MX2008013435A

MX2008013435A - Sintesis y usos de derivados de acido piroglutamico.

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Publication number: MX2008013435A
Application number: MX2008013435A
Authority: MX
Inventors: Julio Alvarez Builla; Jose Luis Novella Robisco; Ma Paz Matia Martin; Sonia Serna Pereda
Original assignee: Prodimed Sa
Priority date: 2006-04-20
Filing date: 2007-04-20
Publication date: 2009-01-09
Also published as: RU2008145775A; JP5616628B2; JP2007291050A; US20070249678A1; EP2021334A1; AU2007242793A1; JP2009534361A; US8835466B2; CA2649762C; US7671206B2; CA2649762A1; BRPI0710538A2; AU2007242793B2; CN101454309B; EP1847536A1; CN101454309A; ES2543199T3; EP2021334B1; WO2007122199A1; RU2456271C2

Abstract

Los nuevos derivados de ácido piroglutámico (I), en los que R1 es -OH, -ORa, en donde Ra es alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, arilo, aralquilo o heterociclilo; R2, R3 y R4 son independientemente H, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida; X es un anión farmacéuticamente aceptable; e Y es un grupo que contiene N; bien en forma de sus estereoisómeros ópticamente activos aislados o bien en forma de mezclas de los mismos, son compuestos útiles para potenciar la respuesta inmunitaria en un sujeto y/o para tratar tumores, infecciones bacterianas, fúngicas o virales, o enfermedades autoinmunitarias. (ver fórmula I).

Description

SÍNTESIS Y USOS DE DERIVADOS DE ÁCIDO PIROGLUTAMICO DESCRIPCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva síntesis de derivados de ácido piroglutámico , sus estereoisómeros ópticamente activos aislados y mezclas de los mismos y sus usos, y a nuevos productos intermedios hacia la síntesis de los mismos. La presente invención se refiere también al uso terapéutico de dichos derivados de ácido piroglutámico, a sus estereoisómeros ópticamente activos y mezclas de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La patente europea EP 0768308 Bl describe mezclas de estereoisómeros de derivados de ácido piroglutámico que tienen la fórmula general siguiente en donde Rlf R2 y R3 pueden ser hidrógeno o -C(=0)Me y A puede ser Cl-, CH3COO- o HO- para estimular la respuesta biológica inmunitaria. El procedimiento descrito en ese documento para la síntesis de dichos compuestos comprende hacer reaccionar L-serina con un exceso molar de anhídrido acético y piridina bajo calor. Por tanto, tal como se describe en dicho documento, los diferentes estereoisómeros no se han aislado nunca y los ensayos in vivo e in vitro descritos en ese documento se realizan con las mezclas de los cuatro posibles estereoisómeros ópticamente activos todos juntos. No se describe ninguna indicación en lo que concierne a las mezclas puras o enriquecidas de los estereoisómeros individuales. Además, no se ofrece ninguna indicación en lo que concierne al aislamiento de los diferentes estereoisómeros ópticamente activos de la mezcla. El experto en la materia sabe que los diferentes estereoisómeros ópticamente activos de un compuesto pueden tener efectos diferentes, o incluso opuestos. Por ejemplo, un compuesto puede tener efectos terapéuticos mientras que su enantiómero puede ser tóxico. Ejemplos de tales situaciones son bien conocidas por el experto en la materia. El dextrometorfano es un descongestionante, mientras que el levometorfano es un narcótico potente.

Dextrometorfano Levometorfano Se conoce también la diferencia de comportamiento in vivo de los enantiomeros de perhexilina.

S-Perhexilina R-Perhexilina Ambos son moduladores del ritmo cardiaco, pero uno de los enantiómeros se metaboliza más lentamente y se acumula en el cuerpo, situación que provocó un número de muertes durante los años 80. Probablemente el ejemplo mejor conocido y más trágico es la talidomida, que se administró como una mezcla racémica a las mujeres embarazadas con el fin de tratar las náuseas del embarazo .

S-Talidomida R-Talidomida Mientras que la R-talidomida era eficaz, los efectos teratogénicos de la S-talidomida se descubrieron más tarde. Por tanto, en la búsqueda de nuevos compuestos con efectos terapéuticos beneficiosos normalmente es necesario realizar ensayos con estereoisómeros enantioméricamente puros en un intento de seleccionar los enantiómeros más activos y/o descartar los eventualmente tóxicos. Así, hay una necesidad de proporcionar estereoisómeros aislados de derivados de ácido piroglutámico .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un procedimiento para obtener derivados de ácido piroglutámico , sus estereoisómeros ópticamente activos y mezclas de los mismos. El procedimiento implica el uso de un estereoisomero ópticamente activo de un precursor de un derivado de ácido piroglutámico que puede separarse fácilmente y transformarse posteriormente con el fin de dar el estereoisomero ópticamente activo deseado. En particular, los inventores han previsto una síntesis en la cual se aislan los diferentes productos intermedios, si se desea, con la estereoquímica deseada. Estos productos intermedios pueden transformarse adicionalmente con el fin de proporcionar el derivado de ácido piroglutámico deseado o bien en la forma del estereoisomero deseado sustancialmente puro o en la forma de una mezcla de estereoisómeros. Los inventores parten de un compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV, que genera entonces productos intermedios y productos finales diastereoméricos que pueden separarse y purificarse fácilmente. Usando el compuesto de fórmula IV con la estereoquímica deseada, es posible obtener productos intermedios en la forma de estereoisómeros sustancialmente puros o en la forma de una mezcla de estereoisómeros. Dicho compuesto de fórmula IV puede sintetizarse usando ácido glutámico enantioméricamente puro. Por lo tanto, según un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener un estereoisomero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I, o mezclas del mismo, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula IV con un compuesto de fórmula V con el fin de obtener un estereoisomero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo; transformar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo; y, finalmente, hacer reaccionar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo con un compuesto de fórmula HX para dar el derivado de ácido piroglutámico deseado de fórmula I como un estereoisómero sustancialmente puro o mezclas del mismo. Un aspecto más de la presente invención se refiere a un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I (es decir, la, Ib, Ic o Id) . Algunas composiciones que comprenden mezclas de los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula la, Ib, Ic y/o Id constituye un aspecto más de la presente invención, tal como una composición que comprende los estereoisómeros de fórmula la, Ib, Ic y/o Id con la condición de que dicha composición no contiene simultáneamente mezclas de todos los cuatro estereoisómeros de los compuestos siguientes: (i) clorhidrato de cloruro de 1- (3 -amino-5-carboxi -2 - oxopirrolidin- 3 - ilmetil ) piridinio, o (ii) clorhidrato de cloruro de 1- (l-acetil-3-amino-5- carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio . Un aspecto más de la presente invención se refiere a un estereoisómero sustancialmente -puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo. El procedimiento para obtener dicho compuesto constituye un aspecto adicional de la presente invención.

Un aspecto más de la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o un estereoisómero sustancialmente puro de dicho compuesto de fórmula I . Un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II (es decir, lia, Ilb, lie o lid) constituye un aspecto adicional de la presente invención. Algunas composiciones que comprenden mezclas de los estereoisómeros sustancialmente puros de una fórmula lia, Ilb, lie y/o lid también constituyen un aspecto más de la presente invención.

Un aspecto más de la presente invención se refiere a algunas composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto seleccionado de un grupo de compuestos de fórmula la, Ib, Ic, Id y mezclas de los mismos, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Un aspecto más de la presente invención se refiere al uso de un compuesto seleccionado del grupo de compuestos de fórmula la, Ib, Ic, Id y algunas mezclas de los mismos, en la fabricación de una composición para prevenir o tratar tumores .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de los isómeros (1-4) sometidos a ensayo sobre el crecimiento de células tumorales Renca comparado con placebo (S.S.F.) [ejemplo 6], expresado como la media de las superficies tumorales. La figura 2 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de los isómeros (1-4) sometidos a ensayo sobre el crecimiento de células tumorales Renca comparado con placebo (S.S.F.) [ejemplo 6], expresado como la mediana de los volúmenes del tumor. La figura 3 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de los isómeros (1-4) sometidos a ensayo sobre el crecimiento de células tumorales Renca comparado con placebo (S.S.F.) [ejemplo 6], expresado como la media de las superficies tumorales. La figura 4 es un gráfico que muestra el efecto inhibidor de los isómeros (1-4) sometidos a ensayo sobre el crecimiento de células tumorales Renca comparado con placebo (S.S.F.) [ejemplo 6], expresado como la media de los volúmenes tumorales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención, los significados de algunos términos y expresiones tal como se usan en el contexto de la invención se incluyen en el presente documento. "Alquilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturación, que tiene 1-12, preferiblemente de uno a ocho átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, etc. Los radicales alquilo pueden estar sustituidos opcionalmente por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, 0-propilo, 0-bencilo, 0-benzoato, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo , amino, imino, nitro, mercapto y alquiltio . "Alquenilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos una insaturación, que tiene 1-12, preferiblemente de uno a ocho átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, etc. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, 0-propilo, 0-bencilo, 0-benzoato, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, imino, nitro, mercapto y alquiltio . "Alcoxilo" se refiere a un radical de la fórmula -0-alquilo, en donde alquilo se ha definido anteriormente, por ejemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, etc. "Arilo" se refiere a un radical hidrocabonado aromático tal como fenilo, naftilo o antracilo. El radicál arilo puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes tales como hidroxilo, mercapto, halógeno, alquilo, fenilo, alcoxilo, haloalquilo, nitro, ciano, dialquilamino , aminoalquilo, acilo y alcoxicarbonilo, tal como se definen en el presente documento. "Ariloxilo" se refiere a un radical de la fórmula -0-arilo, en donde arilo se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos de compuestos de araloxilo son -0-fenilo, -0-p-tolilo, -0-m-tolilo, -0-o-tolilo u -0-naftilo. "Amino" se refiere a un radical de la fórmula -NH2, NHRa, -NRaRb, en donde Ra y Rb se seleccionan independientemente de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; o Ra y Rb juntos forman un heterociclo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido o cicloalquenilo sustituido o no sustituido. "Aralquilo" se refiere a un grupo arilo unido a un grupo alquilo tal como bencilo y fenetilo. "Carboxiéster" se refiere a un -C02Ra, en donde Ra se selecciona de un alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido. "Cicloalquilo" se refiere a un anillo carbocíclico saturado que tiene desde 3 a 8 átomos de carbono. "Cicloalquenilo" se refiere a un anillo carbocíclico que tiene desde 3 hasta 8 átomos de carbono y al menos una insaturación . "Heterociclilo" se refiere a un anillo de 3 a 15 miembros estable que consiste en átomos de carbono y desde uno hasta cinco heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno, y azufre, preferiblemente un anillo de 4 a 8 miembros con uno o más heteroátomos, más preferiblemente un anillo de 5 ó 6 miembros con uno o más heteroátomos. Para los fines de esta invención, el heterociclo puede ser un sistema cíclico monocíclico, bicíclico o tricíclico, que puede incluir sistemas de anillos condensados ; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre pueden estar oxidados opcionalmente en el radical heterociclilo ; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado ; y el radical heterociclilo puede estar parcial o completamente saturado o ser aromático. Ejemplos de dichos heterociclos incluyen, pero no se limitan a, azepinas, benzimidazol , benzotiazol, furano, isotiazol, imidazol, indol , piperidina, piperazina, purina, quinolina, tiadiazol, tetrahidrofurano . "Heteroarilo" se refiere a un grupo heterocíclico en donde al menos uno de los anillos es un anillo aromático. "Grupo protector" se refiere a un grupo que bloquea un grupo funcional orgánico y que puede eliminarse en condiciones controladas. Los grupos protectores, sus reactividades relativas y las condiciones en las que permanecen inertes son conocidos por el experto en la materia. Se hace referencia a Greene y Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis" , John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999. Las referencias del presente documento a grupos sustituidos en los compuestos de la presente invención se refieren al resto especificado que puede estar sustituido en una o más posiciones disponibles por uno o más grupos adecuados, por ejemplo, halógeno tal como flúor, cloro, bromo y yodo; ciano; hidroxilo; nitro; azido; alcanoílo tal como un grupo alcanoílo Ci-Cg tal como acilo y similares; carboxamido; grupos alquilo que incluyen aquellos grupos que tienen de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono y más preferiblemente 1-3 átomos de carbono; grupos alquenilo y alquinilo que incluyen grupos que tienen uno o más enlaces insaturados y desde 2 hasta aproximadamente 12 carbonos o desde 2 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; grupos alcoxilo que tienen uno o más enlaces de oxígeno y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o de 1 a aproximadamente 6 átomos .de carbono; ariloxilo tal como fenoxilo; grupos alquiltio que incluyen aquellos restos que tiene uno o más enlaces tioéter y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono ; grupos alquilsulfinilo que incluyen aquellos restos que tienen uno o más enlaces sulfinilo y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfonilo que incluyen aquellos restos que tienen uno o más enlaces sulfonilo y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono ; grupos aminoalquilo tales como grupos que tienen uno o más átomos de N y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; arilo carbocíclico que tiene 6 o más carbonos, particularmente fenilo o naftilo y aralquilo tal como bencilo. A menos que se indique lo contrario, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo, y cada sustitución es independiente de la otra. El término "anión farmacéuticamente aceptable" hace referencia a cualquier anión que es capaz de formar una sal farmacéuticamente aceptable cuando está en la presencia de un contracatión apropiado. Ejemplos de aniones farmacéuticamente aceptables, son Cl~, Br" , I", F", S042~, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato, etc. Otros ejemplos de aniones farmacéuticamente aceptables pueden ser evidentes para el experto en la materia. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal farmacéuticamente aceptable, que, tras administración al receptor puede proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto tal como se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciará que sales no farmacéuticamente aceptables también caen dentro del alcance de la invención ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de compuestos proporcionados en el presente documento pueden ser sales de adición de ácidos, sales de adición de bases o sales metálicas, y pueden sintetizarse a partir del compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. Generalmente, tales sales, se preparan por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de base o ácido libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de ácido o base apropiados en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo . Ejemplos de las sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácidos minerales tales como, por ejemplo clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato, y sales de adición de ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato . Ejemplos de sales de adición de álcali incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, amonio, y sales alcalinas orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina , etanolamina, N,N-dialquilenetanolamina, trietanolamina , glucamina y sales de aminoácidos básicos. Ejemplos de sales metálicas incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y litio. "Enantioméricamente enriquecido" aplicado a una mezcla de enantiómeros se refiere a una mezcla de enantiómeros de un compuesto en donde uno de ellos está presente en cantidades superiores a las del otro enantiómero. Por lo tanto, las mezclas enantioméricamente enriquecidas tienen un exceso enantiomérico superior al 0% con respecto a uno de sus enantiómeros, preferiblemente superior al 20%, preferiblemente superior al 40%, preferiblemente superior al 70%, más preferiblemente superior al 80%, más preferiblemente superior al 90% y más preferiblemente superior al 95%. Un compuesto "enantioméricamente puro" puede considerarse como una mezcla de dos enantiómeros que tienen un exceso enantiomérico superior al 95%, preferiblemente superior al 98%, más preferiblemente superior al 99%, más preferiblemente superior al 99,5%. Un compuesto "sustancialmente puro" en la presente solicitud de patente hace referencia a un compuesto que tiene una pureza superior al 95%, preferiblemente superior al 98%, más preferiblemente superior al 99%, más preferiblemente superior al 99,5%.

Un "estereoisóraero" en la presente solicitud de patente hace referencia a compuestos formados por los mismos átomos unidos por la misma secuencia de enlaces pero que tienen estructuras tridimensionales diferentes que no son intercambiables . "Nucleófilo que contiene nitrógeno" se refiere a una molécula que tiene al menos un nitrógeno con al menos un par libre de electrones, pudiendo formar dicho par de electrones un enlace con un resto electrófilo (deficiente en electrones) de otra molécula o dentro de la misma molécula. Ejemplos de nucleófilos que contienen nitrógeno son aminas primarias, secundarias o terciarias, átomos de nitrógeno no sustituido que forman parte de un heterociclo, incluso el átomo de nitrógeno de un resto de amida puede actuar en ciertas circunstancias como un nucleófilo.

El documento EP 0768308 Bl produce mezclas de estereoisomeros de derivados de ácido piroglutámico Fracasaron todos los intentos de. separar las mezclas de estereoisomeros que se dan a conocer en el documento EP 0768308 Bl, en los compuestos sustancialmente puros de los mismos. Siguiendo la sección experimental de los inventores, se obtuvo un 5% del compuesto identificado como BLAS-236(C1) (clorhidrato de cloruro 1- (3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio) en la patente europea citada anteriormente -236 (Cl) como una mezcla de los cuatro posibles estereoisómeros . También, se sintetizó el precursor inmediato BLAS -320 (Ac) (acetato de 1- (l-acetil-3-acetilamino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3 -ilmetil ) piridinio) BLAS-320 (Ac) usando diferentes procedimientos. El compuesto de fórmula BLAS-320 (Ac) se obtuvo como una mezcla de estereoisómeros imposible de purificar, fundamentalmente debido a problemas de solubilidad (compuesto BLAS-320 (Ac) sólo era soluble en agua y metanol) . Además, se intentó la sustitución del contraión acetato por otros aniones en el compuesto de fórmula BLAS-320 (Ac) , pero fracasó. Adicionalmente , se intentó la transformación (o síntesis directa) y purificación adicional del compuesto de fórmula BLAS-320 (Ac) en los derivados de éster del mismo. Las mezclas brutas negras obtenidas fueron imposibles de purificar en todos los casos.

En vista de los hechos anteriores, se comprendió que la descripción del documento EP 0768308 Bl era insuficiente para obtener los estereoisómeros sustancialmente puros deseados de los derivados de ácido piroglutámico referidos en ese documento. Por consiguiente, se desarrolló un enfoque totalmente diferente.

Síntesis de los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula I y mezclas de los mismos En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento, denominado a continuación en el presente documento como el procedimiento de la invención, para la síntesis de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I (I) en donde Ri se selecciona de -OH, -ORa, en donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido ; R2, 3 y se seleccionan independientemente de hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida; X es un anión farmacéuticamente aceptable; e Y es un residuo orgánico seleccionado de (i) un grupo que contiene N de fórmula Vía - ) T (Vía) en donde la línea de puntos junto con el átomo de N forman un heteroarilo sustituido o no sustituido, y X es como se definió anteriormente; o (ii) un grupo que contiene N de fórmula VIb Ra X NH TT (VIb) en donde X es como se definió anteriormente; y Ra y Rb se seleccionan independientemente de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; o Ra y Rb junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un heterociclo sustituido o no sustituido; o mezclas del mismo; que comprende a) hacer reaccionar un compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV en donde Ri y R2 son como se definieron anteriormente ; o mezclas del mismo; con un compuesto de fórmula V Phl=N^ 4 (V) en donde R4 es como se definió anteriormente; para dar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III (III) en donde Rlf R2 y R4 son como se definieron anteriormente ; o mezclas del mismo; b) transformar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II (II) en donde Ri, R2 y R4 son como se definieron previamente; R5 se selecciona de una carga negativa o R3, en donde R3 es como se definió anteriormente; e Y es un residuo orgánico que contiene N seleccionado de (i) cuando R5 es una carga negativa, Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula Vlla (Vlla) en donde línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido; o (ii) cuando R5 es R3í Y es un residuo orgánico seleccionado de (ii. a) un grupo que contiene N de fórmula Vllb Ra I Rb (vi ib) en donde Ra y Rb son como se definieron anteriormente; o (ii.b) un residuo orgánico que contiene N de fórmula VI Ic (VIIc) en donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido; y Z es un anión farmacéuticamente aceptable ; o mezclas del mismo; y poner en contacto dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, con un medio ácido que comprende un ácido de fórmula HX, en donde X es tal como se definió anteriormente, para dar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I, o mezclas del mismo.

El papel de los grupos protectores de nitrógeno que se hidrolizan en condiciones ácidas (R2, R3 y/o R4) es proteger la funcionalidad de nitrógeno hasta la etapa c) (que transforma los compuestos de fórmula II en los compuestos de fórmula I haciendo reaccionar dicho compuesto de fórmula II con un compuesto de fórmula HX) . Es apropiado cualquier grupo protector de nitrógeno que pueda proteger el átomo de nitrógeno hasta la etapa c) para la presente invención. Grupos protectores de nitrógeno preferidos que se hidrolizan en condiciones ácidas son aquellos que pueden hidrolizarse durante la etapa c) al mismo tiempo que se forma la sal o disal para dar un compuesto de fórmula I. De esta manera, durante la etapa c) se desprotegen los átomos de nitrógeno de la molécula y se forma la sal o disal en una única etapa sintética. Sin embargo, según la presente invención, no es esencial que la sal o disal se forme al mismo tiempo que se desprotegen los átomos de nitrógeno. Por lo tanto, según una realización de la invención, la formación de la sal o disal y la desprotección de los átomos de nitrógeno pueden requerir más de una etapa. Según una realización preferida, se seleccionan los grupos protectores de nitrógeno que se hidrolizan en condiciones ácidas de carbamatos de fórmula -(0=)C-0-Ra, en donde Ra tiene el mismo significado que anteriormente, preferiblemente en donde Ra es bencilo, -C(CH3)3 o -CH2CH3; o un sulfonato de fórmula - (0=) S (=0) -Ra en donde Ra tiene el mismo significado que anteriormente, preferiblemente en donde Ra es -CH3 o tosilato. Otros grupos protectores que se hidrolizan en condiciones ácidas son conocidos para el experto en la materia; véanse libros referencia tales como Greene y uts "Protective Groups in Organic Synthesis" , John iley & Sons, Inc., Nueva York, 1999. Cuando al menos uno de R2, 3 y R4 es ftalamida, es necesario realizar una etapa adicional previa a la formación de la sal o disal (previa a la etapa c) que comprende una reducción o reacción con hidrazina (para más detalles de cómo eliminar un grupo ftalamida, véase por ejemplo Greene y Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999). El compuesto de partida de fórmula IV del procedimiento de la invención puede estar en forma de un compuesto enantioméricamente puro (es decir, R ó S) o en forma de una mezcla de enantiomeros (R y S) , enriquecidos opcionalmente en uno de ellos. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mezcla de enantiomeros" incluye cualquier mezcla de dos enantiomeros, en proporciones equimolares o no, y, como tal, incluye no sólo mezclas racémicas de dichos dos enantiomeros sino también mezclas enriquecidas en cualquiera de dichos enantiomeros. Cuando el compuesto de fórmula IV está en forma de un compuesto enantioméricamente puro, la reacción mencionada anteriormente puede dar dos productos (estereoisómeros) , uno que corresponde al ataque desde la cara ß y otro que corresponde al ataque desde la cara a. En este caso, la reacción muestra baja estereoselectividad y se obtiene una mezcla de los dos posibles compuestos (estereoisómeros) de cada uno de los enantiomeros del compuesto de fórmula IV. Así, según una realización particular, el compuesto de fórmula IV está en forma de un compuesto enantioméricamente puro. Si se usa el isómero S del compuesto de fórmula IV como material de partida, la reacción da, en general, una mezcla de un compuesto de fórmula Illa Illa en donde Ri, R2 y R4 son como se definieron anteriormente ; y un compuesto de fórmula II Ib Illb en donde Ri, R2 y R4 son como se definieron anteriormente . Asi que, cuando el isómero del compuesto de fórmula IV usado es el estereoisómero S, el compuesto resultante de fórmula III obtenido estará, generalmente, en forma de una mezcla de sus estereoisómeros de fórmula Illa y Illb. Si se desea, dicho compuesto de fórmula III, en forma de dicha mezcla de estereoisómeros, puede aislarse mediante métodos convencionales (por ejemplo, sílice, recristalización, etc.) con el fin de obtener una mezcla de Illa y Illb, en una razón equimolar o no. Alternativamente, si se desea, dicha mezcla de estereoisómeros de fórmula Illa y Illb puede tratarse mediante métodos convencionales (por ejemplo, recristalización, cromatografía, etc.) con el fin de separar cada estereoisómero y obtener los estereoisómeros de fórmula Illa y Illb como compuestos enantioméricamente puros. También, si se usa el isómero R del compuesto de fórmula IV como material de partida, la reacción da, en general, una mezcla de un compuesto de fórmula lile, en donde Rlt R2 y R4 son como se definieron anteriormente ; compuesto de fórmula II Id en donde Rl7 R2 y R4 son como se definieron anteriormente . Así que, cuando el isómero del compuesto de fórmula IV usado es el estereoisómero R, el compuesto resultante de fórmula III obtenido estará, generalmente, en la forma de una mezcla de sus estereoisómeros de fórmula lile y Illd. Tal como se mencionó anteriormente, si se desea, dicho compuesto de fórmula III, en la forma de dicha mezcla de estereoisomeros, puede aislarse mediante métodos convencionales con el fin de obtener una mezcla de lile y Illd, en una razón equimolar o no, o alternativamente, dicha mezcla de estereoisomeros puede tratarse mediante métodos convencionales con el fin de separar cada estereoisómero y obtener los estereoisomeros de fórmula lile y Illd como compuestos enantioméricamente puros. Aunque esto puede parecer una desventaja, los inventores han encontrado que los compuestos de la mezcla finalmente obtenida a partir de la reacción del compuesto de fórmula IV con el compuesto de fórmula V pueden separarse fácilmente en los estereoisomeros sustancialmente puros correspondientes de un compuesto de fórmula III, es decir, Illa, Illb, lile o Illd. Esto permite la síntesis de los estereoisomeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula I, lo cual es un aspecto de la presente invención. Según otra realización particular, el compuesto de fórmula IV está en la forma de una mezcla de los dos posibles enantiómeros (R o S) , opcionalmente , enriquecidos enantioméricamente con respecto a uno de dichos enantiómeros. En tales casos, el compuesto resultante de fórmula III se selecciona de una mezcla de Illa, Illb, lile y Illd (en proporciones equimolares o no) ; una mezcla de Illa y lile en una razón equimolar o no; o una mezcla de IIIb y II Id en una razón equimolar o no. El compuesto de fórmula IV puede obtenerse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se describe uno de los enfoques sintéticos usados por los inventores en el esquema 1. El ácido glutámico 1 (en este caso, ácido D-glutámico) puede transformarse en un compuesto de fórmula 2 como se describe en Silverman, R.B. ; Levy, M.A., J". Org. Chem. 1980, 45, 815. La segunda etapa es la protección del nitrógeno de amido, usando un método conocido (Flyn, D.L., et al., J. Org. Chem., 1983, 48, 2424) para obtener un compuesto de fórmula 3. Entonces, las dos etapas siguientes son: en primer lugar, la sustitución de la posición 3 de la 2 -pirrolidona por un grupo dimetilaminometilo, que da 4 , [que es realmente una mezcla de dos diastereómeros , porque el centro quiral en 3 no se controla en el procedimiento] y la cuaternización con Mel, y la eliminación da el compuesto de fórmula 5 (compuesto de fórmula IV en donde Ri es -OEt y R2 es BOC) que se ha descrito ya en Panday, S. K. ; Grif fart-Brunel , D.; Langlois, N. ; Tetrahedron Lett., 1994, 35, 6673. En este caso, el compuesto de fórmula IV obtenido tiene la configuración R. Cuando se deseaba la configuración S, se usó ácido L-glutámico como material de partida (como una vista general, 5 tiene la misma configuración que el ácido glutámico de partida) .

Esquema 1 Una primera variante del método mencionado anteriormente para la síntesis del compuesto 5 comprende la transformación de ácido glutámico 1 (en este caso, ácido D-glutámico) en el ácido piroglutámico de fórmula 1' como se describe en Lennox, J.R.; Turner, S.C.; Rapoport , H.J". Org. Chem. 2001, 66, 7078-7083. Dicho ácido piroglutámico de fórmula 1' se transforma entonces en el compuesto de fórmula 2 descrito anteriormente mediante esterificación en presencia de etanol y SOC12 (véase el esquema 2) .

Esquema 2 Una segunda variante del método mencionado anteriormente para la síntesis del compuesto 5 comprende la transformación del compuesto de fórmula 2 en el compuesto de fórmula 3 usando DMAP como base y acetonitrilo (MeCN) como disolvente.

Una tercera variante del método mencionado anteriormente para la síntesis del compuesto 5 comprende la transformación del compuesto de fórmula 3 en un compuesto de fórmula 4' mediante reacción con tBuOCH (NMe2) 2 (reactivo de Bredereck) . Dicho compuesto de fórmula 4' se transforma en el compuesto de fórmula 5 en una secuencia de dos etapas. En primer lugar, haciendo reaccionar el compuesto de fórmula 4' con HCl diluido. Luego, haciendo reaccionar el compuesto resultante con HCHO acuoso (al 37%) en presencia de una base inorgánica tal como se describe en el documento WO 2004039314 (véase el esquema 3) .

Esquema 3 Hay varios reactivos conocidos por el experto en la materia con el fin de lograr la formación del anillo de aziridina. Sin embargo, no es fácil la elección del reactivo para la síntesis de espiro-aziridinas a partir de enlaces dobles carbono- carbono . Por ejemplo, el uso de cloramina-T en presencia de HBr/H202 (L.J. Suman; B.S. Sharma; S. Bir. Tetrahedron Letters 2004, 45, 8731) no dio la aziridina deseada, sino derivados clorados de la siguiente fórmula general Después de varios experimentos, se encontró que el reactivo más apropiado para la reacción era el bencilyodinano de fórmula V. Según una realización particular, R4 se selecciona de - (0=) C-O-C (CH3) 3 , - (0= ) C-0-CH2CH3 , -(0=)S(=0)-tosilo o ftalamida. En una realización preferida, el compuesto de fórmula V es N- tosiliminobencilyodinano (Barón E . ; O'Brien P . ; Towers T.D. Tetrahedron Lett . , 2002, 43, 723) , que puede sintetizarse siguiendo el método descrito en Gillepia, K. , Synthetic Comunn . 2001, 123. La reacción del compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV, o mezclas del mismo, con el compuesto de fórmula V para dar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, puede llevarse a cabo, si se desea, en presencia de un catalizador, preferiblemente un catalizador a base de cobre, más preferiblemente seleccionado de Cu(ft)2 o Cu(acac)2, en los que "ft" es ftalocianina y "acac" es acetoacetato . Para más detalles con relación a catalizadores y condiciones, véase Barón, E . ; O'Brien, P.; Towers, T. D. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 723 y S. L. Jain, B. Sain, Journal of molecular catalysis A: Chemical 2003, 195, 283. Ésta reacción se lleva a cabo normalmente en un disolvente orgánico adecuado a una temperatura apropiada, preferiblemente una temperatura comprendida entre 0 y 100 °C. Aunque puede usarse prácticamente cualquier disolvente orgánico adecuado en dicha reacción (por ejemplo acetonitrilo , dimetilformamida , etc.) , en una realización particular, cuando el compuesto de fórmula IV es éster 1-tercbutílico, éster 2-et£lico del ácido 4-metilen-5-oxopirrolidin-l , 2 -dicarboxí lico y el compuesto de fórmula V es N- tosiliminobencilyodinano (PhI=NTs) [ejemplos 3.1 y 4.1] , el disolvente orgánico es acetonitrilo y la reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 0°C y temperatura ambiente (aproximadamente 18°C-24°C) .

Además, pueden usarse los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula III, o mezclas de los mismos, para obtener estereoisómeros sustancialmente puros de los derivados de ácido piroglutámico de fórmula I, o mezclas de los mismos, a través de los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula II o mezclas de los mismos. Así, un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo, se transforma adicionalmente en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo, por medio de una estrategia que depende de la naturaleza de R5 e Y, así: (A) con el fin de preparar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo en donde R5 es una carga negativa e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula VI la, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo, se hace reaccionar con un nucleófilo que contiene nitrógeno de fórmula Villa Villa en donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido, o (B) con el fin de preparar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo en donde R5 es R3 e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula Vllb, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo, se hace reaccionar con un nucleófilo que contiene nitrógeno de fórmula VlIIb Ra \ HN Rb vil ib en donde Ra y Rb son como se definieron anteriormente ; y, si se desea, se extingue la mezcla resultante con un compuesto de fórmula X R3Z (X) en donde R3 y Z se definieron anteriormente; o ¦ (C) con el fin de preparar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo en donde R5 es R3 e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula VIIc el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo, se hace reaccionar con un nucleófilo que contiene nitrógeno de fórmula Villa, y se extingue la mezcla resultante con dicho compuesto de fórmula X. En resumen, tal como se ha mencionado anteriormente, la síntesis de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, comprende hacer reaccionar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o una mezcla del mismo, con un compuesto de fórmula Villa, o alternativamente con, un compuesto de fórmula VlIIb, y, si se desea, con un compuesto de fórmula X, o alternativamente con, un compuesto de fórmula Villa y con un compuesto de fórmula X. El compuesto de partida de fórmula III puede estar en forma de un estereoisómero sustancialmente puro [es decir, (3 ,5R); (3S,5S); (3R,5S); o (3S,5R)] o en forma de una mezcla de dichos estereoisómeros sustancialmente puros, por ejemplo, como una mezcla de diastereómeros , etc., en las mismas o en proporciones diferentes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mezclas de estereoisómeros" incluye cualquier mezcla de dos o más estereoisómeros de un compuesto, en razón equimolar o no . En general, se mantiene la estereoquímica del material de partida (compuesto de fórmula III) en el producto resultante (compuesto de fórmula II) . Así, según una realización particular, el compuesto de fórmula III está en forma de un estereoisómero sustancialmente puro del mismo [es decir, (3R,5R); (3S,5S); (3R,5S) ; o (3S,5R)] , en cuyo caso, se obtiene un compuesto esencialmente puro de fórmula II que mantiene la estereoquímica del compuesto de partida de fórmula III. Según otra realización particular, el compuesto de fórmula III está en forma de una mezcla de dichos estereoisómeros (es decir, una mezcla de dos o más estereoisómeros seleccionados de los compuestos de fórmula Illa, Illb, lile y Illd) , en una razón equimolar o no. En este caso, se obtiene una mezcla de estereoisómeros del compuesto de fórmula II que mantienen la estereoquímica de los estereoisómeros de partida de fórmula III. La mezcla de estereoisómeros de fórmula II puede separarse en sus estereoisómeros sustancialmente puros correspondientes siguiendo métodos convencionales tales como cromatografía en gel de sílice o recristalización. En una realización, un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o una mezcla del mismo, se hace reaccionar con un compuesto de fórmula Villa para dar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, en donde R5 es una carga negativa e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula Vlla [opción (A) ] . En ese caso, en una realización, el nucleófilo que contiene nitrógeno Villa es una piridina de fórmula IX IX en donde , n es O, 1, 2, 3, 4 ó 5; y R6 se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, alcoxilo sustituido o no sustituido, ariloxilo sustituido o no sustituido, halógeno, carboxiéster sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido y/o la piridina forma uno o más anillos condensados sustituidos o no sustituidos.

Además, según una realización particular, se selecciona dicha piridina de fórmula IX de piridina y uno de los siguientes compuestos Según otra realización particular, el nucleófilo que contiene nitrógeno Villa es un compuesto de fórmula Generalmente, la reacción del estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o una mezcla del mismo, con el compuesto de fórmula Villa se lleva a cabo con calentamiento. De hecho, el experto en la materia sabe que las reacciones tales como la transformación de un compuesto de fórmula III en un compuesto de fórmula II, concretamente la apertura de anillo del anillo de aziridina en presencia de un nucleófilo, normalmente requiere calor. Pueden usarse microondas, si se desea. En una realización particular, se logra el calentamiento mediante la irradiación de la mezcla de reacción con microondas que permiten alcanzar fácilmente la temperatura deseada y mantener la misma durante el periodo de tiempo deseado. Según una realización, la reacción se realiza en presencia de un catalizador, tal como montmorillonita , un catalizador ácido poroso (por ejemplo, ejemplos 3.2.1, 3.2.2, 4.2.1 y 4.2.2). En otra realización, un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o una mezcla del mismo, se hace reaccionar con un compuesto de fórmula VlIIb, y, opcionalmente con un compuesto de fórmula X, para dar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, en donde R5 es R3 e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula Vllb [opción (B) ] .

En este caso, en una realización, el nucleófilo que contiene nitrógeno VlIIb es un compuesto seleccionado de los siguientes compuestos: Según la opción (B) hay esencialmente dos tipos posibles de condiciones que dependen de las especies reactivas que atacan el anillo de aziridina. Por un lado, es posible generar el anión de un compuesto de fórmula VII Ib poniendo en contacto dicho compuesto de fórmula VII Ib con una base fuerte (es decir butil-litio, etc.) . Una vez que se forma el anión del compuesto de fórmula VIIIb, puede añadirse el compuesto de fórmula III y se ataca el anillo de aziridina por el anión del compuesto de fórmula VlIIb. La reacción puede continuar adicionalmente mediante la adición del compuesto de fórmula X, por ejemplo, un compuesto alquilante tal como yoduro de metilo (R3 = alquilo), etc. Las condiciones necesarias para formar el anión de un compuesto de fórmula VIIIb se conocen por el experto en la materia. Incluso algunas de dichas especies están disponibles comercialmente . Alternativamente, es posible extinguir la reacción antes de la adición de un compuesto de fórmula X, en cuyo caso R3 será hidrógeno en el compuesto resultante de fórmula II. Por otro lado, es posible usar directamente el compuesto de fórmula VlIIb. Estas condiciones requieren normalmente calor o microondas y dan un compuesto de fórmula II en donde R3 es hidrógeno. Todavía en otra realización, un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o una mezcla del mismo, se hace reaccionar con un compuesto de fórmula Villa y con un compuesto de fórmula X, para dar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, en donde Rs es R3 e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula VIIc [opción (C) ] . Los compuestos de fórmula Villa y X se han definido anteriormente .

El experto en la materia sabe que reacciones tales como la transformación del compuesto de fórmula III en un compuesto de fórmula II, concretamente la apertura de anillo del anillo de aziridina en la presencia de un nucleófilo, normalmente requiere calor. Pueden usarse microondas, si se desea . El compuesto de fórmula II tiene dos centros quirales; por tanto, puede estar en forma de cualquiera de los estereoisómeros esencialmente puros o mezclas de los mismos. En una realización particular, se selecciona el compuesto de fórmula II del grupo que consiste en: a) un compuesto sustancialmente puro de fórmula lia, Ha en donde Ri, R2, R4, R5 e Y son como se definieron anteriormente ; b) un compuesto sustancialmente puro de fórmula Ilb, Ilb en donde Rl t R2 , R4 , 5 e Y son como se definieron anteriormente ; c) un compuesto sustancialmente puro de fórmula IIc, lie en donde Rx, R2; R4, R5 e Y son como se definieron anteriormente ; d) un compuesto sustancialmente puro de fórmula lid, lid en donde Ri, R2, R4 , R5 e Y son como se definieron anteriormente; y e) cualquier mezcla de los compuestos anteriormente mencionados de fórmula lia, 11b, lie y/o lid (en una razón equimolar o no) . Compuestos preferidos de fórmula II, que incluyen sus estereoisómeros sustancialmente puros, se mencionan a continuación bajo el encabezamiento correspondiente. Los compuestos resultantes de fórmula II pueden aislarse o usarse directamente para la etapa siguiente sin purificación adicional. Cuando se obtiene una mezcla de estereoisómeros del compuesto de fórmula II, es posible aislar el estereoisómero deseado mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la materia.

Así, según la invención, puede obtenerse un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, precursor inmediato del estereoisómero sustancialmente puro del derivado de ácido piroglutámico de fórmula I, o mezclas del mismo, con la estereoquímica deseada, o bien purificando la mezcla resultante de estereoisómeros del compuesto de fórmula III y entonces haciendo reaccionar los estereoisómeros aislados con los reactivos correspondientes, o bien, alternativamente, purificando la mezcla resultante de la reacción entre dicho compuesto de fórmula III y el nucleófilo de fórmula Villa o VlIIb y X (si es necesario) . Así, según la etapa c) del procedimiento de la invención, se convierte un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, en el estereoisómero sustancialmente puro del derivado de ácido piroglutámico de fórmula I, o mezclas del mismo, poniendo en contacto dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, con un medio ácido que comprende un ácido de fórmula HX, en donde X se define como anteriormente. El experto en la materia es consciente de los ácidos orgánicos o inorgánicos de fórmula HX adecuados para realizar la reacción con el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo. En una realización particular, dicho ácido HX es un ácido inorgánico, tal como HCl, HBr, etc. Según una realización preferida, HX es HBr. Dependiendo de la naturaleza de los compuestos de fórmula I y II, la reacción requiere de 1 ó 2 equivalentes de HX . El experto en la materia es consciente de las condiciones que son necesarias para formar la sal. Según una realización de la invención, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, se pone en contacto con un exceso de un ácido de fórmula HX, en donde X se define como anteriormente. Según una realización adicional, se disuelve en HBr acuoso y se calienta el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo Según lo anterior, es posible obtener un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I o mezclas del mismo, en una secuencia por etapas a partir del estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo. Sin embargo, también es posible obtener el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I o mezclas del mismo, a partir del compuesto de fórmula III siguiendo una estrategia one-pot. Es, por lo tanto, un aspecto adicional de la invención, un proceso one-pot para la síntesis de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I o mezclas del mismo, que comprende hacer reaccionar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo, con un nucleófilo que contiene nitrógeno de fórmula Villa ó VII Ib; y, posteriormente, hacer reaccionar el compuesto resultante de la etapa previa con un ácido de fórmula HX. El compuesto de fórmula I tiene dos centros quirales; por lo tanto, puede estar en forma de cualquiera de los estereoisómeros sustancialmente puros de los mismos o en forma de una mezcla de los mismos. Compuestos preferidos de fórmula I, que incluyen sus estereoisómeros sustancialmente puros se mencionan a continuación bajo el encabezamiento correspondiente .

Compuesto de fórmula I Los compuestos de fórmula I tienen dos centros quirales; por lo tanto, pueden estar en forma de cualquiera de los estereoisómeros sustancialmente puros o de una mezcla de los mismos. En una realización particular, el compuesto de fórmula I se selecciona del grupo que consiste en: a) un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula la la en donde Rx , R2 , R3 , R4 , X e Y son como se definieron anteriormente; b) un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula Ib, Ib en donde R1( R2 , R3, R4 , X e Y son como se definieron anteriormente; c) un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula Ic Ic en donde Ri , R2 , R3, R , X e Y son como se definieron anteriormente; d) un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula Id Id en donde Rx, R2, R3, R4 X son como se definieron anteriormente; y e) cualquier mezcla de los compuestos sustancialmente puros de fórmula la, Ib, Ic y/o Id anteriormente mencionados, en una razón equimolar o no, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente los cuatro estereoisómeros de los compuestos siguientes : (i) clorhidrato de cloruro de 1- (3 -amino-5- carboxi-2 -oxopirrolidin-3 -ilmetil) piridinio, o (ii) clorhidrato de cloruro de 1- (l-acetil-3- amino- 5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) - piridinio. Aunque algunos compuestos de fórmula I, concretamente (i) clorhidrato de cloruro de l-(3-amino- 5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) iridinio, y (ii) clorhidrato de cloruro de 1- (l-acetil-3-amino-5-carboxi- 2-oxopirrolidin-3-ilmetil) iridinio se han descrito como mezclas de todos los cuatro posibles estereoisómeros de los mismos, no se ha logrado una síntesis de sus estereoisómeros esencialmente puros hasta la fecha. En una realización particular, en el compuesto de fórmula I, ¾ es -OH o -ORa, en donde Ra es como se definió anteriormente, preferiblemente -OH. En otra realización particular, en el compuesto de fórmula I, R2 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalamida, preferiblemente hidrógeno. En otra realización particular, en el compuesto de fórmula I, R3 o R , independientemente, es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida, preferiblemente ambos son, simultáneamente, hidrógeno. En otra realización particular, en el compuesto de fórmula I, X es un anión farmacéuticamente aceptable, preferiblemente bromuro o cloruro. En otra realización particular, en el compuesto de fórmula I, Rx es OH o ORa, preferiblemente OH; R2 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida, preferiblemente hidrógeno; R3 o R4 , independientemente, son hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida, preferiblemente R3 o R son, simultáneamente, hidrógeno; y/o X es un anión farmacéuticamente aceptable, preferiblemente bromuro o cloruro. En otra realización particular, en el compuesto de fórmula I, Y es un residuo orgánico seleccionado de En otra realización particular, en el compuesto de fórmula I, Y es un residuo orgánico seleccionado de Según una realización particular, el compuesto de fórmula I es un compuesto sustancialmente puro de fórmula I'a I ' a en donde Ri, R2, R6 y n son como se definieron anteriormente . Según una realización particular de la invención, dicho compuesto de fórmula I es un compuesto sustancialmente puro de fórmula I'b I'b en donde Rlt R2 , R6 y n son como se definieron anteriormente . Según una realización particular de la invención, dicho compuesto de fórmula I es un compuesto sustancialmente puro de fórmula I'c, en donde Rlt R2 , R6 , y n son como se definieron anteriormente .

Según una realización particular de la invención, dicho compuesto de fórmula I es un compuesto sustancialmente puro de fórmula I'd en donde Ri, R2, R6 y n son como se definieron anteriormente . Según una realización particular de la invención, se proporciona una mezcla que comprende dos o más compuestos de fórmula I'a, I'b, I'c y/o I'd, en razones equimolares o no; por ejemplo, una mezcla que comprende compuestos de fórmula I'a y I'b, o que comprende compuestos de fórmula I'a y I'c, o que comprende compuestos de fórmula I'a y I'd, o que comprende compuestos de fórmula I'b y I'c, o que comprende compuestos de fórmula I'b y I'd, o que comprende compuestos de fórmula I'c y I'd, o que comprende compuestos de fórmula I'a, I'b y I'c, o que comprende compuestos de fórmula I'a, I'b y I'd, o que comprende compuestos de fórmula I'b, I'c y I'd, o que comprende compuestos de fórmula I'a, I'b, I'c y I'd. Según una realización particular de la invención, se selecciona el compuesto de fórmula I del grupo que consiste en : bromhidrato de bromuro de 3S , 5S- 1 - (3 -amino-5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio ; bromhidrato de bromuro de 3R, 5S- 1 - (3 -amino-5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio ; bromhidrato de bromuro de 3R, 5R-1- (3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) piridinio; y bromhidrato de bromuro de 3S, 5R-1- (3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio . La invención proporciona adicionalmente una composición que comprende una mezcla de dichos compuestos de fórmula la, Ib, Ic y/o Id, en razones equimolares o no, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los siguientes compuestos (i) clorhidrato de cloruro de 1- (3 -amino-5 -carboxi -2- oxopirrolidin-3-ilmetil) piridinio, o (ii) clorhidrato de cloruro de 1- (l-acetil-3-amino-5- carboxi -2 -oxopirrolidin-3 -ilmetil ) piridinio .

Compuesto de fórmula II Aunque algunos compuestos de fórmula II, concretamente acetato de 1- (3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil ) piridinio, acetato de 1- (l-acetil-3-amino-5-carboxi- 2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio , acetato de l-(l-acetil- 3-acetilamino-5-carboxi-2 -oxo-pirrolidin-3 -ilmetil) piridinio o clorhidrato de 1- (l-acetil-3-acetilamino-5-carboxi-2-oxo-pirrolidin-3 -ilmetil ) piridinio se han descrito como mezclas de todos los cuatro estereoisómeros posibles de los mismos, no se ha logrado una síntesis de sus estereoisómeros esencialmente puros hasta la fecha.

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un compuesto sustancialmente puro de fórmula II o mezclas del mismo . En una realización particular, la invención se refiere a un compuesto sustancialmente puro de fórmula lia, Ilb, lie y lid. En una realización particular, la invención se refiere a una mezcla de los compuestos de fórmula lia, Ilb, lie y/o lid mencionados anteriormente, en cualquier razón molar, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente los cuatro estereoisómeros de los siguientes compuestos: acetato de 1 - (3 -amino- 5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio ; acetato de 1 - ( 1 -acetil - 3 -amino-5 -carboxi -2 - oxopirrolidin-3 - ilmetil) piridinio; acetato de 1- (l-acetil-3-acetilamino-5-carboxi-2-oxo- pirrolidin-3-ilmetil) piridinio; o clorhidrato de 1- (l-acetil-3-acetilamino-5-carboxi-2- oxo-pirrolidin-3 - ilmetiDpiridinio. En otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde Ri es -ORa, preferiblemente en donde Ra es un grupo alquilo. En otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde R2 es -(0=)C-0-Ra, preferiblemente el grupo BOC. En otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde R4 es - (0=) S (=0) -Ra, preferiblemente tosilo. En otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde Ri es -ORa, preferiblemente en donde Ra es un grupo alquilo; R2 es -(0=)C-0-Ra, preferiblemente el grupo BOC; y R4 es -(0=)S(=0)-Ra, preferiblemente tosilo. Según otra realización de la invención, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde R2 , R4 y R5, son, independientemente, hidrógeno. Según otra realización de la invención, . el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde Rx es -OH. Según otra realización de la invención, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde R5 es una carga negativa. La invención también se refiere a una composición que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en los compuestos de fórmula lia, Ilb, lie, lid anteriormente mencionados y mezclas de los mismos, en cualquier razón molar, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente los cuatro estereoisómeros de los siguientes compuestos: acetato de 1- (3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3- ilmetil)piridinio; acetato de 1 - ( 1 -acetil -3 -amino-5 -carboxi - 2 - oxopirrolidin- 3 -ilmetil)piridinio; acetato de 1- (l-acetil-3-acetilamino-5-carboxi-2-oxo- pirrolidin-3-ilmetil) piridinio; o clorhidrato de 1 - ( 1 -acetil -3 -acetilamino-5 -carboxi -2 - oxo-pirrolidin-3 -ilmetil) piridinio . El estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II o mezclas del mismo puede obtenerse, tal como se mencionó anteriormente, por medio de un procedimiento que comprende hacer reaccionar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo, con un compuesto de fórmula Villa, o alternativamente con, un compuesto de fórmula VlIIb, y, si se desea, con un compuesto de fórmula X, o alternativamente con, un compuesto de fórmula Villa y con un compuesto de fórmula X. Dicho procedimiento constituye un aspecto adicional de la presente invención y hace posible la síntesis de estereoisómeros sustancialmente puros del compuesto de fórmula II o mezclas del mismo.

Compuesto de fórmula III , En otro aspecto, la invención se refiere a un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo. Dicho compuesto de fórmula III tiene dos centros quirales; por lo tanto, puede estar en forma de cualquiera de los estereoisómeros sustancialmente puros o una mezcla de los mismos. En una realización particular, el compuesto de fórmula III se selecciona del grupo que consiste en los compuestos de fórmula Illa, Illb, lile, Illd y cualquier mezcla de los mismos . En otra realización particular, la invención se refiere a una mezcla que comprende dos o más compuestos de fórmula Illa, Illb, lile y Illd. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de dichas mezclas incluye mezclas de dos de esos compuestos (por ejemplo, mezclas de Illa y Illb, Illa y lile, Illa y Illd, Illb y IIIc, Illb y Illd o IIIc y Illd) , o mezclas de tres de dichos compuestos (por ejemplo, mezclas de Illa, Illb y IIIc, Illa, Illb y Illd, o Illb, IIIc y Illd) , o mezclas de dichos cuatro compuestos (por ejemplo, una mezcla de Illa, Illb, IIIc y Illd) . Cada compuesto particular (Illa a Illd) puede presentarse en dicha mezcla en cualquier proporción o razón, por ejemplo, en proporciones o razones equimolares o en proporciones o razones diferentes en donde uno o más de dichos compuestos están en exceso con respecto al/a los otro/s . En otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde Ri es -ORa, preferiblemente en donde Ra es un grupo alquilo. Según otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde R2 es -(0=)C-0-Ra, preferiblemente el grupo BOC. Según otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde R4 es -(0=)S(=0)-Ra, preferiblemente tosilo.

Según otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde Rx es -ORa, preferiblemente en donde Ra es un grupo alquilo; R2 es -(0=)C-0-Ra, preferiblemente el grupo BOC; y R4 es -(0=)S(=0)-Ra, preferiblemente tosilo. Según otra realización particular, el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, es un compuesto en donde R2, R4 y R5, son, independientemente, hidrógeno. El estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III o mezclas del mismo, puede obtenerse, tal como se mencionó anteriormente, por medio de un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula IV, tanto en una forma enantioméricamente pura como en forma de una mezcla de enantiómeros , con un compuesto de fórmula V. Dicho procedimiento constituye un aspecto adicional de la presente invención. Por medio de dicho procedimiento, también es posible obtener estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula III o mezclas de los mismos.

Usos del compuesto de fórmula I y composiciones farmacéuticas Los estereoisómeros sustancialmente puros de un compuesto de fórmula I, o mezclas de los mismos, pueden usarse como principios activos de medicamentos para el tratamiento y/o la profilaxis de algunos estados en un sujeto, por ejemplo, tumores, inmunodeficiencias , infecciones, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitantes, de estados susceptibles de ser tratados con el estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I o mezclas del mismo, incluyen: A) Estados relacionados con cáncer o tumores: que comprenden prácticamente todos los cánceres y tipos de tumores, que incluyen leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda del adulto, leucemia mieloide aguda infantil, leucemia mieloide aguda del adulto, carcinoma adrenocortical , cánceres relacionados con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), cáncer anal, astrocitoma, astrocitoma cerebeloso infantil, carcinoma de Cali basal, cáncer del conducto biliar, cáncer vesical extrahepático , cáncer de vejiga, cáncer de huesos, histiocitoma fibroso maligno osteosarcoma , glioma del tronco cerebral, tumor cerebral, glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma , tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales , glioma hipotalámico y de la vía visual, cáncer de mama, adenomas / carcinoides bronquiales asociados, linforna de Burkitt infantil, tumor carcinoide, carcinoma gastrointestinal primario desconocido, linforna del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso primario, astrocitoma cerebral / glioma maligno, cáncer cervicouterino , cánceres infantiles, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linforna cutáneo de células T, cáncer endometrial, cáncer esofágico, familia de tumores de Ewing infantiles, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular, cáncer ocular por melanoma intraocular, retinoblastoma , cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago) , tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de células germinales, glioma de tumor trofoblástico gestacional ovárico, glioma del adulto, glioma del tronco cerebral, glioma tipo astrocitoma cerebral, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (de hígado), cáncer hepatocelular (de hígado) del adulto (primario) , linfoma de Hodgkin infantil (primario) , linfoma de Hodgkin del adulto, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, carcinoma de células de islote (de páncreas endocrino) , sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (de células renales), cáncer de riñon, cáncer de laringe, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de células pilosas, de labio y de la cavidad bucal, cáncer de pulmón infantil (primario) , cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma de células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin del adulto, linfoma de Hodgkin infantil, linfoma no Hodgkin del adulto, linfoma no Hodgkin infantil, del sistema nervioso central primario, macroglobul inemia , histiocitoma fibroso maligno de Waldenstróm del hueso / osteosarcoma , meduloblastoma , melanoma, carcinoma de células de Merkel intraocular (del ojo), mesotelioma, mesotelioma maligno del adulto, cáncer escamoso de cuello metastático infantil con síndrome primario oculto de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple infantil / neoplasmas de células plasmáticas, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos , enfermedades mielodisplásicas / mieloproliferativas , leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda del adulto, mieloma agudo infantil, trastornos mieloproliferat ivos múltiples, cáncer del seno paranasal y la cavidad nasal crónico, cáncer nasofaríngeo, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma infantil, cáncer bucal, cáncer de la cavidad bucal infantil, cáncer de labio y bucofaríngeo , osteosarcoma / histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario infantil, tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario con bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas infantil, de células de islote, cáncer del seno paranasal y la cavidad nasal, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, feocromocitoma , pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales , tumor de hipófisis infantil, neoplasma de células plasmáticas / mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar , linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (de riñon) , cáncer de células renales (de riñon), renal infantil, de uréter y pelvis, cáncer de células de transición, retinoblastoma , rabdomiosarcoma , cáncer de las glándulas salivales infantil, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma infantil, familia de tumores de Ewing, sarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma del adulto de tejido blando, sarcoma infantil de tejido blando, síndrome uterino de Sezary, cáncer de. piel (no melanoma) , cáncer de piel infantil (melanoma), carcinoma cutáneo, cáncer de pulmón de células pequeñas de células de Merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, sarcoma de tejido blando del adulto, carcinoma de células escamosas infantil, sarcoma de tejido blando escamoso de cuello con cáncer oculto primario de estómago (gástrico) metastásico, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales infantiles, linfoma de células T infantil, cáncer de testículos, timoma, timoma infantil y cáncer de tiroides de carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición infantil del tumor trofoblástico de uréter y pelvis renal, sitio primario desconocido gestacional, cáncer de células de transición, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino endometrial, cáncer de vagina, glioma hipotalámico y de la vía visual, cáncer vulvar infantil, macroglobulinemia de Waldenstróm, tumor de Wilms, etc. ; B) Infecciones: que comprenden prácticamente todos los tipos de infecciones, tales como infecciones de origen bacteriano, fúngico y viral; o C) Enfermedades autoinmunitarias : que comprenden prácticamente todas las enfermedades autoinmunitarias mencionadas en el sitio web de la "American Autoimmune Related Diseases Association" ("Asociación Americana de Enfermedades Relacionadas Autoinmunitarias" ) [http://www.aarda.org], que incluyen esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo 1, psoriasis, lupus, colitis ulcerosa, vitíligo, enfermedad celíaca, vasculitis, dermatomiositis , polimiositis , tiroiditis (Hashimoto, Graves), miastenia grave, síndrome de Guillain-Barre , uveítis, liquen plano, arteritis temporal, sarcoidosis, síndrome seco (Sjóegren), asma bronquial, pénfigo, espondilitis anquilosante, esclerodermia , fibromialgia , fiebre reumática, etc. Por tanto, según un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica, denominada a continuación en el presente documento como la composición farmacéutica de la invención, que comprende un compuesto de fórmula I, sus estereoisómeros sustancialmente puros la, Ib, Ic o Id, o mezclas de los mismos en razones equimolares o no, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los siguientes compuestos: (i) clorhidrato de cloruro de 1- (3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3-ilmetil) piridinio, o (ii) clorhidrato de cloruro de 1 - ( 1 -acetil -3 -amino- 5 -carboxi -2 -oxopirrolidin- 3 -ilmetil ) piridinio , y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende, como principio activo, al menos un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I, es decir, la, Ib, Ic o Id, o mezclas de los mismos en relaciones equimolares o no, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente los cuatro estereoisómeros de los compuestos mencionados anteriormente (i) o (ii) , en una cantidad terapéuticamente eficaz. En el sentido utilizado en esta descripción "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de principio activo calculada para producir el efecto deseado y estará determinada generalmente, entre otros motivos, por las propias características del principio activo utilizado y el efecto terapéutico que va a obtenerse. En una realización particular, la dosis de principio activo administrada a un sujeto que necesita tratamiento para el tratamiento o la profilaxis de los estados mencionados anteriormente está en el intervalo de 10" 10 a 1010 mg/kg de peso corporal, normalmente entre 1CT3 y 103 mg/kg de peso corporal .

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el principio activo. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se emplean preferiblemente agua o soluciones salinas de disolución acuosa y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos, particularmente para disoluciones inyectables. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Además, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen normalmente una reacción no deseada alérgica o similar, tal como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, tal como se utiliza en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o enumerado en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y más particularmente en seres humanos. Para su administración a un sujeto, tal como un mamífero, por ejemplo un ser humano, que necesita el tratamiento, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse por cualquier ruta apropiada (vía) , tal como, oral (por ejemplo, oral, sublingual, etc.), parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intramuscular, etc.), vaginal, rectal, nasal, tópica, oftálmica, etc. La composición farmacéutica de la invención, obtenida mezclando el (los) principio (s) activo (s) con el (los) vehículo (s) farmacéuticamente aceptable (s) , puede administrarse en una pluralidad de formas farmacéuticas de administración, por ejemplo, sólidas, líquidas, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de dichas formas farmacéuticas de administración de la composición farmacéutica de la invención incluyen gotas orales (disolución, suspensión, emulsión, etc.); formulaciones orales (líquidas, disolución, suspensión, emulsión, gel, pasta, polvo, etc.); liofilizado oral; goma oral; polvo para disolución o suspensión oral; gránulos; gránulos gastrorresistentes; gránulos de liberación prolongadas; gránulos de liberación modificada; gránulos para suspensión oral; polvo y disolvente para disolución o suspensión oral; jarabe; polvo para jarabe; gránulos para jarabe; comprimidos (por ejemplo, comprimido soluble, comprimido dispersable, comprimido recubierto, comprimido recubierto de película, comprimido efervescente, comprimido bucodispersable , comprimido gastrorresistente , comprimido de liberación prolongada, comprimido de liberación modificada, comprimido bucal, comprimido masticable, etc.); té herbal ; té herbal instantáneo; polvo o gránulos efervescentes; sobre, cápsula (por ejemplo, dura, blanda, cápsula dura o blanda gastrorresistente, cápsula dura o blanda de liberación prolongada, cápsula dura o blanda de liberación modificada, etc.); pildoras; dispositivo intrarruminal de liberación continua; dispositivo intrarruminal de liberación pulsátil; bloque para chupar; premezcla para personal de alimentación medicada; grageas, gárgaras; concentrado para gárgaras; gárgaras (polvo o comprimido para disolución) ; disolución, suspensión, gotas, aerosol, gel, pasta, cápsula bucomucosos etc.; aerosol, comprimido sublinguales, etc.; enjuague bucal; disolución, gel, pasta gingivales, etc.; pastilla para chupar; pastilla para chupar comprimida; pastilla; gel, bastoncillo, inserto, polvo, disolución, suspensión, emulsión dentales, etc.; pasta de dientes; crema; gel; pomada; pasta, espuma, aerosol, disolución, suspensión, polvo, líquido, disolución cutáneos concentrado para disolución, suspensión, emulsión, bastoncillo, esponja cutáneos, etc.; tirita; champú; disolución para iontoforesis ; parche transdérmico ; cataplasma; disolución, suspensión, emulsión para baño por inmersión, concentrado para disolución, suspensión, emulsión para baño por inmersión; disolución, suspensión, emulsión para derrame ( "pour-on" ) ; disolución para aplicación en la piel ( "spot -on" ) ; suspensión para aplicación en la piel; emulsión para aplicación en la piel; disolución para baño por inmersión de tetilla; suspensión para baño por inmersión de tetilla; emulsión para baño por inmersión de tetilla; disolución de aerosol para tetilla; crema ocular; gel ocular; pomada ocular; colirios (disolución, suspensión, polvo y disolvente para disolución, polvo y disolvente para suspensión, disolvente para reconstitución, loción, disolvente para reconstituir una loción, etc.); inserto oftálmico; crema para los oídos,- gel para los oídos; pomada para los oídos; gotas para los oídos (disolución, suspensión, emulsión, polvo, etc.); aerosol para los oídos (disolución, suspensión, etc.); irrigación para los oídos (disolución, emulsión, etc.) ; tampón para los oídos; bastoncillo para los oídos; crema nasal; gel nasal; pomada nasal; gotas nasales (disolución, suspensión, emulsión, etc.); polvo nasal; aerosol nasal (disolución, suspensión, emulsión, etc.); irrigación nasal, bastoncillo, nasal; crema vaginal; gel vaginal; pomada vaginal; espuma vaginal; disolución vaginal; suspensión vaginal; emulsión vaginal; comprimido para disolución vaginal; cápsula dura o blanda vaginal; comprimido vaginal; comprimido efervescente vaginal; sistema de administración vaginal; crema rectal; gel rectal; pomada rectal; espuma rectal; disolución rectal; suspensión rectal; emulsión rectal; concentrado para disolución rectal; polvo para disolución rectal; polvo para suspensión rectal; comprimido para suspensión rectal; supositorio; cápsula rectal; disolución para tampón-nebulizador rectal; suspensión nebulizadora; polvo para suspensión nebulizadora; polvo para disolución nebulizadora; emulsión nebulizadora; inhalación presurizada (disolución, suspensión, emulsión, etc.); polvo para inhalación; polvo para inhalación (cápsula dura) ; polvo para inhalación, predispensado; vapor para inhalación (polvo, cápsula, disolución, comprimido, pomada, líquido, etc.); gas para inhalación; gel para inyección; disolución para inyección; suspensión para inyección; emulsión para inyección; polvo para disolución para inyección; polvo para suspensión para inyección; polvo y disolvente para disolución para inyección; polvo y disolvente para suspensión para inyección; concentrado para disolución para inyección; disolución para infusión; emulsión para infusión; polvo para disolución para infusión; concentrado para disolución para infusión; polvo y disolvente para disolución para infusión; comprimido de implantación; disolución para diálisis peritoneal; disolución para hemofiltración; disolución para hemodiafiltración ; disolución para hemodiálisis ; concentrado para disolución para hemodiálisis; disolución para uso intravesical ; irrigación de la vejiga; polvo para irrigación vesical; gel uretral; bastoncillo uretral; instilación endotraqueopulmonar (disolución) ; instilación endotraqueopulmonar (polvo para disolución) ; instilación endotraqueopulmonar (suspensión) ; instilación endotraqueopulmonar (polvo y disolvente para disolución) ; gel endocervical ; polvo y disolvente para gel endocervical; disolución intramamaria ; suspensión intramaria; emulsión intramaria; pomada intramamaria; bastoncillo para tetilla; sistema de administración intrauterina; etc. Los vehículos y sustancias auxiliares necesarias para fabricar la forma farmacéutica deseada de administración de la composición farmacéutica de · la invención dependerán, entre otros factores, de la forma farmacéutica de administración elegida. Dichas formas farmacéuticas de administración de la composición farmacéutica se fabricarán según métodos convencionales conocidos por el experto en la materia. Puede encontrarse una revisión de diferentes métodos de administración de principios activos, excipientes a utilizar y procedimientos para producirlos en "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I, es decir, la, Ib, Ic o Id, o mezclas de los mismos en razones equimolares o no, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los siguientes compuestos: (i) clorhidrato de cloruro de 1-(3 -amino-5-carboxi-2 -oxopirrolidin-3-ilmetil ) piridinio, o (ii) clorhidrato de cloruro de 1- (l-acetil-3-amino-5-carboxi-2 -oxopirrolidin- 3 - ilmetil ) piridinio , para la fabricación de una composición farmacéutica para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto, o para la fabricación de una composición farmacéutica antitumoral, o para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una infección de origen bacteriano, fúngico o viral, o para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad autoinmunitaria . Según una realización preferida, la presente invención se refiere a dicho uso para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis de cáncer.

Según una realización preferida más, la presente invención se refiere a dicho uso para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad o estado seleccionados del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma, mastocitoma, cáncer de pulmón y cáncer renal . Según una realización preferida, la presente invención se refiere a dicho uso para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis del SIDA y enfermedades relacionadas. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de estados susceptibles de ser tratados con la composición farmacéutica proporcionada por la presente invención incluyen los mencionados anteriormente.

Pueden utilizarse los siguientes ejemplos para ilustrar la invención y no deben considerarse limitantes del alcance de la misma.

EJEMPLOS Procedimientos generales. Todos los puntos de , fusión se midieron en tubos capilares y están sin corregir. Los espectros IR se determinaron utilizando pastillas de KBr utilizando un espectrómetro Nicolet Impact 410. Los espectros de 1H-RMN se obtuvieron a de 300 a 500 MHz en un aparato VARIAN UNITY y UNITYPLUS . Se determinaron los desplazamientos químicos (d) utilizando TMS como patrón interno, y está indicada la multiplicidad (s, singlete; d, duplete; dd, duplete doble; t, triplete; q, cuartete; m, multiplete) para cada señal. Se realizaron análisis de HPLC-EM en un aparato Agilent 1100. Se utilizó una columna cromatográfica Luna C18 (150 x 4,6 mm) 5 µt? Phenomenex, con una fase móvil formada por un gradiente triple de ácido fórmico ac . al 4% (A) , agua (B) y acetonitrilo (C) . _E1 gradiente comenzó como A (2,5%) , B (93%) y C (4,5%) y, en 30 minutos alcanzó A (2,5%) , B (4,5%) y (93%) . En el detector de masas, el fragmentador funcionó a 70 eV. Se realizó el análisis elemental en un instrumento LECO CHNS-932. Todos los rendimientos corresponden a compuestos puros aislados. El ejemplo 1 se refiere a la síntesis del éster 1-tercbutí lico , éster 2-etílico del ácido (2R-4-metilen-5-oxopirrolidin- 1 , 2 -dicarboxilico) , un material de partida del procedimiento de la invención (compuesto de fórmula IV) .

El ejemplo 2 se refiere a la síntesis del compuesto de fórmula V, un material de partida del procedimiento de la invención . Los ejemplos 3 y 4 se refieren a la síntesis de bromhidrato de bromuro de (3R,5R), (3S,5S), (3R,5S) y (3S, 5R) -1- ( 3 -amino- 5 -carboxi- 2 -oxopirrolidin-3 -ilmetil ) piridinio , que son compuestos de fórmula I, utilizando una secuencia one-pot. El ejemplo 5 se refiere a la síntesis one-pot de bromhidrato de bromuro de 3S, 5S-1- (3 -amino- 5 -carboxi -2-oxopirrolidin-3-ilmetil) piridinio siguiendo una síntesis por etapas . El ejemplo 6 analiza el efecto de los diferentes isómeros de un compuesto de fórmula I sobre el crecimiento tumoral (tumor sometido a ensayo: RENCA) .

EJEMPLO 1 Síntesis de un compuesto de fórmula IV; éster 1- tercbutílico, éster 2-etílico del ácido (R) -5 (2R-4-metilen-5-oxopirrolidin- 1 , 2 -dicarboxílico) La síntesis del compuesto del título se muestra en el esquema 1. 1.1 Síntesis del compuesto 2: éster etílico del ácido 2S-5-oxopirrolidin-2 -carboxilico Se cargó un reactor de 10 L. con ácido D-glutámico 1 (1 kg, 6,80 mol) en etanol absoluto (5,0 L) , se enfrió hasta -10 °C y a través de un embudo de goteo, se añadió cloruro de tionilo (2,0 kg, 14,9 mol) lentamente durante 2 h. Después que la adición fue completa, se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h y luego se calentó hasta 80 °C durante una hora más. La disolución resultante se concentró hasta sequedad (CUIDADO: se desprenden vapores de HC1 y S02) . Se diluyó el residuo con etanol (2,5 L) y se neutralizó hasta pH = 7 con la adición de una disolución de hidróxido de potasio en etanol (10% en peso, aproximadamente 2,0 L) . Se retiró por filtración el sólido formado y se concentró la disolución para dar el éster dietílico de 1 como un sólido ceroso. Entonces se destiló el residuo a vacío (90°C, 3,1 mbar) durante 2 h y el resto se calentó adicionalmente hasta 150 °C a 5,2 mbar durante 2 h. A temperatura ambiente, el residuo solidificó. La recristalización en MTBE/hexano (2:1) dio el producto deseado 2 como un sólido pardo (960 g, 90%) . p.f. 49-51°C. 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) : 6,82 (sa, 1H) ; 4,29-4,23 (m, 1H) ; 4,21 (q, 2H, J=7,3Hz) ; 2,48-2,17 (m, 4H) ; 1,28 (t, 3H, J=7,3Hz) ppm. 1.2 Síntesis de 3: éster 1-tercbutílico, éster 2-etílico del ácido 2R- 5 -oxopirrolidin- 1 , 2 -dicarboxí lico A una disolución con agitación de piroglutamato de etilo 2 (900 g, 5,73 mol) en diclorometano (8,0 L) en un reactor, se añadieron dicarbonato de di-terc-butilo (2,5 kg, 11,5 mol) , trietilamina (800 mL, 5,73 mol) y DMAP (700 g, 5,73 mol) y se agitó la reacción durante 2 h. Se concentró hasta sequedad la disolución marrón rojiza, se diluyó con acetato de etilo (10,0 L) y se lavó con HC1 ac . 3 N (4 x 2,5 L) . Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (6 x 2,5 L) y salmuera (1,0 L) , y se secaron sobre sulfato de sodio. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad, se enfrió en hielo y se trituró con MTBE y hexano (1:1) para dar un sólido marrón (390 g) . La concentración de las aguas madre dio un aceite (600 g) que, tras cromatografía (Si02, hexano/acetato de etilo 3:1) dio un sólido incoloro (386 g) 3. Rendimiento total (776 g, 54%) . p.f. 48-49°C. 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) : 4,57 (dd, 1H, J=9,5Hz, J=3,3Hz); 4,20 (q, 2H, J=7,3Hz); 2,72-1,77 (m, 4H) ; 1,46 (s, 9H) ; 1,26 (t, 3H, J=7,3Hz) ppm . 1.3 Síntesis de 4: Mezcla de áster 1-tercbutílico, éster 2-etílico del ácido cis y trans-2R-4-dimetilamino-5-oxopirrolidin- 1 , 2 -dicarboxílico A una disolución con agitación de LiHMDS en THF (1 M, 0,24 L, 0,24 mol) a -78°C, se añadió lentamente una disolución de 3 (30 g, 0,12 mol) en THF anhidro (1,0 L) . Tras agitar durante 40 min. a -78°C, se añadió sal de Eschenmoser (45,5 g, 0,24 mol), y se continuó la agitación durante 20 min. adicionales. Se permitió que la disolución se calentara hasta temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas más. Se concentró la mezcla y el residuo se repartió entre acetato de etilo (300 mL) y agua (300 mL) . Se extrajo de nuevo la fase acuosa con acetato de etilo (2 x 300 mL) . Se lavó el extracto orgánico combinado con HC1 acuoso 1 M (3 x 150 mL) . La fase ácida se neutralizó inmediatamente con bicarbonato de sodio y se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 mL) . Se lavó la fase orgánica con agua (300 mL) , salmuera (50 mL) , se secó sobre sulfato de sodio y se concentró hasta sequedad para dar el producto deseado 4 como un aceite marrón pálido (26,9 g, 72%), que se utilizó directamente en la siguiente etapa. 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) : 4,62 (dd, 1H, J=9,4Hz, J=3,3Hz); 4,21 (q, 2H, J=7,3Hz); 4,18-4,07 (m, 1H) ; 2,57-2,20 (m, 3H) ; 2,22 (s, 3H) ; 2,17 (s, 3H) ; 1,47 (s, 9H) ; 1,24 (t, 3H, J=7,3Hz) ppm. 1.4 Síntesis de (R)-5: áster 1-tercbutílico, áster 2-etílico del ácido 2R-4 -metilen-5-oxopirrolidin- 1 , 2 -dicarboxílico Se cargó un autoclave (4 L) con una disolución de 4 (244,9 g, 0,74 mol) en eOH (2,5 L) y yodometano (138,2 mL, 2,22 mol) . Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 48 h. Se eliminó el disolvente y el residuo se repartió entre acetato de etilo (2 L) y NaHC03 al 10% (1 L) . Se extrajo de nuevo la fase acuosa con acetato de etilo (3 x 500 mL) . Se secaron las fases orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (hexano/acetato de etilo 4:1 > acetato de etilo) para obtener (R) -5 como un aceite incoloro (55,1 g, 27%) . 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) : 6,23 (t, 1H, J=2,7Hz); 5,51 (t, 1H, J=2,2Hz); 4,61 (dd, 1H, J=10,3Hz, J=3,3Hz); 4,22 (q, 2H, J=7,lHz); 3,17-3,05 (m, 1H) ; 2,75-2,64 (m, 1H) ; 1,47 (s, 9H) ; 1,23 (t, 3H, J=7,lHz) ppm.

EJEMPLO 2 Síntesis de un compuesto de fórmula IV: (éster 1-tercbutílico, áster 2-etílico del ácido (R) -5 2R-4-metilen-5- oxopirrolidin- 1 , 2 -dicarboxílico) La síntesis del compuesto del título se muestra en el esquema 4 a continuación e incluye las tres variantes para la síntesis del compuesto de fórmula 5 dado a conocer en la descripción .

Esquema 4 4' 2.1 Síntesis de ácido (2R) -piroglutámico (2') : Método descrito en Lennox, J. R.; Turner, S. C. Rapoport, H. J". Org. Chem. 2001, 66, 7078-7083 Se calentó a reflujo ácido D-glutámico (1¡ (100 g, 679,7 mmol) en agua (400 mL) mientras se agitaba durante 72 horas. Se hizo pasar la disolución transparente resultante a través de una columna de resina Dowex 50wX8 (resina de intercambio iónico en forma ácida, 135 g) y se lavó con agua hasta que el eluato dejó de ser ácido. Se concentraron los eluatos acuosos combinados a 50 °C hasta que se habían recogido 300 mL de destilado. Se añadió metanol (500 mL) para ayudar a la eliminación del agua restante y para evitar la aglutinización del sólido. Se secó el sólido resultante a vacío para proporcionar el compuesto 2' como un sólido blanco (74,63 g, 85%) . p.f. 157°C, [?] 22 +10,5° (c 2,0, H20) , 2.2 Síntesis de (21?) -piroglutamato de etilo (2) : A una suspensión con agitación de ácido (21?) -piroglutámico 2' (1 equiv., 2,017 g, 15,62 mmol) en EtOH (2 mL/mmol, 8 mL) , se añadió SOCl2 (0,1' equiv., 115 DL, 1,56 mmol) . Se agitó la disolución resultante a temperatura ambiente durante 16 horas. Se neutralizó la mezcla de reacción con HC03Na 1 M acuoso. Se concentró el disolvente a vacío y se extrajo el residuo con AcOEt (3 x 25 mL) . Se secó la fase orgánica sobre Na2S04 anhidro y se concentró a vacío. El compuesto 2 se obtuvo como un sólido incoloro que se usó en la etapa siguiente sin purificación adicional (79%) . 2.3 Síntesis de (21?) -N- ( terc-butoxicarbonil ) piroglutamato de etilo (3) : A una disolución con agitación, fría (5-10°C) del éster 2 (1 equiv, 78,6 g, 0,50 mol) y -dimetilaminopiridina (DMAP) (0,1 equiv., 6,10 g, 50 mmol) en MeCN (0,3 mL/mmol, 180 mL) , se añadió dicarbonato de t-butilo (Boc)20 (1,2 equiv., 131 g, 0,60 mol) en porciones (30 minutos) . Se agitó la disolución roja resultante a temperatura ambiente durante 3 horas. Entonces se concentró la mezcla a vacío y se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida (EtOAc : CH2C12 , 1:4) para proporcionar 3 como un sólido amarillento (95%) . p.f. 48-49°C. 2.4 Síntesis de enaminona (4') : Método descrito en Dieterich, P.; Young, D. W. Org . Bíomol . Chem. 2006, 4, 1492-1496 A una disolución de piroglutamato 3 (1 equiv., 83,1 g, 0,32 mol) en 1 , 2 -dimethoxietano (2,3 mL/mmol, 736 mL) , se añadió cBuOCH (NMe2) 2 (Reactivo de Bredereck, 1,5 equiv. , 100 mL, 0,48 mol) y se calentó la mezcla resultante a 85°C durante 15 horas. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se evaporó a vacío. Se trituró el aceite bruto resultante en la cantidad mínima de MTBE y se filtró el sólido resultante. El compuesto 4' se obtuvo como un sólido naranja (59,48 g, 59%) . Se concentraron a vacío los líquidos de la disolución madre de nuevo y recristalizaciones sucesivas aumentan el rendimiento total hasta el 84 % (84,26 g) . 2.5 Síntesis de alqueno (5) : Método descrito en el documento WO 2004039314. A una disolución de 4' (59,48 g, 0,19 mol) en THF (1,56 mL/mmol, 300 mL) , se añadió HCL 1 M acuoso (1,1 equiv., 210 mL) . Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas. Se separaron las fases acuosa y orgánica, se desechó la fase acuosa y se añadieron K2C03 (1,4 equiv., 37 g, 0,27 mol") y HCHO acuoso (37%) (1 mL/mmol, 190 mL) a la fase orgánica. Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se separaron las dos fases y se recogió la fase orgánica y se concentró a vacío. Se disolvió el producto bruto resultante en (MTBE) metil cbutiléter (400 mL) , se lavó con agua (200 mL) , Na2S03 (acuoso al 20%, 200 mL) y agua (200 mL) . Se secó la fase orgánica sobre Na2S0 anhidro, se filtró y se evaporó a vacío. El compuesto 5 se obtuvo tras purificación mediante una cromatografía ultrarrápida corta como un aceite incoloro (20,8 g, 40 %) .

!H-NMR (CDC13; 300 MHz) : 6,23 (t, 1H, J=2,7Hz); 5,51 (t, 1H, J=2,2Hz); 4,61 (dd, 1H, J=10,3Hz, J=3,3Hz); 4,22 (q, 2H, J=7,lHz); 3,17-3,05 (m, 1H) ; 2,75-2,64 (m, 1H) ; 1,47 (s, 9H) ; 1,23 (t, 3H, J=7,lHz) ppm.

EJEMPLO 3 Síntesis de un compuesto de fórmula V; N- Tosi1iminobencilyodinano La síntesis del compuesto del título se muestra en el esquema 5. Esquema 5 Se agitaron p-toluensulfonamida (5,13 g) , hidróxido de potasio (4,20 g) y metanol (120 mL) en un matraz cónico en un baño de hielo, garantizando que la mezcla de reacción estaba a menos de 10°C. Se añadió diacetato de yodobenceno (9,60 g) a la mezcla con agitación y la disolución de color amarillo resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas. La mezcla de reacción se vertió en un gran exceso de agua helada y se agitó durante 1 hora. Precipitó un sólido de color amarillo en reposo durante la noche. El sólido amarillo claro se aisló mediante filtración y se secó con un flujo de aire a través del embudo Buchner. Se utilizaron varias porciones de éter, en donde el producto es insoluble para eliminar mediante lavado cualquier cantidad de yodobenceno presente. Se disolvió el sólido amarillo en la mínima cantidad posible de metanol en ebullición. Se puso la disolución en una nevera durante la noche, con lo cual se recuperó un sólido blanquecino a través de filtración. (5,1 g, 46%) . 3.2 Síntesis de un compuesto de fórmula V: N-tosiliminobencilyodinano Se añadió KOH (2,5 equiv, 393 g, 7,00 mol) a una disolución de p-toluenosulfonamida (1 equiv., 480 g, 2,80 mol) en MeOH (11 L) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente hasta que se completó la disolución. Se enfrió la mezcla hasta 0°C y se añadió diacetato de yodobenceno (1 equiv., 903 g, 2,80 mol) y se agitó a 0°C durante 40 minutos. Se calentó lentamente la reacción hasta 22 °C y se agitó durante la noche. Se filtró el sólido formado, se lavó con Et20 (250 mL) y se secó a vacío a temperatura ambiente (285 g) . Se obtuvieron fracciones adicionales cuando los líquidos de la disolución madre se enfriaron hasta 0°C y se añadió lentamente una mezcla de H20/hielo (5 L) . Se almacenó la mezcla resultante a 5°C durante la noche. Entonces, se filtró el precipitado, se lavó con Et20 (250 mL) y se secó a vacío a temperatura ambiente (479 g, rendimiento combinado del 73%) .

EJEMPLO 4 Síntesis de brom idrato de bromuro de (3R, 5R-1- (3 -amino-5-carboxi-2 -oxopirrolidin- 3 -ilmetil) piridinio) 9c y bromhidrato de bromuro de (3S, 5R- 1- (3 -amino- 5 -carboxi-2 -oxopirrolidin- 3 - ilmetil) piridinio) 9d La síntesis de los compuestos del título (9c y 9d) se muestra en el esquema 6.

Esquema 6 (R)-5 PhI=NTs c 4.1.1 Síntesis de éster 5- tercbutílico, áster 6-etílico del ácido 3R, 6R-4 -oxo- 1 - (4 - toluenosulfonil ) -l,5-diazaespiro[2,4] -heptano-5 , 6-dicarboxílico 7c y éster 5-tercbutílico, éster 6-etílico del ácido 3S , 6R-4 -oxo- 1 - (4 -toluenosulfonil )- 1 , 5 -diazaespiro [2,4] heptano-5 , 6-dicarboxílico 7d A una disolución fría (0°C, baño de agua con hielo) de (R)-5 (3,02 g, 11,21 mmol) en acetonitrilo anhidro (12 mL) , se añadió PhI=NTs (véase el ejemplo 2) (6,27 g, 16,8 mmol) en una porción seguido por Cu(acac) 2 (293 mg, 1,12 mmol) . Se agitó la mezcla heterogénea resultante a 0°C durante 15 minutos, y se permitió que se calentara hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. A la mezcla resultante, se añadió NaOH 1 M (50 mL) , y se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x 25 mL) . Entonces se lavaron las fases orgánicas con salmuera (25 mL) , se secaron sobre Na2S04 anhidro y se evaporaron hasta sequedad. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía ultrarrápida (Si02, hexanos/EtOAc : 2/1) para producir la aziridina 7c (730 mg) y 7d (287 mg) como sólidos blancos (rendimiento combinado: 23%) . 7c: P. f . : 94-95°C [a]D25°c= +42° (0,032, CHC13) IR (KBr, cm"1) : 2977, 2928, 1808, 1746, 1352, 1298, 1251, 1192, 1161, 988,690. 1H-RMN (CDCI3, 500 MHz) (7c): 7,82 (d, 2H, J=7,3Hz); 7,31 (d, 2H, J=7,7Hz); 4,74 (dd, 1H, J=9,7Hz, J=2,02Hz); 4,25-4,22 (m, 2H) ; 3,28 (dd, 1H, J=14,4Hz, J=9,7Hz); 2,78 (s, 1H) ; 2,57 (s, 1H) ; 2,53 (dd, 1H, J=14,4Hz, J=2,02Hz); 2,42 (s, 3H) ; 1,49 (s, 9H) ; 1,29 (t, 3H, J=7,0Hz) ppm. 13C (CDCI3, 125 MHz) (7c) : 170,5, 166,9, 148,7, 145,1, 135,2, 129,6, 127,9, 84,5, 62,0, 55,5, 47,1, 38,3, 27,7, 25, 3, 21,5, 14, 0 ppm EM (ESI+) : m/z: 339 (M+l-Boc) 7d: P.f . : 55-56°C [a]D25°c= +11° (0,036, CHCI3) IR (KBr, cm"1) : 2981, 2936, 1799, 1749, 1371, 1330, 1253, 1203, 1156, 1094, 989, 687. 1H-R N (CDCI3, 500 Hz) (7d) : 7,79 (d, 2H, J=8,0Hz) ; 7,30 (d, 2H, J=7,7Hz) ; 4,70 (dd, 1H, J=9,4Hz, J=4,3Hz) ; 4,30- 4,22 (m, 2H) ; 3,06 (dd, 1H, J=15,lHz, J=4,3Hz) ; 2,92 (dd, 1H, J=15,4Hz, J=9,4Hz) ; 2,82 (s, 1H) ; 2,63 (s, 1H) ; 2,41 (s, 3H) ; 1,49 (s, 9H) ; 1,28 (t, 3H, J=7,0Hz) ppm. 13C (CDCI-3, 125 MHz) (7d) : 169,5, 167,1, 148,9, 145,0, 135,7, 129,6, 127,9, 84,5, 62,1, 56,1, 47,0, 37,1, 27,8, 24,5, 21,6, 14 , 0 ppm. EM (ESI+) : m/z: 339 (M+l-Boc) 4.1.2 Síntesis de éster 5-tercbutílico, éster 6-etílico del ácido 3S, 6R-4-OXO-1- (4 -toluenosulfonil) -1,5-diazaespiro [2 , 4] heptano-5 , 6 -dicarboxí lico 7d con tratamiento mej orado A una disolución fría (0°C, baño de hielo-agua) de (R) -5 (1,84 g, 6,82 mmol) en acetonitrilo anhidro (7 mL) se añadió PhI=NTs (3,82 g, 10,2 mmol) en una porción, seguido de Cu(acac)2 (178 mg, 0,682 mmol) . Se agitó la mezcla resultante a 0°C durante 15 minutos, entonces se permitió que se calentara hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla resultante se evaporó a vacío. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía ultrarrápida (Si02, CH2Cl2/EtOAc : 9/1) para producir una mezcla de aziridinas libre de impureza de p-TsNH2 (determinado mediante HPLC-EM) . La mezcla se sometió de nuevo a cromatografía (Si02, hexano/EtOAc : 2/1) hasta que se obtuvo cis-aziridina 7d como una espuma blanca pura. (8%) . 4.2.1 Síntesis one-pot de bromhidrato de bromuro de 3R,5R-1- ( 3 -amino- 5 -carboxi-2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio 9c Se irradió una mezcla de la aziridina 7c (200 mg, 0,46 mmol), montmorillonita MK10 (20% en peso, 40 mg) y piridina (37 µ???, 0,46 mmol) con microondas (300 W) a 100°C, y durante 10 minutos. Se diluyó la mezcla bruta con acetato de etilo [EtOAc] (10 mL) , se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis de HPLC no mostró piridina restante. Se utilizó la betaína 8c en la siguiente etapa sin purificación adicional (pureza del 93% mediante HPLC) . Se disolvió el aceite marrón bruto en HBr acuoso al 48% (20 mL) y se calentó a reflujo durante 18 horas. Se diluyó la mezcla con agua y se lavó con EtOAc (3 x 10 mL) , se evaporó la fase acuosa hasta sequedad. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía empleando polvo de celulosa : Si02 : polvo de celulosa: carbón activado, (1 cm:0,5 cm:0,5 cm:2 cm) como fase estacionaria, produciendo 9c como un sólido (51 mg, 28%) . P.f.: > 200°C. [a]D25°C= +40° (0,041, CH3OH) IR (KBr, cm"1) : 3434, 3051, 1725, 1633, 1488, 1420, 1384, 1280, 1188, 1145, 1083, 683. """H-R (D20, 500 MHz) 8,82 (d, 2H, J=5,3Hz); 8,59 (t, 1H, J=7,8Hz); 8,09 (t, 2H, J=6,8Hz); 5,21 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,93 (d, 1H, J=14,3Hz) ; 4,24 (t, 1H, J=9,2Hz) ; 3,01 (dd, 1H, J=13,9Hz, J=9,3Hz) ; 2,11 (t, 1H, J=7,8Hz) ppm. 13C (D20, 125 MHz) : 173,2, 173,1, 147,1, 145,6, 128,6, 64,4, 64,2, 49,3, 33,0 ppm. EM (ESI+) : m/z: 236 (M+l-2Br) . 4.2.2 Síntesis one-pot de bromhidrato de bromuro de 3S,5R-1-( 3 - amino- 5 - carboxi - 2 -oxopirrol idin- 3 - i lmet i 1 ) piridinio 9d Se irradió una mezcla de la aziridina 7d (200 mg, 0,46 mmol) , montmorillonita MK10 (20% en peso, 40 mg) y piridina (37 ^iL, 0,46 mmol) con microondas (300 ) a 100°C, y durante 10 minutos. Se diluyó la mezcla bruta con EtOAc (10 mL) , se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis de HPLC no mostró piridina restante. Se utilizó la betaína 8d en la siguiente etapa sin purificación adicional (pureza del 93% mediante HPLC) . Se disolvió el aceite marrón bruto en HBr acuoso al 48% (20 mL) y se calentó a reflujo durante 18 horas. Se diluyó la mezcla con agua y se lavó con EtOAc (3 x 10 mL) , se evaporó la fase acuosa hasta sequedad. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía empleando polvo de celulosa : Si02 : polvo de celulosa: carbón activado, ( lcm : 0 , 5cm : 0 , 5cm : 2cm) como fase estacionaria, produciendo 9d como un sólido (52 mg, 28%) . P.f.> 200°C. [a]D25°c= +40° (0,038, CH3OH) IR (KBr, cm"1) : 3435, 3051, 1721, 1631, 1509, 1475, 1422, 1384, 1280, 1190, 1144, 683. ^-RMN (D20, 500 MHz) 8,76 (d, 2H, J=5,3Hz) ; 8,59 (t, 1H, J=7,8Hz) ; 8,07 (t, 2H, J=6,8Hz) ; 5,19 (d, 1H, J=14,3Hz) ; 4,78 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,33 (t, 1H, J=9,2Hz); 2,90 (dd, 1H, J=13,9Hz, J=9,3Hz); 2,46 (t, 1H, J=7,8Hz) ppm. 13C (D20, 125 MHz) : 173,3, 172,4, 147,0, 145,1, 128,5, 65,6, 64,7, 49,3, 33,9 ppm. EM (ESI+) : m/z: 236 (M+l-2Br). 4.2.3 Síntesis one-pot de bromhidrato de bromuro de 3S,5R-1-( 3 -amino-5 -carboxi -2 -oxopirrolidin- 3 - ilmetil ) iridinio 9d con cristalización mejorada Se calentó una mezcla de aziridina 7d (100 mg, 0,23 mraol) , montmorillonita MK10 (20% en peso, 20 mg) y piridina (18 QL, 0,23 mmol) a 90°C durante 3 horas. Se diluyó la mezcla bruta con EtOAc (3 mL) , se filtró y se evaporó a vacío. Se trituró el residuo en Et20, se filtró y se obtuvo la betaína 8d como un sólido marrón. Se disolvió este compuesto en HBr al 48% acuoso (10 mL) y se calentó a reflujo durante 18-72 horas. Se monitorizó la reacción mediante análisis de HPLC-EM. Se trituró el aceite bruto con acetona para producir un sólido marrón. Se disolvió este sólido en la cantidad mínima de MeOH (1 mL) y se añadieron Et20 o acetona hasta que se observó precipitación. Entonces se filtró el sólido y se secó a vacío (CUIDADO: el producto es altamente higroscópico) . Se repitió el proceso dos veces y se determinó la pureza del producto mediante análisis de HPLC (rendimiento del 80%) .

EJEMPLO 5 Síntesis de (bromhidrato de bromuro de 3S, 5S-1- (3 -amino-5- carboxi- 2 -oxopirrolidin-- 3 -ilmetil) piridinio) 9a y (bromhidrato de bromuro de 3R, 5S-1- (3-amino-5-carboxi-2- oxopirrolidin-3 - ilmetil) piridinio) 9b La síntesis de los compuestos del título (9a y 9b) s muestra en el esquema 7.

Esquema 7 9b 5.1 Síntesis del éster 5- tercbutílico, éster 6 -etílico del ácido 3S , 6S-4-OXO-1- (4 - toluenosulfonil ) -1,5-diazaespiro [2 , 4] -heptano-5 , 6-dicarboxílico 7a y éster 5-tercbutílico , éster 6-etílico del ácido 3R, 6S-4 -oxo- 1 - (4 -toluenosulfonil ) -1, 5-diazaespiro [2 , 4] heptano-5 , 6 -dicarboxílico 7b A una disolución fría (0°C, baño de agua con hielo) de (S) -5 (1,84 g, 6,82 mmol) en acetonitrilo anhidro (7 mL) , se añadió PhI=NTs (véase el ejemplo 2) (3,82 g, 10,2 mmol) en una porción seguido por Cu(acac)2 (178 mg, 0,682 mmol) . Se agitó la mezcla heterogénea resultante a 0°C durante 15 minutos, y se permitió que se calentara hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. A la mezcla resultante, se añadió NaOH 1 M (20 mL) , y se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x 25 mL) . Entonces se lavaron las fases orgánicas con salmuera (25 mL) , se secaron sobre Na2S04 anhidro y se evaporaron hasta sequedad. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía ultrarrápida (Si02, hexanos/EtOAc : 2/1) para producir la aziridina 7a (641 mg) y 7b (478 mg) como sólidos blancos (rendimiento combinado: 37%) . 7a: P. f . : 95-96°C [0t]D25°c= -57° (0,029, CHC13) IR (KBr, cnf1) : 2977, 2928, 1808, 1746, 1352, 1298, 1251, 1192, 1161, 988,690. 1H-RMN (CDCI3, 500 MHz) (7a) : 7,77 (d, 2H, J=7,3Hz); 7,27 (d, 2H, J=7,7Hz); 4,70 (dd, 1H, J=9,7Hz, J=2,02Hz); 4,21-4,17 (m, 2H) ; 3,22 (dd, 1H, J=14,4Hz, J=9,7Hz); 2,75 (s, 1H) ; 2,51 (s, 1H) ; 2,49 (dd, 1H, J=14,4Hz, J=2,02Hz); 2,37 (s, 3H) ; 1,45 (s, 9H) ; 1,27 (t, 3H, J=7,0Hz) ppm.

"C (CDCI3, 125 MHz) (7a): 170,5, 166,9, 148,7, 145,1, 135,2, 129,6, 127,9, 84,5, 62,0, 55,5, 47,1, 38,3, 27,7, 25,3, 21,5, 14, 0 ppm EM (ESI+) : m/z: 339 (M+l-Boc) 7b: P. f . : 57-58°C [a]D25°C= -13° (0,068, CHCI3) IR (KBr, cm"1) : 2982, 2936, 1799, 1749, 1371, 1330, 1252, 1203, 1154, 1093, 989, 687. 1H-RMN (CDCI3, 500 MHz) (7b): 7,78 (d, 2H, J=8,0Hz); 7,29 (d, 2H, J=7,7Hz); 4,70 (dd, 1H, J=9,4Hz, J=4,3Hz); 4,29-4,20 (m, 2H) ; 3,04 (dd, 1H, J=15,lHz, J=4,3Hz); 2,91 (dd, 1H, J=15,4Hz, J=9,4Hz); 2,82 (s, 1H) ; 2,63 (s, 1H) ; 2,40 (s, 3H) ; 1,48 (s, 9H) ; 1,29 (t, 3H, J=7,0Hz) ppm. 13C (CDCI3, 125 MHz) (7b): 169,5, 167,1, 148,9, 145,0, 135,7, 129,6, 127,9, 84,5, 62,1, 56,1, 47,0, 37,1, 27,8, 24,5, 21,6, 14 , 0 ppm. EM (ESI+) : m/z: 339 (M+l-Boc) 5.2.1 Síntesis one-pot de bromhidrato de bromuro de 3S,5S-1- (3 -amino- 5 -carboxi -2 -oxopirrol idin-3 -ilmetil ) piridinio 9a Se irradió una mezcla de aziridina 7a (311 mg, 0,71 mmol) , montmorillonita MK10 (20% en peso, 60 mg) y piridina (58 nL, 0,71 mmol) con microondas (300 W) a 100°C, y durante 10 minutos. Se diluyó la mezcla bruta con EtOAc (10 mL) , se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis de HPLC no mostró piridina restante. Se utilizó la betaína 8a en la siguiente etapa sin purificación adicional (pureza del 93% mediante HPLC) .

Se disolvió el aceite marrón bruto en HBr acuoso al 48% (30 mL) y se calentó a reflujo durante 18 horas. Se diluyó la mezcla con agua y se lavó con EtOAc (3 x 10 mL) , se evaporó la fase acuosa hasta sequedad. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía empleando polvo de celulosa: Si02: polvo de celulosa: carbón activado, ( lcm : 0 , 5cm : 0 , 5cm : 2cm) como fase estacionaria, produciendo 9a como un sólido (110 mg, 40%) . P. f . : > 200°C [ ]D25°c= -49° (0,069, CH3OH) IR (KBr, cm"1) : 3433, 3051, 1724, 1633, 1488, 1420, 1384, 1281, 1188, 1144, 1083, 683. """H-RMN (D20, 500 MHz) 8,82 (d, 2H, J=5,3Hz); 8,59 (t, 1H, J=7,8Hz); 8,08 (t, 2H, J=6,8Hz); 5,23 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,97 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,28 (t, 1H, J=9,2Hz); 3,06 (dd, 1H, J=13,9Hz, J=9,3Hz); 2,13 (t, 1H, J=7,8Hz) ppm. 13C (D20, 125 MHz): 173,1, 172,6, 147,2, 145,6, 128,6, 63,9, 63,7, 49,2, 32,7 ppm. EM (ESI+) : m/z: 236 (M+l-2Br) 5.2.2 Síntesis one-pot de bromhidrato de bromuro de 3R,5S-1- (3 -amino- 5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio 9b Se irradió una mezcla de aziridina 7b (200 mg, 0,46 mmol) , montmorillonita MK10 (20% en peso, 40 mg) y piridina (37 ^iL, 0,46 mmol) con microondas (300 W) a 100°C, y durante 10 minutos. Se diluyó la mezcla bruta con EtOAc (10 mL) , se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis de HPLC no mostró piridina restante. Se utilizó la betaína 8b en la siguiente etapa sin purificación adicional (pureza del 93% mediante HPLC) . Se disolvió el aceite marrón bruto en HBr acuoso al 48% (20 mL) y se calentó a reflujo durante 18 horas. Se diluyó la mezcla con agua y se lavó con EtOAc (2 x 10 mL) , se evaporó la fase acuosa hasta sequedad. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía empleando polvo de celulosa: Si02: polvo de celulosa: carbón activado, ( lcm : 0 , 5cm : 0 , 5cm: 2cm) como fase estacionaria, produciendo 9b como un sólido (44 mg, 24%) . P . f . > 200°C. [0t]D25°c= -09° (0,12, CH3OH) IR (KBr, crcf1) : 3435, 3049, 1724, 1631, 1513, 1475, 1420, 1384, 1280, 1190, 1144, 683. XH-RMN (D20, 500 MHz) 8,82 (d, 2H, J=5,3Hz); 8,59 (t, 1H, J=7,8Hz); 8,08 (t, 2H, J=6,8Hz); 5,23 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,97 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,28 (t, 1H, J=9,2Hz); 3,06 (dd, 1H, J=13,9Hz, J=9,3Hz); 2,13 (t, 1H, J=7,8Hz) ppm. 13C (D20, 125 MHz) : 173,4, 172,4, 147,0, 145,0, 128,5, 65,7, 64,8, 49,3, 33,9 ppm. EM (ESI+) : m/z: 236 (M+l-2Br) EJEMPLO 6 Síntesis por etapas de bromhidrato de bromuro de 3S,5S-l-(3- amino- 5-carboxi-2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio 6.1 Síntesis de betaína 8a Siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5, se irradió una mezcla de aziridina 7a (311 mg, 0,71 mmol) , montmorillonita MK10 (20% en peso, 60 mg) y piridina (58 µ??, 0,71 mmol) con microondas (300 W) a 100°C, y durante 10 minutos. Se diluyó la mezcla bruta con EtOAc (10 mL) , se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis de HPLC no mostró piridina restante. Se purificó la betaína 8a mediante tratamiento con dietil éter, aislándose el producto como un sólido blanco. P. f . : 127-128°C IR (KBr, cm"1) : 3434, 2980, 1786, 1746, 1489, 1370, 1311, 1287, 1199, 1153, 1121, 555. 1H-RMN (CDC13, 300 MHz) : 9,2 (d, 2H, J=5,6Hz); 8,3 (t, 1H, J=7,7Hz); 7,89 (t, 2H, J=6,9Hz); 7,69 (d, 2H, J=8,0Hz); 7,10 (d, 2H, J=8,0Hz); 5,07 (d, 1H, J=13,0Hz); 4,89 (d, 1H, J=12,6Hz); 4,27 (t, 2H, J=7,lHz); 4,20-4,13 (m, 2H) ; 2,81 (dd, 1H, J=12,8Hz, J=7,lHz); 2,31 (s, 3H) ; 2,04-1,98 (m, 1H) ; 1,38 (s, 9H) ; 1,25 (t, 3H, J=7,lHz) ppm. EM (ESI+) : m/z: 518 (M+l) . Alternativamente, se obtuvo la betaína 8a calentando la misma mezcla de reacción (aziridina 7a (311 mg, 0,71 mmol), montmorillonita MK10 (20% en peso, 60 mg) y piridina (58 µ??. , 0,71 mmol)) a 90 °C durante 7 horas. Se diluyó la mezcla bruta con EtOAc (10 mL) , se filtró y se evaporó a vacío hasta que el análisis de HPLC no mostró piridina restante. El rendimiento obtenido fue similar al rendimiento obtenido utilizando microondas. 6.2 Síntesis de bromhidrato de bromuro de 3S , 5S- 1 - (3 -amino- 5-carboxi -2 -oxopirrolidin- 3 - ilmetil ) piridinio 9a Se disolvió la betaína pura 8a obtenida en la etapa anterior en HBr acuoso al 48% (30 mL) y se calentó a reflujo durante 18 horas. Se diluyó la mezcla con agua y se lavó con EtOAc (3 x 10 mL) , la fase acuosa se evaporó hasta sequedad. Se purificó el aceite bruto mediante cromatografía empleando polvo de celulosa: Si02: polvo de celulosa: carbón activado, ( lcm : 0 , 5cm : 0 , 5cm : 2cm) como fase estacionaria, produciendo 9a como un sólido (110 mg, 40%) . P.f.: > 200°C. [a]D25°c= -49° (0,069, CH3OH) IR (KBr , cm"1) : 3433, 3051, 1724, 1633, 1488, 1420, 1384, 1281, 1188, 1144, 1083, 683. """H-RMN (D20, 500 MHz) 8,82 (d, 2H, J=5,3Hz); 8,59 (t, 1H, J=7,8Hz); 8,08 (t, 2H, J=6,8Hz); 5,23 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,97 (d, 1H, J=14,3Hz); 4,28 (t, 1H, J=9,2Hz); 3,06 (dd, 1H, J=13,9Hz, J=9,3Hz); 2,13 (t, 1H, J=7,8Hz) ppm. 13C (D20, 125 MHz) : 173,1, 172,6, 147,2, 145,6, 128,6, 63,9, 63,7, 49,2, 32,7 ppm. EM (ESI+) : m/z: 236 (M+l-2Br) .

EJEMPLO 7 Efectos de los diferentes isómeros (9a, 9b, 9c y 9d) sobre el crecimiento tumoral . Tumor sometido a ensayo: Renca Este ensayo se realizó con el fin de comprobar el efecto de cada estereoisómero sobre el crecimiento tumoral in vivo en ratones expuestos a células de Renca. Su efecto se comparó con placebo. Los estereoisómeros sometidos a ensayo fueron: Isómero 1: bromhidrato de bromuro de 3R, 5S-1- (3-amino-5-carboxi -2 -oxopirrolidin-3 -ilmetil) piridinio (9b) Isómero 2: bromhidrato de bromuro de 3R, 5R-1- (3-amino-5-carboxi -2 -oxopirrolidin-3 -ilmetil)piridinio (9c) Isómero 3 : bromhidrato de bromuro de 3S , 5S- 1 - ( 3 -amino- 5-carboxi -2 -oxopirrolidin-3 -ilmetil ) piridinio (9a) Isómero 4 : bromhidrato de bromuro de 3S , 5R- 1 - ( 3 -amino-5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) iridinio ( 9d) Pueden obtenerse estos isómeros según el procedimiento descrito en los ejemplos 4, 5 y 6.

MATERIALES y MÉTODOS Tumor Renca es un carcinoma de células renales originado en la cepa de ratón Balb/c, y por tanto, singénico en ratones con fondo genético Balb/c [Melder RJ et al., Cáncer Immunol . Immunother., 2005, 54:535-547; Felluga B et al., 1969, J. Nati. Cáncer Inst . 43:319-333] . Renca se considera un tumor inmunogénico moderado y se utiliza como un modelo adecuado para probar los enfoques de inmunointervención [Salup RR, et al., 1992, The Journal of Urology, 147:1120-1123] . Se mantuvieron células de Renca (CLS, Eppelheim, Alemania) in vitro mediante pases en serie cada 3-4 días. Los cultivos se realizaron con medio RPMI (RPMI, 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, gentamicina 80 µg/mL,· todos ellos se adquirieron a Sigma, St . Louis, MO, USA) sembrando 5 x 106 células en matraces de cultivo de 75 era2. Se utilizaron las células recogidas de cultivos de 48 horas con tripsinización (Sigma, St . Louis, MO, USA) como fuente de células de Renca para los estudios descritos a continuación.

Fármacos en estudio Principio activo Isómero 1 (9b) a 2,815 mg/mL en solución salina fisiológica estéril. Isómero 2 (9c) a 2,520 mg/mL en solución salina fisiológica estéril. Isómero 3 (9a) a 2,080 mg/mL en solución salina fisiológica estéril . Isómero 4 (9d) a 3,040 mg/mL en solución salina fisiológica estéril . Placebo Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, España) Ratones Animal Balb/c AnNHsd Justificación de la selección Cepa de ratón consanguíneo singénico con Renca Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales del estudio aproximadamente 181 machos Edad al inicio del 8-10 semanas de edad Peso tratamiento 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Tamaño de la muestra Según los datos anteriores, el tamaño de la muestra necesario para alcanzar significación era de 26 animales por grupo. Este tamaño de la muestra se calculó utilizando el software Epi-info v6 , 0 [Fleiss. Statistical Methods for rates and Proportions. 2a Ed, Wiley, 1981: 38-45] y se estimó para un poder estadístico de 0,8, con un nivel de confianza de 0,95 para una disminución de dos veces en la superficie del tumor y una razón control-caso de 1-1.

Equipo Campana de inundación laminar, baño, microscopio invertido, cámara de recuento, incubador de C02, centrífuga, calibre, balanzas,1 pipetas ajustables, recipiente con nitrógeno, nevera / congelador y bandejas con ratones inmunodeficientes .

Reactivos Azul trípano (Sigma, St . Louis, MO, USA) PBS estéril (Sigma, St . Louis, MO, USA) Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, España) Dosis, vehículo, vía y volumen de administración Dosis Se probó cada isómero a los niveles de dosis de 260 ng administrados en los días 6, 7 y 14 tras la inoculación tumoral .

Vehículo El vehículo en donde se diluyeron los isómeros fue solución salina fisiológica.

Vía y volumen de administración Se administraron los tratamientos por vía intraperitoneal (i.p.) . El volumen inoculado fue de 0,2 mL/animal. Se eligió esta vía porque es la descrita en el método original [Pérez S, et al., 2003, Clinical Cáncer Research. 9:5776-5785] .

Diseño del estudio Los tumores se establecieron mediante inoculación subcutánea en el flanco de la pata derecha. Se inocularon los ratones (Balb/c) con 0,2 mL que contenían 105 células de Renca viables. El día de la inoculación subcutánea se considerará el día 0 de la prueba. Los ratones Balb/c inoculados con células de Renca distribuyeron en 5 grupos experimentales: Grupo n Sexo Tratamiento Dosis* Días Vía (Al) Masculin Placebo 31 6, 7, 14 i.p. BALB/C o (S.S.F. ) (Cl) Masculin 30 isómero 1 260 ng 6, 7, 14 i.p. BALB/C o (C2) Masculin 30 isómero 2 260 ng 6, 7, 14 i.p. BALB/C o (C3) Masculin 30 isómero 3 260 ng 6, 7, 14 i.p. BALB/C o (C4) Masculin 30 isómero 4 260 ng 6, 7, 14 i.p. BALB/C o * Dosis por día y ratón Se observaron los ratones diariamente y se registró el tamaño del tumor dos veces a la semana. Esto se llevó a cabo midiendo dos diámetros perpendiculares (L/A) con un calibre. Estas medidas se utilizaron para obtener tanto la superficie como el volumen tumorales: Superficie tumoral = L x A (mm2) Volumen tumoral = L x A2 x 1/2 (mm3) Los resultados se expresaron como valores únicos y/o como la media ± DE o la mediana de cada grupo experimental .

Estadística Se realizó un estudio de caso-control con ratones tratados y control con el fin de determinar si estaban presentes diferencias entre los isómeros y la administración de placebo. Los datos obtenidos (superficie y volumen tumorales) se probaron para determinar una distribución normal dentro de los grupos, prueba de Kolmogorov-Smirnov p < 0,05. Se realizó una prueba de hipótesis no paramétrica para muestras no pareadas con el fin de contrastar si los isómeros tenían un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral. Se eligió la prueba U de Mann-Withney por ser una de las pruebas no paramétricas mejor conocida, de todas formas, los resultados de esta prueba son equivalentes a los de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon y de dos grupos de Kruskal-Wallis . Debido a la alta dispersión de los datos, se excluyeron los resultados atípicos (animales más allá del percentil 25 o por encima del percentil 75 para la superficie tumoral en el día 25) del estudio. El software estadístico utilizado fue SPSSvl2.0 RESULTADOS El efecto inhibidor de los isómeros sobre el crecimiento de células tumorales de Renca Se planificó que se estudiaran treinta ratones por grupo (treinta y uno en el grupo placebo) . Dos ratones del grupo del isómero 2 murieron por causas desconocidas la segunda semana después de la inoculación tumoral y se excluyeron. Las tablas 1 y 2 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana. Estas tablas resumen .la mediana de la superficie (tabla 1) o volumen (tabla 2) en el grupo de ratones de isómeros o S.S.F. cada día puntuado.

Tabla 1 SUPERFICIE (mm2) Valores globales (mediana) Dosis n Días tras la inoculación TrataGrup ng/rató (prime tumoral miento o n r día) 0 11 14 18 21 25 S.S.F. - Al 31 0 0 9 36 64 132 isómero 160, 260 Cl 30 1 0 0 12 , 5 36 81 5 isómero 260 C2 28 2 0 0 9 42 77 140 isómero 260 C3 30 3 0 0 4 18 45,5 90 isómero 260 C4 30 4 0 0 0 9 25 63 , 5 Tabla 2 VOLUMEN (mm3) Valores globales (mediana) Las tablas 3 y 4 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores medios . Estas tablas resumen la media de la superficie (tabla 3) o el volumen (tabla 4) en los grupos de ratones de isómeros o S.S.F. cada día puntuado.

Tabla 3 SUPERFICIE (itim2 ) Valores globales (med Tabla 4 VOLUMEN (ittm3 ) Valores globales (med Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 3 frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien' en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) en los días 18° y 25° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 4 frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,01) todos los días puntuados después del día 14° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney . La figura 1 representa el gráfico de la mediana de las superficies tumorales (grupos Al, Cl, C2 , C3 , C4 ) mientras que la figura 2 representa el gráfico de la mediana de los volúmenes tumorales (grupos Al, Cl, C2 , C3 , C4 ) . Tal como puede observarse en estas figuras, hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 3 y el isómero 4 frente a placebo. La figura 3 representa el gráfico de las superficies tumorales medias (grupos Al, Cl, C2 , C3 , C4 ) mientras que la figura 4 representa el gráfico de los volúmenes tumorales medios (grupos Al, Cl, C2 , C3 , C4) . Tal como puede observarse en estas figuras, hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Renca entre los ratones que recibieron el isómero 3 y el isómero 4 frente a placebo. Los resultados muestran que el isómero 3 y el isómero 4 inhiben el crecimiento in vivo del carcinoma de células renales (Renca) , mostrando el isómero 4 el mayor efecto inhibidor sobre el crecimiento del tumor Renca.

EJEMPLO 8 Comparación del crecimiento tumoral entre diferentes isómeros (9a, 9b, 9c y 9d) y la mezcla de BLAS. Tumor sometido a ensayo ; ASB XIV Este ensayo se realizó con el fin de comprobar el efecto de cada estereoisómero sobre el crecimiento tumoral in vivo en ratones con el efecto de la mezcla de todos ellos expuestos a tumores ASB XIV. Los stereoisómeros sometidos a ensayo fueron los mismos que en el ejemplo 7 anterior más una mezcla de todos ellos (BLAS) . El equipo (cuando sea necesario), los reactivos, la dosis, el vehículo y la vía y el volumen de administración fueron los mismos que en el ej emplo 7.

MATERIALES Y MÉTODOS Tumor ASB XIV es un carcinoma de células escamosas pulmonar originado en cepa de ratón Balb/c, y por tanto singénico en ratones con fondo genético de Balb/c. Se mantuvieron las células de ASB XIV (CLS, Eppelheim, Alemania) in vitro mediante pases en serie cada 3-4 días. Los cultivos se realizaron con medio RPMI (RPMI, 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, gentamicina 80 g/mL,· todos ellos se adquirieron a Sigma, St . Louis, MO, USA) sembrando 5 x 10s células en matraces de cultivo de 75 cm2. Se utilizaron las células recogidas de cultivos de 48 horas con tripsinización (Sigma, St . Louis, MO, USA) como fuente de células de ASB XIV en el presente ejemplo.

FARMACO EN ESTUDIO Principio activo BLAS (mezcla de isómeros 1, 2, 3 y 4) a una concentración de 65 en solución salina fisiológica estéril . Isómero 1 (9b) a una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril . Isómero 2 (9c) a una concentración de 65 9/p? en solución salina fisiológica estéril. Isómero 3 (9a) a una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril. Isómero 4 (9d) a una concentración de 65 µg/mL en solución salina fisiológica estéril . Placebo Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, España) Ratones Animal Balb/c AnNHsd Justificación de la selección Cepa de ratón consanguíneo singénico con células de ASB XIV Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales del estudio aproximadamente 187 machos Edad al inicio del 8-10 semanas de edad Peso tratamiento 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Tamaño de la muestra Según los datos anteriores, el tamaño de la muestra necesario para alcanzar significación era de 26 animales por grupo. Este tamaño de la muestra se calculó utilizando el software Epi-info v6.0 y se estimó para un poder estadístico de 0,8, con un nivel de confianza de 0,95 para una disminución de dos veces en la superficie tumoral y una razón control-caso de 1-1.

Diseño del estudio Los tumores se establecieron mediante inoculación subcutánea en el flanco de la pata derecha. Se inocularon los ratones (Balb/c) con 0,2 mL que contenían 2 x 105 células de ABS XIV viables. El día de la inoculación subcutánea se considerará el día 0 de la prueba. Los ratones Balb/c inoculados con células de ABS XIV se distribuyeron en 6 grupos experimentales: Grupo n Sexo Tratamiento Dosis* Oías Vía Placebo i .p.

(Al) BALB/C 32 Masculino 6, 7 y 14 (S.S.F. ) 6, 7 y 14 i .p.

(Bl) BALB/C 31 Masculino BLAS 260 ng 6, 7 y 14 i.p. 6, 7 y 14 i .p.

(Cl) BALB/C 31 Mascul ino isómero 1 260 ng 6, 7 y 14 i.p. 6, 7 y 14 i.p.

(C2) BALB/C 31 Masculino isómero 2 260 ng 6, 7 y 14 i.p. 6 , 7 y 14 i.p.

(C3) BALB/C 31 Masculino isómero 3 260 ng 6, 7 i y 14 .p. 6, 7 y 14 i.p.

(C4) BALB/C 31 Masculino isómero 4 260 ng 6, 7 y 14 i.p.

* Dosis por día y ratón Se observaron los ratones diariamente y se registró el tamaño del tumor dos veces a la semana. Esto se llevó a cabo midiendo dos diámetros perpendiculares (dl/d2) con un calibre. Estas medidas se utilizaron para obtener tanto la superficie como el volumen tumorales: Superficie tumoral = di x d2 (mm2) Volumen tumoral = di x d22 x 1/2 (mm3) Los resultados se expresaron como valores únicos y/o como la media ± DE o la mediana de cada grupo experimental .

Estadística Se realizó un estudio de caso-control con ratones tratados y control con el fin de determinar si estaban presentes diferencias entre BLAS o cada estereoisómero diferente y la administración de placebo. Los datos obtenidos (superficie y volumen tumorales)- se probaron para determinar una distribución normal dentro de los grupos, prueba de Kolmogorov-Smirnov p < 0,05. Se realizó una prueba de hipótesis no paramétrica para muestras no pareadas con el fin de contrastar si BLAS tenía un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral. Se eligió la prueba U de Mann-Withney por ser una de las pruebas no parametricas mejor conocida, de todas formas, los resultados de esta prueba son equivalentes a los de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon y de dos grupos de Kruskal-Wallis . Debido a la alta dispersión de los datos, se excluyeron los resultados atípicos (animales más allá del percentil 10 o por encima del percentil 90 para la superficie tumoral en el día 33) del estudio. El software estadístico utilizado fue SPSSvl2.0 RESULTADOS El efecto inhibidor de BLAS o cada isómero sobre el crecimiento de células tumorales de ASB XIV Se estudiaron treinta y un ratones por grupo (treinta y dos del grupo de placebo) . Dos ratones del grupo del isómero 4 (9d) murieron por causas desconocidas la primera semana después de la inoculación tumoral y se excluyeron. Las tablas 5 y 6 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana. Estas tablas resumen la mediana de la superficie o volumen en el grupo de ratones de BLAS, isómeros o S.S.F. cada día puntuado .

Tabla 5 SUPERFICIE (iran2) Valores globales (mediana) Tabla VOLUMEN Valores globales (mediana) n Días tras la inoculación tumoral TrataDosis Grupc (primer miento ng/ratón 0 8 12 15 19 22 26 29 33 día) S.S.F - Al 32 0 0 0 0 32 117 364 , 5 632, 75 936 BLAS 260 Bl 31 0 0 0 0 13, 5 75 245 364,5 600 Isómero 1 260 Cl 31 0 0 0 0 32 108 288 550 864 Isómero 2 260 C2 31 0 0 0 0 62 , 5 196 550 864 1436, 5 Isómero 3 260 C3 31 0 0 0 0 13 , 5 62,5 256 445, 5 700 Isómero 4 260 C4 19 0 0 0 0 13 , 5 62 , 5 171, 5 364 , 5 550 Las tablas 7 y 8 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores medios. Estas tablas resumen la media de la superficie o el volumen en los grupos de ratones de BLAS, isómeros o S.S.F. cada día puntuado.

Tabla 7 SUPERFICIE (mm2) Valores globales (med n Días tras la inoculación tumoral TrataDosis (prime Grupo miento ng/ratón r 0 8 12 15 19 22 26 29 33 día) 126,3 169, 2 S.S.F - Al 32 0 0 0,5 3 , 84 22 , 72 47,69 92,41 4 5 0,1 131,4 BLAS 260 Bl 31 0 0 9 2,45 13 , 81 34,19 68, 84 96, 52 2 Isómero 0,3 125, 1 165, 6 260 Cl 31 1 0 0 2 3,45 19, 65 46,81 92, 52 6 5 Isómero 0,7 29,8 142 , 188, 260 C2 31 2 0 0 1 6, 19 4 63 , 55 105, 97 45 87 Isómero 0,2 15, 1 94 , 6 131, 260 C3 31 3 0 0 9 2 , 81 6 33 , 16 68, 67 1 35 Isómero 0,1 14,5 90, 2 123 , 260 C4 29 4 0 0 7 2 , 79 9 34, 52 65, 86 8 45 Tabla VOLUMEN Valores globales (med n Días tras la inoculación tumoral TrataDosis Grupo (primer miento ng/ratón 0 8 12 15 19 22 26 29 33 día) S . S . F - Al 32 0 0 0, 69 7, 52 69, 89 197, 25 492 , 77 751,27 1165, 34 BLAS 260 Bl 31 0 0 0, 19 4 , 26 34,29 116, 52 322 , 06 511, 90 806 , 10 Isómero 1 260 Cl 31 0 0 0,45 5, 34 53 , 37 179, 79 474 , 10 733 , 26 1114 , 37 Isómero 2 260 C2 31 0 0 1 12 , 68 102, 44 292 , 39 603 , 66 913 , 90 1377 , 02 Isómero 3 260 C3 31 0 0 0 , 44 6,31 44 , 13 116, 65 337,18 529, 37 848, 87 Isómero 4 260 C4 29 0 0 0 , 16 5,29 36,5 118 , 19 297 , 83 451, 55 700, 66 Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor ASB XIV entre los ratones que recibieron BLAS frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 26° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor ASB XIV entre los ratones que recibieron el isómero 3 frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 26° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney . Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor ASB XIV entre los ratones que recibieron el isómero 4 frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 26° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney . BLAS, isómero 3 e isómero 4 inhiben el crecimiento in vivo de ASB XIV de carcinoma de pulmón. No hubo diferencias entre el efecto inhibidor de cada uno- sobre el crecimiento tumoral de ASB XIV.

EJEMPLO 9 Comparación del crecimiento tumoral entre diferentes isómeros (9a, 9b, 9c y 9d) y la mezcla de BLAS. Tumor sometido a ensayo: Ehlrich Este ensayo se realizó con el fin de comprobar el efecto de cada estereoisómero sobre el crecimiento tumoral in vivo en ratones con el efecto de la mezcla de todos ellos expuestos a tumores Ehlrich. Se usaron los mismos productos, equipo, reactivos, dosis, vehículo y vía de administración que en el ejemplo 8.

MATERIALES Y MÉTODOS Tumor Se inocularon los ratones con células tumorales Ehrlich. Se describió como un adenocarcinoma mamario de ratón. El tumor Ehrlich es un carcinoma mamario de ratón que se genera originalmente en un ratón no consanguíneo, y por tanto pertenece a los denominados tumores no específicos (Subiza JL, Viñuela JE, Rodríguez R, Gil J, Figueredo MA, de la Concha. EG. Development of splenic natural suppressor (NS) cells in Ehrlich tumor bearing mice .. Int J Cáncer, 44:307 315; 1989) . Puede crecer a través de barreras de histocompatibilidad y por tanto no es específico de cepa de ratón (Carry PJ, Prescott DM, Ogilvie GK. Resistance to Ehrlich ascites tumor in a strain of dystrophic mice. Cáncer Res., 39:2139-2140; 1979) . Se mantuvieron las células de Ehrlich in vitro mediante pases en serie cada 3-4 días. Los cultivos se realizaron con medio RPMI (RPMI, 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, gentamicina 80 todos ellos se adquirieron a Sigma, St . Louis, MO, USA) sembrando 5 x 106 células en matraces de cultivo de 75 cm2. Se utilizaron las células recogidas de cultivos de 48 horas como fuente de células para los estudios descritos a continuación.

Ratones Animal Balb/c AnNHsd Justificación de la selección Cepa de ratones consanguíneos inmunocompetentes Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales del estudio aproximadamente 96 machos Edad al inicio del 8-10 semanas de edad Peso tratamiento 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Diseño del estudio Los tumores se establecieron mediante inoculación subcutánea en el flanco de la pata derecha. Se inocularon los ratones (Balb/c) con 0,2 mL que contenían 2 x 105 células de Ehrlich viables. El día de la inoculación subcutánea se considerará el día 0 de la prueba. Los ratones Balb/c inoculados con células de Ehrlich se distribuyeron en 6 grupos experimentales: Grupo n Sexo Tratamient Dosis* Días Vía o (Al) Placebo i P · 16 Masculino 6, 7 y 14 BALB/C (S . S . F) 6, 7 y 14 i P- (Bl) i P- 16 Masculino BLAS 260 ng 6, 7 y 14 BALB/C 6, 7 y 14 i P- (Cl) i P- 16 Masculino isómero 1 260 ng 6, 7 y 14 BALB/C 6, 7 y 14 i P- (C2) i P- 16 Masculino isómero 2 260 ng 6, 7 y 14 BALB/C 6, 7 y 14 i P- (C3) i •P- 16 Masculino isómero 3 260 ng 6, 7 y 14 BALB/C 6, 7 y 14 i P- (C4) i P- 16 Masculino isómero 4 260 ng 6, 7 y 14 BALB/C * Dosis por día y ratón Se observaron los ratones diariamente y se registró el tamaño del tumor dos veces a la semana. Esto se llevó a cabo midiendo dos diámetros perpendiculares (L/A) con un calibre. Estas medidas se utilizaron para obtener tanto la superficie como el volumen tumorales : Superficie tumoral = L x A (mm2) Volumen tumoral = L x A2 l/2 (mm3) Los resultados se expresaron como valores únicos y/o como la media + DE o la mediana para cada grupo experimental .

Estadística Se realizó un estudio de caso-control con ratones tratados y control con el fin de determinar si estaban presentes diferencias entre BLAS o cada estereoisómero diferente y la administración de placebo. Los datos obtenidos (superficie y volumen tumorales) se probaron para determinar una distribución normal dentro de los grupos, prueba de Ko1mogorov-Smirnov p < 0,05. Se realizó una prueba de hipótesis no paramétrica para muestras no pareadas con el fin de contrastar si BLAS tenía un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral . Se eligió la prueba U de Mann-Withney por ser una de las pruebas no paramétricas mejor conocida, de todas formas, los resultados de esta prueba son equivalentes a los de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon y de dos grupos de Kruskal -Wallis . El software estadístico utilizado fue SPSSvl2.0 RESULTADOS El efecto inhibidor de los BLAS sobre el crecimiento de células tumorales de Ehrlich Se planificó que se estudiaran dieciséis ratones por grupo . Las tablas 9 y 10 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana (n (primer día) es en todos los casos 16 y la dosificación es de 260 ng/ratón) . Estas tablas resumen la mediana de la superficie o el volumen en el grupo dé ratones de BLAS, isómeros o S.S.F. cada día puntuado.

Tabla 9 SUPERFICIE (mm2) Valores globales (mediana) TrataDías tras la inoculación tumoral Grupo miento 0 8 13 16 20 23 29 31 35 38 S.S.F Al 0 10,5 25 49 64 84 103 119 138 148, 5 BLAS Bl 0 6,5 18 27 , 5 39 49 49 52 , 5 56 64 Isómero 1 Cl 0 2 16 20,5 27, 5 39, 5 39,5 46, 5 52 , 5 53 Isómero 2 C2 0 4 16 20 27,5 33 42 45 51 71 Isómero 3 C3 0 0 9 16 20 25 27, 5 36 43 49,5 Isómero 4 C4 0 0 12 , 5 18 27,5 39 45 48,5 52 , 5 68 Tabla 10 VOLUMEN (mm3) Valores globales (mediana) TrataDías tras la inoculación tumoral Grupo miento 0 8 13 16 20 23 29 31 35 38 S . S . F Al 0 15, 75 62, 5 171, 5 256 336 455, 25 575 675 815 BLAS Bl 0 8 , 75 36 68, 75 117 171 , 5 171,5 183 , 75 198 232 Isómero 1 Cl 0 2 32 47,25 68 , 75 123, 25 123, 25 147 , 75 173 ,25 191 Isómero 2 C2 0 4 32 40 68, 75 91,5 126 135 153 266, 5 Isómero 3 C3 0 0 13,5 32 40 62 , 5 68,75 100, 5 135, 5 164 , 25 Isómero 4 C4 0 0 22, 75 36 68, 75 117 135 157,75 183 , 75 272 Las tablas 11 y 12 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores medios (n (primer día) es en todos los casos 16 y la dosificación es de 260 ng/ratón) . Estas tablas resumen la media de la superficie o el volumen en los grupos de ratones de BLAS, isómeros o S.S.F. cada día puntuado.

Tabla 11 SUPERFICIE (imti2 ) Valores globales (med TrataDías tras la inoculación tumoral Grupo miento 0 8 13 16 20 23 29 31 35 38 S . S . F Al 0 9, 19 27,5 44 64, 19 80, 31 98, 25 111, 5 125, 87 147 , 62 BLAS Bl 0 6,81 19,81 30,31 41, 75 51,5 59,87 65 74 , 19 87 , 81 Isómero 1 Cl 0 5,69 13, 69 20, 875 32 , 37 42 , 12 50 57 68 , 87 78 , 81 Isómero 2 C2 0 6,69 14, 81 20,37 28,37 35,75 46, 12 50, 06 60, 25 75,37 Isómero 3 C3 0 3, 62 10, 94 16, 5 24 , 12 32 , 25 42, 94 53 , 37 66 79,37 Isómero 4 C4 0 3,37 12 , 44 20,19 31,31 43 , 06 52 , 94 63, 12 76, 31 91, 56 Tabla 12 VOLUMEN (mm3) Valores globales (Media) TrataDías tras la inoculación tumoral Grupo miento 0 8 13 16 20 23 29 31 35 38 S . S . F Al 0 17,34 73 , 56 149, 75 263, 09 356, 34 470,81 571, 25 691 , 75 899, 12 BLAS Bl 0 11, 91 46, 22 86, 53 140, 81 191, 94 237, 31 274 , 87 339, 66 437,41 Isómero 425, 91 Cl 1 0 9,91 31, 34 53 , 12 105, 19 160, 5 202 , 19 249, 06 342 , 94 Isómero C2 2 0 10, 97 32 , 16 51,87 81,81 113 , 75 167 191 , 91 258 , 06 372 , 5 Isómero C3 3 0 6 23 , 53 37, 12 65, 12 100, 44 156, 34 213, 31 293 , 87 387,69 Isómero C4 4 0 5, 94 26, 91 50,34 95, 59 156, 53 214 , 91 274 , 94 379, 72 504 , 22 Hubo diferencias en la tasa de ' crecimiento del tumor Ehrlich entre los ratones que recibieron BLAS frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 16° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney. En los días 35° y 38° se observó una tendencia en superficie (p=0,056 y p=0,08, respectivamente). En los días 13°, 16°, 20° y 38° se observó una tendencia en volumen (p=0,08, p=0,056 p=0,051 y p=0,067, respectivamente). Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Ehrlich entre los ratones que recibieron el isómero 1 frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados después del día 13° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney . Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Ehrlich entre los ratones que recibieron el isómero 2 frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados después del día 13° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann- hitney . Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Ehrlich entre los ratones que recibieron el isómero 3 frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados después del día 8° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney . Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Ehrlich entre los ratones que recibieron el isómero 4 frente a placebo. Estas diferencias, o bien' en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados después del día 8 o del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney. Se observó una tendencia en 35° y 38°, o bien en superficie o bien en volumen (p=0,061 y p=0,08, respectivamente; p=0,102, los dos) . Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor Ehrlich entre los ratones que recibieron BLAS frente a isómero 3. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) en los días 13°, 16°, 20° y 23° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney. BLAS, isómero 1, isómero 2, isómero 3 e isómero 4 inhiben el crecimiento in vivo de células del tumor de Ehrlich. El isómero 3 muestra el efecto inhibidor más alto sobre el crecimiento del tumor de Ehrlich.

EJEMPLO 10 Efecto del isómero 4 (9d) sobre el crecimiento de diferentes tumores Se realizaron los siguientes ensayos con el fin de comprobar el efecto del isómero 4 (9d) sobre diferentes tumores siguiendo métodos y materiales análogos a los usados en los ejemplos 8 y 9, En todos los casos se usó solución 11 salina fisiológica estéril (Grifols, Barcelona, España) como placebo. El isómero 4 (9d) se sometió a prueba a los niveles de dosis indicados en la tabla 13 en los días 6, 7 y 14 tras la inoculación tumoral . En todos los casos el vehículo fue solución salina fisiológica y los tratamientos se administraron por vía intraperitoneal . El volumen inoculado fue de 0,2 mL/animal. Los resultados se muestran en la tabla 13.

Tabla 13 Tumor ¿Inhibición Ratones Dosis del (muestra de (ng/rato- crecimiento tamaño) nes) tumoral? CT26.wt Balbc/cByl (carcinoma de colon en (aprox. 40 250 SÍ dosis alta) machos) CT26.CL25 Balbc/cByl (Carcinoma de colon en (aprox. 40 250 SÍ dosis baja) machos ) Mm5MT C3H/HeN 250 SÍ (Tumor de mama) (42 machos) KLN 205 DBA/2NCrI (carcinoma de pulmón (aprox. 62 260 SÍ en dosis alta) machos) ASB XIV Balb/cAnNCr (carcinoma de pulmón I 260 SÍ en dosis alta) (61 machos) ASB XIV Balb/cAnNCr (carcinoma de pulmón I 260 sí en dosis baja) (62 machos) Lewis C57BL/6NCrI (carcinoma de pulmón 260 sí (62 machos) en dosis baja) P-815 DBA/2NCrI . 250 sí (Mastocitoma) (42 machos) EJEMPLOS 11, 12 y 13 Efecto del isómero 4 (9d) frente a placebo y combinaciones de 9d + Cisplatino. Tumores sometidos a ensayo; KLN 205 y célula de pulmón de Lewis Se realizó este ensayo con el fin de comparar el efecto del isómero 4 (9d) sobre el crecimiento tumoral in vivo en ratones con el efecto de la mezcla de isómero 4 (9d) + Cisplatino expuestos a tumores KLN 205 y células de pulmón de Lewis. Se usó el mismo equipo, reactivos, vehículo, y vía y volumen de administración que los usados en el ejemplo 7.

Fármacos en estudio En los ejemplos 11, 12 y 13 estuvieron en estudio los siguientes fármacos: Principio activo Cisplatino (Sigma, St . Louis, O, USA) en solución salina fisiológica estéril. Isómero (9d) bromhidrato de bromuro de (3S,5R-l-(3-amino- 5-carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio) en solución salina fisiológica estéril. Placebo Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, España) En los ejemplos 11, 12 y 13 se observaron los ratones diariamente y se registró el tamaño del tumor dos veces a la semana. Esto se llevó a cabo midiendo dos diámetros perpendiculares (dl/d2) con un calibre. -Estas medidas se utilizaron para obtener tanto la superficie como el volumen tumorales : Superficie tumoral = di x d2 (mm2) Volumen tumoral = di x d22 x 1/2 (mm3) Los resultados se expresaron como valores únicos y/o como la media ± DE o la mediana de cada grupo experimental .

EJEMPLO 11 Efecto de 9d en combinación con cisplatino sobre el crecimiento tumoral. Tumor sometido a ensayo; KLN 205 Se realizó este ensayo con el fin de comprobar el efecto sobre el crecimiento tumoral in vivo en ratones expuestos a células de KLN 205. Se comparó su efecto con la combinación de cisplatino más 9d y/o placebo.

MATERIALES Y MÉTODOS Tumor KLN 205 es un carcinoma de células de pulmón originado en la cepa de ratón DBA/2, y por lo tanto singénico en ratones con fondo genético de DBA/2 (Kaneko T y LePage GA. Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo. Cáncer Res. 38: 2084-2090; 1978) . Se mantuvieron células de KLN 205 (CLS, Eppelheim, Alemania) in vitro mediante pases en serie cada 3-4 días. Los cultivos se realizaron con medio RPMI (RPMI, 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, gentamicina 80 µg/mL,· todos ellos se adquirieron a Sigma, St . Louis, MO, USA) sembrando 5 x 106 células en matraces de cultivo de 75 cm2. Se llevaron a cabo subcultivos recogiendo las células separadas tras el tratamiento con tripsina-EDTA (Sigma, St . Louis, MO, USA) . Se utilizaron las células recogidas de cultivos de 48 horas como fuente de células de KLM 205 para los estudios descritos a continuación Ratones Animal DBA/2NCrI Justificación de la selección Cepa de ratón consanguíneo singénico con células de KLN 205 Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales del estudio aproximadamente 62 machos Edad 8-10 semanas de edad al inicio del Peso tratamiento 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Dosis Se sometió a prueba cisplatino a los niveles de dosis de 65 g administrados dos veces por semana durante tres semanas tras la inoculación tumoral . El isómero 4 (9d) se sometió a prueba a los niveles de dosis de 250 ng administrados dos veces por semana durante 3 semanas tras la inoculación tumoral .

Diseño del estudio Los tumores se establecieron mediante inoculación subcutánea en el flanco de la pata derecha. Se inocularon los ratones (DBA/2) con 0,2 mL que contenían 2 x 105 células de KLN 205 viables. El día de la inoculación subcutánea se considerará el día 0 de la prueba. Los ratones DBA/2 inoculados con células de KLN 205 se distribuyeron en 6 grupos experimentales : Grupo n Sexo Tratamiento Dosis* Días Vía (Al) Placebo 16 Masculino DBA/2 (S.S.F) (Bl) 9d 16 Masculino 250 ng 3, 6, DBA/2 10, 13, (Cl) ip. 15 Masculino Cisplatino 65 /xg 17, 20 DBA/2 (DI) 9d '250 ng 15 Masculino DBA/2 Cisplatino 65. /¿g Dosis por día y ratón Estadística Se realizó un estudio de caso-control con ratones tratados y control con el fin de determinar si estaban presentes diferencias entre placebo, 9d, cisplatino o 9d + cisplatino. Los datos obtenidos (superficie y volumen tumorales) se probaron para determinar una distribución normal dentro de los grupos -prueba de Kolmogorov-Smirnov p < 0,05-. Se realizó una prueba de hipótesis paramétrica para muestras no pareadas con el fin de contrastar si 9d y/o cisplatino tenían un efecto sinérgico sobre el crecimiento tumoral . Se eligió la prueba t por ser una de las pruebas paramétricas mejor conocida. El software estadístico utilizado fue SPSSvl2.0 RESULTADOS El efecto inhibidor de 9d y/o cisplatino sobre el crecimiento de células del tumor KLN 205 Se planificó que se estudiaran dieciséis o quince ratones por grupo. Las tablas 14 y 15 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana. Estas tablas resumen la mediana de la superficie o volumen en el grupo de ratones de 9d, cisplatino, 9d+cisplatino o S.S.F. cada día puntuado.

Tabla 14 SUPERFICIE (mm2) Valores globales (mediana) n Días tras la inoculación tumoral Trata¬ Dosis Grupo (primer miento 0 10 13 17 20 24 27 31 34 38 día) S.S.F - Al 16 0 0,5 12 , 5 30,5 49 80 , 5 114 , 5 174 210 270 , 5 9d 250 ng Bl 16 0 4 16 25 36 64 105, 5 132, 5 170, 5 227, 5 Cispla- 198 65 g Cl 15 tino 0 4 16 20 36 72 99 120 150 9d + 250 ng Cispla- + 65 DI 15 tino M9 0 4 9 16 25 42 63 81 100 132 Tabla 15 VOLUMEN (mm3) Valores globales (mediana) n Días tras la inoculación tumoral Trata¬ Dosis Grupo (primer miento 0 10 13 17 20 24 27 31 34 38 día) S.S.F - Al 16 0 0,25 22 , 75 85,25 171,5 342,25 582, 75 1044 1477 , 5 2007 250 9d Bl 16 ng 0 4 32 62, 5 108 256 446, 75 628, 75 937 , 75 1478 , 8 Cispla- 65 µa> Cl 15 tino 0 4 32 40 108 288 445 , 5 600 800 1089 9d + 250 Cispla- ng + DI 15 tino 65 µa> 0 4 13,5 32 62, 5 126 220, 5 364, 5 500 700 Las tablas 16 y 17 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la media. Estas tablas resumen la media de superficie o volumen en el grupo de ratones de 9d, cisplatino, 9d+cisplatino o S.S.F en cada día puntuado.

Tabla 16 SUPERFICIE (mm2) Valores globales (med n Días tras la inoculación tumoral TrataGrup Dosis (prime miento o 0 10 13 17 20 24 27 31 34 38 r día) S . S . F - Al 16 0 3 , 63 17, 44 40, 81 70, 56 104 , 69 141, 75 187 , 25 221,69 275, 31 9d 250 ng Bl 16 0 5,38 17, 25 29, 88 57 , 06 81,38 113 , 5 135,31 168, 81 214 , 44 Cispla- 65 µg Cl 15 tino 0 4 , 07 14, 87 23 , 93 39,07 72 , 2 97, 07 124 , 67 147, 3 185 , 33 9d + 250 ng Cispla- + DI 15 tino 65 µg 0 3,2 10, 6 18,47 31,07 47, 2 65, 8 85, 73 105, 73 136, 87 Tabla 17 VOLUMEN (inm3 ) Valores globales (med n Días tras la inoculación tumoral TrataGrup Dosis (prime miento o 0 10 13 17 20 24 27 31 34 38 r día) S . S . F - Al 16 0 7, 12 48,41 151, 16 324,47 539, 84 813 , 44 1213 , 9 1584 , 0 2166, 8 9d 250 ng Bl 16 0 8, 81 43 , 38 94 , 56 246,03 393 , 25 611, 75 777 , 53 1068 , 3 1504 , 7 Cispla 65 µg Cl 15 -tino 0 5,1 31,77 59, 1 119,07 285, 43 445 , 8 637, 07 809, 03 1129, 9 9d + 250 ng Cispla + DI 15 - tino 65 µg 0 3 , 73 19, 77 42 , 17 93,4 170, 07 267, 57 377, 67 514 740, 3 Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor KLN 205 entre los ratones que recibieron 9d+cisplatino frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados después del día 17° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba t. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor KLN 205 entre los ratones que recibieron cisplatino frente a placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos -los días puntuados después del día 20° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba t. No hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor KLN 205 entre los ratones que recibieron 9d frente a placebo. Hubo una tendencia significativa, o bien en superficie o bien en volumen, todos los días puntuados después del día 31° del desarrollo tumoral según se calculó mediante la prueba t. Por tanto, cisplatino y 9d o cisplatino inhiben el crecimiento in vivo de célula de KLN 205. 9d y cisplatino tienen un efecto sinérgico.

EJEMPLO 12 Efecto del isómero (9d) en combinación con cisplatino sobre el crecimiento tumoral a través de inoculación subcutánea, intradérmica o intramuscular Tumor sometido a ensayo; KLN 205 Se realizó este ensayo con el fin de comprobar el efecto sobre el crecimiento tumoral en vivo en ratones expuestos con células de KLN 205. Se establecieron tumores mediante inoculación subcutánea, intradérmica o intramuscular.

Se comparó el efecto de la combinación de cisplatino y/o isómero ( 9d) con el placebo . en ratones expuestos por vía intradérmica . Además, se comparó el efecto de 9d sobre el crecimiento tumoral in vivo en ratones expuestos por vía intramuscular o subcutánea con el placebo.

MATERIALES Y MÉTODOS Tumor KLN 205 es un carcinoma de células de pulmón originado en la cepa de ratón DBA/2, y por tanto es singénico en ratones con fondo genético DBA/2 (Kaneko T y LePage GA. Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo. Cáncer Research. 38: 2084-2090; 1978 ) . Se mantuvieron células KLN 205 (CLS, Eppelheim, Alemania) in vitro mediante pases en serie cada 3-4 días. Se realizaron los cultivos con medio RPMI (RPMI, suero de ternero fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, gentamicina 80 µg/mL,· todos adquiridos de Sigma, St . Louis, MO, USA) sembrando 5 x 106 células sobre matraces de cultivo de 75 cm2. Se llevaron a cabo subcultivos recogiendo células desprendidas tras el tratamiento con tripsina-EDTA (Sigma, St . Louis, MO, USA) Se usaron las células tumorales, recogidas de cultivos de 48 horas, como fuente de células KLN 205 para los estudios descritos a continuación.

Ratones Animal DBA/2NCrI Justificación de la selección Cepa de ratón consanguíneo singénico con células KLN 205 Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales del estudio aproximadamente 80 machos Edad 8-10 semanas de edad al inicio del Peso tratamiento 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Dosis Se sometió a prueba el cisplatino a los niveles de dosis de 65 µg administrados en los días 7, 11, 14, 18, 21, 25 y 28 tras la inoculación tumoral . Se sometió a prueba el isómero (9d) a los niveles de dosis de 250 ng administrados en los días 7, 11, 14, 18, 21, 25 y 28 tras la inoculación tumoral.

Diseño del estudio Se establecieron tumores mediante inoculación subcutánea e intradérmica en el flanco de la pata derecha, e intramuscular en la pata posterior derecha. Se inocularon ratones (DBA/2) con 0,05 mL que contenían 2 x 105 células KLN 205 viables. El día de la inoculación subcutánea, intradérmica e intramuscular se considerará el día 0 de la prueba .

Los ratones DBA/2 inoculados con células KLN 205 se distribuyeron en 8 grupos experimentales: Grupo n Sexo Vía de Trata-miento Dosis* Días** Vía inoculación (Al) Placebo 10 Masculino subcutánea -DBA/2 (S.S.F. ) (A2) 10 Masculino subcutánea 9d 250 ng DBA/2 (Bl) Placebo 10 Masculino intradérmica -DBA/ 2 (S.S.F.) (B2) 10 Masculino intradérmica 9d 250 ng DBA/ 2 7, 11, 14, 18, (B3) i .p. 10 Masculino intradérmica cisplatino 65 µg 21, 25 y 28 DBA/2 (B4) 9d 250 ng DBA/ 2 10 Masculino intradérmica cisplatino 65 g (Cl) Placebo 10 Masculino intramuscular -DBA/ 2 (S.S.F. ) (C2) 10 Masculino intramuscular 9d 250 ng DBA/2 * Dosis por día y ratón ** En inoculación intramuscular, así como esos días, los ratones se trataron en los días 32 y 35.

Estadística Se realizó un estudio de caso-control con ratones tratados y control con el fin de determinar si estaban presentes diferencias entre el placebo, 9d, cisplatino o 9d + cisplatino. Se sometieron a prueba los datos obtenidos (superficie y volumen tumorales) para determinar la distribución normal dentro de los grupos (prueba de Kolmogorov Smirnov p<0,05) . Se realizó una prueba de hipótesis no parametrica para muestras no pareadas con el fin de contrastar si 9d, cisplatino o 9d + cisplatino tenían un' efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral . Se eligió la prueba de U de Mann Withney por ser una de las pruebas no paramétricas mejor conocidas, de todas formas, los resultados para esta prueba son equivalentes tanto a los de la suma de rangos de Wilcoxon como de la prueba de dos grupos de Kruskal -Wallis . Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (Paquete estadístico para ciencias sociales) vl3.0.

RESULTADOS El efecto inhibidor del isómero 4 (9d) sobre el crecimiento de células del tumor KLN 205 Se planificó que se estudiaran diez ratones por grupo. Las tablas 18 y 19 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana. Estas tablas resumen la mediana de la superficie o el volumen en cada día puntuado.

Tabla 18 SUPERFICIE (mm2) Valores globales (mediana) n TrataDosis Días tras la inoculación tumoral Grupo (primer miento ng/ratón día) 0 10 13 17 20 24 27 31 34 38 S.S.F. - Al 10 0 18 32, 5 61,5 100 156, 5 206 , 5 268 9d 250 A2 10 0 12 , 5 30 45 70 118, 5 159 186 S.S.F. - Bl 10 0 12 , 5 25 54 89, 5 142 186 221 9d 250 ng B2 10 0 12 , 5 25 42 63 , 5 95 128 162 , 5 cispla- 65 ng B3 10 tino 0 6,5 20 33 56 96 129 155 9d + 250 ig + cispla- B4 10 65 µg tino 0 6,5 18 30 56 88 120 143 S.S.F. - Cl 10 0 0 0,23 0,4 0,63 2 , 8 6 , 5 12 , 25 19, 89 34 , 68 9d 250 C2 10 0 0, 03 0, 17 0,315 0, 93 1, 83 6 , 94 12 , 26 24 , 34 37, 56 Tabla 19 VOLUMEN (mm3) Valores globales (Medi TrataDías tras la inoculaci'ón tumoral Dosis n (primer miento Grupo ng/ratón día) 0 10 13 17 20 24 27 31 S.S.F. - Al 10 0 36 81, 25 208, 25 400 793 , 25 1217· 1860, 5 9d 250 A2 10 0 22, 75 75 135 245 506 , 25 800 1058, 75 S.S.F. - Bl 10 0 22, 75 62 , 5 166 , 75 336 748, 5 1116 1436, 5 9d 250 ng B2 10 0 22, 75 62 , 5 126 232, 75 425,25 608,5 885, 75 ^1 cispla- 65 B3 10 tino 0 8,75 40 91, 5 196 384 646 , 5 775 9d + 250 µg + 65 cispla- B4 10 tino 9 0 8, 75 36 75 196 352 600 786, 5 Las tablas 20 y 21 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la media. Estas tablas resumen la media de la superficie o el volumen en cada día puntuado.

Tabla 20 SUPERFICIE (mm2) ores globales (medi n Días tras la inoculación tumoral TrataDosis Grupo (primer miento ng/ratón día) 0 10 13 17 20 24 27 31 34 38 S.S.F. - Al 10 0 17, 8 33,3 67, 9 112,5 163 , 9 214 270, 7 9d 250 A2 10 0 11,4 27,4 49 74 , 4 117, 4 149, 3 179,2 S.S.F. - Bl 10 0 13, 9 30,6 63 , 4 97, 9 141, 9 185, 3 231,6 9d 250 ng B2 10 0 14 , 3 27, 9 46,3 71,2 107, 8 141, 7 177, 1 cispla 65 µg B3 ' 10 tino 0 7,3 20 38 , 3 62 , 2 93, 7 124 , 1 151,3 9d + 250 ng + 65 cispla- B4 10 tino 0 6,8 17 31,3 54,6 82, 6 115 143,6 S.S.F. - Cl 10 0 0, 04 0,25 0,36 0,69 2 , 64 6, 81 12 , 48 20, 78 34,38 9d 250 C2 10 0 0, 06 0,18 0,37 0,89 2,48 6 , 7 13 , 61 29, 17 41, 53 Tabla 21 VOLUMEN (mm3) Valores globales (med n Días tras la inoculación tumoral TrataDosis Grupo (primer miento ng/ratón día) 0 10 13 17 20 24 27 31 S.S.F. - Al 10 0 41,3 93 , 05 257,35 534,45 887, 35 1315 1879, 85 9d 250 A2 10 0 22 75,5 171,6 304, 2 554, 9 765, 05 1020 S.S.F. - Bl 10 0 27,65 85,5 229,1 447, 75 777 , 15 1155,45 1595, 8 9d 250 ng B2 10 0 28,85 74 , 95 150, 05 280,6 496 , 8 744 , 75 1029, 35 Cispla- 65 µg B3 10 tino 0 11, 05 43 , 6 115, 5 233, 5 408, 05 642, 55 848, 95 9d + 250 ng + cispla- B4 10 65 ng tino 0 10, 3 37,7 91, 15 201, 6 350, 8 592 , 9 835, 8 Hubo diferencias en la tasa de crecimiento de tumor KLN 205 subcutáneo entre ratones que recibieron 9d frente al placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 20° de desarrollo del tumor tal como se calculó mediante la prueba de U de Mann-Whitney. No hubo diferencias en la tasa de crecimiento de tumor KLN 205 intradérmico entre ratones que recibieron 9d frente al placebo. Hubo una tendencia significativa, o bien en superficie o bien en volumen, todos los días puntuados tras el día 17° de desarrollo del tumor tal como se calculó mediante la prueba de U de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento de tumor KLN 205 intradérmico entre ratones que recibieron cisplatino frente al placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) en los días 17°, 20° y 31° de desarrollo del tumor tal como se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento de tumor KLN 205 intradérmico entre ratones que recibieron 9d + cisplatino frente al placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 13° de desarrollo del tumor tal como se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney . No hubo diferencias en la tasa de crecimiento de tumor KLN 205 intramuscular entre ratones que recibieron 9d frente al placebo tal como se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney .

El isómero 4 (9d) inhibe el crecimiento in vivo de células KLN 205 subcutáneas. 9d+cisplatino o cisplatino inhiben el crecimiento in vivo de células KLN 205 intradérmicas .

EJEMPLO 13 Efecto de 9d en combinación con cisplatino sobre el crecimiento tumoral . Tumor sometido a ensayo: Lewis Se realizó este ensayo con el fin de comprobar el efecto sobre el crecimiento tumoral in vivo en ratones expuestos con células de pulmón de Lewis. Su efecto se comparará con la combinación de agentes quimioterápicos más 9d y/o placebo. MATERIALES Y MÉTODOS Tumor El carcinoma pulmonar de Lewis es un carcinoma de células pulmonares originado en la cepa de ratones C57BL/6J, y por tanto singénica en ratones con fondo genético C57BL/6J (Rodrigo Garzón M, Tirapu Fernández de la Cuesta I, Arina Iraeta A, Noel Centelles Llórente M y Zulueta Francés J. Use of Gene Therapy in a Subcutaneous Murine Model of Lung Cáncer. Arch Bronconeumology. 42: 526 - 532; 2006) . Se mantuvieron células pulmonares de Lewis (CLS, Eppelheim, Alemania) in vitro mediante pases en serie cada 3-4 días. Se realizaron los cultivos con medio RPMI (RPMI, suero de ternero fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 20 mM, gentamicina 80 todos adquiridos de Sigma, St . Louis, MO, USA) sembrando 5 x 106 células sobre matraces de cultivo de 75 cm2. Se llevaron a cabo subcultivos recogiendo células desprendidas tras el tratamiento con tripsina-EDTA (Sigma, St . Louis, MO, EE.UU.) . Se usaron células tumorales, recogidas de cultivos de 48 horas, como fuente de células pulmonares de Lewis para los estudios descritos a continuación.

Ratones Animal C57BL/6NCrI Justificación de la selección Cepa de ratón consanguíneo singénico con células pulmonares de Lewis Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales del estudio aproximadamente 60 machos Edad 8-10 semanas de edad al inicio del Peso tratamiento 20-25 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Dosis Se sometió a prueba el cisplatino a los niveles de dosis de 65 ^ig administrados en los días 7, 11, 14, 18, 21, 24 y 27 tras la inoculación tumoral . Se sometió a prueba el isómero 4 (9d) a los niveles de dosis de 250 ng administrados en los días 7, 11, 14, 18, 21, 24 y 27 tras la inoculación tumoral.

Diseño del estudio Se establecieron tumores mediante inoculación subcutánea en el flanco de la pata derecha. Se inocularon a los ratones con 0,2 mL que contenían 2 x 105 células viables. El día de la inoculación subcutánea se considerará el día 0 de la prueba . Se distribuyeron los ratones en 4 grupos experimentales: Grupo y 11 Sexo Tratamiento Dosis* Días Vía cepa (Al) Placebo 15 Masculino C57BL/6J (S.S.F. ) (Bl) 9d 15 Masculino 250 ng 7, 11, 14, C57BL/6J 18, 21, 25, i .p.

(Cl) 15 Masculino Cisplatino 65 µ9 28 C57BL/6J (DI) 9d 250 ng 15 Masculino C57BL/6J Cisplatino 65 ^ig * Dosis por día y ratón Se observaron los ratones diariamente y se registró el tamaño del tumor dos veces a la semana. Esto se llevó a cabo midiendo dos diámetros perpendiculares (dl/d2) con un calibre. Se usaron estas mediciones para obtener tanto la superficie como el volumen tumoral . Superficie tumoral = di x d2 (mm2) Volumen tumoral = di x d22 x 1/2 (mm3) Los resultados se expresaron como valores únicos y/o como la media ± DE o la mediana para cada grupo experimental .

Estadística Se realizó un estudio de caso-control con ratones tratados y control con el fin de determinar si estaban presentes diferencias entre el placebo, 9d, cisplatino o 9d + cisplatino. Se sometieron a prueba los datos obtenidos (superficie y volumen tumorales) para determinar la distribución normal dentro de los grupos (prueba de Kolmogorov Smirnov p<0,05) . Se realizó una prueba de hipótesis no paramétrica para muestras no pareadas con el fin de contrastar si 9d, cisplatino o 9d + cisplatino tenían un efecto perjudicial sobre el crecimiento tumoral. Se eligió la prueba de U de Mann Withney por ser una de las pruebas no paramétricas mejor conocidas, de todas formas, los resultados para esta prueba son equivalentes tanto a los de la suma de rangos de ilcoxon como de la prueba de dos grupos de Kruskal-Wallis . Se excluyeron del estudio animales que tenían un tumor indetectable o no puntuado en el día 31° tras la inoculación tumoral. Debido a la alta dispersión de los datos, se excluyeron los datos extremos del estudio. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (Paquete estadístico para ciencias sociales) vl3.0.

RESULTADOS El efecto del isómero 4 (9d) sobre el crecimiento del tumor pulmonar de Lewis Se planificó que se estudiaran quince ratones por grupo. Un ratón del grupo del placebo murió por causas desconocidas la segunda semana tras la inoculación tumoral y se excluyó.

Las tablas 22 y 23 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores de la mediana. Estas tablas resumen la mediana de la superficie o el volumen en el grupo de ratones S.S.F., 9d, cisplatino o 9d+cisplatino en cada día puntuado.

Tabla 22 SUPERFICIE (iran2) Valores globales (mediana) Tabla 23 VOLUMEN (mm3) Valores globales (mediana) n Días tras la inoculación tumoral Tratamiento Dosis Grupo (primer día) 0 10 13 17 20 24 27 31 S.S.F. - Al 15 0 4 32 108 208 , 25 493 885, 75 1519 250 9d Bl 15 ng 0 0 4 48 108 320 364, 5 665, 5 cisplatino 65 µ Cl 15 0 0 4 56 171, 5 405 600 1080 250 9d + ng + DI 15 cisplatino 65 µg 0 0,5 13 , 5 62 , 5 162 384 650 936 Las tablas 24 y 25 muestran los resultados de cada grupo experimental expresados como los valores medios. Estos tablas resumen la media de la superficie o el volumen en el grupo de ratones de S.S.F., 9d, cisplatino o 9d+cisplatino en cada día puntuado .

Tabla 24 SUPERFICIE (mm2) Valores globales (media) n Días tras la inoculación tumoral Trata¬ Dosis Grupo (primer miento día) 0 10 13 17 20 24 27 31 S . S . F . - Al 15 0 4,53 13 , 87 33 , 6 56, 5 97, 79 151, 86 223 , 93 250 9d Bl 15 ng 0 2 6, 47 20, 13 34 , 33 60, 6 104 , 8 141 , 8 Cispla¬ 65 ng Cl 15 tino 0 2,4 6, 73 20,73 58,33 106, 07 160, 07 204 , 93 9d + 250 Cisplang + DI 15 tino 65 ng 0 2 , 47 9 21, 87 46,67 85, 8 132, 27 176, 53 Tabla 25 VOLUMEN (iran3) Valores globales (med Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor pulmonar de Lewis entre ratones que recibieron 9d frente al placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 13° de desarrollo del tumor tal como se calculó mediante la prueba U de Mann- Whitney . Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor pulmonar de Lewis entre ratones que recibieron cisplatino frente al placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) en los días 10°, 13° y 17° de desarrollo del tumor tal como se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney. Hubo diferencias en la tasa de crecimiento del tumor pulmonar de Lewis entre ratones que recibieron 9d+ cisplatino frente al placebo. Estas diferencias, o bien en superficie o bien en volumen, fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) todos los días puntuados tras el día 17° de desarrollo del tumor tal como se calculó mediante la prueba U de Mann-Whitney . 9d, cisplatino y 9d+cisplatino inhiben el crecimiento ín vivo del tumor pulmonar de Lewis en ratones cosanguíneos .

EJEMPLO 14 TOXICIDAD Se realizó este ensayo con el fin de comprobar la tolerancia (letalidad/toxicidad) de los tratamientos con BLAS e IL-2 en ratones.

MATERIALES Y MÉTODOS Fármacos en estudio BLAS (mezcla equimolar de isómeros 1, 2, 3 y 4) 1,25 mg/mL en solución salina fisiológica estéril. IL-2 recombinante humana, a 18xl06 UI/mL (Proleukin; Chiron Iberia, Madrid, España) Ratones Animal Balb/c AnNHsd Justificación de la selección Cepa de ratón cosanguíneo Proveedor Harían Ibérica Número de animales de estudio aproximadamente 50 machos Edad 12 semanas de edad al inicio Peso del tratamiento 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Dosis, vehículo, vía y volumen de administración Dosis * Dosis por ratón y día, usando un volumen constante de mL Vehículo El vehículo en el que se diluyeron BLAS e IL-2 fue solución salina fisiológica estéril para inyección (Grifols , Barcelona, España) y agua destilada estéril para inyección (Grifols, Barcelona, España) Vía de administración Los tratamientos se administraron por vía i.p.

Diseño del estudio Se observó cada ratón diariamente durante 30 días. Se realizaron dos mediciones: 1. Letalidad. Esto se expresó como el porcentaje supervivencia . 2. Toxicidad. Esto se comprobó en ratones vivos para los siguientes parámetros y criterios de puntuación Parámetro Puntuación Aspecto general Normal 0 Pelaje afectado 1 Pelaje afectado más secreciones 2 oculares/nasales Posición anómala 3 Comportamiento anómalo Ausencia 0 Presencia 3 RESULTADOS Letalidad y toxicidad asociadas con el tratamiento con BLAS e IL-2 La tabla 26 muestra la letalidad observada con cualquier tratamiento. Los resultados se expresan como el porcentaje de supervivencia. Tal como puede observarse en esta tabla, dos ratones del grupo B2 , que recibieron la dosis más alta de IL-2, murieron en el día 6 y 7 tras la primera dosis. No se observaron más muertes en ningún otro grupo de ratones, ya se tratasen con IL-2 (dosis inferior) o BLAS a cualquier dosis usada . 15 Tabla 26 LETALIDAD La tabla 27 muestra la toxicidad observada en ratones con cualquier tratamiento tal como se puntúa con los criterios descritos anteriormente. Los resultados se expresan como la puntuación tóxica acumulada por grupo de tratamiento.

Tabla 27 PUNTUACIÓN DE TOXICIDAD TrataDosis Días tras el comienzo del tratamiento Grupo miento (ratón) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 30 31 BLAS 1 µg Al 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BLAS 25 µg A2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BLAS 250 µg A3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9xl05 IL-2 Bl 0 0 1 1 4 10 10 10 9 9 5 1 1 0 0 0 0 0 0 UI 1, 8xl06 IL-2 B2 0 0 1 7 25 45 35 32 32 26 24 26 18 18 10 3 0 0 0 UI Tal como puede observarse en esta tabla, sólo se observó toxicidad en ratones tratados con IL-2 (grupos Bl y B2) El grupo B2 (la dosis de IL-2 más alta) mostró los efectos adversos más marcados pero los ratones del grupo Bl (dosis inferior) también puntuaron aunque en un grado inferior. Se observaron efectos adversos durante y tras el tratamiento con IL2 (desde el día 2 hasta el día 15) . Tal como podía esperarse, más tarde desaparecieron estos efectos ya que se interrumpió la IL-2 seis días tras la dosis inicial. Debe indicase que BLAS aparentemente no era tóxico en absoluto, y no pudo puntuar ningún ratón durante el seguimiento. Esto es notable, dado que la dosis usada en este estudio superaba 1.000 veces la dosis terapéutica usada en la mayoría de los ejemplos anteriores. BLAS, al contrario que IL-2, se tolera bien en ratones incluso a dosis que superan en gran medida su intervalo terapéutico .

EJEMPLO 15 TOXICIDAD DEL ISÓMERO 4 (9d) Se realizó este ensayo con el fin de realizar un estudio preliminar para abordar el efecto tóxico del isómero 4 (9d) usado a una dosis alta en ratones sanos. Su toxicidad eventual se comparará con el placebo.

MATERIALES Y MÉTODOS Fármaco en estudio Sustancia activa Isómero 4 (9d) a 0,7 mg/mL en solución salina fisiológica estéril . Placebo Solución salina fisiológica estéril para inyección (Grifols, Barcelona, España) Ratones Animal C57BL/6NCrI Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales de estudio aproximadamente 10 machos Edad 24 semanas de dad al inicio Peso del tratamiento 23-29 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Animal Swiss Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales de estudio aproximadamente 10 hembras Edad 24 semanas de edad al inicio Peso del tratamiento 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Dosis, vehículo, vía y volumen de administración Dosis * Dosis por ratón y día, usando un volumen constante de 1,8 mL (Al, Bl) o 0,2 mL (Cl , DI) Vehículo El vehículo en el que se diluyó el isómero 4 fue solución salina fisiológica estéril para inyección (Grifols, Barcelona, España) y agua destilada estéril para inyección (Grifols, Barcelona, España) Vía de administración Los tratamientos se administraron por vía i.p. o por vía s.c.

Diseño del estudio Cada ratón se observó diariamente durante 10 días. Se realizaron tres mediciones: 3. Peso. Esto se midió y se expresó en gramos.

Letalidad. Esto se expresó como supervivencia .

Parámetro Toxicidad local Puntuación Normal 0 Eritema en el sitio de inoculación 1 Eritema más irritación/roncha 2 Eritema más irritación/roncha más pelaje 3 afectado Necrosis en el sitio de inoculación 4 Estadística Se realizó un estudio de caso-control con ratones tratados y control para determinar si estaban presentes diferencias entre el isómero 4 y la administración de placebo. Se eligió la prueba de U de Mann Withney por ser una de las pruebas no paramétricas mejor conocidas, de todas formas, los resultados para esta prueba son equivalentes tanto a los de la suma de rangos de Wilcoxon como de la prueba de dos grupos de Kruskal-Wallis. El software estadístico usado fue SPSSvl2.0 RESULTADOS Letalidad y toxicidad asociada al tratamiento con isómero 4.

Las tablas 28 y 29 muestran el peso de cada ratón C57BL/6 cada día puntuado así como la ' media, la desviación estándar y la mediana. No se observaron diferencias en peso entre grupos tal como se detectó mediante la prueba U de Mann-Whitney (p>0,05) Tabla 28 PÉRDIDA DE PESO Grupo Al (Isómero 4) Tabla 29 PÉRDIDA DE PESO Grupo Bl (Placebo) No se observaron muertes ni toxicidad en ningún grupo de ratones tratados con el isómero 4 (grupo Al) o solución salina fisiológica (grupo Bl) . Es de observar que la dosis usada para la toxicidad sistémica superaba 50.000 veces la cantidad total de la dosis terapéutica. No se observó toxicidad total ni en los ratones tratados con el isómero 4 (grupo Cl) ni el placebo (grupo DI) . Es de observar que la dosis usada para la toxicidad local en este estudio superaba 500 veces la concentración normal de la dosis terapéutica. Por tanto, el isómero 4 se tolera bien en ratones incluso a dosis que superan en gran medida su ¦ intervalo terapéutico. No se observa toxicidad local en el sitio de inoculación en ningún ratón expuesto.

EJEMPLO 16 ANÁLISIS DEL FENOTIPO DE LEUCOCITOS Este ejemplo se llevó a cabo con el objetivo de evaluar diferencias' eventuales en el porcentaje de la población de leucocitos entre ratones tratados mediante citometría de flujo. Se llevaron a cabo los recuentos usando un citómetro de flujo tras el mareaje de las proteínas de membrana (CD11B y Ly6G) con anticuerpos específicos frente a dichas proteínas. El marcador CD11B (también conocido como Mac-1) se expresa en poblaciones de monocitos mientras que Ly6G (también conocido como GR-1) se expresa en poblaciones de granulocitos . Ambos marcadores (CDllb y Ly6G) se expresan en poblaciones de neutrófilos. Este ensayo muestra que el compuesto sometido a ensayo aumenta las poblaciones de glóbulos blancos, particularmente del linaje de células mieloides, lo que es importante en casos que requieren potenciar la respuesta inmunitaria en un sujeto, tal como, por ejemplo, en pacientes que padecen SIDA.

MATERIALES Y MÉTODOS Fármaco en estudio Isómero 4 (compuesto 9d) a 65 ig/mh en solución salina fisiológica estéril .

Placebo Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, España) .

Ratones Animal Balb/cByJ Justificación de la selección Cepa de ratón cosanguíneo singénico con células tumorales de Renca Proveedor CRIFFA - Charles River Número de animales de estudio aproximadamente 10 machos Edad al inicio del tratamiento 10-12 semanas de edad Peso 25-30 g Identificación Mediante una técnica de punción en la oreja Equipo Cabina de flujo laminar, citómetro de flujo, pipetas ajustables, jeringuillas estériles, agujas estériles, tubos estériles con EDTA, tubos de plástico.

REACTIVOS • Disolución anestésica • PBS estéril (Sigma, St . Louis, MO, EE.UU) • Solución salina fisiológica (Grifols, Barcelona, España) • Anticuerpo de rata anti-ratón CDllb-PE (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) • Anticuerpo de rata anti-ratón Ly6G-FITC (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) • Optylise C (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) Dosis, vehículo, vía y volumen de administración Dosis Se sometió a prueba el isómero 4 (compuesto 9d) a los niveles de dosis de 250 ng administrados en los días 0 y 7.

Vehículo El vehículo en el que se diluyó el isómero 4 es solución salina fisiológica.

Volumen y vía de administración Los tratamientos se administraron por vía intraperitoneal . El volumen inoculado fue de 200 µ?/animal.

Diseño del estudio Se distribuyeron los ratones Balb/c en dos grupos experimentales : Grupo n Sexo Tratamiento Dosis* Días Vía (Al) 5 Masculino Placebo (S.S.F.) BALB/C 0 y 7 i .p.

(Bl) 5 Masculino Isómero 4 250 ng BALB/C * Dosis por día y ratón Tres días tras la última dosis del tratamiento, se aisló sangre murina . Se obtuvo directamente a partir de punción intracardiaca . Anteriormente, se anestesiaron los ratones por vía intramuscular. Se mezcló la sangre con los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente. Tras 20 minutos de incubación, se añadió disolución de Optylise C a las muestras para lisar la población de eritrocitos . Finalmente, se diluyeron las muestras ¾ con lx PBS estéril y se comprobaron mediante citometría de flujo. Se analizaron los porcentajes de cada población y se expresaron como valores únicos y como la media ± DE de cada grupo experimental .

RESULTADOS Selección por citometría de flujo PBL (Sangre periférica) % de Control (n=5) compuesto 9d ID % (n=4) Ly6G+ 1 16, 9 27 2 22 , 1 37,6 3 28, 9 - 4 23 , 7 33 , 3 5 10,7 41,2 Media 20,46 34, 775 Desviación estándar 6, 934551175 6, 107031467 % de Control (n=5) compuesto 9d ID % (n=4) CDllb+Ly6G+ 1 16, 1 29,7 2 20,4 32 , 3 3 13, 7 - 4 7, 78 28 , 5 5 8, 02 33 , 7 Media 13, 2 31, 05 Desviación estándar 5,401592358 2, 37416652 Según estos resultados, los ratones (Balb/C) tratados con dos dosis (una vez por semana) de compuesto 9d muestran un aumento de células positivas para CDllb, Ly6G y CDllb + Ly6G en la sangra periférica, en comparación con ratones control (solución salina fisiológica) . Estas células se comprobaron mediante citometría de flujo tres días tras la última dosis del tratamiento.

Claims

REIVINDICACIONES Un procedimiento para la síntesis de un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I (i) en donde Ri se selecciona de -OH, -ORa, en donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida; X es un anión farmacéuticamente aceptable; e Y es un residuo orgánico seleccionado de (i) un grupo que contiene N de fórmula Vía © x T (Vía) en donde la línea de puntos junto con el átomo de N forma un heteroarilo sustituido o no sustituido, y X es como se definió anteriormente; o (ii) un grupo que contiene N de fórmula VIb (VIb) en donde X es como se definió anteriormente; y Ra y Rb se seleccionan independientemente de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; o Ra y Rb junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un heterociclo sustituido o no sustituido; o mezclas del mismo; que comprende a) hacer reaccionar un compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV en donde Ri y R2 son como se definieron anteriormente ; o mezclas del mismo; con un compuesto de fórmula V Phl==N^ R4 V en donde R4 es como se definió anteriormente; para dar un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III en donde Rl7 R2 y R4 son como se definieron anteriormente ; o mezclas del mismo; b) transformar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II II donde Ri, R2 y R4 son como se definieron previamente; R5 se selecciona de una carga negativa o R3 , en donde R3 es como se definió anteriormente; e Y es un residuo orgánico que contiene N seleccionado de (i) cuando R5 es una carga negativa, Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula Vlla (Vlla) en donde la línea de puntos junto con el átomo de N forman un heteroarilo sustituido o no sustituido; o (ii) cuando R5 es R3, Y es un residuo orgánico que contiene N seleccionado de (ii.a) un grupo que contiene N de fórmula Vllb (Vllb) en donde Ra y Rb son como se definieron anteriormente; o (ii.b) un residuo orgánico que contiene de fórmula VI Ic (VIIc) en donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido; y Z es un anión farmacéuticamente aceptable ; o mezclas del mismo; c) poner en contacto dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II, o mezclas del mismo, con un medio ácido que comprende un ácido de fórmula HX, en donde X es tal como se definió anteriormente, para dar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula I, o mezclas del mismo. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el compuesto de fórmula IV está en la forma de un compuesto enantioméricamente puro seleccionado del isómero S y el isómero R. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el compuesto de fórmula IV es éster 1-tercbutílico, éster 2-etílico del ácido 5R-4 -metilen- 5 -oxopirrolidin- 1 , 2 -dicarboxílico o éster 1-tercbutílico, éster 2-etílico del ácido 5S-4 -metilen-5-oxopirrolidin-l , 2 -dicarboxílico . Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el compuesto de fórmula V es N-tosiliminobencilyodinano. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la reacción del compuesto enantioméricamente puro del compuesto de fórmula IV, o mezclas del mismo, con el compuesto de fórmula V, se lleva a cabo en presencia de un catalizador, preferiblemente un catalizador a base de cobre, preferiblemente un catalizador seleccionado del grupo formado por Cu(ft)2, en donde "ft" es ftalocianina , y Cu(acac)2; en donde "acac" es acetoacetato . Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, se transforma en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II en donde R5 es una carga negativa e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula Vlla, haciendo reaccionar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, con un nucleófilo que contiene nitrógeno de fórmula Villa ) Villa en donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, se transforma en un estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula II en donde R5 es R3 e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula Vllb, haciendo reaccionar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, con un nucleofilo que contiene nitrógeno de fórmula VlIIb VlIIb en donde Ra y Rb son como se definieron anteriormente ; y, si se desea, se extingue la mezcla resultante con un compuesto de fórmula X R3Z (X) en donde R3 y Z son como se definieron anteriormente . Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, se transforma en un estereoisómero sustancialmente . puro de un compuesto de fórmula II en donde R5 es R3 e Y es un residuo orgánico que contiene N de fórmula VIIc, haciendo reaccionar dicho estereoisómero sustancialmente puro de un compuesto de fórmula III, o mezclas del mismo, con un nucleofilo que contiene nitrógeno de fórmula Villa ; Villa en donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido; y con un compuesto de fórmula X 3Z (X) en donde R3 y Z son como se definieron anteriormente . Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto de fórmula III está en forma de un estereoisómero sustancialmente puro (3R, 5R) ; (3S,5S); (3R, 5S) ; o (3S, 5R) . Procedimiento según la reivindicación 6 u 8, en donde dicho nucleofilo que contiene nitrógeno de fórmula Villa es una piridina de fórmula IX en donde , n es 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y R6 se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo . sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, alcoxilo sustituido o no sustituido, ariloxilo sustituido o no sustituido, halógeno, carboxiéster sustituido o no sustituido, amino sustituido o no sustituido y/o la piridina forma uno o más anillos condensados sustituidos o no sustituidos. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la transformación del compuesto de fórmula III en un compuesto de fórmula II se lleva a cabo bajo calentamiento, preferiblemente con microondas . Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el ácido de fórmula HX es un ácido inorgánico, preferiblemente, HCl o HBr . Un compuesto de fórmula I seleccionado del grupo que consiste en: a) un compuesto sustancialmente puro de fórmula la la en donde Ri se selecciona de -OH, -ORa, en donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalamida; X es un anión farmacéuticamente aceptable; e Y es un residuo orgánico seleccionado de (i) un grupo que contiene N de fórmula Vía (Vía) en donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido, y X es como se definió anteriormente; o (ii) un grupo que contiene N de fórmula VIb 10 (VIb) en donde X es como se definió anteriormente; y Ra y Rb se seleccionan independientemente de alquilo sustituido o no sustituido, 15 cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no 20 sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; o Ra y Rb junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un heterociclo sustituido o no sustituido; 25 b) un compuesto sustancialmente puro de fórmula Ib, Ib en donde Rlf R2 , R3, R4 , X e Y son como se definieron anteriormente; c) un compuesto sustancialmente puro de fórmula Ic Ic en donde Ri, R2, R3, R4, X e Y son como se definieron anteriormente; d) un compuesto sustancialmente puro de fórmula Id Id en donde Ri, R2/ R3 , 4 , X e Y son como se definieron anteriormente; y e) cualquier mezcla de los compuestos sustancialmente puros de fórmula la, Ib, Ic y/o Id anteriormente mencionados, en cualquier razón molar, en donde dicha mezcla no contenga simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los compuestos siguientes: (i) clorhidrato de cloruro de 1- (3-amino-5- carboxi -2 -oxopirrol idin-3 -ilmetil) piridinio, o (ii) clorhidrato de cloruro de 1- (l-acetil-3-amino- 5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio . Compuesto según la reivindicación 13, en donde Rx es OH u ORa, preferiblemente OH; R2 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida, preferiblemente hidrógeno; R3 o R4 , independientemente, son hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza en condiciones ácidas o ftalamida, preferiblemente R3 o R4 son, simultáneamente, hidrógeno; y/o X es un anión farmacéuticamente aceptable, preferiblemente bromuro o cloruro. Compuesto según la reivindicación 13, en donde Y es un residuo orgánico seleccionado de un residuo orgánico seleccionado de Compuesto según la reivindicación 13, seleccionado del grupo que consiste en: - un compuesto de fórmula I'a I'a en donde Ri( R2 , Rs y n son como se definieron anteriormente ; un compuesto de fórmula I'b anteriormente ; un compuesto de fórmula I'c en donde Rlf R2/ Rs y n son como se definieron anteriormente ; compuesto de fórmula I'd en donde R1( R2, R6 y n son como se definieron anteriormente; y mezclas de los mismos. 17. Compuesto según la reivindicación 13, seleccionado del grupo que consiste en: bromhidrato de bromuro de 3S , 5S- 1 - ( 3 -amino- 5 -carboxi -2 - oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio ; bromhidrato de bromuro de 3R, 5S- 1- ( 3 -amino-5-carboxi-2 - oxopirrolidin-3 - ilme il ) piridinio ; bromhidrato de bromuro de 3R, 5R- 1 - (3 -amino-5 -carboxi -2 - oxopirrolidin-3-ilmetil) piridinio; y bromhidrato de bromuro de 3S , 5R- 1 - (3 -amino- 5 -carboxi -2 - oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio . 18. Una composición que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en los compuestos de fórmula la, Ib, Ic, Id y mezclas de los mismos, según la reivindicación 13, en cualquier razón molar, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los siguientes compuestos : (i) clorhidrato de cloruro de 1- (3-amino-5- carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio, o (ii) clorhidrato de cloruro de 1- (l-acetil-3-amino- 5 -carboxi -2 -oxopirrolidin- 3 - ilmetil ) piridinio . 19. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, o una composición según la reivindicación 18, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 20. Un compuesto de fórmula II seleccionado del grupo que consiste en: a) un compuesto sustancialmente puro de fórmula lia, Ha donde Ri se selecciona de -OH, -ORa, en donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalamida ; e Y es un residuo orgánico seleccionado de (i) un grupo que contiene N de fórmula Vía (Vía) en donde la línea de puntos junto con el átomo de nitrógeno forman un heteroarilo sustituido o no sustituido, y X es un anión farmacéuticamente aceptable; o (ii) un grupo que contiene N de fórmula VIb (VIb) en donde X se define como anteriormente; y Ra y Rb se seleccionan independientemente de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; o Ra y Rb junto con el átomo de nitrógeno al cuál están unidos forman un heterociclo sustituido o no sustituido; un compuesto sustancialmente puro de fórmula Ilb, Ilb en donde Ri, R2 , R4 , R5 e Y son como se definieron anteriormente ; un compuesto sustancialmente puro de fórmula lie, lie en donde Ri, R2, R4 , R5 e Y son como se definieron anteriormente; y d) un compuesto sustancialmente puro de fórmula lid, lid en donde Rlr R2, R , 5 e Y son como se definieron anteriormente; y e) cualquier mezcla de los compuestos sustancialmente puros de fórmula lia, Ilb, lie y/o lid anteriormente mencionados, en cualquier razón molar, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los compuestos siguientes: acetato de 1 - (3 -amino-5 -carboxi -2 -oxopirrolidin-3 - ilmetil ) piridinio ; acetato de 1 - ( 1 -acetil - 3 -amino- 5 -carboxi -2 - oxopirrolidin-3 -ilmetil ) piridinio; acetato de 1 -( 1 -acetil - 3 -acetilamino- 5 -carboxi -2 - oxo-pirrolidin-3-ilmetil) piridinio; o clorhidrato de 1 -( 1 -acetil -3 -acetilamino- 5-carboxi - 2 -oxo-pirrolidin-3 -ilmetil) piridinio. Compuesto según la reivindicación 20, en donde Rx es - ORa, preferiblemente en donde Ra es un grupo alquilo; R2 es -(0=)C-0-Ra, preferiblemente el grupo BOC; y/o R4 es - (0=) S (=0) -Ra, preferiblemente tosilo. 22. Compuesto según la reivindicación 20, en donde R2 , R4 y R5, son, independientemente, hidrógeno. 23. Compuesto según la reivindicación 20, en donde R5 es una carga negativa. 24. Una composición que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en los compuestos de fórmula lia, Ilb, lie, lid y mezclas de los mismos, según la reivindicación 20, en cualquier razón molar, en donde dicha mezcla no contiene simultáneamente todos los cuatro estereoisómeros de los compuestos siguientes: acetato de 1- (3-amino-5-carboxi-2-oxopirrolidin-3- ilmetil ) piridinio ; acetato de 1- (l-acetil-3-amino-5-carboxi-2- oxopirrolidin- 3 - ilmetil ) piridinio ; acetato de 1- (l-acetil-3-acetilamino-5-carboxi-2- oxo-pirrolidin- 3 -ilmetil) iridinio; o clorhidrato de 1- (l-acetil-3-acetilamino-5-carboxi- 2 -oxo-pirrolidin-3 -ilmetil ) piridinio . 25. Un compuesto de fórmula III seleccionado del grupo que consiste en: a) un compuesto sustancialmente puro de fórmula Illa, Illa n donde Ri se selecciona de -OH, -ORa, en donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; R2 y R4 se seleccionan independientemente de hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalamida; ) un compuesto de fórmula II Ib Illb en donde Ri, R2 y R4 son como se definieron anteriormente ; ) un compuesto de fórmula lile, IIIc en donde Ri, R2 y R4 son como se definieron anteriormente ; ) un compuesto de fórmula II Id nid en donde Ri, R2 y R4 son como se definieron anteriormente; y e) mezclas de los mismos. Compuesto según la reivindicación 25, en donde Rx es -ORa, preferiblemente en donde Ra es un grupo alquilo; R2 es -(0=)C-0-Ra, preferiblemente el grupo BOC; y/o R4 es -(0=) S (=0) -Ra, preferiblemente tosilo. Compuesto según la reivindicación 25, en donde R2, R y R5, son, independientemente, hidrógeno. Un procedimiento para la síntesis de un compuesto de fórmula I según se define en la reivindicación 13, que comprende poner en contacto un compuesto de fórmula II según se define en la reivindicación 20, con un medio ácido que comprende un ácido de fórmula HX, en donde X es un anión farmacéuticamente aceptable. Procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto enantioméricamente puro de fórmula IV IV en donde Ri se selecciona de -OH, -ORa, en donde Ra se selecciona de alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, cicloalquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, aralquilo sustituido o no sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido; y R2 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalamida ; o mezclas del mismo; con un compuesto de fórmula V Phl -^N^ R4 V en donde R4 es hidrógeno, un grupo protector de nitrógeno que se hidroliza bajo condiciones ácidas o ftalamida; para dar un compuesto de fórmula III según se define en la reivindicación 25. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, para la fabricación de una composición farmacéutica para potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto, o para la fabricación de una composición farmacéutica antitumoral, o para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una infección de origen bacteriano, fúngico o viral o para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad autoinmunitaria . 31. Uso según la reivindicación 30, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis de cáncer. 32. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 30 y 31, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad o estado seleccionados del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma, mastocitoma, cáncer de pulmón y cáncer renal. 33. Uso según la reivindicación 30, para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la profilaxis del SIDA y enfermedades relacionadas.