MX2008012485A - Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de c-met. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos y fragmentos que se enlazan con el objetivo de proteína c-Met, en particular con los epítopos localizados en el dominio extracelular de c-Met, así como métodos de uso de los anticuerpos y kits, para el tratamiento de una célula indeseada, en particular una célula asociada con una condición relacionada con c-Met, tal como un cáncer, una metástasis, o una condición inflamatoria.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE USO PARA ANTICUERPOS DE C-MET Campo Técnico La presente invención se refiere a composiciones que contienen anticuerpos que se enlazan específicamente con el objeto de proteína c-Met, a métodos para la elaboración de estos anticuerpos, y a métodos de uso para tratar condiciones proliferativas, tales como cánceres y metástasis, y condiciones inflamatorias. Antecedentes El Receptor del Factor de Crecimiento de Hepatocitos, referido en la presente como c-Met, es una cinasa de tirosina receptora que se ha demostrado que se sobre-expresa y/o se muta en una variedad de malignidades, específicamente se encuentra un número de mutaciones de c-Met en diferentes tumores en fase sólida. El ligando de c-Met, el factor de crecimiento de hepatocitos (HG F), también conocido como factor de dispersión (SF), se enlaza con c-Met en una senda que está implicada en la invasión y en la metástasis de las células tumorales (Ma y colaboradores, 2003 Cáncer and Metástasis Reviews. 22:309-325). La interacción del factor de crecimiento de hepatocitos con c-Met inicia una cascada de eventos intracelulares (Derman y colaboradores, 1 996 J. Biol. Chem. 23;271 (8):4251 -4255). El enlace del factor de crecimiento de hepatocitos da como resultado la activación de la actividad intrínseca de la cinasa de tirosina de c- Met, y la auto-fosforilación de varios residuos de tirosina sobre el dominio intracelular (Ma y colaboradores, 2003 Cáncer and Metástasis Reviews. 22 :309-325). La activación de la senda de HGF/c-Met da como resultado un amplio arreglo de respuestas celulares, incluyendo dispersión de células, angiogénesis, proliferación, mejor movilidad celular, invasión , y metástasis. El antagonismo puede actuar para inhibir la auto-fosforilación y/o para inducir la internalización de c-Met superficial , y/o para sub-regular la actividad de c-Met. Las células tumorales pueden invadir un l ímite del tejido, degradando y remodelando la matriz extracelular circundante, de tal manera que las células tumorales pueden migrar a través del l ímite del tejido de la matriz extracelular, permitiendo la diseminación y formación de metástasis. La señalización de HGF/c-Met es una senda que media el crecimiento invasivo normal y maligno. Se han identificado mutaciones en mal sentido de c-Met en una variedad de cánceres, localizándose la mayoría de las mutaciones en el dominio de cinasa . Los mutantes se caracterizan por una mayor actividad de cinasa de tirosina , promoviendo de esta manera las acciones biológicas de c-Met. Existe una necesidad de composiciones y métodos para tratar cánceres, metástasis de canceres, y condiciones inflamatorias, tales como agentes que interfieran con la señalización de HGF/c-Met, en donde la actividad de c-Met contribuya a la invasión y/o a la metástasis.

Breve Descri pción de la Invención La cinasa de tirosina receptora c-Met está involucrada en los procesos de migración , invasión , y morfogénesis que acompañan a la embriogénesis a la regeneración del tejido. Varias l íneas de evidencia han indicado que c-Met también tiene un papel en la patogénesis tumoral . Las mutaciones de la l ínea germinal activadora dentro del dominio de cinasa de c-Met están asociadas con el desarrollo de carcinoma de células renales papilares hereditario (PRCC). También se han reportado, aunque raramente, mutaciones dentro del dominio de cinasa en formas esporádicas del carcinoma de células renales papilares, en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, y en el carcinoma gástrico. Se observan niveles elevados de c-Met, junto con su único ligando HGF/SF, a una alta frecuencia, en múltiples tumores cl ínicamente relevantes. Se ha reportado una correlación entre la mayor expresión y progreso de la enfermedad , metástasis, y mortalidad de pacientes en varios cánceres, incluyendo carcinoma de vejiga, de mama y gástrico, así como leiomiosarcoma y glioblastoma. Los anticuerpos de la invención se enlazan específicamente con c-Met, con una alta afinidad , y modulan el efecto de c-Met de la enfermedad . Los anticuerpos que antagonizan los niveles o la actividad de c-Met se contemplan para el tratamiento de enfermedades proliferativas o de enfermedades inflamatorias. Las enfermedades proliferativas que se cree que pueden ser tratadas mediante los anticuerpos de la invención incluyen en especial cánceres. Los anticuerpos que agonizan los niveles o la actividad de c-Met se contemplan para la regeneración de órganos, el sanado de heridas, la regeneración de tejidos, y similares. Una modalidad de la presente invención proporciona un anticuerpo que se enlaza selectivamente con una proteína de c-Met, o una porción inmunológicamente activa de este anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo funcional . En una modalidad , el anticuerpo o la porción inmunológicamente activa de este anticuerpo es de un mamífero, que tenga un origen tal como de roedor, humano, o camélido, o es un anticuerpo humanizado. En una modalidad particular, el anticuerpo anti-c-Met se caracteriza por tener una región de enlace de antígeno que es específica para la proteína objetivo c-Met, y el anticuerpo o el fragmento funcional se enlaza con c-Met o con un fragmento de c-Met. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal . En ciertas modalidades, el anticuerpo o la porción inmunológicamente activa de este anticuerpo, es un anticuerpo monoclonal . Una modalidad adicional de la invención incluye, por ejemplo, un fragmento funcional, tal como una porción de enlace de antígeno, o este fragmento provisto sobre un andamiaje o estructura no basada en inmunoglobulina o no tradicional . En otra modalidad , el anticuerpo o el fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza con la proteína objetivo, c-Met, con una KD de 2.0 x 1 0"5M o menos, de 2.0 x 1 0"6M o menos, de 2.0 x 1 0'7M o menos, de 2.0 x 1 0"8M o menos, o de 2.0 x 1 0"9M o menos. En una modalidad relacionada, el anticuerpo o el fragmento funcional de este anticuerpo tiene un índice de desactivación ( Koesactivado ) para la proteína objetivo c-Met de 1 .0 x 1 0"2 por segundo o menos, de 1 .0 x 1 0"3 por segundo o menos, de 1 x 1 0"4 por segundo o menos, o de 1 .0 x 1 0"5 por segundo o menos. En una modalidad relacionada, el anticuerpo o el fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza con la proteína objetivo c-Met con una KD de 2.0 x 1 0"6M o menos, de 2.0 x 1 0"7M o menos, de 2.0 x 10"8M o menos, o de 2.0 x 1 0"9M o menos, e inhibe el enlace de HGF con c-Met. En una modalidad relacionada, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo antagoniza la actividad de c-Met. En ciertas modalidades, el anticuerpo o el fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza con la proteína objetivo c-Met, y modula, es decir, activa (agoniza) o inhibe (antagoniza) la actividad de c-Met, incluyendo, pero no limitándose a , la fosforilación , en especial la auto-fosforilación . En ciertas modalidades, el agonismo o la activación de la fosforilación de c-Met estimula cuando menos una de una actividad seleccionada a partir del grupo de regeneración de órganos, sanado de heridas, y regeneración de tejidos. En una modalidad relacionada, el órgano es riñon, hígado , páncreas, pulmón , estómago, intestino, piel , timo, o tiroides. En una modalidad preferida, el anticuerpo de la invención antagoniza c-Met, en donde el antagonismo da como resultado cuando menos una actividad seleccionada a partir de: la inhibición de la proliferación celular, la inhibición de la migración celular, la inhibición de la sobrevivencia celular, la inhibición de la metástasis, y/o la inhibición del enlace de HGS, o inducción de internalización de c-Met. En la mayoría de las modalidades, el antagonista de anticuerpo de c-Met de la invención se puede utilizar en el tratamiento de una enfermedad proliferativa, en especial cáncer o enfermedad inflamatoria. En una modalidad relacionada , el enlace se determina mediante uno o más ensayos que se pueden utilizar para medir una actividad que sea ya sea antagonismo o agonismo mediante el anticuerpo. Los ensayos miden cuando menos uno de los efectos del anticuerpo sobre un ligando de c-Met, que incluyen cuando menos: inducción de una actividad de la enzima de la senda de transducción de señales de c-Met; la inducción de la expresión de un gen de la senda de transducción de señales de c-Met; el enlace directo basado en electroquimiluminiscencia con c-Met; el ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas del enlace con c-Met; y la proliferación , sobrevivencia , migración, o metástasis de una célula. El hecho de que el anticuerpo tenga un efecto antagonista o agonista es determinado mediante la comparación de los resultados con controles que carezcan del ligando natural HGF. Por consiguiente, un anticuerpo antagonista bloquea la inducción de c-Met, inclusive en la presencia de HGF , mientras que un anticuerpo agonista provoca la inducción en ausencia de HGF. En otra modalidad , la invención proporciona secuencia de aminoácidos y de nucleótidos aisladas que proporcionan anticuerpos, y la secuencia de nucleótidos aislada codificante seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:1-30, 73-76, y 85-88. En una modalidad relacionada, la invención proporciona secuencias de aminoácidos aisladas codificadas por estas secuencias de nucleótidos, respectivamente, y las variantes conservadoras de estas secuencias de aminoácidos. En otra modalidad relacionada, la secuencia de nucleótidos aislada de cada una de las SEQ ID NOs:1-20, codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de enlace de antígeno. En todavía otra modalidad relacionada, la secuencia de nucleótidos aislada de cada una de las SEQ ID NOs:21-30 codifica una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de enlace de antígeno. En otra modalidad, la invención proporciona una secuencia de aminoácidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:31-72, 77-84, y 89-96, y las variantes conservadoras de estas secuencias. En una modalidad relacionada, la secuencia de aminoácidos aislada de cada una de las SEQ ID NOs:31-54 incluye una cadena ligera de enlace de antígeno. En otra modalidad relacionada, la secuencia de aminoácidos aislada de cada una de las SEQ ID NOs:55-72 incluye una cadena pesada de enlace de antígeno. En cierta modalidad, la invención proporciona una secuencia de aminoácidos aislada que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con las SEQ ID NOs:31-72, 77-84, y 89-96. En una modalidad relacionada, la invención proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia ilustrada en las SEQ I D NOs: 1 -30, 73-76, y 89-96. En todavía otra modalidad , la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada de cualquiera de estos anticuerpos, o un fragmento funcional de cualquiera de estos anticuerpos. Por consiguiente, en ciertas modalidades, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 -20. En una modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NO:21 -30. En otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 -20, y una cadena pesada codificada con una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:21 -34. En una modalidad relacionada , la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54. En otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:55-72. En todavía otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54, y las variantes conservadoras de estas secuencias, y una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:55-72 , y las variantes conservadoras de estas secuencias. En otra modalidad , la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera de Ig lambda codificada por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:73. En una modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera Ig kappa codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:74-76. En una modalidad adicional , la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera de Ig lambda con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:77-80. En otra modalidad relacionada, la invención proporciona una región de enlace de antígeno aislada que tiene una cadena ligera de Ig kappa con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:81 -84. En otra modalidad , la invención proporciona un anticuerpo humano o humanizado aislado, o un fragmento funcional del anticuerpo, teniendo el anticuerpo una región de enlace de antígeno que es específica para un epítopo que se encuentra en la proteína c-Met, de tal manera que el anticuerpo o el fragmento funcional se enlaza con los receptores superficiales de c-Met sobre una célula, e impide o mejora el desarrollo o la metástasis de un cáncer. En una modalidad relacionada, la invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento funcional que tiene una región de enlace de antígeno que es específica para un epítopo de la proteína objetivo c-Met, conteniendo un epítopo uno o más residuos de aminoácidos del dominio extracelular (ECD) de c-Met. En una modalidad relacionada, el epítopo es un epítopo de conformación . En todavía otra modalidad , el anticuerpo aislado o el fragmento funcional , como se describe anteriormente, es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv, o es un nanocuerpo de camélido. El Fab o el scFv en ciertas modalidades es monovalente. La naturaleza monovalente del anticuerpo es particularmente adecuada para un agente diseñado para antagonizar la proteína c-Met. En cierta modalidad , cualquiera de los anticuerpos IgG es una IgG . En una modalidad relacionada, cualquiera de los anticuerpos anteriores es una lgG 1 , una lgG2, una lgG3, o una lgG4. En una modalidad particular, la IgG es una lgG4. En una modalidad más específica, la lgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:85-88. En todavía otra modalidad relacionada, la lgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:85-88. En una modalidad relacionada adicional , la lgG4 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:89-96, y las variantes conservadoras de estas secuencias. En otra modalidad , la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cuando menos uno de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales o variantes conservadoras de estos anticuerpos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para los mismos. En todavía otra modalidad , la invención proporciona un animal transgénico o una célula transgénica que lleva un gen que codifica cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de ellos. En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno o condición relacionada con c-Met, el cual involucra administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriores. La enfermedad o condición es un cáncer o una condición inflamatoria. En una modalidad , el cáncer es esofágico, de mama, de riñon , incluyendo, pero no limitándose a, carcinoma de células renales papilares, glioma, de cabeza y cuello, epitelial , de pulmón, de piel , leucemia , linfoma , mieloma, de cerebro, pancreático, gástrico, gastrointestinal , de estómago, de colon, de intestino, de h ígado, genital , urinario, de melanoma, o de próstata , así como otros tumores conocidos por un experto en este campo. En una modalidad particular, el cáncer es de hígado o esofágico, o es un sarcoma. Más particularmente, el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer genital , cáncer urinario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga (superficial e invasivo del músculo), cáncer de mama, cáncer cervical , cáncer de colon , cáncer colo-rectal , glioma (incluyendo glioblastoma , astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma, oligodendroglioma), cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal , cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), incluyendo carcinoma hepatocelular de la infancia, cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo), carcinoma de células de Hurthle, cáncer epitelial , cáncer de piel , melanoma, incluyendo melanoma maligno, mesotelioma, linfoma, mieloma, incluyendo mieloma múltiple, leucemias, cáncer pulmonar, incluyendo cáncer pulmonar no microcelular (incluyendo todos los subtipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma macrocelular, y el tipo mixto adenoescamoso), cáncer pulmonar microcelular, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de riñón , cáncer de células renales, incluyendo cáncer de células renales papilares hereditario y esporádico, Tipo I y Tipo I I , y cáncer de células renales de células transparentes; sarcomas, en particular osteosarcomas, sarcomas de células transparentes, y sarcomas del tejido blando (incluyendo rabdomiosarcomas alveolares y embrionarios, sarcomas de la parte blanda alveolar); carcinoma de tiroides (papilar y otros subtipos). En una modalidad dada, una condición inflamatoria de ejemplo se debe a una infección. En una modalidad , el método de tratamiento sería bloquear la infección por el patógeno. En una modalidad particular, la infección es una infección bacteriana, incluyendo, por ejemplo, una infección de Listeria. Véase, por ejemplo, Shen y colaboradores, Cell 1 03:501 -1 0, (2000). Sin pretender limitarse a un mecanismo de acción, se piensa que las bacterias utilizan una proteína de enlace de c-Met para internalizarse. Los anticuerpos de la invención bloquearían esta interacción, impidiendo de esta manera la internalización . En otra modalidad , el tratamiento estimula una respuesta celular, por ejemplo una respuesta de sanado de heridas.

En ciertas modalidades, cualquiera de los métodos anteriores involucra administrar además un agente quimioterapéutico. En una modalidad relacionada, el agente quimioterapéutico es un agente contra el cáncer. Se proporcionan combinaciones específicas a través de toda la solicitud. En una modalidad relacionada, cualquiera de los métodos anteriores involucra administrar además un inhibidor específico de la senda. El inhibidor específico de la senda puede ser un agente quimioterapéutico, o puede ser un agente biológico, por ejemplo tal como anticuerpos. Los inhibidores específicos de la senda incluyen , pero no se limitan a, inhibidores de EGFR, VEGFR, etc. En todavía otra modalidad , la invención proporciona un método para el tratamiento de una célula indeseada, el cual involucra poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de estos anticuerpos. En una modalidad relacionada, la célula lleva c-Met sobre la superficie celular. En otra modalidad relacionada, el método anterior involucra además tratar la célula con un agente quimioterapéutico o con radiación . En una modalidad relacionada con varios de los métodos anteriores, en seguida de la administración al sujeto o del contacto con la célula, estos métodos pueden involucrar además observar la mejoría o el retardo del desarrollo o de la metástasis del cáncer. En todavía otra modalidad , la invención proporciona el método para la identificación de una célula que lleve el receptor superficial c-Met, involucrando el método poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anteriores o los fragmentos funcionales, de tal manera que los anticuerpos o los fragmentos funcionales tengan una marca detectable. Por ejemplo, la marca es radioactiva , fluorescente, magnética, paramagnética, o quimiluminiscente. En una modalidad relacionada, el método anterior involucra además un paso de tomar imágenes o separar la célula . Por ejemplo, la separación de la célula es el aislamiento de la célula que lleva c-Met apartándose de una población más grande de células. En otra modalidad, el anticuerpo humano o humanizado anterior, o el fragmento de anticuerpo, es un anticuerpo sintético, por ejemplo, un polipéptido producido mediante un sintetizador de aminoácidos en fase sólida. En otra modalidad , la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de estos anticuerpos, y un agente terapéutico adicional . El agente terapéutico adicional se selecciona a parti r del grupo que consiste en un agente contra el cáncer; un antibiótico; un agente anti-inflamatorio; un factor de crecimiento; y una citoquina. La invención se refiere además a un método para prevenir o tratar enfermedades proliferativas, o enfermedades tales como un cáncer, en un mamífero, en particular en un ser humano , con una combinación de agentes farmacéuticos que comprende: (a) un antagonista de c-Met de la invención; y (b) uno o más agentes farmacéuticamente activos; en donde cuando menos un agente farmacéuticamente activo es un producto terapéutico contra el cáncer. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden : (a) un antagonista de anticuerpo de c-Met; (b) un agente farmacéuticamente activo; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable; en donde cuando menos un agente farmacéuticamente activo es un producto terapéutico contra el cáncer. La presente invención se refiere además a un paquete comercial o a un producto que comprende: (a) una formulación farmacéutica de un antagonista de anticuerpo de c-Met; y (b) una formulación farmacéutica de un agente farmacéuticamente activo, para su uso simultáneo, concurrente, separado, o en secuencia ; en donde cuando menos un agente farmacéuticamente activo es un producto terapéutico contra el cáncer. En cierta modalidad , la invención proporciona un anticuerpo aislado que tiene una primera secuencia de aminoácidos que es una cadena pesada , tal como las SEQ I D NOs: 55-72, o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60 , el 70 , el 80, el 90, el 95 , o el 99 por ciento con una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:55-72; y una segunda secuencia de aminoácidos que es una cadena ligera, tal como las SEQ I D NOs:31 -54, o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54. En todavía otra modalidad , la invención proporciona un inmunoconjugado que tiene un primer componente que es un anticuerpo o fragmento como se describe anteriormente, y un segundo componente que es una segunda secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el segundo compuesto de inmunoconjugado es una citotoxina, o es una proteína de enlace o anticuerpo que tiene una especificidad de enlace por un objetivo que es diferente de c-Met. Por ejemplo, el objetivo de la especificidad de enlace diferente de c-Met es un antígeno tumoral o una proteína asociada con tumor sobre una superficie de una célula de cáncer. En ciertas modalidades, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anteriores como un anticuerpo biespecífico. En otra modalidad , la invención proporciona un kit que tiene cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos de anticuerpos. En algunas modalidades, el kit contiene además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para los mismos. En otras modalidades relacionadas, cualquiera de los anticuerpos anteriores en el kit está presente en una dosis unitaria. En todavía otra modalidad relacionada, el kit incluye instrucciones para su uso en la administración de cualquiera de los anticuerpos anteriores, o fragmentos funcionales de estos anticuerpos, a un sujeto, o para uso en investigación o rastreo. Se predeciría que los agentes terapéuticos que antagonizan la actividad de c-Met tendrían un impacto benéfico sobre el tratamiento de un amplio rango de tumores clínicamente relevantes. En la invención se incluyen anticuerpos completamente humanos que se enlacen directamente con el dominio extracelular de c-Met y que bloquean la interacción con HG F/SF. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una alineación de secuencias de las cadenas VH de la invención, que además delimita las regiones FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 de cada cadena. La Figura 2 es una alineación de secuencias de las cadenas VL lambda de la invención , que además delimita las regiones FR1 , CDR 1 , FR2, CDR2 , FR3, CDR3 y FR4 de cada cadena. La Figura 3 es una alineación de secuencias de las cadenas VL kappa de la invención, que además delimitan las regiones FR1 , CDR1 , FR2, CDR2 , FR3, CDR3 y FR4 de cada cadena. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos aislados, en particular a anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos humana o humanizada, que se enlazan específicamente con c-Met, específicamente con una porción extracelular de la proteína c-Met, y que inhiben las propiedades funcionales de c-Met. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se derivan a partir de secuencias de cadena pesada y ligera particulares, y/o comprenden características estructurales particulares, tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. La invención proporciona anticuerpos aislados, métodos para la elaboración de estos anticuerpos, ensayos para detectar tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden estos anticuerpos, y composiciones farmacéuticas que contienen a los anticuerpos, inmunoconjugados, o moléculas biespecíficas de la invención. La invención también se refiere a métodos para utilizar los anticuerpos con el fin de inhibir, es decir, antagonizar, la función de c-Met, con el objeto de inhibir el desarrollo de un trastorno o condición asociada con la presencia del c- et objetivo del receptor celular, dando como resultado el tratamiento de una enfermedad proliferativa, por ejemplo un cáncer o una condición inflamatoria. La invención, en una modalidad diferente, también se refiere a anticuerpos que activan , es decir, agonizan, la fosforilación de c-Met, y a métodos de uso de anticuerpos agonistas, que estimulan, por ejemplo, la regeneración de órganos, el sanado de heridas, o la regeneración de tejidos. En una modalidad dada, la condición inflamatoria es una infección . En una modalidad , el método de tratamiento sería bloquear la infección por patógenos. En una modalidad particular, la infección es una infección bacteriana, incluyendo, por ejemplo, una infección de Listeria. Con el objeto de que se pueda entender más fácilmente la presente invención , ciertos términos se definen por tener los significados de la presente, excepto como sea requerido de otra manera por el contexto. Se estipulan definiciones adicionales a través de toda la descripción detallada. Un "polipéptido c-Met" o "receptor c-Met" o "c-Met" se refiere a las cinasas de tirosina receptoras que se enlazan con el factor de crecimiento de hepatocitos. Los ejemplos específicos incluyen, por ejemplo, un polipéptido humano codificado por la secuencia de nucleósidos proporcionada en GenBank N úmero de Acceso N M_000245, o la proteína humana codificada por la secuencia de polipéptido proporcionada en GenBank N úmero de Acceso N P_000236, o el dominio extracelular de los mismos. La proteína precursora de una sola cadena primaria se disocia después de la traducción para producir las subunidades alfa y beta, las cuales se enlazan con disulfuro para formar el receptor maduro. La cinasa de tirosina receptora c-Met está involucrada en los procesos celulares, incluyendo, por ejemplo, los procesos de migración , invasión, y morfogénesis que acompaña a la embriogénesis y a la regeneración del tejido. La frase "trastorno o condición relacionada con c-Met" se refiere a cualquier enfermedad , trastorno, o condición que resulte de una expresión deseada o falta de expresión , de una regulación indeseada o falta de regulación , o de una actividad indeseada o falta de actividad , de c-Met, o que puede ser modulada, tratada, o curada mediante la modulación de la expresión o actividad de c-Met. Por ejemplo, se puede esperar la activación de la senda de HGF/c-Met en una gran proporción de pacientes de cáncer, o en los pacientes cuya enfermedad sea realmente impulsada por las alteraciones relacionadas con la senda de c-Met. Por ejemplo, la sobre-regulación se puede deber a diferentes mecanismos como la sobre-expresión de HGF y/o c-Met, o la activación constitutiva mediante la mutación de c-Met. Un trastorno o condición relacionada con c-Met incluye, pero no se limita a, por ejemplo, enfermedades y trastornos proliferativos, y enfermedades y trastornos inflamatorios. Las enfermedades proliferativas incluyen , pero no se limitan a, por ejemplo, cánceres, incluyendo, por ejemplo, gástrico, esofágico, de mama , de riñon incluyendo carcinoma de células renales papilares, glioma, de cabeza y cuello, epitelial , de pulmón , de piel , leucemia, linfoma , mieloma, de cerebro, pancreático, gastrointestinal , de estómago, de intestino, de colon , de h ígado, genital , urinario, melanoma, y de próstata, así como otros tumores conocidos por un experto en este campo. Las enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, infección bacteriana, incluyendo, por ejemplo, por Listeria. Otros trastornos se describen en la presente, y, por ejemplo, en las entradas de Online endelian I nheritance in Man ("OM IM") para , por ejemplo, el proto-oncogén de Met en OM IN Número de Acceso 164860, y para el factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión en OM I N Número de Acceso 142409. Otros ejemplos serán conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como es revisado por Corso y colaboradores, TRENDS en Mol. Med. 1 1 (6): 2841 (2005), y en Christensen y colaboradores, Cáncer Letts. 225: 1 -26 (2005), ambos de los cuales se incorporan como referencia. El término "respuesta inmune" se refiere a cualquier actividad de linfocitos, células presentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por estas células o por el hígado (incluyendo la producción y/o secreción de anticuerpos, citoquinas, y complemento), que da como resultado el enlace selectivo con, el daño a, la destrucción de, o la eliminación desde el cuerpo humano, de los patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o, en los casos de autoinmunidad o inflamación patológica, las células o tejidos humanos normales. Una "senda de transducción de señales" se refiere a una relación causal bioquímica generalmente iniciada por una interacción de proteína-proteína, tal como el enlace de un factor de crecimiento con un receptor, que da como resultado la transmisión de una señal desde una porción de una célula hasta otra porción de una célula . En general , la transmisión involucra la fosforilación específica de uno o más residuos de tirosina, serina, o treonina sobre una o más proteínas en la serie de reacciones que provocan la transducción de señales. Los penúltimos procesos típicamente incluyen eventos nucleares, que dan como resultado un cambio en la expresión genética. Un "receptor superficial" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal , y capaces de transmitir esta señal a través de la membrana de plasma de una célula. Un ejemplo de un receptor de superficie celular de la presente invención es c- et, con el cual se enlaza una molécula de proteína de factor de crecimiento, por ejemplo, un factor de crecimiento de hepatocitos (HG F). El término "anticuerpo" abarca cualquier fracción que tenga la función de enlace de tipo inmunoglobina. El término incluye las moléculas de anticuerpo enteras y cualquier fragmento de enlace de antígeno (es decir, "porción de enlace de antígeno"), o las cadenas individuales de los mismos, anticuerpos de camélido, incluyendo, por ejemplo, nanocuerpos, construcciones de enlace de exhibición de fagos, y similares. Un anticuerpo que se presenta naturalmente es una glicoproteína que comprende cuando menos dos cadena pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro . Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena presada (abreviada en la presente como VH), y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH 1 , CH2, y CH3. Existen solamente dos tipos de cadena ligera : lambda y kappa. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL), y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad , denominadas como regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas como regiones de estructura (FR). Como se encuentran en la naturaleza, cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs configuradas desde el término amino hasta el término carboxilo en el siguiente orden FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina con los tejidos o factores del huésped , incluyendo diferentes células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras), y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico . Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal . El término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de antígeno") se refiere a la longitud completa o a uno o más fragmentos de un anticuerpo, que tienen la capacidad para enlazarse específicamente con un antígeno (por ejemplo, una porción de c-Met). Se ha demostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo puede ser llevada a cabo por fragmentos de una molécula de anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de los fragmentos de enlace que contienen una porción de enlace de antígeno de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL, y CH 1 ; un fragmento F(ab)2 , que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación ; un fragmento Fv que tiene los dominios VH y CH1 ; un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de una sola secuencia de aminoácidos de una cadena de anticuerpo; un fragmento dAb (Ward y colaboradores, 1989 Nature 341 :544-546), que tiene un dominio VH; y una región determinante de complementariedad aislada (CDR). La referencia a fragmentos de anticuerpo que contienen las porciones de enlace de antígeno puede contemplar el fragmento aislado o conjugado con fracciones químicas o biológicas, o los fragmentos unidos a las estructuras o andamiajes derivados de inmunoglobulina no tradicionales, incluyendo , pero no limitándose a, por ejemplo, anquirinas, fibronectinas, anticuerpos de dominio, lipocalina, productos inmuno-farmacéuticos modulares pequeños, maxicuerpos, nanocuerpos, proteína A, afilina, gamma-cristalina, y ubiquitina, y otros andamiajes contemplados conocidos por un experto en este campo. Adicionalmente, aunque en una molécula de anticuerpo que se presente naturalmente existen dos cadenas que tienen dominios Fv, VL y VH, que son codificadas por genes separados, se pueden unir empleando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les hace posible expresarse de una manera recombinante como una sola cadena de proteína , en donde las regiones VL y VH forman una molécula monovalente (conocida como Fv de una sola cadena (scFv); véase, por ejemplo, Bird y colaboradores, 1 988 Science 242:423-426; y Huston y colaboradores, 1988 Proc. Nati. Acad. Sci. 85:5879-5883). Estos anticuerpos de una sola cadena también están abarcados dentro del término de porción de enlace de antígeno de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen empleando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se rastrean para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos u otros fragmentos de los mismos. Un "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente con un determinante que es un conjunto de aminoácidos sobre c-Met, está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlazan específicamente y sustancialmente con antígenos diferentes de c-Met). Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente con una proteína c-Met, tal como c-Met humana, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como con moléculas c-Met de otras especies, o con proteínas que tengan una alta cantidad de homología con una secuencia de aminoácidos de c-Met humana . Más aún , un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o productos químicos. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" , se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo, todas las cuales comparten una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal , por lo tanto, exhibe una sola especificidad de enlace y afinidad por un epítopo particular. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo policlonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población de anticuerpos heterogénea. Los anticuerpos policlonales con frecuencia se derivan a partir del suero reservado a partir de animales inmunizados, o a partir de seres humanos seleccionados. El término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables, en donde cuando menos una, y en general ambas, regiones de estructura y CDR, se derivan a partir de secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva a partir de estas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la l ínea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones, tales como sustituciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro, o mediante somática in vivo). El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a los anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace, que tienen regiones variables, en donde ambas regiones de estructura y CDR se derivan a partir de secuencias humanas. En una modalidad , los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye una célula-B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada, en general de origen humano, y un transgén de cadena ligera, en general de origen humano, fusionado con una célula inmortalizada , generalmente de origen humano. El término "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos humanos que se preparan , se expresan , se crean , o se aislan por medio recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón ) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmuno-globulina humana, o un hibridoma preparado a partir de los mismos, los anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo a partir de un transfectoma, los anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos de combinación, recombinantes, y los anticuerpos preparados, expresados, creados, o aislados por cualquier otro medio que involucre el empalme de todas o una porción de una o más secuencias del gen de inmunoglobulina humano con otras secuencias de ADN. Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en donde las regiones de estructura y CDR se derivan a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, estos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo), de tal manera que las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes, son secuencias que, aunque se derivan a partir de, y se relacionan con, las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgA, IgD, IgM, IgE, ó IgG, tales como lgG1, una lgG2, una lgG3, o una lgG4) que es proporcionada por los genes de región constante de cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico" para un antígeno, se utilizan de una manera intercambiable en la presente con el término "un anticuerpo que se enlaza específicamente con un antígeno". Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "se enlaza específicamente con la c-Met humana", pretende referirse a un anticuerpo que se enlaza con la c-Met con una KD de 2.0 x 1 0"5M o menos, de 2.0 x 1 0"6M o menos, de 2.0 x 10"7M o menos, de 2.0 x 1 0'8M o menos, o de 2.0 x 1 0"9M o menos. Como se utiliza en la presente, el término "reactividad cruzada" se refiere a un anticuerpo o a una población de anticuerpos que se enlazan con epítopos sobre otros antígenos. Esto puede ser causado ya sea por la baja avidez o especificidad del anticuerpo, o por múltiples antígenos distintos que tengan identidad o epítopos muy similares. La reactividad cruzada algunas veces es deseable cuando se desea el enlace general con un grupo relacionado de antígenos, o cuando se trata de marcar especies cruzadas si la secuencia del epítopo del antígeno no está altamente conservada en la evolución . Un anticuerpo que "reacciona cruzadamente con un antígeno diferente de la c-Met humana" se refiere a un anticuerpo que se enlaza con ese antígeno con una KD de 0.5 x 1 0"7M o menos, 5 x 1 0" 8M o menos, o de 2 x 1 0"9M o menos. Un anticuerpo que "no reacciona cruzadamente con un antígeno particular" pretende referirse a un antígeno que se enlaza con ese antígeno, y en su caso, con una KD de 1 .5 x 1 0"8M o más, o con una KD de 5-1 0 x 1 0"7M o de 5 x 1 0 M o más. En ciertas modalidades, estos anticuerpos que no reaccionan cruzadamente con el antígeno, exhiben un enlace esencialmente indetectable contra estas proteínas en los ensayos de enlace convencionales. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe el enlace con c-Met" se refiere a un anticuerpo que inhibe el enlace del ligando de HGF/SF con el receptor de superficie de c-Met con una Ki de 10 nM o menos, de 5 nM o menos, de 1 nM o menos, de 0.75 nM o menos, de 0.5 nM o menos, o de 0.25 nM o menos. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "inhibe la actividad de transducción de señales de c-Met" pretende referirse a un anticuerpo que inhibe la actividad proliferativa inducida por c-Met u otra actividad inducida con una IC50 menor de 1 0 nM , 5 nM , 2.5 nM , 1 .0 nM , 0.5 nM , o menos. El término "Kasoc" o "Ka", como se utiliza en la presente, pretende referirse al índice de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, y el término "Kd i s" o "KD", como se utiliza en la presente, pretende referirse al índice de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término "KD", como se utiliza en la presente, pretende referirse a la constante de disociación , que se obtiene a partir de la proporción de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka), y se expresa como una concentración molar (M ). Los valores KD para los anticuerpos se pueden determinar empleando métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar la KD de un anticuerpo es mediante la utilización de resonancia de plasmón superficial , o utilizando un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo agonista" , o "anticuerpo activador" pretende referirse a un anticuerpo que aumenta una o más actividades inducidas por c-Met por cuando menos el 20 por ciento al 40 por ciento cuando se agrega a una célula, tejido , u organismo que exprese c-Met. En algunas modalidades, el anticuerpo activa la actividad de c-Met por cuando menos el 50 por ciento, el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 1 00 por ciento o más del 1 00 por ciento. En algunas modalidades, un anticuerpo agonista de la invención aumenta cuando menos una actividad de c-Met por diez veces. En términos generales, este aumento se observa en ausencia del inductor biológico , HGF. Sin embargo, en algunas modalidades, tal como en un control para un ensayo , el anticuerpo activador se agrega en la presencia de HGF . Como se utiliza en la presente, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y una porción del antígeno conocida como el "epítopo" , en un solo sitio antigénico. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosas localizaciones atómicas o átomos de residuos de aminoácidos del anticuerpo; en términos generales, mientras mayor sea el número de estas interacciones, más fuerte será la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

Como se utiliza en la presente, el término "avidez" se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fuerza global del complejo de anticuerpo-antígeno. Se controla mediante tres factores principales: afinidad de anticuerpo-epítopo; la valencia de cada uno del antígeno y el anticuerpo; y la configuración estructural o la configuración tridimensional de estas partes que interactúan. Por último, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la posibilidad de que el anticuerpo particular se enlace con un epítopo de antígeno preciso, y la estabilidad y duración del enlace. Con el objeto de obtener una sonda que tenga una avidez más alta, se puede construir un conjugado dimérico (dos moléculas de una proteína o polipéptido de anticuerpo acopladas con un marcador FACS), haciendo de esta manera que las interacciones de baja afinidad (tales como un anticuerpo de la l ínea germinal) sean más fácilmente detectadas mediante FACS . Otro medio para aumentar la avidez del enlace de antígeno involucra la generación de dimeros o multímeros de cualquiera de las construcciones descritas en la presente de los anticuerpos de c-Met. Estos multímeros se pueden generar a través de enlace covalente entre las moléculas individuales, por ejemplo, mediante la imitación del enlace natural de los términos C con N , o mediante la imitación de los d imeros del anticuerpo que se mantienen juntos a través de sus regiones constantes. Los enlaces diseñados en la interfase de Fc/Fc pueden ser covalentes o no covalentes. En adición , se puede utilizar dimerización o multimerización de componentes diferentes de Fe en la construcción de híbridos de anticuerpos anti-c- et, tales como anticuerpos bi-funcionales, para crear estas estructuras de orden más alto. Como se utiliza en la presente, el término "alta afinidad" por un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 1 0"8M o menos de 10"9M o menos, o de 1 0"1 0M o menos para un antígeno objetivo. Sin embargo, el enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, el enlace de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 1 0"7 o menos, o de 1 0"8M o menos. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier mamífero, incluyendo un ser humano, o un mamífero no humano, u otro animal . El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, reses, y no mam íferos, tales como aves, anfibios, reptiles, etc. El término "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos se ha alterado para codificar una secuencia de aminoácidos que utiliza codones que son preferidos en la célula u organismo productor, en general una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de una levadura tal como Pichia, una célula de mamífero tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se diseña para retener completamente, o tanto como sea posible, la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de partida original , que también se conoce como la secuencia "progenitora". Las secuencias optimizadas de la presente se han diseñado para tener codones con secuencias de nucleótidos que son preferidas en las células humanas; sin embargo, también se prevé en la presente la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucarióticas. Las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de la presente, codificadas por las secuencias de nucleótidos optimizadas, también son referidas como optimizadas. Diferentes aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones. Los ensayos convencionales para evaluar la capacidad de enlace de los anticuerpos hacia c-Met de diferentes especies se conocen en la materia, incluyendo, por ejemplo, ELISAs, Western blots, y RIAs. Los ensayos adecuados son conocidos por un experto en este campo. Véase, por ejemplo, F. Ausubel , y colaboradores, edición 2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley I nterscience, Nueva York. La cinética de enlace (por ejemplo, afinidad de enlace) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como mediante el análisis Biacore. Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de c-Met (por ejemplo, que inducen la internalización del receptor, que inhiben el enlace del factor de crecimiento con c-Met, que inhiben la auto-fosforilación de c-Met, que inhiben la activación de la senda de c-Met, impidiendo o mejorando de esta manera la proliferación , o los ensayos de cinasa) se describen en la presente. De conformidad con lo anterior, un anticuerpo que "inhibe" una o más de estas propiedades funcionales de c-Met (por ejemplo, actividades bioqu ímicas, inmunoqu ímicas, celulares, fisiológicas, u otras actividades biológicas, o similares), como se determinan de acuerdo con las metodologías conocidas en la materia y descritas en la presente, se refiere a un antagonismo o disminución estad ísticamente significativa en la actividad particular en relación con la que se ve en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o en la presencia de un anticuerpo de control de una especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de c-Met efectúa esta disminución estadísticamente significativa por cuando menos el 1 0 por ciento del parámetro medido, por cuando menos el 50 por ciento, el 80 por ciento, o el 90 por ciento, y en ciertas modalidades un anticuerpo de la invención puede inhibir más del 95 por ciento, del 98 por ciento, o del 99 por ciento de la actividad funcional de c-Met. En términos generales, la disminución de actividad se mide en seguida de un evento de inducción , tal como la adición de HGF. De una manera alternativa , un anticuerpo que "agoniza" una o más de estas propiedades funcionales de c-Met (por ejemplo, actividades bioqu ímicas, inmunoqu ímicas, celulares, fisiológicas, y otras actividades biológicas, o similares), como se determinan de acuerdo con las metodologías conocidas en la materia y descritas en la presente, se refiere a un aumento estad ísticamente significativo en la actividad particular en relación con la que se ve en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o en la presencia de un anticuerpo de control de una especificidad irrelevante). Un anticuerpo que estimula o agoniza la actividad de c-Met, efectúa este aumento estadísticamente significativo por cuando menos el 10 por ciento del parámetro medido, por cuando menos el 50 por ciento, el 80 por ciento, o el 90 por ciento, y en ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención puede agonizar más del 95 por ciento, del 98 por ciento, o del 99 por ciento o más, de la actividad funcional de c-Met. Anticuerpos Recombinantes Los anticuerpos de la invención son los anticuerpos recombinantes, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en los Ejemplos. Las secuencias de nucleótidos VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:21-30, respectivamente. Las Tablas C-E proporcionan ejemplos de las secuencias de nucleótidos VH de diferentes anticuerpos de la invención. Las secuencias de nucleótidos VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:1-20, respectivamente. (Las Tablas C-E proporcionan ejemplos de las secuencias de nucleótidos VL de diferentes anticuerpos de la invención). Las secuencias de nucleótidos de cadena ligera IgG lambda y kappa de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:73-76 u en las Tablas C-E. Las secuencias de nucleótidos de lgG4 de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:85-88 y en las Tablas C-E. Otros anticuerpos de la invención incluyen nucleótidos que se han mutado, y no obstante, tienen una identidad del 60, 70, 80, 90, 95, ó 99 por ciento con las secuencias descritas anteriormente. Las secuencias de aminoácidos VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:55-72, respectivamente, y en las Tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:31-54, respectivamente, y en las Tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera Ig lambda se muestran en las SEQ ID NOs:77-80, respectivamente, y en las Tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera Ig kappa de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:81-84, respectivamente, y en las Tablas A-B y E. Las secuencias de aminoácidos de lgG4 de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs:89-96, respectivamente, y en las Tablas A-B y E. Los anticuerpos adicionales de la invención incluyen los aminoácidos que se han mutado, y retienen cuando menos una identidad del 60, 70, 80, 90, 95, ó 99 por ciento con las secuencias descritas anteriormente. Debido a que cada uno de estos anticuerpos puede enlazarse con un sitio sobre una porción extracelular de c-Met, la VH/VL (secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos), VH/cadena ligera Ig lambda (secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos), y VH/cadena ligera Ig kappa (secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos) se pueden "mezclar y emparejar" para producir combinaciones adicionales de moléculas de enlace anti-c-Met de la invención. El enlace de c-Met de estos anticuerpos se puede probar utilizando los ensayos de enlace descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs). Las secuencias VH, VL, de cadena ligera Ig lambda , y de cadena ligera Ig kappa , de los anticuerpos de la presente invención , son particularmente susceptibles a combinaciones novedosas, debido a que estos anticuerpos utilizan las secuencias VH, VL, de cadena ligera Ig lambda, y de cadena ligera Ig kappa derivadas a partir de las mismas o similares secuencias de la línea germinal, y por lo tanto, exhiben similitud estructural . De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene cuando menos: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:55-72; y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:31 -54; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met. Los ejemplos de las combinaciones de cadena pesada y ligera incluyen cuando menos: una VH de la SEQ I D NO:65 y una VL de la SEQ I D NO:32; o una VH de la SEQ I D NO:66 y una VL de la SEQ I D NO:34; o una VH de la SEQ I D NO:67 y una VL de la SEQ I D NO: 37; o una VH de la SEQ ID NO:68 y una VL de la SEQ I D NO:38; o una VH de la SEQ I D NO:69 y una VL de la SEQ I D NO:51 ; o una VH de la SEQ I D NO:70 y una VL de la SEQ I D NO:52; o una VH de la SEQ I D N0:71 y una VL de la SEQ I D NO: 53; o una VH de la SEQ ID NO:72 y una VL de la SEQ I D NO:54; o una VH de la SEQ I D NO:55 y una VL de la SEQ I D NO:31 ; o una VH de la SEQ I D NO:58 y una VL de la SEQ I D NO:36; o una VH de la SEQ I D NO:61 y una VL de la SEQ I D NO:41 ; o una VH de la SEQ I D NO:62 y una VL de la SEQ I D NO:45. Las Tablas A-B ¡lustran ejemplos de emparejamientos "mezclados y emparejados" de secuencias de aminoácidos VH y VL de diferentes anticuerpos de la invención. Las Figuras 1 a 3 son tablas que ilustran ejemplos de una secuencia de aminoácidos VH y VL, que ilustran las regiones FR y CDR, que se pueden proporcionar sobre andamiajes alternativos, para proporcionar construcciones que tengan una actividad antagonista de c-Met igual o similar a la de los anticuerpos de la presente. De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo que tiene cuando menos: una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:55-72, y una cadena ligera Ig lambda que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:77-80, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met. Los ejemplos de las combinaciones de VH/cadena ligera Ig lambda incluyen cuando menos: una VH de la SEQ I D NO:66 y una cadena ligera Ig lambda de la SEQ I D NO:77; o una VH de la SEQ I D NO-.65 y una cadena ligera Ig lambda de la SEQ I D NO:78; o una región VH que comprende la región de aminoácidos de la SEQ I D NO:69 y una cadena ligera Ig lambda de la SEQ I D NO:79; o una región VH de la SEQ I D NO:70 y una cadena ligera Ig lambda de la SEQ I D NO:80. De conformidad con lo anterior, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene cuando menos: una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:55-72, y una cadena ligera Ig kappa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:81 -84, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met. Los ejemplos de las combinaciones de VH/cadena ligera Ig kappa incluyen cuando menos: una región VH de la SEQ ID NO:71 y una cadena ligera Ig kappa de la SEQ I D NO:81 ; o una región VH de la SEQ I D NO:68 y una cadena ligera Ig kappa de la SEQ I D NO:82 ; o una región VH de la SEQ I D NO:67 y una cadena ligera Ig kappa de la SEQ I D NO:83; o una región VH de la SEQ I D NO:72 y una cadena ligera Ig kappa de la SEQ I D NO:84. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene cuando menos: una cadena VH que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -30, y una cadena VL que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 1 -20. Por consiguiente, los ejemplos de las combinaciones de cadena pesada y ligera incluyen cuando menos: una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:21 , y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 1 ; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:24 , y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:6; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:27 , y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 1 1 ; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:28, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 1 5; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:29, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 1 8; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:30, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:20; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:22, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 1 ; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:23, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 1 ; o una región VH que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ I D NO:24, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ I D NO:7; o una región VH que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ I D NO:24, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:8; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:24, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:9; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:24, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 1 0. Véanse las Tablas A-B que ilustran los ejemplos de los emparejamientos "mixtos y emparejados" de las secuencias de nucleótidos VH y VL de diferentes anticuerpos de la invención , para tener ejemplos adicionales de emparejamientos de secuencias de nucleótidos VH y VL. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene cuando menos: una cadena VH que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -30, y una cadena ligera Ig lambda que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en la SEQ I D NO:73. Por consiguiente, un ejemplo de una combinación de VH/cadena ligera Ig lambda incluye: una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:23, y una cadena ligera Ig lambda que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:73. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene cuando menos una cadena VH que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -30, y una cadena ligera Ig kappa que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:74-76. Por consiguiente, los ejemplos de las combinaciones de VH y cadena ligera Ig kappa incluyen cuando menos: una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:24, y una región variable de cadena ligera Ig kappa que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:74; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:25 , y una región variable de cadena ligera Ig kappa que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:75; o una región VH que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:27 , y una región variable de cadena ligera Ig kappa que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO:76. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende las regiones variables de cadena pesada o ligera que son "el producto de" o que "se derivan de" una secuencia de la l ínea germinal particular, si las regiones variables del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utilice los genes de 'mmunoglobulina de la l ínea germinal humana. Estos sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que lleve los genes de inmunoglobulina humanos con el antígeno de interés, o el rastreo de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana que se exhiba en el fago con el antigeno de interés. Un anticuerpo humano que sea el producto de, o que se derive de, una secuencia de inmunoglobulina de la l ínea germinal humana, se puede identificar como tal mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la l ínea germinal humana, y se selecciona la secuencia de inmunoglobulina de la l ínea germinal humana que esté más cercana en la secuencia (es decir, con el mayor porcentaje de identidad), a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que sea el producto de, o que se derive de, una secuencia de inmunoglobulina de la l ínea germinal humana particular, puede contener diferencias de aminoácidos, comparándose con la secuencia de la línea germinal . Estas diferencias se deben , por ejemplo, a cuando menos una mutación somática que se presenta naturalmente, o a una introducción intencional de mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado típicamente es cuando menos el 90 por ciento idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la l ínea germinal humana, y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como de origen humano cuando se comparan con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la l ínea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la l ínea germinal de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede tener una identidad de cuando menos el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, o de cuando menos el 95 por ciento, o inclusive de cuando menos el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la l ínea germinal . Típicamente, un anticuerpo humano derivado a partir de una secuencia de la línea germinal humana particular exhibirá no más de 1 0 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no más de 5, o inclusive no más de 4, 3, 2, ó 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal . Anticuerpos Idénticos En todavía otra modalidad , un anticuerpo de la invención tiene cuando menos secuencias de nucleotidos de región variable de cadena pesada y ligera, o secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera, o secuencias de nucleotidos de Ig lambda, o secuencias de aminoácidos de Ig lambda, o secuencias de nucleotidos de Ig kappa, o secuencias de aminoácidos de Ig kappa, o secuencias de nucleotidos de lgG4, o secuencias de aminoácidos de lgG4, que tienen homolog ía o identidad con las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de los anticuerpos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-c-Met de la invención , es decir, demuestran la actividad o las actividades funcionales progenitoras. Las actividades funcionales progenitores pueden ser antagonistas o agonistas. En ambas modalidades, la actividad es antagonista. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una región VH y una región variable de cadena ligera, de tal manera que la región VH comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de cuando menos el 80 por ciento, el 85 por ciento , el 90 por ciento, el 95 por ciento, o el 99 por ciento con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:55-72, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de cuando menos el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, o el 99 por ciento con una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:31 -54, en donde el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades antagonistas funcionales: el anticuerpo induce la internalización del receptor c-Met, o el anticuerpo inhibe el enlace de un factor de crecimiento de proteína para c-Met, o el anticuerpo inhibe la auto-fosforilación de c-Met, impidiendo de esta manera la activación de la senda de c-Met, o el anticuerpo inhibe la sobre-regulación de la senda de c-Met resultante de la transducción de señales, o el anticuerpo inhibe el enlace de c-Met, impidiendo o mejorando de esta manera la proliferación , sobrevivencia, migración, invasión , o cambios en la morfología celular, y en especial impidiendo o mejorando el cáncer, tal como el crecimiento tumoral y/o las metástasis. En una modalidad alternativa, el anticuerpo responde a, y activa, la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En una modalidad , la respuesta celular es una respuesta de sanado de heridas. En un ejemplo adicional , la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig lambda tal que la cadena ligera Ig lambda comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:77-80. En las modalidades adicionales, el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo activa e induce la internalización del receptor c-Met, el anticuerpo inhibe el enlace del factor de crecimiento de proteína con c-Met, impidiendo esta inhibición de esta manera la activación del receptor, por ejemplo, impidiendo la sobre-regulación de la senda resultante de la activación de c-Met y/o de la transducción de señales, o previniendo o mejorando el anticuerpo la proliferación celular, la sobrevivencia , migración, invasión , o cambios en la morfología celular, o el anticuerpo antagoniza la actividad de c-Met, impidiendo o mejorando de esta manera el cáncer, tal como el crecimiento tumoral y/o la metástasis. En una modalidad alternativa, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En otro ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig kappa en donde: la cadena ligera Ig kappa tiene una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:81 -84; el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades funcionales proporcionadas anteriormente y a través de toda la memoria descriptiva . En una modalidad alternativa, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En otra modalidad , la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es una lgG4, de tal manera que la lgG4 tiene una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:89-96; el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales proporcionadas anteriormente y a través de toda la memoria descriptiva. En una modalidad alternativa, el anticuerpo es agonista, y activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular.

En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales antagonistas discutidas en la presente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico. En otra modalidad , la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una región VH y una región variable de cadena ligera, de tal manera que la región VH es codificada por una secuencia de nucleotidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de nucleotidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:21 -30; la región variable de cadena ligera es codificada por una secuencia de nucleotidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de nucleotidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 1 -20; el anticuerpo codificado se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades funcionales proporcionadas anteriormente y a través de toda la memoria descriptiva. En una modalidad alternativa, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular.

En un ejemplo adicional , la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig lambda tal que la cadena ligera Ig lambda es codificada por una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO:73; el anticuerpo codificado se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades funcionales proporcionadas anteriormente y a través de toda la memoria descriptiva. En una modalidad alternativa , el anticuerpo es agonista y activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En otro ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig kappa en donde: la cadena ligera Ig kappa codificada por una secuencia de nucleótidos es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:74-76; el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades funcionales proporcionadas anteriormente y a través de toda la memoria descriptiva. En una modalidad alternativa, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En otra modalidad , la invención proporciona un anticuerpo recombinante aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es una lgG4, en donde la lgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:85-88; el anticuerpo codificado se enlaza específicamente con c-Met, y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades funcionales proporcionadas anteriormente y a través de toda la memoria descriptiva. En una modalidad alternativa, el anticuerpo es agonista, y activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, o tres de las propiedades funcionales antagonistas discutidas en la presente. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser el 50 por ciento, el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento , el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente. Un anticuerpo que tenga las regiones VH y VL con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con las regiones VH y VL de las SEQ I D NOs:31 -72, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las SEQ I D NOs:31 -72, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. En otras modalidades, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y/o de cadena ligera pueden ser el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente. Un anticuerpo que tenga una cadena pesada y una cadena ligera de región variable, que tenga una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con las cadenas pesadas de región variable de las SEQ I D NOs:21 -30 y las cadenas ligeras de región variable de las SEQ I D NOs: 1 -20, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden las SEQ I D NOs: 1 -30, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de cadena ligera Ig lambda pueden ser el 50 por ciento, el 60 por ciento, el 70 por ciento , el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente. Un anticuerpo que tenga una cadena ligera Ig lambda con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con las cadenas ligeras Ig lambda de las SEQ I D NOs:77-80, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las SEQ I D NOs:77-80, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera Ig lambda puede ser el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idénticas a la secuencia estipulada anteriormente. Un anticuerpo que tenga una cadena ligera Ig lambda con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con la cadena ligera Ig lambda de la SEQ I D NO:73, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden la SEQ I D NO:73, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de cadena ligera Ig kappa pueden ser el 50 por ciento, el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente. Un anticuerpo que tenga una cadena ligera Ig kappa con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con las cadenas ligeras Ig kappa de las SEQ I D NOs:81 -84, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las SEQ I D NOs:81 -84, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera Ig kappa puede ser el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento , el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idéntica u homologa a la secuencia estipulada anteriormente. Un anticuerpo que tenga una cadena ligera Ig kappa con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con las cadenas ligeras Ig kappa de las SEQ I D NOs:74-76, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden las SEQ I D NOs:74-76, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

En otras modalidades, el anticuerpo que es una lgG4 puede ser el 50 por ciento, el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idéntica a las secuencias de aminoácidos estipuladas anteriormente. Una lgG4 con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con las composiciones de lgG4 de las SEQ I D NOs:89-96, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las SEQ I D NOs:89-96, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado derivado mediante mutagénesis para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. En otras modalidades, el anticuerpo es una lgG4 que es el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idéntica a la secuencia de nucleótidos estipulada anteriormente. Una lgG4 con una alta identidad (es decir, del 80 por ciento o mayor) con las lgG4 de las SEQ I D NOs:85-88, respectivamente, se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa) de las moléculas de ácidos nucleicos que comprenden las SEQ I D NOs:85-88, seguida por la prueba del anticuerpo alterado codificado para determinar la función retenida (es decir, las funciones estipuladas anteriormente), utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. Como se utiliza en la presente, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos, es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias, y estos términos se utilizan de una manera intercambiable en la presente. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de homolog ía = # de posiciones idénticas/* total de posiciones x 1 00), tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesitan introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se pueden llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los Ejemplos no limitantes que se encuentran más adelante. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl . Biosci . , 4: 1 1 -1 7 , 1 988), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM 1 20, una multa por longitud de hueco de 1 2 , y una multa de hueco de 4. En adición, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J.

Mol. Biol. 48:444-453, 1970), que se ha incorporado en el programa GAP, en el paquete de software GCG (disponible en htt://www. gcg .com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o bien una matriz PAM250 , y un peso de hueco de 14, 16 , 12 , 10, 8, 6, ó 4, y un peso por longitud de 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6. Adicionalmente o de una manera alternativa , las secuencias de proteínas de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente como una "secuencia pedida" para llevar a cabo una búsqueda contras las bases de datos públicas, por ejemplo, con el fin de identificar secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores, 1990 J. Mol. Biol. 21 5:403-10. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden llevar a cabo con el programa XBLAST, puntaje = 50 , longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpos de la invención . Con el objeto de obtener alineaciones con huecos para propósitos de comparación , se puede utilizar el Gapped BLAST como se describe en Altschul y colaboradores, 1997 Nucleic Acids Res. 25( 1 7):3389-3402. Cuando se utilizan las programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden emplear los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http:lwww.ncbi .nhn .nih.gov. Las condiciones que permitirán que las secuencias de nucleótidos se hibriden a las secuencias de nucleótidos mostradas en la presente, se pueden determinar de acuerdo con las técnicas conocidas. La hibridación de las secuencias de nucleótidos se lleva a cabo bajo condiciones de restringencia reducida, restringencia media , o inclusive condiciones altamente restringentes. Las condiciones de baja restringencia de ejemplo son un regulador que contenga del 35 al 40 por ciento de formamida con solución de Denhardt 5x, SDS al 0.5 por ciento, y I xSSPE a 37°C. Las condiciones de restringencia media de ejemplo son un regulador que contenga del 40 al 45 por ciento de formamida con solución de Denhardt 5x, SDS al 0.5 por ciento, y I xSSPE a 42°C. Las condiciones de alta restringencia de ejemplo son un regulador que contenga el 50 por ciento de formamida con solución de Denhardt 5x, SDS al 0.5 por ciento, y I xSSPE a 42°C o a una temperatura más alta, dependiendo del porcentaje de G+X, y de la longitud de los polinucleótidos. Véase J . Sambrook y colaboradores (1 989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición) (Cold Spring Harbor Laboratory). La hibridación de las secuencias de nucleótidos bajo cualquiera de las condiciones de restringencia de ejemplo anteriores, se lleva a cabo en solución , y se recolecta sobre un filtro. De una manera alternativa, la hibridación de las secuencias de nucleótidos bajo cualquiera de las condiciones de restringencia de ejemplo anteriores, se lleva a cabo en geles, por ejemplo Southern blot. Anticuerpos con Modificaciones Conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención tiene una región VH que incluye secuencias seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs:55-72 , y una región variable de cadena ligera que incluye las secuencias seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54, de tal manera que una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácido especificadas basándose en los anticuerpos descritos en la presente, o modificaciones conservadoras de los mismos, y los anticuerpos tienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-c-Met de la invención . De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo , que tiene una cadena VH y una cadena VL, de tal manera que la cadena VH tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs:55-72 , y las modificaciones conservadoras de las mismas; y la cadena VL tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met; y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las siguientes propiedades funcionales: el anticuerpo activa e induce la internalización del receptor c-Met, el anticuerpo inhibe el enlace de un factor de crecimiento de proteína con c-Met, impidiendo esta inhibición de esta manera la activación del receptor, por ejemplo, impidiendo la sobre-regulación de la senda resultante de la activación de c-Met y/o de la transducción de señales, o impidiendo o mejorando el anticuerpo la proliferación celular, la sobrevivencia, la migración , invasión , o cambios en la morfología celular, o el anticuerpo antagoniza la actividad de c-Met, impidiendo o mejorando de esta manera el cáncer, tal como el crecimiento tumoral y/o la metástasis. En una modalidad alternativa, el anticuerpo es agonista, y activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En ciertas modalidades, el anticuerpo de la invención es una cadena ligera Ig lambda que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs.77-80, de tal manera que una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos derivadas a partir de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente, que tiene modificaciones conservadoras de las mismas, de tal manera que los anticuerpos derivados retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-c-Met de la invención. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo progenitor aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig lambda tal que la cadena ligera Ig lambda tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs:77-80, y modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met; y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades antagonistas funcionales descritas en la presente. En una modalidad alternativa, el anticuerpo es agonista, y activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En otras modalidades, la invención proporciona un anticuerpo con una cadena ligera Ig kappa que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:81 -84, de tal manera que uno o más de estos anticuerpos tienen una secuencia de aminoácidos derivada a partir de los anticuerpos descritos en la presente, que tiene modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos demuestran las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-c-Met progenitores de la invención . De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que tiene una cadena ligera Ig kappa tal que la cadena ligera Ig kappa tiene las secuencias de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo de las SEQ I D NOs:81 -84, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met; y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades funcionales proporcionadas en la presente. En una modalidad alternativa, el anticuerpo activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En otras modalidades, el anticuerpo de la invención es una lgG4 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:89-96, en donde una o más de estas secuencias tiene una secuencia de aminoácidos derivada a partir de una secuencia de aminoácidos progenitora de los anticuerpos descritos en la presente, o modificaciones conservadoras de los mismos, y los anticuerpos demuestran las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-c-Met de la invención . De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es una lgG4, en donde: la lgG4 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:89-96, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo se enlaza específicamente con c-Met; y el anticuerpo exhibe cuando menos una de las propiedades antagonistas funcionales descritas en la presente. En una modalidad alternativa, el anticuerpo es agonista, y activa la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular. En diferentes modalidades, el anticuerpo puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales antagonistas enlistadas discutidas anteriormente. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. Como se utiliza en la presente, el término "modificación de secuencia conservadora" pretende referirse a las modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran de una manera significativa las características de enlace del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Estas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones, y supresiones de aminoácidos, como se describen en la presente. Las modificaciones se introducen en un anticuerpo de la invención mediante técnicas convencionales conocidas en este campo, tales como mutagénesis dirigido al sitio y mutagénesis mediada por reacción en cadena de la polimerasa.

Las sustituciones de aminoácidos conservadoras reemplazan a un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente que tiene una cadena lateral químicamente y físicamente similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares son conocidas en la técnica. Estas familias incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina , arginina, histidina), con cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), con cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), con cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), con cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina , valina, isoleucina), y con cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por consiguiente, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención pueden ser reemplazados con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral , y el anticuerpo alterado se puede probar para determinar la función retenida, utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente. Estructuras de Anticuerpos Se puede emplear una amplia variedad de estructuras o andamiajes de anticuerpos/inmunoglobulina, siempre que el polipéptido resultante incluya una o más regiones de enlace que sean específicas para la proteína c-Met de las secuencias de ejemplo de la presente. Estas estructuras o andamiajes incluyen los cinco idiotipos principales de las inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas (tales como se dan a conocer en cualquier otra parte de la presente), e incluyen las inmunoglobulinas de otras especies de animales, que tengan de preferencia aspectos humanizados. Los anticuerpos de una sola cadena pesada, tales como aquéllos identificados en camélidos, son un de interés particular en este aspecto. Los expertos en este campo continúan descubriendo y desarrollando estructuras y andamiajes novedosos. De una manera alternativa, se pueden emplear las estructuras y andamiajes que no sean de inmunoglobulina conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de enlace específica para la proteína c-Met. Estos compuestos se conocen en la presente como "polipéptidos que comprenden una región de enlace específica de c-Met". Las estructuras o andamiajes que no son de inmunoglobulina conocidos incluyen Adnectinas (fibronectina) (Compound Therapeutics, I nc. , Waltham , MA), anquirina (Molecular Partners AG , Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) y Ablynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), lipocalina (Anticalina) (Pieris Proteolab AG , Freising , Alemania), productos inmuno-farmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc. , Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, I nc. (Mountain View, CA)), Proteína A (Affibody AG, Suecia), y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH , Halle, Alemania). Anticuerpos q ue se enlazan con el mismo epítopo que los anticuerpos anti-c-Met de la invención En otra modalidad , la invención proporciona anticuerpos que se enlazan con el mismo epítopo que los diferentes anticuerpos anti-c-Met de la invención, proporcionados en la presente. Estos anticuerpos adicionales se pueden identificar basándose en su capacidad para competir cruzadamente (por ejemplo, para inhibir de una manera competitiva el enlace, de una manera estad ísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención, en ensayos de enlace de c-Met convencionales. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlace de los anticuerpos que tengan una capacidad conocida para enlazarse con la c-Met humana, demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con este anticuerpo. Este anticuerpo, de acuerdo con la teoría no limitante, puede enlazarse con el mismo epítopo o con un epítopo relacionado (por ejemplo, un epítopo estructuralmente similar o espacialmente proximal) sobre la c-Met humana, que el anticuerpo con el que compite. Estos anticuerpos se pueden preparar y aislar como se describe en los Ejemplos. Anticuerpos de Camélido Se han caracterizado proteínas de anticuerpos obtenidas a partir de miembros de la familia de camellos y dromedarios ( Camelus bactrianus y Calelus dromaderius), incluyendo los miembros del nuevo mundo, tales como las especies de llamas (Lama páceos, Lama glama y Lama vicugna), con respecto al tamaño, complejidad estructural , y antigenicidad en sujetos humanos. Ciertos anticuerpos de IgG de esta familia de mamíferos, como se encuentran en la naturaleza de cadenas ligeras, y por lo tanto, tienen estructuras que son distintas de la estructura cuaternaria de cuatro cadenas típicas que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, características de los anticuerpos de otros animales. Véase la Publicación del TCP Número PCT/EP93/02214 (Publicación Internacional Número WO 94/04678 publicada el 3 de marzo de 1994). Se puede obtener una región del anticuerpo de camélido que es el único dominio variable pequeño identificado como VHH, mediante ingeniería genética, para producir una proteína pequeña que una alta afinidad por un objetivo, que da como resultado una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida como un "nanocuerpo de camélido". Véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,759,808 expedida el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans, B. y colaboradores, 2004 J. Biol. Chem. 279:1256-1261; Dumoulin, M. y colaboradores, 2003 Nature 424:783-788; Pleschberger, M. y colaboradores, 2003 Bioconjugate Chem. 14:440-448; Cortez-Retamozo, V. y colaboradores 2002 Int. J. Cáncer 89:456-62; y Lauwereys, M. y colaboradores, 1998 EMBO J. 17:3512-3520. Las bibliotecas diseñadas de anticuerpos de camélido y de fragmentos de anticuerpos están comercialmente disponibles, por ejemplo, en Ablynx, Ghent, Bélgica. Como se conoce en la técnica para otros anticuerpos de origen no humano, la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido se puede alterar de una manera recombinante con el objeto de obtener una secuencia que se parezca más estrechamente a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede humanizar. Por consiguiente, se puede reducir adicionalmente la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélido para los seres humanos. El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de aquél de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solamente unos cuantos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélido para enlazarse con los sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para las proteínas de anticuerpo más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélido son útiles como reactivos para detectar antígenos que de otra manera son crípticos utilizando las técnicas inmunológicas clásicas, y también son útiles como posibles agentes terapéuticos. Por ejemplo, todavía otra consecuencia del tamaño pequeño, es que un nanocuerpo de camélido puede inhibirse como un resultado del enlace con un sitio específico en una ranura o hendedura estrecha de una proteína objetivo, y por consiguiente, pueden servir en una capacidad que se parece más estrechamente a la función de un fármaco de bajo peso molecular clásico, que aquélla de un anticuerpo de alto peso molecular clásico. El bajo peso molecular y el tamaño compacto dan como resultado además que los nanocuerpos de camélido sean extremadamente termoestables, estables al pH extremo, y estables a la digestión proteolítica, y que tengan una baja antigenicidad . Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio hacia los tejidos, es decir, para extravasarse, e inclusive cruzan la barrera hematoencefálica, y de este modo, se pueden diseñar para tratar trastornos que afecten a los tejidos nerviosos. Los nanocuerpos pueden facilitar adicionalmente el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 200401 61 738 publicada el 1 9 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos, indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas se pueden expresar completamente en células procarióticas, tales como se expresan las de E. coli como proteínas de fusión con bacteriófagos, y las proteínas así expresadas son funcionales. De conformidad con lo anterior, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad por una proteína objetivo c-Met. En ciertas modalidades de la presente, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce naturalmente en el animal camélido, es decir, es producida por el camélido en seguida de la inmunización con la proteína objetivo c-Met o con un fragmento peptídico de la misma, utilizando las técnicas descritas en la presente para otros anticuerpos, o se produce de una manera recombinante en un animal camélido transgénico. De una manera alternativa, el nanocuerpo de camelido anti-c-Met se diseña, es decir, se produce mediante selección , por ejemplo, a partir de una biblioteca de fagos que exhiban proteínas de nanocuerpos de camélido apropiadamente mutadas, empleando procedimientos de paneo con c-Met como un objetivo, como se describe en los Ejemplos de la presente. Los nanocuerpos diseñados se pueden hacer adicionalmente a la medida mediante ingeniería genética para tener una vida media en un sujeto receptor desde 45 minutos hasta dos semanas. Anticuerpos diseñados y modificados Un anticuerpo de la invención se puede preparar utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL > secuencias de cadena ligera Ig lambda, o secuencias de cadena ligera Ig kappa mostradas en la presente como material de partida, es decir, como una secuencia progenitora, para diseñar un anticuerpo modificado derivado, el cual es un anticuerpo modificado, que puede tener propiedades alteradas o mejoradas comparándose con el anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), o dentro de la cadena ligera Ig lambda solamente, o dentro de la cadena ligera Ig kappa solamente, dentro de una o más regiones CDR, y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicionalmente o de una manera alternativa, un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de los residuos dentro de las regiones constantes, por ejemplo para alterar una función efectora del anticuerpo.

Un tipo de diseño de región variable que se puede llevar a cabo es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos objetivo predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se localizan en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones determinantes de complementariedad son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias que están fuera de las regiones determinantes de complementariedad. Debido a que las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de los anticuerpos que se presentan naturalmente específicos, mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad a partir de un anticuerpo que se presente naturalmente, injertándose sobre las secuencias de estructura a partir de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann , L. y colaboradores, 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. y colaboradores, 1986 Nature 321 :522-525; Queen , C. y colaboradores, 1 989 Proc. Nati. Acad. Sci . , EUA. 86: 1 0029-1 0033; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,225 ,539 a Winter, y Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530, 1 01 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 1 80,370 a Queen y colaboradores).

Estas secuencias de estructura se pueden obtener de las bases de datos de ADN públicas, o de las referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la l ínea germinal . Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de región variable de cadena pesada y de cadena ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la l ínea germinal humana "VBase" (disponible en la I nternet, en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A. , y colaboradores, 1 991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de N I H Número 91 -3242; Tomlinson , I . M . , y colaboradores, 1 992 J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J . P. L. y colaboradores, 1 994 Eur. J Immunol. 24:827-836; el contenido de cada uno de los cuales se incorpora expresamente a la presente como referencia. Se ha encontrado que, en ciertos casos, es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejorar la capacidad de enlace de antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530, 1 01 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 1 80,370 a Queen y colaboradores). Otro tipo de modificación de la región variable es la mutación de los residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1 , CDR2, y/o CDR3 de VH y/o VL, para mejorar de esta manera una o más propiedades de enlace (por ejemplo, la afinidad ) del anticuerpo de interés, conocida como "maduración por afinidad". Se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa para introducir las mutaciones, y se evalúa el efecto consecuencial sobre el enlace del anticuerpo o sobre otra propiedad funcional de interés mediante ensayos ¡n vitro o in vivo, como se describe en la presente, y como se proporciona en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se discute anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos. Típicamente, se alteran no más de 1 , 2, 3, 4, ó 5 residuos dentro de una región determinante de complementariedad , aunque también se prevén alteraciones adicionales. Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquéllos en donde se han hecho modificaciones de los residuos de estructura dentro de las cadenas VH y/o VL, y/o las cadenas ligeras Ig lambda , y/o las cadenas ligeras Ig kappa , por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, estas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un planteamiento es "retro-mutar" uno o más residuos de estructura, con aquél de la secuencia de la l ínea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que se haya sometido a mutación somática puede contener residuos de estructura que difieran de la secuencia de la l ínea germinal a partir de la cual se derive el anticuerpo. Estos residuos se pueden identificar mediante la comparación de las secuencias de estructura del anticuerpo con las secuencias de la l ínea germinal a partir de la cual se derive el anticuerpo. Para regresar las secuencias de la región de estructura hasta su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se retro-mutan hasta los residuos de la l ínea germinal mediante, por ejemplo , mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por reacción en cadena de la polimerasa. Estos anticuerpos retro-mutados también están abarcados dentro de la presente invención. Otro tipo de modificación de estructura involucra mutar uno o más residuos dentro de la región de estructura, o inclusive dentro de una o más regiones determinantes de complementariedad , para remover los epítopos de células-T, con el fin de reducir de esta manera la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este planteamiento también es referido como "desinmunización", y se describe con mayor detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 200301 53043 por Carr y colaboradores. En adición o de una manera alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones de estructura o CDR, los anticuerpos de la invención se pueden diseñar para incluir modificaciones dentro de la región Fe, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la vida media en suero, la fijación del complemento, el enlace del receptor Fe, y/o la citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se puede unir una o más fracciones químicas al anticuerpo), o se puede modificar para alterar su glicosilación, nuevamente con el fin de alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe con mayor detalle más adelante. La numeración de los residuos en la región Fe es aquélla del índice de Estados Unidos de Kabat. En una modalidad , la región de articulación de CH 1 se modifica de tal manera que se altera el número de residuos de cisteína en la región de articulación , por ejemplo, aumenta o disminuye. Este planteamiento se descubre adicionalmente en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,677,425 por Bodmer y colaboradores. El número de residuos de cisteína en la región de articulación de CH 1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamble de las cadenas ligera y pesada, o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad , se muta la región de articulación Fe de un anticuerpo para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. De una manera más específica, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento de articulación Fe, de tal manera que el anticuerpo tenga el enlace de proteína de estafilococo A (SpA) deteriorado en relación con el enlace de SPA del dominio de articulación Fe nativo. Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 6, 1 65,745 por Ward y colaboradores.

En otra modalidad , el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diferentes planteamientos. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de los siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,277,375 a Ward . De una manera alternativa, con el objeto de incrementar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH 1 o CL, para contener un epítopo de enlace de receptor de salvamento tomado a partir de dos ciclos de un dominio CH2 de una región Fe de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,869,046 y 6, 1 21 ,022 por Presta y colaboradores. En todavía otras modalidades, se altera la región Fe reemplazando cuando menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero que retenga la capacidad de enlace de antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector con el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe, o el componente de complemento C 1 . Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter y colaboradores. En otra modalidad , uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos de aminoácidos pueden reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga un enlace de C1 q alterado, y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida . Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 1 94,551 por Idusogie y colaboradores. En otra modalidad , uno o más residuos de aminoácidos se alteran para alterar de esta manera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este planteamiento se describe adicionalmente en la Publicación del TCP Número WO 94/29351 por Bodmer y colaboradores. En todavía otra modalidad , la región Fe se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy, mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Este planteamiento se describe adicionalmente en la Publicación del TCP Número WO 00/42072 por Presta. Más aún , los sitios de enlace sobre la lgG 1 humana para FcyRI , FCY R I I , FcyRI 11 , y FcRn se han mapeado, y se han descrito variantes con un mejor enlace (véase Shields, R. L. y colaboradores, 2001 J. Biol. Chem. 276:6591 -6604). Los anticuerpos que tienen estas regiones Fe modificadas están dentro del alcance de las composiciones de la presente. En todavía otra modalidad, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo glicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno objetivo de c-Met. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo mediante, por ejemplo, alterar uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de región variable, para eliminar de esta manera la glicosilación en este sitio. Esta glicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,71 4,350 y 6,350,861 por Co y colaboradores. Adicionalmente o de una manera alternativa , se puede hacer un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación , tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo, o un anticuerpo que tenga mayores estructuras de disección GIcNac. Estos patrones de glicosilación alterados han demostrado aumentar la actividad ADCC de los anticuerpos. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la expresión del anticuerpo en una célula huésped con una maquina enzimática de glicosilación alterada. Las células con una maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica, y se pueden utilizar como células huésped en las cuales se expresen los anticuerpos recombinantes de la invención , para producir de esta manera un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, la Patente Europea N úmero EP 1 , 1 76, 1 95 por Hang y colaboradores, describe una l ínea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, el cual codifica una fucosil-transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en esta l ínea celular exhiben hipofucosilación. La Publicación del TCP Número WO 03/035835 por Presta describe una línea celular de CHO variante, las células Lecl3, con una capacidad reducida para unir la fucosa a los carbohidratos enlazados con Asn(297), dando como resultado también una hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, R. L. y colaboradores, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación del TCP Número WO 99/54342 por Umana y colaboradores, , describe l íneas celulares diseñadas para expresar las glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteína (por ejemplo, la beta-( 1 ,4)-N-acetil-glucosaminil-transferasa I I I (GnTI I I )), de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiben mayores estructuras de disección que GIcNac, lo cual da como resultado una mayor actividad ADCC de los anticuerpos (véase también Umana y colaboradores, 1 999 Nat. Biotech. 1 7: 1 76-1 80). Otra modificación de los anticuerpos de la presente, que es contemplada por la invención, es la pegilación. Un anticuerpo se puede pegilar, por ejemplo, para aumentar la vida media biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o el fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o un derivado de aldehido de PEG, bajo condiciones en donde uno o más grupos PEG lleguen a unirse covalentemente al anticuerpo o al fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de oscilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un pol ímero soluble en agua análogo). Como se utiliza en la presente, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se hayan utilizado para derivar otras proteínas, tales como mono-alcoxilo (de 1 a 1 0 átomos de carbono)- o ariloxi-polietilenglicol , o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo glicosilado. Los métodos para pegilar las proteínas son conocidos en la materia , y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención . Véase, por ejemplo, la Patente Europea Número EP 0, 1 54,31 6 por Nishimura y colaboradores, y la Patente Europea Número EP 0,401 ,384 por Ishikawa y colaboradores. Métodos para Diseñar Anticuerpos Como se discute anteriormente, los anticuerpos anti-c-Met que tienen las secuencias de VH, VL, cadena ligera Ig lambda, o cadena ligera Ig kappa mostradas en la presente, se pueden utilizar para diseñar anticuerpos anti-c-Met adicionales, mediante la modificación de los residuos en las secuencias de VH y/o VL y/o cadenas ligeras Ig lambda y/o cadenas ligeras Ig kappa, o mediante la modificación de las regiones constantes unidas a las mismas. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención , se utilizan las características estructurales de un anticuerpo anti-c-Met de la invención para crear anticuerpos anti-c-Met estructuralmente relacionados que retengan cuando menos una propiedad funcional de los anticuerpos antagonistas o agonistas progenitores de la invención, tal como el enlace con la c-Met humana, y también para inhibir una o más propiedades funcionales de c-Met (por ejemplo , inducir internalización, impedir la activación, por ejemplo, una sobre-regulación resultante de la transducción de señales, impedir o mejorar la proliferación, sobrevivencia, migración , invasión , o cambios en la morfología celular, o el anticuerpo inhibe el enlace del receptor c-Met que impide o mejora el cáncer, tal como el crecimiento tumoral y/o la metástasis), o en el caso agonista, activar la fosforilación de c-Met y activar una respuesta celular, así como otras propiedades funcionales proporcionadas en la presente. Por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de las mismas, se pueden combinar de una manera recombinante con las regiones de estructura conocidas y/u otras regiones determinantes de complementariedad , para crear anticuerpos anti-c-Met recombinantemente diseñados adicionales de la invención, como se discute anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquéllas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de diseño es una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones determinantes de complementariedad de las mismas, para utilizarse como una secuencia progenitora. Con el objeto de crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresarse como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones determinantes de complementariedad de las mismas. Más bien , se utiliza la información contenida en las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos como el material de partida para las técnicas de mutación conocidas en este campo, con el fin de crear una secuencia de "segunda generación" derivada de las secuencias originales, y luego se prepara la secuencia de nucleótidos de "segunda generación" y se expresa como una proteína. De conformidad con lo anterior, en ciertas modalidades, la invención proporciona un método para la preparación de un anticuerpo anti-c-Met que tiene, como material progenitor de partida, una secuencia de anticuerpo VH que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:55-72 , y una secuencia de anticuerpo VL que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54. El método involucra alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia progenitora de anticuerpo VH y/o VL para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. En otras modalidades, la invención proporciona un método para la preparación de un anticuerpo anti-c-Met, el cual comprende: una secuencia de anticuerpo de cadena ligera Ig lambda que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:77-80, y alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena ligera Ig lambda para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada ; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. En las modalidades relacionadas, la invención proporciona un método para la preparación de un anticuerpo anti-c-Met, el cual comprende: una secuencia de anticuerpo de cadena ligera Ig kappa que tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:81 -84; alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de cadena ligera Ig kappa para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. El anticuerpo alterado puede exhibir una o más, dos o más, o tres o más de las propiedades funcionales discutidas en la presente.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar utilizando los ensayos convencionales disponibles en la técnica y/o descritos en la presente, tales como aquéllos estipulados en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs). En ciertas modalidades de los métodos para diseñar los anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones de una manera aleatoria o selectiva a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación del anticuerpo anti-c-Met, y los anticuerpos anti-c-Met modificados resultantes se pueden expresar y rastrear para determinar su actividad de enlace y/u otras propiedades funcionales, como se describe en la presente. Los métodos de mutación se han descrito en la materia. Por ejemplo, la Publicación del TCP Número WO 02/092780 por Short, describe métodos para crear y rastrear mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis de saturación , ensamble de ligamiento sintético, o una combinación de los mismos. De una manera alternativa, la Publicación del TCP Número WO 03/074679 por Lazar y colaboradores, describe métodos para utilizar métodos de rastreo por computación con el fin de optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.

Anticuerpos de la Invención Las secuencias de nucleótidos y de polipéptidos de los anticuerpos de la invención se proporcionan en seguida . Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de los anticuerpos progenitores, o del primer rastreo, se proporcionan en la Tabla A y en la Tabla C, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de los anticuerpos mejorados por afinidad , comparándose con los anticuerpos progenitores, se proporcionan en la Tabla B y en la Tabla D, respectivamente.

Tabla A: Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos Fab anti-c-Met progenitores. 04536 VH: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIINP WTGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTP SDLWGQGTLVTVSS 04536 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQAYDSSMLRVFGGGTKLTVLGQ 04687 VH: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP FGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQG TLVTVSS 04687 VL: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNHPHTFGQGTKV EIKRT 04541 VH: QVQLQESGPGLVKPGETLSLTCTVSGGSISSSSYYWNWIRQAPGKGLEWIGEIY FGWTYYNPSLKGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCARGYEFHGYTTF DYWGQGTLVTVSS 04541 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDFPSIVFGGGTKLTVLGQ 04537 VH: QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGFIFP DTSYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVKLITDYWGQ GTLVTVSS 04537 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSLRSYFVSWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRP SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCASWDTLSDVEVFGGGTKLTVL GQ 04690 VH: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWGWIRQSPGRGLEWLGRI YYRSKWVNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQGAVYP GPYGFDVWGQGTLVTVSS 04690 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDKLGSYFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDDNRP SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSFGISNFYVFGGGTKLTVLGQ 04682 VH: QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYGIAWVRQMPGKGLEWMGIIYPS DSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARMSYDYQHQAP SMDSWGQGTLVTVSS 04682 VL: DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVIWYQQLPGTAPKLLIYDDTNRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCSTYDNYQAGWVFGGGTKLTVL GQ Tabla B: Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos Fab anti-c-Met mejorados por afinidad. 05078 VH: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIIDP WNGQTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYT PSDLWGQGTLVTVSS 05078 VL = 04536 VL DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQAYDSSMLRVFGGGTKLTVLGQ 05079 VH: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGVID PWNGITNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYT PSDLWGQGTLVTVSS 05079 VL = 04536 VL DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQAYDSSMLRVFGGGTKLTVLGQ 05087 VH = 04536 VH Q VQLVQSGAE VKKPG AS VKVSCKASG YTFTG YYM NWVRQAPGQGLEWMG 11 NP WTGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTP SDLWGQGTLVTVSS 05087 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANYHDSWVFGGGTKLTVLG Q 05088 VH = 04536 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIINP WTGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTP SDLWGQGTLVTVSS 05088 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYASDYTSWVFGGGTKLTVLG Q 05091 VH = 04536 VH QVQLVQSG AE VKKPGASVKVSCKASG YTFTG YYM NWVRQ APGQGLEWMG 1 I NP WTGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTP SDLWGQGTLVTVSS 05091 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYAHYHDIWVFGGGTKLTVLG Q 05092 VH = 04536 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIINP WTGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYTP SDLWGQGTLVTVSS 05092 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQAHDSLYSRVFGGGTKLTVLGQ 05081 VH: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP IMGTEYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQGT LVTVSS 05081 VL = 04687 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNHPHTFGQGTKV EIKRT 05082 VH: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGEIDP VIGETDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQG TLVTVSS 05082 VL = 04687 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNHPHTFGQGTKV EIKRT 05097 VH = 04687 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP FGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQG TLVTVSS 05097 VL: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYAFGWTFGQGTKV EIKRT 05098 VH = 04687 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP FGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQG TLVTVSS 05098 VL: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQYSDEPWTFGQGTKV EIKRT 05100 VH = 04687 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP FGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQG TLVTVSS 05100 VL: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYAYEPNTFGQGTKV EIKRT 05101 VH = 04687 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP FGTAN YAQ KFQG RVT ITADESTSTA YM E LSSL RS E DTAVYYCARVYQ D VWGQG TLVTVSS 05101 VL: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQYAFSPWTFGQGTKV EIKRT 05093 VH = 04541 VH QVQLQESGPGLVKPGETLSLTCTVSGGSISSSSYYWNWIRQAPGKGLEWIGEIY FGWTYYNPSLKGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCARGYEFHGYTTF DYWGQGTLVTVSS 05093 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDSYIFVFGGGTKLTVLGQ 05094 VH = 04541 VH QVQLQESGPGLVKPGETLSLTCTVSGGSISSSSYYWNWIRQAPGKGLEWIGEIY FGWTYYNPSLKGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCARGYEFHGYTTF DYWGQGTLVTVSS 05094 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCSTYDAFTFVFGGGTKLTVLGQ 05095 VH = 04541 VH QVQLQESGPGLVKPGETLSLTCTVSGGSISSSSYYWNWIRQAPGKGLEWIGEIY FGWTYYNPSLKGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCARGYEFHGYTTF DYWGQGTLVTVSS 05095 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSYYVYWYQQKPGQAPVLVIYDDNDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDKYVFVFGGGTKLTVLGQ 05102 VH = 04537 VH QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGFIFP DTSYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTA YYCARVKLITDYWGQ GTLVTVSS 05102 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSLRSYFVSWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRP SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCASWDPPSAFEVFGGGTKLTVL GQ 05105 VH = 04537 VH QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGFIFP DTSYTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARVKLITDYWGQ GTLVTVSS 05105 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSLRSYFVSWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRP SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCASWDNDHFEVFGGGTKLTVLG Q 05106 VH = 04690 VH QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWGWIRQSPGRGLEWLGRI YYRSKWVNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQGAVYP G PYG FDVWGQGTLVTVSS 05106 VL: DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDKLGSYFVYWYQQKPGQAPVLVIYDDDNRP SGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCGSWAYLGDVFGGGTKLTVLGQ 05174 VH = 05078 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIIDP WNGQTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYT PSDLWGQGTLVTVSS 05174 VL = 05087 VL DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANYHDSWVFGGGTKLTVLG Q 05184 VH = 05078 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMNWVRQAPGQGLEWMGIIDP WNGQTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGFFYYT PSDLWGQGTLVTVSS 05184 VL = 05091 VL DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDSIGNKYVHWYQQKPGQAPVLVIYADSDRPS GIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYAHYHDIWVFGGGTKLTVLG Q 05185 VH = 05081 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP IMGTEYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQGT LVTVSS 05185 VL = 05100 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYAYEPNTFGQGTKV EIKRT 05186 VH = 05081 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIDP IMGTEYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVYQDVWGQGT LVTVSS 05186 VL = 05101 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSILYGINNNFLGWYQQKPGQPPKLLIYW ASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLQYAFSPWTFGQGTKV EIKRT Tabla C : Secuencias de n ucleótidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos Fab anti-c-Met progenitores. 04536 VH: CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGC GTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAA TTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAA TCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGAC CATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTG CGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGG I I I I I I I I A TTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 04536 VL: GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTA CCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGAT CGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACC GCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATT G CCAGG CTTATG ATTCTTCTATG CTTCGTGTGTTTG G CGG CGG C ACGAAGTT AACCGTTCTTGGCCAG 04687 VH: CAGGTGCAATTGGTTCAGTCTGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCAGCAGC GTG AAAGTG AG CTG CAAAG CCTCCGG AGGCACTTTTTCTTCTTATG CTATTTC TTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGGTATCGA TCCGTTTGGCACTGCGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATT ACCGCGGATGAAAGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCGT AGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGTTTATCAGGATGTTTGGG GCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 04687 VL: GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCCTGGGCGAA CGTG CG ACCATTAACTG CAG AAG CAG CCAGTCTATTCTTTATGGTATTAACAA TAATTTTCTGGGTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAGCCGCCGAAACTATTAA TTTATTGGGCTTCTACTCGTGAAAGCGGGGTCCCGGATCGTTTTAGCGGCTC TGGATCCGGCACTGATTTTACCCTGACCATTTCGTCCCTGCAAGCTGAAGAC GTGG CGGTGT ATT ATTG CCAG C AGTATTATAATCATCCTC ATACCTTTG GCC A GGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG 04541 VH: CAGGTGCAATTGCAAGAAAGTGGTCCGGGCCTGGTGAAACCGGGCGAAACC CTGAGCCTGACCTGCACCGTTTCCGGAGGTAGCATTTCTTCTTCTTCTTATTA TTGGAATTGGATTCGCCAGGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTGGCGA GATCTATTTTGGCTGGACCTATTATAATCCGAGCCTGAAAGGCCGGGTGACC ATTAGCGTTGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGAAACTGAGCAGCGTGAC GGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTTATGAGTTTCATGGT TATACTACTTTTGATTATTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 04541 VL: GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATAATATTGGTTCTTATTATGTTTATTGGTA CCAGCAG AAACCCG G G CAG G CGCCAGTTCTTGTG ATTTATG ATG ATAATG AT CGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACC GCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATT GCCAGTCTTATGATTTTCCTTCTATTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACC GTTCTTGGCCAG 04537 VH: CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGC CTGAA TTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTTCTAATTATTGGATTGGT TGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCTTTATCTTTC CGGATACTAGCTATACCCGTTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCAT TAG CG CGG ATAAAAG CATTAG CACCGCGTATCTTCAATGG AG CAG CCTG AAA GCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTGTTAAGCTTATTACTGATTA TTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 04537 VL: GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTCTTCGTTCTTATTTTGTTTCTTGGTA CCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGATGATGATGAT CGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACC GCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATT GCGCTTCTTGGGATACTCTTTCTGATGTTGAGGTGTTTGGCGGCGGCACGAA GTTAACCGTTCTTGGCCAG 04690 VH: CAG GTG C AATTGCAACAGTCTG GTCCGG G CCTGGTG AAACCG AG CC AAACC CTG AG CCTG ACCTGTG CG ATTTCCGG AG ATAGCGTG AG CTCTAATTCTG CTG CTTGGGGTTGGATTCGCCAGTCTCCTGGGCGTGGCCTCGAGTGGCTGGGCC GTATCTATTATCGTAGCAAGTGGGTTAACGATTATGCGGTGAGCGTGAAAAG CCGGATTACCATCAACCCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAGCCTGCAACTGA ACAGCGTGACCCCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCAGGGTG CTGTTTATCCTGGTCCTTATGGTTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTG ACGGTTAGCTCA 04690 VL: GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATMGCTTGGTTCTTATTTTGTTTATTGGTA CCAG CAG AAACCCG GG CAGG CGCCAGTTCTTGTG ATTTATG ATG ATG ATAAT CGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACC GCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATT GCCAGTCTTTTGGTATTTCTAA I I I I I ATGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTA ACCGTTCTTGGCCAG 04682 VH: GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGTGGCGCACCAGGTCAGCGT GTG ACC ATCTCGTGTAG CGG CAG CAG CAGC AACATTGGTTCTAATTATGTG A TTTGGTACCAGCAGTTGCCCGGGACGGCGCCGAAACTTCTGATTTATGATGA TACTAATCGTCCCTCAGGCGTGCCGGATCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGC ACCAGCGCGAGCCTTGCGATTACGGGCCTGCAAAGCGAAGACGAAGCGGAT TATTATTGCTCTACTTATGATAATTATCAGGCTGGTTGGGTGTTTGGCGGCGG CACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG 04682 VL: CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGAAAGC CTGAAAATTAGCTGCAAAGGTTCCGGATATTCCTTTACTAATTATGGTATTGCT TGGGTGCGCCAGATGCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCTAT CCGTCTGATAGCTATACCAATTATTCTCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCAT TAGCGCGGATAAAAGCATTAGCACCGCGTATCTTCAATGGAGCAGCCTGAAA GCGAGCGATACGGCCATGTATTATTGCGCGCGTATGTCTTATGATTATCAGCA TCAGGCTCCTTCTATGGATTCTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGC TCA Tabla D: Secuencias de n ucleótidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos Fab anti-c-Met mejorados por afinidad. 05078 VH: CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGC GTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAA TTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATTGA TCCTTGGAATGGTCAGACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACC ATG ACCCGTG ATACCAGC ATT AG CACCG CGTATATGG AACTG AG C AG CCTG C GTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGG I I I I I I I I AT TATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 05078 VL = 04536 VL GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTA CCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGAT CGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACC GCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATT GCCAGGCTTATGATTCTTCTATGCTTCGTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTT I .

AACCGTTCTTGGCCAG 05079 VH: CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGC GTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAA TTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCGTTATTGA TCCTTGGAATGGTATTACTAATTATGCTCAGAAGTTTCAGGGTCGGGTCACCA TGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTGCG TAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGG I I I I I I I I ATT ATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 05079 VL = 04536 VL G AT ATCG AACTG ACCCAG CCGCCTTCAGTG AG CGTTG C ACCAG GTCAG ACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTA CCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGAT CGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACC GCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATT G CCAGG CTTATG ATTCTTCTATG CTTCGTGTGTTTGG CGG CGG C ACG AAGTT AACCGTTCTTGGCCAG 05087 VH = 04536 VH 9 CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGC GTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAA TTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAA TCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGAC CATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTG CGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGG I I I I I I I I A TTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 05087 VL: 5 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTA CCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGAT CGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACC GCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGACGAAGCGGATTATTATT 1 o GCCAGTCTTATGCTAATTATCATGATTCTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGAA GTTAACCGTTCTTGGCCAG 05088 VH = 04536 VH CAGGTGCAATTGGTTCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGC GTGAAAGTGAGCTGCAAAGCCTCCGGATATACCTTTACTGGTTATTATATGAA 15 TTGGGTCCGCCAAGCCCCTGGGCAGGGTCTCGAGTGGATGGGCATTATCAA TCCGTGGACTGGCAATACGAATTACGCGCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGAC CATGACCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAACTGAGCAGCCTG CGTAGCGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGATCCTGG I I I I I I I I A TTATACTCCTTCTGATCTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA 20 05088 VL: GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAGGTCAGACC GCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATGTTCATTGGTA CCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTATGCTGATTCTGAT ?? 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Se contemplan las secuencias de polipéptidos relacionadas adicionales dentro del alcance de la invención que tengan , por ejemplo, cambios de aminoácidos conservadores, o que contengan secuencias de aminoácidos adicionales, tales como marcas 6xHis, u otras marcas, o que se fusionen con una segunda secuencia de polipéptido, o que contengan cambios de residuos que reduzcan la respuesta inmune a la terapia con el anticuerpo, o que tengan los residuos FR1 , FR2. FR3, o FR4 modificados. Las regiones Fr y CDR se proporcionan en las Figuras 1 a 3. Las secuencias de CDR preferidas son como se proporcionan en las Figuras. Las enfermedades dependientes de cinasa de proteína son en especial las enfermedades proliferativas, de preferencia un tumor benigno o en especial maligno, más preferiblemente carcinoma del cerebro, riñon , hígado, glándula adrenal , vejiga , mama , estómago (en especial tumores gástricos), ovarios, colon , recto, próstata , páncreas, pulmón, vagina , tiroides, sarcoma, glioblastomas, mieloma múltiple, o cáncer gastrointestinal , en especial carcinoma de colon o adenoma colo-rectal , o un tumor de cuello y cabeza, una hiper-proliferación epidérmica , en especial soriasis, hiperplasia de próstata, una neoplasia, en especial de carácter epitelial , de preferencia carcinoma mamario, o una leucemia, en especial hasta donde esté involucrada la c-Met. Son capaces de provocar la regresión de los tumores y de prevenir la formación de metástasis tumorales y el crecimiento de (también micro) metástasis. En adición , se pueden utilizar en la hiper-proliferación epidérmica (por ejemplo, soriasis), en la hiperplasia de próstata, en el tratamiento de neoplasias, en especial de carácter epitelial , por ejemplo carcinoma mamario , y en leucemias. También es posible utilizar los anticuerpos de la invención en el tratamiento de enfermedades del sistema inmune, hasta donde estén involucradas varias, o en especial las cinasas de proteína tirosina individuales y/o cinasas de proteína de serina/treonina (adicionales); además, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar también en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central o periférico, en donde esté involucrada la transmisión de señales por parte de cuando menos una cinasa de proteína tirosina y/o una cinasa de proteína serina/treonina (adicional). En ciertas modalidades, el anticuerpo o el fragmento funcional de este anticuerpo se enlaza con la proteína objetivo c-Met, y modula, es decir, activa o inhibe, la fosforilación de c-Met. En ciertas modalidades, la activación de la fosforilación de c-Met estimula cuando menos una de una actividad seleccionada a partir del grupo de regeneración de órgano, sanado de heridas, y regeneración de tejido. En una modalidad relacionada, el órgano es piel , riñon , h ígado, páncreas, pulmón , intestino, timo , o tiroides. En las modalidades alternativas, los anticuerpos para c-Met bloquearían la infección por patógenos, en particular la infección por Listeria, o mejoraría las enfermedades patogénicas tales como malaria (Carrolo, y colaboradores, Nature Med. 9: 1 363-1 369, 2003). Los anticuerpos que muestran inhibición de c-Met son útiles en el tratamiento de cáncer de colon , incluyendo metástasis, por ejemplo en el h ígado, y de carcinoma pulmonar no microcelular. Los anticuerpos anti-c-Met también se pueden utilizar en el tratamiento de carcinoma renal papilar hereditario (Schmidt, L. y colaboradores, Nat. Genet. 1 6, 68-73, 1 997), y otras enfermedades proliferativas en donde se sobre-exprese o se active constitutivamente la c-Met mediante mutaciones (Jeffers y Vande Woude. Oncogene 1 8, 51 20-51 25 , 1 999; y la referencia citada en el mismo), o mediante reconfiguraciones cromosómicas (por ejemplo, TPR-M ET; Cooper y colaboradores, Nature 31 1 , 29-33, 1 984; Park. y colaboradores, Cell 45, 895-904, 1 986). Los antagonistas de los anticuerpos de la invención son especialmente útiles para el tratamiento de una célula indeseada , en particular una célula asociada con una condición relacionada con c-Met, tal como un cáncer, una metástasis, o una condición inflamatoria. Los cánceres de ejemplo incluyen , pero no se limitan a , por ejemplo, esofágico, de mama , de riñon incluyendo, pero no limitándose a, carcinoma de células renales papilares, glioma, de cabeza y cuello, epitelial , de pulmón, de piel , leucemia , linfoma , mieloma, de cerebro, pancreático, gástrico, gastrointestinal, de estómago, de intestino, de colon , de h ígado, genital , urinario, melanoma , y de próstata. Los cánceres y condiciones adicionales se proporcionan en la presente o se conocen en la técnica. Los anticuerpos que muestran antagonismo de c-Met son útiles en el tratamiento de cáncer de vejiga (superficial e invasivo del músculo), cáncer de mama, cáncer cervical , cáncer colo-rectal , glioma (incluyendo glioblastoma, astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma, oligodendroglioma), cáncer esofágico, cáncer gástrico, carcinoma hepatocelular (HCC), incluyendo carcinoma hepatocelular de la infancia, cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de Hurthle, melanoma maligno, mesotelioma , mieloma múltiple, leucemias, cáncer pulmonar no microcelular (incluyendo todos los subtipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma macrocelular, y el ti po mixto adenoescamoso), cáncer pulmonar microcelular, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de células renales, incluyendo cáncer de células renales papilares hereditario y esporádico, Tipo I y Tipo I I , y cáncer de células renales de células transparentes; sarcomas, en particular osteosarcomas, sarcomas de células transparentes, y sarcomas del tejido blando (incluyendo rabdomiosarcomas alveolares y embrionarios, sarcomas de la parte blanda alveolar); carcinoma de tiroides (papilar y de otros subtipos).

En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno o condición relacionada con c-Met, el cual involucra administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriores. El trastorno o la condición es un cáncer o una condición inflamatoria. En otra modalidad relacionada, el cáncer es esofágico, de mama, de riñon, de cabeza y cuello, epitelial , de pulmón , leucemia , linfoma, mieloma, de cerebro, pancreático, de estómago, de colon , de h ígado, genital , urinario, melanoma, o de próstata . En una modalidad particular, el cáncer es de h ígado o esofágico. En ciertas modalidades, cualquiera de los métodos involucra además administrar un agente quimioterapéutico. En una modalidad relacionada, el agente quimioterapéutico es un agente contra el cáncer. En todavía otra modalidad , la invención proporciona un método para el tratamiento de una célula indeseada , el cual involucra poner en contacto la célula con cualquiera de los anticuerpos anteriores o fragmentos funcionales de estos anticuerpos. En una modalidad relacionada, la célula lleva un receptor c-Met. En otra modalidad relacionada, el método anterior involucra además tratar la célula con un agente quimioterapéutico o con radiación. En una modalidad alternativa, el anticuerpo responde a, y activa, la fosforilación de c-Met, estimulando una respuesta celular, tal como en el sanado de heridas. En otra modalidad , la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye cualquiera de los anticuerpos anteriores, o fragmentos funcionales de estos anticuerpos, y un agente terapéutico adicional . El agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un agente contra el cáncer; un antibiótico; un agente anti-inflamatorio; un factor de crecimiento; y una citoquina. Moléculas de ácidos nucleicos q ue codifican los anticuerpos de la invención Otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Los ejemplos de las secuencias VH se muestran en las SEQ I D NOs:21 -30. Los ejemplos de las secuencias VL se muestran en las SEQ I D NOs: 1 -20. Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos de Ig lambda se muestra en la SEQ I D NO:73. Los ejemplos de las secuencias de nucleótidos de Ig kappa se muestran en las SEQ I D NOs:74-76. Los ejemplos de las secuencias de nucleótidos de lgG4 se muestran en las SEQ I D NOs:85-88. Los ácidos nucleicos proporcionados en la presente, que codifican los anticuerpos, pueden estar presentes en células enteras, en un Usado celular, o pueden ser ácidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o en una forma sustancialmente pura. Un ácido nucleico se aisla o se hace sustancialmente puro cuando se purifica a partir de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS , banda de CsCI , cromatografía en columna , electroforesis en gel de agarosa, y otros bien conocidos en este campo. Véase F. Ausubel, y colaboradores, edición 2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley I nterscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN , y puede o no contener secuencias intrónicas. En una modalidad , el ácido nucleico es una molécula de ADNc. El ácido nucleico puede estar presente en un vector, tal como un vector de exhibición de fago, o en un vector de plásmido recombinante. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden obtener empleando técnicas de biología molecular convencionales. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que llevan genes de inmunoglobulina humana, como se describe adicionalmente más adelante), los ADNcs que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo hecho por el hibridoma , se pueden obtener mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa convencional , o mediante técnicas de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de exhibición de fagos), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede recuperar a partir de diferentes clones de fagos que sean miembros de la biblioteca. Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo, para convertir los genes de región variable hasta los genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, hasta genes de fragmento Fab, o hasta un gen de scFv, mediante el ligamiento de los nucleótidos codificantes en vectores conocidos. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifique VL o VH se enlaza operativamente con otra molécula de ADN , o con un fragmento que codifique otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "enlazado operativamente", como se utiliza en este contexto, pretende significar que los fragmentos de ADN se unen de una manera funcional , por ejemplo, de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen dentro del marco, o de tal manera que la proteína se expresa bajo el control de un promotor deseado. El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir hasta un gen de cadena pesada de longitud completa mediante el enlace operativo del ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifique las regiones constantes de cadena pesada (CH 1 , CH2, y CH3). Las secuencias de los genes de región constante de cadena pesada humana se conocen en este campo (véase, por ejemplo, Kabat, E . A. , y colaboradores, 1 991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición , Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de N I H Número 91 -3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa convencional . La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE , IgM , ó IgD. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH se puede enlazar operativamente con otra molécula de ADN que codifique solamente la región constante de cadena pesada CH 1 . El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir hasta un gen de cadena ligera de longitud completa (así como hasta un gen de cadena ligera de Fab), mediante el enlace operativo del ADN que codifica VL con otra molécula de ADN que codifique la región constante de cadena ligera, CL . Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en este campo (véase, por ejemplo, Kabat, E. A. , y colaboradores, 1 991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición , Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación de N I H Número 91 -3242), y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa convencional . La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. Con el objeto de crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se enlazan operativamente con otro fragmento que codifique un enlazador flexible, por ejemplo que codifique la secuencia de aminoácidos (Gly4 -Ser)3, de tal manera que se puedan expresar las secuencias VH y VL como una proteína de una sola cadena contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird y colaboradores, 1 988 Science 242:423-426; Huston y colaboradores, 1 988 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:5879-5883; McCafferty y colaboradores, 1 990 Nature 348: 552-554). Producción de los anticuerpos monoclonales de la invención Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden producir mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodolog ía de anticuerpos monoclonales convencional , por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein, 1 975 Nature 256:495. Se pueden emplear muchas técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de los linfocitos-B . Un sistema animal para la preparación de hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la materia. También se conocen los componentes de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y los procedimientos de fusión . Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal de murino preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma de murino de interés, y se diseña para contener secuencias que no sean de inmunoglobulina de murino (por ejemplo, humanas), empleando técnicas de biología molecular convencional . Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden enlazar con las regiones constantes humanas empleando los métodos bien conocidos en este campo (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,81 6,567 a Cabilly y colaboradores). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR de murino se pueden insertar en una estructura humana, empleando métodos conocidos en este campo (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,225,539 a Winter, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica N úmeros 5, 530, 1 01 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 1 80,370 a Queen y colaboradores). En cierta modalidad , los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra c-Met se pueden generar utilizando las partes portadoras de ratón transgénico o transcromosómico del sistema inmune humano, en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones preferidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM , respectivamente, y son referidos colectivamente en la presente como "ratones de Ig humana". El ratón HuMAb® (Medarex, I nc. ) contiene los mini-/oc del gen de inmunoglobulina humana que codifican las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y y) y de cadena ligera no reconfiguradas, junto con las mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadena µ y ? endógenos (véase, por ejemplo, Lonberg , et al . , 1 994 Nature 368(6474):856-859). De conformidad con lo anterior, los ratones exhiben una expresión reducida de la IgM o ? de ratón , y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos sufren un cambio de clase y mutación somática para generar la IgGK monoclonal humana de alta afinidad Lonberg, N. et al., 1994 supra; revisado en Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13:65-93, y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de los ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas llevadas por estos ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. y colaboradores, 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. y colaboradores, 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y colaboradores, 1993 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94:3720-3724; Choi y colaboradores, 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. y colaboradores, 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon y colaboradores, 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. y colaboradores, 1994 International Immunology 579-591; y Fishwild, D. y colaboradores, 1996 Nature Biotechnology 14:845-851, el contenido de todos los cuales se incorpora específicamente a la presente como referencia en su totalidad. Véanse además, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas a Lonberg y Kay; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,545,807 a Surani y colaboradores; las Publicaciones del TCP Números WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y la Publicación del TCP Número WO 01/14424 a Korman y colaboradores.

En otra modalidad, se puede provocar ("reproducir") la producción de los anticuerpos humanos de la invención utilizando un ratón que lleve secuencias de inmunoglobulina humana sobre transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que lleve un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Estos ratones, referidos en la presente como "ratones KM" se describen con detalle en la Publicación del TCP Número WO 02/43478 a Ishida y colaboradores. Todavía además, en la técnica están disponibles sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan los genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos anti-c-Met de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo referido como el Xenomouse (Xeno-ratón) (Abgenix, lnc.);estos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 a Kucherlapati y colaboradores. Más aún, en la técnica están disponibles sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan los genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos anti-c-Met de la invención. Por ejemplo, se pueden utilizar los ratones que llevan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como "ratones TC"; estos ratones se describen en Tomizuka y colaboradores, 2000 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97:722- 727. Adicionalmente, se han descrito en la técnica vacas que llevan transcromosomas de cadena pesada y ligera humanas (Kuroiwa y colaboradores, 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos anti-c-Met de la invención . Los anticuerpos humanos o los anticuerpos monoclonales humanos también se pueden preparar empleando los métodos de exhibición de fagos para el rastreo de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana . Estos métodos de exhibición de fagos para identificar y clonar los anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse, por ejemplo: Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,223,409; 5,403,484; y 5,571 ,698 a Ladnery colaboradores; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,427 ,908 y 5,580,71 7 a Dower y colaboradores; Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica N úmeros. 5,969, 1 08 y 6, 1 72, 1 97 a McCafferty y colaboradores; y Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5 ,885,793; 6, 521 ,404; 6,544,731 ; 6,555,31 3; 6,582,91 5 y 6,593,081 a Griffiths y colaboradores. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCI D, en los cuales se hayan reconstituido células inmunes humanas, de tal manera que se pueda generar una respuesta de anticuerpo humano después de la inmunización. Estos ratones se describen, por ejemplo , en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,476,996 y 5,698, 767 a Wilson y colaboradores.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra c-Met La c-Met humana extracelular recombinante purificada expresada en E. coli (R & D Systems, Minneapolis, MN ), o la c-Met humana recombinante purificada conjugada con la hemocianina de limpete de orificio (KLH), se utiliza como el antígeno. También se contemplan otras fuentes de c-Met expresada como dentro del alcance de la invención, incluyendo, por ejemplo, la c-Met aislada a partir de sistemas de expresión tales como baculovirus, células CHO, y otras conocidas por un experto en la materia . Los anticuerpos monoclonales completamente humanos para c- Met se preparan utilizando las cepas HCo7, HCo12 , y HCo1 7 de los ratones transgénicos HuMAb, y la cepa KM de los ratones transcromosómicos transgénicos, cada una de las cuales expresa genes de anticuerpos humanos. En cada una de estas cepas de ratón, el gen de cadena ligera kappa de ratón endógeno se puede alterar homocigóticamente, como se describe en Chen y colaboradores, 1 993 EMBO J.12 :81 1 -820, y el gen de cadena pesada de ratón endógeno se puede alterar homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación del TCP N úmero WO 01 1091 87. Cada una de estas cepas de ratón lleva un transgén de cadena ligera kappa humano, KCo5, como se describe en Fishwild y colaboradores, 1 996 Nature Biotechnology 14:845-851 . La cepa HCo7 lleva el transgén de cadena pesada humano HCo7, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,625,825; y 5,545,807. La cepa HCo1 2 se lleva el transgén de cadena pesada humano HCo 1 2, como se describe en el Ejemplo 2 de la Publicación del TCP Número WO 01 /091 87. La cepa HCo 1 7 lleva el transgén de cadena pesada humano HCo 1 7. La cepa KN M contiene el transcromosoma SC20 , como se describe en la Publicación del TCP Número WO 02/43478. Con el objeto de generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para c-Met, los ratones HuMAb y los ratones KM se inmunizan con el dominio extracelular de c-Met recombinante purificado expresado en E. coli, o con el conjugado de c-Met-KLH como el antígeno. Los esquemas de inmunización generales para los ratones HuMAb se describen en Lonberg, N . y colaboradores, 1 994 Nature 368(6474):856-859; Fishwild , D . y colaboradores, 1 996 Nature Biotechnology 1 4:845-851 , y en la Publicación del TCP Número WO 98/24884. Los ratones son de 6 a 1 6 semanas de edad después de la primera infusión del antígeno. Se utiliza una preparación recombinante purificada (de 5 a 50 microgramos) del antígeno de c-Met (por ejemplo, purificado a partir de células de E. coli transfectadas que expresen el dominio extracelular de c-Met) para inmunizar a los ratones HuMAb y a los ratones KM intraperitonealmente, subcutáneamente (Se), o mediante inyección en la planta de la pata. Los ratones transgénicos se inmunizan dos veces con el antígeno en adyuvante completo de Freund o en adyuvante de Ribi , ya sea intraperitonealmente (I P), subcutáneamente (Se), o mediante inyección en la planta de la pata (FP), seguido por 3 a 21 d ías de inmunización intraperitoneal , subcutánea, o mediante inyección en la planta de la pata (hasta un total de once inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund o en adyuvante de Ribi . La respuesta inmune se monitorea mediante sangrados retro-orbitales. El plasma se rastrea mediante ELISA, y se utilizan los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina humana anti-c-Met para las fusiones. Los ratones se refuerzan intravenosamente con el antígeno 3 y 2 días antes del sacrificio y de la remoción del bazo. Típicamente, se llevan a cabo de 1 0 a 35 fusiones para cada antígeno. Varias docenas de ratones se inmunizan para cada antígeno. Se inmunizan un total de 82 ratones de las cepas de ratones HCo7 , HCo1 2 , HCo17 , y KM con c-Met. Para seleccionar los ratones HuMAb que produzcan anticuerpos que se enlacen con c-Met, se pueden probar los sueros de los ratones inmunizados mediante EL ISA, como es descrito por Fishwild , D . y colaboradores, 1 996. Dicho de una manera breve, en un protocolo de ejemplo, las placas de microtitulación se recubren con la c-Met recombinante purificada a partir de E. coli a 1 -2 miligramos/mililitro en suero regulado con fosfato, en 50 microlitros/pozo que se incuban a 4°C durante la noche, y luego se bloquean con 200 microlitros/pozo de suero de pollo al 5 por ciento en suero regulado con fosfato/Tween (al 0.05 por ciento). También se pueden emplear otras concentraciones y fuentes alternativas. Las diluciones del plasma a partir de los ratones inmunizados con c-Met se agregan a cada pozo, y se incuban durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan con suero regulado con fosfato/Tween, y luego se incuban con un anticuerpo policlonal Fe de cabra anti-lgG humana con jugado con peroxidasa de radícula roja (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavarse, las placas se desarrollan con sustrato ABTS (Sigma, A-1888, 0.22 miligramos/mililitro), y se analizan mediante el espectrofotómetro a una longitud de onda ? de 415 a 495 nanómetros. De una manera alternativa, son posibles otros tipos de detección, y puede ser proporcionados por un experto en este campo. Los ratones que desarrollen las titulaciones más altas de anticuerpos anti-c-Met se utilizan para obtener las células para las fusiones. Las fusiones se llevan a cabo, y se prueban los sobrenadantes de hibridoma para determinar la actividad anti-c-Met mediante ELISA. Los esplenocitos de ratón aislados a partir de los ratones HuMAb y de los ratones KM, se fusionan con una línea celular de mieloma de ratón basándose en los protocolos convencionales utilizando PEG. Los hibridomas resultantes se rastrean entonces para determinar la producción de los anticuerpos específicos del antígeno. Las suspensiones celulares individuales de los linfocitos esplénicos de los ratones inmunizados se fusionan con una cuarta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50 por ciento (Sigma). Las células se aplican a aproximadamente 1x105/pozo en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación de aproximadamente dos semanas en un medio selectivo que contiene suero bovino fetal al 10 por ciento, medio acondicionado P388D1 al 1 0 por ciento (ATCC, CRL, TIB-63), factor de clonación Origen® (IGEN ) del 3 al 5 por ciento en DM EM (Mediatech , CRL 1 001 3, con alto contenido de glucosa, L-glutamina, y piruvato de sodio) más HEPES 5 inM , 2-mercapto-etanol 0.055mM , 50 miligramos/litro de gentamicina, y HAT 1 x (Sigma , CRL P-71 85). Después de una a dos semanas, las células se cultivan en el medio en donde el HAT es reemplazado con HAT. Los pozos individuales se rastrean entonces mediante ELISA para determinar los anticuerpos de IgG monoclonales anti-c-Met humanos. Una vez que se ha presentado un crecimiento extenso del hibridoma , se monitorea el medio usualmente después de 1 0 a 14 d ías. Los hibridomas que secretan el anticuerpo son reemplazados, se rastrean nuevamente, y si todavía son positivos para la IgG humana, se subclonan los anticuerpos monoclonales anti-c-Met cuando menos dos veces mediante dilución limitante. Luego se cultivan los subclones estables in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en el medio de cultivo de tejido para una caracterización adicional. Inmu nización de Ratones de Ig H umana Los ratones de Ig humana utilizados para reproducir los anticuerpos humanos de la invención, se inmunizan con una preparación purificada o enriquecida de antígeno de c-Met y/o c-Met recombinante, o una proteína de fusión de c-Met, como es descrito por Lonberg , N . y colaboradores, 1 994 Nature 368(6474):856-859; Fishwild , D. y colaboradores, 1 996 Nature Biotechnology 1 4:845-851 ; y las Publicaciones del TCP Números WO 981 24884 y WO 01 /1 4424. Los ratones son de 6 a 1 6 semanas de edad en la primera infusión . Por ejemplo, se utiliza una preparación purificada o recombinante (de 5 a 50 microgramos de antígeno de c-Met para inmunizar los ratones de Ig humana intraperitonealmente. Los procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para c-Met se describen anteriormente. La experiencia acumulativa con diferentes antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente de una manera intraperitoneal ( I P) con el antígeno en adyuvante completo de Freund , seguido por inmunizaciones intraperitoneales (hasta un total de 6) con el antígeno con adyuvante incompleto de Freund cada tercera semana. Sin embargo, también se encuentra que son efectivos otros adyuvantes diferentes del de Freund . En adición , se encuentra que las células enteras en ausencia del adyuvante son altamente inmunogénicas. La respuesta inmune se puede monitorear durante el transcurso del protocolo de inmunización , obteniéndose muestras de plasma mediante sangrados retro-orbitales. El plasma se puede rastrear mediante ELISA, y se pueden utilizar los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina humana anti-c-Met para las fusiones. Los ratones se pueden reportar intravenosamente con el antígeno 3 d ías antes del sacrificio y de la remoción del bazo. Se espera que se puedan necesitar llevar a cabo de dos a tres fusiones por cada inmunización . Se inmunizan típicamente entre 6 y 24 ratones por cada antígeno. Usualmente, se utilizan ambas cepas HCo7 y HCo 1 2. En adición , ambos transgenes HCo7 y HCo 12 se pueden reproducir juntos en un solo ratón que tenga dos transgenes de cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo 1 2). Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos Con el objeto de generar hibridomas que produzcan los anticuerpos monoclonales humanos de la invención , se aislan los esplenocitos y/o las células de nodos linfáticos de los ratones inmunizados, y se fusionan con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón . Los hibridomas resultantes se rastrean para determinar la producción de los anticuerpos específicos del antígeno. Por ejemplo, las suspensiones celulares individuales de los linfocitos esplénicos de los ratones inmunizados se fusionan con una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL1 580) con PEG al 50 por ciento. En una modalidad de ejemplo, las células se aplican en placas de microtitulacion de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en un medio selectivo conteniendo suero de clon fetal al 20 por ciento, medio acondicionado "653" al 1 8 por ciento, origen® ( IGEN ) al 5 por ciento, L-glutamina 4 mM , piruvato de sodio 1 mM , HEPES 5 mM , 2-mercapto-etanol 0.055 mM , 50 unidades/mililitro de penicilina, 50 microgramos/mililitro de estreptomicina, 50 microgramos/mililitro de gentamicina, y HAT 1 X (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar en el medio en donde el HATU es reemplazado con HT. Luego las células individuales se pueden rastrear mediante ELISA para determinar los anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se presenta un crecimiento extenso del hibridoma, se puede analizar el medio, normalmente después de 10 a 1 4 d ías. Los hibridomas que secretan anticuerpo se pueden volver a aplicar en la placa, se rastrean nuevamente, y si todavía son positivos para la IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar cuando menos dos veces mediante dilución limitante. Luego los subclones estables se pueden cultivar in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en el medio de cultivo de tejido para la caracterización. Con el objeto de purificar los anticuerpos monoclonales humanos, se cultivan los hibridomas seleccionados en matraces centrífugos de dos litros para la purificación del anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se filtran y se concentran antes de la cromatografía por afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia , Piscataway, N . J . ). La IgG eluida se verifica mediante electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alto rendimiento para asegurar la pureza. La solución reguladora se intercambia con suero regulado con fosfato, y se determina la concentración mediante OD28o , utilizando la extinción de un coeficiente de 1 .43. Los anticuerpos monoclonales se ponen en al ícuotas y se almacenan a -80°C. Generación de transfectomas q ue producen anticuerpos monoclonales Los anticuerpos de la invención también se producen un transfectoma de la célula huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfeccion genética, como es bien conocido en este campo (por ejemplo, Morrison, S. ( 1 985) Science 229: 1 202). Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o los fragmentos de anticuerpo de los mismos, los ADNs que codifican las cadenas ligera y pesada parciales o de longitud completa se pueden obtener mediante técnicas de biología molecular convencionales (por ejemplo, amplificación con reacción en cadena de la polimerasa o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que exprese el anticuerpo de interés), y los ADNs se pueden insertar en vectores de expresión, de tal manera que los genes se enlacen operativamente con las secuencias de control de transcripción y de traducción. En este contexto, el término "operativamente enlazados" pretende significar que un gen de anticuerpo se liga en un vector, de tal manera que las secuencias de control de transcripción y de traducción dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y la traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se seleccionan de tal manera que sean compatibles con la célula huésped de expresión utilizada . El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en un vector separado, o más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión . Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (por ejemplo, ligamiento de sitios de restricción complementarios sobre el fragmento del gen de anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no están presentes los sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente se pueden utilizar para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo, mediante su inserción en vectores de expresión que ya codifiquen las regiones constantes de cadena pesada y las regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado, de tal modo que el segmento VH se enlace operativamente con los segmentos CH dentro del vector, y el segmento VL se enlace operativamente con el segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o de una manera alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena del anticuerpo a partir de una célula huésped . El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector, de tal manera que el péptido de señal se enlace dentro del marco con el término amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina, o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal a partir de una proteína que no sea inmunoglobulina). En adición a los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula huésped . El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, secuenciadores, y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación), que controlan la transcripción o la traducción de los genes de la cadena del anticuerpo. Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 1 85, Academic Press, San Diego, CA 1 990). Los expertos en este campo apreciarán que el diseño del vector de expresión , incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se vaya a transformar, del nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras para la expresión de células huésped de mam ífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en las células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados a partir de citomegalovirus (CMV), virus de simio 40 (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tard ío mayor de adenovirus (AdMLP)), y polioma. De una manera alternativa, se pueden utilizar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de P-globina. Todavía además, se pueden utilizar elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de leucemia de células-T humana tipo 1 (Takebe, Y. y colaboradores, 1 988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472). En adición a los genes de la cadena del anticuerpo y a las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulen la réplica del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de réplica), y genes marcadores seleccionares. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en donde se haya introducido el vector (por ejemplo, véanse las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,399,21 6, 4,634,665 y 5, 1 79,01 7, todas por Axel y colaboradores). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G41 8, higromicina, o metotrexato, en una célula huésped en donde se haya introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de reductasa de dihidrofolato (DHR) (para utilizarse en las células huésped de dhfr con selección/amplificación con metotrexato), y el gen neo (para la selección de G41 8). Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula huésped mediante técnicas convencionales. Las diferentes formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo electroporación , precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y similares. Teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención en células huésped ya sea procarióticas o eucarioticas. La expresión de los anticuerpos en células eucarioticas, en particular en células huésped de mam ífero, se discute debido a que las células eucarioticas, y en particular las células de mam ífero, tienen más probabilidades que las células procarióticas de ensamblarse y secretar un anticuerpo apropiadamente plegado e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de los genes de anticuerpo se ha reportado como inefectiva para la producción de altos niveles de anticuerpo activo (Boss, M . A. y Wood , C. R. , 1 985 Immunology Today 6: 1 2-1 3). Las células huésped de mamífero para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo las células de dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin , 1 980 Proc. Nati. Acad. Sel. EUA 77:421 6-4220 , utilizadas con un marcador seleccionable de DH FR, por ejemplo como se describe en R. J . Kaufman y P. A. Sharp, 1 982 Mol. Biol. 1 59:601 -621 , células de mieloma NSO, células COS, y células SP2. En particular, para utilizarse con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sistema de expresión genética GS mostrado en las Patentes Números WO 87/04462 , WO 89/01 036 y EP 338,841 . Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped , o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde se cultiven las células huésped . Los anticuerpos se pueden recuperar a partir del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína convencionales. Inmunoconiugados En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-c-Met, o un fragmento del mismo, conjugado con una fracción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor), o una radiotoxina. Estos conjugados son referidos en la presente como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluye una o más citotoxinas son referidos como "inmunotoxinas" . Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que aniquile) las células. Los ejemplos incluyen taxol , citocalasina B , gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida , tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona , mitramicina , actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol , y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen , por ejemplo antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tioguanina, citosina-arabinosida , 5-fluorouracilo-dacarbazina), agentes de ablación (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucil , melfalano, carmustina (BSN U), y lomustina (CCN U ), ciclofosfamida, busulfano, dibromo-manitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cisplatina de cis-dicloro-diamina-platino (II) (DDP), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunorrubicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Otros ejemplos de citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar con un anticuerpo de la invención incluye duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas, y auristatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de caliqueamicina está comercialmente disponible (MylotargTm; Wyeth-Ayerst). Las citotoxinas se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención empleando la tecnología de enlazadores disponible en este campo. Los ejemplos de los tipos de enlazadores que se han utilizado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros, y enlazadores que contienen péptidos. Se puede seleccionar un enlazador que sea, por ejemplo, susceptible a la disociación mediante un pH bajo dentro del compartimiento lisosomal, o susceptible a la disociación mediante proteasas, tales como las proteasas preferencialmente expresadas en el tejido tumoral, tales como las catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D). Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, enlazadores, y métodos para conjugar los agentes terapéuticos con los anticuerpos, véanse también Saito, G. y colaboradores, 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 1 99-21 5; Trail, P. A. y colaboradores, 2003 Cáncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. , 2003 Cáncer Cell 3:207-21 2; Alien , T. M . , 2002 Nat. Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan , I . y Kreitman, R. J . , 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1 089-1 091 ; Senter, P. D. y Springer, C. J . , 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar con un isótopo radioactivo para generar productos radiofarmacéuticos citotóxicos, también referidos como radioinmunoconjugados. Los ejemplos de los isótopos radioactivos que se pueden conjugar con los anticuerpos para utilizarse diagnósticamente o terapéuticamente incluyen , pero no se limitan a, yodo1 31 , indio1 1 1 , itrio90, y lutecio1 77. Los métodos para preparar radioinmunoconjugados están establecidos en la técnica. Los ejemplos de los radioinmunoconjugados están comercialmente disponibles, incluyendo ZevalinM R (DEC Pharmaceuticals) y BexxarM R (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden emplear métodos similares para preparar los radioinmunoconjugados, utilizando los anticuerpos de la invención. Los conjugados de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica dada, y la fracción de fármaco no debe interpretarse como limitada a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, una toxina de Diphteria; una proteína, tal como factor de necrosis tumoral o interferón-?; o modificadores de la respuesta biológica, tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), interleucina 6 (IL-6), factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar esta fracción terapéutica con los anticuerpos son bien conocidas; véanse, por ejemplo, Amon y colaboradores, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld y colaboradores, (editores), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y colaboradores, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Edición), Robinson y colaboradores, (editores), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y colaboradores, (editores), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin y colaboradores, (editores), páginas 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y colaboradores, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982). Moléculas biespecíficas En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-c-Met, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o las porciones de enlace de antígeno del mismo, se pueden derivar o enlazar con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor), con el fin de generar una molécula biespecífica que se enlace con cuando menos dos sitios de enlace diferentes o moléculas objetivo. El anticuerpo de la invención, de hecho, se puede derivar o enlazar con más de una molécula funcional diferente, para generar moléculas multiespecíficas que se enlacen con más de dos sitios de enlace y/o moléculas objetivo diferentes; estas moléculas multiespecíficas también son abarcadas por el término "molécula biespecífica", como se utiliza en la presente. Con el objeto de crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera) con una o más moléculas de enlace diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido, o mimético de enlace, de tal manera que resulte una molécula biespecífica. En ciertas modalidades, las moléculas biespecíficas se dirigen contra otras cinasas de tirosina receptoras, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, cRon ó EGFR, u otros objetivos en la senda de c-Met. Los objetivos de la molécula biespecífica adicionales incluyen receptores y ligandos dirigidos por productos terapéuticos contra el cáncer, tales como los que se proporcionan en la presente. De conformidad con lo anterior, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden cuando menos una primera especificidad de enlace para c-Met, y una segunda especificidad de enlace para un segundo epítopo objetivo. Por ejemplo, el segundo epítopo objetivo es un receptor de Fe, por ejemplo FcyRI humano (CD64), o un receptor de Fea humano (CD89). Por consiguiente, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de enlazarse con células efectoras que expresen FcyR, FcaR, o FceR (por ejemplo, monocitos, macrófagos, o células polimorfonucleares (PMNs)), y con células que expresen c-Met. Estas moléculas biespecíficas dirigen las células que expresen c-Met hacia la célula efectora, y desencadenan las actividades de la célula efectora mediadas por el receptor de Fe, tales como fagocitosis de una célula que expresen c-Met, citotoxicidad mediada por las células dependiente del anticuerpo (ADCC), liberación de citoquina, o generación del anión de superóxido. Adicionalmente, para la invención, en donde la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de enlace, en adición a una especificidad de enlace anti-Fc y una especificidad de enlace anti-c-Met. Por ejemplo, la tercera especificidad de enlace podría ser una porción anti-factor de potenciación (EF), por ejemplo, una molécula que se enlace con una proteína superficial involucrada en la actividad citotóxica, y de esta manera aumenta la respuesta inmune contra la célula objetivo. La "porción anti-factor de potenciación" podría ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional , o un ligando que se enlace con una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y que de esta manera dé como resultado una potenciación del efecto de los determinantes de enlace para el receptor de Fe o para el antígeno de la célula objetivo. La "proporción anti-factor de potenciación" para enlazarse con una receptor de Fe o con un antígeno de la célula objetivo. De una manera alternativa , la porción anti-factor de potenciación podría enlazarse con una entidad que sea diferente de la entidad con la que se enlacen las primera y segunda especificidades de enlace. Por ejemplo, la porción anti-factor de potenciación puede enlazarse con una célula-T citotóxica (por ejemplo, mediante CD2 , CD3, CD8, CD28, CD4, CD44, ICAM-1 , u otra célula inmune que dé como resultado una respuesta inmune incrementada contra la célula objetivo). En una modalidad , las moléculas biespecíficas de la invención comprenden , como una especificidad de enlace, cuando menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, o un Fv de una sola cadena. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento m ínimo del mismo, tal como un Fv, o una construcción de una sola cadena , como se describe en Ladner y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,946,778, el contenido de la cual se incorpora expresamente como referencia. En una modalidad , la especificidad de enlace para un receptor de Fcy es proporcionada por un anticuerpo monoclonal , cuyo enlace no es bloqueado por la inmunoglobulina G humana (IgG). Como se utiliza en la presente, el término "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena-? localizados sobre el cromosoma 1 . Estos genes codifican un total de doce isoformas receptoras transmembrana o solubles que se agrupan en tres clases de receptor de Fy: FcyRI (CD64), F CYR I I (C D32) , y FcyRI I I (C D 16). En otra modalidad, el receptor de Fcv es un FcyRI de alta afinidad humano. El FcyRI humano es una molécula de 72 kDa , y tiene una alta afinidad para la IgG monomérica (1 08 -1 09 M"1 ). La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fcy son descritas por Fanger y colaboradores, en la Publicación del TCP Número WO 88/00052, y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,954,61 7, las enseñanzas de las cuales se incorporan absolutamente como referencia en la presente. Estos anticuerpos se enlazan con un epítopo de FcyRI , FcyRI l , ó FcyRI I I , en un sitio que es distinto del sitio de enlace de Fcy del receptor, y por lo tanto, su enlace no es bloqueado sustancialmente por los niveles fisiológicos de IgG . Los anticuerpos anti-FcvRI específicos útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce el mAb 32 está disponible en la American Type Culture Collection , ATCC Número de Acceso HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo anti-receptor de Fcy es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describen en Graziano, R. F. y colaboradores, 1 995 J. Immunol. 1 55 ( 1 0):4996-5002, y en la Publicación del TCP Número WO 94/1 0332. La línea celular que produce el anticuerpo 1 1 22 se depositó en la American Type Culture Collection bajo la designación de HA022CL1 , y tiene el número de acceso CRL 1 1 1 77. En todavía otras modalidades, la especificidad de enlace para un receptor de Fe es proporcionada por un anticuerpo que se enlaza con un receptor de IgA humana, por ejemplo un receptor de Fc-alfa, FcaRI (CD89), cuyo enlace no tiene que ser bloqueado por la inmunoglobulina A humana ( IgA). El término "receptor de IgA" pretende incluir el producto genético de un gen (FcaRI) localizado sobre el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas transmembranas alternativamente empalmadas de 55 a 1 1 0 kDa . FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente sobre los monocitos/macrófagos, los granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos, pero no sobre las poblaciones de células no efectoras. FcaRI tiene una afinidad intermedia o media (5x1 07 M" ) tanto para lgA1 como para lgA2, que aumenta al exponerse a las citoquinas, tales como G-CSF ó GM-CSF (Morton , H . C. y colaboradores, 1 996 Critica! Reviews ¡n Immunology 1 1 6:423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI , identificados como A3, A59, A62, y A77 , que se enlazan con FcaRI afuera del dominio de enlace de ligando de IgA (Monteiro, R. C. y colaboradores, 1 992 J. Immunol. 148: 1 764) FcaRI y FcyRI son receptores desencadenantes para utilizarse en las moléculas biespecíficas de la invención, debido a que se expresan primordialmente sobre las células efectoras inmunes, por ejemplo los monocitos, los PM Ns, los macrófagos, y las células dendríticas; se expresan en altos niveles (por ejemplo, de 5,000 a 1 00,000 por célula); son mediadores de las actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); median la presentación de antígeno potenciada de los antígenos, incluyendo los auto-antígeno, dirigida hacia ellos. Otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales de murino, quiméricos, y humanizados. Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de enlace constituyentes, por ejemplo , las especificidades de enlace anti-FcR y anti-c-Met, o empleando los métodos conocidos en este campo. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molécula biespecífica se puede generar por separado, y luego se conjugan unas con otras. Cuando las especificidades de enlace son proteínas o péptidos, se puede utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o de reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos de los agentes reticulantes incluyen proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTN B), o-fenilen-dimaleimida (oPDM ), N-succinimidil-3-(2-ditiopiridil)-propionato (SPDP), y ciclohexan-1 -carboxilato de sulfo-succinimidil-4-(N-maleimido-metilo) (sulfo-S CC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores, 1984 J. Exp. Med. 1 60: 1 686; Liu, M . A. y colaboradores, 1 985 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82 :8648). Otros métodos incluyen aquéllos descritos en Paulus, 1 985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 1 1 8-1 32 ; Brennan y colaboradores, 1985 Science 229:81 -83; y Glennie y colaboradores, 1 987 J. Immunol. 1 39:2367-2375. Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford , I L). Los anticuerpos se conjugan mediante enlace de sulfhidrilo de las regiones de articulación del término C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particular, la región de articulación se modifica para contener un número non de residuos de sulfhidrilo, por ejemplo uno, antes de la conjugación. De una manera alternativa, los genes que codifican ambas especificidades de enlace se pueden diseñar en el mismo vector, y se pueden expresar y ensamblar, por ejemplo, como una proteína de fusión, en la misma célula huésped . Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2, o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprenda un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de enlace, o una molécula biespecífica de una sola cadena que comprenda dos determinantes de enlace. Las moléculas biespecíficas pueden comprender cuando menos dos moléculas de una sola cadena. Los métodos para la preparación de las moléculas biespecíficas se describen , por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 5,260,203; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,455 ,030; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,881 , 1 75; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5, 1 32,405; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,091 ,51 3; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,476,786; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,01 3,653; en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,258,498; y en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,482,858. El enlace de las moléculas biespecíficas con sus objetivos específicos se puede confirmar, por ejemplo, mediante ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o ensayo Western blot. Cada uno de estos ensayos detecta en general la presencia de los complejos de proteína-anticuerpo de un interés particular, mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo se pueden detectar utilizando, por ejemplo, un anticuerpo enlazado con enzima o un fragmento de anticuerpo que reconozca y se enlace específicamente con los complejos de anticuerpo-FcR. De una manera alternativa, los complejos se pueden detectar utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar radioactivamente, y se puede utilizar en un radioinmunoensayo ( RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub; B . , Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo de 1 986, el cual se incorpora a la presente como referencia). El isótopo radioactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador ?, o un contador de cintilación, o mediante auto-radiografía. Ensayos para la mod ulación de la actividad de c-Met (agonismo o antagonismo) Los anticuerpos anti-c-Met se ensayan por tener una capacidad agonista o antagonista de c-Met. El agonismo es la capacidad para reemplazar el efector positivo HG F mediante el enlace con , y la activación de, c-Met, por ejemplo, un receptor de c-Met humano llevado sobre una célula de una línea celular establecida en cultivo, o llevado sobre una línea celular primaria establecida a partir de una muestra de tejido humano, o una proteína c-Met purificada que está comercialmente disponible (R&D Systems #358 MT), la cual se inmoviliza sobre una placa de ensayo o sobre un gránulo. Una medida de la actividad agonista es la concentración del efector, en este caso un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la presente, que produzca el 50 por ciento de la actividad de HGF de control , es decir, la EC50. La EC50 se puede determinar utilizando un ensayo de enlace de ligando, como se determina mediante una técnica inmunológica convencional , tal como ELISA, RIA, o mediante un ensayo basado en células, tal como un ensayo de dispersión celular, de crecimiento en ágar suave, y/o de invasión de matriz (ensayo de tubulomorfogénesis). De una manera preferible, la actividad inhibidora EC50 es menor de 5 microgramo/mililitro, menor de 1 microgramo/mililitro, menor de 0.5 microgramos/mililitro, menor de 0.1 microgramos/mililitro, y todavía preferiblemente menor de 50 nanogramos/mililitro, medida, por ejemplo, mediante ELISA. El antagonismo es la capacidad para impedir la interacción con, e inhibir la acción de, el HGF efector positivo, mediante el enlace con el receptor de c-Met, por ejemplo, un c-Met humano llevado sobre una cél ula de una l ínea celular establecida en cultivo, o llevado sobre una línea celular primaria establecida a partir de una muestra de tejido humano, o una proteína c-Met purificada que está comercialmente disponible (R&D Systems #358 MT), la cual se inmoviliza sobre una placa de ensayo o sobre un gránulo. Una medida de la actividad antagonista es la concentración del efector, en este caso un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente, que inhiban el 50 por ciento de la actividad del HGF de control , es decir, la IC50. La I C50 se puede determinar utilizando un ensayo de enlace de ligando, como se determina mediante una técnica inmunológica convencional , tal como ELISA, RIA, o mediante un ensayo basado en células, tal como un ensayo de dispersión celular, de crecimiento en ágar suave, y/o de invasión de matriz (ensayo de tubulomorfogénesis). De preferencia, la actividad inhibidora IC50 es menor de 5 microgramos/mililitro, menor de 1 microgramo/mililitro, menor de 0.5 microgramos/mililitro, menor de 0.1 microgramos/mililitro, y todavía preferiblemente menor de 50 nanogramos/mililitro, medida, por ejemplo, mediante ELISA. Ensayo de modulación de la fosforilación de c-Met mediante anticuerpos anti-c-Met agonistas o antagonistas El agonismo o antagonismo mediante los anticuerpos anti-c-Met de la invención se mide mediante la activación o la inhibición de la fosforilación de c-Met en las células con o sin estímulo con HGF. Las células de una l ínea celular, tales como las células A549, se aplican a una densidad de 3x1 04 células por pozo en un volumen total de 1 00 microlitros/pozo de DM EM complementado con suero bovino fetal al 1 0 por ciento en placas tratadas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos (Costar, #3595). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 24 horas, después de lo cual , el medio se aspira suavemente desde cada pozo de las placas, y se agrega un volumen de 100 microlitros/pozo de DMEM . Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 24 horas, después de lo cual , se agrega a las células una muestra de un anticuerpo purificado que se vaya a probar, en 1 00 microlitros por pozo del anticuerpo o una dilución, en el pozo diluido en D EM . Como un control negativo para la falta de activación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tenga una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo de c-Met), o regulador, a los pozos designados. Las células se incuban a 37°C durante un corto período de tiempo (por ejemplo, 2 horas), o durante un período de tiempo más largo (por ejemplo, 24 horas). Cuando sea apropiado , las células se estimulan mediante la adición de HGF en un medio DMEM sin suero a una concentración final de 200 nanogramos/pozo. En general , cuando se ensaya la actividad agonista de los anticuerpos, excepto por el control positivo (no tratado con anticuerpo), se omite el HGF de los pozos de anticuerpo de muestra de prueba . En general, cuando se ensaya la actividad antagonista de los anticuerpos, se incluye HGF en los pozos de anticuerpo de muestra de prueba. Las placas se incuban adicionalmente durante 1 0 minutos a 37°C, y luego se aspira el medio suavemente de los pozos de las placas. Las células se lavan con suero regulado con fosfato frío, y la solución se aspira suavemente desde las placas. Las células se Usan con 50 microlitros de regulador de lisis (regulador de lisis M P40: NaCI 1 20 mM , Tris-HCI 50 mM , pH de 7.5, N P-40 al 1 por ciento, EDTA 1 mM , EGTA 6 mM , NaF 20mM , Benzamidina 1 mM con Na3V04 0.5 mM recién agregado, y PMSF 0.1 mM . Las placas se agitan a temperatura ambiente durante 1 5 minutos, y luego se almacenan a -80°C hasta que se necesiten para el ELISA. Se utiliza un ELISA para determinar los niveles de fosforilación de c-Met. Para la preparación de la placa ELISA, la placa N unc-lmmuno R Píate, MaxiSorbM R Surface (VWR I nternational AG, Número 391 -8786), se lava dos veces con regulador de lavado (suero regulado con fosfato-Tween al 0.05 por ciento, Biorad #670-6531 ); y se agregan 100 microlitros del anticuerpo de captura monoclonal de c-Met (DO-24) en suero regulado con fosfato. Las placas se incuban durante la noche a 4°C, y se lavan tres veces con suero regulado con fosfato-Tween al 0.05 por ciento. Los sitios de enlace no específico se bloquean con 200 microlitros/pozo de albúmina de suero bovino al 3 por ciento en suero regulado con fosfato-Tween durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación . Inmediatamente antes de usarse, se remueve la solución de bloqueo. Los Usados celulares congelados se funden agitando a temperatura ambiente, y se agregan 40 microlitros del lisado a las placas Nunc-lmmuno, y las placas se incuban a 4°C durante 4 horas. Las placas se lavan tres veces con PBS-T, y 50 microlitros/pozo de 0.2 microgramos/mililitro de anticuerpo anti-fosfotirosina PY20-HRP (ZYM ED , #03-7722) en albúmina de suero bovino al 3 por ciento-PBS-T. Las placas se incuban durante la noche a 4°C, y se lavan tres veces con PBS-T. El PBS-T se aspira, y se agregan 90 microlitros/pozo de sustrato de fosfatasa alcalina (CDR-Star, TROPIX, #MS1 00RY), y se desarrollan mientras que se agitan suavemente durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas se leen utilizando un lector de placas de 96 pozos. Estos resultados demuestran que los miembros de la clase antagonista de anticuerpos anti-c-Met inhibe la capacidad de HGF para estimular la fosforilación de c-Met.

Modulación de la proliferación inducida por HGF con los clones agonistas v antagon istas de los anticuerpos anti-c-Met Se lleva a cabo un ensayo para medir el efecto antagonista o agonista de los anticuerpos anti-c-Met, en ausencia o sobre el estímulo con HGF. Las células de una l ínea celular, tales como 4M Br-5, se aplican a una densidad de 3x1 03 células por pozo, en un volumen total de 1 00 microlitros/pozo de F1 2K de Ham complementado con suero bovino fetal al 2 por ciento, en placas tratadas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos (Costar, #361 0). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 2 horas, después de lo cual, se agregan 50 microlitros del medio que contiene el anticuerpo purificado que se va a probar. Como un control negativo para la falta de modulación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o regulador, a los pozos designados. Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 1 hora, después de lo cual , se agregan 50 microlitros del medio solo, o 50 microlitros conteniendo HG F (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 microgramos/microlitro a aproximadamente 50 nanogramos/-mililitro). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 72 horas, después de lo cual , se ensaya la incorporación del ensayo de BrDU ELISA de proliferación celular (Roche), N úmero de Catálogo 1 669 91 5. Dicho de una manera breve, se agregan 20 micromoles/pozo de solución de BrDU (#1 ), y las placas se incuban durante 22 horas a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento. El medio se remueve suavemente, y la placa se seca durante 1 hora a 60°C. Se agregan 200 microlitros de FixDenat (solución #2), y las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La solución se remueve suavemente, y se agregan 1 00 microlitros/pozo de solución de procesamiento anti-BrDU . Las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 90 minutos. La solución se remueve suavemente, y los pozos se lavan con 250 microlitros de solución de lavado. La solución se remueve suavemente, y se miden 1 00 microgramos/pozo de solución de sustrato agregado a las placas a una A405 nm . Estos resultados demuestran que se inhibe la proliferación estimulada por HGF de las células que expresan niveles de c-Met, en las células que se hayan tratado con los clones de anticuerpo anti-c-Met antagonistas. Modulación de la migración celular dependiente de c-Met con una clase antagonista de anticuerpos anti-c-Met Se sabe que las células de ciertas líneas celulares, tales como las células NCI-H441 , que expresan c-Met, migran en respuesta a un gradiente de concentración de HG F. Se llevan a cabo ensayos utilizando células NCI-H441 , en donde se mide la capacidad de los anticuerpos anti-c-Met para modular la migración a través de una membrana perforada (Boyden Chamber Assay) desde un área de baja concentración de HGF hasta un área de alta concentración de HGF. La migración celular se ensaya utilizando el ensayo de migración celular de 96 pozos 8 µ? de quimiotaxis QCMM R. De conformidad con lo anterior, 24 horas antes del ensayo, las células se lavan dos veces con suero regulado con fosfato estéril, y se agotan en el DM EM conteniendo suero bovino fetal al 1 por ciento a 37°C, en una atmósfera de C02 al 5 por ciento. Posteriormente, las células se tripsinizan, y se vuelven a suspender a 1 .0x106 células por mililitro, en la presencia de la concentración apropiada del anticuerpo purificado durante 30 minutos a 37°C. Como un control negativo para la falta de modulación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o regulador, a los pozos designados. Bajo condiciones estériles, se remueve la tapa de la placa de cámara de migración, y se agregan 1 50 microlitros de medio sin suero conteniendo 50 nanogramos/mililitro de HG F (R&D Cat No. 294-HGN ) a los pozos de la charola de alimentación (cámara inferior). 1 00 microlitros de 5-1 0x1 04 células en DM EM con suero bovino fetal al 1 por ciento previamente incubadas con el anticuerpo, se agregan suavemente a la cámara superior. La placa se cubre y se incuba durante 1 6 horas a 37°C en CQ2 al 4-6 por ciento. Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, las células/medio de la cámara superior se desechan, y se coloca la cámara en una charola de alimentación de 96 pozos, en donde se han agregado 1 50 microlitros/pozo de solución de desprendimiento de células previamente calentada. Las células se desalojan mediante incubación durante 30 minutos a 37°C, con una agitación periódica suave. Subsiguientemente se agregan 50 microlitros del tinte CyQuant GR previamente diluido a cada pozo de la charola de alimentación . La placa se incuba durante 1 5 minutos a temperatura ambiente, y se transfieren 1 50 microlitros de la mezcla a una nueva placa de 96 pozos adecuada para la medición de la fluorescencia, utilizando un conjunto de filtro de 480/520 nanómetros. Los datos obtenidos muestran que una clase de los clones de anticuerpo anti-c-Met antagonistas son capaces de inhibir una consecuencia biológica de la activación de c-Met, es decir, la migración estimulada por HGF de las células NCI-H441 , a través de una membrana microporosa .

Determinación de las constantes de afinidad Kn de los anticuerpos anti-c-Met mediante BIACOREMR Se determina la afinidad de enlace del anticuerpo purificado utilizando resonancia de plasmón superficial , empleando el instrumento B I ACOREM R 3000 (Pharmacia Biosensor AB , Uppsala, Suecia y Piscataway, N . J .), siguiendo los protocolos del fabricante, como se describe anteriormente para los anticuerpos antagonistas.

Determinación de las constantes de afinidad (Kn) de los anticuerpos anti-c-Met con citometría de flujo Se determina la afinidad de enlace de los anticuerpos purificados para c-Met expresado sobre la superficie de las células de carcinoma pulmonar A549 humanas, y de las células pulmonares de cinomolgo, mediante citometría de flujo, utilizando el citómetro de flujo BDMR Biosciences LSR, de acuerdo con los protocolos del fabricante, como se describe anteriormente para los anticuerpos antagonistas. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, la cual contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porciones de enlace de antígeno de los mismos, de la presente invención , formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados, o moléculas biespecíficas de la invención . Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se enlacen con diferentes epítopos sobre el antígeno objetivo, o que tengan actividades complementarias. Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en una terapia de combinación , es decir, se pueden combinar con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-c-Met de la presente invención combinado con cuando menos otro agente contra el cáncer o anti-inflamatorio. Los ejemplos de los agentes terapéuticos que se pueden utilizar en la terapia de combinación se describen con mayor detalle más adelante, en la sección sobre los usos de los anticuerpos de la invención . Como se utiliza en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión , recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción , y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo debe ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral , espinal , o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración , el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, inmunoconjugado, o molécula biespecífica , se puede recubrir en un material para proteger al compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que no afecta a la actividad biológica deseada del compuesto progenitor, y que no imparte ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo, Berge, S . M . , y colaboradores, 1 977 J. Pharm. Sci. 66: 1 -1 9). Los ejemplos de estas sales incluyen las sales de adición de ácido y las sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquéllas derivadas a partir de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, y similares, así como de los ácidos orgánicos no tóxicos, tales como los ácidos mono- y di-carboxílicos alifáticos, los ácidos alcanoicos sustituidos por fenilo, los hidroxi-ácidos alcanoicos, los ácidos aromáticos, los ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de bases incluyen aquéllas derivadas a partir de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, así como a partir de las aminas orgánicas no tóxicas, tales como N ,N'-dibencil-etilen-diamina, N-metil-glucamina, cloro-procaína, colina , dietanolamina , etilen-diamina, procaína, y similares. Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen cuando menos antioxidantes solubles en agua , tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxi-anisol butilato (BHA), hidroxi-tolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol , y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilen-diamina-tetra-acético (EDTA), sorbitol , ácido tartárico , ácido fosfórico, y similares. Los ejemplos de los veh ículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol , polioles (tales como glicerol , propilenglicol, polietilenglicol , y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensoactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes, y agentes de dispersión . La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización , supra, como mediante la inclusión de diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno , cloro-butanol , ácido sórbico de fenol , y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares, en las composiciones. En adición , se puede provocar la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción , tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estables estériles. El uso de estos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es conocido en este campo. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención . También se pueden incorporar compuestos activos complementarios en las composiciones. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución , microemulsión , liposoma , u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El veh ículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol , poliol (por ejemplo, glicerol , propilenglicol , y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión , y mediante el uso de tensoactivos. En muchos casos, se pueden incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, poli-alcoholes tales como manitol , sorbitol , o cloruro de sodio en la composición. Se puede provocar una absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción , por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida de un solvente apropiado, con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por microfiltración por esterilización . En términos generales, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico, y los otros ingredientes requeridos a partir de aquéllos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización), que proporcionen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional , a partir de la solución previamente filtrada estéril del mismo. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de veh ículo para producir una sola forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando, y del modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una sola forma de dosificación generalmente será la cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico. En términos generales, del 1 00 por ciento, esta cantidad estará en el intervalo de aproximadamente el 0.01 por ciento a aproximadamente el 99 por ciento de ingrediente activo, de aproximadamente el 0.1 por ciento a aproximadamente el 70 por ciento, o de aproximadamente el 1 por ciento a aproximadamente el 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los reg ímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a través del tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente, como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificación para tener facilidad de administración y uniformidad de la dosificación . La forma unitaria de dosificación , como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se vayan a tratar; cada unidad contiene una cantidad previamente determinada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención es dictada por, y depende directamente de, las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se vaya a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de este compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos. Para la administración del anticuerpo, la dosificación está en el intervalo de aproximadamente 0.0001 a 100 miligramos/kilogramo, y más usualmente, de 0.01 a 5 miligramos/kilogramo del peso corporal del huésped . Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0.3 miligramos/kilogramo de peso corporal , de 1 miligramo/kilogramo de peso corporal , de 3 miligramos/kilogramo de peso corporal , de 5 miligramos/kilogramo de peso corporal , o de 1 0 miligramos/kilogramo de peso corporal , o dentro del intervalo de 1 a 1 0 miligramos/kilogramo. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada tres meses, o una vez cada 3 a 6 meses. Los regímenes de dosificación para un anticuerpo anti-c-Met de la invención incluyen 1 miligramo/kilogramo de peso corporal o 3 miligramos/kilogramo de peso corporal mediante administración intravenosa, dándose el anticuerpo utilizando uno de los siguientes programas de dosificación : cada cuatro semanas para seis dosificaciones, luego cada tres semanas; cada tres semanas; 3 miligramos/kilogramo de peso corporal una vez, seguidos por 1 miligramo/kilogramo de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos con las mismas o diferentes especificidades de enlace, en cuyo caso, la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo normalmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanas, mensuales, cada tres meses, o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indique mediante la medición de los niveles en sangre del anticuerpo para el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración del anticuerpo en plasma de aproximadamente 1 a 1 ,000 microgramos/mililitro, y en algunos métodos, de aproximadamente 25 a 300 microgramos/mililitro. De una manera alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso, se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general , los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos por los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un período de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento por el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduzca o se termine el progreso de la enfermedad , o hasta que el paciente muestre una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad . Posteriormente, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particulares, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, sal , o amida de las mismas, de la vía de administración, del tiempo de administración, de la velocidad de excreción del compuesto particular que se esté empleando, de la duración del tratamiento, de otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, de la edad , sexo, peso, condición, salud general , e historia médica previa del paciente que se esté tratando, y de factores similares bien conocidos en la técnica médica. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-c-Met de la invención da como resultado una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad , un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad , o una prevención del deterioro o de incapacidad debido a la aflicción de la enfermedad . Los síntomas de la enfermedad incluyen los criterios de diagnóstico estándares de cáncer, tales como la etapa , el tamaño del tumor primario, el miembro y el tamaño de las metástasis, o la extensión de la inflamación . Una composición de la presente invención se puede administrar mediante una o más vías de administración , utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en este campo . Como será apreciado por el experto, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración para los anticuerpos de la invención incluyen las vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal , subcutánea, espinal , u otras vías de administración parenteral , por ejemplo, mediante inyección o infusión . La frase "administración parenteral", como se utiliza en la presente, significa modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección , e incluye, sin limitación , inyección e infusión intravenosa , intramuscular, intra-arterial , intratecal , intracapsular, intraorbital , intracard íaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea , subcuticular, e intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , epidural , e intraesternal . De una manera alternativa, un anticuerpo de la invención se puede administrar mediante una vía no parenteral , tal como una vía de administración tópica, epidérmica, o mucosa, por ejemplo intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente, o tópicamente. Los compuestos activos se pueden preparar con veh ículos que protejan al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar pol ímeros biocompatibles biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli-ácido glicólico, colágeno, poli-orto-ésteres, y poli-ácido láctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J . R. Robinson , editor, Marcel Dekker, I nc. , Nueva York, 1 978 . Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con los dispositivos médicos conocidos en este campo. Por ejemplo, en una modalidad , una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo para inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos mostrados en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5 ,399, 1 63; 5,383,851 ; 5,31 2,335; 5,064,41 3; 4,941 ,880; 4,790,824 ó 4,596,556. Los ejemplos de los implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen cuando menos: la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,487,603, la cual muestra una bomba para micro-infusión implantable para dosificar medicamento a una velocidad controlada; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,486, 194, la cual muestra un dispositivo terapéutico para la administración de medicamentos a través de la piel ; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número, 4,447,233, la cual muestra una bomba para infusión de medicamento, para suministrar el medicamento a una velocidad de infusión precisa; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,447 ,224, la cual muestra un aparato para infusión implantable de flujo variable para el suministro continuo del fármaco; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,439, 1 96, la cual muestra un sistema de suministro de fármaco osmótico, que tiene compartimientos de múltiples cámaras; y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,475, 1 96, la cual muestra un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan a la presente como referencia. M uchos otros de estos implantes, sistemas de suministro, y módulos son conocidos por los expertos en la materia. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se pueden formular para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye a muchos compuestos altamente hidrofílicos. Con el fin de asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la barrera hematoencefálica (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,522,81 1 ; 5,374,548; y 5,399,331 . Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que sean transportadas selectivamente hacia las células u órganos específicos, para mejorar de esta manera el suministro de fármacos dirigido (véase, por ejemplo, V. V. Ranade, 1 989 J. Cline Pharmacol. 29:685). Las fracciones de dirección de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,41 6,01 6 a Low y colaboradores, ); manosidas (Umezawa y colaboradores, 1 988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1 53: 1 038); anticuerpos (P. G. Bloeman y colaboradores, 1 995 FEBS Lett. 357: 140; M . Owais y colaboradores, 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39: 1 80); receptor de proteína A de tensoactivo (Briscoe y colaboradores, 1995 Am. J. Physiol. 1 233: 1 34); p 120 (Schreier y colaboradores, 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K.

Keinanen ; M . L. Laukkanen, 1 994 FEBS Lett. 346: 123; J . J . Killion; I .

J . Fidler, 1 994 Immunomethods 4:273. Las combi naciones La invención se refiere además a un método para prevenir o tratar enfermedades proliferativas, o enfermedades tales como un cáncer, en un mamífero, en particular en un ser humano, con una combinación de agentes farmacéuticos que comprende: (a) una composición antagonista del anticuerpo de c-Met; y (b) uno o más agentes farmacéuticamente activos. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) una composición antagonista del anticuerpo de c-Met; y (b) un agente farmacéuticamente activo; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere además a un paquete o producto comercial que comprende: (a) una formulación farmacéutica de una composición antagonista del anticuerpo de c-Met; y (b) una formulación farmacéutica de un agente farmacéuticamente activo para uso simultáneo, concurrente, separado, o en secuencia. Los agentes farmacéuticamente activos El término "agentes farmacéuticamente activos" es amplio, y cubre muchos agentes farmacéuticamente activos que tienen diferentes mecanismos de acción . Las combinaciones de algunos de estos con los anticuerpos/composiciones antagonistas de c-Met, pueden dar como resultado mejoras en la terapia de cáncer. En términos generales, los agentes farmacéuticamente activos se clasifican de acuerdo con el mecanismo de acción. Muchos de los agentes disponibles son anti-metabolitos de las sendas de desarrollo de diferentes tumores, o reaccionan con el ADN de las células tumorales. También hay agentes que inhiben las enzimas, tales como topoisomerasa I y topoisomerasa I I , o que son agentes anti-mitóticos. El término "agente farmacéuticamente activo" significa en especial cualquier agente farmacéuticamente activo diferente de una composición antagonista del anticuerpo de c-Met, o un derivado de la misma. Incluye, pero no se limitan a: i . un inhibidor de aromatasa ; ii . un anti-estrógeno, un anti-andrógeno, o un agonista de gonadorelina; iii . un inhibidor de topoisomerasa I , o un inhibidor de topoisomerasa I I ; iv. un agente activo en microtúbulos, un agente alquilante, un anti-metabolito anti-neoplásico, o un compuesto de platina; v. un compuesto que dirige/reduce la actividad de una cinasa de proteína o de lípido, o la actividad de una fosfatasa de proteína de l ípido, un compuesto anti-angiogénico adicional , o un compuesto que induce los procesos de diferenciación celular; vi . anticuerpos monoclonales; vii . un inhibidor de ciclo-oxigenasa, un bisfosfonato, un inhibidor de heparanasa, un modificador de la respuesta biológica; viii . un inhibidor de las isoformas oncogénicas Ras; ix. un inhibidor de telomerasa; x. un inhibidor de proteasa, un inhibidor de metaloproteinasa de matriz, un inhibidor de amino-peptidasa de metionina, o un inhibidor de proteasoma; xi . los agentes utilizados en el tratamiento de malignidades hematológicas, o los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la actividad de Flt-3; xii. un inhibidor de HSP90; xiii . anticuerpos anti-proliferativos; xiv. un inhibidor de la desacetilasa de histona (H DAC); xv. un compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina ; xvi . un antagonista del receptor de somatostatina; xvii . un compuesto anti-leucémico; xviii . planteamientos que dañan las células tumorales; xix. un enlazador de EDG ; xx. un inhibidor de la reductasa de ribonucleótido; xxi . un inhibidor de la descarboxilasa de S-adenosil-metionina; xxii . un anticuerpo monoclonal de VEGF o de VEGFR; xxiii . terapia fotodinámica; xxiv. un esteroide angiostático; xxv. un implante que contiene corticosteroides; xxvi . un antagonista del receptor AT1 ; y xxvii . un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina. El término "inhibidor de aromatasa", como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que inhibe la producción de estrógeno, es decir, la conversión de los sustratos de androstenodiona y testosterona hasta estrona y estradiol , respectivamente. El término incluye, pero no se limita a, esteroides, en especial atamestano, exemestano, y formestano; y en particular, no esteroides, en especial amino-glutetimida , rogletimida, pirido-glutetimida, trilostano, testolactona, quetoconazol , vorozol , fadrozol , anastrozol , y letrozol . El exemestano se comercia como AROMASI N ; el formestano como LENTARON ; el fadrozol como AFEMA; el anastrozol como ARIM I DEX; el letrozol como FEMARA o FEMAR; y la amino-glutetimida como ORI M ETEN . Una combinación de la invención que comprende, un agente farmacéuticamente activo que es un inhibidor de aromatasa, es particularmente útil para el tratamiento de los tumores positivos para el receptor de hormonas, por ejemplo los tumores de mama.

El término "anti-estrógeno", como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que antagoniza el efecto de los estrógenos al nivel del receptor de estrógeno . El término incluye, pero no se limita a, tamoxifeno, fulvestrant, raloxifeno, y clorhidrato de raloxifeno. El tamoxifeno se puede administrar en la forma como se comercia , por ejemplo NOLVADEX; y el clorhidrato de raloxifeno se comercia como EVISTA. El fulvestrant se puede formular como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,659 ,51 6, y se comercia como FASLODEX. Una combinación de la invención que comprende un agente farmacéuticamente activo que es un anti-estrógeno, es particularmente útil para el tratamiento de los tumores positivos por el receptor de estrógeno, por ejemplo tumores de mama . El término "anti-andrógeno", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sustancia que es capaz de inhibir los efectos biológicos de las hormonas androgénicas, e incluye, pero no se limita a, bicalutamida (CASODEX), que se puede formular, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,636,505. El término "agonista de gonadorelina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, abarelix, goserelina, y acetato de goserelina. La goserelina se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4, 1 00,274, y se comercia como ZOLADEX. El abarelix se puede formular, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,843,901 . El término "inhibidor de topoisomerasa I", como se utiliza en la presente incluye, pero no se limita a, topotecano, gimatecano, irinotecano, camptotecina y sus análogos, 9-nitro-camptotecina, y el conjugado de camptotecina macromolecular PN U-1 66148 (compuesto A1 de la Publicación Internacional Número WO 99/1 7804). El irinotecano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia , por ejemplo bajo la marca comercial registrada CAMPTOSAR. El topotecano se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo bajo la marca comercial registrada HYCAMTI N . El término "inhibidor de topoisomerasa I I", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a , las antraciclinas, tales como doxorrubicina, incluyendo la formulación liposomal , por ejemplo CAELYX, daunorrubicina, incluyendo la formulación liposomal , por ejemplo DAU NOSOM E, epirrubicina , idarrubicina, y nemorrubicina; las antraquinonas mitoxantrona y losoxantrona; y las podofilotoxinas etoposida y teniposida. La etoposida se comercia como ETOPHOS ; la teniposida como VM 26-BRISTOL; la doxorrubicina como ADRI BLASTI N o ADRIAMYCI N ; epirrubicina como FARMORUB I CI ; la idarrubicina como ZAVEDOS ; y la mitoxantrona como NOVANTRON . El término "agente activo en microtúbulos", como se utiliza en la presente, se refiere a los agentes estabilizantes de microtúbulos y desestabilizantes de microtúbulos, y a los inhibidores de la polimerización de microtubulina, incluyendo, pero no limitándose a, taxanos, por ejemplo paclitaxel y docetaxel ; alcaloides vinca, por ejemplo vinblastina, en especial sulfato de vinblastina; vincristina, en especial sulfato de vincristina, y vinorelbina; discodermolidas; colquicina y derivados de epotilona de la misma, por ejemplo epotilona B , o un derivado de la misma. Paclitaxel se comercia como TAXOL; docetaxel como TAXOTERE; el sulfato de vinblastina como VI NBLASTI N R. P. ; y el sulfato de vincristina como FARM ISTI N . También se incluyen las formas genéricas de paclitaxel , así como las diferentes formas de dosificación de paclitaxel . Las formas genéricas de paclitaxel incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de betaxolol . Las diferentes formas de dosificación de paclitaxel incluyen, pero no se limitan a, el paclitaxel en nanopartículas de albúmina comerciado como ABRAXAN E ; ONXOL, CYTOTAX, discodermolida se pueden obtener, por ejemplo, como se da a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,01 0,099. También se incluyen los derivados de epotilona que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 1 94, 1 81 , y en las Publicaciones Internacionales Números WO 98/1 0121 , WO 98/25929, WO 98/08849, WO 99/43653, WO 98/22461 y WO 00/31 247. Se prefieren en especial Epotilona A y/o B . El término "agente alquilante", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano, o nitrosourea (BCNU o Gliadel), o temozolamida (TEMODAR). La ciclofosfamida se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo bajo la marca comercial registrada CYCLOSTIN; y la ifosfamida como HOLOXAN. El término "anti-metabolito anti-neoplásico" incluye, pero no se limita a, 5-fluoro-uracilo (5-FU); capecitabina; gemcitabina; agentes desmetilantes del ADN, tales como 5-azacitidina y decitabina; metotrexato; edatrexato; y antagonistas de ácido fólico tales como, pero no limitándose a, pemetrexed. La capecitabina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo bajo la marca comercial registrada XELODA; la gemcitabina como GEMZAR. El término "compuesto de platina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, carboplatina, cisplatina, cisplatino, oxaliplatina, satraplatina, y agentes de platino tales como ZD0473. La carboplatina se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo CARBOPLAT; y la oxaliplatina como ELOXATIN. El término "compuestos que dirigen/reducen la actividad de una cinasa de proteína o de lípido; o la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido; u otros compuestos anti-angiogénicos; como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los inhibidores de cinasa de proteína tirosina y/o de cinasa de serina y/o treonina, o los inhibidores de cinasa de lípido, por ejemplo: i) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de VEGF, en especial los compuestos que inhiben al receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, tales como, pero no limitándose a, los derivados de 7H-pirrolo-[2,3-d]-pirimidina (AEE788); BAY 43-9006; los compuestos de isolcolina dados a conocer en la Publicación Internacional Número WO 00/09495, tales como (4-terbutil-fenil)-94-piridin-4-il-metil-isoquinolin-1 -il)-amina (AAL881); y ii) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de PDGFR, en especial los compuestos que inhiben al receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, por ejemplo un derivado de N-fenil-2-pirimidin-amina, por ejemplo imatinib, SU101, SU6668, y GFB-111; iii) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR); iv) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del receptor del factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1R), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del IGF-1R, en especial los compuestos que inhiben al receptor IGF-1R. Los compuestos incluyen, pero no se limitan a, los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/092599 y los derivados de los mismos de 4-amino-5-fenil-7-ciclobutil-pirrolo-[2,3-d]-pirimidina (AEW541); v) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasa de tirosina receptor Trk; vi) los compuestos que dirigen , reducen , o inhiben la actividad de la familia de cinasa de tirosina receptora Axl; vii) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad del receptor c-Met; viii) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la cinasa de tirosina receptora Ret; ¡x) los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la actividad de la cinasa de tirosina receptora Kit/SCFR; x) los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la actividad de las cinasas de tirosina receptoras C-kit (parte de la familia de PDGFR), tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de la cinasa de tirosina receptora c-Kit, en especial los compuestos que inhiben al receptor C-kit, por ejemplo imatinib; xi) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los miembros de la familia Abl y sus productos de fusión genética, por ejemplo la cinasa BCR-Abl , tales como los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de los miembros de la familia c-Abl y sus productos de fusión genética, por ejemplo un derivado de N-fenil-2-pirimidin-amina, por ejemplo imatinib, PD 1 80970, AG957, NSC 68041 0 ó PD1 73955 de ParkeDavis; BMS354825; xii) los compuestos que dirigen , reducen , o inhiben la actividad de los miembros de la cinasa C de proteína (PKC) y de la familia de cinasas de serina/treonina Raf, los miembros de la familia M EK, SRC, JAK, FAK, PDK, y Ras/MAPK, o la familia de cinasa Pl(3), o de la familia de cinasa relacionada con cinasa Pl(3), y/o los miembros de la familia de cinasa dependiente de ciclina (CDK), y son en especial derivados de estaurosporina que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,093,330, por ejemplo midostaurina. Los ejemplos de otros compuestos incluyen, por ejemplo, UCN-01 ; safingol; BAY 43-9006; Briostatina 1 ; Perifosina; llmofosina; RO 31 8220 y RO 320432 ; GO 6976; Isis 3521 ; LY333531 /LY3791 96; compuestos de isoquinolina, tales como los que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número WO 00/09495; FTIs; PD1 84352 ó QAN697 , un inhibidor de P 1 3K; xiii) los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la actividad de la cinasa de proteína tirosina, tales como mesilato de imatinib (GLEEVEC); tirfostina, o pirimidil-amino-benzamida y sus derivados (AMN 1 07). Una tirfostina de preferencia es un compuesto debajo peso molecular (Mr <1 500), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en especial un compuesto seleccionado a partir de la clase de benciliden-malonitrilo, o de la clase de compuestos de S-aril-bencen-malonitrilo o bisustrato de quinolina, más especialmente cualquier compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en Tirfostina A23/RG-5081 0, AG 99, Tirfostina AG 21 3, Tirfostina AG 1 748, Tirfostina AG 490, Tirfostina B44, enantiómero (+) de Tirfostina B44, Tirfostina AG 555, AG 494, Tirfostina AG 556; AG957, y adafostina (adamantil-éster del ácido 4-{[(2,5-dihidroxi-fenil )-metil]-amino}-benzo¡co, NSC 680410, adafostina); xiv) los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de la familia de cinasas de tirosina receptoras del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 como homo- o hetero-dímeros), tales como los compuestos que dirigen , reducen , o inhiben la actividad de la familia receptora del factor de crecimiento epidérmico, como son en especial los compuestos, proteínas, o anticuerpos que inhiben a los miembros de la familia de cinasa de tirosina receptora de EG F, por ejemplo, los receptores de EG F: ErBb2, ErbB3 y ErbB4. , o que se enlazan con EG F o con los ligandos relacionados con EGF , y son en particular los compuestos, proteínas, o anticuerpos monoclonales genérica y específicamente dados a conocer en la Publicación Internacional Número WO 97/02266, por ejemplo el compuesto del Ejemplo 39, o en las Patentes N úmeros EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722 , EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,747 ,498, WO 98/1 0767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983, y en especial WO 96/30347, por ejemplo el compuesto conocido como CP 358774, WO 96/33980, por ejemplo el compuesto ZD 1 839; y WO 95/03283, por ejemplo el compuesto ZM 1 051 80, por ejemplo trastuzumab ( H ERCEPTI N®), cetuximab, Iressa, OSI-774, Cl 1 033, EKB-569, GW-2016, E1 .1 , E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.1 1 , E6.3 ó E7.6.3, y los derivados de 7H-pirrolo-[2 ,3-d]-pirimidina que se dan a conocer en la Publicación I nternacional Número WO 03/01 3541 , erlotinib y gefitinib. El erlotinib se puede administrar en la forma como se comercia , por ejemplo TARCEVA, y el gefitinib como I RESSA; los anticuerpos monoclonales humanos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico, incluyendo ABX-EGFR; y xv) los compuestos que dirigen , reducen, o inhiben la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina son en especial los compuestos, proteínas, o anticuerpos que dirigen/inhiben a los miembros de la familia de cinasa mTOR, por ejemplo RAD, RAD001 , CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicina y sus derivados/análogos, AP23573 y AP23841 de Ariad , everolimus (CERTICAN ), y sirolimus. CERTI CAN (everolimus, RAD), un inhibidor de la señal de proliferación novedoso de investigación que impide la proliferación de las células-T y de las células de músculo liso vascular. Cuando se hace referencia a un anticuerpo, esto incluye los anticuerpos monoclonales intactos, nanocuerpos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de cuando menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biológica deseada. La frase "compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los inhibidores de fosfatasa 1 , fosfatasa 2A, PTEN ó CDC25, por ejemplo ácido ocadaico o un derivado del mismo.

El término "anticuerpos monoclonales", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, bevacizumab, cetuximab, trastuzumab, Ibritumomab tiuxetano, denosumab, anti-CD40, anti-GM-CSF, y tositumomab, y yodo I 1 31 . El bevacizumab se puede administrar en la forma como se comercia, por ejemplo AVASTI N; el cetuximab como ERBITUX; el trastuzumab como H ERCEPTI N ; el Rituximab como MABTHERA; el I britumomab tiuxetano como ZEVULI N ; el anti-RANKL como denosumab (AMG 1 62), el anti-CD40 como HCD122 (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2002-01 06371 ), y el tositumomab y yodo I 131 como BEXXAR. La frase "otros compuestos anti-angiogénicos" incluye, pero no se limita a, los compuestos que tienen otro mecanismo para su actividad , por ejemplo no relacionada con la inhibición de cinasa de proteína o de l ípido, por ejemplo talidomida (THALOM I D) y TN P-470.

La frase "compuestos que inducen los procesos de diferenciación celular", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ácido retinoico, a-, ?-, ó d-tocoferol, ó a-, ?-, ó d-tocotrienol . El término "inhibidor de ciclo-oxigenasa", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, por ejemplo, inhibidores de COX-2, ácido 2-aril-amino-fenil-acético sustituido por 5-alquilo y sus derivados, tales como celecoxib (CELEBREX), rofecoxib (VIOXX), etoricoxib, valdecoxib, o un ácido a 5-alquil-2-aril-amino-fenil-acético, por ejemplo ácido 5-metil-2-(2'-cloro-6'-fluoro-anilino)-fenil- acético, lumiracoxib. El término "bisfosfonatos", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, ácido etridónico, clodrónico, tiludrónico, pamidrónico, alendrónico, ibandrónico, risedrónico, y zoledrónico. El "ácido etridónico" se puede administrar, por ejemplo, en la forma como se comercia, por ejemplo DIDRONEL; el "ácido clodrónico" como BONEFOS; el "ácido tiludrónico" como SKELID; el "ácido pamidrónico" como AREDIA; el "ácido alendrónico" como FOSAMAX; el "ácido ibandrónico" como BONDRANAT; el "ácido risedrónico" como ACTONEL; y el "ácido zoledrónico" como ZOMETA. El término "inhibidor de heparanasa", como se utiliza en la presente, se refiere a los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la degradación del sulfato de heparina. El término incluye, pero no se limita a, Pl 88. El término "modificador de la respuesta biológica", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, linfocina o interferones, por ejemplo el interferón ?. El término "inhibidor de las isoformas oncogénicas Ras", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, H-Ras, K-Ras, o N-Ras, como se utiliza en la presente, y se refiere a los compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad oncogénica de Ras, por ejemplo un inhibidor de farnesil-transferasa (FTI), por ejemplo L-744832, DK8G557 ó R115777 (ZARNESTRA). El término "inhibidor de telomerasa", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la actividad de la telomerasa. Los compuestos que dirigen , reducen, o inhiben la actividad de la telomerasa son en especial los compuestos que inhiben al receptor de telomerasa, por ejemplo telomestatina. El término "inhibidor de la metaloproteinasa de matriz" o (inhibidor de MM P), como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los inhibidores peptidomiméticos y no peptidomiméticos de colágeno; los derivados de tetraciclina, por ejemplo el inhibidor peptidomimético de hidroxamato, batimastato; y su análogo oralmente biodisponible, marimastato (BB-2516), prinomastato (AG3340), metastato (NSC 683551 ), BMS 279251 , BAY 1 2-9566, TAA21 1 , M M I270B ó AAJ996. El término "amino-peptidasa de metionina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que dirigen , reducen , o inhiben la actividad de la amino-peptidasa de metionina . Los compuestos que dirigen , reducen , o inhiben la actividad de la amino-peptidasa de metionina son , por ejemplo, bengamida o un derivado de la misma. El término "inhibidores de proteasoma", como se utiliza en la presente, incluye los compuestos que dirigen , reducen , o inhiben la actividad del proteasoma. Los compuestos que dirigen , reducen , o inhiben la actividad del proteasoma incluyen, pero no se limitan a, PS-341 ; MLN 341 . bortezomib o Velcade. La frase "agente utilizado en el tratamiento de malignidades hematológicas", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a , los inhibidores de sintasa de tirosina tipo F S, por ejemplo los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la actividad de los receptores de cinasa de tirosina tipo FMS (F -3R); interferón , 1 -b-D-arabino-furanosil-citosina (ara-c), y bisulfano; y los inhibidores de ALK, por ejemplo los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la cinasa de linfoma anaplásico. La frase "compuestos que dirigen, reducen, o inhiben la actividad de Flt-3", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos, proteínas, o anticuerpos que inhiben Flt-3, por ejemplo N-benzoil-estaurosporina, midostaurina, un derivado de estaurosporina, SU 1 1 248 y M LN51 8. El término "inhibidores de HSP90" , como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que dirigen, reducen , o inhiben la actividad intrínseca de ATPasa del HSP90; que degradan , dirigen, reducen , o inhiben las proteínas cliente de HSP90 por medio de la senda del proteasoma de ubiquitina. Los compuestos que dirigen , reducen, o inhiben la actividad intrínseca de ATPasa del HSP90 son en especial los compuestos, proteínas, o anticuerpos que inhiben la actividad de ATPasa del HSP90, por ejemplo 1 7-alil-amino, 1 7-desmetoxi-geldanamicina ( 1 7-AAG), un derivado de geldanamicina; otros compuestos relacionados con geldanamicina; radicicol , e inhibidores de HDAC. El término "un anticuerpo anti-proliferativo", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, trastuzumab (HERCEPTIN), trastuzumab-DM 1 , erlotinib (TARCEVA), bevacizumab (AVASTI N ), rituximab (RITUXAN), PR064553 (anti-CD40), y anticuerpo 2C4. Anticuerpo significa, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de cuando menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. El término "inhibidor de HDAC", como se utiliza en la presente, se refiere a los compuestos que inhiben la desacetilasa de histona, y que poseen una actividad anti-proliferativa. Esto incluye, pero no se limita a, los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/22577, en especial N-hidroxi-3-[4-[[(2-hidroxi-etil)-[2-(1 H-indol-3-il)-etil]-amino]-metil]-fenil]-2E-2-propenamida, y N-hidroxi-3-[4-[[[2-(2-metil-1 H-indol-3-il )-etil]-amino]-metil]-fenil]-2E-2-propenamida, y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas (LBH589). Además, incluye en especial el ácido hidroxámico de suberoil-anilida (SAHA); el piridin-3-il-metil-éster del ácido [4-(2-amino-fenil-carbamoil)-bencil]-carbámico y sus derivados; ácido butírico; piroxamida, tricostatina A, Oxamflatina, apicidina, Depsipéptido; depudecina, y trapoxina. La frase "compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos, proteínas, o anticuerpos que dirigen/inhiben a los miembros de la familia de cinasa mTOR, por ejemplo RAD, RAD001, CCI-779, ABT578, SAR543, rapamicina, y sus derivados/análogos, AP23573 y AP23841 de Ariad, everolimus (CERTICAN), y sirolimus (RAPAMUNE), CCI-779 y ABT578. CERTICAN (everolimus, RAD), es un inhibidor de la señal de proliferación novedoso de investigación, que impide la proliferación de las células-T y de las células de músculo liso vascular. El término "antagonista del receptor de somatostatina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los agentes que dirigen, tratan, o inhiben al receptor de somatostatina, tales como octreorida y SOM230. El término "compuesto anti-leucémico", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, Ara-C, un análogo de pirimidina, que es el derivado de 2'-a-hidroxi-ribosa (arabinosida) de la desoxicitidina. También se incluye el análogo de purina de hipoxantina, 6-mercapto-purina (6-MP), y fosfato de fludarabina. La frase "planteamientos que dañan las células tumorales", se refiere a los planteamientos, tales como radiación ionizante. El término "radiación ionizante", referido anteriormente y más adelante en la presente, significa la radiación ionizante que se presenta como rayos electromagnéticos, tales como rayos-X y rayos gamma; o como partículas, tales como partículas alfa, beta, y gamma. La radiación ionizante se proporciona en, pero no se limita a, la terapia de radiación, y se conoce en este campo. Véase Hellman, Cáncer, 4a Edición, Volumen 1, Devita y colaboradores, Editores, páginas 248-275 (1993). El término "enlazador de EDG", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, una clase de inmunosupresores que modulan la recirculación de los linfocitos, tales como FTY720. El término "inhibidor de la reductasa de ribonucleótido", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, pirimidina o análogos de nucleósido de purina, incluyendo, pero no limitándose a, fludarabina y/o ara-C; 6-tioguanina; 5-FU ; cladribina; 6-mercapto-purina, en especial en combinación con ara-C contra la leucemia linfocítica aguda; y/o pentostatina. Los inhibidores de reductasa de ribonucleótido son en especial hidroxi-urea o los derivados de 2-hidroxi-1 H-isoindol-1 ,3-diona, tales como PL-1 , PL-2 , PL-3, PL-4, PL-5, PL-6, PL-7 ó PL 8. Véase Nandy y colaboradores, Acta Oncológica, Volumen 33, Número 8, páginas 953-961 ( 1 994). El término "inhibidores de la descarboxilasa de S-adenosil-metionina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,461 ,076. La frase "anticuerpos monoclonales de VEGF ó VEGFR" , como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los compuestos que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 98/35958, por ejemplo 1 -(4-cloro-anilino)-4-(4-piridil-metil )-ftalazina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, por ejemplo el succinato, o en las Patentes Números 00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/1 1 223, WO 00/2781 9 y EP 0 769 947; los descritos por Prewett y colaboradores, Cáncer Res, Volumen 59, página 5209-521 8 ( 1 999); Yuan y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 93, página 1 4765-14770 (1 996); Zhu y colaboradores, Cáncer Res, Volumen 58, páginas 3209-3214 ( 1 998); y Mordenti y colaboradores, Toxicol Pathol, Volumen 27, Número 1 , páginas 1 4-21 (1 999), en la Publicación I nternacional Número WO 00/37502 y en la Publicación I nternacional Número WO 94/1 0202; ANG I OSTATINA, descrita por O' Reilly y colaboradores, Cell, Volumen 79, páginas 31 5-328 (1994); ENDOSTATINA, descrita por O' Reilly y colaboradores, Cell, Volumen 88, páginas 277-285 ( 1 997); amidas del ácido antranílico; ZD41 90; ZD6474; SU541 6; SU6668; bevacizumab; o anticuerpos anti-VEGF, o anticuerpos anti-receptor de VEGF, por ejemplo rhuMAb y RH UFab; aptámero de VEGF, por ejemplo Macugon ; inhibidores de FLT-4; inhibidores de FLT-3; anticuerpo lgG1 de VEGFR-2; angiozima (RPI 4610); y Avastan . El término "terapia fotodinámica", como se utiliza en la presente, se refiere a la terapia que utiliza ciertos productos químicos conocidos como agentes fotosensibilizantes, para tratar o prevenir cánceres. Los ejemplos de la terapia fotodinámica incluyen , pero no se limitan a, el tratamiento con agentes, tales como, por ejemplo, VISUDYNE , y porfímero-sodio. El término "esteroide angiostático", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los agentes que bloquean o inhiben la angiogénesis, tales como, por ejemplo, anecortave, triamcinolona, hidrocortisona, 1 1 -a-epihidrocortisol , cortexolona, 1 7a-hidroxi-progesterona, corticosterona, desoxicorticosterona, testosterona, estrona, y dexametasona.

La frase "implante que contiene corticosteroides", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, agentes tales como, por ejemplo, fluocinolona y dexametasona . El término "antagonista del receptor AT1 ", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, los agentes tales como DIOVAN . El término "inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina", como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, CIBACEN , benazepril , enazepril (LOTENSIN), captopril , enalapril , fosinopril , lisinopril , moexipril , quinapril , ramipril , perindopril y trandolapril . Otros agentes farmacéuticamente activos incluyen, pero no se limitan a, alcaloides de plantas, agentes y antagonistas hormonales, modificadores de la respuesta biológica, de preferencia linfocinas o interferones, oligonucleótidos anti-sentido o derivados de oligonucleótidos; o agentes varios, o agentes con otro mecanismo de acción desconocido. En cada caso en donde se dan citas de solicitudes de patente o de publicaciones científicas, en particular con respecto a las reivindicaciones de los compuestos respectivos y a los productos finales de los ejemplos de procesamiento de las mismas, el asunto objeto de los productos finales, las preparaciones farmacéuticas, y las reivindicaciones, se incorporan a la presente solicitud por referencia a estas publicaciones. De la misma manera están comprendidos los estereoisómeros correspondientes, así como las modificaciones de cristal correspondientes, por ejemplo solvatos y polimorfos, que se den a conocer en las mismas. Los compuestos utilizados como ingredientes activos en las combinaciones que se dan a conocer en la presente, se pueden preparar y administrar como se describe en los documentos citados, respectivamente. La estructura de los agentes activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales, se puede tomar de la edición actual del compendio estándar "The Merck I ndex" o de las bases de datos, por ejemplo Patents International , por ejemplo IMS World Publications, o de las publicaciones mencionadas anteriormente y más adelante. El contenido correspondiente de las mismas se incorpora a la presente como referencia. Se entenderá que las referencias a los componentes (a) y (b) pretenden incluir también a las sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias activas. Si las sustancias activas comprendidas por los componentes (a) y/o (b) tienen, por ejemplo, cuando menos un centro básico, pueden formar sales de adición de ácido. También se pueden formar las sales de adición de ácido correspondientes que tengan , si se desea, un centro básico adicionalmente presente. Las sustancias activas que tengan un grupo ácido, por ejemplo COOH , pueden formar sales con bases. Las sustancias activas comprendidas en los componentes (a) y/o (b), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, también se pueden utilizar en la forma de un hidrato, o pueden incluir a otros solventes utilizados para la cristalización.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la prevención o el tratamiento de las enfermedades proliferativas o las enfermedades que sean desencadenas por una angiogénesis persistente en un mam ífero, de preferencia en un paciente humano, el cual comprende tratar al paciente de una manera concurrente o en secuencia con cantidades farmacéuticamente efectivas de una combinación de: (a) una composición antagonista de anticuerpo de c-Met; y (b) un agente farmacéuticamente activo . En una modalidad preferida la presente invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende: (a) una composición antagonista de anticuerpo de c-Met; y (b) uno o más agentes farmacéuticamente activos seleccionados a partir del grupo que consiste en un inhibidor de aromatasa; un anti-estrógeno; un anti-andrógeno; un agonista de gonadorelina; un inhibidor de topoisomerasa I ; un inhibidor de topoisomerasa I I ; un agente activo en microtúbulos; un agente alquilante; un anti-metabolito anti-neoplásico; un compuesto de platina; un compuesto que dirige/reduce la actividad de una cinasa de proteína o de lípido, o la actividad de una fosfatasa de proteína o de lípido; un compuesto anti-angiogénico; un compuesto que induce los procesos de diferenciación celular; anticuerpos monoclonales; un inhibidor de ciclo-oxigenasa; un bisfosfonato; un inhibidor de heparanasa ; un modificador de la respuesta biológica; un inhibidor de las isoformas oncogénicas Ras; un inhibidor de telomerasa; un inhibidor de proteasa; un inhibidor de metaloproteinasa de matriz; un inhibidor de amino-peptidasa de metionina; un inhibidor de proteasoma; agentes que dirigen, reducen , o inhiben la actividad de Flt-3; un inhibidor de HSP90; anticuerpos anti-proliferativos; un inhibidor de HDAC; un compuesto que dirige, reduce, o inhibe la actividad/función de la cinasa mTOR de serina/treonina; un antagonista del receptor de somatostatina; un compuesto antileucémico; planteamientos que dañan las células tumorales; un enlazador de EDG; un inhibidor de reductasa de ribonucleótido; un inhibidor de descarboxilasa de S-adenosil-metionina; un anticuerpo monoclonal de VEG F o de VEGFR; terapia fotodinámica; un esteroide angiostático; un implante que contiene corticosteroides; un antagonista del receptor AT1 ; y un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina. Cualquiera de las combinaciones de los componentes (a) y (b), el método de tratamiento de un animal de sangre caliente que comprende administrar estos dos componentes, una composición farmacéutica que comprende estos dos componentes para su uso simultáneo, separado, o en secuencia, el uso de la combinación para la demora del progreso o el tratamiento de una enfermedad proliferativa , o para la fabricación de una preparación farmacéutica para estos propósitos, o un producto comercial que comprende esta combinación de los componentes (a) y (b), todos como se mencionan o se definen anteriormente, serán referidos posteriormente también como un combinación de la invención (siempre que ese término se refiera a cada una de las modalidades que de esta manera puedan reemplazar a este término donde sea apropiado). La administración simultánea, por ejemplo, puede tener lugar en la forma de una combinación fija con dos o más ingredientes activos, o mediante la administración simultánea de dos o más ingredientes activos que se formulen de una manera independiente. El uso (administración) en secuencia de preferencia significa la administración de uno (o más) componentes de una combinación en un punto del tiempo, otros componentes en un punto del tiempo diferente, es decir, de una manera crónicamente escalonada, de preferencia de tal manera que la combinación muestre más eficiencia que los compuestos individuales administrados de una manera independiente (en especial , que muestre sinergismo). El uso (la administración) separado de preferencia significa la administración de los componentes de la combinación independientemente unos de otros en diferentes puntos del tiempo, de preferencia significando que los componentes (a) y (b) se administran de tal manera que no hay ningún traslape de los niveles en sangre mensurables de ambos compuestos presente, de una manera traslapada (al mismo tiempo). También , son posibles las combinaciones de dos o más de la administración en secuencia, separada, y simultánea, de preferencia de tal manera que los fármacos componentes de la combinación muestren un efecto terapéutico conjunto que exceda al efecto que se encuentra cuando los fármacos componentes de la combinación se utilizan de una manera independiente a intervalos de tiempo tan grandes que no se puede encontrar un efecto mutuo sobre su eficiencia terapéutica, prefiriéndose en especial un efecto sinérgico.

El término "demora de progreso", como se utiliza en la presente, significa la administración de la combinación a los pacientes que estén en una etapa previa o en una fase temprana de la primera manifestación o de una recurrencia de la enfermedad que se vaya a tratar, en cuyos pacientes, por ejemplo, se diagnostique una pre-forma de la enfermedad correspondiente, o cuyos pacientes estén en una condición , por ejemplo, durante un tratamiento médico o una condición resultante de un accidente, bajo la cual sea probable que se desarrolle una enfermedad correspondiente. "Conjuntamente activos terapéuticamente" o "efecto terapéutico conjunto", significa que los compuestos se pueden dar por separado (de una manera crónicamente escalonada, en especial de una manera específica de la secuencia), a intervalos de tiempo tales que de preferencia, en el animal de sangre caliente, en especial en el ser humano que se vaya a tratar, todavía muestren una interacción (de preferencia sinérgica) (efecto terapéutico conjunto). El hecho de que éste sea el caso, se puede determinar, entre otras cosas, siguiendo los niveles en sangre, mostrando que ambos compuestos están presentes en la sangre del ser humano que se va a tratar cuando menos durante ciertos intervalos de tiempo. "Farmacéuticamente efectiva" se refiere de preferencia a una cantidad que es terapéuticamente, o en sentido más amplio, también profilácticamente, efectiva contra el progreso de una enfermedad proliferativa. El término "un paquete comercial" o "un producto", como se utiliza en la presente, define en especial un "kit de partes" en el sentido de que los componentes (a) y (b), como se definen anteriormente, se pueden dosificar de una manera independiente, o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de los componentes (a) y (b), es decir, de una manera simultánea o en diferentes puntos del tiempo. Más aún, estos términos comprenden un paquete comercial que comprende (en especial que combina), como ingredientes activos, los componentes (a) y (b), junto con instrucciones para su uso simultáneo, en secuencia (crónicamente escalonados, en una secuencia específica en el tiempo, de preferencia), o (menos preferiblemente) separado, en la demora de progreso o el tratamiento de una enfermedad proliferativa. Entonces, las partes del kit de partes, por ejemplo, se pueden administrar de una manera simultánea o cronológicamente escalonada, es decir, en diferentes puntos del tiempo, y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. De una manera muy preferible, los intervalos de tiempo se seleccionan de tal manera que el efecto sobre la enfermedad tratada en el uso combinado de las partes, sea mayor que el efecto que se obtendría mediante el uso de solamente cualquiera de los componentes de combinación (a) y (b) (como pueda ser determinado de acuerdo con los métodos convencionales). La proporción de las cantidades totales del componente de combinación (a) al componente de combinación (b) que se van a administrar en la preparación combinada se puede variar, por ejemplo, con el objeto de tratar con las necesidades de una sub-población de pacientes que se vayan a tratar, o con las necesidades del paciente individual , cuyas diferentes necesidades pueden deberse a la enfermedad particular, la edad , sexo, peso corporal, etc. de los pacientes. De preferencia, existe cuando menos un efecto benéfico, por ejemplo una mejora mutua del efecto de los componentes de combinación (a) y (b), en particular un efecto más que aditivo, que, por consiguiente, se podría alcanzar con dosis más bajas de cada uno de los fármacos combinados, respectivamente, que lo tolerable en el caso del tratamiento con los fármacos individuales solamente sin combinación , produciendo efectos convenientes adicionales, por ejemplo menos efectos secundarios, o un efecto terapéutico combinado en una dosificación no efectiva de uno o ambos de los componentes de la combinación (a) y (b), y muy preferiblemente, un fuerte sinergismo de los componentes de combinación (a) y (b). Tanto en el caso del uso de la combinación de los componentes (a) y (b), como del paquete comercial , también es posible cualquier combinación de uso simultáneo, en secuencia, y separado, significando que los componentes (a) y (b) se pueden administrar en un punto del tiempo de una manera simultánea, seguido por la administración de solamente un componente con una toxicidad más baja para el huésped ya sea crónicamente, por ejemplo más de 3 a 4 semanas de dosificación diaria, en un tiempo posterior, y subsiguientemente el otro componente o la combinación de ambos componentes en un punto del tiempo todavía posterior (en los siguientes cursos de tratamiento de combinación de fármacos para un efecto anti-tumoral óptimo), o similares. La COMB I NACIÓN DE LA I NVENCIÓN también se puede aplicar en combinación con otros tratamientos, por ejemplo intervención quirúrgica, hipertermia, y/o terapia de irradiación . Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por medios convencionales, y son aquéllas adecuadas para administración enteral, tal como oral o rectal , y parenteral a mamíferos, incluyendo el hombre, comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de VEGF , y cuando menos un agente farmacéuticamente activo solo o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, en especial aquéllos adecuados para aplicación enteral o parenteral . Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente el 0.00002 a aproximadamente el 100 por ciento , en especial , por ejemplo, en el caso de las diluciones para infusión o que están listas para usarse, del 0.0001 al 0.02 por ciento, o, por ejemplo, en el caso de los concentrados para inyección o infusión , o en especial las formulaciones parenterales, de aproximadamente el 0.1 por ciento a aproximadamente el 95 por ciento, de preferencia de aproximadamente el 1 por ciento a aproximadamente el 90 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente el 20 por ciento a aproximadamente el 60 por ciento de ingrediente activo (peso por peso, en cada caso). Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención , por ejemplo, pueden estar en una forma de dosis unitaria, tal como en la forma de ampolletas, frascos, grageas, tabletas, bolsas para infusión , o cápsulas. La dosificación efectiva de cada uno de los componentes de combinación empleados en una formulación de la presente invención puede variar dependiendo del compuesto particular o de las composiciones farmacéuticas empleadas, del modo de administración, de la condición que se esté tratando , y de la severidad de la condición que se esté tratando. Un médico, cl ínico, o veterinario de una experiencia ordinaria, puede determinar fácilmente la cantidad efectiva de cada uno de los ingredientes activos, necesaria para prevenir, tratar, o inhibir el progreso de la condición . Las tirfostinas, en especial adafostina, de preferencia se administran a un animal de sangre caliente, en especial a un ser humano, en una dosificación en el intervalo de aproximadamente 1 a 6,000 miligramos/d ía, más preferiblemente de 25 a 5,000 miligramos/d ía, de una manera muy preferible de 50 a 4,000 miligramos/d ía. A menos que se informe de otra manera en la presente, el compuesto de preferencia se administra desde 1 a 5, en especial de 1 a 4 veces al d ía. Las preparaciones farmacéuticas para la terapia de combinación para administración enteral o parenteral son, por ejemplo, aquéllas que están en formas de dosificación unitaria, tales como tabletas recubiertas con azúcar, cápsulas, o supositorios, y adicionalmente ampolletas. Si no se indica de otra manera, estas formulaciones se preparan por medios convencionales, por ejemplo por medio de procesos convencionales de mezcla, granulación, recubrimiento con azúcar, disolución, o liofilización. Se apreciará que el contenido unitario de un componente de combinación contenido en una dosis individual de cada forma de dosificación no necesita por sí mismo constituir una cantidad efectiva, debido a que se puede alcanzar la cantidad efectiva necesaria mediante la administración de una pluralidad de unidades de dosificación . Un experto en la materia tiene la capacidad para determinar las cantidades farmacéuticamente efectivas apropiadas de los componentes de combinación. De preferencia, los compuestos o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se administran como una formulación farmacéutica oral , en la forma de una tableta, cápsula, o jarabe; o como inyecciones parenterales, si es apropiado. En la preparación de las composiciones para administración oral , se puede emplear cualquier medio farmacéuticamente aceptable, tal como agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen almidones, azúcares, celulosas microcristalinas, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes.

Las soluciones del ingrediente activo, y también las suspensiones, y en especial las soluciones o suspensiones acuosas ¡sotónicas, son útiles para administración parenteral del ingrediente activo, siendo posible, por ejemplo, en el caso de las composiciones liofilizadas, que comprendan al ingrediente activo solo o junto con un veh ículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo manitol , para las soluciones o suspensiones que se vayan a producir antes de usarse. Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservadores, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o reguladores del pH , y se preparan de una manera conocida por sí misma, por ejemplo por medio de procesos convencionales de disolución o liofilización. Las soluciones o suspensiones pueden comprender sustancias incrementadoras de viscosidad , tales como carboxi-metil-celulosa de sodio, carboxi-metil-celulosa, dextrano, polivinil-pirrolidona, o gelatina. Las suspensiones en aceite comprenden , como el componente de aceite, los aceites vegetales, sintéticos, o semi-sintéticos acostumbrados para propósitos de inyección . El agente isotónico se puede seleccionar a partir de cualquiera de aquéllos conocidos en la técnica, por ejemplo, manitol , dextrosa , glucosa, y cloruro de sodio. La formulación para infusión se puede diluir con el medio acuoso. La cantidad de medio acuoso empleado como un diluyente se selecciona de acuerdo con la concentración deseada del ingrediente activo en la solución para infusión . Las soluciones para infusión pueden contener otros excipientes comúnmente empleados en las formulaciones que se vayan a administrar intravenosamente, tales como antioxidantes. La presente invención se refiere además "una preparación combinada", la cual , como se utiliza en la presente, define en especial un "kit de partes", en el sentido de que los componentes de combinación (a) y (b), como se definen anteriormente, se pueden dosificar de una manera independiente, o mediante el uso de combinaciones fijas diferentes con cantidades distinguidas de los componentes de combinación (a) y (b), es decir, de una manera simultánea o en diferentes puntos del tiempo . Las partes del kit de partes, por ejemplo, se pueden administrar entonces de una manera simultánea o cronológicamente escalonada, es decir, en diferentes puntos del tiempo, y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. La proporción de las cantidades totales del componente de combinación (a) al componente de combinación (b) que se van a administrar en la preparación combinada puede variar, por ejemplo, con el objeto de tratar con las necesidades de una sub-población de pacientes que se vaya a tratar, o con las necesidades del paciente individual , basándose en la severidad de cualesquiera efectos secundarios que experimente el paciente. Usos y métodos de la invención Los anticuerpos (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la presente invención tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a las células en cultivo, por ejemplo, in vitro o in vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir, o diagnosticar una variedad de trastornos. El término "sujeto", como se utiliza en la presente, pretende incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen a todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, reses, caballos, pollos, y no mamíferos, tales como aves, anfibios, y reptiles. Los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tengan un trastorno asociado con una expresión aberrante de c-Met. Cuando los anticuerpos para c-Met se administran junto con otro agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o de una manera simultánea. En una modalidad , los anticuerpos (e inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) de la invención , se pueden utilizar para detectar los niveles de c-Met, o los niveles de células que contengan c-Met. Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (tal como una muestra in vitro), y una muestra de control , con el anticuerpo anti-c-Met, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y c-Met. Cualesquiera complejos formados entre el anticuerpo y c-Met se detectan y se comparan en la muestra y en el control . Por ejemplo, los métodos de detección convencionales, bien conocidos en este campo, tales como ELISA y ensayos de citometría de flujo, se pueden llevar a cabo utilizando las composiciones de la invención . De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona además métodos para detectar la presencia de c-Met (por ejemplo, el antígeno de c-Met humano) en una muestra , o para medir la cantidad de c-Met, los cuales comprenden poner en contacto la muestra, y una muestra de control , con un anticuerpo de la invención , o con una porción de enlace de antígeno del mismo, que se enlace específicamente con c-Met, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo o la porción del mismo, y c-Met. Entonces se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra comparada con la muestra de control indica la presencia de c-Met en la muestra. También dentro del alcance de la invención, están los kits que consisten en las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, anticuerpos humanos, inmunoconjugados, y moléculas biespecíficas) de la invención , e instrucciones para su uso . El kit puede contener además un reactivo adicional , o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que tenga una actividad complementaria que se enlace con un epítopo sobre el antígeno distinto del primer anticuerpo). Los kits típicamente incluyen una etiqueta que indica el uso pretendido del contenido del kit. El término "etiqueta" incluye cualquier escrito, o material registrado suministrado sobre o con el kit, o que acompaña de otra manera al kit.

Habiéndose descrito completamente la invención , se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos y Reivindicaciones, los cuales son ilustrativos y no pretenden ser adicionalmente limitantes. Los expertos en la técnica reconocerán y podrán aseverar, utilizando no más que la experimentación de rutina, numerosos equivalentes para los procedimientos específicos descritos en la presente. Estos equivalentes están dentro del alcance de la presente invención y de las Reivindicaciones. El contenido de todas las referencias, incluyendo las patentes expedidas y las solicitudes de patente publicadas, citadas a través de toda esta solicitud , se incorpora a la presente como referencia. Ejemplos Ejemplo 1 : Generación de anticuerpos específicos de c-Met humanos a partir de la biblioteca H uCAL GOLD®. Se generan anticuerpos terapéuticos contra la proteína c-Met humana mediante la selección de los clones que tengan altas afinidades de enlace, utilizando como la fuente del anticuerpo, las proteínas variantes de una biblioteca de exhibición de fagos comercialmente disponible, la biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®. HuCAL GOLD® es una biblioteca de Fab (Knappik y colaboradores, 2000 J. Mol. Biol. 296:57-86; Krebs y colaboradores, 2001 J. Immunol. Methods 254:67-84; Rauchenberger y colaboradores, 2003 J. Biol. Chem. 278(40):381 94-38205), en donde todas las regiones determinantes de complementariedad están diversificadas mediante mutaciones apropiadas, y que emplea la tecnología CysDisplayMR para enlazar los fragmentos Fab con la superficie del fago (Publicación I nternacional Número WO 01 /05950 Lóhning 2001 ). Procedimientos generales: rescate de fagémido. amplificación de fago, v purificación La biblioteca HuCAL GOLD® se amplifica en un medio bacteriano rico estándar (2xYT) que contiene 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol , y glucosa al 1 por ciento (2xYT-CG). Después de infectar las células a una OD6oonm de 0.5 con los fagos auxiliares VCSM 1 3 (incubando la mezcla de células y fagos durante 30 minutos a 37°C sin agitación, seguidos por 30 minutos a 37°C agitando a 250 revoluciones por minuto), las células se centrifugan (4, 1 20g ; 5 minutos; 4°C), se vuelven a suspender en 2xYT/34 microgramos/mililitro de cloranfenicol/50 microgramos/-mililitro de canamicina/IPTG 0.25 mM , y se cultivan durante la noche a 22°C. Al final de este período, las células se remueven mediante centrifugación , y los fagos se precipitan en PEG dos veces a partir del sobrenadante, se vuelven a suspender en suero regulado con fosfato/glicerol al 20 por ciento, y se almacenan a -80°C. La amplificación de fagos entre dos rondas de paneo se conduce como sigue: las células de la cepa TG 1 de E. coli en fase de medio registro, se infectan con los fagos que se eluyen en seguida de la selección con la proteína c-Met, y se aplican sobre LB-ágar complementado con el 1 por ciento de glucosa y 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol (placas de LB-CG). Después de la incubación durante la noche de las placas a 30°C, se raspan las colonias bacterianas de la superficie de ágar, y se utilizan para inocular el caldo 2xYT-CG con el objeto de obtener una OD600nm de 0.5, y luego se agregan los fagos auxiliares VCSM 1 3 para obtener una infección productiva como se describe anteriormente. Experimentos previos para el paneo en sol ución utilizando perlas magnéticas Strep-Tactin Se ha reportado que la marca Strep-tag I I tiene una baja afinidad para la matriz Strep-Tactin (KD ~ 1 µ? de acuerdo con Voss y Skerra, 1 997 Protein Eng . 1 0:975-982), y por consiguiente, se lleva a cabo un experimento previo para evaluar la idoneidad de utilizar las perlas MagStrep recubiertas con Strep-Tactin para la captura del antígeno durante las selecciones de anticuerpos, y para evitar la pérdida del antígeno durante los paneos. Para este propósito, se incuban 8 miligramos de perlas MagStrep con 46 microgramos de c-Met marcada con His-Strep durante 1 hora a temperatura ambiente, y la muestra se divide en cuatro tubos Eppendorf previamente bloqueados. Un tubo sirve como el control positivo (sin lavado), y las otras tres muestras se lavan con diferentes restringencias de acuerdo con la sección de paneo manual HuCAL GOLD®. La detección del enlace de c-Met marcada con His-Strep con las perlas MagStrep (perlas magnéticas recubiertas con Strep-Tactin obtenidas de I BA, Góttingen , Alemania) se lleva a cabo en BioVeris utilizando un anticuerpo de cabra anti-c-Met, y un anticuerpo de detección anti-cabra marcado con rubidio. Como se muestra en las figuras de la presente, no se puede detectar ninguna pérdida significativa de la c-Met marcada con His-Strep a partir de las perlas recubiertas con Strep-Tactin cuando se comparan las perlas no lavadas con las perlas lavadas con diferentes restringencias de HuCAL®. Por consiguiente, la c-Met marcada con His-Strep parece ser adecuada para utilizarse en los paneos en solución con las perlas magnéticas recubiertas con Strep-Tactin (perlas MagStrep). Selección mediante paneo de los anticuerpos específicos de c-Met a partir de la biblioteca Para la selección de los anticuerpos que reconocen la c-Met humana, se aplican dos estrategias de paneo. En términos generales, los fagos-anticuerpos HuCAL® se dividen en cuatro reservas que comprenden diferentes combinaciones de genes maestros VH (la reserva 1 contiene VH1/5 ??; la reserva 2 contiene VH3 ? ; la reserva 3 contiene VH2/4/6 ? ; y la reserva 4 contiene VH1-6 ? ). Estas reservan se someten individualmente a dos rondas de paneo en solución sobre la c-Met marcada con His-Strep capturada sobre células magnéticas Strep-Tactin (perlas Mega Strep; IBA), y para la tercera ronda de selección solamente, ya sea sobre la c-Met marcada con His-Strep capturada sobre células magnéticas Strep-Tactin, o bien sobre la proteína c-Met marcada con APP capturada por las perlas de estreptavidina (Dynabeads® M280 Estreptavidina; Dynal), con un anticuerpo anti-APP biotinilado. De una manera específica, para el paneo en solución utilizando la c-Met marcada con His-Strep acoplada con las perlas magnéticas Strep-Tactin , se aplica el siguiente protocolo: se preparan tubos previamente bloqueados (tubos Eppendorf de 1 .5 mililitros) mediante su tratamiento con 1 .5 mililitros de ChemiBLOCKER 2x diluido a 1 : 1 con suero regulado con fosfato durante la noche a 4°C. Las perlas previamente bloqueadas se preparan mediante el tratamiento como sigue: 580 microlitros (28 miligramos de perlas) de perlas magnéticas Strep-Tactin se lavan una vez con 580 microlitros de suero regulado con fosfato, y se vuelven a suspender en 580 microlitros de ChemiBLOCKER 1 x (diluido en un volumen de suero regulado con fosfato 1 x). El bloqueo de las perlas se lleva a cabo en los tubos previamente bloqueados durante la noche a 4°C. Las partículas de fago diluidas en suero regulado con fosfato hasta un volumen final de 500 microlitros para cada condición de paneo, se mezclan con 500 microlitros de ChemiBLOCKER 2x/Tween al 0.1 por ciento, y se mantienen durante 1 hora a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. La pre-adsorción de las partículas de fago para la remoción de Strep-Tactin o de los fagos de enlace de perlas, se lleva a cabo dos veces: se agregan 1 60 microlitros de perlas magnéticas Strep-Tactin bloqueadas (4 miligramos) a las partículas de fago bloqueadas, y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente en una rueda giratoria. Después de la separación de las perlas mediante un dispositivo magnético (Dynal M PC-E), se transfiere el sobrenadante de fago (aproximadamente 1 .1 mililitros) hasta un tubo de reacción bloqueado fresco, y se repite la pre-adsorción utilizando 1 60 microlitros de perlas bloqueadas durante 30 minutos. Entonces, se agrega la c-Met cada con His-Strep, ya sea en 400 nM o en 1 00 nM , a las partículas de fago bloqueadas, en un tubo de reacción de 1 .5 mililitros bloqueado fresco, y la mezcla se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Los complejos de fago-antígeno se capturan utilizando ya sea 320 microlitros o bien 1 60 microlitros de perlas magnéticas Strep-Tactin bloqueadas agregadas a las reservas de paneo de fagos 400 nM ó 100 nM , respectivamente, que luego se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Las partículas de fago enlazadas con las perlas magnéticas Strep-Tactin se recolectan nuevamente con el separador de partículas magnéticas. Luego las perlas se lavan siete veces con suero regulado con fosfato/Tween al 0.05 por ciento (PBST), seguido por lavado otras tres veces con suero regulado con fosfato solamente. La elución de las partículas de fago a partir de las perlas magnéticas Strep-Tactin se lleva a cabo mediante la adición de 200 microlitros de DTT 20 mM en Tris-HCI 1 0 mM , pH de 8.0, a cada tubo durante 1 0 minutos. El eluato se recolecta, y las perlas se lavan una vez con 200 microlitros de suero regulado con fosfato, y el eluato del suero regulado con fosfato se agrega al eluato de DTT. Esta muestra de eluato se utiliza para infectar 14 mililitros de un cultivo de TG-1 de E. coli, que se cultiva previamente hasta una OD6oonm de 0.6 a 0.8.

Después de la infección y de la subsiguiente centrifugación durante 10 minutos a 5,000 revoluciones por minuto, cada gránulo bacteriano se vuelve a suspender en 500 microlitros del medio 2xYT, se aplica sobre placas de ágar 2xYT-CG, y se incuba durante la noche a 30°C. A la mañana siguiente, se raspan las colonias resultantes de las placas, y se prepara el fago mediante rescate y amplificación como se describe anteriormente. La segunda ronda de paneos en solución sobre c-Met marcada con His-Strep, se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo de la primera ronda, excepto que se utilizan cantidades decrecientes de antígeno (50 nM y 10 nM), y se altera apropiadamente la restringencia del procedimiento de lavado. Se aplican dos estrategias de paneo diferentes para la tercera ronda de selección : la salida del fago amplificado de la segunda ronda de paneo se divide y se somete a dos condiciones de paneo diferentes. La primera mitad de la producción de fago se utiliza para la estrategia de paneo estándar sobre la c-Met marcada con His-Strep humana capturada sobre las perlas Strep-Tactin, como se describe anteriormente (las cantidades de antígeno son de 1 0 nM o de 1 nM , respectivamente). La segunda variación de paneo para la tercera ronda de selección se lleva a cabo sobre c-Met marcada con APP humana. La proteína c-Met marcada con APP en una concentración final de 50 nM o de 1 0 nM , se mezcla con 1 mililitro de las partículas de fago de la segunda ronda previamente limpiadas, y la mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora sobre una rueda giratoria. En paralelo, se incuban 8 miligramos de Dynabeads M-280 Estreptavidina (Dynal ) previamente bloqueadas, con 40 microgramos de anticuerpo de ratón anti-APP biotinilado durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria, seguido por dos pasos de lavado con PBST. Los complejos previamente formados consistentes en fagos-anticuerpos enlazados con c-Met marcada con APP, se capturan mediante las perlas magnéticas de Estreptavidina M-280 recubiertas con anti-APP durante 30 minutos a temperatura ambiente. La elución y amplificación del fago se llevan a cabo como se describe anteriormente. Subclonación y expresión de fragmentos Fab solubles Los insertos que codifican Fab de los fagémidos HuCAL GOLD® seleccionados se subclonan en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH (véanse las Figuras), con el objeto de facilitar la expresión rápida y eficiente de los Fabs solubles. Para este propósito, el ADN del plásmido de los clones seleccionados se digiere con las endonucleasas de enzimas de restricción Xba\ y EcoRI , separando de esta manera el inserto que codifica Fab (ompA-VLCL y phoA-Fd ). Este inserto se clona entonces en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH digerido por Xba\/EcoR\ . Las proteínas Fab se expresan a partir de este vector, y como resultado, llevan dos marcas c-terminales (FLAGM R y 6xHis, respectivamente) tanto para la detección como para la purificación .

M icroexpresión de anticuerpos HuCAL GOLD® en E. coli Con el objeto de obtener cantidades suficientes de proteína codificada por cada uno de los clones obtenidos anteriormente, se seleccionan colonias bacterianas individuales resistentes al cloranfenicol después de la subclonación de los Fabs seleccionados en el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH . Entonces cada una de estas colonias se utiliza para inocular los pozos de una placa de microtitulación estéril de 96 pozos, conteniendo cada pozo 1 00 microlitros del medio 23xYT-CG por pozo, y se cultivan las bacterias durante la noche a 37°C. Se transfiere una muestra (5 microlitros) de cada cultivo de TG-1 de E. coli a una placa de microtitulación de 96 pozos estéril fresca previamente llenada con 1 00 microlitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol y glucosa al 0.1 por ciento por pozo. Las placas de microtitulación se incuban a 30°C con agitación a 400 revoluciones por minuto sobre un agitador de microplacas, hasta que los cultivos quedan ligeramente turbios (de aproximadamente 2 a 4 horas) con una OD6oonm de aproximadamente 0.5. Para la expresión en el formato de estas placas, se agregan 20 microlitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol e I PTG 3 mM (isopropil- -D-tiogalactopiranosida) por pozo (concentración final de I PTG 0.5 mM ), las placas de microtitulación se sellan con una cinta permeable al gas, y se incuban durante la noche a 30°C, agitando a 400 revoluciones por minuto. Generación de Usados cel u lares enteros (extractos BEL) A cada pozo de las placas de expresión, se el agregan 40 microlitros de regulador BEL (BBS 2x/EDTA:24.7 gramos/litro de ácido bórico, 1 8.7 gramos de NaCI/litro, 1 .49 gramos de EDTA/litro, pH de 8.0) conteniendo 2.5 miligramos/mililitro de lisozima, y las placas se incuban durante 1 hora a 22°C sobre un agitador de placas de microtitulación (400 revoluciones por minuto). Los extractos BEL se utilizan para los análisis de enlace mediante FMAT (véase el Ejemplo 2). Expresión de las cantidades en microg ramos de los anticuerpos Fab H uCAL GOLD® en E. coli, y pu rificación La expresión de los fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_FH las células-F de TG-1 de E. coli, se lleva a cabo en tubos de plástico de 50 mililitros. Para este propósito, los pre-cultivos inoculados con los clones individuales se cultivan en el medio 2xYT-CG durante la noche a 30°C. A la mañana siguiente, se utilizan 50 microgramos de cada pre-cultivo para inocular 25 mililitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol , I PTG 1 mM , y glucosa al 0.1 por ciento en tubos de plástico estériles de 50 mililitros, y se incuban durante la noche a 30°C. Las células de E. coli se cosechan, los gránulos celulares se congelan , y finalmente se alteran con el Bug Buster (Novagen). Los fragmentos Fab se aislan utilizando Ni-NTA-Agarosa (Qiagen , Hilden, Alemania).

Expresión de cantidades en miligramos de los anticuerpos Fab HuCAL GOLD® en E. coli v purificación La expresión de los fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_FH en las células-F de TG-1 , se lleva a cabo en cultivos de matraz de agitación utilizando 750 mililitros del medio 2xYT complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol . Los cultivos se agitan a 30°C hasta que la OD600nm alcanza 0.5. La expresión se induce mediante la adición de I PTG 0.75 mM , seguida por incubación durante 20 horas a 30°C. Las células se alteran utilizando lisozima, y los fragmentos Fab se aislan mediante cromatografía de Ni-NAT (Qiagen, Hilden , Alemania). Las concentraciones de proteína se determinan mediante UV-espectrofotometría (Krebs y colaboradores, 2001 ). Ejemplo 2: Identificación de los anticuerpos H uCAL® específicos de c-Met Los extractos BEL de los clones de E. coli individuales seleccionados mediante las estrategias de paneo anteriormente mencionadas, se analizan mediante la Tecnolog ía de Ensayo de Microvolumen Fluorométrico (FMATM R, analizador de sistema de detección celular/8200, Applied Biosystems), para identificar los clones que codifican los Fabs específicos de c-Met. Análisis de enlace basado en la tecnología de ensayo de microvol umen fl uorométrico (FMAT). para la detección de los Fabs de enlace de c-Met a partir de los lisados bacterianos Para la detección de los anticuerpos Fab de enlace de c-Met a partir de los lisados de E. coli (extractos BEL), se analiza el enlace con el sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Para acoplar la c-Met marcada con His-Strep sobre las perlas M-450 Expoxy (Dynal), se transfiere una muestra de 300 microlitros de las perlas M450 Epoxy ( 1 .2 x 1 08 perlas) a un tubo de reacción , y se capturan con un separador de partículas magnético. El sobrenadante se remueve, y las perlas se lavan cuatro veces en 1 mililitro de regulador de fosfato de sodio 1 00 mM , pH de 7.4. Para el recubrimiento del antígeno, se agregan 60 microlitros de c-Met marcada con His-Strep a la suspensión de perlas en 1 50 microlitros de regulador de fosfato de sodio 1 00 mM , pH de 7.4. La suspensión de antígenos-perlas se incuba durante 1 6 horas a temperatura ambiente sobre una rueda giratoria. Las perlas recubiertas se lavan entonces tres veces con suero regulado con fosfato, y se vuelven a suspender en un volumen final de 250 microlitros de suero regulado con fosfato. Para cada placa de 384 pozos, se prepara una mezcla de 20 mililitros de suero regulado con fosfato conteniendo albúmina de suero bovino al 3 por ciento, Tween 20 al 0.005 por ciento, 4 microlitros de perlas recubiertas con c-Met ( 1 .9x1 06 perlas), y 4 microlitros de anticuerpo de detección Cy5M R. Se dosifica una muestra de 45 microlitros de esta solución por pozo, en una placa de fondo negro/transparente FMAT de 384 pozos (Applied Biosystems). Se agrega el extracto BEL que contiene el Fab (5 microlitros) a cada pozo. Las placas FMAT se incuban a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, las placas se analizan en el Sistema de Detección Celular 8200 (Applied Biosystems). Se obtienen clones positivos, y se analizan las secuencias de cadena pesada y ligera de los clones que producen señales específicas positivas en el FMAT. Se identifican los clones anti-c-Met únicos (no redundantes) que muestran un enlace suficientemente fuerte con la c-Met humana. Estos clones se expresan, se purifican , y se prueban para determinar su afinidad en los ensayos funcionales.

Determi nación de las afi nidades nanomolares utilizando resonancia de plasmón superficial Utilizando estos clones, se lleva a cabo el análisis SPR cinético en un chip CM5 (Biacore, Suecia), que se ha recubierto con una densidad de aproximadamente 400 RU de la c-Met humana recombinante, en acetato de sodio 1 0 mM , pH de 4.5, utilizando la química de acoplamiento de amina EDC-N HS estándar. Se inmoviliza una cantidad comparable de albúmina de suero humano (HSA) en la senda de flujo de referencia . Se utiliza suero regulado con fosfato (NaCI 1 36 mM , KCI 2.7 mM , Na2HP04 10 mM , KH2P04 1 .76 mM , pH de 7.4) como el regulador de ejecución . Las preparaciones de Fab se aplican en series de concentración de 1 6 a 500 nM , a una velocidad de flujo de 20 microlitros/minuto. La fase de asociación se establece en 60 segundos, y la fase de disociación en 120 segundos. En la Tabla 1 de la presente se muestra un resumen de las afinidades en nM con la c-Met humana.

Tabla 1 . Afi nidades de los Fabs seleccionados con la c-Met humana Ejemplo 3 : Análisis cuantitativo de las afin idades : Determinación de los Fab candidatos c-Met humana que se enlazan con la c-Met de longitud com pleta Determinación por afinidad Con el objeto de caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-c-Met, se determina la afinidad con la c-Met humana y de cinomolgo de longitud completa. Las células GTL16, CHO que sobreexpresan la c-Met de cinomolgo, o 4MBr-5 de Rhesus, se lavan, se tripsinizan , y se suspenden en suero regulado con fosfato conteniendo suero fetal de becerro al 3 por ciento (suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato) a 4°C. Se vuelven a suspender 2-5x1 05 células/muestra en 140 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato conteniendo 5 microgramos/mililitro de los FABS anti-c-Met purificados, o diluciones en serie de los mismos. COmo un control positivo, se utilizan 5 microgramos/mililitro de D024 ( lgG2a de ratón), anti-c-Met humana. Las células incuban durante 30 a 60 minutos a 4°C antes de granularse mediante centrifugación durante 2 minutos a 2,000 revoluciones por minuto (71 6 g) a 4°C, y se lavan en 200 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato helado . Las células nuevamente se granulan mediante centrifugación , y se remueve suavemente en suero regulado con fosfato. Las células se vuelven a suspender en 1 00 microlitros de conjugado de PE de cabra anti-lgG humana (H+L) (Jackson , Número de Catálogo 1 09-1 1 6-088), diluido a 1 :200 en suero fetal de becerro al 3 por ciento/NaN3 al 0.02 por ciento/suero regulado con fosfato. Para el control positivo, se utiliza el conjugado de PE de cabra anti-lgG de ratón (H + L) (Jackson , Número de Catálogo 1 1 5-1 1 6-1 46) diluido a 1 :200 en suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato. Las muestras se incuban en la oscuridad durante 30 a 60 minutos a 4°C. En seguida de la centrifugación y del lavado en 200 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/NaN3 al 0.02 por ciento/suero regulado con fosfato, las células se vuelven a suspender en 1 00 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato, y se ensayan utilizando el arreglo FACS o el FACS-Calibur.

Los datos de afinidad resumidos sobre la c-Met humana y de cinomolgo se muestran en la Tabla 2 de la presente. Los seis Fabs probados mostrados en la Tabla 2 tienen una afinidad con la c-Met humana debajo de 1 00 nM . Además, 9 clones producen anticuerpos con afinidades menores de 10 nM . En todos los casos probados, las afinidades para c-Met de cinomolgo y de ratón son casi idénticas a aquéllas para la c-Met humana.

Tabla 2. Datos de afinidad de los Fabs seleccionados sobre la c- Met humana, de Rhesus, y de ci nomolgo KD [nM] c-Met de KD [nM] c-Met KD [nM] c-Met cinomolgo Anticuerpo humana de Rhesus CHO-c-Met GTL-16 4MBr-5 cinomolgo 4536 0.4 0.5 0.1 4537 2.6 ND 0.1 4541 0.5 ND 0.1 4682 1 .2 0.3 0.3 4687 5.7 1 .1 1 .2 4690 1 .1 ND 0.1 Ejemplo 4: Producción de inmunoglobulinas HuCAL®. Conversión en el formato IgG La dimerización mediada por el anticuerpo puede dar como resultado una activación agonista de la actividad de la cinasa de tirosina c-Met. Por consiguiente, los Fabs seleccionados con base en la c-Met purificada en el enlace, se convierten hasta el formato IgG. Con el objeto de expresar la inmunoglobulina de longitud completa (Ig), los fragmentos de dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se subclonan a partir de los vectores de expresión de Fab pMORPH®X9_FH, ya sea en la serie de vector pMORPH®_h_lg o pMORPH®2_h_lg para la lgG1 humana y la lgG4 humana. Se utilizan las enzimas de restricción EcoR , Mfe\, y Blp\ para la subclonación del fragmento de dominio VH en pMORPH®_h_lgG1 y pMORPH®_h_lgG4. Se utilizan las enzimas de restricción Mfe\ y B/pl para la subclonación del fragmento de dominio VH en pMORPH®2_h_lgGf y pMORPH®2_h_lgG4. La subclonación del fragmento de dominio VL en pMORPH®_h_lgK y pMORPH®2_h_lgK se lleva a cabo utilizando los sitios EcoRV y BsiWI, mientras que la subclonación en pMORPH®_h_lgÁ y pMORPH®2_h_lgÁ2 se hace utilizando EcoRV y /-/pal. Expresión transitoria v purificación de la IgG humana Las células HEK293 se transfectan con una cantidad equimolar de los vectores de expresión de cadena pesada y ligera de IgG. En los días 4 ó 5 después de la transfección, se cosecha el sobrenadante del cultivo celular. Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8.0, y de la filtración estéril , la solución se somete a cromatografía en columna de proteína A estándar (Poros 20A, PE Biosystems). Conversión de los Fabs progenitores en los formatos lgG 1 e lgG4 En paralelo con el inicio de la maduración por afinidad , se clonan insertos en los vectores de expresión pMORPH®2_h_lgGf y pMORPH®2_h_lgG4. Se lleva a cabo la expresión a pequeña escala mediante la transfección transitoria de las células H EK293, y se purifican las inmunoglobulinas de longitud completa a partir del sobrenadante del cultivo celular. Identificación de los candidatos de IgG anti-c-Met humana gue modulan la proliferación dependiente de c-Met Los anticuerpos específicos de c-Met diferentes resultantes seleccionados a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®, se convierten entonces al formato IgG, y se prueban para determinar su potencia para inhibir la proliferación impulsada por HGF. Se evalúa la actividad funcional de cada uno de los clones seleccionados utilizando un ensayo de incorporación de BrdU después del estímulo con HG F de las células 4MBr-5. Las células 4MBr-5 se aplican a una densidad de 3x1 03 células por pozo, en un volumen total de 1 00 microlitros/pozo de F 1 2K de Ham complementado con suero bovino fetal al 1 0 por ciento , en placas tratadas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos (Costar, #361 0). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 2 horas, después de lo cual , se agregan 50 microlitros del medio que contiene el anticuerpo purificado que se va a probar. Como un control negativo para la falta de modulación , se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o regulador, a los pozos designados. Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 1 hora, después de lo cual , se agregan 50 microlitros del medio solo, o 50 microlitros conteniendo HGF (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 microgramos/microlitro a aproximadamente 50 nanogramos/-mililitro). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 72 horas, después de lo cual , se ensaya la incorporación de Brd U utilizando el ELISA de proliferación celular, ensayo de BrdU (Roche) Número de Catálogo 1 669 91 5. Dicho de una manera breve, se agregan 20 micromoles/pozo de solución de Brd U (#1 ), y las placas se incuban durante 22 horas a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5 por ciento. El medio se remueve suavemente, y la placa se seca durante 1 hora a 60°C. Se agregan 200 microlitros de FixDenat (solución #2), y las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La solución se remueve suavemente, y se agregan 1 00 microlitros/pozo de solución de procesamiento anti-Brd U . Las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 90 minutos. La solución se remueve suavemente, y los pozos se lavan tres veces con 250 microlitros de solución de lavado. La solución se remueve suavemente, y se miden 1 00 microlitros/pozo de solución de sustrato agregada a las placas a una A405 nM . Determinación de la ECsn Los datos que muestran la concentración efectiva para la inhibición del 50 por ciento de la proliferación estimulada por HGF para los clones de los anticuerpos que tienen la mayor afinidad para c-Met, se muestran en la Tabla 3 de la presente. Los datos muestran que las concentraciones EC50 efectivas están en el intervalo de 4 nM , con un valor medio entre 6 y 1 50 nM . Identificación de los candidatos de IgG anti-c-Met h umana que modulan la migración dependiente de c-Met Se ensaya la migración celular en respuesta al estímulo con HGF, utilizando células NCI-H441 en el ensayo de migración celular de 96 pozos 8 µ? de quimiotaxis QCMMR. Como se describe anteriormente, 24 horas antes del ensayo, las células se lavan dos veces con suero regulado con fosfato estéril , y se agotan en el DM EM que contiene suero bovino fetal al 1 por ciento a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento. Subsiguientemente, las células se tripsinizan y se vuelven a suspender a 1 .0x 1 06 células por mililitro, en la presencia de la concentración apropiada del anticuerpo purificado durante 30 minutos a 37°C. Como un control negativo para la falta de modulación , se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o regulador, a los pozos designados. Bajo condiciones estériles, se remueve la tapa de la placa de cámara de migración, y se agregan 1 50 microlitros de medio sin suero que contiene 50 nanogramos/mililitro de HGF (R&D Número de Catálogo 294-HGN ) a los pozos de la charola de alimentación (cámara inferior). Se agregan suavemente 100 microlitros de 5-1 0x1 04 células en DM EM en suero bovino fetal al 1 por ciento previamente incubado con el anticuerpo, a la cámara superior. La placa se cubre y se incuba durante 1 6 horas a 37°C en C02 al 4-6 por ciento. Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, se desechan las células/medio de la cámara superior, y la cámara se coloca en una charola de alimentación de 96 pozos, en donde se han agregado 1 50 microlitros/pozo de solución de desprendimiento de células previamente calentada. Las células se desalojan mediante incubación durante 30 minutos a 37°C con agitación periódica suave. Subsiguientemente, se agregan 50 microlitros del tinte CyQuant GR previamente diluido a cada pozo de la charola de alimentación . La placa se incuba durante 1 5 minutos a temperatura ambiente, y se transfieren 1 50 microlitros de la mezcla a una nueva placa de 96 pozos adecuada para la medición de fluorescencia, utilizando un conjunto de filtro de 480/520 nanómetros. Los datos que muestran la concentración efectiva para la inhibición del 50 por ciento de la migración estimulada por HGF para los clones de los anticuerpos que tienen la mayor afinidad para c-Met, se muestran en la Tabla 3 de la presente. Los datos muestran que las concentraciones EC50 efectivas están en el intervalo de 0.1 4 nM , con un valor medio de entre 0.27 y 0.61 nM .

Tabla 3. Concentración efectiva para la inhibición del 50 por ciento de los Fabs seleccionados Ejemplo 5: Maduración por afi nidad de los Fabs anti-c-Met seleccionados, mediante intercambio paralelo de los casetes LCDR3 y HCDR2. Para optimizar las afinidades de los anticuerpos descritos en la presente para c-Met, para una reserva de fragmentos Fab progenitores, se remueven la LCDR3, la estructura 4, y la región constante de las cadenas ligeras (405 pares de bases) de cada Fab progenitor, utilizando Bpl\ y Sph\ , y se reemplazan por un repertorio de LCDR3s diversificadas, junto con la estructura 4 y el dominio constante. Una muestra de 0.5 microgramos del vector de la reserva enlazadora se liga con un exceso molar de tres veces del fragmento del inserto que lleva las LCDR3s diversificadas. En un planteamiento similar, se diversifica la HCDR2 utilizando los sitios Xho\ y físsH I l , y se mantienen constantes las regiones de estructura de conexión . Con el objeto de aumentar la eficiencia de la clonación , la HCDR2 progenitora es reemplazada por una secuencia embutida de 590 pares de bases antes de la inserción del cásete de HCDR2 diversificado. Las mezclas de ligamiento de diferentes bibliotecas se electroporan en 4 mililitros de células TOP 1 0 F' de E. coli (Invitrogen, Carlsbad , CA, EUA), produciendo de 2x1 07 a 2x108 colonias independientes. La amplificación de las bibliotecas se lleva a cabo como se describe anteriormente (Rauchenberger y colaboradores, 2003 J. Biol. Chem. 278(40):381 94-38205). Para el control de calidad , se recogen aleatoriamente varios clones por biblioteca, y se secuencian (SequiServe, Vaterstetten , Alemania) utilizando los cebadores CFR84 (VL) y OCAL_Seq_Hp (VH ). Selección de candidatos para la maduración por afinidad Se seleccionan seis candidatos de maduración seleccionados ("Fabs progenitores") utilizando las siguientes propiedades: las afinidades con la c-Met humana menores de 1 0 nM , con una reactividad cruzada significativa con la c-Met de cinomolgo, EC50 menor de 250 nM , y niveles de expresión de Fab buenos a moderados en E. coli, y actividad en el formato IgG en los ensayos de proliferación y migración impulsadas por c-Met. Las propiedades de los fragmentos Fab seleccionados se proporcionan en la Tabla 4.

Tabla 4. Propiedades de los Fabs seleccionados Generación de bibliotecas de Fab seleccionadas para la maduración por afinidad Con objeto de obtener clones que tengan una mayor afinidad y actividad inhibidora de los anticuerpos anti-c-Met, los clones de Fab seleccionados mostrados en el Ejemplo anterior se someten a rondas adicionales de diversificación y selección, un proceso conocido como maduración por afinidad. Para este propósito, las regiones CDR se diversifican utilizando los casetes de maduración LCDR3 y HCDR2 correspondientes previamente construidos mediante mutagénesis de trinucleótidos (Virnekás y colaboradores, 1994 Nucleic Acids Res. 22:5600-5607; Nagy y colaboradores, 2002 Nature Medicine 8:801- 807). Los fragmentos Fab a partir del vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH se subclonan en el vector de fagémido pMORPH®25 (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,753, 1 36). Este vector proporciona la proteína de fago pl l l fusionada N-terminalmente con un residuo de cisteína , así como una cisteína C-terminal con la cadena de anticuerpo Fd , y por lo tanto, permite la exhibición enlazada con disulfuro de los fragmentos Fab respectivos sobre la superficie del fago. Se aplican dos estrategias diferentes en paralelo para optimizar tanto la afinidad como la eficiencia de los Fabs progenitores. Se generan cinco bibliotecas de Fab de anticuerpos de fagos, en donde la LCDR3 de 5 de los 6 clones progenitores es reemplazada por un repertorio de secuencias CDR3 de cadena ligera individuales. (La maduración de LCDR3 del clon no se lleva a cabo, debido a que este clon tiene un sitio de restricción Bpl l adicional en una de las regiones CDR, y se utiliza la enzima de restricción fíp/l para el procedimiento de clonación de la biblioteca). En paralelo , la región HCDR2 de cada clon progenitor es reemplazada por un repertorio de secuencias CDR2 de cadena pesada individuales. Cada Fab progenitor se separa y es reemplazado por un embutido de 590 pares de bases. Este embutido de ADN facilita la separación de las bandas de vector individualmente digeridas de las doblemente digeridas, y reduce el fondo de los Fabs progenitores de alta afinidad durante los paneos de maduración. En el siguiente paso, se separa el embutido de los plásmidos que codifican Fab de cada clon progenitor, y es reemplazado por el cásete de maduración HCDR2 altamente diversificado. Se generan grandes bibliotecas de maduración por afinidad de más de 2x107 miembros mediante procedimientos de clonación convencionales, y los clones diversificados se transforman en las células TOP10 F' de E. coli electro-competentes (Invitrogen). Los fagos presentadores de Fab se preparan como se describe anteriormente. Se construyen reservas de maduración con el objeto de facilitar el siguiente proceso de selección: la reserva 1a consiste en las bibliotecas LCDR3-1; la reserva 1b consiste en las bibliotecas HCDR2-1. La reserva 2a consiste en las bibliotecas LCDR3-2; y la reserva 2b consiste en las bibliotecas HCDR2-2. Para cada reserva, se lleva a cabo el paneo en solución, utilizando cantidades decrecientes de c-Met marcado con His-Strep y fago-antígeno capturado por las perlas Strep-Tactin. En paralelo, cada reserva se aplica en los paneos utilizando cantidades decrecientes de c-Met biotinilada, que se captura sobre las placas recubiertas con neutravidina. Con el objeto de aumentar la restringencia del paneo, y de seleccionar índices de desactivación mejorados, se lleva a cabo la competencia con los Fabs progenitores purificados, así como con el antígeno no marcado, durante períodos de incubación prolongados. I nmediatamente después del paneo, las reservas de fagémidos enriquecidos se subclonan en el vector de expresión pMORPH®X9_FH . Se recogen los clones individuales, y se induce la expresión de los genes en los Fabs con IPTG . Estrategias de paneo de mad uración Los procedimientos de paneo utilizando las cuatro reservas de anticuerpo se llevan a cabo con c-Met marcada con His-Strep, y con c-Met marcada con His-Strep biotinilada en solución para dos o tres rondas, respectivamente. Por cada una de las estrategias de paneo, se utiliza competencia con las proteínas Fab progenitoras purificadas, o con la c-Met marcada con APP no etiquetada, así como bajas concentraciones de antígeno y extenso lavado, para aumentar la restringencia . El paneo en solución sobre la c-Met marcada con His-Strep no etiquetada se lleva a cabo en dos rondas de selección , principalmente de acuerdo con el protocolo convencional descrito en el Ejemplo 1 . Las excepciones a estos procedimientos son la aplicación de cantidades reducidas de antígeno (que disminuyen desde 5 nM bajando hasta 1 nM ), la alta restringencia del procedimiento de lavado ya sea con competidor o sin él , y los períodos de incubación prolongados de los anticuerpos-fagos junto con el antígeno . Para la pri mera ronda de selección utilizando la c-Met biotinilada, los pozos de una placa de neutravidina se lavan dos veces con 300 microlitros de suero regulado con fosfato. Los pozos se bloquean con ChemiBLOCKER 2x (Chemicon , Temecula, CA) diluido a 1 : 1 en suero regulado con fosfato (regulador de bloqueo). Antes de las selecciones, los fagos HuCAL GOLD® también se bloquean con un volumen de regulador de bloqueo conteniendo Tween 20 al 0.1 por ciento durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las preparaciones de fagos bloqueados se transfieren en al ícuotas de 1 00 microlitros a los pozos de una placa recubierta con neutravidina durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este paso de pre-adsorción se repite una vez. Las preparaciones de fagos bloqueados y previamente limpiados se incuban con c-Met biotinilada 5 mM durante 2 horas a 22°C sobre una rueda giratoria. Se agrega una muestra que contiene el Fab progenitor y APP-c-Met, o un control positivo que no contiene competidor, y las muestras se incuban durante la noche a 4°C sobre una rueda giratoria. Los complejos de antígenos-fagos se capturan en los pozos de una placa de neutravidina durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de extensos pasos de lavado, se eluyen las partículas de fago enlazadas mediante la adición de 200 microlitros de DTT 20 mM en Tris 1 0 mM , pH de 8.0, por pozo, durante 1 0 minutos a temperatura ambiente. El eluato se remueve y se agrega a 14 mililitros de células TG1 de £. coli cultivadas hasta una OD600nm de 0.6 a 0.8. Los pozos se enjuagan una vez con 200 microlitros de suero regulado con fosfato, y esta solución también se agrega a las células TG 1 de E. coli. Se permite la infección con el fago de E. coli durante 45 minutos a 37°C sin agitación. Después de la centrifugación durante 1 0 minutos a 5,000 revoluciones por minuto, los gránulos bacterianos se vuelven a suspender cada uno en 500 microlitros del medio 2xYT, se aplican sobre placas de ágar 2xYT-CG , y se incuban durante la noche a 30°C. Las colonias se cosechan mediante raspado de la superficie de las placas, y las partículas de fago se rescatan y se amplifican como se describe anteriormente. La segunda y tercera rondas de selección se llevan a cabo como se describe en lo anterior para la primera ronda de selección, excepto que las condiciones de lavado son más restringentes, y las concentraciones de antígeno son de 1 y 0.1 nM , respectivamente. Análisis de enlace basado en electroquimiluminiscencia (BioVeris) de los Fabs de enlace de c-Met Para la detección de los fragmentos de anticuerpo específicos de c-Met de mejor afinidad en los lisados de E. coli (extractos BEL), se utiliza una estación de trabajo BioVeris M-384 SERIES® Workstation (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido). El ensayo se lleva a cabo en placas de microtitulación de polipropileno de 96 pozos, y con suero regulado con fosfato complementado con albúmina de suero bovino al 0.5 por ciento y Tween 20 al 0.02 por ciento como el regulador de ensayo. La c-Met humana biotinilada se inmoviliza sobre perlas paramagnéticas de estreptavidina M-280 (Dynal) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se agrega una dilución de 1 :25 de la solución de suministro de perlas por pozo. Las muestras de 100 microlitros de extracto BEL diluido y perlas se incuban durante la noche a temperatura ambiente sobre un agitador. Para la detección , se utiliza el (Fab)'2 anti-humano (Dianova) marcado con BV-tag de acuerdo con las instrucciones del proveedor (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido). Se analiza un conjunto de clones aleatoriamente recogidos mediante el método descrito anteriormente. Se selecciona un subconjunto de estos clones que dan los valores más altos, para un análisis adicional en una titulación en equilibrio de solución. Determinación de las afinidades picomolares utilizando la titulación en equilibrio de solución (SET) Para la determinación de la KD, se utilizan fracciones de monómeros (cuando menos un contenido de monómero del 90 por ciento, analizado mediante SEC anal ítica; Superdex75, Amersham Pharmacia) de Fab. La determinación por afinidad basada en electroquimiluminiscencia (ECL) en solución, y la evaluación de los datos, se llevan a cabo básicamente como es descrito por Haenel y colaboradores, 2005. Se equilibra una cantidad constante de Fab con diferentes concentraciones (3n diluciones en serie) de la c-Met humana (concentración inicial de 4 nM ) en solución. Se agrega la c-Met humana biotinilada acoplada con perlas paramagnéticas (Estreptavidina M-280, Dynal), y el (Fab)'2 anti-humano marcado con BV-tag R (BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, Reino Unido) (Dianova), y la mezcla se incuba durante 30 minutos. Subsiguientemente, se cuantifica la concentración del Fab no enlazado mediante detección de electroquimiluminiscencia, utilizando el analizador M-SERI ES® 384 (BioVeris Europe). Para este propósito, se seleccionan los clones individuales, y se purifican mediante Ni-NTA-agarosa en la escala de microgramos.

Las afinidades preliminares se determinan mediante titulación en equilibrio de solución de cuatro puntos (SET) en el BioVeris. A partir de estos datos, se seleccionan los clones que muestran afinidades.

Estos Fabs se purifican en la escala de miligramos. Las afinidades finales se determinan a partir de dos lotes independientes de cada clon de Fab utilizando una medición de titulación en equilibrio de solución de ocho puntos, y la c-Met humana, de ratón , y de cinomolgo. La determinación por afinidad para la c-Met de ratón y de cinomolgo se hace esencialmente como se describe anteriormente, utilizando la c-Met de ratón (R&D Systems) y la c-Met de cinomolgo como el analito en solución , en lugar de la c-Met humana. Para la detección del Fab libre, se utiliza la c-Met humana biotinilada acoplada con perlas paramagnéticas. Las afinidades se calculan de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en este campo, por ejemplo, Haenel y colaboradores, 2005 Anal. Biochem. 339.1 : 1 82-1 84. Utilizando las condiciones de ensayo descritas anteriormente, se determinan las afinidades para los Fabs anti-c-Met optimizados por afinidad en solución . Las afinidades se determinan para los anticuerpos con KDs debajo de 4.6 pM para la c-Met humana. Se lleva a cabo el análisis basado en FACs del enlace con c-Met de cinomolgo expresada en células CHO, como se describe en anterior. Las afinidades se resumen en la Tabla 5 de la presente.

Tabla 5. Afinidades de Fabs Ejemplo 6: Caracterización de los Fabs anti-c-Met h umana optimizados por afinidad. Técnicas de saturación FACS Se determina la especificidad de enlace de los Fabs maduros en la presencia de suero humano al 50 por ciento (HS). Se incuban diluciones en serie de los Fabs anti-c-Met optimizados en la presencia de suero humano al 50 por ciento, o bien en la presencia de albúmina de suero bovino al 2.8 por ciento. Se evalúa el enlace de saturación de FACS con las células GTL-1 6. Las células GTL-1 6 se lavan , se tripsinizan , y se suspenden en suero regulado con fosfato conteniendo suero fetal de becerro al 3 por ciento (suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato) a 4°C. Las 2-5x1 05 células/muestra se vuelven a suspender en 1 40 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato conteniendo 5 microgramos/mililitro de Fabs anti-c-Met optimizados purificados, o diluciones en serie de los mismos. Como un control positivo, se utilizan 5 microgramos/mililitro de D024 (lgG2a de ratón), anti-c-Met humana. Las células se incuban durante 30 a 60 minutos a 4°C, antes de granularse mediante centrifugación durante 2 minutos a 2,000 revoluciones por minuto (71 6g) a 4°C, y se lavan en 200 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato helado. Las células se granulan nuevamente mediante centrifugación , y se remueve suavemente el suero regulado con fosfato. Las células se vuelven a suspender en 1 00 microlitros de conjugado de PE de cabra anti-lgG humana (H + L) (Jackson , Número de Catálogo 1 09-1 1 6-088) diluido a 1 :200 en suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato. Para el control positivo, se utiliza el conjugado de PE de cabra anti-lgG de ratón de control positivo (H + L) (Jackson, Número de Catálogo 1 1 5-1 1 6-1 46) diluido a 1 :200 en suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato. Las muestras se incuban en la oscuridad durante 30 a 60 minutos a 4°C. En seguida de la centrifugación y del lavado en 200 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato, las células se vuelven a suspender en 1 00 microlitros de suero fetal de becerro al 3 por ciento/suero regulado con fosfato, y se ensayan utilizando el arreglo FACS , o el FACS-Calibur. En la Tabla 6 se muestran las curvas de enlace de ejemplo, la cual resumen la actividad de enlace de los Fabs anti-c-Met optimizados en la presencia de suero humano al 50 por ciento, comparándose con la actividad de enlace en albúmina de suero bovino al 2.8 por ciento, que está en el intervalo del 83.3 por ciento al 1 00 por ciento. Se encuentra que el valor medio es del 90.2 por ciento, y por lo tanto, se encuentra que los Fabs anti-c-Met se enlazan completamente con el objetivo en la presencia de suero humano. Tabla 6. Actividad de enlace de los Fabs *EI enlace del 51 85 no se analiza todavía en términos de la EC50, debido a que no se alcanza l a saturación . Conversión de los Fabs candidatos anti-c-Met optimizados en el formato IqG La dimerización mediada por el anticuerpo puede dar como resultado una activación agonista de la actividad de la cinasa de tirosina c-Met. Por consiguiente, los Fabs optimizados, seleccionados con base en la c-Met purificada en el enlace, se convierten al formato IgG . Con el objeto de expresar la inmunoglobulina (Ig) de longitud completa, se subclonan los fragmentos de dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) de los vectores de expresión de Fab pMORPH®X9_FH , ya sea en la serie de vectores pMORPH®_h_l g o pMORPH®2_h_l g para la lgG1 humana y la lgG4 humana. Se utilizan las enzimas de restricción EcoRI , Mfel , y Blp\ , para la subclonación del fragmento del dominio VH en pMORPH®_h_lgG 1 y pMORPH®_h_lgG4. Se utilizan las enzimas de restricción Mfe\ y B/p l para la subclonación del fragmento del dominio VH en pMORPH®2_h_lgG1 f y pMORPH®2_h_lgG4. La subclonación del fragmento del dominio VL en pMORPH®_h_l g y pMORPH®2_h_ l g se lleva a cabo utilizando los sitios EcoRV y Bc/WI , mientras que la subclonación en pMORPH®_h_lgA y pMORPH®2_h_lgA2 se hace utilizando EcoRV y Hpa\ . Expresión transitoria v purificación de la IqG humana Las células HEK293 se transfectan con una cantidad equimolar de vectores de expresión de cadena pesada y ligera de IgG . En los días 4 ó 5 después de la transfección, se cosecha el sobrenadante del cultivo celular. Después de ajustar el pH del sobrenadante a 8.0, y de la filtración estéril, la solución se somete a cromatografía en columna de proteína A estándar (Poros 20A, PE Biosystems). Identificación de los candidatos de IgG anti-c-Met humana optimizados q ue modulan la proliferación depend iente de c-Met Los anticuerpos específicos de c-Met optimizados resultantes seleccionados a partir de la biblioteca HuCAL GOLD®, se convierten entonces al formato IgG, y se prueban para determinar su potencia para inhibir la proliferación impulsada por HGF. Se evalúa la actividad funcional de cada uno de los clones seleccionados utilizando un ensayo de incorporación de BrdU después del estímulo con HG F de las células 4MBr-5. Las células 4MBr-5 se aplican a una densidad de 3x1 03 células por pozo, en un volumen total de 1 00 microlitros/pozo de F12K de Ham complementado con suero bovino fetal al 1 0 por ciento en placas tratadas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos (Costar, #361 0). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 2 horas, después de lo cual , se agregan 50 microlitros del medio conteniendo el anticuerpo purificado que se va a probar. Como un control negativo para la falta de modulación, se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o regulador, a los pozos designados. Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 1 hora, después de lo cual , se agregan 50 microlitros del medio solo, o 50 microlitros conteniendo HGF (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 microgramos/microlitro a aproximadamente 50 nanogramos/-mililitro). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 72 horas, después de lo cual , se ensaya la incorporación de Brd U utilizando el ELISA de proliferación celular, ensayo de Brd U ( Roche), catálogo Número 1 669 91 5. Dicho de una manera breve, se agregan 20 micromoles/pozo de solución de Brd U (#1 ), y las placas se incuban durante 22 horas a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento . Se remueve suavemente el medio, y la placa se seca durante 1 hora a 60°C. Se agregan 200 microlitros de FixDenat (Solución #2), y las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 30 minutos. La solución se remueve suavemente, y se agregan 5 litros/pozo de solución de procesamiento anti-BrdU . Las placas se incuban a temperatura ambiente con agitación suave durante 90 minutos. La solución se remueve suavemente, y los pozos se lavan tres veces con 250 microlitros de solución de lavado. La solución se remueve suavemente, y se miden 1 00 microlitros/pozo de solución de sustrato agregada a las placas a una A405 nM . Determi nación de la ECsn Los datos que muestran la concentración efectiva para la inhibición del 50 por ciento de la proliferación estimulada por HGF para los clones de los anticuerpos que tienen la mayor afinidad para c-Met, se muestran en la Tabla 7 de la presente. Los datos muestran que las concentraciones EC50 efectivas están en el intervalo de 0.3 nM , con un valor medio de entre 0.5 nM y 1 .3 nM .

Tabla 7. Actividad in hibidora de los candidatos anti-c-Met utilizados en la formación de IgG sobre la prol iferación estimulada por HGF Técnicas de ensayo i nmunosorbentes enlazado con enzimas (ELISA) Se determina la especificidad de enlace de los Fabs maduros en la presencia de suero humano al 50 por ciento (HS). Las diluciones en serie del anticuerpo biotinilado recombinante humano en TBS se recubren sobre placas de microtitulación de neutravidina durante 2 horas a temperatura ambiente, a partir de 8 nanogramos de anticuerpo por pozo hasta una concentración de 125 nanogramos de anticuerpo por pozo. Después del recubrimiento del antígeno, los pozos se bloquean con TBS/Tween al 0.05 por ciento (TBS-T) complementado con albúmina de suero bovino al 1 por ciento durante 1 hora a temperatura ambiente. Los Fabs purificados descritos anteriormente se diluyen ya sea en TBS/albúmina de suero bovino al 4 por ciento, o bien en TBS/HS al 50 por ciento, a una concentración final de 1 microgramo/mililitro, se agrega a los pozos recubiertos y bloqueados, y las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la detección, se utiliza un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP) anti-FLAG(dilución a 1:5000 en TBST), y el sustrato fluorogénico AttoPhos (Roche). Después de cada incubación, los pozos de las placas de microtitulación se lavan con TBST cinco veces, excepto después del paso de incubación final, con el anticuerpo secundario marcado, cuando los pozos se lavan tres veces. La fluorescencia se mide en un lector de placas TECAN Spectrafluor. Identificación de los candidatos de IgG anti-c-Met humana que modulan la migración dependiente de c-Met Se ensaya la migración celular en respuesta al estímulo con HGF utilizando células NCI-H441 en el ensayo de migración celular de 96 pozos 8 µ? de quimiotaxis QCM R. Como se describe anteriormente, 24 horas antes del ensayo, las células se lavan dos veces con suero regulado con fosfato estéril, y se agotan en el D EM conteniendo suero bovino fetal al 1 por ciento a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento. Subsiguientemente, las células se tripsinizan y se vuelven a suspender a 1 .0x1 06 células por mililitro, en la presencia de la concentración apropiada del anticuerpo purificado durante 30 minutos a 37°C. Como un control negativo para la falta de modulación , se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o regulador, a los pozos designados. Bajo condiciones estériles, se remueve la tapa de la placa de la cámara de migración, y se agregan 1 50 microlitros del medio sin suero que contiene 50 nanogramos/mililitro de HGF (R&D Número de Catálogo 294-HGN ) a los pozos de la charola de alimentación (cámara inferior). Se agregan suavemente 1 00 microlitros de 5-10x104 células en DMEM con suero bovino fetal al 1 por ciento , previamente incubadas con el anticuerpo, a la cámara superior. La placa se cubre y se incuba durante 1 6 horas a 37°C en C02 al 4-6 por ciento. Siguiendo las instrucciones de los fabricantes, las células/medio de la cámara superior se desechan, y la cámara se coloca en una charola de alimentación de 96 pozos, en donde se han agregado 1 50 microlitros/pozo de solución de desprendimiento de células previamente calentada. Las células se desalojan mediante incubación durante 30 minutos a 37°C, con agitación suave periódica . Subsiguientemente, se agregan 50 microlitros del tinte CyQuant GR previamente diluido a cada pozo de la charola de alimentación . La placa se incuba durante 1 5 minutos a temperatura ambiente, y se transfieren 1 50microlitros de la mezcla a una nueva placa de 96 pozos adecuada para la medición de la fluorescencia, utilizando un conjunto de filtro de 480/520 nanómetros. Los datos que muestran la concentración efectiva para la 5 inhibición del 50 por ciento de la migración estimulada por HGF para los clones de los anticuerpos que tienen la mayor afinidad para c- Met, se muestran en la Tabla 8 de la presente. Los datos muestran que las concentraciones EC50 efectivas están en el intervalo de 0.61 nM , con un valor medio de entre 0.73 nM y 0.76 nM . ?? Tabla 8. Actividad in hibidora de los candidatos anti-c-Met optimizados en la formación de IgG sobre la migración estimulada por HGF 0 5 Ejemplo 7: Modulación de la auto-fosforilación de c-Met estimulada por HGF, med iante anticuerpos anti-c-Met antagonistas seleccionados. Se mide el agonismo o el antagonismo por parte de los anticuerpos anti-c-Met de la invención, mediante la activación o la inhibición de la fosforilación de c-Met en células con y sin estímulo con HG F. Las células de una l ínea celular, tales como las células A549, se aplican a una densidad de 3x104 células por pozo, en un volumen total de 100 microlitros/pozo de DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento, en placas tratadas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos (Costar, #3595). Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 24 horas, después de lo cual , se aspira suavemente el medio de cada pozo de las placas, y se agrega un volumen de 1 00 microlitros/pozo de DM EM . Las placas se incuban a 37°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento durante 24 horas, después de lo cual , se agrega una muestra de un anticuerpo purificado que se va probar, a 1 00 microlitros por pozo del anticuerpo, o una dilución , a las células en el pozo, diluida en DM EM . Como un control negativo para la falta de activación , se agrega una muestra de un anticuerpo no relacionado (que tiene una especificidad conocida no relacionada con los determinantes del epítopo c-Met), o regulador, a los pozos designados. Las células se incuban a 37°C durante un corto período de tiempo (por ejemplo, 2 horas), o durante un período de tiempo más largo (por ejemplo, 24 horas). Cuando es apropiado, las células se estimulan mediante la adición de HGF en un medio DM EM sin suero, a una concentración final de 200 nanogramos/pozo. En general , cuando se ensaya la actividad agonista de los anticuerpos, excepto por el control positivo (no tratado con anticuerpo), se omite el HGF de los pozos de anticuerpo de muestra de prueba. En general , cuando se ensaya la actividad antagonista de los anticuerpos, se incluye HGF en los pozos de anticuerpos de muestra de prueba. Las placas se incuban adicionalmente durante 1 0 minutos a 37°C, y luego se aspira suavemente el medio desde los pozos de las placas. Las células se lavan con suero regulado con fosfato frío, y la solución se aspira suavemente desde las placas. Las células se Usan con 50 microlitros de regulador de lisis (regulador de lisis N P-40: NaCI 120 mM , Tris-HCI 50 mM , pH de 7.5, N P-40 al 1 por ciento, EDTA 1 mM , EGTA 6 mM , NaF 20 mM , Benzamidina 1 mM con Na3V04 0.5 mM recién agregado , y PMSF 0.1 mM ). Las placas se agitan a temperatura ambiente durante 1 5 minutos, y luego se almacenan a -80°C hasta que se necesiten para el ELISA. Se utiliza un ELISA para determinar los niveles de fosforilación de c-Met. Para la preparación de la placa de ELISA, la placa Nunc-l mmunoM R Píate, MaxiSorb R Surface (VWR I nternational AG , Número 391 -8786) se lava dos veces con regulador de lavado (suero regulado con fosfato-Tween al 0.05 por ciento Biorad #670-6531 ), y se agregan 1 00 microlitros de anticuerpo de captura monoclonal de c-Met(DO-24) en suero regulado con fosfato. Las placas se incuban durante la noche a 4°C, y se lavan tres veces con suero regulado con fosfato-Tween al 0.05 por ciento. Los sitios que no se enlazan específicamente se bloquean con 200 microlitros/pozo de albúmina de suero bovino al 3 por ciento en PBS-T durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación . I nmediatamente antes de usarse, se remueve la solución de bloqueo. Los lisados celulares congelados se funden mediante agitación a temperatura ambiente, y se agregan 40 microlitros del Usado a las placas Nunc-lmmuno, y las placas se incuban a 4°C durante 4 horas. Las placas se lavan tres veces con PBS-T, y 50 microlitros/pozo de 0.2 microgramos/mililitro de anticuerpo anti-fosfotirosina PY20-HRP (ZYM ED, # 03-7722) en albúmina de suero bovino al 3 por ciento-PBS-T. Las placas se incuban durante la noche a 4°C, y se lavan tres veces con PBS-T. El PBS-T se aspira, y se agregan 90 microlitros/pozo de sustrato de fosfatase alcalina (CDR-Star, TROPIX, #MS1 00RY), y se desarrolla mientras se agita suavemente durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas se leen utilizando un lector de placas de 96 pozos. Los datos que muestran la concentración efectiva para la inhibición del 50 por ciento de la migración estimulada por HGF para los clones de los anticuerpos que tienen la mayor afinidad para c-Met, se muestran en la Tabla 9 de la presente. Los datos muestran que las concentraciones EC50 efectivas están en el intervalo de 0.1 66 nM , con un valor medio de entre 0.1 93 y 0.21 9 nM .

Tabla 9. Actividad in hibidora de los candidatos anti-c-Met optimizados en la formación de IgG sobre la auto-fosforilación del receptor estimulada por HGF Ejemplo 8 : Secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de los genes optimizados para la expresión. Con el objeto de aumentar la expresión en mamífero, se introducen cambios en las cadenas pesada y ligera de los Fabs de la presente, para la optimización del uso de codones para la expresión en una célula de mam ífero. Se sabe que varios motivos de acción negativamente cis disminuyen la expresión en mamíferos. El proceso de optimización de la presente remueve los sitios de acción cis negativa (tales como los sitios de empalme o las señales poli-(A)), que tienen una influencia negativa sobre la expresión . El proceso de optimización de la presente enriquece además el contenido de GC, para prolongar la vida media del ARNm.

Las regiones variables de cadena ligera y pesada se optimizan utilizando un clon de un Fab, y se aislan mediante selección con exhibición de fagos. Entonces, las secuencias de nucleotidos que codifican cada una de las cadenas ligera y pesada enteras de este y otros clones, se optimizan cada una empleando estos procedimientos. Proceso de optimización para las cadenas VH V VI Para la optimización de la secuencia de nucleotidos y de la secuencia de aminoácidos de cada una de las cadenas VL y VH, se adapta el uso de codones a la inclinación de codones de mamífero, en especial de los genes de H. sapiens. En adición, se reducen o se eliminan las regiones de muy alto (>80 por ciento) o muy bajo (<30 por ciento) contenido de GC donde sea posible. Durante el proceso de optimización, se evitan los siguientes motivos de secuencia de acción c/'s: los cuadros TATA internos, los sitios chi, y los sitios de entrada ribosomal, los estiramientos de secuencia ricos en AT o ricos en GC, los elementos de secuencia de motivo de inestabilidad del ARN (ARE), los elementos de secuencia de ARN inhibidor (INS), los elementos de secuencia que responden a cAMP (CRS), las secuencias de repetición y las estructuras secundarias de ARN, los sitios donadores y aceptores de empalme, incluyendo los sitios críticos, y los puntos de ramificación. Excepto como se indica, se evita la introducción de los sitios Mhul y Hindlll en el proceso de optimización de la secuencia de nucleotidos de la cadena VL. Excepto como se indica, se evita la introducción de los sitios Mlyl y BstEI I en el proceso de optimización de la secuencia de nucleótidos de la cadena B H . Secuencias de aminoácidos de las cadenas VH v Vi optimizadas para la expresión Se adapta el uso de codones a aquél de los mamíferos para hacer posible que haya índices de expresión más altos y más estables en una célula de mam ífero, para las secuencias de aminoácidos optimizadas resultantes para las cadenas VH y VL del clon descritas anteriormente. Se pueden utilizar histogramas para mostrar los porcentajes de los codones de secuencia para cada una de las secuencias progenitores y de los genes optimizados, respectivamente, y análisis de la clase de calidad de las secuencias de nucleótidos respectivas que codifican las cadenas VH y VL. El valor de calidad , como se utiliza en la presente, significa que el codón más frecuente utilizado para un aminoácido dado en el sistema de expresión deseado se establece como 1 00, y los codones restantes se escalan de conformidad con lo mismo hasta la frecuencia de uso (Sharp, P. M . , Li , W. H . , Nucleic Acids Res. 1 5 (3), 1 987). Además, el índice de adaptación de codones (CAI ) es un número que describe qué tan bien se emparejan los codones de la secuencia de nucleótidos con la preferencia de uso de codones del organismo objetivo. El valor máximo de CAI se establece en 1 .0, y por lo tanto, se considera que CAI de >0.9 hace posible una alta expresión . El CAI para la cadena VL antes de la optimización se encuentra en 0.73, y después de la optimización, el CAI se determina en 0.95. De una manera similar, el CAI para la cadena VH antes de la optimización se encuentra en 0.74, y después de la optimización , se determina en 0.98. El contenido de GC en la cadena VL se incrementa a partir de la secuencia progenitora para la secuencia optimizada. Optimización para la expresión de las cadenas ligeras y de las cadenas pesadas de longitud completa Se aplica el proceso de optimización a cada una de las secuencias de nucleotidos de longitud completa progenitoras de las cadenas ligeras, y de las secuencias de nucleotidos de longitud completa progenitoras de las cadenas pesadas. Se utiliza el proceso de optimización para construir las secuencias de nucleotidos de cadena ligera asociadas con los números de clones progenitores. Además, se utiliza el proceso de optimización para construir las secuencias de nucleotidos de cadena pesada asociadas con los números de clones progenitores.

LISTADO DE SECU ENCIAS DE LA INVENCIÓN Ab Ref. No. - SEO. ID SECUENCIA Tipo de NO: Cadena 04536 1 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAG VL GTCAGAC CGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATG TTCATT GGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTAT GCTGAT TCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAA CAGCGG CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGAC GAAGCGG ATTATTATTGCCAGGCTTATGATTCTTCTATGCTTCGTGTG I I I GG CGGC GGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG 05087 2 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAG VL GTCAGAC CGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATG TTCATT GGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTAT GCTGAT TCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAA CAGCGG CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGAC GAAGCGG ATTATTATTGCCAGTCTTATGCTAATTATCATGATTCTTGGGTGTT TGGC GGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG 05088 3 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAG VL GTCAGAC CGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATG TTCATT GGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTAT GCTGAT TCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAA CAGCGG CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGAC GAAGCGG ATTATTATTGCCAGTCTTATGCTTCTGATTATACTTCTTGGGTGTT TGGC GGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG 05091 4 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAG VL GTCAGAC CGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATG TTCATT GGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTAT GCTGAT TCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAA CAGCGG CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGAC GAAGCGG ATTATTATTGCCAGTCTTATGCTCATTATCATGATATTTGGGTGTT TGGC GGCGGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG 05092 5 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCTTCAGTGAGCGTTGCACCAG VL GTCAGAC CGCGCGTATCTCGTGTAGCGGCGATTCTATTGGTAATAAGTATG TTCATT GGTACCAGCAGAAACCCGGGCAGGCGCCAGTTCTTGTGATTTAT GCTGAT TCTGATCGTCCCTCAGGCATCCCGGAACGCTTTAGCGGATCCAA CAGCGG CAACACCGCGACCCTGACCATTAGCGGCACTCAGGCGGAAGAC GAAGCGG ATTATTATTGCCAGGCTCATGATTCTCTTTATTCTCGTGTGTTTGG CGGC GGCACGAAGTTAACCGTTCTTGGCCAG 04687 6 GATATCGTGATGACCCAGAGCCCGGATAGCCTGGCGGTGAGCC VL TGGGCGA ACGTGCGACCATTAACTGCAGAAGCAGCCAGTCTATTCTTTATG GTATTA ACAATAA I I I I 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Claims (1)

1. RE IVI N D ICAC IO N ES 1 . Un anticuerpo humano o humanizado aislado, o un fragmento funcional del mismo, el cual comprende una región de enlace de antígeno que es específica para la proteína objetivo c-Met, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza con c-Met. 2. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza con la proteína objetivo c-Met con una KD de 2.0 x 1 0"5M o menos, de 2.0 x 10"6M o menos, de 2.0 x 1 0"7M o menos, de 2.0 x 1 0"8M o menos, y de 2.0 x 1 0"9M o menos. 3. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo tiene un índice de desactivación ( desacivado) para la proteína objetivo c-Met de 1 .0 x 10~2 por segundo o menos, de 1 .0 x 1 0 3 por segundo o menos, de 1 x 10"4 por segundo o menos, o de 1 .0 x 1 0~5 por segundo o menos. 4. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza con la proteína objetivo c-Met con una KD de 2.0 x 1 0"5M o menos, de 2.0 x 10"6M o menos, de 2.0 x 1 0"7M o menos, de 2.0 x 1 0"8M o menos, y de 2.0 x 1 0_9? o menos, e inhibe el enlace de HGF con c-Met. 5. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza con la proteína objetivo c-Met, y modula la fosforilación de c-Met. 6. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la activación de la fosforilación de c-Met estimula cuando menos una de una actividad seleccionada a partir del grupo de regeneración de órganos, sanado de heridas, y regeneración de tejidos. 7. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el órgano se selecciona a partir del grupo de riñon, hígado, páncreas, pulmón , intestino, piel , timo, y tiroides. 8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el enlace del anticuerpo con c-Met se determina mediante cuando menos un ensayos seleccionado a partir de una cantidad de antagonismo o agonismo de: inducción de ligando de una actividad enzimática de la senda de transducción de señales de c-Met; inducción de ligando de una expresión genética de la senda de transducción de señales de c-Met; enlace basado en electroquimiluminiscencia de un ligando con c-Met; ensayo inmunosorbente enlazado con enzimas del enlace de un ligando con c-Met; y proliferación, sobrevivencia, migración, o metástasis de una célula. 9. Una región de enlace de antígeno aislada de un anticuerpo o de un fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 . 1 0. Una secuencia de nucleotidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 -30, 73-76, y 85-88. 1 1 . Una secuencia de aminoácidos aislada codificada por una secuencia de nucleotidos de acuerdo con la reivindicación 1 0, y las variantes conservadoras de la secuencia de aminoácidos. 12. La secuencia de nucleotidos aisladas de acuerdo con la reivindicación 10, en donde cada una de las SEQ I D NOs: 1 -20 codifica una cadena ligera de enlace de antígeno. 1 3. La secuencia de nucleotidos aisladas de acuerdo con la reivindicación 1 0, en donde cada una de las SEQ I D NOs:21 -30 codifica una cadena pesada de enlace de antígeno. 1 4. Una región de enlace de antígeno aislada que comprende una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 -20. 1 5. Una región de enlace de antígeno aislada que comprende una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:21 -30. 1 6. Una región de enlace de antígeno aislada, la cual comprende una cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs: 1 -20; y una cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:21 -30. 1 7. Una secuencia de aminoácidos aislada seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -72 , 77-84, y 89-96, y las variantes conservadoras de las mismas. 18. La secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación 1 7, en donde cada una de las SEQ I D NOs:31 -54 comprende una cadena ligera de enlace de antígeno. 1 9. La secuencia de aminoácidos aislada de acuerdo con la reivindicación 1 7, en donde cada una de las SEQ I D NOs:55-72comprende una cadena pesada de enlace de antígeno. 20. Una región de enlace de antígeno aislada , la cual comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54. 21 . Una región de enlace de antígeno aislada, la cual comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:55-72. 22. Una región de enlace de antígeno aislada, la cual comprende una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:31 -54, y las variantes conservadoras de las mismas, y una cadena pesada codificada por una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:55-72, y las variantes conservadoras de las mismas. 23. Una secuencia de aminoácidos aislada, la cual tiene una identidad de cuando menos el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 , o el 99 por ciento con las SEQ I D NOs:31 -72, 77-84, y 89-96. 24. Una secuencia de nucleotidos aislada, la cual tiene una identidad de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia ilustrada en las SEQ I D NOs: 1 -30, 73-76, y 85-88. 25. Una región de enlace de antígeno aislada, la cual comprende una cadena ligera Ig lambda codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada a partir del grupo de la SEQ I D NO:73. 26. Una región de enlace de antígeno aislada, la cual comprende una cadena ligera Ig kappa codificada por una secuencia de nucleotidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs.74-76. 27. Una región de enlace de antígeno aislada, la cual comprende una cadena ligera Ig lambda como se muestra en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:77-80. 28. Una región de enlace de antígeno aislada, la cual comprende una cadena ligera Ig kappa como se muestra en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:81 -84. 29. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual es una IgG . 30. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 29, el cual es una lgG 1 , una lgG2 , una lgG3, o una lgG4. 31 . El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la lgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ I D NOs:85-88. 32. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 31 , en donde la lgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:85-88. 33. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la lgG4, como se muestra , es una secuenci a de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:89-96, y las variantes conservadoras de las mismas. 34. Un anticuerpo humano o humanizado aislado, o un fragmento funcional del mismo, el cual comprende una región de enlace de antígeno que es específica para un epítopo de c-Met, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional se enlaza con los receptores superficiales c-Met sobre una célula, y previene o mejora el desarrollo o la metástasis de un cáncer, o previene o mejora una condición inflamatoria. 35. El anticuerpo aislado o el fragmento funcional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, el cual es un fragmento de anticuerpo Fab o scFv. 36. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 35, el cual es una IgG. 37. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 36, el cual es una lgG 1 , una lgG2, una lgG3, o una lgG4. 38. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la lgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:85-88. 39. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 38, en donde la lgG4 es codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:85-88. 40. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la lgG4, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:89-96, y las variantes conservadoras de las mismas. 41 . El anticuerpo aislado o el fragmento funcional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, el cual es un fragmento Fab o un fragmento de anticuerpo scFv, o un nanocuerpo de camélido. 42. El anticuerpo aislado o el fragmento funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 41 , en donde el epítopo es un epítopo de conformación . 43. El epítopo de acuerdo con la reivindicación 42 , en donde el epítopo comprende residuos de una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de c-Met. 44. Una composición farmacéutica , la cual comprende cuando menos un anticuerpo o un fragmento funcional de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42 , y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo. 45. Un animal transgénico que lleva un gen que codifica un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42. 46. Un método para el tratamiento de un trastorno o de una condición relacionada con c-Met, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 44. 47. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el trastorno o la condición es un cáncer o una condición inflamatoria. 48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer genital , cáncer urinario, cáncer de próstata, cáncer de vejiga (superficial e invasivo del músculo), cáncer de mama, cáncer cervical , cáncer de colon , cáncer colo-rectal, glioma (incluyendo glioblastoma, astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma, oligodendroglioma), cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal , cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC), incluyendo carcinoma hepatocelular de la infancia , cáncer de cabeza y cuello (incluyendo carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo), carcinoma de células de Hurthle, cáncer epitelial , cáncer de piel , melanoma , incluyendo melanoma maligno, mesotelioma, linfoma, mieloma, incluyendo mieloma múltiple, leucemias, cáncer pulmonar, incluyendo cáncer pulmonar no microcelular (incluyendo todos los subtipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma broncoalveolar, carcinoma macrocelular, y el tipo mixto adenoescamoso), cáncer pulmonar microcelular, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de riñon , cáncer de células renales, incluyendo cáncer de células renales papilares hereditario y esporádico, Tipo I y Tipo I I , y cáncer de células renales de células transparentes; sarcomas, en particular osteosarcomas, sarcomas de células transparentes, y sarcomas del tejido blando (incluyendo rabdomiosarcomas alveolares y embrionarios, sarcomas de la parte blanda alveolar); carcinoma de tiroides (papilar y otros subtipos). 49. El método de acuerdo con la reivindicación 48, en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo de cánceres que consiste en cáncer de h ígado y esofágico. 50. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el método comprende además administrar un agente quimioterapéutico. 51 . El método de acuerdo con la reivindicación 50, en donde el agente quimioterapéutico es un agente contra el cáncer. 52. Un método para el tratamiento de una célula indeseada, el cual comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42. 53. Un método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde la célula lleva c-Met. 54. El método de acuerdo con la reivindicación 52 ó 53, el cual comprende además tratar la célula con un agente quimioterapéutico o con radiación. 55. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 54, en donde en seguida de la administración o del contacto, el método comprende además observar la mejoría o el retardo del desarrollo o de la metástasis del cáncer. 56. Un método para identificar una célula que comprende c- Met, comprendiendo el método poner en contacto la célula con un anticuerpo o con un fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42, en donde el anticuerpo o el fragmento comprende además una marca detectable. 57. El método de acuerdo con la reivindicación 56, en donde la marca es radioactiva, fluorescente, magnética, paramagnética, o qui mi luminiscente. 58. El método de acuerdo con la reivindicación 56, el cual comprende además un paso de tomar imágenes o separar la célula . 59. Un anticuerpo humano o humanizado , o un fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42 , en donde el anticuerpo es un anticuerpo sintético. 60. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 44, la cual comprende además un agente terapéutico adicional . 61. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 60, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un agente contra el cáncer; un antibiótico; un agente anti-inflamatorio; un factor de crecimiento; y una citoquina. 62. Un anticuerpo aislado, el cual comprende una primera secuencia de aminoácidos que es una cadena pesada seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:55-72, y una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:55-72; y una segunda secuencia de aminoácidos que es una cadena ligera seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:31-54, y una secuencia que tiene una identidad de secuencia de cuando menos el 60, el 70, el 80, el 90, el 95, o el 99 por ciento con una secuencia seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NOs:31-54. 63. Un inmunoconjugado, el cual comprende un primer componente que es un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42. 64. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 63, el cual comprende un segundo componente que tiene una segunda secuencia de aminoácidos. 65. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 64, el cual comprende además una citotoxina. 66. El inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 64, en donde la segunda secuencia es una proteína de enlace o un anticuerpo que tiene una especificidad de enlace por un objetivo que es diferente de la c-Met. 67. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 64. 68. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 67, en donde el objetivo de la especificidad de enlace diferente de c-Met, es un antígeno tumoral o una proteína asociada con tumor sobre una superficie de una célula de cáncer. 69. Un kit que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 42. 70. El kit de acuerdo con la reivindicación 69, el cual comprende además un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo. 71 . El kit de acuerdo con la reivindicación 69, en donde el anticuerpo está presente en una dosis unitaria, y que además comprende instrucciones para utilizarse en la administración a un sujeto . RESU MEN Se proporcionan anticuerpos y fragmentos que se enlazan con el objetivo de proteína c-Met, en particular con los epítopos localizados en el dominio extracelular de c-Met, así como métodos de uso de los anticuerpos y kits, para el tratamiento de una célula indeseada , en particular una célula asociada con una condición relacionada con c-Met, tal como un cáncer, una metástasis, o una condición inflamatoria.