MX2008011822A

MX2008011822A - Extracciones y metodos que comprenden especies sauco.

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Publication number: MX2008011822A
Application number: MX2008011822A
Authority: MX
Inventors: Robert T Gow; George W Sypert; Dan Li; Randall S Alberte
Original assignee: Herbalscience Singapore Pte Ltd
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2008-09-30
Also published as: WO2007109600A3; EP2001304A2; BRPI0709566A2; CA2643916A1; KR20090009202A; SG170751A1; EP2001304A4; AU2007226979A1; IL193432A0; JP2009531316A; WO2007109600A2; US20070248700A1

Abstract

La presente invención se relaciona con métodos de extractos de material vegetal de especies saúco preparados por las extracciones de CO2 supercríticos, métodos para tratar virus en un sujeto y métodos para inhibir las infecciones virales en las células de los mismos.

Description

EXTRACCIONES Y MÉTODOS QUE COMPRENDEN ESPECIES SAÚCO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con extracciones y métodos de los mismos derivados a partir de especies Saúco Sambuca que tienen constituyentes químicos de aceite esencial excepcionalmente elevados, constituyentes químicos de ácido fenólico, constituyentes químicos de antocianidina o proantocianidina , o constituyentes químicos de lectinpolisacáridos y extracciones hechas por tales métodos y los métodos para el uso de tales extracciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Saúco, Sambuca nigra L., nativa de Europa, África del Norte, y Asia Occidental es un arbusto silvestre. Saúco además consiste de más de 20 especies Sambuca, muchas de las cuales tienen constituyentes químicos similares. Sambucus nigra L. es de las especies en las cuales la mayoría de las investigaciones científicas se han llevado a cabo. Es un árbol caduco que crece 10 m que muestra flores blancas cremosas y bayas azul oscuro (bayas de saúco) . Todas las flores, hojas y bayas contienen constituyentes químicos de importancia médica que incluyen compuestos de aceite esenciales, ácidos fenólicos, particularmente los flavonoides y antocianidinas , compuestos de proteína de lectina, y compuestos de polisacáridos . El uso de especies Sambuca como medicinas se remota al siglo cincuenta A.C., incluyendo los escritos de Hipócrates, Dioscórides, y Pliny. Saúco tiene una historia extensa de uso tradicional contra herbolarios Americanos y Europeos Nativos. El uso médico tradicional y las actividades de investigación modernas se han enfocado en los extractos de las flores. Las flores se cosechan en la primavera y se secan fuera de la luz del sol por debajo de 40°C, para minimizar la pérdida del aroma. Las bayas se cosechan en el otoño cuando maduran por completo. Más de las flores y bayas en el comercio se importan de la Federación Rusa, Polonia, Hungría . Bulgaria, y Portugal. Las bayas también se utilizan para agregar sabor y color, para vinos, licores de invierno, conservadores, alimentos y condimentos. Tanto las flores como las bayas tienen bastantes historias como agentes medicinales. Los constituyentes químicos de flores y bayas Sambucus nigra L. Incluyen ácidos fenólicos bioactivos (flavonoides y antocianidinas), proteínas, polisacáridos, y vitaminas (C, P, Bl, B2 , y B6) . Aunque la información en los constituyentes químicos de las flores y bayas de especies Sambuca son incompletas, los constituyentes químicos conocidos se listan en la Tabla 1. A partir de un punto de vista comercial y biológico, los flavonoides y los antocianidinas se han considerado tradicionalmente para ser de gran importancia que los otros constituyentes.

Tabla 1. Constituyentes químicos de inflorescencia y bayas Sambucus nigra L.

Constituyentes químicos % peso en masa Flores Bayas Aceite Esencial 0.04-0.31 0.01 Aceite Volátil Ácido Linoleico Ácido Linolénico Ácido Palmítico Triterpeno 1 1 Alfa-amirina Beta-amirina Ácidos Triterpeno 0.85 0.9 Ácido Ursólico Ácido Oleanólico Ácidos Fenólicos Glicósidos Flavonoides 2-3 2-3 Astragalin Hiperósida I soqueei trina Rutósido Aglicones Quercetina Caempferol Derivados de ácido cafeico 1-3 1-3 Ácido Clorogénico Antocianidinas 3 -sambubiósido-5-glucósido de cianidina 3 , 5-diglucósido de Cianidina 3 -sambubiósido de Cianidina 3 -glucósido de Cinanidina Taninos Alcanos Mucilago Pectina Proteína (plastocinina) Carbohidratos Monosacáridos Polisacáridos 8-9 3-9 Minerales Las propiedades medicinales de las especies saúco resultan de la presencia de sus constituyentes químicos farmacológicamente activos. Como una regla general para los contenidos químicos, las barreras fuertemente coloreadas contienen niveles elevados de antocianidinas como pigmentos, así como glicósidos flavonol y agliconas (Espin JC et al. J Agrie Food Chem 48:1588-1592, 2000; Kahkonen MP et al. J Agrie Food Chem 49:4076-4082, 2001). Las antocinidinas son derivados de polihidroxi glicosilado y polimetoxi de sales 2-fenilbenzopirilio (Brouillard KaHSH . Chemical Structure of Anthocyanins . Academic Press, New York, 1982) . Las bayas de saúco son una de las fuentes más ricas de estos pigmentos que tienen contenidos de 0.2 - 1%, los cuales son mucho más altos que aquellos encontrados en las uvas (Bronnum-Hansen K et al . J Food Technology 20:703-711, 1985). La baya de saúco contiene diversas antocianinas diferentes de las cuales el cianidin-3 -sambubiósido (compuesto 1) y cianidin-3-glucósido (compuesto 2) son cuantitativamente los más importantes, representando más del 85% del contenido de antocianidina , mientras que el ciandin-3 -sambubiósido-5-glucósido (compuesto 3) y cianidin-3 , 5-diglucósido (compuesto 4) solo están presentes en menores cantidades (Bronnum-Hansen K et al. J Chromatography 262:393-396, 1983; Drdak M & Daucik P. Acta Aliment 19:3-7, 1990). Las antocianidinas muestran un grado de actividades biológicas . Uno de los mejores atributos conocidos es la actividad antioxidante, especialmente de los derivados de cianidina (Drdak M & Daucik P. Acta Aliment 19:3-7, 1990; Tsuda T et al. J Agrie Food Chem 42:2407-2410, 1994). Compuesto 1: Rl=sambubiósido , R2=H glucósido, R2 = H sambubiósido, R2 = = glucósido, R2 = glucósido Diferentes clases de prueba de los compuestos de ácido fenólico de arándano por su capacidad para inhibir el crecimiento de las células de cáncer de colon in vitro, se encuentra que las antocianidinas que son fenólicos potentes (Kamei H et al . Cáncer Invest 13:590-594, 1995) . La cianidina en particular fue más efectiva al inhibir el crecimiento celular a una concentración más baja de 2 µg/ml, la cual es sólo 1/10 de la concentración requerida para la genisteina anticancerígena potente. La actividad anticáncer también se ha observado para las antocianinas de la mora azul (Smith MAL et al. J Food Sci 65:352-356, 2000) . El rutósido e isoquercitrina son los glicósidos flavonol principales en los materiales vegetales de especie saúco (Pietta P & Bruno A. J Chromatography 593:165-170, 1992). Estos compuestos tienen la capacidad para actuar como un depurador radical potente, (Shahidi F & Wannasundra PK. Crit Rey Food Sci Nutr 32:67-103, 1992 ; Rice-Evans CA et al. Free Radical Biol & Med 20:933-956, 1996), inhibiendo una variedad de enzimas (Fórmica JV & Regelson W. Food y Chem Toxic 33:1061-1080, 1995), y tienen una actividad anti-hemorrágica por los vasos sanguíneos apretados (Dawidowicz AJ et al . J Liquid Chromotog & Related Technologies 26:2381-2397, 2003). En estudios que utilizan extracción de solvente acelerado de la flor Sambucus nigra, la baya y hoja, se encontró que el rutósido es el flavonoide principal . La flor tiene la cantidad más elevada de rutósido e isoquercitrina en concentración de 2-3% y 0.1%. Las bayas de saúco y las hojas tienen cantidades similares de rutósido en concentración de aproximadamente 0.2%. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Rutósido: R=rutinósido Isoquercitrina : R=glucósido Tabla 2. Rendimiento de extracción por 80% de metanol de rutósido e isoquercitrina de diferentes partes de S. nigra L.

El material vegetal de especies saúco posee un agradable sabor fuerte debido a sus constituyentes volátiles. Diversos alcanos han sido identificados en las hojas del saúco con heptacosano, nonacosano y hentriacontanos siendo cuantitativamente los más importantes. El aceite esencial de flores de saúco es elevado en ácidos grasos (66%) y n-alcanos (7.2%) . 79 compuestos se han identificado de la destilación por vapor del aceite esencial de flor de saúco (Toulemonde B et al . J Agrie Food Chem 31:365-370, 1983). Los constituyentes principales del aceite esencial son trans-3 , 7-dimetil-1 , 3 , 7 -octatrien-3 -ol (13%), ácido palmítico (11.3%), linalool (3.7%), cis-hexenol (2.5%) y cis- y trans-rose óxidos (3.4% y 1.7% respectivamente). El extracto de baya de saúco comercial principal contiene una concentración de antocianidina de 0.5% (Espin JC et al. J Agrie Food Chem 48:1588-1592, 2000). Las antocianidinas predominantes son cianidin-3 -monoglicósido (97%) y cianidin-3 , 5-diglicósido (3%). El concentrado también se caracterizó por la presencia de derivado de ácido caféico (0.011%) y rutósido (0.055). Se ha pensado mucho que los triterpenos y flavonoides son los constituyentes químicos principales responsables por la actividad biológica de las especies Sambuca (Blumenthal M et al. Herbal Medicine: Expanded Commission E Monographs , Integrative Medicine Communications, Newton, MA, 2000, pp . 103-105). Sin embargo, las cuatro principales antocianidinas parecen jugar un papel significante en la actividad anti-influenza de especies Sambuca. Estas antocianidinas se incorporan en la membrana de plasma y citosol de células endoteliales seguidas por una exposición de 4 horas en un extracto Sambuca (Youdin KA et al. Free Radie Biol Med 29:51-60, 2000). Tanto el enriquecimiento de células endoteliales de humano y animal con antocianidinas de especies Sambuca parece conferir efectos protectores contra factores estresantes oxidativos . Sin embargo, un extracto de bayas de especies Sambuca se han mostrado que tienen capacidad de absorción radical de oxígeno (Roy S et al. Free Radical Res 36:1023-1031, 2002). La lectina de especies Sambuca y las proteínas de inactivación de ribosomas también demuestran la actividad anti-viral (Vanderbussche F et al. Eur J Biochem 27:1508-1515, 2004; de Benito FM et al. FEBS Lett 428:75-79, 1998; Fujimura Y et al. Virchows Arch 444:36-42, 2003) . Un extracto estandarizado de bayas S. nigra (Sambucol®. Razei Bar, Jerusalem) (dosis para adulto de 4 g) , contienen 38% de extracto de bayas de saúco negras con antocianidinas combinadas con extracto Echinacea angustifolica (rizoma), Echinacea púrpura (tallo, hoja, y flor) extracto, Vitamina C (lOOmg) y zinc (10 mg) se han mostrado que exhiben las propiedades siguientes: inhibición de hemaglutinación producida por virus de influenza en humanos (Zakay-Rones Z et al . J Alternative & Complementary Medicine 1:361-369, 1995); inhibición de replicación viral en humanos e in vitro (Zakay-Rones Z et al . J Alternative & Complementary Medicine 1:361-369, 1995); la producción incrementada de citocinas inflamatorias y antiinflamatorias en humanos (Barak V et al. Isr Med Assoc J 4 (suppl 11): 919-922, 2002); hemaglutinación e inhibición de virus de influenza humana tipo A y tipo B in vitro (Zakay-Rones Z et al. J Alternative & Complementary Medicine 1:361-369, 1995); reducción de inefectividad de HIV in vitro (Zakay-Rones Z et al . J International Med Res 32:132-140, 2004); inhibición de cepas HSV-1 de replicación in vitro (Zakay-Rones Z et al . J International Med Res 32:132-140, 2004); reducción de colitis en el modelo de rata (Bobek P et al. Biología Bratislavia 56:643-648, 2002); reducción de síntomas de influenza en chimpancés (Gray AM et al . J Nutr 30:15-20, 2000); y una reducción demostrada de evaluación clínica aleatorizada en síntomas de influenza A y B en humanos (Zakay-Rones Z et al . J International Med Res 32:132-140, 2004). Hallazgos adicionales con otras composiciones de extracción derivadas de S. nigra incluyen: mejora de enzimas lisosomales, reducción de producción de productos de lipoxigenación y reducción de actividad de mieloperoxidasa in vitro (Bobek P et al. Biología Bratislavia 56:643-648, 2002); protección contra tensión oxidativa in vitro (Brouillard KaHSH. Chemical Structure of Antocianinas . Academic Press, New York, 1982); incremento en la capacidad de absorción radical de oxígeno in vitro (Bronnum-Hansen K et al. J Chromatography 262:393-396, 1983) y acciones de liberación de insulina y similar a insulina in vivo (Gray AM et al. J Nutr 30:15-20, 2000). Para resumir brevemente el valor terapéutico de los constituyentes químicos de S. nigra, la búsqueda científica y los estudios clínicos han demostrado los siguientes efectos terapéuticos de los diversos compuestos químicos, grupos químicos o composiciones de extracto de especies Sambuca las cuales incluyen: anti-viral, antiresfriado común, anti-influenza, anti-HIV, anti-HSV (triterpenos, antocianidinas , proteínas de lectina, polisacáridos , extractos sin purificar); anti-oxidantes y depuradores de radical libre oxígeno ( flavonoides , antocianidinas, extracto sin purificar); actividad antiinflamatoria (extracto sin purificar); actividad antidiabetes (polisacáridos, extracto soluble de agua) ; regulación de actividad del intestino y moderación de diarrea (extracto); y reducción de agitación y agitación (extracto) . Además, la flor de saúco S. nigra o composiciones de extracto de baya de saúco se consideran generalmente seguras con contraindicaciones no conocidas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende una fracción que tiene un cromatograma de espectrometría de masa de Análisis Directo en Tiempo Real (DART) de cualesquiera de las Figuras 36 a 70. En una modalidad adicional, la fracción tiene un cromatograma de espectrometría de masa DART de cualquiera de las Figuras 46 a 50. En una modalidad adicional, la fracción tiene un cromatograma de espectrometría de masa DART de la Figura 48. En un aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende una fracción que tiene una IC5o de 150 a 1500 /xg/mL tal como se mide en un virus de influenza HlNl . En una modalidad adicional, la fracción tiene una IC50 de 150 a 750 µg/ L. En una modalidad adicional, la fracción tiene una IC50 de 150 a 300 ízg/mL. En una modalidad adicional, la fracción tiene IC50 de al menos 195 µg/mL. En una modalidad adicional la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco de la presente invención, en donde la fracción comprende una antocianina ; flavonoide; ácido graso saturado o insaturado de 16 ó 18 átomos de carbono, alcohol, o éster; y/o un polisacárido . En una modalidad adicional, la antocianina se selecciona del grupo que consiste de cianidin-3 -glucósido y cianidin-3-sambuciósido . En una modalidad adicional, la cantidad de antocianinas es mayor que 10, 20, 30, 40 ó 50% en peso. En una modalidad adicional, el flavonoide es rutósido. En una modalidad adicional, el ácido graso saturado o insaturado de 16 ó 18 átomos de carbono, alcohol, o éster se selecciona del grupo que consiste de hexadecanol, ácido hexadecanoico , metiléster del ácido hexadecanoico , etiléster del ácido hexadecanoico, butiléster del ácido hexadecanoico, ácido octadecanoico , etiléster del ácido octadecanoico, butiléster del ácido octadecanoico, 9-octadecen-l-ol , ácido 9,12-octadecanienoico , y combinaciones de las mismas. En una modalidad adicional, la cantidad de ácido graso saturado o insaturado de 16 ó 18 átomos de carbono, alcohol, o éster es 2 , 4, 6, 8, o 10% en peso. En una modalidad adicional, el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de dextrano, glucosa, arabinosa, galactosa, ramnosa, xilosa, ácido urónico, y combinaciones de los mismos. En una modalidad adicional, la cantidad de polisacárido es 10, 15, 20, 25, 30, 35, o 40% en peso. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con un extracto saúco de la presente invención, en donde la fracción comprende una antocianina; ácido graso saturado o insaturado de 16 ó 18 átomos de carbono, alcohol, o éster; y un polisacárido. En una modalidad adicional, la antocianina se selecciona del grupo que consiste de cianidin-3 -glucósido y cianidin-3-sambuciósido . En una modalidad adicional, la cantidad de antocianina es mayor que 10, 20, 30, 40 ó 50% en peso. En una modalidad adicional, el ácido graso saturado o insaturado de 16 ó 18 átomos de carbono, alcohol, o éster se selecciona del grupo que consiste de hexadecanol, ácido hexadecanoico , metiléster del ácido hexadecanoico , etiléster del ácido hexadecanoico, butiléster del ácido hexadecanoico, ácido octadecanoico , etiléster del ácido octadecanoico , butiléster del ácido octadecanoico, 9-octadecen-l-ol , ácido 9 , 12-octadecanienoico , y combinaciones de las mismas. En una modalidad adicional, la cantidad de ácido graso saturado o insaturado de 16 ó 18 átomos de carbono, alcohol, o éster es 2 , 4, 6, 8, o 10% en peso. En una modalidad adicional, el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de dextrano, glucosa, arabinosa, galactosa, ramnosa, xilosa, ácido urónico, y combinaciones de los mismos. En una modalidad adicional, la cantidad de polisacárido es 10, 15, 20, 25, 30, 35, o 40% en peso . En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un alimento o medicamento que comprende el extracto de especies saúco de la presente invención. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para tratar a un sujeto por una infección viral que comprende administrar al sujeto con necesidad del mismo una cantidad efectiva del extracto de especies saúco de la presente invención. En una modalidad adicional, la infección viral se debe a un virus con envoltura. En una modalidad adicional, el virus con envoltura es un virus flavivirus . En una modalidad adicional, la infección viral se debe a un virus sin envoltura. En una modalidad adicional, la infección viral se debe a virus de aninfluenza, virus A y B de influenza humana, virus de gripe aviar, HlNl , H5N1, virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , SARs , virus de herpes simple (HSV) , flavivirus, dengue, fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental y encefalitis. En una modalidad adicional, la infección viral se debe al virus de Norwalk, hepatitis A, polio, andovirus o una rinovirus . En una modalidad adicional, el sujeto es un primate, bovino, aviar, ovino, equino, porcino, roedor, felino, o canino. En una modalidad adicional, el sujeto es un humano. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con un método para inhibir la infección viral de células que comprende las células con el extracto de especies saúco de la presente invención. En una modalidad adicional, la infección viral es una infección de virus con envoltura. En una modalidad adicional, la infección de virus con envoltura es una infección de flavivirus . En una modalidad adicional, la infección viral es una infección de virus sin envoltura. En una modalidad adicional, la infección viral es un virus de influenza, virus A y B de influenza humana, virus de gripe aviar, HlNl, H5N1, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), SARs, virus de herpes simple (HSV) , flavivirus, dengue, fiebre amarilla, infección del virus del Nilo Occidental y encefalitis. En una modalidad adicional, la infección viral es un virus de Norwalk, hepatitis A, polio, andovirus o una rinovirus. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para preparar un extracto de especies saúco que tiene por lo menos una característica predeterminada que comprende: extraer secuencialmente un material vegetal de especies saúco para producir una fracción de aceite esencial, una fracción polifenólica y una fracción de polisacárido al a) extraer un material vegetal de especies saúco por extracción supercrítica con dióxido de carbono para producir la fracción de aceite esencial y un primer residuo; b) extraer de ya sea un material vegetal de especies saúco o el primer residuo de la etapa a) agua salada a aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 70°C o una extracción hidro-alcohólica para producir la fracción polifenólica y un segundo residuo; y c) extraer el segundo residuo de la etapa b) por agua a aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 90°C extracción para producir la fracción de polisacárido. En otra modalidad la fracción de extracción puede llevarse a cabo con cualquiera de las especies ricas en antocianidinas y/o proantocianidinas tales como, por ejemplo, bayas de grosella negras, bayas de grosella rojas, grosella silvestre, arándanos, zarzamora, mora azul, cerezas, arándanos, bayas de acerolo, zarza de Longan, frambuesa, bayas púrpura, manzanas, granadas, membrillos, y ciruelas. En una modalidad adicional, la obtención de la fracción de aceite esencial comprende: 1) cargar en un material vegetal de especies saúco molidas en un recipiente de extracción; 2) agregar dióxido de carbono bajo cationes supercríticos ; 3) poner en contacto el material vegetal de especies saúco y dióxido de carbono durante un tiempo; y 4) recolectar una fracción de aceite esencial en un recipiente de recolección. En una modalidad adicional, los métodos de la presente invención además comprenden la etapa de alterar los índices del compuesto constituyente químico de aceite esencial fraccionando la extracción del aceite esencial con un sistema de separación fraccional supercrítico con dióxido de carbono. En una modalidad adicional, la fracción polifenólica se obtiene al 1) poner en contacto el material vegetal de especies saúco trituradas o el residuo de la etapa a) con agua a aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 70°C o una solución hidro-alcohólica por un tiempo suficiente para extraer constituyentes químicos polifenólicos ; 2) pasar la solución hidro-alcohólica de los constituyentes químicos polifenólicos extraídos de la etapa a) se adsorben a través de una columna de resina adsorbente de afinidad en donde los ácidos polifenólicos incluyen las antocianidinas ; y 3) eluir las fracciones constituyentes químicas polifenólicas purificadas de la resina adsorbente de afinidad. En una modalidad adicional, el método que obtiene la fracción de polisacárido comprende: 1) poner en contacto el segundo residuo de la etapa b) con agua a aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 90°C por un tiempo suficiente para extraer los polisacáridos ; y 2) precipitar los polisacáridos de la solución acuosa por la precipitación con etanol . En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco preparado por cualquiera de los métodos de la presente invención. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende pirogalol, ácido metilcinámico de 15 a 25% en peso del pirogalol, cinamida de 1 a 4% en peso del pirogalol, 2-metoxifenol de 5 a 10% en peso del pirogalol, benzaldehído de 1 a 2% en peso del pirogalol, cinamaldehído de 5 a 10% en peso del pirogalol, y acetato de cinamilo de 5 a 15% en peso del pirogalol . En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende rutosido, ácido ferúlico de 20 a 30% en peso de rutosido, ácido cinámico de 25 a 35% en peso de rutosido, ácido shikímico de 15 a 25% en peso de rutosido, y ácido fenilláctico de 55 a 65% en peso de rutosido. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende rutosido, taxifolina de 1 a 10% en peso de rutosido, ácido ferúlico de 1 a 5% en peso de rutosido, ácido cinámico de 1 a 5% en peso de rutosido, ácido shikímico de 0.5 a 5% en peso de rutosido, ácido fenilláctico de 1 a 5% en peso de rutosido, cianidina de 5 a 15% en peso de rutosido, y petunidina de 15 a 25% en peso de rutosido. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende rutosido, cianidina de 30 a 40% en peso de rutosido, petunidina de 75 a 85% en peso de rutosido, ácido vaníllico de 5 a 10% en peso de rutosido, ácido ferúlico de 1 a 5% en peso de rutosido, y ácido cinámico de 1 a 10% en peso de rutosido . En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende p-ácido coumárico/ácido fenilpirúvico , rutosido de 65 a 75% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , ácido vaníllico de 65 a 75% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , ácido ferúlico de 35 a 45% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , ácido cinámico de 65 a 75% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , y ácido shikímico de 45 a 55% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico . En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende rutósido, hesperidina de 20 a 30% en peso de rutósido, ácido vaníllico de 70 a 80% en peso de rutósido, y ácido cinámico de 40 a 50% en peso de rutósido. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende petunidina, rutósido de 85 a 95% en peso de la petunidina, ácido vaníllico de 55 a 65% en peso de la petunidina, y ácido cinámico de 30 a 40% en peso de la petunidina. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende rutósido, cianidina de 5 a 15% en peso de rutósido, taxifolina de 1 a 10% en peso de rutósido, ácido caféico de 5 a 15% en peso de rutósido, ácido ferúlico de 1 a 10% en peso de rutósido, ácido shikímico de 1 a 10% en peso de rutósido, petunidina de 25 a 35% en peso de rutósido, y eriodictiol o fustina de 1 a 5% en peso de rutósido. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un extracto de especies saúco que comprende rutósido, cianidina de 10 a 20% en peso de rutósido, eriodictiol o fustina de 1 a 5% en peso de rutósido, naringenina de 10 a 20% en peso de rutósido, y taxifolina de 1 a 10% en peso de rutósido. Estas modalidades de la presente invención, otras modalidades, y sus rasgos y características, serán aparentes a partir de la descripción, dibujos y reivindicaciones que siguen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa un diagrama esquemático ejemplar del proceso de extracción de especies saúco de acuerdo con la presente invención. La Figura 2 representa un diagrama esquemático ejemplar del proceso de extracción de especies saúco de acuerdo con la presente invención. La Figura 3 representa un diagrama esquemático ejemplar del proceso de extracción de especies saúco de acuerdo con la presente invención. La Figura 4 representa un diagrama esquemático ejemplar del proceso de extracción de especies saúco de acuerdo con la presente invención. La Figura 5 representa un sistema de ensayo de entrada viral que utiliza HlNl tipo A humano. Las células MDCK se incubaron solamente con virus (superior izquierda; 10-4 Flu A), sin virus (inferior izquierda; PBS) , virus mezclado con un anticuerpo del virus anti-influenza a una concentración de 1:1,000 (superior derecha; 1:1000 Ab) y una concentración de 1:500 (inferior derecha; 1:500 Ab) . Cada experimento se hizo por triplicado. Cada mancha roja castaña indica un evento de infección viral . La inhibición o reducción del virus en el número de manchas de color se detecta en los controles de anticuerpos . La Figura 6 representa un ejemplo de un ensayo de inhibición que utiliza desabsorción F4 de fracción de antocianina ADS5 de la baya de saúco B y virus H1N1 tipo A de influenza humana. Diluciones seriales (no diluidas a diluciones 1:32) fracción de desabsorción F4 , fracción de antocinina ADS5 de la baya de saúco B donde se pre- incuba con el virus antes de la incubación con células MDCK. Cada experimento se hace por triplicado. Las manchas corresponden a un evento de infección viral . La inhibición del virus se indica por una reducción en el número de manchas . La Figura 7 representa un ensayo de inhibición usando desabsorción F4 de fracción de antocinina ADS5 de la baya de saúco B y virus H1N1 tipo A de influenza humana. Diluciones seriales (no diluidas en diluciones 1:32) de la fracción de desabsorción F4 de fracción de antocinina ADS5 de la baya de saúco B donde se pre-incuba con el virus antes de la incubación con células MDCK. Cada experimento se hace por triplicado. Las manchas parduzcas rojas corresponden a un evento de infección viral . La inhibición del virus se indica por una reducción en el número de manchas de color. La Figura 8 representa un ensayo de inhibición usando desabsorción F4 de fracción de antocinina ADS5 de la baya de saúco B y virus H5N1 tipo A de influenza humana. Diluciones seriales (no diluidas en diluciones 1:32) de la desabsorción de la fracción F4 de fracción de antocinina ADS5 de la baya de saúco B donde se pre-incuba con el virus antes de la incubación con células MDCK. Cada experimento se hace por triplicado. Las manchas parduzcas rojas corresponden a un evento de infección viral . La inhibición del virus se indica por una reducción en el número de manchas de color. La Figura 9 representa el ensayo de inhibición para el HIV-1 SG3 quimérico (genoma) subtipo C (con envoltura) . +, es el control de infección positivo; F4 , es la fracción F4 de extracción de bayas de saúco; y T es titulación del virus utilizado en el ensayo. La Figura 10 representa ensayos de viabilidad MTT para fracción de desabsorción F2 , fracciones de antocinina ADS5 de baya de saúco B en células T 293. La Figura 11 representa ensayos de viabilidad MTT para fracción de desabsorción F2 , fracciones de antocinina ADS5 de baya de saúco B en células MDCK. La Figura 12 representa ensayos de viabilidad MTT para fracción de desabsorción F4, fracciones de antocinina ADS5 de baya de saúco B en células T 293 después de 24 horas . La Figura 13 representa ensayos de viabilidad MTT para fracción de desabsorción F4, fracciones de antocinina ADS5 de baya de saúco B en células T 293 después de 44 horas . La Figura 14 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F2 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B. La Figura 15 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F3 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B. La Figura 16 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F4 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B. La Figura 17 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F2 , flor de saúco XAD 7HP.

La Figura 18 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F3 , flor de saúco XAD 7HP. La Figura 19 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F3 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B sin tampón utilizando Virus H1N1. La Figura 20 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F3 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B sin tampón utilizando virus HlNl . La Figura 21 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para fracción de desabsorción F2 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B sin tampón utilizando virus HlNl . La Figura 22 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para fracción de desabsorción F4 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B sin tampón utilizando virus HlNl . La Figura 23 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para fracción de desabsorción F4 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B amortiguadas utilizando virus HlNl . La Figura 24 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F4 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B sin tampón utilizando virus HlNl. La Figura 25 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F4, fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B amortiguadas utilizando virus H5N1. La Figura 26 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para fracción de desabsorción F4 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B amortiguadas utilizando virus H5N1. La Figura 27 representa las curvas de respuesta de dosis de inhibición de la infectividad combinada para los extractos probados. La Figura 28 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F2 , flor de saúco ADS5 amortiguada utilizando virus HlNl . La Figura 29 representa HlNl de IC50 calculada para la fracción F2 de flor de saúco. La Figura 30 representa una comparación de HlNl de IC50 calculada para la fracción F4 de baya de saúco y fracción F2 de flor de saúco. La Figura 31 representa una comparación de HlNl de IC50 para la fracción F4 de baya de saúco y fracción F" de flor de saúco. La Figura 32 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la desabsorción F2 de la fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B utilizando el virus del dengue tipo 2. La Figura 33 representa la fracción de desabsorción F4 de fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B de curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad utilizando el virus HIV. La curva muestra 100% de inhibición a la concentración indicada. La Figura 34 representa la fracción de desabsorción F4 de fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B de curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad utilizando el virus HIV. La curva muestra 100% de inhibición a la concentración indicada. La Figura 35 representa la curva de respuesta de dosis de inhibición de infectividad y 50% de concentración inhibitoria para la fracción de desabsorción F4 , fracción de antocinina ADS5 de baya de saúco B utilizando el virus HIV. La Figura 36 representa Espectro de Masa AccuTOF- DART para polisacárido de baya de saúco (modo iónico positivo) . La Figura 37 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para polisacárido de baya de saúco (modo iónico negativo) . La Figura 38 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para polisacárido de flor de saúco (modo iónico positivo ) . La Figura 39 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para polisacárido de flor de saúco (modo iónico negativo ) . La Figura 40 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para materia prima de baya de saúco completa con posibles estructuras descritas (modo iónico positivo) . Donde se detectaron ácido metilcinámico (163.0688) (abund. =19.47 ) , cinamida ( 148.0826 ) (abund . = 2.63), 2-metoxifenol ( 125.0599 ) (abund . =7. 4 ) , 3-metoxi-l-tirosina (212.0985) (abund. =17.42) , benzaldehído (107.0422) (abund . =1.10 ) , cinamaldehído ( 133.0568 ) ( abund . =6.56 ) , acetato de cinamilo ( 177.0956 ) ( abund . = 8.51), y pirogalol ( 127.0344 ) (abund . =93.67 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como CeH804 + H+ (en 145.0469) y C6H603 + H+ (en 127.0344) . La Figura 41 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para materia prima de baya de saúco completa con posibles estructuras descritas (modo iónico negativo) . Se detectaron ácido cinámico ( 147.0385 ) (abund . = 5.57), cinamaldehído ( 131.04 ) (abund. = 5.57), pirogalol (125.024) (abund. = 3.54), quercetina ( 301.0253 ) ( abund . = 0.73), ácido ursólico (455.3518 ) (abund. =10.99 ) , y ácido shikímico (173.0454) (abund. =7.18) . La Figura 42 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una extracción de materia prima de bayas de saúco completa con un 80% de solución de EtOH (modo iónico positivo) . Los compuestos no identificados se detectaron como C6Hi0O5 + H+ (163.0601) (abund. =17.19) y C14H15 O + H+ (214.1266) (abund. = 24.06). La Figura 43 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F2 utilizando material de empaque de desabsorción ADS 5 (modo iónico positivo) . Se detectaron rutósido o delfinidina (303.0541) (abund. =59.28) , ácido ferúlico (195.0755) (abund. =13.54) , ácido cinámico ( 149.0572 ) ( abund . =19.55 ) , ácido shikímico ( 175.0699 ) (abund . =11.72 ) , y ácido fenilláctico ( 167.0793 ) (abund . = 36.17). Los compuestos no identificados también se detectaron como C6H603 + H+ (127.0348) (abund. =100) y C7H604 + H+ ( 155.0335 ) (abund . = 59.18) . La Figura 44 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F3 utilizando material de empaque de desabsorción ADS 5 (modo iónico positivo) . Se detectaron rutósido o delfinidina (303.0521) (abund. =100) , taxifolina (305.0693 ) (abund. = 4.25), ácido ferúlico ( 195.075 ) ( abund . =1.34 ) , ácido cinámico ( 149.0552 ) ( abund . = 3.32), ácido shikímico (175.0696) (abund. = 0.96), ácido fenilláctico (167.0701) (abund. = 3.97), cianidina (287.0622 ) (abund. = 8.36), y petunidina (317.0707 ) (abund. = 21.71). Los compuestos no identificados también se detectaron como C10Hi2O3 + H+ (181.0854) (abund. =9.71) y Ci3H14N202 + H+ (231.1163) (abund. = 5.85) . La Figura 45 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F4 utilizando material de empaque de desabsorción ADS 5 (modo iónico positivo) . Se detectaron rutósido o delfinidina (303.0534) (abund. =100) , ácido ferúlico ( 195.0744 ) (abund. = 3.32), ácido cinámico ( 149.057 ) (abund . =6.36 ) , cianidina (287.0608) (abund. = 36.44), petunidina (317.0691) (abund. =78.75) , y ácido vaníllico ( 169.0524 ) ( abund . =7.75 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como C29Hi807 + H+ (479.1218) (abund. = 22.62) y Ci2H1404 + H+ (223.0994) (abund. = 21.56). La Figura 46 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F2 utilizando material de empaque de desabsorción ADS 5 de antocianina de bayas de saúco B (modo iónico positivo) . Esta fracción se utilizó en un ensayo antiviral utilizando HlNl resultando en una IC5o = 333 µg/mL. Se detectaron rutósido o delfinidina ( 303.0566 ) (abund . =18.33 ) , ácido ferúlico ( 195.0724 ) (abund. =10.32 ) , ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico ( 165.0639 ) (abund. 25.54), ácido cinámico (149.0573) (abund. =17.86) , ácido shikímico (175.0633) (abund. =12.62 ) , y ácido vaníllico ( 169.0575 ) (abund. =18.01 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como Ci3H O + H+ (183.0818) (abund. = 43.33) y Ci4H17N03 + H+ (248.1271) (abund. =60.28) . La Figura 47 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F3 utilizando material de empaque de desabsorción ADS 5 de antocianina de bayas de saúco B (modo iónico positivo) . Esta fracción se utilizó en un ensayo antiviral utilizando HlNl resultando en una IC50 = 294 g/mL. Se detectaron rutósido o delfinidina (303.0553 ) (abund. = 41.74), hesperina (287.0936) (abund. =10.41) , ácido cinámico (149.0584) (abund. =17.85) , y ácido vaníllico ( 169.0571 ) ( abund . = 31.09). Los compuestos no identificados también se detectaron como C8H8o + H+ ( 121.0586 ) (abund . = 29.36) y Ci4H2o 203 + H+ o C15H20O + H+ (265.1469) (abund. = 26.23). La Figura 48 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F4 utilizando material de empaque de desabsorción ADS 5 de antocianina de bayas de saúco B (modo iónico positivo) . Esta fracción se utilizó en un ensayo antiviral utilizando H1N1 resultando en una IC50 =195 µg/mL. Se detectaron rutósido o delfinidina (303.0557) (abund. = 20.27), ácido cinámico (149.0593) (abund. =7.94 ) , petunidina (317.071) (abund. = 22.09), y ácido vaníllico ( 169.0538 ) (abund. =12.82 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como C6H10O5 + H+ (163.076) (abund. =63.28) y C17Hi80 + H+ (239.1531) (abund. = 26.32). La Figura 49 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F2 utilizando material de empaque de desabsorción XAD 7HP de la flor de saúco (modo iónico positivo) . Esta fracción se utilizó en un ensayo antiviral utilizando HlNl resultando en una IC5o =1,592 µg/mL. Se detectaron cianidina (287.0588) ( abund. =10.92 ) , rutósido o delfinidina (303.0531) (abund. =100) , taxifolina (305.0651) (abund. = 4.69), ácido caféico/ácido 4-hidroxifeniláctico (181.0589) (abund. =9.45) , ácido ferúlico ( 195.0741 ) ( bund . = 3.33), ácido shikímico ( 175.0645 ) (abund . = 3.11) , petunidina (317.0689) (abund. = 29.48) , y eriodictiol o fustina (288.0709) (abund. = 2.36) . Los compuestos no identificados también se detectaron como ?10?13??2 + H+ (180.1024) (abund. =15.98) y C8H6N20 + H+ o C9H602 + H+ (147.0545) (abund. =73.50) . La Figura 50 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para una fracción de cromatografía en columna F3 utilizando material de empaque de desabsorción XAD 7HP de flor de saúco (modo iónico positivo) . Esta fracción se utilizó en un ensayo antiviral utilizando H1N1 resultando en una IC50 = 582 µg/mh. Se detectaron cianidina (287.0574) (abund. =17.16) , rutósido o delfinidina (303.0518) (abund. =100) , taxifolina (305.0658 ) (abund. = 5.54) , naringenina/buteina/floretina (273.0797) (abund. =16.06 ) , y eriodictiol o fustina (289.0795 ) (abund. = 3.14) . Los compuestos no identificados también se detectaron como Ci0H16O + H+ (153.1268) (abund. = 30.96) y C23H14O4 + H+ (355.1048) (abund. = 30.03) . La Figura 51 representa Espectro de Masa AccuTOF- DART para #185 (modo iónico positivo) . Se detectaron ácido cinámico (149.0616) (abund. = 3.82) , ácido shikímico (175.0613) (abund. =14.71) , y ácido fenilláctico (167.074) (abund. = 5.35) . Los compuestos no identificados también se detectaron como C30H46O2 + H+ ( 439.3625 ) ( abund . =16.49 ) y C39H6805 + H+ (617.5151) (abund.= 4.09). La Figura 52 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #319 (modo iónico positivo) . Se detectaron ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico ( 165.0604 ) (abund . = 3.96), ácido cinámico ( 149.0579 ) (abund. = 0.48), ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (225.0816 ) (abund. =10.59 ) , ácido shikímico ( 175.0569 ) (abund. = 5.37), y ácido fenilláctico (167.0773) (abund. = 2.71). Los compuestos no identificados también se detectaron como CeHgC + H+ (145.0507) (abund. =100) y Ci2H1206 + H+ ( 253.0708 ) (abund . = 35.27) . La Figura 53 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #322 (modo iónico positivo) . Se detectaron delfinidina ( 304.0576 ) (abund . = 8.75), rutósido (303.057) (abund. = 49.28), eriodictiol / fustina (289.0752) (abund. =13.50) , taxifolina ( 305.0638 ) ( abund . = 3.41), ácido ferúlico ( 195.0745 ) ( abund . =7.1 ) , ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico (165.0613 ) (abund. =16.91) , ácido cinámico (149.0695) (abund. = 3.20), ácido shikímico ( 17 .067 ) (abund . = 8.34), y ácido fenilláctico ( 167.0722 ) (abund . = 8.84). Los compuestos no identificados también se detectaron como C6H603 + H+ (127.0413 ) (abund. =100) y C H1505 + H+ (227.0876) (abund. = 29.26). La Figura 54 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #324 (modo iónico positivo) . Los compuestos no identificados se detectaron como C37H66C>4 + H+ (575.51) (abund.= 5.42) y C59H8805 + H+ (877.67) (abund.=15.46) . La Figura 55 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #325 (modo iónico positivo) . Se detectó ácido shikímico (175.0658) ( abund . =6.05 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como C16H14O4 + H+ (271.0941) (abund. = 22.24) y Ci6H1605 + H+ (289.0983) (abund. =15.76) . La Figura 56 representa Espectro de Masa AccuTOF- DART para #326 (modo iónico positivo) . Se detectó ácido cinámico (149.0681) (abund. = 2.67). Los compuestos no identificados también se detectaron como C22H42O4 + H+ (371.3196) (abund. = 46.60) y Ci8H3o02 + H+ ( 279.2346 ) (abund . = 20.28) . La Figura 57 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #327 (modo iónico positivo) . Los compuestos no identificados se detectaron como CsH80 + H+ (121.0663 ) (abund. =66.34) y C8H802 + H+ ( 137.065 ) (abund. = 20.16). La Figura 58 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #328 (modo iónico positivo) . Se detectaron ácido ferúlico (195.0737) (abund. = 4.04), ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico (165.0604 ) (abund. = 3.67), ácido cinámico (149.0691) (abund. = 3.49), ácido 3 , 5-dimetoxi-4- hidroxicinámico (225.0817) (abund. = 5.18), ácido shikímico (175.0616) (abund. = 4.88), y ácido fenilláctico (167.0786) (abund.= 2.63). Los compuestos no identificados también se detectaron como C6Hi0O5 + H+ (163.0602 ) (abund. =10.84) y Ci2Hi407 + H+ (271.0829 ) (abund. = 21.7) . La Figura 59 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #329 (modo iónico positivo) . Se detectaron ácido cinámico (149.0621) ( abund . =1.43 ) y ácido shikímico (175.0633) (abund. = 3.23). Los compuestos no identificados también se detectaron como C2iH3603 + H+ (337.2763) (abund. =13.38) y C39H66O + H+ ( 599.507 ) ( abund . = 5.53). La Figura 60 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #330 (modo iónico positivo) . Se detectaron ácido ferúlico (195.0747) (abund. = 2.76), ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico (165.0608) (abund. = 2.42), ácido cinámico (149.0616) (abund. = 0.79), ácido 3 , 5-dimetoxi-4-hidroxicinámico (225.0824) (abund. = 2.98), ácido shikímico (175.0604) (abund. = 2.55), y ácido fenilláctico (167.078) (abund . =1.95 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como C14H14O4 + H+ (247.0895) (abund. = 4.28) y C3oH4602 + H+ (439.3619) (abund. = 5.98) . La Figura 61 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #185 (modo iónico negativo) . Se detectaron hesperidina ( 285.0841 ) ( abund . = 0.44) y floridzina (255.0711) (abund.= 0.71). Los compuestos no identificados también se detectaron como C4H605 - H+ (133.0134) (abund. =100) y C10H8O4 - H+ ( 191.0325 ) (abund. = 25.34) . La Figura 62 representa Espectro de Masa AccuTOF- DART para #319 (modo iónico negativo) . Se detectó ácido cinámico (147.0358) (abund. = 0.67). Los compuestos no identificados también se detectaron como C4H605 - H+ (133.0135) (abund. = 86.11) y C10H8O4 - H+ (191.0195) (abund. =100) . La Figura 63 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #322 (modo iónico negativo) . Se detectaron cianidina (286.0502 ) (abund. = 5.30), delfinidina (302.0388) (abund. =18.51) , pelargonidina (270.0512 ) (abund. = 0.34), miricetina (317.0315 ) (abund. =13.27 ) , rutósido (301.0324) (abund. =100) , silibina/genisteina ( 269.0399 ) (abund . = 0.42), flavona 3-OH (237.0587 ) (abund. = 0.89), eriodictiol / fustina (287.0592) (abund. =7.09 ) , catequina/epitcatequina (289.0784) (abund. = 5.29), taxifolina ( 303.0468 ) (abund. = 5.31), floridzina (255.0614) (abund. = 0.81), ácido vaníllico (167.0416) (abund. = 4.07), ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico ( 163.0307 ) (abund . =12.95 ) , ácido 3 , 5-dimetoxi-4-hidroxi cinámico (223.054) (abund. = 0.80), ácido gálico (169.0166) (abund. =1.73 ) , y ácido shikímico (173.0475) ( abund . =1.11 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como C10H8O4 - H+ ( 191.0532 ) (abund. = 31.51) y C22H22013 - H+ (493.0955) (abund. = 4.42). La Figura 64 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #324 (modo iónico negativo) . Se detectaron eriodictiol/fustina ( 287.065 ) (abund . = 0.99), catequina/epitcatequina ( 289.0726 ) (abund . = 0.92), ácido ursólico (455.3465) (abund. = 0.87), ácido vaníllico (167.0388) (abund. =1.89 ) , ácido ferúlico (193.0478) ( abund . =7.35 ) , ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico (163.0404) (abund. = 5.66), ácido cinámico ( 147.0373 ) (abund . = 5.97), y ácido shikímico ( 173.0373 ) ( abund . =10.00 ) . Los compuestos no identificados también se detectaron como Ci6H1404 - H+ (269.0878) (abund. = 21.98) y C23Hi803 - H+ (341.1193) (abund. =12.27) . La Figura 65 representa Espectro de Masa AccuTOF- DART para #325 (modo iónico negativo) . Los compuestos no identificados se detectaron como C4H605 - H+ (133.0118) (abund. =100) y Ci0H8O4 - H+ (191.0183 ) (abund. = 81.19). La Figura 66 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #326 (modo iónico negativo) . Se detectaron rutósido (301.0441) (abund. = 31.62), flavona 3-OH (237.062) (abund. = 0.74), catequina/epitcatequina ( 289.079 ) ( abund . = 2.70), floridzina (255.0687 ) (abund. = 2.24), ácido ursólico (455.3556) ( abund . -? .43 ) , ácido caféico/ácido 4-hidroxifeniláctico (179.0398) ( abund . =12.26 ) , ácido ferúlico ( 193.051 ) (abund . =7.63 ) , ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico (163.0405) (abund. = 8.75), ácido cinámico (147.0414) (abund. = 3.24), y ácido shikímico (173.0452) (abund. = 23.59) . Los compuestos no identificados también se detectaron como C5H604 - H+ ( 129.0178 ) ( abund . =100 ) y C16Hi608 - H+ (335.0807) (abund. = 25.82). La Figura 67 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #327 (modo iónico negativo) . Se detectaron flacona 3-OH (237.0524 ) (abund. = 0.26), hesperidina (285.0822 ) (abund. = 0.63), catequin/epitcatequina (289.0732) (abund. = 0.11), floridzina ( 255.0706 ) ( abund . = 0.82), 3,5-dimetoxi-4-hidroxi ácido cinámico (223.0543 ) (abund. = 0.09), y ácido corismico (225.0489 ) (abund. = 0.10). Los compuestos no identificados también se detectaron como C4H605 - H+ (133.0117) (abund. =100) y C20H2o07 - H+ ( 371.1175 ) (abund . = 2.39) . La Figura 68 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #328 (modo iónico negativo) . Se detectaron rutósido (301.0446) (abund. = 0.62), floridzina (255.0744) (abund. = 0.05), y ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico (163.0386) (abund. = 0.36). Los compuestos no identificados también se detectaron como C5H805 - H+ (147.0293 ) (abund. =7.50) y C6H606 - H+ (173.0099) (abund. =7.84) . La Figura 69 representa Espectro de Masa AccuTOF- DART para #329 (modo iónico negativo) . Los compuestos no identificados se detectaron como C6Hi0O5 - H+ (161.04) (abund. = 2.97) y C8H1207 - H+ (219.05 ) (abund. = 3.64) . La Figura 70 representa Espectro de Masa AccuTOF-DART para #330 (modo iónico negativo) . Los compuestos no identificados se detectaron como C5H4O3 - H+ (111.01) (abund. =12.32) y C6H1206 - H+ ( 179.05 ) ( abund . =1.20 ) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los artículos "un" y "uno" se utilizan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir al menos uno) del objeto gramatical. Por medio del ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. El término "antocianidina" es la técnica reconocida y se refiere a compuestos que comprenden derivados de catión flavilio. El término "antocianinas " es la técnica reconocida y se refiere a antocianidinas con un grupo de azúcar. Son principalmente 3-glucósidos de las antocianidinas . Las antocianinas se subdividen en aglicones de antocianidina y glicósidos de antocianidina libres de azúcar . El término "cápsida" es la técnica reconocida y se refiere a una cubierta de proteína que rodea y protege el ácido nucleico de los virus (ADN o ARN) . Los términos "comprende" y "que comprende" se utilizan en el sentido abierto global, significa que los elementos adicionales pueden incluirse. El término "que consiste" se utiliza para limitar los elementos a aquellos especificados excepto por las impurezas ordinariamente asociadas con esto. El término "que consiste esencialmente de" se utiliza para limitar los elementos a aquellos especificados y aquellos que no afectan materialmente las características básicas y novedosas del material o etapas. El término "cianidina" o " flavon-3 -ol " es la técnica reconocida y se refiere a un compuesto orgánico natural clasificado como un flavonoide y una antocianina. Es un pigmento encontrado en muchas moras rojas incluyendo pero sin limitarse a arándano, mora negra, mora azul, cereza, arándano agrio, bayas de saúco, acerolo, zarza de Logan, mora acaí y frambuesa. Puede también encontrarse en otras frutas tal como manzanas y ciruelas. El término "cantidad efectiva" como se utiliza en la presente se refiere a la cantidad necesaria para obtener la respuesta biológica deseada. Como se apreciará por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, la cantidad efectiva de un compuesto o agente bioactivo puede variar dependiendo de los factores como el punto final biológico deseado, el agente bioactivo a ser suministrado, la composición de la matriz de encapsulación, el tejido objetivo, etc. Como se utiliza en la presente, "saúco" se refiere al material de plantas Sambuca derivado de las especies botánicas Sambuca. El término "saúco" se utiliza también de forma intercambiable con especies saúco, especies Sambuca, y bayas de saúco y medios de estas plantas, clones, variantes, y manchas, etc. Como se utiliza en la presente, el término "constituyente saúco" deberá significar los compuestos químicos encontrados en las especies saúco y indicará todos los compuestos químicos identificados en lo anterior así como otros compuestos encontrados en especies saúco, incluyendo pero sin limitar a los constituyentes químicos de aceite esencial, ácidos polifenólicos , y polisacáridos . Como se utiliza en la presente, el término "virus con envoltura" se refiere a un virus que comprende una bicapa de lípidos que contiene glicoproteínas virales derivadas de una membrana de célula huésped. En un virus con envoltura, las proteínas virales que median la unión y penetración dentro de la célula huésped se encuentran en la envoltura. Los ejemplos de virus con envoltura incluyen influenza, tanto humana como aviar, HIV, SARs , HPV, virus de herpes simple (HSV) , dengue, y flavi-virus, tal como por ejemplo, fiebre amarilla, fiebre del virus occidental, y virus de encefalitis. Como se utiliza en la presente, el término "fracción de aceite esencial" comprende lípido soluble, compuestos insolubles en agua obtenidos o derivados de saúco y especies relacionadas incluyendo, pero sin limitarse al compuesto químico clasificado como ácido linoelaídico . Como se utiliza en la presente, el término "sub-fracción de aceite esencial" comprende lípido soluble, compuestos insolubles en agua obtenidos o derivados de saúco y especies relacionadas incluyendo, pero sin limitarse al compuesto químico clasificado como ácido lineolaídico que tiene concentraciones mejoradas o reducidas de compuestos específicos encontrados en el aceite esencial de especies saúco. Como se utiliza en la presente, "materia prima" generalmente se refiere a material vegetal sin refinar, que comprende solamente todos los vegetales, o en combinación con una o más partes de constituyentes de un vegetal que comprende hojas, raíces, incluyendo, pero sin limitarse a, raíces principales, raíces principales, y raíces de fibra, tallo, corteza, hojas, bayas, semillas, y flores, en donde las partes de vegetal o constituyentes pueden comprender material que está sin refinar, desecado, vaporizado, calentado o de otra manera sometido a procedimiento físico para facilitar el procedimiento, el cual puede además comprender material que está intacto, cortado en trozos, cortado en cuadros, triturado, molido o de otra manera procesado para afectar el tamaño e integridad física del material vegetal. Ocasionalmente, el término "materia prima" puede utilizarse para caracterizar un producto de extracción que debe utilizarse como fuente de alimento para procesos de extracción adicionales. Un " flavi-virus" es un subgrupo de virus con envoltura. Existen generalmente virus encontrados en animales que tienen humanos infectados al adquirir unas envolturas de bicapa de lípido. Ejemplos de flavi-virus incluyen fiebre amarilla, dengue, fiebre del virus occidental, y virus de encefalitis. Como se utiliza en la presente, el término "fracción" significa la composición de extracción que comprende un grupo específico de compuestos químicos caracterizados por ciertas propiedades físicas, químicas o propiedades físicas o químicas. El término "incluyendo" se utiliza en la presente para dar a entender "incluyendo pero sin limitarse a" . "Incluyendo" e "incluyendo pero sin limitar a" se utilizan intercambiablemente .

Como se utiliza en la presente, el término "virus sin envoltura" se refiere a un virus que carece de una bicapa de lípidos. En virus sin envolturas la cápsida se media la unión a, y penetración dentro de las células huésped. Ejemplos de virus sin envolturas incluyen virus Norwalk, hepatitis A, polio, y rinovirus . Como se utiliza en la presente, el término "uno o más compuestos" significa que al menos un compuesto, tal como, pero sin limitarse a, ácido linoelaidico (un constituyente químico de aceite esencial de lipido soluble de especies saúco) , o cianidin-3 -glucósido (un polifenólico soluble en agua de especies saúco) o se pretende una molécula de polisacárido de especies saúco, o se pretende más de un compuesto, por ejemplo, ácido linoelaidico y cianidin-3 -glucósido . Como se conoce en la técnica, el término "compuesto" no significa una molécula sencilla, pero si múltiples o moles de uno o más compuestos. Como se conoce en la técnica, el término "compuesto" significa un constituyente químico específico que prosee propiedades químicas y físicas distintas, mientras que los "compuestos" se refieren a uno o más constituyentes químicos . Un "paciente," "sujeto" o "huésped" a ser tratado por el método objeto puede ser un primate (por ejemplo humano), bovino, ovino, equino, porcino, roedor, felino, o canino .

El término "sales farmacéuticamente aceptables" es la técnica reconocida y se refiere a las sales de adición del ácido relativamente no tóxicas, inorgánicas u orgánicas de los compuestos, incluyendo, por ejemplo, aquellas contenidas en composiciones de la presente invención . Como se utiliza en la presente, el término "fracción polifenólica" comprende compuestos de ácido polifenólicos solubles en agua y solubles en etanol obtenidos o derivados de saúco y especies relacionadas, además comprende, pero no se limita a, compuestos tal como rutósido, y cianidin-3-glucósido . Como se utiliza en la presente, el término "fracción de polisacárido" comprende compuestos de proteína de lactina y polisacáridos solubles en agua-solubles en etanol obtenidos o derivados de saúco y especies relacionadas . Otros constituyentes químicos de saúco pueden también presentarse en estas fracciones de extracción. El término "proantocianinas " como se utiliza en la presente se refiere a dímeros, trímeros, y quadifers de antocianinas . Como se utiliza en la presente, el término "perfil" se refiere a los índices de por ciento de peso en masa de los compuestos químicos dentro de la fracción de extracción o sub-fracción en los índices del por ciento en cada uno de los tres constituyentes químicos de fracción saúco en una composición de extracción de saúco final . Como se utiliza en la presente, el término fracción "purificada" o extracción significa una fracción o extracción que comprende un grupo específico de compuestos caracterizado por ciertas propiedades químicas que se concentran mayor que 10% en peso de masa de los constituyentes químicos de la extracción. En otras palabras, una fracción o extracción comprende menos de 80% de compuestos constituyentes químicos que no se caracterizan por ciertas propiedades físicas-químicas deseadas o propiedades físicas o químicas que definen la fracción o extracción. El término "sinergístico" es la técnica reconocida y se refiere a dos o más componentes que trabajan juntos de modo que el efecto total es mayor que la suma de los componentes . El término "tratar" es la técnica reconocida y se refiere a curar así como mejorar al menos un símbolo que mejora al menos un síntoma de cualesquier condición o trastorno . El término "virus" es la técnica reconocida y se refiere a entidades biológicas no celulares que carecen de maquinaria metabólica o de su propiedad y reproduce al utilizar que de una célula huésped. Los virus comprenden una molécula de ácido nucleico (ADN o AR ) y pueden ser virus con envolturas o sin envolturas.

Composiciones La presente invención comprende composiciones de fracciones aisladas y purificadas de aceites esenciales (o sub-fracciones de aceite esencial), ácidos poli fenólicos , y polisacáridos de una o más especies saúco. Estas composiciones de fracción individual pueden combinarse en proporciones específicas (perfiles) para proporcionar composiciones de combinación benéfica y pueden proporcionar productos de extracto viales o reproducibles que no se encuentren en los productos de extracto actualmente conocidos. Por ejemplo, una fracción de aceite esencial o sub-fracción de unas especies puede combinarse con una fracción de aceite esencial o sub-fracción a partir de las mismas o diferentes especies o con una fracción de ácido polifenólico de las mismas o diferentes especies, y que en combinación pueden o no pueden combinarse con una fracción de polisacárido de las mismas o diferentes especies saúco. La composición de especies saúco extraída pueden comprende cualquiera de una, dos, o tres de las fracciones de extracto concentradas dependiendo de los efectos biológicos benéficos deseados para el producto dado.

Típicamente, una composición contiene las tres fracciones de extracción de especie saúco que se desean generalmente tal como composiciones novedosas que representan los primeros productos de extracción de especie saúco altamente purificados que contienen tres de los constituyentes químicos benéficos biológicos principales encontrados en el material vegetal nativo. Las modalidades de la invención comprenden métodos donde las características predeterminadas comprende una concentración selectivamente incrementada, predeterminada de los constituyentes químicos de aceite esencial de las especies saúco, antocianidinas polifenólicas , y polisacáridos en fracciones de extracción separadas . En particular, las composiciones de la presente invención tienen cantidades elevadas de antocianinas relativas a composiciones conocidas que incluyen aquellas encontradas en la naturaleza. Las antocianinas son antioxidantes potentes, químicos altamente activos que se han asociado incrementadamente con una variedad de beneficios saludables, incluyendo protección contra enfermedad del corazón y cáncer. Además de sus propiedades antioxidantes', se ha reportado que también pueden utilizarse antocianinas para tratar diabetes, producción de insulina reforzada hasta 50%. Las composiciones de la presente invención pueden comprender cantidades elevadas de antocianmas como el ingrediente activo único, o las composiciones pueden contener otros ingredientes activos asociados con saúco. Ejemplos de otros ingredientes activos incluyen ácidos grasos de 16 ó 18 átomos de carbono, alcoholes, o ésteres encontrados en la fracción de aceite esencial, o un polisacárido encontrado en la fracción de polisacárido . Antocianina y flavonoide pueden concentrarse y describirse por tecnología adsorbente de polímero (PA) . Amplio rango de adsorbente de polímero puede utilizarse en tal aplicación, tal como Amberlita XAD4 , XAD7HP (Rohm-Hass), Dialon HP20, HP21, SP825 (Mitsubishi), ADS 5, ADS 17 (Naikai University) . El principio de operación de procesamiento PA se basa en "igual atrae a igual" (si el adsorbato permanecerá unido al adsorbente o se disolverá en el eluyente dependiendo de la resistencia relativa) . Ejemplos de XAD7HP y ADS5 de utilización se presentan aquí. Los resultados se muestran en las siguientes tablas: Tabla 3. % en peso de post extracción de componentes de antocianina .

Tabla 4. perfil de Antocianina. rTabla 5. Indice rutósido en antocianina total.

Tabla 6. % de Perfil.

El porcentaje en peso de los compuestos nos dice cuánto de los compuestos ha sido purificado (concentrado) durante el procesamiento: cianidin-3 , 5-glucósido se ha purificado hasta 56.2 veces de aquella en la materia prima (F2, XAD7HP PA) ; cianidin-3 -sambubiósido se ha purificado hasta 74 veces de aquella en la materia prima (F3, XAD7HP PA) ; Cianidin-3-glucósido se ha purificado hasta 50 veces de aquella en la materia prima (F4, XAD7HP PA) ; antocianina total se ha purificado hasta 46 - 47 veces de aquella en la materia prima (F2 y F3,)(AD 7HP PA) ; rutósido se ha purificado 107 veces de aquella en la materia prima (F3, ADS5 PA) y ácido fenólico total se ha purificado a 13 - 17 veces de aquél de la materia prima. Los datos del perfil de antocianina muestran que el perfil de la antocianina puede adaptarse durante el procesamiento: cianidin-3 -glucósido puede describirse entre 9% -17%; y cianidin-3 , 5-glucósido puede describirse entre 4.8% - 43%. El rutósido y antocianina son compuestos farmacéuticos importes en las especies saúco. El índice de rutósido contra antocianina total puede describirse entre 0.10 - 3267 durante el procesamiento. La concentración de antocianina y rutósido en el ácido fenólico total puede también describirse durante el procesamiento: cianidin-3 -glucósido puede describirse entre 0.02 - 5.4 % ; cianidin-3 -sambubiósido puede describirse entre 0 - 1.5%; cianidin-3 , 5-glucósido puede describirse entre 0 - 3.8%; antocianina total puede describirse entre 0.02 - 9.6%; y rutósido puede describirse entre 0.8 84.9%. En una modalidad, las composiciones de la presente invención contienen cantidades elevadas de antocianinas y un portador farmacéutico como se expone en lo siguiente. En otra modalidad, las composiciones de la presente invención comprenden otras especies saúco tales como ácidos grasos de 16 y 18 átomos de carbono saturados e insaturados , alcoholes y ésteres de la fracción de aceite esencial . La comparación entre los datos de literatura de los constituyentes volátiles de las flores saúco secas (Toulemonde 1983) y la búsqueda actual se muestran en la siguiente tabla: Tabla 7. Comparación de los datos de literatura y experimentales .

Las composiciones de la presente invención pueden comprender cantidades elevadas de antocianinas y un polisacárido . En los extractos sin purificar acuosos, los rendimientos de proteína fueron 0.09% en la flor de saúco y 0.59% en la baya de saúco. 95% de la proteína en el extracto sin purificar puede precipitarse por 80% etanol . Por lo tanto, 80% de precipitados son complejo de proteína de polisacárido . El peso molecular promedio de estos complejos son -2000 KDa . En una modalidad, la composición comprende una composición de fracción de lectina-polisacárido , que tiene una pureza de 100-170 mg/g de equivalencia de dextrano con base en los métodos analíticos colorimétricos y la pureza de proteína lectina mayor de 4-50% en peso de masa con base en el ensayo de proteína Bradford como se enseñó en la presente invención. Las composiciones de la presente invención pueden comprender cantidades elevadas de antocianinas , ácido graso de 16 ó 18 átomos de carbono saturados o insaturados, alcohol, y un polisacárido.

Extracciones con Relación a las Especies Saúco Naturales Composiciones de la presente invención pueden también definirse en términos de concentraciones con relación a aquellas encontradas en las especies saúco naturales. Por ejemplo, la concentración de los aceites esenciales es de 0.001 a 10000 veces la concentración de las especies saúco nativas, y/o composiciones donde la concentración de los ácidos polifenólicos deseados es 0.001 a 40 veces la concentración de las especies saúco nativas, y/o composiciones donde la concentración de los polisacáridos insolubles de etanol solubles en agua es de 0.001 a 40 veces la concentración de especies saúco nativas, y/o composición en donde la concentración de las proteínas de lectina es de 0.001 a 100 veces la concentración de material vegetal de especies saúco nativas. Las composiciones de la presente invención comprenden composiciones donde la concentración de los aceites esenciales es de 0.01 a 10000 veces la concentración de especies saúco nativas, y/o composiciones donde la concentración de los ácidos polifenólicos deseados es de 0.01 a 40 veces la concentración de especies saúco nativas, y/o composiciones donde la concentración de polisacáridos es de 0.01 a 40 veces la concentración de especies saúco nativas, y/o composición donde la concentración de las proteínas de lectina es de 0.01 a 100 veces la concentración del material vegetal de especies saúco nativas. Además, las composiciones de la presente invención comprenden sub-fracciones de los constituyentes químicos de aceite esencial que tienen al menos uno o más compuestos químicos presentes en el aceite esencial de material vegetal nativo que está en mayor cantidad que o menor que la que se encuentra en los constituyentes químicos de aceite esencial de material vegetal de saúco nativo. Por ejemplo, el compuesto químico, ácido lineolaídico , puede tener su concentración incrementada en una sub-fracción de aceite esencial a 22% por % de peso en masa de la sub-fracción desde su concentración de 2% por % de peso en masa de los constituyentes químicos de aceite esencial total en el material vegetal del saúco nativo, un incremento de 10 veces en la concentración. En contraste, el ácido lineolaídico puede tener su concentración reducida en una sub-fracción de aceite esencial a menos de 0.01% por % de peso en masa de la sub-fracción de su concentración de aproximadamente 2% por % de peso en masa de los constituyentes químicos de aceite esencial total en el material vegetal nativo, una disminución de 100 veces en la concentración. Las composiciones de la presente invención comprenden composiciones donde la concentración de compuestos químicos específicos en tales sub-fracciones de aceite esencial novedosas es ya sea incrementado por aproximadamente 1.1 hasta aproximadamente 10 veces o disminuido por aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 veces que es la concentración encontrada en los constituyentes químicos de aceite esencial saúco nativos.

Pureza de las Extracciones En la realización de los métodos de extracción previamente descritos se encontró que mayor que 80% del rendimiento por el peso en masa de los constituyentes químicos de aceite esencial tienen mayor que 95% de pureza de los constituyentes químicos de aceite esencial en la baya seca original o la materia prima de la flor de las especies saúco que pueden extraerse en la fracción de extracto SCC02 de aceite esencial (Etapa 1A) . Utilizando los métodos como se enseñó en la Etapa 1A y IB, el rendimiento de aceite esencial puede reducirse debido a la sub-fracción de los constituyentes químicos de aceite esencial en las sub-fracciones de aceite esencial altamente purificadas que tienen perfiles constituyentes químicos novedosos. Además, el proceso de extracción y fraccionación de SCC02 como se enseñó en esta invención permite los índices (perfiles) de los compuesto químicos individuales comprender la fracción constituyente química de aceite esencial a ser alterada tal que los perfiles de índice de los compuestos químicos individuales comprenden la fracción constituyente química de aceite esencial que puede alterarse de manera que los perfiles de sub-fracción de aceite esencial únicos puedan crearse para propósitos médicos particulares. Por ejemplo, la concentración de los constituyentes químicos de aceite esencial de alcohol pueden incrementarse mientras reduce simultáneamente la concentración de los compuestos de ácido graso o visa versa . Utilizando los métodos como se enseñó en la Etapa 2 de esta invención, una fracción de lixiviación hidroalcohólica se logra con un rendimiento en peso de masa de 35.6% a partir de la materia prima de las especies saúco originales que tienen una concentración de 4.3% de los ácidos fenólicos totales, un rendimiento de aproximadamente 60% de peso en masa de los constituyentes químicos de ácido fenólico encontrados en la materia prima de baya de saúco nativa. Además, este extracto solvente hidroalcohólico también contiene los constituyentes químicos antocianidina valuables . Utilizando los métodos como se enseñó en la Etapa 3 de esta invención (Procesos de Extracción Adsorbentes de Afinidad o Cromatografía de Proceso) , las fracciones de ácido polifenólico con pureza de mayor que 40% por % de masa seca de la fracción de extracción con antocianidinas mayor que 2.5% por % de peso en masa puede obtenerse. Es posible extraer aproximadamente 60% de los ácidos polifenólicos de la materia prima de extracto de lixiviación hidroalcohólica. Esto equivale a un 40% de rendimiento de los constituyentes químicos de ácido polifenólico encontrados en el material vegetal de especies saúco nativas. También es posible producir sub- fracciones de ácido fenólico purificadas que contienen concentraciones elevadas de ácidos fenólicos (>30% en peso en masa) con cualesquier concentraciones relativamente elevadas de antocianidinas (> 2.9% en peso en masa) o concentraciones menores de antocianidinas (< 0.05% en peso en masa) . Utilizando los métodos como se enseñó en la Etapa 4 de la invención (la lixiviación en agua y precipitación con etanol, parece que son mayores que 90% de rendimiento por % de peso en masa de la proteína lectina insoluble en etanol-soluble en agua y constituyentes químicos del polisacárido del material de materia prima de especies saúco secas originales pueden extraerse y purificarse en la fracción de lectin-polisacárido . Utilizando 80% de etanol para precipitar las lectinas y polisacáridos , una fracción de lectona-polisacárido purificada puede colectarse del extracto de lixiviación en agua. El rendimiento de la fracción de lectina-polisacárido es aproximadamente 3.45% por % de peso en masa con base en la materia prima del material vegetal de saúco nativo. Con base en un método analítico colorimétrico que utiliza dextrano como estándares de referencia, una pureza de polisacárido de 100-170 mg/gm equivalentes de dextrano pueden obtenerse. Con base en el ensayo de proteína Bradford, una pureza de lectina 16% por peso de masa de la fracción puede obtenerse. La evidencia disponible debe indicar que los compuestos restantes en la fracción son los polisacáridos (aproximadamente 83% de peso en masa) . La pureza de las proteínas de lectina puede reducirse a aproximadamente 5% utilizando 60% de precipitación con etanol o puede además incrementarse hasta aproximadamente 50% en peso de masa de una sub-fracción que utiliza una precipitación con etanol al 80% por etapas de la solución de residuo después de una precipitación con etanol al 60% y la extracción de los polisacáridos . Finalmente, los métodos como se enseñó en la presente invención permiten la purificación (concentración) de las fracciones constituyentes químicas de aceite esencial de especies saúco, fracciones polifenólicas novedosas o sub-fracciones , y fracciones de lectina-polisacárido novedosas para ser tan elevadas como 99% por el peso en masa de los constituyentes químicos deseados en las fracciones de aceite esencial, tan altas como 41% de peso en masa de los ácido fenólicos en la fracción fenólica, tan altas como 3% de las antocianidinas en la fracción polifenólica, tan altas como 50% de lectinas por peso en masa en la fracción de lectina-polisacárido , y tan altas como 90% de polisacáridos por peso en masa en la fracción de lectina-polisacárido. Los ambientes de extracción específicos, porcentajes de extracción, solventes, y tecnología de extracción utilizadas dependen del perfil constituyente químico inicial del material de origen y el nivel de purificación deseados en los productos de extracción final. Los métodos específicos como se enseñó en la presente invención pueden ya determinarse por aquellos expertos en la técnica utilizando no más que la experimentación de rutina típica para ajustar un proceso para justificar las variaciones de la muestra en los atributos de los materiales de partida que se procesan en un material de producción que tiene atributos específicos. Por ejemplo, en un lote particular de material vegetal de especies saúco, las concentraciones iniciales de los constituyentes químicos de aceite esencial, los ácidos polifenólicos , las antocianidinas , las lectinas, y los polisacáridos se determinan utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica como se enseñó en la presente invención. Un experto en la técnica puede determinar la cantidad de la concentración inicial de los constituyentes químicos de aceite esencial, por ejemplo, en las cantidades predeterminadas o distribución (perfil) de constituyentes químicos de aceite esencial para el producto de extracción final que utiliza los métodos de extracción, como se describe aquí, para alcanzar la concentración y/o perfil deseados en el producto de composición de especies saúco finales.

Subfraceiones Una modalidad adicional de la invención es composiciones que comprenden sub-fracciones novedosas de los constituyentes químicos de aceite esencial en donde la concentración de grupos químicos específicos tales como, pero no limitados a, alcoholes, aldehidos, ésteres o ácidos grasos tienen sus concentraciones respectivas incrementadas para disminuir en los productos de composición de extracción novedosa. Otra modalidad de la invención son composiciones que comprenden sub-fracciones novedosas de los constituyentes químicos polifenólicos purificados donde la concentración de los grupos químicos específicos tales como, pero no limitados a, antocianidinas tienen sus concentraciones respectivas incrementadas o disminuidas en las composiciones de extracción novedosas. Una modalidad adicional de la presente invención son composiciones que comprenden sub-fracciones novedosas de los constituyentes químicos de lectina-polisacárido purificados donde la concentración de los grupos químicos específicos tales como, pero no limitados a, lectinas que tienen concentraciones respectivas incrementadas o reducidas en las composiciones de extracción novedosas.

Métodos de Extracción Los métodos de la presente invención proporcionan composiciones saúco novedosas para el tratamiento y prevención de trastornos humanos. Por ejemplo, una composición de especies saúco novedosas para el tratamiento de influenza puede tener una concentración de composición de fracción polifenolica incrementada, una concentración de composición de polisacárido incrementada, y concentraciones de composición de fracción de aceite esencial reducida, por % en peso, que aquellas encontradas en el material vegetal nativo de especies saúco o productos de extracción conocidos convencionales. Una composición de especies saúco novedosas para daño anti-vaso sanguíneo, anti-oxidante, y enfermedad cerebrovascular isquémica puede tener un aceite esencial incrementado y composición de fracción de ácido polifenólico y una composición de fracción de polisacárido reducida, por % en peso, que aquella encontrada que aquella encontrada en el material vegetal de especies saúco nativas o productos de extracción conocidos convencionales. Otro ejemplo de una composición de especies saúco novedosas, para el tratamiento de trastornos diabéticos comprende una composición que tiene una concentración de composición de fracción polifenolica incrementada, una composición de polisacárido reducida, y una composición de fracción de aceite esencial reducida que aquella encontrada en el material vegetal de especies saúco nativas o productos de extracción conocidos convencionales. Las modalidades adicionales comprenden composiciones que comprenden perfiles alterados (distribución de índice) de los constituyentes químicos de las especies saúco con relación a aquellas encontradas en el material vegetal nativo o productos de extracto de especies saúco actualmente disponibles. Por ejemplo, la fracción de aceite esencial puede incrementarse o disminuirse en la relación en los ácidos polifenólicos y/o concentraciones de polisacárido . En forma similar, los ácidos polifenólicos o polisacáridos puede incrementarse o disminuirse en relación con las otras fracciones de constituyente de extracto para permitir las composiciones de perfil químicas constituyentes novedosas para efectos biológicos específicos. Al combinar las fracciones aisladas y purificadas de uno o más de los aceites esenciales, polifenólicos y/o polisacáridos, las composiciones novedosas pueden hacerse. Los siguientes métodos como se enseñó pueden utilizarse individualmente o en combinación con el método descrito o métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica . El material inicial para la extracción es el material vegetal de una o más especies saúco. El material vegetal puede ser de cualquier porción de la planta, aunque la baya y la flor son el material de inicio más preferido. El material vegetal de especies saúco puede experimentar etapas pre-extracción para convertir el material en cualquier forma particular y cualquier forma que sea útil para que la extracción se contemple por la presente invención. Tales etapas pre-extracción incluyen pero no se limitan a, aquellas en donde el material se pica, desmenuza, ralla, muele, pulveriza, corta o rasga y el material de partida, previo a las etapas de pre-extracción, es material vegetal seco o refresco. Una etapa de extracción preferida comprende moler y/o pulverizar el material vegetal de especies saúco en un polvo fino. El material de partida o material después de las etapas de pre-extracción puede secarse o tener humedad agregada al mismo. Una vez que el material vegetal de las especies saúco está en una forma para extracción, los métodos de extracción se contemplan por la presente invención.

Extracción de Fluido Supercrítico de Saúco Los métodos de extracción de la presente invención comprenden procesos descritos aquí. En general, los métodos de la presente invención comprenden, en parte, métodos donde el material vegetal de especies saúco se extrae utilizado extracción de fluido supercrítico (SFE) con dióxido de carbono como el solvente (SCCO2) que es seguido por una o más etapas de extracción de solvente, tales como, pero no limitados a, agua, procesos de extracción de absorbente polimérico por afinidad e hidroalcohólico . Otros métodos adicionales contemplados por la presente invención comprenden la extracción del material vegetal de especies saúco que utilizan otros solventes orgánicos, químicos refrigerantes, gases comprimibles, sonificación, extracción de líquido por presión, cromatografía de contracorriente de alta velocidad, polímeros impresos moleculares y otros métodos de extracción conocidos. Tales técnicas se conocen por aquellos expertos en el arte. En otro aspecto, las composiciones de la presente invención pueden prepararse por un método que comprende las etapas representadas esquemáticamente en las Figuras 1-4. La invención incluye procesos para la concentración (purificación) y descripción del aceite esencial y otros compuestos solubles lípidos del material vegetal saúco que utiliza la tecnología SCC02. La invención incluye las fracción de los constituyentes químicos solubles lípidos de saúco en, por ejemplo, una fracción de aceite esencial de pureza elevada (concentración constituyente química de aceite esencial elevada) . Además, la invención incluye un proceso SCC02 donde los constituyentes químicos individuales dentro de una fracción de extracción pueden tener sus índices o perfiles constituyentes químicos alterados. Por ejemplo, la separación fraccional SCC02 de los constituyentes químicos dentro de una fracción de aceite esencial permite la extracción preferencial de ciertos compuestos de aceite esencial con relación a otros compuestos de aceite esencial tales como aquellos de una sub-fracción de extracto aceite esencial que pueden producirse con una concentración de ciertos compuestos mayor que la concentración de otros compuestos. La extracción de los constituyentes químicos de aceite esencial de las especies saúco con SCC02 como se enseñó en la presente invención elimina el uso de solventes orgánicos tóxicos y proporciona fraccionación simultánea de los extractos. El dióxido de carbono es un producto biológico natural y seguro y un ingrediente en muchos alimentos y bebidas. Un diagrama esquemático de los métodos de extracción de los constituyentes químicos biológicamente activos de saúco se ilustra en las Figuras 1-4. El proceso de extracción es típicamente, pero no limitados a, 5 etapas. Los métodos analíticos utilizados en el proceso de extracción se representan en la sección de Ej emplificación .

ETAPA 1 : Extracción de Dióxido de Carbono de Fluido Supercrítico de Aceite Esencial de Saúco. Debido a la naturaleza hidrofóbica del aceite esencial, los solventes no polares, incluyendo pero no se limitan a SCC02, hexano, éter de petróleo, y acetato de etilo pueden utilizarse por este proceso de extracción. Ya que algunos de los componentes del aceite esencial son volátiles, la destilación de vapor puede utilizarse como un proceso de extracción. Una descripción generalizada de la extracción de los constituyentes químicos de aceite esencial del rizoma de las especies saúco que utilizan SCC02 se coloca en diagramas en la Figura 1. La materia prima 10 se seca moliendo baya o flor de saúco (aproximadamente 140 mallas) . El solvente 210 de extracción es dióxido de carbono puro. El etanol puede utilizarse como un co-solvente. La materia prima se carga en un recipiente 20 de extracción SFE . Después de la prueba de purga y fuga, el proceso comprende C02 licuado seguido de un recipiente de almacenaje a través de un enfriador a una bomba CO2. El CO2 se comprime en la presión deseada y fluye a través de la materia prima en el recipiente de extracción donde la presión y temperatura se mantienen en un nivel deseado. Las presiones para la extracción varían de aproximadamente 6 Megapascales (60 bar) y 80 Megapascales (800 bar) y la temperatura varía de aproximadamente 35°C a aproximadamente 90°C. Las extracciones SCC02 enseñadas en la presente se realizan de manera de preferible a presiones de al menos 10 Megapascales (100 bar) y una temperatura de al menos 35°C, y de manera más preferible a una presión de aproximadamente 6 Megapascales y 50 Megapascales (60 bar a 50 Megapascales (500 bar) es) y a una temperatura de aproximadamente 40°C a aproximadamente 80 °C . El tiempo para la extracción para etapa sencilla del grado de extracción desde aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2.5 horas, a aproximadamente 1 hora. El solvente en el índice de alimentación es de aproximadamente 60 a 1 por cada una de las extracciones SCC02. El C02 se recicle. Los constituyentes 30 químicos de aceite esencial extraídos, purificados y descritos entonces se colectan, en un colector o separados, se guardan en botellas de vidrio protegidas de la luz, y se almacenan en un refrigerador oscuro a 4°C. El material de materia prima 10 de saúco puede extraerse en un proceso de una etapa (Figura 1) donde la fracción 30 de aceite esencial de saúco extraída y purificada se colecta en un colector SFE o sistema 20 de SCC02 o en etapas múltiples (Figura 1, Etapa IB) donde las sub-fracciones 50, 60, 70, 80 de aceite esencial de saúco purificadas y descritas, extraídas se separan y colectan en forma secuencial en un sistema 20 SFE colector. Alternativamente, como en un sistema SFE fraccional, el material de materia prima de saúco extraído SCC02 puede segregarse en recipientes colectores (separadores) de modo que dentro de cada colector existe una composición constituyente química de aceite esencial de porcentaje relativo diferente (perfil) en cada una de las sub- fracciones de aceite esencial purificadas, colectadas. El residuo (resto) 40 se colecta guarda y utiliza para procesamiento adicional para obtener fracciones purificadas de los ácido fenólicos de especies saúco polisacáridos . Una modalidad de la invención comprende extraer el material de materia prima de especies saúco que utiliza la extracción SCC02 de etapa múltiple en una presión de 6 Megapascales y 50 Megapascales (60 bar a 50 Megapascales (500 bar) es) y a una temperatura entre 35°C y 90°C y que colectan el material saúco extraído después de cada etapa. Una segunda modalidad de la invención comprende extraer el material de materia prima de especies saúco que utiliza fraccionación de extracción SCC02 a presiones de 6 Megapascales y 50 Megapascales (60 bar a 50 Megapascales (500 bar) es) y a una temperatura de entre 35°C y 90°C y que colectan el material saúco extraído en recipientes colectores divergentes en condiciones predeterminadas (presión, temperatura, y densidad) e intervalos predeterminados (tiempo) . Las composiciones de sub-fracción de aceite esencial purificadas de saúco extraído resultantes de cada uno de los extractores de etapa múltiple o en diferentes recipientes colectores (sistema fraccional) puede recuperarse y utilizarse independientemente o pueden combinarse para formar una o más composiciones de aceite esencial de saúco que comprende una concentración de constituyente químico de aceite esencial predeterminada que es mayor o menor que aquella encontrada en el material vegetal nativo o en productos de extracción saúco convencional. Típicamente, el rendimiento total de la fracción de aceite esencial a partir de las bayas de especies saúco que utilizan una extracción SCC02 máxima de etapa sencilla es de aproximadamente 9% (> 95% de los constituyentes químicos de aceite esencial) por % en peso que tiene una pureza de constituyente químico de aceite esencial mayor de 95% de peso en masa del extracto. En contraste, el rendimiento total de la fracción de aceite esencial a partir de las flores saúco que utilizan una extracción SCC02 máxima de etapa sencilla es de aproximadamente 1.5% (>95% de los constituyentes químicos de aceite esencial) por % de peso en masa que tiene una pureza de constituyente químico de aceite esencial mayor que 95% de peso en masa del extracto. Estos datos demuestran que las bayas de saúco contienen aproximadamente 6 veces la concentración de los compuestos de aceite esencial que las flores. Los ejemplos de la presente invención, las bayas de saúco se utilizan como el material de materia prima de especies saúco nativas. Un ejemplo de este proceso de extracción puede encontrarse en el Ejemplo 1. En este ejemplo experimental que utilizan bayas de saúco como la materia prima, las condiciones de extracción se establecen donde las temperaturas varían de 40-80°C y las presiones varían de 8 - 50 Megapascales (60 bar a 50 Megapascales (500 bar) es) . La velocidad de flujo de C02 fue 10 gm/min. Los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9.

Tabla 8. Efectos de temperatura, presión, y tiempo en rendimiento de extracción de aceite esencial SCC02 que utiliza baya de saúco como materia prima. T = 40 C T = 60 C T = 80 C P (bar) 100 300 500 100 300 500 100 300 500 Densidad 0.64 0.915 1.00 0.297 0.834 0.94 0.227 0.751 0.88 (g/cc) Tiempo (min) RENDIMIENTO (%) 5 0.00 3.68 1.49 1.34 0.00 3.21 10 0.52 6.13 6.71 4.68 5.57 2.67 7.58 15 0.54 6.78 7.05 7.56 4.34 8.69 20 0.67 7.92 7.00 7.95 8.27 5.93 9.57 30 1.11 8.42 7.12 8.35 8.81 8.19 9.79 60 1.53 8.63 7.51 0.60 8.53 9.39 0.45 8.85 9.86 90 2.09 8.98 7.63 8.71 9.43 120 2.10 9.31 Tabla 9. Composiciones químicas GC-MS de fracciones de extracción de aceite esencial SCC02 de baya de saúco extraídas en condiciones SFE diferentes (temperatura-T y presión en bar) .

T = 40 °C T = 60 °C T = 80 °C Tiempo de Ret. Pico No. (min) 100 300 500 100 300 500 100 300 500 1 7.1 0.02 0.17 1.03 % 0iO7v §¾4¾¾g¾0|t,. , - .*4 2.32 . 1-.06 0.68 ' ' 3 8.4 0.45 2.22 ' ÍTe 0.81 0.64 4 12.1 0.03 0.1 0.07 5 17.5 0.09 0.19 0.2 0.91 4.17 3.06 0.24 1.59 0.3 6 17.7 0.06 0.12 0.13 1.71 1.3 1.41 0.52 3.4 7 18 0.31 0.23 0.36 0.24 0.32 0.16 m -; 4;;16; •0,62 , 0,41 ¾..!¾: ¦¾ "'? " ; - 9 19.7 0.02 ' a?ß' 0.1 0.8 0.5 0.34 0.63 ????? · ;4.46' ': 2.94 · 2.02 t 20.6 0.03 0.13 0.12 0.88 0.6 0.3 0.7 12 31.7 0.06 0.19 0.35 2.78 0.87 1.6 13 34.4 0.02 0.21 0.42 14 35.8 0.02 0.24 0.13 0.88 1.07 0.6 1.12 36.2 0.02 0.11 0.29 16 38.8 0.04 0.08 0.11 0.02 0.39 0.27 0.3 17 42.2 0.02 0.06 0.18 0.87 0.52 0.92 18 44.1 0.05 0.25 0.3 0.42 0.22 ' 02' ¡pff 7.46 ' 2.51 2.19 ?f .»>¦ ' ¾¾?: : ?. ¿¾f 20 45. ? 0.02 ' 0.08 0.31 0.03 0.91 0.67 0.53 0.37 0.64 21 47.4 0.16 0.09 0.12 0.53 22 48.4 0.03 0.05 0.16 0.35 0.42 0.36 0.35 0.43 23 49.2 0.01 0.06 0.16 0.29 0.5 24 49.7 0.02 0.09 0.39 0.23 1.2 0.06 0.64 1.06 49.8 0.06 0.07 0.45 1.01 0.49 0.31 26 49.9 0.13 0.29 0.2 0.92 0.42 0.01 27 50.1 0.11 0.12 0.66 0.3 0.25 0.27 0.29 0.22 28 50.6 0.03 29 50.7 0.07 0.15 0.22 0.42 0.34 32 52.5 0.12 1.38 0.21 0.5 0.2 33 53.0 0.26 3.22 0.08 36 55 0.13 0.1 0.73 0.5 0.17 0.08 37 56.3 0.04 0.11 0.07 0.24 1.3 1.15 0.14 0.68 1.13 ·' <£?? ·?¾38 ififg ?6.-38 12:71 8.01 ¿ % ·¦ «* fe. :-..'¾á».;í í¿ ¾ ;¾·,* 39 57.5 0.88 1.22 0.83 0.8 ' 6*52 1.08 ' 2.24 1.3 0.86 40 57.8 0.05 0.37 ,:; 10.12 .7ß?-.- .4.56 42 58.8 0.25 0.22 1.06 0.24 6.23 0.26 0.33 43 59.1 1.98 0.49 12.97 0.5 0.54 0.58 0.55 44 59.7 0.33 0.47 0.16 0.82 0.58 0.54 0.9 1.08 0.75 49 62.7 2.73 2.12 1.8 1.88 2.58 2.3 1 .31 50 62.9 2.85 0.14 51 63.4 0.15 0.44 0.24 PS ¡l li 0 ,6' ^2-67,, - 7 04 0 75 4Í.78 ; 10.88 53 64.3 0.09 6.14" 1.28 " 0.36 0.3 54 64.7 0.22 :|5 23'86 - $ 1.38 - :'. °-77 0.2 0.9 1 ,1 1 56 68.7 ó"í 0.4 0.3 0.39 0.38 57 69.4 0.11 0.37 58 69.8 0.09 0.24 59 70.1 0.09 0.02 0.61 0.91 0.18 0.75 0.91 60 70.9 2.47 0.27 11.49 0.32 0.29 0.27 63 74.7 0.36 1.96 1.7 7.93 15.38 22.31 2.25 9.96 23.1 64 75 0.17 0.37 1.6 0.46 0.44 0.28 0.6 0.27 65 75.2 0.32 0.67 "" 0 45 0,23 0v8 1.3 67 76.8 0.36 0.48 0.31 1.04 0.64 0.57 0J7 0.86 ácido graso 71 .41 17.81 17.54 55.76 9.77 8.8 18.32 22.62 10.08 C16+C18 70.55 17.08 17.46 55.58 9.43 7.91 16.1 21.73 9.46 éster 5.14 18.3 12.21 13.69 25.1 1 33.39 7.15 17.76 36.06 alcohol 16.46 26.63 16.42 24.27 19.13 27.43 50.67 36.07 25.74 hidrocarburo 5.66 36.16 46.14 0.48 5.83 4.21 2.04 3.85 5.32 aldehido 0.67 1 .48 0.69 3.5 17.84 12.1 5 9.13 5.14 8.2 total 99.34 98.9 92.31 97.7 77.68 85.98 87.31 85.44 85.4 Tabla 10. Compuestos de aceite esenciales de baya de saúco identificados por GC-MS.

Estos resultados demuestran el efecto de presión en los cinéticos de extracción. Las presiones de extracción elevadas resultan en el equilibrio que alcanza el sistema en los momentos más cortos con menos cantidad de CO2 consumida. El rendimiento de extracción total incrementa con la presión de extracción debido al incremento de densidad asociado con el incremento de presión. De modo interesante, las presiones más bajas tales como 10 - 30 Megapascales (100-30 Megapascales (30 bar) ) , la más baja de la temperatura, la más alta del rendimiento de nuevo se relaciona con una densidad más elevada. En las presiones más elevadas tales como 30 - 50 Megapascales (300-50 Megapascales (500 bar)es), la temperatura tiene mucho menos efecto del rendimiento de extracción. Aunque el rendimiento más elevado y la eficiencia mayor de extracción puede lograrse con presiones mayores que 30 Megapascales (30 bar) , 95% de pureza de los constituyentes químicos de aceite esenciales pueden lograrse con presiones menores que 30 Megapascales (30 bar) y temperaturas de aproximadamente 40-60 °C. En el grado de experimento investigado, puede observarse claramente que existe un efecto de competición entre la temperatura y la densidad. Este aspecto se define bien y se documenta en la literatura, donde un incremento en la presión a temperatura constante, conduce a un incremento en el rendimiento debido al mejoramiento en la energía de solvencia de la supercrítica y el fluido casi crítico. Un incremento en la temperatura promueve una mejora en la presión de vapor de los compuestos que dan sabor a la extracción. Adicionalmente , el incremento en el coeficiente de difusión y la disminución en la viscosidad del solvente también ayuda a los compuestos a la extracción de la matriz porosa herbácea cuando la temperatura se incrementa a un valor más elevado. De otro modo, un incremento en la temperatura, en la presión del sistema constante, conduce a una disminución en la densidad del solvente . Los sesenta y siete compuestos se separan e identifican en aceite esencial de baya de saúco utilizando análisis GC-MS de acuerdo al espectro de masa de cada compuesto (Tablas 9 y 10) . Los compuestos varían a partir de los compuestos de 7 carbonos (C7) a compuestos de 23 carbonos (C23) que incluyen: 9 aldehidos (C7-C15) que tienen tiempos de retención de 7-50 minutos, uno de los principales siendo los aldehidos C7 y CIO insaturados (compuestos #1, 2, 6, y 8 de la Tabla 5); 111 alcoholes (C13-C20); 12 ésteres (C13-C22); 7 ácidos grasos (C14-C22); y otros compuestos aromáticos y alifáticos. Con base en la bioactividad conocida, los compuestos más importantes parecen ser los ácidos grasos saturados e insaturados de C16 y C18, alcohol, y su éster. Por ejemplo, hexadecanol (#30), ácido hexadecanoico (#34), metiléster del ácido hexadecanoico (#32), etiléster del ácido hexadecanoico (#35), y butiléster del ácido hexadecanoico (#52) todos pertenecientes a los compuestos C16. El ácido octadecanoico saturado y sus ésteres de etiléster de ácido octadecanoico (#53) y butiléster del ácido octadecanoico, isómeros 9-octadecen-l-ol de ácidos grasos monoinsaturados (#38,39), ácidos grasos poliinsaturados , isómeros del ácido 9,12 octaecanienoico (#46,48) pertenecientes a los compuestos C18. Los nombres comunes de los ácidos grasos C16 y C18 se llaman ácido pálmico y ácido esteárico. En la Tabla 9, los compuestos destacados son los compuestos de concentración más elevados encontrados en las fracciones de aceite esencial. Debe observarse que los índices de los compuestos varían con las condiciones de extracción SCC02 diferentes. Por ejemplo, a presiones bajas tales como 10 Megapascales (100 bar), los ácidos grasos de C16 y C18 son una concentración más elevada con un rendimiento de extracción total bajo. En contraste, los ésteres de ácido graso de C16 y C18 se encuentran en concentración mayor a las temperaturas de extracción elevadas . De modo interesante, el escualeno se extrae en concentraciones elevadas de aproximadamente 23% en las fracciones de aceite esencial de 40° y 30 Megapascales (30 bar) y concentración más baja de aproximadamente 8% en la fracción de 40°C y 50 Megapascales (500 bar) es. El escualeno ha sido investigado como una terapia coadyuvante para algunos cánceres humanos. En los modelos animales se ha provisto ser efectivo en el cáncer de pulmón de inhibición. Se ha mostrado también que tienen efectos quimiopreventivos contra el cáncer de colón en modelos animales. El complemento con escualeno en modelos animales se ha mostrado para mejorar la función inmune y reducir los niveles de colesterol.

En conclusión, la concentración de ciertos constituyentes químicos de aceite esencial de especies saúco pueden alterarse utilizando diferentes condiciones SFE . Tales propiedades de extracción SFE diferenciales pueden utilizarse para mejorar además o disminuir la concentración de ciertos compuestos en sub- fracciones aceite esencial purificadas utilizando la fraccionación SCCO2 de etapa múltiple secuencial como se ilustra en la Etapa IB, Figura 1 o un sistema de fraccionación de multi-colector .

ETAPA 2. Proceso de Lixiviación Hidroalcohólica para la Extracción de Fracción de Ácido Fenólico sin Purificar En un aspecco, la presente invención comprende la extracción y concentración de constituyentes químicos de ácido fenólico bioactivos mientras conserva las lectinas y polisacáridos en el residuo para la extracción separada y purificación (Etapa 4). Una descripción generalizada de esta etapa se coloca en diagrama en la Figura 2. Esta Etapa 2 de proceso de extracción es un proceso de lixiviación de solvente. La materia prima para esta extracción es cualesquiera especies saúco crecidas en el material 10 vegetal seco o el residuo 40 de la extracción SCCO2 de la Etapa 1 de los constituyentes químicos de aceite esencial. El solvente 220 de extracción es etanol acuoso. El solvente de extracción puede ser alcohol acuoso de 10-95%, etanol acuoso al 80% se prefiere. En este método, el material de materia prima saúco y el solvente de extracción se cargan en un recipiente 100, 150 de extracción que se calienta y agita. Puede calentarse a 100°C, a aproximadamente 90°C, a aproximadamente 80°C, a aproximadamente 70°C, o a aproximadamente 60-90°C. La extracción se lleva a cabo durante aproximadamente 1-10 horas, durante aproximadamente 1-5 horas, durante aproximadamente 2 horas. El extracto de fluido resultante se filtra 110 y centrifuga 120. El filtrado (sobrenadante) 310, 320, 330 se colecta como el producto, medido por la masa seca de contenido sólido y volumen después de la evaporación del solvente. El material 160 de residuo de extracción se retiene y guarda para procedimiento adicional (véase Etapa 4). La extracción puede repetirse tantas veces como sea necesaria o se desee. Puede repetirse una o más veces, dos o más veces, tres o más veces, etc. Por ejemplo, la Figura 2 muestra un proceso de tres etapas, donde la segunda etapa y la tercer etapa utilizan los mismos métodos y condiciones. Un ejemplo de esta etapa de extracción se encuentra en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11. Rendimiento de ácido fenólico sin purificar de extracción de lixiviación y pureza de baya de saúco.

El rendimiento de extracción de ácido fenólico sin purificar total fue de aproximadamente 35% de peso en masa de la materia prima de la baya de saúco nativa original con un rendimiento de extracción de ácido fenólico total de 1.6% y pureza de ácido fenólico de 4.3% de peso en masa de la fracción. El rendimiento de extracción de antocianidina en la fracción de ácido fenólico sin purificar fue de 0.06% de peso en masa de la materia prima de la baya de saúco original con una pureza (concentración) de 0.18 por peso en masa de la fracción. El ácido fenólico principal fue rutósido y la antocianidina principal fue cianidin-3 -glucósido . Estos datos son todos consistentes con la literatura. La composición de ácido fenólico sin purificar puede utilizarse ya sea como un producto final o como una materia prima para procesamiento adicional para purificar los constituyentes químicos de ácido fenólico deseados (Etapa 3) .

ETAPA 3. Proceso de Extracción Adsorbente de Afinidad Como se enseñó aquí, un extracto de fracción de ácido fenólico purificado de saúco y especies relacionadas pueden obtenerse al poner en contacto un extracto hidroalcohólico de materia prima de saúco con una resina de adsorbente de polímero de afinidad de sólido así como para adsorber los ácido fenólicos activos contenidos en el extracto hidroalcohólico en el adsorbente de afinidad. Los constituyentes químicos de enlace son subsecuentemente eluidos por los métodos enseñados en la presente. Previo a la elución los constituyentes químicos de fracción de ácido fenólico, el adsorbente de afinidad con los constituyentes químicos deseados adsorbidos en los mismos pueden separarse del resto del extracto en cualquier forma convencional, de manera preferible, el proceso para hacer contacto con el adsorbente y la separación se efectúan pasando el extracto acuoso a través de una columna de extracción o lecho de material adsorbente. Una variedad de adsorbentes de afinidad puede utilizarse para purificar los constituyentes químicos de ácido fenólico de especies saúco, tales como, pero no limitados a "Amberlite XAD-2" (Rohm & Hass), "Duolite S-30" (Diamond Alkai Co . ) , "SP207" (Mitsubishi Chemical), ADS-5 (Nankai University, Tianjin, China), ADS-17 (Nankai University, Tianjin, China), Dialon HP 20 (Mitsubishi, Japan) , y Amberlite XAD7 HP (Rohm & Hass). Amaberlita XAD7 HP se utiliza de manera preferible debido a la alta afinidad para los constituyentes químicos de ácido fenólico de las especies saúco y relacionadas. Aunque varios eluyentes pueden emplearse para recubrir los constituyentes químicos de ácido fenólico a partir del adsorbente, en un aspecto de la presente invención, el eluyente comprende alcoholes de peso molecular bajo, que incluyen pero no se limitan a, metanol, etanol, o propanol. En un segundo aspecto, el eluyente comprende alcohol molecular bajo en una mezcla con agua. En otro aspecto, el eluyente comprende alcohol de peso molecular bajo, un segundo solvente orgánico y agua. De manera preferible, la materia prima se especie saúco ha experimentado uno o más procesos de purificación preliminar tal como, pero no limitados a, los procesos descritos en la Etapa 1 y 2 previos al contacto del constituyente químico de ácido fenólico acuoso que contiene extracto con el material adsorbente de afinidad. Utilizando los adsorbentes de afinidad como se enseñó en la presente invención resulta en constituyentes químicos de ácido fenólico altamente purificados de las especies saúco que son remarcablemente libres de los otros constituyentes químicos los cuales están normalmente presentes en el material vegetal natural o en los productos de extracción comerciales disponibles. Por ejemplo, el proceso enseñado en la presente invención puede resultar en los extractos de ácido fenólico purificado que contienen constituyentes químicos de ácido fenólico totales en exceso de 40% y antocianidinas en exceso de 2% de peso en masa seca . Una descripción generalizada de la extracción y purificación de los ácidos fenólicos a partir de las hojas de las especies saúco que utilizan cuentecillas de resina adsorbentes de afinidad de polímero se coloca en diagrama en la Figura 3. La materia prima para este proceso de extracción puede ser la solución de etanol acuosa de ácidos fenólicos de la Etapa 2, extracción de lixiviación de agua 310 +/- 320 +/- 330. El peso apropiado de las cuentecillas de resina adsorbentes (5 mg de ácidos fenólicos por gm de resina adsorbente) se lava con etanol 230 4-5 BV y agua 240 destilada 4-5 BV antes y después de que se cargue en una columna 410, 420. El ácido fenólico que contiene la solución acuosa 310+320 entonces se carga en la columna 430 a una velocidad de flujo de 3 a 5 volúmenes de lecho (BV)/hora. Una vez que la columna se cargó por completo, la columna se lavó 450 con agua 250 destilada a una velocidad de flujo de 2-3 BV/hora para eliminar cualesquier impurezas de los ácidos fenólicos adsorbidos. El residuo 440 efluente y el residuo 460 de lavado se colectaron, midieron por el contenido de masa, contenido de ácido fenólico, y se descargaron. La elución de los ácidos 470 fenólicos adsorbidos se logró en una forma isocrática con 40 u 80% de etanol/agua como una solución 260 de elución a una velocidad de flujo de 3-4 BV/hora y la curva de elución se registró para el extracto de eluyente (extractos) 480. Los volúmenes 480 de elución pueden colectarse aproximadamente cada 25 minutos y estas muestras se analizaron utilizando HPLC y se probaron para el contenido de sólidos y la pureza. Un ejemplo de este proceso de extracción se encuentra en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en las Tablas 12 y 13.

Tabla 12. Balance de masa y resultados de análisis HPLC en las fracciones diferentes eluídas de columna XAD 7HP.

Tabla 13. Balance de masa y resultados de análisis HPLC en fracciones diferentes eluídas de columna ADS5.

Como se enseñó en la presente, los adsorbentes de afinidad XAD7HP y ADS5 pueden además purificar, (concentrar) los ácidos fenólicos flavonoides y antocianidina del material vegetal de especies saúco. La pureza de los ácidos fenólicos totales mayor que 40%, antocianidinas tales de mayor que 2.8%, y rutósido de mayor que 29% de peso en masa de la sub-fracción del eluyente respectiva. Estos representan un incremento mayor de 10 veces en la concentración sobre aquella que se encuentra en el material vegetal nativo de especies saúco o conocidos y mayor que 5-veces el incremento en la concentración sobre aquellos encontrados en productos de extracción de especies saúco disponibles. Mayor que 60% de rendimiento por peso en masa de los constituyentes químicos de ácido fenólico de las soluciones de carga se recuperan en el eluyente. Con base en la materia prima de saúco original, el rendimiento de ácido fenólico total es de aproximadamente 4.2% de peso en masa del material de materia prima original. De hecho, casi ningún rutósido o antocianidinas pueden detectarse en el efluente o soluciones de lavado. De un modo interesante, ADS5 tiene una ventaja bastante única en que es posible separar las antocianidinas del rutósido en diferentes sub-fracciones utilizando las concentraciones diferentes de soluciones de etanol . Por ejemplo, los concentrados de fracción de elución de etanol (F2) a 40% ADS5 concentran las antocianidinas mayor que 10-veces mientras los concentrados de rutósido de sub-fracciones (F3+F4) combinadas mayor que 25-veces con poco o sin concentración de antocianidinas. Por lo tanto, el proceso adsorbente de afinidad de Etapa 3 puede producir sub-fracciones de ácido fenólico purificadas novedosas con perfiles constituyentes químicos novedosos.

ETAPA 4. Procesos de Extracción de Fracción de Lectina-polisacárido La fracción del extracto de lectin-polisacárido de los constituyentes químicos de especies saúco se han definido en la literatura científica como la "fracción de extracción insoluble de etanol, soluble en agua". Una descripción generalizada de la extracción de la fracción de polisacárido a partir de extractos de especies saúco que utilizan procesos de lixiviación de solvente acuoso y precipitación con etanol se pone en diagramas en la Figura 4. La materia prima 160 es el residuo sólido del proceso de extracción de lixiviación hidroalcoholíco de la Etapa 2. Esta materia prima se somete a lixiviación extraída en dos etapas. El solvente es agua 270 destilada. En esta modalidad, el residuo 160 de especie saúco y el solvente 270 de extracción se carga en un recipiente 500, 520 de extracción y se calienta y agita. Puede calentarse a 1002C, aproximadamente 802C o aproximadamente 70-902C. La extracción se lleva a cabo durante aproximadamente 1-5 horas, durante aproximadamente 2-4 horas o durante aproximadamente 2 horas. Las dos etapas de soluciones 600+610 de extracción se combinan y la lechada se filtra 540, se centrifuga 550 y se evapora 560, para remover agua hasta aproximadamente 8 veces el incremento en la concentración de los químicos en la solución 620. El etanol anhidro 280 entonces se utiliza para reconstituir el volumen original de la solución que hace la concentración de etanol final a 60-80%. Un precipitado 570 mayor se observa. La solución se centrifuga 580, se decanta 590 y residuos 730 sobrenadantes se desecha. El producto 640 de precipitado es la fracción lectin-polisacárido purificada que puede analizarse por polisacáridos que utilizan el método colorimétrico utilizando peso molecular de 5,000-410,000 de Dextrano como estándares de referencia y para la proteína que utiliza el método de análisis de proteína Bradford. La pureza de la fracción de polisacárido extraída es de aproximadamente 100-170 mg/g de equivalentes estándar de dextrano con un rendimiento total de 2.4-3.5% por % de peso en masa de la materia prima del material del vegetal saúco nativo original. La pureza de las proteínas de lectinas extraídas es de aproximadamente 16% de peso en masa de la fracción de lectin-polisacárido con un rendimiento total de 0.56% por % de peso en masa del material vegetal de saúco nativo original. Un ejemplo de este proceso se da en el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en las Tablas 14 y 15. Además, la espectrometría de masa AccuTOF-DART (véase sección de E empli ficación) se utilizó para perfil adicional de los pesos moleculares de los compuestos que comprenden la fracción de polisacárido pura .

Tabla 14. Análisis de polisacárido de fracciones de lectin- polisacárido de baya de saúco Tabla 15. Análisis de proteína de fracciones de lectin- polisacárido de baya de saúco El rendimiento de lectin-polisacárido de saúco total fue de 2.43% con 60% de precipitación con etanol y 3.45% con 80% de precipitación con etanol por % de peso en masa con base en el material de materia prima de baya de saúco nativo original. Con base en los experimentos múltiples con material vegetales de especies saúco así como otros botánicos y la literatura científica. Debe parecer que el 3.5% de rendimiento de la fracción de lectin-polisacárido es tan estrecha la concentración de polisacárido insoluble de etanol-soluble en agua y las proteínas de lectinas presentes en el material vegetal de especies saúco sin refinar. La pureza de los polisacáridos fue de 100 a 170 mg/gm de equivalentes dextrano . Aunque los equivalentes dextrano de las fracciones de polisacárido parecen un poco más bajos que aquellas encontradas por las fracciones de polisacárido purificadas de otras botánicas, los pesos moleculares de los polisacáridos en el material vegetal de especies saúco se conocen. Por lo tanto, la pureza de los constituyentes químicos de polisacárido puede ser mucho mayores en la fracción de polisacárido purificada de especie saúco que aquellas estimadas que utilizan el ensayo colorimétrico con equivalentes de dextrano. La pureza de la proteína de lectinas en las fracciones de lectin-polisacárido saúco fue de 4.8% con 60% de precipitación con etanol y 16.2% con 80% de precipitación con etanol por % de peso en masa de la fracción. El rendimiento de proteína de lectinas total con 80% de precipitación con etanol fue 0.56% de peso en masa con base en la materia prima nativa de especies saúco original y aproximadamente 95% de peso en masa con base en el extracto de lixiviación en agua sin purificar. El rendimiento de lectina total con 60% de precitación de etanol es solo de aproximadamente 20% de peso en masa con base en el extracto de lixiviación en agua sin purificar. El 60% de los resultados de precipitación con etanol en una pureza mayor de los constituyentes químicos de polisacárido , es posible que tengan una concentración de polisacárido elevada inferior a la sub-fracción de perfil de concentración de proteína de lectina (-0/1) que utiliza 60% de etanol seguido por una segunda etapa de precipitación que utiliza 80% de etanol para dar una sub-fracción de polisacárido inferior/perfil de concentración de proteína lectinas elevada (-2/1). Muchos métodos se conocen en la técnica para eliminar el alcohol de la solución. Si se desea mantener el alcohol para reciclar, el alcohol puede eliminarse de las soluciones, después de la extracción, mediante destilación bajo presiones atmosféricas normales o reducidas. El alcohol puede re-usarse. Además, también existen muchos métodos conocidos en la técnica para eliminar el agua de las soluciones, cualquiera de las soluciones acuosas o soluciones de las cuales el alcohol se elimina. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, secar por aspersión las soluciones acuosas en un portador adecuado tal como, pero no limitado a, carbonato de magnesio o maltodextrina , o alternativamente, el líquido puede tomarse a sequedad mediante secado por congelamiento o secado por ventana refractiva .

Alimento y Medicamentos Como una forma de alimentos de la presente invención, puede formularse en cualquier forma opcional, un estado granulado, un estado de grano, un estado de pasta, un estado de gel, un estado sólido, o un estado líquido. En estas formas, varias formas de sustancias convencionalmente conocidas por aquellos expertos en la técnica que se han dejado agregar a los alimentos, por ejemplo, un aglutinante, un desintegrante, un espesor, un dispersante, un agente de promoción de reabsorción, un agente de degustación, un tampón, un tensioactivo , un auxiliador de disolución, un conservador, un emulsificador , un agente de isotonicidad, un estabilizador o un controlador pH, etc. Pueden contenerse opcionalmente . Una cantidad del extracto de baya de saúco se agrega a los alimentos que no se limiten específicamente, y por ejemplo, puede ser de aproximadamente 10 mg a 5 g, de manera preferible 50 mg a 2 g por día como una cantidad tomada por un adulto que pesa aproximadamente 60 kg. En particular, cuando se utiliza como alimentos para la conservación de la salud, los alimentos funcionales, etc., se prefieren para contener el gradiente efectivo de la presente invención en tal cantidad que los efectos predeterminados de la presente invención se muestren lo suficiente. Los medicamentos de la presente invención pueden prepararse opcionalmente de acuerdo con los métodos conocidos convencionalmente, por ejemplo, como un agente sólido tal como una tableta, un gránulo, polvo, una cápsula, etc., o como un agente líquido tal como una inyección, etc. Para estos medicamentos, pueden existir formulados cualesquier materiales generalmente utilizados, tal como aglutinante, un desintegrante, un espesor, un dispersante, un agente de promoción de reabsorción, un agente de degustación, un tampón, un tensioactivo , un auxiliador de disolución, un conservador, un emulsi ficante un agente de isotonicidad, un estabilizador o un controlador de pH. Una cantidad de administración del ingrediente efectivo (extracto de baya de saúco) en los medicamentos puede variar dependiendo de una clase, una forma de agente, una edad o peso corporal o un síntoma para aplicarse a un paciente y similares, por ejemplo, cuando se administran oralmente, se administran una o varias veces por día por un adulto que pesa de aproximadamente 60 kg, y se administra en una cantidad de aproximadamente 10 mg a 5 g, de manera preferible aproximadamente 50 mg a 2 g por día. El gradiente efectivo puede ser uno o varios componentes del extracto de saúco.

Sistemas de Suministro Los modos de administración útiles para el suministro de las composiciones de la presente invención a un sujeto incluyen modos de administración comúnmente conocidos por uno de experiencia ordinaria en la técnica, tal como, por ejemplo, polvos, aspersores, ungüentos, pastas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una modalidad, el modo de administración es un inhalante el cual puede incluir formas de liberación por tiempo o de inhalantes de liberación controlada, tal como, por ejemplo, formulaciones liposomales. Tal como un sistema de suministro debe ser útil para tratar a un sujeto por SARS , gripe aviar y similar. En esta modalidad, las formulaciones de la presente invención pueden ser útiles en cualesquier dispositivo de dispersión de dosis adaptado por administración intranasal . El dispositivo debe interpretarse con una visión de constatar la exactitud y compatibilidad exacta de medición de sus elementos constructivos, tales como contenedor, válvula y accionador con la formulación nasal y puede basarse en un sistema de bomba mecánica, por ejemplo, aquella de un nebulizador de dosis de medición, inhalador de polvo seco, inhalador de vaporización suave o un nebulizador. Debido a la dosis administrada amplia, los dispositivos preferidos incluyen nebulizadores por chorro (por ejemplo, PARI LC Star, AKITA) , inhaladores de vaporización suave (por ejemplo, PARI e-Flow) , e inhaladores de polvo seco con base en cápsulas, (por ejemplo, PH&T Turbospin) . Los propulsores adecuados pueden seleccionarse entre tales gases como fluorocarburos , hidrocarburos, nitrógeno y óxido de dinitrógeno o mezclas de los mismos. El dispositivo de suministro de inhalación puede ser un nebulizador o un inhalador de dosis por medición (MDI) o cualquier otro dispositivo de suministro de inhalación adecuado conocido por uno de experiencia ordinaria en la técnica. El dispositivo puede contener y puede utilizarse para suministrar una dosis sencilla de las formulaciones o el dispositivo puede contener y utilizarse para suministrar dosis múltiples de las composiciones de la presente invención. Un dispositivo de suministro de inhalación tipo nebulizador puede contener las composiciones de la presente invención como una solución, usualmente acuosa o una suspensión. En forma general los aspersores nebulizadores de las composiciones para inhalación, el dispositivo de suministro tipo nebulizador pueden accionarse ultrasónicamente, mediante aire comprimido, mediante otros gases, electrónica o mecánicamente. El dispositivo nebulizador ultrasónico usualmente trabaja componiendo una forma de onda oscilante rápidamente en la película líquida de la formulación mediante una superficie de vibración electroquímica. En una amplitud dada de forma de onda que llega a ser inestable, por lo que desintegra la película líquida, y produce pequeñas gotitas de formulación. El dispositivo nebulizador accionado por aire u otros gases opera la base de aquella de una corriente de gas de presión elevada que produce una caída de presión local que extrae la formulación líquida en la corriente de gases mediante acción de capilaridad. Esta corriente líquida fina entonces se desintegra antes. El nebulizador puede ser potable y portátil en diseño, y puede equiparse con una unidad eléctrica autocontenida . El dispositivo nebulizador puede comprende una boquilla que tiene dos canales de salida coincidentes del tamaño de abertura definidos a través del cual la formulación líquida puede acelerarse. Esto resulta en la impactación de dos corrientes y atomización de la formulación. El nebulizador puede usar un accionador mecánico para forzar la formulación líquida a través de la boquilla de orificios múltiples de tamaño de aberturas definidas para producir un aerosol de la formulación por inhalación. En el diseño de los nebulizadores de dosis sencilla, los paquetes contienen dosis sencillas de la formulación que pueden emplearse. En la presente invención el nebulizador puede emplearse para asegurar la dimensión de las partículas que es óptima para la colocación de la partícula dentro, por ejemplo, la membrana pulmonar. Un inhalador de dosis medido (MDI) puede emplearse como el dispositivo de suministro de inhalación para las composiciones de la presente invención. Este dispositivo se presuriza (PMDI) y su estructura básica comprende una válvula de medición, un accionador y un contenedor. Un propulsor se utiliza para descargar la formulación del dispositivo. La composición puede consistir de partículas de un tamaño definido suspendido en el líquido del o los propulsores presurizados , o la composición puede estar en una solución o suspensión de los propulsores líquidos presurizados. Los propulsores utilizados son hidrofluorocarburos amigablemente atmosféricos de manera principal (HFCs) tales como 134a y 227. Los clorofluorocarbonos tradicionales como CFC-11, 12 y 114 se utilizan únicamente cuando es esencial. El dispositivo del sistema de inhalación puede suministrar una dosis sencilla mediante, por ejemplo, un paquete blister, o puede ser de dosis múltiple en diseño. El inhalador de dosis medido, presurizado del sistema de inhalación puede ser de respiración accionada para suministrar una dosis exacta de formulación que contiene lípidos. Para exactitud garantizada de dosis, el suministro de la formulación puede programarse mediante un microprocesador para que ocurra en un cierto punto en el ciclo de inhalación. El MDI puede ser portable y portátil. En otra modalidad, el sistema de suministro puede ser un sistema de suministro transdérmico , tal como, por ejemplo, un hidrogel, crema, loción, ungüento o parche. Un parche en particular puede utilizarse cuando un suministro programado de semanas o aún meses se desea. En otra modalidad, las rutas parenterales de administración pueden utilizarse. Las rutas parenterales involucran inyecciones en varios compartimentos del cuerpo. Las rutas parenterales incluyen administración intravenosa (iv) , es decir directamente en el sistema vascular a través de una vena; administración arterial (ia), es decir directamente en el sistema vascular a través de una arteria; administración intraperitoneal (ip), es decir en la cavidad abdominal; administración subcutánea (se) es decir bajo la piel; administración intramuscular (im) es decir en un músculo; y administración intradérmica (id) , es decir entre capas de la piel. La ruta parenteral algunas veces se prefiere sobre unas orales cuando parte de la formulación administrada debe parcial o totalmente degradar el tracto gastrointestinal. De manera similar, cuando se necesita para respuesta rápida en casos de emergencia, la administración parenteral es usualmente preferida sobre la oral .

Método para Tratar Influenza La actividad inhibitoria de fracciones de baya de saúco se cuantifican por el virus de influenza HlNl tipo A. La dilución serial de las fracciones se incuba con cantidades conocidas de virus y se suministra a monocapas de cultivo celular (véase Figura 5) . Las curvas de respuestas de dosis se trazan y 50% de concentraciones de inhibición (IC50) se determinan para cada fracción contra el virus tipo A HlNl humano. Véase Figura 6-11 y Tabla 16 siguiente para valores IC50. También se ha determinado que la desabsorción F2 de las fracciones antocinina ADS5 de bayas de saúco inhiben el virus del dengue así como el virus de influenza humana tipo A HlNl (véase Figura 12) . Véase Ejemplo 9 para el protocolo experimental.

Tabla 16. Resumen de resultados de ensayos de inhibición que utilizan virus de influenza humana tipo A HlNl.

Método para Tratar HIV La actividad inhibitoria de las fracciones de baya de saúco se cuantifican para virus HIV-1. Una dilución conocida de extracción se incuba con una cantidad conocida de virus del subtipo C (envoltura) de SG3 (genoma) de HIV-1 quimérico. Véase Figura 9. Las curvas de respuesta de dosis se trazan y extrapolan, las concentraciones inhibitorias al 50% (IC50) se determinaron. Véase Figuras 32-34 y Tabla 17 siguiente. Véase Ejemplo 10 para el protocolo experimental.

Tabla 17. Resumen de los resultados de análisis de inhibición que utilizan virus HIV-1.

Materiales Botánicos : Bayas Sambucus nigra L. (saúco) silvestres producidas (Producto #: 724, Lote #: L10379w, Hungría) y Flores Sambucus nigra L. (saúco) (Producto #: 725, Lote #: L01258W, Polonia) se compraron de Blessed Herbs, Inc. Saúco (Cincinnati) .

Solventes orgánicos : Acetona (67-64-1), 99.5%, reactivo ACS (179124); Acetonitrilo (75-05-8) para HPLC, grado de gradiente 99.9% (GC) (000687); Hexano (110-54-3), 95+%, grado espectrofotométrico (248878); Acetato de etilo (141-78-6), 99.5+%, grado ACS (319902); Etanol , desnaturalizado con isorpropanol al 4.8% (02853); Etanol (64-17-5), absoluto, (02883); Metanol (67-56-1), 99.93%, grado HPLC CAS, (4391993); y Agua (7732-18-5), grado HPLC, (95304). Todos comprados de Sigma-Aldrich. Ácidos y bases : ácido fórmico (64-18-6), solución al 50% (09676); ácido acético (64-19-7), 99.7+%, reactivo ACS (320099); ácido clorhídrico (7647-01-0), solución 1.0N estándar volumétrica en agua (318949); reactivo de fenol Folin-Ciocalteu (2N) (47641); Fenol (108-95-2) (P3653); Ácido sulfúrico (7664-93-9), reactivo ACS, 95 - 97% (44719); y carbonato de sodio (S263-1, Lote #: 037406) se compraron de Fisher Co . Estándares de referencia químicos: Albúmina de suero (9048-46-8), cultivo celular de polvo de Fracción V de Bovino Albúmina probado (A9418); Rutósido (CAS# 153-18-4) ; y cloruro de 3-glucósido de cianidina (CAS# 7084-24-4) se compraron de Chromadex. Estándares de dextrano [5000 (00269), 50, 000 (00891) y 410,000 (00895)] certificado de acuerdo a DIN se compró de Fluka Co . Las estructuras de los estándares de referencia químicos HPLC se muestran en lo siguiente . Rutósido Cloruro de cianidin-3-glucósido Adsorbentes de afinidad Polímero: Amberlita XAD 7HP (Rohm & Haas, France) , polímero reticulado acrílico, alifático macroreticular utilizado como cuentecillas translúcidas blancas con tamaño de partícula de 560-710 nm y el área de superficie es 380 m2/g. ADS-5 (Nankai University, China) , poliestireno modificado por grupo éster con tamaño de partícula de 300-1200 nm y área de superficie es 500-600 m2/g.

Métodos Métodos de Cromatografía Líquida (HPLC) de Alto Rendimiento Sistema cromatográfico : el sistema LC-10AVP cromatográfico líquido de rendimiento elevado Shimadzu equipado con una bomba LC10ADVP con detector de secuencia de foto diodo SPD-M 10AVP. Los productos de extracción de etanol de la presente invención se midieron en una columna de Júpiter C18 de fase inversa (250x4.6 mm I . D., 514 300 Á) (Phenomenex, Parte #: OOG-4053-E0, No. de serie: 2217520-3, Lote No. : 5243-17) . El volumen de inyección fue de 10 µ? y la velocidad de flujo de la fase móvil fue de 1 ml/min. La temperatura en columna fue 25°C. La fase móvil consistió de A (Ácido acético fórmico al 5% v/v) y B (metanol) . El gradiente se programó como sigue: con los primeros 2 minutos, mantiene B a 5%, 2-10 min solvente B linealmente incrementado de 5% a 24 por ciento 10-15 minutos, B se mantiene a 24%, 15-30 min, B linealmente de 24% a 35%, y 30-35 min, B se mantiene a 35% 35- 50 min, B linealmente de 35% a 45%, mantenida en esta composición durante 5 minutos, luego 55-65 min, B linealmente de 45% a 5%, 65-68 min, d se mantiene a 5%. Las longitudes de onda de detección fueron 350 nm para flavonoides y 520 nm para antocianidinas . Las soluciones de sustancias de metanol de dos estándares de referencia se prepararon disolviendo cantidades pesadas de compuestos estándar en etanol a 5 mg/ml . La solución estándar de referencia mezclada entonces se diluyó etapa por etapa para dar una serie de soluciones en concentraciones finales de 1.0, 0.5, 0.25, 0.1, y 0.05 mg/ml, respectivamente. Todas las soluciones de suspensión y la solución de trabajo se utilizaron dentro de 7 días, se almacenaron en +4°C, y se llevaron a temperatura ambiente antes del uso. Las soluciones se utilizaron para identificar y cuantificar los compuestos tanto en la baya de saúco y la flor de saúco. Los tiempos de retención de cianidin-3 -glucósido (CY3glu) a 520 nm y Rutósido a 350 nm fueron de aproximadamente 13.27 y 20.20 min, respectivamente. Un ajuste lineal que varia de 0.01 a 20 \ig se encontró. Las ecuaciones de regresión y los coeficientes de correlación fueron como sigue: Antocianidina-3 -glucósido: Área/100 = 20888 * x C (ßg)+ 502.21, R2 = 0.9994 (N = 5); y Rutósido: Área/100 =11573 x C g) + 584.57, R2 = 0.9996 (N = 5) los resultados de HPLC se muestran en la Tabla 18. Los contenidos de los estándares de referencia en cada muestra se calcularon mediante interpolación de las curvas de calibración correspondientes con base en el área pico .

Tabla 18. Resultados de análisis HPLC de estándares de referencia de saúco en concentración de 0.1 mg/ml en metanol .

* Las placas teóricas se calcularon por N =16 x (tR/w)2. tR es tiempo de retención y w es el ancho de pico, https : / /www. mn-net . com/web%5CM -WEB HPLCKatalog . nsf /WebE/GRUNDLAGEN Métodos de Cromatografía de Gas-Espectroscopia de Masa (GC-MS) El análisis GC-MS se realizó utilizando un sistema Shimadzu GCMS-QP2010. El sistema incluye cromatografía de gas de rendimiento elevado, interfaz GC/MS acoplada directa, fuente iónica de electroimpacto (El) con control de temperatura independiente, y filtro de masa de cuadrupolo. El sistema se controla con software Ver .2 de solución GCMS para la adquisición de datos y análisis post ejecución. La separación se llevó a cabo en una columna de capilaridad de sílice fusionada Agilent J&W DB-5 (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 ixm espesor de película (5% fenilo, 95% dimetilsiloxano) ) (catálogo: 1225032, No. de Serie: US5285774H) utilizando el programa de temperatura siguiente. La temperatura inicial fue 60°C, mantenida durante 2 min, entonces se incremento a 120°C a velocidad de 4°C/min, mantenida durante 15 min, entonces se incrementó a 200°C a velocidad de 4°C/min, mantenida durante 15 min, entonces incrementó a 240°C a velocidad de 4°C/min, manteniendo otros 15 min. El tiempo de ejecución total fue de aproximadamente 92 minutos . La temperatura de inyección muestra fue 250°C. 1 µ? de la muestra se inyecto mediante un autoinyector en modo de menor separación en un minuto. El gas portador fue helio y la velocidad de flujo se controló mediante presión a 60KPa. Boja tal presión, la velocidad de flujo fue 1.03 ml/min y la velocidad lineal fue 37.1 cm/min y el flujo total fue 35 ml/min. La temperatura de fuente iónica MS fue 230°C, y la temperatura de interfaz GC/MS fue 250°C. El detector MS se escaneo entre m/z de 50 y 500 en escaneo de velocidad de 1000 AMU/segundo con un voltaje de ionización a 70eV. La temperatura de eliminación de solvente fue 3.5 min.

Concentración de ácido fenólico total por método (Markar, H. P. S., Bluemmel, M. , Borowy, N, K. y Becker, K., 1993, J. Sci. Food Agrie. 61: 161-165) Instrumentos: Espectrómetro UV-Vis de Shimadzu (UV 1700 con sonda UV: S/N: A1102421982LP) . Estándares de Referencias: Se hace ácido gálico de sustancia/solución de agua a concentración de 1 mg/ml . Las cantidades adecuadas cargadas de solución de ácido gálico en los tubos de prueba, constituyó el volumen a 0.5 mi con agua destilada, agregando 0.25 mi de reactivo Folin Ciocalteu y luego 1.25 mi de la solución de carbonato de sodio 20% en peso. El tubo se sacude bien en un baño ultrasónico durante 40 min y la absorbencia registrada a 724 nm. Los datos de estándar de referencia se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Datos de curva de calibración para estándares de referencia de ácido gálico utilizados en el método Folin-Ciocalteu .

Tubo Solución de Ácido gálico Agua Reactivo Solución de Absorbencia ácido gálico destilada de folina carbonato de 725 mm* (µß) (O.lmg/ml) (mi) (mi) de sodio (mi) (mi) Virgen 0.00 0 0.50 0.25 1.25 0.000 1 0.02* 2 0.48* 0.25 1.25 0.1 11 2 0.04 4 0.46 0.25 1.25 0.226 3 0.06 6 0.44 0.25 1.25 0.324 4 0.08 8 0.42 0.25 1.25 0.464 5 0.1 10 0.40 0.25 1.25 0.608 * : cantidad de solución de ácido gálico es dependiente en la información de absorción. Muestra desconocida: Se toman alícuotas adecuadas del extracto que contienen tanino en tubos de ensayo, constituir el volumen a 0.5 mi con agua destilada agregar 0.25 mi del reactivo y Folin-Ciocalteu y luego 1.25 mi de la solución de carbonato de sodio. Se sometieron a vórtice los tubos y la absorbancia de registro a 725 nm después de 40 min. Calcular la cantidad de los fenoles totales como el equivalente de ácido gálico de la curva de calibración anterior . Determinación de Contenido de Proteína por el Método reactivo de Bradford Instrumento: espectrómetro Shimadzu UV-Vis (UV 1700 con sonda UV: S/N: A1102421982LP) Curva de calibración estándar: Los estándares de proteína preparados de las concentraciones apropiadas en el mismo tampón como las muestras desconocidas . En la presente invención el agua desionizada puede sustituirse por el tampón. Hacer los estándares BSA que varían de 0.1-1.4 mg/ml diluyendo serialmente la solución estándar de proteína BSA 2 mg/ml. Entonces, mezclar 0.1 mi de estándar BSA con reactivo Bradford 3 mi. Someter a vórtice la mezcla y dejar las muestras incubadas a temperatura ambiente durante 5-45 minutos. Registrar la absorbancia a 595 nm. La absorbancia de las muestras debe registrarse antes de los 60 minutos limite de tiempo y dentro de 10 minutos entre sí. Los resultados se muestran en la Tabla 20.

Tabla 20. Datos de calibración estándar para ensayo de proteína Bradford Análisis de muestras desconocido: Tomar las alícuotas adecuadas de las muestras de prueba que contienen proteína en tubos de ensayo; constituir el volumen a 0.1 mi con agua destilada. Entonces agregar reactivo Bradford 3 mi. Sacudir el tubo y registrar la absorbancia a 595 nm dentro de 5-45 minutos. Calcular las cantidades de proteína como equivalente estándar BSA de la curva de calibración anterior. Análisis de polisacárido que utiliza método colorimétrico (Dubois, M . , Gilíes, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A. y Smith, F., 1956, Analytical Chemistry 28(3) : 350-356) . Sistema espectrofotómetro : Espectrómetro visible ultravioleta Shimadzu UV-1700 (190-1100 nm, resolución lmm) se ha utilizado en este estudio. El método colorimétrico se ha utilizado para análisis de polisacárido. Hacer soluciones de dextrano de sustancias 0.1 mg/ml (Mw = 5000, 50,000 y 410,000) . Tomar 0.08, 0.16, 0.24, 0.32, 0.40 mi de solución de sustancia y constituir el volumen a 0.4 mi con agua destilada. Entonces agregar en 0.2 mi solución de fenol al 5% y ácido sulfúrico concentrado 1 mi. Las mezclas se dejaron permanecer durante 10 minutos previos a la realización del escaneo UV. La absorbancia máxima se encontró a 488 nm. Entonces se establece la longitud de onda a 488 nm y se mide la absorbancia para cada muestra. Los resultados se muestran en la Tabla 21. Las curvas de calibración estándar se obtuvieron para cada una de las soluciones de dextrano como sigue: Dextrano 5000, Absorbancia = 0.01919+ 0.027782 C (Mg) , R2 = 0.97 (N = 5); Dextrano 50,000, Absorbancia = 0.0075714+ 0.032196 C (¡ig) , R2 = 0.96 (N = 5); y Dextrano 410,000, Absorbancia = 0.03481+ 0.036293C {ß?) , R2 = 0.98 (N = 5) . Tabla 21. Análisis colorimétrico de estándares de referencia de dextrano.

Análisis Directo en Espectrometría de Masa en Tiempo Real (DART) para Análisis de Polisacárido.

Todos los cromatogramas DART, y en particular aquellos para las fracciones F1-F6 de del material de empaque XAD 7HP y las fracciones F1-F4 del material de empaque ADS5, se ejecutaron utilizando los instrumentos y métodos descritos en lo siguiente. Instrumentos: Tiempo JOEL AccuTOF DART LC de espectrómetro de masa de trayectoria (Joel USA, Inc., Peabody, Massachusetts , USA). Esta tecnología de espectrómetro de masa de Tiempo de Trayectoria (TOF) no requiere ninguna preparación de muestra y masas de rendimientos con exactitud a unidades de masa 0.00001. Métodos: Los establecimientos de instrumento utilizados para capturar y analizar las fracciones de polisacárido son como siguen: Para el modo catiónico, el voltaje de uso DART es 3000 V, elemento de calentamiento a 250°C, Electrodo 1 a 100 V, Electrodo 2 a 250 V, y flujo de gas de helio de 7.45 litros/minuto (L/min) . Para el espectrómetro de masa, el orificio 1 es 10 V, lentes de anillo es 5 V, y el oficio 2 es 3 V. El voltaje de pico se establece a 600 V para dar inicio de energía de resolución aproximadamente 60 m/z, aún dejar resolución suficiente a rangos de masa mayores. El voltaje de detector de placa de microcanal (MCP) se establece a 2450 V. Las calibraciones se realizan cada mañana previos a la introducción de muestra que utiliza un estándar de solución de cafeína 0.5 M ( Sigma-Aldrich Co . , St. Louis, USA). Las tolerancias de calibración se mantienen a = 5 mmu . Las muestras se introdujeron en el plasma de helio DART con fórceps estériles que aseguran que un área de superficie máxima de la muestra se expone al haz de plasma de helio. Para introducir la muestra en el haz, se emplea un movimiento de barrido. Este movimiento permite que la muestra se exponga repetidamente en el golpe hacia delante y hacia atrás durante aproximadamente 0.5 seg/golpe y pirólisis prevenida de la muestra. Este movimiento se repitió hasta que se observó la señal de corriente iónica total (TIC) apreciable en el detector, entonces la muestra se removió, permitiendo la normalización de línea base/entorno . Para el modo aniónico, el DART y AccuTOF MS se transfirió a modo iónico negativo. El voltaje de uso es 3000 V, elemento de calentamiento 250°C, Electrodo 1 a 100 V, Electrodo 2 a 250 V, y flujo de gas de helio a 7.45 L/min. Para el espectrómetro de masa, el orificio 1 es 20 V, lentes de anillo es -13 V, y el orificio 2 es -5 V. El voltaje pico es 200 V. El voltaje MCP se establece a 2450 V. Las muestras se introdujeron en la misma forma exacta como el modo catiónico. Todos los análisis de datos se condujeron utilizando software adecuado MassCenterMain Suite proporcionado con el instrumento.

Ejemplo 1 Ejemplo de la Etapa 1A: La extracción y purificación máxima de etapa sencilla SFE y purificación de baya de saúco. Se realizaron todas las extracciones SFE en SFT 250 ( Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, Delaware, USA) diseñadas para presiones y temperaturas hasta 69 Megapascales (690 bar) es y 200°C, respectivamente. Este aparato permite extracciones simples y eficientes en condiciones supercríticas con flexibilidad para operar en modos ya sea dinámico o estático. Este aparato consiste de tres módulos principalmente; un horno, una bomba y control y módulo de colección. El horno tiene una columna precalentada y un recipiente de extracción de 100 mi. El módulo de bomba se equipó con una bomba accionada al aire comprimida con capacidad de flujo constante de 300 ml/min. El módulo de colección es un frasco de vidrio de 40 mi, sellado con tapas y tabique para la recuperación de los productos extraídos. El equipo se proporciona con válvula de micrómetro y un metro de flujo. La presión del recipiente de extracción y la temperatura se monitorearon y controlaron dentro de ± 0.3 Megapascales (± 3 bar) y ± 1°C . En los ejemplos experimentales típicos, 5 gramos de ya sea polvo de baya Sambucus Nigra L crecida (baya de saúco) o flor (flor de saúco) con tamaño de aproximadamente 105 µt? tamizada medida utilizando un tamiz (140 mallas) se cargó en 100 mi de recipientes de extracción para cada experimento. La lana de vidrio se colocó en dos extremos de la columna para evitar cualquier traslado posible del material sólido. El horno se precalentó en la temperatura deseada antes de que el recipiente empacado se cargara. Después de que el recipiente se conectó en el horno, el sistema de extracción se probó para el escape mediante presurización del sistema con C02 (-58.6 Megapascales (-850 psig) ) , y se purgó. El sistema se cerró y presurizó en la presión de extracción deseada utilizando la bomba de líquido accionada por aire. El sistema entonces se dejó para equilibrio durante ~3 min. Un frasco de muestra (40 mi) se pesó y conectó al puerto de muestra. La extracción se inició mediante flujo C02 a una velocidad de 5 SLPM (10 g/min) , la cual se controló por una válvula de medición. El rendimiento se definió para hacer la relación en peso de los exactos totales en la alimentación del material sin refinar. El rendimiento se definió como el porcentaje en peso del aceite extraído con respecto a la carga inicial del material sin refinar en el extractor. Un diseño de extracción factorial completo se adoptó variando la temperatura de 40-80°C y de 100-50 Megapascales (500 bar) es. Los extractos obtenidos en cada condición se disolvieron en diclorometano a concentración de 400 ppm para el análisis de Cromatografía de Gas-Espectroscopia de Masa (GC-MS) .

Ejemplo 2 Ejemplo de la Etapa 2: Extracción de Lixiviación Hidroalcohólica . Un ejemplo típico de una extracción de solvente de etapa 2 de los constituyentes químicos de ácido fenólico de especies saúco es como sigue: La materia prima fue 17.6 gm de residuo SFE de baya de saúco crecida de la extracción SCC02 Etapa 1 (60°C, 30 Megapascales (300 bar), 90 min) del aceite esencial. El solvente fue 300 mi de metanol acuoso al 25%. En este método, el material de materia prima y etanol acuoso al 80% se cargaron separadamente en 500 mi del recipiente de extracción y se mezcló en un baño de agua calentado a 60°C durante 4 horas. La solución de extracción se filtró utilizando papel de filtro Fisherbrand P4 que tiene un tamaño de retención de partícula de 4-8 µ??, centrifugado a 2000 rpm durante 20 minutos, y el residuo de partícula utilizado para extracción adicional. Los filtrados (sobrenadantes) se colectaron y combinaron para cálculo de rendimiento, análisis HPLC y producción de fracciones F1-F4 y F1-F6 (véase Ejemplo 3 siguiente) . El residuo de la Etapa 1 se extrajo durante 2 horas (Etapa 2) utilizando los métodos antes mencionados.

Ejemplo 3 Ejemplo de Etapa 3 Extracción Adsorbente de afinidad de Fracción de Ácido fenólico (Preparación de Fracciones F1-F4 y F1-F6) . En los experimentos típicos, la solución de trabajo fue la solución hidroalcohólica transparente de extracto de lixiviación de etanol acuoso de especie saúco en la Etapa 2. La resina de polímero adsorbente de afinidad fue XAD7HP o ADS5. 15 gm de adsorbente de afinidad ADS5 o 20 gm de adsorbente de afinidad XAD7HP se pre-lavó con etanol al 95% (4-5 BV) y agua destilada (4-5 BV) antes y después de empaquetar una columna con un ID de 25 mm y longitud de 500 mm. Las soluciones cargadas fueron las soluciones de ácido fenólico de lixiviación de etanol al 80% sin purificar en donde los constituyentes químicos se concentraron mediante rotación de la destilación al vacío y reciclado del etanol. La concentración de solución de carga final fue 29.03 mg/ml para carga de XAD7HP y 34.90 mg/ml para carga de ADS5. 50 mi de la solución de carga se cargó en la columna XAD7HP y 60 mi de la solución de carga se cargó en la columna ADS5 a una velocidad de flujo de 0.3 BV/hr. El tiempo de carga fue de aproximadamente 50-60 minutos. La columna cargada se lavó con 2 BV de agua destilada a una velocidad de flujo de 0.2 BV/hr con un tiempo de lavado de 13 minutos. 40 mi de 40% y 80% de etanol acuoso se utilizó para eluir secuencialmente la columna cargada a una velocidad de flujo de 2 ml/min para XAD7HP y 1.5 ml/min para ADS5. Durante la elución, 6 fracciones de eluyente (F1-F6: Fl-20 mL, F2-20 mL, F3-18 mL, F4-10 mL, F5-17 mL, y F6-27 mL) se colectaron de la columna XAD7HP y 4 fracciones eluyentes (F1-F4: Fl-20 mL, F2-20 mL, F3-17 mL, y F4-17 mL) de la columna ADS5, respectivamente. Para la columna XAD7HP, F1-F3 se eluyeron utilizando 40% de etanol y F4-F6 se colectaron utilizando 80% de etanol. Para la columna ADS5, F1-F2 se eluyeron utilizando 40% etanol y F3-F4 se eluyeron utilizando 80% de etanol. Entonces 4-5 BV de 95% de etanol se utilizó para limpiar los químicos restantes en la columna a una velocidad de flujo de 3.6 BV/hr seguida por lavado con 4-5 BV de agua destilada a 3.8 BV/hr. El tiempo de procesamiento total fue menor de 2 horas . La velocidad de flujo durante el proceso completo se controló utilizando una bomba peristáltica de velocidad variable Omegaflex® FPU 252 (3-50 ml/min) . Cada fracción de elución se colectó y analizó por balance de masa DART y HPLC .

Ejemplo 4 Ejemplo de Etapa 5 Extracción de Fracción de Polisacárido Un ejemplo experimental típico de la extracción de solvente y precipitación de los constituyentes químicos de fracción de lectina-polisacárido purificado insoluble en etanol, soluble en agua de las especies saúco es como sigue: 15 gm del residuo sólido de la extracción de lixiviación hidroalcohólica de 2 etapas (Etapa 2) se extrajo utilizando 300 mi de agua destilada durante dos horas a 80°C en dos etapas. Las dos soluciones de extracción se combinaron y la suspensión se filtró utilizando papel de filtro Fisherbrand P4 (tamaño de poro 4-8 µp?) y se centrifugó a 2,000 rpm durante 20 minutos. La concentración de los compuestos en la solución fue 3.8 mg/ml . 300 mi de esta solución y luego, 456 mi o 1200 mi de etanol anhídrido se agregó para hacer una concentración de etanol final de 60% o 80%. Las soluciones se dejaron permanecer durante una hora mientras ocurrió la precipitación. La solución de extracción se centrifugó a 3,000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se decantó y descargó. El precipitado se colectó y se secó en un horno a 50°C durante 12 horas. La fracción de polisacárido seca se pesó y disolvió en agua para análisis de pureza de polisacárido con el método colorimétrico utilizando dextrano como estándares de referencia y para análisis de pureza de proteína de lectina utilizando método de ensayo de proteína Bradford. La espectrometría de masa AccuTOF-DART se utilizó para perfil adicional de los pesos moleculares de los compuestos que comprenden la fracción de polisacárido purificada. Los resultados para la baya de saúco se mostró en las Figuras 3 6 y 37 y Tabla 22. Los resultados para la flor de saúco se mostraron en las Figuras 3 8 y 3 9 y Tabla 22.

Tabla 20. Polisacárido de análisis DART de baya de saúco flor de saúco.

Ejemplo 5 Los siguientes ingredientes se mezclaron para la formulación : Extracto de bayas S. nigra 150.0 mg Fracción de Aceite Esencial (10 mg, 6.6% de peso seco) Fracción polifenólica (120 mg, 80% de peso seco) Polisacáridos (40 mg, 26.6% de peso seco) Esteviósido (Extracto de Stevia) 12.5 mg Carboximetilcelulosa 35.5 mg Lactosa 77.0 mg Total 275.0 mg El extracto novedoso de las especies saúco comprenden una fracción de aceite esencial, fracción de aceite esencial de ácido fenólico y fracción de polisacárido mediante peso en masa en por ciento mayor que aquella encontrada en el material risoma natural o productos de extracción de conveniencia. Las formulaciones pueden hacerse en cualquier forma de dosis oral y administrarse diariamente o, a quince veces por día como se necesite por los efectos fisiológicos y psicológicos (reducción de agitación y nerviosismo) y efectos médicos (enfermedades virales tales como resfriado común, influenza, herpes simple, herpes zoster, y HIV, diabetes mellitus, prevención y tratamiento de enfermedad cerebrovascular , anti-ateroesclerosis , anti-oxidante y depurador radical libre, antiinflamatorio, antiartritis, trastornos anti-reumáticos y gastrointestinales).

Ejemplo 6 Los siguientes ingredientes se mezclaron para la formulación siguiente: Extracto de bayas S. Nigra 150.0 mg Fracción de Aceite Esencial (6 mg, 6.6% de peso seco) Fracción polifenólica (30 mg, 20% de peso seco) Polisacáridos (114 mg, 76% de peso seco) Vitamina C 15.0 mg Sacarosa 35.0 mg Polvo de Frijol de Mungo 10:1 50.0 mg Sabor Mocha 40.0 mg Sabor Chocolate 10.0 mg Total 300.0 mg La composición de extracto novedoso de chuangxiong de saúco comprenden un aceite esencial, aceite esencial de ácido fenólico, y fracciones y constituyentes químicas de polisacárido por peso de masa en % mayor que el que se encontró en el material vegetal natural o productos de extracción convencional. La formulación puede hacerse en cualquier forma de dosis oral y administrarse en forma segura hasta 15 veces por día como se necesite por los efectos fisiológicos, psicológicos y médicos deseados (véase Ejemplo 5, anterior).

Ejemplo 7 Ensayo MTT para determinación de número celular para utilizarse Propósito: Este es un experimento control para determinar la cantidad de células para utilizarse en ensayo de MTT/citotoxicidad futura. Debe solo necesitar hacerse una vez por línea celular utilizada.

Evaluación JD de Bioactivos para Actividad anti Viral. Día Uno De un frasco T-75 de coefluente de células (este protocolo se escribe utilizando MDCKs): 1. Aspiración media y adición de 2 mi de tripsina en los frascos. Inc. 5 min a 37°C. 2. Golpear los lados de los frascos con fuerza y remover tripsina a un tubo cónico de 55 ce. Agregar 0.5 mi de medio de crecimiento (DMEM+P/S+Glutamax + FBS) a este tubo también. 3. Agregar otra tripsina de 2 mL al frasco, Inc. 3-5 min a 37°C. 4. Golpear los lados de los frascos con fuerza y remover la tripsina en el tubo de 50 ce de la etapa 2. Agregar 10 mi de los medios de crecimiento al frasco, enjuagando el fondo del frasco dos veces. Colocar estos 10 mi de los medios en el mismo tubo de 50 ce. Verificar que el frasco que utiliza microscopio ver si las células se eliminaron. 5. Girar a 4°C, 1000 rpm durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante . 6. Descargar el granulo y resuspender el gránulo en 5 mi de los medios de crecimiento. 7. Girar a 4°C, 1000 rpm durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.

Descargar el gránulo y resuspender las células en el medio de crecimiento de 1 mL . Células diluidas 1:2 agregando 500 µ? de células a 500 µ? de medio de crecimiento en un tubo de microfugas . Se inicia con una placa que se elevó extremadamente en la densidad celular, querrá diluir las células 1:4 en el medio de crecimiento . Verificar 10 µ? de células diluidas en hemacitómetro . Registrar el conteo celular durante 3 cuadrículas y tomar el promedio de estos tres números. Esto da el conteo celular: promedio por 104 células/mL. Quiere iniciar con aproximadamente 5 x 106 células/mL. Si tiene demasiadas células recuente las células después de otra dilución. Usar un total de 11 tubos de microfuga para establecer diluciones de 2 veces. Aquí se encuentra un ejemplo: Tubo # Células/mL Medios Agregados Células Agregadas 1 1.34 x 106 2 6.7 x 105 400 µ? 400 µ? del tubo 1 3 3.35 x 105 400 µ? 400 µ? del tubo 2 4 1.68 x 105 400 µ? 400 µ? del tubo 3 8.4 x 104 400 µ? 400 µ? del tubo 4 6 4.2 x 104 400 µ? 400 µ? del tubo 5 7 2.1 x 104 400 µ? 400 µ? del tubo 6 8 1.05 x 104 400 µ? 400 µ? del tubo 7 9 5.25 x 103 400 µ? 400 µ? del tubo 8 2.63 x 103 400 µ? 400 µ? del tubo 9 11 Sólo medio de control 400 µ? 12. Este ensayo se hizo por triplicado, de este modo agregar 100 µ? de cada tubo en los pozos A-C en una placa de 96 pozos, con cada número de columna en la placa que corresponde al tubo cuya muestra está ahora contenida. 13. Incubar la placa a 37°C durante la noche p/C02, o tan grande como pueda tomarse para las células para recuperar y reunir (usualmente 12-18 horas).

Día Dos 1. Alrededor de las 9:00 a.m., verificar las células en la placa bajo microscopio para asegurarse de que sean adheridas, que sean cofluyentes al menos en la columna 1 y que se observe menos células por pozo cuando se mueva a través de la placa. El medio en las primeras 2-3 columnas debe ser anaranjado; otros deben ser rosa. 2. Agregar reactivo de 10 µ? MTT (el cual se almacenó a 4°C) por pozo, cambiando las puntas entre cada pozo y siendo cuidadosos de no contaminar la sustancia del reactivo MTT . Incubar la placa a 37°C durante 2 horas. Verificar la placa bajo microscopio para la apariencia de incisión púrpura, precipitado intracelular . Si no ve que esto continúe la incubación hasta 20 horas. Una vez que ve el precipitado, agregue 100 µ? del reactivo de detergente (almacenado a temperatura ambiente) por pozo. NO SACUDIR LA PLACA DE AQUÍ EN ADELANTE" . Cubrir la placa con placa de aluminio y dejar la placa a temperatura ambiente durante la noche, a Utilizar el lector de placa Tecan, medir la absorbancia de los pozos a 560 nm con longitud de onda de referencia de 620 nm. Se hará esto si utiliza cualquiera de los programas llamados "MTT" en XFluor4. Se necesitará asegurarse que el portaobjetos C de filtro este en el Tecan. Determinar los valores promedio de los lectores por triplicado y sustraer el valor promedio del promedio para el espacio únicamente medio (columna 11) . La absorbancia de trama en el eje y el número celular por Mi en el eje x. Seleccionar un número celular para el uso en ensayos futuros que rindan una absorbancia de 0.75 a 1.25. El número celular seleccionado debe caer en la porción lineal de la curva.

Ejemplo 8 Ensayo MTT Propósito: Para definir si el o los extractos tienen efecto citotóxico en células. Evaluación JD de Bioactivos para Actividad Antiviral Día Uno 1. Utilizar el balance ultrasensible por la ventana en WH265, medir 0.01 g del extracto y disolver en 100 µ? de PBS estéril. Se volverá loco tratando de hacer esto exacto, de modo que lo obtiene tan detallado como pueda y registre la masa en su cuaderno de notas, junto con los detalles de la etiqueta del tubo de extracto. Esto es su "extracto no diluido" y está en la concentración de aproximadamente 0.1 g/mL. Si el extracto no es soluble por completo, girar el precipitado en la microcentrí fuga a 13k rpm durante 30 seg, el sobrenadante removido en un tubo de microfuga estéril para trabajar todo el día y almacenar el gránulo a -20°C para uso futuro posible. A partir de un matraz T-75 confluente de células (este protocolo se escribe utilizando MDCKs): 1. Aspirar el medio y agregar 2 mi de tripsina a los matraces. Incorporar 5 minutos a 372C. 2. Golpear los lados de los matraces con fuerza y remover la tripsina en un tubo cónico de 50 ce. Agregar 0.5 mi del medio de crecimiento (DMEM + P/S + Glutamax + FBS) en este tuvo también. 3. Agregar otros 2 mi de tripsina al matraz. Incorporar 3-5 minutos a 372C. 4. Golpear los lados de los matraces con fuerza y remover la tripsina al tubo de 50 ce a partir de la etapa 2. Agregar 10 mL de los medios de crecimiento al frasco, enjuagar el matraz de fondo redondo 2 veces. Coloca r estos 10 mL de medio en el mismo tubo de 50 ce. Verificar el matraz utilizando el microscopio para ver su las células se eliminaron . 5. Hacer girar a 42C, 1000 rpm durante 5 minutos.

Aspirar el sobrenadante. 8. Remover el gránulo y volver a suspender las células en 1 mi del medio de crecimiento. 9. Diluir las células 1:2 agregando 500 µ? de células a 500 µ? del medio de crecimiento en un tubo de Microfuga. Si se inicia con una placa que fue extremadamente alta en densidad celular, se pueden diluir células 1:4 en el medio de crecimiento. 10. Verificar 10 µ? de las células diluidas en un hemacitómetro . Registrar el conteo celular para 3 grandes rejillas y tomar el promedio de estos tres números. Esto da el conteo celular: promedio x 104 células/ml. Para iniciar, debe ser aproximadamente 1-1.6 x 105 MDKC células/ml o 1.3-2.1 x 105 293T células/ml; esto puede lograrse por lo siguiente: Para MDKCs : a. Diluir 1:4 b. Contar las células. Se lograrán aproximadamente 360 células por rejilla grande. c. Diluir 1:4 1:3. Luego diluir 1:10 (400 µ? de células en 3.6 mL del medio) . d. Contar las células. Se desean 10-16 células por rejilla grande. Para 293Ts: a. Diluir 1:8. b. Contar las células. Se conseguirán aproximadamente 300 células por rejilla grande. c. Diluir 1:8 1:2. Luego diluir 1:10 (400 µ? células en 3.6 mi del medio). d. Contar las células. Se desean 13-21 células por rejilla grande. 11. Utilizar un total de 9 tubos de microfuga para crear diluciones de 2 veces de extracto como sigue: Tubo # Dilución del Agregar PBS Agregar Extracto Extracto 1 Sin diluir 2 1 2 50 µ? 50 µ del tubo 1 3 1 4 50 µ? 50 µ? del tubo 2 4 1 8 50 µ? 50 µ? del tubo 3 5 1 16 50 µ? 50 µ? del tubo 4 6 1 32 50 µ? 50 µ? del tubo 5 7 1 64 50 µ? 50 µ? del tubo 6 8 1 128 50 µ? 50 µ? del tubo 7 9 1 256 50 µ? 50 µ? del tubo 8 1 0 1 5 12 50 µ? 50 µ? del tubo 9 En placa de 96 pozos, columna 11 = PBS/solvente control únicamente (tiene células pero no extracto) 12 = Medio control únicamente (virgen - sin células, sin extracto) 12. Este ensayo se hace por triplicado, entonces se agrega 100 µ? de células apropiadamente diluidas, se somete a vértex en hileras A-C de las columnas 1-11 en una placa de 96 pozos, estéril, las células se sometieron en vértex en el tubo después de llenar 3 columnas. 13. Agregar 100 µ? de medio en las hileras A-C de la columna 12. 14. Después se agrega 6 µ? de la dilución del extracto a las hileras A-C de las columnas 1-10 en la placa: (Nota: Cada número de columna en la placa debe corresponder al tubo # anterior) . 15. Agregar 6 µ? del solvente en las hileras A-C de la columna 11. 16. Analizar la placa y agitarla suavemente para asegurar que el extracto est en el líquido en cada pozo y no en un costado de ésta. 17. Incubar la placa a 372C durante la noche W/CO2 durante 24 horas. 18. Colocar 500 µ? a partir del tubo de microfuga original de las células (recientemente sometidas a vórtex) en 10 mi del medio de crecimiento en un matraz T-75 durante una proporción de 1:2 y dejar a 37 SC hasta estar lista la proporción de nuevo. 19. Tomar este tiempo para calcular el µg/ml de extracto en cada columna, con base en cuánto se mide y cuánto volumen se agrega a cada columna. Día Dos 1. Aspirar líquido en cada pozo. Utilizar un pipeteador de multicanal, se lava cada pozo una vez con 200 µ? de PBS estéril. Agregar 100 µ? de medio estéril a cada pozo . 2. Verificar las células bajo el microscopio para asegurar que estén ahí y que no se vuelvan púrpuras a partir del extracto internalizado. 3. Remover 400 µ? del reactivo MTT (el cual se almacena en la puerta de 4SC en el cuarto BSL3 ) a partir de la botella a un tubo de Microfuga. Agregar 10 µ? del reactivo MTT por pozo utilizando el pipeteador regular, cambiando las puntas entre cada pozo y tener cuidado de no contaminar el caldo del reactivo MTT. Incubar la placa a 372C durante 2 horas. 4. Utilizar el pipeteador de multicanal, agregar 100 µ? del reactivo detergente (almacenado a temperatura ambiente) por pozo. NO SACUDIR LA PLACA DE AQUÍ EN ADELANTE. Cubrir la placa con una hoja de aluminio y dejar la placa a 372C hasta las 3:00 p.m., en cuyo tiempo se debe leer la placa en el Tecan. Leer la Placa: 1. Utilizar el lector de placa Tecan, se mide la absorbancia de los pozos a 560 nm. Utilizar el programa llamado "MTT" en XFluor4. Asegurar que el portaobjetos de filtro C esté en el Tecan. Determinar los valores promedio a partir de lecturas por triplicado y substraer estos valores promedio a partir del promedio para el medio virgen únicamente (columna 12). Registrar la absorbancia en el eje y, y µg/ml del extracto en el eje x.

Ejemplo 9 Ensayo para inhibición de infección por influenza A por extracciones de saúco Día 1 1. Medir el extracto en un equilibrio super-sensible por ventana en WH 265. Iniciar con por lo menos 40 mg/ml . Esto podría ser 5 mg (ó 0.005 g) por 125 µ? de PBS estéril . 2. Someter a vórtex para disolver. Si no está en solución, agregar la misma cantidad de PBS. Repetir si es necesario. Si después de este tercer intento, no se interviene completamente la solución, hacer girar a 10-13,000 rpm durante 30 segundos en una microcentrífuga . Remover el sobrenadante y utilizarlo en su lugar. Sin embargo, etiquetar y almacenar la fracción insoluble a -202C. 3. Repetir las etapas 1 y 2 y combinar el extracto solubilizado medido para preparar 250 µ? de la solución del extracto. 4. Etiquetar 2 tubos de Microfuga estériles. "Ab 1:1000" y "Ab 1:500". Agregar 999 µ? de PBS estéril y 1 µ? del anticuerpo anti-influenza primaria A al tubo "Ab 1:1000". Someter a vórtex. Agregar 998 µ? de PBS y 2 µ? del anticuerpo anti-influencia A primario al tubo "Ab 1:500". Someter a vórtex.

. Diluir el virus: a. Etiquetar 4 tubos de microfuga "UV" , "-1", "-2" y "-3". Agregar 990 µ? de PBS al tubo "UV" y 900 µ? de PBS a los otros . b. Agregar 10 µ? del virus en hielo al tubo "UV" .

Someter a vórtex. Cambiar la punta. Tomar 100 µ? de aquél y gregar al tubo "-1". Someter a vórtex. Continuar, agregando 100 µ? de cada tubo al siguiendo, sometiendo a vórtex y cambiando la punta entre cada dilución. 6. Diluir el extracto: a. Etiquetar 5 tubos de microfuga "1:2", "1:4", "1:8", "1:16" y "1:32". Agregar 125 µ? de PBS a cada uno. b. Someter a vórtex la solución del extracto. Agregar 125 µ? de una solución del extracto al tubo "1:2". Someter a vórtex y cambiar la punta: Agregar 125 µ? de "1:2" a "1:4". Someter a vórtex y cambiar la punta. Agregar 125 µ? de "1:4" a "1:8". Repetir para los tubos restantes, sometiendo a vórtex y cambiando las puntas entre las diluciones . 7. Preparar el ensayo: a. Etiquetar 7 tubos de microfuga "sin diluir" "1:2", "1:4", "1:8", "1:16", "1:32" y "PBS". b. Agregar 600 µ? de PBS a todos, aunque el tubo "PBS", el cual obtiene 100 µ? de PBS. c. Agregar 100 µ? de la dilución del virus "-3" (RECIENTEMENTE SOMETIDO A VÓRTEX ! ) a todos los 6 tubos -sin el tubo "PBS" . d. Someter a vórtex la solución del extracto "1:2". Agregar 100 µ? de la solución del extracto "1:2" al nuevo tubo "1:2". Someter a vórtex. e. Repetir la etapa d para los tubos "1:4" a "1:10", agregando las diluciones del extracto a sus tubos nuevos respectivamente etiquetados que contienen PBS y virus . f. Agregar 100 µ? de la solución del extracto sin diluir (RECIENTEMENTE SOMETIDA A VÓRTEX) al tubo "sin diluir" que contiene PBS y virus. Se somete a vórtex. g. Preparar otro tubo con 100 µ? del virus -3 y 700 µ? de PBS y etiquetarlo "virus -4". Someter a vórtex. h. Desechar inmediatamente 300 µ? de los tubos "Ab 1:1000" y "Ab 1:500" y agregar 100 µ? de la dilución del virus "-3" (RECIENTEMENTE SOMETIDO A VÓRTEX) a cada uno de los tubos "Ab 1:1000" y "Ab 1:500". Se somete a vórtex. i. Ajustar el cronómetro durante 1 hora. j . Apagar la luz en la capucha durante esta etapa de pre-incubación . k. Etiquetar las placas con cada columna por triplicado etiquetada "extracto sin diluir", "1:2", "1:4", "1:8", "1:16", "1:32", "1:1000" y "1:500" para controles del anticuerpo, "virus -4 + PBS únicamente" y "PBS únicamente" . 1. Aproximadamente 50 minutos en pre-incubación, lavar las células 3 veces en PBS, dejando los pozos vacíos para la siguiente etapa. m. DESPUÉS DE LA HORA que la pre-incubación acaba, se somete a vórtex a cada tubo justo antes de agregar 200 µ? a éste a cada pozo respectivamente etiquetado . n. Incubar a temperatura ambiente en un Belly Dancer durante 30 minutos, girando 90a después de 15 minutos y haciendo que se recubra el agar en este punto, también . 8. Cuando se han dejado 15 minutos en la infección, preparar el recubrimiento de agar: a. Agregar una botella de DMEM en un baño acuoso para calentarla. b. Mezclar lo siguiente en una botella de vidrio estéril que mantiene por lo menos 100 mi.

RECUBRIMIENTO DE AGAR Para placa de Para placas de 1-6 pozos: 5-6 pozos: DMEM, calentado a 502C 11.56 mi 57.8 mi Antibiótico-antimicótico 150 µ? 750 µ? 7.5% de BSA* 0.576 µ? 2.88 µ? Glutamax 150 µ? 750 µ? Tripsina (1 mg/ml)* 14.4 µ? 72 µ? 5% de Agarosa de placa marina† 2.55 mi 12.75 mi * Para hacer BSA, agregar 0.75 g de BSA a 10 mi de CaMg-PBS y esterilizar en filtro en la capucha. La alícuota en 1.5 mi de alícuotas y se almacena a - 202C. *La tripsina se constituye de 8.5 g/1 de solución NaCl-H20, filtro esterizado en la capucha, se somete a alícuota en lmL de alícuotas, y se almacena a -20SC. † agregar 5g agarosa a 100 mL H20 y autoclave. Almacenar a RT. d. Remover el inoculo y reemplazar con 2 mi de recubrimiento de agar por pozo. Dejar las placas hacia arriba a 4 C durante aproximadamente 20 minutos. e. Remover las placas del refrigerador y colocarlas hacia arriba a 372C en el incubador durante 27 horas después de la infección (después de que se agrega el virus a las células en la etapa m) . DÍA 2 27 horas después de la infección, agregar 0.5-1 mi de Formafresh a cada pozo. Dejar las placas a 42C durante la noche.

DIA 3 1. Aspirar el Formafresh. 2. Remover los tapones de agar con espátula. 3. Agregar 0.5 mi del EtOH al 70% e incubar a temperatura ambiente durante por lo menos 20 minutos. Mientras tanto, constituir el anticuerpo primario a 1:1000 en Blotto en un tubo cónico de 50 ce hacia arriba, someter a vórtex para mezclar los ingredientes : 15.5 mi de PBS 0.775 g de leche en polvo 15.5 µ? de Tween 20 15.5 µ? del anticuerpo anti-influenza A (mantener a 42C) 4. Aspirar EtOH. Enjuagar una vez con PBS. 5. Agregar 500 µ? del anticuerpo primario recientemente sometido a vórtex en Blotto a cada pozo. Oscilar hacia arriba a 4SC en un Belly Dancer durante la noche .

DÍA 4 1. Mezclar hacia arriba el anticuerpo secundario 1:500 en Blotto. (Luego, constituir Blotto como en lo anterior, agregar únicamente 62 µ? del anticuerpo secundario (que se ha congelado en glicerol, se tomó y se almacenó a -202C) en lugar del anticuerpo primario) . 2. Tomar las placas hacia abajo y aspirar el anticuerpo primario. 3. Lavar una vez con PBS . 4. Agregar 500 µ? por pozo del anticuerpo secundario en Blotto e incubar durante 5 horas a temperatura ambiente en el Belly Dancer. 5. Aspirar el anticuerpo secundario. Enjugar una vez con PBS. 6. Agregar 6 gotas por pozo del sustrato Dakko (mantener en puerta a 42C hacia abajo en P3 ) . 7. Colocar inmediatamente en el Belly Dancer e incubar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos, o hasta que se vea el punto. 8. Aspirar el sustrato y lavar una vez con PBS. Almacenar en PBS. 9. Fotografiar en la caja de iluminación y contar las facetas .

Ejemplo 10 Protocolo de Inhibición del HIV para Evaluar la Actividad del Extracto de Saúco Producción de HIV-1 seudo-clasíficado Los viriones de HIV-1 seudo-clasificados se produjeron co-transfectando células 293T en matraces de cultivo celular T75 con 6 ^g de pSG3Eenv, un plásmido que contiene una copia deficiente de envoltura del genoma de la cepa SG3 del HIV-1, y 2 µg del clon ZM53M.PB12 de envoltura, que codifica la envoltura de una cepa de HIV-1 del subtipo C de Zambia. El Reactivo de Transfección Effectene (Qiagen, Valencia, CA) se utilizó para transfectar las células. Después de 18 h el cultivo y el medio con el Reactivo de Transfección Effectene se reemplazó. Los sobrenadantes se recolectaron 48 h después de la transfección, se aclararon por centrifugación a baja velocidad, se sometieron con alícuotas, y se congelaron a -18SC. Los títulos de los caldos virales se determinaron infectando células GHOST, se sembraron en una placa de 96 pozos, durante 2 h a 372C con diluciones de diez veces en serie. Después de 2 h de incubación el medio con el virus se reemplazó con medio Eagle modificado con Dulbecco fresco que contiene 10% de suero de bovino fetal y se incubaron durante 48 h a 372C. La placa se escaneo y se contaron las facetas utilizando un phosphorimager Typhoon con software ImageQuant (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) .

Preparación del extracto de bayas de saúco (fracción F4 ) y ensayos de inhibición de infección El extracto de bayas de saúco (F4) se preparó volviendo a suspender 40 mg de extracto de bayas de saúco liofilizado en 1 mi de PBS (pH 7.2) y poniéndolo completamente en solución ajustando su pH a 7.0 con 40 µ? de NaOH 0.625 M. Para evaluar la actividad viral de F4 contra HIV-1, 5 x 104 de células GHOST se formaron en placas en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. El siguiente día, -1,000 p.f.u. de un virus seudo-clasificado se agregaron a cada pozo en la presencia o ausencia de 6.55, 3.28, 1.64, 0.82, 0.41 y 0.20 Mg de F4/ml. Después de 2 h de incubación a 37 QC, el medio que contiene virus se removió y 200 µ? de medio Eagle modificado con Dulbecco que contiene 10% de suero de bovino fetal se agregó por pozo y 372C, la incubación se continúo durante 48 h. Subsiguientemente, la placa se barrió y se escaneo y se contaron las facetas utilizando un phosphorimager Typhoon con software ImageQuant (Amersham Bioscience) .

Ensayo de Inhibición de subtipo C de HIV-1 El ensayo de inhibición para HIV-1 SG3 quimérico (genoma) subtipo C (envoltura). Esta proteína de envoltura específica se origina del clon de envoltura ZM135M . PB12 , número de acceso GeneBank AY423984, originado en Zambia, modo de transmisión Hembra a Macho, provisto por los Drs . E. Hunter y C. Derdeyn. El brillo, las manchas blancas (véase la Figura 9) son las facetas en una trayectoria ligeramente láctea. La trayectoria es causada por una fluorescencia ligera de las células huéspedes y no puede disminuirse además. +, control de infección positiva; F4, fracción F4 de extracto de baya de saúco; T, titulación del virus utilizado en el ensayo.

Incorporación para Referencia Todas las patentes norteamericanas y publicaciones de solicitud de patente norteamericanas citadas en la presente se incorporan en la presente para referencia .

Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de constatar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención se describen en la presente. Tales equivalentes se pretenden para abarcarse por las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones
REIVINDICACIONES 1. Un Extracto de especies saúco que comprenden una fracción que tiene un cromatograma de espectrometría de masa de Análisis Directo en Tiempo Real (DART) de cualquiera de las Figuras 36 a 70. 2. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción tiene un cromatograma de espectrometría de masa de DART de cualquiera de las Figuras 46 a 50.
3. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción tiene un cromatograma de espectrometría de masa de DART de la Figura 48.
4. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende una fracción que tiene una IC50 de 150 a 1500 µg/ml como se mide en un ensayo de inhibición de influenza HlNl .
5. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la fracción tiene una IC5o de 150 a 750 µg/ml como se mide en el ensayo de inhibición de influenza H1N1.
6. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la fracción tiene una IC5o de 150 a 300 jg/ml .
7. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la fracción tiene una IC50 de por lo menos 195 /¿g/ml.
8. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 1 ó 4, caracterizado porque la fracción comprende una antocianina; flavonoide; ácido graso saturado o insaturado de C16 o C18, alcohol, o éster; y/o un polisacárido .
9. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la antocianina se selecciona del grupo que consiste de cianidin-3 -glucósido y cianidin-3 -sambuciosido .
10. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad de antocianinas es mayor de 10% en peso.
11. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el flavonoide es rutósido.
12. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el ácido graso saturado o insaturado de C16 o C18, alcohol, o éster se selecciona del grupo que consiste de hexadecanol, ácido hexadecanoico , metiléster del ácido hexadecanoico, etiléster del ácido hexadecanoico, butiléster del ácido hexadecanoico, ácido octadecanoico , etiléster del ácido octadecanoico , butiléster del ácido octadecanoico, 9-octadecen-l-ol , ácido 9 , 12 -octadecanienoico y combinaciones de los mismos .
13. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad de ácido graso saturado o insaturado de C16 o C18, alcohol o éster es por lo menos aproximadamente 2% en peso.
14. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de dextrano, glucosa, arabinosa, galactosa, ramnosa, xilosa, ácido urónico y combinaciones de los mismos.
15. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad de polisacárido es por lo menos aproximadamente 10% en peso .
16. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende una antocianina; un ácido graso saturado o insaturado de C16 o C18, alcohol, o éster; y un polisacárido.
17. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la antocianina se selecciona del grupo que consiste de cianidin-3 -glucósido y cianidin-3 -sambuciosido .
18. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad de antocianina es mayor de 10% en peso.
19. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ácido graso saturado o insaturado de C16 o C18, alcohol, o éster se selecciona del grupo que consiste de hexadecanol, ácido hexadecanoico , metiléster del ácido hexadecanoico , etiléster del ácido hexadecanoico, butiléster del ácido hexadecanoico, ácido octadecanoico , etiléster del ácido octadecanoico , butiléster del ácido octadecanoico, 9-octadecen-l-ol , ácido 9 , 12 -octadecanienoico , y combinaciones de los mismos.
20. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad del ácido graso saturado o insaturado de C16 o C18, alcohol o éster es por lo menos aproximadamente 2% en peso.
21. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polisacárido se selecciona del grupo que consiste de dextrano, glucosa, arabinosa, galactosa, ramnosa, xilosa, ácido urónico y combinaciones de los mismos.
22. El extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad de polisacárido es por lo meno aproximadamente 10% en peso.
23. Un alimento o medicamento, caracterizado porque comprende el extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 1 ó 4.
24. Un método para tratar a un sujeto infectado con un virus, caracterizado porque comprende administrar al sujeto con necesidad del mismo, una cantidad efectiva del extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 1 ó 4.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el virus es un virus con envoltura.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el virus con envoltura es un flavi-virus.
27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el virus es un virus sin envoltura.
28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste de virus de la influenza, virus A y B de la gripe humana, virus de la gripe aviar, HlNl, H5N1, virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , SARs , virus del herpes simple (HSV) , flavivirus, dengue, fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental y virus de la encefalitis .
29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste de virus de Norwalk, hepatitis A, polio y andovirus y rinovirus .
30. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el sujeto es un primate, ave, bovino, ovino, equino, porcino, roedor, felino o canino.
31. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el sujeto es un ser humano .
32. Un método para inhibir la infección viral de las células, caracterizado porque comprende poner en contacto las células con el extracto de especies saúco de conformidad con la reivindicación 1 ó .
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el virus es un virus con envoltura.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el virus con envoltura es un flavi-virus.
35. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el virus es un virus sin envoltura.
36. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste de virus de la influenza, virus A y B de la gripe humana, virus de la gripe aviar, HlNl, H5N1, virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , SARs , virus del herpes simple (HSV) , flavivirus, dengue, fiebre amarilla, virus del Nilo Occidental, y virus de encefalitis .
37. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que consiste de virus de Norwalk, hepatitis A, polio, andovirus y rinovirus .
38. Un método para preparar un extracto de especies saúco que tiene por lo menos una característica predeterminada, caracterizado porque comprende: extraer secuencialmente un material vegetal de especies saúco para producir una fracción de aceite esencial, una fracción polifenólica y una fracción de polisacáridos para a) extraer un material vegetal de especies saúco por una extracción supercrítica con dióxido de carbono para producir la fracción de aceite esencial y un primer residuo ; b) extraer ya sea un material vegetal de especies saúco o el primer residuo de la etapa a) con agua de aproximadamente 40°C a aproximadamente 70°C o con una extracción hidro-alcohólica para producir la fracción polifenólica y un segundo residuo; y c) extraer el segundo residuo de la etapa b) por agua en una extracción de 70°C a aproximadamente 90°C para producir la fracción del polisacárido .
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa a) comprende : i) cargar en un recipiente de extracción material vegetal de especies saúco molido; ii) agregar dióxido de carbono bajo condiciones supercríticas ; iii) poner en contacto el material vegetal de especies saúco y el dióxido de carbono durante un tiempo; y iv) recolectar una fracción de aceite esencial en un recipiente de recolección.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque además comprende la etapa de alterar los índices del compuesto del constituyente químico del aceite esencial al fraccionar la extracción de aceite esencial con un sistema de separación fraccional supercrítico con dióxido de carbono.
41. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la etapa b) comprende : i) poner en contacto material vegetal de especies saúco molido o el residuo de la etapa a) con agua de aproximadamente 40°C a aproximadamente 70°C o una solución hidro-alcohólica durante un tiempo suficiente para extraer los constituyentes químicos polifenólicos ; ii) pasar el agua o la solución hidro-alcohólica de los constituyentes químicos polifenólicos extraídos de la etapa a) a través de una columna de resina adsorbente por afinidad en donde los ácidos polifenólicos que incluyen las antocianidinas , se adsorben; y iii) eluir la o las fracciones del constituyente químico polifenólico purificado a partir de la resina adsorbente por afinidad.
42. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el método para extracción de la fracción de polisacárido comprende: i) poner en contacto el segundo residuo de la etapa b) con agua de aproximadamente 70°C a aproximadamente 90°C durante un tiempo suficiente para extraer polisacáridos ; y ii) precipitar los polisacáridos de la solución acuosa por precipitación con etanol .
43. Un extracto de especies saúco preparado por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 42.
44. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende pirogalol, ácido metilcinámico en 15 a 25% en peso del pirogalol, cinamida en 1 a 4% en peso del pirogalol, 2-metoxifenol en 5 a 10% en peso del pirogalol, benzaldehído en 1 a 2% en peso del pirogalol, cinamaldehído en 5 a 10% en peso del pirogalol y acetato de cinamilo en 5 a 15% en peso del pirogalol.
45. Una extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende rutósido, ácido ferúlico en 20 a 30% en peso del rutósido, ácido cinámico en 25 a 35% en peso del rutósido, ácido shikímico en 15 a 25% en peso del rutósido, y ácido fenil-láctico en 55 a 65% en peso del rutósido.
46. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende rutósido, taxifolina en 1 a 10% en peso del rutósido, ácido ferúlico en 1 a 5% en peso del rutósido, ácido cinámico en 1 a 5% en peso del rutósido, ácido shikímico en 0.5 a 5% en peso del rutósido, ácido fenil-láctico en 1 a 5% en peso del rutósido, cianidina en 5 a 15% en peso del rutósido, y petunidina en 15 a 25% en peso del rutósido.
47. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende rutósido, cianidina en 30 a 40% en peso del rutósido, petunidina en 75 a 85% en peso del rutósido, ácido viníllico en 5 a 10% en peso del rutósido, ácido ferúlico en 1 a 5% en peso del rutósido, y ácido cinámico en 1 a 10% en peso del rutósido.
48. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , rutósido en 65 a 75% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , ácido viníllico en 65 a 75% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , ácido ferúlico en 35 a 45% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , ácido cinámico en 65 a 75% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico , y ácido shikímico en 45 a 55% en peso del ácido p-coumárico/ácido fenilpirúvico .
49. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende rutósido, hesperidina en 20 a 30% en peso del rutósido, ácido viníllico en 70 a 80% en peso del rutósido y ácido cinámico en 40 a 50% en peso del rutósido.
50. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende petunidina, rutósido en 85 a 95% en peso de la petunidina, ácido vaníllico en 55 a 65% en peso de la petunidina, y ácido cinámico en 30 a 40% en peso de la petunidina .
51. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende rutósido, cianidina en 5 a 15% en peso del rutósido, taxifolina en 1 a 10% en peso del rutósido, ácido cafeico en 5 a 15% en peso del rutósido, ácido ferúlico en 1 a 10% en peso del rutósido, ácido shikímico en 1 a 10% en peso del rutósido, petunidina en 25 a 35% en peso del rutósido y eriodictiol o fustina en 1 a 5% en peso del rutósido .
52. Un extracto de especies saúco, caracterizado porque comprende rutósido, cianidina en 10 a 20% en peso del rutósido, eriodictiol o fustina en 1 a 5% en peso del rutósido, naringenina en 10 a 20% en peso del rutósido, y taxifolina en 1 a 10% en peso del rutósido.