de control de 93%. Todas las vacunas bivalentes con adyuvante oleoso mostraron protección contra S. difficile. No se observo protección contra S. difficile en las vacunas bivalentes acuosas. Esto se debe muy probablemente a la ausencia de un adyuvante oleoso. Vacunas formuladas con adyuvante oleoso en la proporción (S. difficile: S. iniae) de 40:2 y 40:8 dieron 71% PRS contra S. difficile, mientras que las vacunas con proporción de 40:1 y 40:4 dieron valores PRS más bajos, de 64%. El valor RPS más bajo obtenido con vacunas bivalentes con adyuvante oleoso provino de una formulación 40:40 (S. difficile: S. iniae) con 50% PRS. La Fig. 2 muestra la eficacia de vacunas bivalentes conteniendo S. iniae. Todas las vacunas bivalentes mostraron protección contra S. iniae con 46% de mortalidad y aislamiento positivo de la bacteria usada en el grupo de control. No se observo diferencia en el nivel de protección entre vacunas acuosas formuladas con la proporción de (S. difficile: S. iniae) 40:1, vacunas oleosas
formuladas en una proporción de 40:1 y 40:2, dando ambas el mismo valor PRS de 71%. Sin embargo, se observe una declinación en los valores PRS a medida que la proporción de S. dlfficile: S. iniae en las vacunas formuladas con adyuvante oleoso se reduce de 40:4 a 40:8 y 40:40. Los valores PRS en las citadas vacunas con adyuvante oleosos fueron de 57%, 42% y 14% respectivamente. CONCLUSION Los resultados obtenidos de este estudio muestran que al final del período pos vacunación no hubo diferencia aparente entre el peso promedio de los peces en ningún grupo vacunado y el grupo de control. Por la tanto, todas las vacunas bivalentes formuladas y administradas en la dosis de 0,05 mi por pez fueron seguras para el uso por vacunación IP en Tilapia Los resultados obtenidos a partir de cultivos de S. difficile mostraron que se requiere un adyuvante, preferiblemente un adyuvante oleoso, para que sean eficaces las vacunas bivalentes (S. difficile y S. iniae) contra S. difficile. Se observo una mortalidad de 93% con aislamiento positivo de bacterias usadas en el grupo de control y se observo que todas las vacunas con adyuvante oleoso daban protección con intensidad variable: el nivel más de 50% PRS, se observo con la formulación 40:40 (S. difficile: S. iniae). El S. iniae usado como inoculantes en el grupo de control dio 46% de mortalidad con re aislamiento de la bacteria
inoculada. Se observo que la vacuna acuosa bivalente formulada con 40:1 (S. difficile; S. iniae) una proporción y todas las vacunas bivalentes con adyuvante oleoso daban protección contra S. iniae. Sin embargo, el valor más bajo de PRS de 14% de nuevo se observo en la vacuna con adyuvante oleoso formulada con una proporción 40:40 de S. difficile: S. iniae. En este estudio se nota que cuando se formulaba un antígeno de S. difficile 40 o 20 veces más alto que el antígeno de S. iniae (sobre la base de célula: célula), se observaban valores de 64% PRS o 71% PRS contra S. iniae, y 71% PRS contra S. iniae. Leyenda de las figuras Figura 1: eficacia de vacunas bivalentes usando cultivos de S. difficile. Figura 2: eficacia de vacunas bivalentes usando cultivos de S. iniae.
Claims (16)
1 . Vacuna combinada para la protección de peces contra la i nfección de estreptococica que tiene como característica una vacuna combinada que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae en tanto la proporción de cél ulas de Streptococcus difficile a células de Streptococcus iniae es igual o mayor que 40 a 10.
2. Vacuna combinada según la reivindicación 1 , caracterizada porque tal proporción es igual o mayor que 40 a 8 , preferiblemente igual o mayor que 40 a 6, más preferiblemente a ig ual o mayor que 40 a 4, aun más preferiblemente igual o mayor que 40 a 2 y la más preferiblemente igual o mayor que 40 a 1 .
3. Vacuna combinada según la reivindicación 1 ó 2 , caracterizada por ser una vacuna agua en aceite.
4. Vacuna combinada según la reivindicación 1 ó 2 , caracterizada por ser una vacuna agua en aceite en agua .
5. Vacuna combinada para la protección de peces contra infección de estreptococica caracterizada por ser una vacuna agua en aceite que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y de Streptococcus difficile donde l as células de Srrepfococcus iniae y de Streptococcus difficile se hallan presentes en gotitas separadas de la fase acuosa de tal emulsión agua en aceite.
6. Vacuna combinada para la protección de peces contra infección de estreptococica caracterizada por ser una vacuna agua en aceite en agua que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y de Streptococcus difficile y donde las células de Streptococcus iniae y de Streptococcus difficile se hallan presentes en gotitas separadas de la fase acuosa de tal emulsión agua en aceite en agua.
7. Vacuna combinada para la protección de peces contra infección de estreptococica caracterizada por ser una vacuna agua en aceite en agua que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus iniae y de Streptococcus difficile y donde las células de Streptococcus iniae se hallan presentes en gotitas acuosas encapsuladas en el aceite de tal emulsión agua en aceite en agua y las células de Streptococcus difficile están presentes en la fase acuosa libre de tal emulsión agua en aceite en agua.
8. Vacuna combinada para la protección de peces contra infección de estreptococica caracterizada por ser una vacuna agua en aceite en agua que comprende una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus difficile y las células de Streptococcus iniae en la que las células de Streptococcus difficile se hallan presentes en gotitas acuosas encapsuladas en el aceite de tal emulsión agua en aceite en agua y las células de Streptococcus iniae están presentes en la fase acuosa libre de tal emulsión agua en aceite en agua.
9. Vacuna combinada según la reivindicación 1 a 2, caracterizada porque la vacuna es una vacuna agua en aceite según la reivindicación 5 o una vacuna agua en aceite en agua según las reivindicaciones 6-8.
10. Vacuna combinada según las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque tal vacuna comprende un adyuvante.
11. Vacuna combinada según las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque tal vacuna combinada comprende por lo menos uno u otro microorganismo o virus patógeno para los peces, o uno u otro antígeno o material genético que codifique otro antígeno donde otro antígeno o material genético es derivado de un virus o microorganismo patógeno para los peces.
12. Vacuna combinada según la reivindicación 10, caracterizada porque el otro microorganismo o virus se elige del grupo de los siguientes patógenos para los peces: Vibrio anguillarurn, Photobacterium damselae subespecie piscicida, Tenacibacuium maritimum, Flavobacterium sp., Flexibacter sp., Lactococcus garviae, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, virus de la necrosis viral, iridovirus, Spring Virernia de la carpa, herpesvirus Kol, Aeromonas salmonicidae, Vibrio salmonicidae, Moritella viscosa, Vibrio ordalii, Piscirickettsia salmonis, virus de la enfermedad pancreática del salmón, virus de la enfermedad del sueño, virus de la necrosis nerviosa viral, virus de la necrosis pancreática infecciosa, virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, virus de la anemia infecciosa del salmón, virus de la septicemia hemorrágica viral, irdovirus, Lepeophterius salmonis, Caligus elongatus, Cryptobia salmositica. Myxobolus cerebralis, Kudoa thyrsites, lchthyophthirius multifiliis, Dactylogyrus spp., Trichodina spp. y Benedenia seriolae.
13. Método para la preparación de la vacuna según la reivindicación 5, caracterizado por comprender la etapa de hacer una emulsión agua en aceite qua comprenda una cantidad inmunizador de células de Streptococcus iniae y una emulsión agua en aceite que comprenda una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus difficile y luego la etapa de mezclar ambas emulsiones.
14. Método para la preparación de la vacuna según la reivindicación 6, caracterizado por comprender la etapa de hacer una emulsión agua en aceite en agua que comprenda una cantidad inmunizador de células de Streptococcus iniae y una emulsión agua en aceite en agua que comprenda una cantidad de inmunizador de células de Streptococcus difficile siguiendo por las etapas de mezclar 2 emulsiones.
15. Método para la preparación de la vacuna según la reivindicación 7, caracterizado por comprender tales métodos de la etapa de hacer una emulsión agua en aceite en la que la fase acuosa comprende solo las células de. Streptococcus iniae, seguida por la etapa de emulsionar esta emulsión agua en aceite con una fase acuosa que comprende las células de Streptococcus difficile.
16. Método para la preparación de la vacuna según la reivindicación 8, caracterizado por comprender la etapa de hacer una emulsión agua en aceite en la que la fase acuosa comprende solamente las células de Streptococcus difficile, seguida por la etapa de emulsionar esta emulsión agua en aceite con una fase acuosa que comprende células de Streptococcus iniae.
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