MX2008009232A - Metodos para modular el contenido de manosa de proteinas recombinantes - Google Patents

Abstract

La presente invención es concerniente con métodos para modular (por ejemplo reducir) el contenido de manosa, particularmente alto contenido de manosa de glicoproteínas recombinantes.

Description

MÉTODOS PARA MODULAR EL CONTENIDO DE MAÑOSA DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los eucariontes superiores efectúan una variedad de modificaciones pos-traducción, en las que se incluyen mutilación, sulfatación, fosforilación, adición de lípido y glicosilación. Tales modificaciones pueden ser de importancia crítica para la función de una proteína. Las proteínas secretadas, proteínas de membrana y proteínas apuntadas a vesículas o ciertos organelos intracelulares son probablemente glicosilados. La glicosilación N-enlazada es una forma de glicosilación que involucra la adición de oligodacáridos a un residuo de asparagina encontrado en secuencias de reconocimiento (por ejemplo, Asn-X-Ser/Thr) en proteínas. Las glicoproteínas N-enlazadas contienen estructuras ramificadas estándar que están compuestas de mañosa (Man) , galactosa, N-acetilglucosamina (GlcNac) y ácidos neurámicos. La N-glicosilación de proteína se origina comúnmente en el retículo endoplásmico (ER) , en donde un oligosac'árido N-enlazado (por ejemplo, Glc3 Man9 GlcNAc2) ensamblado sobre dolicol (un intermediario portador de lípido) es transferido a la asparagina apropiada (Asn) de una proteína naciente. Este es un evento común a todas las glicoproteínas N-enlazadas eucariónticas . Hay dos tipos principales de sacáridos N- enlazados: oligosacáridos de alto contenido de mañosa y oligosacáridos complejos. Los oligosacáridos de alto contenido de mañosa incluyen comúnmente dos N-acetilglucosaminas con muchos residuos de mañosa (por ejemplo, mayor de 4) . Los oligosacáridos complejos son nombrados así debido a que contienen casi cualquier número de otros tipos de sacárido en los que se incluyen más de los dos N-acetilglucosaminas originales. Las proteínas pueden ser glicosiladas tanto mediante ambos tipos de oligosacáridos en porciones diferentes de la proteína. Si un oligosacárido es de alto contenido de mañosa o complejo se piensa que depende de su capacidad de acceso a proteínas modificadoras de sacárido en el aparato de Golgi. Si el sacárido es relativamente inaccesible, más probablemente permanecerá en su forma de alto contenido de mañosa original. Si es accesible, entonces es probable que muchos de los residuos de mañosa serán escindidos y el sacárido será modificado adicionalmente por la adición de otros tipos de grupo como se discute anteriormente. Después de que una cadena de oligosacárido ha sido agregada a una proteína, los tres residuos de glucosa y un residuo de mañosa son removidos mediante tres enzimas diferentes en un orden fijo. Este evento ocurre en el ER y es una señal que la proteína puede ser transportada al aparato de Golgi para procesamiento adicional . Después del procesamiento en el ER, el oligosacárido tipo alto contenido de mañosa es formado. Los tres residuos de glucosa y un residuo de mañosa alfa-1, 2 -enlazado específico son removidos mediante glucosidasas específicas y una alfa-1, 2 -manosidasa en el ER, dando como resultado la estructura en el oligosacárido de núcleo, Man8 GlcNA2. La proteína con esta estructura de azúcar de núcleo es transportada al aparato de Golgi, en donde la porción de azúcar sufre varias modificaciones. En células mamíferas, la modificación de la cadena de azúcar procede vía 3 rutas diferentes dependiendo de la porción de proteína a la cual está anexada. Las tres rutas diferentes son: (1) la cadena de azúcar de núcleo no cambia; (2) la cadena de azúcar de núcleo es cambiada al agregar la porción de N-acetilglucosamina-1-fosfato (GlcNAz-1-P) en UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) a la posición 6 de mañosa en la cadena de azúcar de núcleo, seguido por remoción de la porción de GlcNAc para formar una cadena de azúcar acida en la glicoproteína o (3) la cadena de azúcar del núcleo es primero convertida a Man GlcNAc2 al remover 3 residuos de mañosa con manosidasa I; Man5 GlcNAc2 es modificado adicionalmente mediante adición de GlcNAc y remoción de 2 residuos de mañosa más, seguido de la adición secuencial de GlcNac, galactosa (Gal) y ácido N-acetilneuramínico (también llamado ácido siálico (NeuNAc) ) para formar varias cadenas de azúcar híbridas o complejas (R. Kornfeld y S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664 (1985); Chiba et al . , J. Biol. Chem. 273: 26298-26304 (1998) ) . El contenido de oligosacárido de proteínas recombinantes puede afectar la seguridad y eficacia de glicoproteínas terapéuticas. Así, métodos para controlar el contenido de oligosacárido, particularmente el contenido de mañosa de tales glicoproteínas serían benéficos. El alto contenido de mañosa de las composiciones de glicoproteína, particularmente anticuerpos terapéuticos, puede afectar significativamente la seguridad y eficacia de tales proteínas durante el uso terapéutico. Sin estar limitados por una teoría particular, la evidencia sugiere que las glicoproteínas de alto contenido de mañosa son despejadas de la circulación más rápido que sus contrapartes de bajo contenido de mañosa debido por ejemplo, a aceptores de mañosa en macrófagos y células dendríticas. Adicionalmente, se espera que las glicoproteínas de alto contenido de mañosa sean más inmunogénicas . Así, es deseable producir glicoproteínas terapéuticas tales como anticuerpos terapéuticos que tengan bajo contenido de mañosa. Esta necesidad en el arte es resuelta al proporcionar métodos para modular (por ejemplo, controlar o reducir) el contenido de mañosa de proteínas y péptidos producidos recombinantemente .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada, por lo menos en parte, en el descubrimiento de factores que afectan el contenido de mañosa y en particular, el alto contenido de mañosa de glicoproteínas expresadas recombinantemente. Así, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para modular el contenido de mañosa (esto es, en una cadena lateral de oligosacárido) de una glicoproteína recombinante producida en una célula huésped mamífera al manipular las condiciones de cultivo celular, de tal manera que las glicoproteínas producidas por la célula tenga bajo contenido de mañosa. Como se usa en la presente, el término "bajo contenido de mañosa" se refiere a composiciones de glicoproteína en donde menos de aproximadamente 10% o menos de aproximadamente 8% o menos de aproximadamente 5% (por ejemplo, aproximadamente 4% o menor) de las glicoproteínas en la composición tienen más de cuatro residuos de mañosa (esto es, son especies de M5 o mayor) . Como se usa en la presente, el término "bajo contenido de mañosa" también se refiere a composiciones de glicoproteína en donde menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 9%, menos de aproximadamente 8%, menos de aproximadamente 7%, menos de aproximadamente 6%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 1% o cualesquier valores entre cualquiera de estos intervalos precedentes o aún a cero. En una modalidad de la invención, el bajo contenido de mañosa es obtenido al mantener el ambiente de cultivo celular a baja osmolalidad (por ejemplo, menos de aproximadamente 600 mOsm/Kg, o menos de aproximadamente 500 mOsm/Kg, o menos de aproximadamente 400 mOsm/Kg, por ejemplo, entre aproximadamente 380 a 250 mOsm/Kg) . Esto enriquece el cultivo celular para glicoproteínas que tienen bajo contenido de mañosa, esto es, que tienen cuatro o menos residuos de mañosa en las cadenas laterales de oligosacáridos de las glicoproteínas. Así, en una modalidad particular, la invención proporciona un método para producir una glicoproteína recombinante que tiene bajo contenido de mañosa que comprende cultivar una célula huésped mamífera (por ejemplo, en una fase de expansión o producción del cultivo) que expresa la glicoproteína en un medio que tiene una osmolalidad de aproximadamente 600 mOsm/Kg o menos (por ejemplo, entre un intervalo de aproximadamente 200 y 600 mOsm/Kg, por ejemplo, aproximadamente 250 y 550 mOsm/Kg, aproximadamente 250 y 500 mOsm/Kg, aproximadamente 250 y 450 mOsm/Kg, aproximadamente 250 y 400 mOsm/Kg, aproximadamente 250 y 380 mOsm/Kg o aproximadamente 250 y 350 mOsm/Kg) . Los intervalos de osmolalidad anteriores pueden ser obtenidos al manipular una diversidad de parámetros de cultivo celular en los que se incluyen pero no limitados a concentraciones de una o más de sales, vitaminas, azúcares, peptonas y aminoácidos en el medio de cultivo celular. Así, en una modalidad particular, la invención proporciona un método para producir una glicoproteína recombinante que tiene un bajo contenido de mañosa al cultivar una célula huésped que expresa la glicoproteína en un medio que contiene potasio en una concentración de aproximadamente 70 mM o menos (por ejemplo, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM) y/o sodio a una concentración de aproximaamente 200 M o menor (por ejemplo, aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM) y mantener la osmolalidad del cultivo celular a aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor . En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para producir una glicoproteína recombinante que tiene bajo contenido de mañosa al cultivar una célula huésped que expresa la glicoproteína en un medio que está sustancialmente libre de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de alanina, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico y mantener la osmolalidad del cultivo celular a aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor. Además, en todavía otra modalidad, el medio puede incluir una o más vitaminas seleccionadas del grupo que consiste de biotina, patontenato de D-calcio' , cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, piridoxal HCl, piridoxina HCl, riboflavina, tiamina HCl y cianovobalamina, a una concentración de aproximadamente 0.00005 g/1 a aproximadamente 0.9 g/1. En todavía otra modalidad, el medio incluye glucosa a una concentración e aproximadamente 1 mM a aproximadamente 90 mM. En una modalidad adicional, el medio incluye una o más peptonas seleccionadas del grupo que consiste de extracto de levadura, levadura hidrolizada, peptona de soya, hidrolizado de soya, peptona de trigo y trigo hidrolizado, a una concentración de aproximadamente 0.5 g/1 a aproximadamente 60 g/1. En todavía una modalidad adicional de la presente invención, el medio de cultivo celular puede incluir uno oO más osmoprotectores en una cantidad necesaria para mantener la osmolalidad a un nivel deseado, por ejemplo aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor. Osmoprotectores apropiados son conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo , betaína, glicina, L-treonina y L-prolina y derivados de los mismos tales como por ejemplo, glicina betaína y betaína aldehido. En una modalidad particular, el osmoprotector (por ejemplo, betaína) está presente a una concentración de aproximadamente 20 mM o mayor en el medio de cultivo celular. En modalidades particulares, el osmoprotector (por ejemplo, betaína) está presente a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM o aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM. Parámetros de cultivos celulares adicionales que pueden ser controlados, ya sea solos o en combinación con uno o más de los parámetros descritos en la presente incluyen por ejemplo, temperatura y liberación de tiempo con el que las células son cultivadas. En ciertas modalidades, una célula huésped que expresa una glicoproteína recombinante es cultivada a una temperatura de aproximadamente 31 °C a aproximadamente 38 °C. En ciertas otras modalidades, una célula huésped que expresa una glicoproteína recombinante es cultivada por un período que fluctúa aproximadamente 5 días a aproximadamente 14 días. Células huésped apropiadas para expresar glicoproteínas recombinantes de acuerdo con la presente invención son bien conocidas en el arte e incluyen cualquiera de aquellas descritas en la presente, tales como células CHO, células linfocíticas (por ejemplo, células NSO) y una variedad de otras células mamíferas. La presente invención puede ser empleada para producir una amplia variedad de glicoproteínas que tienen bajo contenido de mañosa como se describe en la presente. En una modalidad particular, la invención es usada para producir un anticuerpo monoclonal recombinante o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene bajo contenido de mañosa. Anticuerpos apropiados pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados y plenamente humanos, también como otras formas de anticuerpo conocidas en el arte. En otra modalidad particular, el anticuerpo se enlaza a IL-15, que incluye pero no está limitado a los anticuerpos revelados en la Publicación Estadounidense No. 2003-0138421, que es incorporada por referencia en la presente en su totalidad. En otra modalidad particular, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal plenamente humano que se enlaza a IL-15 que tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO. 4 y/o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 2, también como secuencias homologas que se enlazan a IL-15 (por ejemplo, que tienen secuencias de aminoácidos de aproximadamente 80, 85, 90, 95% o mayor identidad a SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 2, respectivamente) . En una modalidad particular adicional, el anticuerpo es un anticuerpo humano que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que tiene una región variable de cadena ligera que comprende una o más regiones que determinan la complementariedad (CDR) resumidas en SEQ ID NOS: 8-10, también como secuencias homologas que se enlazan a IL-15 (por ejemplo, que tienen secuencias de aproximadamente 80, 85, 90, 95% o mayor identidad a cualquiera de SEQ ID Nos: 8-10, respectivamente) y una región variable de cadena pesada que comprende una o más regiones que determinan la complementariedad (CDR) resumidas en SEQ ID Nos: 5-7, también como secuencias homologas que se enlazan a IL-15 (por ejemplo, que tienen secuencias de aminoácidos de aproximadamente 80, 85, 90, 95% o mayor identidad a cualquiera de SEQ ID Nos: 5-7, respectivamente) . En una modalidad particular, un anticuerpo monoclonal humano que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo incluye una región variable de cadena ligera que comprende todas las tres CDR resumidas en SEQ ID Nos: 8-10 y una región variable de cadena pesada que comprende todas las tres CDR resumidas en SEQ ID Nos: 5-7 o sustituciones de aminoácidos conservadoras de las mismas. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona glicoproteínas recombinantes que tienen un bajo contenido de mañosa producidas mediante los métodos descritos en la presente. Así, tales glicoproteínas pueden incluir cualquiera de las glicoproteínas terapéuticas mencionadas anteriormente, tales como anticuerpos, hormonas, enzimas, péptidos y otras glicoproteínas. También abarcadas por la presente invención están composiciones que comprenden cualquiera de las glicoproteínas mencionadas anteriormente que tienen bajo contenido de mañosa. En una modalidad particular, la composición es una composición farmacéutica que incluye una glicoproteína aislada (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano aislado que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) que tiene bajo contenido de mañosa y un portador aceptable farmacéuticamente.

Así, en todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una alteración que está asociada con la sobreexpresión de IL-15 humana y/o en la cual una desregulación o inhibición de efectos inducidos por IL-15 humana es benéfica es proporcionado, al administrar a un sujeto un anticuerpo de IL-15 aislado que tiene bajo contenido de mañosa. Alteraciones ejemplares incluyen pero no están limitadas a vasculitis, psoriasis, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn, o enfermedad celíaca) , rechazo de aloinjerto, enfermedad de huésped contra injerto, linfoma de célula T y leucemia de célula T. Así, en todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una alteración que está asociada con la sobreexpresión de IL-15 humana y/o en la cual una desregulación o inhibición de efectos inducidos por IL-15 humana es benéfica es proporcionado, al administrar a un sujeto un anticuerpo IL-15 aislado que tiene bajo contenido de mañosa. Alteraciones ejemplares incluyen pero no están limitadas a artritis, alteraciones de tejido conectivo, alteraciones oftalmológicas, alteraciones neurológicas, alteraciones gastrointestinales y hepáticas, alteraciones alérgicas, alteraciones hematológicas, alteraciones de la piel, alteraciones pulmonares, malignidades, alteraciones derivadas de trasplante, alteraciones endocrinológicas, alteraciones vasculares, alteraciones ginecológicas y enfermedades infecciosas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que ilustra la correlación entre osmolalidad y alto contenido de mañosa de un anticuerpo monoclonal plenamente humano que se enlaza a IL-15 producido mediante células de cultivo que expresan el anticuerpo en un control de agitador (50 ml) y biorreactores (150 1 y 500 1) . La Figura 2 es una gráfica que ilustra la correlación entre la adición de un osmoprotector, betaína y el alto contenido de mañosa de un anticuerpo monoclonal plenamente humano que se enlaza a IL-15. La Figura 3 es una gráfica que ilustra la correlación entre la osmolalidad y la concentración de K+ del medio de cultivo. La Figura 4 es una gráfica que ilustra la correlación entre el alto contenido de mañosa de un anticuerpo monoclonal plenamente humano que se enlaza a IL-15 y la osmolalidad, al cultivar células en un medio que contiene ya sea 15 mM o 45 mM de KC1. La Figura 5 es una representación gráfica de la correlación entre la concentración de K+ y el alto contenido de mañosa, que muestra que la concentración óptima de K+ para mantener el alto contenido de mañosa a menos de 10% es de entre aproximadamente 0 y aproximadamente 70 mM. La Figura 6 es una gráfica que representa la correlación entre la concentración de Na+ y el alto contenido de mañosa, que muestra que la concentración óptima de Na+ para mantener el alto contenido de mañosa a menos de 10% es de entre aproximadamente 0 mM y aproximadamente 200 mM. La Figura 7 es una gráfica que ilustra la correlación entre la concentración de aminoácido y el alto contenido de mañosa. La Figura 8 es una gráfica que ilustra la correlación entre el tipo de medio de alimentación usado y el alto contenido de mañosa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Así, es deseable producir glicoproteínas terapéuticas tales como por ejemplo, anticuerpos terapéuticos, que tengan bajo contenido de mañosa. Con el fin de que la presente revelación pueda ser entendida más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Definiciones adicionales son resumidas en toda la descripción detallada.

I . Definiciones Las porciones de carbohidrato son descritas en la presente con referencia a la nomenclatura usada comúnmente para los oligosacáridos. Una revisión de la química de carbohidratos que usa esta nomenclatura se puede encontrar por ejemplo en Hubbard e IBTA, Ann. Rev. Biochem. 50: 555-583 (1981) . Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man, que representa mañosa; GlcNAc, que representa 2-N-acetilglucosamina; Gal que representa galactosa y Glc, que representa glucosa. Los ácidos siálicos son descritos con referencia a la notación breve NeuNAc, para ácido 5-N-acetilneuramínico y NeuNGc para ácido 5-glicolilneuramínico . El término "osmolalidad", como se usa en la presente, se refiere a una medida de la presión osmótica de partículas de soluto disueltas en una solución acuosa. Las partículas de soluto incluyen tanto iones como moléculas no ionizadas. La osmolalidad es expresada como la concentración de partículas osmóticamente activas (esto es, osmoles) disueltas en 1 Kg de solución (1 mlsm/Kg H20 a 38 °C es equivalente a un presión osmótica de 19 mm de mercurio) . Como se usa en la presente, la abreviatura "mOsm" significa "miliosmoles/Kg de solución" . En modalidades ejemplares, la osmolalidad del medio de cultivo celular es mantenida a aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor, o aproximadamente 550 mOsm/Kg o menor, o aproximadamente 500 mOsm/Kg o menor, o aproximadamente 450 mOsm/Kg o menor, o aproximadamente 400 mOsm/Kg o menor, o aproximadamente 380 mOsm/Kg o menor o entre aproximadamente 200 mOsm/Kg y aproximadamente 600 mOsm/Kg, o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg y aproximadamente 550 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg aproximadamente 500 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg a aproximadamente 450 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg a aproximadamente 400 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg a aproximadamente 380 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg a aproximadamente 350 mOsm/Kg. Como se usa en la presente, el término "glicoproteína" se refiere a péptidos y proteínas, en las que se incluyen anticuerpos, que tienen por lo menos una cadena lateral de oligosacárido que incluye residuos de mañosa. Las glicoproteínas pueden ser homologas a la célula huésped o pueden ser heterólogas, esto es, extrañas, a la célula huésped que es utilizada, tal como por ejemplo, una glicoproteína humana producida por una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO) . Tales glicoproteínas son denominadas en general como "glicoproteínas recombinantes". En ciertas modalidades, las glicoproteínas expresadas por una célula huésped son secretadas directamente al medio. Ejemplos de glicoproteínas mamíferas incluyen las siguientes moléculas y anticuerpos contra las mismas, citocinas, por ejemplo, IL-1 a IL-15 y sus receptores; quimiocinas, tales como TNF, TECK y sus receptores, por ejemplo, TNFR, CCR9; hormonas de crecimiento, en las que se incluyen hormona de crecimiento humano y hormona de crecimiento bovino; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroides; hormona estimuladora de tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora de folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor de tejido y factor de von illebrands; factores anti-ciagulación tales como Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante de pulmón; activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de purina humana o activador de plasminógeno tipo tejido (t-PA) ; bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; encefalinasa; RANTES (regulado en la activación de célula T expresada y secretada) ; proteína inflamatoria de macrófago humano (MIP-1-alfa) ; albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; sustancia que inhibe mulerianos; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina,-péptido gonadotropina-asociado de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; ADNasa; inhibina; activita; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina, proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF) , neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento de nervio tal como NGF-beta; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; factor de crecimiento de fibroblasto tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, en los que se incluyen TGF-beta, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4 o TGF-beta5; factor de crecimiento semejante a insulina I y II (IGF-1 e IGF-II) ; des (1-3) -IGF-I (IGF- I de cerebro) , proteínas de enlace de factor de crecimiento semejante a insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; proteína morfogenética de hueso (BMP) ; interferones tales como interferón-alfa, -beta y -gamma; factores estimuladores de colonia (CSF), por ejemplo M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL) , por ejemplo IL-1 a IL-15; superóxido dismutasa; receptores de célula T; proteínas de membrana superficial; factor de aceleración de decaimiento, antígeno viral tal como por ejemplo una porción de la envolvente de SIDA; proteínas de transporte; receptores homing y proteínas reguladoras . Como se usa en la presente, los términos "medio de cultivo celular" y "medio de cultivo" se refieren a una solución de nutriente usada para cultivar células mamíferas que proporcionan comúnmente por lo menos un componente de las siguientes categorías: (1) una fuente de energía, usualmente en forma de un carbohidrato tal como por ejemplo glucosa; (2) uno o más de todos los aminoácidos esenciales y usualmente el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína; (3) vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones; (4) ácidos grasos libres y (5) elementos en trazas, en donde los elementos en trazas son definidos como compuestos inorgánicos o elementos que se presentan de manera estable en la naturaleza que son requeridos comúnmente a concentraciones muy bajas, usualmente en el intervalo micromolar. La solución de nutriente puede opcionalmente ser complementada con componentes adicionales para optimizar el crecimiento de las células. El cultivo de células mamíferas de la presente invención es preparado en un medio apropiado para la célula particular que es cultivada. Medios de cultivo celular apropiados que pueden ser usados para cultivar un tipo de célula particular serían evidentes para aquel de habilidad ordinaria en el arte. Medios disponibles comercialmente ejemplares incluyen, por ejemplo, FIO de Ham (SIGMA) , Medio Esencial Mínimo (MEM, SIGMA) , RPMI-1640 (SIGMA) y Medio de Tagle Modificado de Dulbecco (DMEM, SIGMA) . Cualquiera de estos u otros medios apropiados pueden ser complementados como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferían o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones reguladoras del pH (tales como HEPES) , nucleósidos (tales como adenosina y timidita) , antibióticos (tales como Gentamycin™) , elementos en trazas (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) , lípidos (tales como ácido linolénico u otros ácidos grasos) y sus portadores apropiados y fructosa o una fuente de energía equivalente y/o modificados como se describe en la presente para facilitar la producción de glicoproteínas recombinantes que tienen bajo contenido de mañosa. En una modalidad particular, el medio de cultivo celular está libre de suero. En ciertas modalidades, un medio de cultivo celular es optimizado para modular 8por ejemplo, reducir) el alto contenido de mañosa de una glicoproteína recombinante expresada por una célula huésped cultivada en sal medio. En una modalidad particular, la célula huésped mamífera es una célula CHO y un medio apropiado contiene un componente de medio basal tal como una formulación a base de DMEM/HAM F-12 con concentraciones modificadas de uno o más componentes tal como por ejemplo, aminoácidos, sales, azúcares, peptonas y vitaminas, para modular (por ejemplo, reducir) el alto contenido de mañosa de una glicoproteína recombinante expresada por una célula CHO cultivada en tal medio. El término "fase de crecimiento" de un cultivo celular se refiere al período de crecimiento celular exponencial (esto es, la fase logarítmica) en donde las células están en general dividiéndose rápidamente. Las células son mantenidas en la fase de crecimiento por un período de aproximadamente un día o aproximadamente dos días o aproximadamente tres días o aproximadamente cuatro días o más de cuatro días. La duración del tiempo por el cual las células son mantenidas en fase de crecimiento variará en base al tipo de célula y velocidad de crecimiento de las células y las condiciones de cultivo, por ejemplo. El término "fase de transición" se refiere a un período de tiempo entre la fase de crecimiento y la fase de producción. En general, la fase de transición es el tiempo durante el cual las soluciones de cultivo pueden ser controladas para soportar un desplazamiento de una fase de crecimiento a la fase de producción. Varios parámetros de cultivo celular que pueden ser controlados incluyen pero no están limitados a uno o más de temperatura, osmolalidad, vitaminas, aminoácidos azúcares, peptonas, amonio y sales. El término "fase de producción" de un cultivo celular se refiere al período de tiempo en donde el crecimiento de la célula ha llegado a una meseta. El crecimiento celular logarítmico termina comúnmente antes o durante esta fase y la producción de proteína toma lugar. Es deseable complementar el medio de cultivo celular para obtener la producción de proteína deseada en esta etapa. Los términos "célula huésped mamífera", "célula huésped" y "célula mamífera" se refieren a líneas celulares derivadas de mamíferos que son capaces de crecer y sobrevivir cuando son colocadas ya sea en cultivo de monocapa o en cultivo de suspensión en un medio que contiene los nutrientes y factores de crecimiento apropiados. Comúnmente, tales células son capaces de expresar y segregar grandes cantidades de una glicoproteína de interés particular al medio de cultivo. Ejemplos de células huésped mamíferas apropiadas incluyen pero no están limitadas a células de ovario de hámster chino/DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77: 4216 (1980)); células dp 12CHO (EP 307247) ; línea CV1 de riñon de chango transformada por SV40 (ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión) (Gram. et al . , J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (ATCC CCL 10); células de sertoli de ratón (TM4) (Mather, Bibl . Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de riñon de chango (ATCC CCL 70) ; células de riñon de chango verde africano (VERO-76) (ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HeLa) (ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK) (ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A) (ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humanas (W138) (ATCC CCL 75) ; células de hígado humano (Hep G2 HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562; ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al . , Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hematoma humano (Hep G2) . El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se usa en la presente, se propone referirse a una célula a la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Se debe entender que tales términos se proponen referirse no solamente a la célula sujeto particular si no a la progenie de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debidas ya sea a mutación o influencias ambientales, tal progenie puede en efecto no ser idéntica a la célula padre, pero todavía son incluidos en el alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. Los términos "expresión" , "expresar" y "expresa" se refieren en general a la transcripción y traducción que ocurren dentro de una célula huésped. El nivel de expresión del producto genético en una célula huésped puede ser determinado en base ya sea a la cantidad de ya sea ARNm correspondiente que está presente en la célula o en la cantidad de la proteína codificada por el gen. Por ejemplo, ARNm trascrito de un gen de producto puede ser cuantificado mediante hibridización de northern (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . Una proteína codificada por un gen puede ser cuantificada ya sea al analizar la actividad biológica de la proteína o al usar análisis que son independientes de tal actividad, tales como por ejemplo, análisis de western blot o radioinmunoanálisis utilizando anticuerpos que son capaces de reaccionar con la proteína (Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.8 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) . En algunas modalidades, los términos "expresión" , "expresar" y "expresa" son usados con referencia a una proteína recombinante que tiene bajo contenido de mañosa producida mediante un método de la invención. Los términos "baja mañosa" y "bajo contenido de mañosa", como se usan en la presente, se refieren a una composición de glicoproteína, en donde no más de aproximadamente 10% de la composición comprende glicoproteínas que contienen más de cuatro residuos de mañosa, esto es, especie M5 o mayor. Inversamente, "alto contenido de mañosa" se refiere a una composición de glicoproteína en donde no más de aproximadamente 10% de la composición comprende glicoproteínas que tienen más de cuatro residuos de mañosa. Los términos "baja mañosa" y "bajo contenido de mañosa" son también usados con referencia a una composición de glicoproteína que^ incluyen más de aproximadamente 90% o mayor de aproximadamente 95% de la composición que tiene glicoproteínas que incluyen cuatro o menos de cuatro residuos de mañosa. El término "una glicoproteína que tiene bajo contenido de mañosa" es usado con referencia a una composición de glicoproteína recombinante, que cuando es producida al cultivar una célula huésped, incluye pero no está limitada a la misma, no más de aproximadamente 4%, no más de aproximadamente %, no más de entre aproximadamente 4% y aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 6%, no más de entre aproximadamente 5% y 6%, no más de aproximadamente 7%, no más de entre aproximadamente 6% y 7%, no más de aproximadamente 8%, no más de aproximadamente 7% y 8%, no más de aproximadamente 9%, no más de entre 8% y 9%, no más de aproximadamente 10% o no más de entre aproximadamente 9% y 10% de las glicoproteínas en la composición que tienen más de cuatro residuos de mañosa (esto es, especie M5 o mayor) . Así, el término "una glicoproteína que tiene bajo contenido de mañosa" se refiere a una composición de glicoproteína recombinante que cuando es producida al cultivar una célula huésped, incluye mayor de aproximadamente 90% o mayor de aproximadamente 95% de las glicoproteínas en la composición que tiene cuatro o menos de cuatro residuos de mañosa (esto es, 0-4 residuos de mañosa) . El alto contenido de mañosa puede ser medido mediante uno o más métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en Wuhrer et al. (Journal of Chromatography B Vol. 825: 124-133, 2005) y Dell et al. (Science, Vol. 291: 2351-2356) y aquellas descritas en la presente en las que se incluyen, por ejemplo, el método analítico para el mapeo de N-glicana de glicoproteínas. Brevemente, las N-glicanas son removidas enzimáticamente de las glicoproteínas recombinantes, tal como un anticuerpo monoclonal recombinante y marcadas con un marcador fluorescente (2-aminobenzamida) en el término reductor. Las N-glicanas fluorescentes son separadas mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto pH (HPAEC) y detectadas utilizando detección de fluorescencia. La separación de las N-glicanas neutras está basada en general en la complejidad incrementada en las estructuras N-glicanas. La separación de las N-glicanas cargadas está basada en el número y tipo de ácido siálico, sulfato u otras modificaciones presentes de las cuales un número de cargas puede ser derivado. Estos perfiles de glicana de muestras de prueba son comparados visualmente con un estándar apropiado. El alto contenido de mañosa puede también ser medido utilizando un método revelado en la presente: un método de alto rendimiento para detectar y/o cuantificar el alto contenido de mañosa de una glicoproteína, en los que se incluyen pero no limitados a anticuerpos o fragmentos de los mismos; por ejemplo, fragmentos Fab, proteínas de fusión que comprenden fragmentos Fe y pepticuerpo cuando son expresados en células huésped eucariónticas . Los anticuerpos tienen comúnmente una sola glicana N-enlazada en la región de Fe. Debido a la estructura parcialmente enterrada de la glicana, es frecuentemente solo procesada parcialmente, dando como resultado tipos de alto contenido de mañosa e híbridos en exceso. La selección de clon, mutación de células u otra manipulación genética o manipulación de cultivo celular puede alterar el tipo de glicanas producidas por las células. Grandes números de condiciones/células son explorados, así muchas pruebas de glicana son requeridas durante la selección. El mapeo de glicana tradicional es lento y de labor intensa, requiriendo múltiples días. El análisis de glicana de alto contenido de mañosa/híbrido de la presente invención proporciona proporciones de tipo glicana mucho más rápido con mucho menos esfuerzo del operador. En particular, la invención proporciona un método para detectar y/o cuantificar el alto contenido de mañosa de una glicoproteína en una muestra o una composición que comprende la glicoproteína, el método comprende someter a la muestra o la composición que comprende la glicoproteína a una digestión de endoglicosilasa, reducir las glicoproteínas reducidas utilizando un agente reductor (si se requiere) para separar las glicoproteínas digeridas mediante electroforesis de desnaturalización mediante el cual se determina la proporción de alto contenido de manosa/glicana tipo híbrido al restar la fracción de cadena pesada sin glicosilar (fracción pico sin tratamiento de endoglicosidasa) de la fracción de cadena pesada des-glicosilada (pico en seguida de la digestión de endoglicosidasa) . La fracción de cadena pesada sin glicosilar o la fracción pico sin tratamiento de endoglicosidasa es generada al someter la misma muestra o composición a la misma condición de digestión, excepto que ninguna endoglicosidasa está presente en la misma. Esta etapa se puede llevar a cabo concurrentemente con o separadamente de la etapa de digestión de endoglicosidasa. Cualesquier endoglicosidasas que escinden selectivamente as glicanas de alto contenido de mañosa e híbridas entre GlcNAcl y GlcNAc2 sobre la glicana central (o generación de glicanas cortas en la proteína) , en tanto que dejan las glicanas N-enlazadas complejas intactas puede ser usado en esta invención. Para la cuantificación apropiada, la endoglicosidasa no debe estar en cantidades limitantes. La condición específica para llevar a cabo la digestión de endoglicosidasa, incluyendo la concentración de la enzima, la temperatura de incubación y tiempo de digestión, depende del tipo de endoglicosidasa usada. Ejemplos de endoglicosidasas relacionadas con esta invención incluyen pero no están limitadas a endoglicosidasa H y endoglicosidasa Fl . En una modalidad de la presente invención, la muestra que comprende las glicoproteínas es tratada con Endoglicosidasa H a 37 °C durante aproximadamente 2 horas, reducida con ß-mercaptoetanol y sometida a análisis de CE-SDS. Métodos ejemplares para separar las glicoproteínas des-glicosiladas, por ejemplo, anticuerpo desglicosilado, de las glicoproteínas glicosiladas, por ejemplo, anticuerpo glicosilado, incluyen pero no están limitados a los siguientes dos métodos : 1) CE-SDS bajo condiciones reductoras . La glicoproteína glicosilada, por ejemplo un anticuerpo, es desnaturalizada con SDS y un agente reductor y la cadena pesada (HC) de la misma con la glicana es separada de la HC escindida (HC desglicosilada) mediante electroforesis capilar-SDS (CE-SDS) . Un electroferograma es generado de la señal de UV. Las áreas bajo los picos son proporcionales a las cantidades relativas. Por consiguiente, la cantidad de tipo de alto contenido de mañosa/híbrido es determinada de la fracción que se eluye en la posición HC des-glicosilada anterior. Puesto que la GlcNAc-HC co-migra con la HC desglicosilada, el por ciento de HC desglicosilada de una muestra sin ser sometida a dilución es restada del pre-pico de una muestra sometida a digestión para producir el valor de por ciento de alto contenido de mañosa. La separación requiere 15-30 minutos, dependiendo de la configuración. 2) CE-SDS a base de microfluido. La glicoproteína es desnaturalizada como en 1) pero separada o "laboratorio en un chip", tal como el LC90 por Caliper. El mismo principio es usado en el análisis y la separación, aunque se usa un tinte fluorescente para detectar la proteína. El tiempo de separación es reducido a aproximadamente 30 segundos por análisis y se pueden tomar muestras de una placa de microtítulo. El método de la presente invención como se describe anteriormente puede ser efectuado sobre proteína purificada pero también sobre muestras de cultivo de células crudas. Con anticuerpos recombinantes, la señal es suficientemente fuerte de tal manera que no se requiere la purificación. En ciertas modalidades, glicoproteínas que tienen más de cuatro residuos de mañosa incluyen glicoproteínas que tienen 5 a 9 residuos de mañosa (esto es, especies M5-M9) . Sin desear estar limitado por una teoría particular, aquel de habilidad ordinaria en el arte entenderá que una composición de glicoproteína expresada por una célula huésped incluye glicoproteínas con un número variable de residuos de mañosa. Por ejemplo, las glicoproteínas de bajo contenido de mañosa tienen cuatro o menos de cuatro residuos de mañosa (por ejemplo, 0-4 residuos de mañosa) y las glicoproteínas de alto contenido de mañosa tienen más de cuatro residuos de mañosa (por ejemplo, especie M5 o superior) . En una modalidad particular de la invención, una glicoproteína que tiene bajo contenido de mañosa es un anticuerpo recombinante o un enlace de antígeno del mismo. En otra modalidad particular de la invención, una glicoproteína recombinante que tiene bajo contenido de mañosa es un anticuerpo monoclonal de humano que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo. El término "sustancialmente libre", como se usa en la presente, se refiere en general a preparaciones de un medio de cultivo celular que está libre o tiene una cantidad reducida (esto es, en relación con los medios de cultivo sin modificar) de ciertos componentes. Por ejemplo, en una modalidad, el medio de cultivo usado para producir glicoproteínas recombinantes que tienen bajo contenido de mañosa está sustancialmente libre de ciertos aminoácidos (por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de alanina, arginina, ácido aspártico y acido glutámico) . En algunas modalidades, un medio de cultivo sustancialmente libre de uno o más componentes es modificado para incluir menos de aproximadamente 1% o menos de aproximadamente 3% o menos de aproximadamente 5% o menos de aproximadamente 10% de uno o más de tales componentes en relación con el medio de cultivo sin modificar. Los términos "IL-15", "antígeno IL-15" e "interieucina 15" son usados intercambiablemente en la presente e incluyen cualesquier variantes o isoformas que son expresadas naturalmente por células. El término "anticuerpo" como se hace referencia en la presente incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de enlace de antígeno (esto es, "porción de enlace de antígeno") o una sola cadena del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro o una porción de enlace de antígeno del mismo. Cada cadena pesada consiste de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consiste de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera consiste de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste de un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden ser subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones que determinan la complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, arregladas de término amino a término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden moderar el enlace de la inmunoglobulina a tejidos o factores huéspedes, en las que se incluyen varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Los términos "porción de enlace de antígeno" y "fragmento de enlace de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que se enlaza selectivamente a un antígeno (por ejemplo, IL-15) . Se ha demostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo puede ser efectuada por fragmentos de un anticuerpo de plena longitud. Ejemplos de fragmentos de enlace de antígeno abarcados en el término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen (1) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL/ VH, Cl y CH1; (ii) un fragmento de F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de engozne; (iii) un fragmento de Fd que consiste de los dominios de VH y CH1; (iv) un fragmento de Fv que consiste de los dominios de VH y VL de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento de dAb, ( ard et al . , Nature 341: 544-546 (1989) ) , que consiste de un dominio de VH y (vi) una región que determina la complementariedad aislada (CDR) o (vii) una combinación de dos o más CDR aisladas que pueden opcionalmente estar unidas por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH son codificados por genes separados, pueden ser unidos utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite que se elaboren como una cadena de proteína individual a la cual VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv) ; véase por ejemplo, Brid et al . Science 242: 423-426 (1988); y Huston et al . Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883 (1988). Tales anticuerpos de una sola cadena también pretenden ser abarcados en los términos "porción de enlace de antígeno" y "fragmento de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos son obtenidos utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos de habilidad en el arte y los fragmentos son seleccionados en cuanto a utilidad de la misma manera como los anticuerpos intactos. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que muestra una sola especificidad y afinidad de enlace por un epítopo particular. Así, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que muestra una sola especificidad de enlace y que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea celular humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada . El término "anticuerpo humano recombinante" , como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón9 que es transgénico o transcromosomal para genes de inmunoglobulina humanos o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humana recombinante, combinatorial y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualesquier otros medios que nutran el empalme de secuencias de gen de inmunoglobulina humanas a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vi tro (o cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y V de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, en tanto que son derivadas de y relacionadas con secuencias de VH y VL de línea celular humana, pueden no existir de manera natural en el repertorio de línea celular de anticuerpo humano in vivo. Como se usa en la presente, un "anticuerpo heterólogo" es definido en relación con el organismo no humano transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico de codificación correspondiente a silla encontrada en un organismo no consistente del animal no humano transgénico y en general de una especie diferente a aquella del animal no humano transgénico.

Un "anticuerpo aislado" como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades de antígeno (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a IL-15 está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlazan específicamente a antígenos diferentes a IL-15) . Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un epítopo de IL-15 puede sin embargo tener reactividad cruzada con otras citocinas relacionadas u otras proteínas de IL-15 de especies diferentes. Sin embargo, el anticuerpo siempre se enlaza preferiblemente a IL-15 humana. Además, un anticuerpo aislado está comúnmente libre sustancialmente de otro material celular y/o compuesto químico. En una modalidad particular, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen diferentes especificidades de IL-15 son combinados en una composición bien definida. Como se usa en la presente, "enlace específico", "enlace selectivo" y "enlace selectivamente" , se refieren a un anticuerpo o fragmento del mismo, que se enlaza a un antígeno predeterminado. Por ejemplo, en una modalidad, el anticuerpo se enlaza con una afinidad (KD) de aproximadamente menos de 10~7 M, tal como aproximadamente menos de 10"8 M, 10"9 M o 10"10 M o aún más baja cuando se determina mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 utilizando IL-15 humana recombinante como el analito y el anticuerpo como el ligando y se enlaza al antígeno predeterminado con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor que su afinidad por el enlace a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente al antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico con un antígeno" son usados intercambiablemente en la presente con el término "un anticuerpo que se enlaza selectivamente a un antígeno" . El término "KD" , como se usa en la presente, se propone referirse a la constante en equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) que es codificada por genes de región constante de cadena pesada. Como se usa en la presente, "conmutación de isotipo" se refiere al fenómeno mediante el cual la clase o isotipo de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig. Como se usa en la presente, "isotipo no conmutado" se refiere a la clase isotípica de cadena pesada que es producida cuando no toma lugar ninguna conmutación de isotipo; el gen de CH que codifica el isotipo no conmutado es comúnmente el primer gen CH inmediatamente corriente abajo del gen VDJ rearreglado funcionalmente. La conmutación de isotipo ha sido clasificada como conmutación de isotipo clásica o no clásica. La conmutación de isotipo clásica ocurre mediante eventos de regeneración que involucran por lo menos una región de secuencia de conmutación en el transgen. La conmutación de isotipos no clásica puede ocurrir, por ejemplo, mediante recombinación homologa entre sµ humano y ?µ humano (cancelación d-asociada) . Mecanismos de conmutación no clásicos alternativos, tales como recombinación de intertransgen y/o intercromosomal , entre otros, pueden ocurrir y efectuar la conmutación de isotipos. Como se usa en la presente, el término "secuencia de conmutación" se refiere a aquellas secuencias de ADN reforzabbles por la combinación de conmutación. Una secuencia "donadora de conmutación" comúnmente una región de conmutación µ, estará 5' (esto es, corriente arriba) de la región del constructo a ser cancelada mediante la recombinación de conmutación. La región de "aceptoras de conmutación" estará entre la región de constructo a la región cancelada y la región constante de reemplazo (por ejemplo, ?, e, etc.). Ya que no hay ningún sitio específico en donde la recombinación siempre ocurre, la secuencia de gen final comúnmente no será predecible del constructo. Como se usa en la presente, "patrón de glicosilación" es definido como el patrón de unidades de carbohidrato que están anexadas covalentemente a una proteína, más específicamente a una proteína de inmunoglobulina. Un patrón de glicosilación de un anticuerpo heterólogo puede ser caracterizado por ser sustancialmente similar a patrones de glicosilación que se presentan naturalmente sobre anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando aquel de habilidad ordinaria en el arte reconocería el patrón de glicosilación del anticuerpo heterólogo como siendo más similar al patrón de glicosilación en la especie del animal transgénico no humano que a la especie de la cual los genes CH del transgen fueron derivados. El término "que se presenta de manera estable en la naturaleza" como se usa en la presente, tal como es aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislada de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio se presenta de manera estable en la naturaleza. El término "rearreglado" como se usa en la presente se refiere a una configuración de un sitio de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera, en donde un segmento V está colocado inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio de VH o VL completo, respectivamente. Un sitio de gen de inmunoglobulina rearreglado puede ser identificado por comparación al ADN de línea germinal; un sitio rearreglado tendrá por lo menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado. El término "sin arreglar" o "configuración de línea germinal" como se usa en la presente en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no está recombinado para estar inmediatamente adyacente a un segmento D o J. El término "molécula de ácido nucleico" como se usa en la presente, se refiere a moléculas de ADN y ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra. El término "molécula de ácido nucleico aislada" como se usa en la presente, con referencia a ácidos nucleicos que cosifican anticuerpos o porciones de anticuerpos (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se enlazan selectivamente a IL-15, se refieren a una molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se enlazan a antígenos diferentes a IL-15, con otras secuencias que pueden flanquear de manera natural el ácido nucleico en ADN genómico humano. Las SEQ ID Nos: 1-4 corresponden a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que comprenden las regiones de cadena pesada (VH) y de cadena ligera (VL) de un anticuerpo anti-IL- 15 humano. En particular, SEQ ID NO: 1 y 2 corresponden a la VH del anticuerpo y la SEQ ID NO: 3 y 4 corresponden a la V del anticuerpo. En una modalidad particular, un anticuerpo monoclonal humano que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, incluye una región variable de cadena ligera que comprende una o más y preferiblemente todas las tres CDR resumidas en SEQ ID Nos: 8-10 y una región variable de cadena pesada que comprende una o más y preferiblemente todas las tres CDR resumidas en SEQ ID Nos: 5-7. En una modalidad particular, la presente invención también abarca "modificaciones de secuencias conservadoras" o "sustituciones de secuencias conservadoras" de las secuencias resumidas en SEQ ID Nos: 1-10, esto es, modificaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de enlace del anticuerpo modificado por la secuencia de nucleótidos o que contienen la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones de secuencias conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y cancelaciones de aminoácidos. Las modificaciones pueden ser introducidas a SEQ ID Nos: 1-10 mediante técnicas estándar conocidas en el arte, tal como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis PCR-moderada . Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámuico) , cadenas laterales polares sin cargar (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales ß-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-IL- 15 humano es reemplazado preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación de anticuerpo anti-IL-15, tal como mediante mutagénesis de saturación y los anticuerpos anti-IL-15 modificados resultantes pueden ser seleccionados en cuanto actividad de enlace. Así, los anticuerpos codificados por las secuencias de nucleótidos (región variable de cadena pesada y ligera) revelados en la presente y/o que contienen las secuencias de aminoácidos (región variable de cadena pesada y ligera) reveladas en la presente (esto es, SEQ ID Nos: 1-4) incluyen anticuerpos sustancialmente similares codificados por o que contienen secuencias similares que han sido modificadas conservadoramente . Discusión adicional en cuanto a cómo tales anticuerpos sustancialmente similares pueden ser generados en base a las secuencias parciales) esto es, regiones variables de cadena pesada y ligera) reveladas en la presente como SEQ IS Nos. 1-4 se proporciona posteriormente en la presente. Para ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos o secuencias designadas de los mismos, cuando son alineadas y comparadas óptimamente, son idénticas con inserciones o cancelaciones de nucleótidos apropiadas, en por lo menos 80% de los nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 90% a 95% y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 98% a 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos se hibridizarán bajo condiciones de hibridización selectiva, al complemento de la hebra. Para secuencias de aminoácidos, el término "homología" indica el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos cuando son alineadas óptimamente y comparadas con inserciones o cancelaciones apropiadas. El por ciento de identidad entre dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es, % de homología # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que necesita ser introducido para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de por ciento de identidad entre dos secuencias pueden ser efectuadas utilizando un algoritmo matemático. El por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinado utilizando el programa GAP en el paquete de elementos de programación GCG (disponible en htt : //www.gcg . com) , utilizando una matriz de N Sgadpina . CMP y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede también ser determinado utilizando el algoritmo de E. Meyers y . Millar (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que ha sido incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4. Además, el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado utilizando el algoritmo de Needleman y unsch (J. Mol. Biol. (48) : 444-453 (1970) ) que ha sido incorporado al programa de GAP en el paquete de elementos de programación de GCG (disponible en http: //www. gcg . com) , utilizando ya sea una matriz de Blossum 62 o una matriz de PAM250 y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención pueden ser usadas adicionalmente como una "secuencia de interrogación" para efectuar una búsqueda contra bases de datos públicas para por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden ser efectuadas utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al . J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990). Búsquedas de nucleótidos de BLAST pueden ser efectuadas con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Búsquedas de proteínas BLAST pueden ser efectuadas con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con espacio por propósitos de comparación, se puede utilizar VLAST con espacios como se describe en Altschul et al . , Nucleic Acid Res. 25(17): 3389-3402 (1997). Se utilizan los programas BLAST y BLAST con espacio, los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden ser usados. (Véase http : //www . ncbi . nlm. nih . gov) . Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un listado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "sustancialmente puro" cuando es purificado de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándar, en las que se incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl , cromatografía en columna, electroforesis de gel de azarosa y otras bien conocidas en el arte. Véase, F. Ausubel, et al . ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987) . Las composiciones de ácidos nucleicos de la presente invención, en tanto que frecuentemente en una secuencia natural (excepto por sitios de restricción modificados y los semejantes) ya sea de ADNc, ADN genómico o mezclas de los mismos pueden ser mutadas, de acuerdo con técnicas estándar para proporcionar secuencias genéticas. Para secuencias de codificación, estas mutaciones pueden afectar las secuencias de aminoácidos como se desee. En particular, secuencias de ADN sustancialmente homologas a o derivadas de V, D, J naturales, constantes, conmutaciones y otras secuencias descritas en la presente son contempladas (en donde "derivado" indica que una secuencia es idéntica o modificada de otra secuencia) . Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando es colocado en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o mejorador está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a secuencias reguladoras de transcripción, enlazado operativamente significa que las secuencias de ADN son enlazadas son contiguas y en donde si es necesario, para unir dos regiones de purificación de proteínas, contiguas y en cuadros de lectura. Para las secuencias de conmutación, enlazado operativamente indica que las secuencias son capaces de efectuar la recombinación de conmutación. El término "vector", como es usado en la presente, se propone referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido" , que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular al cual segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped a la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) pueden ser integrados al genoma de una célula huésped después de su introducción a la célula huésped y mediante esto son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. Tales vectores son denominados en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión y utilidad en técnicas de ADN recombinantes están frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden ser usados intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la presente invención se propone incluir otras de tales formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados) que sirven para funciones equivalentes. Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser usados para tratar un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, tal como artritis, por ejemplo, artritis reumatoide. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Varios aspectos de la invención son descritos en detalle adicional en las siguientes subsecciones .

II . Factores que afectan el contenido de mañosa (a) Osmolalidad Varios parámetros de cultivo celular pueden afectar el contenido de mañosa de una glicoproteína recombinante expresada en cultivo celular mamífero. En particular, se descubrió que por medio de la presente invención mientras más alta es la osmolalidad del medio de cultivo celular, más alto es el porcentaje de glicoproteínas en la composición que tiene más de cuatro residuos de mañosa (esto es, especie M5 o superior) . Así, en una modalidad de la presente invención, la osmolalidad del medio de cultivo celular es mantenida a menos de aproximadamente 600 mOsm/Kg para reducir o controlar el contenido de mañosa de glicoproteína expresada (por ejemplo, aproximadamente 250 mOsm/Kg a aproximadamente 600 mOsm/Kg) . Para el cultivo celular mamífero, la osmolalidad del medio de cultivo celular es mantenida a menos de aproximadamente 550 mOsm/Kg o a menos de aproximadamente 500 mOsm/Kg o a menos de aproximadamente 450 mOsm/Kg o a menos de aproximadamente 400 mOsm/Kg o a menos de aproximadamente 380 mOsm/Kg o entre aproximadamente 200 mOsm/Kg y aproximadamente 600 mOsm/Kg, o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg y aproximadamente 550 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg y aproximadamente 500 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg y aproximadamente 450 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg y aproximadamente 400 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg y aproximadamente 380 mOsm/Kg o entre aproximadamente 250 mOsm/Kg y aproximadamente 350 mOsm/Kg. Con el fin de obtener una osmolalidad en el intervalo deseado, la concentración de varios constituyentes en el medio de cultivo puede ser ajustada. Por ejemplo, solutos que pueden ser agregados al medio de cultivo para incrementar la osmolalidad del mismo incluyen proteínas, péptidos, aminoácidos, proteínas animales hidrolizadas tal como peptonas, polímeros no metabolizados, vitaminas, iones, sales, azúcares, metabolitos, ácidos orgánicos, lípidos y los semejantes. Sin embargo, se apreciará que la(s) concentración (es) de otros constituyentes en el medio de cultivo puede (n) ser modificada (s) con el fin de obtener una osmolalidad deseada. En otras modalidades, la osmolalidad puede ser ajustada a los intervalos mencionados anteriormente al agregar uno o más osmoprotectores al medio de cultivo. Osmoprotectores ejemplares son bien conocidos en el arte e incluyen pero no están limitados a betaína, glicina, L-treonina, L-prolina y derivados de los mismos en los que se incluyen pero no limitados a glicina betaína, betaína aldehido. En una modalidad particular, un medio de cultivo celular contiene betaína a una concentración de aproximadamente 20 mM o mayor o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM y más preferiblemente alrededor de 20 mM a aproximadamente 30 mM.

La osmolalidad puede ser medida mediante cualquiera de los medios que son bien conocidos en el arte y aquellos descritos en la presente. Por ejemplo, un osmómetro tal como es vendido por Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, bajo el nombre de marca OSMETTE puede ser usado para medir la osmolalidad de un medio de cultivo celular. Alternativamente, se puede usar el Osmette Modelo 2007 (Precisión Systems, Inc., Natick, MA) . En otras modalidades de la invención, la osmolalidad puede ser ajustada al modificar la concentración de una o más sales, azúcares, peptona, aminoácidos y amonio en el medio de cultivo celular. En todavía otras modalidades, los parámetros mencionados anteriormente que afectan la osmolalidad pueden ser combinado con la manipulación de la temperatura y duración del tiempo que las células son cultivadas para modular el contenido de mañosa (por ejemplo, reducirlo) . Así, se debe entender que los varios parámetros de cultivo celular descritos en la presente pueden ser ajustados solos o en combinación para modular el contenido de mañosa de glicoproteínas recombinantes. (i) Concentraciones de potasio y sodio. En los experimentos que conducen a la presente invención, se demostró que un incremento en la concentración de potasio (K+) en el medio de cultivo contribuye al alto contenido de mañosa de las glicoproteínas. Así, en una modalidad, la invención emplea un medio de cultivo que tiene una concentración de K+ de aproximadamente 20 mM o menor (por ejemplo a aproximadamente 10 mM o aproximadamente 50 mM) . Como se discute anteriormente, la concentración de potasio del medio de cultivo celular solo puede ser controlada o puede ser controlada en combinación con uno o más de los otros factores descritos en la presente que afectan la osmolalidad. En una modalidad particular, el medio de cultivo incluye además una concentración de sodio de aproximadamente 200 mM o menor (por ejemplo, a aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM) . (ii) Aminoácidos Otros factores que se descubrió que afectan la osmolalidad del medio de cultivo celular y/o contribuyen al alto contenido de mañosa de proteínas expresadas recombinantemente son la concentración y tipo de aminoácidos en el medio. Por ejemplo, en una modalidad particular, la duplicación de la concentración de todos los 20 aminoácidos en el medio da como resultado un incremento en el contenido de mañosa. Así, en una modalidad particular de la presente invención, el medio de cultivo celular es ajustado para tener una concentración de aminoácido reducida. En un medio particular, la concentración de aminoácido es reducida por aproximadamente la mitad.

En otra modalidad particular, el medio de cultivo celular está sustancialmente libre de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de alanina, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico. (iii) Azúcares Otros factores que se descubrió que afectan la osmolalidad del medio de cultivo celular y/o contribuyen al alto contenido de mañosa de proteínas expresadas recombinantemente son la concentración y tipo de azúcares en el medio. En una modalidad particular, el medio de cultivo celular incluye glucosa a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 90 mM. (iv) Amonio Otro factor que puede afectar la osmolalidad del medio de cultivo celular y/o contribuir al alto contenido de mañosa de proteínas expresadas recombinantemente es la concentración de amonio de aproximadamente 30 mM o menor (por ejemplo a aproximadamente 0 mM a aproximadamente 10 mM) . En una modalidad, la concentración de amonio es de aproximadamente 10 mM o menor . (v) Peptonas Otros factores que se descubrió que afectan la osmolalidad del medio de cultivo celular y/o contribuyen al alto contenido de mañosa de proteínas expresadas recombinantemente son la concentración y tipo de peptonas usadas en el medio. Las peptonas son complementos de medio que son producidos a partir de proteínas animales hidrolizadas. Las fuentes de peptona son bien conocidas en el arte e incluyen por ejemplo productos secundarios de animales, gelatinas y materiales de plantas. Peptonas ejemplares incluyen pero no están limitadas a extracto de levadura, levadura hidrolizada, peptonas ejemplares incluyen pero no están limitadas a extracto de levadura, levadura hidrolizada, peptona de sodio, hidrolizado de sodio, peptona de trigo e hidrolizado de trigo a una concentración de aproximadamente 0.5 g/1 a aproximadamente 160 g/1. (vi) Vitaminas Otros factores que se descubrió que afectan la osmolalidad del medio de cultivo celular y/o contribuyen al alto contenido de mañosa de proteínas expresadas recombinantemente son la concentración y tipo de vitaminas usadas en el medio. En una modalidad particular, el medio de cultivo celular incluye una o más vitaminas seleccionadas del grupo que consiste de biotina, D-calcio, pantotenato, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, piridoxal HCl, piridoxina HCl, riboflavina, tiamina HCl, cianocobalamina a una concentración de aproximadamente 0.00005 g/1 a aproximadamente 0.9 g/1. (b) Temperatura Otro factor que fue descubierto que contribuye al alto contenido de mañosa de proteínas expresadas recombinantemente es la temperatura a la cual el cultivo celular es mantenido. Así, en otra modalidad de la presente invención, la temperatura a la cual las células huésped son cultivadas es también ajustada sola o en combinación con los factores anteriores (por ejemplo, ajuste de la sincronización de cultivo celular y factores que afectan la osmolalidad) para modular (por ejemplo, reducir) el contenido de mañosa de glicoproteínas expresadas recombinantemente. En ciertas modalidades, las células huéspedes son cultivadas a aproximadamente 31°C o a aproximadamente 32 °C o a aproximadamente 33 °C o a aproximadamente 34 °C o a aproximadamente 35°C o a aproximadamente 36°C o a aproximadamente 37°C o a aproximadamente 38°C.

III. Procedimientos de cultivo celular De acuerdo con los métodos de la presente invención, las células huésped son cultivadas en un medio que permite la expresión de glicoproteínas recombinantes que tienen bajo contenido de mañosa. Procedimientos de cultivo celular y condiciones apropiadas son bien conocidos en al arte. Células huésped (por ejemplo células CHO y NSO) pueden ser cultivadas en una amplia variedad de formatos y recipientes de cultivo. Por ejemplo, las células huésped pueden ser cultivadas en formatos diseñados para la producción a gran escala o pequeña escala de glicoproteínas. Adicionalmente, las células huésped pueden ser cultivadas adherentes al fondo de matraces de cultivo o cajas o pueden estar en suspensión en matraces agitados, bioreactores o en cultivos de botella de rodillos. En ciertas modalidades, para producción de glicoproteínas recombinantes en cantidades comercialmente relevantes, las células huésped pueden ser cultivadas en bioreactores y preferentemente bioreactores que tienen una capacidad de aproximadamente 2 litros o más o aproximadamente 5 litros o más o aproximadamente 10 litros o más o aproximadamente 50 litros o más o aproximadamente 100 litros o más o aproximadamente 500 litros o más o aproximadamente 1000 litros o más o aproximadamente 1500 litros o más o aproximadamente 2000 litros o más . En ciertas modalidades, las células huésped pueden ser cultivadas (por ejemplo mantenidas y/o cultivadas) en medios líquidos y preferiblemente son cultivadas ya sea continua o intermitentemente, mediante métodos de cultivo convencionales tales como cultivo vertical, cultivo de tubo de ensayo, cultivo de agitación (por ejemplo, cultivo de agitación rotativo, cultivo de matraz de agitación, etc.), cultivo de espiner de aireación o fermentación. En ciertas modalidades, las células huésped son cultivadas en matraces de agitación. En todavía otras modalidades, las células huésped son cultivadas en un fermentador (por ejemplo, en un proceso de fermentación) . Los procesos de fermentación incluyen pero están limitados a métodos de fermentación por lotes, alimentación-lote y continua. Los términos "proceso por lotes" y "fermentación por lotes" se refieren a un sistema cerrado en el cual la composición de los medios, nutrientes, aditivos complementarios y los semejantes son ajustados al comienzo de la fermentación y no sometidos a alteración durante la fermentación; sin embargo, se han hecho intentos para controlar factores tales como el pH y concentración de oxígeno para impedir la acidificación en exceso del medio y/o muerte de microorganismos. Los términos "proceso de alimentación-lotes" y fermentación de "alimentación-lotes" se refieren a una fermentación por lotes la excepción de que una o más sustituidas o complementos son agregados (esto es, agregados en incrementos o continuamente) o las condiciones de cultivo celular son cambiadas a medida que la fermentación avanza. Los términos "proceso continuo" y "fermentación continua" se refieren a un sistema en el cual un medio de fermentación definido es agregado continuamente a un fermentador y una cantidad igual de medios usados o "acondicionados" son removidos simultáneamente, por ejemplo para la recuperación del producto deseado (por ejemplo, glicoproteína recombinante) . Una variedad de tales procesos han sido desarrollados y son bien conocidos en el arte. En una modalidad particular, una célula huésped que expresa un anticuerpo monoclonal humano recombinante que se enlaza a IL-15 es cultivado en botellas de rodillo, matraces de espiner de 2 litros y cualquier otro sistema de cultivo apropiado .

IV. Recuperación de glicoproteína Enseguida de la fase de producción de polipéptido, la proteína recombinante de interés puede ser recuperada del medio de cultivo utilizando técnicas que son bien establecidas en el arte. La glicoproteína de interés es recuperada preferiblemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque puede también ser recuperada del lisado de célula huésped. En ciertas modalidades, el medio de cultivo o lisado es centrifugado para remover los desechos celulares en partículas. Después de esto, la glicoproteína es purificada de proteínas solubles contaminantes y polipéptidos utilizando procedimientos de purificación apropiados. Procedimientos de purificación apropiados incluyen pero no están limitados a fraccionamiento o inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración en gel utilizando por ejemplo Sephadex G-75 y columnas de Sefarosa proteína A para remover contaminantes tales como IgG. Un inhibidor de proteasa tal como fenil metil sulfonil fluoruro (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación. Aquel experimentado en el arte apreciará que métodos de métodos de purificación apropiados para la glicoproteína recombinante de interés pueden requerir modificación para tomar en cuenta cambios en el carácter de la glicoproteína después de expresión en cultivo celular recombinante. En una modalidad particular de la presente invención, una glicoproteína recombinante expresada utilizando los métodos de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano o fragmento de enlace de antígeno del mismo. En general, los cuerpos son caracterizados inicialmente mediante ELISA. Por ejemplo, placas de microtítulo pueden ser recubiertas con antígeno purificado, tal como por ejemplo IL-15 en PBS y luego bloqueadas con proteínas irrelevantes tales como albúmina de suero bovino (BSA) diluida en PBS. Diluciones de extracto de células cultivadas son agregadas a cada cavidad e incubadas durante 1-2 horas a 37°C. Las placas son lavadas con PBS/Tween 20 y luego incubadas con un reactivo policlonal Fc-específico de IgG de cabra anti-humano conjugado a fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después de lavado, las placas son reveladas con sustrato de ABTS y analizadas a OD de 405. Para determinar si los anticuerpos producidos mediante los métodos de la presente invención se enlazan a epítopos únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado utilizando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL) . El enlace de MAb biotinilado puede ser detectado con una sonda marcada con estreptavidina. Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, ELISA de isotipo pueden ser efectuadas utilizando técnicas reconocidas en el arte. Por ejemplo, las cavidades de placas de microtítulo pueden ser recubiertas con 10 µg/ml de Ig anti-humana durante toda la noche a 4°C. Después del bloqueo con BSA al 5%, las placas se hacen reaccionar con 10 µg/ml de anticuerpos de controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego las cavidades pueden hacer reaccionar ya sea con ++++ humano u otras sondas conjugadas específicas de isotipo humanas. Las placas son reveladas y analizadas como se describe anteriormente . En una modalidad particular, una glicoproteína recombinante producida utilizando los métodos de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno de la misma. Para probar el enlace de anticuerpos monoclonales IL-15 a células vivas que expresan IL-15, se puede usar citometría de flujo.

Brevemente, líneas celulares y/o PBMC humanas que expresan IL-15 enlazada a membrana (cultivada bajo condiciones de cultivo estándar) son mezcladas con varias concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene BSA al 0.1% y NaN3 al 0.01% a 4°C durante 1 hora. Después de lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo IgG anti-humano fluoresceína-marcado bajo las mismas condiciones como el teñido de anticuerpo primario. Las muestras pueden ser analizadas mediante un instrumento FACScan utilizando luz y propiedades de dispersión lateral para someter a compuerta en células individuales y el enlace de los anticuerpos marcados es determinado, un análisis alternativo utilizando microscopia fluorescente puede ser usado (además de o en lugar de) el análisis de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas exactamente como se describe anteriormente y examinadas mediante microscopia de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno. Las IgG humanas anti-IL- 15 pueden ser probadas adicionalmente en cuanto a reactividad con el antígeno de IL-15 mediante Western blot. Brevemente, extractos celulares de células huésped que expresan IL-15 pueden ser preparados y sometidos a electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados serán transferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados con suero de ratón al 20% y probadas con anticuerpos monoclonales a ser probados. El enlace de IgG humano puede ser detectado utilizando fosfatasa alcalina de IgG anti-humana y revelada con tabletas de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St . Louis, MO) .

V. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica que contiene una o una combinación de proteína recombinantes que tienen bajo contenido de mañosa. En una modalidad particular, la composición farmacéutica incluye por lo menos una proteína terapéutica que tiene bajo contenido de mañosa tal como por ejemplo un anticuerpo terapéutico o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene bajo contenido de mañosa (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo) . En otra modalidad particular, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una o más glicoproteínas recombinantes que tienen bajo contenido de mañosa, formulada junto con un portador aceptable farmacéuticamente. Composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser administradas en terapia de combinación, esto es, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente invención con por lo menos uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como agentes antiinflamatorios, DMARD (fármacos anti-reumáticos modificadores de enfermedad) , agentes inmunosupresores, quimioterapéuticos y agentes de psoriasis. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden también ser administradas en conjunción con terapia de radiación. La co-administración con otros anticuerpos, tales como anticuerpos específicos de CD4 y anticuerpos específicos IL-2, también son abarcadas por la invención. Tales combinaciones con anticuerpos CD4 específicos o anticuerpos IL-2 específicos son consideradas particularmente útiles para el tratamiento de enfermedad autoinmunes y rechazo de trasplante. Como se usa en la presente "portador aceptable farmacéuticamente" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agente antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y agentes que retardan la absorción y los semejantes que son compatibles fisiológicamente. Preferiblemente, el portador es apropiado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión) . Dependiendo de las rutas de administración, la glicoproteína recombinante, por ejemplo un anticuerpo, molécula bisespecífica y multiespecífica, puede ser recubierto en un material para proteger el compuesto de la ácido de acciones y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. Una "sal aceptable farmacéuticamente" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico indeseable (véase por ejemplo Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977)). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y los semejantes, también como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y los semejantes. Las sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y los semejantes, también como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N' -dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y los semejantes. Una composición de la presente invención puede ser administrada mediante una variedad de métodos conocidos en el arte. Como se apreciará por el técnico experimentado, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden ser preparados con portadores que protegerán al compuesto contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, en los que se incluyen implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biodegradables, biocompatibles, pueden ser usados, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son en general conocidos para aquellos experimentados en el arte. Véase, por ejemplo Sustained and Controlled Reíase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc. Nueva York, 1978. Para administrar un compuesto de la invención mediante ciertas rutas de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con o co-administrar el compuesto con un material para impedir su desactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo liposomas o un diluyente. Diluyentes aceptables farmacéuticamente incluyen soluciones salinas y soluciones reguladoras del pH acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones de CGF de agua en aceite en agua también como liposomas convencionales (Stejan et al., J. Neuroimmunol . 7:27 (1984) ) . Los portadores aceptables farmacéuticamente incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de tales medios y agentes como sustancias farmacéuticamente activas es conocido en el arte. Excepto que como a cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención es contemplado. Compuestos activos complementarios pueden también ser incorporados a las composiciones. Las composiciones terapéuticas comúnmente deben ser estriles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada apropiada para una alta concentración del fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser efectuada al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser incorporadas al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por microfiltración de esterilización. En general, las dispersiones son preparadas al incorporar el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la proporción de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril de la misma. Los regímenes de dosificación son ajustados para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un solo bolo puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas en el tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada proporcionalmente como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos humanos de la invención pueden ser administrados una vez o dos veces a la semana mediante inyección subcutánea o una vez o dos veces mensualmente mediante inyección subcutánea. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación por facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas apropiadas como dosificaciones unitarias para los objetos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención son determinadas por y directamente dependientes de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a ser obtenido y (b) las alimentaciones inherentes en el arte de combinación de tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Ejemplos de antioxidantes aceptables farmacéuticamente incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, disulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y los semejantes; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (VHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y los semejantes y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y los semejantes . Para las composiciones terapéuticas, formulaciones de la presente invención incluyen aquellas apropiadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o administración parenteral. Las formulaciones pueden convenientemente ser presentadas en forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas mediante cualesquier métodos conocidos en el arte de farmacia. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con un material portador para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del sujeto que es tratado y el modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con un material portador para producir una sola forma de dosificación será en general aquella cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, de un 100%, esta cantidad fluctuará de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 90% de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 60%, más preferiblemente de alrededor de 0.01% a aproximadamente 30%. Las formulaciones de la presente invención que son apropiadas para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de atomización que contienen tales portadores como son conocidos en el arte como apropiados. Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de composiciones de esta invención incluyen polvos, atomizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede ser mezclado bajo condiciones estériles con un portador aceptable farmacéuticamente y con cualesquier conservadores, soluciones reguladoras del pH o propelentes que puedan ser requeridos. Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se usan en la presente significa modos de administración diferentes a administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e inyección e infusión intraesternal. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos apropiados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables, tales como foliato de etilo. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de surfactantes. Estas composiciones pueden también contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede ser asegurada tanto mediante procedimientos de estilización, supra, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo paraben, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y los semejantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y los semejantes a las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser efectuada mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando los compuestos de la presente invención son administrados como farmacéuticos a humanos y animales, pueden ser dados solos o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo 0.001 al 90% (más preferiblemente 0.005 al 70%, tal como 0.01 al 30%) de ingrediente activo en combinación con un portador aceptable farmacéuticamente. Sin consideración de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden ser usados en una forma hidratada apropiada y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, son formuladas en forma de dosificación aceptable farmacéuticamente mediante métodos convencionales conocidos para aquellos experimentados en el arte . Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden hacer variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para obtener la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxica al paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos en los que se incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que es empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que es tratado y factores semejantes bien conocidos en las artes médicas. El médico o veterinario que tenga habilidad ordinaria en el arte puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría empezar con dosis de los componentes de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos con el fin de obtener el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se obtiene el efecto deseado. En general, una dosis diaria apropiada de una composición de la invención será aquella cantidad del compuesto que es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva dependerá en general de los factores descritos anteriormente. Es preferido que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, administrada preferiblemente al sitio del objetivo. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede ser administrada como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas separadamente a intervalos apropiados en todo el día, opcionalmente en formas de dosificación unitarias. En tanto que es posible que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, es posible administrar el compuesto como una formación farmacéutica (composición) . Composiciones terapéuticas pueden ser administradas con dispositivos médicos conocidos en el arte. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede ser administrada con un dispositivo de inyección hipodérmico sin agujas, tales como los dispositivos revelados en las patentes estadounidenses Nos. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824 ó 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: patente estadounidense 4,487,603, que revela una bomba de micro-infusión implantable para surtir medicación a una velocidad controlada; patente estadounidense 4,486,194, que revela unido dispositivo terapéutico para la administración de medicamentos a través de la piel; patente estado 4,447,233, que revela una bomba de infusión de medicación para administración de medicación a una velocidad de infusión precisa; patente estadounidense 4,447,224, que revela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración de fármaco continua; patente estadounidense 4,439,196, que revela un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de multicámaras y patente estadounidense 4,475,196 que revela un sistema de administración de fármaco osmótico. Muchos de otros de tales implantes, sistemas de administración y módulos son conocidos para aquellos experimentados en el arte . En ciertas modalidades, las glicoproteínas terapéuticas de la presente invención pueden ser formuladas para asegurar la distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera de sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea) pueden ser formulados, por ejemplo en liposomas. Para métodos de manufactura de liposomas, véase por ejemplo patentes estadounidenses 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que son transportadas selectivamente a células u órganos específicos, mejoran así la administración de fármaco apuntada (véase por ejemplo V.V. Ranade J. Clin . Pharmacol . 29:685 (1989). Porciones de apuntamiento ejemplares incluyen foliato o biotina (véase por ejemplo patente estadounidense 5,416,016 expedida a Low et al.); Manósidos (Umezawa et al., Biochem. Biophys . Res . Commun . 153:1038 (1988)); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. FEBS Lett . 357:140 (1995); M. Owais et al., Antijiíicrob. Agents Chemother 39:180 (1995)); receptor de proteína A de surfactante (Briscoe et al., Am. ". Physiol . 1233:134 (1995)), diferentes especies de las cuales puede comprender las formulaciones de la invención, también como componentes de moléculas inventadas; pl20 (Schreier et al. J. Biol . Chem . 269:9090 (1994)); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen FEBS Lett . 346:123 (1994); J.J. Killion; I.J. idler Immunomethods 4:273 (1994). En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos de la presente invención son formulados en liposomas; en una modalidad más preferida, los liposomas incluyen una porción de apuntamiento. En una modalidad más preferida, los compuestos terapéuticos en los liposomas son administrados mediante inyección de bolo a un sitio próximo al tumor o infección. La composición debe ser fluida a la extensión que existe la capacidad de aplicación en jeringa fácil. Debe ser estable bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción de contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. En una modalidad adicional, una glicoproteína recombinante de la presente invención puede ser formulada para impedir o reducir el transporte a través de la placenta. Esto se puede hacer mediante métodos conocidos en el arte, por ejemplo mediante recubrimiento con PEG del anticuerpo o mediante el uso de fragmentos de F(ab)2'. Referencias adicionales se pueden hacer a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, riffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates" . Esto es particularmente relevante cuando la glicoproteína es un anticuerpo usado para el tratamiento o prevención de aborto espontáneo recurrente . Una "dosificación terapéuticamente efectiva" para artritis reumatoide dará como resultado preferiblemente una definición preliminar de mejora ACR20 en pacientes, más preferido en una definición preliminar de mejora ACR50 y aún más preferido en una definición preliminar de mejora de ARCD70. La definición preliminar de mejora ACR20 es definida como: =20% de mejora en: conteo de articulación tierna (TCJ) y conteo de articulación hinchada ++++ (SWJ) y =20% de mejora en tres de cinco determinaciones siguientes: determinación de dolor del paciente (VAS) , determinación global del paciente (VAS) , determinación global del médico (VAS) , dishabilidad autodeterminada del paciente (HAQ) , reactante de fase aguda (CRP o ESR) . ACR50 y ACR70 son definidos de la misma manera con =50% y =70% de mejoras, respectivamente. Para detalles adicionales véase Felson et al. en American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Theumatoid Arthiritis; Arthritis Rheumatism 38:727-735 (1995). La habilidad de un compuesto para inhibir cáncer puede ser evaluada en un sistema de modelo de animal predictivo de eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede ser evaluada al examinar la habilidad del compuesto para inhibir, tal inhibición in vitro mediante análisis conocidos para el práctico experimentado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o de otra manera mejorar síntomas en un sujeto. Aquel de habilidad ordinaria en el arte sería apto de determinar tales cantidades en base a factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto y la composición o ruta de administración particular seleccionadas . La habilidad de los anticuerpos para tratar o impedir psoriasis puede también ser evaluada de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte.

La composición debe ser estéril y fluida a la extensión que la composición es administrable mediante jeringa. Además de agua, el portador puede ser una solución salina de pH regulado isotónica, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y los semejantes) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo mediante el uso de recubrimiento tales como lecitina, por el mantenimiento de tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede ser efectuada al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina . Cuando el compuesto activo es protegido apropiadamente, como se describe anteriormente, el compuesto puede ser administrado oralmente, por ejemplo con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Otras modalidades de la presente invención son descritas en los siguientes ejemplos que no deben ser interpretados como limitantes adicionales. El contenido del listado de secuencias, figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en toda esta solicitud son incorporadas expresamente en la presente por referencia. EJEMPLOS En todos los ejemplos discutidos posteriormente en la presente, un anticuerpo monoclonal plenamente humano que se enlaza a IL-15 que tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 2 fue usada como una glicoproteína recombinante ejemplar (referida en los ejemplos como "glicoproteína recombinante ejemplar"). Sin embargo, sería claro para aquel de habilidad ordinaria en el arte que el contenido de mañosa de cualquier glicoproteína recombinante puede ser modulada, como se discute en la presente.

Ejemplo 1: La osmolalidad afecta el contenido de mañosa de glicoproteínas recombinantes Con el fin de investigar el efecto de la osmolalidad sobre el contenido de mañosa de glicoproteínas, el contenido de mañosa de una glicoproteína recombinante ejemplar fue analizado a varias osmolalidades tanto en cultivos de matraz de agitador y de bioreactor. Como se demuestra en la Figura 1, el alto contenido de mañosa se incrementó de aproximadamente 14% a aproximadamente 24% con el incremento de la osmolalidad media de aproximadamente 500 a aproximadamente 580 mOsmo/Kg. En un experimento adicional, se agregó 20 mM de un osmoprotector, betaína al cultivo celular para proporcionar evidencia adicional con respecto a la relación entre osmolalidad y alto contenido de mañosa. La siguiente tabla resume los resultados de tal experimento.

Tabla I Todavía evidencia adicional para la correlación entre alto contenido de mañosa y osmolalidad es ilustrada en la Figura 2. La adición de betaína a aproximadamente 20 mM al medio de cultivo celular redujo espectacularmente el alto contenido de mañosa de la glicoproteína recombinante ejemplar. Por ejemplo, cuando la osmolalidad era de aproximadamente 300 mOsm/Kg, el alto contenido de mañosa se redujo de aproximadamente 9.5% a aproximadamente 0 mM de betaína a aproximadamente 4.5% después de la adición de betaína 20 molar (esto es, aproximadamente una reducción de 5% en el alto contenido de mañosa) . Similarmente, cuando la osmolalidad fue aproximadamente 400 mOsm/Kg, el alto contenido de mañosa se redujo de aproximadamente 16.5% a aproximadamente 0 mM de betaína a aproximadamente 7.5% después de la adición de betaína 20 mM (esto es, aproximadamente una reducción de 9% en el alto contenido de mañosa) . Además, a una osmolalidad de aproximadamente 500 mOsm/Kg, el alto contenido de mañosa se redujo de aproximadamente 25% a aproximadamente 0 molar de betaína a aproximadamente 9.5% después de la adición de aproximadamente betaína 20 mM (esto es, una reducción de aproximadamente 15.5% en el alto contenido de mañosa) .

Ejemplo 2: Concentración de K+ en el cultivo puede ser controlada para modular el contenido de mañosa de glicoproteínas recombinantes En un experimento adicional, la concentración de una o más sales en el medio de cultivo celular fue controlada para modular (por ejemplo, reducir) el contenido de mañosa (esto es, alto contenido de mañosa) de la glicoproteína recombinante ejemplar. En un experimento ejemplar, la concentración de K+ en el medio de cultivo celular fue controlada y se mostró que afecta el contenido de mañosa y específicamente, el alto contenido de mañosa de la glicoproteína recombinante ejemplar. Específicamente, el alto contenido de mañosa, esto es, especie M5 o mayor) de la glicoproteína recombinante ejemplar producida al cultivar una célula huésped que expresa la glicoproteína ya sea a 15 mM o 45 mM fue examinado. Como se muestra en la Figura 3 y 4, el porcentaje de alto contenido de mañosa se incrementó de aproximadamente 3% a aproximadamente 13% con el incremento concomitante en osmolalidad. Una osmolalidad de entre aproximadamente 370 y aproximadamente 500 mOsm/Kg condujo a un incremento en el alto contenido de mañosa que excedió del 10% de la composición de glicoproteína. En un experimento adicional, se demostró como se muestra en la Figura 5, que el intervalo de concentración óptimo para la concentración de K+ en el medio de cultivo celular es de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 70 mM con el fin de mantener el porcentaje del alto contenido de mañosa de una glicoproteína recombinante a menos del 10%.

Ejemplo 3: Concentración de Na+ en el medio de cultivo celular puede ser controlada para modular el contenido de mañosa de glicoproteínas recombinantes En un experimento adicional, la concentración de Na+ fue controlada para modular (por ejemplo, reducir) el alto contenido de mañosa de la glicoproteína recombinante ejemplar.

En un experimento ejemplar, se demostró que un incremento en concentración de Na+ en el medio de cultivo celular contribuye a un incremento en el porcentaje del alto contenido de mañosa de la glicoproteína recombinante ejemplar. La Figura 6 demuestra que el intervalo de concentración óptimo para Na+ es de entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 200 mM con el fin de mantener el porcentaje del alto contenido de mañosa a menos de 10%.

Ejemplo 4: Los aminoácidos contribuyen al alto contenido de mañosa de glicoproteínas recombinantes En otro experimento, el efecto de aminoácidos presentes en un medio de cultivo celular fue examinado sobre el alto contenido de mañosa de la glicoproteína recombinante ejemplar. Como se muestra en la Figura 7, el porcentaje de alto contenido de mañosa de una glicoproteína recombinante se incrementa de aproximadamente 4% a aproximadamente 10% al duplicar la concentración de 20 aminoácidos en el medio de alimentación. Este experimento demostró que un medio enriquecido en cuanto a aminoácidos da como resultado un incremento en el contenido de glicoproteínas de alto contenido de mañosa expresadas por una célula huésped cultivada en tal medio.

Ejemplo 5: Composición global de la composición del medio de alimentación puede contribuir al alto contenido de mañosa de glicoproteínas recombinantes En este experimento, el efecto de diferentes tipos de medio de alimentación fue examinado en cuanto al alto contenido de mañosa de la glicoproteína recombinante ejemplar. Específicamente, el efecto de un medio de alimentación modificado sustancialmente libre de los aminoácidos L-alanina, L-arginina HCl, ácido L-aspártico y ácido L-glutámico y que también tienen una concentración más baja de CaCl, MgCl , KCl y piruvato de sodio en relación con el medio sin modificar fue investigado en cuanto al alto contenido de mañosa de la glicoproteína recombinante ejemplar. Como se ilustra en la Figura 8, el alto contenido de mañosa fue de aproximadamente 4% cuando el medio de alimentación modificado fue usado en este porcentaje se incrementa a aproximadamente 13% cuando se usa el medio de alimentación modificado. Ejemplo 6: Efecto de la temperatura sobre el alto contenido de mañosa El efecto de cuatro temperaturas diferentes sobre el alto contenido de mañosa fue examinado utilizando dos medios de alimentación diferentes. Los siguientes datos en la Tabla II indican que hubo un incremento en el porcentaje de alto contenido de mañosa con un incremento en la temperatura.

Tabla II La especificación es entendida más plenamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la especificación, que son incorporadas en la presente por referencia. Las modalidades en la especificación proporcionan una ilustración de modalidades de esta revelación y no deben ser interpretadas para limitar su alcance. Aquellos experimentados en el arte reconocerán fácilmente que muchas otras modalidades están abarcadas por esta revelación. Todas las publicaciones y patentes citadas y secuencias identificadas por los números de acceso o números de referencia de bases de datos en esta revelación son incorporados por referencia en su totalidad. A la extensión de que el material incorporado por referencia contradice o es inconsistente con la presente especificación, la presente especificación sustituye a cualesquier tales materiales. La cita de cualesquier referencias en la presente no es admisión de que tales referencias son arte previo a la presente revelación. A no ser que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivo celular, condiciones de tratamiento y así sucesivamente usados en la especificación, incluyendo las reivindicaciones, se comprenderá que están modificados en todas las instancias por el término "aproximadamente". Así, a no ser que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invención. A no ser que se indique de otra manera, el término "por lo menos" precedente a una serie de elementos, se comprenderá que se refiere a cada elemento en la serie. Aquellos experimentados en el arte reconocerán o serán aptos de indagar, usando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Se pretende que tales equivalentes sean abarcados por las siguientes reivindicaciones .

Claims (42)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una composición de glicoproteína recombinante que tiene bajo contenido de mañosa, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped que expresa la glicoproteína recombinante en un medio de cultivo que tiene una osmolalidad de aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor .
2. 2. Un método para producir una composición de anticuerpo recombinante o fragmento de enlace de antígeno del mismo que tiene bajo contenido de mañosa, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped que expresa el anticuerpo recombinante o fragmento de enlace de antígeno del mismo en un medio de cultivo que tiene una osmolalidad de aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor.
3. 3. Un método para producir una composición de anticuerpo monoclonal humano recombinante o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se enlaza a IL-15, caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped que expresa el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo en un medio de cultivo que tiene una osmolalidad de aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor, en donde el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 4 o sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 2 o sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma .
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la osmolalidad del medio de cultivo es de entre aproximadamente 250 y aproximadamente 600 mOsm/Kg.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la osmolalidad del medio de cultivo es de entre aproximadamente 250 y aproximadamente 500 mOsm/Kg.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la osmolalidad del medio de cultivo es de entre aproximadamente 250 y aproximadamente 380 mOsm/Kg.
7. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo comprende una sal seleccionada del grupo que consiste de potasio, a una concentración de aproximadamente 70 mM o menor, sodio a una concentración de aproximadamente 200 mM o menor y combinaciones de las mismas.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el medio de cultivo comprende una sal seleccionada del grupo que consiste de: (a) potasio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM; (b) sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM y (c) combinaciones de (a) y (b) .
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo está sustancialmente libre de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de alanita, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo comprende una o más vitaminas seleccionadas del grupo que consiste de biotina, pantotenato de D-calcio, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, niacinamida, piridoxal HCl, piridoxina HCl, riboflavina, tiamina HCl y cianobalamina, a una concentración de aproximadamente 0.00005 g/1 a aproximadamente 0.9 g/1.
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo comprende glucosa a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 90 mM.
12. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo comprende una o más peptonas seleccionadas del grupo que consiste de extracto de levadura, hidrolizado de levadura, peptona de soya, hidrolizado de soya, peptona de trigo e hidrolizado de trigo, a una concentración de aproximadamente 0.5 g/1 a aproximadamente 60 g/1.
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo comprende por lo menos un osmo-protector en una cantidad necesaria paira mantener la osmolalidad a aproximadamente 600 mOsm/Kg o menor.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el osmo-protector es seleccionado del grupo que consiste de betaína, glicina, L-treonina, L-prolina y derivados de los mismos.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el osmo-protector es betaína a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la betaína está presente a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM.
17. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula huésped es cultivada por un período de aproximadamente 5 a aproximadamente 14 días.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula huésped es cultivada a una temperatura de aproximadamente 31°C a aproximadamente 38°C.
19. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula huésped es una célula mamífera.
20. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la célula huésped mamífera es una célula CHO.
21. 21. Una composición de glicoproteína recombinante, caracterizada porque es producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 1.
22. 22. Una composición de anticuerpo recombinante o fragmento de enlace de antígeno, caracterizada porque es producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 2.
23. 23. Una composición de anticuerpo monoclonal humano o fragmento de enlace de antígeno del mismo que se enlaza a IL-15, caracterizada porque es producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 3.
24. 24. Una composición, caracterizada porque comprende un anticuerpo aislado o fragmento de enlace de antígeno del mismo, que tiene bajo contenido de mañosa.
25. 25. Una composición que comprende un anticuerpo monoclonal humano aislado que se enlaza a IL-15 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, caracterizada porque tiene bajo contenido de mañosa.
26. 26. Una composición de un anticuerpo monoclonal humano que tiene bajo contenido de mañosa, caracterizada porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos de por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad con la misma o sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos resumida en SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos de por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad con la misma o sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma.
27. 27. Una composición de un anticuerpo monoclonal humano que tiene bajo contenido de mañosa, caracterizada porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una o más CDR que comprenden secuencias de aminoácidos resumidas en SEQ ID NO: 8-10 o una secuencia de aminoácidos de por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad con la misma o sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma y una región variable de cadena pesada que comprende una o más CDR que comprenden secuencias de aminoácidos resumidas en SEQ ID NO: 5-7 o una secuencia de aminoácidos de por lo menos 90% o por lo menos 95% de identidad con la misma o sustituciones de aminoácidos conservadoras de la misma.
28. 28. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque comprende además un portador aceptable farmacéuticamente.
29. 29. Un método para el tratamiento o prevención de una alteración que está asociada con la sobreexpresión de IL-15 humana y/o en la cual la regulación descendente o inhibición de efectos inducidos por IL-15 humana es benéfica, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto un anticuerpo aislado producido mediante el método de conformidad con la reivindicación 3.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la alteración es seleccionada del grupo que consiste de: vasculitis, psoriasis, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, rechazo de aloinjerto, enfermedad injerto contra huésped, linfoma de célula T y leucemia de célula T.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la alteración es enfermedad de intestino inflamatorio.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enfermedad de intestino inflamatorio es enfermedad de Crohn o enfermedad celíaca.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la alteración es seleccionada del grupo que consiste de artritis, alteraciones de tejido conectivo, alteraciones oftalmológicas, alteraciones neurológicas, alteraciones gastrointestinales y hepáticas, alteraciones alérgicas, alteraciones hematológicas, alteraciones de la piel, alteraciones pulmonares, malignidades, alteraciones derivadas de trasplante, alteraciones endocrinológicas, alteraciones vasculares, alteraciones ginecológicas y enfermedades infecciosas.
34. 34. La composición de conformidad con la reivindicación 26 o 27, caracterizada porque no más de aproximadamente 10% de los anticuerpos en la composición comprende M5 o mayor .
35. 35. La composición de conformidad con la reivindicación 26 o 27, caracterizada porque no más de aproximadamente 5% de los anticuerpos en la composición comprende M5 o mayor.
36. 36. La composición de conformidad con la reivindicación 26 o 27, caracterizada porque no más de aproximadamente 4% de los anticuerpos en la composición comprende M5 o mayor.
37. 37. Un método para detectar y/o cuantificar el alto contenido de mañosa de una glicoproteína en una muestra, el método está caracterizado porque comprende someter la muestra a una digestión de endoglicosidada, seguida por separación de las proteínas sometidas a digestión mediante electroforesis.
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la endoglicosidasa comprende Endoglicosidasa H y la digestión se lleva a cabo a 37°C durante aproximadamente 2 horas .
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la electroforesis comprende electroforesis capilar desnaturalizante.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque antes de la etapa de separación, la muestra sometida a digestión es reducida usando un agente reductor.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el agente reductor comprende ß-mercaptoetanol .
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la glicoproteína comprende un anticuerpo producido de un hibridoma o una célula huésped eucarióntica .