MX2008011707A

MX2008011707A - Medicamentos y proteinas.

Info

Publication number: MX2008011707A
Application number: MX2008011707A
Authority: MX
Inventors: Sharon O'kane; Nick Occleston; Mark William James Ferguson; Phillip Mellor; Hugh Gerard Laverthy; Emma Atkinson
Original assignee: Renovo Ltd
Priority date: 2006-03-11
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2008-09-26
Also published as: NO20084187L; EP2359844A3; BRPI0708791A2; CN101605555A; KR20080100828A; WO2007104946A2; IL193700A0; AR062773A1; EP2359844A2; RU2008140117A; JP2009543757A; EP2012812A2; GB0604966D0; US7902150B2; WO2007104946A3; US20090137475A1

Abstract

Se proporciona el uso de los TGF-( monoméricos, o sus fragmentos o derivados, como medicamentos. Estos medicamentos con preferencia comprenden TGF-( monoméricos o sus fragmentos o derivados. Los medicamentos provistos por el uso en la aceleración de heridas y/o la inhibición de formación de cicatrices, en la promoción de regeneración epitelial, o en la prevención y/o tratamiento de trastornos fibróticos.

Description

MEDICAMENTOS Y PROTEINAS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a la provisión de nuevos medicamentos. En realizaciones preferidas la invención proporciona medicamentos adecuados para el uso en la aceleración de la curación de heridas y/o la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. La invención también proporciona un método para la aceleración de la curación de heridas y/o la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. Los factores de crecimiento transformante betas (TGF-ß) son una familia de citoquinas que tienen diversas actividades biológicas. La familia TGF-ß comprende cinco isoformas, TGF-ß? , TGF- 2, TGF- 3, TGF^4, y TGF-ßd. Los TGF-ß tienen utilidad en muchos contextos terapéuticos diferentes. Como resultado del potencial terapéutico de los TGF-ß existe mucho interés en la aplicación farmacéutica de los miembros de la familia TGF-ß, en particular TGF-ß 1 -3. TGF-ß? , TGF^2 y TGF^3 son bien conocidos por cumplir funciones cruciales en la regulación de la respuesta de curación de heridas. La actividad de TGF-ß puede influir la tasa de curación de heridas así como el grado de formación de cicatrices que ocurre como resultado de la curación.

TGF-ß se usa en la prevención y/o tratamiento de escleroderma, trastornos de angiogénesis, enfermedad renal, osteoporosis, enfermedad ósea, glomerulonefritis y enfermedad renal. TGF-P2 se puede usar en el tratamiento de glioma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, tumor de páncreas, tumores sólidos, tumor de colon, tumor de ovario, degeneración macular relacionada con la edad, lesión injuria, osteoporosis, retinopatía, úlceras, carcinoma, inflamación bucal y escleroderma. TGF-P3 se puede usar en el tratamiento de los trastornos fibróticos, fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, escleroderma, trastornos de angiogénesis, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, hueso e inducción de cartílago, fertilización in vitro, mucositis oral, enfermedad renal, prevención, reducción o inhibición de formación de cicatrices, mejora de la reconexión neuronal en el sistema nervioso periférico y central, prevención, reducción o inhibición de complicaciones de la cirugía ocular (tal como cirugía LASIK o PRK) o formación de cicatrices en el fondo de ojo (tal como la formación de cicatrices asociada con vitreorretinopatía proliferativa). Los miembros de la familia TGF-ß existen naturalmente en la forma de dímeros que comprenden dos cadenas de péptidos. Los dímeros de TGF-ß activos tienen un peso molecular de aproximadamente 25.4 kDa. El fragmento del TGF-ß dimérico activo está estabilizado por las interacciones hidrofóbicas y iónicas, que están reforzadas adicionalmente por un puente disulfuro entre subunidades. Se acepta generalmente que la actividad biológica y de este modo la actividad terapéutica de los miembros de la familia de TGF-ß es estimulada solo por el dímero activo. A la luz de lo anterior, se reconocerá que existe una necesidad bien establecida de proporcionar medicamentos que pueden utilizar las propiedades terapéuticas de los miembros de la familia TGF-ß. Sin embargo, a pesar de este requerimiento bien reconocido para las composiciones farmacéuticas que comprenden miembros de la familia TGF-ß existen muchos problemas admitidos asociados con la fabricación de los TGF-ß para uso terapéutico. Una de las más grandes desventajas de usar los TGF-ß como agentes terapéuticos es que a fin de producir dímeros proteicos biológicamente (y de este modo terapéuticamente) usando un huésped procariótico, se necesita la renaturalización intensiva a la forma dimérica biológicamente activa. La formación de dímeros puede extender el plan de tiempo de la fabricación. Esto también tiene consecuencias importantes en la limitación del uso terapéutico de alguno de los TGF-ß. Es un objeto de la presente invención obviar o aliviar al menos algunos de los problemas asociados con las composiciones farmacéuticas del arte previo que comprenden los TGF-ß. En particular, un objeto de ciertas realizaciones de la presente invención es obviar o aliviar los problemas asociados con el uso de métodos que requieren mucho tiempo usados para producir dímeros biológicamente activos de estas proteínas.

En un primer aspecto de la invención se proporciona un monómero de TGF-ß, o un fragmento biológicamente activo de este, para uso como medicamento. La invención se basa en el muy sorprendente hallazgo de los inventores de que los TGF-ß monoméricos pueden ejercer actividades biológicas que anteriormente se consideraban que solo las proporcionaban las proteínas de TGF-ß dimérico. Este hallazgo hace posible el uso de los TGF-ß monoméricos en medicamentos efectivos que pueden utilizar la propiedades biológicas de un TGF-ß seleccionado. Como se apreciará inmediatamente este hallazgo y en consecuencia la presente invención, expande en grana parte las aplicaciones prácticas en las que los TGF-ß se pueden usar en forma terapéutica, a través de la reducción del tiempo y costo asociados con la fabricación de medicamentos adecuados. Los inventores consideran que las ventajas de los medicamentos de acuerdo con la invención pueden ser provistas por medicamentos que comprenden cualquier isoforma monomérica de TGF-ß. Por consiguiente, excepto cuando el contexto lo requiera de otro modo, las referencias a TGF-ß o los TGF-ß se entienden que abarcan cualquier forma monomérica biológicamente activa de una isoforma de TGF-ß tal como TGF-ß? , 2, 3, 4 y 5. Los monómeros adecuados preferidos para uso en los medicamentos de la invención son los monómeros de TGF-ß (de cualquier forma deseada). Los TGF-ß monoméricos adecuados para el uso de acuerdo con la presente invenciones seleccionan del grupo que consiste en TGF-ß? , TGF^2 y TGF- ß3. Con más preferencia el TGF-ß monomérico es TGF^3, y en un segundo aspecto de la invención se proporciona un monómero de TGF^3, o un fragmento biológicamente activo de este, para uso como medicamento. Se prefiere que los monómeros de TGF-ß usados de acuerdo con la presente invención sean los TGF-ß monoméricos humanos. Se prefiere que los TGF-ß provistos en los medicamentos de acuerdo con la presente invención estén presentes sustancialmente y completamente en forma monomérica. Los TGF-ß monoméricos adecuados para usar en los medicamentos o métodos de la invención con preferencia pueden tener un peso molecular de aproximadamente 12 kDa, y más particularmente aproximadamente 12.5 kDa. Las secuencias del residuo de aminoácido de las formas humanas de TGF-ß? , TGF^2 y TGF^3 se muestran como las Secuencias ID Nos. 1 , 2 y 3 respectivamente, y un TGF-ß monomérico que comprende cualquiera de estas secuencias, o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de estas secuencias, constituye un monómero preferido para el uso de acuerdo con la presente invención. El TGF^3 monomérico (Secuencia ID No. 3) constituye un monómero particularmente preferido para el uso de acuerdo con diversos aspectos de la presente invención. Excepto cuando el contexto requiera otra cosa, se debe considerar que las referencias de la presente memoria descriptiva a los TGF-ß monoméricos (que incluyen referencias a las isoformas particulares) abarcan también a los fragmento biológicamente activos y derivativos de dichos TGF-ß monoméricos. Los fragmentos biológicamente activos que pueden derivar de la Secuencias ID Nos. 1 a 3 representan fragmentos preferidos para uso en los medicamentos de la invención, con fragmentos biológicamente activos derivables de la Secuencia ID No. 3 que constituye fragmentos particularmente preferidos. Los fragmentos biológicamente activos preferidos pueden comprender la porción de unión al receptor de la isoforma de TGF-ß seleccionada. Los derivados adecuados de los TGF-ß monoméricos que se pueden utilizar en los medicamentos o métodos de la invención incluyen: derivados de péptidos terapéuticamente efectivos de los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); fragmentos o derivado terapéuticamente efectivos que comprenden o se basan en el farmacóforo de los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); derivados de peptoide terapéuticamente efectivos de los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); derivados de D-aminoácidos terapéuticamente efectivos de los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); peptidomiméticos terapéuticamente efectivos basados en los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); análogos de péptidos terapéuticamente efectivos de los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); pseudopéptidos terapéuticamente efectivos basados en los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); péptidos retro-inversos terapéuticamente efectivos basados en los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); derivados de depsipéptidos terapéuticamente efectivos basados en los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); derivados de péptidos ß terapéuticamente efectivos basados en los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos); y derivados retropeptoides terapéuticamente efectivos basados en los TGF-ß monoméricos (o sus fragmentos). Los inventores han hallado que las formas monoméricas del TGF-P3 humano se puede usar de la misma manera que el TGF-P3 dimérico, por ejemplo para el tratamiento de los trastornos fibróticos, escleroderma, trastornos de angiogénesis, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, hueso e inducción de cartílago, fertilización in vitro, mucositis oral, enfermedad renal, prevención, reducción o inhibición de formación de cicatrices, mejora de la reconexión neuronal en el sistema nervioso periférico y central, prevención, reducción o inhibición de complicaciones de la cirugía ocular (tal como cirugía LASIK o PRK), tratamiento de labio y paladar fisurado, prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices y curación acelerada de tendones y ligamentos. Las formas monoméricas de TGF-P3 también pueden promover la regeneración epitelial en los sitios de daño epiteliales. Los hallazgos de los inventores también indican que las formas monoméricas de TGF-ß? y TGF-P2 pueden ejercer todas las actividades terapéuticas asociadas con las formas diméricas de estos factores de crecimiento. "Actividad biológica" en el contexto de la presente invención con preferencia se mide in vivo. Los inventores han hallado que, de acuerdo con los hallazgos publicados en el arte previo, las formas monoméricas de los TGF-ß generalmente no exhiben actividad biológica evaluadas por métodos in vitro. Sin embargo, en contraste directo con las creencias del arte previo, los inventores han hallado en forma muy sorprendente que las formas monoméricas de los TGF-ß puede ejercer actividad biológica y terapéutica in vivo. Por consiguiente, se reconocerá que un TGF-ß monomérico, o un fragmento o derivado de este, considerado biológicamente activo de acuerdo con la presente invención no es necesario para el TGF-ß monomérico exhibir actividad biológica medible por medios in vitro e in vivo, sino solamente que exhiba actividad biológica que se pueda medir ya sea in vitro o in vivo, y con preferencia la actividad se puede medir in vivo. En forma adecuada, la actividad biológica de los TGF-ß monoméricos adecuados para el uso de acuerdo con el primer aspecto de la invención se puede medir con referencia a la actividad biológica conocida de los dímeros del TGF^3 dado. En una realización preferida, la actividad biológica se puede medir con referencia a la capacidad de un monómero (tal como un monómero de la Secuencia ID No. 3) para aceleran la cura de heridas y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices. A luz de los párrafos precedentes, se reconocerá que los medicamentos de acuerdo con el primer o segundo aspectos de la invención son particularmente adecuados para usar en la aceleración de la curación de heridas y/o la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. Además, los medicamentos de acuerdo con el primer o segundo aspectos de la invención también son particularmente adecuados para el uso en la promoción de la reepitelización.

En efecto, en un tercer aspecto de la invención se proporciona el uso de un monómero de TGF- 3, o un fragmento biológicamente activo de este, en la preparación de un medicamento para uso en la aceleración de la curación de heridas y/o la inhibición de la formación de cicatrices. En un cuarto aspecto de la invención se proporciona el uso de un monómero de TGF-ß, o un fragmento biológicamente activo de este, en la preparación de un medicamento para uso en la promoción de la regeneración epitelial. En un quinto aspecto de la invención se proporciona el uso de un monómero de TGF 3, o un fragmento biológicamente activo de este en la preparación de un medicamento para uso en la prevención y/o tratamiento de un trastorno fibrótico. Los trastornos fibróticos preferidos que se pueden prevenir y/o tratar usando dichos medicamentos se pueden seleccionar del grupo que consiste en fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, escleroderma, fibrosis cutánea, fibrosis muscular, fibrosis por radiación, fibrosis renal y fibrosis uterina. Además, en un sexto aspecto de la invención se proporciona un método de acelerar la curación de heridas y/o inhibir la formación de cicatrices, el método comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un TGF-P3 monomérico, o un fragmento de este. En un séptimo aspecto de la invención se proporciona un método de promoción de la regeneración epitelial, el método comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un TGF- 3 monomérico, o un fragmento de este. En un octavo aspecto de la invención se proporciona un método de prevención y/o tratamiento de un trastorno fibrótico, el método comprende administrar a un paciente que necesita dicha prevención y/o tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un TGF-P3 monomérico, o un fragmento de este. Los trastornos fibroticos preferidos que se pueden prevenir y/o tratar usando dichos medicamentos se pueden seleccionar del grupo que consiste en fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, escleroderma, fibrosis cutánea, fibrosis muscular, fibrosis por radiación, fibrosis renal y fibrosis uterina Para los fines de la presente invención una cantidad terapéuticamente efectiva de un TGF-ß monomérico, o un fragmento de este, es una cantidad suficiente para provocar una acción requerida: i) aceleración de la curación de heridas y/o inhibición de la formación de cicatrices; o ii) promoción de la regeneración epitelial; o iii) prevención y/o tratamiento de un trastorno fibrótico. El grado de aceleración de la curación de heridas y/o inhibición de la formación de cicatrices, o regeneración epitelial, o prevención o reducción de fibrosis que se puede necesitar será evidente, y efectivamente fácilmente determinado por un médico responsable de la atención del paciente. Una evaluación adecuada del grado de aceleración de la curación de heridas y/o la inhibición de la formación de cicatrices, o promoción de la regeneración epitelial, o la prevención o reducción de la fibrosis puede ser determinada por el clínico, y puede ser con referencia a los métodos de medición sugeridos descriptos en la presente. Los TGF-ß monoméricos preferidos y adecuados para el uso de acuerdo con la invención se pueden seleccionar con referencia a alguna o todas las consideraciones descriptas en la presente. En el caso que se desee efectuar la curación de heridas acelerada con prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices o efectuar la prevención o tratamiento de trastornos fibróticos, por ejemplo, fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, escleroderma, glomerulonefritis, o similares, generalmente se preferirá usar TGF^3 monomérico o un fragmento biológicamente activo adecuado. Si bien el uso de TGF^3 monomérico tiene beneficios particularmente notables, los medicamentos que comprenden formas monoméricas de otras isoformas de TGF-ß también son de gran valor. Por ejemplo, los medicamentos que comprenden TGF-ß? monomérico o fragmentos biológicamente activos de este, pueden tener usos en la prevención y/o tratamiento de heridas que no curan crónicas, por ej., ulceras venosas, llagas por presión, úlceras diabéticas, trastornos de angiogénesis, enfermedad renal, osteoporosis, enfermedad ósea, glomerulonefritis y enfermedad renal. A modo de ejemplo, se ha demostrado en modelos animales que el TGF-ß! dimérico de tipo salvaje administrado en forma local es un potente estimulador del crecimiento y regeneración ósea. Además, se ha demostrado que la administración de TGF-ß? protege los tejidos de la lesión por isquemia-reperfusión, en particular en el cerebro (después de un accidente cerebrovascular), y en el corazón (después de una oclusión de las arterias coronarias). Los medicamentos que comprenden TGF- 2 monomérico, o fragmentos biológicamente activos de este, se pueden usar en el tratamiento de glioma, glioma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, tumor de páncreas, tumores sólidos, tumor de colon, tumor de ovario, degeneración macular relacionada con la edad, lesión injuria, osteoporosis, retinopatia, úlceras, carcinoma, inflamación bucal y escleroderma. A modo de ejemplo, se ha demostrado en dos ensayos clínicos que la aplicación tópica del TGF- 2 dimérico de tipo salvaje acelera el cierre de la úlceras de pierna crónicas asociadas con estasis venosa; y se ha demostrado en modelos animales que la aplicación local de TGF- 2 recombinante humana promueve el recrecimiento y regeneración del hueso. Los medicamentos que comprenden TGF-33 monomérico, o fragmentos biológicamente activos de este se pueden usar en el tratamiento de heridas (que incluyen heridas crónicas tales como úlceras), escleroderma, trastornos fibróticos, por ej., fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, fibrosis renal etc., trastornos de angiogénesis, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, inducción de hueso y cartílago, fertilización in vitro, mucositis oral y enfermedad renal. A modo de ejemplo, se ha demostrado en modelos animales y en la clínica que la aplicación tópica de TGF- 3 dimérico de tipo salvaje acelera la tasa de curación de las úlceras por presión que no curan, crónicas; reduce la incidencia, gravedad y duración de la mucositis oral; y reduce los efectos adversos del síndrome gastrointestinal por radiación resultante del daño a las células madre causado por la radioterapia o quimioterapia durante el tratamiento del cáncer. Los hallazgos de los inventores indican que el TGF-P3 monomérico se puede usar en todos estos contextos con en fin de producir actividades terapéuticas del ?T?-ß3 dimérico. La capacidad de ciertos métodos y medicamentos de la invención (tal como los que usan monómeros de TGF-ß se exponen en la Secuencia ID No. 3) para acelerar la curación de heridas puede la curación de heridas puede ser fácilmente apreciada y/o medida con referencia a las propiedades exhibidas por las heridas tratadas. Para los presentes propósitos una "herida tratada" se puede considerar a una herida expuesta a una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento de la invención, o que ha recibido tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención. La aceleración de la curación de las heridas tratadas se puede ilustrar por un aumento en la tasa epitelización en comparación con las heridas control. En consecuencia los métodos y medicamentos de la invención promocionan una reconstitución más rápida de una capa epitelial funcional sobre un área herida que lo sería de otro modo. En forma alternativa o adicional, la curación acelerada de las heridas tratadas se puede ilustrar por un ancho de herida disminuido en comparación con las heridas de control en puntos de tiempo comparables. Se apreciará que esta reducción del ancho de la herida asegura que exista una tasa de cierre de la herida relativamente más rápido (ya que existe menos ancho de la herida por cerrar) y es indicativo de la capacidad de dichos medicamentos para acelerar la respuesta de curación. Las heridas más angostas pueden producir cicatrices más angostas que son estéticamente preferibles que las cicatrices más anchas. Por consiguiente, se debe considerar que la curación de heridas acelerada en el contexto de la presente invención abarca cualquier aumento de la tasa de curación de un herida tratada en comparación con la tasa de curación que se produce en heridas tratadas control o heridas no tratadas. Con preferencia la aceleración de la curación de heridas se puede evaluar con respecto a la comparación de la tasa de reepitelización obtenida en heridas tratadas y control, o la comparación de la del ancho relativo de las heridas tratadas y control en puntos de tiempo comparables. Con más preferencia la curación de heridas acelerada se puede definir como que comprende tanto una tasa de reepitelización aumentada como una reducción del ancho de la herida en comparación con las heridas de control en puntos de tiempo comparables. Con preferencia la promoción de la curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 5%, 10%, 20% o 30% mayor que la tasa de curación que ocurre en una herida control o no tratada. Con más preferencia la promoción de la curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 40%, 50% o 60% mayor que la curación en una herida control. Aun es más preferido que la promoción de curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 70%, 80%, o 90% mayor que la que ocurre en las heridas control, y con máxima preferencia la promoción de la curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 100% mayor que la tasa que se produce en las heridas control. Existe un amplio rango de trastornos de la curación de heridas que se caracterizan, o al menos se caracterizan parcialmente por el fracaso, retraso o retardación inapropiados de la respuesta normal de curación de heridas. La capacidad de ciertos métodos y medicamentos de la invención para promover la curación de heridas acelerada en consecuencia es de utilidad en la prevención o tratamiento de dichos trastornos. Debido a que métodos y medicamentos de la invención pueden provocar la aceleración de la curación de heridas mediante la promoción de una respuesta de reepitelizacion estimulada (de este modo aumenta la velocidad en que se cierra la herida) se apreciará que estos métodos y medicamentos de la invención son particularmente ventajosos para el tratamiento de heridas de pacientes que de otro modo están propensos a la reepitelizacion defectuosa, retrasada o alterada de otro modo. Por ejemplo, es bien sabido que las heridas dérmicas de la persona de edad avanzada exhiben una respuesta de reepitelizacion menos vigorosa que la de los individuos más jóvenes. También existen otras patologías o trastornos en los que la curación de heridas está asociada con reepitelización retrasada o alterada de otro modo. Por ejemplo, los pacientes que sufren de diabetes, pacientes con polifarmacia (por ejemplo, como resultado de una edad avanzada), mujeres posmenopásicas, pacientes susceptibles a lesiones por presión (por ejemplo parapléjicos), pacientes con enfermedad venosa, pacientes clínicamente obesos, pacientes que reciben quimioterapia, pacientes que reciben radioterapia, pacientes que reciben tratamientos de esferoides o pacientes inmunocomprometidos puede sufrir de curación de heridas con reepitelización alterada. En muchos casos la falta de una respuesta de reepitelización apropiada contribuye al desarrollo de las infecciones en el sitio de la herida, que puede a su vez contribuir a la formación de heridas crónicas tales como úlceras. Por consiguiente se apreciará que dichos pacientes probablemente se beneficiarán particularmente con los métodos o medicamentos adecuados de la invención. Las heridas crónicas son quizás el ejemplo más importante de los trastornos asociados con una respuesta de curación de heridas retrasada. Una herida se puede definir como crónica si no muestra ninguna tendencia de curación dentro de las ocho semanas de la formación cuando está sometida al tratamiento terapéutico apropiado (convencional). Los ejemplos bien conocidos de heridas crónicas incluyen úlceras venosas, úlceras diabéticas y úlceras decúbito, sin embargo las heridas crónicas pueden surgir en algún momento de otro modo de lesiones agudas normales. Típicamente las heridas crónicas puede surgir como resultado de infección del sitio de la herida, tratamiento de herida inadecuado, o como una consecuencia de una ruptura de tejido progresiva causada por enfermedad vascular venosa, arterial, o metabólica, presión, daño por radiación o tumor. Se apreciará que los métodos y medicamentos de la invención capaces de acelerar la curación de heridas se pueden utilizar en el tratamiento de heridas crónicas existentes con el fin de promover su curación. Dichos métodos y medicamentos pueden promover la reepitelización de las heridas crónicas, de este modo producen la curación y cierre del trastorno. Los métodos y medicamentos de la invención preferidos (tales como los que utilizan TGF-ß monomérico que comprenden la Secuencia ID No. 3) también pueden inhibir la formación de cicatrices asociada con la curación de heridas. La prevención de la formación de cicatrices en dichos contexto puede ser particularmente ventajoso ya qua las heridas crónicas normalmente se extienden sobre otras porciones relativamente grandes del cuerpo de un paciente. Además o alternativamente, para su uso en el tratamiento de las heridas crónicas existentes, los métodos y medicamentos de la invención adecuados se pueden usar para prevenir heridas agudas de pacientes predispuestos a la curación de heridas alterada que se convierten en heridas crónicas. Debido a que los métodos y medicamentos adecuados de la invención pueden promover la cobertura epitelial del sitio dañado, ellos pueden reducir la probabilidad de que una herida tratada se infecte. De modo similar, esta promoción de reepitelización puede ser beneficiosa en el tratamiento de las heridas crónicas que surgen como resultado de otras patologías tales como diabetes o enfermedad venosa. Un grupo adicional de pacientes que puede obtener beneficio particular de los métodos y medicamentos de la invención son aquellos en los que el sistema inmune está comprometido (por ejemplo, pacientes que se someten a quimioterapia o radioterapia o los que sufren de infección con HIV). Está bien reconocido que las heridas de los inmunocomprometidos, que no pueden desarrollar una respuesta inflamatoria normal después de la herida, tienden a asociarse con malos resultados de curación. Dichos pacientes se pueden beneficiar por el tratamiento con los métodos y medicamentos adecuados de la invención. La capacidad de los medicamentos y métodos de la invención de utilizar los TGF-ß monoméricos que comprenden la Secuencia ID No. 3 para promover la curación de heridas acelerada a la vez que prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices también se usa en contextos clínicos más generales. Los ejemplos de estos otros beneficios se pueden considerar en referencia con la curación de heridas por intención primaría, secundaria o terciaria, como se describe a continuación. Para los fines de la presente invención, se puede considerar que la curación por intención primaria involucra el cierre por medios quirúrgicos (tal como suturas, tiras adhesivas o grapas) de los márgenes opuestos de una herida. La curación por intención primaria se emplea normalmente en el tratamiento de incisiones quirúrgicas u otras heridas limpias, y se asocia con niveles mínimos de pérdida de tejido. Los expertos reconocerán debido a que los medicamentos o métodos adecuados de acuerdo con la invención (tal como los que utilizan monómeros que comprenden la Secuencia ID No. 3) son capaces de reducir el ancho de la herida, también facilitan la unión de los bordes opuesto de la herida, y en consecuencia pueden ser beneficiosos para la curación de heridas por intención primaria. Además, dichos métodos o medicamentos may (como se describen a continuación) producen la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices que de otro modo pueden ocurrir en dicha curación. Los inventores consideran que el tratamiento de esta manera puede tener impacto en la apariencia tanto macroscópica como microscópica de las cicatrices que se forman a partir de las heridas tratadas; microscópicamente las cicatrices pueden ser menos perceptibles y combinarse con la piel circundante, microscópicamente las cicatrices pueden exhibir una regeneración de una estructura de piel más normal. Para los fines de la presente invención, se considera que la curación por intención secundaria constituye el cierre de las heridas por la curación del proceso de las heridas, sin intervención quirúrgica directa. Las heridas curadas por intención secundaria se pueden someter a cuidado continuo (por ejemplo el vendaje y re-vendaje de la herida así como la aplicación de los medicamentos adecuados), pero es el proceso natural de formación del tejido de granulación y la reepítelización los que causan el cierre de la herida. Se apreciará que debido a que los medicamentos y métodos de la invención preferidos (tal como los que utilizan monómeros que comprenden la Secuencia ID No. 3) pueden aumentar la velocidad de reepitelización y disminuir la posterior formación de cicatrices en comparación con lo que ocurre en las heridas control estos tienen utilidad en la promoción de la curación de heridas por intención secundaria. La curación por intención terciaria se pueden considerar que comprende el cierre quirúrgico de una herida que previamente se ha dejado abierta para permitir al menos formación del tejido de granulación y la reepitelización parciales. Las propiedades de los métodos y medicamentos de la invención preferidos los hacen adecuados para el uso en la curación por intención primaria o secundaria son también beneficiosos en el contexto de la promoción de la curación de heridas por intención terciaria. El uso de métodos y medicamentos de la invención preferidos que utilizan monómeros que comprenden la Secuencia ID No. 3 para estimular la reepitelización (como parte de su promoción de la curación de heridas acelerada) mientras que inhibe la formación de cicatrices también es particularmente efectivo en el tratamiento de las heridas asociadas con procedimientos de injerto. El tratamiento mediante estos métodos y medicamentos de la invención es beneficioso tanto en un sitio dador del injerto (donde puede ayudar en el restablecimiento de una capa epitelial funcional a la vez que previene, reduce o inhibe la formación de cicatrices), y como en los sitios receptores del injerto (donde los efectos anti-formación de cicatrices del tratamiento inhibe la formación de cicatrices, a la vez que curación acelerada promueve la integración del tejido injertado). Los inventores consideran que los métodos y medicamentos de la invención confieren ventajas en los contextos de los injertos que utilizan piel, piel artificial o sustitutos de piel. Los inventores han hallado que los métodos y medicamentos de la invención que utilizan monómeros que comprenden la Secuencia ID No. 3 pueden promover la curación de heridas acelerada con inhibición de la formación de cicatrices cuando se administran antes de la herida, o una vez que la herida ya se ha formado. Los inventores han hallado que los o medicamentos de la invención que utiliza TGF-p3 monoméricos, tal como los que comprenden la Secuencia ID No. 3, son capaces de promover la regeneración epitelial. La promoción de la regeneración epitelial dentro del contexto de la presente invención se puede considerar que abarca cualquier aumento de la regeneración epitelial en comparación con la regeneración que ocurre en el epitelio control tratado o no tratado. La velocidad de regeneración epitelial obtenida usando los métodos o medicamentos adecuados de acuerdo con la invención se pueden comparar fácilmente con el que tiene lugar en los epitelios control tratados o no tratados usando cualquier modelo de regeneración epitelial conocido en el arte. Por ejemplo, se puede comparar la velocidad en la que se regeneran los sitios de daño epitelial experimental que tienen áreas conocidas usando modelos in vivo bien conocidos en ratones, ratas, conejos o cerdos tales como los descriptos en Tomlinson y Ferguson (2003), Davidson et al. (1991 ) y Paddock et al. (2003). Sin desear estar ligado a ninguna hipótesis los inventores consideran que la promoción de la regeneración epitelial obtenida por las formas monoméricas de TGF- 3 es mediada por la promoción de los monómeros de la migración de las células epiteliales. Las células epiteliales (cuya migración se ha promovido) en consecuencia son capaces de repoblar y regenerar el epitelio dañado más rápidamente que los que ocurre en ausencia de tratamiento. Se apreciará que la promoción de la regeneración epitelial usando monómeros que comprenden la Secuencia ID No. 3 puede ser útil para inducir la reepitelización efectiva en contextos en que la respuesta de reepitelización está alterada, inhibida, retardada o defectuosa de algún otro modo. La promoción de la regeneración epitelial también se puede efectuar para acelerar la tasa de respuestas de regeneración epitelial normal o defectuosa de los pacientes que sufren de daño epitelial. Existen muchos contextos en los que la respuesta de reepitelización del cuerpo puede ser defectuosa. Por ejemplo, la reepitelización defectuosa de la piel es asocia con patologías tales como pénfigo, enfermedad de Hailey-Hailey (pénfigo benigno familiar), necrólisis epidérmica tóxica (TEN)/síndrome de Lyell, epidermolisis bullosa, leishmaniasis cutánea y queratosis actínica. La reepitelización defectuosa de los pulmones se puede asociar con fibrosis pulmonar idiomática (IPF) o enfermedad pulmonar intersticial. La reepitelización defectuosa del ojo se puede asociar con patologías tales como deficiencia parcial de células madre límbicas o erosiones corneanas. La reepitelización defectuosa del aparato gastrointestinal o colon se puede asociar con patologías tales como fisuras anales crónicas (fisura de ano), colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn, y otros trastornos intestinales inflamatorios. Tal como se estableció anteriormente, ciertos métodos o medicamentos de acuerdo con la presente invención (y en particular los que utilizan monómeros que comprenden la Secuencia ID No. 3) pueden prevenir, reducir o inhibir de otro modo la formación de cicatrices. Esta inhibición de la formación de cicatrices se puede efectuar en cualquier sitio del cuerpo y cualquier tejido u órgano, que incluye piel, ojo, nervios, tendones, ligamentos, músculo y cavidad oral (que incluye los labios y el paladar), así como órganos internos (tal como hígado, corazón, cerebro, cavidad abdominal, cavidad pélvica, cavidad torácica, intestinos y tejido reproductor). En la piel, el tratamiento puede mejorar el aspecto macroscópico y microscópico de las cicatrices; desde el punto de vista macroscópico las cicatrices pueden ser menos visibles y combinarse con la piel circundante, desde el punto de vista microscópico las fibras de colágeno de la cicatriz pueden tener una morfología y organización que es más similar que la de la piel circundante. Se debe entender que la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices dentro del contexto de la presente invención abarca cualquier grado de prevención, reducción o inhibición in formación de cicatrices en comparación con el nivel de formación de cicatrices que ocurre en la herida control tratada y no tratada (definida en otra parte de la memoria descriptiva). Excepto cuando el contexto lo requiera lo contrario las referencias a "prevención", "reducción" o "inhibición" de la formación de cicatrices se pueden toma como mecanismos equivalentes que se manifiestan en la actividad de anti-formación de cicatrices. La prevención, reducción o inhibición de formación de cicatrices dérmicas obtenida usando métodos y medicamentos de la invención se puede evaluar y/o medir con referencia al aspecto microscópico o, con preferencia, macroscópico de una cicatriz tratada en comparación con el aspecto de una cicatriz no tratada. Con más preferencia al prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede evaluar con referencia al aspecto tanto macroscópico como microscópico de un cicatriz tratada. Para los presentes fines una "cicatriz tratada" se puede definir como una cicatriz formada por la curación de una herida tratada, mientras que una "cicatriz no tratada" se puede definir como una cicatriz formada por la curación de una herida no tratada, o una herida tratada con placebo o atención estándar. Las cicatrices de comparación adecuadas con preferencia se pueden emparejar con la cicatriz tratada con respecto a edad, sitio, tamaño de la cicatriz y el paciente. Al considerar el aspecto macroscópico de una cicatriz resultante de una herida tratada, se puede evaluar el grado de formación de cicatrices, y en consecuencia la magnitud de cualquier prevención, inhibición o reducción de la formación de cicatrices obtenida con referencia a algunos de muchos parámetros. Los parámetros adecuados para la evaluación macroscópica de cicatrices pueden incluir: i) Color de la cicatriz. Como se indicó anteriormente, las cicatrices normalmente pueden ser hipopigmentada o hiperpigmentada con respecto a la piel circundante. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la pigmentación de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de piel sin cicatrices que la pigmentación de una cicatriz no tratada. De modo similar, las cicatrices pueden ser más rojas que la piel circundante. En este caso la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando el enrojecimiento de una cicatriz tratada se atenúa más temprano o más completamente, o se asemeja más estrechamente al aspecto de la piel circundante, en comparación con una cicatriz no tratada. ii) Altura de la cicatriz. Las cicatrices normalmente pueden estar elevadas o hundidas en comparación con la piel circundante. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la altura de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de una piel sin cicatrices (es decir, ni levantada ni hundida) que a la altura de una cicatriz no tratada. iii) Textura superficial de la cicatriz. Las cicatrices pueden tener superficies que son relativamente más suaves que la piel circundante (que genera una cicatriz con un aspecto "brillante") o que son más rugosas que la piel circundante. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la textura de superficie de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de una piel sin cicatrices que a la textura de superficie de una cicatriz no tratada. iv) Rigidez de la cicatriz. La composición y estructura anormales de las cicatrices hacen que estas sean normalmente más rígidas que la piel no dañada que rodea la cicatriz. En este caso, la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la rigidez de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de una piel sin cicatrices que a la rigidez de una cicatriz no tratada. Una cicatriz tratada con preferencia demostrará prevención, inhibición o reducción de la formación de cicatrices evaluada con referencia a al menos uno de los parámetros de evaluación macroscópica expuestos anteriormente. Con más preferencia, una cicatriz tratada puede demostrar una formación de cicatrices prevenida, reducida o inhibida con al menos dos de los parámetros, aun con más preferencia al menos tres de los parámetros, y con máxima preferencia con los cuatro parámetros. Se puede realizar una evaluación global de la formación de cicatrices usando, por ejemplo, una escala visual analógica o una escala de evaluación digital. Los parámetros adecuados para la evaluación microscópica de las cicatrices pueden incluir: i) Espesor de fibras de la matriz extracelular (ECM). Las cicatrices normalmente contienen fibras de la ECM más delgadas que las halladas en la piel circundante. Esta propiedad es aún más pronunciada en el caso las cicatrices queloides e hipertróficas. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando el espesor de las fibras de ECM de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente al espesor de las fibras de ECM halladas en la piel sin cicatrices que al espesor de las fibras halladas en una cicatriz no tratada. ii) Orientación de Las fibras de ECM. Las fibras de ECM halladas en las cicatrices tienden a exhibir un mayor grado de alineamiento entre sí que las halladas en la piel sin cicatrices (que tienen una orientación al azar frecuentemente denominada como "tejido de canasta"). La ECM de las cicatrices patológicas tales como cicatrices queloides e hipertróficas pueden exhibir orientaciones aún más anómalas, con frecuencia forman grandes "espirales" o "cápsulas" moléculas de ECM. Por consiguiente, la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la orientación de las fibras de ECM en una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la orientación de las fibras de ECM halladas en la piel sin cicatrices que a la orientación de dicha fibras en una cicatriz no tratada. iii) Composición de ECM de la cicatriz. La composición de las moléculas de ECM presentes en las cicatrices muestra diferencias de las halladas en la piel normal con una reducción de la cantidad de elastina presente en la ECM de las cicatrices. En consecuencia la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la composición de las fibras de ECM de la dermis de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la composición de dichas fibras halladas en la piel sin cicatrices que a la composición hallada en una cicatriz no tratada. iv) Celularidad de la cicatriz. Las cicatrices tienden a contener relativamente menos células que la piel sin cicatrices. En consecuencia se apreciará que la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la celularidad de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la celularidad de la piel sin cicatrices que a la celularidad de una cicatriz no tratada. Una cicatriz tratada con preferencia demostrará la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices evaluada con referencia a al menos uno de los parámetros de la evaluación microscópica expuesta anteriormente. Con más preferencia a cicatriz tratada, se puede demostrar la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices con referencia a al menos dos de los parámetros, aun con más preferencia al menos tres de los parámetros, y con máxima preferencia a cuatro de estos parámetros. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices de una herida tratada se puede evaluar adicionalmente con referencia a parámetros adecuados en: i) evaluación clínica macroscópica de las cicatrices, en particular la evaluación de las cicatrices en un sujeto; ii) evaluación de imágenes fotográficas de las cicatrices; iii) evaluación de moldes de silicona o moldes de plástico positivos hechos de molde de silicona de las cicatrices; y iv) evaluación microscópica de las cicatrices, por ejemplo por análisis histológico de la estructura microscópica de las cicatrices. Se apreciará que la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices de una herida tratada puede estar indicada por la mejora de uno o más de dichos parámetros adecuado, y que en el caso de la prevención, reducción o inhibición evaluada con referencia a diversos parámetros, que estos parámetros se pueden combinar en diferentes esquemas de evaluación (por ej., reducción, inhibición o mejora de al menos un parámetro usado en la evaluación macroscópica y al menos un parámetro usado en la evaluación microscópica). La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una mejora de uno o más de los parámetros que indican que una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la piel sin cicatrices con referencia a los parámetros seleccionados que una cicatriz no tratada o control. Los parámetros adecuados para la medición y evaluación clínica de las cicatrices se pueden seleccionar sobre la base de una variedad de medidas o evaluaciones que incluyen las descriptas por Beausang et al (1998) y van Zuijlen et al (2002). Normalmente, los parámetros adecuados pueden incluir: 1 . Evaluación con respecto a la escala visual analógica (VAS) de clasificación de cicatriz La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una reducción en el puntaje de la VAS de una cicatriz tratada cuando se compara con una cicatriz control. Una VAS adecuada para usar en la evaluación de las cicatrices se puede basar en el método descripto por Beausang et al (1998). 2. Altura de la cicatriz, ancho de la cicatriz, perímetro de cicatriz, área de cicatriz o volumen de cicatriz. La altura y el ancho de las cicatrices se pueden medir directamente en el sujeto, por ejemplo, por el uso de dispositivos de medición manual tales como calibres. El ancho, el perímetro y el área de la cicatriz se pueden medir directamente en el sujeto o por análisis de imagen de las fotografías de la cicatriz. Los expertos conocerán los métodos y dispositivos no invasivos que se pueden usar para investigar parámetros adecuados, que incluyen moldeado en silicona, ultrasonido, perfilometría óptica tridimensional e imágenes de resonancia magnética de alta resolución. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una reducción de altura, ancho, área o volumen, o cualquiera de sus combinaciones de una cicatriz tratada en comparación con una cicatriz no tratada. 3. Aspecto y/o color de la cicatriz comparada con la piel circundante sin cicatrices El aspecto o color de una cicatriz tratada se puede comparar con el de la piel circundante sin cicatrices, y las diferencias (si existen) se compararon con la diferencia entre el aspecto y el color de las cicatrices no tratadas y la piel sin cicatrices. Dicha comparación se puede realizar sobre la base de una evaluación visual de las cicatrices respectivas y la piel sin cicatrices. El aspecto de una cicatriz se puede comparar con la piel sin cicatrices con referencia a si la cicatriz es más clara o más oscura que la piel sin cicatrices. Los colores respectivos de las cicatrices y la piel puede estar perfectamente emparejados entre sí, relativamente mal emparejados, obviamente mal emparejados o extremadamente mal emparejados. En forma alternativa o adicional a la evaluación visual, existen numerosos dispositivos colorimétricos no invasivos que pueden proporcionar datos con respecto a la pigmentación de las cicatrices y piel sin cicatrices, así como del enrojecimiento de la piel (que puede ser un indicador del grado de vascularización presente en la cicatriz o la piel). Los ejemplos de dichos dispositivos incluyen Minolta Chronameter CR-200/300; Labscan 600; Dr. Lange Micro Colour; Derma Spectrometer; medidor de flujo láser-Doppler; y análisis espectrofotómetrico intracutáneo (SIA). La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una menor magnitud de diferencia entre el aspecto o el color de las cicatrices tratadas y la piel sin cicatrices que entre las cicatrices no tratadas y la piel sin cicatrices. 4. Distorsión de la cicatriz y desempeño mecánico La distorsión de la cicatriz se puede evaluar por la comparación visual de una cicatriz y la piel sin cicatrices. Una comparación adecuada puede clasificar una cicatriz seleccionada como que no causa distorsión, distorsión leve, distorsión moderada o distorsión severa. El desempeño mecánico de las cicatrices se puede evaluar usando varios métodos y dispositivos no invasivos basados en succión, presión, torsión, tensión y acústica. Los ejemplos adecuados que incluyen los dispositivos conocidos que se pueden usar en la evaluación del desempeño mecánico de las cicatrices incluyen el indentómetro, cutómetro, reviscómetro, analizas viscoelástico de la piel, Dermaflex, durómetro, medido de torque térmico, elastómetro. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una reducción de la distorsión causada por las cicatrices tratadas en comparación con la causada por las cicatrices no tratadas. Se apreciará que la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por el desempeño mecánico de la piel sin cicatrices que es más similar al de las cicatrices tratadas que al de las cicatrices no tratadas. 5. Contorno de la cicatriz y textura de la cicatriz El contorno de la cicatriz se puede investigar por medio de la evaluación visual. Los parámetros adecuados para considerar en dicha evaluación incluye si una cicatriz está nivelada o no con la piel circundante, ligeramente sobresalientes, ligeramente hendida, hipertrófica o queloide. La textura de una cicatriz se puede evaluar con referencia a aspecto de la cicatriz, y esto se puede realizar por una evaluación visual respecto de si la cicatriz, por ejemplo, es mate o brillante o tiene aspecto rugoso o liso en comparación con la piel sin cicatrices. La textura de la cicatriz se puede evaluar adicionalmente con referencia a si la cicatriz tiene la misma textura que la piel sin cicatrices (textura normal), es solo palpable, firme o dura en comparación con la piel sin cicatrices. La textura de las cicatrices también se puede evaluar con referencia a la escala de Hamilton (descripta en Crowe et al, 1998). Además de las técnicas expuestas anteriormente, existen numerosos dispositivos perfilométricos no invasivos que usan métodos ópticos o mecánicos para la evaluación del contorno y/o la textura de la cicatriz. Dichas evaluaciones se pueden llevar a cabo en el cuerpo del sujeto o, por ejemplo, en impresiones de molde de silicona de las cicatrices, o en moldes positivos hechos con estas impresiones. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar en el caso de que las cicatrices tratadas tengan perfiles y textura de cicatriz más comparables con la piel sin cicatrices que las cicatrices no tratadas.

Evaluaciones fotográficas Panel de posición independiente La evaluación fotográfica de las cicatrices tratadas y no tratadas puede ser realizada por un panel de asesores de posición independiente y las fotografías estandarizadas y calibradas de las cicatrices. Las cicatrices pueden ser evaluadas por un panel de posición independíente para proporcionar datos de clasificación en categorías (por ej., que una cicatriz tratada dada "mejor", "peor" o "no diferente" cuando se compara con una cicatriz no tratada) y datos cuantitativos usando una escala visual analógica (VAS) basada en el método descripto por Beausang et al (1998). La captura de estos datos puede utilizar programas de computación y/o sistemas electrónicos adecuados descriptos en la solicitud de patente en trámite de los solicitantes.

Panel de expertos La evaluación fotográfica de las cicatrices tratadas y no tratadas puede ser realizada en forma alternativa por un panel de asesores expertos fotografías estandarizadas y calibradas de las cicatrices por evaluar. El panel de expertos con preferencia consiste en experto en el arte tales como cirujanos plásticos y científicos de antecedentes adecuados. Dicha evaluación puede proporcionar datos de categorización, como se describió antes o con respecto a la comparación de imágenes con el transcurso del tiempo de cicatrices tratadas y no tratadas seleccionadas. Las evaluaciones adecuadas realizadas pueden incluir: La identificación de la mejor cicatriz, que a los fines de la presente invención se puede considerar que es la cicatriz que se asemeja más estrechamente a la piel circundante. Una vez que la mejor cicatriz ha sido identificada se puede considerar la magnitud de diferencia entre las cicatrices, por ejemplo es la diferencia entre las cicatrices leves u obvias. Otros parámetros que se pueden considerar incluyen el tiempo más inmediato después la formación de cicatriz en el que se pueden detectar diferencias entre las cicatrices, el tiempo después de la formación en que la diferencia entre las cicatrices es más obvia (o alternativamente el hallazgo de que la diferencia continúa después del último punto de tiempo evaluado), así como considerar si la cicatriz mejor permanece o no en forma constante mejor. También se toma en consideración si una cicatriz es o no proporcionalmente más roja que la otra, y si el enrojecimiento se atenúa en los tiempo de tiempo considerados (o continúa después del último punto de tiempo) y si es así, a qué tiempo después de la formación de la cicatriz. Un panel experto también puede considerar en qué tiempo después de la formación se hace detectable cualquier diferencia de enrojecimiento, así como el tiempo después de la formación en que la diferencia de enrojecimiento es más obvia. Un panel experto también puede considerar si una cicatriz tratada o no tratada es o no proporcionalmente más blanca que la piel sin cicatrices. En el caso que sea detectable una diferencia en la blancura se puede tomar en consideración el tiempo después de la formación de la cicatriz en que se puede detectar la diferencia, el tiempo en que la diferencia es más obvia y el tiempo en que la diferencia desaparece. Otro parámetro que puede ser evaluado por un panel de expertos es la textura de cicatrices tratadas y no tratadas. En la comparación de cicatrices tratadas y no tratadas panel de expertos puede considerar cual de las cicatrices tiene la mejor textura de piel, el tiempo más inmediato después de la formación de la cicatriz en que se puede detectar cualquier diferencia presente, el tiempo posterior a la formación en que cualquier diferencia es más obvia, y el tiempo en que cualquier diferencia desaparece. La comparación de cicatrices tratadas y no tratadas puede evaluar adicionalmente, cuál de las cicatrices es más angosta, y cuál de las cicatrices es más corta. También se puede tomar en consideración la forma de la cicatriz y la proporción del margen de la cicatriz que se puede distinguir de la piel circundante. Como se describió previamente también se pueden considerar las evaluaciones visuales y las evaluaciones de color, presencia, grado y ubicación de la hiperpigmentación.

Como se indicó anteriormente, una de las maneras en que se puede comparar la calidad de las cicatrices tratadas y no tratadas es por la evaluación microscópica. La evaluación microscópica de la calidad de la cicatriz normalmente se puede llevar a cabo usando secciones histológicas de las cicatrices. El proceso de la evaluación y medición microscópica de las cicatrices puede tomar en consideración los datos de categorización basados en los siguientes parámetros adecuados: 1 . Restitución epidérmica. Se debe prestar atención particular al grado de restauración de las crestas interpapilares y el espesor de la epidermis restaurada. 2. Angiogénesis e inflamación. Se puede tomar en consideración el número de vasos sanguíneos presentes, el tamaño de los vasos sanguíneos presentes y la evidencia de inflamación, que incluye una evaluación de cualquier nivel de inflamación presente. 3. Organización del colágeno. En la evaluación de la organización del colágeno se puede hacer referencia de las fibras de colágeno presentes en la cicatriz, la densidad de dichas fibras y el grosor de la fibra de colágeno en la dermis papila y reticular. 4. La evaluación de la escala visual analógica (VAS) de la organización del colágeno para la dermis papilar y para la dermis reticular también puede proporcionar un índice de la calidad de la cicatriz. 5. Otros rasgos que se pueden tomar en cuenta para evaluar la calidad microscópica de las cicatrices incluyen la elevación o depresión de la cicatriz respecto de la piel circundante sin cicatrices y la prominencia o visibilidad de la cicatriz en la interfaz dérmica normal. 6. Se observará que las evaluaciones descriptas anteriormente permiten la generación de datos de clasificación de cicatrices que permiten proporcionar una indicación respecto de si una cicatriz tratada es mejor, peor o no diferente comparada con una cicatriz control, no tratada u otro comparador adecuado. Además de los datos de categorización, se pueden generar datos cuantitativos (con preferencia relacionados con los parámetros anteriores) usando análisis de imagen en combinación con técnicas de visualización adecuadas. Los ejemplos de técnicas de visualización adecuadas que se pueden emplear en la evaluación de la calidad de la cicatriz son tinturas histológicas o de inmunomarcación específicas, en donde se puede determinar cuantitativamente el grado de tinción o marcación por análisis de imagen. Los datos cuantitativos se pueden producir en forma útil y fácil en relación con los siguientes parámetros: 1 . Ancho, altura, elevación, volumen y área de la cicatriz. 2. Espesor epitelial y área de cobertura (por ejemplo, el área de epidermis presente en una cicatriz o la proporción de una herida con cobertura epidérmica). 3. Número, tamaño, área (es decir, transversal) y ubicación de los vasos sanguíneos. 4. Grado de inflamación, número, ubicación y poblaciones/tipos de células inflamatorias presentes. 5. Organización del colágeno, espesor de la fibra de colágeno, densidad de la fibra de colágeno. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por un cambio en cualquiera de los parámetros considerados anteriormente, de modo que una cicatriz tratada se asemeje más estrechamente a una piel sin cicatrices que una cicatriz control o no tratada (u otro comparador adecuado). Las evaluaciones y parámetros descriptos son adecuados para las comparaciones de los efectos de los péptidos o medicamentos de la invención en comparación con el tratamiento control, placebo o atención estándar en animales o humanos. Se pueden usar pruebas estadísticas apropiadas para analizar los conjuntos de datos generados a partir de diferentes tratamientos a fin de investigar la significación de los resultados. Con preferencia la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a más de un parámetro. Con más preferencia, la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a un parámetro clínico (es decir, observado en el sujeto) y un parámetro fotográfico. Aun con más preferencia la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a un parámetro clínico, un parámetro fotográfico y también un parámetro de evaluación microscópica (por ejemplo un parámetro histológico). Con máxima preferencia, la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a un puntaje de VAS clínico, puntaje VAS de panel de posición externa y clasificación (a partir de imágenes fotográficas) y puntaje VAS microscópico de la dermis reticular. El uso de métodos y medicamentos de la invención adecuados permite producir una rápida mejora del aspecto cosmético de un área lesionada asi tratada. Las consideraciones cosméticas son importantes en varios contextos clínicos, en particular cuando las heridas se forman en sitios del cuerpo importantes tales como cara, cuello y manos. En consecuencia la inhibición de la formación de cicatrices (que con preferencia puede estar en combinación con la curación de heridas acelerada) en dichos sitios donde se desea mejorar el aspecto cosmético de la cicatriz formada representa una realización preferida de la invención. Además de su impacto cosmético la formación de cicatrices de la piel es responsable de una cantidad de efecto deletéreos que afectan a los sufren de dicha formación de cicatrices. Por ejemplo, la formación de cicatrices en la piel se puede asociar con reducción de la función física y mecánica, en particular en el caso de las cicatrices contráctiles (tales como las cicatrices hipertróficas) y/o situaciones en las que las cicatrices se forman en las articulaciones. En estos casos, las propiedades mecánicas alteradas de la piel con cicatrices, en contraste con la piel sin cicatrices, y los efectos de la contracción de la cicatriz pueden llevar al movimiento drásticamente restringido de una unión (articulación) efectuada de este modo. Por consiguiente se prefiere una realización en que los medicamentos y métodos de la invención adecuados sean usados para prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices e heridas que cubren las articulaciones del cuerpo (con preferencia que también aceleren la curación de dichas heridas). En otra realización preferida, los medicamentos y métodos de la invención adecuados se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices de heridas con alto riesgo de formar una cicatriz contráctil. El grado de formación de la cicatriz, y en consecuencia el grado de deterioro cosmético u otro que puede ser causado por la cicatriz, también puede estar influido por factores tales como la tensión del sitio en que se forma la herida. Por ejemplo, se sabe que la piel bajo tensión relativamente alta (tal como la que se extiende sobre el tórax, o asociada con lineas de tensión) puede estar predispuesta a la formación de cicatrices más graves que en otros sitios corporales. En consecuencia, en una realización preferida los medicamentos y métodos de la invención adecuados se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices de heridas ubicadas en sitios de alta tensión cutánea. Existen muchos procedimientos quirúrgicos que se pueden usar en la corrección de la cicatriz para permitir el realineamiento de las heridas y las cicatrices de modo que estas sean sujeto para la tensión reducida. Probablemente el más conocido de estos es la "plastia en Z" en la que dos colgajos en forma de V de la piel se transponen para permitir la rotación de una línea de tensión. En consecuencia en una realización más preferida dichos medicamentos y métodos de la invención se usan para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices de heridas durante la corrección quirúrgica de las cicatrices desfigurantes. La formación de cicatrices patológicas puede tener efectos deletéreos más pronunciados que se originan como resultado de la formación normal de cicatrices relativamente severas. Los ejemplos comunes de cicatrices patológicas incluyen cicatrices hipertróficas y queloides. Se reconoce que ciertos tipos de heridas o ciertos individuos pueden estar predispuestos a la formación de cicatrices patológicas. Por ejemplo, se puede considerar que los individuos de herencia afrocaribeña, japonesa o mongoloide, o los que tienen antecedentes familiares de formación de cicatrices patológicas tienen riesgo aumentado de formación de cicatriz hipertrófico o queloide. Las heridas de niños, y en particular las heridas de quemaduras de niños, también se asocian con aumento de la formación de cicatrices hipertróficas. Por consiguiente se prefiere una realización de la invención en que los medicamentos y métodos adecuados se usen para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices de las heridas en las que hay un riesgo aumentado de formación de cicatrices patológicas.

Si bien los individuos ya sujeto de la formación de cicatrices patológicas sufren de una predisposición para la formación de cicatriz adicional excesiva a menudo es clínicamente necesario corregir quirúrgicamente las cicatrices hipertróficas o queloides, con un riesgo acompañante de la consecuente formación de cicatrices patológicas. En consecuencia, en una realización preferida de la invención, los medicamentos y métodos adecuados se usan para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices de heridas producidas por la corrección quirúrgica de cicatrices patológicas. Se reconoce que las heridas resultantes de las lesiones por quemaduras (que para los fines de la presente invención también abarcan las lesiones por escaldadura que involucran los gases o líquidos calientes) se pueden extender en grandes áreas de un individual afectado de este modo. Por consiguiente, las quemaduras puede originar la formación de la cicatriz que cubre una gran proporción del cuerpo de un paciente, de este modo aumenta el riesgo de que la cicatriz formada cubra área de importancia cosmética elevada (tal como cara, cuello, brazos o manos) o de importancia mecánica (en particular las regiones que cubren o rodean a las articulaciones). Las lesiones por quemaduras causadas por líquidos calientes con frecuencia son sufridas por los niños (por ejemplo como resultado del volcado de sartenes, pavas o similares) y, debido al tamaño corporal relativamente más pequeño de los niños, es particularmente probable que estas lesiones causen daño extenso en una alta proporción del área corporal.

En otra realización preferida de la invención los medicamentos y métodos adecuados se usan para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices de heridas producidas por lesiones por quemaduras. Como se indicó anteriormente, la curación de heridas como respuesta a las lesiones por quemaduras con frecuencia se asocia con los resultados adversos de la formación de cicatrices, tal como la formación de las cicatrices hipertróficas. Otra consecuencia del tamaño relativamente grande de las lesiones por quemaduras es que estas son particularmente sensibles a las complicaciones tales como infección y desecación que se originan debido a la carencia de una capa epitelial funcional. A la luz de lo anterior se apreciará que los métodos y medicamentos de la invención adecuados se pueden usar en el tratamiento de las lesiones por quemaduras para reducir el nivel de formación de cicatrices producidas como resultado de la herida y/o acelerar la reconstitución de una barrera epitelial funcional. Los inventores han hallado que los métodos y medicamentos de la invención que utilizan monómeros tales como los que comprenden la Secuencia ID No. 3 son capaces de promover la reepitelización. Por consiguiente dichos métodos y medicamentos son particularmente efectivos en tratamiento de todas las lesiones que involucran el daño a una capa epitelial. Dichas lesiones se ejemplifica, sin limitación por lesiones en la piel, en que se daña la epidermis. Sin embargo se apreciará que dichos métodos y medicamentos de la invención también son aplicables a otros tipos de heridas en las que se dañan los epitelios, tales como lesiones que involucran los epitelios respiratorios, epitelios digestivos o epitelios circundantes de los tejidos u órganos internos (tales como los epitelios del peritoneo). La curación de las heridas que involucran el peritoneo (el revestimiento epitelial de los órganos internos, y/o el interior de la cavidad corporal) con frecuencia puede originar adhesiones. Dichas adhesiones con una consecuencia común de la cirugía que involucra tejidos ginecológicos o intestinales. Los inventores consideran que la capacidad de los métodos y medicamentos de la invención (que utilizan monómeros adecuados tales como los que comprenden la Secuencia ID No. 3) para acelerar la regeneración del peritoneo a la vez que reducir la formación de cicatrices puede reducir la incidencia de fijación inapropiada de porciones del peritoneo entre sí, y de este modo se reduce la aparición de adhesiones. Por consiguiente, el uso de dichos métodos y medicamentos de la invención para prevenir la formación de adhesiones intestinales o ginecológicas representa una realización preferida de la invención. En efecto el uso de dichos métodos o medicamentos de la invención en la curación de cualquier herida que involucre al peritoneo es una realización preferida. Los métodos y medicamentos de la invención se pueden usar profilácticamente, por ejemplo en sitios donde no existe herida pero donde de otro modo se podría originar una cicatriz o formarse una herida crónica. A modo de ejemplo los medicamentos de acuerdo con la invención se pueden administrar en sitios que experimentarán herida como resultado de procedimientos elegidos (tales como cirugía), o en sitios que se consideran de alto riesgo de herida. Se puede preferir que los medicamentos de la invención se administren en el sitio alrededor del momento de la herida, o inmediatamente antes de la formación de una herida (por ejemplo en período de hasta seis horas antes de la herida) o los medicamentos se pueden administrar en un tiempo inmediatamente antes de la herida (por ejemplo hasta 48 antes de la formación de la herida). Los expertos apreciarán que los momentos de máxima preferencia de administración antes de la formación de una herida se determinarán con referencia a diversos factores, que incluyen la formulación y vía de administración del medicamento seleccionado, la dosis del medicamento administrado, el tamaño y naturaleza de la herida que se forma y el estado biológico del paciente (que se puede determinar con referencia a factores tales como edad, salud y predisposición a las complicaciones de curación o formación de cicatrices adversas del paciente). El uso profiláctico de los métodos y medicamentos de acuerdo con la invención es una realización preferida de la invención, y es particularmente preferida para la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices en el contexto de las heridas quirúrgicas. Los métodos y medicamentos de la invención también pueden promover la curación de heridas acelerada y/o la formación de cicatrices inhibida si se administra después de que se ha formado una herida. Se prefiere que dicha administración debería ocurrir tan temprano como sea posible después de la formación de la herida, pero los agentes de la invención pueden promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices en cualquier momento hasta que se haya completado el proceso de curación (es decir, incluso en el caso de una herida ya se haya curado parcialmente, los métodos y medicamentos de la invención se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices respecto de la porción no curada restante). Se apreciará que la "ventana" en que se pueden usar los métodos y medicamentos de la invención para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices depende de la naturaleza de la herida en cuestión (que incluye el grado de daño que ha producido y el tamaño del área herida). De este modo en el caso de una herida grande los métodos y medicamentos de la invención se pueden administrar relativamente tarde en la respuesta de curación, ya que aún pueden promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Los métodos y medicamentos de la invención, por ejemplo, con preferencia se pueden administrar dentro de las primeras 24 horas después de que se forma una herida, pero aún pueden promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices si se administran hasta diez, o más días después de la herida. Los métodos y medicamentos de la invención se pueden administrar en una o más ocasiones, según corresponda, a fin de promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Por ejemplo, se pueden administrar cantidades terapéuticamente efectivas de los medicamentos a una herida tan frecuentemente como se requiera hasta completar el proceso de curación. A modo de ejemplo, los medicamentos de la invención se pueden administrar diariamente o dos veces por día a una herida durante al menos los primeros tres días posteriores a la formación de la herida. Los inventores han hallado que los regímenes que involucran dos administraciones de medicamentos de la invención, el primero antes de la formación de una herida y el segundo después de la herida son particularmente beneficiosos para reducir la formación de la cicatriz. Con preferencia dichos regímenes pueden incluir una primera administración inmediatamente antes de la formación de una herida y una segunda administración 24 horas después de la herida. Con máxima preferencia los métodos y medicamentos de la invención se pueden administrar tanto antes como después de la formación de una herida. Los inventores han hallado que la administración de los medicamentos de la invención inmediatamente antes de la formación de una herida, seguido por la administración diaria de dichos agentes en los dais posteriores a la herida, es particularmente efectivo para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Para los fines de la presente memoria descriptiva por "agente" o "agente de la invención" se entiende TGF-ß monomérico biológica o terapéuticamente activo. Dichos agentes con preferencia pueden ser TGF-ß monomérícos tipo salvaje y con más preferencia pueden ser TGF-ß monoméricos capaces de promover la curación de heridas acelerada y/o inhibir la formación de cicatrices, el ejemplo preferido comprende el monómero expuesto en la Secuencia ID No. 3. Se apreciará que todos estos se pueden incorporar en los medicamentos de acuerdo con la invención, y se pueden usar en los métodos o usos de la invención. Se apreciará que la cantidad de un medicamento de la invención que se debe aplicar a una herida depende varios factores tales como la actividad biológica y biodisponibilidad del agente presente en el medicamento, que a su vez depende, entro otros factores, de la naturaleza del agente y el modo de administración del medicamento. Otros factores para determinar una cantidad terapéutica adecuada de un medicamento pueden incluir: A) La vida media del agente en el sujeto tratado. B) La patología específica tratada (por ej., herida aguda o heridas crónicas). C) La edad del sujeto. La frecuencia de administración también estará influida por los factores mencionados anteriormente y en particular la vida media del agente elegido dentro del sujeto tratado. En general cuando se usan los medicamentos de acuerdo con la invención para tratar heridas existentes, el medicamento se debería administrar tan pronto como se produzca la herida (o en el caso de las heridas que no sean inmediatamente evidentes, tales como las de los sitios corporales internos, tan pronto como la herida ha sido diagnosticada). La terapia con los métodos o medicamentos de acuerdo con la invención debería continuar hasta que el proceso de curación sea acelerado y/o prevenido, reducido o inhibido la formación de cicatrices hasta la satisfacción del médico. La frecuencia de administración dependerá de la vida media biológica del agente usado. Normalmente se debería administrar una crema o ungüento que contiene un agente de la invención a un tejido blanco de modo que la concentración del agente en una herida se mantenga en un nivel adecuado para tener un efecto terapéutico. Esto puede requerir la administración diaria o incluso varias veces por día. Los medicamentos de la invención, se pueden administrar por cualquier vía adecuada capaz de obtener el efecto deseado de promover la curación de heridas y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices, pero se prefiere que los medicamentos se administren en forma local en un sitio de la herida. Los inventores han hallado que la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede efectuar por la administración de un agente de la invención por inyección en el sitio de la herida. Por ejemplo, en el caso de las heridas dérmicas, los agentes de la invención se pueden administrar por medio de inyección intradérmica. En consecuencia un medicamento preferido de acuerdo con la invención comprende una solución inyectable de un agente de la invención (por ej., para la inyección alrededor de los márgenes de un sitio de daño epitelial o un sitio con probabilidades de daño). Las formulaciones adecuadas para usar en esta realización de la invención se consideran a continuación. En forma alternativa o adicional, los medicamentos de la invención también se pueden administrar en forma tópica para promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. Dicha administración se puede efectuar como parte de la atención inicial y/o de seguimiento del área herida. Los inventores hallan que la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices está particularmente mejorada por la aplicación tópica de un agente de la invención a una herida (o, en el caso de la aplicación profiláctica a un tejido o sitio donde se forma una herida). Las composiciones o los medicamentos que contienen los agentes de la invención pueden adoptar muchas formas diferentes que dependen en particular de la manera en que estos se usan. En consecuencia, por ejemplo, estos pueden estar en forma de un líquido, ungüento, crema, gel, hidrogel, polvo o aerosol. Todas estas composiciones son adecuadas para la aplicación tópica a una herida, que es un medio de administración preferido de los agentes de la invención a un sujeto (persona o animal) que necesita el tratamiento. Los agentes de la invención se pueden proporcionar en un vendaje o parche esmeril, que se puede usar para cubrir una herida u otro sitio de daño epitelial tratado.

Se apreciará que el vehículo de una composición que comprende los agentes de la invención deber uno que sea bien tolerado por el paciente y que permita la liberación del agente a la herida. Dicho vehículo con preferencia es biodegradable, bioresolvible, bioresorbible y/o no inflamatorio. Los medicamentos y las composiciones que comprenden los agentes de la invención se pueden usar de varias maneras. En consecuencia, por ejemplo, una composición se puede aplicaren la herida y/o alrededor de ella a fin de promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Si la composición se aplica a una herida "existente", entonces el vehículo aceptable para uso farmacéutico será uno que sea relativamente "moderado", es decir, un vehículo que es biocompatible, biodegradable, bioresolvible y no inflamatorio. Un agente de la invención, o un ácido nucleico que codifica dicho agente (como se considera también a continuación), se puede incorporar en un dispositivo de liberación lenta o retardada. Dichos dispositivos, por ejemplo, se pueden colocar sobre la piel o insertar debajo de ella y el agente o ácido nucleico se puede liberar durante días, semanas o aun meses. Dicho dispositivo puede ser particularmente útil para los pacientes (tal como los que sufren de heridas crónicas) que requieren la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices a largo plazo. Los dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se usan para la administración de agente o ácido nucleico que normalmente requerirla administración frecuente (por ej., al menos administración diaria por otras vías). Las dosis diarias de un agente de la invención se pueden dar como administración única (por ej., una aplicación diaria de una formulación tópica o una inyección diaria). Alternativamente, el agente de la invención puede requerir administración dos veces o más durante un día. En otra alternativa, se puede usar un dispositivo de liberación lenta para proveer dosis óptimas de un agente de la invención a un paciente sin la necesidad de administrar dosis repartidas. En una realización un vehículo farmacéutico para la administración de un agente de la invención puede ser un líquido y una composición farmacéutica adecuada en forma de solución. En otra realización, vehículo aceptable para uso farmacéutico es un sólido y una composición adecuada está en forma de un polvo o comprimido. En una realización adicional el agente de la invención se puede formular como parte de un parche transdérmico aceptable para uso farmacéutico. Un vehículo sólido puede incluir una o mas sustancias que también pueden actuar como agentes saborizantes lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, rellenos, deslizantes, auxiliares de compresión, aglutinantes o agentes de desintegración de comprimidos; también puede ser un material de encapsulado. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que está en una mezcla con el agente de la invención finamente dividido. En los comprimidos, el agente de la invención se mezcla con un vehículo que tiene las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y se compactan en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos con preferencia contienen hasta 99% del agente de la invención. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de fusión baja y resinas de intercambio iónico. Los vehículos líquidos se pueden usar para preparar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El agente de la invención se puede disolver o suspender en un vehículo líquido aceptable para uso farmacéutico tal como agua, un solvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas aceptables para uso farmacéutico. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, buffer, conservantes, edulcorantes, agentes saborizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, reguladores de viscosidad, estabilizantes o reguladores osmóticos. Los ejemplos adecuados de los vehículos líquidos para la administración oral y parenteral incluyen agua (que parcialmente contienen aditivos como anteriores por ej., derivados de celulosa, con preferencia solución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (que incluyen alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ej., glicoles) y sus derivados, y aceites (por ej., aceite de coco fraccionado y aceite de maní). En general se prefiere que lose medicamentos o métodos de la invención utilizan formulaciones en las que los TGF-ß monoméricos, tales como TGF-p3, se proporcionan en ausencia de alcoholes. Dichas formulaciones libres de alcohol pueden ser particularmente preferidos para usar en sitios de la herida (o sitios donde se forman las heridas) debido a su naturaleza relativamente "moderada". Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos adecuados son útiles en las composiciones forma líquida estéril para la administración parenteral. El vehículo líquido para las composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente aceptable para uso farmacéutico. Las composiciones farmacéuticas líquidas que son soluciones o suspensiones estériles se pueden utilizar por ejemplo, para inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intradérmica, intraestromal (córnea) o subcutánea. Las soluciones estériles también se pueden administrar por vía intravenosa. El agente de la invención se puede preparar como una composición sólida estéril que se puede disolver o suspender en el momento de la administración usando agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado. Los vehículos deben incluir aglutinantes, agentes de suspensión, lubricantes y conservantes inertes y necesarios. En la situación en que se desea administrar un agente de la invención por medio de ingestión oral, se apreciará que el agente elegido con preferencia será un agente que tenga un grado elevado de resistencia a la degradación. Por ejemplo, el agente de la invención se puede proteger (por ejemplo usando las técnicas descriptas anteriormente) de modo que se reduce su velocidad de degradación en el aparato digestivo. Las composiciones de los agentes de la invención son adecuados para usar para promover la curación de heridas acelerada y/o inhibir la formación de cicatrices en la córnea. Las heridas en la córnea pueden provenir del trauma en el ojo que surge como resultado de la lesión accidental (considerada anteriormente) o como resultado de las operaciones quirúrgicas (por ej., cirugía láser en la córnea). En este caso un medicamento de la invención preferido puede estar en forma de una gota ocular. Los agentes de la invención se pueden usar en una variedad de heridas "internas" (es decir, heridas que aparecen dentro del cuerpo, más que en una superficie externa). En consecuencia por ejemplo, los medicamentos de acuerdo con la invención se pueden formular para la inhalación para el uso en las heridas que se originan en los pulmones u otros epitelios respiratorios. Los procedimientos conocidos, tales como los que se emplean convencionalmente en la industria farmacéutica (por ej., en experimentación in vivo, ensayos clínicos etc), se pueden usar para establecer formulaciones especificas de las composiciones que comprenden los agentes de la invención y regímenes terapéuticos precisos para la administración de dichas composiciones (tales como dosis diarias del agente activo y la frecuencia de administración). Una dosis diaria adecuada de un agente de acuerdo con la invención puede promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices depende de una variedad de factores que incluyen (pero sin limitación) la naturaleza del tejido herido, área y/o profundidad de la herida tratada, la gravedad de la herida, y la presencia o ausencia de factores predisponentes a la formación de cicatrices patológicas o heridas crónicas. A modo de ejemplo, la cantidad de un agente activo que se puede administrar a una herida o sitio de daño epitelial en una única frecuencia de tratamiento con preferencia puede estar en la región de 50-200 ng/cm lineal de herida o cm2 de daño epitelial (si se administra por inyección), o 100-300 ng/cm lineal de herida o cm2 de daño epitelial (si se administra por vía tópica). A modo de ejemplo adicional, la cantidad de un agente activo preferida para administrarse en forma diaria a una herida o sitio de daño epitelial puede estar en la región de 50 ng/cm lineal de herida o cm2 de daño epitelial (si se administra por inyección), o 100 ng/cm lineal de herida o cm2 de daño epitelial (si se administra por vía tópica). A modo de ejemplo, la cantidad total de un agente activo que se puede administrar por inyección local a una herida o sitio de daño epitelial con preferencia puede estar en la región de 50 ng/100 pl_ por centímetro lineal de herida o cm2 de daño epitelial, dado una vez por día hasta a tres días, de este modo proporciona una dosis total de 150 ng/cm lineal de herida o cm2 de daño epitelial.

En el caso de la aplicación tópica a heridas agudas o sitios de daño epitelial, una cantidad adecuada de un agente activo con preferencia puede estar en la región de 100 ng/lineal de herida o cm2 de daño epitelial, dado una vez por día hasta 3 días, de este modo proporciona una dosis total de 300 ng/cm lineal de herida o cm2 de daño epitelial. Sin restar mérito a lo anterior, la cantidad de un agente de acuerdo con la invención necesaria para el tratamiento de las heridas u otros sitios de daño epitelial normalmente estarán estará en el rango de 1 pg a 1 mg del agente administrado por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante 24 horas, si bien esta figura se puede modificar hacia arriba o hacia abajo en respuesta a los factores descriptos anteriormente. El agente con preferencia se puede proporcionar en la forma de una solución 1 pg/100 µ?_ -1 mg/100 L del agente, y 100 µ?_ de dicha solución administrada por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante un período de 24 horas. El agente con más preferencia se puede administrar como una solución 10 pg/100 µ?_ - 100 pg/100 pl_ con 100 pl_ de dicha solución administrada por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante un período de 24 horas. Con máxima preferencia el agente se puede administrar como una solución de 1 ng/100 µ?_ - 1000 ng/100 µ?. con 100 µ?_ de dicha solución administrada por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante un período de 24 horas.

En general, las composiciones que comprenden los agentes de la invención se deberían formular de modo que cuando se administran a una herida se obtenga una concentración del agente entre 0.79 pM y 0.79 mM por centímetro lineal de herida o daño epitelial. Con preferencia el agente se puede proporcionar a concentraciones de entre 7.9 pM y 0.079 mM por centímetro lineal. Un agente de la invención (tal como el péptido de la Secuencia ID No. 3) se puede administrar a una concentración de entre 0.79 pM y 0.79 mM. Con preferencia un agente de la invención se puede administrar a una concentración de entre 7.9 pM y 0.079 mM. Con máxima preferencia un agente de la invención se puede administrar a una concentración de entre 0.79 nM y 0.79 µ?. Solo a modo de ejemplo una solución inyectable que contiene entre 10 pg/100 pL y 100 pg/100 µ?_ de un agente de la invención (tal como el péptido de la Secuencia ID No. 3) es adecuada para la aplicación para promover la curación acelerada de heridas dérmicas y/o inhibición de la formación de cicatrices cuando se administra como una inyección intradérmica y se dosifica con 100 pL por centímetro lineal de margen de herida. En el caso de un péptido monomérico de la Secuencia ID No. 3, las dosis preferidas para la administración en una herida pueden ser 1 ng/100 pL-1000 ng/100 pl_, y 100 pL de dicha solución administrada por centímetro lineal de margen de herida.

Los agentes de la invención se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices como monoterapia (por ej., mediante el uso de medicamentos de la invención solos). Alternativamente los métodos y medicamentos de la invención se pueden usar en combinación con otros compuestos o tratamientos para la promoción de la curación de heridas o inhibición de formación de cicatrices. Los expertos en el arte conocerán tratamientos adecuados que se pueden usar como partes de dichas terapias de combinación. Los inventores han hallado que los medicamentos de acuerdo con la presente invención, y en particular los que comprenden péptidos de la Secuencia ID No. 3 se pueden formular ventajosamente en presencia de un azúcar. Este azúcar pueden ser un azúcar reductor o no reductor y/o aun fosfato o fosfonato derivado de este. Los ejemplos de dichos azúcares se pueden seleccionar, pero sin limitación, del grupo que comprende maltosa, mañosa, trehalosa, arabinosa, manitol, sacarosa, fructosa, dextrosa y glucosa. Los azúcares preferidos se pueden seleccionar del grupo que consiste en maltosa y trehalosa. Los medicamentos de la invención, y en particular los de acuerdo con esta realización de la invención, con preferencia puede tener un pH de entre 5 y 7. Se apreciará que los péptidos de TGF-ß monoméricos pueden representar agentes favorables administrados por técnicas que involucran la expresión celular de secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichas moléculas. Dichos métodos de expresión celular son particularmente adecuados para uso médico en que se requieren efectos terapéuticos de los péptidos durante un período prolongado, por ejemplo en contextos donde se desea aumentar durante período de tiempo una respuesta defectuosa de curación de heridas. Es particularmente preferido que los monómeros de TGF-ß se administren por medio de expresión celular que comprende los péptidos definidos por la Secuencia ID No. 3. Muchos métodos conocidos de administrar agentes peptídicos de la invención a los tejidos tales como heridas tienen la desventaja de que pueden dificultar la obtención de niveles sostenidos del agente de la invención en el sitio de tratamiento durante el curso de incluso pocos días debido a que los agentes peptídicos pueden tener vida media corta in vivo. La vida media de los agentes puede ser corta por numerosas razones que incluyen: (i) Degradación por proteasas y similares. (ii) Depuración por proteínas de unión. (iii) Unión e inhibición de la actividad del agente por moléculas de la matriz extracelular. Además, los agentes usados para promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices necesitan administrarse en un vehículo adecuado y con frecuencia se proporcionan como una composición que comprende el agente y el vehículo. Tal como se describió, dichos vehículos con preferencia son no inflamatorios, biocompatibles, bioresorbibles y no deben degrada o inactivar el agente (en el almacenamiento o el uso). Sin embargo, con frecuencia puede ser difícil proporcionar un vehículo satisfactorio para administrar agentes a un tejido con una herida para tratar. Una manera conveniente de obviar o atenuar estos problemas es proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de la invención en un área tratada por medio de terapia géníca. Debido a la degeneración del código genético, es claro que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican agentes adecuados para el uso de acuerdo con la invención se pueden variar o cambiar sin afectar sustancíalmente la secuencia del producto codificado de este modo, para proporcionar una variante funcional de este. Las secuencias de los ácidos nucleicos posibles que se pueden usar codifican péptidos definidos por las Secuencias ID Nos. 1 a 3 serán evidentes para los expertos y los ejemplos adecuados se proporcionan como las Secuencias ID Nos. 4 a 7 respectivamente. Los sistemas de administración de terapia génica son muy adecuados para alcanzar los niveles sostenidos de un agente de la invención en una herida durante un periodo más largo del que es posible para la mayoría de los sistemas de administración convencionales. Los agentes de la invención adecuados para promover la curación de heridas acelerada y/o inhibir la formación de cicatrices se pueden expresar en forma continua en las células en un sitio de la herida que ha sido transformado con la molécula de ADN descripta en el noveno aspecto de la invención. En consecuencia, aun cuando el agente de la invención tenga una vida media muy corta in vivo, se pueden expresar en forma continua cantidades terapéuticamente efectivas del agente a partir del tejido tratado. Además, los sistemas de administración de terapia génica se pueden usar para proporcionar la molécula de ADN (y de este modo el agente de la invención) sin la necesidad de usar vehículos farmacéuticos convencionales tales como los que se requieren en ungüentos o cremas que se ponen en contacto con la herida. Un sistema de administración de terapia génica adecuado es con preferencia de modo tal que una molécula de ADN es capaz de expresarse (cuando el sistema de administración se administra a un paciente) para producir un péptido definido por el grupo que comprende las Secuencia ID Nos. 1 a 3. La molécula de ADN se puede combinar dentro de un vector adecuado para formar un vector recombinante. El vector recombinante por ejemplo puede ser un plásmido, cósmido o fago. Dichos vectores recombinantes son muy útiles en los sistemas de administración de terapia génica de la invención para transformar células con moléculas de ADN adecuadas. Los vectores recombinantes también pueden incluir otros elementos funcionales. Por ejemplo, los vectores recombinantes se pueden diseñar de modo que el vector se replicará autónomamente en el núcleo de la célula. En este caso, los elementos que inducen la replicación de ADN pueden ser necesarios en el vector recombinante. Alternativamente el vector recombinante se puede diseñar de modo que el vector y la molécula de ADN recombinante se integran en el genoma de una célula. En este caso las secuencias de ADN que favorecen la integración específica (por ej., por recombinación homologa) son deseables. Los vectores recombinantes también pueden tener ADN que codifica los genes que se pueden usar como marcadores seleccionabas en el proceso de clonación. El vector recombinante también puede comprender un promotor o regulador para controlar la expresión del ge, según corresponda. La molécula de ADN puede (pero no necesariamente) incorporarse en el ADN de las células del sujeto tratado. Las células no diferenciadas se pueden transformar en forma estable lo que lleva a la producción de células hija modificadas genéticamente. En este caso, se puede requerir la regulación de la expresión en el sujeto por ej., con factores de transcripción específicos, activadores del gen o con más preferencia con promotores inducibles que transcriben el gen en respuesta a una señal que se halla específicamente en una herida. En forma alternativa, se puede diseñar el sistema de administración para favorecer la transformación estable o transitoria de células diferenciadas en el sujeto tratado. En este caso, la regulación de la expresión puede ser menos importante debido a que la expresión de la molécula de ADN se detendrá cuando las células transformadas mueran o detengan la expresión de la proteína (idealmente cuando se ha efectuado la promoción de la curación de heridas acelerada con reducción de la formación de cicatrices).

EL sistema de administración puede proporcionar la molécula de ADN a un sujeto sin incorporarse al vector. Por ejemplo, la molécula de ADN se puede incorporar dentro de un liposoma o partícula viral. Alternativamente la molécula de ADN "desnudo" se puede insertar en las células del sujeto por un medio adecuado, por ej., captación endocitótica directa. La molécula de ADN se puede transferir a las células de un sujeto tratado por transfección, infección, microinyección, fusión celular, fusión de protoplasto o bombardeo balístico. Por ejemplo, la transferencia puede ser por bombardeo balístico con partículas de oro recubiertas, líposomas que contienen la molécula de ADN, vectores virales (por ej., adenovirus) y medios de provisión de de captación directa de ADN (por ej., endocitosis) por la aplicación de ADN de plásmido directamente en una herida en forma tópica o por inyección. La expresión celular del agente de la invención puede ser por células del borde del área no dañada circundante de la herida o en forma alternativa puede ser por células introducidas terapéuticamente en la herida (por ejemplo células endógenas o exógenas cultivadas involucradas en la respuesta de curación de heridas). Se apreciará que las células que se introducen en forma terapéutica para promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se pueden manipular ex vivo de modo que ellas expresen niveles aumentados de un agente de la invención, y luego se introducen en el área herida. Dichas células con preferencia pueden ser células cultivadas ex vivo para usar en la preparación o fabricación de piel artificial o sustitutos de piel que se usan en la promoción de la curación de heridas. Las células con más preferencia pueden ser células autólogas, si bien se apreciará que se pueden usar cualquier célula adecuada. Por consiguiente, en un decimoséptimo aspecto de la invención, se proporciona un medicamento que comprende células inducidas para expresar un agente de la presente invención. Dichas células con preferencia pueden expresar una TGF-ßß monomérico. La inducción de la expresión celular de un agente de la invención se puede efectuar por medio de la incorporación en las células de ácidos nucleicos que producen la expresión de agentes adecuados para el uso de acuerdo con la invención. La invención se describirá adicionalmente por medio de ejemplos con referencia a los siguientes protocolos y estudios experimental, y las Figuras acompañantes en las que: La Figura 1 ilustra los resultados de la comparación de las formas monoméricas y diméricas de TGF-ßß por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras; en donde: CUADRO A La Figura 2 establece el molde usado para la ubicación de las heridas incisional en las ratas experimentales; La Figura 3 muestra los resultados de la evaluación, tres días después de la herida, del aspecto de las heridas experimentales tratadas con TGF-ßß monomérico o dimérico; La Figura 4 muestra los resultados de evaluación, 70 días después de la herida, del aspecto de las heridas experimentales tratadas con TGF-p3 monomérico o dimérico; La Figura 5 muestra imágenes macroscópicas representativas que muestran el aspecto de las cicatrices experimentales las cicatrices días después de la herida; La Figura 6 muestra imágenes microscópicas representativas que muestran la estructura de las cicatrices experimentales las cicatrices días después de la herida; La Figura 7 y el cuadro D ilustran la producción de monómeros de TGF-P3 por células huésped transformadas con éxito; CUADRO D La Figura 8 ilustra la generación de TGF- 3 dimérico y monomérico en condiciones de replegamiento de proteínas experimentales; y La Figura 9 ilustra el aislamiento de las proteínas de de TGF- 3 por ultrafiltración/cromatografía de interacción hidrofóbica. La información respecto de las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos de importancia se proporciona en la sección "Información de secuencia" (que incluye las secuencias de aminoácidos de los fragmentos activos de las isoformas de TGF-ß humana adecuadas para el uso de acuerdo con la invención, además de las secuencias de las moléculas de ADN que codifican los péptidos de longitud completo de las isoformas de TGF- 3, y el ADN que codifica el fragmento activo de TGF-P3 de tipo salvaje; y las secuencias de ADN de los cebadores usados en la generación de ADNc de las isoformas humanas de TGF-ß adecuadas para el uso de acuerdo con la invención).

PROTOCOLOS Y EJEMPLOS EJEMPLO 1 Metodologías para la producción, replegamiento y purificación de proteínas monoméricas de TGF-ß 1.1 Secuencia de nucleótidos Las secuencias de ADN que codifican las proteínas de TGF-ß de longitud completa se muestran como las secuencias ID Nos. 4 a 6. Las proteínas de TGF-ß de longitud completa consisten en un péptido señal (mostrado en itálica), pro-péptido (mostrado en negrita) asi como el fragmento activo (mostrado en texto normal). La secuencia de nucleótidos que codifica para los fragmentos activos del TGF^3 tipo salvaje se muestran la Secuencia ID No. 7. 1 .2 Generación de ADNc El ARN total de un herida incisional humana (tomado el día 5 pos-herida) se trató con ADN libre (Ambion) para eliminar cualquier ADN contaminante. Usando ARN total como templado, se generó ADNc para cada uno de las tres isoformas de TGF-ß de mamífero es decir, TGF-ß? , TGF^2 y TGF^3 por la reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR). Se preparó la mezcla maestra de RT-PCR a partir del kit de QRT-PCR Core Reagent 1 -paso Brilliant® (Stratagene). Se agregó un microgramo de ARN a 50 µ? de una solución que contiene: buffer QRT-PCR de 1 paso, 0.2 mM de dNTP, 3.5 mM de MgCI2, 1 pL de transcriptasa reversas StrataScript, 2.5 unidades de Taq Polymerasa, 0.4 pM de cebador de sentido (Figura 1 ), 0.4 pM de cebador de antisentido (como se muestra en la información de secuencia). La reacción se colocó en un ciclador térmico (Hybaid PCR Express) y se corrió en las siguientes condiciones: 30 min a 45°C, 10 min a 95°C, luego 40 ciclos de 95°C durante 30 seg, 65°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. La etapa final fue de 72°C durante 10 min. Las muestras de PCR se corrieron en gel de agarosa 2% (p/p) para verificar el tamaño de banda y se purificó usando el kit Wizard PCR Prep (Promega). 1 .3 Construcción del plásmido. El vector pET-3d se deriva del vector pBR322 y contiene un promotor T7 bajo control de LacUV5 control y un gen marcador resistente a ampicilina. Los fragmentos de las tres isoformas de TGF-ß 3 (generados en la Sección 1 .2) se subclonaron en los vectores pET-3d en los sitios Neo I y Bam Hl (5'-3' respectivamente). Los ligamiento resultantes luego se transformaron en células XL10 Gold (Stratagene) y se realizó el análisis de de PCR de colonia para ubicar los clones que contienen un inserto. Los clones finales se cultivaron y sus ADN del plásmidos se extrajeron en agua usando Qiaprep®Spin Miniprep Kit (Qiagen). Los plásmidos se secuenciaron y verificaron usando el cebador del promotor T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') y cebador del terminador T7 (5 -GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'). 1 .4 Transformación y clonación. 10 pL (50 ng por pl) de ADN de plásmido que codifica para cada un de las isoformas de TGF-ß (de la Sección 1 .3) se agregaron a 1 mi de células E.coli BL21 (DE3) pLysS SinglesTM (Novagen) competentes en frío (4°C). Después de 20 min las células se sometieron a shock térmico por la incubación durante 30 segundos a 42°C en baño de agua. Se agregaron 100 pL de medio Psi a la mezcla de células/plásmido y se agitaron a 37°C durante 90 min. Se sembraron alícuotas de 50 pL y 100 pL en placas de agar LB que contienen 100 pg/ml de ampicilina (Sigma) y se incubaron durante 18 horas a 37°C. Se cultivaron colonias únicas y se congelaron patrones de las células generadas y se almacenaron a -80°C. El plásmido de ADN se analizó a partir de las células patrón para verificar la correcta transformación. 1 .5 Expresión Las ampollas de las células de E.coli congeladas que se transformaron con cada una de las isoformas de cells that TGF-ß (de la Sección 1 .4) se recuperaron y se inocularon en matraces erlenmeyer con tabique, que contiene 100 mi de medio LB y 100 pg/ml de ampicilina. Los matraces se incubaron con agitación a 37°C toda la noche. Se agregaron 5 mi de este cultivo de la noche a matraces Erlenmeyer de 2 litros (500 mi de medio LB/amp) y se incubaron con agitación a 37°C. Se tomaron muestra de 2 mi de caldo por hora para rastrear el crecimiento y la expresión de la isoforma TGF-ß (pos-inducción). El crecimiento se determinó por la medición de absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Cuando la absorbancia se midió a 0.6 de Abs las células se indujeron a expresar las isoformas de TGF-ß por la adición de R-D-Tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG, Sigma) a una concentración final de 1 mM. Los cultivos se incubaron durante 4 horas adicionales. Las muestras de caldo de 0.5 mi se sedimentaron por centrifugación (10 min, 10.000 rpm en Sorvall Biofuge) y se descartó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 50 pl de buffer de muestra electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en dodecilsulfato de sodio (SDS) y se calentó durante 10 minutos en baño de agua a 95°C. Se cargaron 10 pL de muestras en SDS-PAGE. Se realizaron SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (como se describe en A.T Andrews, 1986) usando un Hoefer®Mighty Small SE 245 Dual Gel Caster (Amersham). Los geles eran de 1 mm de espesor y contenían 15% (v/v) de gel de poliacrilamida. 1 .6 Recolección de células y aislamiento de cuerpos de inclusión Las células de Sección 1 .5 se sedimentaron por centrifugación a 5000 g durante 0 min a 4°C en un centrífuga Hettich Rotina 46R con un rotor 4315. La ruptura celular y la recuperación de cada una de las isoformas de TGF-ß insolubles insoluble (cuerpos de inclusión) se llevaron a cabo a 4°C.

Las células se suspendieron en 50 mi de 100 mM de Tris/HCI (Sigma), 10 mM de EDTA (Sigma) pH 8.3 y se disgregaron por sonicación usando un Sanjo Soniprep 50. Se agregó 0.2% (p/p) de Tritón X- 00 (Sigma) y la suspensión y se agitó durante una hora. La suspensión se centrifugó a 12.000 g durante 40 min. Los pellet se resuspendieron en 50 mi de 100 mM de Tris/HCI, 10 mM de EDTA pH 8.3 a temperatura ambiente antes de centrifugar durante 40 min a 15.000g. 1 .7 Solubilización de los cuerpos de inclusión Los pellet de la Sección 1.6 se resuspendieron en 40 mi de urea 8 M, 1 % (p/p) DL-ditiotreitol (DTT) y se disgregaron en un homogenizador Heidolph Diax 900. La suspensiónse cubrió y dejó agitar durante 1 hora para solubilizar los cuerpos de inclusión y reducir el TGF-ß a su forma monomérica desnaturalizada. Luego las suspensiones se centrifugaron a 12.000 g durante 30 min a 4°C. Los sobrenadantes se dializaron para intercambiar el buffer de 8 M de urea (ICN Biomedical) a 10% (v/v) de ácido acético. Las proteínas de E.coli que fueron solubles en urea 8 M precipitaron fuera de la solución cuando se intercambió el buffer a 10% (v/v) de ácido acético. Se agregó 1 % (p/v) de DTT (Sigma) a las suspensiones, se cubrieron y dejaron agitar durante 30 min para reducir los puentes disulfuro que se pueden haber formado entre los monómeros de TGF-ß durante el intercambio del buffer. Las suspensiones se centrifugaron para separar las proteínas solubles y las proteínas no solubles. Se tomaron muestras de la solubilización de urea y las etapas de intercambio de buffer (material de ácido acético soluble y no soluble), y luego se analizó mediante SDS-PAGE. 1 .8 Ultrafiltración El material de 10% (v/v) de ácido acético de la Sección 1 .7 se sometió a ultrafiltración con una membrana de 10 kDa en una Vivoflow50 (Vivascience). El fin de esto fue reducir el volumen de la suspensión de 10% (v/v) de ácido acético a 3 mi y eliminar las proteínas de bajo peso molecular (<10 kDa). 1 .9 Replegamiento y purificación Las proteínas solubilizadas de TGF-ß? , 2 y 3 se concentraron primero por ultrafiltración y luego se corrieron en una columna de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Las fracciones de la SEC que contenían proteína de TGF-ß luego se mezclaron y liofilizaron. Las TGF-ß? , 2 y 3 monoméricas liofilizadas se solubilizaron en urea 8 M que contenía 10 mM de DTT hasta obtener un una concentración final de 10 mg/ml. Las soluciones de proteína de TGF-ß? , 2 y 3 se agregaron gota a gota, mientras se agitaba la solución de replegamiento ( 1 M de sulfonato de 3-(-piridino)-1 -propano (NDSB-20 ), 20% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma), 2% (p/v) de 3-(3-colamidopropil)dimetilamonio-l-propanosulfonato (CHAPS), 1 M de NaCI (Sigma), 1 % (p/v) de glutatión reducido (GSH, Sigma), 0.05 M de Trizma®Base (Sigma) pH 9.3) hasta alcanzar las concentraciones finales de 0.2 mg/ml de proteínas de TGF-ß? , 2 y 3. Es importante que el pH se mantenga dentro de un rango de 9.2-9.4 usando NaOH/HCI concentrado. La solución se cubrió con Parafilm, que se perforó para permitir la oxidación de las proteínas monoméricas y se dejó agitar a 8°C. Después de 144 horas la solución se centrifugó a 15.000g durante 40 minutos para eliminar el precipitado formado y el pH se ajustó a pH 3.5 con ácido acético glacial. 1 .10 Purificación de proteínas monoméricas replegadas El material replegado resultante de TGF-ß luego se también se purificó usando técnicas cromatográfícas estándares seguidas por la concentración de las fracciones relevantes (es decir, que contienen TGF-ß monoméricas) por ultrafiltración antes de la caracterización.

EJEMPLO 2 Metodología in-vitro e ¡n-vivo para la caracterización de evaluación de la activdad biológica de las proteínas de TGF-ß monoméricas Las proteínas TGF-ß monoméricas se caracterizaron y evaluaron para determinar la actividad biológica por medio de vahos métodos que incluyen: SDS-PAGE; análisis de secuencia de aminoácidos (por LCMS); ensayo de actividad biológica in-vivo (usando modelos de rata de curación de de heridas cutáneas y formación de cicatrices que se describe a continuación). 2.1 Caracterización in vivo de monómeros de TGF-P3 2.1 .1 Análisis de SDS-PAGE no reductor y reductor de TGF-33 monoméricas purificadas 2.1 .1.1 Método Los monómeros de TGF-ß purificados se evaluaron por SDS-PAGE para determinar la pureza y masa molecular. Se cargaron 3 pg de los TGF- 3 monoméricos purificados (muestras reducidas y no reducidas), 3 pg de TGF-TGF- 3 diméricos control positivo (reducido y no reducido) y 10 pL de estándares de peso molecular Invitrogen Mark 2en un gel de poliacrilamida (10%-20% (v/v) de gradiente de acrilamida). Una vez que la electroforesis finalizó el gel se tiñó con azul Coomassie. 2.1 .1 .2 Resultados Los resultados del análisis SDS-PAGE no reductor y reductor se muestran en la Figura 1 , y se ilustra que los TGF-TGF- 3 diméricos corrieron a las posiciones esperadas en el gel (-13 kDa para reducido como monómeros y 25 kDa para las muestra no reducidas). El TGF-TGF-ß monomérico corrió a la posición esperada -13 kDa (teórica 12.5 kDa) del gel para las muestras reducidas y no reducidas. No se detectaron bandas de proteínas adicionales por la tinción de azul Coomassie, que tiene una sensibilidad de aproximadamente 1 pg de proteína. 2.1 .2 Análisis de secuencia de aminoácidos 2.1 .2.1 Método Se secaron al vacío 50 microlitros de TGF- 3 monomérico purificado y luego se resuspendieron en 20 pl de una solución que contiene 50 mM de NH4HC03 y 10% (v/v) de acetonitrilo. Se resuspendieron 20 pg de tripsina de calidad de secuenciación (Promega) en 10 pl de buffer de resuspensión provisto por el kit (Promega) para dar una concentración de tripsina de 2 pg/µ?. Esto luego se diluyó en 50 mM de NH4HCO3 y 10% (v/v) de acetonitrilo para dar una concentración final de tripsina de 0.2 pg/µ?. La digestión se realizó durante la noche por la adición de tripsina en una relación de 1 :20 (p/p) de TGF- 3 monomérico. La digestión se inactivo por la adición de ácido fórmico (Fluka) a una concentración final de 0.1 % (v/v). Las muestras luego se diluyeron a 1 pmol/µ? de péptidos y luego se analizaron por un proceso de nanoflujo RPLCMS (sistema Ultímate. Dionex en línea con un Q-ToF2, Micromass). Se realizó la cromatografía en una columna de 75 pm C18 (empacamiento LC) que utiliza un gradiente de 45 min desde 5% de acetonitrilo a 55% de acetonitrilo (Romíl). El análisis MS adoptó la forma de análisis dependiente datos donde el instrumento midió la m/z de los iones peptídicos que eluyen de la LC y se seleccionaron los iones apropiados por análisis MSMS donde se empleó la descomposición inducida por colisión para obtener la información de secuencia de los iones peptídicos fragmentados. 2.1 .2.2 Resultados El análisis de la secuencia de aminoácidos confirmó que el monómero de TGF- 3 tipo salvaje tenía la secuencia de aminoácidos esperada (correspondiente a la Secuencia ID No. 3). 2.2 Evaluación in vivo de la actividad biológica de los monómeros de TGF-P3 Los datos de la bibliografía han demostrado que los TGF- 3 diméricos que incluyen TGF- 3 aceleran la curación de heridas cutáneas y reducen formación de cicatrices después de una herida o lesión (Shah, et al 1995). El siguiente ejemplo investigó los efectos biológicos de TGF- 3 monoméricos en la curación de heridas ¡ncisionales (3 días después de la herida) y la formación de cicatrices (70 días después de la herida) en ratas macho adultas. 2.2.1 El efecto de las proteínas monoméricas de TGF-33 tipo salvaje y mutado sobre la curación de heridas (Día 3 de herida incisional) 2.2.1 .1 Método Las ratas macho (Sprague Dawley) se anestesiaron con halotano y se afeitaron sus lomos. Se marcaron las posiciones de las heridas usando un molde patentado con tinta marcadora de la piel como se muestra en la Figura 2. Las muestras se diluyeron en buffer de vehículo estéril que contiene 0.25 M de Maltosa (Sigma), 0.002% (v/v) de ácido acético y 0.33% (v/v) de alcohol isopropílico a las concentraciones descríptas en el cuadro B. Todas las muestras se esterilizaron con filtración y eran libres de endotoxina. Se usaron cuatro ratas por cada grupo de tratamiento. Se inyectaron por vía intradérmica 100 pL de muestra de cada grupo de tratamiento (cuadro B) en las posiciones de heridas marcadas A y B (excepto en las ratas que no recibieron tratamiento - "naive"). En las posiciones A y B se realizaron incisiones larga de 1 cm de grosor completo con una hoja de escalpelo No. 1 . Todos los animales se alojaron en jaulas separadas. Después de 24 horas los animales recibieron una segunda dosis de muestra. Después de 3 días se fotografiaron las heridas y analizaron usando un sistema de clasificación analógico visual macroscópico (modificado de Beausang, E et al. 1998). Se realizó el análisis estadístico de los datos usando las pruebas de Mann Whítney U/T de Student. Un valor de p<0.05 se consideró significativo.

CUADRO B Tratamientos administrados a los sitios de herida de los animales experimentales 2.2.1 .2 Resultados Se examinaron las heridas incisionales después de 3 días usando un sistema VAS macroscópico (ver Figura 3). En esta escala de 10 puntos un puntaje de 0 representa una herida bien curada y un puntaje de 10 representa una herida muy mal curada. Los datos muestran que: El tratamiento con 50 ng/100 µ?_ o 100 ng/100 pL de TGF- 3 monomérico de tipo salvaje disminuye el puntaje de VAS (es decir, mejora el aspecto macroscópico de las heridas) en comparación con no tratamiento (control sin tratamiento) y tratamiento con placebo. El tratamiento con la dosis de 100 ng/100 µ?_ mejoró significativamente (p<0.01 ) el aspecto de las heridas en comparación con no tratamiento (control sin tratamiento). Es sorprendente advertir que de TGF-P3 monomérico de tipo salvaje mostró mayor efectividad que las forma dimérica. 2.2.2 El efecto de las proteínas de TGF-33 monomérico de tipo salvaje sobre la formación de cicatrices (Día 70 de herida incisional) 2.2.2.1 Método Las ratas macho (Sprague Dawley) se anestesiaron con halotano y se afeitaron sus lomos. Se marcaron las posiciones de las heridas usando un molde estandarizado con tinta marcadora de la piel como se muestra en el cuadro C. Las muestras se diluyeron en buffer de vehículo estéril que contiene 0.25 M de Maltosa (Sigma), 0.002% (v/v) de ácido acético y 0.33% (v/v) de alcohol isopropilico a las concentraciones descriptas en el cuadro C.Todas las muestras se esterilizaron con filtración y eran libres de endotoxina. Se usaron cuatro ratas por cada grupo de tratamiento. Se inyectaron por vía intradérmica 100 pL de muestra de cada grupo de tratamiento (cuadro C) en las posiciones de heridas marcadas A y B (excepto en las ratas que no recibieron tratamiento - "naive"). En las posiciones A y B se realizaron incisiones largad de 1 cm de grosor completo con una hoja de escalpelo No. 1 1 . Todos los animales se alojaron en jaulas separadas. Después de 24 horas los animales recibieron una segunda dosis de muestra. Después de 70 días se fotografiaron las cicatrices y analizaron usando un sistema de clasificación analógico visual macroscópico (modificado de Beausang, E et al. 1998). Los ejemplos representativos del aspecto macroscópico producidos como se describió anteriormente se muestran en la Figura 5.

CUADRO C Tratamientos administrados a los sitios de herida de los animales experimentales Después del análisis macroscópico, las heridas se extirparon y colocaron en solución salina buferizada 10% antes de procesarlas para la evaluación histológica en bloques de cera. Los bloques de cera se cortaron en secciones seriadas de 5 pm y se colocaron en portaobjetos. Los portaobjetos se tiñeron con Massons Tricrómico y se analizaron. Se realizó el análisis estadístico de los datos usando las pruebas de Mann Whitney U T de Student. Un valor de p<0.05 se consideró significativo. Los ejemplos representativos del aspecto macroscópico de las cicatrices producidas como se describió anteriormente se muestran en la Figura 6. 2.2.2.2 Evaluación de las heridas incisionales al día 70 usando VAS macroscópico Las heridas incisionales se examinaron después de 70 días usando un sistema VAS macroscópico. Un puntaje 10 indica una mala cicatriz y un puntaje de 0 es piel normal. Los resultados del análisis VAS de las heridas el día 70 se sintetizan en la Figura 4. Esta muestra que: El TGF-p3 monomérico de tipo salvaje (en dosis de 50 ng/100 pL y 100 ng/100 pL) redujo la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y sin tratamiento. Para la dosis de 100 ng/100 pL esta reducción es estadísticamente significativa en comparación con las heridas tratadas con placebo (p<0.01 ). El TGF- 3 dimérico a 50 ng/100 pL redujo la formación de cicatrices cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y sin tratamientos. Esta reducción es estadísticamente significativa en comparación con las heridas tratadas con placebo (p<0.01 ).

EJEMPLO 3 Desarrollo de condiciones preferidas para la producción de monómeros biológicamente activos Los inventores investigaron si se podrían establecer o no métodos mejorados de re-plegamiento de monómeros de TGF-ß biológicamente activos. El siguiente ejemplo es ilustrativo de la aplicación de los métodos de la invención al re-plegamiento de TGFP3 monomérico. Se estableció un estudio para analizar reactivos de replegamiento (ver 3.12). Luego se investigaron los métodos de purificar los monómeros correctamente replegados (3.13). Estos estudios llevaron a los inventores a darse cuenta que los métodos mejorados de generación de monómeros de TGF-ß correctamente plegados se pueden establecer por el siguiente método que comprende agregar un factor de crecimiento monomérico no plegado solubilizado a una solución que contiene: (i) ácido 2-(ciclohexilamino)-etansulfónico (CHES) o un análogo funcional de este; y (ii) un sistema redox sulfidrilo/disulfuro de bajo pesos molecular; e incubar el factor de crecimiento en la solución hasta que se forma factor de crecimiento dimérico biológicamente activo.

Experimental 3.1 Generación de ADNc El ARN total de un herida incisional humana (tomado el día 5 pos-herida) se trató con ADN libre (Ambion) para eliminar cualquier ADN contaminante. Usando ARN total como templado, se generó ADNc de TGF^3 por la reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR). Se preparó la mezcla maestra de RT-PCR a partir del kit de QRT-PCR Core Reagent 1 -paso Brilliant® (Stratagene). Se agregó un microgramo de ARN a 50 pl de una solución que contiene: buffer QRT-PCR de 1 paso, 0.2 mM de dNTP, 3.5 mM de MgCI2, 1 µ? de transcriptasa reversas StrataScript, 2.5 unidades de Taq Polymerase, 0.4 µ? de cebador de sentido (5' GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3'), .4 µ? de cebador de sentido (5'-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACA AGA C 3'). ). La reacción se colocó en un ciclador térmico (Hybaid PCR Express) y se corrió en las siguientes condiciones: 30 min a 45°C, 10 min a 95°C, luego 40 ciclos de 95°C durante 30 seg, 65°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. La etapa final fue de 72°C durante 10 min. Las muestras de PCR se corrieron en gel de agarosa 2% (p/p) para verificar el tamaño de banda y se purificó usando el kit Wizard PCR Prep (Promega). 3.2 Clonación del vector y transformación en célula huésped. El vector pET-24d se deriva del vector pBR322 y contiene un promotor T7 bajo control de LacUV5 control y un gen marcador resistente a kanamicina. Los fragmentos de ADNc de TGF-P3 (generados en la Sección 1 .1 ) se digirieron con 0.75 µ? de Nco1 (New England Biolabs) y 0.75 µ? de BamH1 (New England Biolabs) con buffer BamH1 1 X (New England Biolabs) en una reacción de 15 µ?_ (agua libre de nucleasa, Novagen) a 37°C durante 4 horas. Se digirió un microlitro de plásmido pET-24d (Novagen) de la misma manera. El ADNc digerido y el fragmento del plásmido mayor se purificaron en gel de agarosa y se recuperaron usando el kit de extracción de ADN en gel SpinPrep (Novagen). El ADNc y los fragmentos de plásmido purificados se ligaron usando un kit de T4 ligasa (Novagen). El ADNc/plásmido ligado se transformó en HMS174 (DE3), (kit de transformación Novagen HMS174 (DE3)). Se seleccionaron los transformantes por sembrado en placas de agar con caldo Luria (LB) que contienen 50 pg/ml de kanamicina (Invitrogen). Se seleccionaron tres clones para la digestión por restricción y/o expresión. 3.3 Selección del clon para la expresión del producto Los clones se cultivaron en cultivos en matraces de agitación de "caldo Terrific" de concentración media (6 g/L de peptona de fitona (Becton Dickinson), 12 g/L de extracto de levadura (Becton Dickinson), 2 g/L de glicerol (IT Baker), 1 .16 g/L de fosfato de potasio monobásico (JT Baker), 6.25 g/L de fosfato de potasio dibásico (IT Baker), con es a 1 litro de agua destilada) y se induce una fase exponencial a una D06oo entre 0.65 y 0.85 con 1 mM de beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG). Se tomaron las muestras pos-inducción 3 horas después de la adición de IPTG y se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para la inducción y expresión del producto. Se corrieron alícuotas de muestra de los clones 1 -4 pre/pos-inducción y estándares de peso molecular Mark 12 (Invitrogen- rango de peso molecular 2.5-200 kDa) en un gen NuPAGE® Novex 12% de Bis-Tis, 1 .0 mm (Invitrogen) durante aproximadamente 40-50 minutos a 120 miliAmp y 200 voltios y luego se tiñeron con azul de Coomassie. Una proteína con un tamaño entre 6 y 14.4 kDa (es decir, monómero de TGF-p3) es claramente inducida en cada uno de estos cultivos (ver Figura 7) con el Clon 2 que expresa la mayor cantidad de proteína de TGF- 3. 3.4 Patrón de células congeladas Los clones 1 -4 se cultivaron en un matraces de agitación en caldo Terrific de concentración media a una D06oo de aproximadamente 1 y se conservaron como patrones de glicerol por la adición de glicerol a 20% (v/v). Se alicuotaron 1 .2 mi de caldo en crioviales de 12 x 2 mi (que contenían 0.3 mi de glicerol) y luego se conservaron a -70°C. 3.5 Confirmación de secuencia del gen de TGF-Beta 3. Se tomaron muestras de los cultivos usados para los patrones de células congeladas antes de la adición de glicerol y se usaron para el aislamiento del plásmido usando un kit Qiagen MiniPrep. El plásmido aislado se secuenció y verificó usando un cebador promotor T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') y y un cebador terminador T7 (5 -GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'). 3.6 Cultivo de semilla. Debido a que el Clon 2 expresó la mayor cantidad de proteína de TGF-Beta 3, se recuperó una ampolla de patrón congelado (de la Sección 3.4) y se inoculó en un matraz erlenmeyer con tabique de 2 litros, que contiene 500 mi de medio HySoy (12 g/L de Hy-Soy (Quest Internacional), 24 g/L de extracto de levaduras (Becton Dickinson), 10 g/L de NaCI (Sigma) y 10 g/L de glicerol (Sigma) y 50 pg/ml de kanamicina. El matraz se incubó con agitación a 37°C y 200 rpm y se muestreó periódicamente para medir la DO550. Cuando la DO del cultivo alcanzó 3.21 U/ml (después de 7 horas) se usó el caldo de células para sembrar un fermentador de 150 L (volumen de trabajo de 100 L). 3.7 Fermentación Se usaron novecientos mililitros de caldo celular (de la Sección 3.6) para inocular un fermentador de 150 L (WHE) que contiene 90 L de medio de cultivo en lote (0.6 g/L de K2HP04, 0.4 g/L de KH2P04, 1 .25 g/L de NH4SO4, 12 g/L de HY-Soy, 24 g/L de extracto de levaduras y 10 g/L de glicerol). Los parámetros operativos de la fermentación se controlaron de la siguiente manera: punto de ajuste de temperatura 37°C; punto de ajuste de pH, 7.0 (mantenido usando 4 N de hidróxido de amonio y 4 N de ácido fosfórico), y oxígeno disuelto (DO) calibrado inicialmente a 100%. La presión del cabezal del recipiente fue 7 ps¡, y la agitación y flujo de aire fueron de 200-400 rpm con un volumen de aire por volumen de medio por minuto (vvm o slpm), respectivamente. El DO se mantuvo por encima de 20% por el ajuste de los parámetros de ajuste con la siguiente prioridad: agitación (máx. 400 rpm), aeración (máx. 1 .5 vvm), suplemento de oxígeno (máx. 33.3 Ipm), y presión trasera (máx 12 psi). La formación de espuma se controló con Pluronic L-61 (25% v/v). Cuando la DO del cultivo alcanzó 10 U/ml se inició una alimentación de glicerol (50% v/v) con una velocidad de flujo de 45 ml/min. Cuando la DO alcanzó 40 U/ml, las células se indujeron con la adición de IPTG hasta una concentración final de 0.2 mM. 3.8 Recolección Después de 4 horas pos-inducción, el fermentador se refrigeró a 10°C y se redujeron el flujo de aire y la agitación a 0.3 vvm y 100 rpm respectivamente. Los controles de espuma y pH terminaron y se ajustó la presión trasera a 3 psi. Se recolectó el cultivo por centrifugación continua con centrifuga continua Westfalia CSA8 a 10°C. La centrífuga operó a 15.000 rpm y una velocidad de flujo de 3 litros por minutos y se recolectaron las suspensiones celulares. 3.9 Lisis celular y recuperación de IB La pasta de células de fermentación (de la Sección 3.8) se diluyó 1 :5 con buffer de lisis (6.1 g/L de TrizmaBase (Tris), 3.7 g/L de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 58.44 g/L de NaCI y 10 g/L de Tritón X-100, pH 8.0) y se resuspendió usando un homogenizador manual. La pasta celular resuspendida se pasó dos veces a través de un homogenizador de alta presión (parámetros: presión, 10.000 psig; velocidad de flujo, 450 ml/min; y temperatura, 1 5°C). El lisado celular homogenizado luego se centrifugó (centrífuga de cabezal, rotor de ángulo fijo) a 5.000 xg durante 20 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante dejando el TGF-Beta 3 insoluble (cuerpos de inclusión). El pellet de cuerpos de inclusión (IB) se resuspendió en buffer de lavado (6.1 g/L de Tris y 3.72 g/L de EDTA, pH 8.0) usando un homogenizador manual y se centrifugó (5.000 xg durante 20 minutos a 4°). 3.10 Solubilización de cuerpos de inclusión El sedimento de la Sección 3.9 se diluyó 1 : 10 con el buffer de solubilización (6.1 g/L de Tris, 1 5.4 g/L de DL-ditiotreitol (DTT) y 360.4 g/L de urea, pH 8.0) y re-suspendió en un homogenizador manual. La suspensión se cubrió y dejó agitar durante 60-75 minutos, a temperatura ambiente para solubilizar los cuerpos de inclusión y reducir el TGFBeta 3 a sus forma monomérica. El pH del pellet resuspendido se ajustó a pH 9.4-9.6 con NaOH/ácido acético antes de la incubación durante un segundo tiempo de 60-75 minutos. 3.1 1 Clarificación/ultrafiltración y diafiltración El material solubilizado de la Sección 3.10 se clarificó, concentró y diafiltró en un sistema de flujo tangencial (TFF) (Millipore). La clarificación y concentración iniciales se obtuvo con una membrana de clarificación TFF preacondicionada (Millipore Pellicon 1000 kDa, celulosa regenerada, prueba V). El TGFBeta 3 clarificado se recolectó en el permeato. Luego se cambia a una membrana de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) (Millipore Pellicon 5kDa, celulosa regenerada, prueba C), el TGF-Beta 3 luego se lava en 6 volúmenes de diafiltración del buffer de solubilización (6.1 g/L de Tris, 15.4 g/L de DTT y 360.4 g/L de urea, pH 9.5). 3.12 Prueba de replegamiento en matriz 1 3.12.1 Metodología El contenido de proteína de TGF-Beta 3 en el material clarificado de la Sección 1 .12 se cuantifico usando el ensayo de proteína RC DCTM (BioRad) en conjunto con SDS-PAGE, tinción con azul de Coomassie y densitometría. El material de TGF-Beta3 se diluyó en una serie de bufferes de replegamiento (ver Tablas 1 y 2). Se tomaron diariamente muestras de 1 mi durante un cronograma de 6 días y se analizaron en condiciones no reductoras usando SDS-PAGE. Se corrieron las alícuotas de las muestras y los estándares de peso molecular Mark 12 (Invitrogen- rango de peso molecular 2.5-200 kDa) en gel NuPAGE® Novex 12% de Bís-Tris 1 .0 mm (Invitrogen) durante aproximadamente 40-50 minutos a 120 miliAmp y 200 voltios. Las muestras de proteína luego transfirieron por electroforesis a la membrana de nítrocelulosa (Invitrogen) usando un aparato Novex Blotting (Invitrogen). La membrana se bloqueó con 5% (p/v) de leche en polvo descremada, 1 % (v/v) de monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween 20;Sigma) en solución buffer salina (PBS). Se lavó la membrana (PBS, 0.1 % (v/v) Tween 20) y se incubó durante 1 hora en anticuerpo primario (Anti-TGF-Beta 3, MAB643 (sistemas R&D) diluido 1 :500 en PBS y 0.1 (v/v) de Tween 20). Después de la incubación con el anticuerpo primario, la nítrocelulosa se lavó con buffer de lavado (PBS, 1 % (v/v) de Tween 20). Luego la nítrocelulosa se incubó durante 1 hora adicional en el anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Abcam P0397) diluida 1 :2000 con PBS, 0.1 % (v/v) de Tween 20). La membrana se lavó nuevamente (PBS, 1 % (v/v) de Tween 20 antes de desarrollar color con el substrato estabilizado Western Blue para fosfatasa alcalina (Promega). El anticuerpo MAB 643 detecta especies de TGF-Beta 3 monoméricas y diméricas correctamente replegadas. 3.12.2 Resultados Las tablas 1 y 2 sintetizan los resultados obtenidos por el análisis de replegamiento de TGF-Beta 3 en 50 condiciones experimentales diferentes. Los inventores establecieron que las condiciones que se describen a continuación (es decir, las condiciones experimentales 12, 19, 36, 37, 42, 43 y 44) produjeron TGF-Beta 3 dimérico correctamente replegado: 1 . 0.7 M de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES), 2 mM de glutatión reducido (GSH), 0.4 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 12). 2. 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/ml de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 19). 3. 1 M de NDSB-201 , 2 mM glutatión reducido (GSH), 2 mM de de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 36). 4. 0.7 M de CHES, 2 mM glutatión reducido (GSH), 2 mM de de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 37). 5. 30 mM de taurodesoxicolato más 1 M de NDSB-221 , 2 mM glutatión reducido (GSH), 2 mM de de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 42). 6. 30 mM de taurodesoxicolato más 0.7 M de CHES, 2 mM glutatión reducido (GSH), 2 mM de de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 43). 7. 30 mM de taurodesoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 2 mM de GSSG, 0.12 mg/mL de TGF-Beta3, pH 9.5 a 2-8°C (Condición experimental 44). A modo de ejemplos la Figura 8 ilustra la efectividad de de la Condición experimental 12.

CUADRO 2 Matriz de prueba de replegamiento y resultados 3. 3 Ultrafiltración/Cromatografía de interacción hidrofóbica. La solución replegada seleccionada se concentró 5 veces por ultrafiltración (la membrana fue una lámina plana Millipore Pellicon 5 kDa, 0.1 m2, prueba de celulosa regenerada). El pH del material replegado concentrado luego se ajustó a un pH de 2.5-2.8 usando ácido acético glacial antes de diluir 1 : 1 en buffer de dilución (2.72 g/L de acetato de sodio, 264.28 g/L de sulfato de amonio, 100 g/L de ácido acético, y 210.7 g/L de clorhidrato de arginina de pH 3.3). Se equilibró una columna de flujo rápido de Butilsefarosa 4 (Amersham, 16 cm de altura de lecho) con cuatro volúmenes de columna de Buffer A (2.72 g/L de acetato de sodio, 132.14 g/L de sulfato de amonio y 100 g/L de ácido acético a pH 3.3). El material replegado se filtró a través de una membrana de 0.22 µ? (filtro Millipore Millipak) antes de cargarse en una columna de butilsefarosa a una velocidad de flujo de 100 cm/hora (esta velocidad de flujo se usó en todo el procedimiento). La columna luego se lavó en Buffer A para cuatro volúmenes de columna. Las proteínas de TGF-Beta 3 se eluyeron de la columna usando Buffer B (2.72 g/L de acetato de sodio, 100 g/L de ácido acético y 300 g/L de etanol, pH 3.3). Se mezcló el primer pico, que contiene proteínas TGF-P3 en formas monoméricas y diméricas (ver, Figura 9), antes de la separación de las proteínas monoméricas.

Información de secuencia TGF-ß? (Secuencia ID No. 1 ) AI,D'I^ 'CF SI:KNCCVRQLYJ.DF?.KDLGWKWIH?P GYHAN?CLGPC?YIWSLDT QYSKVLALY QI-INPGASA?'.?CCV?Q7\LEPLPIVYYVGRKPKVEQI,S KIVRSCKCS TGF- 2(Secuencia ID No. 2) ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYI D KRDLGWKWI H2PKGYNANFCAGACPYLWSSDT Q.H5RVLSLYN7?MFZA3AS?C VSQ LFPLTILYYIG T?KIEQJ S MIVKSCKCS TGF-p3(Secuencia ID No. 3) ALDTXYCFR IIÍENCCVRPLYTDFRQDLGWKWVHEPKGYYAKFCSGPCPYLRSADT T3STVLG.L íNT_JN EASAS PCCV PQDLE PLTILYYVGRT PKVEQLSNMWKSCKCS El ADN que codifica el TGF-Beta1 de longitud completa (Secuencia ID No. 4), que muestra péptidos señal (mostrado en itálica), pro-péptido (mostrado en negrita) así como el fragmento activo (mostrado en texto normal) a terecoeco¦': cgggctgcg g-ctgctgctg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg c gacQCCc gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatega catggagctg gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc agccccccga gccaggggga gg tgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg tacaacagea cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caaegaaate tatgacaag t caagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac ateagagetc cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acageaacaa ttcctggcga tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc accggagttg tgcggcagtg g ttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc gcccactgct c tgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggcctt t cctgcttctc atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagc t cccggcaccg ccgag cctg ga acc cl:. a g t caq ct cacggag aagaacuqctr. gcgtgcggca gctgtacatt gscctccgca aggac gc c t gga?.q gg atccacgagc ecaagggcta ccatgccaac tteugcctcg ggecctgccc ctaca ttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg gecct aca ccageatas cccgggcgcc tcggcggcgc cgtg tgcgt gccgcaggcg ctgqagccgc tgcccathqt gtacr-acgtg ggccgcaagc ccaagy gga gcagctg cc aar:atg ';cg tg gct.cc'_g caagtgeage tga El ADN que codifica el TGF-Beta 2 de longitud completa (Secuencia ID No. 5), que muestra péptidos señal (mostrado en itálica), pro-péptido (mostrado en negrita) asi como el fragmento activo (mostrado en texto normal) c tgtcia zct g agcaca t cga ta tgga c cag c tcá gc gcn sgagga t cgaggcgatc cgcgggcaga tcctgagcaa gctgaagctc accagtcccc cagaagacta tcctgagccc gaggaagtcc ccccggaggt gatttccatc tacaacagca ccagggactt gctccaggag aaggcgagcc ggagggcggc cgcctgcgag cgcgagagga gcgacgaaga gtactacgcc aaggaggttt acaaaataga catgccgccc ttcttcccct ocgaagccat cccgcccaot ttctacagac cctacttcag asttgttcga tttgacgtct cagcaatgga gaagaatgct tccaatttgg tgaaagcaga gttcagagtc tttcgtttgc agaacccaaa agccagagtg cctgaacaac ggattgagct atatcagatt ctcaagtcca aagatttaac atotcoaacc cagcgctaca tcgacagcaa agttgtgaaa acaagagcag aaggcgaatg gctctccttc gatgtaactg atgctgttca tgaatggctt caccataaag acaggaacct gggatttaaa ataagcttac actgtccctg ctgcactttt gtaccatcta ataattacat catcecaaat aaaagtgaag aactagaagc aagatttgca ggtattgatg gcacctccac atataocagt ggtgatcaga aaactataaa gtccactagg aaaaaaaaca gtgggaagac cccacatctc ctgctaatgt tattgccctc ctacagactt gagtcacaac agaccaaccg gcggaagaag cgtgctt.tgg atg ugccta ryctt aga aatgtgcagg ataa tLgctg cctccgtcca cLttacatLg atttcaagag ggatctaggg tggaaa*.:gqa tacangaacc caaagggtac aatgccaacfc tctgtgctgg ag atgcncg tatT.targga gttcagacac tcagcacasc agggtcctga ccttatatiaa taccataaat ccagaagcat ctgd:tct:cc ttgctgcgtg - 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IAC TGC TTC: CGC AAC TTG GAO GA(i AAC TGC TG1 GZ'G CGC CCG CTC I AC A'l~ GAC TTC. CX">;\ CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CA'!' GAA CCT AAG GGC TAC TA f GCC AAC TTC. TGC CA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA <»\C ACA ACC CAC AGG ACO GJ'G CTG GGA CTC, IAC AAC AC CTG AAC CCT AA GCA TCT GCC I (Xi CCJ TGC TGC GTC, CCC CAG GAC CTG GAG CGC CTC i ACC ATC CTG TAC ?? O i J GGG AGG ACC ( CC ??? CTG GAG C'AG C TC I CC AAC ATG GTC, GTG AAG TC T TGT ??? TC, T AGC Cebadores de sentido y antisentido para la generación de ADHc de T<;r-liuiu I.TCH-Bcta 2 y TU"- Beta 3: cebador sen ido ..y GTT ACA CCA TGG CCC TGG ACA CCA ACT¡ A I T .V Cebador antisentido-3 ' C AG CCG AT CCG GTC GAC TCA GCT GCA C'IT 5" TGF-lkta 2 Cebador sentido -V GTT ACA CCA TGG C GG ATO CGG CCT ??G Cebador antisentido-3' C'AG CCG GAT CC- (i GTC GAC TCA GCT GCA I' i 5' TG F- Beta 3 Cebador sentido -5' GA'I ATA CCA TGG CTT TGG A< IA CCA ATT ACT ACT GC . " Cebador antisentido- ' CAG CCG GAT CCG GTC C TCA GCT ACA TTT ACA AC"

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 .- Un monómero TGF-ß o un fragmento biológicamente activo o derivado de este para uso como medicamento. 2. - Un monómero TGF-P3, o un fragmento biológicamente activo o derivado de este para uso como medicamento. 3. - El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el monómero TGF-ß tiene un peso molecular de aproximadamente 12 kDa. 4. - El uso de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3, en la preparación de un medicamento para usar en la aceleración de la cura de heridas y/o la inhibición de la formación de cicatrices. 5.- El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el monómero TGF^3, o fragmento o derivado, es un monómero TGF^3 de tipo salvaje que comprende la Secuencia ID No. 3, o un fragmento biológicamente activo o derivado de éste. 6. - El uso de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5, en donde la herida es una herida dérmica. 7. - El uso de acuerdo con la reivindicación 4 o reivindicación 5, en donde la herida es una herida ocular. 8. - El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde la herida es una herida aguda. 9. - El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la herida es una quemadura. 10. - El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde la herida es una herida crónica. 1 1 . - El uso de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3, en la preparación de un medicamento para usar en la promoción de la regeneración epitelial. 12. - El uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde el epitelio comprende la epidermis. 13. - El uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde el epitelio comprende un epitelio ocular. 14. - El uso de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3, en la preparación de un medicamento para usar en la prevención y/o tratamiento de un trastorno fibrótico. 15. - El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el trastorno fibrótico se selecciona del grupo que consiste en fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, escleroderma, fibrosis cutánea, fibrosis muscular, fibrosis por radiación, fibrosis renal, fibrosis ocular y fibrosis uterina. 16. - El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el monómero, o fragmento biológicamente activo o derivado de éste se proporciona en una concentración de entre 0.78 pM y 0.78 mM. 17. - El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el medicamento tiene un pH de aproximadamente 5 a 7. 18. - El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el medicamento es sustancialmente libre de alcohol. 19.- El uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde el monómero TGF-ß, o fragmento biológicamente activo o derivado de éste, se pliega en su forma biológicamente activa por un método que comprende agregar TGF-ß monomérico no plegado, solubilizado (o fragmento o derivado de éste) a una solución que contiene: (i) ácido 2-(ciclohexilamino)-etansulfónico (CHES) o un análogo funcional de éste; y (ii) un sistema redox de sulfhidrilo/disulfuro de bajo peso molecular; e incubar el TGF-ß en la solución hasta que se forma TGF-ß monomérico biológicamente activo.