MX2008013388A

MX2008013388A - Metodos y composiciones para expresar arn viral en sentido negativo en celulas caninas.

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Publication number: MX2008013388A
Application number: MX2008013388A
Authority: MX
Inventors: James Young; Gregory Duke; George Kemble; Zhaoti Wang
Original assignee: Medimmune Llc
Priority date: 2006-04-19
Filing date: 2007-04-18
Publication date: 2009-03-02
Also published as: JP5491173B2; EP2016194A2; CA2646526A1; HK1136849A1; EP2431478A1; AU2007240448A1; JP2009534039A; KR101436176B1; PT2016194E; EP2016194A4; WO2007124327A2; EP2016194B1; ES2539514T3; RU2457250C2; WO2007124327A3; AU2007240448A8; CN101528941A; RU2008145226A; KR20090032030A; AU2007240448B8

Abstract

La presente invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos reguladoras pol I caninas novedosas, útiles para la expresión de secuencias de ácidos nucleicos en células caninas tales como células MDCK. La invención proporciona además vectores de expresión y células que comprenden tales ácidos nucleicos así como métodos de uso de tales ácidos nucleicos para hacer virus de la influenza, incluyendo virus infecciosos de la influenza.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA EXPRESAR ARN VIRAL EN SENTIDO NEGATIVO EN CELULAS CANINAS Campo de la Invención En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino. En otros aspectos, la invención proporciona vectores de expresión y células que comprende tales ácidos nucleicos asi como métodos para usar tales ácidos nucleicos para hacer virus de la influenza, incluyendo virus infecciosos de la influenza.

Antecedentes de la Invención Las pandemias de influenza se definen por un incremento global dramático en la morbilidad y mortalidad debido a la enfermedad de influenza. Varios factores se combinan para modular la severidad y extensión de la pandemia incluyendo el bajo grado de inmunidad en la población y la eficiencia con la cual el virus se puede transmitir entre humanos. La última está influenciada no solo por el virus mismo sino la densidad de la población y la facilidad para viajar en y fuera de una región. El virus responsable de la pandemia generalmente es una variante antigénica recientemente emergida que la mayoría de la población no tiene experiencia con éste y, por lo tanto, tiene poca o ninguna inmunidad a éste. Además, la transmisión Ref.: 197429 humano a humano eficiente es un requisito previo para una expansión rápida y, en el caso de introducción zoonótica de virus animales ' en poblaciones humanas, el virus deberá adaptarse para replicación en humanos y ser capaz de transmisión eficiente. La pandemia de influenza se extiende muy rápido y puede tener un impacto devastador. La pandemia más severa del siglo XX, la pandemia de 1918, mató arriba de 500,000 ciudadanos de los ' Estados Unidos de América y entre 20 hasta 40 millones de personas a nivel mundial. La pandemia puede producir ondas de enfermedad, cuyos picos de incidencia se separan por semanas hasta meses. El inicio y expansión relativamente rápidos de la pandemia de influenza presenta varios problemas para responder a un ataque global de esta magnitud e impone cargas aplastantes en los servicios de respuesta a emergencia y trabajadores de cuidado de salud. La identificación y respuesta rápida a la pandemia emergente es claramente un elemento necesario de la solución; varios programas están actualmente en colocación a nivel mundial para vigilar los virus de influenza emergente incluyendo los virus de influenza aviar que con poca frecuencia provocan enfermedad en humanos. Estos datos de vigilancia se usan en conjunto con niveles de alerta pandémicos predefinidos con objeto de identificar la probabilidad de amenaza y proporcionar una guia para una respuesta efectiva.

La vacunación es la medida de salud pública más importante para prevenir la enfermedad causada por epidemias anuales de influenza. El corto intervalo entre la identificación de la pandemia potencial y el inicio de niveles de enfermedad importantemente incrementados presenta retos importantes para producir suficientes vacunas para proteger un gran segmento de la población. El tener tecnología de vacuna e infraestructura de fabricación en el lugar antes de emerger la siguiente pandemia, sería crítico para aligerar una cantidad importante de enfermedad y muerte. Los tiempos de respuesta cortos necesarios para producir una "vacuna pandémica" no permitirán conducir una investigación o desarrollo de procesos prolongados con objeto de proporcionar una respuesta efectiva. A la fecha, todas las vacunas de influenza comercialmente disponibles para cepas no pandémicas en los Estados Unidos de América se han propagado en huevos de gallina embriónicos. No obstante que el virus de influenza crece bien en los huevos de gallina, la producción de vacuna depende de la disponibilidad de huevos. El suministro de huevos deberá organizarse, y las cepas para producción de vacuna seleccionar meses por adelantado para la siguiente temporada de gripa, lo que limita la flexibilidad de este enfoque, y a menudo resulta en retrasos y escasez en la producción y distribución. Desafortunadamente, algunas cepas de vacuna de influenza, tales como la cepa fenotipo A/Fuj i/411/02 que circula durante la temporada 2003-04, no replica bien en huevos de pollo embriónicos, y tiene que aislarse por cultivo celular en un procedimiento que consume tiempo y es costoso. Los sistemas para producir virus de influenza en cultivo celular también se han desarrollado en años recientes (ver, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohén & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151). Típicamente, estos métodos involucran la infección de células hospederas inmortalizadas apropiadas con una cepa seleccionado del virus. Aunque se eliminan muchas de las dificultades relacionadas con la producción de vacuna en huevos de gallina, no todas las cepas patogénicas de influenza crecen bien y pueden producirse de acuerdo con los métodos de cultivo de tejido establecidos. Además, muchas cepas con características deseables, por ejemplo, atenuado, sensibilidad a la temperatura y adaptación al frío, apropiados para la producción de vacunas atenuadas vivas, no crecen exitosamente en cultivo de tejido usando los métodos establecidos. Además de los métodos basados en cultivo celular que dependen de infectar el cultivo celular con virus vivo, los virus de influenza completamente infecciosos se han producir en cultivo celular usando tecnología de ADN recombinante . La producción de virus de influenza de ADN recombinante incrementa significativamente la flexibilidad y utilidad de los métodos de cultivo de tejido para producción de vacuna de influenza. Recientemente, los sistemas para producir virus de influenza A y B de plásmidos recombinantes que incorporan ADNc que codifican el genoma viral se han reportado. Ver, por ejemplo, Neumann et al. (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned ADNcs. Proc Nati Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73 : 9679-9682; Hoffmann et al. (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Nati Acad Sci USA 97:6108-6113; WO 01/83794; Hoffmann and Webster (2000), Unidirectional ARN polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids, 81:2843-2847; Hoffmann et al. (2002), Rescue of influenza B Viruses from 8 plasmids, 99(17): 11411-11416; Patentes de E.U.A Nos. 6,649,372 y 6,951,754; Publicaciones E.U.A. nos. 20050003349 y 20050037487, que se incorporan para referencia en la presente. Estos sistemas, a menudo referidos como "rescate de plásmido", ofrecen el potencial para producir virus recombinantes que expresan las proteínas HA y NA inmunogénicas de cualquier cepa seleccionada. Sin embargo, estos métodos recombinantes dependen del uso de vectores de expresión que comprenden elementos reguladores de la polimerasa I de ARN (ARN pol I) para conducir la transcripción del ARNr genómico viral. Tales elementos reguladores son necesarios para producir los extremos 5' y 3' definidos del ARN genómico de influenza de tal manera que pueden hacerse virus de influenza completamente infecciosos. Los sistemas recombinantes actuales, tales como aquellos descritos arriba, usan el sistema regulador ARN pol I humano para expresar ARN viral. Debido a la especificidad de especie del promotor ARN pol I, estos elementos reguladores solo son activos en células de humano o primate. De esta manera, el rescate plásmido del virus de influenza ha sido a la fecha posible sólo por transfección de plásmidos apropiados en células de humano o primate. Además, tales células de humano o primate frecuentemente no proporcionan una concentración suficiente de virus de influenza requerida para la manufactura de la vacuna. Al contrario, las células de riñon canino adin-Darby (células MDCK, por sus siglas en inglés) pueden usarse para replicar cepas de vacuna a una concentración suficiente para fabricar vacunas comerciales. De esta manera, la producción de una vacuna de influenza usando rescate plásmido requiere actualmente el uso de al menos dos diferentes cultivos celulares. La identificación y clonación de las secuencias reguladoras de ARN pol OI canino permitiría realizar el rescate plásmido en el mismo cultivo celular como la replicación vírica, lo que elimina la necesidad de un cultivo de rescate separado, como tal, que una necesidad para la identificación y clonación de elementos reguladores de ARN pol I canino que puedan utilizarse para construir vectores apropiados para rescate plásmido en MDCK y otras células caninas. Estas y otras necesidades no cubiertas se proporcionan por la presente invención. La cita o discusión de una referencia en la presente no debería construirse como una admisión de que tal es el arte previo a la presente invención. Además, la cita de una patente no debería construirse como una admisión de su validez.

Breve Descripción de la Invención Se describen en la presente ácidos nucleicos que comprenden elementos reguladores que se pueden usar para expresar, por ejemplo, ARN genómico de la influenza en células caninas. Las composiciones tales como ácidos nucleicos aislados, vectores, y células que comprenden las secuencias caninas reguladoras de la invención, y métodos de uso de los mismos son modalidades de la invención actual. En consecuencia, en determinados aspectos, los ácidos nucleicos aislados de la invención comprenden una secuencia reguladora de polimerasa I de ARN (pol I) canina. En determinadas modalidades, la secuencia reguladora comprende un promotor. En determinadas modalidades, la secuencia reguladora comprende un aumentador. En determinadas modalidades, la secuencia reguladora comprende tanto un promotor como un aumentador. En una modalidad, la secuencia reguladora comprende nucleótidos -250 hasta -1 (en relación al primer nucleótido transcrito desde el promotor, también conocido como el nucleótido +1) del correspondiente promotor nativo o un derivado funcional del mismo. En una modalidad, la secuencia reguladora es ligada operativamente a un ADN viral, por ejemplo, un ADN viral clonado. En una modalidad, el ADN viral clonado codifica el ARN viral de un virus de hebra negativa o positiva o el correspondiente ARNc. En determinadas modalidades, el ADN viral clonado codifica el ARN viral genómico (o el correspondiente ARNc) de un virus de la influenza . En una modalidad, los ácidos nucleicos aislados de la invención comprenden una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino y una secuencia de terminación de la transcripción. En determinadas modalidades, la secuencia de terminación de la transcripción es una secuencia de terminación de polimerasa I de ARN. En una modalidad especifica, la secuencia de terminación de la transcripción es una secuencia de terminación pol I humana, de mono, o canina.

En determinados aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un promotor pol I canino del ARN. Preferiblemente, el promotor pol I canino del ARN es ligado operativamente a un ácido nucleico a transcribirse, tal como, por ejemplo, an ARN genómico de la influenza. En una modalidad, la introducción del ácido nucleico en una célula canina resulta en la transcripción del ARN genómico de la influenza, y, en la presencia de proteínas de influenza adecuadas, el transcrito de ARN puede empacarse en un virus infeccioso de la influenza. En una modalidad, se proporcionan ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia reguladora del ARN canino de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN), en donde la secuencia reguladora es ligada operativamente a un ácido nucleico a transcribirse y, en la presencia de proteínas apropiadas (por ejemplo, un complejo RNP en el caso de un ácido nucleico que codifica un segmento ARNv de influenza) in vitro o in vivo, se transcribe. En una modalidad, el ácido nucleico ligado operativamente a la secuencia reguladora es un segmento ARNv de influenza. En determinadas modalidades, los ácidos nucleicos de la invención comprenden una secuencia de polinucleótidos o un fragmento funcionalmente activo del mismo, por ejemplo, una secuencia reguladora pol I de ARN canina, que enlaza un polipéptido pol I humano, de primate, ratón o canino y es al menos 100% o alrededor de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, ó 65% idéntico a una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28. En una modalidad, la secuencia de polinucleótidos o fragmento funcionalmente activo de la misma mantiene además la capacidad para iniciar la transcripción, en la presencia de polipéptidos apropiados (por ejemplo, polipéptidos pol I humanos, de primate, ratón o caninos), de una segunda secuencia de polinucleótidos ligada operativamente a la secuencia de nucleótido. En una modalidad, "fragmentos funcionalmente activos" de los ácidos nucleicos establecidos en las SEQ ID Nos: 1-28 mantienen una o más actividades funcionales descritas en la presencia de las secuencias de longitud completa de SEQ ID Nos: 1-28. Por ejemplo, fragmentos funcionalmente activos de la secuencia reguladora establecida como SEQ ID NO:l se proporcionan, por ello el fragmento de secuencia reguladora se liga operativamente a un ácido nucleico a transcribirse y, en la presencia de proteínas apropiadas in vitro o in vivo, se transcribe. En determinadas modalidades, los ácidos nucleicos de la invención comprenden una secuencia de polinucleótidos o un fragmento de la misma, por ejemplo, a secuencia reguladora pol I de ARN canina, que enlaza un polipéptido pol I humano, de primate, ratón o canino y/o es 100% o al menos o alrededor de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, ó 65% idéntico a una o más secuencias de nucleótidos seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28. En una modalidad, la secuencia de polinucleótidos o fragmento de la misma mantiene además la capacidad para iniciar la transcripción, en la presencia de polipéptidos apropiados (por ejemplo, polipéptido pol I humano, de primate, ratón o caninos), de una segunda secuencia de polinucleótidos ligada operativamente a la secuencia de nucleótido. En otras modalidades, los ácidos nucleicos aislados de la invención comprenden una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino y una secuencia de ribozima. Esta puede ser, por ejemplo, la secuencia de ribozima genómica del virus de hepatitis delta o un derivado funcional de la misma. En una modalidad, los ácidos nucleicos de la invención codifican ARN viral genómico de cualquier virus de ARN de hebra negativa conocido por alguien de experiencia en el arte sin limitación. En determinadas modalidades, el ARN viral codifica ARN viral genómico de un virus del orden ononegavirales . En determinadas modalidades, el ARN viral codifica ARN viral genómico de un virus de la familia Paramyxoviridae , Pneumovirinae , Rhabdoviridae, Filoviridae, BoARNviridae , Orthomyxoviridae , Bunyaviridae , o Arenaviridae . En determinadas modalidades, the ARN viral codifica ARN viral genómico de un virus del género Respirovirus , virus Morbilli, Rubulavirus, Henipavirus, Avulavirus, Pneumovirus, Metapneumovirus , Vesiculovirus , Lisavirus, Efemerovirus , Citorhabdovirus , Nucleorhabdovirus, Novirhabdovirus , Marburgvirus , Ebolavirus, BoARNvirus, Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Thogotovirus , Isavirus, Ortobuniavirus , Hantavirus, Nairovirus, Flebovirus, Tospovirus, Arenavirus, Ofiovirus, Tenuivirus, o Deltavirus. En determinadas modalidades, el ARN viral codifica ARN viral genómico de un virus seleccionado del grupo que consiste de virus Sendai, virus de sarampión, virus de paperas, virus Hendra, virus de enfermedad de Newcastle, virus sincitial respiratorio humano, pneumovirus de aves, virus de estomatitis de Indiana vesicular, virus de rabia, virus de fiebre efímera de bovino, virus Amarillo necrótico de lechuga, virus de enanismo Amarillo de la papa, virus de necrosis hematopoyético infeccioso, marburgvirus del lago Victoria, virus de ébola de Zaire, virus de enfermedad de BoARN, Virus A de la influenza, Virus B de la influenza, virus C de la influenza, virus de Thogoto, virus de anemia del salmón infeccioso, virus de Bunyamwera, virus de Hantaan, virus de Dugbe, virus de la fiebre del valle Rift, virus de marchitado manchado del tomate, virus de coriomeningitis linfocítica, virus de psorosis de cítricos, virus de rayas de arroz, y virus de Hepatitis delta. En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. En determinadas modalidades, el vector es un vector de expresión. En determinadas modalidades, el vector comprende un origen de replicación bacteriano. En determinadas modalidades, el vector comprende un origen de replicación eucariótico. En determinadas modalidades, el vector comprende un marcador de selección que puede seleccionarse en una célula procariótica. En determinadas modalidades, el vector comprende un marcador de selección que puede seleccionarse en una célula eucariótica. En determinadas modalidades, el vector comprende un sitio de clonación múltiple. En determinadas modalidades, el sitio de clonación múltiple se orienta con relación a la secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino para permitir la transcripción de secuencia de polinucleótido introducida en el sitio de clonación múltiple de la secuencia reguladora. En determinadas modalidades, el vector comprende una secuencia de polinucleótidos que puede expresarse en células caninas, por ejemplo, en células MDCK. En una modalidad, la invención proporciona vectores de expresión útiles para rescatar recombinantemente un virus del cultivo celular, por ejemplo, cultivos celulares MDCK. Generalmente, los vectores son útiles para rescatar cualquier virus conocido por alguien experto en la técnica para producción requerida de ARN con extremos definidos durante su ciclo de vida. Tales virus incluyen, pero no se limitan a, virus de ARN de hebra sentido negativos, tales como aquellos descritos arriba. Preferiblemente, el virus es un virus de la influenza, por ejemplo, un virus de influenza A, influenza B, o influenza C.

En determinadas modalidades, uno o más de los vectores de la invención comprende además una secuencia de terminación de transcripción de ARN. En determinadas modalidades, la secuencia de terminación de transcripción es seleccionada del grupo que consiste de secuencia de terminación de transcripción de polimerasa I de ARN, secuencia de terminación de transcripción de polimerasa II de ARN, secuencia de terminación de transcripción de polimerasa III de ARN, y una ribozima . En determinadas modalidades, los vectores de expresión son vectores de expresión unidireccionales. En otras modalidades, los vectores de expresión son vectores de expresión bidireccionales . En algunas modalidades, los vectores de expresión bidireccionales de la invención incorporan un primer promotor insertado entre un segundo promotor y un sitio de poliadenilación, por ejemplo, un sitio de poliadenilación SV40. En determinadas modalidades, el primer promotor es un promotor pol I canino del ARN. En determinadas modalidades, el segundo promotor es un promotor pol I canino del ARN. En una modalidad, el primer promotor y el segundo promotor pueden situarse en orientaciones opuestas que flanquean al menos un sitio de clonación. En determinadas modalidades, los vectores de expresión comprenden una secuencia de ribozima o secuencia de terminación de transcripción 3' de al menos un sitio de clonación con relación al promotor pol I canino del ARN. En determinadas modalidades, los vectores de expresión comprenden a secuencia de ribozima o secuencia de terminación de transcripción 3' de al menos un sitio de clonación con relación al promotor pol I canino del ARN de tal manera que el ARNv puede sintetizarse intracelularmente con extremos 5' y 3' exactos . En una modalidad, en los vectores de expresión bidireccionales de la invención, un gen o ADNc se localiza entre un promotor pol II 5' y una secuencia reguladora pol I canina 3' (por ejemplo, un promotor pol I) de la invención. La transcripción del gen o ADNc del promotor pol II produce ARNm viral de sentido positivo tapado y la transcripción de la secuencia reguladora pol I canina produce ARNv no tapado, de sentido negativo. AlteARNtivamente , en un sistema vector unidireccional de la invención, el gen o ADNc se localiza 3' del promotor pol I y pol II. El promotor pol II produce ARNm viral de sentido positivo tapado y el promotor pol I produce ARNc viral de sentido positivo no tapado. En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o diecisiete vectores, en donde los vectores comprenden uno o más ácidos nucleicos de la invención (por ejemplo, una secuencia reguladora pol I canina de la invención) ligada operativamente a ADNc viral, por ejemplo, influenza ADNc viral. En determinadas modalidades, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, o más e doce de los vectores de la invención se presentan en un plásmido sencillo. En determinadas modalidades, al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce de los vectores se presentan en un plásmido separado. En determinadas modalidades, cada vector es un plásmido separado. En determinadas modalidades, los vectores de la invención son de expresión bidireccional . Un vector de expresión bidireccional de la invención típicamente incluye un primer promotor y un segundo promotor, en donde el primero y segundo promotores se ligan operativamente a hebras alteARNtivas del mismo ADNc de hebra doble que codifica el ácido nucleico viral incluye un segmento del genoma del virus de influenza. Generalmente, al menos uno de estos promotores es un promotor pol I canino del ARN. Opcionalmente, el vector de expresión bidireccional puede incluir una señal de poliadenilación y/o una secuencia de terminación. Por ejemplo, la señal de poliadenilación y/o la secuencia de terminación puede localizarse flanqueando un segmento del genoma del virus de influenza interno a los dos promotores. Una señal de poliadenilación favorable es una señal de poliadenilación SV40. En una modalidad, la invención comprende un sistema de expresión basado en plásmido bidireccional y un sistema de expresión basado en plásmido unidireccional, en donde el ADNc viral es insertado entre una secuencia reguladora pol I canina (por ejemplo, un promotor pol I) de la invención y secuencias de terminación (unidad de transcripción inteARN) . Esta unidad de transcripción inteARN se flanquea por un promotor de polimerasa II (pol II) de ARN y un sitio de poliadenilación (unidad de transcripción exterior) . En el sistema unidireccional, los promotores pol I y pol II están 5' del ADNc y produce ARNc no tapado de sentido positivo (del promotor pol I) y ARNm tapado de sentido positivo (del promotor pol II). El promotor pol I, secuencia de terminación pol I, promotor pol II y señal de poliadenilación en el sistema unidireccional puede referirse a como que comprende una "orientación 5' a 3'". En el sistema bidireccional, los promotores pol I y pol II están en lados opuestos del ADNc en donde un promotor pol II 5' produce ARNm tapado de sentido positivo y un promotor pol I 3' produce ARN viral no tapado de sentido negativo (ARNv) . Estos sistemas pol I-pol II comienzan con el inicio de la transcripción de las dos enzimas de polimerasa de ARN celular de sus propios promotores, presumiblemente en compartimientos diferentes de los núcleos. El promotor pol I y la secuencia de terminación pol I en el sistema bidireccional pueden referirse como que comprende una "orientación 3' a 5'" mientras que el promotor pol II y la señal de poliadenilación en el sistema bidireccional pueden réferirse como que comprende una "orientación corriente arriba a corriente abajo." En otros aspectos, la invención descrita en la presente incluye composiciones que comprenden un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que se transcribe por la polimerasa I de ARN canina. En determinadas modalidades, el polinucleótido produce un ARNv o ARNc de influenza. En determinadas modalidades, la composición comprende una pluralidad de vectores de expresión que cada uno comprende una secuencia de polinucleótidos que se transcribe por polimerasa I de ARN canina. En determinadas modalidades, los polinucleótidos producen una pluralidad de ARNvA o ARNc de influenza. En determinadas modalidades, los polinucleótidos producen los ocho ARNvA o ARNcA de influenza. En otros aspectos, la invención descrita en la presente incluye composiciones que comprende una pluralidad de vectores de expresión de la invención que, cuando se introducen en una célula canina en la ausencia/presencia de un virus auxiliar, resulta en la producción de un genoma de influenza. En determinadas modalidades, las composiciones de la invención comprende una pluralidad de vectores de expresión que, cuando se introducen en una célula canina en la ausencia/presencia de un virus auxiliar, resulta en la producción de un virus infeccioso de la influenza. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza sensible al frió. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza atenuado. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza sensible a la temperatura. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza que se adapta al frío. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza que se adapta al frío, sensible a la temperatura, atenuado. En determinadas modalidades, las composiciones de la invención comprenden un vector que comprende, desde 5' hasta 3' , un promotor ligado operativamente a secuencias del virus de influenza no codificadas 5' ligadas a ADNc ligado a secuencias del virus de influenza no codificadas 3' ligadas a una secuencia de terminación de transcripción. En determinadas modalidades, uno o más de los ADNc en los vectores está en la orientación sentido. En determinadas modalidades, uno o más de los ADNc en los vectores está en la orientación anti-sentido .

En determinadas modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden una pluralidad de vectores, en donde la pluralidad de vectores comprende un vector que comprende una secuencia canina reguladora de la invención ligada operativamente a un ADNc de proteina ácida (PA) de polimerasa de virus de influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende una secuencia canina reguladora ligada operativamente a un ADNc de proteina 1 básica (PB1) de polimerasa de virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende una secuencia canina reguladora ligada operativamente a un ADNc de proteina 2 básica (PB2) de polimerasa del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende una secuencia canina reguladora ligada operativamente a un ADNc de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende una secuencia canina reguladora ligada operativamente a un ADNc de nucleoproteina (NP) del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende una secuencia canina reguladora ligada operativamente a un ADNc de neuraminidasa (NA) del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, un vector que comprende una secuencia canina reguladora ligada operativamente a un ADNc de proteina de matriz del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción, y un vector que comprende una secuencia canina reguladora ligada operativamente a un ADNc NS del virus de la influenza ligado a una secuencia de terminación de transcripción. En determinadas modalidades, la composición comprende además uno o más vectores de expresión que expresan un ARNm que codifican uno o más polipéptidos de influenza seleccionados del grupo que consiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, proteina 1 de matriz (MI), proteina 2 de matriz (M2), y proteínas 1 y 2 no estructurales (NS1 y NS2). En una modalidad, la composición, cuando se introduce en una célula canina, resulta en la producción de virus infeccioso de la influenza. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza sensible al frío. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza atenuado. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza sensible a la temperatura. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza que se adapta al frío. En determinadas modalidades, el virus infeccioso de la influenza es un virus de influenza que se adapta al frío, sensible a la temperatura, atenuado. En determinadas modalidades, la invención proporciona una composición que genera virus infecciosos de la influenza del ADN viral clonado, que comprende un conjunto de plásmidos en donde cada plásmido comprende ADNc que codifica al menos un segmento genómico viral, y en donde el ADNc viral correspondiente al segmento genómico viral es insertado entre una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino de la invención y un elemento regulador (por ejemplo, una secuencia de terminación pol I canina) para la síntesis de ARNv o ARNc con un extremo 3' exacto, que resulta en la expresión de ARNv o ARNc. En determinadas modalidades, la invención proporciona una composición que genera virus infecciosos de la influenza de un ADN viral clonado, que comprende un conjunto de plásmidos en donde cada plásmido comprende ADNc que codifica al menos un segmento genómico viral, y en donde ADNc viral correspondiente al segmento genómico viral es insertado entre una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino de la invención y un elemento regulador (por ejemplo, una secuencia de terminación pol I canina) para la síntesis de ARNv o ARNc con un extremo 3' exacto, que resulta en la expresión de ARNv o ARNc, en donde la secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino, ADNc viral, y un elemento regulador para la síntesis de ARNv o ARNc con un extremo 3' exacto son de nuevo insertados entre un promotor de polimerasa II (pol II) de ARN y una señal de poliadenilación, que resulta en la expresión de ARNm viral y una proteína vírica correspondiente, en donde la expresión del conjunto completo de ARNv o ARNc y las proteínas virales resulta en el ensamble de un virus infeccioso de la influenza. En determinadas modalidades, el elemento regulador para la síntesis de ARNv o ARNc con un extremo 3' exacto es una secuencia de terminación de polimerasa I (pol I) de ARN. Como alguien experto en la técnica está conciente, la replicación y transcripción eficiente de ARNv de influenza requiere secuencias muy especificas en los extremos 5' y 3' del ARNv. El técnico experto puede usar una secuencia de terminación de polimerasa I (pol I) de ARN para asegurar que la secuencia del extremo 3' del transcrito de ARN hecho se define para ser el extreme exacto deseado para replicación y/o transcripción eficiente de este ARN genómico. En determinadas modalidades, el elemento regulador para la síntesis de ARNv o ARNc con un extremo 3' exacto es una secuencia de ribozima. En determinadas modalidades, el promotor pol I está próximo a la señal de poliadenilación y la secuencia de terminación pol I está próxima al promotor pol II. En determinadas modalidades, el promotor pol I está próximo al promotor pol II y la secuencia de terminación pol I está próxima a la señal de poliadenilación. En determinadas modalidades, el virus de la influenza es un virus A de la influenza. En determinadas modalidades, el virus de la influenza es un virus B de la influenza. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un ARN genómico de la influenza, que comprende transcribir un ácido nucleico de la invención, por ello produciendo un ARN genómico de la influenza. En determinadas modalidades, el ARN genómico de la influenza se transcribe en un sistema libre de célula. En determinadas modalidades, el ARN genómico de la influenza se transcribe en una célula canina, por ejemplo, una célula MDCK. En una modalidad, los métodos comprenden transcribir una pluralidad de ácidos nucleicos de la invención, por ello produciendo una pluralidad de moléculas de ARN, por ejemplo, una pluralidad de ARN genómico de la influenza. En determinadas modalidades, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho ARN genómicos de la influenza se transcriben. En determinadas modalidades, un conjunto completo de ARN genómicos de la influenza se transcribe. En determinadas modalidades, el ARN genómico de la influenza, cuando se transcribe en una célula canina, por ejemplo, una célula MDCK, en la presencia de PA, PB1, PB2, y NP, expresan una proteina de influenza. En determinadas modalidades, la proteina de influenza es seleccionada del grupo que consiste de PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MI, M2 , NS1, y NS2. En determinadas modalidades, el conjunto completo de ARN genómicos de la influenza, cuando se transcribe en una célula canina, por ejemplo, una célula MDCK, en la presencia de PA, PB1, PB2, y NP, expresa un virus infeccioso de la influenza. En determinadas modalidades, los métodos comprenden introducir PA, PB1, PB2, y NP junto con ARN genómico de la influenza. En determinadas modalidades, PA, PB1, PB2, y NP se proporcionan por un virus auxiliar. En determinadas modalidades, el conjunto completo de ARN genómico de la influenza es de un virus de influenza atenuado, sensible a la temperatura, adaptado al frío. En una modalidad, se proporciona un método de transcribir un segmento de ARNc de un virus de la influenza, el método comprende las etapas de 1) poner en contacto un polinucleótido que comprende un ácido nucleico (o fragmento activo del mismo) seleccionado del grupo que consiste de: Nos: 1-28 con una o más proteínas de influenza PB1, PB2, NP, y PA, en donde el ácido nucleico se liga operativamente a una molécula de ADNc que codifica el segmento ARNv; y 2) aislar un segmento de ARNv transcrito. En una modalidad específica, el virus auxiliar se usa en el método. En un aspecto, la invención proporciona un método para producir virus recombinantes infecciosos recombinantes que comprende un genoma de ARN segmentado (por ejemplo, un virus infeccioso de la influenza) , que comprende las etapas de cultivar células hospederas caninas, por ejemplo, células MDCK, que comprende uno o más vectores de expresión de la invención que comprenden ADNc viral correspondiente a cada gen en el genoma viral y uno o más vectores de expresión que expresan ARNm viral que codifican uno o más polipéptidos virales; y aislar una población del virus infeccioso. En una modalidad, la población del virus infeccioso es una población del virus de la influenza. En una modalidad, el método comprende además la etapa de introducir uno o más vectores de expresión en las células hospederas caninas antes de la etapa de cultivar. En una modalidad, el método comprende además la etapa de hacer uno o más vectores de expresión antes de la etapa de introducir. En una modalidad, se proporciona un método de producir virus recombinantes infecciosos que comprenden un genoma de ARN segmentado (por ejemplo, un virus infeccioso de la influenza) en donde el método comprende las etapas de: a) insertar en uno o más vectores de expresión de la invención ADNc viral correspondiente a cada gen en el genoma viral; (b) introducir (por ejemplo, por electroporación ) los vectores de expresión y uno o más vectores de expresión que expresan ARNm viral que codifica uno o más polipéptidos virales en una célula hospedera (por ejemplo, una célula canina) o una población de células hospederas; (c) incubar las células hospederas; y d) , aislar una población del virus infeccioso. En una modalidad, el virus infeccioso recombinante es influenza. En determinadas modalidades, el virus de la influenza es virus de influenza atenuado, sensible a la temperatura, adaptado al frío. En una modalidad, se proporciona un método de producir un virus infeccioso recombinante que comprende un genoma de ARN segmentado (por ejemplo, un virus infeccioso de la influenza) en donde el método comprende las etapas de: a) insertar en uno o más vectores de expresión de la invención un ADNc viral correspondiente a cada gen en el genoma viral; (b) introducir (por ejemplo, por electroporación) los vectores de expresión en una célula hospedera (por ejemplo, una célula canina) o una población de células hospederas; (c) incubar las células hospederas; y d) , aislar una población del virus infeccioso. En una modalidad, el virus infeccioso recombinante es influenza. En determinadas modalidades, el virus de la influenza es un virus de influenza atenuado, sensible a la temperatura, adaptado al frío. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para generar virus de influenza recombinante infeccioso en células hospederas usando vectores de expresión de la invención para expresar los segmentos ARNv o ARNc correspondientes y proteínas del virus de la influenza, en particular PB1, PB2, PA y NA. De acuerdo con esta modalidad, el virus auxiliar puede o no usarse para generar los virus recombinantes de la influenza infecciosos. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir un virus de influenza recombinante, que comprende cultivar células caninas que comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino ligada operativamente a uno o más ADNc que codifica cada ARN genómico de la influenza y uno o más vectores de expresión que expresan ARNm viral que codifica uno o más polipéptidos de influenza: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MI, M2 , NS1 y NS2; y aislar el virus de influenza recombinante de las células. En determinadas modalidades, los métodos comprenden introducir en vectores de expresión de células caninas que dirigen la expresión en las células de segmentos de ARN viral genómicos o antigenómicos , una nucleoproteina , y una polimerasa dependiente de ARN, de manera que los complejos de ribonucleoproteina pueden formarse y las partículas virales se pueden ensamblar en ausencia de un virus auxiliar; y (b) cultivar las células en donde las partículas virales se empacan y rescatan. En determinadas modalidades, el virus de hebra negativa recombinante es un virus no segmentado. En determinadas modalidades, el virus de ARN de hebra negativa recombinante es un virus segmentado. En determinadas modalidades, el virus de ARN de hebra negativa es un virus de la influenza. En determinadas modalidades, los métodos comprenden introducir vectores de expresión de células caninas cultivadas que dirige la expresión de los segmentos de ARN genómico o antigenómico de un virus de ARN de hebra negativa segmentado, una nucleoproteina, y una polimerasa dependiente de ARN bajo condiciones que permiten la formación de complejos RNP que contienen los segmentos de ARN genómico de los virus y el ensamble de partículas virales en ausencia del virus auxiliar; y cultivar las células en donde las partículas virales se producen. En determinadas modalidades, los vectores de expresión dirigen la expresión de segmentos de ARN genómico del virus. En determinadas modalidades, las células caninas usadas en los métodos de la invención comprenden uno o más vectores de expresión que expresan una o más proteínas seleccionadas de la nucleoproteína y las subunidades de la polimerasa de ARN dependiente de ARN. En determinadas modalidades, los vectores de expresión dirigen la expresión de uno o más de la nucleoproteína y las subunidades de la polimerasa de ARN dependiente de ARN. En determinadas modalidades, la expresión de una o más proteínas virales de los vectores de expresión es bajo el control de la secuencia reguladora seleccionada del promotor tardío principal de adenovirus 2 ligado a la secuencia líder tripartita empalmada de adenovirus tipo 2 humano o el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano, o un derivado funcional de la secuencia reguladora. En determinadas modalidades, el virus es un virus de la influenza del tipo A, B o C. En determinadas modalidades, el virus es un virus reagrupado que tiene segmentos de ARNv derivados de más de un virus precursor. En determinadas modalidades, los métodos de la invención comprenden introducir una pluralidad de vectores de la invención, cada uno de los cuales incorpora una porción de un virus de la influenza en una población de células hospederas capaces de soportar replicación vírica. Las células hospederas pueden cultivarse bajo condiciones que permiten el crecimiento viral, y pueden recuperarse virus de influenza. En algunas modalidades, los virus de la influenza son virus atenuados, virus que se adaptan al frío y/o virus sensibles a la temperatura. Por ejemplo, en determinadas modalidades, los virus de la influenza recombinantes derivados del vector pueden ser virus atenuados, adaptados al frío, sensibles a la temperatura, de tal manera que son apropiados para la administración como una vacuna aligerada viva, por ejemplo, en una formulación de vacuna intranasal. En una modalidad ejemplar, los virus se producen al introducir una pluralidad de vectores que incorporan todo o parte de un genoma de virus influenza B/Ann Arbor/1/66, por ejemplo, un genoma de virus ca B/Ann Arbor/1/66. En algunas modalidades, una pluralidad de vectores que comprende ADNc que codifica al menos los 6 segmentos de genoma interno (por ejemplo, segmentos de genoma que codifican todas las proteínas de influenza excepto para HA y NA) de una cepa de influenza y ADNc que codifica uno o más segmentos de genoma (por ejemplo, segmentos de ARNv HA y NA) de una cepa de influenza diferente pueden introducirse en una población de células hospederas. Por ejemplo, al menos los 6 segmentos de genoma interno ("la columna") de una cepa de influenza A o B aligerada, sensible a la temperatura y/o adaptada al frío, por ejemplo, una cepa ca, att, ts de B/ Ann Arbor/1/66 o una cepa de influenza A o B ca, att, ts producida por ingeniería artificialmente, puede introducirse en una población de células hospederas junto con uno o más segmentos que codifican antígenos inmunogénicos derivados de otra cepa de virus. Típicamente los antígenos de superficie inmunogénicos incluyen cualquiera o ambos de los antígenos de hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA) . En modalidades donde se introduce un segmento sencillo que codifica un antígeno de superficie inmunogénico, los 7 segmentos complementarios del virus seleccionado también se introducen en las células hospederas.

En determinadas modalidades, los vectores de expresión se transfectan en las células por electroporación . En determinadas modalidades, los vectores de expresión se introducen dentro de las células por transfección dentro de las células en la presencia de un reactivo de transfección liposomal o por medio de precipitación de fosfato de calcio. En determinadas modalidades, los vectores de expresión son plásmidos . En determinadas modalidades, los vectores de expresión comprenden un vector de expresión separado para expresión de cada segmento de ARN genómico del virus o los correspondientes ARN de codificación. En determinadas modalidades, la expresión de cada segmento de ARN genómico o ARN de codificación es bajo el control de una secuencia promotora derivada de un promotor Pol I canino como se describe en la presente. En determinadas modalidades, una pluralidad de vectores plásmidos que incorpora segmentos del genoma del virus de influenza se introducen en una población de células hospederas. Por ejemplo, en determinadas modalidades, 8 plásmidos, cada uno de los cuales incorpora un segmento de genoma diferente puede utilizarse para introducir un genoma de influenza competo en las células hospederas. AlteARNtivamente , puede emplearse un número más grande de plásmidos, que incorporan subsecuencias genómicas más pequeñas. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para generar en partículas virales infecciosas de células cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa segmentado que tiene más de 3 segmentos de ARNv genómicos, por ejemplo un virus de la influenza tal como un virus A de la influenza, el método comprende: (a) introducir en una población de células capaz de soportar el crecimiento del virus un primer conjunto de vectores de expresión capaz de expresarse en las células de segmentos de ARNv genómico para proporcionar los segmentos de ARNv genómico completos del virus; (b) introducir en las células un segundo conjunto de vectores de expresión capaz de expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por ello se producen las partículas virales. En determinadas modalidades, las células son células caninas. En determinadas modalidades, las células son células MDCK. En determinadas modalidades, el virus es virus B de la influenza. En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión está contenido en los plásmidos 1-8. En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión está contenido en un plásmido. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión está contenido en los plásmidos 1-8. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión está contenido en un plásmido. En determinadas modalidades, el primero, segundo, o ambos conjuntos de vectores de expresión se introducen por electroporación . En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión codifica el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el primer conjunto o segundo conjunto de vectores de expresión (o ambos conjuntos) comprenden un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia canina reguladora de la invención (por ejemplo, pol I canino) . En determinadas modalidades, el primer conjunto o segundo conjunto de vectores de expresión (o ambos conjuntos) codifican un ARNv o ARNm del segundo virus. Por ejemplo, un conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifican el HA y/o NA ARNm y/o ARNv de un segundo virus de influenza. La presente invención también proporciona un método para generar en células cultivadas partículas virales infecciosas de un virus de ARN de hebra negativa segmentado que tiene más de 3 segmentos de ARNv genómicos, por ejemplo un virus de la influenza tal como un virus A de la influenza, el método comprende: (a) introducir en una población de células capaz de soportar el crecimiento del virus un conjunto de vectores de expresión capaz de tanto expresarse en los segmentos de ARNv genómicos de células para proporcionar los segmentos de ARNv genómicos completos del virus como ser capaz de expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; (b) cultivar las células por ello se producen las partículas virales. En determinadas modalidades, las células son células caninas. En determinadas modalidades, las células son células MDCK. En determinadas modalidades, el virus es virus B de la influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión está contenido en los plásmidos 1-17. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión está contenido en los plásmidos 1-8. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión está contenido en los plásmidos 1-3. En determinadas modalidades, los conjuntos de vectores de expresión se introducen por electroporación . En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza y el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión comprende un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia canina reguladora de la invención (por ejemplo, pol I canino) . En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica un ARNv o ARNm del segundo virus. Por ejemplo, el conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifica el HA y/o NA ARNm y/o ARNv de un segundo virus de influenza. En determinadas modalidades, el primer conjunto o segundo conjunto de vectores de expresión (o ambos conjuntos) codifican un ARNv o ARNm del segundo virus. Por ejemplo, un conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifica el HA y/o NA ARNm y/o ARNv de un segundo virus de influenza. En determinadas modalidades, los métodos comprenden además amplificar partículas virales producidas por las células caninas por una o más etapas de infección celular adicional que emplean células que son la misma o diferente de células caninas. En determinadas modalidades, los métodos comprenden además aislar partículas virales infecciosas. En determinadas modalidades, los métodos comprenden además una etapa de atenuado o eliminación vírica. En determinadas modalidades, los métodos comprenden además incorporar partículas víricas aligeradas o eliminadas en la composición de vacuna. En una modalidad, los métodos para producir virus de la invención resultan en concentraciones de virus (24 horas, o 36, o 48 horas, o 3 días, o 4 días después de introducir vectores de la invención en células hospederas) de al menos 0.1 x 10 PFU/ml, o al menos 0.5 x 10 PFU/ml, o al menos 1.0 x 103 PFU/ml, o al menos 2 x 103 PFU/ml, o al menos 3 x 103 PFU/ml, o al menos 4 x 103 PFU/ml, o al menos 5 x 103 PFU/ml, o al menos 6 x 103 PFU/ml, o al menos 7 x 103 PFU/ml, o al menos 8 x 103 PFU/ml, o al menos 9 x 103 PFU/ml, o al menos 1 x 104 PFU/ml, o al menos 5 x 104 PFU/ml, o al menos 1 x 105 PFU/ml, o al menos 5 x 105 PFU/ml, o al menos 1 x 106 PFU/ml, 0 al menos 5 x 106 PFU/ml, o al menos 1 x 107 PFU/ml, o en el intervalo de 0.1-1 x 103 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 103- 1 x 104 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 104-lx 105 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 105-1 x 106 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 106-1 x 107 PFU/ml, o mayor a 1 x 107 PFU/ml. En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para rescatar virus, en donde la concentración de los virus rescatados a 24 hasta 36 horas o 2-3 días es al menos 0.1 x 103 PFU/ml, o al menos 0.5 x 103 PFU/ml, o al menos 1.0 x 103 PFU/ml, o al menos 2 x 103 PFU/ml, o al menos 3 x 103 PFU/ml, 0 al menos 4 x 103 PFU/ml, o al menos 5 x 103 PFU/ml, o al menos 6 x 103 PFU/ml, o al menos 7 x 103 PFU/ml, o al menos 8 x 103 PFU/ml, o al menos 9 x 103 PFU/ml, o al menos 1 x 104 PFU/ml, o al menos 5 x 104 PFU/ml, o al menos 1 x 105 PFU/ml, o al menos 5 x 105 PFU/ml, o al menos 1 x 106 PFU/ml, o al menos 5 x 106 PFU/ml, o al menos 1 x 107 PFU/ml o en el intervalo de 0.1-1 x 103 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 103- 1 x 104 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 10 -lx 105 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 105-1 x 106 PFU/ml, o en el intervalo de 1 x 106-1 x 107 PFU/ml, o mayor a 1 x 107 PFU/ml. En algunas modalidades, los virus de la influenza corresponden a un virus B de la influenza. En algunas modalidades, los virus de la influenza corresponden a un virus A de la influenza. En determinadas modalidades, los métodos incluyen recuperar virus de la influenza recombinantes y/o reagrupados capaces de producir una respuesta inmune durante la administración, por ejemplo, administración intranasal, a un sujeto. En algunas modalidades, los virus se inactivan previo a la administración, en otras modalidades, los virus atenuados vivos se administran. Los virus A de la influenza y virus B de la influenza recombinantes y reagrupados producidos de acuerdo a los métodos de la invención también son una característica de la invención. En determinadas modalidades, los virus incluyen un virus de la influenza atenuado, un virus de la influenza adaptada al frío, un virus de la influenza sensible a la temperatura, o un virus con cualquier combinación de estas propiedades deseables. En una modalidad, el virus de la influenza incorpora un virus de la cepa B/ Ann Arbor/1/66 de la influenza, por ejemplo, una cepa atenuada, sensible a la temperatura, adaptada al frío de B/ Ann Arbor/1/66. En otra modalidad, el virus de la influenza incorpora un virus de la cepa A/ Ann Arbor/6/60 de la influenza, por ejemplo, una cepa atenuada, sensible a la temperatura, adaptada al frío de A/ Ann Arbor/6/60. Opcionalmente, los virus reagrupados se producen al introducir vectores que codifican los seis ARNv internos de una cepa vírica seleccionada por sus propiedades favorables con respecto a la producción de vacunas, en combinación con los vectores que codifican los segmentos ARNv de los antígenos de superficie (HA y NA) de un seleccionado, por ejemplo, cepa patogénica. Por ejemplo, el segmento HA puede seleccionarse favorablemente de una cepa Hl, H3 o B patogénicamente relevante, como se realiza rutinariamente para la producción de vacunas. Similarmente , el segmento HA puede seleccionarse de una cepa patogénica emergente tal como una cepa H2 (por ejemplo, H2N2), una cepa H5 (por ejemplo, H5N1) o una cepa H7 (por ejemplo, H7N7). AlteARNtivamente, los siete segmentos del gen complementario de la primera cepa se introducen en combinación con ya sea el segmento que codifica HA o NA. En determinadas modalidades, los segmentos del gen interno se derivan de la cepa B/Ann Arbor/1/66 o la cepa A/ Ann Arbor/6/60 de la influenza. Además, un virus de la influenza puede producirse (por ejemplo, un H5N1, H9N2, H7N7, o HxNy (donde x=l-9 e y =1-15) que comprende un gen HA modificado. Por ejemplo, el gen HA puede modificarse por eliminación del sitio de desdoblamiento polibásico. En otro aspecto, la invención proporciona una célula hospedera que comprende un ácido nucleico o vector de expresión de la invención. En determinadas modalidades, la célula es una célula canina. En determinadas modalidades, la célula canina es una célula de riñon. En determinadas modalidades, la célula de riñon canina es una célula MDCK. En otras modalidades, la célula es seleccionada del grupo que consiste de células Vero, células Per.C6, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK, células 293 (por ejemplo, células 293T) , y células COS. En algunas modalidades, los co-cultivos de una mezcla de al menos dos de estas lineas celulares, por ejemplo, una combinación de células COS y MDCK o una combinación de células 293T y MDCK, constituyen la población de células hospederas. Las células hospederas que comprenden los vectores de la influenza de la invención pueden hacerse crecer en el cultivo bajo condiciones permisivas para replicación y ensamble de los virus. Típicamente, las células hospederas que incorporan los plásmidos de la influenza pueden cultivarse a una temperatura debajo de 37 °C, preferiblemente a una temperatura igual a, o menor que, 35°C. En determinadas modalidades, las células se cultivan a una temperatura entre 32°C y 35°C. En algunas modalidades, las células se cultivan a una temperatura entre alrededor de 32°C y 34°C, por ejemplo, a alrededor de 33°C. Seguido por el cultivo durante un periodo adecuado de tiempo para permitir la replicación del virus a concentración particular, se pueden recuperar los virus recombinantes . Opcionalmente , los virus recuperados pueden inactivarse. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona un método para procesar por ingeniería un virus de la influenza de manera que su crecimiento se restringe a tipos celulares particulares incluyendo, pero no limitado a, MRC-5, WI-38, FRhL-2, PerC6, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-1, Vero, MDCK, MvlLu, células epiteliales humanas y tipos de célula SF9. En una modalidad, el crecimiento se restringe de manera que un virus de la influenza no puede crecer en una célula primaria humana (por ejemplo, PerC6) . En otra modalidad, el crecimiento se restringe de manera que un virus de la influenza no puede crecer en una célula epitelial humana. Alguien experto en la técnica reconocerá que el fenotipo de restricción de crecimiento puede combinarse con uno o más fenotipos adicionales tales como adaptado al frío, sensible a la temperatura, atenuado, etc. También se reconocerá que una mutación responsable para un fenotipo restringido al crecimiento también puede contribuir y/o ser responsable para fenotipos adicionales tales como aquellos enlistados arriba. En otro aspecto, la invención proporciona métodos novedosos para los virus A de la influenza o virus B de la influenza reagrupados o recombinantes rescatados (es decir, cepas de tipo silvestre y de variante del virus A de la influenza y/o virus de la influenza) de las células MDCK en el cultivo. En determinadas modalidades, una pluralidad de vectores que incorporan un genoma del virus de la influenza aquellos de transcripción se controla por una secuencia canina reguladora de la invención se electropora en una población de células MDCK. Las células pueden hacerse crecer bajo condiciones permisivas para replicación vírica, por ejemplo, en el caso de cepas de virus sensibles a la temperatura, atenuadas, adaptadas al frío, las células MDCK se hacen crecer a una temperatura debajo de 37 °C, preferiblemente a una temperatura igual a, o menor que, 35°C. Típicamente, las células se cultivan a una temperatura entre 32°C y 35°C. En algunas modalidades, las células se cultivan a una temperatura entre alrededor de 32°C y 34°C, por ejemplo, a alrededor de 33°C. Opcionalmente (por ejemplo, para la producción de vacunas), las células MDCK se hacen crecer en medio libre de suero sin ningunos productos derivados de animal. En algunas modalidades de los métodos descritos arriba, los virus de la influenza pueden recuperarse después del cultivo de las células hospederas que incorporan los plásmidos del genoraa de la influenza. En algunas modalidades, los virus recuperados son virus recombinantes . En algunas modalidades, los virus son virus de la influenza reagrupados que tienen contribuciones genéticas de más de una cepa parental de virus. Opcionalmente , los virus reagrupados o recombinantes recuperados se amplifican además al pasar en las células cultivadas o en huevos de gallina. Opcionalmente, los virus recuperados pueden inactivarse. En algunas modalidades, los virus recuperados comprenden una vacuna para la influenza. Por ejemplo, la vacuna para la influenza recuperada puede ser un virus de la influenza reagrupado (por ejemplo, 6:2 o 7:1 virus reagrupados) que tienen un antigeno HA y/o NA derivado de una cepa seleccionada de la influenza A o influenza B. En una modalidad, el antigeno HA o NA se modifica. En diversas modalidades favorables, los virus de la influenza reagrupados tienen un fenotipo atenuado. Opcionalmente, los virus reagrupados son adaptados al frío y/o sensibles a la temperatura, por ejemplo, un virus A o B de la influenza sensible a la temperatura o adaptado al frió. Tales virus de la influenza son útiles, por ejemplo, como vacunas atenuadas vivas para la producción profiláctica de una respuesta inmune especifica para un seleccionado, por ejemplo, cepa de la influenza patogénica. Los virus de la influenza, por ejemplo, virus reagrupado atenuados, producidos de acuerdo a los métodos de la invención son una característica adicional de la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para producir una vacuna para el virus de la influenza recombinante que comprende introducir una pluralidad de vectores que incorporan un genoma del virus de la influenza aquellos de la transcripción se controla por una secuencia canina reguladora de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN) en una población de células hospederas capaces de soportar la replicación del virus de la influenza, cultivar las células hospederas a una temperatura menor que o igual a 35°C, y recuperar un virus de la influenza capaz de producir una respuesta inmune durante la administración a un sujeto. Las vacunas pueden comprender ya sea virus de la cepa A de la influenza o B de la influenza. En algunas modalidades, los virus para la vacuna de la influenza incluyen un virus de la influenza atenuado, un virus de la influenza adaptado al frío, o un virus de la influenza sensible a la temperatura. En determinadas modalidades, los virus poseen una combinación de estas propiedades deseable. En una modalidad, el virus de la influenza contiene un virus de la cepa A/ Ann Arbor/6/60 de la influenza. En otra modalidad, el virus de la influenza incorpora un virus de la cepa B/ Ann Arbor/ 1/66 de la influenza. AlteARNtivamente, la vacuna incluye artificialmente procesamiento por ingeniería de los virus A de la influenza o virus B de la influenza que incorporan al menos un aminoácido substituido que influencia las propiedades biológicas características de ca A/ Ann Arbor/6/60 o ca/B/Ann Arbor/1/ßß, tales como un aminoácido único de estas cepas. En una modalidad, se proporciona una vacuna que comprende una población de virus recombinantes (o virus derivados de los mismos) producida por los métodos de la invención. En una modalidad específica, la vacuna comprende un virus vivo producido por los métodos. En otra modalidad específica, la vacuna comprende un virus eliminado o inactivado producido por los métodos. En otra modalidad específica, la vacuna comprende una composición inmunogénica preparada de un virus vivo, eliminado o inactivado producido por los métodos. En otra modalidad específica, la vacuna comprende una composición inmunogénica preparada de un virus de la influenza sensible a la temperatura, adaptado al frío, atenuado vivo producido por el método. En otra modalidad específica, la vacuna comprende un virus de la influenza sensible a la temperatura, adaptado al frío, atenuado vivo producido por el método o un virus derivado del mismo.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 presenta curvas de crecimiento de cepa wt y ca B (B/Beijing/243/97) en tanto células PerC6 como MDCK; la concentración del virus para cada punto de tiempo se determinó por el ensayo TCID50. La figura 2 presenta curvas de crecimiento de cepas wt y ca A (A/Sydney/05/97 y A/Beij ing/262 /95 ) en tanto células PerC6 como DCK; la concentración del virus para cada punto de tiempo se determinó por el ensayo TCID50. La figura 3 presenta curvas de crecimiento de cepa wt y ca A (A/ Ann Arbor/6/60) en tanto células PerC6 como MDCK; la concentración del virus para cada punto de tiempo se determinó por el ensayo TCID50. La figura 4 presenta análisis en tiempo real del ARN viral de A/Sydney en células PerC6 y MDCK, usando sondas Taqman® (Roche Molecular Systems; Palo Alto, CA) especificas para el segmento M del ARN viral. La figura 5 presenta curvas de crecimiento de ca A/Vietnam/ 1203/2004 (H5N1) en células MDCK; la concentración del virus para cada punto de tiempo se determinó por el ensayo TCID50. La figura 6 presenta un diagrama que muestra el rescate de cada segmento del gen de la influenza como un reagrupado 7:1 generado por la técnica de rescate de ocho plásmidos. La figura 7 presenta curvas de crecimiento de cada unos de los reagrupados 7:1 en células PerC6; la concentración del virus para cada punto de tiempo se determinó por el ensayo TCID50.

La figura 8 presenta un mapa de restricción de un fragmento Eco RI que comprende a secuencia reguladora pol I de ARN canina. Las figuras 9A, 9B y 9C presentan la secuencia de nucleótidos (SEQ ID N0:1) de un ácido nucleico de aproximadamente 3.5 kB clonado del ADN genómico canino, que codifica al menos una porción del gen de 18s ARNr, empezando en el nucleótido 1809 (+1) en la secuencia presentada. La figura 10 presenta un mapa de pAD3000 plásmido, que puede adaptarse fácilmente para hacer un vector de expresión de la invención. La figura 11 presenta un diagrama de los constructos del promotor MDCK pol I usados en el ensayo de mini-genoma. La figura 12 presenta los resultados de un ensayo de mini-genoma. La señal EGFP generada de los constructos del promotor -1, +1 y +2 MDCK pol I se muestran en los paneles en las parte superior izquierda, media y derecha, respectivamente. Un control de promotor menor muestra solamente la fluorescencia de respaldo (parte izquierda al fondo) . Como un control positivo las células también se transíectaron con un constructo CMV-EGFP (parte derecha al fondo) . La figura 13 presenta la secuencia de pAD4000 del vector de expresión plásmido (SEQ ID NO: 29) que comprende un fragmento 469 bp (bases 1-469 en pAD4000) del subclon MDCK EcoRI-BamHI (bases 1340-1808 de SEQ ID NO:l) . Nota: El fragmento 469 bp se muestra en orientación del complemento inverso y la secuencia de ligadura se subraya y está en negritas. La figura 14 indica las posiciones alineadas en sus pares base de los cebadores usados para conducir las reacciones por RT-PCR en el ARN del virus rescatado. La figura 15 presenta las secuencias de cebadores usados para conducir las reacción es por RT-PCR en el ARN del virus rescatado. Las figuras 16A-16B muestran las secuencias parciales de los segmentos NS y PB1 y las posiciones de las mutaciones en silencio introducidas.

Descripción Detallada de la Invención El rescate de los plásmidos del virus de la influenza generalmente comprende la introducción de vectores de expresión para expresar proteínas virales y transcribir el ARN genómico viral en células hospederas adecuadas. La transcripción del ARN genómico viral se realiza generalmente con una enzima de polimerasa I del ARN, como estas enzimas producen transcriptos con extremos adecuados para uso como genomas virales. De esta manera, los promotores de pol I del ARN y otros elementos reguladores se usan para iniciar la transcripción de los ARN genómicos durante el rescate de plásmidos. Desafortunadamente, los promotores de pol I del ARN son especies altamente especificas. Esto es, el pol I del ARN de una especie puede o no puede enlazarse eficientemente a un promotor pol I del ARN de una especie no relacionada. En consecuencia, la disponibilidad de los promotores de pol I del ARN limita las células en las cuales el rescate de plásmidos puede realizarse. Previo a la presente invención, el rescate de plásmidos no era posible en células caninas. Durante el primer tiempo, el rescate de plásmidos en células caninas es posible con base en la descripción de la presente invención como sigue. En consecuencia, en un primer aspecto, los ácidos nucleicos aislados de la invención que comprenden una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN caninos se ¦ proporcionan. En determinadas modalidades, la secuencia reguladora es un promotor. En una modalidad, la secuencia reguladora es una secuencia promotora de pol I canino. En otra modalidad, la secuencia reguladora es ligada operativamente a un ADN viral clonado. Todavía en otra modalidad, el ADNc viral clonado codifica el ARN viral de un virus de hebra negativa o positiva o el ARNc correspondiente. En una modalidad específica, el ADNc viral clonado codifica el ARN viral genómico (o el ARNc correspondiente) de un virus de la influenza . En una modalidad específica, los ácidos nucleicos aislados de la invención comprenden una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino y una secuencia de terminación de la transcripción. En determinadas modalidades, las secuencias de terminación de la transcripción es una secuencia de terminación pol I. En determinadas modalidades, las secuencias de terminación de la transcripción es una secuencia de terminación pol I humana, de mono, o canina. En determinadas modalidades, ácidos nucleicos de la invención comprenden una secuencia de polinucleótidos o un fragmento funcionalmente activo del mismo, por ejemplo, una secuencia reguladora pol I de ARN canino, que enlaza un polipéptido pol I humano, primates, de ratón o canino y es al menos 100% o alrededor de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, ó 65% idéntico a una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28. En una modalidad, la secuencia de polinucleótidos o fragmento funcionalmente activo del mismo además conserva la capacidad para iniciar la transcripción, en la presencia de polipéptidos adecuados (por ejemplo, polipéptidos pol I humano, primate, de ratón o canino) , de una segunda secuencia de polinucleótidos operativamente ligada a la secuencia de nucleótido. En una modalidad, "fragmentos funcionalmente activos" de los ácidos nucleicos se establecen en SEQ ID Nos: 1-28 conservando una o más actividades funcionales descritas en la presente de las secuencias de longitud completa de SEQ ID Nos: 1-28. Por ejemplo, fragmentos funcionalmente activos de la secuencia reguladora establecidos como SEQ ID NO: 1 se proporcionan si el fragmento de secuencia reguladora se liga operativamente a un ácido nucleico para transcribirse y, en la presencia de proteínas adecuadas in vitro o in vivo, se transcribe. En una modalidad particular, ácidos nucleicos de la invención comprenden una secuencia de polinucleótidos del ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 26. En determinadas modalidades, ácidos nucleicos de la invención comprenden una secuencia de polinucleótidos o un fragmento del mismo, por ejemplo, una secuencia reguladora pol I de ARN canino, que enlaza un polipéptido pol I humano, primates, de ratón o canino y/o es 100% o al menos o alrededor de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, o 65% idéntica a una o más secuencias de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28. En una modalidad, la secuencia de polinucleótidos o fragmento del mismo además conserva la capacidad para iniciar la transcripción, en la presencia de polipéptidos adecuados (por ejemplo, polipéptidos pol I humano, primates, de ratón o canino) , de una segunda secuencia de polinucleótidos operativamente ligada a la secuencia de nucleótido. En determinados aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un promotor pol I canino del ARN. Preferiblemente, el promotor pol I canino del ARN se liga operativamente a un ácido nucleico para transcribirse, tal como, por ejemplo, un ARN genómico de la influenza. La introducción del ácido nucleico en una célula canina resulta en transcripción del ARN genómico de la influenza, y, en la presencia de proteínas de influenza adecuadas, el transcripto de ARN se puede empacar en un virus infeccioso de la influenza. En una modalidad, ácidos nucleicos aislados se proporcionan que comprenden una secuencia reguladora del ARN canino de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN) , en donde la secuencia reguladora se liga operativamente a un ácido nucleico para transcribirse y, en la presencia de proteínas adecuadas in vitro o in vivo, se transcribe. En una modalidad, el ácido nucleico ligado operativamente a la secuencia reguladora es un segmento de ARNv de la influenza. En otro aspecto, la invención proporciona vectores y métodos para producir virus recombinantes de la influenza en cultivo celular canino completamente de ADN viral clonado. Por ejemplo, los virus de la influenza se pueden producir al introducir una pluralidad de vectores que comprenden ADNc clonado que codifica cada segmento de genoma viral bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora del ARN canino (por ejemplo, un promotor pol I canino) de la invención en células hospederas caninas, cultivando las células caninas, y aislando los virus recombinantes de la influenza producidos del cultivo celular. Cuando los vectores que codifican un genoma de virus de la influenza se introducen asi (por ejemplo, por electroporación ) en células caninas, virus recombinantes adecuados como vacunas se pueden recuperar por procedimientos de purificación estándar. Usando el sistema vector y métodos de la invención, virus reclasificados que incorporan los seis segmentos de genes internos de una cepa seleccionada para sus propiedades deseables con respecto a producción de vacunas, y los segmentos HA y NA inmunogénicos de un seleccionado, por ejemplo, cepa patogénica, se puede rápidamente y eficientemente producir en cultivo de tejido. Asi, el sistema y métodos descritos en la presente son útiles para la rápida producción en cultivo celular canino de virus de influenza A y B recombinantes y reclasificados , incluyendo virus adecuados para usar como vacunas, incluyendo vacunas atenuadas vivas. Las vacunas preparadas de acuerdo a métodos de la invención se pueden liberar intranasalmente o intramuscularmente . Típicamente, una cepa de Virus Donador Maestro sencillo (MDV, por sus siglas en inglés) se selecciona para cada uno de los subtipos A y B. En el caso de una vacuna atenuada viva, la cepa de Virus Donador Maestro se elige típicamente para sus propiedades favorables, por ejemplo, sensibilidad a la temperatura, adaptación y/o atenuación fría, relativa a producción de vacunas. Por ejemplo, Cepas de Donador Maestro ejemplar incluyen tales cepas sensibles a la temperatura, atenuadas y adaptadas frías de A/Ann Arbor/6/60 y B/Ann Arbor/1/66, respectivamente. Por ejemplo, un virus tipo A donador maestro seleccionado (MDV-A) , o virus tipo B donador maestro (MDV-B) , se puede producir de una pluralidad de de ADNc virales clonados que constituyen el genoma viral. En una modalidad ejemplar, virus recombinantes se producen de ocho de ADNc virales clonados. Ocho ADNc virales que representan tanto las secuencias MDV-A o MDV-B seleccionadas de PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M y NS se clonan en un vector de expresión, por ejemplo, un vector de expresión bi-direccional tal como un plásmido (por ejemplo, pAD3000 o pAD4000), tal que el ARN genómico viral se puede transcribir de un promotor (pol I) de polimerasa I de ARN canino de una hebra y los ARNm virales se pueden sintetizar de un promotor (pol II) de polimerasa II de ARN de la otra hebra. Opcionalmente , cualquier segmento de gen se puede modificar, incluyendo el segmento HA (por ejemplo, para remover el sitio de desdoblamiento multi-básico) . El virus MDV-A o MDV-B recombinante infeccioso se recupera luego siguiendo la transfección de plásmidos que portan los ocho ADNc virales en células hospederas adecuadas, por ejemplo, células MDCK. Usando los plásmidos y métodos descritos en la presente, la invención es útil, por ejemplo, para generar vacunas de influenza reclasificadas 6:2 por co- transfección de los 6 genes internos (PB1, PB2, PA, NP, M y NS) del virus seleccionado (por ejemplo, MDV-A, MDV-B, PR8 ) junto con el HA y NA derivados de diferentes virus de la influenza tipo (A o B) correspondiente. Por ejemplo, el segmento HA se selecciona favorablemente de una cepa Hl, H3 o B patogénicamente pertinente, como se realiza rutinariamente para la producción de vacunas. Similarmente, el segmento HA se puede seleccionar de una cepa con aplicabilidad emergente como una cepa patogénica tales como una cepa H2 (por ejemplo, H2N2), una cepa H5 (por ejemplo, H5N1) o una cepa H7 (por ejemplo, H7N7). Reclasificados que incorporan siete segmentos de genoma del MDV y ya sea el gen HA o NA de una cepa seleccionada (7:1 reclasificados ) se pueden también producir. Además, este sistema es útil para determinar las bases moleculares de características fenotípicas, por ejemplo, los fenotipos atenuados (att), adaptados en frío (ca), y sensibles a la temperatura (ts) , importantes para producción de vacunas. .1 Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos científicos y técnicos se entiende que tienen el mismo significado como se usa comúnmente en la técnica a la que pertenecen. Para el propósito de la presente invención los siguientes términos se definen abajo. Los términos "ácido nucleico, " "polinucleótido, " "secuencia de polinucleótido" y "secuencia de ácido nucleico" se refiere a polímeros de desoxiribonucleótido o ribonucleótido de hebra sencilla o hebra doble, o quimeras o análogos de los mismos. Como se usa en la presente, el término opcionalmente incluye polímeros de análogos de nucleótidos que se presentan naturalmente que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales en la medida en que hibridiza a ácidos nucleicos de hebra' sencilla en una forma similar a nucleótidos que se presentan naturalmente (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido) . A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular de esta invención abarca secuencias complementarias, además a la secuencia explícitamente indicada. El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica. Así, los genes incluyen secuencias de codificación y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. El término "gen" se aplica a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o un ARNm codificado por la secuencia genómica. Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Secuencias reguladoras no expresadas incluyen "promotores" y "potenciadores , " a cuyas proteínas reguladoras tales como enlace de factores de transcripción, que resultan en transcripción de secuencias adyacentes o cercanas. Un promotor o potenciador "Especifico de tejido" es uno que regula la transcripción en un tipo de tejido especifico o tipo de célula, o tipos. Un "promotor" o "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de iniciar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico al cual esto se enlaza operablemente, cuando las enzimas relacionadas con transcripción adecuada, por ejemplo, polimerasa de ARN, se presentan bajo condiciones, por ejemplo, condiciones de cultivo o fisiológicas, que las enzimas son funcionales. Un promotor se puede presentar corriente arriba o corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico cuya transcripción se inicia. Una secuencia promotora la cual se localiza corriente arriba de un ADNc se enlaza a su terminal 3' por un sitio de inicio de transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables arriba del respaldo. Una secuencia promotora la cual se localiza corriente abajo de un ADNc (para expresar un (-)ARN) se enlaza a su terminal 5' por un sitio de inicio de transcripción y se extiende corriente abajo (dirección 3') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables arriba del respaldo. El sistema bidireccional de la invención incluye ambos promotores corriente arriba y corriente abajo; el sistema unidireccional incluye solamente promotores corriente arriba. Dentro o adyacente a la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de transcripción (convenientemente definido por ejemplo, por mapeo con nucleasa SI), y puede también incluir dominios de enlace de proteínas (secuencias de consenso) que promueven, regulan, aumentan, o son de otra manera responsables para el enlace de polimerasa de ARN. Una "secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino" o "elemento regulador de la polimerasa I del ARN canino" (o fragmentos funcionalmente activos del mismo) , como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es capaz de aumentar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico al cual esto se enlaza operablemente, cuando polimerasa I del ARN canino y, opcionalmente, factores de transcripción asociados, se presentan bajo condiciones, por ejemplo, condiciones de cultivo o fisiológicas, según lo cual las enzimas son funcionales. Los ejemplos de secuencias reguladoras de polimerasa I del ARN canino incluyen un promotor de polimerasa I de ARN canino, el cual aumenta la transcripción de un ácido nucleico operablemente ligado a ello arriba del respaldo, y un potenciador de polimerasa I de ARN canino, el cual incrementa transcripción de un ácido nucleico ligado operativamente a un promotor de polimerasa I de ARN canino arriba del nivel observado en la ausencia de un potenciador de polimerasa I de ARN canino. Una prueba para identificar un elemento regulador de la polimerasa I del ARN canino es para introducir el elemento regulador de la polimerasa I del ARN canino supuesto, ligado operativamente a un ácido nucleico de interés, en una célula canina adecuada, por ejemplo, una célula MDCK, y transcripción detectada del ácido nucleico de interés usando un ensayo convencional, por ejemplo, un técnica Northern blot. La comparación de los niveles de transcripción del ácido nucleico en la presencia y ausencia del elemento regulador de la polimerasa I del ARN canino supuesto permite al técnico experto determinar si el elemento de ácido nucleico es un elemento regulador de la polimerasa I del ARN canino. El término "vector" se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, un plásmido, vector viral, ácido nucleico recombinante o ADNc que se pueden usar para introducir secuencias de ácido nucleico heterólogas en una célula. Un vector de la invención típicamente comprenderá una secuencia reguladora de la invención. Los vectores se pueden repetir autónomamente o no repetir autónomamente. Un vector puede ser también un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto de ambos ADN y ARN dentro de la misma hebra, un ADN o ARN conjugado con poli-lisina, un ADN o ARN conjugado con péptido, un ADN conjugado con liposoma, o similares, que no se repiten autónomamente. Más comúnmente, los vectores de la presente invención son plásmidos . Un "vector de expresión" es un vector, tal como un plásmido, el cual es capaz de promover la expresión, por ejemplo, transcripción, de un ácido nucleico incorporado. Un vector de expresión de la invención típicamente comprenderá una secuencia reguladora de la invención. Los vectores de expresión se pueden repetir autónomamente o no repetir autónomamente. Típicamente, el ácido nucleico a expresarse es "operativamente ligado" a un promotor y/o potenciador, y se somete a control regulador de transcripción por el promotor y/o potenciador. Un "vector de expresión bi-direccional" está típicamente caracterizado por dos promotores alteARNtivos orientados en la dirección opuesta relativa a un ácido nucleico colocado entre los dos promotores, tal que la expresión se puede iniciar en ambas orientaciones resultantes en, por ejemplo, transcripción de ambos ARN de hebra más ( + ) o sentido, y hebra negativa (-) o antisentido. AlteARNtivamente , el vector de expresión bi-direccional puede ser un vector en ambos sentidos, en el cual el ARNm viral y ARN genómico viral (como un ARNc) se expresan de la misma hebra. En el contexto de la invención, el término "aislado" se refiere a un material biológico, tal como un ácido nucleico o una proteína, la cual es substancialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con esto en su medio ambiente que se presenta naturalmente. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su medio ambiente natural, por ejemplo, una célula. Por ejemplo, si el material está en su medio ambiente natural, tal como una célula, el material se ha colocado en un lugar en la célula (por ejemplo, genoma o elemento genético) no nativo para un material encontrado en el medio ambiente. Por ejemplo, un ácido nucleico que se presenta naturalmente (por ejemplo, una secuencia de codificación, un promotor, un potenciador, etc.) se vuelve a aislar si esto se introduce por medios que se presentan no naturalmente a un locus del genoma (por ejemplo, un vector, tal como un vector de plásmido o virus, o amplicón) no nativo al de ácido nucleico. Tales ácidos nucleicos se refieren también como ácidos nucleicos "heterólogos" . El término "recombinante" indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o proteína) se ha alterado artificialmente o sintéticamente (no naturalmente) por intervención humana. La alteración se puede realizar en el material dentro, o remover de, su medio ambiente o estado natural. Específicamente, cuando se refiere a un virus, por ejemplo, un virus de la influenza, el virus es recombinante cuando esto se produce por la expresión de un ácido nucleico recombinante . El término "reagrupado, " cuando se refiere a un virus, indica que el virus incluye componentes genéticos y/o polipéptidos derivados de más de una cepa parenteral viral o fuente. Por ejemplo, un reagrupado 7:1 incluye 7 segmentos genómicos virales (o segmentos de gen) derivados de un primer virus parenteral, y un segmento genómico viral complementario sencillo, por ejemplo, que codifica hemaglutinina o neuraminidasa, de un segundo virus precursor. Un reagrupado 6:2 incluye 6 segmentos genómicos, más comúnmente los 6 genes internos de un primer virus parenteral, y dos segmentos complementarios, por ejemplo, hemaglutinina y neuraminidasa, de un diferente virus precursor. El término "introducir" cuando se refiere a un ácido nucleico heterologo o aislado se refiere a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica donde el ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN de cromosoma, de plásmido, de plástido o mitocondrial ) , convertido en un replicón autónomo, o transitoriamente expresado (por ejemplo, ARNm transíectado ) . El término incluye tales métodos como "infección," "transíección, " "transformación" y "transducción . " En el contexto de la invención una variedad de métodos se pueden emplear para introducir ácidos nucleicos en células procarióticas , incluyendo electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por lipido ( lipofección) , etc. El término "célula hospedera" significa una célula que puede o ha tenido hasta un ácido nucleico, tal como un vector, y apoya la replicación y/o expresión del ácido nucleico, y opcionalmente producción de uno o más producto codificados incluyendo un polipéptido y/o un virus. Las células hospederas pueden ser células procarióticas tales como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, anfibio, ave o mamífero, incluyendo células de humano. Las células hospederas ejemplares en el contexto de la invención incluyen células Vero (riñon de mono verde Africano), células Per.C6 (células de retina embriónicas humanas), células BHK (riñon de hámster bebe), células de riñon chicas primarias (PCK), células de Riñon caninas Madin-Darby (MDCK) , células de Riñon bovinas Madin-Darby (MDBK) , células 293 (por ejemplo, células 293T), y células COS (por ejemplo, células COSI, COS7). El término célula hospedera abarca combinaciones o mezclas de células incluyendo, por ejemplo, cultivos mezclados de diferentes tipos de célula o líneas celulares (por ejemplo, célula Vero y CEK) . Una co-cultivación de células SF Vero electroporadas se describe por ejemplo en PCT/US04/42669 con fecha 22 de diciembre, 2004, la cual se incorpora como referencia en su totalidad. La expresión "artificialmente producido por ingeniería" se usa en la presente para indicar que el virus, ácido nucleico viral o producto codificado viralraente, por ejemplo, un polipéptido, una vacuna, comprende al menos una mutación introducida por métodos recombinantes , por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis PCR, etc. La expresión "artificialmente producido por ingeniería" cuando se refiere a un virus (o componente o producto viral) que comprende una o más mutaciones de nucleótido y/o substituciones de aminoácido indica que el genoma viral o segmento de genoma que codifica el virus (o componente o producto viral) no se deriva de fuentes que se presentan naturalmente, tales como una cepa de laboratorio que se presenta naturalmente o que existe previamente de virus producidos por métodos no recombinantes (tales como paso progresivo a 25°C), por ejemplo, una cepa tipo silvestre o adaptada en frío A/Ann Arbor/6/60 o B/Ann Arbor/1/66. El término "% de identidad de secuencia" se usa intercambiablemente en la presente con el término "% de identidad" y se refiere al nivel de identidad de secuencia de aminoácidos entre dos o más secuencias de péptido o al nivel de identidad de secuencia de nucleótido entre dos o más secuencias de nucleótidos, cuando se linean usando un programa de alineación de secuencia. Por ejemplo, como se usa en la presente, 80% de identidad significa lo mismo que 80% de identidad de secuencia determinada por un algoritmo definido, y significa que una secuencia dada es al menos 80% idéntica a otra longitud de otra secuencia. Los niveles ejemplares de identidad de secuencia incluyen, pero no se limitan a, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98% o más identidad de secuencia a una secuencia dada. El término "% de homología de secuencia" se usa intercambiablemente en la presente con el término "% de homología" y se refiere al nivel de homología de secuencia de aminoácido entre dos o más secuencias de péptido o el nivel de homología de secuencia de nucleótido entre dos o más secuencias de nucleótidos, cuando se alinean usando un programa de alineación de secuencia. Por ejemplo, como se usa en la presente, 80% de homología significa lo mismo que 80% de homología de secuencia determinada por un algoritmo definido, y en consecuencia un homólogo de una secuencia dada tiene más de 80% de homología de secuencia sobre una longitud de la secuencia dada. Niveles ejemplares de homología de secuencia incluyen, pero no se limitan a, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98% o más homología de secuencia a una secuencia dada. Programas de computadora ejemplares que se pueden usar para determinar identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, la serie de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, públicamente disponibles en la Internet en el sitio de la Internet NCBI . Ver también Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10 (con referencia especial a la configuración predeterminada publicada, es decir, parámetros w=4, t=17) y Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402. Las búsquedas de secuencia se llevan a cabo típicamente usando el programa BLASTP cuando se evalúa una secuencia de aminoácido dado relativa a secuencias de aminoácido en las Secuencias de Proteína GenBank y otras bases de datos públicas. El programa BLASTX se prefiere para la búsqueda de secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos lo marcos de lectura contra secuencias de aminoácido en las Secuencias de Proteína de GenBank y otras bases de datos publicas. Ambos BLASTP y BLASTX se ejecutan usando parámetros predeterminados de una penalización de espacio abierto de 11.0, y una penalización de espacio extendido de 1.0, y utilizar la matriz BLOSUM-62. Ver id. Una alineación preferida de secuencias seleccionadas con objeto de determinar "% de identidad" entre dos o más secuencias, se realiza usando por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en versión 6.5 MacVector, operado con parámetros predeterminados, incluyendo una penalización de espacio abierto de 10.0, una penalización de espacio extendido de 0.1, y una matriz de similitud BLOSUM 30. "Hibridizar específicamente a" o "hibridización específica" o "hibridizar selectivamente a", se refiere al enlace, duplicado, o hibridizado de una molécula de ácido nucleico preferentemente a una secuencia de nucleótido particular bajo estrictas condiciones cuando la secuencia está presente en una mezcla de complejo (por ejemplo, celular total) ADN o ARN . El término "condiciones severas" se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda hibridizará preferentemente a su secuencia objetivo, y en menor medida a, o no en todos, otras secuencias. "Hibridización estricta" y "condiciones de lavado de hibridización estricta" en el contexto de experimentos de hibridización de ácido nucleico tales como hibridizaciones Southern y northern son dependientes de' la secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros de medio ambiente. Una extensa guia para la hibridización de ácidos nucleicos se puede encontrar en Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capitulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, NY; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3ra ed., NY; and Ausubel et al., eds . , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience , NY . Generalmente, hibridización altamente severa y condiciones de lavado se seleccionan para estar alrededor de 5°C inferior al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica en una fuerza y pH iónicos definidos. El Tm es la temperatura (bajo fuerza y pH iónicos definidos) en el cual 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente igualada. Condiciones muy severas se seleccionan para ser igual al Tm por una sonda particular. Un ejemplo de condiciones severas de hibridación para hibridización de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de alrededor de 100 residuos complementarios en un filtro en una técnica Southern o Northern blot es 50% formalina con 1 mg de heparina a 42°C, con la hibridización llevada a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente estrictas es NaCl 0.15 M a 72°C durante alrededor de 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado estrictas es un lavado 0.2X SSC a 65°C durante 15 minutos. Ver Sambrook et al., para una descripción de solución amortiguadora SSC. Un lavado de alta severidad puede ser precedido por un lavado de baja severidad para remover señal de sonda antecedente. Un lavado ejemplar de media severidad para un doble de, por ejemplo, más de alrededor de 100 nucleótidos, es lx SSC a 45°C durante 15 minutos. Un lavado ejemplar de baja severidad para un doble de, por ejemplo, más de alrededor de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40°C durante 15 minutos. En general, una señal para relación de ruido de 2x (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridización particular indica detección de una hibridización específica.

El término "alrededor de," como se usa en la presente, a menos que se indique de otra manera, se refiere a un valor que no es más de 10% arriba o abajo del valor siendo modificado por el término. Por ejemplo, el término "alrededor de 5 pg/kg" significa un rango desde 4.5 g/kg hasta 5.5 pg/kg. Como otro ejemplo, "alrededor de 1 hora" significa un rango desde 48 minutos hasta 72 minutos. El término "codificar, " como se usa en la presente, se refiere a la propiedad de un ácido nucleico, por ejemplo, ácido desoxiribonucleico, para transcribir un ácido nucleico complementario, incluyendo un ácido nucleico que se puede traducir en un polipéptido. Por ejemplo, un ácido desoxiribonucleico puede codificar un ARN que se transcribe del ácido desoxiribonucleico. Similarmente , el ácido desoxiribonucleico puede codificar un polipéptido traducido de un ARN transcrito del ácido desoxiribonucleico. .2 Ácidos nucleicos Que Comprenden Elementos Reguladores Pol I de ARN Canino En una modalidad, ácidos nucleicos aislados se proporcionan siempre que comprenden una secuencia reguladora del ARN canino de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN) . La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ligarse operativamente a un ácido nucleico para transcribirse y puede, en la presencia de proteínas adecuadas in vitro o in vivo, transcribirse. En una modalidad, el ácido nucleico operativamente ligado a la secuencia reguladora es un segmento de ARNv de influenza. En determinados aspectos, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un promotor pol I canino del ARN. Preferiblemente, el promotor pol I canino del ARN se liga operativamente a un ácido nucleico para transcribirse, tales como, por ejemplo, un ARN genómico de la influenza. La introducción del ácido nucleico en una célula canina puede resultar en transcripción del ARN genómico de la influenza, y, en la presencia de proteínas de influenza adecuadas, el transcripto de ARN o transcriptos se pueden empacar en un virus de la influenza, por ejemplo, un virus infeccioso de la influenza. En determinadas modalidades, los ácidos de ácido nucleico de la invención comprenden una secuencia reguladora pol I de ARN canino o fragmento del mismo que enlaza un polipéptido pol I humano, primates, de ratón o canino y es al menos o alrededor de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, o 60% idéntico a una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28. En una modalidad, la secuencia reguladora pol I de ARN o fragmento del mismo además conserva la capacidad para iniciar la transcripción de un gen operativamente ligado a la secuencia de nucleótido. En determinadas modalidades, los ácidos de ácido nucleico de la invención comprenden una secuencia de polinucleótidos que es al menos o alrededor de 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, o 60% idéntico a la secuencia de SEQ ID NO:29.

Además, los ácidos nucleicos de la invención también abarcan versiones derivadas de ácidos nucleicos que comprenden un promotor pol I canino del ARN. Tales derivados se pueden hacer por cualquier método conocido por un experto en la técnica sin limitación de las secuencias reguladoras pol I de ARN canino identificadas de aquí en adelante. Por ejemplo, derivados se pueden hacer por mutagénesis especifica del sitio, incluyendo substitución, inserción, o eliminación de uno, dos, tres, cinco, diez o más nucleótidos, de los ácidos nucleicos. AlteARNtivamente, los derivados se pueden hacer por mutagénesis aleatoria. Un método para mutagenizar aleatoriamente un ácido nucleico comprende amplificar el ácido nucleico en una reacción PCR en la presencia de MnCl2 0.1 mM y concentraciones de nucleótido desequilibradas. Estas condiciones aumentar la relación de mala incorporación de la polimerasa usada en la reacción PCR y resulta en mutagénesis aleatoria del ácido nucleico amplificado. Preferiblemente, los ácidos nucleicos derivados conservan la capacidad para iniciar la transcripción de un gen ligado operativamente a la secuencia de nucleótido. En determinadas modalidades, el ácido nucleico de la invención comprende al menos alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, o 1000 nucleótidos consecutivos de una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28. Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una secuencia que puede iniciar la transcripción de un gen ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos en células caninas, y asi es un derivado funcional. En una modalidad, el ácido nucleico comprende una secuencia que puede enlazar polipéptidos pol I canino e iniciar {in vitro o in vivo) la transcripción de un ARNv de influenza en células caninas. En una modalidad, una secuencia de ácido nucleico aislado se prevé que comprende al menos 250, o al menos 350, o al menos 450 nucleótidos contiguos de la secuencia establecida como SEQ ID NO: 26, en donde la secuencia de ácido nucleico cuando liga operativamente a ADNc que codifica un ARNv de influenza e introduce en una célula MDCK es capaz de dirigir la expresión del ARNv de influenza. En otra modalidad, una secuencia de ácido nucleico aislado se prevé que comprenda un polinucleótido que tiene al menos 80% identidad para la secuencia de nucleótidos establecidos como SEQ ID NO: 26, en donde la secuencia de ácido nucleico cuando liga operativamente a ADNc que codifica un ARNv de influenza e introduce en una célula DCK es capaz de dirigir la expresión del ARNv de influenza. En otra modalidad, una secuencia de ácido nucleico aislado' se prevé que comprende un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID Nos 1-26, en donde la secuencia de ácido nucleico cuando liga operativamente a ADNc que codifica un ARNv de influenza e introduce en una célula MDCK es capaz de dirigir la expresión del ARNv de influenza. En determinadas modalidades, ácidos nucleicos de la invención comprenden al menos alrededor de 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, o 3000 nucleótidos consecutivos de SEQ ID No.29. En determinadas modalidades, un secuencia de ácidos nucleicos de la invención comprende, o alteARNtivamente consiste de nucleótidos -469 hasta -1 (en relación al primer nucleótido transcrito del promotor, también conocido como el nucleótido +1) de la secuencia presentada como SEQ ID NO:l, o un derivado funcional del mismo. En otras modalidades, una secuencia de ácidos nucleicos de la invención comprende, o alteARNtivamente consiste de nucleótidos -250 hasta -1 (en relación con el primer nucleótido transcrito del promotor, también conocido como el nucleótido +1) de la secuencia presentada como SEQ ID N0:1, o un derivado funcional del mismo. El nucleótido +1 para el ARN ribosomal 18S expresado de la secuencia reguladora pol I canina encontrado en SEQ ID NO: 1 es el nucleótido en la posición 1809 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad, un ácido nucleico se prevé que comprende nucleótidos 1-469 de la SEQ ID NO: 26, el complemento del mismo, el complemento inverso del mismo, o un fragmento funcionalmente activo del mismo. La presente invención también proporciona fragmentos funcionalmente activos de SEQ ID NO: 1 (una subsecuencia de la secuencia de nucleótidos presente en el clon depositado A. T. C. C. No. De Acceso PTA-7540) . En consecuencia, la presente invención además proporciona polinucleótidos que tienen uno o más residuos de ácidos nucleicos eliminados de la terminal amino de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l. Las eliminaciones de terminal N de la SEQ ID NO: 1 se pueden describir por la fórmula general m - 3537, donde m es un entero desde 2 hasta 3512, donde m corresponde a la posición del nucleótido identificado en la SEQ ID NO:l, o la secuencia de nucleótidos presente en el clon depositado (A. T. C. C. No. De Acceso PTA-7540). La presente invención también proporciona polinucleótidos que tienen uno o más residuos de ácidos nucleicos eliminados de la terminal carboxi de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. Las eliminaciones de terminal C de la SEQ ID NO: 1 se pueden describir por la fórmula general 1 - n, donde n es un entero desde 2 hasta 3512, donde n corresponde a la posición de nucleótido identificado en la SEQ ID NO: 1, o la secuencia de nucleótidos presente en el clon depositado (A.T.C.C. No. De Acceso PTA-7540) . La presente invención también proporciona fragmentos funcionalmente activos de la SEQ ID NO: 26 (una subsecuencia de la secuencia de nucleótidos presente en el clon depositado A.T.C.C. No. De Acceso PTA-7540) . En consecuencia, la presente invención además proporciona polinucleótidos que tienen uno o más residuos de ácidos nucleicos eliminados de la terminal amino de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 26. Las eliminaciones de terminal N de la SEQ ID NO: 26 se pueden describir por la fórmula general m - 469, donde m es un entero desde 2 hasta 450, donde m corresponde a la posición del residuo de ácido nucleico identificado en la SEQ ID NO:26. La presente invención también proporciona polinucleótidos que tienen uno o más residuos de ácidos nucleicos eliminados de la terminal carboxi de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:26. Las eliminaciones de terminal C de la SEQ ID NO: 26 se pueden describir por la fórmula general 1 - n, donde n es un entero desde 2 hasta 450, donde n corresponde a la posición de residuo de ácido nucleico identificado en la SEQ ID NO:26. En determinadas modalidades, la secuencia reguladora pol I canina de la invención comprende, o alteARNtivamente consiste de un ácido nucleico aislado (o la secuencia complemento del mismo) que hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28 y puede iniciar la transcripción de un gen ligado operativamente a la secuencia reguladora en células caninas. En una modalidad, la secuencia reguladora pol I canina de la invención comprende un secuencia de ácidos nucleicos que pueden enlazar un polipéptido pol I de ARN canino y, en una modalidad, inicia la transcripción de un gen ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos en células caninas. En una modalidad, el ácido nucleico comprende una secuencia que puede enlazar un un polipéptido pol I eucariótico e iniciar (in vitro o in vivo) la transcripción de un ARNv de influenza. En determinadas modalidades, enlace de polipéptido pol I de ARN canino a una secuencia reguladora pol I canina se analiza con un ensayo de protección de nucleasa. En determinadas modalidades, enlace de polipéptido pol I de ARN canino a una secuencia reguladora pol I canina se analiza con un sistema BIACORE para evaluar interacciones de proteínas (Biacore InteARNtional AG, Uppsala, Suecia) . En determinadas modalidades, el ácido nucleico comprende una secuencia que enlaza pol I de ARN canino. En determinadas modalidades, la secuencia enlaza al pol I de ARN canino con mayor afinidad que una polimerasa de ARN seleccionada del grupo que consiste de: un pol I de ARN de primates, un pol I humano, y un pol I de ratón. En determinadas modalidades, la secuencia enlaza al pol I de ARN canino con mayor afinidad que pol II de ARN canino. En determinadas modalidades, la secuencia enlaza al pol I de ARN canino con mayor afinidad que pol III de ARN canino. En determinadas modalidades, enlace a una secuencia reguladora pol I canina se analiza con un sistema BIACORE para evaluar interacciones de proteínas (Biacore InteARNtional AG, Uppsala, Suecia). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: ATTCCCGGTGAGGCTGCCTCTGCCGCGCGTGGCCCTCCACCTCCCCTGGCCCGAG CCGGGGTTGGGGACGGCGGTAGGCACGGGGCGGTCCTGAGGGCCGCGGGGGAC GGCCTCCGCACGGTGCCTGCCTCCGGAGAACTTTGATGATTTTTCAAAGTCTCCT CCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCG GCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCC CCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGG TGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCG GGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTG CCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGT (SEQ ID NO: 26), que es una subsecuencia de la secuencia de nucleótidos presente en el clon depositado A. T. C. C. No. de Acceso PTA-7540. En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGG GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGT TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCT GACA (SEQ ID NO: 2) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGC GTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGT ATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCC TGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGAC AGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCC GGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGT GCTGACA (SEQ ID NO: 20). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGT TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCT GACA (SEQ ID NO: 3) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGC GGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATG AACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO: 4). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCT GACA (SEQ ID NO: 5) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGA ACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCTGACA (SEQ ID NO: 6). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAGATGAACATTTTTTGTTGCCAGGTAGGTGCT GACA (SEQ ID NO: 7) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTG ( SEQ ID NO: 8) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGC GTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGT ATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCC TG (SEQ ID NO:21) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO: 9). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGC GTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGT ATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC (SEQ ID NO:22). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC (SEQ ID NO: 10) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGC GTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGT ATC (SEQ ID NO: 23) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT (SEQ ID NO: 11) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGC GT (SEQ ID NO:24) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGCGT GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGG GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGT TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 12) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTGATGATTTTTCAAAGTCTCCTCCCGGAGATCACTGGCTTGGCGGCGTGGCGGC GTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGT ATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCC TGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGAC AGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCC GGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO:25). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATC GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGG GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGT TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 13) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTAT CGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTG GGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAG TTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGG CAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO:27). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCGTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGG GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGT TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 14). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGGCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGT TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 15) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGC GGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 16) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGC AGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 17). En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GGCGTGGCGTCTCCACCGACCCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCCG TTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGGG CGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTCG CGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 18) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: GGCGTGGCGTCTCCACCGACCGCGTATCGCCCCTCCTCCCCTCCCCCCCCCCCCCC GTTCCCTGGGTCGACCAGATAGCCCTGGGGGCTCCGTGGGGTGGGGGTGGGGGG GCGCCGTGGGGCAGGTTTTGGGGACAGTTGGCCGTGTCACGGTCCCGGGAGGTC GCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 28) . En determinadas modalidades, el promotor pol I canino del ARN comprende, o alteARNtivamente consiste de, la siguiente secuencia de nucleótidos: TCGCGGTGACCTGTGGCTGGTCCCCGCCGGCAGGCGCGGTTATTTTCTTGCCCGAG (SEQ ID NO: 19) . .3 Vectores y vectores de expresión En otro aspecto, la invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico de la invención, incluyendo vectores de expresión útiles para rescate recombinante de un virus del cultivo celular. Generalmente, los vectores de expresión son útiles para rescatar cualquier virus conocido por alguien experto en la técnica para requerir producción de ARN con finales definidos durante su ciclo de vida. Por ejemplo, como se describe anteriormente, el virus del ARN genómico de la influenza debería tener final 5' y 3' para ser efectivamente replicado y empaquetado en un sistema recombinante. Ver, examinar también in Neumann et al. (2002), 83:2635-2662, que se incorpora en la presente como referencia. La siguiente discusión se enfoca en vectores de expresión adecuados para uso con influenza; sin embargo, se deberá notar que otros virus también pueden rescatarse usando los vectores de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, en una modalidad, ADNc que codifica el ARN genómico viral correspondiente para cada uno de los ocho segmentos genómicos de influenza (los segmentos pueden ser de diferentes virus de la influenza, por ejemplo, 6 de la cepa X y 2 de la cepa Y) se pueden insertar en un vector recombinante para manipulación y producción de virus de la influenza. Una variedad de vectores, incluyendo vectores virales, plásmidos, cósmidos, fago, y cromosomas artificiales, se pueden emplear en el contexto de la invención. Típicamente, para facilitar la manipulación, el ADNc se inserta en un vector plásmido, proporcionando uno o más orígenes de replicación funcional en las bacterias y células eucarióticas , y, opcionalmente , un marcador conveniente para separación por exclusión o células seleccionadas incorporando la secuencia de plásmidos. Ver, por ejemplo, Neumann et al, 1999, PNAS . USA 96:9345-9350. En una modalidad, los vectores de la invención son vectores bi-direccionales de expresión capaces de iniciar la transcripción de un segmento genómico viral del ADNc insertado en cualquier dirección, que es, dando lugar tanto moléculas de ARN de hebra (+) y hebra (-) . Para efecto de transcripción bi-direccional, cada uno de los segmentos genómicos virales se insertan en un vector de expresión que tiene al menos dos promotores independientes, tal que las copias del ARN genómico viral se transcriben por un primer promotor de polimerasa de ARN {por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN) ; de una hebra, y ARNm virales se sintetizan de un segundo promotor de polimerasa de ARN (por ejemplo, un promotor Pol II canino del ARN u otro promotor que puede iniciar la transcripción por ARN pol II en células caninas) . En consecuencia, los dos promotores se pueden organizar en orientaciones de acompañamiento frente al menos un sitio de clonación (es decir, una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción) preferiblemente un sitio de clonación único, adecuado para inserción de segmentos de ARN genómico virales. AlteARNtivamente , un vector de expresión de "ambisentido" se puede emplear en el cual el ARNm de hebra ( + ) y el ARN viral de hebra (-) (como un ARNc) se transcriben de la misma hebra del vector. Como se describe anteriormente, el promotor pol I para transcribir el ARN genómico viral es preferiblemente un promotor pol I canino. Para asegurar el extremo 3' correcto de cada ARNv o ARNc expresado, cada vector de expresión ARNv o ARNc puede incorporar una secuencia de ribozima o secuencia de terminación apropiada {por ejemplo, humano, ratón, primate, o secuencia de terminación de polimerasa I del ARN canino) corriente descendente de la secuencia que codifica al ARN. Este puede ser, por ejemplo, la secuencia del ribosoma genómico del virus delta de hepatitis o un derivado funcional del mismo, o la secuencia de terminación del rADN de murina (número de acceso al Genbank M12074). AlteARNtivamente , por ejemplo, se puede emplear una secuencia de terminación pol (Neumann et al, 1994, Virology 202:477-479). Los vectores de expresión del ARN de expresión se pueden construir de la misma manera' como los vectores de expresión ARNv descritos en Pleschka et al, 1996, J. Virol. 70:4188-4192; Hoffmann and Webster, 2000, J. Gen Virol. 81 :2843-2847; Hoffmann et al, 2002, Vaccine 20:3165-3170; Fodor et al, 1999, J. Virol. 73:9679-9682; Neumann et al, 1999, P.N.A.S.USA 96:9345-9350; y Hoffmann et al, 2000, Virology 267:310-317, cada uno de los cuales se incorporan para referencia en su totalidad. En otros sistemas, las secuencias virales se transcriben por los promotores pol I y pol II se puede transcribir de diferentes vectores de expresión. En estas modalidades, los vectores que codifican cada uno de los segmentos genómicos virales bajo el control de una secuencia canina reguladora de la invención, por ejemplo, un promotor pol I canino ("vectores de expresión ARNv") y vectores que codifican uno o más polipéptidos virales, por ejemplo, polipéptidos de influenza PA, PB1, PB2, y NP ("vectores de expresión de proteínas") bajo el control de un promotor pol II se pueden usar. En cualquier caso, con respecto al promotor pol II, el segmento del genoma del virus de la influenza para ser expresado se puede ligar operativamente a una secuencia de control de transcripción apropiada (promotor) a síntesis de ARNm directa. Una variedad de promotores son adecuados para usar en vectores de expresión para regular la transcripción de segmentos de genoma de virus de la influenza. En determinadas modalidades, el promotor (Pol II) de Polimerasa II de ARN dependiente de ADN de citomegalovirus (CMV) se utiliza. Si se desea, por ejemplo, para expresión condicional de regulación, otros promotores se pueden sustituir que inducen la transcripción de ARN bajo las condiciones especificadas, o en el tejido especifico o células. Numerosos virales y mamíferos, por ejemplo, promotores humanos están disponibles, o se pueden aislar de acuerdo a la aplicación específica contemplada. Por ejemplo, promotores alteARNtivos obtenidos de los genomas de virus animal y humano incluyen tales promotores como el adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus de papiloma, virus de hepatitis B, y virus de polioma, y diversos promotores retrovirales . Los promotores de mamífero incluyen, entre muchos otros, el promotor de actina, promotores de inmunoglobulina , promotores . de choque de calor, y los similares. En una modalidad específica, la secuencia reguladora comprende el último promotor principal de adenovirus 2 ligado a la secuencia líder tripartita empalmada de adenovirus 2 humano, como se describe por Berg et al, Bio Techniques 14:972-978. Además, promotores de bacteriófago se pueden emplear en conjunto con la polimerasa de ARN similar, por ejemplo, el promotor T7. Los vectores de expresión usados para expresar proteínas virales, en particular proteínas virales para la formación del complejo RNP, preferiblemente expresará homólogos de proteínas virales para el virus deseado. La expresión de proteínas virales por estos vectores de expresión puede regularse por cualquier secuencia reguladora conocida para aquellos de experiencia en la técnica. La secuencia reguladora puede ser un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor especifico de tejido. Los ejemplos adicionales de los promotores que pueden usarse para controlar la expresión de proteínas virales en vectores de expresión de proteínas incluyen, pero no se limitan a, la región del promotor temprano SV40 (Bernoist and Chambón, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la terminal larga 3' repetida del virus Rous sarcoma (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de herpes timidina cinasa (Wagner et al, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1 41-1445), las secuencias reguladoras del gen metalotioneina (Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procariótica tal como el promotor ß-lactamasa (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), o el promotor tac (DeBoer et al, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:21-25); ver también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; los vectores de expresión de planta que comprenden la región del promotor de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al, Nature 303:209-213) o el promotor 35S ARN del virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al, 1981, Nucí. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la carboxilasa de bifosfato de ribulosa de la enzima fotosintética (Herrera-Estrella et al, 1984, Nature 310:115-120); elementos del promotor de levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa) , promotor PGK ( fosfoglicerol cinasa), promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional de animal, que muestran especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos : región de control del gen de elastasa I que está activa en células acinares pancreáticas (Swift et al, 1984, Cell 38:639-646; Omitz et al, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol . 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control del gen de insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control del gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al, 1984, Cell 38:647-658; Adames et al, 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares , de mama, linfoides y cebadas (Leder et al, 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al, 1987, Genes and Devel. 1:268-276), región de control del gen alfa-fetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al, 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de alfa 1-antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1 : 161-171), región de control del gen de beta-globina que está activa en células mieloide (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); región de control del gen de proteína básica de mielina que está activa en células oligodendrocitas en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), región de control del gen de cadena 2 ligera de miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286), y región de control del gen de la hormona que libera gonadotrópica que está activa en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Science 234:1372-1378). En una modalidad especifica, los vectores de expresión de proteínas de la invención comprenden un promotor ligado operativamente a un secuencia de ácido nucleico, uno o más orígenes de replicación, y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables {por ejemplo, un gen resistente al antibiótico) . En otra modalidad, un vector de expresión de proteína de la invención que es capaz de producir ARNm bicistrónico puede producirse al insertar la secuencia de ARNm bicistrónico. Ciertas secuencias del sitio de entrada de ribosoma inteARN (IRES, por sus siglas en inglés) pueden utilizarse. Los elementos preferidos IRES incluyen, pero no se limitan a los BiP IRES de mamíferos y los IRES del virus de la hepatitis C. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención se inserta en el pAD3000 plásmido o un derivado del mismo. Ver, Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 20050266026 y Figura 10. De esta manera, en determinadas modalidades, el vector de expresión es un vector de expresión bi-direccional . En determinadas modalidades, el vector de expresión comprende una señal de poliadenilacion SV40 flanqueada a un segmento del genoma del virus de la influenza interno en los dos promotores. En determinadas modalidades, el vector de expresión comprende el ADN de citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) dependiente del promotor de ARN Pol II. En una modalidad, un ácido nucleico de la invención se inserta en el pAD4000 plásmido o un derivado del mismo. En una modalidad, los ácidos nucleicos de la invención comprenden o alteARNtivamente consisten de la secuencia de pAD4000 presentado como SEQ ID NO:29. Los vectores que contienen insertos de genes pueden identificarse por, por ejemplo, tres enfoques generales: (a) hibridación de ácido nucleico; (b) presencia o ausencia de funciones del gen "marcador"; y, en el caso de vectores de expresión, (c) expresión de secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia del gen viral insertado en unos vectores puede detectarse por hibridación de ácido nucleico usando sondas que comprenden secuencias que son homologas a los genes insertados. En el segundo enfoque, el sistema hospedero/vector recombinante puede identificarse y seleccionarse con base de la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, resistencia a antibióticos o fenotipo de transformación) provocadas por la inserción de los genes en los vectores. En el tercer enfoque los vectores de expresión pueden identificarse al procesar por ensayo el producto del gen expresado. Tales ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de la proteína vírica en sistema de ensayo in vitro, por ejemplo, enlace de proteínas virales a anticuerpos. En una modalidad específica, uno o más vectores de expresión de proteínas codifican y expresan las proteínas virales necesarias para la formación de complejos RNP. En otra modalidad, uno o más vectores de ' expresión de proteínas codifican y expresan las proteínas virales necesarias para formar partículas víricas. Todavía en otra modalidad, uno o más vectores de expresión de proteínas codifican y expresan todas las proteínas virales de un virus de ARN de hebra negativa particular. La transcripción de los vectores de expresión puede opcionalmente incrementarse al incluir una secuencia potenciadora . Los potenciadores son típicamente cortos, por ejemplo, 10-500 bp, elementos de ADN que actúan con cis que actúan conjuntamente con un promotor para incrementar la transcripción. Muchas secuencias potenciadoras se han aislado de genes mamíferos (hemoglobina, elastasa, albúmina, alfa-" fetoproteína, e insulina), y virus de célula eucariótica. El potenciador puede empalmarse en el vector a una posición 5' o 3' para la secuencia de codificación heteróloga, pero se inserta típicamente en un sitio 5' al promotor. Típicamente, el promotor, y si se desea, las secuencias potenciadoras de transcripción adicional se eligen para optimizar la expresión en el tipo célula hospedera en la cual el ADN heterólogo se introduce (Scharf et al. (1994) Heat stress promoters and transcripción factors Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signáis to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 512-27). Opcionalmente , el amplicón también puede contener un sitio enlazado a la ribosoma o un sitio de entrada de ribosoma inteARN (IRES) para inicio traducción. Los vectores de expresión de la invención también pueden incluir secuencias para la terminación de transcripción y para estabilizar el ARNm, tales como un sitio de poliadenilación o una secuencia de terminación (por ejemplo, secuencia de terminación de polimerasa I de ARN de humano, ratón, primate, o canino) . Tales secuencias están comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3' , de ADN o ADNc eucarióticos o virales. En algunas modalidades, las secuencias de poliadenilación SV40 proporcionan una señal de poliadenilación. Además, , como se describe arriba, los vectores opcionalmente incluyen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotipico para la selección de células hospederas transformadas, además para genes previamente enlistados, marcadores tales como dihidrofolato reductasa o resistente a la neomicina son adecuados para selección en cultivo de célula eucariótica. El vector de expresión que contiene la secuencia de ADN apropiada como se describe arriba, asi como un promotor apropiado o secuencia de control, puede emplearse para transformar una célula hospedera que permite la expresión de la proteina. Mientras que los vectores de expresión de la invención pueden replicarse en células bacterianas, más frecuentemente serán deseables para introducirse en células mamiferas, por ejemplo, células Vero, células BHK, célula MDCK, células 293, células COS, más preferiblemente células MDCK, para el propósito de expresión. Los vectores de expresión de la invención se pueden usar para dirigir la expresión de vAN genómicos o ARNc correspondientes que tienen una o más mutaciones (por ejemplo, eliminación o inactivación de un sitio desdoblado polibásico en el gen HA de cepas pandémicas de la influenza particular tales como H5N1). Estas mutaciones pueden resultar en la atenuación del virus. Por ejemplo, los segmentos ARNv pueden ser los segmentos ARNv de un virus A de la influenza teniendo una substitución en par base atenuada en una región promotora doble de mango de sartén, en particular, por ejemplo, la substitución en par base atenuada conocida de A para C y U para G en la posición 11-12' en la región doble del ARNv especifico de NA (Fodor et al., 1998, J. Virol. 6923-6290) . Al usar los métodos de la invención para producir virus de ARN de hebra negativa recombinante , nuevas mutaciones de atenuación pueden identificarse. Además, cualesquiera de los vectores de expresión descritos en la Patente de E.U.A. Nos. 6,951,754, 6,887,699, 6,649,372, 6,544,785, 6,001,634, 5,854,037, 5,824,536, 5,840,520, 5,820,871, 5,786,199, y 5,166,057 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. Nos. 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814, y 20020164770 se pueden usar de acuerdo con la presente invención. Generalmente, los vectores descritos en estas publicaciones pueden adaptarse para uso de acuerdo con la presente invención al introducir un ácido nucleico de la invención (por ejemplo, una secuencia canina reguladora de la invención tal como secuencia promotora obtenida de caninos) como se describe en la presente en los vectores de expresión para la síntesis directa de ARNv o ARNc viral. .3.1 Elementos de expresión adicional Más comúnmente, el segmento de genoma que codifica la proteína del virus de la influenza incluye cualesquiera secuencias adicionales necesarias para su expresión, incluyendo traducción en una proteína vírica funcional. En otras situaciones, puede emplearse un minigen, u otro constructo artificial que codifica las proteínas virales, por ejemplo, una proteína HA o NA. En este caso, es a menudo deseable incluir señales de inicio específicas que ayudan en la traducción eficiente de la secuencia de codificación heteróloga. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Para asegurar la traducción del inserto entero, el codón de inicio se inserta en el cuadro de lectura correcto relativo a la proteína vial. Los elementos transcripcionales exógenos y codones de inicio pueden ser de varios orígenes, tanto natural como sintético. La eficiencia de la expresión puede potenciarse por la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso. Si se desea, las secuencias de polinucleótido codifican los elementos expresados adicionales, tales como secuencias de señal, secuencias de secreción o localización, y los similares pueden incorporarse en el vector, usualmente, en el cuadro con la secuencia de polinucleótido de interés, por ejemplo, para la expresión de polipéptido objetivo para un compartimiento celular deseado, membrana, u organelo, o en el medio de cultivo celular. Tales secuencias son conocidas para aquellos de experiencia, e incluyen péptidos líderes de secreción, secuencia de dirección de organelos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención ER, secuencias de tránsito en la mitocondria) , secuencias de anclaje/localización de membrana (por ejemplo, secuencias de transferencia detenida, secuencias de anclaje GPI), y los similares. .4 Vectores de expresión para hacer virus quiméricos Los vectores de expresión de la invención también se pueden usar para hacer virus quiméricos que expresan secuencias heterólogas a un genoma viral. Los vectores de expresión que dirigen la expresión de ARNv o ARNc correspondientes se introducen en células hospederas junto con vectores de expresión dirigidos de la expresión de proteínas virales para generar virus de ARN de hebra negativa recombinante infecciosos novedosos o virus quiméricos. Ver, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. no. US20040002061. Las secuencias heterólogas que pueden procesarse por ingeniería en estos virus incluyen ácidos nucleicos antisentido y ácido nucleico tal como una ribozima. AlteARNtivamente , las secuencias heterólogas que expresan un péptido o polipéptido pueden procesarse por ingeniería en estos virus. Las secuencias heterólogas que codifican los siguientes péptidos o polipéptidos pueden procesarse por ingeniería en estos virus incluyen: 1) antígenos que son característicos de un patógeno; 2) antígenos que son característicos de enfermedad autoinmunitaria ; 3) antígenos que son característicos de un alérgeno; y 4) antígenos que son característicos de un tumor. Por ejemplo, las Secuencias de gen heterólogas que pueden procesarse por ingeniería en los virus quiméricos de la invención incluye, pero no se limitan a, epítopos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tales como gpl60; antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg, por sus siglas en inglés); las glicoproteínas del virus del herpes (por ejemplo, gD, gE) ; VP1 del virus de polio; y determinantes antigénicos de patógenos no virales tales como bacterias y parásitos para nombrar sino unos pocos. Los antígenos que son característicos de enfermedad autoinmunitaria típicamente se derivarán a partir de la superficie celular, citoplasma, núcleo, mitocondria y los similares de tejidos mamíferos, incluyendo antígenos característicos de diabetes mellitus, esclerosos múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, escleroderma , gastritis atrófica autoinmune, diabetes juvenil, y lupus eritromatoso discoide . Los antígenos que son alérgenos son generalmente proteínas o glicoproteínas, incluyendo antígenos derivados de pólenes, polvo, mohos, esporas, cólera, insectos y alimentos.

Los antígenos que son característicos de antígenos de tumor típicamente se derivarán a partir de la superficie celular, citoplasma, núcleo, organelos y los similares de células de tejido de tumor. Los ejemplos incluyen antígenos característicos de proteínas de tumor, incluyendo proteínas codificadas por oncogenes mutados; proteínas virales asociadas con tumores; y glicoproteínas . Los tumores incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de los tipos de cáncer: labio, nasofaringe, faringe y cavidad bucal, esófago, estómago, colon, recto, hígado, vesícula biliar, páncreas, laringe, pulmón y bronquios, melanoma de piel, mama, cervical, uterino, ovario, vejiga, riñon, útero, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroide, próstata, testículos, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia. En una modalidad específica de la invención, las secuencias heterólogas se derivan del genoma del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , preferiblemente virus de inmunodeficiencia humana 1 o virus de inmunodeficiencia humana 2. En otra modalidad de la invención, las secuencias de codificación heterólogas pueden insertarse dentro de una secuencia de codificación de gen del virus de ARN de hebra negativa de manera que un producto de gen quimérico se expresa el cual contiene la secuencia del péptido heterologo dentro de la proteína vírica. En tal modalidad de la invención, las secuencias heterólogas también pueden derivarse del genoma de un virus de inmunodeficiencia humana, preferiblemente del virus de inmunodeficiencia humana 1 o virus de inmunodeficiencia humana 2.

En casos en los cuales las secuencias heterólogas se derivan de VIH, tales secuencias pueden incluir, pero no se limitan a secuencias derivadas del gen env (es decir, secuencias que codifican todo o parte de gpl60, gpl20, y/o gp41) , el gen pol (es decir, secuencias que codifican todo o parte de la transcriptasa inversa, endonucleasa , proteasa, y/o integrasa) , el gen gag (es decir, secuencias que codifican todo o parte de p7, p6, p55, pl7/18, p24/25) tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, y/o vpx . Un enfoque para construir estas moléculas híbridas es insertar la secuencia de codificación heteróloga en un complemento de ADN de un gen del virus de ARN de hbra negativa de manera que la secuencia heteróloga se flanquea por las secuencias víricas requeridas para la actividad de polimerasa vírica; por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN y un sitio de poliadenilación . En un enfoque alteARNtivo, los oligonucleótidos que codifican un promotor promotor pol I canino del ARN, por ejemplo, el complemento de la terminación 3' o ambas terminaciones de los segmentos genómicos del virus pueden ligarse a la secuencia de codificación heteróloga para construir la molécula híbrida. La colocación de un gen o segmento externo de un gen externo dentro de una secuencia objetivo se estableció anteriormente por la presencia de sitios de enzimas de restricción apropiados dentro de la secuencia objetivo. Sin embargo, ciertos avances en la biología molecular han disminuido este problema mayormente. Los sitios de enzimas de restricción pueden fácilmente colocarse en cualquier sitio dentro de una secuencia objetivo a través del uso de mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, ver, por ejemplo, las técnicas descritas por Kunkel, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82:488). Las variaciones en la tecnología de reacción de cadena de polimerasa (PCR), descritas, también se permiten para la inserción específica de secuencias (es decir, sitios de enzimas de restricción) y permiten la construcción fácil de moléculas híbridas. AlteARNtivamente , las reacciones por PCR pueden usarse para preparar plantillas recombinantes sin la necesidad de clonación. Por ejemplo, las reacciones por PCR pueden usarse para preparar moléculas de ADN de hebra doble que contienen un promotor de polimerasa de ARN dirigido al ADN (por ejemplo, bacteriofase T3, T7 o SP6) y la secuencia de híbrido que contiene el gen heterólogo y un promotor pol I canino del ARN. Las plantillas de ARN pueden luego transcribirse directamente de este ADN recombinante . Todavía en otra modalidad, los ARNv recombinantes o ARNc correspondiente pueden prepararse al ligar los ARN para especificar la polaridad negativa del gen heterólogo y el promotor pol I canino del ARN usando una ligasa de ARN. El ARNm bicistrónico puede construirse para permitir el inicio interno de traducción de las secuencias víricas y permitir la expresión de secuencias de codificación de proteina exteARN del sitio de inicio de terminal regular. AlteARNtivamente, una secuencia de ARNm bicistrónico puede construirse en donde la secuencia vírica se traduce del cuadro de lectura abierto de terminal regular, mientras que la secuencia exteARN se inicia de un sitio interno. Ciertas secuencias del sitio de entrada de ribosoma inteARN (IRES) pueden utilizarse. Las secuencias IRES que se eligen deberán cortarse lo suficiente para no interferir con las limitaciones de empacado del virus. De esta manera, es preferible que las IRES elegidas para tal enfoque bicistrónico no sean más de 500 nucleótidos de longitud, con menos de 250 nucleótidos son preferidas. Además, es preferible que las IRES utilizadas no porten homología de secuencia o estructural con elementos picoARNvirales . Los elementos IRES preferidos incluyen, pero no se limitan a BiP FRES de mamíferos y IRES del virus de la hepatitis C. AlteARNtivamente, una proteína exteARN puede expresarse de una unidad transcripcional inteARN en la cual la unidad transcripcional tiene un sitio de inicio y sitio de poliadenilación . En otra modalidad, el gen externo se inserta en un gen del virus de ARN de hebra negativa de manera que la proteína expresada resultante es una proteína de fusión. .5 Métodos para generar virus recombinantes La presente invención proporciona métodos para generar virus de ARN de hebra negativa recombinante infeccioso al introducir vectores de expresión de proteínas y ARNv o ARNc correspondientes que expresan vectores de expresión de la invención en células hospederas en la ausencia del virus auxiliar. Preferiblemente, las células hospederas son células caninas, por ejemplo, células MDCK. La presente invención también proporciona métodos para generar virus de ARN de hebra negativa recombinante infeccioso al introducir los vectores de expresión de proteínas y ARNv o ARNc correspondientes que expresan vectores de expresión de la invención en células hospederas en la presencia de virus auxiliar. Las células hospederas pueden ser, por ejemplo, células caninas (tales como células MDCK), células Vero, células Per.C6, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK, células 293 (por ejemplo, células 293T) , y células COS. Los vectores de expresión de proteínas y vectores de expresión que dirigen la expresión de ARNv o ARNc correspondientes pueden introducirse en las células hospederas usando cualquier técnica conocida para aquellos de experiencia en la técnica sin limitación. Por ejemplo, los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en las células hospederas al emplear la electroporación, DEAE-dextrano, precipitación de fosfato de calcio, liposomas, microinyección, y bombardeo de microparticulas (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. , 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.). Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en las células hospederas simultáneamente o secuencialmente . En una modalidad, uno o más vectores de expresión que dirigen la expresión de ARNv o ARNc correspondientes se introducen en células hospederas previo a la introducción de los vectores de expresión que dirigen la expresión de proteínas virales. En otra modalidad, uno o más vectores de expresión que dirigen la expresión de proteínas virales se introducen en células hospederas previo a la introducción de uno o más vectores de expresión que dirigen la expresión de ARNv o ARNc correspondientes. De acuerdo con estas modalidades, los vectores de expresión que dirigen la expresión de los ARNv o ARNc correspondientes pueden introducirse juntos o separadamente en transfecciones diferentes. Además, de acuerdo con estas modalidades, los vectores de expresión que dirigen la expresión de las proteínas virales pueden introducirse juntos . o separadamente en transfecciones diferentes. En otra modalidad, uno o más vectores de expresión que dirigen la expresión de ARNv o ARNc correspondientes y uno o más vectores de expresión que dirigen la expresión de proteínas virales se introducen en células hospederas simultáneamente. En determinadas modalidades, todos los vectores de expresión se introducen en células hospederas usando liposomas. En una modalidad un método para producir un virus de la influenza recombinante se proporciona que comprende introducir en una población de vectores de expresión de las células caninas capaces de expresarse en los segmentos ARNv genómicos de las células para proporcionar los segmentos ARNv genómicos completos del virus, en donde los vectores de expresión comprenden nucleótidos 1-469 de SEQ ID NO: 26, o un fragmento funcionalmente activo del mismo; (b) introducir en los vectores de expresión de las células capaces de expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por ello las partículas víricas de la influenza se producen. En una modalidad, las concentraciones de las partículas víricas de la influenza producidas durante el cultivo de las células durante 48-72 horas es al menos 1.0 x 104 PFU/ml o al menos 1.0 x 105 PFU/ml. En una modalidad, un método para producir virus recombinantes de la influenza se proporcionan en donde el método comprende introducir en una población de vectores de expresión de las células caninas capaces de expresarse en los segmentos ARNv genómicos de las células para proporcionar los segmentos ARNv genómicos completos del virus, en donde los vectores de expresión comprenden nucleótidos 1-469 de SEQ ID NO: 26, o un fragmento funcionalmente activo del mismo; (b) introducir en los vectores de expresión de las células capaces de expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por ello partículas víricas de la influenza se producen. En una modalidad, las concentraciones de las partículas víricas de la influenza producidas durante el cultivo de las células durante 48-72 horas es al menos 1.0 x 104 PFU/ml o al menos 1.0 x 105 PFU/ml . Las cantidades y relaciones apropiadas de los vectores de expresión para efectuar un método de la invención pueden determinarse por experimentación de rutina. Como guía, en el caso de transfección liposomal o precipitación de calcio de los plásmidos en las células hospederas, se considera que cada plásmido puede emplearse a unos pocos µgs, por ejemplo, 1 hasta 10 µg, por ejemplo, diluido a una concentración de ADN total final de alrededor de 0.1 µg/ml previo a mezclarse con el reactivo de transfección en una manera convencional. Puede preferirse el uso de vectores que expresan subunidades de polimerasa de ARN dependiente de NP y/o ARN a una concentración alta que aquellos que expresan segmentos ARNv. Alguien experto en la técnica apreciará que las cantidades y relaciones de los vectores de expresión pueden variar dependiendo de las células hospederas.

En una modalidad, al menos 0.5 µ?, preferiblemente al menos 1 µ?, al menos 2.5 µg, al menos 5 µg, al menos 8 µg, al menos 10 µg, al menos 15 µg, al menos 20 µq , al menos 25 µq, o al menos 50 µ? de uno o más vectores de expresión de proteínas de la invención se introducen en células hospederas para generar virus de ARN de hebra negativa recombinante infeccioso. En otra modalidad, al menos 0.5 µg, preferiblemente al menos 1 µg, al menos 2.5 µg, al menos 5 µq , al menos 8 µg, al menos 10 µg, al menos 15 µg, al menos 20 µg, al menos 25 µg o al menos 50 µg de uno o más vectores de expresión de la invención que dirigen la expresión de ARNv o ARNc se introducen en células hospederas para generar virus de ARN de hebra negativa recombinante infeccioso. Las células hospederas que pueden usarse para generar los virus de ARN de hebra negativa de la invención incluyen células primarias, células cultivadas o secundarias, y células transformadas o inmortalizadas (por ejemplo, células 293, células 293T, células CHO, células Vero, células PK, MDBK, OMK y MDCK) . Las células hospederas son preferiblemente células de animales, más preferiblemente células de mamíferos, y más preferiblemente células caninas. En una modalidad preferida, los virus de ARN de hebra negativa recombinante infecciosos de la invención se generan en células MDCK. La presente invención proporciona métodos para generar virus de ARN de hebra negativa recombinante infeccioso en lineas celulares hospederas establemente transducidas . Las lineas células hospederas establemente transducidas de la invención pueden producirse al introducir ADNc controlado por elementos de control de expresión apropiada (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, secuencias de terminación de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) , y un marcador seleccionable en las células hospederas. Después de la introducción del ADN externo, las células transducidas pueden -permitirse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambia para un medio selectivo. El marcador seleccionable confiere resistencia a las células y permite que las células integren establemente el ADN en sus cromosomas. Las células hospederas transducidas con el ADN establemente integrado pueden clonarse y expandirse en las lineas celulares. Un número de sistemas de selección puede usarse, incluyendo pero no limitado a los genes de timidina cinasa del virus simple de herpes (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), fosforibosiltransferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026), y fosforibosiltransferasa de adenina (Lowy et al, 1980, Cell 22:817) pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, la resistencia de antimetabolito se puede usar como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a los genes de metotrexato (Wigler et al, 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al G-418 aminoglicósido (Colberre-Garapin et al, 1981, J. Mol. Biol . 150:1); e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al, 1984, Gene 30:147). Los virus de ARN de hebra negativa recombinante infecciosos generados por los métodos de la invención que no se atenúan, pueden atenuarse o eliminarse por, por ejemplo, métodos clásicos. Por ejemplo, los virus de ARN de hebra negativa recombinantes de la invención pueden eliminarse por tratamiento caliente o formalina, de manera que el virus no es capaz de replicarse. Los virus de ARN de hebra negativa recombinantes de la invención que no se atenúan pueden atenuarse por, por ejemplo, pasar a través de hospederos no naturales para producir virus de progenie que son inmunogénicos, pero no patogénicos. Los virus atenuados, vivos o eliminados producidos de acuerdo con la invención pueden incorporarse posteriormente en una composición de vacuna de manera convencional o usarse para producir virus adicionales, por ejemplo, en huevos. Donde tal virus tiene un segmento de ARNv quimérico como se discute arriba que codifica un antigeno externo, puede formularse para alcanzar la vacunación contra más de un patógeno simultáneamente. Los virus recombinantes atenuados producidos de acuerdo con la invención que poseen un segmento ARNv quimérico también pueden diseñarse para otros usos terapéuticos, por ejemplo, un agente anti-tumor o herramienta de terapia del gen, en cuyo caso la producción de los virus se seguirá por su incorporación en una composición farmacéutica apropiada junto con un portador o diluyen farmacéuticamente aceptable . El rescate libre del virus auxiliar de acuerdo con la invención se favorece particularmente para la generación de virus reagrupado, especialmente virus de la influenza reagrupados deseados para uso de vacuna particularmente ya que los métodos de selección no son necesarios para quitar el cultivo del virus auxiliar. Los métodos de la presente invención pueden modificarse para incorporar aspectos de los métodos conocidos para aquellos experimentos en la técnica, con objeto de mejorar la eficiencia de rescate de partículas víricas infecciosas. Por ejemplo, la técnica de genética inversa involucra la preparación de ARN virales recombinantes sintéticos que contienen las regiones sin codificación del ARN del virus de hebra negativa que son esenciales para el reconocimiento por polimerasas víricas y para señales de empacado necesarias para generar un virión maduro. Los ARN recombinantes se sintetizan de una plantilla de ADN recombinante y reconstituido in vitro con complejo de polimerasa vírica purificado para formar ribonucleoproteína recombinante (RNP, por sus siglas en inglés) que se pueden usar para células transíectadas . Una transfección más eficiente se realiza si las proteínas de polimerasa vírica se presentan durante la transcripción de los ARN sintéticos ya sea in vitro o in vivo. Los RNP recombinantes sintéticos pueden rescatarse en partículas de virus infecciosas. Las técnicas anteriores se describen en la Patente de E.U.A. No. 5,166,057 presentada el 24 de noviembre de 1992; en la Patente de E.U.A. No. 5,854,037 presentada el 29 de diciembre de 1998; en la Patente de E.U.A. No. 5,789,229 presentada el 4 de agosto de 1998; en la Publicación de Patente Europea EP 0702085A1, publicada el 20 de febrero de 1996; en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. de serie 09/152,845; en Publicaciones de Patente InteARNcional PCR O97/12032 publicada el 3 de abril de 1997; W096/34625 publicada el 7 de noviembre 1996; en la Publicación de Patente Europea EP-A780475; WO99/02657 publicada el 21 de enero de 1999; O98/53078 publicada el 26 de noviembre de 1998; O98/02530 publicada el 22 de enero de 1998; W099/15672 publicada el 1 de abril de 1999; WO98/13501 publicada el 2 de abril de 1998; WO97/06720 publicada el 20 de febrero de 1997; y EPO 780 47SA1 publicada el 25 de junio de 1997, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad . .5.1 Modalidades del Virus de ARN de Hebra Negativa Segmentada Especificas La presente invención proporciona un método para generar partículas virales recombinantes infecciosas en células cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa segmentada que tiene más de 3 segmentos de ARNv genómico, por ejemplo un virus de la influenza tal como un virus A de la influenza, el método comprende: (a) introducir en una población de células capaces de apoyar el crecimiento del virus, un primer conjunto de vectores de expresión capaces de expresar en los segmentos ARNv de células genómicas para proporcionar los segmentos de ARNv genómico completos del virus; (b) introducir en las células un segundo conjunto de vectores de expresión capaces de expresar ARNm codificando uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por ello se producen las partículas virales. En determinadas modalidades, las células son células caninas. En determinadas modalidades, las células son células MDCK. En determinadas modalidades, El virus recombinante es virus de influenza A o B. En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión se contienen en 1-8 plásmidos. En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión se contienen en un plásmido. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión se contienen en 1-8 plásmidos. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión se contienen en un plásmido. En determinadas modalidades, el primer, segundo, o ambos conjuntos de vectores de expresión se introducen por electroporación . En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión codifican cada segmento ARNv de un virus de la influenza. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión codifican el ARNm de uno o más o todos los polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el primer conjunto o segundo conjunto de vectores de expresión (o ambos conjuntos) comprenden un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia reguladora pol I canino del ARN de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN). En determinadas modalidades, el primer conjunto o segundo conjunto de vectores de expresión (o ambos conjuntos) codifican un ARNv o ARNm de un segundo virus. Por ejemplo, un conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifican el HA y/o NA ARNm y/o ARNv de un segundo virus de influenza. En una modalidad, el virus auxiliar se usa en el método. En una modalidad, las células cultivadas usadas en el método son células caninas. La presente invención proporciona un método para generar partículas virales recombinantes infecciosas en células cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa segmentada que tiene más de 3 segmentos ARNv genómicos, por ejemplo un virus de la influenza tal como un virus A de la influenza, el método comprende: a) introducir en una población de células capaces de apoyar el crecimiento del virus, un primer conjunto de vectores de expresión capaces de expresar en los segmentos ARNv de células genómicas para proporcionar los segmentos de ARNv genómico completos del virus y capaces de expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; (b) cultivar las células por ello se producen las partículas virales. En determinadas modalidades, las células son células caninas. En determinadas modalidades, las células son células MDCK. En determinadas modalidades, el virus es virus de influenza A o B. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión se comprenden en 1-17 plásmidos. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión se contiene en 1-8 plásmidos. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión se contiene en 1-3 plásmidos. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión se contiene en un plásmido. En determinadas modalidades, los conjuntos de vectores de expresión se introducen por electroporación . En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza y el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión comprende un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia reguladora pol I canino del ARN de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN) . En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica un ARNv o ARNm de un segundo virus. Por ejemplo, el conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifican el HA y/o NA ARNm y/o ARNv de un segundo virus de influenza. En determinadas modalidades, el primer conjunto o segundo conjunto de vectores de expresión (o ambos conjuntos) codifican un ARNv o ARNm de un segundo virus. Por ejemplo, un conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifican el HA y/o NA ARNm y/o ARNv de un segundo virus de influenza. En una modalidad, el virus auxiliar se usa en el método. En una modalidad, las células cultivadas usadas en el método son células caninas. La presente invención proporciona un método para generar partículas virales recombinantes infecciosas en células cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa, el método comprende: (a) introducir en una población de células capaces de apoyar el crecimiento del virus un primer conjunto de vectores de expresión capaces de expresar en las células ARNv genómico para proporcionar el ARNv genómico completo del virus; (b) introducir en las células un segundo conjunto de vectores de expresión capaces de expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por ello se producen las partículas virales. En determinadas modalidades, las células son células caninas. En determinadas modalidades, las células son células MDCK. En determinadas modalidades, el virus es virus B de la influenza. En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión se contiene en 1-8 plásmidos. En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión se contiene en un plásmido. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión se contiene en 1-8 plásmidos. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión se contiene un plásmido. En determinadas modalidades, el primer, segundo, o ambos conjuntos de vectores de expresión se introducen por electroporación . En determinadas modalidades, el primer conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza. En determinadas modalidades, el segundo conjunto de vectores de expresión codifica el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el primer conjunto o segundo conjunto de vectores de expresión (o ambos conjuntos) comprenden un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia reguladora pol I canina del ARN de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN) . En una modalidad, el virus auxiliar se usa en el método. En una modalidad, las células cultivadas usadas en el método son células caninas. La presente invención proporciona un método para generar partículas virales infecciosas en células cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa, el método comprende: (a) introducir en una población de células capaces de apoyar el crecimiento del virus un conjunto de vectores de expresión capaces de expresar ambos en las células del ARNv genómico para proporcionar el ARNv genómico completo del virus y capaces de expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; (b) cultivar las células por ello se producen las partículas virales. En determinadas modalidades, las células son células caninas. En determinadas modalidades, las células son células MDCK. En determinadas modalidades, el virus es virus B de la influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresiones contiene en 1-17 plásmidos. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión se contiene en 1-8 plásmidos. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión se contiene en 1-3 plásmidos. En determinadas modalidades, los conjuntos de vectores de expresión se introducen por electroporación . En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica cada segmento ARNv de un virus de la influenza y el ARNm de uno o más polipéptidos de influenza. En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión comprende un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, una secuencia reguladora pol I canina del ARN de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN). En determinadas modalidades, el conjunto de vectores de expresión codifica un ARNv o ARNm de un segundo virus. Por ejemplo, el conjunto de vectores comprende uno o más vectores que codifican el HA y/o NA mARM y/o ARNv de un segundo virus de influenza. En una modalidad, el virus auxiliar se usa en el método. En una modalidad, las células cultivadas usadas en el método son células caninas. La presente invención proporciona un método para generar partículas virales infecciosas en células caninas cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa segmentada que tiene más de 3 segmentos ARNv genómicos, por ejemplo un virus de la influenza tal como un virus A de la influenza, el método comprende: (a) proporcionar una primera población de células caninas capaces de apoyar el crecimiento del virus y que tiene un primer conjunto de vectores de expresión capaz de expresar directamente en los segmentos ARNv genómicos de células caninas para proporcionar los segmentos ARNv genómicos completos de los virus, o las ARNcs correspondientes, en la ausencia de un virus auxiliar para proporcionar cualquiera de tal segmento de ARN, las células caninas también son capaces de proporcionar una nucleoproteina y polimerasa de ARN dependiente del ARN por ello los complejos RNP que contienen los segmentos ARNv genómicos del virus se pueden formar y las partículas virales se pueden ensamblar dentro de las células caninas; y (b) cultivar las células caninas por ello se producen las partículas virales. En determinadas modalidades, las células caninas son células MDCK. La presente invención también proporciona un método para generar partículas virales infecciosas en células caninas cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa segmentada, el método comprende (i) proporcionar una primera población de células caninas que son capaces de apoyar el crecimiento del virus y que se modifican de modo para ser capaces de proporcionar (a) los ARNv genómicos del virus en la ausencia de un virus auxiliar y (b) una nucleoproteina y polimerasa de ARN dependiente del ARN por ello los complejos de ARN que contienen los ARNv genómicos se pueden formar y las partículas virales se pueden ensamblar, los ARNv genómicos se expresan directamente en las células bajo el control de una secuencia reguladora pol I canino del ARN, o derivado funcional del mismo; y (ii) cultivar las células caninas por ello se producen las partículas virales. La presente especificación también proporciona un método para generar partículas virales infecciosas en células cultivadas de un virus de ARN de hebra negativa segmentada, el método comprende: (i) proporcionar una población de células caninas que son capaces de apoyar el crecimiento del virus y que se modifican de manera que son capaces de proporcionar (a) las ARNv genómicas del virus en la ausencia de un virus auxiliar y (b) una nucleoproteína y polimerasa de ARN dependiente del ARN por ello el complejo o complejos RNP que contiene las ARNv genómicas se pueden formar y las partículas virales se pueden ¦ ensamblar, los ARNs genómicos se expresan directamente en las células caninas bajo el control de una secuencia reguladora Pol I canina del ARN o un derivado funcional del mismo, por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN como se describe anteriormente; y (ii) cultivar las células caninas por ello se producen las partículas virales. En una modalidad específica, un virus de ARN de hebra negativa recombinante infeccioso que tiene, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, o al menos 8 segmentos de ARNv genómico en una célula hospedera canina se genera usando los métodos descritos en la presente. En una modalidad específica, la presente invención proporciona métodos de generar virus de influenza recombinante infeccioso en células hospederas usando vectores de expresión para expresar los segmentos ARNv o ARNcs correspondientes y proteínas del virus de la influenza, en particular PB1, PB2, PA y NA. De acuerdo con esta modalidad, el virus auxiliar se puede o no puede incluir para generar los virus de influenza recombinantes infecciosos. Los virus de influenza recombinantes infecciosos de la invención pueden o no pueden reproducir y producir progenie. Preferiblemente, los virus de influenza recombinantes infecciosos de la invención se atenúan. Los virus de influenza recombinantes infecciosos atenuados pueden, por ejemplo, tener una mutación en el gen NS1. En determinadas modalidades, unos virus recombinantes infecciosos de la invención se pueden usar para producir otros virus útiles para prepare una composición de vacuna de la invención. En una modalidad, los virus recombinantes o reagrupados producidos por un método de la invención se usan para la producción de virus adicional para uso como una vacuna. Por ejemplo, una población los virus recombinantes o reagrupados producidos por los métodos de la invención que incorporan una secuencia reguladora pol I canica del ARN de la invención (por ejemplo, un promotor pol I canino del ARN) . Subsecuentemente, la población de los virus se cultiva en huevos u otro cultivo de tal manera que los virus adicionales se producen por la preparación de vacunas o una composición inmunogénica . En determinadas modalidades, los virus de influenza recombinantes infecciosos de la invención expresan secuencias heterólogas (es decir, virus sin influenza) . En otra modalidad, los virus de influenza recombinantes infecciosos de la invención expresan proteínas del virus de la influenza de diferentes hebras de influenza. En aún otra modalidad preferida, los virus de influenza recombinantes infecciosos de la invención expresan proteínas de fusión. 5.5.2 Introducción de vectores en células hospederas Los vectores que comprenden segmentos de genoma de influenza se pueden introducir (por ejemplo, transíectadas ) en células hospederas de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Publicaciones de Solicitud de Patente EUA nos. US20050266026 y 20050158342) para introducir ácidos nucleicos heterólogos en células eucarióticas , incluyendo, por ejemplo, co-precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. Por ejemplo, vectores, por ejemplo, plásmidos, se pueden transfectar en células hospederas, tales como, por ejemplo, células MDCK, células COS, células 293T, o combinaciones de los mismos, usando el reactivo de transfección de poliamina TransIT-LTl (Minis) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1 g de cada vector para introducirse en una población de células hospederas se pueden combinar con aproximadamente 2 µ? de TransIT-LTl diluido en medio 160 µ?, preferiblemente medio libre de suero, en un volumen total de 200 µ?. El ADN : mezclas de reactivo de transfección se puede incubar a temperatura ambiente durante 45 min seguido por la adición de 800 µ? de medio. La mezcla de transfección luego se agrega a las células hospederas, y las células se cultivan como se describe anteriormente. En consecuencia, para la producción de los virus recombinantes o reagrupados en cultivo celular, los vectores incorporados en cada uno de los 8 segmentos del genoma, (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA) se mezclan con aproximadamente 20 µ? TransIT-LTl y transfectados en células hospederas. Opcionalmente, el medio que contiene suero se reemplaza primero para transfección con medio libre de suero, por ejemplo, Opti-ME I, e incubado durante 4-6 horas. AlteARNtivamente, la electroporación se puede emplear para introducir vectores que incorporan segmentos de genoma de influenza en células hospederas. Ver, por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente EUA US20050266026 y 20050158342, que se incorporan para referencia en la presente. Por ejemplo, los vectores de plásmidos que incorporan un virus de influenza A o de influenza B se introducen en células MDCK usando electroporación de acuerdo al procedimiento siguiente. En breve, 5 x 106 de células MDCK, por ejemplo, cultivo en Medio Eagle Modificado (MEM) suplementado con Suero de Bovino Fetal 10% (FBS) se resuspenden en 0.3 mi de OptiMEM y se coloca en una cubeta de electroporación. Veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 µ? se agregan a las células en la cubeta, que luego se mezcla suavemente por golpeo. La electroporación se realiza de acuerdo a las instrucciones del fabricante (por ejemplo, BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected) a 300 voltios, 950 microFarads con una constante de tiempo de entre 35-45 msec. Las células se volvieron a mezclar por golpeo suave y aproximadamente 1-2 minutos seguidos de electroporación 0.7 mi de OPTI-MEM se agregan directamente a la cubeta. Las células luego se transfieren a dos pozos de un plato de cultivo de tejido de 6 pozos estándar que contiene 2 mi de OPTI-MEM sin suero. La cubeta se lava para recuperar cualquiera de las células restantes y la suspensión lavada se divide entre los dos pesos. El volumen final es aproximadamente 3.5 mis. Las células luego se incuban bajo condiciones permisibles para el crecimiento viral, por ejemplo, a aproximadamente 33°C para cepas adaptadas frías . La orientación adicional en la introducción de vectores en células hospederas se puede encontrar, por ejemplo, en Patente EUA Nos. 6,951,754, 6,887,699, 6,649,372, 6,544,785, 6,001,634, 5,854,037, 5,824,536, 5,840,520, 5,820,871, 5,786,199, y 5,166,057 y Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. Nos. 20060019350, 20050158342, 20050037487, 20050266026, 20050186563, 20050221489, 20050032043, 20040142003, 20030035814, y 20020164770. .6 Cultivo celular Típicamente, la propagación del virus se logra en las composiciones de medios en las cuales la célula hospedera se cultiva comúnmente. Las células hospederas adecuadas para la replicación de virus de influenza incluyen, por ejemplo, Células Vero, células Per.C6, células BHK, células MDCK, células 293 y células COS, incluyendo células 293T, células C0S7. Las células MDCK se prefieren en el contexto de la presente invención. El uso de células tumorigénicas MDCK no tumorigénica como células hospederas también es una modalidad de la invención. Los co-cultivos incluyen dos de las líneas celulares anteriores, por ejemplo, células MDCK y ya sea células 293T o COS también se pueden emplear en una relación, por ejemplo, de 1:1, para mejorar la eficiencia de replicación. Ver, por ejemplo, 20050158342. Típicamente, las células se cultivan en un medio de cultivo comercial estándar, tales como medio Eagle modificado Dulbecco suplementado con suero (por ejemplo, suero bovino fetal al 10%), o en medio libre de suero, bajo humedad controlada y concentración de C02 adecuado para mantener el pH de solución amortiguado neutral {por ejemplo, a pH entre 7.0 y 7.2) . Opcionalmente , el medio contiene antibióticos para prevenir crecimiento bacteriano, por ejemplo, penicilina, estreptomicina, etc., y/o nutrientes adicionales, tales como L-glutamina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, suplementos adicionales para promover características de crecimiento favorables, por ejemplo, tripsina, ß-mercaptoetanol , y los similares. Los procedimientos para mantener células mamíferas en cultivo se han reportado extensivamente, y son conocidas por aquellos de habilidad en la técnica. Los protocolos generales se proporcionan, por ejemplo, en Freshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture. 5a ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam. Los detalles con respecto a los procedimientos del cultivo de tejido de interés particular en la producción de virus de influenza in vitro incluye, por ejemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. In Cohén and Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines, que se incorpora en la presente en su totalidad. Adicionalmente, las variaciones de tales procesos adaptados a la presente invención se determinan fácilmente a través de experimentación de rutina. Las células para la producción del virus de influenza se pueden cultivar en medio que contiene suero o libre de suero. En algunos casos, por ejemplo, para la preparación de virus purificados, se desea para crecer las células hospederas en condiciones libre de suero. Las células se pueden cultivar a pequeña escala, por ejemplo, menos de 25 mi de medio, tubos de cultivo o matraces o en matraces largos con agitación, en botellas rotatorias, o en perlas microportadoras (por ejemplo, perlas microportadoras DEAE-Dextran, tales como Dormacell, Pfeifer & Langen; -Superbead, Flow Laboratories; perlas de copolimero-tri-metilamina de estireno, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) en matraces, botes o reactores de cultivo. Las perlas microportadoras son esferas pequeñas (en el intervalo de 100-200 micrones de diámetro) que proporciona un área de superficie larga para crecimiento celular adherente por volumen del cultivo celular. Por ejemplo un litro sencillo de medio puede incluir más de 20 millones de perlas microportadoras proporcionando más de 8000 centímetros cuadrados de crecimiento de superficie. Para producción comercial de virus, por ejemplo, para la producción de vacunas, a menudo se desea para cultivar las células en un birreactor o termentador. Los bioreactores están disponibles en volúmenes desde bajo 1 litro hasta en exceso de 100 litros, por ejemplo, Bioreactor Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN) ; bioreactores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, N. J. ) ; bioreactores a escala de laboratorio y comercial de B. Braun Biotech InteARNtional (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania) .

A pesar del volumen del cultivo, en el contexto de la presente invención, los cultivos se pueden mantener a una temperatura menor de o igual a 35°C, para asegurar eficiente recuperación de virus de influenza recombinante y/o reagrupados, particularmente virus de influenza recombinante y/o reagrupados atenuados de temperatura sensible adaptados al frió. Por ejemplo, las células se cultivan a una temperatura entre alrededor de 32°C y 35°C, típicamente a una temperatura de entre alrededor de 32°C y alrededor de 3 °C, usualmente en alrededor de 33°C. Típicamente, un regulador, por ejemplo, un termotasto, u otro dispositivo para detener y mantener la temperatura del sistema de cultivo celular se emplea para asegurar que la temperatura no exceda 35°C durante el periodo de la replicación del virus. .7 Recuperación de los virus Los virus son típicamente recuperados del medio de cultivo, en que células infectadas (transfectadas) se han cultivado. El medio crudo típicamente se clarifica antes para la concentración de virus de la influenza. Los métodos comunes incluyen filtración, ultrafiltración, adsorción en sulfato de bario y elución, y centrifugación. Por ejemplo, medio crudo de cultivos infectados se puede primero clarificar por centrifugación a, por ejemplo, 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para remover desechos de células y otras materias particulares largas, por ejemplo, entre 10 y 30 minutos. AlteARNtivamente , el medio se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa 0.8 i para remover células intactas y otras materias particulares largas. Opcionalmente , el sobre nadante medio clarificado luego se centrifuga para peletizar los virus de la influenza, por ejemplo, a 15,000 x g, durante aproximadamente 3-5 horas. Después de volver a suspender el virus peletizado en una solución amortiguadora apropiada, tales como STE (Tris-HC10.01 M; NaC10.15 M; EDTA 0.0001 M) o solución amortiguadora salina de fosfato (PBS) a pH 7.4 , el virus se concentra por centrifugación de gradiente de densidad en sacarosa (60%-12%) o tartrato de potasio 50%-10%) . Ya sean gradientes continuos o por etapas, por ejemplo, un gradiente de sacarosa entre 12% y 60% en cuatro etapas 12%, son adecuadas. Los gradientes se centrifugan a una velocidad, y durante un tiempo, suficiente para concentrar los virus en una banda visible para recuperar. AlteARNt ivamente , y durante solicitudes comerciales a escala más largas, los virus se eluyen de gradientes de densidad usando un rotor centrifugo zonal operando en modo continuo. Los detalles adicionales suficientes para guiar a alguien de habilidad a través de la preparación de virus de la influenza de cultivos de tejido se proporcionan, por ejemplo, in Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohén & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 1 1- 151, y patentes de Estados Unidos de América no. 5,690,937, solicitud de publicación E.U.A. nos. 20040265987, 20050266026 y 20050158342, las cuales se incorporan en la presente para referencia. Si se desea, los virus recuperados se pueden almacenar a -8°°C en la presencia de sucrosa-fosfata (SPG) como un estabilizador. .8 Virus de la influenza El genoma de virus de la influenza se compone de ocho segmentos del ácido ribonucleico de hebra lineal (-) (ARN) , que codifica la hemaglutinina inmunogénica (HA) y proteínas de neuraminidasa (NA), y seis polipéptidos de núcleo interno: la nucleoproteína de nucleocápsida (NP) ; proteínas de matriz (M) ; proteínas no estructurales (NS); y polimerasa de proteínas de ARN 3 (PA, PB1, PB2) . Durante la replicación, el ARN viral genómico se transcribe en ARN mensajero de hebra ( + ) y ARNc genómico de hebra (-) en los núcleo de la célula hospedera. Cada uno de los ochos segmentos genómicos se empaquetan en complejos de ribonucleoproteína que contiene, en adición al ARN, NP y un complejo de polimerasa (PB1, PB2, y PA) . Los virus de la influenza que se pueden producir por los procesos de la invención en las células MDCK de la invención incluyen pero no se limitan a, virus reagrupados que incorporan antígenos de hemaglutinina , y/o neuraminidasa seleccionados en el contexto de una cepa maestra sensible de temperatura atenuada aprobada. Por ejemplo, los virus pueden comprender cepas maestras que son uno o más de, por ejemplo, sensibles a la temperatura (ts), adaptados frío (ca), o uno atenuado (att) (por ejemplo, A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, PR8, B/Leningrad/1 /17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14 /55 , B/England/2608/76, A/Puerto Rico/8/34 (es decir, PR8 ) , etc. o variantes antigénicas o derivados de los mismos) . .9 Vacunas del virus de influenza Históricamente, las vacunas del virus de influenza se han producido en huevos de gallinas embriónicos usando cepas de virus seleccionados basados en predicciones empíricas de cepas relevantes. Más recientemente, los virus reagrupados se han producido para incorporar antígenos de hemaglutinina y neuraminidasa seleccionados en el contexto de una cepa de una cepa maestra sensible a la temperatura atenuada aprobada. Después del cultivo del virus a través de múltiples pasajes en huevos de gallinas, los virus de la influenza se recuperan y, opcionalmente , inactivados, por ejemplo, usando formaldehído y/o ß-propiolactona . Sin embargo, la producción de vacuna de influenza de esta manera tiene varios inconvenientes importantes. Los contaminantes restantes de los huevos de gallina son altamente antigénicos, pirogénicos, y frecuentemente resulta en efectos colaterales importantes sobre la administración. Más importantemente, las cepas designadas para la producción debería seleccionarse y distribuirse, típicamente meses en avances de la siguiente temporada de resfriados para permitir tiempo para la producción e inactivación de vacunas de influenza. Los intentos para producir vacunas recombinantes o reordenadas en cultivo celular se han obstaculizado por la incapacidad de cualquiera de las cepas aprobadas para la producción de vacunas para crecimiento eficientemente bajo condiciones de cultivo estándar. La presente invención proporciona un sistema de vector, composiciones y métodos para producir virus recombinantes y reagrupados en cultivos que hacen lo posible para producir rápidamente vacunas correspondientes a una o más cepas antigénicas seleccionadas del virus. En particular, las condiciones y cepas que se proporcionan resultan en producción eficiente de virus de un sistema de multiplásmido en cultivo celular. Opcionalmente, si se desea, los virus se pueden amplificar además en huevos de gallina o cultivar células que difieren de los cultivos usados para rescatar al virus. Por ejemplo, no se ha permitido crecer la cepa maestra B de influenza B/Ann Arbor/1/66 bajo condiciones de cultivo celular estándar, por ejemplo, a 37°C. En los métodos de la presente invención, plásmidos múltiples, cada uno incorporando un segmento de un genoma de virus de influenza se introduce en células adecuadas, y se mantienen en cultivo a una temperatura menor de o igual a 35°C. Típicamente, los cultivos se mantienen entre alrededor de 32°C y 35°C, preferiblemente entre alrededor de 32°C y alrededor de 34°C, por ejemplo, alrededor de 33°C. Típicamente, los cultivos se mantienen en un sistema, tal como un incubador de cultivo celular, bajo humedad controlada y C02, a temperatura constante al usar un regulador de temperatura, tal como un termostato para asegurar que la temperatura no exceda 35 °C . Los virus reagrupados de la influenza se pueden obtener fácilmente al introducir un subconjunto de vectores que comprenden el ADNc que codifica los segmentos genómicos de un virus maestro de la influenza, en combinación con segmentos complementarios derivados de cepas de interés (por ejemplo, variantes antigénicas de interés) . Típicamente, las cepas maestras se seleccionan sobre la base de las propiedades deseables relevantes para la administración de vacunas. Por ejemplo, para la producción de vacunas, por ejemplo, para la producción de una vacuna viva atenuada, la cepa del virus donador maestro se puede seleccionar para un fenotipo atenuado, adaptación en frío y/o sensibilidad a la temperatura. En este contexto, la cepa de la influenza A ca A/ Ann Arbor/6/60; cepa de influenza B ca B/ Ann Arbor/1/66; u otra cepa seleccionada por sus propiedades fenotípicas deseables, por ejemplo, una cepa sensible a la temperatura y/o adaptada al frío, atenuada, se seleccionan favorablemente como cepas maestras donadoras. En una modalidad, los plásmidos que comprenden ADNc que codifica los seis segmentos internos de ARNv de la cepa del virus maestro de la influenza, (es decir, PB1, PB2, PA, NP, NB, MI, BM2, NS1 y NS2) se transfectan en células hospederas adecuadas en combinación con ADNc que codifica segmentos de ARNv de hemaglutinina y neuraminidasa a partir de una cepa antigénicamente deseable, por ejemplo, una cepa predicha para provocar una infección importante local o global de influenza. Después de la replicación del virus reagrupado en el cultivo celular a temperaturas para una recuperación eficiente, por ejemplo, igual a o menor que 35 °C, tal como entre alrededor de 32 °C y 35 °C, por ejemplo entre alrededor de 32 °C y alrededor de 34 °C, o a alrededor de 33 °C, los virus reagrupados se recuperan. Opcionalmente, el virus recuperado se puede inactivar al usar un agente desnaturalizante tal como formaldehído o ß-propiolactona . .10 Métodos y composiciones para la administración profiláctica de vacunas Los virus reagrupados y recombinantes de la invención se pueden administrar profilácticamente en un portador o excipiente apropiado para estimular una respuesta inmune específica para una o más cepas del virus de la influenza. Típicamente, el portador o el portador o excipiente es un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina acuosa, soluciones salinas amortiguadas acuosas, soluciones acuosas de dextrosa, soluciones acuosas de glicerol, etanol, fluido alantoico de huevos de gallina no infectados (es decir, fluido alantoico normal "NAF") o combinaciones de los mismos. La preparación de tales soluciones que asegura la esterilidad, pH, isotonicidad, y estabilidad se efectúa de acuerdo con los protocolos establecidos en la técnica. Generalmente, se selecciona un portador o excipiente para minimizar los efectos alérgicos y otros efectos indeseables, y para ajusfar la vía particular de administración, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intranasal, etc. Generalmente, los virus de la influenza de la invención se administran en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmune específica para una o más cepas del virus de la influenza. Preferiblemente, la administración de los virus de la influenza produce una respuesta inmune protectora. Las dosificaciones y métodos para producir una respuesta inmune protectora contra una o más cepas de influenza se conoce por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los virus de la influenza inactivados se proporcionan en el intervalo de alrededor de 1-1000 HID50 (dosis infecciosa humana) , es decir, alrededor de 105 -108 pfu (unidades formadoras de placas) por dosis administrada. AlteARNtivamente, alrededor de 10-50 yg, por ejemplo, alrededor de 15 yg HA se administran sin un adyuvante, con las dosis más pequeñas que se administran con un adyuvante. Típicamente, la dosis se ajustará dentro de este intervalo con base en, por ejemplo, edad, condición física, peso corporal, sexo, dieta, tiempo de administración, y otros factores clínicos. La formulación de vacunas profilácticas se administra sistémicamente, por ejemplo, por inyección subcutánea o intramuscular al usar una aguja y jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. AlteARNtivamente, la formulación de vacunas se administra intranasalmente, ya sea por gotas, aerosol de partículas grandes (mayores de alrededor de 10 micrones), o rocío dentro del tracto respiratorio superior. Aunque cualquiera de las vías anteriores de administración resulta en una respuesta inmune sistémica protectora, la administración intranasal confiere el beneficio adicional de producir inmunidad en la mucosa en el sitio de entrada del virus de la influenza. Para administración intranasal, las vacunas de virus vivo atenuado se prefieren a menudo, por ejemplo, un virus de influenza reagrupado o recombinante sensible a la temperatura y/o adaptado al frío, atenuado. Aunque la estimulación de una respuesta inmune protectora con una dosis sencilla se prefiere, se pueden administrar dosis adicionales, por la misma o diferente vía, para lograr el efecto profiláctico deseado. AlteARNtivamente, se puede estimular una respuesta inmune por el ataque ex vivo o in vivo de células dendriticas con virus de la influenza. Por ejemplo, las células dendriticas proliferadoras se exponen a virus en una cantidad suficiente y por un periodo de tiempo suficiente para permitir la captura de los antigenos de la influenza por las células dendriticas. Las células luego se transfieren dentro de un sujeto a vacunarse por métodos estándar de transplante intravenoso. Opcionalmente , la formulación para la administración profiláctica de los virus de la influenza, o subunidades de los mismos, también contiene uno o más adyuvantes para potenciar la respuesta inmune a los antigenos de la influenza. Los adyuvantes adecuados incluyen: saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas para superficie tales como lisolecitina , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburos, bacilo Calmette-Guerin (BCG) , Corynebacterium parvum, y los adyuvantes sintéticos QS-21 y MF59. Si se desea, la administración de la vacuna profiláctica del virus de la influenza se puede efectuar en conjunto con la administración de una o más moléculas inmunoestimuladoras . Moléculas inmunoestimuladoras incluyen varias citoquinas, linfocinas, y quimiocinas con actividades inmunoestimuladoras , inmunopotenciadoras , y pro-inflamatorias, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 12, IL- 13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulador de colonias (CSF) de granulocitos-macró.fagos (GM) ) ; y otras moléculas inmunoestimuladoras , tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras se pueden administrar en la misma formulación como los virus de la influenza, o se pueden administrar separadamente. Ya sea la proteina o un vector de expresión que codifica la proteina se pueden administrar para producir un efecto inmunoestimulador . En otra modalidad, los vectores de la invención que incluyen segmentos del genoma de la influenza se pueden emplear para introducir ácidos nucleicos heterólogos dentro de un organismo hospedero o célula hospedera, tales . como una célula de mamíferos, por ejemplo, células derivadas de un sujeto humano, en combinación con un portador o excipiente farmacéutico adecuado como se describe anteriormente. Típicamente, el ácido nucleico heterólogo se inserta dentro de una región no esencial de un gen o segmento de genes, por ejemplo, el gen M del segmento 7. La secuencia heteróloga de polinucleótidos puede codificar un polipéptido o péptido, o un ARN tal como un ARN antisentido o ribozima. El ácido nucleico heterólogo luego se introduce dentro de un hospedero o células hospederas al producir virus recombinantes que incorporan el nucleico heterólogo, y los virus se administran como se describe anteriormente. En una modalidad, la secuencia heteróloga de polinucleótidos no se deriva de un virus de la influenza . AlteARNtivamente , un vector de la invención que incluye un ácido nucleico heterologo se puede introducir y expresar en células hospederas al co-transfectar el vector dentro de una célula infectada con un virus de la influenza. Opcionalmente , las células luego se regresan o administran al sujeto, típicamente al sitio a partir del cual se obtuvieron. En algunas aplicaciones, las células se injertan sobre un tejido, órgano o sitio del sistema (como se describe anteriormente) de interés, usando procedimientos establecidos de transferencia celular o injerto. Por ejemplo, células madre del linaje hematopoyético, tales como médula ósea, sangre del cordón umbilical, o células madre hematopoyéticas derivadas de sangre periférica se pueden administrar a un sujeto al usar técnicas de transfusión o administración estándar. AlteARNtivamente , los virus que comprenden un ácido nucleico heterologo se pueden suministrar a las células de un sujeto in vivo. Típicamente, tales métodos involucran la administración de partículas del vector a una población de células objetivo (por ejemplo, células sanguíneas, células de la piel, células del hígado, células neuronales (incluyendo el cerebro), células del riñon, células uterinas, células musculares, células intestinales, células cervicales, células vaginales, células de la próstata, etc., así como células de tumor derivadas de una variedad de células, tejidos y/u órganos. La administración puede ser ya sea sistémica, por ejemplo, por la administración intravenosa de partículas virales, o al suministrar las partículas virales directamente al sitio o sitios de interés por una variedad de métodos, incluyendo inyección (por ejemplo, al usar una aguja o jeringa), administración de vacuna sin aguja, administración tópica, o empujar dentro de un tejido, órgano o sitio en la piel. Por ejemplo, las partículas del vector viral se pueden administrar por inhalación, oralmente, intravenosamente, subcutáneamente, subdermalmente , intradermalmente , intramuscularmente , intraperitonealmente, intratecalmente, por administración vaginal o rectal, o al colocar las partículas virales dentro de una cavidad u otro sitio del cuerpo, por ejemplo, durante la cirugía. Los métodos antes descritos son útiles para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad o trastorno al introducir un vector de la invención que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido terapéuticamente o profilácticamente efectivo (o péptido) o ARN (por ejemplo, un ARN antisentido o ribozima) dentro de una población de células objetivo in vitro, ex vivo o in vivo. Típicamente, el polinucleótido que codifica el polipéptido (o péptido) , o ARN, de interés es ligado operativamente a secuencias reguladoras apropiadas como se describen anteriormente en las secciones tituladas "Vectores de expresión" y "Elementos de Expresión Adicionales." Opcionalmente, más de una secuencia de codificación heteróloga se incorpora dentro de un vector o virus sencillo. Por ejemplo, además de un polinucleótido que codifica un polipéptido o ARN terapéuticamente o profilácticamente activo, el vector también puede incluir polipéptidos adicionales terapéuticos o profiláctivos , por ejemplo, antigenos, moléculas co-estimuladoras , citoquinas, anticuerpos, etc., y/o marcadores, y los similares. En una modalidad, la invención proporciona composiciones que comprenden virus reagrupados y recombinant es de la invención (o porciones de los mismos) que se han tratado con un agente tal como benzonasa, para eliminar los oncogenes potenciales. En consecuencia, una composición de vacuna libre de oncogen se incluye específicamente dentro de las modalidades de la invención . Los métodos y vectores de la presente invención se pueden usar para tratar terapéuticamente o profilácticamente una amplia variedad de trastornos, incluyendo trastornos genéticos y adquiridos, por ejemplo, como vacunas para enfermedades infecciosas, debidas a virus, bacterias, y los similares. .11 Kits Para facilitar el uso de los vectores y sistemas de vectores de la invención, cualquiera de los vectores, por ejemplo, plásmidos de consenso del virus de la influenza, plásmidos variantes de polipéptidos de la influenza, plásmidos de la colección de polipéptidos de la influenza, etc., y componentes adicionales, tales como, solución amortiguadora, células, medio de cultivo, útil para empaque e infección de virus de la influenza para propósitos experimentales o terapéuticos, se pueden empacar en forma de un kit . Típicamente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales los cuales pueden incluir, por ejemplo instrucciones para efectuar los métodos de la invención, material de empaque, y un recipiente. .12 Manipulación de ácidos nucleicos y proteínas virales En el contexto de la invención, los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias reguladoras caninas de ARN pol I u otros ácidos nucleicos de la invención, vectores de expresión, ácidos nucleicos y/o proteínas del virus influenza y los similares, se manipulan de acuerdo con técnicas bien conocidas de biología molecular. Los protocolos detalladas para diversos de tales procedimientos, incluyendo amplificación, clonación, mutagénesis, transformación, y los similares, se describen en, por ejemplo, en Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (complementado a lo largo del 2000) John Wiley & Sons, New York ( "Ausubel " ) ; Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook"), y Berger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger") . Además de las referencias anteriores, protocolos para las técnicas de amplificación in vitro, tales como la reacción en cadena de polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR) , amplificación de £^-replicasa , y otras técnicas mediadas por la polimerasa del ARN (por ejemplo, NASBA) , útiles por ejemplo, para amplificar sondas de ADNc de la invención, se encuentran en Mullís et al. (1987) Patente de E.U.A. No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) ("Innis"); Arnheim y Levinson (1990) C&EN 36; The JouARNl Of NIH Research (1991) 3:81; Kwoh et al. (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc Nati Acad Sci USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J Clin Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241 :1077; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291; u y Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13:563. Métodos adicionales, útiles para la clonación de ácidos nucleicos en el contexto de la presente invención, incluyen Wallace et al., patente de E.U.A. No. 5,426,039. Los métodos mejorados de amplificación de ácidos nucleicos grandes por PCR se resumen en Cheng et al. (1994) Nature 369:684 y las referencias allí. Ciertos polinucleótidos de la invención, por ejemplo, oligonucleótidos se pueden sintetizar la utilizar diversas estrategias de fase sólida incluyendo química de acoplamiento con fosforamidita basada en mononucleótidos y/o trinucleótidos . Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleicos se pueden sintetizar por la adición secuencial de monómeros y/o trímeros activados para alargar la cadena de polinucleótido . Ver por ejemplo, Caruthers, M.H. et al. (1992) Meth Enzymol 211 :3. En lugar de sintetizar las secuencias deseadas, se puede ordenar a la medida esencialmente cualquier ácido nucleico a partir de una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen, Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies, Inc. (www.operon.com), y muchos otros. Además, las sustituciones de residuos de aminoácidos seleccionados se puede lograr mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. Por ejemplo, los polipéptidos virales con sustituciones de aminoácidos correlacionados funcionalmente con la característica fenotípica deseable, por ejemplo, un fenotipo atenuado, adaptación al frió, sensibilidad a la temperatura, se pueden producir al introducir mutaciones especificas dentro de un segmento viral de ácido nucleico que codifique el polipéptido. Los métodos para la mutagénesis dirigida al sitio son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Ausubel, Sambrook, y Berger, supra. Numerosos kits para efectuar la mutagénesis dirigida al sitio están comercialmente disponibles, por ejemplo, el kit Chameleon para mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene, La Jolla) , y se pueden usar según las instrucciones del fabricante para introducir, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos, dentro de un segmento del genoma que codifica un polipéptido de influenza A o B, respectivamente . .13 Otros Virus Los ácidos nucleicos, vectores, y métodos de la presente invención también se pueden usar para la expresión y purificación de otros virus recombinantes . La siguiente discusión proporciona guia para consideraciones importantes en adaptar los vectores para uso con otros de tales virus. Si el virus objetivo comprende un genoma de ARN segmentado, de hebra positiva, un promotor pol I canino del ARN se localiza, preferiblemente, corriente arriba del ADNc en la unidad interior de transcripción (sistema unidireccional).

En esta modalidad, el ARN de hebra positiva se genera para la incorporación directa dentro de nuevos virus. Sin embargo, las modalidades en donde los virus objetivo comprenden una hebra negativa, se producen genomas de ARN segmentados al usar el sistema unidireccional, están dentro del alcance de la invención . Si el virus objetivo comprende un genoma de ARN segmentado, de hebra negativa, el promotor pol I canino del ARN se localiza, preferiblemente, corriente abajo del ADNc en la unidad interior de transcripción (sistema bidireccional ) . En esta modalidad, el ARN de hebra negativa se genera para la incorporación directa dentro de nuevos virus. Las modalidades en donde los virus objetivo que comprenden genomas de ARN segmentados de hebra positiva, se producen con el sistema bidireccional están dentro del alcance de la invención. La presente invención también se puede usar para producir virus que comprenden genomas de ARN no segmentados infecciosos o no infecciosos (de hebra sencilla o de hebra doble) . En general, la introducción sencilla del ARN genómico viral infeccioso dentro de una célula hospedera es suficiente para provocar el inicio del ciclo de vida viral dentro de la célula y la producción eventual de virus completos. Por ejemplo, la introducción sencilla del ARN genómico picoARNviral dentro de una célula hospedera es suficiente para provocar la generación de picoARNvirus completos. El inicio del ciclo de vida de un virus que comprende ARN genómico no infeccioso, típicamente, requiere de la introducción adicional de otras proteínas virales las cuales se llevan usualmente dentro de la partícula viral junto con el genoma. Por ejemplo, el virus de la parainfluenza III lleva una polimerasa de ARN dependiente del ARN cuya presencia se requiere dentro de una célula hospedera recientemente infectada para el inicio de la replicación del ARN genómico viral y transcripción de los ARNm virales; en la ausencia de la polimerasa, el ARN genómico de la parainfluenza III no es infeccioso, En modalidades de la presente invención en donde se generan los virus que comprenden ARNs genómicos no segmentados, infecciosos, la introducción sencilla de un plásmido de expresión dual de la invención, que lleve un ácido nucleico que incluya el genoma viral, dentro de una célula hospedera adecuada, es suficiente para provocar la generación de virus completos. En las modalidades en donde se generan los virus que comprenden ARN genómico no segmentado no infeccioso, los plásmidos de expresión adicional también deben introducirse dentro de una célula hospedera junto con el plásmido de expresión dual que lleva el genoma viral. El plásmido adicional debe expresar las proteínas requeridas para el inicio del ciclo de vida viral, las cuales se introducen normalmente dentro de una célula hospedera con la infección (por ejemplo, polimerasas de ARN dependientes del ARN). En las modalidades en donde el picoARNvirus , el cual comprende un genoma de ARN no segmentado, infeccioso, se produce, se inserta el ADNc que comprende el genoma viral completo dentro del plásmido de expresión del promotor dual de la invención. Un promotor corriente arriba en una unidad de transcripción exterior, preferiblemente, un promotor pol II, dirige la producción del ARNm de hebra positiva que comprende el genoma viral completo, una poliproteina se traduce del ARNm y se dividen y liberan las proteínas individuales de la poliproteina (por ejemplo, por una proteasa dentro de la poliproteina) . Ya que el genoma viral comprende ARN de hebra positiva, un segundo promotor corriente arriba en una unidad de transcripción interior (sistema unidireccional), preferiblemente pol I de ARN canino, dirige la producción de una copia de hebra positiva del genoma. Si el genoma viral comprendía un ARN de hebra negativa, un segundo promotor corriente abajo, en una unidad de transcripción interior (sistema bidireccional ) , preferiblemente pol I de ARN canino, dirigiría la producción de una cpa de hebra negativa del genoma. Las modalidades en donde los virus de hebra negativa, no segmentados de ARN se producen al usar el sistema unidireccional están dentro del alcance de la invención. Similarmente, las modalidades en donde los virus de hebra positiva, no segmentados de ARN se producen al usar el sistema bidireccional están dentro del alcance de la invención. Los virus que comprenden genomas no infecciosos de ARN sin segmentar, en donde no se produce una poliproteina , también se puede generar con la presente invención. Por ejemplo, el presente sistema se puede usar para producir virus de rhabdoviridae o virus de paramyxoviridae , preferiblemente virus de la parainfluenza III, cuyo ciclo de vida incluye normalmente la producción de ARNms múltiples monocistrónicos a partir de ARN genómico de hebra negativa, por una polimerasa de ARN dependiente de ARN derivado viralmente; las proteínas individuales se expresan a partir de los ARNms monocistrónicos. En estas modalidades, una unidad de transcripción exterior que comprende un promotor, preferiblemente un promotor pol II, dirige la producción de una copia policistrónica , de hebra positiva del genoma viral a partir del cual, generalmente, solamente se traduce el primer gen (NP) . Adicionalmente, una unidad de transcripción interior que comprende un promotor, preferiblemente un promotor canino pol I, dirige la expresión de una copia de ARN del genoma para la incorporación dentro de nuevos virus. Ya que el genoma viral de parainfluenza III comprende ARN de hebra negativa, el promotor de la unidad de transcripción interior se localiza preferiblemente corriente abajo del ADNc (sistema bidireccional ) . Si el genoma viral comprende ARN de hebra positiva, el promotor de la unidad de transcripción interior se localiza preferiblemente corriente arriba del ADNc (sistema unidireccional). Las modalidades en donde los virus que comprenden un genoma de ARN de hebra positiva se producen al usar el sistema bidireccional y las modalidades en donde los virus que comprenden un genoma de ARN de hebra negativa, se producen al usar el sistema unidireccional, están dentro del alcance de la invención. Proteínas virales adicionales (diferentes a la proteína expresada del ARNm policistrónico ) , se requieren para la transcripción y replicación viral (L y P) , y estas proteínas se proporcionan individualmente sobre los plásmidos de expresión separados. La invención también puede incluir las modalidades en donde virus que comprenden genomas de ARN segmentados, de hebra doble se generan. En estas modalidades, un plásmido que comprende cada gen en el genoma viral objetivo, se puede insertar dentro del plásmido de expresión del promotor dual de la invención. El plásmido puede ser ya sea un plásmido unidireccional o un plásmido bidireccional. Un promotor en una unidad exterior de transcripción, preferiblemente un promotor pol II, dirige la expresión de un transcrito de ARNm de cada gen el cual se traduce dentro de la proteína codificada. Un promotor en una unidad de transcripción interior, preferiblemente un promotor canino pol I, dirige la transcripción de ya sea una hebra positiva (sistema unidireccional) o una hebra negativa (sistema bidireccional) . Posteriormente, la primera hebra la cual se produce, puede actuar como una plantilla para la producción de la hebra complementaria por polimerasa viral del ARN. El producto resultante del ARN de hebra doble se incorpora en nuevos virus. 6. Modalidades Especificas 1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino. 2. El ácido nucleico de la modalidad 1, en donde la secuencia reguladora es un promotor. 3. El ácido nucleico de la modalidad 1, en donde la secuencia reguladora es un potenciador. 4. El ácido nucleico de la modalidad 1, en donde la secuencia reguladora es tanto un potenciador como un promotor.

. El ácido nucleico de la modalidad 1, en donde la secuencia reguladora de la polimerasa del ARN comprende los nucleótidos 1 al 1808 de SEQ ID NO:l o un fragmento funcionalmente activo del mismo. 6. El ácido nucleico de la modalidad 1, 2, 3, 4, o 5, en donde la secuencia reguladora está ligada operativamente al ADNc que codifica un ARN genómico viral de hebra o el cARN correspondiente . 7. El ácido nucleico de la modalidad 6, en donde el ARN genómico viral de hebra negativa es un ARN genómico de la influenza . 8. El ácido nucleico de la modalidad 6 o 7, en donde el ácido nucleico comprende además una secuencia de terminación de la transcripción. 9. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la modalidad 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8. 10. El vector de expresión de la modalidad 9, en donde el vector de expresión comprende un origen bacteriano de replicación . 11. El vector de expresión de la modalidad 9, en donde el vector de expresión comprende un marcador de selección que se puede seleccionar en una célula procariótica . 12. El vector de expresión de la modalidad 9, en donde el vector de expresión comprende un marcador de selección que se puede seleccionar en una célula eucariótica. 13. El vector de expresión de la modalidad 9, en donde el vector de expresión comprende un sitio múltiple de clonación. 14. El vector de expresión de la modalidad 13, en donde el sitio múltiple de clonación se orienta con relación a la secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino para permitir la expresión de una secuencia de codificación introducida dentro del sitio múltiple de clonación a partir de la secuencia reguladora. 15. Un método para producir un ARN genómico de la influenza, que comprende transcribir el ácido nucleico de la modalidad 7, produciendo con ello un ARN genómico de la influenza. 16. Un método para producir un virus recombinante de la influenza, que comprende cultivar una célula canina que comprenden el vector de expresión de la modalidad 9, 10, 11, 12 13, o 14 y uno o más vectores de expresión que expresan un ARNm que codifica uno o más polipéptidos de la influenza seleccionado del grupo que consiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MI, M2 , NS1, y NS2; y aislar el virus recombinante de la influenza . 17. El método de la modalidad 16, en donde se usa un virus auxiliar. 18. El método de la modalidad 16, en donde el virus de la influenza producido es infeccioso. 19. El método de la modalidad 16, 17 o 18, en donde el método resulta en la producción de al menos lxlO3 PFU/ml virus de la influenza. 20. Una célula que comprende el ácido nucleico de la modalidad 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8. 21. Una célula que comprende el vector de expresión de la modalidad 9, 10, 11, 12, 13 o 14. 22. La célula de la modalidad 20 o 21, en donde la célula es una célula canina. 23. La célula canina de la modalidad 22, en donde la célula canina es una célula de riñon. 24. La célula de riñon canina de la modalidad 23, en donde la célula de riñon canina es una célula MDCK.

. Un método para generar en células caninas cultivadas un virus de ARN de hebra negativa segmentado recombinante que tiene más de 3 segmentos genómicos de ARNv, el método que comprende: (a) introducir dentro de una población de células caninas un primer conjunto de vectores de expresión que pueden expresar en las células segmentos genómicos de ARNv para proporcionar los segmentos genómicos completos de ARNv del virus; (b) introducir dentro de las células un segundo conjunto de vectores de expresión que pueden expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por lo cual se producen las partículas virales. 26. El método de la modalidad 25, en donde las partículas virales infecciosas de influenza se producen. 27. El método de la modalidad 25 o 26, en donde se usa un virus auxiliar. 28. Un método para generar en células caninas cultivadas, partículas virales infecciosas de influenza, el método que comprende: (a) introducir dentro de una población de células caninas un conjunto de vectores de expresión que pueden expresarse en las células i) segmentos genómicos de ARNv para proporcionar segmentos genómicos completos de ARNv del virus y (ii) ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; (b) cultivar las células por lo que se producen las partículas virales . 29. Un método de transcripción de un segmento de ARNv de un virus de la influenza, que comprende poner en contacto un polipéptido de polimerasa canino de pol I con un polinucleótido que comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID Nos: 1-28, en donde el ácido nucleico está ligado operativamente a una molécula de ADNc que codifica el segmento de ARNv del virus de hebra negativa; y aislar un segmento transcrito de ARNv. 30. El método de la modalidad 29, en donde el ARNv se transcribe en una célula hospedera. 31. El método de la modalidad 16, 17, 18, 19, 25, 26, 27 o 28, en donde cada vector de expresión está sobre un plásmido separado . 32. Una composición que comprende una pluralidad de vectores, en donde la pluralidad de vectores comprende un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc de virus de la influenza PA ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc del virus de la influenza PB1 ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc del virus de la influenza PB2 ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc de virus de la influenza HA ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc del virus de la influenza NP ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc del virus de la influenza NA ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc del virus de la influenza M ligado a una secuencia de terminación de la transcripción, y un vector que comprende un promotor canino pol I ligado operativamente a un ADNc del virus de la influenza NS ligado a una secuencia de terminación de la transcripción. 33. La composición de la modalidad 32 que comprende además uno o más vectores de expresión que expresan un ARNm que codifica uno o más polipéptidos de la influenza seleccionados del grupo que consiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MI, M2, NS1, y NS2. 34. Una célula hospedera que comprende la composición de las modalidades 32 o 33. 35. Una vacuna que comprende un virus producido por el método de la modalidad 16, 17, 18, 19, 25, 26, 27 o 28. 36. Una vacuna que comprende una composición inmunogénica preparada a partir de un virus producido del método de la modalidad 16, 17, 18, 19, 25, 26 27 o 28. 37. La composición de la modalidad 35 o 36, en donde cada vector de expresión está sobre un plásmido separado. 7. Ejemplos Los siguientes ejemplos sirven meramente para ilustrar la invención y no se intentan como limitantes de la invención en ninguna manera. 7.1 Ejemplo 1: Crecimiento de las cepas de Influenza en las células MDCK Este ejemplo describe la caracterización de diversas lineas celulares para el cultivo de influenza. Diferentes lineas celulares y células primaras se evaluaron por la producción de los reagrupamientos tipo silvestre (wt, por sus siglas en inglés) y genéticos derivados del laboratorio adaptado, por ejemplo, adaptados al frío (ca), cepas de influenza, tipo A y tipo B, incluyendo MRC-5, WI-38, FRhL-2, PerC6, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-I, Vero, y MDCK. Mientras muchos de los tipos de células soportan la replicación de algunas cepas de influenza adaptadas frías a una extensión limitada, solamente el MDCK produce consistentemente altas concentraciones de ambos virus de tipo A y tipo B. Por ejemplo, las células PerC6 se encontraron para soportar la replicación de ciertos virus tipo B wt y ca a un nivel similar como aquel observado en las células MDCK aunque los crecimientos cinéticos son diferentes (ver Figura 1). En contraste, el PerC6 no fue capaz de soportar la replicación de un número de virus tipo A ca. La figura 2 muestra las curvas de crecimiento para los virus wt y ca A/ S i dn e y / 05 / 97 y A / Be i j i ng / 262 / 95. En ambos casos la cepa ca no se replica bien en las células PerC6. S imi 1 a rmen t e , la figura 3 muestra las curvas de crecimiento para wt y ca A/Ann Arbor/6/60 demostrando que la cepa ca no se replica eficientemente en las células PerC6 y la replicación del wt A/Ann Arbor/6/60 no es tan sólida como en las células MDCK. El análisis PCR en tiempo real de la replicación del virus de la influenza en las células PerC6 mostró que el ARN viral (ARNv) de ambas cepas del virus de influenza A ca y wt se incrementa durante las primas 24 horas después de la infección sin embargo solamente las cepas wt continúan el incremento hasta 120 horas, las cepas ca no. En contraste, tanto el ARNv wt y ca se incrementa y alcanza a nivelarse en el dia 3 en las células MDCK. Ver Figura 4. Las células MDCK también se probaron por su habilidad para soportar la replicación de una vacuna pandémica potencial, ca A/Vietnam/1203/2004. Las células MDCK se infectaron en una multiplicidad baja de la infección con ca A/Vietnam/1203/2004 y el virus en el sobrenadante se cuantificó en diversos tiempos después de la infección. Durante 48 horas después de la infección, las concentraciones ca A/Vietnam/1203/2004 alcanzaron aproximadamente 8 logio TCID5o/mL y permanecieron estables durante los próximos 3 hasta 4 días. Ver Figura 5. En los experimentos, las células MDCK obtenidas del ATCC (Acceso No. CCL-34) se expandieron un número limitado de veces en ya sea el medio que contiene 10% de suero de bovino fetal originado de los Estados Unidos o en un medio libre de suero apropiado (por ejemplo, SFMV 100) para producir las células pre-maestras que existen para los estudios de caracterización iniciales. Los medios libres de suero apropiados se describen en la Solicitud provisional de E.U.A. No. 60/638,166, presentada el 23 de Diciembre de 2004; Solicitud provisional de E.U.A. No. 60/641,139, presentada el 5 de Enero de 2005; y Solicitud de E.U.A. No. 11/304,589 presentada el 16 de Diciembre de 2005, cada una de las cuales se incorpora para referencia en su totalidad. Las células se hicieron crecer fácilmente en ambos tipos de medios y ambos existentes de las células soportaron la replicación de las cepas de la vacuna adaptadas al frío y cepas pandémicas como se muestra en la tabla 1, a continuación y en la figura 5, respectivamente.

Tabla 1 Comparación de la productividad de las cepas de influenza adaptadas al frío en el suero y suero libre de células MDCK en crecimiento TCID50/mL (logio) Cepa del virus MDCK con suero MDCK w/sin suero (agrupamiento 6:5) A/Nueva 8.1 7.8 Caledonia/20/99 (HlNl) A/Panamá/20/99 (H3N2) 6.8 6.4 A/Sidney/05/97 (H3N2) 7.0 6.5 B/Brisbane/32/2002 7.2 7.5 B/Hong Kong/330/2001 7.2 7.4 B/Victoria/504/2000 6.9 7.4 Para investigar los segmentos del gen responsables de restringir el crecimiento en las células PerC6 la técnica de rescate de ocho plásmidos se empleó para generar un agrupamiento 7 : 1 para cada segmento del gen de la cepa de la influenza A/AA/6/60. Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. 6,951,754 para la descripción representativa del sistema de rescate de ocho plásmidos. La Figura 6 muestra un diagrama esquemático y la estrategia de denominación para cada agrupamiento 7:1. El agrupamiento resultante luego se evalúa por su habilidad para replicarse en las células PerC6. Ver Figura 7. El fenotipo de restricción de crecimiento aparece como mapa para los segmentos del gen PB2 y PB1. El mapeo detallado fino de la ubicación exacta responsable para este fenotipo puede llevarse a cabo usando los métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, la comparación de la secuencia de las cepas wt y ca en los segmentos de genes identificados deberá permitirse para la identificación de las diferencias especificas la cuales puede luego volver a imitarse en ya sea una cepa wt o ca. Tales mutantes luego se analizan para su habilidad para crecer en las células PerC6. cualquier mutación que ya sea previene el crecimiento de una cepa wt o permite el crecimiento de una cepa ca se identifica como una que contribuye al fenotipo de restricción de crecimiento. 7.2 Ejemplo 2 : Tumorigenicidad de las lineas de células MDCK La tumorigenicidad potencial de las dos células pre-maestras existentes de las células MDCK, un crecimiento en el medio que contiene suero y el otro en el medio libre de suero, se evalúan en los modelos de ratón atimico en una etapa que debería representarse en 5 pasajes celulares después de que se espera el uso para la producción de la vacuna. Para evaluar la tumorigenicidad, las 107 células se inyectaron subcutáneamente en un grupo de 10 ratones y después de 84 días los animales se sacrificaron y examinaron. Las neoplasias se observaron en 6 de los 10 animales inoculados con los pasajes celulares en el medio libre de suero. En contraste, no se encontró evidencia de la neoplasia en cualquiera de los animales inoculados con los pasajes celulares en el medio suplementado con 10% de suero de bovino fetal; aunque algunos fibrosarcomas se observaron en el sitio de la inoculación, los pasajes celulares en el suero no fueron tumorigénicos como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2 Tumorigenicidad y Cariologia de las células MDCK pasadas en dos medios diferentes Libre de 10% de suero Pasaje 4 Pasaje 20 Pasaje 4 Pasaje 20 Tumorigenicidad ND Neoplasias ND Sin neoplasis. anotadas Fibrosarcomas en el sitio de la inyección TP50* Estimado ND ~107 ND No estimable (sin animales (6/10) (>107) con (0/10) tumores/total de animales) Cariologia 78; 78; 78; Pocas 78; Pocas Número medio; distribución distribución células con el células con el comentarios larga de las larga de las número de numero de células con el células con el cromosomas cromosomas número de número de anómalo 70 anómalo (70 cromosomas de cromosomas de hasta 82) hasta 82) 52 hasta 82 52 hasta 82 *TP5o: Número de células requeridas para inducir los tumores en 50% de los animales ND: no se hizo Como se muestra en la tabla 2, los análisis de cariotipo también se realizaron en estas dos células premaestras existentes en tanto el pasaje cuarto o vigésimo en su medio respectivo. Los pasajes de las células no tumorigénicas en 10% de FCS tienen un número medio de 78 cromosomas de metafase con la distribución relativamente limitada de las células con otros números de cromosomas (70 hasta 82). Mientras las células pasaron en medios libres de suero también tienen un número medio de 78 cromosomas de metafase, significativamente más células se observaron con un rango de número del cromosoma de aneuploide desde 52 hasta 82 cromosomas de metafase. En ambos casos, la cariologia no cambió después del pasaje. 7.3 Ejemplo 3 : Adaptación de las células MDCK para crecimiento en los medios libres de suero Las células MDCK del ATCC se pasan en el medio que contiene los FBS irradiados gamma. Estas células luego se pasan un número limitado de veces en una formulación de medio libre de suero elegida para soportar la producción del banco celular. Los medios libres de suero se describen en la Solicitud provisional de E.U.A. Nos. 60/638,166 y 60/641,139, y Solicitud de Patente de E.U.A. 11/304,589. Estos pasos adicionales se pueden efectuar ya sea a 37°C o 33°C. El paso de las células MDCK en tres medios que contienen suplementos derivados de las plantas más que el suero proporcionó las células con cariotipos similares a aquellos de los pasos celulares MDCK en el medio que contiene FCS (los datos no se muestran) . 7.4 Ejemplo 4: Clonación de células MDCK Se clonaron biológicamente células a través de una dilución limitante con objeto de asegurar que las células de producción se derivan de una constelación genética única. Los clones se separaron por exclusión por diversas propiedades fenotipicas incluyendo el tiempo de duplicación y la tumorigenicidad relativa, asi como la producción viral. En una prueba inicial del experimento de concepto, cincuenta y cuatro clones MDCK se obtuvieron en el medio que contiene FCS. Estos clones se pasaron y cada uno se infectó con un multiplicidad baja de la infección de A/New Caledonia/20/99. Varios días después de la infección, el sobrenadante se removió y la cantidad del virus en el sobrenadante se midió por TCID50. Una minoría de los clones produce relativamente concentraciones altas del virus, mayor que la que se produjo en las células parenterales no clonadas. Los clones con propiedades fisiológicas y biológicas superiores se usan para establecer un banco de células maestras (MCB) como se describe a continuación. 7.5 Ejemplo 5: Prueba y caracterización de un banco de células maestras El MCB se prueba extensivamente para asegurar que no existe evidencia de los agentes accidentales. Por ejemplo, una o más de las diversas pruebas PCR y/o especificas del anticuerpo para los agentes virales disponibles se llevan a cabo como se muestra en la tabla 3, a continuación.

Tabla 3 Régimen de prueba para el MCB Pruebas generales PCR*/Ab especifico Esterilidad AAV Tipos 1 y 2 Micoplasma HCMV Agentes accidentales in Vitro EBV (linea celulares múltiples) Agentes accidentales in vivo HSV PERT Hepatitis B, C y E Co-cultivo HHV 6, 7, y 8 Cariologia HIV 1 y 2 Microscopía de electrones HPV Tumorigenicidad de las células HTLV I y II intactas (TP50) Oncogenicidad del ADN celular Polioma (virus BK y JC) Oncogenicidad del lisado celular Circovirus Virus bovino por 9CFR Parvovirus canino Virus porcino por 9CFR Moquillo canino Adenovirus SV40 7.6 Ejemplo 6: Caracterización preclinica del virus de influenza derivado del cultivo celular Este ejemplo describe la caracterización de cepas de influenza producidas del cultivo celular asi como de los huevos y compara el virus producido de los sistemas. Generalmente, los virus de la influenza son adecuados para el uso como vacunas en humanos y tiene propiedades biológicas que hacen el virus adecuado para tal uso. En este ejemplo, los virus de influenza se adaptan al frío (ca; tienen la habilidad para replicar eficientemente una temperatura inferior) , son sensibles a la temperatura (ts; tiene la replicación restringida in Vitro a temperaturas altas) y atenuados (att; no detectan la replicación en los tejidos del pulmón de hurones) y se refieren en la presente como cepas catsatt. La comparación incluye: evaluación bioquímica, antigenica y genética (procesamiento por secuencia) del producto viral; caracterización biológica y bioquímica del virus seguido por la replicación en células humanas; replicación en un modelos animal permisivo; e inmunogenicidad en un modelo animal permisivo. 7.6.1 Comparación genética, bioquímica y antigénica Las cepas Catsatt del tipo A/H1N1, A/H5N1, A/H3N2 y B replicadas para concentraciones relativamente altas en las células MDCK. Además, el pasaje de estas cepas ca ts att en las células MDCK no altera su secuencia genómica. Tres cepas ca ts att, ca A/Sidney/05/97 , ca A/Bei j ing/262/95, y ca B/Ann Arbor/1/94 se pasaron una o dos veces en las células MDCK y las regiones codificadas completas de todos los 6 genes internos se procesaron por secuencia y se compararon con el material de partida. No se observaron cambios de nucleótidos, demostrando que este paso a través de este substrato no cambia la composición genética de estas cepas. La caracterización de la secuencia adicional se llevó a cabo en diferentes cepas de vacunas producida en las células MDCK bajo condiciones que se esperan para imitar los procesos de producción incluyendo la composición media, dosis de inicio (moi), temperatura de incubación y tiempo de cosechado. Basado en los datos preliminares, se espera que no deberán haber cambios en la secuencia genómica de los virus producidos por MDCK. Debido a que el genoma fue genéticamente estable después del paso en las células MDCK, los rasgos biológicos de la vacuna producida en los huevos o células MDCK se espera que sean indistinguibles. Sin embargo, el producto viral primario del cultivo celular puede tener diferencias sutiles comparadas al producto basado en huevos, particular con respecto a la modificación post-traduccional de las proteínas virales incluyendo HA y NA, o la composición de los lípidos en la membrana viral; ambos de los cuales podrían potencialmente cambiar las propiedades físicas generales del virión. Los datos preclínicos preliminares en la antigenicidad del cultivo celular producido y la vacuna producida del huevo demuestran que no se detectan diferencias en este parámetro importante. Los huevos existentes de diversas cepas de la vacuna se pasaron a través de las células MDCK y la antigenicidad de ambos productos se determinó por medir las concentraciones HAI usando anti-sueros de referencia. Como se muestra en la tabla 4, todas las concentraciones HAI fueron dentro de 2 veces uno del otro, lo que indica que la replicación de la vacuna en las células no cambió la antigenicidad de la vacuna en comparación con el material derivado del huevo.

Tabla 4 Concentraciones HAI de las cepas producidas en los huevos y las células MDCK Concentración HAI Cepa Derivado del huevo Derivado de A/Panamá/20/99 265 256 A/Wuhan/359/95 1024 2048 A/Wyoming/03/2003 512 1024 B/Jilin/20/2003 64 32 B/Hong Kong/330/01 64 64 B/Jiangsu/10/2003 128 128 7.7 Ejemplo 7: Infección de las células epiteliales humanas en el cultivo En una modalidad, para evaluar las similitudes bioquímicas, biológicas y estructurales siguiendo la replicación de las vacunas producidas del MDCK y huevo en las células de origen humano, las vacunas pueden pasarse una vez en las células humanas diploides relevantes, tales como las células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) . Este pasaje deberá servir para imitar un evento de infección sencilla en las vías respiratorias humanas y luego permite la comparación del virus de progenie, el virus que es responsable finalmente de producir una respuesta inmune efectiva. Los estudios de las vacunas de actividades de hemaglut inina (enlace y fusión) y neuraminidasa pueden medirse en estos materiales así como otros estudios bioquímicos y estructurales incluyendo microscopía de electrones, las relaciones de partículas totales a infecciosas y equivalentes del genoma viral pueden evaluarse. En general, estas comparaciones servirán para demostrar la comparación de las vacunas derivadas de la célula para la vacuna producida por huevo efectiva y segura. Un resumen de los estudios analíticos se resume en la tabla 5.

Tabla 5 Estudios preclínicos para comparar las vacunas producidas por células y huevos In Vivo (hurones) In Vitro* Atenuación/Replicación Enlace del virus Extensión de la replicación Concentración de en las vías respiratorias hemaglutinina superiores Enlace de los ácido siálicos Cinéticos de la replicación diferentes en las vías respiratorias superiores Inmunogenicidad Propiedades físicas Reactividad cruzada Morfología por EM cinéticos Infeccioso: Partículas totales (genomas) Infectividad Actividad de fusión Dosis requerida para la pH óptimo replicación detectable Temperatura óptima Dosis requerida para la respuesta del anticuerpo Secuencia genómica Actividad de neuraminidasa *Productos primarios comparados y después de un pasaje en células humanas 7.8 Ejemplo 8: Modelos animales preclinicos El hurón es un modelo de animal robusto usado para evaluar la atenuación e inmunogenicidad de las vacunas de influenza atenuadas y componente de las cepas de la vacuna. Se compara el desempeño de las cepas de influenza derivadas de células producidas a partir de MCB con las mismas cepas producidas en los huevos. La comparación cabeza a cabeza de estos materiales en los estudios controlados permite un nivel alto de asegurar la comparación de estos productos virales. Con objeto de evaluar la habilidad de las dos vacunas para infectar o llevar a cabo una "toma" en el hurón, los animales se anestesiaron ligeramente e inocularon intranasalmente con ya sea las preparaciones virales producidas de las células o huevos. El material de lavado nasal se colecta en diversos puntos de tiempo siguiendo la inoculación y la cantidad del virus se evalúa por uno de los diversos métodos disponibles con objeto de evaluar la cinética y el grado de la replicación viral en los animales en el tracto respiratorio superior. Los experimentos se realizaron con un rango de dosis y se incluyen cepas múltiples y diferentes mezclas trivalentes para generalizar la infectividad relativa de las cepas de crecimiento del cultivo celular para las cepas producidas de los huevos. Estos mismos estudios también se usaron para evaluar la inmunogenicidad de las cepas de influenza, una propiedad que se liga inherentemente a la habilidad del virus para iniciar la infección. Los animales se mezclaron y los lavados nasales se cosecharon en diversos puntos (semanas) después de la inoculación; estos especímenes se usaron para evaluar el anticuerpo del suero y las respuestas IgA nasales para la infección. La culminación de estos datos, infectividad, anticuerpo del suero y respuestas del anticuerpo mucosal, deberán usarse para comparar y evaluar la infectividad relativa de la vacuna producida de la célula para la vacuna producida por el huevo. El resultado más probablemente que se predice es que las cepas de la vacuna producidas por la célula y huevo tienen infectividad e inmunogenicidad similares. Si la vacuna derivada de la célula parece ser más infectiva o más inmunogénica que el producto derivado del huevo, los estudios además evalúan la posibilidad de que la dosis inferior se lleve a cabo. Un número de estudios de inmunogenicidad y replicación se realizaron en el modelo de hurón para evaluar las vacunas derivadas del cultivo celular con una dosis humana unitaria sencilla. La infección con las cepas ca ts att generalmente provoca la respuestas fuerte y rápida del anticuerpo en los hurones. Además, las cepas ca ts att individuales se probaron rutinariamente y mostraron expresar el fenotipo (att) atenuado por replicar relativamente las concentraciones altas en la nasofaringe pero en niveles indetectables en el pulmón de estos animales. El impacto del crecimiento del cultivo celular en estos rasgos también se evalúa. Sin embargo, no es probable que cualquier diferencia sea observada, ya que el fenotipo att es una parte integral de la composición genética de estas cepas. El crecimiento cinético y reactividad cruzada de estas cepas se evalúa siguiendo la administración de una dosis humana sencilla en estos animales. Esto produce los anticuerpos del suero que tienen reacción cruzada con las cepas múltiples dentro de un linaje genético y se espera que una vacuna derivada de la célula tendrá la misma capacidad. Estas evaluaciones de comparación deberá proporcionar la visión significante en las diferencias bioquímicas potenciales y/o biofísicas del producto del virus primario y demuestra el impacto de estas diferencias epigénicas en el rendimiento de las cepas ca ts att medidas por primero pasar el virus en las células humanas o estudios animales. Basado en la información de la secuencia para la fecha, no se espera impacto en el rendimiento inmunogénico de las cepas ca ts att resultantes de la producción en las células MDCK. Los hurones son un modelo de animal bien documentado para la influenza y se usan rutinariamente para evaluar el fenotipo de atenuación e inmunogenicidad de las cepas ca ts att. En general, animales de 8-10 semanas de edad se usan para evaluar la atenuación; típicamente el estudio designa evaluar n = 3-5 animales por prueba o grupo de control. Los estudios de inmunogenicidad se evalúan en animales de 8 semanas hasta 6 semanas de edad y generalmente requieren n = 3-5 animales por articulo de prueba o grupo de control. Estos número proporcionan información suficiente para obtener comparaciones estadísticamente válidas e importantes en la observación entre los grupos. Durante la mayoría de los estudios los signos tipo influenza pueden observarse, pero no es probable. Los hurones no exhiben señales de disminución en el apetito y peso, descarga nasal u ocular; la observación de los signos de la enfermedad tipo influenza es una parte necesaria del estudio e intervenciones tales como analgésicos no se justifican. Otros signos de malestar, tales como llagas abiertas o pérdida de peso significante, resultaría en la disposición apropiada del animal siguiendo la discusión con el veterinario que atiende. 7.9 Ejemplo 9: Desarrollo de la siembra del virus maestro (MVS) Actualmente las cepas de la vacuna de influenza se generan al co-infectar las células de aves con un virus tipo silvestre y ya sea el MDV tipo A o tipo B y aislando y separando por exclusión la progenie para la constelación genética 6:2 deseada. Este proceso requiere diversos pasajes del virus a través de los cultivos celulares de aves y/o huevos SPF. Recientemente, el plásmido rescatado se introduce por producir la preparación del virus de influenza. En este proceso, las células Vero (mono verde africano) de una prueba y caracterización extensivamente en el banco celular son electroporadas con, por ejemplo, plásmidos 8 ADN, cada uno contiene una copia de ADNc de uno de los segmentos de ADN de influenza 8. Diversos días después de la electroporación el sobrenadante de estas células electroporadas contiene el virus de influenza. Los sobrenadantes luego se inoculan en los huevos SPF para amplificar y biológicamente clonar la cepa de la vacuna. Ambos de estos procedimientos resultan en una cepa de la vacuna que se inocula en los huevos SPF para producir los MVS . Mientras el plásmido rescatado tiene diversas ventajas incluyendo una programación más confiable, más genéticamente los segmentos del gen exacto y menos contaminación potencial con los agentes accidentales del aislado de tipo silvestre, los MVS individuales generados por estos dos métodos son indistinguibles de uno de otro y pueden usarse para iniciar el volumen de producción de la vacuna. Usando los métodos y composición de la invención, este método se adapta para usar las células MDCK en lugar de las células Vero para el rescate del plásmido. La amplificación final de las cepas de la vacuna se conduce en las células derivadas de los bancos celulares MDCK. Esta amplificación final puede llevarse a cabo con los cultivos de escala pequeña (<20L) de las células MDCK. El sobrenadante de estas células se colecta, se concentra y caracteriza/prueba para producir el MVS. 7.10 Ejemplo 10: Clonación de las secuencias reguladoras Pol I de AR canino Este ejemplo describe la clonación del gen de ADN ribosomal 18S canino y las secuencias de ácido nucleico 5' para este gen. Primero, el ADN genómico de las células MDCK (Acceso No. CCL-34, ATCC) se aisló usando un kit de purificación de ADN puro maestro (EPICENTRE Biotechnologies ; Madison, WI). Las alineaciones de la secuencia indican que el gen 18S ARNr es alrededor de 90% idéntico en el perro, humano, ratón, rata y pollo. Un par de cebadores se diseñaron basados en las secuencias en la región conservada cerca del extremo 5' del gene de ARNr 18S por PCR para amplificar una región de ~ 500pb del ADN genómico MDCK como una sonda para detectar los fragmentos de digestión en la membrana la cual tiene las secuencias complementarias a través de la hibridización Southern. Un fragmento de restricción sencillo se identificó en el ADN genómico digerido separadamente con BamH I (~2.2kb) y EcoR I (~7.4kb). Ambos fragmentos se clonaron en el vector pGEM 7 (Promega Corp.; Madison, WI) por análisis adicional. El plásmido que contiene el fragmento EcoR I se presentó al depositarse con la American Type Culture Collection el 19 de Abril de 2006 y se asignó el A.T.C.C. Acceso No. PTA-7540 y la fecha de depósito del 20 de Abril de 2006. Los dos clones obtenidos por el análisis de digestión de restricción se alinearon y la orientación de los dos clones se confirmó por el procesamiento por secuencia de ambos extremos de los dos clones. Un mapa de restricción del fragmento Eco RI se presenta como en la Figura 8. En seguida, las secuencias de ácido nucleico completas del fragmento entre el sitio 5' EcoR I y posteriormente el sitio BamH I en la dirección 3' se determinó y se montó en una secuencia que contiene alrededor de 3536 bases. Esta secuencia se presenta como en las Figuras 9A-C (SEQ ID NO: 1) . En seguida, los experimentos de la extensión del cebador se realizaron para identificar el nucleótido inicial de los transcritos expresados de los elementos reguladores pol I de ARN canino. Brevemente, el ARN total se aisló de las células MDCK. Un cebador de oligonucleótido etiquetado se reconoció por el ARN y se usó para la síntesis del ADN cebador hacia el extremo 5' del 18s ARNr. Para identificar el primer nucleótido en el transcrito, el mismo cebador se usó para procesar por secuencia el ARNr usando un protocolo basado en el didesoxinucleótido convencional. Por comparar la longitud del ácido nucleico obtenido en la extensión del cebador en diversos ácido nucleicos obtenidos en la reacción del procesamiento de secuencia, la primera base del 18s podría identificarse. El primer nucleótido transcrito (la posición +1) es una base 1809 de la secuencia del nucleótido presentada como en las Figuras 9A-C. Para confirmar que las secuencias están corriente arriba de este nucleótido que contiene suficientes elementos reguladores para dirigir la transcripción de los genes corriente abajo, un constructo comprende un gen EGFP bajo el control de las secuencias reguladoras se construyó usando las técnicas estándar. El gen EGFP usado en este constructo es el gen EGFP descrito en Hoffmann et al. (2000) "Ambisense" approach for the generation of influenza virus A: ARNv y ARNm synthesis from one témplate Virology 15 : 267 ( 2 ) : 310-7 ) . Este constructo luego se transfectó en las células DCK usando las técnicas convencionales. 24 horas siguiendo la transfección, el ARN se aisló de las células transfectadas y se sometió a análisis de manchado Northern con un ADN etiquetado que codifica un gen EGFP. La detección de los transcritos de tamaño apropiadamente confirma que los plásmidos transfectados en las células MDCK contienen las secuencias reguladoras que dirigen la transcripción de las secuencias 3' para los elementos reguladores. 7.11 Ejemplo 11: Identificación del elemento regulador de la polimerasa I del ARN canino Este ejemplo describe la identificación y caracterización de un elemento regulador de la polimerasa I del ARN canino, el promotor de polimerasa I de ADN canino. Los promotores pol I de ARN canino y otras regiones reguladoras se identifican al inspeccionar las secuencias 5' para el inicio de la transcripción de los 18s ARNr para las secuencias del promotor canónicas. Además, los experimentos de eliminación sencilla se realizaron para identificar las secuencias requerida por el inicio transcripcional eficiente. En uno de tales experimentos de eliminación, un sitio de restricción se introduce en o se identifica en un plásmido que codifica la secuencia de nucleótido de las figuras 9A-9C por la mutagénesis dirigida al sito. El sitio de restricción se introduce alrededor de 50 nucleótidos en el extremo 3' del nucleótido +1 identificado arriba, el nucleótido 1809 en la secuencia se presenta como las Figuras 9A-9C. Otro sitio de restricción en el extremo 5' para la secuencia del nucleótido de las Figuras 9A-9C es relativo para la posición +1 se identifica o introduce por mutagénesis dirigida al sitio. Los vectores que contienen estos sitios de restricción luego se linealizan por la digestión con la enzima de restricción apropiada. En seguida, una nucleasa apropiada (por ejemplo, Exonucleasa I, Exonucleasa III, y los similares) se usan para digerir los ácidos nucleicos lineales. Al detener la reacción en diferentes puntos de tiempo, diferentes tamaños de eliminaciones en las regiones 5' para el inicio de la transcripción puede obtenerse. En seguida, los plásmidos lineales se vuelven a circular y transformar en las células hospederas apropiadas, luego la separación por exclusión para identificar los plásmidos que contienen las eliminaciones deseadas. AlteARNtivamente, los oligonucleótidos apropiados pueden sintetizarse como aquellos que contienen las secuencias de flanqueo una eliminación se introduce. Tales oligonucleótidos luego se usan para hacer los derivados que contienen las eliminaciones fuera del rizo usando las técnicas estándar. Los oligonucleótidos pueden también usarse para hacer substituciones dirigidas al sitio usando las técnicas estándar . La capacidad de diferentes mutantes de eliminación y substitución para iniciar la transcripción se determina por transfectar los plásmidos en las células MDCK y detectar el ARN transcrito de los plásmidos por el manchado Northern como se describe anteriormente. Para comparar las secuencias de los plásmidos que permiten la transcripción con aquellas que permiten la transcripción, la secuencia del promotor de polimerasa I de ARN canino se identifica. Las técnicas convencionales luego se usaron para clonar un ácido nucleico que codifica esta secuencia. AlteARNtivamente, el promotor pol I de ARN canino puede mapearse del ácido nucleico proporcionado como en la SEQ ID NO:l por otros métodos conocidos en el arte, por ejemplo, por usar un enfoque del minogenoma. Ver, por ejemplo, Solicitud de E.U.A. publicada 20050266026 para el uso de un reportero del minogenoma de influenza designados pFlu-CAT, el cual contiene el gen CAT sentido negativo clonado bajo el control del promotor pol I. También ver, el monigenoma EGFP en Hoffmann et al. (2000) "Ambisense" approach for the generation of influenza virus A: ARNv and ARNm synthesis from one témplate Virology 15 : 267 (2 ) : 310-7 ) ; y el sistema del minigenoma CAT pPOLI-CAT-RT en Pleschka et al. (1996) J. Virol. 70(6):4188-4192. Para usar estos sistemas para identificar y caracterizar las secuencias requeridas por el inicio transcripcional eficiente, la eliminación diferente/substitución de los mutantes descrita arriba u otras subsecuencias de la SEQ ID NO:l se introducen en el plásmido reportero seleccionado (por ejemplo, PFlu-CAT, el minigenoma EGFP) tal que la transcripción de una copia de sentido negativo del gen reportero depende de la iniciación de la transcripción por la eliminación o substitución del mutante. El constructo que contiene el EGFP descrito arriba puede convenientemente usarse para hacer tal eliminación o substitución del mutante. En seguida, la polimerasa de ARN dependiente del ARN viral sintetiza el ARNm de hebra positiva del ARN de hebra negativa transcrita del plásmido reportado. Este ARNm de hebra positiva luego se traduce por la maquinaria celular de manera que la actividad de la proteina reportera (ya sea EGFP o CAT) pueda detectarse. En los ensayos, un conjunto de plásmidos de expresión que contienen los ADNc de PB1, PB2, PA y NP o PB1, PA, NP (-PB2 como un control negativo) se transfecta en las células MDCK junto con un plásmido que comprenden un minigenoma EGFP del virus A de la influenza o el reportero pFlu-CAT bajo el control de una secuencia reguladora Pol I canina supuesta. Las células luego se cultivaron bajo condiciones que permiten la transcripción y traducción de la secuencia reportera. La actividad de la proteina reportera se detecta usando las técnicas convencionales. En el caso del EGFP, las células transíectadas se observaron bajo la fase de contraste del microscopio o fluorescencia del microscopio en 48 horas después de la transfeccion. AlteARNtivamente , la citometria de flujo se emplea para detectar la expresión EGFP. En los ensayos con un minigenoma que comprenden el gen CAT, el pFlu-CAT designado se utiliza para medir la actividad de polimerasa. En tal ensayo, la expresión CAT se mide por detectar directamente la proteina CAT (por ejemplo, por ELISA), por detectar el ARNm que codifica el CAT (por ejemplo, por manchado Northern) , o por detectar la actividad CAT (por ejemplo, detectar la transferencia de los grupos de acetilo radioetiquetados para un substrato apropiado) como un indicado de la actividad reportera. Por ejemplo, los fragmentos de ADN del clon MDCK los cuales tienen actividad promotora exhibida (ver extensión del cebador y ensayos de transcripción de arriba) se clonaron corriente arriba de un inserto el cual contiene las regiones no traducida 5' y 3' de la influenza localizadas en los extremos 5' y 3' , respectivamente de un gen EGFP de sentido negativo seguido por un terminador Pol I de murina (ver, Figura 11) . Tres constructos separados se hicieron los cuales difieren en las secuencias de MDCK insertadas: secuencias MDCK 1-1807 (-1), 1-1808 ( + 1) y 1-1809 (+2) de la SEQ ID NO: 1. Cada uno de estos constructos se combinaron separadamente con los plásmidos de expresión para las proteínas de replicación de influenza (PB1, PB2, PA y NP) y se electroporaron en las células MDCK. En 24 horas después de la electroporación, las células se examinaron por microscopía de fluorescencia. Como se muestra en la figura 12, todos los tres fragmentos MDCK, -1, +1 y +2 (izquierda superior, mitad y derecha, respectivamente) resultaron en la fluorescencia EGFP mientras el constructo carece de la actividad promotora exhibida solamente en la fluorescencia inferior (izquierda inferior). El fragmento 1-1808 ( +1) resulta en el nivel alto de la fluorescencia. Un plásmido con un promotor CMV maneja la expresión del EGFP usado como un control positivo (derecha inferior) . Las proteínas de replicación de influenza deberán solamente replicar los extremos de ARNv de influenza auténticos. La señal EGFP de cada uno de los plásmidos contiene una secuencia pol I MDCK que indica que los fragmentos de la secuencia reguladora canina contienen la actividad promotora la cual produce un ARN con los extremo del ARNv de influenza correctos capaces de soportar la replicación de la influenza. Otros ensayos útiles para identificar y caracterizar las secuencias reguladoras pol I de ARN canino incluyen los experimentos de impresión interior del ADN . En tales procedimientos, las moléculas de ARN comprenden, por ejemplo, la secuencia presentada en las figuras 9A-C, se ponen en contacto a una o más subunidades de la polimerasa I de ARN canino. Una o más subunidades del poli I de ARN canino enlazan las secuencias de ADN apropiadas de conformidad a su afinidad particular. En seguida, un ARNsa, por ejemplo, la ARNsa I se usa para degradas el ARN no protegido por una o más subunidades de la polimerasa de ARN canino. La ARNsa luego se inactiva y los fragmentos del ARN protegidos se aislan de una o más subunidades protegidas de la polimerasa I de ARN. Los fragmentos aislados contienen los enlaces de secuencias por una o más subunidades de la polimerasa de ARN y son excelentes candidatos para las secuencias que tienen la actividad promotora/aumentadora . Además, estos experimentos de impresión interior pueden realizarse en la presencia de diferentes subunidades de la polimerasa I de ARN canino para identificar la subunidad enlazada a la secuencia de ARN. Estos experimentos pueden ayudar para determinar la actividad de las diferentes secuencias de enlace por, por ejemplo, comparar las secuencias de diferentes subunidades de la polimerasa Pol I canina hasta las subunidades de polimerasa I de ARN de otras especies con las secuencias conocidas y especificidades de enlace . Las técnicas in vítro pueden también usarse para monitorear la transcripción de las secuencias reguladoras pol I caninas supuestas. En estas técnicas, las diferentes eliminaciones /substituciones de los mutantes se describe arriba u otras subsecuencias de la SEQ ID NO: 1 ó 26 se ligan operativamente a un transcrito de interés. El conjunto de las proteínas de polimerasa I de ARN canino requeridas para la transcripción luego se agregan a los transcritos. La transcripción efectiva se detecta por detectar el transcrito de ARN hecho por las proteínas de polimerasa I de ARN canino por, por ejemplo, la técnica Northern blot . Los ensayos similares pueden usarse para identificar otros elementos reguladores poli I de ARN canino, por ejemplo, elementos aumentadores , represores, u otros que afectan la transcripción por el pol I de ARN. Generalmente, en tales ensayos, los niveles de expresión de los constructos reporteros comprenden eliminaciones, substituciones, o subsecuencias de la SEQ ID N0.:1 se comparan para los niveles de expresión de un promotor pol I de ARN mínimo identificado como se describe arriba. Para comparar los niveles de expresión, la presencia de un elemento asociado con aumentar o disminuir la transcripción puede identificarse. 7.12 Ejemplo 12 : Rescate de influenza en las células MDCK Este ejemplo describe el uso de los elementos reguladora pol I de ARN canino clonados en el ejemplo 10 para rescatar el virus de influenza en el cultivo celular MDCK. Ocho vectores de expresión que codifican los ARNs genómicos virales bajo el control del promotor pol I de ARN canino se construyeron usando las técnicas de biología molecular convencional. En particular, el vector de expresión del plásmido pAD4000 (SEQ ID NO:29, Figura 13) se construyó de un vector pAD3000 (Hoffman et al. PNAS (2002), 99(17) : 11411- 11416, Figura 10) por reemplazar las secuencias promotoras Pol I humanas de 213 pb en la pAD3000 con un fragmento de 469 pb (1-469 bases en pAD4000) del subclon MDCK EcoRI-BamHI (1808-1340 bases del SEQ ID NO:l) . Nota: el fragmento de 469 pb en la Figura 13 se muestra como las 1-469 bases, pero en la orientación complementaria inversa. El fragmento MDCK de 469 pb contiene un promotor Pol I canino funcional. Además, la secuencia ligadora de 18 pb en la pAD3000 AGGAGACGGTACCGTCTC (SEQ ID NO: 30) se reemplazó con la secuencia ligadora de 24 pb AGAGTCTTCTCGAGTAGAAGACCG (SEQ ID NO:31) en la pAD4000. Ocho segmentos de la influenza que codifican al genoma MDV B, dos de los cuales (el NS, SEQ ID NO: 32 y PB1, SEQ ID NO: 40) contienen mutaciones silenciosas (SEQ ID NOS: 33 y 41, respectivamente y la Figura 16) se clonaron en ocho vectores de expresión pAD4000 separados (bajo el control de un promotor Pol I canino funcional) . Los ocho vectores de expresión luego se elect roporaron en las células MDCK en el medio Opti-MEM® I libre de suero (Invitrogen) y los sobrenadantes de las células se usaron para inocular los huevos. Después de 72 horas la incubación a 33°C del virus se cosecho de los huevos positivos HA. Las reacciones RT-PCR se realizaron (ver, secuencias del cebador (SEQ ID NOS: 34-39) y posiciones de renaturalización en las Figuras 14 y 15) en el ARN extraído del virus seguido por el análisis de secuencia del nucleótido de los productos PCR. Basado en la presencia de los segmentos PB1 y NS que contienen las mutaciones silenciosas, se determinó que el virus vivo infeccioso de la influenza se había rescatado en las células MDCK.

Sorprendentemente, las altas concentraciones de virus de rescate (ambos de MDV-B y DV-Bm [MDV-B con mutaciones silentes]) se encontraron en los sobrenadantes. Ver, Tabla 6. Por ejemplo, 4-5 logio PFU/ml de virus se midió en el día 3. Típicamente, las concentraciones de los virus rescatados al usar sistemas de promotor humano pol I con base en células Vero tienen solamente <= 100 pfu en los días 2 al 3. En consecuencia, el sistema de rescate de plásmidos canino pol I descrito en la presente, parece mucho más eficiente que la tecnología existente de rescate de plásmidos descrita por otros.

Tabla 6 Concentración de HAI PFU/ml MDV-B MDV-Bm Día 2 1. 8E+03 2.22E+02 Día 3 6.60E+05 9.80E+04 Día 4 2.28E+07 5.20E+06 Día 5 1.90E+07 1.80E+07 Día 6 3.60E+06 3.20E+0.6 Día 7 2.62E+06 2.96E+06 La rigidez del sistema de rescate de plásmidos pol I canino se demostró por el rescate de ambos, una cepa B y una cepa A ca virus maestro donador (MDV) , así como, numerosos reagrupamientos de las cepas A y B. Para los reagrupamientos , los seis segmentos internos de genes del MDV apropiado (cepa A o B) se combinaron con los segmentos HA y NA a partir de la cepa A de los siguientes subtipos: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1 o una cepa B ya sea de los linajes Yamagata o el B/Victoria. Las cepas rescatadas MDV y reagrupamientos se resumen en la Tabla 7. Estos virus se rescataron esencialmente como se describe anteriormente. Los segmentos de la influenza que codifican los genomas de la cepa A o B se clonaron dentro de vectores de expresión separados pAD4000 (que comprenden el promotor canino funcional Pol I antes descrito) . Los ocho vectores de expresión que codifican todos los ocho segmentos de influenza de la cepa a rescatarse, se transfectaron en células MDCK en medios libres de suero Opti-MEM® I (Invitrogen) y se usaron sobrenadantes de las células para inocular huevos. En estos experimentos, la transfección se efectuó al usar un reactivo de transfección que no es de liposomas (PromoFectin Cat . No. PK-CT- 2000, PromoKine, Alemania), siguiendo las instrucciones suministradas por el fabricante. Después de 72 hrs de incubación a 33° C, se cosechó el virus a partir de huevos positivos de HA.

Tabla 7 Cepas A Cepas B H1N1 ca B Malasia/2506/2004 ca A Nueva Caledonia/20/1999 ca B Florida/07/2004 H2N2 ca B Jiangsu/10/2003 MDV A (A/Ann Arbor/6/1960) ca B Hong Kong/330/2001 MDV B (B/Ann Arbor/1/1996) H3N2 ca A Wisconsin/67/2005 ca A California/7/2004 ca A Panamá/2007/1999 H5N1 ca A Hong Kong/213/2003 ca A Hong Kong/67/1997 (491H5/486N1) Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle para propósitos de claridad y entendimiento, estará claro para alguien experto en la técnica a partir de la lectura de esta descripción, que se pueden hacer diversos cambios en la forma y detalle sin alejarse del verdadero alcance de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas y aparatos antes descritos se pueden usar en diversas combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, u otros documentos citados en esta solicitud se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos, al mismo grado como si cada publicación, patente, solicitud de patente, u otro documento en lo individual, se indicara individualmente para incorporarse como referencia para todos los propósitos. Además, la solicitud de patente PCT No. Ser. PCT/US2006/023867 , presentada el 20 de junio, 2006; las solicitudes de patente de E.U.A. Nos. de serie 11/455,734, presentada el 20 de junio, 2006; 11/501,067, presentada el 9 de agosto, 2006; solicitud provisional de patente de E.U.A. Nos.: 60/ 793, 522, presentada el 19 de abril, 2006; U.S. 60/793,525, presentada el 19 de abril, 2006; U.S. 60/702,006, presentada el 22 de julio, 2005; U.S. 60/699,556, presentada el 15 de julio, 2005; U.S. 60/699, 555, presentada el 15 de julio, 2005; U.S. 60/692,965 presentada el 21 de junio, 2005; y U.S. 60/692,978 presentada el 21 de junio, 2005 se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia reguladora de polimerasa I del ARN canino .
2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia reguladora es un promotor.
3. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia reguladora de polimerasa I de ARN comprende los nucleótidos 1-469 de SEQ ID NO: 26, el complemento de la misma, el complemento inverso de la misma, o un fragmento funcionalmente activo de la misma.
4. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, 2, o 3, caracterizado porque la secuencia reguladora está ligada operativamente a un ADNc que codifica un ARN genómico viral de hebra negativa o el cARN correspondiente.
5. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ácido nucleico comprende además una secuencia de terminación de la transcripción.
6. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el ARN genómico viral de hebra negativa es un ARN genómico de la influenza.
7. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6.
8. Un método para producir un ARN genómico de la influenza, caracterizado porque comprende transcribir el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6 en una célula, produciendo con ello un ARN genómico de la influenza.
9. Un método para producir un virus recombinante de la influenza, caracterizado porque comprende cultivar una célula canina que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7 y uno o más vectores de expresión que expresan un ARNm que codifica uno o más polipéptidos de la influenza seleccionados del grupo que consiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MI, M2, NS1, y NS2; y aislar el virus recombinante de la influenza.
10. Un método para producir un virus recombinante de la influenza, que comprende a) introducir dentro de una población de células caninas vectores de expresión que pueden expresar en las células, segmentos genómicos de ARNv para proporcionar segmentos genómicos completos del ARNv del virus, caracterizado porque los vectores de expresión comprenden los nucleótidos 1-469 de SEQ ID NO:26, o un fragmento funcionalmente activo del mismo; (b) introducir dentro de las células, vectores de expresión que pueden expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por las que se producen las partículas virales de la influenza .
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración de las partículas virales de la influenza producidas con el cultivo de las células por 48-72 horas es al menos 1.0 x 104 PFU/ml.
12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la concentración de las partículas de influenza producidas con el cultivo de las células por 48-72 horas es al menos 1.0 x 105 PFU/ml.
13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las partículas virales de la influenza producidas son infecciosas.
14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las partículas virales de la influenza producidas son infecciosas.
15. Una célula caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7.
16. La célula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula es una célula canina.
17. La célula canina de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la célula canina es una célula de riñon.
18. La célula canina de riñon de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la célula canina de riñon es una célula MDCK.
19. Un método para generar en células caninas cultivadas un virus recombinante de ARN de hebra negativa segmentada que tiene más de 3 segmentos genómicos de ARNv, caracterizado porque comprende: (a) introducir dentro de una población de células caninas un primer conjunto de vectores de expresión que pueden expresar en las células segmentos genómicos de ARNv para proporcionar los segmentos genómicos completos de ARNv del virus; (b) introducir dentro de las células un segundo conjunto de vectores de expresión que pueden expresar ARNm que codifica uno o más polipéptidos del virus; y (c) cultivar las células por lo cual se producen las partículas virales.
20. Un método para producir un virus recombinante de la influenza, caracterizado porque comprende i) introducir dentro de una población vectores de expresión de células caninas; a) que pueden expresar en las células segmentos genómicos de ARNv para proporcionar los segmentos genómicos de ARNv completos del virus, en donde uno o más de los vectores de expresión comprenden los nucleótidos 1-469 de SEQ ID NO: 26, o un fragmento funcionalmente activo del mismo, y b) también que pueden expresar en las células el ARNm que codifica uno o más polipéptidos de la influenza seleccionados del grupo que consiste de: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MI, M2, NS1, y NS2; y ii) cultivar las células por las que se producen las partículas virales de la influenza.
21. El método de conformidad con la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque la concentración de las partículas virales de la influenza producidas al cultivar las células por 48-72 horas es al menos 1.0 x 104 PFU/ml.
22. El método de conformidad con la reivindicación 19 o 20, caracterizado porque la concentración de las partículas virales de la influenza producidas al cultivar las células por 48-72 horas es al menos 1.0 x 105 PFU/ml.
23. El virus de la influenza caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 20.
24. El método de conformidad con las reivindicaciones 10, 19, 20, caracterizado porque se usa un virus auxiliar.
25. El vector de expresión pAD4000 caracterizado porque se establece en SEQ ID NO:29.
26. Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende al menos 250, o al menos 350, o al menos 450 nucleótidos contiguos de la secuencia establecida como SEQ ID NO: 26, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico cuando es ligada operativamente a un ADNc que codifica un ARNv de la influenza y se introduce dentro de la célula MDCK puede dirigir la expresión del ARNv de la influenza.
27. Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad para la secuencia de nucleótidos establecida como SEQ ID NO:26, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico cuando es ligada operativamente a un ADNc que codifica un ARNv de la influenza y se introduce dentro de una célula MDCK, puede dirigir la expresión del ARNv de la influenza.
28. Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que comprende un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID Nos 1-26, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico cuando es ligada operativamente a un ADNc que codifica un ARNv de la influenza y se introduce dentro de una célula MDCK, puede dirigir la expresión del ARNv de la influenza.
29. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 26, 27, o 28.
30. Un método para producir un ARN genómico de la influenza, caracterizado porque comprende introducir el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 29 en una célula con lo cual se produce un ARN genómico de la influenza.
31. Un método para producir un ARN genómico de la influenza, caracterizado porque comprende introducir el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 7 en una célula con lo cual se produce un ARN genómico de la influenza.