MX2008012233A - Metodo para la producción enzimática de ácidos carboxílicos 2-hisdroxi-2metilo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para la producción enzimática de ácidos carboxílicos de 3-hidroxi, donde el ácido carboxílico de 3-hidroxi se produce en una solución de reacción acuosa y/o se añade a esta solución de reacción y se incuba.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS 2 -HIDROXI-2 -METILO La presente invención se relaciona con un método para la producción enzimática de ácidos carboxílicos de 3-hidroxi, donde el ácido carboxilico de 3-hidroxi se produce en una solución de reacción acuosa y/o se añade a esta solución de reacción y se incuba. La solución de reacción acuosa comprende una unidad que tiene una actividad mutasa de 3-hidroxi-caboxilato-CoA que tiene una actividad de producción de éster de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA e isomerización de éster de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA y convierte el ácido carboxilico en ácido carboxilico de 2-hidroxi-2 -metilo correspondiente que se aisla como ácido en la forma de sus sales. En una forma de realización, la unidad que tiene una actividad mutasa de 3 -hidroxi-carboxilato-CoA comprende una mutasa dependiente de cobalamina aislada y donde una enzima productora de éster de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA o sistema de enzima o es un microorganismo que los incluye. La invención preferentemente se relaciona con un proceso biotecnológico para producir ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo, donde los microorganismos que tienen la actividad mutasa deseada se cultivan en un sistema acuoso con la ayuda de productos naturales simples y ésteres de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA formados intracelularmente que se convierten en los ácidos carboxílieos de 2-hidroxi-2-etilo correspondientes. Igualmente, la invención engloba la producción de ácidos carboxílieos de 2 -metilo insaturados, donde los ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo se obtienen y convierten por deshidratación en ácidos carboxílicos de 2 -metilo insaturados correspondientes (ácido metacrílico y homólogos superiores) . En una forma de realización de preferencia de la invención, el microorganismo productor de tioéster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA e isomerizante de tioéster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA utilizados en la cadena de HCM-10 (DSM 18028) . El ácido metacrílico y los ácidos carboxílicos de 2 -metilo insaturados homólogos se utilizan ampliamente en la producción de láminas de vidrio acrílico, productos moldeados por inyección, recubrimientos y muchos otros productos . Se ha revelado una pluralidad de procesos para la producción de ácido metacrílico y sus homólogos. Sin embargo, la vasta mayoría de la producción comercial en el mundo se basa en un método de hidrolización de sulfatos de amida de ácido metacrílico y sus homólogos, que s producen de los nitrilos de 2-hidroxi correspondientes (W. Bauer, "Ácido Metacrílico y derivados", en: Ullmann's Encyclopedia of Industial Chemistry, 5a Edición, editores: B. Elvers. S.

Hawkins, G. Schulz, VCH, Nueva York, 1990, Col. A16, . 441-452; A. W. Gross, J.C. Dobson, "Ácido Metacrilico y derivados" , en Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4a Edición, editores: J. I. Kroschwitz, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, Nueva York, 1995, Vol. 16, pp. 474-506) . Este método requiere, por ejemplo, alrededor de 1.6 kg de ácido sulfúrico para la producción de 1 kg de ácido metacrilico. Por esta razón, los métodos alternativos de producción comercial de ácido metacrilico sin el requerimiento de recuperación del ácido sulfúrico (y los costos altos de energía asociados con el mismo) serían ventajosos . US 3,666,805 y US 5,225,594 han revelado la conversión química de ácido isobutírico de 2-hidroxi a ácido metacrilico. Esto comprende ácido isobutírico de 2.hidroxi deshidratado a través de utilizar óxidos de metal, hidróxidos de metal, resinas de intercambio de iones, alúmina, dióxido de silicón, aminas, fosfinas, alcóxidos de metal álcali y carboxilatos de metal álcali. Las temperaturas de reacción usuales entre 160°C y 250°C. Este método hace posible las producciones de ácido metacrilico de hasta 96%. Un método alternativo de la producción de ácido metacrilico y sus homólogos se basa en la hidrólisis de nitrilos de 2-hidroxi a los ácidos carboxílieos de 2-hidroxi-2 -metilo, utilizando enzimas de nitrilo hidrolizantes . El último es nitrilasa de una combinación de hidratasa y amidasa de nitrilo (A. Banerjee, R. Sharma, U. C. Banerjee, 200, "Las enzimas degradantes de nitrilo: estado actual y prospectos futuros", Ap l . Microbiol. Biotechno., 60:33-44). Este método se protege por una pluralidad de patente (US 6,582,943 Bl) . Una desventaja severa de este método es la inestabilidad de los nitrilos en el rango neutral de pH requerido para una actividad eficiente de enzima de nitrilo hidrolizante . La descomposición de los nitrilos en los resultados de la mezcla de reacción en la acumulación de cetonas y cianuros, de los cuales los dos inhiben las actividades de nitrilo hidrolizante . Una desventaja general de los dos métodos, por ejemplo del método dominante actualmente basado en sulfatos de amida y del método hidrolizante de nitrilo enzimático, es la necesidad de nitrilos 2 -hidroxi. El último primero debe prepararse de reactivos dañinos ambientalmente , concretamente cetonas y cianuros . Por esta razón, los métodos para la producción de ácido metacrílico y sus homólogos, que se basan en los reactivos benignos simples ambientalmente, serían ventajosos . Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es investigar las posibilidades alternativas para producir ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo y para proveer métodos que se basan, donde sea posible, sobre la aplicación de reactivos simples benignos ambientalmente, que consumen poca energía y producen pocos productos de desecho . El objetivo se logra a través de un método enzimático para la producción de ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo de ácidos carboxílicos de 3-hidroxi. De acuerdo con la invención, el ácido carboxílico de 3-hidroxi se produce y/o se añade a una solución de reacción acosa que tiene una unidad que tiene una actividad mutasa de 2-hidroxi-carboxilato-CoA. Una unidad que tiene una actividad mutasa de 3 -hidroxi-carboxilato-CoA significa para el propósito de la invención una unidad que comprende una mutasa dependiente de cobalamina y donde sea correcto, una enzima productora de éster de 2-hidroxi-carbonilo-CoA o un sistema de enzima o un sistema biológico que comprende o los produce, que tiene una actividad mutasa de 3-hidroxi-carboxilato-CoA y exhibe tanto producción de éster de 3-hidroxi-carboxilo-CoA y una actividad isomerizante de éster-2-hidroxi-carbonilo-CoA. Después de la incubación el ácido carboxílico de 2-hidroxi-2-metilo convertido correspondientemente se aisla como ácido o en la forma de sus sales.

La invención preferentemente se relaciona con un proceso biotecnológico para la producción de ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo con el uso de microorganismos. Los microorganismos usualmente tienen una actividad sintetizadora de éster de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA y son capaces de producir o comprenden una mutasa dependiente de cobalamina, debido a la actividad de mutasa de 3-hidroxi-carboxilato-CoA, con capacidad de convertir ésteres de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA intracelularmente formados a partir de productos naturales simples (de los reactivos como, por ejemplo, azúcares y/o alcoholes y/o ácidos orgánicos y sus derivados) hacia los ésteres de 2-hidroxi-2-metil-carbonilo CoA correspondientes. El método de la invención se caracteriza en particular en que los microorganismos que producen o comprenden la mutasa dependiente de cobalamina y que tienen una actividad de mutasa de 3. hidroxi-caboxilato-CoA que se utilizan en sistemas acuosos para convertir los ácidos carboxílicos de 3-hidroxi hacia el ácido carboxílico de 2-hidroxi-2 -metilo correspondiente. En el método variante de preferencia, los microorganismos que comprenden una actividad mutasa de 3-hidroxi-carboxilato-CoA y que tienen una actividad tanto productora de tioéster de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA como isomérica de tioéster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA se cultiva en un sistema acuoso con materias primas renovables o productos de desecho derivados del consumo de materias primas renovables como fuentes de carbono y de energía. En el proceso, los tioésteres de 3-hidroxi-carboxilato-CoA formados intracelularmente se convierten en ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo correspondientes. La reacción se realiza preferentemente con la adición de ácido carboxílico de 3-hidroxi externo. El ácido carboxílico de 2-hidroxi-2-metilo correspondiente se aisla como ácido o en la forma de sus sales. Este método novedoso de biotecnología que utiliza la producción de ácidos carboxílicos de 3-hidroxi a partir de productos neutrales y su isomerización para ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo es capaz de resolver el problema especificado anteriormente. En la forma de realización de preferencia de la invención, el método comprende los siguientes pasos (a) ácidos carboxílicos de 3-hidroxi se producen de productos naturales simples y después se convierten en ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo en un sistema biológico adecuado que tiene una actividad sintetizadora de éster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA, y (b) los ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo se aislan como ácidos libres o sus sales correspondientes .

Los ácidos carboxílieos de 2-hidroxi-2-metilo que se obtienen de esta forma pueden utilizarse ventajosamente de la producción de ácidos iso-alquenóicos C2-C3 insaturados (ácido metacrílico y sus homólogos) , posiblemente por deshidratación de los ácidos producidos en (a) y (b) o sus sales correspondientes. Estas reacciones se describen a continuación: productos naturales simples (por ejemplo, materias primas renovables o productos de desecho derivados del consumo de materias primas renovables, como, por ejemplo, azúcares, ácidos orgánicos o alcoholes) -> ácidos carboxílieos de 2-hidroxi - ácidos carboxílieos de 2-hidroxi-2 -metilo (por ejemplo cepa HCM-10) Las condiciones de reacción (pH, concentración de iones, requerimientos de bióxido de oxígeno/ carbono, elementos de traza, temperaturas y similares) son elegidas por supuesto aquí de tal manera que los microorganismos se habilitan para convertir de manera óptima los ácidos carboxílieos de 3-hidroxi a ácido carboxílico de 2-hidroxi-2-metilo. Bajo estas condiciones de proceso, la mutasa dependiente de la cobalamina puede tener una estabilidad muy alta y eficacia en el ambiente micro natural, es decir, dentro de la célula, en lugar de la enzima aislada. Adicionalmente, la propagación de la célula y de esta forma un incremento en la concentración de la mutasa puede ser posible bajo condiciones adecuadas. La conversión enzimática por medio de microorganismos constituye de esta forma, cuando sea correcto, una importante ventaja sobre la conflabilidad, automatización y simplicidad se como una calidad y una producción del producto final del método. Para la conversión enzimática de acuerdo con la invención de ácidos carboxílieos de 3-hidroxi a ácidos carbox licos de 2-hidroxi-3-metilo, también es posible introducir en la solución de la reacción la unidad que tiene una actividad mutasa de 3-hidroxi-caboxilato-CoA, es decir una mutasa dependiente de cobalamina, preferentemente en combinación con una actividad sintetizadora de éster de CoA, por ejemplo en una forma purificada, concentrada y/o aislada, siendo posible para las enzimas que sean de origen natural. Por supuesto, las enzimas pueden ser enzimas producidas de manera recombinante a partir de un organismo modificado genéticamente. Para el propósito de esta invención, las enzimas de utilizan en el método de la invención como catalizadores tanto en forma de células microbianas intactas como en la forma de células microbianas permeabilizadas . Además los posibles usos de éstos en la forma de componentes (uno o más) a partir de extractos de células microbianas, pero también en una forma parcialmente purificada o purificada totalmente. Cuando sea correcto, otras enzimas sintetizantes de éster de CoA, por ejemplo transferasa de CoA o sintetasas de CoA, se utilizan de acuerdo con la invención. Los catalizadores enzimáticos pueden ser inmovilizados o adjuntos a un material de soporte disuelto o sin disolver. En una forma de realización variante de preferencia, los compartimientos de células particulares o parte de los mismos separados entre sí, es decir estructuras de carbohidratos, lípidos o proteínas y/o péptidos y también ácidos nucleicos, que son capaces de influenciar la unidad que tiene actividad mutasa, que es capaz de influenciar la unidad que tiene actividad mutasa en una forma positiva o negativa que puede ser combinada o separada. Con el fin de utilizar esta influencia conscientemente, por ejemplo, los extractos crudos se preparan a partir de microorganismos de una forma experta, por ejemplo, que los extractos son centrifugados, donde sea correcto, para poder llevar a cabo una reacción de la invención con el sedimento o súper flotante. Los ácidos carboxílieos 3-hidroxi (por ejemplo ácido butírico 3-hidroxi) o más específicamente su tioéster CoA intracelular de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA, puede fácilmente producirse de productos naturales simples a través de un gran número de cepas de bacterias . Estos ácidos son los bloques/monómeros de construcción básica para el carbono bacterial común y la sustancia de almacenamiento de energía, de poli-3 -hidroxialcanoato . Las redisposiciones del carbono dentro del esqueleto de los ácidos carboxílicos son de igual manera comunes en sistemas bacteriales al igual que en otros sistemas biológicos. Sin embargo, ningún sistema biológico para convertir ásteres de 3-hidroxi-carbonilo-CoA a los ásteres de 2-hidroxi-2-metil-carbonilo CoA ha sido identificado previamente. La invención se basa en los hallazgos sorprendentes que los sistemas con actividad mutasa dependiente de cobalamina tienen ambas propiedades. Los microorganismos que comprenden las mutasas dependientes de cobalamina son, por ejemplo, Metilibium petroelifilu PMI1, Metilibium sp. R8 (recolección de cepa UFZ, Leipzig, Alemania), la cepa ß-proteobacterial HC -10, Xanthobacter autotroficus Py2 , Rhodobacter sphaeroides (ATCC17029) o Nocardioides sp JS614. Un sistema biológico adecuado preferentemente se ha encontrado en la cepa HCM-10. Esta cepa se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en el depósito de microorganismos par los propósitos de procedimiento de patente en Deutschen Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GMBH (Recolección alemana de microorganismos y cultivos de células] , Brunswick, Alemania, bajo el No. DSN 18028 en 13.03.2006.

Utilizando este sistema biológico de preferencia, ha sido posible lograr una buena producción particularmente de ácidos carboxilicos de 2-hidroxi-2-metilo, en particular ácido isobutírico de 2-hidroxi. Sin embargo, la conversión enzimática a través de microorganismos no está limitada en lo absoluto a esta cepa. Cualquier organismo con capacidad de convertir los ácidos carboxilicos de 3-hidroxi. Sin embargo, la conversión enzimática por microorganismos no está limitada en lo absoluto a esta cepa. Cualquier organismo capaz de convertir ácidos carboxilicos de 3-hidroxi a ácidos carboxilicos de 2-hidroxi-2 -metilo puede utilizarse de acuerdo con la invención. Estos pueden ser microorganismos que primeramente poseen el mismo gen o el producto de gen o en segundo lugar tienen un gen análogo resultante en productos de gen que tienen una actividad similar o análoga. Es decir, actividades de mutasa de 3-hidroxi-carbonilo-CoA de otro origen son de igual manera cubiertas por la invención. La invención también incluye sistemas transformados que tienen una actividad similar de mutasa de 3-hidroxi-carbonilo-CoA como cepa HCM-10 o de otro origen. Esto puede incluir mutantes, genéticamente modificados y modificaciones aisladas de los microorganismos, por ejemplo, organismos que tienen la actividad mutasa dependiente de cobalamina deseada debida a la introducción de una secuencia de nucleótido que codifica la mutasa. El sistema biológico utilizado preferentemente (cela HCM-10-DS 18029) produce ésteres de 3-hidroxi-carbonilo-CoA como tioésteres a partir de productos naturales simples como azúcares y/o ácidos orgánicos y/o alcoholes y sus derivados. En el sistema de preferencia utilizado aquí, los ésteres de 2-hidroxi-carbonilo-CoA se convierten a través de la mutasa reacomodadota del esqueleto de carbono dependiente de la cobalamina a ésteres de 2-hidroxi-2-metil-carbonilo-CoA, como se describe a manera de ejemplo para el caso de (R) -3 -hidroxi-butirilo CoA en la ecuación 1. El tioéster CoA es hidrolizado en el sistema y el ácido se segrega en el medio de cultivo.

(R) -3 -hidroxibutirilo CoA 2 -hidroxiisobutirilo CoA Se da preferencia a utilizar como catalizador de enzima en el método de la invención la cepas de microorganismos que comprenden mutasas dependientes de cobalamina, HCM-10 (DSM 18028) , Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC17029) o Nocardioides sp.

JS614, sus extractos crudos o partes. Las cepas utilizadas de acuerdo con la invención preferentemente producen las proteínas con las secuencias SEC ID NO: 2 y/o SEC ID NO: 4 o comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID NO: 1 y/o SEC ID NO: 3 (HCM-10) , las proteínas con las secuencias SEC ID NO: 5 y/o SEC ID NO: 6 , o comprende las secuencias del ácido nucleico SEC ID NO: 7 y/o SEC ID NO: 8 (Xanthobacter autotrophicus Py2) , las proteínas con las secuencias SEC ID NO: 9 y/o SEC ID NO : 10, o comprende las secuencias de ácido nucleico SEC ID NO: 11 y/o SEC ID NO: 12 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029) o las proteínas con las secuencias SEC ID NO: 13 y/o SEC ID NO : 14, o comprende las secuencias de ácido nucleico SEC ID NO: 15 y/o SEC ID NO: 16 (Nocardioides sp JS614) . Para el propósito de la invención, las proteínas también pueden utilizarse en una forma producida concentrada, aislada o sintéticamente. En una forma de realización variante de preferencia adicional de la invención, los catalizadores de enzima, en particular microorganismos, extractos crudos, partes de los mismos y/o las enzimas concentradas o aisladas se utilizan en una forma inmovilizada. La inmovilización presenta enzimas, órganos celulares y células insolubles y limitadas en espacio de reacción. Por ejemplo, pueden inmovilizarse en una matriz de polímero (por ejemplo, alginato, alcohol de polivinilo o geles de poliacrilamida) . También pueden inmovilizarse en materiales de soporte disueltos o sin disolver (por ejemplo celita) para facilitar la recuperación o reutilización de los catalizadores. Los métodos de inmovilización de la célula en una matriz de polímero o en un soporte disuelto o sin disolver se conocen por las personas habilitadas y se han descrito en detalle anteriormente. Las actividades de las enzimas pueden de igual manera aislarse de las células microbiales. Estas pueden entones utilizarse directamente como catalizador o en una forma inmovilizada en una matriz de polímero o en un soporte disuelto o sin disolver. Los métodos requeridos para esto se conocen por las personas habilitadas y, por ejemplo, se describen en los Métodos de Biotecnología, Vol . 1: Inmovilización de enzimas y células, editor: G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 1997. Los ácidos carboxílieos 3-hidroxi se convierten en ácidos carboxílicos 2-hidroxi^2-metilo, preferentemente dentro del marco de trabajo de un proceso continuo que puede llevarse a cabo en un reactor de flujo donde el crecimiento microbiol y de esta forma se realiza la formación del producto. Sin embargo, un proceso continuo también puede significar cualquier sistema de crecimiento de células y enzimas catalizadoras , que se suministran con una solución nutriente y desde el cual la solución de cultivo, incluyendo el ácido carboxilico 2-hidroxi-2-metilo formado enzimáticamente, se retira. De acuerdo con al invención, el proceso también puede realizarse como un proceso semi-continuo o de lote. Como se explicó anteriormente, el ácido carboxilico 3-hidroxi que es el material de inicio para el ácido carboxilico 2-hidroxi-2-metilo se produce preferentemente a través de una conversión enzimática de carbohidratos y/o ácidos orgánicos y/o alcoholes o sus derivados. En el contexto de la invención, se hace uso, a un lado de la mutasa dependiente de la cobalamina, cuando se correcto además de enzimas sintetizadoras de éster de CoA que están presentes o añadidas al microorganismo. Esto involucra la conversión de hidrocarburos y/o carbohidratos y/o ácidos orgánicos y/o alcoholes o derivados de los mismos a ácido carboxilico 3-hidroxi y del ácido carboxilico 3-hidroxi a ácido carboxilico 2-hidroxi-2-metilo en un solo paso de proceso, es decir, conversión de los sustratos de inicio de hasta ácido carboxilico 3-hidroxi y de las reacciones de conversión enzimática de ácido carboxilico 3-hidroxi al ácido carboxilico 2 -hidroxi-2-metilo correspondientes se realizan al mismo tiempo o con un ligero retraso de tiempo en una o en la misma solución de reacción. En una forma de realización muy particular de la invención, un sustrato con una radical ter-butilo como fuente de carbono y fuente de energía se utiliza para el cultivo, con preferencia al alcohol de ter-butilo que es el único carbono y fuente de energía en un medio basa. El método de la invención es preferentemente útil para la producción de ácido propanóico de 2-hidroxi-2-metilo (ácido isobutírico de 2-hidroxi) . La producción de preferencia del ácido isobutírico de 2-hidroxi es además caracterizado porque el ácido butírico de 3-hidroxi se añade externamente. El método puede realizarse aeróbicamente, de preferencia con el uso de células intactas, o de otra forma no aeróbicamente, por ejemplo con gaseo con nitrógeno, preferentemente cuando se utilizan extractos de enzimas o enzimas purificadas. La invención también se relaciona con codificación de moléculas de ácido nucleico para una enzima que tiene la actividad de la mutasa dependiente de la cobalamina, seleccionada del grupo consistente de a) codificación de moléculas de ácido nucleico par una proteína que comprende las secuencias de ácido amino indicado bajo la Sec. No. 2 y/o Sec . No. 4 ; b) Las moléculas de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido descrita en la Sec. No. 1 y (o Sec. No. 3.

Una enzima de la invención se ha demostrado que es preferentemente una proteina heterodimérica que comprenden las su, -unidades descritas bajo la Sec. No. 2 y la Sec. No. 4 y de esta manera tienen una excelente actividad de enzima. Una molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN preferentemente cADN o ADN genómico y/o una molécula de ANR. Ambos ácidos nucleicos y proteínas pueden asilarse a partir de fuentes naturales, preferentemente de DSM 18028, pero también, por ejemplo, de Methilibium petroleiphilu PM1, Methilibium sp R8 (recolección de cepa UFZ Leipzig, Alemania), Xanthobacter autotrophicus Py2 , Rhodobacter sphaeroides (ATCC17029) o Nocardioides sp JS614 o pueden sintetizarse por métodos conocidos. Las mutaciones pueden generarse en las moléculas de ácido nucleico utilizadas de acuerdo con la invención por medios de técnicas de biología molecular conocidas por si mismas, permitiendo así que las enzimas adicionales con propiedades análogas o similares se sinteticen, lo cual de igual manera se utilizaron en el método de la invención. Las mutaciones pueden ser mutaciones de eliminación que dan como resultado enzimas truncadas. Las enzimas modificadas con propiedades similares o análogas pueden de igual forma generarse por otros mecanismos moleculares, como, por ejemplo, inserciones, duplicaciones, transportaciones, fusión de gen, intercambio nucleótido bien transferencia de gen entre diferentes cepas de microorganismos. Estas moléculas de ácido nucleico pueden identificarse y aislarse utilizando las moléculas de ácido nucleico o partes de los mismos. Las moléculas hibridizantes con las moléculas de ácido nucleico también comprenden fragmentos, derivados y variantes arílieos de las moléculas de ácido nucleico antes descritas, cuyo código para una enzima utilizable de acuerdo con la invención. Los fragmentos aquí significan partes de las moléculas de ácido nucleico, que son suficientemente largas para codificar la enzima descrita. Derivativo significan las secuencias de estas moléculas, que difieren de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico antes descrito en una o más posiciones pero que tienen un alto grado de homología para estas secuencias. Homología aquí significa una identidad de secuencia de por lo menos 40%, en particular una identidad de por lo menos 60%, preferentemente más de 80% y particularmente preferente de más de 90%, 95%, 97% o 99%, en el nivel de ácido nucleico. Las enzimas codificadas aquí tienen una identidad de secuencia para las secuencias de ácido amino especificada de por lo menos 60%, preferentemente de por lo menos 80%, particularmente preferente de por lo menos 95%, muy particularmente de por lo menos 99%, en el nivel de ácido amino. Las desviaciones aquí puede ser el resultado de la eliminación, sustitución, inserción o recombinación. Estas pueden ser variaciones que ocurren naturalmente, por ejemplo, secuencias de otros organismos, o otras mutaciones que pueden ocurrir naturalmente o por medio de mutagénesis específica (rayos UV, rayos X, agentes químicos u otros) . Las variantes también pueden ser secuencias producidas sintéticamente. Estas variantes tienen características comunes particulares como, por ejemplo, actividad de enzima, concentración de enzima activa, subunidades, grupos funcionales, reactividad inmunológica, conformación y/o propiedades físicas como la conducta de migración en electroforesis de gel, conducta cromatográfica, solubilidad, coeficientes de sedimentación, pH óptimo, temperatura óptima, propiedades espectroscópicas , estabilidad y/u otras. SEC ID NO: 1 describe la secuencia nucleótido 1644 bp para la subunidad larga de la mutasa dependiente de la cobalamina de DSM 18028. SEC ID NO: 2 describe la secuencia de ácido amino 548 aa de la subunidad larga de la mutasa dependiente de cobalamina de DSM 18028. SEC ID NO: 3 describe la secuencia nucleótido parcial 369 bp para la subunidad pequeña de la mutasa dependiente de la cobalamina de DSM 18028.

SEC ID NO: 4 describe la secuencia parcial 123 aa de la subunidad de la mutasa dependiente de la cobalamina de DSM 18028. SEC ID NO: 5 6 describe la secuencia de ácido amino 562 y 135 aa, respectivamente, secuencias de ácido amino de una mutasa dependiente de cobalamina de Xanthobacter autotrophicus Py2. SEC ID NO: 7 y 8 describen 1689 y 408 bp, respectivamente, de la secuencia nucleótida para las mutasas dependientes de cobalamina de Xanthobacter autotrophicus Py2. SEC ID NO: 9 y 10 describen 553 y 135 aa, respectivamente, secuencias de ácido de amina de una mutasa dependiente de cobalamina de Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029. SEC ID NO: 11 y 12 describen 1692 y 408 bp, respectivamente, de la secuencia de nucleótido para la mutasa dependiente de la cobalamina de Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029. SEC ID NO: 13 y 14 describen 569 y 164 aa, respectivamente, secuencias de ácido amino de una mutasa dependiente de cobalamina de Nocardoides sp. JS614. SEC ID NO: 15 y 16 describe 1710 y 495 bp, respectivamente, de la secuencia de nucleótido para las mutasas dependientes de cobalamina de Nocardoides sp .

JS614. Los ácidos carboxílicos de 2-hidroxi-2-metilo producidos de acuerdo con la invención pueden asilarse a través de tratar el medio de cultivo (después de retirar los componentes no disueltos como las células microbiales) a través de métodos previamente revelados. Los ejemplos de estos métodos son, entre otros, la concentración, intercambio de iones, destilación, electrodiálisis , extracción y cristalización. El producto puede aislarse como sal o (después de acidificación) como ácido carboxílico 2-hidroxi-2-metilo protonatado. Los ácidos carboxílicos de 2 -hidroxi-2 -metilo (o sus sales correspondientes) pueden ser deshidratados, por una multiplicidad de métodos para dar los ácidos carboxílicos 2 -metilo insaturados correspondientes. Los ácidos isoalquenóicos insaturados se producen a través de deshidratar el ácido carboxílico 2-hidroxi-2-metilo producido, utilizando los métodos conocidos de la tecnología anterior. Los ácidos carboxílicos 2-hidroxi-2-metilo pueden deshidratarse utilizando óxidos de metal, hidróxidos de metal, intercambio de iones, resinas, alúmina, dióxido de silicio, aminas, fosfinas, alcóxidos de metal álcali y carboxilatos de metal álcali- Las temperaturas de reacción usualmente son entre 160°C y 250°C. De esta manera, por ejemplo, el ácido metacrílico se produce al deshidratar el ácido isobutírico 2-hidroxi en presencia de NaOH a temperaturas de aproximadamente 185 °C. El ácido metacrílico producido por este proceso y sus homólogos se aplica correctamente, en un número entero de sectores industriales, por ejemplo, como aditivos y recubrimientos. En contraste con los métodos conocidos anteriores, el método combina la ventaja deseada de un proceso de temperatura baja el uso de reactivos benignos ambientalmente y una producción más baja de desechos. La invención se describirá en mayor detalle a continuación sobre la base de forma de realización ejemplificada pero no se intenta limitar la misma. Material y métodos Catalizador de enzima microbiana Las células microbianas de la cepa HCM-10 (DSM 18028) , caracterizada porque un éster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA con actividad productiva y un éster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA con actividad isomerizante, o las subunidades de proteína con secuencia No. 2 y No. 4 se aislan de las mismas. La cepa HCM-10 se concentró de la capa freática en un medio basal (Tabla 1) conteniendo alcohol ter-butilo como única fuente de carbono y energía. La cepa pertenece filogenéticamente al grupo Rubrivivax-Leptothrix .

Tabla 1 Medio basal (mg/L) NH4C1 761.4 Biotina 0. 02 KH2P04 340.25 Ácido Fólico 0. 02 K2HP04 435.45 Piridoxina-HCI 0 .1 CaCl3 x 6 H20 5.47 Tiamina-HCl 0. 05 MgS0( x 7 H20 71.2 Riboflavina 0. 05 ZnS04 x 7 H20 0.44 Ácido Nicotínico 0. 05 MnS0 x H20 0.615 DL-Ca-pantotenato 0. 05 CuSO0 x 5 H20 0.785 Ácido p-aminobenzóico 0. 05 CoCl2 x 6 H20 0.2 Ácido Lipónico 0. 05 Na2Mo04 x 2 H20 0.252 FeSU4 x 7 H20 4.98 pH 7 .0 La cepa HCM-10 creció aeróbicamente bajo las sustituyentes condiciones (Tabla 2) para ensayo de la actividad de mutasa 3-hidroxi-carbonilo-CoA. Tabla 2 Cepa Sustrato Medio Temperatura Tiempo (°C) (d) HCM-10 Alcohol de ter-butilo Medio 25 7 (0.5 g/L) Basal Las células se utilizaron inmediatamente después de 'cosecharlas . Las células intactas pueden utilizarse sin pretratamiento adicional, como por ejemplo, permeabilización. Más aún, las células pueden utilizarse en una forma permeabilizada (por ejemplo a través de tratamiento con tolueno, detergentes o por ciclos de congelación - descongelación) con el fin de mejorar las tasas de difusión de las sustancias en las células y fuera de las células. La concentración del ácido isobutírico de 2-hidroxi y ácido butírico de 3-hidroxi en el líquido de cultivo o en la mezcla de reacción se determinó a través de cromatografía de gas después de metanálisis ácida, utilizando un detector FFAP y un FID Ejemplo 1: Conversión de ácido butírico dé 3-hidroxi en ácido isobutírico 2-hidroxi a través de cepa HCM-10. Se introdujo una suspensión de 1 g (masa seca) de células de cepa HCM 10 en 100 mi de medio basal en botellas de suero de 120 mi. Esta suspensión se mezcló con 50 mg de ácido butírico de 3-hidroxi y la suspensión se incubó en un agitador rotatorio a 30°C. Después de 0.3 h de incubación aeróbica, la suspensión se gaseó con nitrógeno y se incubó con agitación a 30°C durante otras 4.4 horas. En varios tiempos, las muestras se tomaron y el contenido de ácido isobutírico de 2-hidroxi y el contenido de ácido butírico de 3-hidroxi en el súper flotante libre de células se determinó después de centrifugación de la suspensión. Se encontró que el ácido butírico de 2-hidroxi fue el único producto liberado en la fase anaeróbica. En contraste, el ácido butírico de 3-hidroxi fue evidentemente degradado completamente en la fase inicial aeróbica (Figura 1) . El producto del ácido isobutírico de 2-hidroxi fue en este cado de 5.1% con aproximadamente 80% de ácido butírico de 3-hidroxi permaneciendo en el líquido de reacción. Ej emplo 2 : Conversión de ácido butírico de 3-hidroxi en ácido isobutírico 2-hidroxi a través de extracto crudo de cepa HCM-10. Se preparó un extracto crudo libre de células de la cepa HCM-10 a través de desintegrar las células en un molino de bola, y los escombros de célula se retiraron subsecuentemente por centrifugación. El extracto crudo libre de células en una concentración de 10 mg se selló herméticamente y se incubó con agitación a 30°C durante 2 horas. Los productos de reacción se analizaron como se ilustró anteriormente. La producción del ácido isobutírico 2-hidroxi fue en este caso de 9%, con aproximadamente 88% de ácido butírico 3-hidroxi restante en el líquido de reacción (Figura 2) . Ejemplo 3: Deshidratación de ácido isobutírico de 2-hidroxi a metacrilato. Una solución de ácido isobutírico de 2-hidroxi (1 mg/5 mi) producido de acuerdo con el procedimiento llevado a cabo en el ejemplo 2 se mezcló con NaOH (0.06 mg) con agitación. La solución se incubó con agitación y se engrió con reflujo bajo la presión reducida (300 torr) a 185-195°C. 'Alícuotas adicionales de 0.5 mg de ácido isobutírico de 2-hidroxi por 5 mi se añadieron cada hora durante un período de 5 horas, estas alícuotas adicionales contuvieron 0.4 por ciento por peso de p-metoxifenol con el fin de evitar la polimerización del metacrilato. La reacción se detuvo después de 24 horas de incubación. La conversión del ácido isobutírico 2-hidroxi a metacrilato fue de 97%. El ácido metacrílico se retiró de la mezcla de reacción a través de destilación. 1) Figura 1 Formación de ácido isobutírico de 2-hidroxi de ácido butírico de 3-hidroxi por células intactas de cepa HCM-10 (Ejemplo 1) . 2) Figura 2 Formación de ácido isobutírico de 2-hidroxi de ácido butírico de 3-hidroxi por células intactas de cepa HCM-10 (Ejemplo 2) .

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para una producción enzimática de ácidos carboxilicos de 2-hidroxi-2-metilo a partir de ácidos carboxilicos de 3-hidroxi, caracterizado porque un ácido carboxílico de 3-hidroxi se produce y/o se añade a una solución de reacción acuosa que comprende una unidad que tiene actividad mutasa de 3 -hidroxi-carboxilato-CoA, que tiene tanto actividad productora de éster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA como de actividad isomerizante de éster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA, y después de la incubación el ácido carboxílico de 2-hidroxi-2-metilo convertido correspondientemente se aisla como ácido o en la forma de sus sales.
2. 2. Un método como se describe en la Reivindicación 1, caracterizado porque la unidad tiene actividad mutasa de 3-hidroxi-carboxilato-CoA que comprende una mutasa dependiente de cobalamina aislada. 3. Un método como se describe en la Reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la unidad tiene actividad mutasa 3-hidroxi-carboxilato-CoA que comprende una enzima o sistema de enzima que produce éster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA. 4. Un método como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque la unidad que tiene una actividad mutasa de 3-hidroxi-carboxilato-CoA es un microorganismo o un extracto crudo de la misma. 5. Un método como se describe en la Reivindicación 1 o 4, caracterizado porque los microorganismos que producen o comprenden una mutasa dependiente de cobalamina, tiene una actividad mutasa de 3-hidroxi-carboxilato-CoA y tiene tanto actividad productora de éster de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA y actividad isomerizante de éster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA se utilizan en sistemas acuosos para convertir ácidos carboxílieos de 3-hidroxi en el ácido carboxílico de 2-hidroxi-2-metilo correspondientes . 6. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque a) los microorganismos con actividad mutasa de 3-hidroxi-carboxilato-CoA, que tienen tanto actividad productora de tioéster de 3 -hidroxi-carbonilo-CoA como actividad isomerizante de tioéster de 3-hidroxi-carbonilo-CoA, se cultivan en un sistema acuoso con materias primas renovables o derivados de productos de desecho a partir del consumo de materias primas renovables como carbono y · fuentes de energía, donde los tioésteres de 3-hidroxi-carboxilato-CoA intracelulares se sintetizan y se convierten en los ácidos carboxílieos de 2-hidroxi-2-metilo correspondientes, y b) el ácido carboxílico de 2-hidroxi-2-metilo correspondiente se aisla como ácido o en la forma de sus sales . 7. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque la reacción se realiza con la adición de ácido carboxilico 3-hidroxi externo . 8. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de la cepa HCM-10 de la bacteria DSM 18028, Xanthobacter autotrophicus Py2 , Prodobacter sfaeroides (ATCC17029) o Nocardioides sp. JS614. 9. Un método como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las células intactas de los microorganismos se utilizan sin cambios, permeabilizadas o fijas a un soporte. 10. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los extractos de las células y/o la mutasa dependiente de cobalamina y, donde sea correcto, las otras enzimas como, por ejemplo, enzimas sintetizadoras de éster de CoA, después de aislamiento parcial o completo de los microorganismos se utilizan donde sea correcto en una forma purificada. 11. Un método como se describe en la Reivindicación 10, caracterizado porque se utilizan los extractos crudos libres de células de los microorganismos . 12. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las proteínas con las secuencias SEC ID NO: 2 y/o SEC ID NO: 4, con las secuencias SEC ID NO: 5 Y/0 sec . ID no: 6, las proteínas con las secuencias SEC ID NO: 9 y/o SEC ID NO: 10 o las proteínas con las secuencias SEC ID NO: 13 y/o SEC ID NO: 14 se utilizan en por lo menos 60% de sus homólogos. 13. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se utiliza un azúcar y/o un alcohol y/o un ácido orgánico y/o un hidrocarburo o sus derivados como carbono y fuentes de energía para conversión enzimática durante el cultivo. 14. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque un sustrato con radical ter-butilo se utiliza como fuente de carbono y fuente de energía para el cultivo. 15. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 14 , caracterizado porque el alcohol de ter-butilo se utiliza como fuente sola de carbono y fuente de energía en un medio basal para cultivo. 16. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la conversión enzimática de un azúcar y/o un alcohol y/o un ácido orgánico y/o un hidrocarburo o sus derivados para el ácido carboxílico 3-hidroxi y de ácido carboxílico 3-hidroxi al ácido carboxílico 2-hidroxi-2-metilo se lleva a cabo en un paso de método simple. 17. Un método como se describe en las Reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el ácido isobutírico de 2-hidroxi se produce con la adición de ácido butírico 3-hidroxi. 18. Un método para la producción de ácido isoalquenóico C2-C3 insaturado, caracterizado porque un ácido carboxílico de 2-hidroxi-2-metilo producido como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 17 se deshidrata. 19. Un método para la producción de pacido metacrílico, caracterizado porque un ácido isobutírico de 2-hidroxi producido como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 17 se deshidrata. 20. Un microorganismo de cepa HCM-10 - DSM 18028, 21. Una molécula de ácido nucleico codificado para una enzima que tiene la actividad de una mutasa dependiente de cobalamina, seleccionado del grupo que consiste de a) moléculas de ácido nucleico codificado para una proteína que comprende las secuencias de ácido amino indicado bajo la Sec. No. 2 y/o Sec. No. 4 ; b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleótido descrito bajo la Sec. No. 1 y/o Sec. No.
3. 3. 22. Una molécula de ácido nucleico como se describe en la Reivindicación 21, caracterizado porque codifica para una proteína la cual es una enzima oligomérica compuesta de dos diferentes subunidades, que comprenden las secuencias de ácido amino indicadas bajo Sec. No. 2 y Sec. No. 4. 23. Una molécula de ácido nucleico como se describe en la Reivindicación 21 o 22, que es una molécula de ADN. 24. Una molécula de ácido nucleico como se describe en la Reivindicación 23, que es un cADN o ADN genómico. 25. Una molécula de ácido nucleico como se describe en la Reivindicación 21 o 22, que es una molécula de ANR. 26. Una proteína que tiene la actividad de una mutasa dependiente de cobalamina codificada por una molécula de ácido nucleico como se describe en las Reivindicaciones 21 y 22. 27. Una proteína con la secuencia No. 2 y por lo menos 99% de sus homólogos. 28. Una proteína con la secuencia No. 4 y por lo menos 99% de sus homólogos. 29. Una proteína como enzima heterodimérica comprende la secuencia No. 2 y la secuencia No.
4. 4.