MX2008012926A - Metodo para predecir una característica de interes. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para pronosticar un rasgo de interés de una planta al medir el grado de asociación de almidón-proteína en la planta; el grado de asociación de almidón-proteína puede determinarse al identificar ya sea propiedades químicas o propiedades físicas o ambas propiedades físicas y químicas de células vegetales; en una modalidad en particular, el grado de asociación de almidón-proteína se determina al identificar la composición proteínica de la planta.

Description

METODO PARA PREDECIR UNA CARACTERISTICA DE INTERES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la producción de cereales y de alimentos para ganado, y también se refiere a la producción de etanol mediante la fermentación de plantas que contienen almidón. Más específicamente, la invención se refiere a un método para predecir una característica de interés, por ejemplo, para predecir una alta digestibilidad y/o para predecir la capacidad de fermentación para producir un alto rendimiento de etanol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las afirmaciones en esta sección únicamente proporcionan información antecedente relacionada con la presente descripción y no pueden constituir técnica anterior. El uso de fuentes de energía alternativas puede ser preferible por varias razones, por ejemplo, podría disminuir la dependencia de los combustibles fósiles, y por lo tanto puede disminuir la contaminación del aire. La producción de etanol por la fermentación de plantas que contienen carbohidratos es una posible fuente de energía alternativa. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,568,644 de Wang describe un método para producir etanol a partir de sustratos de biomasa utilizando un microorganismo que sea capaz de convertir carbohidratos de hexosa y pentosa en etanol, y en una menor extensión, los ácidos acético y láctico. La patente de E.U.A. No. 5,628,830 de Brink describe un método para producir azucares y etanol a partir de un material de biomasa, que consiste en dos procedimientos: la hidrólisis de celulosa en glucosa y la fermentación de glucosa en etanol. La maximización de la producción de etanol a partir de biomasa resulta económicamente preferible. Se han hecho esfuerzos para lograr un rendimiento incrementado, especialmente alterando la producción de los procedimientos o agregando pasos extra para la producción de etanol. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,916,780 de Foody et al. describe un procedimiento para mejorar el rendimiento económico de etanol seleccionando alimento con una relación de arabinoxilan a polisacáridos totales que no son de almidón de más de aproximadamente 0.39, después tratando previamente el alimento para aumentar la producción de glucosa con menos enzima de celulosa. Se reporta que la fermentación subsecuente permite un mayor rendimiento de etanol. La patente de E.U.A. No. 6,509,180 de Verser et al. describe un procedimiento para producir etanol que incluye una combinación de conversiones bioquímicas y sintéticas para lograr una producción de etanol de alto rendimiento, evitando la producción de C02, que es una limitación importante en la producción económica del etanol. La digestividad maximizada a partir de la biomasa también es económicamente preferible. Los granos cultivados y cosechados para el consumo humano o por parte del ganado, tiene niveles variados de digestividad. Para el ganado en particular, la productividad efectiva en costos y la ganancia de peso dependen de la digestividad del alimento. Para el ganado en particular la industria ha utilizado diversos métodos para mejorar el valor del alimento incluyendo el descascaramiento con vapor, la reconstitución, la micronización y la extrusión en corto tiempo y a alta temperatura. Sin embargo, resultaría más benéfico predecir, antes de cualquier paso de procesamiento, la digestividad de una variedad particular de planta, por ejemplo, la digestividad de un híbrido de maíz. Se encuentra disponible un número de técnicas para caracterizar la organización celular de una planta. Las propiedades físicas y/o químicas de una planta se utilizan para analizar la constitución de la planta. El análisis químico se utiliza ampliamente en los laboratorios, ya que es rápido y sensible, y es adecuado para la automatización. El artículo de Bietz, Separation of Cereal Proteins by Reversed- Phase High-Performance Liquid Chromatography, Journal of Chromatography, 255: 219-238 (1983) describe el uso de la cromatografía líquida de lato rendimiento y de fase inversa (RP-HPLC) para aislar, comparar y caracterizar las proteínas del cereal. El artículo de Bietz et al, en Wrigley (Ed.), Identification of Food- Grain Varieties, American Association of Cereal Chemists, St. Paul, 73-90 (1995) describe el uso de la cromatografía líquida de alto rendimiento y de fase inversa (RP-HPLC) para distinguir los componentes de las plantas de cereal, incluyendo maíz, avena, cebada, centeno, etc., como la selección del genotipo y la identificación en el cultivo. También se puede utilizar la espectrometría de masas en tiempo de vuelo por deserción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) para el análisis celular de la planta. La MALDI-TOF MS, debido a su facilidad de uso e insensibilidad relativa a las matrices biológicas que se utilizan en la preparación de la mayoría de las muestras biológicas, se utiliza comúnmente para el análisis de muestras biológicas. El artículo de Adams et al, Matrix Assited Láser Desorption lonization Time of Flight mass Spectrometry Análisis of Zeins in Mature Maize Kernels, J. Agrie. Food Chem., 52: 1842-49 (2004) describe el análisis y la identificación de zeinas a partir de extractos de prolamina de grano de maíz crudo por MALDI-TOF MS. El artículo de Dombrink-Kurtzman, Examiniation of Opaque Mutants of Maize by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography and Scanning Electrón Microscopy, Journal of Cereal Science, 19: 57-64 (1994) describe la examinación de proteínas de zeina de ocho mutantes de maíz opaco mediante RP-HPLC y la examinación de la microestructura de sus endospermos mediante microscopía por barrido electrónico (SEM). (Basándose en los resultados del estudio utilizando RP-HPLC y SEM, el auto propone que las zeinas no son responsables de la dureza de los granos). El artículo de Dien et al, Fate of Bt Protein and Influence of Corn Irbid on Etanol Production, Cereal Chemistry, 79(4): 582-585 (2002) describe la presencia de la proteína Bt en los productos secundarios de maíz en distintas etapas durante la producción de combustible de etanol. Después de comparar el rendimiento de etanol a partir de cinco híbridos de grano, los autores proponen que la estructura química del almidón y la matriz de almidón-proteína pueden afectar la disponibilidad del almidón. El artículo de Philippeau et al, Influence of Grain Source on Ruminal Cha ráete ristics and Rate, Site, and Extent of Digestión in Beef Steers, Journal oí Animal Science, 77:1587-1596 (1999) describe la correlación inversa entre la síntesis de proteína microbiana y la degradación de almidón de rumen. Los autores proponen que el sitio y la extensión de la degradación del almidón depende de la naturaleza del cereal (por ejemplo trigo contra maíz) y del genotipo del cereal. El artículo de Zinn et al, Flaking corn: Processing Mechamos, Quality Standards, and Impacts on Energy Availability and Performance of Feedlot Cattle, Journal of Animal Science, 80:1 145-1 156 (2002) describe cómo se puede incrementar la extensión de la digestión del almidón por el descascaramiento del maíz. Los autores proponen que este aumento es causado por la disrupción de la matriz de proteína protectora alrededor del gránulo de almidón.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente descripción proporciona un método de análisis para predecir una característica de interés a partir de por lo menos una planta, que comprende medir el grado de asociación de almidón-proteína en la planta. En algunas modalidades, la característica de interés es la fermentabilidad para la producción de etanol a partir de por lo menos una planta. En otras modalidades, la característica de interés es la digestividad. El método comprende medir el grado de asociación de almidón-proteína en la planta. El grado de asociación de almidón- proteína se puede determinar identificando ya sea las propiedades químicas o las propiedades físicas, o ambas propiedades de las células de la planta. En una modalidad, se proporciona un método para medir el grado de asociación de almidón-proteína, que comprende medir una propiedad química de la planta determinada por el análisis de proteína, almidón o de ambos. En otra modalidad se proporciona un método para medir el grado de asociación de almidón-proteína, que comprende medir una propiedad física de la planta determinada por la visualización de proteína, almidón, o ambos. La presente descripción también proporciona un método para predecir la fermentabilidad para la producción de etanol a partir de por lo menos una planta, que comprende medir el grado de asociación de almidón-proteína en la planta, en donde la asociación de almidón-proteína se determina por una combinación del análisis de la proteína en la planta y la visualización de la agrupación de proteínas dentro de la asociación de almidón-proteína. La presente descripción también proporciona un método para predecir la digestibidad a partir de por lo menos una planta, que comprende medir el grado de asociación de almidón-proteína en la planta, en donde la asociación de almidón-proteína está determinada por una combinación del análisis de proteína en la planta y la visualización de la agrupación de proteínas dentro de la asociación de almidón-proteína. Serán evidentes áreas de aplicabilidad adicionales a partir de la descripción que se proporciona en la presente. Deberá entenderse que la descripción y los ejemplos específicos tienen el propósito únicamente de ilustración, y no pretenden limitar el alcance de la presente descripción.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los dibujos que se describen en la presente únicamente tienen el propósito de ilustrar y no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la presente descripción. La figura 1 es un dibujo superpuesto del análisis de espectro de masas del total de proteínas de zeina a partir de muestras de maíz diluidas 5 veces con una solución de matriz. El alto rendimiento de etanol y el bajo rendimiento de etanol se pueden distinguir por la altura del pico, los híbridos con bajo rendimiento de etanol muestran picos más altos en cada uno de los marcadores indicados de proteína zeina. La figura 2 es un dibujo superpuesto de cromatogramas de RP-HPLC que perfilan las proteínas zeina en los híbridos con alto rendimiento de etanol y bajo rendimiento de etanol. El híbrido con bajo rendimiento de etanol presenta áreas de pico más grandes a 66.7 minutos que las del híbrido con alto rendimiento de etanol. Las figuras 3A a 3D muestran secciones del endospermo de maíz (3A y 3B) y suspensiones de granos de almidón (3C y 3D) observados bajo microscopía de luz polarizada, siguiendo el seccionamiento a manos libres del tejido de endospermo de maíz proveniente de granos de híbridos de alto rendimiento de etanol y de bajo rendimiento de etanol. Las figuras 4A y 4B muestran imágenes confocales de secciones transversales de endospermo a manos libres, teñidas para almidón (negro) y proteína (fluorescencia, gris), a partir de granos de maíz de híbridos de alto rendimiento de etanol (4A) y bajo rendimiento de etanol (4B). Podrán notarse las diferencias entre los patrones de organización de la matriz de proteína (gris) y los granos de almidón (negro) dentro de las células. La figura 5 muestra proyecciones tridimensionales de la matriz de proteína de células de endospermo, provenientes de secciones transversales de granos de maíz de los híbridos de alto rendimiento de etanol y bajo rendimiento de etanol, obtenidos a partir de series de secuencia de secciones ópticas confocales de muestras teñidas para proteína.

Las figuras 6A a 6F muestran micrógrafos electrónicos de barrido a bajas temperaturas de secciones a manos libres de endospermo de maíz, provenientes de híbridos de alto rendimiento de etanol (6A a 6C) y de bajo rendimiento de etanol (6D a 6F). Podrán notarse las diferencias en la agrupación de amiloplasto, y la presencia de material(es) unido(s) a cada amiloplasto, cuyo machado y observación por fluorescencia y por microscopía confocal reveló que es principalmente proteína, rica en tioles y disulfuros. La figura 7 muestra un micrógrafo electrónico de transmisión de las células de endospermo de maíz provenientes de una muestra de un híbrido de alto rendimiento de etanol (EA). La figura 8 muestra un micrógrafo electrónico de transmisión de células de endospermo de maíz provenientes de una muestra de un híbrido de bajo rendimiento de etanol (EJ). La figura 9 muestra un micrógrafo electrónico de transmisión de amiloplastos en una célula de endospermo de maíz provenientes de una muestra de un híbrido de alto rendimiento de etanol (5494), fijado por congelamiento a alta presión. La figura 10 muestra micrógrafos electrónicos de transmisión de amiloplastos en células de endospermo de maíz provenientes de muestras de un híbrido de bajo rendimiento de etanol (5110), fijadas por congelamiento a alta presión La figura 1 es un diagrama que muestra el porcentaje de granos de almidón asociados con proteína, contados de pequeñas secciones de híbridos de alto rendimiento de etanol (EA) y de bajo rendimiento de etanol (EJ). La figura 12 muestra pequeñas secciones de granos de maíz teñidos para proteínas (fluorescencia, gris).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La siguiente descripción es únicamente de naturaleza ejemplar y no pretende limitar la presente descripción, solicitud, o usos. De acuerdo con la presente descripción, los solicitantes descubrieron que el nivel relativo de digestividad y/o fermentabilidad para producir etanol de una variedad de planta individual, se puede predecir midiendo el grado de asociación de almidón-proteína en la planta. Una matriz de proteína característica, altamente organizada, consiste en numerosos cuerpos de proteína estrechamente agrupados, presionados contra amiloplastos, que está presente en las células de endospermo vegetal con bajo rendimiento de etanol y baja digestividad. Las plantas con dichas características tienen células que son más difíciles de separar, y de liberar el contenido de estas células como granos individuales de almidón libres de proteína. Sin querer apegarse a la teoría, se cree que la capacidad de resistir la división, o un alto grado de asociación de almidón-proteína, puede ser una limitante importante para la digestividad y la producción económica del etanol a partir de fuentes vegetales, ya que es reducida la disponibilidad de los granos de almidón. En los procedimientos de fermentación y de digestión, los granos de almidón se rompen en azucares simples, normalmente por la adición de alfa amilasa y/o gluco amilasa. El etanol se produce cuando se alimenta levadura en los azucares. Como se utiliza en la presente, la frase "grado de asociación de almidón-proteína" indica el nivel al que están conectados entre si el almidón y la proteína, determinado, por ejemplo, por los métodos que se describen a continuación. Un ejemplo de asociación de almidón-proteína incluye, pero no está limitado, a los amiloplastos en asociación con cuerpos de proteína. El análisis de los híbridos provenientes de una mezcla para buscar una característica de interés, normalmente se lleva a cabo procesando el grano por molido, cocción, etc, y puede iniciar con un estudio de la organización subcelular de las células de endospermo, por ejemplo, un estudio de la organización subcelular de las células de endospermo de los híbridos de alto rendimiento de etanol y de bajo rendimiento de etanol, o de los híbridos de alta y baja digestividad. Las variedades de alto rendimiento de etanol y de bajo rendimiento de etanol tienen características distinguibles, tanto en propiedades químicas como físicas, como sucede con los híbridos de alta y baja digestividad, y la identificación de estas características lleva a la predicción y al análisis de una planta para identificar la característica de interés. Los inventores descubrieron que las propiedades químicas de las plantas, que se estiman utilizando análisis cromatográficos, presentan perfiles de elusión de proteína marcadamente diferentes para líneas de plantas con alta y baja fermentabilidad. En particular, por ejemplo, proteínas vegetales específicas como zeinas, son mucho más abundantes en líneas de maíz poco fermentables, en comparación con las líneas de maíz altamente fermentables. Las proteínas de zeina son hidrofóbicas y se encuentran unidas al almidón a través de un enlace no covalente e interacciones hidrofóbicas. Por consiguiente, un contenido más alto de zeina puede jugar un papel importante en el proceso de rendimiento de fermentación, como la inhibición del proceso de fermentación mediante la limitación de la disponibilidad del almidón. Las proteínas de zeina contienen cantidades más altas de tioles y de disulfuros con relación a otras proteínas, por lo tanto, en una modalidad, la cuantificación de tioles y de disulfuros en una muestra de proteína es un indicador de la cantidad de proteína de zeina. De igual manera, las propiedades químicas de las plantas presentan perfiles de elusión de proteína muy diferentes para las líneas de plantas de alta y baja digestividad. Las proteínas de zeina son más abundantes en las líneas de maíz de baja digestividad, y son menos abundantes en las líneas de maíz de alta digestividad. Los inventores también determinaron que las propiedades físicas de las plantas, estimadas utilizando microtécnicas, revelan que cada una de las plantas con alto rendimiento de etanol y con bajo rendimiento de etanol tienen organizaciones subcelulares distinguibles, como sucede con las plantas con alta y baja digestividad. No se encuentran diferencias significativas entre los granos de almidón de los híbridos con alto rendimiento de etanol y con bajo rendimiento de etanol, en términos del tamaño, la forma, índices de refracción, relaciones de poblaciones de grano de almidón, y color de tinción. Sin embargo, en las muestras de híbridos con alto rendimiento de etanol, los granos de almidón están dispersados aleatoriamente dentro de la célula, son fáciles de aislar, formando de esta manera suspensiones que contienen densidades más altas de granos de almidón. En dichas muestras con alto rendimiento de etanol, los granos de almidón generalmente están dispersados en suspensión como estructuras únicas, raramente asociadas con proteína, mientras que para las muestras de híbridos con bajo rendimiento de etanol, los granos de almidón están altamente organizados dentro de la célula, son difíciles de aislar, y por lo tanto dan como resultado suspensiones de grano de almidón de baja densidad. Estos granos de almidón de baja densidad con frecuencia están presentes en suspensión como agregados o como racimos, y con frecuencia están asociados con proteína. Específicamente, la examinacion microscópica muestra que los granos de almidón de los híbridos con alto rendimiento de etanol están agrupados de manera holgada dentro de las células y raramente presentan superficies irregulares. Los granos de almidón de los híbridos con bajo rendimiento de etanol están agrupados apretadamente uno contra otro, y muestran materiales asociados con/o en la superficie de amiloplasto. Estos mismos descubrimientos aplican para otras características de interés incluyendo la digestividad.

La tinción de proteína muestra diferencias significativas entre los híbridos con alto rendimiento de etanol y de bajo rendimiento de etanol: la matriz de proteína de las muestras de alto rendimiento de etanol es pareja, continua y frágil, pero la matriz de proteína de las muestras de bajo rendimiento de etanol es irregular, más gruesa, con una alta densidad de las estructuras globulares. Por lo tanto, los granos que están dispersados en los agregados o racimos, y que están asociados con proteínas se pueden evaluar como una variedad de bajo rendimiento de etanol. Los hallazgos son similares para los híbridos de alta y baja digestividad. La frase "agrupación de proteínas" como se utiliza en la presente describe la visualización de la matriz de proteína. En algunas modalidades, la visualización de la agrupación de proteínas se utiliza para analizar la asociación de almidón-proteína. La frase "matriz de almidón proteína" como se utiliza en la presente se refiere a la asociación del almidón con las matrices de proteínas circundantes, normalmente en células de endospermo. De acuerdo con los anteriores descubrimientos de los inventores, es posible predecir características tales como la fermentabilidad para producir etanol, o la digestividad mediante un método de análisis de las propiedades híbridas de la planta. El uso de dicho método para predecir la fermentabilidad para la producción de etanol, puede llevar a la selección de propiedades preferidas del grano para condiciones óptimas de procesamiento en la fermentación de granos o de biomasa. El uso de dicho método para predecir la digestividad puede llevar a la selección de propiedades preferidas del grano para un diseño óptimo de alimentación. Para seleccionar una variedad de planta preferible para una característica en particular, un método de la presente invención, comprende la generación de información química, cinética, física, geológica, morfológica y agronómica para una población representativa con un amplio rango de variación. Dicha información se puede utilizar cobrando la aplicación de una técnica destructiva o no destructiva, o una combinación de las mismas. En algunas modalidades la invención emplea una técnica para analizar por lo menos una propiedad química o física, o ambas. La concentración más alta de cierta sustancia puede revelar información concerniente a una característica de interés, por ejemplo, la fermentabilidad de una planta para producir etanol. De este modo, el análisis de las propiedades químicas de una planta se puede llevar a cabo a través del perfilamiento de cierta sustancia de las células o de los tejidos tomados de una planta. Se puede evaluar una amplia variedad de sustancias con el propósito de clasificar plantas y variedades de plantas. Generalmente la sustancia que será analizada será seleccionada basándose en la especie de la planta que será analizada. Se necesita analizar por lo menos una sustancia, y un experto en la técnica puede determinar el número óptimo o preferible de sustancias objetivo basándose en las plantas que será utilizada. Normalmente se selecciona una sustancia que será analizada a partir del grupo que consiste en proteínas, almidones y lípidos.

Se puede utilizar cualquier técnica de análisis químico conocida en al técnica, para la determinación de las propiedades químicas, como la determinación de las composiciones de proteína, almidón y lípidos. Entre las distintas técnicas de análisis químico, generalmente son preferibles las técnicas de separación para una aplicación de la presente invención. Ejemplos de técnicas de análisis químico incluyen, pero no están limitadas a, HPLC, MALDI-TOF MS, electroforesis capilar, MS en línea de RP-HPLC, electroforesis en gel, y combinaciones de los mismos. En una modalidad, un método para predecir una característica de interés es un método de alto rendimiento que emplea un analizador de alto rendimiento que es capaz de producir rápidamente resultados. El rápido suministro del resultado sobre una característica, como la fermentabilidad, puede ayudar en la optimización de los procedimientos de fermentación a un nivel de las plantas. Los analizadores ilustrativos incluyen. Pero no están limitados a, por ejemplo, electroforesis capilar, MS en línea RP-HPLC electroforesis en gel, y combinaciones de los mismos. El término planta como se utiliza en la presente se refiere a una planta individual, a más de una planta, a una variedad de planta, a un cultivo de grano, o a una variedad de grano. Una planta que será analizada por los métodos presentes, puede ser cualquier planta que sea fermentable a través de los métodos de producción de etanol convencionales. Normalmente la planta es una variedad de cereal como por ejemplo, maíz, trigo, cebada, arroz, centeno, avena, sorgo o soya. En algunas modalidades la planta se analiza para ver el perfil químico de la sustancias objetivo como proteína, almidón o lípidos. En una modalidad particular la planta se analiza para buscar por lo menos una proteína de zeina que comprende las proteínas a-zeina, ß-zeina, y ?-zeina. En otras modalidades, la muestra se analiza para determinar el contenido de azufre, un indicador de las proteínas que contienen tiol y disulfuro. El análisis de una planta puede incluir el análisis de una o más semillas de la planta. Se puede utilizar cualquier semilla en un método o ensayo de la invención, se pueden analizar semillas individuales o una pluralidad de semillas. El análisis de una planta puede incluir el análisis de otros tejidos vegetales, como se utiliza en la presente, tejidos vegetales incluyen, pero no están limitados a cualquier parte de la planta, como las hojas, las flores, las raíces, y los pétalos. También se puede predecir una característica de interés analizando las propiedades físicas de la planta, por ejemplo, la asociación de almidón-proteína. En una modalidad, el método comprende determinar la densidad de almidón de una muestra de la planta en suspensión. La densidad de almidón es la cantidad de almidón visualizado o medido en alguna unidad discreta, por ejemplo, un volumen o un área de una imagen. En otra modalidad, el método comprende analizar la proteína por medio de la inmunoprecipitación o inmunotinción. En otra modalidad el método comprende tomar una muestra de tejido de por lo menos una planta; teñir la muestra de tejido con un reactivo de tinción para proteína, lípido, lipoproteína o carbohidrato; observar u obtener imágenes de la muestra teñida con un microscopio o con un equipo equivalente; y determinar la asociación de almidón-proteína observando o analizando las imágenes. La visualización de los componentes de la célula generalmente requiere la preparación de la muestra como un paso inicial. Las muestras para el análisis microscópico se pueden tomar de cualquier parte o tejido de la planta de interés. Por lo general es preferible obtener muestras de las partes o tejidos de la planta que sean una fuente principal de almidón. Ilustrativamente, se pueden utilizar los tejidos de endospermo para la preparación de la muestra. Se puede tomar más de una muestra de una variedad de planta para confirmar la precisión del análisis. Las muestras se pueden seccionar (rebanadas delgadas y planas) o moler (machacadas con una cuchilla o molidas con un triturador mecánico para formar un polvo). Si se analizan dos o más plantas, generalmente deberán obtenerse muestras de cada planta del mismo tejido. Después de tomar las muestras de las plantas, se pueden teñir, o etiquetar para una mejor observación microscópica. Los objetivos de tinción se pueden cambiar dependiendo de la planta que será utilizada en la producción. Los objetivos generalmente se seleccionan de proteína, lípidos, lipoproteínas y carbohidratos. Los procedimientos de tinción son bien conocidos en la técnica y prácticamente se puede emplear exitosamente cualquier procedimiento conocido en la presente invención, un procedimiento de tinción específico será elegido adecuadamente de acuerdo con el objetivo de tinción. Al igual que los protocolos de tinción, se puede utilizar cualquier reactivo de tinción para la presente invención, ilustrativamente, se puede utilizar el mercurocromo, yodo y Sudan IV para la tinción de proteínas, almidón y lípidos, respectivamente. Sin embargo, la elección de los reactivos no determinará necesariamente el resultado de la invención. Las muestras se pueden teñir con uno o más reactivos. Por ejemplo, una muestra se puede teñir con mercurocromo para identificar las proteínas que contienen tioles y disulfuros, después se puede contrateñir con naranja de acridina para identificar amiloplastos. De esta manera la doble tinción permite la visualización de objetivos co-localizados. Para analizar las propiedades físicas de la planta, se pueden emplear técnicas de formación de imágenes por microscopía. Se puede utilizar cualquier técnica conocida de formación de imágenes por microscopía como por ejemplo, microscopía de luz, confocal y electrónica, para determinar la organización subcelular de las células o tejidos. Un experto en la técnica puede elegir las técnicas apropiadas de formación de imágenes para usarlas de acuerdo con el método de la invención, por ejemplo, las técnicas adecuadas de formación de imágenes pueden incluir, pero no están limitadas a, microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC), microscopía de luz polarizada, microscopía de fluorescencia, microscopía de epi-fluorescencia, microscopía confocal, microscopía de barrido electrónico (SEM), microscopía electrónica de transmisión (TEM), y formación de imágenes hiperespectrales.

Se forman imágenes de las muestras para identificar la organización subcelular dentro de las muestras. Por ejemplo, se pueden determinar las cantidades respectivas de granos de almidón asociados con proteína y sin proteína, que están presentes en las muestras de plantas, con el conteo de los granos asociados. Esto puede servir como base para la determinación de las características de alto rendimiento de etanol y de bajo rendimiento de etanol, o para determinar las características de alta y baja digestividad. La observación y el conteo se pueden llevar a cabo mediante observación directa a través de un ocular y/o por la examinación de las imágenes obtenidas por las técnicas de formación de imágenes que se describieron antes. La asociación de almidón-proteínas puede determinar por la cuantificación de puntos fluorescentes, la determinación de la intensidad de fluorescencia o determinación del área de fluorescencia. El análisis de la organización subcelular, como el conteo de granos, puede ser automática con la ayuda de un dispositivo computador o software, o una combinación del dispositivo computador y del software. Se pueden emplear otras técnicas de visualización para analizar las características físicas y químicas de una planta, incluyendo, pero no limitados a, un lector de placa fluorescente, fluorímetro, citómetro de flujo, espectrofotómetro, difusor de luz y por análisis espectral. Las plantas objetivo que se pueden utilizar en el método de análisis físico puede ser cualquier planta fermentable. Ilustrativamente, las plantas son las mismas que se enumeraron anteriormente en el método de análisis químico. En una modalidad, el grado de asociación de almidón-proteína también se puede determinar con una combinación de análisis químico y análisis físico de la planta objetivo. El orden de los análisis no tiene generalmente una influencia en el resultado. Cualquier análisis puede hacer primero y el otro análisis se usa después para confirmar el primer resultado. La combinación de los dos análisis puede proporcionar, en algunas modalidades, resultados más precisos que un solo análisis. También se proporciona en la presente un modelo de análisis multivariado para predecir la fermentabilidad para producir etanol a partir de una planta. El modelo comprende: a) obtener una muestra de por lo menos una planta; b) medir en la muestra por lo menos una propiedad química, por lo menos una propiedad física, por lo menos una propiedad agronómica, o cualquier combinación de las mismas; y c) terminar la corelación entre por lo menos una propiedad y la fermentabilidad para producir etanol. La por lo menos una propiedad química se puede seleccionar del grupo que consiste en contenido de aceite, contenido de fibra, contenido de humedad, contenido de aminoácidos, contenido de proteínas, y contenido de almidón. El contenido de aceite puede incluir tanto la cantidad como el tipo de aceite. El contenido de fibra puede incluir tanto la cantidad como la clasificación de la fibra. El contenido de aminoácidos puede incluir tanto la cantidad como el tipo de aminoácido. El contenido de proteína puede incluir tanto la cantidad como el tipo de proteína. El contenido de almidón puede incluir tanto la cantidad como la clasificación del almidón. La por lo menos una propiedad física puede seleccionarse del grupo que consiste en la densidad de la semilla absoluta, el peso de prueba de la semilla, la dureza de la semilla, el tamaño de la semilla, la relación de endospermo de duro a suave, el tamaño de germen, color, resquebrajamiento, captación de agua, espesor de pericarpio, y tamaño de corona. La por lo menos una propiedad agronómica se puede seleccionar del grupo que consiste en rendimiento de la cosecha, vigor de la semilla, madurez relativa, vigor de emergencia, vigor vegetativo, tolerancia a la tensión, resistencia a las enfermedades, ramificación, floreo, ajuste de la semilla, densidad de la semilla, estabilidad y manejabilidad de la semilla. La madurez relativa como se utiliza en la presente es el cese de la acumulación de peso seco por parte del grano y, por lo tanto, el rendimiento máximo. La manejabilidad de la semilla como se utiliza en la presente incluye la densidad de agrupación, la fragilidad, el contenido de humedad, el desgranado, etc. La invención también está ilustrada, pero no limitada, por los siguientes ejemplos. Son posibles variaciones de los siguientes ejemplos sin apartarse del alcance de la invención.

EJEMPLOS Las abreviaciones que se utilizan en los siguientes ejemplos incluyen: ACN Acetonitrilo DTT Ditiotreitol Cromatografía liquida de alto rendimiento de fase RP-HPLC inversa Espectroscopia de masas de tiempo de vuelo por MALDI-TOF MS desorción/ionización mediante láser asistida por matriz SEM Microscopía de barrido electrónico TEM Microscopía electrónica de transmisión EJEMPLO 1 Análisis químico utilizando RP-HPLC y/o MALDI-TOF MS. La proteína se extrajo de muestras de maíz al resuspender la harina de maíz desgrasada (50 mg) en NH4OH 25 mM, ACN al 60% y DTT 10 mM, posteriormente agitando a 60°C (en un baño de agua) durante dos horas. La proteína que contiene el sobrenadante se recuperó mediante centrifugado (3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente) y se transfirió a tubos vacíos. Cada muestra fue analizada mediante MALDI-MS y RP-HPLC. Se realizó MALDI-TOF MS en muestras de proteína diluida (5 veces diluida con solución de matriz JAVA, Sigma, St. Louis, MO). Los espectros de masa fueron obtenidos utilizando una bioespectrometría Applied Biosystems Voyager-DE PRO. La figura 1 es un dibujo superpuesto del análisis de espectro de masa de proteínas de zeína totales de muestras de maíz diluidas 5 veces con solución matriz. Los híbridos con alto y bajo rendimiento en etanol pueden distinguirse mediante una altura pico, con híbridos con bajo rendimiento en etanol mostrando picos superiores en cada uno de los marcadores de proteína de zeína indicados. Se realizó RP-HPLC al inyectar muestras de proteína en una columna C18 Vydac HPLC y una gradiente lineal de acetonitrilo (de 15% a 80%). Todas las muestras se recolectaron; las fracciones de muestra fueron recolectadas a los 67 minutos para análisis subsecuente mediante MALDI-TOF MS. La figura 2 es un dibujo superpuesto de los cromatogramas RP-HPLC que perfila las proteínas de zeína en híbridos con alto y bajo rendimiento en etanol. El híbrido con bajo rendimiento demuestra áreas pico superiores a los 66.7 minutos que el híbrido con alto rendimiento.

EJEMPLO 2 La identificación de propiedades físicas de una planta muestra utilizando técnicas de microscopía se llevo a cabo con dos tipos de híbridos de maíz, es decir, híbridos polinizados a mano (cuadro 1 ) e híbridos polinizados abiertos (cuadro 2). 1. Preparación muestra para híbridos polinizados a mano Se realizó una prueba ciega con muestras que consisten en 12 híbridos recolectados aleatoriamente de semillas de reserva de muestras previamente analizadas y determinadas por ser seis híbridos con alto rendimiento en etanol y seis híbridos con bajo rendimiento en etanol. Un total de 12 granos fueron recolectados de cada híbrido para la prueba. Dos a cuatro granos por híbrido fueron procesadas cada vez. Granos secos (cuatro por híbrido) y grados saturados en agua (ocho por híbrido) se utilizaron. Las secciones longitudinales se probaron para 2 granos/híbrido secos y dos saturados. Las secciones transversales se probaron para los granos restantes (8 granos por híbrido). Únicamente se utilizó tejido endospermo, ya sea seccionado o triturado (que se raspó con una navaja para formar polvo o mediante triturado mecánico). La comparación entre híbridos que condujo al establecimiento de dos grupos diferentes se basó en secciones transversales. Los 12 híbridos fueron macados EA a EL. Los rendimientos porcentuales en etanol después de la fermentación de los híbridos se muestran en el cuadro 1.

CUADRO 1 A- Polinizados a mano Marca Rendimiento EA 15.67 EB 15.47 EF 15.66 EG 15.68 EH 15.98 El 15.72 EC 14.38 ED 14.52 EE 14.64 EK 13.66 EL 14.52 EJ 13.86 Al menos seis secciones fueron obtenidas por grano, y 6-12 porciones de endospermo procesadas para TEM a partir de las cuales al menos 8 muestras, con 5 a 8 secciones delgadas cada una, se utilizaron para microscopía por florescencia/confocal, y 3 a 15 rejillas para TEM. Se utilizaron las siguientes microtécnicas: contraste de interferencia diferencial (DIC) luz polarizada; microscopía por fluorescencia o confocal (para secciones teñidas); SEM y TEM. La selección de características morfológicas y/o subcelulares, o marcadores, se basó en lo siguiente: 1) el(los) mismo(s) marcador(es) subcelular(es) debe(n) observarse en todas las muestras de los granos de algún híbrido; 2) el(los) marcador(es) subcelular(es) tuvo (tuvieron) que estar presentes únicamente en 6 híbridos (o ser característicos de); 3) la presencia de dicha característica o marcador debe corroborarse por todas las microtécnicas utilizadas. 2. Visualización de proteínas, almidón, y lípidos Tinción de proteínas: Las muestras se incubaron durante 1 hora, a temperatura ambiente, en una solución de mercurocromo ([sal disódica de 2,7-dibromo-4-(hidroximercuri) fluoreceína] de Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) preparada en regulador de Tris, pH 7.4. Esta tinción identifica tioles de proteína y disulfuros. Después de la incubación las muestras se lavaron en regulador de Tris, se montaron en agua, regulador de pH, o Vectashield (Vector Laboratories, CA, E.U.A.) y se observó bajo un microscopio fluorescente o confocal. Las proteínas fueron identificadas como fluorescencia roja tras la excitación de mercurocromo (microscopio de fluorescencia 525/565 nm o 545/>590 nm; confocal: 533 nm). Tinción de algodón: Las muestras se incubaron durante 3 a 15 minutos (dependiendo del tipo de muestra) a temperatura ambiente en solución de yodo Lugol comercial (Electron Microscopy Sciences, PA, E.U.A.). Esta tinción identifica al almidón. Después de la incubación las muestras se lavaron en agua, se montaron en regulador de pH, y se observaron bajo un microscopio de luz, microscopio de epi-fluorescencia o microscopio confocal. El almidón se tiñe café oscuro. Esta tinción se utilizó frecuentemente después de la tinción de proteína. La tinción con solución naranja de acridina 1 µg/mL durante 3 minutos (Molecular Probes, CA, E.U.A.) también se utilizó en el reemplazo de tinción con yodo, permitiendo la localización de amiloplastos (organelos que contienen almidón) que hace que se vuelva verde cuando se excita a 510 nm.

Tinción de lípidos: Las muestras se incubaron durante 15 minutos, a temperatura ambiente, en una solución Sudan IV al 0.3% (p/v) preparada en etanol al 70% (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.). Esta tinción identifica lípidos totales. Después de la incubación, las muestras se lavaron en solución de etanol al 50% (v/v), se lavaron con agua, se montaron en agua, y se observaron bajo un microscopio de luz. 3. Preparación de la muestra para híbridos polinizados abiertos Esta prueba se realizó con muestras que consisten en dos híbridos con alto rendimiento en etanol y dos con bajo rendimiento en etanol. Los rendimientos porcentuales en etanol respectivos después de la fermentación se ilustran en el cuadro 2.

CUADRO 2 B-Polinizado abierto Marca Rendimiento 5494 17.47 A-03 17.59 5110 16.14 B-20 15.52 Un total de 12 granos se recolectaron de cada híbrido para la prueba. El diseño de prueba fue idéntico al seguido por los híbridos polinizados a mano pero únicamente 2 a 4 granos por híbrido fueron analizados. Además de las técnicas previamente probadas, las muestras 5494 y 51 10 se procesaron para TEM utilizando la técnica de congelamiento por alta presión en lugar de fijación química. 4. Cuantificación de asociación de almidón-proteína para secciones delgadas Los granos para las muestras EA y EJ fueron procesadas para microscopía de electrones de transmisión utilizando un procedimiento optimizado de microonda. Las secciones delgadas (0.5 µ?? de espesor) dé los mismos bloques como aquéllas utilizadas previamente se tiñeron para visualización de proteínas utilizando microscopía por fluorescencia. Los granos de almidón con y sin proteína fueron contados automáticamente de seis secciones de grano diferentes. Un conteo adicional se realizó para secciones del mismo grano, (para EA y EJ), para verificar variaciones dentro del grano. Se utilizó un software Image Pro-Plus para contar los puntos obscuros (almidón) contra las zonas/puntos rojos pequeños (proteína). 5. Cuantificación de la asociación de almidón -proteína para muestras trituradas. Esta prueba consiste en dos híbridos con alto rendimiento en etanol y dos con bajo rendimiento en etanol, 15 mg de granos triturados por híbrido, por duplicado. Cada muestra de 15 mg se tiñó para visualización de proteína, con y sin contratinción de amiloplastos, lavados y alícuotas al 20 µ? (30 g µL) que se tomaron para observación bajo microscopio de fluorescencia/confocal. Se adquirieron diez imágenes por alícuota al 20 µ?_, y el número y área de puntos fluorescentes rojos (proteína) se determinó utilizando un software Image Pro-Plus. 6. Resultado No se encontraron diferencias importantes entre los granos de almidón de híbridos con alto rendimiento en etanol y bajo rendimiento en etanol en términos de tamaño, forma, índices de refracción, relaciones de poblaciones de grano de almidón y color de tinción. Para muestras de híbridos con alto rendimiento en etanol, los granos de almidón fueron dispersados aleatoriamente dentro de la célula, fácil de aislar, formando así suspensiones que contienen altas densidades de granos de almidón, y dichos granos de almidón generalmente de dispersaron en suspensión como estructuras individuales, raramente asociadas con la proteína. Véase figuras 3A-3D, 7 y 9. Para las muestras de híbridos con bajo rendimiento en etanol, los granos de almidón fueron altamente organizados dentro de la célula, difíciles de aislar, dando como resultado suspensiones de grano de almidón de baja densidad, frecuentemente presentes en suspensión como agregados o grupos, y frecuentemente relacionados con la proteína. Véase figuras 3A-3D, 6A-6F, 8 y 10. Los resultados de SEM (figuras 6A-6F) corroboraron resultados de microscopía ligera (figuras 3A-3D) y mostraron que para híbridos con alto rendimiento en etanol los granos de almidón fueron débilmente empacados dentro de las células, y mostraron rara vez superficies irregulares, por lo que para los híbridos con bajo rendimiento en etanol, los granos fueron estrechamente empacados entre sí, mostrando materiales relacionados con/o en la superficie de amiloplastos. La tinción con proteína mostró diferencias considerables entre los híbridos con alto rendimiento y bajo rendimiento en etanol. Para muestras con alto rendimiento en etanol, la matriz de proteína fue lisa, continua y frágil, mientras que para muestras con bajo rendimiento en etanol, la matriz de proteína fue irregular y más espesa, manteniendo una densidad superior de estructuras globulares. Véase figura 4A-4B. Se observó que los granos de almidón de endospermo seccionado o triturado de híbridos con bajo rendimiento en etanol tendían a dispersarse en suspensión en números más bajos que los granos de almidón de muestras con alto rendimiento en etanol, frecuentemente en agregados o grupos, y se asociaron con proteínas. Dicha asociación de almidón-proteína se correlacionó sorprendentemente con híbridos con bajo rendimiento en etanol con fermentabilidad reducida y de esta manera producción reducida de etanol. Las secciones delegadas de muestras de endospermo del maíz, teñidos para proteína, y analizados utilizando un software Image Pro-Plus, se probaron como herramientas para cuantificar las asociaciones de almidón -proteína en híbridos con bajo y alto rendimiento en etanol. El cuadro 3 muestra el número de granos de almidón contados por el software Image Pro-Plus para secciones de endospermo delgadas de maíz de híbridos con alto (EA) y bajo (EJ) rendimiento en etanoi, teñidos para proteína y almidón, y se observaron bajo microscopía de fluorescencia. En el cuadro, "almidón limpio" significa granos de almidón no relacionados con la proteína y "c/proteína" denota granos de almidón relacionados con la proteína.

CUADRO 3 Híbridos con alto rendimiento en etanoi Híbridos con alto rendimiento en etanoi Almidón limpio c/proteína Total Almidón limpio c/proteína Total 1985 15 2000 5780 322 6102 2503 19 2522 4821 232 5053 5027 54 5081 2509 306 2815 3684 3 3687 2112 278 2390 11984 0 1 984 1419 270 1689 7426 43 7469 1089 347 1436 2937 4 2941 495 173 668 TOTAL 35546 138 35684 18225 1928 20153 * Conteos para secciones del mismo grano Los resultados de los conteos Image Pro-Plus mostraron que el número de granos de almidón relacionados con la proteína fue hasta 25 veces superior en secciones delgadas de híbridos con bajo rendimiento en etanoi que para los de alto rendimiento en etanoi. La comparación de los dos híbridos también se ilustra en la figura 11. Cuando se tiñeron las secciones de maíz delgadas para proteína, las paredes celulares de la muestra con alto rendimiento se tiñeron intensamente, por lo que la tinción para las paredes celulares de la muestra con bajo rendimiento fue nula o débil. Esta observación indica que la composición de la pared celular es diferente en híbridos con alto rendimiento en etanol y bajo rendimiento en etanol. Véase figura 12. Cuado se introducen elementos o características y las modalidades ejemplares, los artículos "un" "una", "el/la" y "dicho/dicha" dan a entender que existen uno o más de dichos elementos o características. Los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser inclusivos y significa que puede haber elementos adicionales o características diferentes a aquellas especificadas. Además debe entenderse que los pasos del método, procedimientos y operaciones descritas en la presente no deben construirse como que requieren necesariamente su rendimiento en el orden particular discutido o ilustrado, a menos que se identifique específicamente como una orden para la realización. También debe entenderse que los pasos adicionales o alternativos también pueden ser empleados. La definición de la descripción es meramente ejemplar en naturaleza y, de esta manera, se pretende que las variaciones que no se apartan de la esencia de la descripción estén dentro del alcance de la descripción. No debe considerarse que dichas variaciones se apartan del espíritu y alcance de la descripción.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para analizar al menos una planta para predecir una característica de interés seleccionada del grupo que consiste en fermentabilidad para producir etanol y digestibidad, el método comprende medir el grado de asociación de almidón-proteína en al menos una planta.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la característica de interés es fermentabilidad para producir etanol.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la característica de interés es digestibidad.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque medir el grado de asociación de almidón-proteína comprende medir una propiedad química de al menos una planta determinada por análisis de proteína, almidón o ambos proteína y almidón.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la proteína a ser analizada comprende al menos una proteína zeína.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque al menos una proteína zeína se selecciona de una o más de a, ß y -zeínas.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque medir el grado de asociación de almidón-proteína comprende analizar la proteína para determinar el contenido de azufre.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque medir el grado de asociación de almidón-proteína comprende analizar la proteína mediante una técnica de separación seleccionada del grupo que consiste en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), espectroscopia de masas en tiempo de vuelo por deserción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), electroforesis capilar, espectroscopia de masas en línea de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (MS en línea de RP-HPLC), electroforesis en gel, page de gel de dodecil sulfato de sodio (SDS), electroforesis en gel bidimensional y combinaciones de los mimos.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la técnica de separación es HPLC, MALDI-TOF MS o ambas HPLC y MALDI-TOF MS.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la medición del grado de asociación de almidón-proteína comprende medir una propiedad física de la planta determinada por visualización de proteína, almidón o ambas proteína y almidón.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque medir la asociación de almidón-proteína comprende obtener una muestra de tejido de planta y determinar la densidad del almidón en una suspensión de la muestra.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque medir la asociación de almidón-proteína comprende obtener una muestra de tejido de planta y analizar la proteína mediante inmunotinción o inmunoprecipitación.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque medir la asociación de almidón-proteína comprende: (a) tomar una muestra de tejido de al menos una planta; (b) teñir la muestra de tejido con un reactivo de tinción para proteína, lípido, lipoproteína y/o carbohidrato; (c) observar o formar imágenes de la muestra teñida bajo un microscopio; y (d) medir la asociación de almidón-proteína.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la muestra de tejido se toma del endospermo.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el reactivo de tinción es mercurocromo, Sudan IV o yodo.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el microscopio se selecciona del grupo que consiste en microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC), microscopio de luz polarizada, microscopio de fluorescencia, microscopio de epi-fluorescencia, microscopio confocal, microscopio de electrones de escaneo (SEM), microscopio hiperespectral, y microscopio electrónico de transmisión (TEM).

17. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque determinar la asociación de almidón-proteína se hace mediante cuantificación de puntos fluorescente, determinación de fluorescencia, intensidad de fluorescencia o determinación del área de fluorescencia.

18. - El método para predecir la fermentabilidad para producir etanol de al menos una planta que comprende medir el grado de asociación de almidón-proteína en la planta, en donde la asociación de almidón-proteína se determina al analizar la proteína vegetal y visualizar la agrupación de la proteína dentro de la asociación de almidón-proteína.

19. - Un método para predecir la digestibidad de al menos una planta que comprende medir el grado de asociación de almidón-proteína en la planta, en donde la asociación de almidón-proteína se determina al analizar la proteína vegetal y visualizar la agrupación de proteína dentro de la asociación de almidón-proteína.

20. - El método de conformidad con las reivindicaciones 18 o' 19, caracterizado además porque medir la asociación de almidón-proteína comprende analizar la proteína y confirmar los resultados del análisis de la proteína mediante visualización de la agrupación de proteína.

21. - El método de conformidad con las reivindicaciones 18 d 19, caracterizado además porque medir la asociación de almidón-proteína comprende analizar la proteína vegetal al teñir la proteína vegetal con mercurocromo y visualizar la agrupación de proteína.

22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 21 , caracterizado además porque al menos una planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, cebada, arroz, centeno, avena, sorgo y soya.

23. - Una prueba para analizar al menos una planta para predecir una característica de interés seleccionada del grupo que consiste en fermentabilidad para producir etanol y digestibidad, la prueba comprende: (a) obtener una muestra de la planta, y (b) medir en la muestra la asociación del almidón-proteína, en donde el grado de asociación de almidón-proteína predice la característica de interés.

24. - La prueba de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque la característica de interés es fermentabilidad para producir etanol.

25. - La prueba de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque la característica de interés es digestibidad.