CN111676263A - 调节重组蛋白中甘露糖含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调节重组蛋白中甘露糖含量的方法，具体地调节(例如，降低)重组糖蛋白中的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的方法。

Description

调节重组蛋白中甘露糖含量的方法

本申请是申请日为2007年01月23日的中国专利申请CN200780006761.6“调节重组蛋白中甘露糖含量的方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及调节(例如，降低)重组糖蛋白中的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的方法。

背景技术

高等真核生物进行各种翻译后修饰，包括甲基化，硫酸化，磷酸化，脂质添加和糖基化。这种修饰对蛋白的功能可能是极其重要的。分泌蛋白，膜蛋白，和被靶向囊泡或某些细胞内细胞器的蛋白，可能是被糖基化的。

N-糖基化是一种糖基化形式，其包括添加寡糖到蛋白中的识别序列(例如，Asn-X-Ser/Thr)中发现的天冬酰胺残基上。N-连接的糖蛋白包含标准的分支结构，其由甘露糖(Man)，半乳糖，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和神经氨酸组成。蛋白N-糖基化一般发生于内质网(ER)，其中在多萜醇(一种脂质载体中间体)上组装的N-连接的寡糖(例如，GlC₃Man₉GlcNAc₂)，转移到新生蛋白的合适的天冬酰胺(Asn)上。这是所有真核生物的N-连接的糖蛋白共有的事件。存在两种重要类型的N-连接糖：高甘露糖寡糖和复合寡糖。

高甘露糖寡糖一般包括具有许多甘露糖残基(例如，大于4)的两个N-乙酰葡萄糖胺。复合寡糖如此命名，因为它们可以包含几乎任何数量的其它类型的糖，包括超过原始的两个N-乙酰葡萄糖胺。蛋白可以在蛋白的不同部分上被两类寡糖糖基化。寡糖是高甘露糖的还是复合的，据认为取决于在高尔基体中它对糖修饰蛋白的可及性，如果糖是相对难接近的，它将很可能保持它的原始高甘露糖形式。如果它是可接近的，那么可能许多甘露糖残基将裂解，而且糖将通过添加如上所述的其它类型基团而进一步被修饰。

寡糖链已经添加到蛋白以后，通过3个不同的酶以固定顺序除去3个葡萄糖和1个甘露糖残基。该事件发生在ER中，而且是蛋白可以被转运到Golgi用于进一步加工的一个信号。在ER中加工以后，形成高甘露糖型寡糖。3个葡萄糖残基和1个特定的α-1，2-连接的甘露糖残基被ER内的特异性葡糖苷酶和α-1，2-甘露糖苷酶除去，导致核心寡糖结构，Man₈GlcNAc₂。具有这种核心糖结构的蛋白转运到高尔基体中，糖部分在本文中进行各种修饰。

在哺乳动物细胞中，糖链修饰通过3种不同的途径进行，取决于其上添加的蛋白部分。3种不同的途径是：(1)核心糖链不改变；(2)通过添加UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)中的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸盐部分(G1cNAc-1-P)到核心糖链中的甘露糖的6-位置，然后除去GlcNAc部分以形成糖蛋白中的酸性糖链，而使核心糖链改变；或(3)通过用甘露糖苷酶I除去3个甘露糖残基，核心糖链首先转变成Man₅GlcNAc₂；通过添加GlcNAc和除去另外的2个甘露糖残基，接着连续添加GlcNAc，半乳糖(Gal)，和N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸(NeuNAc))，以形成各种杂合的或复合的糖链(R.Kornfeld and S.Kornfeld，Ann.Rev.Biochem.54：631-664(1985)；Chiba et al.，J.Biol.Chem.273：26298-26304(1998))。

重组蛋白的寡糖含量能影响治疗糖蛋白的安全和功效。因此，用于控制这种糖蛋白的寡糖含量，尤其是甘露糖含量的方法将是有益的。

糖蛋白组合物，尤其是治疗抗体的高甘露糖含量，在治疗应用期间能显著地影响这些蛋白的安全和功效。不受特定理论的束缚，证据表明，由于例如，巨噬细胞和树突细胞上的甘露糖受体，高甘露糖糖蛋白比它们的低甘露糖对应物更快地从循环中清除。另外，高甘露糖糖蛋白预期更具有免疫原性。因此，生产具有低甘露糖含量的治疗糖蛋白，如例如治疗抗体，是合乎需要的。

本发明人通过提供调节(例如，控制或降低)重组生产的蛋白质和肽的甘露糖含量的方法，解决了本领域中的这种需要。

发明内容

本发明是基于，至少部分地基于，影响重组表达的糖蛋白的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的因子的发现。

因此，在一个方面，本发明提供了通过操纵细胞培养条件，调节哺乳动物宿主细胞中生产的重组糖蛋白的甘露糖含量(即，寡糖侧链上)的方法，以便细胞生产的糖蛋白具有低甘露糖含量。如本文中使用的，术语“低甘露糖含量”指这样的糖蛋白组合物，其中组合物中小于大约10％，或小于大约8％，或小于大约5％(例如，大约4％或更少)的糖蛋白具有超过4个甘露糖残基(即，是M5或更大的种类)。如本文中使用的，术语“低甘露糖含量”也指这样的糖蛋白组合物，其中组合物中小于大约10％，小于大约9％，小于大约8％，小于大约7％，小于大约6％，小于大约5％，小于大约4％，小于大约3％，小于大约2％，小于大约1％，或前述这些范围之间的任何值，或甚至为零的糖蛋白具有超过4个甘露糖残基。

在本发明的一个实施方案中，通过保持细胞培养环境在低渗透压度(例如，于大约600mOsm/Kg，或于大约500mOsm/Kg，或于大约400mOsm/Kg，例如，在大约380到250mOsm/Kg之间)，来获得低甘露糖含量。这针对具有低甘露糖含量，即糖蛋白的寡糖侧链上具有4个或更少的甘露糖残基的糖蛋白，富集了细胞培养物。因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种用于生产具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的方法，包括培养哺乳动物宿主细胞(例如，在培养的扩大或生产阶段)，其在渗透压度为大约600mOsm/Kg或更少(例如，大约200到600mOsm/Kg之间，例如，大约250到550mOsm/Kg，大约250到500mOsm/Kg，大约250到450mOsm/Kg，大约250到400mOsm/Kg，大约250到380mOsm/Kg，或大约250到350mOsm/Kg)的培养基中表达糖蛋白。

上述渗透压度范围可以通过操纵许多细胞培养参数来获得，包括但不限于，细胞培养培养基中一种或多种盐，维生素，糖，蛋白胨和氨基酸的浓度。因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种通过在包含浓度为大约70mM或更少(例如，大约10mM到大约50mM)的钾；和/或浓度为大约200mM或更少(例如，大约50mM到大约100mM)的钠，并保持大约600mOsm/Kg或更少的细胞培养渗透压度的培养基中，培养表达糖蛋白的宿主细胞，生产具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的方法。

仍然在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过在基本上没有一种或多种选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸，并保持大约600mOsm/Kg或更少的细胞培养渗透压度的培养基中，培养表达糖蛋白的宿主细胞，来生产具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的方法。

而且，仍然在另一个实施方案中，培养基可以包括选自生物素，D-泛酸钙，氯化胆碱，叶酸，i-肌醇，烟酰胺，盐酸吡哆醛，盐酸吡哆醇，核黄素，盐酸硫胺和氰钴胺素的一种或多种维生素，以大约0.00005g/L到大约0.9g/L的浓度。在又一个实施方案中，培养基包括浓度为大约1mM到大约90mM的葡萄糖。在进一步的实施方案中，培养基包括选自酵母抽提物，酵母水解物，大豆蛋白胨，大豆水解物，小麦蛋白胨和小麦水解物的一种或多种蛋白胨，以浓度0.5g/L到大约60g/L的浓度。

仍然在本发明的一个更进一步的实施方案中，细胞培养培养基可以包括一种或多种渗透压保护剂，以保持想要水平的渗透压度例如大约600mOsm/Kg或更少所必需的量。适合的渗透压保护剂是本领域已知的，而且包括，例如，甜菜碱，甘氨酸，L-苏氨酸和L-脯氨酸，及其衍生物如例如，甘氨酸甜菜碱和甜菜醛。在一个特定的实施方案中，细胞培养培养基中渗透压保护剂(例如，甜菜碱)以大约20mM或更大的浓度存在。在特定的实施方案中，渗透压保护剂(例如，甜菜碱)以大约1mM到大约100mM，或大约20mM到大约30mM的浓度存在。

另外的细胞培养参数，其可以单独或与本文中描述的一个或多个参数组合控制，包括例如温度和细胞培养的持续时间。在某些实施方案中，表达重组糖蛋白的宿主细胞在大约31℃到大约38℃的温度下培养。在某些其他的实施方案中，表达重组糖蛋白的宿主细胞培养大约5天到大约14天的时间。

适合用于表达根据本发明的重组糖蛋白的宿主细胞是本领域公知的，包括本文中描述的任何宿主细胞，如CHO细胞，淋巴细胞(例如，NSO细胞)和各种其他的哺乳动物细胞。

本发明可以用于生产如本文中所述的具有低甘露糖含量的各种糖蛋白。在一个特定的实施方案中，本发明用于生产具有低甘露糖含量的重组单克隆抗体或其抗原结合片段。适合的抗体可以包括，例如，鼠，嵌合，人源化和完全的人抗体，以及本领域已知的其他抗体形式。在另一个特定的实施方案中，抗体结合IL-15，其包括但不限于美国公开号2003-0138421中公开的抗体，该美国公开号2003-0138421以其全部引入本文作为参考。在另一个特定的实施方案中，抗体是结合IL-15的完全的人单克隆抗体，其具有包括SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区，和/或包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重链可变区，以及结合IL-15的同源序列(例如，具有分别与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：2具有大约80，85，90，95％或更大的同一性的氨基酸序列)。在进一步的特定的实施方案中，抗体是结合IL-15的人抗体或其抗原结合片段，其具有包括SEQ ID NO：8-10所示的一个或多个互补决定区(CDR)的轻链可变区，以及结合IL-15的同源序列(例如，具有分别与SEQ ID NO：8-10的任何序列具有大约80，85，90，95％或更大的同一性的氨基酸序列)，和包括SEQ ID NO：5-7所示的一个或多个互补决定区(CDR)的重链可变区，以及结合IL-15的同源序列(例如，具有分别与SEQ ID NO：5-7的任何序列具有大约80，85，90，95％或更大的同一性的氨基酸序列)。在一个特定的实施方案中，结合IL-15的人单克隆抗体或其抗原结合片段，包括含有SEQ IDNO：8-10所示的全部3个CDR的轻链可变区，和含有SEQ ID NO：5-7所示的全部3个CDR或其保守的氨基酸替代物的重链可变区。

在又一个方面，本发明提供了通过本文中描述的方法生产的具有低甘露糖含量的重组糖蛋白。因此，这种糖蛋白可包括任何上述的治疗糖蛋白，如抗体，激素，酶，肽及其他糖蛋白。

本发明还包含这样的组合物，其包括具有低甘露糖含量的任何上述糖蛋白。在一个特定的实施方案中，该组合物是一种药物组合物，其包括具有低甘露糖含量的分离的糖蛋白(例如，结合IL-15的分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段)，和药学上可接受的载体。

因此，仍然在另一个方面中，本发明提供了一种通过给受试者施用具有低甘露糖含量的分离的IL-15抗体治疗或预防疾病的方法，该疾病与人IL-15的过表达相关，和/或其中下调或抑制人IL-15诱导的作用是有利的。示例性的疾病包括，但不限于，血管炎，牛皮癣，多发性硬化，类风湿性关节炎，炎症性肠病(例如，克罗恩氏病或乳糜泻)，同种异体移植排斥，移植物抗宿主疾病，T细胞淋巴瘤和T细胞白血病。

因此，仍然在另一个方面中，本发明提供了一种通过给受试者施用具有低甘露糖含量的分离的IL-15抗体治疗或预防疾病的方法，该疾病与人IL-15的过表达相关，和/或其中下调或抑制人IL-15诱导的作用是有利的，。示例性的疾病包括，但不限于，关节炎，结缔组织紊乱，眼科疾病，神经障碍，胃肠和肝紊乱，变应性紊乱，血液学失调，皮肤病，肺疾病，恶性肿瘤，移植来源的疾病，内分泌紊乱，血管疾病，妇科疾病和传染病。

附图简要说明

图1描述了渗透压度与结合IL-15的完全人单克隆抗体的高甘露糖含量之间的相关性，该完全人单克隆抗体通过在振荡器对照(50mL)和生物反应器(150L和500L)中培养表达该抗体的细胞而生产。

图2描述了添加渗透压保护剂甜菜碱与结合IL-15的完全人单克隆抗体的高甘露糖含量之间的相关性。

图3描述了培养基的渗透压度与K+浓度之间的相关性。

图4描述了结合IL-15的完全人单克隆抗体的高甘露糖含量与渗透压度之间的相关性，通过在包含15mM或者45mM KC1的培养基中培养细胞。

图5是K+浓度与高甘露糖含量之间的相关性的图示，其表明了用于保持10％以下的高甘露糖含量的最佳K+浓度是大约0到大约70mM。

图6是Na+浓度与高甘露糖含量之间的相关性的图示，其表明了用于保持10％以下的高甘露糖含量的最佳Na+浓度是大约0mM到大约200mM。

图7描述了氨基酸浓度与高甘露糖含量之间的相关性。

图8描述了使用的补料培养基类型与高甘露糖含量之间的相关性。

具体实施方式

因此，生产具有低-甘露糖含量的治疗糖蛋白，如例如治疗抗体，是合乎需要的。

为了本公开能被更容易地理解，首先对某些术语进行定义。另外的定义通过详细说明陈述。

I.定义

本文中描述的碳水化合物部分指针对寡糖的通常使用的命名。可以在例如，Hubbard and Ivatt，Ann.Rev.Biochem.50.555-583(1981)中发现使用该命名的碳水化合物化学的综述。这些命名包括，例如，Man，其代表甘露糖；GlcNAc，其代表2-N-乙酰葡萄糖胺；Gal，其代表半乳糖；和Glc，其代表葡萄糖。唾液酸用简化符号描述，NeuNAc用于5-N-乙酰神经氨酸，和NeuNGc用于5-羟乙酰基神经氨酸。

如本文中使用的，术语“渗透压度”，指溶解的溶质颗粒在水溶液中的渗透压的度量。溶质颗粒包括离子和非电离的分子。渗透压度表示为溶于1kg溶液的渗透活性颗粒的浓度(即，渗透压克分子)(38℃时，1mOsm/kg H₂O相当于19mm Hg的渗透压)。如本文中使用的，缩写“mOsm”指“毫渗透压克分子/kg溶液”。在一个示例性的实施方案中，细胞培养基的渗透压度保持在大约600mOsm/Kg或更少，或大约550mOsm/Kg或更少，或大约500mOsm/Kg或更少，或大约450mOsm/Kg或更少，或大约400mOsm/Kg或更少，或大约380mOsm/Kg或更少，或大约200mOsm/Kg到大约600mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约550mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约500mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约450mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约400mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约380mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约350mOsm/Kg。

如本文中使用的，术语“糖蛋白”指肽和蛋白质，包括抗体，其具有至少一条包括甘露糖残基的寡糖侧链。糖蛋白可以是与宿主细胞同源的，或可以是与使用的宿主细胞异源的，即外源的，如例如，通过中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞生产的人糖蛋白。这种糖蛋白一般称为“重组糖蛋白”。在某些实施方案中，通过宿主细胞表达的糖蛋白直接分泌到培养基中。哺乳动物糖蛋白的例子包括下列分子和抗其的抗体，细胞因子，例如，IL-1到IL-15，和它们的受体；趋化因子，如TNF，TECK，和它们的受体，例如，TNFR，CCR9；生长激素，包括人生长激素，和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子如VIIIC因子，IX因子，组织因子，和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(调节正常T细胞表达和分泌的激活)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；副中肾管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素-关连肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨来源的神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子如NGF-β；血小板来源的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白，CD蛋白如CD-3，CD-4，CD-8，和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子，免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)，干扰素如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如，IL-1到IL-15；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白，衰变加速因子；病毒抗原如例如，AIDS被膜的部分；转运蛋白；归巢受体和调节蛋白。

如本文中使用的，术语“细胞培养培养基”和“培养基”指用于生长哺乳动物细胞的营养液，其一般提供来自一种或多种下列类别的至少一种组分：1)能源，通常以碳水化合物的形式，如例如葡萄糖；2)一种或多种全部必需氨基酸，而且通常是20种氨基酸加上半胱氨酸的基本集；3)以低浓度需要的维生素和/或其他的有机化合物，4)游离脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定义为无机化合物或天然存在的成份，其一般以非常低的浓度需要，通常在微摩尔的范围内。营养液任选可增补另外的组分以最佳化细胞生长。

本发明的哺乳动物细胞培养物，在适于被培养的特定细胞的培养基中制备。可用于培养特定的细胞类型的适合的细胞培养培养基，对于本领域普通技术人员是显而易见的。示例性的商业可获得培养基包括，例如，Ham′s F10(SIGMA)，最低必需培养基(MEM，SIGMA)，RPMI-1640(SIGMA)，和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM，SIGMA)。任何这些或其他适合的培养基，根据需要可以增补激素和/或其他的生长因子(如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲液(如HEPES)，核苷(如腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷)，抗生素(如Gentamycin^TM)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)，脂质(如亚油酸或其他的脂肪酸)和它们的适合载体，和葡萄糖或相当的能源，和/或如本文中所述修饰的，以促进具有低甘露糖含量的重组糖蛋白的生产。在一个特定的实施方案中，细胞培养培养基是无血清的。

在某些实施方案中，最佳化细胞培养培养基，以便调节(例如，降低)由培养在这种培养基中的宿主细胞表达的重组糖蛋白的高甘露糖含量。在一个特定的实施方案中，哺乳动物宿主细胞是CHO细胞，而且适合的培养基包含基础培养基组分如基于DMEM/HAM F-12的制剂，所述制剂具有改变浓度的一种或多种组分如，例如，氨基酸，盐，糖，蛋白胨和维生素，以便调节(例如，降低)由培养在这种培养基中的CHO表达的重组糖蛋白的高甘露糖含量。

术语细胞培养的“生长期”指，指数细胞生长的时间(也即，对数期)，其中细胞一般快速分裂。细胞保持在生长期大约1天，或大约2天，或大约3天，或大约4天，或比4天更长的时间。细胞保持在生长期的持续时间，将根据例如细胞类型和细胞生长速度以及培养条件而改变。

术语“过渡期”指生长期与生产期之间的时间段。一般，过渡期是期间可以控制培养条件以支持从生长期转移到生产期的时间。可以控制的各种细胞培养参数包括，但不限于，温度，渗透压度，维生素，氨基酸，糖，蛋白胨，铵和盐中的一种或多种。

术语细胞培养的“生产期”，指其中细胞生长已经稳定的时间段。对数细胞生长一般在该期之前或期间结束，而且蛋白质生产接替。补充细胞培养培养基，以便在该阶段获得想要的蛋白质生产是合乎需要的。

术语“哺乳动物宿主细胞”，“宿主细胞”和“哺乳动物细胞”，指来源于哺乳动物的细胞系，其当置于包含合适的养分和生长因子的培养基中单层细胞培养或悬浮培养时，能生长并存活。一般，这种细胞能表达并分泌大量目标特定糖蛋白到培养基中。适合的哺乳动物宿主细胞的例子包括，但不限于，中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad Sci.USA，77：4216(1980))；dp12CHO细胞(EP 307247)；SV40转化的猴肾CV1系(ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞)(Graham et al.，J.Gen Viro1.，36：59(1977))；婴儿仓鼠肾细胞(ATCC CCL10)；小鼠足细胞(TM4)(Mather，Bib1.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)(ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa)(ATCC CCL 2)；犬科肾细胞(MDCK)(ATCC CCL 34)；burfalo老鼠肝细胞(BRL 3A)(ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138)(ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2 HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。

如本文中使用的，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)，用来指其中已经引入重组表达载体的细胞。应当理解，这种术语不仅用来指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代。因为由于突变或者环境影响某些修饰可能发生在继承世代中，这种后代实际上可能与母细胞不同，但是仍然包括在如本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。

术语“表达(expression)”，“表达(express)”和“表达(expresses)”泛指宿主细胞内发生的转录和翻译。宿主细胞中基因产物的表达水平，取决于细胞中存在的对应mRNA的量或基因编码的蛋白的量。例如，从产物基因转录的mRNA可以由Northern杂交定量。(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，pp.7.3-7.57，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))。可以通过分析蛋白的生物学活性，或通过使用独立于这种活性的分析，如例如，使用能与该蛋白反应的抗体的蛋白质印迹法分析或者放射免疫测定，可以定量基因编码的蛋白。(Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，pp.18.1-18.88Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。在一些实施方案中，术语“表达(expression)”，“表达(express)”和“表达(expresses)”，用于指通过本发明的方法生产的具有低甘露糖含量的重组蛋白。

如本文中使用的，术语“低甘露糖”和“低甘露糖含量”，指一种糖蛋白组合物，其中该组合物的至多大约10％包括具有超过4个甘露糖残基糖蛋白，也即M5或更多的种类。相反地，“高甘露糖含量”指一种糖蛋白组合物，其中组合物的超过大约10％包括具有超过4个甘露糖残基的糖蛋白。术语“低甘露糖”和“低甘露糖含量”，也用于指一种糖蛋白组合物，其包括组合物的大于大约90％，或大于大约95％具有包含4个或少于4个甘露糖残基的糖蛋白。

术语“具有低甘露糖含量的糖蛋白”用于指一种重组糖蛋白组合物，当通过培养宿主细胞生产时，其包括，但不限于，组合物中至多大约4％，至多大约5％，至多大约4％到大约5％，至多大约6％，至多大约5％到6％，至多大约7％，至多大约6％到7％，至多大约8％，至多大约7％到8％，至多大约9％，至多8％到9％，至多大约10％，或至多大约9％到10％的糖蛋白具有大于4个甘露糖残基(也即，M5或更多种类)。因此，术语“具有低甘露糖含量的糖蛋白”指一种重组糖蛋白组合物，当通过培养宿主细胞生产时，其包括组合物中大于大约90％，或大于大约95％的糖蛋白具有4个或少于4个甘露糖残基(也即，0-4个甘露糖残基)。

高甘露糖含量可以通过本领域公知的一种或多种方法测定，例如，Wuhrer等(Journal of Chromatography B Vo1.825：124-133，2005)和Del1等(Science Vol.291：2351-2356)中所述的方法，和本文中描述的那些方法，包括例如，用于糖蛋白的N-聚糖作图的分析法。简要地，从重组糖蛋白如重组单克隆抗体酶促除去N-聚糖，并在还原末端用荧光标签(2-氨基苯甲酰胺)进行标记。通过高pH阴离子交换色谱法(HPAEC)分离荧光N-聚糖，并使用荧光检测进行检测。中性N-聚糖的分离一般是根据N-聚糖结构中增加的复杂性。带电荷的N-聚糖的分离是基于唾液酸，硫酸盐或存在的电荷数来源于其的其他修饰的数量和种类。目测比较试验样品的这些聚糖分布图，到一个合适的标准。

也可以使用本文中立即公开的方法来测定高甘露糖含量：用于检测和/或定量糖蛋白的高甘露糖含量的高通量方法，该糖蛋白包括但不限于，抗体或其片段，例如，Fab片段，和当在真核宿主细胞中表达时的包含Fc片段和peptibody的融合蛋白。抗体一般在Fc区具有单N-连接的聚糖。由于聚糖的部分隐伏构造，它常常仅仅被部分加工，其导致过高的甘露糖和混合型(hybrid type)。无性系选择，细胞突变或其他的遗传操作，或细胞培养操作可以改变细胞生产的聚糖类型。研究了大量条件/细胞，因此筛选期间需要许多聚糖检验。传统的聚糖作图较慢而且是劳动密集的，需要很多天。本发明的高甘露糖/混合聚糖分析，提供聚糖类型比例要快得多，而且操作人员工作要少得多。

特别地，本发明提供了一种检测和/或定量包含所述糖蛋白的样品或组合物中糖蛋白的高甘露糖含量的方法，所述方法包括对包含糖蛋白的样品或组合物进行内切糖苷酶消化，使用还原剂还原消化的糖蛋白(如果需要)，并通过变性电泳分离消化的糖蛋白，通过从脱糖基化的重链级分(内切糖苷酶消化后的峰值)，扣除非糖基化的重链级分(没有内切糖苷酶处理的峰值级分)，来确定高甘露糖/混合型聚糖的比例。非糖基化重链级分或没有内切糖苷酶处理的峰值级分，通过使相同的样品或组合物进行相同的消化条件产生，除了那里不存在内切糖苷酶之外。该步骤与内切糖苷酶消化步骤一起或分开进行。

能选择性在核心聚糖上的GlcNAc1与GlcNAc2之间裂解高甘露糖和混合聚糖(或在蛋白上产生短聚糖)，而保留复合N-连接聚糖完好的任何内切糖苷酶，都可用于本发明。为了正确的定量，内切糖苷酶不能以有限量。进行内切糖苷酶消化的特定条件，包括酶浓度，孵育温度和消化时间，取决于使用的内切糖苷酶的类型。与本发明相关的内切糖苷酶的例子，包括但不限于，内切糖苷酶H和内切糖苷酶F1。在本发明的一个实施方案中，包含糖蛋白的样品用内切糖苷酶H于37℃处理大约2小时，用β-巯基乙醇还原，并进行CE-SDS分析。

用于从糖基化的糖蛋白，例如，糖基化抗体，分离脱糖基化的糖蛋白，例如，脱糖基化的抗体的方法的例子，包括但不限于下列两种方法：

1)还原条件下的CE-SDS。糖基化的糖蛋白，例如，抗体，用SDS和还原剂变性，并通过毛细管电泳-SDS(CE-SDS)，从裂解的HC(脱糖基化的HC)分离其带有聚糖的重链(HC)。产生UV信号的电泳图谱。峰值下面的区域与相对含量成正比。因此，从在较早的脱糖基化HC位置洗脱的级分，确定高甘露糖/混合型的量。因为G1cNAc-HC与脱糖基化HC一起迁移，从消化样品的前峰值扣减未消化样品的脱糖基化HC％，来产生高甘露糖值％。分离需要15-30分钟，取决于结构。

2)基于微流体的CE-SDS。糖蛋白如1)中一样变性，但是使用“芯片实验室”仪器分离，如Caliper的LC90。同样的原则用于分析和分离，但是荧光染料用于检测蛋白。分离时间减少到每个分析大约30秒，而且可以从微量滴定板采样。

如上所述的本发明的方法，可以对纯化的蛋白进行，也可以对粗细胞培养样品进行。对于重组抗体，信号是足够强的，不需要进行纯化。

在某些实施方案中，具有超过4个甘露糖残基的糖蛋白包括具有5到9个甘露糖残基的糖蛋白(也即，M5-M9种类)。不希望受特定理论的舒服，本领域的普通技术人员将理解，宿主细胞表达的糖蛋白组合物，包括具有改变数量的甘露糖残基的糖蛋白。例如，低甘露糖糖蛋白具有4个或少于4个甘露糖残基(例如，0-4个甘露糖残基)，高甘露糖糖蛋白具有大于4个甘露糖残基(例如，M5种类或更高)。

在本发明的一个特定的实施方案中，具有低甘露糖含量的糖蛋白是重组抗体或其抗原结合片段。在本发明的另一个特定的实施方案中，具有低甘露糖含量的重组糖蛋白是结合IL-15的人单克隆抗体或其抗原结合片段。

如本文中使用的，术语“基本上没有”，一般指没有或具有降低量(相对于未改变的培养基)的某些组分的细胞培养培养基制品。例如，在一个实施方案中，用于生产具有低甘露糖含量的重组糖蛋白分培养基，基本上没有某些氨基酸(例如，一种或多种选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸)。在一些实施方案中，对基本上没有一种或多种组分的培养基进行修饰，以相对于未修饰的培养基，包括小于大约1％，或小于大约3％，或小于大约5％，或小于大约10％的一种或多种这种组分。

术语“IL-15”，“IL-15抗原”和“白细胞介素15”本文中可互换使用，而且包括细胞天然表达的任何变体或亚型。

本文中的术语“抗体”，包括完整的抗体和其任何抗原结合片段(也即，“抗原结合部分”)或单链。“抗体”指包括通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域组成，CH1，CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。V_H和V_L区可以更进一步再分成高可变区，称为互补决地区(CDR)，与更保守的区域，称为构架区(FR)交替分布。每条V_H和V_L由3个CDR和4个FR组成，其从氨基末端到羧基末端以下列顺序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一个组分(C1q)。

如本文中使用的，术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”)，指选择性与抗原(例如，IL-15)结合的抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”内包含的抗原结合片段的例子包括(i)Fab片段，一种由V_L，V_H，CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包括在绞链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al，Nature 341：544-546(1989))，其由V_H结构域组成；和(vi)分离的互补决地区(CDR)或(vii)两种或多种CDR的组合，其可任选通过合成接头连接。而且，即使Fv片段的两个结构域，V_L和V_H，由独立的基因编码，它们可以通过合成接头使用重组方法连接，该合成接头使它们制备为一条蛋白链，其中V_L和V_H区配对以形成单价分子(通称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Birdet al Science 242：423-426(1988)；and Huston et al.Proc.Nat1.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)。这种单链抗体也意图包括在术语抗体的“抗原结合部分”和“抗原结合片段”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的传统方法获得，并以与完整抗体相同的方法筛选这些片段的应用。

如本文中使用的，术语“单克隆抗体”，指显示对特定的抗原表位的单一结合特异性和亲合力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”指这样的抗体，其显示单一结合特异性，而且其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在一个实施方案中，人单克隆抗体通过包括B细胞的杂交瘤生产，该B细胞获自转基因非人动物，例如，转基因小鼠，其具有包含与无限增殖化细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。

如本文中使用的，术语“重组人抗体”，包括通过重组方法制备，表达，生产或分离的所有人抗体，如(a)从用人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如，老鼠)，或从其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化以表达抗体的宿主细胞，例如，从转染瘤分离的抗体，(c)从重组的，组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及人免疫球蛋白序列剪切到其他DNA序列的任何其他方法，制备，表达，生产或分离的抗体。这种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，这种重组人抗体可以进行体外诱变(或，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，从而重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是这样的序列，其虽然来源于而且与人种系V_H和V_L序列相关，但是可以不天然存在于体内人抗体种系谱系内。

如本文中使用的，相对于生产这种抗体的转基因非人有机体，限定了“异源抗体”。这个术语指具有相当于在不包括转基因非人动物的生物体中发现的，而且通常来自除了转基因非人动物以外的物种的序列的氨基酸序列或编码性核酸序列的抗体。

如本文中使用的，“分离的抗体”，指基本上没有具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合IL-15的分离抗体，基本上没有特异性结合除了IL-15之外的抗原的抗体)。但是，特异性结合IL-15的抗原表位的分离抗体，具有与其他的相关细胞因子或与来自不同物种的其他IL-15蛋白的交叉反应性。不过，抗体优选总是结合人IL-15。而且，分离抗体一般基本上没有其他的细胞物质和/或化学制品。在一个特定的实施方案中，把具有不同的IL-15特异性的“分离的”单克隆抗体的组合，组合到明确限定的组合物中。

如本文中使用的，“特异性结合”，“选择性结合”和“有选择地结合”，指抗体或其片段，结合预先确定的抗原。例如，在一个实施方案中，当通过表面plasmon共振(SPR)技术在BIACORE 3000仪器中，使用重组人IL-15作为analyte，抗体作为配体测定时，抗体以大约小于10^-7M，如大约小于10^-8M，10^-9M或10^-10M或甚至更低的亲合力(KD)结合，而且以比与除预先确定的抗原或密切相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA，酪蛋白)结合的亲合力，高至少两倍的亲合力与预先确定的抗原结合。短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”本文中可以与术语“有选择地与抗原结合的抗体”互换使用。

如本文中使用的，术语“K_D”，意思是指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。

如本文中使用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。

如本文中使用的，“同种型转换”指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变化到其它Ig类别之一的现象。

如本文中使用的，“未转换的同种型”指当没有发生同种型转换时，产生的重链同种型类别；编码未转换的同种型的CH基因一般是功能上重排的VDJ基因下游紧接的第一个CH基因。同种型转换已经划分为典型的或非典型的同种型转换。典型的同种型转换，通过在转基因中包括至少一个转换序列区的重组事件发生。非典型的同种型转换可以通过例如，人σ_μ与人∑_μ之间的同源重组(δ-相关的缺失)发生。可供选择的非典型转换机制，如其中的转基因间和/或染色体间重组等，可发生和实现同种型转换。

如本文中使用的，术语“转换序列”指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列，一般是一个μ转换区，将位于在转换重组期间被缺失的结构区的5′(也即，上游)。“转换受体”区，将位于被缺失的结构区和取代恒定区之间(例如，γ，ε，等等)。因为没有重组总是发生的特异性位点，所以最终的基因序列一般是不可从结构预测的。

如本文中所述，“糖基化模式”定义为共价附着于蛋白，更具体地说共价附着于免疫球蛋白的碳水化合物单元的模式。当本领域普通技术人员将识别异源抗体的糖基化模式为比转基因的CH基因来源的物种，更类似于非人类转基因动物物种中的所述糖基化模式时，异源抗体的糖基化模式可以表征为基本上类似于由非人类转基因动物物种生产的抗体上天然存在的糖基化模式。

如本文中使用的，术语“天然存在的”用于客体时，指自然可发现的客体。例如，有机体(包括病毒)中存在的多肽或多核苷酸序列，其可以从天然来源分离而且没有在实验室中被人为有意修饰，是天然存在的。

如本文中使用的，术语“重排”指重链或轻链免疫球蛋白基因座的结构，其中V部分在构象中与D-J或J部分紧邻，其分别编码基本上完全的V_H或V_L结构域。重排的免疫球蛋白基因座可通过与种系DNA比较来鉴定；一个重排的基因座将具有至少一个重组的七聚物/九聚物同源单元。

如本文中使用的与V部分相关的术语“未重排的”或“种系结构”，指其中V部分没有重组以便与D或J部分紧邻的结构。

如本文中使用的，术语“核酸分子”指DNA和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。

如本文中使用的，术语“分离的核酸分子”，其关于编码选择性结合IL-15的抗体或抗体部分(例如，V_H，V_L，CDR3)的核酸，是指这样的核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列没有编码结合除了IL-15之外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，其他的序列在人基因组DNA中可以天然位于该核酸的旁邻。SEQ ID NOS：1-4相应于包括人抗IL-15抗体的重链(V_H)和轻链(V_L)可变区的核苷酸和氨基酸序列。特别地，SEQ ID NO：1和2相应于抗体的V_H，SEQ ID NO：3和4相应于抗体的V_L。

在一个特定的实施方案中，结合IL-15的人单克隆抗体或其抗原结合片段，包括含有SEQ ID NOs：8-10所示的一个或多个而且优选全部3个CDR的轻链可变区，和含有SEQ IDNO：5-7所示的一个或多个而且优选全部3个CDR的重链可变区。

在一个特定的实施方案中，本发明还包括SEQ ID NO：1-10所示的序列的“保守性序列修饰”或“保守性序列取代”，也即不显著影响或改变该核苷酸序列编码的或包含该氨基酸序列的抗体的结合特性的核苷酸和氨基酸序列修饰。这种保守性序列修饰包括核苷酸和氨基酸取代，添加和缺失。修饰可通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变引入到SEQ ID NO：1-10中。保守性氨基酸取代包括其中氨基酸残基替换为具有类似侧链的氨基酸残基的取代。本领域中已经限定了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，β-分支的侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。因此，人抗IL-15抗体中预测的非必需氨基酸残基，优选用来自相同的侧链家族的另一个氨基酸残基取代。

做为选择，在另一个实施方案中，可如通过饱和诱变，沿着整个或部分抗IL-15抗体编码序列随机引入突变，而且可以筛选得到的修饰的抗IL-15抗体的结合活性。

因此，由本文中公开的(重链和轻链可变区)核苷酸序列编码的，和/或包含本文中公开的(重链和轻链可变区)氨基酸序列(也即，SEQ ID NO：1-4)的抗体，包括由已经保守修饰的类似序列编码或包含其的基本类似的抗体。此外，下面提供了，关于如何根据本文中公开为SEQ ID No：1-4的部分序列(也即，重链和轻链可变区)产生这种基本类似的抗体的论述。

对于核酸，术语“基本上同源”，指当最佳比对和比较至少大约80％的核苷酸，通常至少大约90％到95％，而且更优选至少大约98％到99.5％的核苷酸中合适的核苷酸插入或缺失时，两个核酸或其指定序列是相同的。做为选择，当该部分在选择性杂交条件下与该链的互补体杂交时，基本同源存在。

对于氨基酸序列，术语“同源”指当最佳比对和比较合适的插入或缺失时，两个氨基酸序列之间的同一性程度。

两个序列之间的同一性百分数是两个序列共有的相同位置数目的函数(也即，同源％＝相同位置的#/总的位置x100的#)，其中考虑缺口数，和每个缺口的长度，其需要引入用于两个序列的最佳比对。可以使用数学算法进行两个序列之间的序列比较和确定同一性百分数。

使用GCG软件包中的GAP程序(可获自http：//www.gcg.com)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40，50，60，70或80的缺口权重(gap weight)，和1，2，3，4，5或6的长度权重(lengthweight)可确定的两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分数。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分数，可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法确定，其已经结合到ALIGN程序(version 2.0)中，使用PAM120weight残基表，缺口长度罚分12，和缺口罚分4。而且，两个氨基酸序列之间的同一性百分数，可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法确定，其已经结合到GCG软件包(可获自http：//www.gcg.com)的GAP程序中，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，和16，14，12，10，8，6或4的缺口权重(gapweight)，和1，2，3，4，5或6的长度权重(length weight)。

本发明的核酸和蛋白序列可以另外用作“询问序列”，以对公共数据库进行检索，从而例如确定相关序列。这种检索可使用Altschul等J.Mol.Biol.215：403-10(1990)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)进行。用NBLAST程序，分数＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序，分数＝50，字长＝3进行BLAST蛋白检索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对用于比较的目的，可以利用如Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402(1997)中所述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。(参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。

核酸可以存在于整个细胞中，或细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式。当通过标准技术，包括碱性/SDS处理，CsCl分带，柱色谱，琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术，从其他的细胞组分或其他的杂质，例如，其他的细胞核酸或蛋白质纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel等，ed.Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。

本发明的核酸组合物，虽然经常处于来自cDNA，基因组或其混合物的天然序列(除了修饰的限制性位点等等外)中，但是可以根据标准技术突变，以提供基因序列。对于编码序列，这些突变，可以依照要求影响氨基酸序列。特别地，基本上与天然的V，D，J，恒定，转换和本文中描述的其他这种序列同源或来源于(其中“来源”指序列于另一个序列相同，或从另一个序列修饰)其的DNA序列，是期待的。

当把核酸置于与另一个核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作连接的”。例如，启动子或增强子是与编码序列可操作连接的，如果它影响序列的转录。对于转录调节序列，可操作连接，指被连接的DNA序列是连续的，而且，其中对于连接两个蛋白编码区，连续的并在阅读框架内是必要的。对于转换序列，可操作连接表示序列能影响转换重组。

如本文中使用的，术语“载体”，意思是指能转运它被连接的另一个核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，其指一种环状双链DNA环，另外的DNA部分可以连接到该DNA环中。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA部分可以连接到病毒基因组中。某些载体能在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他的载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中后，马上整合到宿主细胞的基因组中，并从而与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能直接表达与它们可操作连接的基因。这种载体本文中称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般，表达载体常常以质粒的形式用于重组DNA技术中。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意图包括这种其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)，其提供同等的功能。

如本文中使用的，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有炎性疾病，如关节炎，例如类风湿性关节炎的个体。术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物，绵羊，狗，母牛，鸡，两栖动物，爬行动物，等等。

本发明的各个方面在下面的小节中进行更详细的描述。

II.影响甘露糖含量的因子

(a)渗透压度

各种细胞培养参数可影响哺乳动物细胞培养中表达的重组糖蛋白的甘露糖含量。特别地，本发明发现，细胞培养培养基中的渗透压度越高，组合物中具有超过4个甘露糖残基(也即，M5或更高种类)的糖蛋白的百分比越高。因此，在本发明的一个实施方案中，细胞培养培养基的渗透压度保持在小于大约600mOsm/Kg，以降低或控制表达的糖蛋白的甘露糖含量(例如，大约250mOsm/Kg到大约600mOsm/Kg)。

对于哺乳动物细胞培养，细胞培养培养基的渗透压度保持在小于大约550mOsm/Kg，或小于大约500mOsm/Kg，或小于大约450mOsm/Kg，或小于大约400mOsm/Kg，或小于大约380mOsm/Kg，或大约200mOsm/Kg到大约600mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约550mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约500mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约450mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约400mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约380mOsm/Kg，或大约250mOsm/Kg到大约350mOsm/Kg。

为了获得想要范围内的渗透压度，可以调节培养基中各种组分的浓度。例如，可以被添加到培养基中以便增加其渗透压度的溶质，包括蛋白质，肽，氨基酸，水解动物蛋白如蛋白胨，非代谢聚合物，维生素，离子，盐，糖，代谢产物，有机酸，脂质，等等。然而应当理解，可以改变培养基中其他组分的浓度以获得想要的渗透压度。

在其他的实施方案中，可以通过添加一种或多种渗透压保护剂到培养基中，把渗透压度调节到上述的范围。示例性的渗透压保护剂是本领域公知的，而且包括，但不限于，甜菜碱，甘氨酸，L-苏氨酸和L-脯氨酸，及其衍生物包括但不限于，甘氨酸甜菜碱和甜菜醛。在一个特定的实施方案子中，细胞培养培养基包含浓度为大约20mM或更高，或大约1mM到大约100mM，更优选大约20mM到大约30mM的甜菜碱。

可以通过本领域公知的和本文中描述的那些方法测量渗透压度。例如，如FisherScientific销售的渗透压计，Pittsburgh，PA，商标名称为OSMETTE，可用于测定细胞培养培养基的渗透性。作为选择，Osmette型2007(Precision Systems，Inc.，Natick，MA)可使用。

在本发明其他的实施方案中，可通过改变细胞培养培养基中盐，糖，蛋白胨，氨基酸和铵的一种或多种的浓度，来调节渗透压度。

仍然在其他的实施方案中，影响渗透压度的上述参数，可以与操纵培养细胞的温度和持续时间联合，以调节(例如，降低)甘露糖含量。因此，应当理解，本文中描述的各种细胞培养参数可以单独或联合调节，以调整重组糖蛋白的甘露糖内容。

(i)钾和钠浓度

在导致本发明的实验中，证实增加培养基中的钾(K+)浓度促进糖蛋白的高甘露糖含量。因此，在一个实施方案中，本发明应用K+浓度为大约70mM或更少(例如，大约10mM到大约50mM)的细胞培养培养基。

如上所讨论的，可以单独调控细胞培养培养基中的钾浓度，或者可以与本文中描述的影响渗透压度的一个或多个其他因子组合调控细胞培养培养基中的钾浓度。在一个特定的实施方案中，培养基另外包括浓度为大约200mM或更少的钠(例如，大约50mM到大约100mM)。

(ii)氨基酸

发现能影响细胞培养培养基的渗透压度，和/或促进重组表达蛋白的高甘露糖含量的其他因子，是培养基中氨基酸的浓度和种类。例如，在一个特定的实施方案中，培养基中全部20种氨基酸的浓度加倍，导致甘露糖含量增加。因此，在本发明的一个特定的实施方案种，调节细胞培养培养基以具有降低的氨基酸浓度。在一个特定的培养基种，氨基酸的浓度降低了大约一半。

在另一个特定的实施方案中，细胞培养培养基基本上没有选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的一种或多种氨基酸。

(iii)糖

发现能影响细胞培养培养基的渗透压度，和/或促进重组表达蛋白的高甘露糖含量的其他因子，是培养基中糖的浓度和种类。在一个特定的实施方案中，细胞培养培养基包括浓度为大约1mM到大约90mM的葡萄糖。

(iv)铵

可影响细胞培养培养基的渗透压度，和/或促进重组表达蛋白的高甘露糖含量的另一个因子，是浓度为大约30mM或更少的铵(例如，大约0mM到大约10mM)。在一个实施方案中，铵浓度为大约10mM或更少。

(v)蛋白胨

发现能影响细胞培养培养基的渗透压度，和/或促进重组表达蛋白的高甘露糖含量的其他因子，是培养基中使用的蛋白胨的浓度和种类。蛋白胨是从水解动物蛋白产生的培养基补充物。蛋白胨的来源是本领域公知的，而且包括，例如，畜产品，明胶和植物材料。示例性的蛋白胨包括，但不限于，浓度为大约0.5g/L到大约60g/L的酵母抽提物，酵母水解物，大豆蛋白胨，大豆水解物，小麦蛋白胨和小麦水解物。

(vi)维生素

发现能影响细胞培养培养基的渗透压度，和/或促进重组表达蛋白的高甘露糖含量的其他因子，是培养基中使用的维生素的浓度和种类。在一个特定的实施方案中，细胞培养培养基可以包括选自生物素，D-钙，泛酸盐，氯化胆碱，叶酸，i-肌醇，烟酰胺，盐酸吡哆醛，盐酸吡哆醇，核黄素，盐酸硫胺和氰钴胺素的一种或多种维生素，以大约0.00005g/L到大约0.9g/L的浓度。

(b)温度

发现能促进重组表达蛋白的高甘露糖含量的另一个因子，是细胞培养保持的温度。因此，在本发明的另一个实施方案中，也可以单独或与上述因子联合(例如，调节细胞培养时间和影响渗透压度的因子)调节培养宿主细胞的温度，以调整(例如，降低)重组表达糖蛋白的甘露糖含量。在某些实施方案中，在大约31℃，或在大约32℃，或在大约33℃，或在大约34℃，或在大约35℃，或在大约36℃或在大约37℃或在大约38℃培养宿主细胞。

III.细胞培养方法

根据本发明的方法，在允许具有低甘露糖含量的重组糖蛋白表达的培养基中培养宿主细胞。适合的细胞培养程序和条件是本领域公知的。宿主细胞(例如，CHO和NSO细胞)可以各种形式和在各种培养容器中培养。例如，宿主细胞可以设计用于大规模或小规模生产糖蛋白的形式培养。另外，宿主细胞可以培养粘附于培养烧瓶或培养皿的底部，或者它们可以悬浮于搅拌的烧瓶，生物反应器或滚瓶培养中。在某些实施方案中，为了以商业相关的量生产重组糖蛋白，宿主细胞可以生长于生物反应器中，而且优选容量为大约2升或更多，或大约5升或更多，或大约10升或更多，或大约50升或更多，或大约100升或更多，或大约500升或更多，或大约1000升或更多，或大约1500升或更多，或大约2000升或更多的生物反应器中。

在某些实施方案中，宿主细胞可以培养(例如，保持和/或生长)于液体培养基中，而且优选连续或间歇地培养，通过常规培养方法如静置培养，试管培养，振荡培养(例如，旋转的振荡培养，摇瓶培养，等等)，通风旋动培养或发酵。在某些实施方案中，宿主细胞培养于摇瓶中。仍然在其他的实施方案中，宿主细胞培养于发酵罐中(例如，在发酵过程中)。发酵过程包括，但不限于，发酵的分批，分批补料和连续法。术语“分批法”和“分批发酵”指一个封闭系统，其中培养基的组成，养分，补充的添加剂等等在发酵开始时设定，而且在发酵期间不进行改变，但是，可以试图调控这些因子如pH和氧浓度，以防止过量的培养基酸化和/或微生物死亡。术语“分批补料法”和“分批补料”发酵，指添加一种或多种基质或补充物(例如，增量或连续添加)，或细胞培养条件随着发酵进展而改变方面有例外的分批发酵。术语“连续法”和“连续发酵”，指这样的系统，其中连续添加规定的发酵培养基到发酵罐中，而且同时除去等量的使用的或“条件”培养基，例如，用于回收想要的产物(例如，重组糖蛋白)。已经开发了各种这些方法，而且这些方法是本领域公知的。

在一个特定的实施方案中，表达结合IL-15的重组人单克隆抗体的宿主细胞，生长于滚瓶，两升的旋转烧瓶或另一适合的培养系统中。

IV.糖蛋白的回收

多肽生产阶段之后，可以使用本领域公知的技术，从培养基回收目标重组糖蛋白。目标糖蛋白优选作为分泌多肽从培养基回收，虽然它也可以从宿主细胞裂解物回收。

在某些实施方案中，离心培养基或裂解物以除去颗粒细胞碎片。其后使用适合的纯化方法，从杂质可溶性蛋白质和多肽纯化糖蛋白。示例性的纯化方法包括，但不限于，免疫亲和或离子交换柱上的分馏法；乙醇沉淀法；反相HPLC；硅石或阳离子交换树脂如DEAE上的色谱法；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如，交联葡聚糖凝胶G-75的凝胶过滤；和蛋白A琼脂糖凝胶柱，以除去杂质如IgG。蛋白酶抑制剂如苯基甲基磺酰氟化物(PMSF)以可用于抑制纯化期间的蛋白水解降解。本领域技术人员将理解，适于目标重组糖蛋白的净化方法可能需要修改，以解决在重组细胞培养中表达的糖蛋白特征的改变。

在本发明的一个特定的实施方案中，使用本发明的方法表达的重组糖蛋白是人单克隆抗体或其抗原结合片段。一般，抗体最初通过ELISA表征。例如，微量滴定板可以用纯化的抗原如例如，溶于PBS中的IL-15包被，然后用无关的蛋白如在PBS中稀释的牛血清白蛋白(BSA)封闭。把来自培养细胞的提取物的稀释物，添加到每个孔中，并于37℃孵育1-2小时。平板用PBS/吐温20洗涤，然后用与碱性磷酸酶结合的山羊-抗人IgG Fc-特异性多克隆试剂37℃孵育1小时。洗涤以后，平板用ABTS基质显影，并以405的OD分析。

为了确定通过本发明的方法生产的抗体是否与唯一的抗原表位结合，每个抗体可以使用商业可获得的试剂(Pierce，Rockford，IL)进行生物素化。生物素化的MAb结合，可以用链霉亲和素标记的探针检测。为了确定纯化抗体的同种型，可以使用本领域公认的技术进行同种型ELISA。例如，微量滴定板的孔可以用10μg/ml的抗人Ig于4℃包被过夜。用5％BSA封闭以后，使平板与10μg/ml的抗体或纯化的同种型对照于环境温度反应2小时。孔然后可与人IgGl或者其他的人同种型特异性结合的探针反应。平板如上所述显影和分析。

在一个特定的实施方案中，使用本发明的方法生产的重组糖蛋白是结合IL-15人单克隆抗体或其抗原结合片段。可使用流式细胞术，检验IL-15单克隆抗体与表达IL-15的活细胞的结合。简要地，使表达膜结合IL-15的细胞系和/或人PBMC(在标准生长条件下生长)，与溶于包含0.1％BSA和0.01％NaN₃的PBS的各种浓度的单克隆抗体，于4℃混合1小时。洗涤以后，细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体，在与一抗染色相同的条件下反应。可以使用光和侧向散射特性通过单个细胞上的门，通过FACScan仪器分析样品，并确定标记抗体的结合。可以使用利用荧光显微术的可供选择的分析(补充或代替流式细胞术分析)。细胞可以完全如上所述地进行染色，并通过荧光显微术检验。该方法允许目测单个细胞，但是可能削弱了取决于抗原密度的灵敏度。

可以通过Western印迹法，进一步测试抗IL-15人IgG与IL-15抗原的反应性。简要地，可以从表达IL-15的宿主细胞制备细胞提取物，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳以后，分离的抗原转移到硝酸纤维膜，用20％小鼠血清封闭，并用待检测的单克隆抗体探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并用BCIP/NBT基质片剂显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)。

V.药物组合物

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，例如，药物组合物，其含有一种具有低甘露糖含量的重组糖蛋白或其组合。在一个特定的实施方案中，药物组合物包括至少一种具有低甘露糖含量的治疗蛋白如，例如，具有低甘露糖含量的治疗抗体或其抗原结合片段(例如，结合IL-15的人单克隆抗体或其抗原结合片段)。在另一个特定的实施方案中，本发明的药物组合物包括与药学上可接受的载体一起配制的，具有低甘露糖含量的一种或多种重组糖蛋白。

本发明的药物组合物也可以在联合治疗，即与其他的试剂联合中施用。例如，联合治疗可包括本发明的组合物和至少一种或多种另外的治疗剂，如消炎药，DMARD(修饰疾病的抗风湿病药物)，免疫抑制剂，化疗药物和牛皮癣试剂。本发明的药物组合物还可以与放射治疗一起施用。本发明也包括，与其他的抗体，如CD4特异性抗体和IL-2特异性抗体共同施用。这种与CD4特异性抗体或IL-2特异性抗体联合，据认为尤其可用于治疗自身免疫疾病和移植排斥反应。

如本文中使用的，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂，分散介质，涂层，抗菌的和抗真菌试剂，等渗和吸收延迟试剂，等等。优选地，载体适于静脉内，肌内，皮下，肠胃外，脊髓或表皮给药(例如，通过注射或灌输)。取决于给药途径，重组糖蛋白，例如，抗体，双特异和多特异性分子，可以包被在一种物质内，以保护该化合物免于可灭活该化合物的酸类和其他自然条件的作用。

“药学上可接受的盐”，指保留母体化合物的想要生物学活性，而不赋予任何不想要的毒理学作用的盐(参见，例如，Berge，S.M.，et al，J.Pharm.Sci.66：1-19(1977))。这种盐的例子包括加酸盐和加碱盐。加酸盐包括来源于无毒无机酸，如盐酸，硝酸，磷酸，硫酸，溴酸，氢碘酸，亚磷酸等的那些盐，以及来自于无毒的有机酸如脂肪族单和二羧酸，苯基取代的直链烷酸，羟基直链烷酸，芳香酸，脂肪族和芳香族硫酸等等的那些盐。加碱盐包括来源于碱土金属，如钠，钾，镁，钙等等的那些盐，以及来源于无毒的有机胺，如N，N′-二苄基乙二胺，N-甲基葡萄糖胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺，普鲁卡因等等的那些盐。

本发明的组合物可通过本领域已知的各种方法施用。本领域技术人员应当理解，给药的途径和/或模式将根据想要结果而改变。可以用将保护化合物抗快速释放的载体，如控释制剂，包括植入物，经皮膜片和微囊传递系统，来制备活性化合物。可使用生物可降解的，生物相容的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯共聚物，聚酐，聚羟基乙酸，胶原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法被授予专利，或者一般是本领域技术人员已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

为了通过某些给药途径施用本发明的化合物，需要用一种物质包被该化合物，或与一种物质共同施用该化合物，以防止它的灭活。例如，可以使化合物处于合适的载体，例如，脂质体或稀释剂中施用给受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和含水的缓冲液。脂质体包括油包水水包油型CGF乳液以及常规脂质体(Strejan et al，J.Neuroimmunol.7：27(1984))。

药学上可接受的载体，包括用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌水溶液或分散体和无菌粉末。这些介质和试剂用于药学活性物质是本领域已知的。除非任何常规的介质或试剂与该活性化合物不相容，将其用于本发明的药物组合物中是预期的。增补的活性化合物也可以整合到组合物中。

治疗组合物在制备和贮存条件下，一般必须是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液，微乳剂，脂质体，或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质包括，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液体聚乙二醇，等等)，及其适合的混合物。可以例如，利用涂层如卵磷脂，通过在分散体的情况中保持所需的颗粒大小，和利用表面活性剂，来保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露糖醇，山梨糖醇，或氯化钠是优选的。可通过使组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸盐和凝胶，来达到可注射组合物的延长吸收。

可通过把活性化合物以需要的量，合并到带有上面列举的一种组分或组分组合的溶剂中，来制备无菌的可注射溶液，根据需要，接着进行灭菌微过滤。一般，通过把活性化合物，合并到包含基本分散介质和来自上面列举的那些组分的所需其他组分的无菌载体中，来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其预先无菌过滤的溶液，产生活性成分加任何额外需要组分的粉末。

可以调节给药方案，以提供最佳的想要应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单个丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者可以根据治疗状况的急需相应地降低或增加剂量。例如，本发明的人抗体可以通过皮下注射每周施用一次或两次，或者通过皮下注射每月施用一次或两次。

以剂量单位形式配制肠胃外组合物，便于给药和剂量一致性，是特别有利的。如本文中使用的剂量单位形式，指适合作为单位剂量用于待治疗受试者的物理分离的单位；每个单位包含计算出的用于与需要的药物载体结合产生想要的治疗效果的预定量活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格由(a)活性化合物的独特特性和要获得的特定治疗效果，和(b)在复合这种活性化合物用于个体中灵敏度的处理的领域中固有的限制所支配，或直接依赖于其。

药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等等；(2)可溶于油的抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基羟基苯甲醚(BHA)，丁羟甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚，等等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸，等等。

对于治疗组合物，本发明的制剂包括适于口服，鼻，局部(包括颊和舌下)，直肠，阴道和/或肠胃外给药的那些治疗组合物。制剂可以方便地以单位剂量形式存在，而且可以通过药学领域已知的任何方法制备。可以与载体物质联合以产生单剂量形式的活性成分的含量，将根据被治疗的受试者和特定的给药模式而改变。可与载体物质联合以产生单剂量形式的活性成分的含量，一般是产生治疗效果的组合物含量。一般，在百分之百中，该含量的范围为大约百分之0.001到大约百分之九十的活性成分，优选大约百分之0.005到大约百分之七十，最优选大约百分之0.01到大约百分之三十。

适于阴道给药的本发明制剂还包括阴道栓剂，棉塞，乳剂，凝胶剂，糊状物，泡沫或喷雾制剂，其含有本领域已知合适的这些载体。用于本发明组合物的局部或经皮给药的剂型包括粉末，喷雾，软膏剂，糊状物，乳剂，洗液，凝胶剂，溶液，膜片和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体，而且和任何需要的防腐剂，缓冲液或气雾剂基质混合。

如本文中使用的，术语“肠胃外给药”和“肠胃外施用”，指除了肠和局部给药以外的给药模式，通常通过注射，而且包括，非限制性的，静脉内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，硬膜外和胸骨内注射和灌输。

可以用于本发明的药物组合物的适合的含水和非水载体的例子，包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇，等等)，及其合适的混合物，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。可以例如，利用涂层材料如卵磷脂，通过在分散体的情况中保持所需的颗粒大小，和利用表面活性剂，来保持适当的流动性。

这些组合物也可包含佐剂如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。可以通过灭菌方法，上述，和通过包含各种抗菌和抗真菌药，例如，对羟苯甲酸，氯代丁醇，山梨酸苯酚，等等，来确保预防微生物的存在。可能也需要在组合物中包括等渗试剂，如糖，氯化钠，等等。而且，可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和凝胶，来达到可注射药物形式的延长吸收。

当本发明的化合物作为药物施用给人和动物时，它们可以单独提供，或作为药物组合物提供，其包含与药学上可接受的载体联合的，例如0.001到90％(更优选，0.005到70％，如0.01到30％)的活性成分。

不考虑选择的给药途径，可以适合的水合形式使用的本发明化合物，和/或本发明的药物组合物，通过本领域技术人员已知的常规方法，配制成药学上可接受的剂型。

可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便得到对特定患者，组合物和给药模式能有效获得想要的治疗应答，而对患者没有毒性的活性成分含量。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因子，包括应用的本发明特定组合物，或其酯，盐或酰胺的活性，给药途径，给药次数，应用的特定化合物的排出速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合的其他药物，化合物和/或材料，被治疗患者的年龄，性别，体重，状况，全身健康和以前的病史，以及医学领域公知的类似因子。具有本领域普通技术的医生或兽医，可以很容易地确定和规定所需药物组合物的有效量。例如，医生或兽医可以从低于所需水平的水平，开始药物组合物中的本发明化合物的剂量，以获得想要的治疗效果，并逐渐增加剂量直到获得预期效果。总之，本发明的药物组合物的适合日剂量，是能有效产生治疗效果的最低剂量的化合物含量。这种有效剂量一般取决于如上所述的因子。优选的给药是静脉内，肌内，腹膜内，或皮下给药，优选施用到靶位点的近端。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可以作为2，3，4，5，6或更多个亚剂量，在整天以合适的间隔分别施用，任选地，以单位剂型。虽然本发明的化合物可能单独施用，但是优选作为药物制剂(组合物)施用该化合物。

治疗组合物可以用本领域已知的医疗设备施用。例如，在一个优选的实施方案中，本发明的治疗组合物可以用无针皮下注射设备施用，如美国专利号5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公开的设备。可用于本发明的公知的植入物和模件的例子包括：美国专利号4,487,603，其公开了一种用于以控制速率分送药物的可植入微灌流泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种用于通过皮肤施用药物的治疗设备；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的灌输速率传递药物的药物灌流泵；美国专利号4,447,224，其公开了一种用于连续药物传递的变速流可植入灌输装置；美国专利号4,439,196，其公开一种具有多室间隔的渗透性药物传递系统；和美国专利号4,475,196，其公开了一种渗透性药物传递系统。许多其他的这种植入物，传递系统和模件是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，可以配制本发明的治疗糖蛋白以确保体内的合适的分布。例如，血脑屏障(BBB)排斥许多高度亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物跨过BBB(如果需要)，它们可以在例如脂质体中配制。制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利号4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可包括被选择性转运到特定细胞或器官中，从而增强靶向的药物传递的一个或多个部分(参见，例如，V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol.29：685(1989)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038(1988))；抗体(P.G.Bloeman et al.FEBS Lett.357：140(1995)；M.Owais et al.Antimicrob.AgentsChemother.39：180(1995))；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.Am.J.Physiol.1233：134(1995))，其中的不同种类可以包括本发明的制剂，以及发明分子的组分；p120(Schreier et al，J.Biol Chem.269：9090(1994))；也参见K.Keinanen；M.L.LaukkanenFEBS Lett.346：123(1994)；JJ.Killion；I.J.Fidler Immunomethods4：273(1994)。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物在脂质体中配制；在一个更优选的实施方案中，脂质体包括靶向部分。在一个最优选的实施方案中，脂质体中的治疗化合物通过推注传递到邻近肿瘤或感染的位点。组合物必须是流动的，到容易可注射的程度。组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，而且必须被保藏抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。

在一个另外的实施方案中，可以配制本发明的重组糖蛋白，以防止或降低转运跨过胎盘。这可以通过本领域已知的方法，例如，通过抗体的PEG化或利用F(ab)2′片段来完成。可以进一步参考“Cunningham-Rund les C，Zhuo Z，Griffith B，Keenan J.(1992)Biologicalactivities of polyethylene-glycolimmunoglobulin conjugates.”Resistance to enzymatic degradation.J Immunol Methods.152：177-190；和Landor M.(1995)Maternal-fetaltransfer of immunoglobulins，Ann Allergy Asthma Immunol74：279-283。当糖蛋白是用于治疗或预防复发性自发流产的抗体时，这是尤其相关的。

用于类风湿性关节炎的“治疗有效剂量”，将在患者中导致ACR20改善标准(ACR20Preliminary Definition of Improvement)，更优选导致ACR50改善标准，甚至更优选导致ARCD70改善标准。

ACR20改善标准定义为：在关节压痛指数(Tender Joint Count，TCJ)和关节肿胀指数(Swollen Joint Count，SWJ)中的改善≥20％，而且在下面5项评估中有3项的改善≥20％：患者疼痛评价(Patient Pain Assessment，VAS)，患者总体评价(Patient GlobalAssessment，VAS)，医生总体评价(Physician Global Assessment，VAS)，患者自我评价无力(Patient Self-Assessed Disability，HAQ)，急性期反应物(Acute Phase Reactant，CRP或ESR)。

ACR50和ACR70以同样的方式定义为分别改善≥50％和≥70％。对于进一步的详细内容，参见Felson等，美国风湿病学会的类风湿性关节炎改善标准(American College ofRheumatology Preliminary Def inition of Improvement in Rheumatoid Arthritis)；Arthritis Rheumatism 38：727-735(1995)。

可以在动物模型系统中评价化合物抑制癌症的能力，来预测在人肿瘤中的功效。可选择地，可以通过检验化合物抑制的能力来评价组合物的这种特性，这种抑制在体外通过熟练的实施者已知的分析进行。治疗有效量的治疗化合物可以降低肿瘤大小，或改善受试者中的症状。本领域普通技术人员将能根据这些因子，如受试者的大小，受试者症状的严重性，和选择的特定组合物或给药途径，来确定这种治疗有效量。

也可以根据本领域公知的方法，评价抗体治疗或预防牛皮癣的能力。

组合物必须是无菌的，而且是流动的，到组合物可通过注射器传递的程度。除了水以外，载体可以是等渗的缓冲盐水溶液，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇，等等)，及其适合的混合物。可以例如，通过利用涂层如卵磷脂，通过在分散体的情况中保持所需的颗粒大小，和通过利用表面活性剂，来保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇，和氯化钠是优选的。可通过使组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和凝胶，来达到可注射组合物的长期吸收。

当活性化合物用例如，惰性稀释剂或能同化的可食用载体合适地保护时，如上所述，化合物可以口服施用。

本发明的其他实施方案在下面的实施例中描述，其将不会认为是进一步的限制。序列表，附图和整个本申请中引用的所有参考文献，专利和公开的专利申请的内容都清楚地引入本文中作为参考。

实施例

在下面论述的所有实施例中，结合IL-15的完全人单克隆抗体，其具有包括SEQ IDNO：4中所示的氨基酸序列的轻链可变区，和包括SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的重链可变区，用作示例性的重组糖蛋白(实施例中称为“示例性的重组糖蛋白”)。但是，本领域普通技术人员将清楚，任何重组糖蛋白的甘露糖含量可以如本文中所述的进行调节。

实施例1：渗透压度影响重组糖蛋白的甘露糖含量

为了研究渗透压度对糖蛋白的甘露糖含量的影响，以改变渗透压度，在振荡器烧瓶和生物反应器培养中对示例性重组糖蛋白的甘露糖含量进行了分析。如图1中证明的，随着培养基渗透压度从大约500mOsmo/Kg增加到大约580mOsmo/Kg，高甘露糖含量从大约14％增加到大约24％。

在一个另外的实验中，添加20mM的渗透压保护剂甜菜碱到细胞培养物中，以提供关于渗透压度与高甘露糖含量之间的关系的进一步证据。下表总结了一个这种实验的结果。

表I

样品	％Hi-M
			36℃，培养基	19
36℃，培养基+甜菜碱	14
			37℃，培养基	18
37℃，培养基+甜菜碱	13

图2中表明了高甘露糖含量与渗透压度之间的相关的仍然进一步的证据。添加大约20mM甜菜碱到细胞培养培养基中，显著降低了示例性重组糖蛋白的高甘露糖含量。例如，当渗透压度为大约300mOsm/Kg时，高甘露糖含量从大约0mM甜菜碱时的大约9.5％，降低到添加20mM甜菜碱以后的大约4.5％(即，高甘露糖含量降低大约5％)。类似地，当渗透压度为大约400mOsm/Kg时，高甘露糖含量从大约0mM甜菜碱时的大约16.5％，降低到添加20mM甜菜碱以后的大约7.5％(即，高甘露糖含量降低大约9％)。进一步，渗透压度为大约500mOsm/Kg时，高甘露糖含量从大约0mM甜菜碱时的大约25％，降低到添加20mM甜菜碱以后的大约9.5％(也即，高甘露糖含量降低大约15.5％)。

实施例2：可以调控培养中K+的浓度以调节重组糖蛋白的甘露糖含量

在一个进一步的实验中，调控细胞培养培养基中一种或多种盐的浓度，以调节(例如，降低)示例性重组糖蛋白的甘露糖含量(例如，高甘露糖含量)。在一个示例性的实验中，调控细胞培养培养基中的K+浓度，而且显示影响示例性重组糖蛋白的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量。特别地，检验了15mM或45mM时，通过培养表达糖蛋白的宿主细胞生产的示例性重组糖蛋白的高甘露糖含量(即，M5或更多种类)。

如图3和4中所示，随着渗透压度的增加，高甘露糖含量百分比从大约3％增加到大约13％。大约370到大约500mOsm/Kg的渗透压度，导致高甘露糖含量增加，其超过糖蛋白组合物的10％。

在一个进一步的实验中，如图5所示，证明细胞培养培养基中K+浓度的最佳浓度范围为大约0mM到大约70mM，以保持重组糖蛋白的高甘露糖含量百分比低于10％。

实施例3：可以调控细胞培养培养基中Na+的浓度以调节重组糖蛋白的甘露糖含量

在一个进一步的实验中，调控Na+的浓度以调节(例如，降低)示例性重组糖蛋白的高甘露糖含量。在一个示例性的实验中，增加细胞培养培养基中的Na+浓度，显示促进示例性重组糖蛋白的高甘露糖含量百分比的增加。

图6证明了，Na+的最佳浓度范围是大约0mM到大约200mM，以保持高甘露糖含量百分比低于10％。

实施例4：氨基酸促进重组糖蛋白的高甘露糖含量

在另一个实验中，检验了细胞培养基中存在的氨基酸，对示例性重组糖蛋白的高甘露糖含量的影响。如图7所示，通过加倍补料培养基中20种氨基酸的浓度，重组糖蛋白的高甘露糖含量百分比从大约4％增加到大约10％。该实验证明了，富含氨基酸的培养基导致了，这种培养基中培养的宿主细胞表达的高甘露糖糖蛋白的含量增加。

实施例5：补料培养基组合物的总组分可以促进重组糖蛋白的高甘露糖含量

在这个实验中，检验了不同类型的补料培养基，对示例性重组糖蛋白的高甘露糖含量的影响。具体地说，研究了相对于未改变的培养基，改变的补料培养基(其基本上没有氨基酸L-丙氨酸，盐酸L-精氨酸，L-天冬氨酸和L-谷氨酸，并具有较低浓度的CaCl，MgCl，KCl和丙酮酸钠)对示例性重组糖蛋白的高甘露糖含量的影响。如图8中表明的，当使用改变的补料培养基时，高甘露糖含量为大约4％，而且当使用未改变的补料培养基时，这种百分比增加到大约13％。

实施例6：温度对高甘露糖含量的影响

使用2种不同的补料培养基，检验了4种不同的温度对高甘露糖含量的影响。表II中的下列数据表明，随着温度的增加，高甘露糖含量的百分比增加。

表II

根据引入本文中作为参考的说明书内引用的参考文献的教导，可最透彻的理解本说明书。说明书内的实施方案，提供了这种公开中的实施方案的例示，而且将不会解释为限制它的范围。熟练的技术人员可以容易识别本公开中包含的许多其他的实施方案。本公开中引用的所有出版物和专利，以及通过登录或数据库参考数确定的序列，以其全部内容引入作为参考。当引入作为参考的物质与本说明书矛盾或不一致的程度时，本说明书将取代任何这种物质。本文中任何参考文献的引用不认为这些参考文献是本公开的现有技术。

除非另有说明，用于本说明书，包括权利要求中，表达组分，细胞培养，处理条件等等的所有数量，理解为在一切情况下都通过术语“大约”修饰。因此，除非另有与此相反的说明，数字参数是近似值，而且可以根据设法通过本发明获得的想要特性而改变。除非另有说明，一系列单元之前的术语“至少”，理解为指该系列里的每个单元。本领域技术人员将认识到，或至多使用常规实验，能确定本文中描述的发明的特定实施方案的许多等价体。这些等价体意欲由下列权利要求书包括。

Claims (10)

1.一种生产包含重组抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，其中所述组合物中小于10%的抗体或其抗原结合片段具有超过4个甘露糖残基/N-连接的寡糖，所述方法包括：

在培养基中培养表达该重组抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞，所述培养基具有：

(i) 250到450 mOsm/Kg的渗透压度；和

(ii) 浓度为0 mM至70 mM的钾，或浓度为0 mM至200 mM的钠。

2.一种生产包含结合IL-15的重组人单克隆抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，其中所述组合物中小于10%的抗体或其抗原结合片段具有超过4个甘露糖残基/N-连接的寡糖，所述方法包括：

在培养基中培养表达该抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞，所述培养基具有：

(i) 250到450 mOsm/Kg的渗透压度；和

(ii) 浓度为0 mM至70 mM的钾，或浓度为0 mM至200 mM的钠；

其中该抗体或其抗原结合片段包括含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链可变区，和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的重链可变区。

3.权利要求1的方法，其中培养基的渗透压度为250到380m Osm/Kg。

4.权利要求2的方法，其中培养基的渗透压度为250到380m Osm/Kg。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述培养基包含：

浓度为0 mM至70 mM的钾；和

浓度为0 mM至200 mM的钠。

6.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述培养基包含：

浓度为10 mM至70 mM的钾；和

浓度为50 mM至200 mM的钠。

7.权利要求1-4中任一项的方法，其中培养基包含：

浓度为10 mM到50 mM的钾；和

浓度为50 mM到100 mM的钠。

8.权利要求1-4中任一项的方法，其中培养基没有选自丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸和谷氨酸的一种或多种氨基酸。

9.权利要求1-4中任一项的方法，其中培养基包括浓度为0.00005 g/L到0.9 g/L的选自生物素，D-泛酸钙，氯化胆碱，叶酸，i-肌醇，烟酰胺，盐酸吡哆醛，盐酸吡哆醇，核黄素，盐酸硫胺和氰钴胺素的一种或多种维生素。

10.权利要求1-4中任一项的方法，其中培养基包括浓度为1 mM到90 mM的葡萄糖。

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