MX2008007075A - Formulacion farmaceutica para incrementar la permeabilidad epitelial por peptido regulador de glucosa. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende una mezcla de una cantidad farmacéuticamente activa de péptido que regula la glucosa (GRP) e intensificadores, en donde la formulación farmacéutica es empleada en el tratamiento de un síndrome metabólico.

Description

FORMULACIÓN FARMACÉUTICA PARA PERMEABILIDAD INCREMENTADA DE PÉPTIDO QUE REGULA LA GLUCOSA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los péptidos que regulan la glucosa ("GRP"), son una clase de péptidos que tienen potencial terapéutico en el tratamiento de diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDD ), diabetes gestacional o diabetes mellitus no dependiente de la insulina (NIDDM) ; el tratamiento de obesidad, y el tratamiento de dislipidemia . Véase Patente Estadounidense No. 6,5006,724, Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 20030036504A1 ; Patente Europea No. EP1083924B1; Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. O 98/30231A1; y Solicitud de Patente Internacional No. WO 00/73331A2. Estos GRP incluyen péptido similar al glucagón (GLP) , por ejemplo, GLP-1; las exendinas, especialmente exendina-4, también conocida como exenatida; y péptidos amilina y análogos de amilina, tales como pramlintido. Sin embargo, a la fecha, estos GRP han sido solamente administrados a humanos por inyección. Una desventaja principal de la administración del fármaco por inyección es que el personal entrenado es a menudo requerido para administrar el fármaco. Adicionalmente , el personal entrenado se coloca en forma dañina cuando se administra un fármaco por inyección. Para fármacos auto- administrados, muchos pacientes son renuentes o incapaces de darse ellos mismos las inyecciones en una base regular. La inyección también está asociada con riesgos incrementados de infección. Otras desventajas de la inyección de fármaco incluyen variabilidad de resultados de suministro entre individuos, asi como también intensidad impredecible y duración de la acción del fármaco. La administración oral es disponible como una alternativa; sin embargo, ciertos agentes terapéuticos exhiben biodisponibilidad muy baja y retardo de tiempo considerable en la acción cuando se dan por esta ruta, debido al metabolismo hepático de primer paso y degradación en el tracto gastrointestinal. De este modo, existe una necesidad para desarrollar modos de administración de GRP distintos por inyección y/o administración oral. La administración mucosal de compuestos terapéuticos ofrece ciertas ventajas sobre la inyección y otros modos de administración, por ejemplo, conveniencia y velocidad de suministro, asi como también reducción o eliminación de problemas de cumplimiento y efectos secundarios que logra el suministro. Sin embargo, el suministro mucosal de agentes biológicamente activos es limitado por las funciones de barrera mucosal y otros factores. Las células epiteliales hacen la barrera mucosal y proporcionan una interfaz crucial entre el ambiente externo y tejidos mucosales y submucosales y compartimientos extracelulares . Una de las funciones más importantes de las células epiteliales de la mucosa es determinar y regular la permeabilidad mucosal. En este contexto, las células epiteliales crean barreras de permeabilidad selectiva entre diferentes compartimientos fisiológicos. La permeabilidad selectiva es el resultado del transporte regulado de moléculas a través del citoplasma (la trayectoria transcelular ) y la permeabilidad regulada de los espacios entre las células (la trayectoria paracelular). Las uniones intercelulares entre las células epiteliales son conocidas por estar involucradas en tanto el mantenimiento como regulación de la función de barrera epitelial y adhesión célula-células. Las uniones herméticas (TJ) de las células epiteliales y endoteliales son particularmente importantes para las uniones células-célula que regulan la permeabilidad de la trayectoria paracelular, y también divide la superficie celular en compartimientos apicales y basolaterales . Las uniones herméticas forman contactos intercelulares circunferenciales continuos entre células epiteliales y crean una barrera regulada al movimiento paracelular de agua, solutos y células inmunes. También proporcionan un segundo tipo de barrera que contribuye a la polaridad celular limitando el intercambio de lipidos de membrana entre los dominios de membrana apical y basolateral . En el contexto de suministro de fármaco, la capacidad de fármacos para permear las capas de células epiteliales de superficies mucosales, inasistidas por agentes que mejoran el suministro, parece estar relacionada con un número de factores, que incluyen tamaño molecular, solubilidad de lipidos e ionización. En general, moléculas pequeñas, de menos de aproximadamente 300-1,000 daltons, son a menudo capaces de penetrar las barreras mucosales, sin embargo, conforme el tamaño molecular incrementa, la permeabilidad reduce rápidamente. El suministro de fármaco transdermal permite la permeación de moléculas más grandes a través de las capas de células epiteliales de la piel. La administración transdérmica, tal como parche transdérmico, es otra ruta de suministro alternativo para fármacos macromoleculares más grandes. Sin embargo, el suministro transdérmico puede todavía presentar más limitaciones de tamaño que la inyección. Por estas razones, la administración de fármaco mucosal y epidermal, típicamente requiere cantidades más grandes de fármaco que la administración por inyección. Otros compuestos terapéuticos, que incluyen fármacos de molécula grande, son a menudo refractarios al suministro mucosal. Además de la escasa permeabilidad intrínseca, los fármacos macromoleculares grandes son a menudo, sujetos a difusión limitada, así como también degradación enzimática lumenal y celular y rápida separación en sitios mucosales. De este modo, para suministrar estas moléculas más grandes en cantidades terapéuticamente efectivas, los agentes que mejoran la permeación celular son requeridos para ayudar a su pasaje a través de estas superficies mucosales y dérmicas y en la circulación sistémica en donde pueden actuar rápidamente en el tejido obj etivo .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURA 1: Reducción en concentración de glucosa en la sangre después de la administración IN de GLP-1 comparada con Exenatida (SQ) y Control Salino (IN) (corregido para glucosa endógena) en ratas. FIGURA 2: Respuesta a la insulina después de la administración intranasal de GLP-1 en ratas. FIGURA 3: Vacio gástrico después de la administración intranasal de GLP-1 en ratas. FIGURA 4: Farmacocinética mejorada de Exendina-4 administrada IN con intensificadores 2X, IN con intensificadores 2X + gelatina, e IN con intensificadores IX + gelatina comparada con control IN y IV en conejos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la presente invención incluye la utilidad terapéutica de formulaciones farmacéuticas para el suministro de GRP, análogos de GRP, fragmentos de GRP, y derivados funcionales de GRP a través de una superficie epitelial para uso en el tratamiento de enfermedades humanas que incluyen obesidad y diabetes. La presente invención cumple completamente las necesidades mencionadas anteriormente y satisface objetos y ventajas adicionales proporcionando métodos nuevos, efectivos, usos y composiciones para suministro transepitelial , especialmente transmucosal de GRP tal como GLP y análogos de GLP, amilina y análogos de amilina, y exendinas y análogos de exendina, para tratar diabetes mellitus dependiente de insulina (IDD ), diabetes gestacional o diabetes mellitus no dependiente de la insulina (NIDDM) , dislipidemia, hiperglicemia , obesidad, para inducir saciedad en un individuo, y promover pérdida de peso en un individuo. En modalidades ejemplares, los métodos de suministro intensificados y composiciones de la presente invención, proporcionan suministro terapéuticamente efectivo de los agonistas GRP a través de una capa de células biológicas para la prevención o tratamiento de obesidad y trastornos alimenticios en sujetos mamíferos. En un aspecto de la invención, se proporcionan formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración epitelial que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un GRP y uno o más agentes intensificadores del suministro epitelial como se describe aquí, en el cual, las formulaciones son efectiva en un método de suministro epitelial de la invención para prevenir el comienzo o progreso de obesidad o trastornos alimenticios en un sujeto mamífero. El suministro transepitelial de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista GRP y uno o más agentes que intensifican el suministro epitelial, proporcionan niveles terapéuticos elevados del agonista GRP en el sujeto. Los métodos de suministro mejorados y composiciones de la presente invención, proporcionan suministro terapéuticamente efectivo de un GRP para prevención o tratamiento de una variedad de condiciones y enfermedades en sujetos humanos. El GRP puede ser administrado vía una variedad de rutas epiteliales, por ejemplo, contactando el GRP a un epitelio mucosal nasal, un epitelio mucosal bronquial o pulmonar, la superficie bucal oral, la superficie mucosal oral y del intestino delgado, o una superficie epidérmica. En modalidades ejemplares, los métodos y composiciones son dirigidas a, o formuladas para suministro intranasal (por ejemplo, suministro mucosal nasal o suministro mucosal intranasal). Las formulaciones de GRP mencionadas anteriormente y métodos preparativos y de suministro de la invención, proporcionan suministro epitelial mejorado de un GRP a sujetos mamíferos. Estas composiciones y métodos pueden involucrar formulación combinatorial o administración coordinada de uno o más GRP con uno o más agentes que intensifican el suministro epitelial. Entre los agentes que intensifican el suministro epitelial a ser seleccionados para lograr estas formulaciones y método están: (A) agentes de solubilización; (B) agentes que modifican la carga; (C) agentes de control de pH; (D) inhibidores de enzima degradativa ; (E) agentes de separación de mucosa o mucolíticos ; (F) agentes ciliostáticos ; (G) agentes que intensifican la penetración de la membrana (por ejemplo, (i) un tensoactivo, (ii) una sal biliar, (iii) un fosfolípido o aditivo de ácido graso, micelio mezclado, liposoma o portador, (iv) un alcohol, (v) una enamina, (iv) un compuesto donador de NO, (vii) una molécula antipática de cadena larga, (viii) un intensificador de la penetración hidrofóbico pequeño; (ix) derivado de ácido salicílico o sodio; (x) un éster de glicerol de ácido acetoacético (xi) un derivado de ciclodextrina o beta-ciclodextrina , (xii) un ácido graso de cadena media, (xiii) un agente quelante, (xiv) un aminoácido o sal del mismo, (xv) un N-acetilamino ácido o sal del mismo, (xvi) una enzima degradativa a un componente de membrana seleccionado, (xvii) un inhibidor de síntesis de ácido graso, (xviii) un inhibidor de síntesis de colesterol; o (xiv) cualquier combinación de los agentes que intensifican la penetración de la membrana de (i ) - (xviii) ) ; (H) agentes moduladores de la fisiología de unión epitelial, tales como estimuladores de óxido nítrico (NO) ; quitosan, y derivados de quitosan; (I) agentes vasodilatadores; (J) agentes que intensifican el transporte selectivo; y (K) estabilización de vehículos de suministro, portadores, soportes o especies que forman complejos con los cuales, el GRP es/son efectivamente combinados, asociados, contenidos, encapsulados o unidos para estabilizar el agente activo para suministro epitelial mejorado. En varias modalidades de la invención, un GRP es combinado con uno, dos, tres, cuatro o más de los agentes que intensifican el suministro epitelial mencionados en (A) - (K) , anterior. Estos agentes que intensifican el suministro epitelial pueden ser mezclados solos, o en conjunto, con el GRP, o de otro modo, combinados junto con estos en una formulación farmacéuticamente aceptable o vehículo de suministro. La formulación de un GRP con uno o más de los agentes que intensifican el suministro epitelial de conformidad con las enseñanzas aquí (que incluye opcionalmente cualquier combinación de dos o más agentes que intensifican el suministro epitelial, seleccionados de (A) - (K) ) , proporcionan biodisponibilidad incrementada de péptidos enlazantes que regulan la glucosa después del suministro del mismo a una superficie epitelial de un sujeto mamífero.

Además, agregando agentes que intensifican el suministro epitelial a la formulación, la modificación del GRP, tal como a través de la adición de un grupo hidrofóbico, puede ser usada para efectuar la biodisponibilidad del péptido. De este modo, la presente invención es un método para suprimir el apetito, promover la pérdida de peso, reducir la absorción de alimento, o tratar obesidad y/o diabetes en un mamífero, que comprende administración transepitelialmente de una formulación comprendida de un GRP. La presente invención además proporciona el uso de un GRP para la producción de medicamento para la administración transepitelial de un GRP para tratar hiperglicemia , diabetes mellitus, síndrome metabólico, dislipidemia , supresión de apetito, promoción de pérdida de peso, reducción de absorción de alimento, o tratar obesidad en un mamífero. Una dosis mucosalmente efectiva de GRP dentro de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención comprende, por ejemplo, entre aproximadamente 0.001 pmol hasta aproximadamente 100 pmol por kg de peso corporal, entre aproximadamente 0.01 pmol hasta aproximadamente 10 pmol por kg de peso corporal, o entre aproximadamente 0.1 pmol hasta aproximadamente 5 pmol por kg de peso corporal. En modalidades adicionales ejemplares, la dosificación de GRP es entre aproximadamente 0.5 pmol hasta aproximadamente 1.0 pmol por kg de peso corporal. En una modalidad preferida, una dosis intranasal variará desde 0.1 - 100 yg/kg, o aproximadamente 7 - 7000 yg, más preferiblemente 0.5 - 30 yg/kg, o 35 hasta 2100 yg . Dosis más especificas del GRP intranasal incluyen 20 yg, 50 yg, 100 yg, 150 yg, 200 yg hasta 400 yg, 500 yg, 800 hasta 1000 yg y 1200 hasta 1800 yg. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas una o más veces por día, o 3 veces por semana o una vez por semana entre una semana y al menos 96 semanas o aún por la vida del paciente o sujeto individual. En ciertas modalidades, las formulaciones farmacéuticas de la invención son administradas una o más veces diariamente, dos veces diariamente, cuatro veces diariamente, seis veces diariamente, u ocho veces diariamente. Los agentes que intensifican el suministro epitelial son empleados, los cuales intensifican el suministro de GRP en o a través de una capa celular, que incluyen una superficie mucosal nasal. Para fármacos pasivamente absorbidos, la contribución relativa de trayectorias paracelulares y transcelulares al transporte del fármaco, depende del pKa, coeficiente de división, radio molecular y carga del fármaco, el pH del ambiente luminal en el cual el fármaco es suministrado, y el área de la superficie de absorción. El agente que intensifica el suministro epitelial de la presente invención, puede ser un agente de control de pH . El pH de la formulación farmacéutica de la presente invención, es un factor que afecta la absorción de GRP vía trayectorias paracelulares y transcelulares al transporte del fármaco. En una modalidad, la formulación farmacéutica de la presente invención es ajustada de pH a entre aproximadamente pH 2 a 8. En una modalidad adicional, la formulación farmacéutica de la presente invención es ajustada de pH a entre aproximadamente pH 3.0 a 6.0. En una modalidad adicional, la formulación farmacéutica de la presente invención es ajustada de pH entre aproximadamente 3.5 a 5.5. En general, el pH es 4.5 + 0.5. Como se notó anteriormente, la presente invención proporciona métodos mejorados y composiciones para suministro epitelial de GRP a sujetos mamíferos para el tratamiento o prevención de una variedad de enfermedades y condiciones. Ejemplos de sujetos mamíferos apropiados para tratamiento y profilaxis de conformidad con los métodos de la invención incluyen, pero no se restringen a, primates no humanos y humanos, especies de ganado, tales como caballo, vaca, oveja y cabras, y especies de investigación y domésticas, que incluyen perros, gatos, ratones, ratas, cobayos y conejos. Para proporcionar mejor entendimiento de la presente invención, se proporcionan las siguientes definiciones: Péptidos similares a Glucagón (GLP) Incluidos dentro de la invención están . análogos , fragmentos, miméticos y derivados funcionales de proteínas y péptidos GLP. Las incretinas son hormonas derivadas del estómago, que estimulan la secreción de insulina en respuesta a absorción de nutriente (en una forma dependiente de la glucosa). Dos incretinas que se originan naturalmente incluyen, péptido insulinotrópico dependiente de la glucosa (GIP) y glucagones como el péptido-1 (GLP-1) . El GLP-1 es liberado de las células en el intestino en respuesta al alimento. El GLP-1 se enlaza a receptores GLP-1 en células beta del páncreas, estimulando la liberación de insulina. El GLP-1 [7-36] NH2, también conocido como proglucagon [ 78-107 ] y más comúnmente como "GLP-1," tiene un efecto insulinotrópico , estimulando la secreción de insulina; el GLP-1 también inhibe la secreción de glucagón [Orskov, et al., Diabetes 42:658-61, 1993; D'Alessio, et al., J. Clin. Invest. 97:133-38, 1996]. El GLP-1 es reportado por inhibir el vacío gástrico [Williams B . , et al., J. Clin. Encocrinol Metab. 81 :( 1 ): 327-32 , 1996; Wettergren A., et al., Dig. Dis. Sci. 38 : ( 4 ) : 665-73 , 1993], y secreción de ácido gástrico. [Schjoldager B.T., et al., Dig. Dis. Sci. 34 (5) :703-8 , 1989; O'Halloran D.J., et al., J. Endocrinol. 126 ( 1 ): 169-73 , 1990; Wettergren A. , et al., Dig. Dis. Sci. 38: (4) : 665-73, 1993]. GLP-1 [7-37] , el cual tiene un residuo de glicina adicional en su término carboxi, también estimula la secreción de insulina en humanos [Orskov, et al., Diabetes 42:658-61, 1993]. Un receptor acoplado a adenilato-ciclasa de la proteina G de la transmembrana, se cree es responsable del efecto insulinotrópico de GLP-1, se reporta por haber sido clonado de una linea de células a. beta. [Thorens, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:8641-45, 1992]. Una limitación principal de GLP-1 para terapéuticos es su rápida degradación por la enzima ubicua dipeptidil dipeptidasa-IV (DDP-IV) . Los inhibidores de DPP-IV (LAF237; MK-0431), han sido usados para mejorar la duración de la actividad GLP-1 endógena. La Administración de Alimentos y Fármacos Estadounidense ( FDA) , aprobó la JANUVIA™ ( sitagliptina fosfato), Merck & Co . , Inc., un inhibidor de DPP-IV oral disponible en los Estados Unidos para el tratamiento de diabetes tipo 2. Un método para el tratamiento de enfermedades metabólicas en un mamífero comprende coadministración de un compuesto capaz de enlazarse a un sitio de enlace secundario de DPP-IV y enzimas similares a DPP-IV y al menos un agente anti-diabético se describe en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 20060234940. Miméticos de incretina son una clase de fármacos que imitan las acciones antidiabéticas o que reducen la glucosa de hormonas de incretina humana que se origina naturalmente como GLP-1. Las acciones de miméticos de incretina incluyen, estimular la capacidad del cuerpo para producir insulina en respuesta a niveles de azúcar elevados en la sangre, inhibir la liberación de la hormona glucagón, reducir la absorción de nutriente en la corriente sanguínea, reducir la relación de vacío gástrico, promover la saciedad y reducir la absorción de alimento. Los miméticos de incretina se desarrollaron para uso en el tratamiento de diabetes tipo 2 e incluyen, los siguientes: derivados de GLP-1 (Liraglútido y CJC-1131), y Exenatida. El CJC-1131 (ConjuChem, Montreal, Canadá) tiene un enlazador reactivo que permite el enlace covalente a albúmina de suero que resulta en resistencia incrementada a degradación de DPP-IV. El liraglútido (Novo Nordisk, Copenhague, Denmark) es un derivado de GLP-1 diseñado para superar los efectos de la degradación de DPP-VI vía la acilación con una cadena de ácido graso. La estructura de liragúlido se muestra en WHO Drug Information, Vol . 17, No. 2 (2003) . La invención incluye modificaciones de GRP por unión de un grupo hidrofóbico, tal como ácidos grasos al péptido. Ejemplos adicionales de derivados modificados de GLP-1 con propiedades farmacocinéticas deseables se describen en Knudsen et al., J. Med. Chem. 43:1664-1669, 2000, y están por este medio, incorporadas por referencia. Estos compuestos de GLP-1 son derivatizados con ácidos grasos para prolongar su acción facilitando el enlace a albúmina de suero. Se describen los siguientes péptidos precursores y sustituciones de acilo: K8R26' 34-GLP-l ( 7-37 ) ( K8 : ?-Glu-Cl 6 ) ; K18R26' 34-GLP-l ( 7 -37) (K18: Y-G1U-C16) ; K23R26' 34-GLP-l ( 7 -37 ) ( K23 : ?-Glu-Cl 6 ) ; R34-GLP-K7-37) ( K26 : ?-Glu-Cl 6 ) ; K27R2S' 34-GLP- 1 ( 7-37 ) (K7:y-Glu-C16) ; R26-GLP-1 (7-37) (K34 : Y~G1U-C16) ; K36R26'34-GLP-1 (7-37 ) (K36: Y-G1U-C16) ; R26' 34-GLP-l ( 7-38 ) ( K38 : ?-Glu-Cl 6 ) ; GLP-l(7-37) (K26'34:bis-C16-diácido) ; GLP-l(7-37) ( K26' 34 : bis-Y-Glu-Cl 6 ) ; GLP-K7-37) (K26'34:bis-Y-Glu-C14; GLP-l(7-37) ( K26' 34 : bis-C12-diacid) ; R34-GLP-1 (7-37 ) (K26: C16-diácido) ; R34 GLP-l(7-37) (K26: C14-diácido) ; R34-GLP-1 ( 7-37 ) ( K26 : Y-G1U-C18 ) ; R34-GLP- 1(7-37) (K26 : ?-Glu-Cl4 ) ; R3 -GLP-1 ( 7-37 ) ( K26 : y-Glu-C12 ) ; desamino-H7R34-GLP-l (7-37) ( K26 : y-Glu-Cl 6 ) ; R34-GLP-1 ( 7-37 ) (K26: GABA-C16); R34-GLP-1 ( 7-37 ) (K26: p-Ala-C16); R3-GLP-1(7- 37) (K26: Iso-Nip-C16) ; desamino-H7R26-GLP-l ( 7-37 ) (K34:Y-G1U-C16) ; desamino-HR26-GLP-l (7-37) (K34:C8); desamino-H7R26-GLP- 1(7-37) (K34: Y-G1U-C8) ; K36'34-GLP-1 (7-36) (K36: C20-diácido) ; K36'34-GLP-1 (7-36) (K36:C16-diácido) ; K36'34-GLP-1 (7-36) (?36:?-G1U-C18); R26'34-GLP-1 (7-38) ( K38 : Cl 6-diácido ) ; R26' 34-GLP-l ( 7- 38) (K38:C12-diácido) ; R26' 34-GLP-l ( 7-38 ) (K38 : y-Glu-C18 ) ; R26'34-GLP-K7-38) (K38 : y-Glu-C14 ) ; C8R26' 34-GLP-l ( 7-38 ) (K38:y-Glu- C16); E37R6'34-GLP-1 (7-38) ( K38 : y-Glu-Cl 6 ) ; E37C8R26' 34-GLP-l ( 7-38) (K38: Y-G1U-C16) ; y E37C8R26' 3 -GLP-l ( 7-38 ) ( K38 : Y~G1U-C18 ) . La secuencia de aminoácido de GLP-1 se da i. a. por Schmidt, et al., Diabetologia 28:704-707 , 1985. El GLP-1 humano es un péptido de 37 residuos de aminoácido que se origina del preproglucano el cual es sintetizado, i. a en las células L en el íleo distal, en el páncreas y en el cerebro. El procesamiento de preproglucano a GLP-1 ( 7-36) amida, GLP-1(7-37) y GLP-2, ocurre principalmente en las células L. Aunque las propiedades farmacológicas interesantes de GLP-1(7-37) y análogos del mismo, ha atraído mucha atención en años recientes, solamente se sabe poco acerca de la estructura de estas moléculas. La estructura secundaria de GLP-1 en micelios ha sido descrita por Thorton, et al., Biochemistry 33:3532-3539, 1994), pero en solución normal, el GLP-1 es considerado una molécula muy flexible. El GLP-1 y análogos de GLP-1 y fragmentos del mismo, son empleados i. a en el tratamiento de diabetes Tipo 1 y Tipo 2 y obesidad. Los análogos de GLP-1, fragmento de GLP-1 y derivados funcionales de GLP-1 descritos en Holst, J. , Expert Opin. Emerg. Drugs 9 ( 1 ) : 155-161 , 2004; Rolin, R. , et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283 : El 5-E752 , 2002; Deacon, C., Diabetes 53:2181-2187, 2004; Perry, T., et al., Trends Pharmacol. Sci. 24 (7 ): 377-383, 2003; Holz, G., et al., Curr. Med. Chem. 10 (22 ): 2471-2481, 2003; Naslund, E., et al., Regul. Pept. 106:89-95, 2002; solicitudes de patentes WO 87/06941; O 90/11296; WO 91/11457; patentes EP 0708179-A2 y EP 0699686-A2, están incorporados por referencia aquí en su totalidad; El documento WO 87/06941 describe fragmentos de GLP-1, que incluyen GLP-1 (7-37), y derivados funcionales del mismo y a su uso como un agente insulinotrópico . El documento WO 90/11296 describe fragmentos GLP-1, que incluyen GLP-1 (7-36), y derivados funcionales del mismo, los cuales tienen actividad insulinotrópica la cual excede la actividad insulinotrópica de GLP-1 (1-36) o GLP-1 (1-37) y a su uso como agentes insulinotrópicos . El documento WO 91/11457 describe análogos de péptidos GLP-1 activos 7-34, 7-35, 7-36, y 7-37 los cuales pueden ser empleados como porciones GLP-1. El documento 0708179-A2 (Eli Lilly & Co . ) describe análogos de GLP-1 y derivados que incluyen un grupo imidazol N-terminal y opcionalmente un grupo acilo Ce -Cío no ramificado unido al residuo lisina en la posición 34. El documento EP 0699686-A2 (Eli Lilly & Co.) describe ciertos fragmentos truncados N-terminales de GLP-1, que son reportados por ser biológicamente activos. La secuencia de aminoácido de GLP-1 (1-37) es: HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEC ID NO: 1) . La secuencia de aminoácido de GLP-1 (7-37) es: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEC ID NO: 2). La secuencia de aminoácido de GLP-1 (7-36) es: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEC ID NO: 3) . La secuencia de aminoácido de GLP-1 (7-34) es: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK (SEC ID NO: 4).

La secuencia de aminoácido de GLP-1 (9-36) es: EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEC ID NO: 5), Los análogos de GLP-1 listados anteriormente, tienen resistencia incrementada a DPP-IV. La secuencia de aminoácido del análogo de GLP-1 GG es : HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEC ID NO: 6) . La secuencia de aminoácido del análogo de GLP-1 GGi es: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSS (SEC ID NO: 7) . La secuencia de aminoácido del análogo de GLP-1 GG2 es: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAP (SEC ID NO: 8) . La secuencia de aminoácido del análogo de GLP-1 GG3 es: HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS (SEC ID NO: 9) . La secuencia de aminoácido del análogo de GLP-1 GLP-1 ET es: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA LVKGGPSSGAPPPS (SEC ID NO: 10) . La secuencia de aminoácido del análogo sintético de LGP-1 NN2211 es: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK*EFIAWLVRGRG (SEC ID NO: 11) en donde K* en la posición 26 de la cadena de aminoácido es modificada por acilación para generar una cadena lateral hexadecanoilo (es decir, ?-?-e- (?-Glu (??-a-hexadecanoilo) . La secuencia de aminoácido del análogo sintético GLP-1 CJC-1131 es: HA*EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK* (SEC ID NO: 12) en donde A* en la posición 8 de la cadena de aminoácido es una D-alanina sustituida por una L-alanina y la K* en la posición 37 de la cadena de aminoácido tiene un enlazador [2- [2- [2-maleimidopropionamido ( etoxi ) etoxi ] acetamida en su grupo amino e. La secuencia de aminoácido del análogo sintético de GLP-1 LY315902 es: des-HAEG FTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVK*GRG (SEC ID NO: 13), en donde el residuo de histidina en el N-término (des-H) , no contiene un grupo amino y la K* en la posición 34, es modificada por acilación para generar una cadena lateral octanoilo (es decir, K_ ( oxtanoilo) ) . De conformidad con la invención, el GLP-1 también incluye las bases libres, sales de adición de ácido o sales metálicos, tales como sales de potasio o sodio de los péptidos y los péptidos GLP-1 que han sido modificados por tales procesos como amidación, glicosilación, acilación, sulfatación, fosforilación, acetilación, ciclización y otros métodos de modificación covalente conocidos.

Exendinas y Agonistas de Exendinas Incluidos dentro de la invención son análogos, fragmentos y derivados funcionales de proteínas y péptidos de exendinas. Las exendinas son péptidos que fueron primero aislado a partir de las secreciones salivares de monstruo de Gila, un lagarto encontrado en Arizona, y el lagarto Bordado Mexicano. La exendina-3 está presente en las secreciones salivares de Heloderma horrídum, y exendina-4 está presente en las secreciones salivares de Heloderma suspectum [Eng, J. , et al., J. Biol. Chem. 265:20259-62, 1990; Eng., J. , et al., J. Biol. Chem. 267:7402-05, 1992]. Las exendinas tienen alguna secuencia similar a varios miembros de la familia del péptido similar al glucagón, en donde la homología más alta, 53%, es para la hormona incretina GLP-1 [ 7-36 ] H .2 [Goke, et al., J. Biol. Chem. 268:19650-55, 1993]. El nombre genérico para exendina-4 sintético es exenatida [ WHO Drug Information, Vol. 18, No. 1, 2004]. La exenatida es una Exendina-4 sintética. La exenatida espejea los efectos de GLP-1, pero es más potente debido a su resistencia a la degradación de DPP-IV. La BYETTA© es la versión comercialícente disponible de exenatida (Amylin & Lilly) . La FDA Estadounidense aprobó la inyección de BYETTA (Exenatida) como una terapia adyuntiva a la diabetes tipo 2 en donde el tratamiento de metformina oral y/o sulfonilurea no son adecuados para lograr el control glicémico. Además de mejorar el control glicémicos, sujetos en estudios que usan exenatida también experimentan pérdida de peso. La presente invención se dirige a nuevos métodos para tratar diabetes y condiciones que podrían ser beneficiadas reduciendo la glucosa del plasma o retardando y/o reduciendo el vacío gástrico o inhibiendo la absorción de alimento que comprende la administración intranasal de una exendina, un análogo de exendina, un agonista de exendina, una exendina modificada, un análogo de exendina modificado, o un agonista de exendina modificada, o cualquiera de las combinaciones del mismo, por ejemplo: Exendina-3 : His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEC ID NO: 14), o, exendina-4 (exendina-4 sintética (exenatida) ) : His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser en donde la serina del C-término es amidada (SEC ID NO: 15) , o fragmentos insulinotrópicos de exendina-4: Exendina-4 (1-31) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro (SEC ID NO: 16); y.sup.31 Exendina-4 ( 1-31 ) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr (SEC ID NO: 17), o fragmentos inhibitorios de exendina-4: Exendina-4 ( 9-39 ) Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser (SEC ID NO: 18), u otros agonistas de exendina preferidos: exendina-4 (1-30) His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly (SEC ID NO: 19), exendina-4 (1-30) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly-NH.sub.2 (SEC ID NO: 20), exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Trp Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEC ID NO: 21), .sup.14 Leu,.sup.25 Phe exendina-4 amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser-NH.sub.2 (SEC ID NO: 22), .sup.14 Leu, .sup.25 Phe exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe lie Glu Phe Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEC ID NO: 23), y .sup.14 Leu, .sup.22 Ala, .sup.25 Phe exendina-4 (1-28) amida His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Ala lie Glu Phe Leu Lys Asn-NH.sub.2 (SEC ID NO: 24) . o secuencias incorporadas por referencia que han sido descritas en Patente Estadounidense No. 5,424,286; Patente Estadounidense No. 6,506,724; Patente Estadounidense No. 6,528,486; Patente Estadounidense No. 6,593,295; Patente Estadounidense No. 6,872,700; Patente Estadounidense No. 6,902,744; Patente Estadounidense No. 6,924,264; y Patente Estadounidense No. 6,956,026. u otros compuestos los cuales se enlazan efectivamente al receptor en el cual la exendina ejerce su acciones las cuales son benéficas en el tratamiento de diabetes y condiciones que podrían ser beneficiadas reduciendo la glucosa del plasma o retardando y/o disminuyendo el vacío gástrico o inhibiendo la absorción de alimento. El uso de exendina-3 y exendina-4 como agentes insulinotróficos para el tratamiento de diabetes mellitus y la prevención de hiperglicemia , se describe en la Patente Estadounidense No. 5,424,286. Las exendinas también se han mostrado por ser empleadas en la modulación de niveles de triglicéridos y tratar la dislipidemia . De este modo, la invención proporciona péptidos o fragmentos peptídicos, hechos sintéticamente o purificados de fuentes naturales, los cuales incluyen la actividad biológica de las exendinas o fragmentos de las mismas, como se describe por la presente especificación. De conformidad con la presente invención, las exendinas también incluyen las bases libres, sales de adición de ácido o sales metálicas, tales como sales de potasio o sodio de los péptidos, y péptidos de exendina que han sido modificados por tales procesos como amidación, glicosilación, acilación, sulfatación, fosforilación, acetilación, ciclización y otros métodos de modificación covalente bien conocidos . De este modo, de conformidad con la presente invención, los péptidos descritos anteriormente son incorporados en las formulaciones adecuadas para suministro transepitelial , especialmente suministro intranasal y dérmico .

Membranas Biológicas "Membrana biológica", es definida como material de membrana presente dentro de un organismo viviente, preferiblemente un animal, más preferiblemente un humano, que separa un área del organismo de otro. En muchos casos, la membrana biológica separa el organismo con su ambiente o alrededor externos. Ejemplos no limitantes de membrana biológica incluyen, las membranas mucosas y piel en el ser humano .

Agentes que Intensifican el Suministro Epitelial "Agentes que intensifican el suministro epitelial", son definidos como químicos y otros excipientes que, cuando se agregan a una formulación que comprende agua, sales y/o amortiguadores comunes y GRP (la formulación de control), producen una formulación que produce un incremento significante en el transporte de GRP a través de una membrana biológica como se mide por la concentración máxima de sangre, suero o fluido cerebro espinal (Cmax) o por el área bajo la curva AUC, en un trazo de concentración contra tiempo. Las membranas biológicas epiteliales pueden incluir las superficies mucosales nasal, oral, intestinal, bucal, broncopulmonar , vaginal, rectal y dérmica. Los agentes que intensifican el suministro transepitelial son algunas veces llamados portadores.

Agentes que Intensifican el Suministro Mucosal "Agentes que intensifican el suministro mucosal", son definidos como químicos y otros excipientes que, cuando se agregan a una formulación que comprende agua, sales y/o amortiguadores comunes y GRP (la formulación de control), producen una formulación que produce un incremento significante en el transporte de GRP a través de una mucosa, como se mide por la concentración máxima de sangre, suero o fluido cerebro espinal (Cmax) o por el área bajo la curva, AUC, en un trazo de concentración contra tiempo. Una mucosa incluye, las superficies mucosales nasal, oral, intestinal, bucal, broncopulmonar , vaginal y rectal, y en efecto, incluye todas las membranas que secretan moco que revisten todas las cavidades corporales o pasajes que comunican con el exterior. Los agentes que intensifican el suministro mucosal son algunas veces llamados portadores.

Formulación libre de endotoxina "Formulación libre de endotoxina", significa una formulación la cual contiene un GRP y uno o más agentes que intensifican el suministro epitelial que está sustancialmente libre de endotoxinas y/o sustancias pirogénicas relacionadas. Las endotoxinas incluyen toxinas que están confinadas dentro de un microorganismo y son liberadas solamente cuando los microorganismos son rotos o eliminados. Las sustancias pirogénicas incluyen, sustancias termoestables , que inducen fiebre (glicoproteínas ) de la membrana exterior de bacterias y otros microorganismos. Ambas sustancias pueden causar fiebre, hipotensión y apoplejía si se administra a humanos. Producir formulaciones que están libres de endotoxinas puede requerir equipo especial, artesanos expertos, y puede ser significantemente más costoso que hacer formulaciones que no están libres de endotoxinas. Debido a que la administración intravenosa de GLP o amilina, simultáneamente con infusión de endotoxinas en roedores, ha sido mostrada por prevenir la hipotensión y aún muerte asociada con la administración de endotoxina sola (Patente Estadounidense No. 4,839,343), produciendo formulaciones libres de endotoxinas de estos agentes terapéuticos, no podría esperar sea necesario para la administración no parenteral (no inyectado) .

Administración no infundida "Administración no infundida", significa cualquier método de suministro que no involucra una inyección directamente en una arteria o vena, un método el cual fuerza o acciona (típicamente un fluido) , en algo y especialmente para introducir en una parte del cuerpo por medio de una aguja, jeringa u otros métodos invasivos. La administración no infundida incluye inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal y los métodos sin inyección de suministro a una membrana biológica.

Métodos y Composiciones de Suministro Los métodos y composiciones mejoradas para administración epitelial de GRP a sujetos mamíferos, optimiza programas de dosificación de GRP. La presente invención proporciona suministro epitelial de GRP formulado con uno o más agentes que intensifican el suministro epitelial, en donde la liberación de dosificación de GRP es sustancialmente normalizada y/o sostenida por un periodo de suministro efectivo de intervalos de liberación de GRP desde aproximadamente 0.1 hasta 2.0 horas; 0.4 hasta 1.5 horas; 0.7 hasta 1.5 horas; o 0.8 hasta 1.0 horas; después de la administración epitelial. La liberación sostenida de GRP lograda, puede ser facilitada por administración repetida de GRP exógeno utilizando métodos y composiciones de la presente invención .

Composiciones y Métodos de Liberación Sostenida Las composiciones y métodos mejorados para administración epitelial de GRP a sujetos mamíferos, optimiza los programas de dosificación de GRP. La presente invención proporciona suministro epitelial mejorado (por ejemplo, nasal) de una formulación que comprende GRP en combinación con uno o más agentes que intensifican el suministro epitelial y un agente o agentes que intensifican la liberación sostenida. Agentes que intensifican el suministro epitelial de la presente invención, proporcionan un incremento efectivo en el suministro, por ejemplo, un incremento en la concentración máxima de plasma (Cmax) para mejorar la actividad terapéutica de GRP epitelialmente administrada. Un segundo factor que afecta la actividad terapéutica de GRP en el plasma de la sangre y el SNC es el tiempo de residencia (RT) . Los agentes que intensifican la liberación sostenida, en combinación con agentes que intensifican el suministro intranasal, incrementan la Cmax e incrementan el tiempo de residencia (RT) de GRP. Los vehículos de suministro polimérico y otros agentes y métodos de la presente invención que proporcionan formulaciones que intensifican la liberación sostenida, por ejemplo, se describe aquí polietilen glicol (PEG). La presente invención proporciona un método de suministro mejorado de GRP y forma de dosificación para el tratamiento de síntomas relacionados con obesidad, diabetes, hiperglicemia , síndrome metabólico, síndrome coronario, cáncer de colon, cáncer de exendina, cáncer de mama, infarto al miocardio, promoción de neurogénesis , supresión de apetito, promoción de pérdida de peso, y reducción de absorción de alimentos en sujetos mamíferos . Dentro de las formulaciones de suministro epitelial y métodos de la invención, el GRP es frecuentemente combinado o coordinadamente administrado con un portador o vehículo adecuado para suministro epitelial. Como se usa aquí, el término "portador", significa material rellenador, diluyente o encapsulante sólido o líquido farmacéuticamente aceptable. Un portador líquido que contiene agua puede contener aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, preservativos antimicrobianos, antioxidantes, agentes amortiguadores, agentes quelantes, agentes formadores de complejo, agentes solubilizantes, humectantes, solventes, agentes que incrementan la viscosidad y/o suspensión, agentes de tonicidad, agentes humectantes u otros materiales biocompatibles . Una tabulación de ingredientes listados por las categorías anteriores se puede encontrar en U.S. Pharmacopeia National Formulary, 1857-1859, 1990. Algunos ejemplos de los materiales los cuales pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y supositorios de cera; aceites tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya; glicoles tales como propilenglicol ; polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol ; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógeno; salina isotónica; solución de Ringer, alcohol etílico y soluciones amortiguadoras de fosfato, así como también otras sustancias compatibles no tóxicas usadas en formulaciones farmacéuticas. Agentes humectantes, emulsificadores y lubricantes tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como también agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, endulzantes, agentes saborizantes y perfumantes, preservativos y antioxidantes, pueden también estar presentes en las composiciones, de conformidad con los deseos del formulador. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, antioxidantes solubles en agua tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteina, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en agua tales como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propil galato, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes metálicos tales como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinada con los materiales portadores para producir una forma de dosificación, variará dependiendo del modo particular de administración . Dentro de las composiciones de suministro epitelial y métodos de la invención, varios agentes que intensifican el suministro son empleados, los cuales mejoran el suministro de GRP en o a través de una capa celular. En este sentido, el suministro de GRP a través del epitelio, puede ocurrir "intracelularmente" o "paracelularmente" . La magnitud en la cual estas trayectorias contribuyen al flujo total y biodisponibilidad del GRP, depende del ambiente de la membrana biológica, las propiedades psico-quimicas del agente activa, y las propiedades del epitelio. El transporte paracelular involucra solamente difusión pasiva, mientras el transporte transcelular puede ocurrir por procesos pasivos, facilitados o activos. En general, los solutos polares, pasivamente transportados, hidrofilicos , se difunden a través de la ruta paracelular, mientras más solutos lipofilicos usan la ruta transcelular. La absorción y biodisponibilidad (por ejemplo, como se refleja por un coeficiente de permeabilidad o ensayo fisiológico), para solutos diversos, pasivamente y activamente absorbidos, puede ser fácilmente evaluada en términos de componentes de suministro tanto paracelular como transcelular, por cualquier GRP seleccionado dentro de la invención. Para fármacos pasivamente absorbidos, la contribución relativa de trayectorias paracelulares e intracelulares al transporte del fármaco, depende del coeficiente de partición, pKa, radio molecular y carga del fármaco, el pH del ambiente luminal en el cual el fármaco es suministrado, y el área de la superficie de absorción. La ruta paracelular representa una fracción relativamente pequeña de área de superficie accesible del epitelio mucosal nasal. En términos generales, se ha reportado que las membranas celulares ocupan un área de superficie mucosa que es mil veces mayor que el área ocupada por los espacios paracelulares . De este modo, el área accesible más pequeña, y el tamaño y discriminación a base de carga contra la permeación macromolecular podría sugerir que la ruta paracelular podría ser una ruta en general menos favorable que el suministro transcelular para el transporte de fármaco. De manera sorprendente, los métodos y composiciones de la invención proporcionan transporte significantemente mejorado de bioterapéuticos en y a través del epitelio mucosal vía la ruta paracelular. Por lo tanto, los métodos y composiciones de la invención dirigen exitosamente ambas rutas paracelular y transcelular, alternativamente o dentro de un método o composición única. Como se usa aquí, agentes que intensifican el suministro epitelial incluyen agentes los cuales mejoran la liberación o solubilidad (por ejemplo, de un vehículo de suministro de formulación), tasa de difusión, capacidad y sincronización de penetración, absorción, tiempo de residencia, estabilidad, vida media efectiva, niveles de concentración sostenidos o máximos, separación y otras características de suministro epitelial deseadas (por ejemplo, medidas en el sitio de suministro, o en un sitio objetivo seleccionado de actividad tal como la corriente sanguínea o el sistema nervioso central) de GRP u otros compuestos biológicamente activos. La intensificación del suministro epitelial puede de este modo, ocurrir por cualquiera de una variedad de mecanismos, por ejemplo, incrementando la difusión, transporte, persistencia . o estabilidad de GRP, incrementando la fluidez de la membrana, modulando la capacidad o acción de calcio y otros iones que regulan la permeación intracelular o paracelular, solubilización de componentes de membrana (por ejemplo, lipidos), cabio de niveles de sulfhidrilo de proteina y no proteina en tejidos mucosales, incrementar el flujo del agua a través de la capa celular, modular la fisiología de unión epitelial, reducir la viscosidad del moco que traslapa el epitelio mucosa, reducir las tasas de separación mucociliares y otros mecanismos. Como se usa aquí, una "cantidad efectiva de GRP", contempla el suministro efectivo de GRP a un sitio dirigido para actividad de fármaco en el sujeto que puede involucrar una variedad de rutas de suministro o transferencia. Por ejemplo, un agente activo dado puede encontrar su forma a través de separaciones entre células de la mucosa y alcanzar una pared vascular adyacente, mientras por otra ruta el agente puede, ya sea pasivamente o activamente, ser tomado en células mucosales para actuar dentro de las células o ser descargadas o transportadas fuera de las células para alcanzar un sitio objetivo secundario, tal como la circulación sistémica. Los métodos y composiciones de la invención pueden promover la translocación de agentes activos a lo largo de una o más rutas alternas, o pueden actuar directamente sobre el tejido mucosal o tejido vascular próximo para promover la absorción o penetración de los agentes activos. La promoción de absorción o penetración en este contexto, no está limitada a estos mecanismos. Como se usa aquí, "concentración máxima (Cmax) de GRP en un plasma de sangre", "concentración de área bajo la curva (AUC) de GRP en un plasma de sangre", "tiempo a concentración máxima de plasma (tmax) de GRP en una sangre de plasma", son parámetros farmacocinéticos conocidos por un experto en la técnica. Laursen, et al., Eur. J. Endocrinology 235:309-315, 1996. La "concentración contra curva de tiempo", mide la concentración de GRP en un suero de sangre de un sujeto contra el tiempo después de la administración de una dosificación de GRP al sujeto ya sea por rutas de administración intranasal, intramuscular, subcutánea u otra parenteral. La "Cmax" es la concentración máxima de GRP en el suero de la sangre de un sujeto después de una dosificación única de GRP al sujeto. "Tmax" es el tiempo para alcanzar la concentración máxima de GRP en un suero de sangre de un sujeto después de la administración de una dosificación única de GRP al sujeto. Como se usa aquí, "concentración de área bajo la curva de tiempo (AUC) de GRP en un plasma de sangre", se calcula de conformidad con la regla trapezoidal lineal y con adición de las áreas residuales. Una reducción de 23% o un incremento de 30% entre dos dosificaciones podría ser detectada con una probabilidad de 90% (error ß tipo II = 10%) . La "tasa de suministro" o "tasa de absorción", es estimada por comparación del tiempo (tmax) para alcanzar la concentración máxima (Cmax) . Tanto Cmax como tmax, son analizadas usando métodos no paramétricos . Las comparaciones de las farmacocinéticas de administraciones de GRP intramusculares, subcutáneas, intravenosas e intranasales , se realizaron por análisis de varianza (ANOVA) . Para comparaciones en forma de par, se usa un procedimiento secuencial Bonferroni-Holmes para evaluar la significancia. La relación de respuesta de dosis entre las tres dosis nasales es estimada por análisis de regresión. P <0.05 es considerado significante. Los resultados se dan como valores medios +/- SEM. Mientras el mecanismo de promoción de absorción puede variar con diferentes agentes de la invención que intensifican el suministro epitelial, agentes útiles en este contexto no afectarán sustancialmente de manera adversa el tejido y serán seleccionados de conformidad con las características fisicoquímicas del GRP particular u otro agente de intensificación de suministro o activo. En este contexto, agentes que intensifican el suministro que incrementan la penetración o permeabilidad de tejidos mucosales, a menudo resultarán en alguna alteración de la barrera de permeabilidad protectora de la mucosa. Para tales agentes que intensifican el suministro para ser de valor dentro de la invención, se desea en general, que cualquier cambio significante en la permeabilidad de la membrana biológica sea reversible dentro de una estructura de tiempo apropiada a la duración deseada de suministro de fármaco. Además, no debe haber toxicidad cumulativa, sustancial, ni algún cambio deletéreo permanente inducido en las propiedades de barrera de la membrana biológica con uso de término largo. Dentro de ciertos aspectos de la invención, los agentes que promueven la absorción para administración coordinada o formulación combinatorial con GRP de la invención, se seleccionan de moléculas hidrofilicas pequeñas, que incluyen pero no se limitan a, dimetil sulfóxido (DMSO); dimetilformamida, etanol, propilenglicol , y 2-pirrolidonas . Alternativamente, moléculas anfipáticas de cadena larga, por ejemplo, deacilmetilsulfóxido, azona, laurilsulfato de sodio, ácido oleico y sales biliares, pueden ser empleados para mejorar la penetración de la membrana biológica del GRP. En aspectos adicionales, son empleados tensoactivos (por ejemplo, polisorbatos ) como compuestos adjuntos, agentes de procesamiento, o aditivos de formulación para mejorar el suministro transepitelial del GRP. Agentes tales como DMSO," polietilenglicol , y etanol, pueden si se presentan en concentraciones suficientemente altas en el ambiente de suministro (por ejemplo, por pre-administración o incorporación en una formulación terapéutica) , entrar en la fase acuosa de la mucosa y alterar sus propiedades solubili zantes , con ello, mejorar la división del GRP del vehículo en la membrana biológica. Agentes que intensifican el suministro epitelial adicional que son empleados dentro de la administración coordinada y métodos de procesamiento y formulaciones combinatoriales de la invención incluyen, pero no se limitan a, micelios mezclados, enaminas; donadores de óxido nítrico (por ejemplo, S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina , NOR1, NOR4, los cuales son preferiblemente co-administrados con un depurador de NO tal como carboxi-PITO o diclofenac sódico) ; salicilato de sodio; ésteres de glicerol de ácido acetoacético (por ejemplo, gliceril-1 , 3-diacetoacetato o 1,2-isopropilidenglicerina-3-acetoacetato) ; y otros agentes que promueven la liberación-difusión o intra o trans-penetración epitelial que son fisiológicamente compatibles para suministro epitelial. Otros agentes que promueven la absorción, se seleccionan de una variedad de portadores, bases y excipientes que mejoran el suministro epitelial, estabilidad, actividad o penetración trans-epitelial del GRP. Estos incluyen, entre otras cosas, ciclodextrinas y derivados de ß-ciclodextrinas (por ejemplo, 2-hidroxipropil-p- ciclodextrina y heptakis ( 2 , 6-di-O-met il- ß-ciclodextrina ) . Estos compuestos, opcionalmente conjugados con uno o más de los ingredientes activos y además, opcionalmente formulado en una base oleaginosa, mejora la biodisponibilidad en las formulaciones epiteliales de la invención. Agentes que mejoran la absorción adicional aún, adaptados para suministro epitelial incluyen ácidos grasos de cadena media, que incluyen mono y diglicéridos (por ejemplo, extractos de caprato sódico de aceite de coco, Capmul), y triglicéridos (por ejemplo, amilodextrina , Estaram 299, Migliol 810). Las composiciones terapéuticas epiteliales y profilácticas de la presente invención, pueden ser suplementadas con cualquier agente que promueve la penetración, que facilita la absorción, difusión o penetración de GRP a través de las barreras de membrana biológica. El promotor de penetración puede ser cualquier promotor que es farmacéuticamente aceptable. De este modo, en aspectos más detallados de las composiciones de la invención, se proporciona que incorporan uno o más agentes que promueven la penetración, seleccionados de salicilato de sodio y derivados de ácido salicilico (acetil salicilato, salicilato de colina, salicilamida, etc.); aminoácidos y sales de los mismos (por ejemplo, ácidos monoaminocarboxilicos tales como glicina, alanina, fenilalanin , prolina, hidroxiprolina , etc.; hidroxiaminoácidos tales como serina; aminoácidos acídicos tales como ácido aspártico, ácido glutámico, etc.; y aminoácidos básicos tales como lisina etc. -inclusiva de sus sales de metales álcalis o metales alcalino térreos); y N-acetilamino ácidos (N-acetilalanina, N-acetilfenilalanina, N-acetilserina , N-acetilglicina , N-acetillisina, ácido N-acetilglutámico, N-acetilprolina, N-acetilhidroxiprolina, etc.) y sus sales (sales de metales álcalis y metales alcalino térreos). También proporcionados como agentes que promueven la penetración con los métodos y composiciones de la invención, están sustancias las cuales son en general usadas como emulsificadores (por ejemplo, oleil fosfato de sodio, lauril fosfato de sodio, laurilsulfato de sodio, miristil sulfato de sodio, polioxietilenalquil éteres, polioxietilenalquil ésteres, etc.), ácido caproico, ácido láctico, ácido málico y ácido cítrico y sales de metales álcalis del mismo, ácidos pirrilidincarboxílico, ésteres de ácido alquilpirrolidoncarboxílico, N-alquilpirrolidonas , ésteres de acil prolina y similares. Dentro de varios aspectos de la invención, se proporcionan formulaciones y métodos de suministro mucosal nasal mejorados, que permiten el suministro de GRP y otros agentes terapéuticos dentro de la invención a través de las barreras de membrana biológica entre la administración y sitios objetivo seleccionado. Ciertas formulaciones son específicamente adaptadas para una célula, tejido u órgano objetivo seleccionado, o aún un estado de enfermedad particular. En ciertos aspectos, formulaciones y métodos proporcionados por endo o transcitosis eficiente, selectiva de GRP específicamente ruteado junto con una trayectoria intracelular o intercelular definida. Típicamente, la GRP es eficientemente cargada a niveles de concentración efectivos en un portador u otro vehículo de suministro, y es suministrado y mantenido en una forma estabilizada, por ejemplo, en la mucosa nasal y/o durante el pasaje a través de compartimientos intracelulares y membranas a un sitio objetivo remoto de acción de fármaco (por ejemplo, la corriente de sangre o un tejido definido, órgano o compartimiento extracelular ) . El GRP puede ser proporcionado en un vehículo de suministro o de otro modo modificado (por ejemplo, en la forma de un profármaco), en donde la liberación o activación del GRP es activada por un estímulo fisiológico (por ejemplo, cambio de pH, enzimas lisosomales, etc.). A menudo, el GRP es farmacológicamente inactivo hasta que alcanza su sitio objetivo por actividad. En muchos casos, el GRP y otros componentes de formulación son no tóxicos y no inmunogénicos . En este contexto, portadores y otros componentes de formulación son en general seleccionados por su capacidad para ser rápidamente degradados y excretados bajo condiciones fisiológicas. Al mismo tiempo, las formulaciones son químicamente y físicamente estables en forma de dosificación para almacenamiento efectivo.

Péptidos y Análogos de Proteina y Miméticos Incluidos dentro de la definición de péptidos y proteínas biológicamente activos para uso dentro de la invención, están péptidos sintéticos, terapéuticamente o profilácticamente activos (comprendidos de dos o más aminoácidos covalentemente ligados), proteínas, péptidos o fragmentos de proteínas, péptidos o análogos de proteínas y derivados químicamente modificados o sales de péptidos o proteínas activos. Una amplia variedad de análogos y miméticos útiles de GRP están contemplados para uso dentro de la invención, y pueden ser producidos y probados por su actividad biológica de conformidad con métodos conocidos. A menudo, los péptidos o proteínas de GRP u otros péptidos o proteínas biológicamente activos para uso dentro de la invención, son muteínas que son fácilmente obtenibles por sustitución, adición o supresión parcial de aminoácidos dentro de un péptido o secuencia de proteína que se origina naturalmente o nativa (por ejemplo, mutante que se origina naturalmente, de tipo nativo, o variante alélica). Adicionalmente , los fragmentos biológicamente activos de péptidos o proteínas están incluidos. Tales derivados y fragmentos mutantes retienen sustancialmente la actividad biológica deseada del péptido o proteínas nativas. En el caso de péptidos o proteínas que tienen cadenas de carbohidratos, las variantes biológicamente activas marcadas por alteraciones en estas especies de carbohidratos, también están incluidas dentro de la invención. Como se usa aquí, "sustitución de aminoácido conservativo", se refiere a la capacidad de intercambio general de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo comúnmente intercambiable de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida, es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro. Del mismo modo, la presente invención contempla la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina y entre treonina y serina. Adicionalmente, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro o la sustitución de un residuo acidico tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro, también se contempla. Grupos de sustitución de aminoácidos conservativos ejemplares son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina . Alineando un péptido o proteina análoga óptimamente con un péptido o proteina nativa correspondiente, y usando ensayos apropiados, por ejemplo, proteina de adhesión o ensayo de enlace de receptor, para determinar una actividad biológica seleccionada, se puede identificar fácilmente, análogos de proteina y péptido operables para uso dentro de los métodos y composiciones de la invención. Análogos de proteínas y péptidos operables son típicamente específicamente inmunoreactivos con anticuerpos originados al péptido o proteína nativa correspondiente. Un procedimiento para estabilizar formulaciones de proteínas sólidas de la invención, es incrementar la estabilidad física de proteína liofilizada, por ejemplo, purificada. Esto inhibirá la agregación vía interacciones hidrofóbicas , así como también vía trayectorias covalentes que pueden incrementar conforme las proteínas se despliegan. Las formulaciones estabilizantes en este contexto, a menudo incluyen formulaciones a base de polímeros, por ejemplo, un sistema de formulación/suministro de hidrogel biodegradable . Como se notó anteriormente, el papel crítico del agua en la estructura de proteina, función y estabilidad, es bien conocido. Típicamente, las proteínas son relativamente estables en el estado sólido con volumen de agua removido. Sin embargo, las formulaciones de proteína terapéutica sólida pueden llegar a ser hidratadas después del almacenamiento a humedades elevadas o durante el suministro de una composición o dispositivo de liberación sostenida. La estabilidad de proteínas en general cae con el incremento de hidratación. El agua puede también jugar un papel significante en la agregación de proteína sólida, por ejemplo, incrementando la flexibilidad de proteína que resulta en accesibilidad incrementada de grupos reactivos, proporcionando una fase móvil para reactivos, y sirviendo como un reactivo en varios procesos deletéreos tales como beta-eliminación e hidrólisis. Las preparaciones de proteína que contienen entre aproximadamente 6% hasta 28% de agua, son las más inestables. Por debajo de este nivel, la movilidad de enlaces de agua y porciones internas de proteína son bajos. Arriba de este nivel, la movilidad del agua y porciones de proteína alcanzan aquellas de la hidratación completa. Hasta un punto, la susceptibilidad incrementada hacia la agregación de fase sólida con hidratación incrementada, ha sido observada en varios sistemas. Sin embargo, a contenido de agua superior, se observa menos agregación debido al efecto de dilución. De conformidad con estos principio, un método efectivo para estabilizar péptidos y proteínas contra agregación de estado sólido para suministro mucosal, es controlar el contenido de agua en una formulación sólida y mantener la actividad del agua en la formulación a niveles óptimos. Este nivel depende de la naturaleza de la proteína, pero en general, las proteínas mantenidas por debajo de su cobertura de agua "monocapa", exhibirán estabilidad de estado sólido superior. Se proporciona una variedad de aditivos, diluyentes, bases y vehículos de suministro dentro de la invención, que controlan efectivamente el contenido de agua para mejorar la estabilidad de la proteína. Estos reactivos y materiales portadores efectivos como agentes anti-agregación en este sentido incluyen, por ejemplo, polímeros de .varias funcionalidades, tales como polietilenglicol , dextran, dimetilaminoetil dextran y carboximetilcelulosa , los cuales incrementan significantemente la estabilidad y reducen la agregación de fase sólida de péptidos y proteínas mezclados junto con éstos o ligados a estos. En algunos casos, la actividad o estabilidad física de las proteínas también puede ser mejorada por varios aditivos a soluciones acuosas del péptido o fármacos de proteína. Por ejemplo, aditivos tales como polioles (que incluyen azúcares), aminoácidos, proteínas tales como colágeno y gelatina y varias sales, pueden ser usados.

Ciertos aditivos, en particular azúcares y otros polioles, también imparten estabilidad física significante a proteínas liofilizadas , por ejemplo, secas. Estos aditivos también pueden ser usados dentro de la invención para proteger las proteínas contra la agregación no solamente durante la liofilización, sino también durante el almacenamiento en el estado seco. Por ejemplo, sacarosa y Ficoll 70 (un polímero con unidades de sacarosa) , exhiben protección significante contra péptido o agregación de proteína durante la incubación de fase sólida bajo varias condiciones.. Estos aditivos también pueden mejorar la estabilidad de proteínas sólidas incrustadas con matrices poliméricas . Aún aditivos adicionales, por ejemplo, sacarosa, estabilizan proteínas contra la agregación en estado sólido en atmósferas húmedas a temperaturas elevadas, como puede ocurrir en ciertas formulaciones de liberación sostenida de la invención. Proteínas tales como gelatina y colágeno, también sirven como agentes estabilizantes o de volumen para reducir la desnaturalización y agregación de proteínas inestables en este contexto. Estos aditivos pueden ser incorporados en procesos de fusión polimérica y composiciones dentro de la invención. Por ejemplo, micropartículas de polipéptido pueden ser preparadas liofilizando simplemente o atomizando por secado una solución que contiene varios aditivos estabilizantes descritos anteriormente. La liberación sostenida de péptidos y proteínas no agregados puede con ello, obtenerse sobre un periodo prolongado de tiempo . Varios componentes y métodos preparativos adicionales, así como también aditivos de formulación específicos, se proporcionan aquí, los cuales proporcionan formulaciones para suministro epitelial de péptidos y proteínas de agregación propensos, en donde el péptido o proteína es estabilizado en una forma sustancialmente pura, no agregada usando un agente de solubilización . Un intervalo componentes y aditivos están contemplados para uso dentro de estos métodos y formulaciones. Ejemplares de estos agentes de solubilización son ciclodextrinas (CDs), las cuales enlazan selectivamente cadenas laterales hidrofóbicas de polipéptidos . Estas CD se han encontrado por enlazarse a parches hidrofóbicos de proteínas en una manera que inhibe significantemente la agregación. Esta inhibición es selectiva con respecto a tanto la CD como a la proteína involucrada. Tal inhibición selectiva de agregación de proteína proporciona ventajas adicionales dentro de los métodos de suministro intranasal y composiciones de la invención. Agentes adicionales para uso en este contexto incluyen, dímeros, trímeros y tetrámeros de CD con geometrías variantes controladas por los enlazadores que específicamente bloquean la agregación de péptidos y proteínas. Aún agentes de solubilización y métodos para incorporación dentro de la invención involucran, el uso de péptidos y miméticos peptídicos para bloquear selectivamente las interacciones de proteína-proteína. En un aspecto, el enlace específico de cadenas laterales hidrofóbicas reportado para multímeros de CD, se extiende a proteínas vía el uso de péptidos y miméticos peptídicos que bloquean similarmente la agregación de proteína. Un amplio intervalo de métodos adecuados y agentes de anti-agregación son disponibles para incorporación dentro de las composiciones y procesos de la invención.

Modificación de Carga y Agentes de Control de pH y Métodos Para mejorar las características de transporte de agentes biológicamente activos (que incluyen GRP, otros péptidos y proteínas activos, y fármacos moleculares pequeños y macromoleculares ) para suministro mejorado a través de las barreras de membrana biológica hidrofóbica, la invención también proporciona técnicas y reactivos para modificación de carga de agentes biológicamente activos seleccionados o agentes que intensifican el suministro descritos en este documento. En este sentido, las permeabilidades relativas de macromoléculas están en general, relacionada a sus coeficientes de división. El grado de ionización de moléculas, el cual es dependiente del pKa de la molécula y el pH en la superficie de la membrana biológica, también afecta la permeabilidad de las moléculas. La permeación y división de los agentes biológicamente activos, que incluyen GRP y análogos de la invención, para suministro epitelial, puede ser facilitada por alteración de carga o dispersión de carga del agente activo o agente permeabilizante, lo cual se logra por ejemplo, por alteración de grupos funcionales cargados, modificando el pH del vehículo de suministro o solución en la cual el agente activo es suministrado, o por administración coordinada de un reactivo que altera el pH o carga con el agente activo. Consistente con estas enseñanzas generales, el suministro epitelial de especies macromoleculares cargadas, que incluyen GRP y otros péptidos y proteínas biológicamente activas, dentro de los métodos y composiciones de la invención, es sustancialmente mejorado cuando el agente activo es suministrado a la superficie epitelial en un estado de carga eléctrica sustancialmente no ionizada o neutral. Ciertos GRP y otros componentes de proteínas y péptidos biológicamente activos de formulación epitelial para uso dentro de la invención, serán modificados de carga para proporcionar un incremento en la densidad de carga positiva del péptido o proteína. Estas modificaciones se extienden también a cationización de conjugados de péptido y proteína, portadores y otras formas de suministro descritas aquí. La cationización ofrece un medio conveniente para alterar la biodistribución y propiedades de transporte de proteínas y macromoléculas dentro de la invención. La cationización es emprendida en una manera que sustancialmente preserva la actividad biológica del agente activo y limita los efectos laterales potencialmente adversos, que incluyen el daño y toxicidad de tejidos. Un "amortiguador" es en general, usado para mantener el pH de una solución a un valor cercanamente constante. Un amortiguador mantiene el pH de una solución, o aún, cuando cantidades menores de ácido fuerte o base fuerte son agregados a la solución, previniendo o neutralizando los cambios de carga en concentraciones de iones de hidrógeno e hidróxido. Un amortiguador en general, consiste de un ácido débil y su sal apropiada (o una base débil y su sal apropiada) . La sal apropiada para un ácido débil contiene los mismos iones negativos como se presentan en el ácido débil (véase, Lagowski, Macmillan Encyclopedia of Chemistry, Vol. 1, Simón & Schuster, New York, 1997, p. 273-4). La ecuación Henderson-Hasselbach, pH = pKa + loglO [A-]/ [HA], es usada para describir un amortiguador, y se basa en la ecuación estándar para disociación de ácido débil, HA — H+ + A- . Ejemplos de fuentes de amortiguador comúnmente usadas incluyen las siguientes: glutamato, acetato, citrato, glicina, histidina, arginina, lisina, metionina, lactato, formiato, glicolato, tartrato y mezclas de los mismos. La "capacidad amortiguadora", significa la cantidad de ácido o base que puede ser agregada a una solución amortiguadora antes de que ocurra un cambio de pH significante. Si el pH cae dentro del intervalo de pK-1 y pK+1 del ácido débil, la capacidad amortiguadora es apreciable, pero fuera de este rango, cae a tal magnitud que es de poco valor. Por lo tanto, un sistema dado solamente tiene una acción amortiguadora útil en un intervalo de una unidad de pH en cualquier lado del pK del ácido débil (o base débil) (véase Dawson, Data for Biochemical Research, Third Edition, Oxford Science Publications , 1986, p. 419) . En general, se eligen concentraciones adecuadas de manera que el pH de la solución es cercano al pKa del ácido débil (o base débil) (véase Lide, CRC Handbook of Chemistry and Physics, 86th Edition, Taylor & Francis Group, 2005-2006, p. 2-41) . Además, soluciones de ácidos y bases fuertes no son normalmente clasificadas como soluciones amortiguadores, y no exhiben capacidad amortiguadora entre los valores de pH 2.4 a 11.6.

Agentes Inhibitorios de Enzima Degradativa y Métodos Otro excipiente que puede ser incluido en una preparación transepitelial es un inhibidor de enzima degradativa. Complejos inhibidores de polímero-enzima mucoadhesivos ejemplares que son empleados dentro de las formulaciones de suministro epitelial y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a: Carboximetilcelulosa-pepstatina (con actividad anti-pepsina) ; poli (ácido acrilico ) -inhibidor Bowman-Birk (anti-quimiotripsina) ; poli (ácido acrilico) -quimiostatina (anti-quimiotripsina) ; poli (ácido acrilico ) -elastatinal ( anti-elastasa) ; Carboximetilcelulosa-elastatinal (anti-elastasa) ; Policarbofilo-elastatinal (anti-elastasa) ; Quitosan-antipaina (anti-tripsina) ; poli (ácido acrilico ) -bacitrina (anti-aminopeptidasa N) ; Quitosan-EDTA ( anti-aminopeptidasa N, anti-carboxipeptidasa A) ; Quitosan-EDTA-antipaina (antitripsina, antiquimiotripsina , anti-elastasa) . Como se describe en más detalle adicional abajo, ciertas modalidades de la invención incorporarán opcionalmente un nuevo derivado de quitosan o forma químicamente modificada de quitosan. Un nuevo derivado para uso dentro de la invención se denota como polímero ß- [ 1—>4 ] -2-guanidino-2-desoxi-D-glucosa (poli-GuD) . Cualquier inhibidor que inhibe la actividad de una enzima para proteger los agentes biológicamente activos, puede ser útilmente empleado en las composiciones y métodos de la invención. Los inhibidores enzimáticos útiles para la protección de proteínas y péptidos biológicamente activos incluyen, por ejemplo, inhibidores de dipeptidil aminopeptidasa (DPP) IV, inhibidor de tripsina de soya, inhibidor de tripsina exendina, inhibidor de quimiotripsina e inhibidor de tripsina y quimiotripsina aislado de tubérculos de papa (solanum tuberosum L) . Una combinación o mezclas de inhibidores puede ser empleada. Inhibidores adicionales de enzimas proteolit icas para uso dentro de la invención incluyen, enzima ovomucoide, gabaxato mesilato, alfa 1-antitripsina, aprotinina, amastatina, bestatina, puromicina, bacitracina, leupepsina, alfa2-macroglobulina, pepstatina e inhibidor de tripsina de huevo blanco o soya. Estos y otros inhibidores pueden ser usados solos o en combinación. Los inhibidores pueden ser incorporados en o unidos a un portador, por ejemplo, un polímero hidrofílico, revestido en la superficie de la forma dosificada la cual está en contacto con la mucosa nasal, o incorporado en la fase superficial de la superficie, en combinación con el agente biológicamente activo en una formulación separadamente administrada (por ejemplo, pre-administrada ) (por ejemplo, pastillas orales). La cantidad del inhibidor, por ejemplo, de inhibidor enzimático proteolítico que es opcionalmente incorporada en las composiciones de la invención, variará dependiendo de (a) las propiedades del inhibidor específico, (b) el número de grupos funcionales presentes en la molécula (la cual puede se puede hacer reaccionar para introducir insaturación etilénica necesaria para copolimerización con monómeros que forman hidrogel), y (c) el número de grupos lectina, tales como glicósidos, los cuales están presentes en la molécula inhibidora. También pueden depender del agente terapéutico especifico que es propuesto para ser administrado. Hablando de manera general, una cantidad útil de un inhibidor enzimático es desde aproximadamente 0.1 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, a menudo, desde aproximadamente 0.2 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, y más comúnmente, desde aproximadamente 0.5 mg/ml hasta 5 mg/ml de la formulación (es decir, una formulación inhibidora de proteasa separada o formulación combinada con el inhibidor y agente biológicamente activo) . En el caso de inhibición de tripsina, inhibidores adecuados pueden ser seleccionados de por ejemplo, aprotinina, BBI, inhibidor de tripsina de soya, ovomucoide de pollo, ovoinhibidor de pollo, inhibidor de tripsina exendina humana, mesilato camostat, inhibidores flavonoides, antipaina, leupeptina, p-aminobenzamidina , AEBSF, TLCK (tosilisina clorometilcetona ) , APMSF, DFP, PMSF y derivados de poli ( acrilato ) . En el caso de inhibición de quimiotripsina , inhibidores adecuados pueden ser seleccionados de por ejemplo, aprotinina, BBI, inhibidor de tripsina de soya, quimioestatina , benciloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, FK-448, ovoinhibidor de pollo, complejos de ácidos bifenilborónicos de azúcar, DFP, PMSF, ß-fenilpropionato, y derivados de poli (acrilato) . En el caso de inhibición de elastasa, los inhibidores adecuados pueden ser seleccionados de por ejemplo, elastinal, metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-clorometilcetona (MPCMK) , BBI, inhibidor de tripsina de soya, ovoinhibidor de pollo, DFP y PMSF. Inhibidores enzimáticos adicionales para uso dentro de la invención, se seleccionan de un amplio intervalo de inhibidores no de proteina que varían en su grado de potencia y toxicidad. Como se describe en más detalle abajo, la inmovilización de estos agentes adjuntos a matrices u otros vehículos de suministro, o desarrollo de análogos químicamente modificados, puede ser fácilmente implementada para reducir o aún eliminar los efectos tóxicos, cuando estos se encuentran. Entre este amplio grupo de inhibidores de enzima candidatos para uso dentro de la invención, están inhibidores organofosforosos , tales como diisopropilfluorofosfato (DFP) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), los cuales son inhibidores irreversibles, potentes de serina proteasa (por ejemplo, tripsina y quimiotripsina ) . La inhibición adicional de acetilcolinesterasa por estos compuestos, los hace altamente tóxicos en ajustes de suministro incontrolado. Otro inhibidor candidato, fluoruro de 4- ( 2-aminoetil ) -bencensul fonilo (AEBSF) , tiene actividad inhibitoria comparable con DFP y PMSF, pero es marcadamente menos tóxico. El Clorhidrato fluoruro de (4-aminofenil) -metansulfonilo (APMSF) , es otro inhibidor potente de tripsina, pero es tóxico en ajustes incontrolados. Contrario a estos inhibidores, metansulfonato 1 , 2 , 3 , -tetrahidro-l-naftanoato de 4- (4-isopropilpiperadinocarbonil ) fenilo (FK-448), es una sustancia tóxica baja, que representa un inhibidor especifico y potente de quimiotripsina . Representativos adicionales de este grupo sin proteina de candidatos inhibidores, y que también exhiben riesgos tóxicos bajos, son mesilato de camostat (metan-sulfonato de N, N' -dimetil carbamoilmetil-p- (p' -guanidino-benzoiloxi ) fenilacetato ) . Aún otro tipo de agente inhibidor de enzima para uso dentro de los métodos y composiciones de la invención están, aminoácidos y aminoácidos modificados que interfieren con la degradación enzimática de compuestos terapéuticos específicos. Para uso en este contexto, aminoácidos y aminoácidos modificados, son sustancialmente no tóxicos y pueden ser producidos a bajo costo. Sin embargo, debido a su tamaño molecular bajo y buena solubilidad, son fácilmente diluidos y absorbidos en ambientes mucosales. Sin embargo, bajo condiciones apropiadas, los aminoácidos pueden actuar como inhibidores competitivos, reversibles de enzimas proteasas. Ciertos aminoácidos modificados pueden exhibir una actividad inhibitoria mucho más fuerte. Un aminoácido modificado deseado en este contexto, se conoce como un inhibidor de "estado de transición". La actividad inhibitoria fuerte de estos compuestos se basa en su similitud estructural a un sustrato en su geometría de estado de transición, mientras son en general, seleccionados por tener una afinidad muy superior para el sitio activo de una enzima que el sustrato mismo. Los inhibidores de estado de transición son inhibidores competitivos, reversibles. Ejemplos de este tipo de inhibidor son derivados de ácido -aminoborónico, tales como boro-leucina , boro-valina y boro-alanina. El átomo de boro en estos derivados puede formar un ion boronato tetrahédrico que se asemeja al estado de transición de péptidos durante su hidrólisis por aminopeptidasas . Estos derivados de aminoácido son inhibidores reversibles y potentes de aminopeptidasas y se reporta que el boro-leucina es más de 100 veces más efectivo en la inhibición enzimática que la bestatina y más de 1000 veces más efectivo que puromicina. Otro aminoácido modificado para el cual se ha reportado una actividad inhibitoria de proteasa fuerte, es N-acetilcisteína, la cual inhibe la actividad enzimática de aminopeptidasa N. Este agente adjunto exhibe propiedades mucolíticas que pueden ser empleadas dentro de los métodos y composiciones de la invención, para reducir los efectos de la barrera de difusión del moco. Todavía otros inhibidores enzimáticos útiles para uso dentro de los métodos de administración coordinada y formulaciones combinatoriales de la invención, pueden ser seleccionados de péptidos e inhibidores enzimáticos peptidicos modificados. Un representante importante de esta clase de inhibidores es el dodecapéptido cíclico, bacitracina, obtenidos de Bacillus licheniformis . Además de estos tipos de péptidos, ciertos péptidos y tripéptidos exhiben actividad inhibitoria no específica, débil, hacia algunas proteasas. Por analogía con aminoácidos, su actividad inhibitoria puede ser mejorada por modificaciones químicas. Por ejemplo, análogos de dipéptido de ácido fosfírico también son inhibidores de "transición-estado", con una actividad inhibitoria fuerte hacia aminopeptidasas . Han sido según se informa, usados para estabilizar leucina encefalina nasalmente administrada. Otro ejemplo de un análogo de transición-estado, es la pepstatina de pentapéptido modificado, el cual es un inhibidor muy potente de pepsina. Análisis estructural de pepstatina, probando la actividad inhibitoria de varios análogos sintéticos, demuestra las función-estructura principales molécula responsable de la actividad inhibitoria. Otro tipo especial de péptido modificado incluye inhibidores con una función de aldehido terminalmente localizada en su estructura. Por ejemplo, la secuencia benciloxicarbonil-Pro-Phe-CHO, la cual cubre completamente los requerimientos de especificidad primaria y secundaria conocidos de quimiotripsina , se han encontrado por ser un inhibidor reversible potente de esta proteinasa objetivo. Las estructuras químicas de inhibidores adicionales con una función aldehido terminalmente localizado, por ejemplo, antipaína, leupeptina, quimiostatina y elastatinal, también son conocidos en la técnica, como son las estructuras de otros inhibidores peptídicos modificados, reversibles, conocidos, tales como fosforamidon, betatina, puromicina y amastatina . Debido a su masa molecular comparablemente alta, inhibidores de proteasa de polipéptido, son más receptivos que los compuestos más pequeños a suministro concentrado en matrices que portan fármaco. Agentes adicionales para inhibición de proteasa dentro de las formulaciones y métodos de la invención, involucran el uso de agentes formadores de complejos. Estos agentes median la inhibición enzimática evitando el ambiente intranasal (o composición preparativa o terapéutica) , de cationes divalentes, los cuales son co-factores para muchas proteasas. Por ejemplo, los agentes que forman complejos EDTA y DTPA, como agentes adjuntos combinatorialmente formulados o coordinadamente administrados, en concentración adecuada, serán suficiente para inhibir las proteasas seleccionadas para con ello, mejorar el suministro intranasal de agentes biológicamente activos de conformidad con la invención. Representativos adicionales de esta clase de agentes inhibidores son EGTA, 1 , 10-fenantrolina e hidroxiquinolina . Además, debido a su propensidad para quelar cationes divalentes, estos y otros agentes que forman complejos son empleados dentro de la invención como agentes que promueven la absorción, directos. Como se nota en detalle en otra parte aquí, también se contempla usar varios polímeros, particularmente polímeros mucoadhesivos , como agentes que inhiben la enzima dentro de la administración coordinada, métodos y composiciones de multi-procesamiento y/o formulación combinatorial de la invención. Por ejemplo, derivados de poli (acrilato) , tales como poli (ácido acrílico) y policarbófilo, pueden afectar la actividad de varias proteasas, que incluyen tripsina, quimiotripsina . El efecto inhibidor de estos polímeros también se puede basar en la formación de complejos de cationes divalentes tales como Ca2+ y Zn2+. Se contempla además, que estos polímeros pueden servir como patrones o asociados conjugados para agentes inhibidores enzimáticos adicionales, como se describe anteriormente. Por ejemplo, un conjugado quitosan-EDTA, ha sido desarrollado y es empleado dentro de la invención, que exhibe un efecto inhibitorio fuerte hacia la actividad enzimática de proteasas dependientes del zinc. Las propiedades mucoadhesivas de polímeros después de la unión covalente de otros inhibidores enzimáticos en este contexto, no se espera sea sustancialmente comprometida, ni sea la utilidad general de tales polímeros como un vehículo de suministro para agentes biológicamente activos dentro de la invención, se espera sea disminuida. Por el contrario, la distancia reducida entre el vehículo de suministro y la superficie mucosal proporcionada por el mecanismo mucoahdesivo minimizará el metabolismo presistémico del agente activo, mientras los inhibidores de enzima covalentemente unidos permanecerán concentrados en el sitio de suministro de fármaco, minimizando los efectos de dilución indeseados de inhibidores, así como también efectos tóxicos y otros colaterales causados con ello. De esta manera, la cantidad efectiva de un inhibidor de enzima coordinadamente administrado, puede ser reducida a la exclusión de efectos de dilución. Complejos inhibidores de polímero-enzima mucoadhesivos que son empleados dentro de las formulaciones mucosales y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a: Carboximetilcelulosa-pepstatina (con actividad anti-pepsina) ; poli (ácido acrílico) -inhibidor Bowman-Birk ( anti-quimiotripsina ) ; poli (ácido acrílico) -quimiostat ina (anti-quimiotripsina) ; poli (ácido acrílico ) -elastatinal ( anti-elastasa) ; Carboximetilcelulosa-elastatinal (anti-elastasa) ; Policarbofilo-elastatinal (anti-elastasa) ; Quitosan-antipaína ( anti-tripsina ) ; poli (ácido acrílico ) -bacitrina (anti-aminopeptidasa N) ; Quitosan-EDTA ( anti-aminopeptidasa N, anti-carboxipeptidasa A) ; Quitosan-EDTA-antipaína (anti- tripsina, antiquimiotripsina , anti-elastasa ) .

Agentes Separadores de Moco y Mucolitico y Métodos El suministro efectivo de agentes bioterapéuticos vía la administración intranasal deben tomar en cuenta la tasa de transporte de fármaco reducida a través del revestimiento mucoso protector de la mucosa nasal, además de la pérdida de fármaco debido al enlace a glicoproteinas de la capa mucosa. El moco normal es una sustancia similar a gel, viscoelástica que consiste de agua, electrolitos, mucinas, macromoléculas y células epiteliales desplazadas. Sirve principalmente como una cubierta citoprotectora y lubricante para los tejidos mucosales subyacentes. El moco es secretado por células secretoras aleatoriamente distribuidas localizadas en el epitelio nasal y en otros epitelios mucosales. La unidad estructural del moco es mucina. Esta glicoproteina es principalmente responsable por la naturaleza viscoelástica del moco, aunque otras macromoléculas también pueden contribuir a esta propiedad. En mucosas de las vías respiratorias, tales macromoléculas pueden producir localmente IgA, IgM, IgE, lisozima y broncotransferrina secretorias, las cuales también juegan un papel importante en el mecanismo de defensa hospedero. Los métodos de administración coordinados de la presente invención, incorporan opcionalmente agentes de separación de moco o mucoliticos, los cuales sirven para degradar; moco delgado o transparente de las superficies mucosales intranasales para facilita la absorción de agentes bioterapéuticos intranasalmente administrados. Dentro de estos métodos, un agente de separación de moco o mucolitico, es coordinadamente administrado como un compuesto adjunto para mejorar el suministro intranasal del agente biológicamente activo. Alternativamente, una cantidad efectiva de agente de separación de moco o mucolitico, se incorpora como un agente de procesamiento dentro de un método de procesamiento múltiple de la invención, o como un aditivo dentro de una formulación combinatorial de la invención, para proporcionar una formulación mejorada que mejora el suministro intranasal de compuestos bioterapéuticos reduciendo los efectos de barrera de moco intranasal. Una variedad de agentes de separación de moco o mucoliticos son disponibles para incorporación dentro de los métodos y composiciones de la invención. Basados en sus mecanismos de acción, los agentes de separación de moco y mucoliticos puede a menudo, ser clasificados en los siguientes grupos: proteasas (por ejemplo, pronasa, papaina), que desdoblan el núcleo de la proteina de glicoproteinas mucinas; compuestos sulfhidrilo que dividen los enlaces de disulfuro de la mucoproteina ; y detergentes (por ejemplo, Tritón X-100, Tween 20), que rompen enlaces no covalentes dentro del moco. Compuestos adicionales en este contexto incluyen, pero no se limitan a, sales biliares y tensoactivos , por ejemplo, desoxicolato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, glicolato sódico y lisofosfatidilcolina . La efectividad de sales biliares que causan rompimiento estructural del moco, es del orden de desoxicolato > taurocolato > glicolato. Otros agentes efectivos que reducen la viscosidad del moco o adhesión para mejorar el suministro intranasal de conformidad con los métodos de la invención incluyen, por ejemplo, ácidos grasos de cadena corta y agentes mucoliticos que trabajan por quelación, tales como péptidos N-acilcolágeno, ácidos biliares y saponinas (el último funciona en parte, quelando Ca2+ y/o Mg2+, los cuales juegan un papel importante en mantener la estructura de la capa mucosa). Agentes mucoliticos adicionales para uso dentro de los métodos y composiciones de la invención incluyen, N-acetil-L-cisteina (ACS) , un agente mucolitico potente que reduce tanto la viscosidad como adherencia de moco broncopulmonar y es reportado por incrementar modestamente la biodisponibilidad nasal de la hormona de crecimiento humano en ratas anestesiadas (desde 7.5 hasta 12.2%) . Estos y otros agentes que separan el moco o mucoliticos, son contactados con la mucosa nasal, típicamente en un intervalo de concentración desde aproximadamente 0.2 hasta 20 mM, coordinadamente con la administración del agente biológicamente activo, para reducir la viscosidad polar y/o elasticidad del moco intranasal. Todavía otros agentes de separación de moco o mucolíticos pueden ser seleccionados de un intervalo de enzimas glicosidasas, las cuales son capaz de desdoblar enlaces glicosídicos dentro de la glicoproteína del moco. Las a-amilasa y ß-amilasas, son representativas de esta clase de enzimas, aunque su efecto mucolítico puede ser limitado. Por el contrario, las glicosidasas bacterianas las cuales permiten a estos microorganismos permear las capas mucosas de sus hospederos. Para uso combinatorial con la mayoría de agentes biológicamente activos dentro de la invención, que incluyen péptidos y proteínas terapéuticas, detergentes no ionogénicos son en general, también empleados como agentes de separación de moco o mucolíticos. Estos agentes típicamente no modificarán o sustancialmente deteriorarán la actividad de polipéptidos terapéuticos.

Agentes que Intensifican la Viscosidad Los agentes de suspensión o que intensifican la viscosidad, pueden afectar la tasa de liberación de un fármaco a partir de la formulación y absorción de dosificación. Como un resultado, pueden ser usados intensificadores de viscosidad para modificar la permeación de algunos péptidos de regulación de glucosa. Algunos ejemplos de materiales los cuales pueden servir como agentes que intensifican la viscosidad farmacéuticamente aceptables son, metilcelulosa (MC) ; hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) ; carboximetilcelulosa (CMC); celulosa; gelatina; almidón; almidón beta; poloxámeros; plurónicos; CMC sódico; sorbitol; acacia; povidona; carbopol; policarbófilo; quitosan; microesferas de quitosan; microesferas de alginato; glutamato de quitosan; resina amberlite; hialuronano; etil celulosa; maltodextriña DE; almidón de maíz de forma secada en tambor (DDWM); microesferas de almidón degradables (DSM); desoxiglicolato (GDC) ; hidroxietilcelulosa (HEC) ; hidroxipropilcelulosa (HPC) ; celulosa microcristalina (MCC) ; ácido polimetacrilico y polietilenglicol ; ciclodextriña de sulfobutiléter B; bioesferas de almidón eldexómero reticulado; taurodihidrofusidato sódico (STDHF); cloruro de N-trimetil quitosan (TMC) ; microesferas de almidón degradadas; resina amberlite; nanoparticulas de quitosan; crospovidona secada por rocío; microesferas de dextran secadas por rocío; celulosa microcristalina secada por rocío; y microesferas de almidón eldexómero reticuladas.

Agentes Ciliostáticos y Métodos Debido a la capacidad de autolimpieza de ciertos tejidos mucosales (por ejemplo, tejido mucosal nasal), la separación mucociliar, es necesario como una función protectora (por ejemplo, para remover polvo, alérgenos y bacterias), que ha sido considerado en general, que esta función no debe ser sustancialmente deteriorada por medicaciones mucosales. El transporte mucociliar en el tracto respiratorio es un mecanismo de defensa particularmente importante contra infecciones. Para lograr esta unción, el golpe ciliar en los pasajes de las vías respiratorias y nasales mueve una capa de moco junto a la mucosa para remover las partículas y microorganismos inhalados. Agentes ciliostáticos encuentran uso dentro de los métodos y composiciones de la invención, para incrementar el tiempo de residencia de GRP mucosalmente administrados (por ejemplo, intranasalmente) , análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí. En particular, el suministro de estos agentes con los métodos y composiciones de la invención, es significantemente mejorado en ciertos aspectos por administración coordinada o formulación combinatorial de uno o más agentes ciliostáticos que funcionan para inhibir reversiblemente la actividad de las células mucosales, para proporcionar un incremento reversible, temporal en el tiempo de residencia de los agentes activos mucosalmente administrados. Para uso dentro de estos aspectos de la invención, los factores ciliostáticos mencionados anteriormente, ya sea específicos o indirectos en su actividad, son todos candidatos para empleo exitoso como agentes ciliostáticos en cantidades apropiadas (dependiendo de la concentración, duración y modo de suministro) , de manera tal que proporcionan una reducción temporal (es decir, reversible) o cesación de separación mucociliar a un sitio mucosa! de administración para mejorar el suministro de GRP, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos en este documento, sin efectos colaterales inaceptables adversos. Varios factores ciliostáticos bacterianos aislados y caracterizados en la literatura, pueden ser empleados dentro de las modalidades de la invención. Los factores ciliostáticos de la bacteria Pseudomonas aeuroginosa , incluye un derivado de fenazina, un compuesto pió (2-alquil-4-hidroxiquinolinas ) , y un ramnolípido (también conocido como una hemolisina) . El compuesto pió produce ciliostasis a concentraciones de 50 g/ml y sin lesiones ultraestructurales obvias. El derivado fenazina también inhibe la movilidad ciliar pero causa algún rompimiento de membrana aunque a concentraciones sustancialmente mayores de 400 g/ml. La exposición limitada de explantes traqueales al ramnolípido, resulta en ciliostasis, la cual está asociada con membranas ciliares alteradas. Más exposición extensiva a ramnolipidos está asociada con la remoción de ramas dineinas de axonemas.

Agentes Activos de la Superficie y Métodos Dentro de aspectos más detallados de la invención, uno o más agentes de penetración de membrana pueden ser empleados dentro de un método de suministro epitelial o formulación de la invención, para mejorar el suministro epitelial de GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí. Los agentes que intensifican la penetración de la membrana biológica en este contexto, pueden ser seleccionados de: (i) un tensoactivo, (ii) una sal biliar, (iii) un aditivo de fosfolipido, micelios mezclados, liposomas, o portador, (iv) un alcohol, (v) una enamina, (vi) un compuesto donador NO, (vii) una molécula antipática de cadena larga, (viii) un intensificador de la penetración hidrofóbico pequeño; (ix) derivado de ácido salicilico o sodio; (x) un éster de glicerol de ácido acetoacético (xi) un derivado de ciclodextrina o beta-ciclodextrina, (xii) un ácido graso de cadena media, (xiii) un agente quelante, (xiv) un aminoácido o sal del mismo, (xv) un N-acetilamino ácido o sal del mismo, (xvi) una enzima degradativa a un componente de membrana seleccionado, (xvii) un inhibidor de síntesis de ácido graso, (xviii) un inhibidor de síntesis de colesterol; o (xiv) cualquier combinación de los agentes que intensifican la penetración de la membrana mencionados en ( i ) - (xviii ) ) . Ciertos agentes activos de superficie ( tensoactivos ) , son fácilmente incorporados dentro de las formulaciones de suministro epitelial y métodos de la invención como agentes que intensifican la absorción epitelial. Estos agentes, los cuales pueden ser coordinadamente administrados o combinatorialmente formulados con GRP, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, pueden ser seleccionados de un amplio montaje de tensoactivos conocidos. Los tensoactivos, los cuales en general caen en tres clases: (1) polioxietilen éteres no iónicos; (2) sales biliares tales como glicolato sódico (SGC) y desoxicolato (DOC); y (3) derivados de ácido fusidico tales como taurodihidrofusidato sódico (STDHF). Los mecanismos de acción de estas varias clases de agentes activos de la superficie típicamente incluyen solubilización del agente biológicamente activo. Para proteínas y péptidos los cuales a menudo forman agregados, las propiedades activas de la superficie de estos promotores de la absorción pueden permitir interacciones con proteínas, de manera tal que unidades más pequeñas tales como monómeros revestidos de tensoactivo, pueden ser más fácilmente mantenidos en solución. Ejemplos de otros agentes activos de la superficie son didecanoil L-a-fosfatidilcolina (DDPC), polisorbato 80 y polisorbato 20. Estos monómeros son presumiblemente unidades más transportables que los agregados. Un segundo mecanismo potencial es la protección de péptido o proteina a partir de la degradación proteolitica por proteasas en el ambiente mucosal. Tanto las sales biliares como algunos derivados de ácido fusidico según se reporta, inhiben la degradación proteolitica de proteínas por homogeneizados nasales a concentraciones menores que o equivalentes a aquellas requeridas para mejorar la absorción de proteína. Esta inhibición de proteasa puede ser especialmente importante para péptidos con vidas medias biológicas cortas.

Degradación de Enzimas e Inhibidores de Síntesis de Ácido Graso y Colesterol En aspectos relacionados de la invención, GRP, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos para administración de membrana biológica, son formulados o coordinadamente administrados con un agente que intensifica la penetración, seleccionado de una enzima de degradación, o un agente estimulador metabólico o inhibidor de la síntesis de ácidos grasos, esteróles u otros componentes de la barrera epitelial seleccionados, Patente Estadounidense No. 6,190,894. Por ejemplo, enzimas degradativas tales como fosfolipasa, hialuronidasa , neuraminidasa , y condroquitinasa , pueden ser empleados para mejorar la penetración mucosal de GRP, análogos y miméticos , y otros agentes biológicamente activos sin causar daño irreversible a la barrera mucosal. En una modalidad, la condroquitinasa es empleada dentro de un método o composición como se proporciona aquí, para alterar la glicoproteina o constituyentes glicolipidos de la permeabilidad de barrera de la mucosa, con ello, intensificando la absorción mucosal de GRP, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí . Con respecto a inhibidores de síntesis de constituyentes de la barrera mucosal, se nota que los ácidos grasos libres cuentan por 20-25% de lípidos epiteliales por peso. Dos enzimas que limitan la proporción en la biosíntesis de ácidos grasos libres son acetil CoA carboxilasa y sintetasa de ácido graso. A través de una serie de etapas, los ácidos grasos libres son metabolizados en fosfolípidos . De este modo, los inhibidores de síntesis de ácido graso libres y metabolismo para uso con los métodos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de acetil-CoA carboxilasa tal como ácido 5-tetradeciloxi-2-furancarboxílico (TOFA) ; inhibidores de sintetasa de ácido graso; inhibidores de fosfolipasa A tales como gomisina A, ácido 2- (p-amilcinamil) amino-4-clorobenzoico, bromuro de bromofenacilo, monoaluro, ácido 7 , 7-dimetil-5, 8-eicosadienoico, nicergolina, cefarantina, nicardipina, quercetina, AMP dibutiril-cíclico, R-24571, N-oleoiletanolamina, N- (7-nitro-2, 1, 3-benzoxadiazol-4-il ) fosfostidil serina, ciclosporina A, anestésicos tópicos, que incluyen dibucaina, prenilamina, retinoides, tales ácidos trans y 13-cis-retinoico, -7, trifluoperazina, R-24571 ( calmidazolio ) , l-hexadocil-3-trifluoroetil glicero-sn-2-fosfomentol (MJ33); bloqueadores de canal de calcio que incluyen nicardipina, verapamil, diltiazem, nifedipina, y nimodipina; antimalariales que incluyen quinacrina, mepacrina, cloroquina e hidroxicloroquina ; beta bloqueadores que incluyen propanalol y labetalol; antagonistas de calmodulina ; EGTA; timersol; glucocorticoesteroides que incluyen dexametasona y prednisolona ; y agentes antiinflamatorios no esteroidales que incluyen indometacina y naproxeno. Esteróles libres, principalmente colesterol, cuenta por 20-25% de los lipidos epiteliales en peso. La enzima que limita la tasa en la biosintesis de colesterol es reductasa de 3-hidroxi-3-metilglutarilo (HMG) CoA. Inhibidores de síntesis de colesterol para uso dentro de los métodos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, inhibidores competitivos de reductasa CoA (HMG) , tal como simvastatina, lovastatina, fluindostatina ( fluvastatina ) , pravastatina, mevastatina, así como también otros inhibidores de reductasa CoA HMG, tales como oleato de colesterol, sulfato de colesterol y fosfato, y esteróles oxigenados, tales como colesterol 25-OH-- y 26-OH--; inhibidores de sintetasa escualeno; inhibidores de epoxidasa escualeno; inhibidores de reductasa DELTA7 o DELTA24, tales como 22,25-diazacolesterol , 20 , 25-diazacolestenol , AY9944, y triparanol. Cada uno de los inhibidores de la síntesis de ácido graso o inhibidores de la síntesis de esterol, pueden ser coordinadamente administrados o combinatorialmente formulados con uno o más GRP, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, para lograr penetración epitelial mejorada de los agentes activos. Un intervalo de concentración efectivo para el inhibidor de esterol en una formulación terapéutica o adjunta para suministro mucosal es en general, desde aproximadamente 0.0001% hasta aproximadamente 20% en peso del total, más típicamente desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 5% .

Agentes Donadores de Óxido Nítrico y Métodos Dentro de otros' aspectos relacionados de la invención, un donador de óxido nítrico (NO) se selecciona como un agente que intensifica la penetración de la membrana biológica para mejorar el suministro epitelial de uno o más GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí. Varios donadores de NO se conocen en la técnica y son empleados en concentraciones efectivas dentro de los métodos y formulaciones de la invención. Donadores NO ejemplares incluyen, pero no se limitan a, nitroglicerina, nitroprúsido , N0C5 [ 3- ( 2-hidroxi-l- (metil-etil ) -2-nitrosohidrazino) -1-propanamina ] , N0C12 [W-etil-2- ( 1-etil-hidroxi-2-nitrosohidrazino) -etanamina] , SNAP [S-nitroso-N-acetil-DL-penicilamina ] , N0R1 y N0R4. Dentro de los métodos y composiciones de la invención, una cantidad efectiva de un donador NO seleccionado es coordinadamente administrada o combinatorialmente formulada con uno o más GRP, análogos y miméticos, y/o otros agentes biológicamente activos descritos aquí, en o a través del epitelio.

Agentes para Modular la Estructura de Unión Epitelial y/o Fisiología La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen uno o más GRP, análogos o miméticos, y/o otros agentes biológicamente activos en combinación con agentes que intensifican el suministro epitelial descritos aquí formulados en una preparación farmacéutica para el suministro epitelial. El agente permeabilizante reversiblemente intensifica el transporte paracelular epitelial mucosal, típicamente modulando la estructura de unión epitelial y/o fisiología en una superficie epitelial mucosal en el sujeto.

Este efecto involucra típicamente la inhibición por el agente permeabilizante de enlace homotípico o heterotípico entre las proteínas adhesivas de membrana epitelial de células epiteliales vecinas. Las proteínas objetivo para este bloqueo de enlace homotípico o heterotípico pueden ser seleccionadas de varias moléculas de adhesión de unión relacionadas (JAMs), ocludinas, o claudinas. Ejemplos de estos son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o anticuerpos de cadena única que se enlazan a los dominios extracelulares de estas proteínas. En aún modalidades detalladas adicionales, la invención proporciona péptidos permeabilizantes y análogos peptídicos y miméticos para mejorar el transporte paracelular epitelial mucosal. Los péptidos sujeto y análogos peptídicos y miméticos, típicamente funcionan dentro de las composiciones y métodos de la invención modulando la estructura de unión epitelial y/o fisiología en un sujeto animal. En ciertas modalidades, los péptidos y análogos peptídicos y miméticos inhiben efectivamente el enlace homotípico y/o heterotípico de una proteína adhesiva de membrana epitelial, seleccionada de una molécula de adhesión de unión (JAM), ocludina, o claudina. Uno de tales agentes que han sido extensivamente estudiados es la toxina bacterial de Vibrio cholerae conocida como la "toxina zonula occludens" (ZOT) . Esta toxina media la permeabilidad mucosal intestinal incrementada y causa síntomas de enfermedad que incluyen diarrea en sujetos infectados. Fasano, et al, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S. A. 8:5242-5246, 1991. Cuando se prueba en la mucosa ileal de conejo, el ZOT incrementa la permeabilidad intestinal modulando la estructura de uniones herméticas intercelulares. Más recientemente, se ha encontrado que el ZOT es capaz de abrir reversiblemente uniones herméticas en la mucosa intestinal. También se ha reportado que el ZOT es capaz de abrir reversiblemente uniones herméticas en la mucosa nasal. Patente Estadounidense No. 5,908,825. Dentro de los métodos y composiciones de la invención, ZOT, así como también varios análogos y miméticos de ZOT que funcionan como agonistas y antagonistas de actividad ZOT, son empleados para intensificar el suministro nasal de agentes biológicamente activos - incrementando la absorción paracelular en y a través de la mucosa nasal. En este contexto, ZOT típicamente actúa causando una reorganización estructural de uniones herméticas marcadas por localización alterada de la proteína de unión ZOl . Dentro de estos aspectos de la invención, ZOT es coordinadamente administrado o combinatorialmente formulado con el agente biológicamente activo en una cantidad efectiva para proporcionar absorción significantemente mejorada del agente activo, incrementando reversiblemente la permeabilidad de la mucosa nasal sin efectos colaterales sustanciales adversos.

Agentes Vasodilatadores y Métodos Aún otra clase de agentes que promueven la absorción que muestran utilidad benéfica dentro de la administración coordinada y métodos de formulación combinatorial y composiciones de la invención están, compuestos vasoactivos, más específicamente vasodilatadores. Estos compuestos funcionan dentro de la invención para modular la estructura y fisiología de la vasculatura submucosal, incrementando la tasa de transporte de GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos o a través del epitelio y/o tejidos objetivo específicos o compartimientos (por ejemplo, el sistema nervioso central o circulatorio sistémico) . Agentes vasodilatadores para uso dentro de la invención, típicamente causan relajación de los bazos sanguíneos submucosales por ya sea un decremento en el calcio citoplásmico, un incremento en óxido nítrico (NO) o inhibiendo la cinasa de cadena larga de miosina. En general, se dividen en 9 clases; antagonistas de calcio, abridores del canal de potasio, inhibidores ACE, antagonistas del receptor de angiotensina-II , antagonistas del receptor a-adrenérgico e imidazol; agonistas ß?-adrenérgicos , inhibidores de fosfodiesterasa, eicosanoides y donadores de NO. Debido a las diferencias químicas, las propiedades farmacocinéticas de antagonistas de calcio son similares. La absorción en la circulación sistémica es alta, y estos agentes por lo tanto, se someten a considerable metabolismo de primer paso por el hígado, resultando en variación individual en la farmacocinética . Excepto por los fármacos más nuevos del tipo dihidropiridina (amlodipina, felodipina, isradipina, nilvadipina, nisoldipina y nitrendipina ) , la vida media de antagonistas de calcio es corta. Por lo tanto, mantener una concentración de fármaco efectiva para muchos de estos, puede requerir suministro por dosificación múltiple, o formulaciones de liberación controlada, como se describe en otra parte aquí. El tratamiento con el abridor de canal de potasio minoxidil, puede también ser limitado en manera y nivel de administración debido a efectos colaterales potenciales adversos. Inhibidores de ACE previenen la conversión de angiotensina-I a angiotensina-II , y son más efectivos cuando la producción de renina se incrementa. Puesto que el ACE es idéntico a la cinasa-II, la cual inactiva el vasodilatador endógeno potente, bradiquinina , la inhibición de ACE causa una reducción en la degradación de bradiquinina. Los inhibidores ACE proporcionan la ventaja agregada de efectos cardioprotectores y cardioreparadores , previniendo e invirtiendo la fibrosis cardiaca e hipertrofia ventricular en modelos animales. La trayectoria de eliminación predominante de la mayoría de inhibidores ACE es vía excreción renal. Por lo tanto, el deterioro renal está asociado con la eliminación reducida y una reducción de dosificación de 25 a 50% es recomendada en pacientes con deterioro renal moderado a severo . Con respecto a donadores NO, estos compuestos son particularmente útiles dentro de la invención por sus efectos adicionales en la permeabilidad mucosal. Además de los donadores NO notados anteriormente, complejos de NO con nucleófilos llamados NO/nucleófilos , o NONOatos, espontáneamente y no enzimáticamente liberan NO cuando se disuelven en solución acuosa a pH fisiológico. Por el contrario, los nitro vasodilatadores tales como nitroglicerina, requieren actividad enzimática especifica para liberación de NO. NONOatos liberan NO con una estequiometria definida y a tasas predecibles variando desde <3 minutos para dietilamina/NO hasta aproximadamente 20 horas para dietilentriamina/NO (DETANO) . Con ciertos métodos y composiciones de la invención, un agente vasodilatador seleccionado es coordinadamente administrado (por ejemplo, sistémicamente o intranasalmente, simultáneamente o en asociación temporal combinatorialmente efectiva) o combinatorialmente formulado con uno o más GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos en una cantidad efectiva para intensificar la absorción de la mucosa de los agentes activos para alcanzar un tejido objetivo o compartimiento en el sujeto (por ejemplo el hígado, vena portal hepática, tejido o fluido del CNS, o plasma de sangre) .

Agentes Selectivos que Intensifican el Transporte y Métodos Las composiciones y métodos de suministro de la invención, opcionalmente incorporan un agente que intensifica el transporte selectivo, que facilita el transporte de uno o más agentes biológicamente activos. Estos agentes que intensifican el transporte pueden ser empleados en una formulación combinatorial o protocolo de administración coordinado con uno o más de los GRP, análogos y miméticos descritos aquí, para suministrar coordinadamente uno o más agentes biológicamente activos adicionales a través de las barreras de transporte de la membrana biológica, para mejorar el suministro epitelial de los agentes activos para alcanzar un tejido objetivo o compartimiento en el sujeto (por ejemplo, el epitelio mucosal, hígado, tejido o fluido CNS o plasma de sangre) . Alternativamente, los agentes que intensifican el transporte pueden ser empleados en un protocolo de administración coordinada o formulación combinatorial para intensificar directamente el suministro epitelial de uno o más de los GRP, análogos y miméticos, con o sin suministro intensificado de un agente biológicamente activo adicional.

Agentes que intensifican el transporte selectivos para uso dentro de este aspecto de la invención incluyen, pero no se limitan a, glicósidos, moléculas que contienen azúcar, y agentes de enlace tales como agentes de enlace de lectina, los cuales son conocidos por interactuar específicamente con los componentes del transporte de la barrera epitelial. Por ejemplo, ligandos "bioadhesivos específicos, incluyen varias lectinas de plantas y bacterianas, las cuales se enlazan a las porciones de azúcar de superficie celular por interacciones mediadas por el receptor, pueden ser empleadas como portadores o mediadores de transporte conjugados para mejorar el suministro nasal, por ejemplo, mucosal de agentes biológicamente activos dentro de la invención. Ciertos ligandos bioadhesivos para uso dentro de la invención, mediarán la transmisión de señales biológicas a células epiteliales objetivo que activan la absorción selectiva del ligando adhesivo por procesos de transporte celular especializado (endocitosis a transcitosis ) . Estos mediadores de transporte pueden por lo tanto, ser empleados como un "sistema portador" para estimular o dirigir la absorción selectiva de uno o más GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos en y/o a través del epitelio mucosal. Estos y otros agentes que intensifican el transporte selectivos, intensifican significantemente el suministro epitelial de biofarmacéuticos macromoleculares (particularmente péptidos, proteínas, oligonucleótidos y vectores de polinucleótido ) con la invención. Las lectinas son proteínas de planta que se enlazan a azúcares específicos encontrados en la superficie de glicoproteínas y glicolípidos de células eucarióticas . Las soluciones concentradas de lecitinas tienen un efecto "mucoatractivo" y varios estudios han demostrado endocitosis mediada por el receptor rápido (RME) de lectinas y conjugados de lectinas (por ejemplo, concavalina A conjugada con partículas de oro coloidal) a través de las superficies mucosales. Estudios adicionales han reportado que los mecanismos de absorción para lectinas, pueden ser utilizados para dirigir el fármaco intestinal in vivo. En ciertos de estos estudios, las nanopartículas de poliestireno (500 nm) , fueron covalentemente acopladas a lectina de tomate y los rendimientos reportados mejora la absorción sistémica después de la administración oral a ratas. Además de lectinas de plantas, los factores de invasión y adhesión microbiana proporcionan una fuente rica de candidatos para uso como portadores de transporte adhesivo/selectivo dentro de los métodos de suministro mucosal y composiciones de la invención. Dos componentes son necesarios para los procesos de adherencia bacteriana, una "adhesina" bacteriana (adherencia o factor de colonización) y un receptor en la superficie de la célula hospedera. Las bacterias que causan infecciones mucosales necesitan penetrar la capa mucosa antes de unir las mismas a la superficie epitelial. Esta unión es usualmente mediada por fibrinas bacterianas o estructuras del pilus, aunque otros componentes de la superficie celular también pueden tomar parte en el proceso. Las bacterias adherentes colonizan el epitelio mucosal por multiplicación e iniciación de una serie de reacciones bioquímicas dentro de la célula objetivo a través de los mecanismos de transducción de señal (con o sin la ayuda de toxinas) . Asociados con estos mecanismos invasivos, una amplia diversidad de proteínas bioadhesivas (por ejemplo, invasiva, internalina) , producidas originalmente por varias bacterias y virus, se conocen. Estos permiten la unión extracelular de tales microorganismos con una selectividad impresionante para especies hospederas y aún te idos particulares objetivos. Las señales transmitidas por tales interacciones de receptor-ligando, activan el transporte de microorganismos vivientes, intactos en, y eventualmente a través de las células epiteliales por procesos endo y transcitóticos . Tales fenómenos que se originan naturalmente, pueden ser endurecidos (por ejemplo, formando complejos de agentes biológicamente activos tales como GRP con una adhesina), de conformidad con las enseñanzas aquí para suministro mejorado de compuestos biológicamente activos en o a través de una membrana biológica y/o a otros sitios objetivo designados de acción de fármaco. Varias toxinas de plantas y bacterianas que se enlazan a las superficies epiteliales en una manera similar a lectina, especifica, también son empleadas dentro de los métodos y composiciones de la invención. Por ejemplo, la toxina difteria (DT) entra a las células hospederas rápidamente por RME . Del mismo modo, la subunidad B de la toxina lábil al calor de E. coli, se enlaza al limite de la bóveda de las células epiteliales intestinales en una manea similar a lectina, altamente especifica. La absorción de esta toxina y transcitosis al lado basolateral de los enterocitos, ha sido reportado in vivo o in vitro. Otros investigadores han expresado el dominio de la transmembrana de difteria toxina en E. coli como una proteina de fusión de enlace a maltosa y acoplada químicamente a poli-L-lisina de alto peso molecular. El complejo resultante es exitosamente empleado para mediar la internalización de un gen reportero in vitro. Además de estos ejemplos, el Staphylococcus aureus produce una serie de proteínas (por ejemplo, enterotoxina estafilococal A (SEA), SEB, toxina 1 de síndrome de apoplejía tóxica (TSST-1), el cual actúa tanto como superantígenos y toxinas. Estudios que se refieren a estas proteínas han reportados transcitosis facilitada dependiente de la dosis de SEB y TSST-1 en células Caco-2. La hemaglutinina viral comprende otro tipo de agente de transporte para facilitar el suministro mucosal de agentes biológicamente activos dentro de los métodos y composiciones de la invención. La etapa inicial en muchas infecciones virales es el enlace de proteínas de la superficie (hemaglutininas ) a células mucosales. Estas proteínas de enlace han sido identificadas por muchos virus, que incluyen rotavirus, virus de varicela zoster, virus del bosque Semliki, adenovirus, virus de enrollamiento de hoja de papa, y reovirus. Estos y otras hemaglutininas ejemplares se pueden emplear en una formulación combinatorial (por ejemplo, una mezcla o formulación de conjugado) o protocolo de administración coordinada con uno o más de los GRP, análogos y miméticos descritos aquí, para intensificar coordinadamente el suministro mucosal de uno o más agentes biológicamente activos adicionales. Alternativamente, las hemaglutininas virales pueden ser empleadas en una formulación combinatorial o protocolo de administración coordinada para intensificar directamente el suministro mucosal de uno o más de los GRP, análogos y miméticos, con o sin suministro intensificado de un agente biológicamente activo adicional. Una variedad de factores que median el transporte, selectivos, también son disponibles para uso dentro de la invención. Las células de mamífero han desarrollado una clasificación de mecanismos para facilitar la internalización de sustratos específicos y dirigidos estos a compartimientos definidos. Colectivamente, este proceso de deformaciones de membrana es llamado "endocitosis" y comprende, fagocitosis, pinocitosis, endocitosis mediada por el receptor (RME mediada por clatrina) , y potocitosis (RME mediada no por clatrina) . El RME es un proceso biológico celular altamente especifico por el cual, como su nombre lo implica, varios ligandos se enlazan a los receptores de la superficie celular y son subsecuentemente internalizados y traficados dentro de la célula. En muchas células, los procesos de endocitosis asi son activos que la superficie de la membrana completa es internalizada y reemplazada en menos de una media hora. Dos clases de receptores son propuestos basados en su orientación en la membrana celular; el término amino de los receptores Tipo I, está localizado en el lado extracelular de la membrana, mientras los receptores Tipo II, tienen este .mismo extremo de proteina en el entorno intracelular . Todavía otras modalidades de la invención utilizan transferrina como un portador o estimulante de RME de agentes biológicamente activos epitelialmente suministrados. La transferrina, una glicoproteína de transporte de ión de 80 kDa, es eficientemente tomada en células por RME. Los receptores de transferina se encuentran en la superficie de la mayoría de células proliferantes, en números elevados en eritroblastos y en muchas clases de tumores. La transcitosis de transferrina (Tf) y el conjugado de transferrina, según se reporta, son intensificados en la presencia de Brefeldina ? (BFA), un metabolito fúngico. En otros estudios, el tratamiento de BFA ha sido reportado por incrementar rápidamente la endocitosis apical de tanto ricina como HRP en células MDCK. De este modo, BFA y otros agentes que estimulan el transporte mediado por el receptor, pueden ser empleados con los métodos de la invención como formulados combinatorialmente (por ejemplo, conjugados) y/o agentes coordinadamente administrados para mejorar el transporte mediado por el receptor de agentes biológicamente activos, que incluyen, GRP, análogos y miméticos.

Vehículos de Suministro Polimérico y Métodos Dentro de ciertos aspectos de la invención, GRP, análogos y miméticos, otros agentes biológicamente activos descritos aquí, y agentes que intensifican el suministro como se describe anteriormente, son, individualmente o combinatorialmente, incorporados dentro de una formulación epitelialmente administrada (por ejemplo, nasalmente), que incluye un polímero biocompatible que funciona como un portador o base. Tales portadores poliméricos incluyen polvos poliméricos, matrices o vehículos de suministro microparticulados , entre otras formas de polímeros. El polímero puede ser de planta, animal u origen sintético. A menudo, el polímero es reticulado. Adicionalmente, en estos sistemas de suministro, el GRP, análogo o mimético, puede ser funcionali zado en una manera en donde puede ser covalentemente unido al polímero y proporcionado inseparable del polímero de manera simple. En otras modalidades, el polímero es químicamente modificado con un inhibidor de enzimas u otros agentes los cuales pueden degradar o inactivar los agentes biológicamente activos y/o agentes que intensifican el suministro. En ciertas formulaciones, el polímero es parcialmente o completamente insoluble en agua pero el polímero expandible en agua por ejemplo, un hidrogel. Los polímeros empleados en este aspecto de la invención, son deseablemente interactivos con agua y/o hidrofílicos en naturaleza para absorber cantidades significantes de agua, y a menudo, forman hidrogeles cuando se colocan en contacto con agua o medio acuoso por un periodo de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio con agua. En modalidades más detalladas, el polímero es un hidrogel el cual, cuando se coloca en contacto con exceso de agua, absorbe al menos, dos veces su peso de agua en equilibrio cuando se expone a agua a temperatura ambiente. Patente Estadounidense No. 6,0004,583. Los sistemas de suministro basados en polímeros biodegradables son preferidos en muchas aplicaciones biomédicas debido a que tales sistemas son rotos ya sea por hidrólisis o por reacción enzimática en moléculas no tóxicas. La tasa de degradación está controlada manipulando la composición de la matriz polimérica biodegradable. Estos tipo de sistemas pueden por lo tanto, ser empleados en ciertos ajustes para liberación de término largo de agentes biológicamente activos. Los polímeros biodegradables , tales como poli (ácido glicólico) (PGA), poli- (ácido láctico) (PLA), y poli(ácido D, L-láctico-co-glicólico ) ( PLGA) , han recibido atención considerable como portadores de suministro de fármaco posibles, puesto que los productos de degradación de estos polímeros se han encontrado por tener baja toxicidad. Durante la función normal metabólica del cuerpo, estos polímeros se degradan en dióxido de carbono y agua. Estos polímeros también han exhibido excelente biocompatibilidad . Para prolongar la actividad biológica de GRP, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, así como también agentes que intensifican el suministro opcionales, estos agentes pueden ser incorporados en matrices poliméricas, por ejemplo, poliortoésteres , polianhídridos , o poliésteres. Estos rendimientos sostienen la actividad y liberación de los agentes activos, por ejemplo, como se determina por la degradación de la matriz polimérica. Aunque la encapsulación de moléculas bioterapéuticas dentro de los polímeros sintéticos puede estabilizarlos durante el almacenamiento y suministro, los obstáculos más grandes de tecnología de liberación basada en el polímero, son la pérdida de actividad de las moléculas terapéuticas durante los procesos de formulación que a menudo involucran calor, sonicación o solventes orgánicos. Los polímeros que promueven la absorción contemplados para uso dentro de la invención pueden incluir, derivados y versiones químicamente o físicamente modificadas de los tipos mencionados anteriormente de polímeros, además de otros polímeros sintéticos o que se originan naturalmente, gomas, resinas y otros agentes, así como también mezclas de estos materiales entre sí u otros polímeros, tan pronto como las alteraciones, modificaciones o mezclado, no afecte adversamente las propiedades deseadas, tales como absorción de agua, formación de hidrogel y/o estabilidad química para aplicación útil. En aspectos más detallados de la invención, polímeros tales como nilón, acrilán y otros polímeros sintéticos normalmente hidrofóbicos , pueden ser suficientemente modificados por reacción para llegar a ser expandibles en agua y/o formar geles estables en medios acuosos . Los polímeros que promueven la absorción de la invención, pueden incluir polímeros del grupo de homo y copolímeros basados en varias combinaciones de los siguientes monómeros de vinilo: ácidos acrílico y metacrí lieos , acrilamida, metacrilamida , hidroxietilacrilato o metacrilato, vinilpirrolidonas, así como también polinivilalcohol y sus co y terpolímeros, polivinilacetato, sus co y terpolímeros con los monómeros listados anteriormente y ácido 2-acrilamido-2-metil-propansulfónico (A PS©) . Muy útiles son copolimeros de los monómeros listados anteriormente con monómeros funcionales copolimeri zables tales como acrilato de acril o metacrilamida o ásteres de metacrilato en donde los grupos éster son derivados de alquilo, arilo de cadena recta o ramificada que tienen hasta cuatro anillos aromáticos, los cuales pueden contener sustituyentes alquilo de 1 a 6 carbonos; monómeros esferoidales, sulfatos, fosfatos o catiónicos, tales como N, -dimetilaminoalquil (met ) acrilamida, dimetilaminoalquil (met ) acrilato, cloruro de (met ) acriloxialquiltrimetilamonio, cloruro de (met ) acriloxialquildimetilbencilamonio . Polímeros que promueven la absorción adicionales para uso dentro de la invención, son aquellos clasificados como dextranos, dextrinas y de la clase de materiales clasificados como gomas naturales y resinas, o de la clase de polímeros naturales tales como colágeno procesado, quitina, quitosa, pulalan, zooglan, alginatos y alginatos modificados tales como "Kelcoloide" (un alginato modificado de polipropilenglicol ) , gomas de gelano tales como "Kelocogel", gomas de xantano tales como "Keltrol", estastinas, alfa hidroxibutirato y sus copolimeros, ácido hialurónico y sus derivados, ácidos poliláctico y glicólicos. Una clase muy útil de polímeros aplicables dentro de la presente invención son ácidos carboxilicos olefinicamente insaturados que contienen al menos, un enlace doble olefinico carbono a carbono activado, y al menos un grupo carboxilo; esto es, un ácido o grupo funcional fácilmente convertido a un ácido que contiene un enlace doble olefinico el cual fácilmente funciona en la polimerización debido a su presencia en la molécula monomérica, ya sea en la posición alfa-beta con respecto a un grupo carboxilo, o como parte de un grupo metileno terminal. Ácidos olefinicamente insaturados de esta clase incluyen tales materiales como los ácidos acrilicos tipificados por el ácido acrilico mismo, ácido alfa-ciano acrilico, ácido beta metacrilico (ácido crotónico) , ácido alfa-fenil acrilico, ácido beta-acriloxi propiónico, ácido cinámico, ácido p-cloro cinámico, 1-carboxi-4-fenil butadieno-1 , 3 , ácido itacónico, ácido citracónico, ácido mesacónico, ácido glutacónico, ácido aconitico, ácido maleico, ácido fumárico, y tricarboxi etileno. Como se usa aquí, el término "ácido carboxilico" incluye los ácidos carboxilicos y aquellos anhídridos de ácido, tales como anhídrido maleico, en donde el grupo anhídrido es formado por la eliminación de la molécula de agua a partir de dos grupos carboxilo localizados en la misma molécula de ácido carboxilico. Acrilatos representativos útiles como agentes que promueven la absorción con la invención incluyen metil acrilato, etil acrilato, propil acrilato, isopropil acrilato, butil acrilato, isobutil acrilato, metil metacrilato, metil etacrilato, etil metacrilato, octil acrilato, heptil acrilato, octil metacrilato, isopropil metacrilato, 2-etilhexil metacrilato, nonil acrilato, hexil acrilato, n-hexil metacrilato, y similares. Esteres alquil acrilicos superiores son decil acrilato, isodecil metacrilato, lauril acrilato, estearil acrilato, behenil acrilato y melissil acrilato y versiones de metacrilato de los mismos. Mezclas de dos o tres o más ásteres acrilicos de cadena larga, pueden ser exitosamente polimerizados con uno de los monómeros carboxilicos . Otros monómeros incluyen olefinas que incluyen, alfa olefinas, viniléteres, vinilésteres y mezclas de los mismos . Otros monómeros de vinilideno, que incluyen los nitrilos acrilicos, también pueden ser usados como agentes que promueven la absorción con los métodos y composiciones de la invención, para mejorar el suministro y absorción de uno o más GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos, que incluyen mejorar el suministro de agentes activos a un tejido objetivo o compartimiento en el sujeto (por ejemplo, el hígado, vena portal hepática, tejido o fluido del CNS o plasma de sangre) . Nitrilos alfa, beta-olefínicamente insaturados útiles, son preferiblemente nitrilos monoolefínicamente insaturados, que tienen 3 a 10 átomos de carbono, tales como acrilonitrilo, metacrilonitrilo y similares. Más preferidos son acrilonitrilos y metacrilonitrilos . Amidas acrilicas que contienen de 3 a 35 átomos de carbono que incluyen amidas monoolefinicamente insaturadas, también pueden ser usadas. Amidas representativas incluyen acrilamida, metacrilamida , N-t-butilacrilamida , N-ciclohexilacrilamida , alquilamidas superiores, en donde el grupo alquilo en el nitrógeno contiene desde 8 a 32 átomos de carbonos, amidas acrilicas que incluyen N-alquilol amidas de ácidos carboxilicos alfa, beta-olefinicamente insaturados que incluyen aquellas que tienen desde 4 hasta 10 átomos de carbono, tales como N-metilol acrilamida, N-propanol acrilamida, N-metilol metacrilamida, N-metilol maleimida, ésteres de ácido N-metilol maleámico, N-metilol-p-vinil benzamida y similares. Materiales que promueven la absorción útiles aún adicionales, son alfa-olefinas que contienen desde 2 a 18 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 8 átomos de carbono; dienos que contienen desde 4 a 10 átomos de carbono; vinilésteres y alilésteres tales como vinilacetato ; vinilaromáticos tales como estireno, metilestireno y cloro-estireno; vinil y aliléteres y cetonas tales como vinilmetiléter y metilvinilcetona ; cloroacrilatos ; cianoalquilacrilatos tales como alfa-cianometilacrilato y los alfa, beta y gama cianopropilacrilatos; alcoxiacrilatos tales como metoxietilacrilato; haloacrilatos como cloroetilacrilato; vinilharulos y vinilcloruro, cloruro de vinilideno y similares; divinilos, diacrilatos y otros monómeros polifuncionales tales como diviniléter, diacrilato de dietilenglicol , dimetacrilato de etilenglicol , metilen-bis-acrilamida , alilpentaeritritol , y similares; y bis (beta-haloalquil ) alquenil fosfonatos tales como bis (beta-cloroetil ) vinilfosfonato y similares como se conoce por aquellos expertos en la técnica. Los copolimeros en donde el monómero que contiene carboxi son un constituyente menor, y los otros monómeros de vinilideno presentes como componentes principales son fácilmente preparados de conformidad con los métodos descritos aquí. Cuando los hidrogeles son empleados como agentes que promueven la absorción con la invención, estos pueden estar compuestos de copolimeros sintéticos del grupo de ácidos acrilicos y metacrilicos , acrilamida, metacrilamida , hidroxietilacrilato (HEA) o metacrilato (HE A) , y vinilpirrolidonas los cuales son interactivos y expandibles con agua. Ejemplos ilustrativos específicos de polímeros útiles, especialmente para el suministro de péptidos o proteínas, son los siguientes tipos de polímeros: (met ) acrilamida y 0.1 a 99% en peso ácido (met ) acrílico; (met ) acrilamidas y 0.1-75% en peso de cloruro de (met ) acriloxietil trimetilamonio; (met ) acrilamida y 0.1-75% en peso de (met ) acrilamida ; ácido acrilico y 0.1-75% en peso de alquil (met ) acrilatos ; (met ) acrilamida y 0.1-75% en peso de AMPS.RTM (marca comercial de Lubrizol Corp.); (met ) acrilamida y 0 a 30% en peso de alquil (met ) acrilamidas y 0.1-75% en peso de AMPS.RTM; (met ) acrilamida y 0.1-99% en peso de HEMA; (met) acrilamida y 0.1 a 75% en peso de HEMA y 0.1 a 99% de ácido (met ) acrilico; ácido (met ) acrilico y 0.1-99% en peso de HEMA; 50% en mole de viniléter y 50% de mole de anhídrido maleico; (met ) acrilamida y 0.1 a 75% en peso cloruro de (met ) acriloxialquildimetilbencilamonio; (met ) acrilamida y 0.1 a 99% en peso de vinilpirrolidona; (met ) acrilamida y 50% en peso de vinilpirrolidona y 0.1-99.9% en peso de ácido (met ) acrilico; ácido (met ) acrilico y 0.1 a 75% en peso de AMPS.RTM y 0.1-75% en peso de alquil (met ) acrilamida . En los ejemplos anteriores, alquilo significa Ci a C30, preferiblemente Ci a C22 lineal y ramificado y C4 a Ci6 cíclico; en donde (met) se usa, significa que los monómeros con y sin el grupo metilo están incluidos. Otros polímeros de hidrogel muy útiles son expandibles, pero versiones insolubles de almidón de poli ( vinilpirrolidona ) , carboximetilcelulosa y alcohol polivinílico . Materiales de hidrogel poliméricos adicionales útiles con la invención incluyen complejos (poli) hidroxialquil (met) acrilato: hidrogeles aniónicos y catiónicos: poli (electrolito) ; poli ( vinilalcoholes ) que tienen un acetato residual bajo: una mezcla expandible de agar reticulado y carboximetilcelulosa reticulada: una composición expandible que comprende metilcelulosa mezclada con agar escasamente reticulada; un copolimero expandible en agua producido por una dispersión de copolimero finamente dividido de anhídrido maleico con estireno, etileno, propileno o isobutileno ; un polímero expandible en agua de N-vinil lactamas; sales de sodio expandibles de carboximetilcelulosa; y similares. Otros polímeros de retención y absorbentes de fluido, gelificables empleados para formar el hidrogel hidrofílico para el suministro mucosal de agentes biológicamente activos dentro de la invención incluyen pectina; polisacáridos tales como agar, acacia, karaya, tragacanto, algunas y guar y sus versiones reticuladas; polímeros de ácido acrílico, copolímeros y derivados de sales, poliacrilamida ; polímeros de anhídrido indol maleico expandibles en agua; copolímeros de injerto de almidón; polímeros y copolímeros de tipo acrilato con capacidad de absorción de agua de aproximadamente 2 hasta 400 veces su peso original; diésteres de poliglucano; una mezcla de poli ( vinilalcohol ) reticulado y poli (N-vinil-2-pirrolidona ) ; geles de copolimero de bloque de polibutilen-polietileno; goma de carob; geles de poliéster; geles de poliurea; geles de poliéter; geles de poliamida; geles de poliimida; geles de polipéptido; geles de poliaminoácido; geles policelulósicos ; polímeros de acrilato anhídrido maleico-indeno reticulados ; y polisacáridos . Polímeros de hidrogel sintético para uso dentro de la invención pueden hacerse por una combinación infinita de varios monómeros en varias proporciones. El hidrogel puede ser reticulado y en general, posee la capacidad para retener y absorber fluido y expandirse o hincharse a un estado de equilibrio ampliado. Los hidrogeles típicamente se hinchan o expanden después del suministro a la superficie mucosal nasal, absorbiendo aproximadamente 2-5, 5-10, 10-50 hasta 50-100 o más veces el doble de su peso de agua. El grado óptimo de expandibilidad para un hidrogel dado será determinado por diferentes agentes biológicamente activos, dependiendo de tales factores como peso molecular, tamaño, solubilidad y características de difusión del agente activo portado o atrapado o encapsulado dentro del polímero, y el espaciamiento específico y movimiento de cadena cooperativa asociado con cada polímero individual. Los polímeros hidrofílicos empleados con la invención son solubles en agua pero expandibles en agua. Tales polímeros expandibles en agua son como típicamente se refiere a hidrogeles o geles. Tales geles pueden ser convenientemente producidos a partir de polímero soluble en agua por el proceso de reticulación de los polímeros por un agente de reticulación adecuado. Sin embargo, los hidrogeles estables pueden también ser formados a partir de polímeros específicos bajo condiciones definidas de pH, temperatura y/o concentración iónica, de conformidad con los métodos conocidos en el arte. Típicamente, los polímeros son reticulados, esto es, reticulados en la magnitud de que los polímeros poseen buenas propiedades hidrofílicas , tienen integridad física mejorada (comparada con polímeros no reticulados del mismo o similar tipo) y exhiben capacidad mejorada para retener dentro de la red de gel tanto el agente biológicamente activo de interés como los compuestos adicionales para coadministración junto con éstos, tales como citocina o inhibidor de enzima, mientras retiene la capacidad para liberar los agentes activos, en el tiempo y ubicación apropiados. En general, los polímeros de hidrogel para uso con la invención son reticulados con una reticulación difuncional en la cantidad desde 0.01 hasta 25% en peso, basado en el peso de los monómeros que forman el copolímero, y más preferiblemente, desde 0.1 hasta 20 por ciento en peso y más a menudo desde 0.1 hasta 15 por ciento en peso del agente reticulante. Otra cantidad útil de un agente de reticulación es 0.1 a 10 porciento en peso. Agentes de reticulación multifuncional tri, tetra o superiores, pueden también ser empleados. Cuando tales reactivos son utilizados, cantidades inferiores pueden ser requeridas para lograr la densidad de reticulación equivalente, es decir, el grado de reticulación o propiedades de red que son suficientes para contener efectivamente los agentes biológicamente activos. Los reticulantes pueden ser enlaces covalentes, iónicos o hidrógeno con el polímero que posee la capacidad para expandirse en la presencia de fluidos que contiene agua. Tales reticuladores y reacciones de reticulación son conocidas por aquellos expertos en la técnica y en muchos casos, son dependientes del sistema polimérico. De este modo, una red reticulada puede ser formada por copolimerización de radical libre de monómeros insaturados. Los hidrogeles poliméricos también pueden ser formados reticulando polímeros preformados haciendo reaccionar grupos funcionales encontrados en los polímeros, tales como alcoholes, ácidos, aminas con tales grupos como glioxal, formaldehído o glutaraldehído, bis anhídridos y similares. Los polímeros también pueden ser reticulados con cualquier polieno, por ejemplo, decadieno o trivinilciclohexano; acrilamidas tales como N,N-metilen-bis (acrilamida) ; acrilatos polifuncionales tales como trimetilolpropantriacrilato ; o monómero de vinilideno polifuncional que contiene al menos, 2 grupos terminales CH2 <, que incluyen por ejemplo, copolímeros de divinilbenceno, divinilnaftleno, alilo y similares. En ciertas modalidades, los monómeros de reticulación para uso en la preparación de los copolimeros son polialquenilpoliéteres que tienen más de un agrupamiento de alqueniléter por molécula, el cual puede opcionalmente , poseer grupos alquenilo en los cuales un enlace doble olefinico está presente unido a un agrupamiento de metileno terminal (por ejemplo, hecho por la eterificación de un alcohol polihidrico que contiene al menos 2 átomos de carbono y al menos 2 grupos hidroxilo) . Los compuestos de esta clase pueden ser producidos haciendo reaccionar un haluro de alquenilo, tal como cloruro de alilo o bromuro de alilo, con una solución acuosa fuertemente alcalina de uno o más alcoholes polihidricos . El producto puede ser una mezcla compleja de poliéteres con números variantes de grupos éter. La eficiencia del agente de reticulación de poliéter incrementa con el número de grupos potencialmente polimerizables en la molécula. Típicamente, poliéteres que contienen un promedio de dos o más agrupamientos de alqueniléter por molécula, son usados. Otros monómeros de reticulación incluyen por ejemplo, compuestos de dialil ésteres, dimetalil éteres, alil o metalil acrilatos y acrilamidas, tetravinilsilano, polialquenilmetanos , diacrilatos y dimetacrilatos , divinilo, tales como compuestos de divinilbenceno, polialilfosfato, dialiloxi y ésteres de fosfito y similares. Agentes típicos son alil pentaeritritol , alilsacarosa, teimetilolpropan triacrilato, 1 , 6-hexandiol diacrilato, trimetilolpropandialil éter, pentaeritritol triacrilato, tetrametilen dimetacrilato, etilendiacrilato, etilendimetacrilato, trietilenglicol dimetacrilato y similares. Alilpentaeritritol , trimetilolpropan dialiléter y alil sacarosa, proporcionan polímeros adecuados. Cuando el agente de reticulación está presente, las mezclas poliméricas usualmente contienen entre aproximadamente 0.01 hasta 20 por ciento en peso, por ejemplo, 1%, 5%, o 10% o más en peso del monómero de reticulación basado en el total del monómero de ácido carboxílico, más otros monómeros. En aspectos más detallados de la invención, el suministro epitelial de GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, es intensificado reteniendo los agentes activos en vehículo o portador enzimáticamente o fisiológicamente protector de liberación lenta, por ejemplo, un hidrogel que cubre el agente activo de la acción de las enzimas degradativas . En ciertas modalidades, el agente activo está unido por medios químicos al portador o vehículo, el cual también puede ser mezclado o unido a agentes adicionales tales como inhibidores de enzima, citocinas, etc. El agente activo puede alternativamente, ser inmovilizado a través de trampas físicas suficientes dentro del portador o vehículo, por ejemplo, una matriz polimérica.

Los polímeros tales como hidrogeles empleados con la invención, pueden incorporar agentes enlazados funcionales tales como glicósidos químicamente incorporados en el polímero para intensificar la biodisponibilidad intranasal de agentes activos formulados junto con éstos. Ejemplos de tales glicósidos son glucósidos, fructósidos, galactósidos , arabinósidos , manósidos y sus derivados alquilos sustituidos y glicósidos naturales tales como arbutina, florizina, amigdalina, digitonina, saponina e indicano. Existen varias formas en las cuales un glicósido típico se puede unir a un polímero. Por ejemplo, el hidrógeno de los grupos hidroxilo de un glicósido u otro carbohidrato similar puede ser reemplazado por el grupo alquilo a partir de un polímero de hidrogel para formar un éter. También, los grupos hidroxilo de los glicósidos pueden hacerse reaccionar para esterificar los grupos carboxilo de un hidrogel polimérico para formar ésteres poliméricos in situ. Otro procedimiento es emplear condensación de acetobromoglucosa con colest-5-en-3beta-ol en un copolímero de ácido maleico. N-poliacrilamidas sustituidas pueden ser sintetizadas por la reacción de polímeros activados con omega-aminoalquilglicósidos ; (1) (espaciador de carbohidrato) (n) -poliacrilamida, "pseudopolisacáridos" ; (2) (espaciador de carbohidrato) (n) -fosfatidiletanolamina (m) -poliacrilamida, neoglicolípidos , derivados de fosfatidiletanolamina ; (3) (espaciador de carbohidrato) (n)- biotina (m) -poliacrilamida . Estos derivados biotinilados pueden unirse a lectinas en la superficie mucosal para facilitar la absorción de los agentes biológicamente activos por ejemplo, un GRP encapsulado en polímero. Dentro de aspectos más detallados de la invención, uno o más GRP, análogos y miméticos, y/o otros agentes biológicamente activos, descritos aquí, opcionalmente incluyen agentes activos secundarios tales como, inhibidores de proteasas, citocinas, moduladores adicionales de fisiología de unión intercelular, etc., son modificados y unidos a una matriz o portador polimérico. Por ejemplo, esto puede ser realizado enlazando químicamente un agente de péptido o proteína activo y modificando agentes opcionales con una red polimérica reticulada. También es posible modificar químicamente el polímero separadamente con un agente interactivo tal como una molécula que contiene glicosidal. En ciertos aspectos, los agentes biológicamente activos y agentes secundarios activos opcionales, pueden ser funcionalizados , es decir, en donde un grupo reactivo apropiado es identificado o es químicamente agregado a los agentes activos. Más a menudo, se agrega un grupo polimerizable etilénico, y el agente activo funcionalizado es entonces copolimerizado con monómeros y un agente de reticulación usando un método de polimerización estándar tal como solución de polimerización (usualmente en agua), emulsión, suspensión o polimerización de dispersión. A menudo, el agente funcionalizante se proporciona con una concentración suficientemente alta de grupos funcionales o polimerizables para asegurar que varios sitios en los agentes activos son funcionalizados . Por ejemplo, en un polipéptido que comprende 16 sitios amina, es generalmente deseado, funcionalizar al menos, 2, 4, 5, 6 y hasta 8 o más de los sitios . Después de la funcionalización, los agentes activos funcionalizados es/son mezclados con monómeros y un agente de reticulación que comprende los reactivos a partir de los cuales se forma el polímero de interés. La polimerización es entonces inducida en este medio para crear un polímero que contiene los agentes activos unidos. El polímero es entonces combinado con agua u otros solventes apropiados y de otro modo, purificados para remover impurezas rastro sin reaccionar y, si es necesario, triturar o romper por medios físicos tales como por agitación, forzando a través de una malla, ultrasonicación u otros medios adecuados, a un tamaño de partícula deseado. El solvente usualmente agua, es entonces removido en una manera tal para no desnaturalizarse o de otro modo degradar los agentes activos. Un método deseado es liofilización (secado por congelamiento), pero otros métodos son disponibles y pueden ser usados (por ejemplo, secado a vacío, secado por aire, secado por rocío, etc . ) . Para introducir grupos polimerizables en péptidos, proteínas y otros agentes activos con la invención, es posible hacer reaccionar grupos reactivos amino, hidroxilo, tiol y otros disponibles, con grupos insaturados que contienen electrófilos . Por ejemplo, grupos N-hidroxi succinimidilo que contienen monómeros insaturados, carbonatos activos, tales como p-nitrofenil carbonato, triclorofenil carbonatos, tresilato, oxicarbonilimidazoles , epóxido, isocianatos y aldehidos, y carboximetilazidas insaturadas y ortopiridil-disulfuro insaturado, pertenecen a esta categoría de reactivos. Ejemplos ilustrativos de reactivos insaturados son alil glicidil éter, cloruro de alilo, bromuro de alilo, yoduro de alilo, cloruro de acriloilo, isocianato de alilo, cloruro de alilsulfonilo, anhídrido maleico, copolímeros de anhídrido maleico y alil éter y similares. Todos los derivados activos de lisina, excepto aldehido, pueden en general, reaccionar con otros aminoácidos tales como grupos imidazol de histidina y grupos hidroxilo de tirosina y los grupos tiol de cistina si el ambiente local intensifica la nucleofilicidad de estos grupos. Los reactivos funcionalizantes que contienen aldehido son específicos a lisina. Estos tipos de reacciones con grupos disponibles de lisinas, cisteínas, tirosinas, han sido extensivamente documentados en la literatura y son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En el caso de agentes biológicamente activos que contienen grupos amina, es conviente hacer reaccionar tales grupos con un cloruro de aciloilo, tal como cloruro de acriloilo, para introducir el grupo acrilico polimerizable en el agente que se hace reaccionar. Después durante la preparación del polímero, tal como durante la reticulación del copolímero de acrilamida y ácido acrilico, el agente activo funcionalizado, a través de los grupos acrílicos, es unido al polímero y llega a unirse a este. En aspectos adicionales de la invención, agentes biológicamente activos que incluyen péptidos, proteínas, nucleósidos y otras moléculas las cuales son bioactivas in vivo, son de conjugación estabilizada uniendo covalentemente uno o más agentes activos a un polímero que incorpora como una parte integral del mismo, tanto una porción hidrofílica, por ejemplo, un polialquilenglicol lineal, una porción lipofílica (véase por ejemplo, patente Estadounidense No. 5,681,811). En un aspecto, un agente biológicamente activo es covalentemetne acoplado con un polímero que comprende (i) una porción de polialquilenglicol lineal, y (ii) una porción lipofílica, en donde el agente activo, porción de polialquilenglicol lineal, y la porción lipofílica, son conformacionalmente arreglados relativos entre sí, de manera tal que el agente terapéutico activo tiene una resistencia in vivo intensificada a la degradación enzimática (es decir, relativa a su estabilidad bajo condiciones similares en una forma no conjugada desprovista del polímero acoplado a este) . En otro aspecto, la formulación de conjugación estabilizada tiene una conformación tri-dimensional que comprende el agente biológicamente activo acoplado con un complejo de polisorbato que comprende (i) una porción de polialquilenglicol lineal, y (ii) una porción lipofílica, en donde el agente activo, la porción polialquilenglicol lineal y la porción lipofílica, están conformacionalmente arregladas relativas entre sí, de manera tal que (a) la porción lipofílica es exteriormente disponible en la conformación tri-dimensional, y (b) el agente activo en la composición tiene una resistencia in vivo intensificada para degradación enzimática. En un aspecto adicional relacionado, se proporciona un complejo conjugado de ligando múltiple, el cual comprende un agente biológicamente activo acoplado covalentemente con una porción de estructura de triglicérido a través de un grupo espaciador de polialquilenglicol unido a un átomo de carbono de la porción de estructura de triglicérido, y al menos una porción de ácido graso covalentemente unida ya sea directamente a un átomo de carbono de la porción de estructura de triglicérido o covalentemente unida a través de una porción espadadora de polialquilen glicol (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,681,811). En tales complejos de agentes terapéuticos conjugados de ligandos múltiples, los átomos de carbono alfa y beta de la porción bioactiva de triglicéridos , pueden tener porciones de ácido graso unidas uniendo covalentemente ya sea directamente a esta, o indirectamente uniendo covalentemente a esta a través de porciones espadadoras de polialquilenglicol. Alternativamente, una porción de ácido graso puede ser covalentemetne unida ya sea directamente o a través de una porción espadadora de polialquilen glicol a los carbonos alfa y alfa' de la porción de estructura de triglicérido, con el agente terapéutico bioactivo siendo covalentemente acoplado con el gama-carbono de la porción de estructura de triglicérido, ya sea directamente covalentemente unido a este o indirectamente unido a este a través de una porción espadadora de polialquileno . Se reconocerá que una amplia variedad de formas estructurales, composicionales y conformacionales son posibles, para el complejo de agente terapeútico conjugado de ligando múltiple que comprende la porción de estructura de triglicérido, dentro del campo de la invención. Además, se nota que en tal complejo de agente terapéutico de ligando múltiple, los agentes biológicamente activos pueden ser ventajosamente covalentemente acoplados con la porción de estructura modificada de triglicérido a través de grupos espaciadores alquilo, o alternativamente, otros grupos espaciadores aceptables dentro del campo de la invención. Como se usa en tal contexto, aceptabilidad del grupo espaciador se refiere a características de aceptabilidad específicas de aplicación de uso final, esférico y composicional . En aún aspectos adicionales de la invención, se proporciona un complejo de conjugación estabilizada, el cual comprende un complejo de polisorbato que comprende una porción de polisorbato que incluye una estructura de triglicérido que tiene covalentemente acoplado a los átomos de carbono alfa, alfa' y beta del mismo, grupos funcionali zantes que incluyen, (i) un grupo de ácido graso; y (ii) un grupo de polietilenglicol que tiene un agente biológicamente activo o porción covalentemente unida a este, por ejemplo, unida a una funcionalidad apropiada del grupo polietilenglicol . Tal enlace covalente puede ser ya sea directo, por ejemplo, a una funcionalidad hidroxi terminal del grupo de polietilenglicol , o alternativamente, el enlace covalente puede ser directo, por ejemplo, tapando reactivamente el término hidroxi del grupo polietilenglicol con un grupo espaciador de funcionalidad carboxi terminal, de manera que el grupo polietilenglicol tapado resultante, tiene una funcionalidad carboxi terminal en la cual el agente biológicamente activo o porción, puede ser covalentemente unido.

En aspectos aún adicionales de la invención, se proporciona un complejo estable, acuosamente soluble, de conjugación estabilizada, el cual comprende uno o más GRP, análogos y miméticos, y/o otros agentes+ biológicamente activos descritos aquí covalentemente acoplados a una porción glicolipida modificada con polietilenglicol (PEG) fisiológicamente compatible. En tal complejo, los agentes biológicamente activos pueden ser covalentemente acoplados a la porción glicolipida modificada con PEG fisiológicamente compatible por un enlace covalente lábil en un grupo de aminoácido libre del agente activo, en donde el enlace covalente lábil es escindible in vivo por hidrólisis bioquímica y/o proteólisis. La porción glicolipida modificada con PEG fisiológicamente compatible, puede comprender ventajosamente un polímero de polisorbato, por ejemplo, un grupos de éster de ácidos grasos que comprenden polímero de polisorbato, seleccionado del grupo que consiste de monopalmitato, dipalmitato, monolaurato, dilaurato, trilaurato, monoleato, dioleato, trioleato, monoestearato, diestearato y triestearato . En tal complejo, la porción glicolipida modificada con PEG fisiológicamente compatible, puede comprender adecuadamente un polímero seleccionado del grupo que consiste de polietilenglicoléteres de ácidos grasos y polietilenglicolésteres de ácidos grasos, en donde los ácidos grasos por ejemplo, comprenden un ácido graso seleccionado del grupo que consiste de ácidos láurico, palmitico, oleico y esteárico.

Almacenamiento de Material En ciertos aspectos de la invención, las formulaciones combinatoriales y/o métodos de administración coordinados aquí, incorporan una cantidad efectiva de péptidos y proteínas los cuales pueden adherirse a vidrio cargado, con ello, reduciendo la concentración efectiva en el contenedor. Los contenedores silanizados por ejemplo, contenedores de vidrio silanizados, son usados para almacenar el producto acabado para reducir la absorción del polipéptido o proteína a un contenedor de vidrio. En aspectos aún adicionales de la invención, un kit para el tratamiento de un sujeto mamífero comprende una composición farmacéutica estable de uno o más compuestos GRP formulados para suministro mucosal al sujeto mamífero, en donde la composición es efectiva para aliviar uno o más síntomas de diabetes, obesidad, cáncer, hiperglicemia , dislipidemia, síndrome metabólico, síndrome coronario, infarto al miocardio, o trastorno neurológico en dicho sujeto sin efectos secundarios adversos inaceptables. El kit además comprende un vial reactivo farmacéutico para contener uno o más compuestos GRP. El vial reactivo farmacéutico está compuesto de polímero de grado farmacéutico, vidrio u otro material adecuado. El vial de reactivo farmacéutico es, por ejemplo, un vial de vidrio silanizado. El kit además comprende una apertura para suministro de la composición a una superficie mucosal nasal del sujeto. La apertura de suministro está compuesta de un polímero de grado farmacéutico, vidrio u otro material adecuado. La apertura de suministro es, por ejemplo, un vidrio silanizado. Una técnica de silanización combina una técnica de limpieza especial para las superficies a ser silanizadas con un proceso de silanización a baja presión. El silano está en la fase gaseosa y a una temperatura intensificada de las superficies a ser silanizadas. El método proporciona superficies reproducivles con capas de silano estables, homogéneas y funcionales que tienen características de una monocapa. Las superficies silanizadas previenen el enlace al vidrio de polipéptidos o agentes que intensifican el suministro mucosal de la presente invención. El procedimiento es útil para preparar viales reactivos farmacéuticos silanizados para retener composiciones GRP de la presente invención. Las bandejas de vidrio son limpiadas enjuagando con agua destilada doble (ddH20) antes de usar. La bandeja de silano es entonces enjuagada con EtOH al 95%, y la bandeja de acetona es enjuagada con acetona. Los viales de reactivo farmacéutico son sonicados en acetona por 10 minutos. Después de la sonicación de acetona, los viales de reactivos son enjuagados en bandeja de ddH20 al menos, dos veces. Los viales reactivos son sonicados en 0.1M de NaOH por 10 minutos. Mientras los viales reactivos son sonicados en NaOH, la solución de silano se hace bajo una capucha. (SOlución de silano: 800 mi de 95% de etanol; 96 L de ácido glacial acético; 25 mi de glicidoxipropiltrimetoxi silano) . Después de la sonicación de NaOH, los viales de reactivo son enjuagados en bandeja de ddH20 al menos dos veces. Los viales de reactivo son sonicados en solución de silano por 3 a 5 minutos. Los viales de reactivo son enjuagados en bandeja de EtOH al 100%. Los viales de reactivo son secados con gas N2 prepurificado y almacenados en un horno a 100°C por al menos 2 horas antes de usar .

Vehículos de Suministro Bioadhesivo y Métodos En ciertos aspectos de la invención, las formulaciones combinatoriales y/o métodos de administración coordinada aquí, incorporan una cantidad efectiva de un adhesivo no tóxico como un compuesto o portador adjunto, para mejorar el suministro epitelial de uno o más agentes biológicamente activos. Los agentes bioadhesivos en este contexto, exhiben adhesión general o específica a uno o más componentes o superficies de la membrana biológica objetivo. El bioadhesivo mantiene un gradiente de concentración deseado del agente biológicamente activo en o a través de la mucosa para asegurar la penetración de aún moléculas grande (por ejemplo, péptido y proteínas) en o a través del epitelio. Típicamente, el empleo de un bioadhesivo dentro de los métodos y composiciones de la invención, proporciona un incremento de dos a cinco veces, a menudo de cinco a diez veces en permeabilidad para péptidos y proteínas en o a través del epitelio. Este mejoramiento de la permeación epitelial a menudo, permite el suministro transmucosal efectivo de macromoléculas grandes, por ejemplo, a la porción basal del epitelio nasal o en los compartimientos extracelulares adyacentes o un plasma de sangre o tejido de CNS o fluido. Este suministro mejorado proporciona efectividad mayormente mejorada para el suministro de péptidos, proteínas bioactivas y otras especies terapéuticas macromoleculares . Estos resultados dependerán en parte, de la hidrofilicidad del compuesto, con ello, se logrará mayor penetración con especies hidrofílicas comparadas con compuestos insolubles en agua. Además de estos efectos, el empleo de bioadhesivos para mejorar la persistencia del fármaco a la superficie de la membrana biológica, puede provocar un mecanismo reservorio para el suministro de fármaco prolongado, con ello, los compuestos no solamente penetran a través de la membrana biológica, sino también se difunden nuevamente hacia la superficie una vez que el material en la superficie es agotado . Se describe una variedad de bioadhesivos adecuados en la técnica para administración oral, Patentes Estadounidenses Nos. 3,972,995; 4,259,314; 4,680,323; 4,740,365; 4,573,996; 4,292,299; 4,715,369; 4,876,092; 4,855,142; 4,250,163; 4,226,848; 4,948,580; Republicación de Patente Estadounidense No. 33,093, la cual encuentra uso dentro de los nuevos métodos y composiciones de la invención. El potencial de varios polímeros bioadhesivos como una plataforma de suministro nasal, por ejemplo mucosal, con los métodos y composiciones de la invención, puede ser fácilmente valorado determinando su capacidad para retener y liberar GRP, así como también por su capacidad para interactuar con las superficies mucosales después de la incorporación del agente activo ahí. Además, métodos bien conocidos serán aplicados para determinar la biocompatibilidad de polímeros seleccionados con el tejido en el sitio de la administración mucosal. Cuando la mucosa objetivo es cubierta por el moco (es decir, en la ausencia de tratamiento mucolítico o separación del moco) , puede servir como un enlace de conexión al epitelio mucosal subyacente. Por lo tanto, el término "bioadhesivo" como se usa aquí, también cubre los compuestos mucoadhesivos útiles para mejorar el suministro mucosal de agentes biológicamente activos dentro de la invención. Sin embargo, el contacto adhesivo al tejido mucosal mediado a través de la adhesión a una capa de gel mucosa, puede ser limitado por unión incompleta o temporal entre la capa del moco y el tejido subyacente, particularmente en superficies nasales en donde ocurre la separación rápida del moco. En este sentido, las glicoproteinas de mucina son continuamente secretadas e, inmediatamente después, son liberadas de células o glándulas, formando un gel viscoelástico . La superficie luminal de la capa de gel adherente, sin embargo, es continuamente erosionada por acción mecánica, enzimática y/o ciliar. En donde tales actividades son más prominentes o en donde son deseados tiempos de adhesión prolongados, los métodos de administración coordinados y métodos de formulación combinatorial de la invención, pueden además, incorporar métodos mucoliticos y/o ciliostáticos o agentes como se describe aquí anteriormente. Típicamente, los polímeros mucoadhesivos para uso dentro de la invención son macromoléculas naturales o sintéticas las cuales se adhieren a las superficies de tejido mucosal húmedo por mecanismos complejos, pero no específicos. Además de estos polímeros mucoadhesivos, la invención también proporciona métodos y composiciones que incorporan bioadhesivos que se adhieren directamente a una superficie celular, en lugar del moco, por medio de interacciones específicas que incluyen, mediadas por el receptor. Un ejemplo de bioadhesivos que funcionan en esta manera especifica, es el grupo de compuestos conocidos como lectinas. Estas son glicoproteinas con una capacidad para reconocer específicamente y enlazarse a moléculas de azúcar, por ejemplo, glicoproteinas o glicolípidos , los cuales forman parte de las membranas de células epiteliales intranasales y pueden ser considerados como "receptores de lectina". En ciertos aspectos de la invención, materiales bioadhesivos para intensificar el suministro intranasal de agentes biológicamente activos comprenden, una matriz de un polímero hidrofílico, por ejemplo, soluble en agua o expandible, o una mezcla de polímeros que pueden adherirse a una superficie mucosa húmeda. Estos adhesivos pueden ser formulados como ungüentos, hidrogeles (véase anteriormente) , películas gástricas, y otras formas de aplicación. A menudo, estos adhesivos tienen el agente biológicamente activo mezclado junto con éste para efectuar liberación lenta o suministro local del agente activo. Algunos son formulados con ingredientes adicionales para facilitar la penetración del agente activo a través de la mucosa nasal, por ejemplo, en el sistema circulatorio del individuo. Varios polímeros, tanto naturales como sintéticos, muestran enlace significante al moco y/o superficies epiteliales mucosales bajo condiciones fisiológicas. La fuerza de esta interacción puede ser fácilmente medida por desprendimiento mecánico o pruebas de corte. Cuando se aplica a una superficie mucosal húmeda, muchos materiales secos espontáneamente se adherirán, al menos ligeramente. Después de tal contacto inicial, algunos materiales hidrofilicos comienzan a atraer agua por absorción, expansión o fuerzas capilares y si esta agua es absorbida del sustrato subyacente o de la interfaz de polímero-te ido, la adhesión puede ser suficiente para lograr la meta de mejorar la absorción de mucosa por agentes biológicamente activos. Tal "adhesión por hidratación" , puede ser casi fuerte, pero las formulaciones adaptadas para emplear este mecanismo, deben considerar expansión, la cual continua conforme la dosificación se transforma en un muscílago hidrataado. Esto es proyectado para muchos hidrocoloides útiles con la invención, especialmente algunos derivados de celulosa, los cuales son en general, no adhesivos cuando se aplican en el estado pre-hidratado. Sin embargo, los sistemas de suministro de fármaco bioadhesivos para administración epitelial son efectivos dentro de la invención, cuando tales materiales son aplicados en la forma de un polvo seco polimérico, microesfera, o forma de suministro tipo película. Otros polímeros se adhieren a las superficies epiteliales no solamente cuando son aplicados en seco, sino también en estado completamente hidratado, y en la presencia de cantidades en exceso de agua. La selección de un mucoadhesivo de este modo, requiere consideración debido a las condiciones fisiológicas asi como también fisicoquímicas, bajo las cuales el contacto con el tejido será formado y mantenido. En particular, la cantidad de agua o humedad, usualmente presente en el sitio propuesto de adhesión, y el pH prevalente, son conocidas por afectar ampliamente la intensidad de enlace mucoadhesivo de diferentes polímeros. Varios sistemas de suministro de fármaco bioadhesivo polimérico han sido fabricados y estudiados en los pasados 20 años, no siempre con éxito. Una variedad de tales portadores son, sin embargo, actualmente usados en aplicaciones clínicas que involucran usos dentales, ortopédicos, oftalmológicos y quirúrgicos. Por ejemplo, hidrogeles de base acrílica, han sido usados extensivamente por dispositivos bioadhesivos . Los hidrogeles de base acrílica, son bien estudiados para bioadhesión debido a su flexibilidad y características no abrasivas en el estado particularmente expandidlo, el cual reduce la abrasión que causa daño a los tejidos en contacto. Además, su alta permeabilidad en el estado hinchado permite al monómero sin reaccionar, cadenas poliméricas no reticuladas y al iniciador, ser enjuagados de la matriz después de la polimerización, lo cual es una característica importante para selección de materiales bioadhesivos para uso con la invención. Dispositivos poliméricos de base acrílica exhiben intensidad de enlace adhesivo muy fuerte. Para suministro epitelial controlado de fármacos de péptido y proteína, los métodos y composiciones de la invención, opcionalmente incluyen el uso de portadores, por ejemplo, vehículos de suministro polimérico, que funcionan en parte, para proteger el agente biológicamente activo del rompimiento proteolítico, mientras al mismo tiempo, proporcionan penetración intensificada del péptido o proteína en o a través de la mucosa nasal. En este contexto, los polímeros bioadhesivos han demostrado potencial considerable para intensificar el suministro de fármaco oral. Como un ejemplo, la biodisponibilidad de 9-desglicinamida , 8-arginina vasopresina (DGAVP), intraduodenalmente adminsitrada a ratas, junto con 1% (p/p) de dispersión salina del derivado de poli (ácido acrílico) mucoadhesivo policarbofilo, es 3-5 veces incrementada comparada con una solución acuosa del fármaco de péptido sin este polímero. Los polímeros mucoadhesivos del tipo poli (ácido acrílico) , son potentes inhibidores de algunas proteasas intestinales. El mecanismo de inhibición de enzima es explicado por la fuerte afinidad de esta clase de polímeros por cationes divalentes, tales como calcio o zinc, los cuales son cofactores esenciales de metaloproteinasas , tales como tripsina y quimiotripsina . La privación de las proteasas de sus cofactores por poli (ácido acrílico), es reportada por inducir cambios estructurales irreversibles de las proteínas enzimáticas, los cuales están acompañados por una pérdida de actividad enzimática. Al mismo tiempo, otros polímeros mucoadhesivos (por ejemplo, algunos derivados de cleulosa y quitosan) , pueden no inhibir las enzimas proteol íticas bajo ciertas condiciones. Contrario a otros inhibidores enzimáticos contemplados para uso dentro de la invención (por ejemplo, aprotinina; bestatina) , los cuales son relativamente moléculas pequeñas, la absorción trans-nasal de polímeros inhibidores es probablemente mínima en vista del tamaño de estas moléculas, y con ello, eliminan los efectos secundarios adversos posibles. De este modo, los polímeros mucoadhesivos, particularmente del tipo poli (ácido acrílico) , pueden servir tanto como un adhesivo que promueve la adhesión como un agente protector de enzima para intensificar el suministro controlado de péptido y fármacos de proteína, especialmente cuando son considerados intereses de seguridad. Además de la protección contra la degradación enzimática, bioadhesivos y otros agentes que promueven la absorción no poliméricos y poliméricos para uso con la invención, pueden incrementar directamante la permeabilidad epitelial a agentes biológicamente activos. Para facilitar el transporte de moléculas hidrofílicas y grandes, tales como péptidos y proteínas, a través de la barrera epitelial nasal, polímeros mucoadhesivos y otros agentes, han sido postulados para proporcionar efectos de permeación intensificados más allá de lo que se considera por el tiempo de residencia premucosal prolongado del sistema de suministro. El curso de tiempo de las concentraciones de plasma de fármaco según se informa, sugiere que las microesferas bioadhesivas causan un incremento agudo, pero temporal, de permeabilidad de insulina a través de la mucosa nasal. Otros polímeros mucoadhesivos para uso con la invención, por ejemplo, quitosan, según se informa, intensifican la permeabilidad de ciertos epitelios mucosales aún cuando son aplicados como una solución acuosa o gel. Otro polímero mucoadhesivo reportado por afectar directamente la permeabilidad epitelial es ácido hialurónico y derivados de éster del mismo. Un agente bioadhesivo particularmente útil con la administración coordinada y/o métodos de formulación combinatorial y composiciones de la invención es quitosan, así como también sus análogos y derivados. El quitosan es un polímero no tóxico, biocompatible y biodegradable que es ampliamente usado para aplicaciones médicas y farmacéuticas debido a sus propiedades favorables de baja toxicidad y buena compatibilidad. Es un poliaminosacárido natural preparado de quitina por N-desacilación con álcali. Como se usa dentro de los métodos y composiciones de la invención, el quitosan incrementa la retención de GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, en un sitio mucosal de aplicación. Este modo de administración también puede mejorar el acatamiento y aceptación del paciente. Como se proporciona además aquí, los métodos y composiciones de la invención opcionalmente incluirán un nuevo derivado de quitosan o forma qimicamente modificada de quitosan. Uno de tales nuevos derivados para uso con la invención, se denota como un polímero ß- [ 1—»4 ] -2-guanidino-2-desoxi-D-glucosa (poli-GuD) . El quitosan es el producto N-desacilado de quitina, un polímero que se origina naturalmente que ha sido usado extensivamente para preparar microesferas para formulaciones orales e intranasales . El polímero de quitosan también ha sido propuesto como un protador soluble para suministro de fármaco parenteral. Dentro de un aspecto de la invención, la o-metilisourea es usada para convertir una amina quitosan a su porción de guanidino. El compuesto guanidinio es preparado, por ejemplo, por la reacción entre soluciones casi-normales de quitosan y o-metilisourea a pH arriba de 8.0. Compuestos adicionales clasificados como agentes bioadhesivos para uso con la presente invención, actúan mediando interacciones específicas, típicamente clasificadas como "interacciones de ligando-receptor", entre las estructuras complementarias del compuesto bioadhesivo y un componente de la superficie epitelial mucosal. Muchos ejemplos naturales ilustran esta forma de bioadhesión de enlace especifico, como se ejemplifica por interacciones de lect ina-azúcar . Las lectinas son (glico) proteínas de origen no inmune, las cuales se enlazan a polisacáridos o glicocon ugados . Varias lectinas de plantas han sido investigadas como agentes que promueven la absorción farmacéuticos posibles. Una lectina de planta, hemaglutinina de Phaseolus vulgaris (PHA), exhibe alta biodisponibilidad oral de más de 10% después de la alimentación a ratas. La lectina de tomate Lycopersicon esculentum) (TL) , parece segura por varios modos de administración. En resumen, los agentes bioadhesivos mencionados anteriormente, son empleados en las formulaciones combinatoriales y métodos de administración coordinada de la presente invención, los cuales opcionalmente incorporan una cantidad efectiva y forman un agente bioadhesivo para prolongar la persistencia o de otro modo incrementan la absorción epitelial de uno o más GRP, análogos y miméticos, y otros agentes biológicamente activos. Los agentes bioadhesivos pueden ser coordinadamente administrados como compuestos adjuntos o como aditivos dentro de las formulaciones combinatoriales de la invención. En ciertas modalidades, el agente bioactivo actúa como un "pegamento farmacéutico", mientras en otras modalidades, el suministro adjunto o formulación combinatorial del agente bioadhesivo sirve para intensificar el contacto del agente biológicamente activo con la mucosa nasal, en algunos casos promoviendo las interaciones especificas ligando-receptor con "receptores" de células epiteliales y en otros incrementando la permeabilidad epitelial para incrementar significantemente el gradiente de concentración de fármaco medido en un sitio objetivo de suministro (por ejemplo, hígado, plasma de sangre, o tejido del CNS o fluido). Aún agentes bioadhesivos adicionales para uso con la invención, actúan como inhibidores de enzima (por ejemplo proteasa) , para mejorar la estabilidad de agentes bioterapéuticos mucosalmente administrados, suministrados coordinadamente o en formulación combinatorial con el agente bioadhesivo .

Liposomas y Vehículos de Suministro Micelar Los métodos de administración coordinada y formulaciones combinatoriales de la presente invención, opcionalmente incorporan portadores a base de ácidos grasos o lípidos efectivos, agentes de procesamiento, o vehículos de suministro, para proporcionar formulaciones mejoradas para el suministro epitelial de GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos. Por ejemplo, una variedad de formulaciones y métodos son proporcionados para el suministro mucosal, el cual comprende uno o más de estos agentes activos, tales como péptido o proteína, mezclados o encapsulados por, o coordinadamente administrados con una liposoma, portador micelar mezclado o emulsión, para mejorar la estabilidad química y física e incrementar la vida media de los agentes biológicamente activos (por ejemplo, reduciendo la susceptibilidad a proteólisis, modificación química y/o desnaturalización) después del suministro mucosal . Dentro de ciertos aspectos de la invención, los sistemas de suministro especializados para agentes biológicamente activos, comprenden vesículas lípidas pequeñas conocidas como liposomas. Estas son típicamente elaboradas de moléculas lípidas neutrales, biodegradables , no tóxicas y no inmunogénicas , y pueden eficientemente, atrapar o enlazar moléculas de fármacos, que incluyen péptidos y proteínas, en o sobre sus membranas. La capacidad atractiva de liposomas como un sistema de suministro de péptido y proteína dentro de la invención, es incrementado por el hecho de que las proteínas encapsuladas pueden permanecer en su ambiente acuoso preferido dentro de las vesículas, mientras la membrana liposomal las protege contra la proteólisis y otros factores desestabilizantes. Aún aunque no todos los métodos de preparación de liposomas conocidos son factibles en la encapsulación de péptidos y proteínas debido a sus propiedades físicas y químicas únicas, varios métodos permiten la encapsulación de estas macromoléculas sin desactivación sustancial. Una variedad de métodos están disponibles para preparar liposomas para uso con la invención, Patentes Estadounidenses Nos. 4,235,871, 4,501,728, y 4,837,028. Para uso con el suministro de liposoma, el agente biológicamente activo es típicamente atrapado dentro de la liposoma, vesícula lípida o está unido al exterior de la vesícula. Como las liposomas, ácidos grasos de cadena larga insaturados, los cuales también tienen actividad intensificada para absorción mucosal, pueden formar vesículas con estructuras similares a bicapas (así llamadas "ufasomas") . Estas pueden ser formadas por ejemplo, usando ácido oleico para atrapar péptidos y proteínas biológicamente activos para suministro intranasal por ejemplo, mucosal con la invención. Otros sistemas de suministro para uso con la invención, combinan el uso de polímeros y liposomas para aliar las propiedades ventajosas de ambos vehículos tales como encapsulación, dentro de la fibrina de polímero natural. Además, la liberación de compuestos bioterapéuticos de este sistema de suministro es controlable a través del uso de reticulación covalente y la adición de agentes antifibrinolíticos al polímero de fibrina. Los sistemas de suministro más simplificados para uso dentro de la invención, incluyen el uso de lípidos catiónicos como vehículos o portadores de suministro, los cuales pueden ser efectivamente empleados para proporcionar una interacción electrostática entre el portador lipido y tales agentes biológicamente activos cargados como proteínas y ácidos nucleicos polianiónicos . Esto permite el empaquetado eficiente de los fármacos en una forma adecuada para administración mucosal y/o subsecuente suministro a compartimientos sistémicos. Los vehículos de suministro adicional para uso con la invención incluyen, ácidos grasos de cadena media y larga, así como también micelos mezclados de tensoactivos con ácidos grasos. La mayoría de lípidos que se originan naturalmente en la forma de ésteres, tienen implicaciones importantes con respecto a su propio transporte a través de las superficies mucosales. Los ácidos grasos libres y sus monoglicéridos los cuales tienen grupos polares unidos, han sido demostrados en la forma de micelos mezclados para actuar en la barrera intestinal, como intensificadores de la penetración. Este descubrimiento de función modificante de barrera de ácidos grasos libres (ácidos carboxílicos con una longitud de cadena que varía desde 12 hasta 20 átomos de carbono) y sus derivados polares, tiene investigación extensiva estimulada sobre la aplicación de estos agentes como intensificadores de la absorción mucosal. Para uso con los métodos de la invención, los ácidos grasos de cadena larga, especialmente lipidos fusogénicos (ácidos grasos insaturados y monoglicéridos tales como ácido oleico, ácido linoleico, ácido linoleico, monooleina, etc.), proporcionan portadores útiles para intensificar el suministro mucosal de GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí. Los ácidos grasos de cadena media (C6 a C12) y monoglicéridos, también han sido mostrados por tener actividad intensificante en la absorción de fármaco intestina, y pueden ser adaptados para uso con las formulaciones de suministro mucosal y métodos de la invención. Además, las sales sódicas de ácidos grasos de cadena larga y media, son vehículos de suministro efectivos y agentes que intensifican la absorción para suministro epitelial de agentes biológicamente activos con la invención. De este modo, pueden ser empleados ácidos grasos en formas solubles de sales sódicas o por la adición de tensoactivos no tóxicos, por ejemplo, aceite de ricino hidrogenado polioxietilado, taurocolato sódico, etc. Otras preparaciones micelares mezcadas y ácido graso que son empleadas con la invención incluyen, pero no se limitan a, caprilato de Na (C8), caprato de Na (CIO), laurato de Na (C12), u oleato de Na (C18), opcionalmente combinada con sales biliares, tales como glicocolato y taurocolato.

Pegilación Métodos adicionales y composiciones proporcionadas con la invención involucran modificación química de péptidos y proteínas biológicamente activas por unión covalente de materiales poliméricos, por ejemplo, dextranos, polivinilpirrolidonas , glicopéptidos , polietilenglicol y poliaminoácidos . Los péptidos y proteínas conjugados resultantes, retienen sus actividades biológicas y solubilidad para administración epitelial. En modalidades alternas, GRP, análogos y miméticos y otros péptidos y proteínas biológicamente activos, son conjugados a polímeros de polialquilenóxido, particularmente polietilenglicoles (PEG). Patente Estadounidense No. 4,179,337. Los polímeros PEG amino-reactivos para uso con la invención incluyen, SC-PEG con masasmoleculares de2 000, 5000, 10000, 12000, y 20 000; U-PEG-10000; NHS-PEG-3 00-biotin; T-PEG-5000; T-PEG-12000; y TPC-PEG-5000. La PEGilación de péptidos y proteínas biológicamente activos se puede lograr por modificación de sitios carboxilo (por ejemplo, grupos de ácido aspártico o ácido glutámico además del término carboxilo) . Se ha descrito la utilidad de PEG-hidrazida en modificación selectiva de grupos carboxilo de proteína activada por carbodiimida bajo condiciones acídicas. Alternativamente, la modificación PEG bifuncional de péptidos y proteínas biológicamente activas, puede ser empleada. En algunos procedimientos, los residuos de aminoácido cargados, que incluyen lisina, ácido aspártico y ácido glutámico, tienen una tendencia marcada para ser accesibles al solvente en superficies de proteínas.

Otras Modificaciones Estabilizantes de Agentes Activos Además de la PEGilación, agentes biológicamente activos tales como péptidos y proteínas para uso con la invención, pueden ser modificados para mejorar la vida media de circulación protegiendo el agente activo vía conjugación a otros compuestos estabilizantes o protectores conocidos, por ejemplo, por la creación de proteínas de fusión con un péptido, activo, proteína, análogo o mimético, ligado a una o más proteínas portadoras, tales como una o más cadenas de inmunoglobulina .

Formulación, Preparación, Manufactura y Administración Las formulaciones de suministro epitelial de la presente invención comprenden GRP, análogos y miméticos, típicamente combinados junto con una o más portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente , otros ingredientes terapéuticos. Los portadores deben ser "farmacéuticamente aceptables", en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no provocar un efecto deletéreo inaceptable en el sujeto. Tales portadores son descritos aquí anteriormente o son de otro modo, bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de farmacología. De manera deseable, la formulación no debe incluir sustancias tales como enzimas o agentes oxidantes con los cuales el agente biológicamente activo a ser administrado se conoce por ser incompatible. Las formulaciones pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Con las composiciones y métodos de la invención, el GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, pueden ser administrados a sujetos por una variedad de modos de administración mucosales, que incluyen, suministro oral, rectal, vaginal, intranasal, intrapulmonar, o transdérmico, o por suministro tópico a los ojos, oídos, piel u otras superficies mucosales. Las composiciones y métodos de la invención también incluyen modos de administración dérmicos. Opcionalmente, GRP, análogos y miméticos y otros agentes biológicamente activos descritos aquí, pueden ser coordinadamente y adj untivamente administrados por rutas no mucosales, que incluyen parches dérmicos, preparaciones tópicas aplicadas a la piel, rutas intramuscular, subcutánea, intravenosa, intra-atrial , intra-articular, intraperitoneal o parenteral. En otras modalidades alternativas, los agentes biológicamente activos pueden ser administrados ex vivo por exposición directa a células, tejidos u órganos que se originan de un sujeto mamífero, por ejemplo, como un componente de una formulación de tratamiento de órgano o tejido ex vivo, que contiene el agente biológicamente activo en un portador líquido o sólido adecuado. Las composiciones de conformidad con la presente invención, son a menudo administradas en una solución acuosa como un atomizador pulmonar o nasal y pueden ser dispensadas en forma de rocío por una variedad de métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Sistemas preferidos para dispensar líquidos como un atomizador nasal se describen en la Patente Estadounidense No. 4,511,069. Las formulaciones pueden ser presentadas en contenedores de dosis múltiples, por ejemplo, en el sistema de dispensión sellado descrito en la Patente Estadounidense No. 4,511,069. Las formas de suministro en aerosol adicionales pueden incluir, por ejemplo, nebulizadores de aire comprimido, a chorro, ultrasónicos y piezoeléctricos , los cuales suministran el agente biológicamente activo disuelto o suspendido en un solvente farmacéutico, por ejemplo, agua, etanol o una mezcla de los mismos. Las soluciones atomizadoras pulmonares y nasales de la presente invención, típicamente comprenden el fármaco o fármaco a ser suministrado, opcionalmente formulado con un agente activo de la superficie, tal como un tensoactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 80), y uno o más amortiguadores. En algunas modalidades de la presente invención, la solución atomizadora nasal además comprende un propulsor. El pH de la solución atomizadora nasal es opcionalmente entre aproximadamente pH 2.0 y 8, preferiblemente 4.5 + 0.5. Los amortiguadores adecuados para uso con estas composiciones son como se describen anteriormente o de otro modo, conocidos en la técnica. Otros componentes pueden ser agregados para mejorar o mantener la estabilidad química, que incluyen preservativos, tensoactivos , dispersantes o gases. Los preservativos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fenol, metilparabeno, parabeno, m-cresol, tiomersal, clorobutanol , cloruro de benzalconio, benzoato de sodio, etanol, feniletil éter, alcohol bencílico y similares. Tensoactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido oleico, trioletato de sorbitan, polisorbatos , lecitina, fosfatidil colinas y varios diglicéridos y fosfolípidos de cadena larga. Dispersantes adecuados incluyen pero no se limitan a, ácido etilendiaminatetraacético y similares. Los gases adecuados incluyen pero no se limitan a, nitrógeno, helio, clorofluorocarbonos (CFC) , hidrofluorocarbonos (HFC) , dióxido de carbono, aire y similares. Con modalidades alternas, las formulaciones mucosales son administradas como formulaciones en polvo seco que comprenden el agente biológicamente activo en una forma seca, usualmente liofilizada de un tamaño de partícula apropiado, o con un intervalo de tamaño de partícula apropiado. Los tamaños de partícula mínimos apropiados para deposición con los pasajes pulmonares o nasales, son a menudo, de aproximadamente 0.5 µ de masa mediana equivalente al diámetro aerodinámico (MMEAD) , comúnmente aproximadamente 1 µ MMEAD, y más típicamente aproximadamente 2 µ MMEAD. El tamaño de partícula máximo apropiado para deposición con los pasajes nasales es a menudo aproximadamente 10 µ MMEAD, comúnmente aproximadamente 8 µ MMEAD, y más típicamente aproximadamente 4 µ MMEAD. Los polvos intranasalmente respirables con estos tamaños de partícula, pueden ser producidos por una variedad de técnicas convencionales, tales como molido a chorro, secado por rocío, precipitación de solvente, condensción de fluido supercrítico y similares. Estos polvos secos de MMEAD apropiado pueden ser administrados a un paciente vía un inhalador en polvo seco convencional (DPI); el cual depende de la respiración del paciente, de la inhalación pulmonar o nasa, para dispersar el polvo en una cantidad aerosolizada . Alternativamente, el polvo seco puede ser administrado vía dispositivos asistidos por aire que usan una fuente de energía externa para dispersar el polvo en una cantidad aerosolizada, por ejemplo, una bomba de pistón.

Los dispositivos en polvo seco, típicamente requieren una masa en polvo en el intervalo desde aproximadamente 1 mg hasta 20 mg, para producir una dosis aerosolizada única ("nube"). Si la dosis deseada o requerida del agente biológicamente activo es inferior que esta cantidad, el agente activo en polvo típicamente se combinará con un polvo en volumen seco farmacéutico para proporcionar la masa en polvo total requerida. Los polvos secos voluminosos preferidos incluyen, sacarosa, lactosa, dextrosa, manitol, glicina, trehalosa, albúmina de suero humano (HSA) y almidón. Otros polvos secos voluminosos adecuados incluyen, celobiosa, dextranos, maltotriosa, pectina, citrato de sodio, ascorbato de sodio y similares. Para formular composiciones para suministro epitelial con la presente invención, el agente biológicamente activo puede ser combinado con varios aditivos farmacéuticamente aceptables, así como también como una base o portador para dispersión de los agentes activos. Aditivos deseados incluyen, pero no se limitan a, agentes de control de pH, tales como arginina, hidróxido de sodio, glicina, ácido clorhídrico, ácido cítrico, ácido acético, etc. Además, anestésico locales (por ejemplo, alcohol bencílico), agentes isotoni zantes (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol, sorbitol) , inhibidores de la absorción (por ejemplo, Tween 80), agentes intensificadores de la solubilidad (por ejemplo, ciclodextrinas y derivados de los mismos), estabilizadores (por ejemplo, albúmina de suero) y agentes de reducción (por ejemplo, glutationa) , pueden ser incluidos. Cuando la composición para suministro epitelial es un liquido, la tonicidad de la formulación, medida con referencia a la tonicidad de 0.9% (p/v) de la solución salina fisiológica tomada como unidad, es típicamente ajustada a un valor en el cual no se inducirá daño de tejido irreversible sustancial en la mucosa nasal, al sitio de administración. En general, la tonicidad de la solución es ajustada a un valor de aproximadamente 1/3 a 3, más típicamente 1/2 a 2, y más a menudo 3/4 a 1.7. El agente biológicamente activo puede ser dispersado en una base o vehículo, el cual puede comprender un compuesto hidrofílico que tiene una capacidad para dispersar el agente activo y cualquiera de los aditivos deseados. La base puede ser seleccionada de un amplio intervalo de portadores adecuados, que incluyen pero no se limitan a, copolímeros de ácidos policarboxílieos o sales de los mismos, anhídridos carboxílicos (por ejemplo, anhídrido maleico) con otros monómeros (por ejemplo, metil (met ) acrilato, ácido acrílico, etc.), polímeros vinílico hidrofóbico tales como polivinilacetato, alcohol poliviní lico, polivinilpirrolidona, derivados de celulosa tales como hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, etc., y polímeros natural tales como quitosan, colágeno, algunato de sodio, gelatina, ácido halurónico y sales metálicas no toxicas de los mismos. A menudo, un polímero biodegradable se selecciona como una base o portador, por ejemplo, ácido poliláctico, copolímero poli (ácido láctico-ácido glicólico) , ácido polihidroxibutírico, copolímeros de poli (ácido hidroxibutírico-ácido glicólico) y mezclas de los mismos. Alternativamente o adicionalmente, ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como ésteres de ácidos grasos de poliglicerina , éteres de ácido graso de sacarosa, etc., pueden ser empleados como portadores. Los polímeros hidrofílicos y otros portadores pueden ser usados solos o en combinación, y la integridad estructural mejorada, pueden ser impartidos al portador por cristalización parcial, enlace iónico, reticulación y similares. El portador puede ser proporcionado en una variedad de formas, que incluyen, soluciones viscosas o fluidos, geles, pastas, polvos, microesferas y películas para aplicación directa a la mucosa nasal. El uso de un portador seleccionado en este contexto, puede resultar en promoción de absorción del agente biológicamente activo. El agente biológicamente activo puede ser combinado con la base o portador de conformidad con una variedad de métodos, y la liberación del agente activo puede ser por difusión, desintegración del portador o formulación asociada de canales agua. En algunas circunstancias, el agente activo es dispersado en microcapsulas (microesferas ) o nanocápsulas (nanoesferas) preparadas de un polímero adecuado, por ejemplo, 2-cianoacrilato de isobutilo y dispersado en un medio de dispersión biocompatible aplicado a la mucosa nasal, el cual proporciona suministro sostenido y actividad biológica sobre un tiempo prolongado. Para mejorar además el suministro epitelial de agentes farmacéuticos con la invención, formulaciones que comprenden el agente activo también pueden contener un compuesto de bajo peso molecular hidrofílico como una base o excipiente. Tales compuestos de bajo peso molecular hidrofílieos proporcionan un pasaje medio a través del cual un agente activo soluble en agua, tal como un péptido o proteína fisiológicamente activo, puede difundirse a través de la base a la superficie corporal en donde el agente activo es absorbido. El compuesto hidrofílico de bajo peso molecular, opcionalmente absorbe humedad de la mucosa o la atmósfera de administración y disuelve el péptido activo soluble en agua. El peso molecular del compuesto hidrofílico de bajo peso molecular es en general, no es de más de 10000 y preferiblemente no más de 3000. El compuesto hidrofílico de bajo peso molecular ejemplar incluye, los compuestos de poliol, tales como oligo, di y monosacáridos tales como sacarosa, manitol, sorbitol, lactosa, L-arabinosa, D- eritrosa, D-ribosa, D-xilosa, D-manosa, trehalosa, D-galactosa, lactulosa, celobiosa, gentibiosa, glicerina y polietilenglicol . Otros ejemplos de compuestos hidrofilicos de bajo peso molecular empleados como portadores dentro de la invención incluyen, N-metilpirrolidona , y alcoholes (por ejemplo, oligonivilalcohol , etanol, etilenglicol , propilenglicol , etc.)- Estos compuestos hidrofílicos de bajo peso molecular pueden ser usados solos o en combinación entre si o con otros componentes activos o inactivos de la formulación intranasal. Las composiciones de la invención pueden alternativamente contener como portadores farmacéuticamente aceptables, sustancias requeridas a condiciones fisiológicas aproximadas, tales como agentes amortiguadores y que ajustan el pH, agentes que ajustan la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina , etc. Para composiciones sólidas, los portadores no tóxicos convencionales farmacéuticamente aceptables pueden ser usados, los cuales incluyen por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones terapéuticas para administrar el agente biológicamente activo pueden también ser formuladas como una solución, microemulsión u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de ingredientes activos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , y polietilenglicol liquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada para soluciones se puede mantener por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento de un tamaño de partícula deseado en el caso de formulaciones dispersables , y por el uso de tensoactivos . En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada del agente biológicamente activo puede ser llevada aproximadamente incluyendo en la composición un agente, el cual retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoesterato y gelatina. En ciertas modalidades de la invención, el agente biológicamente activo es administrado es una formulación de liberación con el tiempo, por ejemplo, en una composición la cual incluye un polímero de liberación lenta. El agente activo puede ser preparado con portadores que protegerán contra la liberación rápida, por ejemplo, un vehículo de liberación controlada tal como polímero, sistema de suministro microencapsulado o gel bioadhesivo. El suministro prolongado del agente activo, en varias composiciones de la invención, puede ser llevado aproximadamente incluyendo en la composición, agentes que retardan la absorción, por ejemplo, hidrogeles de monoesterato de aluminio y gelatina. Cuando las formulaciones de liberación controlada del agente biológicamente activo se desean, los aglutinantes de liberación controlada adecuados para uso de conformidad con la invención incluyen, cualquier material de liberación controlada biocompatible el cual es insertado en el agente activo y el cual es capaz de incorporar el agente biológicamente activo. Numerosos de tales materiales se conocen en la técnica. Los aglutinantes de liberación controlada útiles son materiales que son metaboli zados lentamente bajo condiciones fisiológicas después de su suministro intranasal (por ejemplo, en la superficie mucosal nasal, o en la presencia de fluidos corporales después del suministro transmucosal ) . Los aglutinantes apropiados incluyen pero no se limitan a polímeros biocompatibles y copolímeros previamente usados en la técnica en formulaciones de liberación sostenida. Tales compuestos biocompatibles son no tóxicos e inertes a tejidos circundantes, y no activan efectos secundarios adversos significantes tales como irritación nasal, respuesta inmune, inflamación o similares. Son metabolizados en productos metabólicos que son también biocompatibles y fácilmente eliminados del cuerpo. Materiales poliméricos ejemplares para uso en este contexto incluyen, pero no se limitan a, matrices poliméricas derivadas de poliésteres copoliméricos y homopoliméricos que tienen enlaces éster hidrolizables . Un número de estos se conocen en la técnica por ser biodegradables y conducir a productos de degradación que no tienen toxicidad o baja. Polímeros ejemplares incluyen ácidos poliglicólicos (PGA) y ácidos polilácticos (PLA), poli(DL-ácido láctico-co-ácido glicólico) (DLPLA), poli(D-ácido láctico-ácido coglicólico) (D PLGA) y poli(L-ácido láctico-co-ácido glicólico) (L PLGA) . Otros polímeros biodegradables o bioerosionables útiles incluyen pero no se limitan a, tales polímeros como poli (épsilon-caprolactona ) , poli (épsilon-aprolactona-CO-ácido láctico) , poli (e-aprolactona-CO-ácido glicólico), poli (beta-ácido hidroxi butírico), poli (alquil-2-cianoacrilato) , hidrogeles tales como poli (hidroxietil metacrilato) , poliamidas, poli(amino ácids) (es decir, L-leucina, ácido glutámico, ácido L-aspártico y similares), poli (éster urea), poli ( 2-hidroxietil DL-aspartamida) , polímeros de poliacetal, poliortoésteres , policarbonato, polimaleamidas , polisacáridos y copolímeros de los mismos. Muchos métodos para preparar tales formulaciones son en general, conocidos por aquellos expertos en la técnica. Otras formulaciones útiles incluyen composiciones de liberación controlada, por ejemplo, microcápsulas , Patentes Estadounidenses Nos. 4,652,441 y 4,917,893, copolímneros de ácido láctico-ácido glicólico empleados en la elaboración de microcápsulas y otras formulaciones, Patentes Estadounidenses Nos. 4,677,191 y 4,728,721, y composiciones de liberación sostenida para péptidos solubles en agua, Patente Estadounidense No. 4,675,189. El proceso de manufacturación de producto atomizador nasal en general, incluye la preparación de un diluyente para atomizador nasal GRP, el cual incluye ~85% de agua más los componentes de la formulación atomizadora nasal sin GRP. El pH del diluyente es entonces medido y ajustado al pH de la formulación deseada con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico si es necesario. El agua es usada para lograr el volumen objetivo final del diluyente. El atomizador nasal GRP es preparado por la transíerancia no aséptica de ~85% del volumen objetivo final del diluyuente a una botella tapada con rosca. Una cantidad apropiada de GRP se agrega y mezcla hasta que se disuelve completamente. El pH es medido y ajustado al pH de formulación deseada con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico, si es necesario. Una cantidad suficiente de diluyente se agrega para alcanzar el volumen objetivo final. Las botellas tapadas con rosca son llenadas y fijadas con tapas. La descripción anterior del proceso de manufacturación representa un método usado para preparar los lotes clínicos iniciales del producto de fármaco. Este método puede ser modificado durante el proceso de desarrollo para optimizar el proceso de manufacturacion . El GRP actualmente comercializado requiere condiciones de manufacturacion estériles para cumplimiento con las regulaciones de la FDA. La administración parenteral que incluye GRP para inyección o infusión, requiere un proceso de manufacturacion estéril (aséptico) . Las Buenas Prácticas de Manufacturacion Actual (GMP) para fabricación de fármaco estéril incluyen estándares para características de construcción y diseño (21 C.F.R. § 211.42 (Abril 1, 2005)); estándares para valorar y aprobar o rechazar componentes, recipientes de producto de fármaco y cierres (§ 211.84)); estándares para el control de contaminación microbiológica (§ 211.113); y otros requerimientos de prueba especiales (§ 211.167). Productos no parenterales (no asépticos), tales como el producto intranasal de la invención, no requieren estas condiicones de manufacturacion estéril especializadas. Como se puede apreciar fácilmente, los requerimientos para un proceso de manufacturacion estéril son sustancialmente superiores y correspondientemente más costosos que aquellos requeridos para un proceso de manufacturacion de producto no estéril. Estos costos incluyen costos de capitalización mucho mayores para instalaciones, así como también costos de manufacturacion costosos: instalaciones adicionales para manufacturación estéril incluyen, cuartos adicionales y ventilación; costos adicionales asociados con la manufacturación estéril incluyen recursos humanos mayores, control de calidad extensivo y aseguramiento de calidad, y soporte administrativo. Como un resultado, los costos de manufacturación de un producto GRP, tal como aquel de la invención, son suficientemente menores que aquellos de un producto GRP parenteralmente administrado. La presente invención satisface la necesidad de un proceso de manufacturación no estéril para GRP. La invención incluye un producto de fármaco GRP libre de preservativo. Tal formulación no contiene un preservativo. En la ausencia de un excipiente antimicrobiano, la formulación podría ser llenada bajo condiciones estériles en un dispositivo atomizador nasal libre de preservativo, o incorporado en una preparación de parche dérmico. El dispositivo podría ser capaz de suministrar una dosis efectiva sin permitir contaminación de la formulación dentro del sistema de suministro. Tal producto de fármaco de GRP podría permitir la dosificación múltiple del mismo contenedor, con ello, reduciendo grandemente el costo de artículos relativos a un producto de fármaco de uso único. Ventajas de una formulación de GRP libre de preservativo de uso múltiple, son estabilidad mejorada, medios alternativos para prevención de la microbiana, y reducción en el costo de artículos que permiten al producto ser más viable para comerciali zación . Las soluciones estériles pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, conforme se requiere, seguido por esterilización filtrada. En generar, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de estos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles, los métodos de preparación incluyen secado a vacío y secado por congelamiento, el cual proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La prevención de la acción de microorganismos puede ser realizada por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. La administración a la piel y mucosal, de conformidad con la invención, permite la autoadministración selectiva para el tratamiento por pacientes, siempre que suficiente seguridad se coloque para controlar y monitorear las dosificaciones y efectos secundarios. La administración a la piel y mucosal también supera ciertas desventajas de otras formas de administración, tales como inyecciones, que son dolorosas y exponen al paciente a infecciones posibles y pueden presentar problemas de biodisponibilidad de fármaco. Para suministro pulmonar y nasal, los sistemas para dispensión controlada de aerosol de líquidos terapéuticos como un atomizador, son bien conocidos. En una modalidad, dosis medidas de agente activo son suministradas por medio de una válvula de bomba mecánica especialmente construida, Patente Estadounidense No. 4,511,069. En otra modalidad, el agente inactivo es suministrado por tecnología de parche dérmico .

Dosificación Para propósitos de tratamiento y profilácticos, los agentes biológicamente activos descritos aquí, pueden ser administrados a los sujetos en un suministro de bolo único, vía suministro continuo (por ejemplo, suministro transdérmico, mucosal o intravenoso continuo) , sobre un periodo de tiempo prolongado o en un protocolo de administración repetida (por ejemplo, por un protocolo de administración repetía cada · hora, diariamente o semanalmente ) . En este contexto, una dosificación terapéuticamente efectiva de GRP puede incluir dosis repetidas dentro de un régimen de tratamiento o profilaxis prolongada que proporcionará resultados clínicamente significantes para aliviar uno o más síntomas o condiciones detectables asociadas con una enfermedad o condición objetivo, como se expone anteriormente. La determinación de las dosificaciones efectivas en este contexto, se basa típicamente en estudios de modelos animales seguido por ensayos clínicos humanos y se guía determinando las dosificaciones efectivas y protocolos de administración que reducen significantemente la incidencia o severidad de síntomas o condiciones de enfermedad objetivo en el sujeto. Los modelos adecuados en este sentido incluyen, por ejemplo, sujetos de modelos animales murino, rata, porcino, felino, primate no humano y otros aceptados, conocidos en la técnica. Alternativamente, las dosificaciones efectivas pueden ser determinadas usando modelos in vitro (por ejmplo, ensayos histopatológicos e inmunológicos ) . Usando tales modelos, solamente cálculos y ajustes ordinarios son típicamente requeridos para determinar una concentración apropiada y dosis para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de los agentes biológicamente activos (por ejemplo, cantidades que son intranasalmente efectivas, transdérmicamente efectivas, intravenosamente efectivas o intramuscularmente efectivas para provocar una respuesta deseada) . En una modalidad alternativa, la invención proporciona composiciones y métodos para suministro intranasal de GRP, en donde los compuestos GRP es/son administrados repetidamente a través de un régimen de dosificación efectivo intranasal que involucra, administraciones múltiples del GRP al sujeto durante un programa diario o semanalmente para mantener un nivel terapéuticamente efectivo elevado y pulsátil reducido de GRP durante un periodo de dosificación prolongado. Las composiciones y métodos proporcionan compuestos GRP que son auto-administrados por el sujeto en una formulación nasal entre una y seis veces diariamente para mantener un nivel terapéuticamente efectivo elevado y pulsátil reducido de GRP durante un periodo de dosificación extendido de 8 horas a 24 horas.

Kits La presente invención incluye kits, paquetes y unidades de contenedores múltiples que contienen las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, ingredientes activos, y/o medios para administrar los msimos, para uso en la prevención y tratamiento de enfermedades y otras condiciones en sujetos mamíferos. Brevemente, estos kits incluyen un contenedor o formulación que contiene uno o más GRP, análogos o miméticos, y/o otros agentes biológicamente activos en combinación con agentes que intensifican el suministro epitelial descritos aquí, formulados en una preparación farmacéutica para suministro epitelial . Las formulaciones intranasales de la presente invención, pueden ser administradas usando cualquier botella o jeringa atomizadora o por instilación. Un ejemplo de botella atomizadora nasal es la "Nasal Spray Pump w/ Safety Clip, Pfeiffer SAP # 60548, la cual suministra una dosis de 0.1 mi por chorro y tiene una logntidud de tubo profundo de 36.05 cm. Puede ser adquirida de Pfeiffer of America of Princeton, NJ.

Administración Nasal en Aerosol de un GRP Se ha descubierto que los GRP pueden ser administrados intranasalmente usando un atomizador nasal o aerosol. Esto es sorprendente debido a que muchas proteínas y péptidos han sido mostrados por ser portados o desnaturalziados debido a las fuerzas mecánicas generadas por el accionador en la producción del atomizador o aerosol. En esta área, son empleadas las siguientes definiciones: 1. Aerosol- Un producto que es envasado bajo presión y contiene ingredientes terapéuticamente activos que son liberados después de la activación de un sistema de válvula apropiado. 2. Aerosol medido- Una forma de dosificación presurizada comprende de válvulas de dosis medidas, las cuales permiten el suministro de una cantidad uniforme de atomizador después de cada activación. 3. Aerosol en polvo- Un producto que es envasado bajo presión y contiene ingredientes terapéuticamente activos en la forma de un polvo, en el cual son liberados después de la activación de un sistema de válvula apropiada. 4. Aerosol atomizado- Un producto en aerosol que utiliza gas comprimido como el propulsor para proporcionar la fuerza necesaria para expulsar el producto como una atomización húmeda; es en general, aplicable a soluciones de agentes químicos en solventes acuosos. 5. Atomizador - Un líquido minuciosamente dividido como por un vapor de chorro o aire. Los productos d fármaco atomizadores nasales contienen ingredientes terapéuticamente activos disueltos o suspendidos en soluciones o mezclas de excipientes en dispensadores no presurizados . 6. Atomizador medido - Una formad de dosificación no presurizada que consiste de válvulas que permiten la dispensión de una cantidad especi ficada de atomizador después de cada activación. 7. Atomizador de suspensión- Una preparación líquida que contiene partículas sólidas dispersadas en un vehículo líquido y en la forma de gotitas en curso o como sólidos finamente divididos. La caracterización dinámica de fluido del atomizador en aerosol se emite por bomba atomizadora nasal medida como un dispositivo de suministro de fármaco ("DDD") . La caracterización de rocío es una parte integral de las admisiones regulatorias necesarias por la Administración de Alimentos y Fármacos ("FDA"), para la aprobación de investigación desarrollo, aseguramiento de calidad y procedimietos de prueba de estabilidad para nuevas y existentes bombas de rocío nasales. A través de la caracterización de la geometría atomizadora, se ha encontrado ser el mejor indicador del desempeño total de las bombas atomizadoras nasales. En particular, mediciones del ángulo de divergencia atomizador (geometría de columna agua), conforme salen del dispositivo; elipticidad en sección transversal del atomizador, uniformidad y distribución de partícula/got ita (patrón atomizador); y el tiempo de evolución del desarrollo de atomizador, se ha encontrado por ser las cantidades de desempeño más representativas en la caracterización de bombas atomizadoras nasales. Durante el aseguramiento de calidad y pruebas de estabilidad, la geometría del chorro y mediciones del patrón atomizador son identificadores claves para verificar la consistencia y conformidad con el criterio de datos aprobado para las bombas atomizadoras nasales.

Definiciones Altura de chorro- la medición de la punta del accionador al punto en el cual el ángulo del chorro llega a ser no lineal debido al rompimiento del flujo lineal. Basados en una examinación visuales de imágenes digitales, y establecer un punto de medición de amplitud que es consistente con un punto de medición más lejano de patrón atomizador, una altura de 30 mm es definida por este estudio . Eje Principal - la cuerda más larga que puede ser extraída con del patrón atomizador ajustado que cruza el COMw en unidades base (mm) . Eje menor - la cuerda más corta que puede ser extraída con el patrón atomizador que cruza el COMw en unidades base (mm) . Relación de Elipticidad - la relación del eje principal al eje menor, preferiblemente entre 0.1 y 1.5, y más preferiblemente entre 1.0 y 1.3 Dio - el diámetro de la gotita por la cual, 10% del volumen total de líquidos de la muestra consiste de gotitas de un diámetro más pequeño (pm) . D5o - el diámetro de la gotita por la cual, 50% del volumen total de líquidos de la muestra consiste de gotitas de un diámetro más pequeño (pm) , también conocida como el diámetro mediano de masa. D9o - el diámetro de la gotita por la cual, 90% del volumen total de líquidos de la muestra consiste de gotitas de un diámetro más pequeño (pm) . Trayecto - medición de la amplitud de la distribución. A valor más pequeño, distribución más estrecha. El trayecto es calculado como (POP - Di o) Dso % RSD - porcentaje de desviación estándar relativa, la desviación estándar dividida por la media de las series y multiplicada por 100, también conocida como % de CV. Volumen - el volumen del líquido o polvo descargado del vehículo de suministro con cada ecuación, preferiblemente entre 0.01 mi y aproximadamente 2.5 mi y más preferiblemente, entre 0.02 mi y 0.25 mi.

EJEMPLOS La descripción anterior generalmente describe la presente invención, la cual es además ejemplificada por los siguientes ejemplos. Estos ejemplos de describen únicamente para propósitos de ilustración, y no se planean para limitar el alcance de la invención. A pesar que se han empleado términos y valores específicos en este documento, tales términos y valores también se entenderán como ejemplos y no limitante del alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Materiales y Equipamiento Usados El presente ejemplo ilustra los reactivos, equipamiento y la fuente de cada uno usado en los subsecuentes Ejemplos de la presente solicitud. La Tabla 1 ilustra los reactivos de muestra usados en los Ejemplos subsecuentes .

Tabla 1 Reactivos de Muestra GLP-1 La tabla 2 ilustra la fuente de los componentes del Sistema MatTek EpiAirway™ que se describen en mayor detalle en el Ejemplo 2 de la presente solicitud.

Tabla 2 Componentes del Sistema del Modelo de Célula Epitelial in vivo La tabla 3 ilustra la fuente y componentes del sistema de ensayo LDH descrito en mayor detalle en el Ejemplo 2 de la presente solicitud.

Tabla 3 Componentes del Ensayo LDH (Citotoxicidad) y MTT (Viabilidad celular) . tabla 4 ilustra los instrumentos y otros suministros de laboratorio relacionados y fuetes de cada uno usado en este documento.

Tabla 4 Instrumentos y Otros suministros Relacionados EJEMPLO 2 Cinética de Permeación in vitro de Formulaciones Farmacéuticas del Péptido-1 (GLP-1) similar a Glucagon El presente ejemplo demuestra las formulaciones farmacéuticas ejemplares de la presente invención, las cuales contienen los excipientes DDPC, EDTA y ?-ß-DC solo o en combinación, permeación GLP-1 intensificada a través de una monocapa de célula epitelial. La tabla 5 ilustra las formulaciones seleccionadas en el Sistema de Modelo EpiAirway por ensayo de resistencia transepitelial (TEER) , ensayo de viabilidad celular ( TT) , ensayo de muerte celular de lactato deshidrogenasa (LHD) y ensayo de permeación de tejido para determinar que formulación logra el mayor grado de permeación de tejido GLP-1 y reducción TEER mientras no resulta en toxicidad celular significante. Las muestras por triplicado de cada formulación y controles se evaluaron usando los insertos de la membrana de la célula epitelial traqueal/bronquial del modelo in vitro del Sistema EpiAirway por MatTek Corp. (Ashland, MA) , catalogo # Air-100. El sistema EpiAirway™ se desarrolló por MatTek Corp. (Ashland, MA) como un modelo del recubrimiento del epitelio pseudoestrat ificado del tracto respiratorio. Las células se hacen crecer en cultivos de célula de fondo redondo de membrana poroso insertos en una interface de aire-liquido, los cual resulta en diferenciación de las células a una morfología altamente polarizada. La superficie apical es ciliado con una ultraestructura microvellosa y la mucosidad procedente del epitelio (la presencia de mucina se ha confirmado por inmunomanchado ) . Los insertos tienen un diámetro de 0.875 cm, proporcionan un área de superficie de 0.6 cm2. Las células se colocaron en placas en los insertos en la fábrica aproximadamente tres semanas antes del embarque . Se recibieron membranas de cultivo EpiAirway™ el día antes que los experimentos inicien. Se enviaron en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco libre de hidrocortisona y libre de rojo fenol (DMEM) . Cada insertos de tejido se colocó en una cavidad de una placa de 6 cavidades que contienen 0.9 mi de DMEM libre de suero. Las membranas después se cultivan por 24 horas a 37°C/CC>2 al 5% para permitir a los tejidos equilibrarse. Este medio a base de DMEM es libre de suero pero suplementado con factor de crecimiento epidérmico y otros factores. El medio es siempre probado para niveles endógenos de cualquier citocina o factor de crecimiento el cual es considerado para suministro intranasal, pero está libre de todos los factores y citocinas estudiadas a la fecha excepto insulina. El volumen es suficiente para proporcionar contacto con los fondos de las unidades y sus posturas, pero la superficie apical del epitelio se deja mantener en contacto directo con el aire. Se usan pinzas estériles en esta etapa y el todas las etapas subsecuentes que involucran la transferencia de unidades a cavidades que contienen liquido para asegurar que no se queda aire atrapado entre los fondos de las unidades y el medio. El sistema de modelo EpiAirway™ se usó para evaluar el efecto de cada GLP-1 que contiene la formulación en TEER, viabilidad celular (ensayo MTT) , citotoxicidad (ensayo LDH) y permeación. Estos ensayos se describen abajo en detalle.

Resistencia Eléctrica Transepitelial (TEER) Se leyeron las mediciones TEER usando una Cámara de Medición de Resistencia del Tejido conectada a un Voltométro Epitelial con el electrodo guia, ambos de World Precisión Instruments. Primero el TEER antecedente se leyó para cada inserto en el día que inicia el experimento. Después que se leyó el TEER, se colocó 1 mi de medio fresco en el fondo de cada cavidad en una placa de 6 cavidades. Los insertos se drenaron en papel absorbente y se colocaron en nuevas cavidades con medio fresco, mientras se mantienen los insertos numerados para correlacionarse con las mediciones de TEER antecedente. Se agregaron 100 ul de formulación experimental a cada inserto. Los insertos se colocaron en un incubador de agitación a 100 rmp y 37°C por 1 hora. Los electrodos y un serto blanco del cultivo de tejido se equilibraron por al menos 20 minutos en medio fresco con la energía antes de verificar la calibración. La resistencia antecedente se midió con 1.5 mi de medio en la cámara de tejido Endohm y 300 µ? de medio en un inserto Millicell-CM blanco. El electrodo superior se ajustó de forma que se sumerge en el medio pero no hace contacto con la superficie superior de la membrana del inserto. La resistencia antecedente del inserto blanco es 5-20 ohms . Prada cada determinación TEER, se agregaron 300 µ? del medio al inserto seguido por una incubación por 20 minutos a temperatura ambiente antes de colocarlo en la cámara Endohm para leer el TEER. La resistencia se expresó como (resistencia medida-blanco) x 0.6 cm2. Todos los valores TEER se reportaron como una función del área de superficie del tejido. TEER calculado como: TEER = (Rr - Rb) X A en donde Rx es la resistencia del inserto con una membrana, Rb es la resistencia del inserto blanco, y A es el área de la membrana (0.6 cm2) . Una disminución en el valor TEER en relación al valor control (control = aproximadamente 100 ohms-cm2; normalizado a 100) indica una disminución en resistencia de membrana celular y un incremento en permeabilidad de la célula epitelial mucosal. Después de 1 hora la incubación se completó, los insertos del tejido se removieron del incubador. Se colocaron 200 µ? de medio fresco en cada cavidad de una placa de 24 cavidades y los insertos del tejido se transfirieron a la placa de 24 cavidades. Se agregaron suavemente 200 µ? de medio fresco a cada inserto de tejido. Nuevamente se midió TEER para cada inserto. Después que los insertos del cultivo de tejido se transfirieron de la placa de 6 cavidades a la placa de 2 cavidades, el medio basal se subdividió en tres partes y se almacenaron en tubos eppendorf. Todas las tres subdivisiones se colocaron a -80°C hasta el uso.

Ensayo de Lactato Deshidrogenasa (LDH) La cantidad de muerte celular se sometió a ensayo midiendo la liberación de LDH de las células usando un Kit de Ensayo de Citotoxicidad CytoTox 96, de Promega Corp. Se realizaron las muestras por triplicado para cada inserto de cultivo de tejido en el estudio. Se cargaron 50 µ? del medio colectado (almacenado a 4°C) en triplicado en una placa de 96 cavidades. Recientemente, se usó el medio libre de célula como un blanco. Se agregaron 50 µ? de solución de sustrato (12 mi de Amortiguador de Ensayo agregado a una botella reciente de la Mezcla del Sustrato, hecha de conformidad con el kit) a cada cavidad y las placas se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, se agregaron 50 µ? de solución de detención a cada cavidad y las placas se leyeron en un lector de placa de densidad óptica pQuant a 490 nm usando el software KCJr.

Ensayo MTT La viabilidad celular de cada inserto de cultivo de tejido se probó por ensayo MTT. La viabilidad celular se valoró usando el ensayo MTT (Kit MatTek, MTT-100) . Este kit mide la recuperación y transformación de sal de tetrazolio o tinte de formazan. Lo concentrado de MTT se descongeló y diluyó con el medio a una proporción de 2 mi de MTT : 8 mi del medio. Lo concentrado de MTT diluido se pipeteo (300 µ?) en una placa de 24 cavidades. Los insertos del tejido se secaron suavemente, se colocaron en las cavidades de la placa, y se incubaron por tres horas en la oscuridad a 37°C. Después de la incubación, cada inserto se removió de la placa, suavemente manchados y se colocaron en una placa de 24 cavidades por extracción. Los insertos del cultivo celular después se sumergieron e 2.0 mi de la solución extractante por cavidad (para completamente cubrir la muestra) . La placa de extracción se cubrió y se selló para reducir la evaporación del extractante. Después de una incubación durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad, el liquido dentro de cada inserto se decantó nuevamente en la cavidad de la cual se tomó, y los insertos se desecharon. La solución extractante (50 µ?) de cada cavidad se pipeteo por triplicado en placas de microtitulador de 96 cavidades, junto con los blancos extraídos y se diluyó con la adición de 150 µ? de solución extractante fresca. La densidad óptica de las muestras se midió a 550 nm en un lector de placa de densidad óptica µ?)?3?? usando el software KCJr.

Ensayo de Permeacion de Tejido La cantidad de GLP-1 (7-36) que pasa de la superficie apical a la superficie basolateral de la monocapa de célula epitelial EpiAirway representa el grado de permeación GLP-1. La cantidad de proteina GLP-1 encontrada en la superficie basolateral de las células cultivadas se miden por ELISA. El kit ELISA amida (7-36) GLP-1 se adquirió de Lineo Research, (St. Charles, MI). El ensayo ELISA se realizó de conformidad con el protocolo del fabricante. Las muestras colectadas se diluyeron con amortiguador de ensayo proporcionado con el kit. Se realizaron varias rondas de selección in vitro. Se calculó el porcentaje de permeación diluyendo la cantidad medida de GLP-1 encontrado en el lado basolateral de las células como se midió por ELISA por la cantidad total de material de partida GLP-1 que se agregó al lado apical de las células multiplicadas por 100. Primero, se realizó un diseño del estudio del experimento (DOE) usando diferentes cantidades de excipientes EDTA, ?-ß-CD y DDPC. El sumario de los resultados se proporciona en la Tabla 5. Todas las formulaciones que contienen uno o más excipientes muestran mejoramiento en permeación sobre el control sin excipientes (#3) .

Tabla 5: Estudio de Permeación in vitro de GLP-1 Las formulaciones farmacéuticas intranasales probadas en estudios TEER in vitro adicional, MTT, LDH y % de permeacion se muestran en la Tabla 6. Los resultados de TEER, MTT, LDH y permeacion para estas formulaciones se resumen en la Tabla 7.

Tabla 6: Formulaciones GLP-1 Probadas in vitro Tabla 7 Sumario de Resultados GLP-1 in vitro Una disminución medida en valor relativo TEER para el control indica una disminución en resistencia de membrana celular o en otras palabras el pasaje de especies iónicas del lado apical al basolateral de la monocapa epitelial. Los datos presentados en la Tabla 7 indican que todas las formulaciones intensificadoras significativamente reducen TEER comparadas a las formulaciones control. El ensayo MTT mide la viabilidad celular mientras el ensayo LDH mide la citotoxicidad . Los ensayos se usan en combinación para determinar el efecto de formulaciones farmacéuticas en célula "saludable". Los resultados MTT y LDH ambos son expresados como porcentajes. Se calculó el porcentaje MTT dividiendo el valor de MTT medido para cada formulación por el valor MTT de la formulación control multiplicado por 100. Asi, el control positivo MTT es 100% y sirve como la comparación de linea base para todas las otras formulaciones. Un valor MTT abajo del 80% representa un efecto negativo en viabilidad celular. Similarmente, se calculó el porcentaje LDH dividiendo el valor LDH para cada formulación por el valor LDH de la formulación control multiplicado por 100. Asi, el control positivo LDH es 100% y sirve como la comparación de linea base para todas las otras formulaciones. Los resultados del ensayo MTT indica que todas pero una formulación (#12 en la Tabla 7) no reduce la viabilidad celular abajo del 80%. Estos datos son además reportados por el ensayo de citotoxicidad LDH muestra que una mayoría de las formulaciones no muestras niveles significantes de citotoxicidad. La permeación del tejido GLP-1 es expresada como % de permeación una vez incrementa sobre la formulación control (muestra #13). Las veces incrementadas sobre el control para el excipiente que contienen formulaciones intensificadores de permeación GLP-1 de aproximadamente 74 veces hasta 341 veces sobre el control. Estos datos indican que la inclusión de los excipientes DDPC, EDTA y ?-ß-CD significantemente mejora la permeación de GLP-1 a través de la monocapa de célula epitelial. De la tabla 7, las formulaciones #1,#2, #6 y #12 resultan en >200 veces mejoramiento del % de permeación sobre el control sin excipiente (#13 en la Tabla 17) . En resumen, los datos in vitro indican que la formulación farmacéutica ejemplar de la presente invención comprende 2 mg/ml de GLP, 10 mg/ml de EDTA y 10 mM de Amortiguador Citrato (muestra #6 en la Tabla 6) , exhibiendo permeación GLP-1 mayor intensificada y cualidades reducidas de TEER mientras tienen un efecto negativo mínimo en viabilidad celular. Así, esta formulación representa un candidato ideal para el suministro de GLP-1 a través de una superficie mucosal, por ejemplo suministro de fármaco intranasal (IN), en el tratamiento de enfermedades humanas que incluyen obesidad y diabetes.

EJEMPLO 3 Comparación de Cinética de Permeación in vitro de Péptido-1 similar a Glucagon (GLP-1) Farmacéutico El presente ejemplo demuestra que la cinética de permeación in vitro de formulaciones farmacéuticas GLP-1 son sensibles a la forma EDTA usada en las formulación. La tabla 8 abajo ilustra la formación seleccionada en el Sistema del Modelo EpiAirway in vitro por resistencia transepitelial (ensayo TEER) , biodisponibilidad celular (ensayo TT) , lactato deshidrogenasa (ensayo LDH; muerte celular) y permeacion de tejido. Todas las muestras contienen 2 mg/ml de GLP-1 excepto las muestras #9 y #19 las cales sirven como controles. Cada formulación se realizan a un volumen total de 0.5 mi y se evalúa por triplicado (n = 3) . Cada muestra se evalúo de conformidad con los protocolos descritos en detalle abajo en el Ejemplo 2.

Tabla 8: Formas Diferentes que Contienen Formulaciones de EDTA Seleccionado para Intensificadores de Permeación GLP-1 Abreviaturas : ?-ß-CD = metil-beta-ciclodextrina, EDTA = edetato de disodio, DDPC = L-a-fosfatidilcolina didecanoil, CB = clorobutanol , Mg EDTA = sal de magnesio de disodio EDTA; Zn EDTA = sal de zinc de disodio EDTA; MTT = ensayo MTT; LDH = ensayo LDH; TEER = resistencia transepitelial .

Resultados Se muestra el efecto de formulaciones farmacéuticas que comprenden agentes para mejorar el suministro intranasal, por ejemplo, los excipientes DDPC, EDTA y -ß-CD en Membrana Celular EpiAirway™ (capa celular epitelial de la mucosa) . Los resultados de cinética de permeación se resumen abajo en la Tabla 9 y representan mediciones tomadas en una hora después que las células se incubaron con las formulaciones mostradas en la Tabla 8.

Tabla 9 Resultados de cinética de permeación para Formulaciones que contienen Sales EDTA diferentes Los datos precedentes indicaron que varias formas de sales EDTA pueden ser usadas en formulaciones farmacéuticas para manipular las cinéticas de permeación del fármaco .

EJEMPLO 4 Estabilidad GLP-1 El presente ejemplo demuestra que los excipientes de molécula pequeña, por ejemplo ?-ß-CD, EDTA y DDPC, no promueven la estabilidad física de GLP-1 en formulaciones farmacéuticas. En el presente ejemplo, se evalúo la estabilidad de GLP-1 con las dos formulaciones descritas abajo en la Tabla 10. El propósito del presente ejemplo es determinar sí el calentamiento de GLP-1 provoca la degradación de proteína.

Tabla 10 Formulaciones de Estabilidad de GLP-1 Se realizó un experimento de calorimetría por exploración diferencial (DSC) con una nueva exploración en la Muestra #1 de la Tabla 10; la muestra se sometió a exploración a partir de 5°C hasta 100°C a una relación de exploración de 60°C/hora. Los datos se graficaron como Cp (cal/°C) contra temperatura (°C) . Se observó un pico de transición sostenida cerca de 35°C en la primera exploración por calor. La propagación después de la transición y la gran disminución en capacidad de calor entre 80 y 90°C sugiere la formación de agregados. Se observó que la solución fue ligeramente turbia después de las exploraciones, que soportan la información de un precipitado. El pico de transición es más estrecho que lo esperado para el desplegado de un péptido, esto puede ser el resultado de agregación inmediatamente después del desplegado del péptido. Estos datos indican que la GLP-1 es para desnaturalizar y/o forma agregados en la formulación en o alrededor de 35°C. Se realizó un experimento DSC con una reexploación en la muestra #2; la muestra se exploró a partir de 5 hasta 100°C a una relación de exploración de 60°C/hora. Los datos se graficaron como Cp(cal/°C) contra temperatura (°C). Se observó un pico muy amplio cerca de 46°C en la primera exploración por calor. La gran disminución en capacidad de calor entre 80 y 90°C puede ser debido a la formación de agregados. Sin embargo, la solución no parece turbia después de las exploraciones, lo que sugiere agregados muy pequeños. Estos datos indicaron que la GLP-1 es para desnaturalizar y/o forma agregados en la formulación en o alrededor de 46°C. Estos datos indicaron que la adición de excipientes como se describen en la Tabla 10 anterior para la formulación GLP-1 no mejora su estabilidad física.

EJEMPLO 5 Evaluación de Cinética (PK) de Administración Intranasal e Intravenosa de Péptido-1 similar a Glucagon (GLP-1) en Formulaciones Farmacéuticas Seleccionadas en Conejos El presente ejemplo demuestra que la biodisponibilidad de GLP-1 por administración intranasal es significantemente mejorada por la inclusión de un inhibidor dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV), por ejemplo Lys(4-nitro-Z ) pirrolidodo, en la formulación farmacéutica. Se realizó un estudio de farmacocinética (PK) en conejos para evaluar las propiedades de farmacocinética del plasma de GLP-1 con varias formulaciones administradas vía suministro intranasal (IN) contra infusión intravenosa (IV). El diseño del estudio completo es presentado abajo en la Tabla 11. Las formulaciones #1 hasta #4 representan las formulaciones IN mientras la formulación #5 representa la formulación infundida IV.

Tabla 11 Diseño del Estudio Completo para la Evaluación Farmacocinética En este estudio, se usaron conejos Blancos de Nueva Zelanda (Hra: (NZW) SPF) como objetos de prueba para evaluar la cinética de plasma de GLP-1 por administración intranasal e infusión intravenosa. Los conejos se seleccionaron como animales objeto para este estudio porque el perfil de farmacocinética derivado de un fármaco administrado a conejos estrechamente se parece al perfil PK para el mismo fármaco en humanos . Se evaluaron cuatro formulaciones intranasales y una formulación intravenosa de GLP-1 en el estudio. La composición del vehículo para cada formulación se proporciona en la Tabla 12. Las formulaciones intranasal e intravenosa de GLP-1 se fabricaron para preparación y prueba final. Para cada una de las soluciones de dosificación, los componentes se proporcionaron en dos partes, Parte A y Parte B (véase Tabla 12). Se creó la formulación final para cada uno de los grupos intranasales (Grupos 1-4) mezclando volúmenes iguales de la Parte A (1 mi) y Parte B (1 mi) . Para el grupo intravenoso (Grupo 5), se mezclaron 1.5 mi de la Parte A y 3.5 mi de la Parte B. Se usaron soluciones de dosificación final para todos los grupos dentro de las 6 horas de la preparación.

Tabla 12 Composición del Vehículo para Formulaciones 1 hasta 5 de GLP-1 La concentración de GLP-1 es constante entre las cuatro formulaciones intranasales . La concentración de citrato y pH también se consideran entre las cuatro formulaciones. La concentración de EDTA es consistente para las formulaciones 1, 3 y 4. La formulación 2 contiene PN159, un modulador de unión fuerte previamente mostró mejoramiento para el suministro de péptidos a través de una capa de célula epitelial, pero no EDTA. La formulación 5 que contiene citrato, EDTA y cloruro de sodio, cada una a la concentración apropiada para administración intravenosa; mientras la concentración de GLP-1 disminuye para proporcionar una dosis total de GLP-1 que es 10% de la dosis intranasal. Lys ( 4 -nitro-Z ) -pirrolidido es un inhibidor especifico de dipeptidil aminopeptidasa (DPP) IV, la enzimas primaria responsable para el metabolismo de GLP-1 activo (fragmento de aminoácido 7-36) para un metabolito inactivo (fragmento de aminoácido 9-36). Para evaluación en este estudio, las concentraciones de Lys ( 4 -nitro-Z ) -pirrolidido es variada para cada uno de los grupos de dosis intranasal con la excepción de concentración igual entre la Formulación 1 y Formulación 2. La dosis total de Lys ( -nitro-Z ) -pirrolidido es aproximadamente 0.04 mMoles/kg para los grupos 1 y 2 (grupos intranasales ) , y grupo 5 (grupo intravenoso) .

Método del Ensayo GLP-1 Se sometieron a ensayo muestras de estudio, muestras de calidad y estándar con un Kit ELISA Péptido-1 similar a Glucagon (Activo) (Lineo Research Inc. Catálogo #EGLP-35K) . Cada muestra se analizó en duplicado. Este ensayo se basa en la captura de GLP-1 activo (fragmentos de amida 7-36 y 7-36) por un anticuerpo monoclonal (especifico a la región N-terminal) inmovilizado en las cavidades de una placa de microtitulador de 96 cavidades, y la detección por un segundo anticuerpo etiquetado de fosfatasa alcalina anti-GLP-1. Después del lavado, se agregó a metil umbeliferil fosfato a cada cavidad, el cual en la presencia de fosfatasa alcalina forma el producto fluorescente umbeliferona . La cantidad de fluorescencia generada es directamente proporcional a la concentración de GLP-1 activo en una muestra desconocida, y asi se derivó por interpolación a partir de una curva de referencia usando estándares de referencia de concentración conocida de GLP-1 activo. Debido a especies similares entre GLP-1 de humano y conejo, se anticipó que puede detectar GLP-1 activo endógeno (es decir, conejo) . Se miden niveles endógenos de GLP-1 de conejo al tiempo 0. El fragmento GLP-1 9-36 no es detectado por el ensayo, con respecto a la fuente.

Evaluación de Farmacocinética Se realizaron cálculos de farmacocinética usando el software inNonlin (Pharsight Corporation, Versión 4.0, Mountain Vie , CA) y un modelo no compartimental de administración extravascular . Los parámetros para evaluación se describen en la Tabla 13.

Tabla 13 Parámetros de Farmacocinética Análisis de Parámetros de Farmacocinética Los datos de farmacocinética GLP-1 media para tanto los grupos intranasales como intravenosos se proporcionan en la Tabla 14. Las concentraciones de pre-dosis (linea base) de GLP-1 endógeno en suero o plasma están generalmente abajo de 10 pg/ml. Para algunas muestras, las limitaciones en análisis repetido impiden el volumen de muestra para obtener resultados definitivos. Se reportó un valor de <4 pg/ml para estas muestras. Para calcular valores medios del grupo, y para evaluación de farmacocinética , los datos se corrigieron en la linea base cuando es apropiado. Los resultados indicados por <NÚMERO se ajusta a "<NÚMERO/2" ; con este procedimiento, un valor de <4 pg/ml se ajusta a 2 pg/ml. Valores de plasma del animal individual, después de la dosificación para GLP-1 excede 10 pg/ml de valor de linea base. En el punto de tiempo final después de la infusión intravenosa (90 minutos), las concentraciones de plasma de GLP-1 están en o cerca de valores de la linea base que indica que las fases infusión y eliminación son capturadas por la estructura de tiempo de muestreo empleada por el estudio. Después de la instilación intranasal, varios animales tienen concentracciones de plasma de GLP-1 que excede los niveles de linea base. Se determinó el AUCinf para estimar el perfil de exposición completo para GLP-1.

Tabla 14 Parámetros de Farmacocinética Media para GLP-1 en Plasma de Conejos Macho después de Instilación Intranasal (Grupos 1-4) e Intravenosos (Grupo 5) Formulación 1/Grupo 1 Concentraciones de pico de GLP-1 (Tmax) ocurrido entre 5 y 20 minutos (media de grupo 11 minutos) después de la administración de dosis. La Cmax media del grupo es 844.9 pg/ml. Las concentraciones de plasma restante abajo de linea base a 90 minutos después de la dosificación, que indican que la eliminación no se completó en este tiempo. Esto se refleja en la AUCúitima media de 20792.7 min*pg/ml y AUCinf0 de 32,415.9 min*pg/ml. La vida media terminal media (ti/ o ) se estimó ser 55,5 minutos .

Formulación 2/Grupo 2 La Cmax media del grupo 2 se estimó ser 424.0 pg/ml. La Tmax medís se estimó ser 43 minutos; sin embargo, existe considerable variabilidad inter-animal para este parámetro. El examen de las concentraciones contra perfil de tiempo para estos animales indica una fase de absorción (incrementada) y eliminación (disminución). La AUCúitíma del grupo 2 es 17,069.8 min*pg/ml. Una ti/2 no debe ser estimada debido a una ausencia de una fase de eliminación clara en dos animales dentro del grupo. Sin embargo, en base a los datos colectados para los animales restantes en el grupo, la ti 2 media es 66.8 minutos. La AUCinf media (tres animales en los cuales Kel debe ser determinado) es 33,324.4 min*pg/ml.

Formulación 3/Grupo 3 La Cmax, Tmax, ti/2 y AUCúitíma media del grupo 3 son 283.9 pg/ml, 25 minutos, 39.3 minutos, y 9331.5 min*pg/ml, respectivamente. Un Kel exacto, y así ti/2 no puede ser terminada porque un animal en el grupo tienen una mayor que el valor esperado en 60 minutos. Así, este valor no se incluye en la ti/2 media del grupo de 39.3 minutos y AUCinf medio del grupo de 13,232.7 min*pg/ml.

Formulación 4/Grupo 4 La Cma:< media para el grupo 4 se estimó ser 154.5 pg/ml. La Tmax media del grupo es 47 minutos, sin embargo, dos, animales, tienen sus mayores concentraciones de plasma medidas de GLP-1 a 90 minutos. Sin un Kel de fase de eliminación aparente (y ti/2) y AUCinf no debe ser determinado para estos animales. La ti 2 media y AUCinf para los otros tres animales se estiman ser 22.4 minutos y 5734.4 min*pg/ml, respect i amente .

Formulación 5/Grupo 5 Durante el procedimiento de infusión, un animal del grupo 5 experimenta una falla mecánica con el aparato de bombeo, el cual resultó en -100 µ? adicionales ser suministrados entre los 5 y 10 minutos puntos de tiempo. Esto se refleja en el valor de concentración de 10 minutos de >5000 pg/ml. Como las condiciones exactas para la infusión o deben ser determinadas, los datos para este animal no se incluyen en la evaluación de farmacocinética para el grupo 5. La Cmax media para la infusión intravenosa de 10 minutos es 3183.6 pg/ml. Tres animales tienen una Tmax a 5 minutos y un animal tiene una Tmax a 10 minutos; aunque las concentraciones de GLP-1 son generalmente similares en los puntos de tiempo de 5 y 10 minutos para todos los cuatro animales. Una ti 2 terminal para el grupo se estimó ser 30.9 minutos. La AUCúitima media de 28, 883.2 min*pg/ml captura la mayoría del perfil de exposición, como la AUCinf es únicamente ligeramente mayor, 29,149.5 min*pg/ml. El examen de la concentración log contra perfil de tiempo entre 10 minutos (fin de la infusión) y 20 minutos, sugiere una eliminación bifásica de GLP-1. La fase a más rápida de un perfil bifásico es generalmente asociada con distribución y eliminación extravascular , mientras la fase ß es más lenta, se considera representar la eliminación terminal. El cálculo de la relación de eliminación durante esta estructura de tiempo indica un ti/2 inicial de 2 minutos o menos. Esta ti/2 inicial debe ser consistente con lograr un estado estable aparente en la última mitad del periodo de infusión de 10 minutos.

Biodisponibilidad Se calculó la biodisponibilidad de GLP-1 después de la administración intranasal usando AUCúitima o AUCinf," estos estimados se proporcionan en la Tabla 15. En los grupos 1, 3 y 4 la concentración del inhibidor Lys ( 4 -nitro-Z ) -pirrolidino en la formulación es 0 m , 15 mM o 25 mM respectivamente. En la ausencia del inhibidor, la biodisponibilidad de GLP-1 es aproximadamente 2% mientras la adición de 15 mM de Lys (4-nitro-Z ) -pirrolidido en la formulación (Grupo 3) incrementa la biodisponibilidad de GLP-1 hasta aproximadamente 3% hasta 5%. La biodisponibilidad de GLP-1 es además incrementada de aproximadamente 7% hasta 11% en adición de 25 mM de Lys (4- nitro-Z ) -pirrolidido en la formulación (Grupo 1). El polipéptido PN159 se ha mostrado por incrementar la biodisponibilidad de péptidos comparado a excipientes de molécula pequeña. Cuando se prueba, la formulación 2 (Grupo 2) que contiene PN159 y 25 mM de Lys ( -nitro-Z ) -pirrolidido tiene una biodisponibilidad GLP-1 aproximada de 6 hasta 11%, lo cual es equivalente a la biodisponibilidad observada para GLP-1 en la presencia de 25 mM de Lys ( -nitro-Z ) -pirrolidido sin PN159. El PN159 tiene el mismo efecto como 10 mM de EDTA en 1N d biodisponibilidad de GLP-1.

Tabla 15 Biodisponibilidad de GLP-1 en Conejos Administrados con 75 pg/kg vía Instilación Intranasal (7.5 yg/kg de Dosis Intravenosa para Cálculo; Grupo 5) Biodisponibilidad = [Dosis (Grupo 5) X AUCXXX (Grupo X) }/ [Dosis (Grupo X) x AUCXXX (Grupo 5)] x 100 La vida media terminal para GLP-1 es aproximadamente 30 minutos en conejo y más larga que lo anticipado en base a los reportes publicados que muestran una vida media terminal de 10 minutos o menos para rata o humano (Parkes, D. et al., " Pharmacokinetic Actions of Exendin-4 in the rat: Comparasion with Glucagon-like Peptide-1", Drug Development Research 53:260-267, 2001; Deacon C, Therapeutics Strategies Based on Glucagon-like Peptide-1, Perspectives in Diabetes 53:2181-2189, 2004. La ti/2 para conejo es consistente entre cada uno de los grupos y animales, y asi se reportó dentro del estudio. El cálculo de ti/2 terminal es dependiente en la porción de la concentración log contra la curva de tiempo usado para determinación del traslape (véase definición de Kel en la Tabla 13). Para lo estimado descrito anteriormente, el programa de modelaje se deja para escoger el mejor ajuste para la estimación de Kel. La selección manual para la curva de ajustamiento de 10 minutos (fin de la infusión) hasta 90 minutos que indica una vida media terminal en el intervalo de 10 hasta 12 minutos (datos no mostrados) . La separación proporciona un segundo medio para evaluar la disposición de un fármaco después de la administración. La separación puede ser considerada como la capacidad intrínseca del cuerpo o sus órganos para remover un fármaco de la sangre (Basic Ckinical Pharmacokinetics , 2da ed. , Applied Therapeutics , Inc. Vancouver, Washington). Sin embargo, en este caso, GLP-1 puede permanecer en la sangre, pero se considera removido para propósitos de evaluación de separación. La razón para esto es que GLP-1 existe en dos diferentes estados: un estado activo que consiste de un fragmento de péptido representado por aminoácidos 7-36 y un estado inactivo, un resultado de metabolismo, que consiste de un fragmento de péptido representado por aminoácidos 9-36. En la conversión para el estado inactivo, el GLP-1 se considera efectivamente eliminado del cuerpo. Como el ensayo usado en este documento para detectar GLP-1 es especifico para la forma activa de GLP-1 (7-36), la presencia de la forma activa de GLP-1 en la sangre no interfiere con la evaluación de la separación de GLP-1. Para los grupos intranasales , el valor de separación superior (CL-F) se nota para el Grupo 4 con una media del grupo de 15,160.0 ml/min/kg. El valor medio para el grupo 3 es 6977.0 ml/min/kg. La separación es similar para los Grupos 2 y 1, 2716.0 ml/min/kg y 3032.8 ml/min/kg, respectivamente. Como se espera, la separación estimada para cada grupo es inversamente proporcional a la exposición sistémica . Los valores de separación para grupos intranasales también se ajustan para la biodisponibilidad de GLP-1. La separación ajustada para Grupos 4 y 3 son 7580 ml/min/kg y 1395 ml/min/kg, respectivamente. Los valores de separación para los grupos 1 y 2, (-11% de biodisponibilidad para cada uno) se determinaron ser 275 ml/min/kg y 247 ml/min/kg, respectivamente. La separación ajustada para los Grupos 1 y 3 son similares a la separación estimada de 259.8 ml/min/kg para el grupo de dosis intravenosa (Grupo 5). La dosis total de Lys- ( 4 -nitro-Z ) -pirrolidido es aproximadamente 0.004 mMoles/kg por Grupos 1, 2 y 5. Los niveles de sangre de Lys ( 4 -nitro-Z ) -pirrolidido no se determinaron en este estudio, como tal la biodisponibilidad después de la administración intranasal no es conocida. La presencia de Lys ( 4 -nitro-Z ) -pirrolidido en la formulación nasal tienen el potencial para proteger el GLP-1 activo, a partir del metabolismo dentro de la mucosa nasal, y se asume que la biodisponibilidad razonable, dentro de la circulación sistémica. La protección del metabolismo por la mucosa nasal es consistente con una Cmax mayor para GLP-1 cuando Lys (4-nitro-Z ) -pirrolidido está presente en la formulación. Sin embargo, como ambos fragmentos de GLP-1 son susceptible a cruza el la circulación, un ensayo para GLP-1 total (fragmento de aminoácido 7-36 y 9-36) será requerido para confirmar un porcentaje mayor es GLP-1 activo. La protección del metabolismo dentro de la sangre es indicada por la similaridad en valores de separación para GLP-1 entre el grupo intravenoso (Grupo 5) y los grupos intranasales con la concentración mayor del inhibidor (Grupos 1 y 2) .

Sumario Estos datos muestran el descubrimiento sorprendente e inesperado que suministra las formulaciones farmacéuticas intransales de GLP-1 con el inhibidor DPP IV Lys ( 4-nitro-Z ) -pirrolidido resultando en biodisponibilidad GLP-1 incrementada. Además, la biodisponibilidad GLP-1 es dependiente de la concentración del inhibidor en la formulación. En la ausencia del inhibidor, la biodisponibilidad de GLP-1 es aproximadamente 2%. La inclusión de Lys ( 4 -nitro-Z ) -pirrolidido a 15 mM incrementada, la biodisponibilidad GLP-1 a aproximadamente 5%, y con 25 mM Lys ( 4-nitro-Z ) -pirrolidido, la biodisponibilidad para GLP-1 es aproximadamente 11%. El potencial para inhibición local (tejido nasal) y sistémica del metabolismo de GLP-1 es indicado por los datos obtenidos. La formulación con PN159, además a 25 mM de Lys (4-nitro-Z ) -pirrolidido, también es investigado para evaluar el potencial para mayor biodisponibilidad con este modulador de enlace fuerte. Bajo las condiciones de este estudio, el efecto de PN159 en la biodisponibilidad de GLP-1 no es mayor que el efecto de EDTA en la formulación.

EJEMPLO 6 Formulaciones de GLP-1 en Estabilidad de Uso y Venta Estabilidad "en uso" se define como aquellos estudios que involucran una formulación almacenada dentro de un vial fijado con un accionador y atomizado de conformidad con el régimen terapéutico apropiado (en este caso, tres veces al día (TID) ) , y se colocan en temperaturas de almacenaje especificas. Viales con accionadores son inicialmente cebados, pero no son cebados entre atomizaciones posteriores. La cebación se define como atomizado hasta que un atomizado completo es visualmente aparente, después actuando una o más veces antes de la dosificación. Los viales son almacenados a 30°C/65% de humedad relativa (HR) todas las veces y son atomizados dentro de 10 minutos después de removerlos de la cámara para cada dosificación. Los viales son accionados tres veces o una vez al día, dependiendo del régimen seleccionado para cada estudio. El tiempo entre cada atomización es al menos 1 hora y se notaron las observaciones visuales/físicas. Se realizaron estudios en uso TID/30°C. Las formulaciones usadas en este estudio contienen 5 mg/ml de GLP-1, 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de Amortiguador de Citrato (pH 3.5), y sin preservativo. Los viales se rellenaron, se cebaron y accionaron por TID, y se almacenaron a 30°C/65% de HR por 10 días. La recuperación y pureza en uso de GLP-1 después de 7 días de TID de atomización se muestran en la Tabla 16 y 17. La recuperación del péptido en uso es mayor de 95 ± 2.2% por hasta 7 días. La pureza del péptido total en uso es 98 ± 2.1% después de 10 días TID/30°C/65% HR.

Tabla 16 Recuperación en uso de GLP-1 después de TID/30°C/65% *% de exigencia de etiqueta de T = 0 Valores estimados Tabla 17 Pureza en uso de GLP-1 Después de TID/30°C/65 Estudios de estabilidad "en venta" se definen como aquellos estudios que involucran la formulación almacenada dentro de un vial cerrado (es decir, tapado) , colocado en almacenaje especifico y condiciones de temperatura acelerada (es decir, 5°C, 25°C, 40°C y/o 50°C) por periodos especificados de tiempo. Se realizaron estudios de estabilidad en venta en formulaciones que tienen resultados positivos de las rondas de selección in vitro. Se elaboraron formulaciones y se almacenaron a 5°C, 25°C y 35°C. La tabla 18 muestra las formulaciones que se probaron. Los resultados de las formulaciones #5 y #6 (que contienen GLP-1 y EDTA) muestran que después de 56 días de almacenaje la recuperación de GLP-1 es 100% a 5°C, y >97% a 25°C y >90% a 35°C.

Tabla 18 Sumario de Formulaciones sometidas a Ensayo para Estabilidad en Venta Se realizó un ensayo de estabilidad en venta en el mismo lote de formulación hecho para el estudio de en uso (5 mg/ml de GLP-1, 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de Amortiguador de Citrato (pH 3.5) y sin preservativo). La formulación se almacenó a 5°C. Los resultados de estabilidad en venta se muestran abajo en las Tablas 19 hasta 20.

Tabla 19 Estabilidad en venta, Recuperación de GLP-1 en Almacenaje a 5°C Tabla 20 Estabilidad en venta, Pureza de GLP-1 en Almacenaje a 5°C EJEMPLO 7 Farmacodinámica in vivo de Formulaciones GLP-1 Intranasales Tres estudios comparan las acciones de farmacodinámica (PD) de GLP-1 (7-36) amida y exendin- 4 sintético (exanatida) en glucosa sanguínea después de administración intranasal (1N) de GLP-1 en la presencia o ausencia del inhibidor DPP-V o inyección subcutánea (SQ) de exenatida. Los estudios se realizaron en el modelo de rata ZDF de la prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) usada en estudios en humano. Se evaluaron las acciones de farmacodinámica monitoreando los niveles de glucosa sanguínea e insulina en la sangre. Se determinó la concentración de glucosa en la sangre usando un analizador Synchron CX4 y Kit de Reactivo de Glucosa apropiado (Beckman Coulter, Brea, CA USA) . Se determinaron los parámetros de farmacocinética usando el software WinNonlin (Pharsight Corporation, Versión 5.01, Mountain View, CA) . Se determinó la concentración de insulina en la sangre por ELISA. Se determinó una concentración de acetaminofen en sangre usando un analizador Synchron CX4 y Kit de Reactivo de Acetominofen (Beckman Coulter, Brea, CA USA) . Se usó acetaminofen como un marcador de vaciado gástrico porque el acetaminofen generalmente tiene absorción insignificante del estómago. El tiempo de concentración del pico (Tmax) y concentraciones del pico (Cmax) después de la administración de la dosis refleja el tiempo en el cual ocurre el vaciado gástrico, y el perfil de vaciado gástrico (por ejemplo, absorción en la circulación sistémica después de la liberación del estómago) refleja la duración del vaciado. El AUC refleja la exposición total. El acetaminofen se adminsitra en el Estudio 2 y Estudio 3 para monitorear el vaciado gástrico.

Estudio 1 El diseño del estudio completo para evaluación valores de glucosa en sangre e insulina en el Estudio resume en la Tabla 21.

Tabla 21 Estudio 1: Diseño del Estudio de Farmacodinámica (PD) Designaciones de Grupo para Determinación de Glucosa Sanguínea e Insulina * Ratas ZDF Macho Formulaciones para ratas tratadas con GLP-1 en el Estudio 1 son Fl = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de Amortiguador de. Citrato (pH 3.5) SIN INHIBIDOR; F2 = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de Amortiguador de Citrato (pH 3.5) y 25 mM de H-Lys ( 4nitro-Z ) pirrolidido (el inhibidor está disponible comercialmente de Bachem) ) ; y F3 = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de Amortiguador de Citrato (pH 3.5) y 25 mM de L-prolina-boroprolina (Pro-boropro se sintetizó en base a la información de la Solicitud de Patente 2004/0229829 Al, Bachovchin, Willia, W. et al.). Los resultados PD para el estudio 1 se muestran en la Tabla 22. El AUC (0-150) de glucosa para ratas tratadas con formulaciones GLP-1 (p/ y p/o inhibidor DPP-IV) es -15% inferior que exanatida en ratas tratadas con placebo. En el estudio 1, la glucosa se proporciona a 2 g/kg, mientras en estudios subsecuentes la glucosa se proporciona a 1 g/kg. Como un resultado, en el Estudio 1, la reducción de glucosa observada es relativamente inferior que los otros estudios (por ejemplo, AUC (0-150) de 0-16%) porque al provocación de glucosa es mayor. Para el estudio 1, el acetaminofen no se dosifica para monitorear el vaciado gástrico.

Tabla 22 Estudio 1: % de Reducción Calculada en AUC de Glucosa GLP-1 comparada a Placebo y Exenatida No existe diferencia en glucosa sanguínea entre las formulaciones GLP-1 cuando se administra +20 minutos después de la dosis de glucosa oral. Existe diferencia en el perfil de glucosa sanguínea entre las formulaciones de GLP-1 con inhibidor ( F2 y F3) contra sin inhibidor (Fl) cuando se administra antes de la dosis, -10 minutos. Ambas formulaciones que contienen un inhibidor DPP-IV ( F2 y F3) resultan en un retraso en Cmax (de 45 hasta aproximadamente 120 minutos). Niveles significantes de GLP-1 retrasan el vaciado gástrico; el estudio de conejo PK mostró un % de BA 5 veces mayor para la formulación de GLP-1 que contienen inhibidor DPP-IV que sin este. En el estudio 2, se agregó acetaminofen a una formulación que contiene un inhibidor DPP-IV para comparar vaciado gástrico en una formulación GLP-1 sin inhibidor. Los datos de mediciones de insulina y glucosa para el Placebo a -10 minutos, Fl de GLP-1 (sin inhibidores) a -10 minutos y Fl de GLP-1 (sin inhibidores a +20 minutos muestran un incremento de insulina mayor con Fl de GLP-1 cuando se administra a ya sea -10 y +20 minutos en relación al placebo.

Estudio 2 Se sometieron a ensayo las acciones PD de GLP-1 (amida 7-36) en la presencia o ausencia del inhibidor DPP-IV en glucosa sanguínea después de la instilación intranasal (GLP-1) en un modelo de rata del OGTT en el Estudio 2. El diseño del estudio completo para evaluación de glucosa sanguínea y valores de insulina se resumen en la Tabla 23. El estudio 2 de OGTT se conduce como una dosis de lg/kg del bolo de una solución de glucosa administrada por sonda oral. Se co-administró acetaminofen, a una dosis de 100 mg/kg dentro de la solución de glucosa. Para propósitos de registro del tiempo el OGTT se designó como 0 minutos en tiempo.

Tabla 23 Estudio 2: Diseño OGTT de Farmacodinámica y Designaciones de Grupo para Determinación de Glucosa Sanguínea e Insulina * Rata ZDF Las formulaciones usadas en el Estudio 2 incluyen: Fl = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de Amortiguador de citrato (pH 3.5) SIN INHIBIDOR; F3 = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de Amortiguador de citrato (pH 3.5) y 25 mM de L-prolina-boroprolina. La glucosa sanguínea se evalúo en los siguientes puntos de tiempo: preOGTT y 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 y 240 minutos post-OGTT. Se calculó la insulina sanguínea en los siguientes putos de tiempo: preOGTT y 15, 30, 60, 120 y 240 minutos post-OGTT. Se evaluaron los niveles de sangre APAP en los siguientes puntos de tiempo: preOGTT y 5, 10, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 y 180 minutos post-OGTT.

Los resultados del Estudio 2 muestran que existe una reducción en AUC de glucosa (linea base correcta) comparada al control, especialmente para formulaciones sin inhibidor (Fl). Ambas formulaciones (Fl y F3) con y sin inhibidor incrementa la insulina después de la dosificación. La dosis a 1N de 100 ug/ml de GLP-1 mostró que en la presencia del inhibidor, se retrasó el vaciado gástrico. Incrementando la dosis de GLP-1 a 1N también el vaciado gástrico es afectado aún sin la presencia del inhibidor. Cuando el vaciado gástrico es retrasado debido a altas dosis o la presencia del inhibidor, la absorción de glucosa se retrasa. La tabla 24 muestra la diferencia en AUC de glucosa para grupos de tratamiento comparados al Placebo.

Tabla 24 Sumario de Diferencias en AUC de Glucosa Estudio 3 En el estudio 3, se sometieron a ensayo las acciones de farmacodinámica (PD) de GLP-1 (amida 7-36) sin inhibidor y exenatida en glucosa sanguínea después de instilación intranasal (GLP-1 o salina) o inyección subcutánea de exenatida en un modelo de rata del OGT . En el estudio 3, se usó una formulación de GLP-1 que no tiene inhibidores DPP-IV (Fl = 10 mg/ml de EDTA, 10 mM de amortiguador de citrato (pH 3.5) SIN INHIBIDOR). La meta principal del Estudio 3 es comparar Fl GLP-1 (IN) a exenatida (SQ) . Se evaluó PD monitoreando el nivel de glucosa sanguínea e insulina en la sangre. Se administró acetaminofen para monitorear el vaciado gástrico (del Estudio 2). En el Estudio 3 el OGTT se condujo usando una dosis de 1 g/kg del bolo de una solución de glucosa administrada por sonda oral. Cuando es relevante, el acetaminofen, a una dosis de 100 mg/kg, se co-administró dentro de la solución de glucosa. Para propósitos de registro del tiempo, el OGTT se designó como 0 minutos de tiempo. El registro del tiempo para la administración de la dosis de tratamiento es relativo al OGTT. La dosis del tratamiento único se administra a -10 minutos. Se conduce la dosificación dos veces, con la primera dosis a -10 minutos y la segunda dosis a +35 minutos. Por lo tanto, la administración para dosis por salina, GLP-1 o exenatida ocurre a -10 minutos, +35 minutos o -10 y +35 minutos, en relación al OGTT. Se colectó la sangre para análisis de farmacodinámica , que incluyen cálculos AUCO-240 y Cmax. Se evalúo la glucosa sanguínea en los siguientes puntos de tiempo: preOGTT y post-OGTT (5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 y 240 minutos) . Se evalúo la insulina sanguínea preOGTT y post-OGTT (5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 y 180 minutos) . Se evaluaron los niveles sanguíneos de acetaminofen preOGTT y post-OGTT (15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 y 180 minutos) . El diseño total para la evaluación del Estudio 3 de valores de glucosa sanguínea e insulina se resumen en la Tabla 25. El diseño total para evaluación de vaciado gástrico se resume en la Tabla 26.

Tabla 25 Estudio 3: Diseño de Estudio de Farmacodinámica y Designaciones de Grupo para Determinaciones de Glucosa Sanguínea e Insulina * Ratas ZDF Macho Tabla 26 Estudio 3: Diseño del Estudio de Farmacodinámica y Designaciones de Grupo para Evaluaciones de Vaciado Gástrico * Ratas ZDF Macho Los resultados del Estudio 3 muestran reducción dramática (-60%) de AUC0-240 de glucosa sanguínea correcta después de la dosificación GLP-1 intranasal comparado a administración Salina o SQ de Exenatida. Se muestran valores AUCo-240 y Cmax en la Tabla 27. El cambio en concentración de glucosa corregida para glucosa endógena se muestra en la Figura 1. Estos resultados de farmacodinámica muestran el descubrimiento sorprendente e inesperado que la administración intranasal de formulaciones farmacéuticas de GLP-1 resulta en una concentración de glucosa disminuida en la sangre.

Tabla 27 Datos de Farmacodinámica para Parámetros de la Farmacocinética de Glucosa Sanguínea Después de la Administración de GLP-1, Exenatida y Salina en Ratas Determinados en Prueba de Tolerancia de Glucosa Oral Los datos de insulina media del grupo para grupos del tratamiento GLP-1 y placebo del Estudio 3 se muestran en la Figura 2. Los niveles de insulina en ratas tratadas con salina (placebo) muestran una disminución ligera después del OGTT. Con una dosis única de 100 g/kg de GLP-1 a -10 minutos, existe un incremento marcado en niveles de insulina en la sangre en respuesta a un OGTT. La administración de GLP-1 a -10 minutos y +35 minutos resulta en un aumento repentino de insulina inmediatamente después de cada dosis. Este patrón indica que el GLP-1 es responsable para la liberación de insulina en respuesta a la glucosa sanguínea elevada . Los datos de acetaminofen medios del grupo para los grupos de tratamiento GLP-1 y placebo (con desviación estándar para el grupo placebo) se exhiben en la figura 3. En el estudio 3, la determinación de exposición total (AUC) indicada es menos de un 3% de diferencia en la cantidad total de acetaminofen absorbido en la circulación sistémica entre los tres grupos de tratamiento. Los valores AUC son 6804 pg*min/kg, 6672 pg*min/kg y 6951 pg*min/kg para el control de salina (placebo) , grupos 100 pg/kg de GLP-1 y 1000 pg/kg GLP-1, respectivamente. Sin embargo, el perfil de absorción es diferente. En ratas tratadas con placebo, la Tmax para acetaminofen es 30 minutos post-dosis; con una CmaK media del grupo de 78 pg/ml con una desviación estándar de ± 21 pg/ml. Una Cma:< ligeramente inferior, 66 ± 21 pg/ml se notó a 30 minutos después de la dosis para el grupo 100 pg/kg GLP-1; sin embargo, las concentraciones de acetaminofen entre este grupo y el grupo control son similares para más puntos de tiempo evaluados. La Cmax para acetaminofen es menor, 45 ± 30 ug/ml, en el grupo 1000 pg/ml GLP-1. Además, la Tmax parece originarse entre 30 y 90 minutos después de la dosis, y los niveles sanguíneos de acetaminofen son marcadamente mayores en los últimos puntos de tiempo. Los resultados para el grupo 1000 pg/kg GLP-1 son consistentes con un retraso en el vaciado gástrico y un perfil más prolongado para vaciado gástrico después de una dosis alta de GLP-1. Los resultados del Estudio 3 muestran que el GLP-1 sin inhibidor significantemente disminuye la glucosa y que la dosis puede ser administrada antes o después de la comida. La formulación de GLP-1 a 1N disminuye la AUC de glucosa mientras la dosificación de Exenatida SQ en ratas ZDF en ya sea 0.6 ó 3 ug/kg no lo hace.

Sumario de Resultados PD Estos resultados de armacodinámica muestran el descubrimiento sorprendente e inesperado que la administración intranasal de formulaciones farmacéuticas de GLP-1 resulta en una concentración de glucosa disminuida en la sangre. Además, el patrón de concentración de insulina en la sangre indica que GLP-1 es el factor responsable para la liberación de insulina en respuesta a glucosa sanguínea elevada. Los resultados para el estudio de acetaminofen son consistentes con un retraso en el vaciado gástrico y un perfil más prolongado para vaciado gástrico a dosis altas de GLP-1 aún en la ausencia del inhibidor DOO-IV. Una dosis inferior de GLP-1, la cual también es efectiva en glucosa sanguínea inferior, no impacta el vaciado gástrico. La disminución de la concentración de glucosa en la sangre, especialmente a través de niveles de insulina elevados es un tratamiento efectivo para Diabetes tipo II. Además, el retraso en vaciado gástrico puede incrementar la saciedad y promover la pérdida de peso. Estos datos soportan la eficacia de la formulación intranasal GLP-1 descrita en estos ensayos para uso en el tratamiento de trastornos metabólicos tales como obesidad y diabetes.

EJEMPLO 8 Formulaciones Transmucosales Sintéticas de Exendin-4 con Intensificadores Se probaron una variedad de excipientes para optimización in vitro de formulaciones de exenatida. Se generaron formulaciones de exenatida transmucosal combinando exenatida y excipientes (que incluyen intensificadores , solubilizadores , tensoactivos , queladores, estabilizadores, amortiguadores, tonificadores y preservativos). Se realizaron rondas múltiples de selección de formulación y se dividieron en dos series, A y B. Las series A se enfocan en cambiar las concentraciones del excipiente de solubilizadores (??-ß-CD) , tensoactivos (DDPC), queladores (EDTA) y estabilizadores (gelatina) . También se probaron amortiguadores tales como amortiguador de citrato, amortiguador de tartrato y glutamato (MSG) . Series B selecciona excipientes alternativos por su potencial para intensificar la permeación de exenatida. Se probaron varias concentraciones de intensificadores de permeación potencial que incluyen ciclodextrinas , glicósidos, ácidos grasos, fosfatidilcolinas, compuestos GRAS, PN159, gelatina y otras. Además a la selección de intensificadores de permeación potencial, también se seleccionaro variando concentraciones de amortiguador (amortiguador de citrato, amortiguador de tartrato) y excipientes tonificadores/estabilizadores (manitol, NaCl). Se probaron preservativos tales como benzoato de sodio (NaBz) y cloruro de benzalconio (BAK) . La tabla 28 enlista los excipientes probados en la selección in vitro. Fuera de las formulaciones únicas 372 que se probaron, once formulaciones se recomendaron para uso en estudios PK de conejo in vivo preclinicos, véase Tabla 29.

Tabla 28 Excipientes Probados en Optimización de Formulación Exenatida in vitro Excipientes Series B Clase DMe- -CD Ciclodextrinas 20 - 50 mg/mL ??-ß-CD Ciclodextrinas 20 - 50 mg/mL B-CD Ciclodextrinas 10-20 mg/mL n-Decil-P-D-maltopiranosida Glicósidos 2.5- 10 mg/mL n-Dodecil- -D-maltopiranosida Glicósidos 2.5 - 10 mg/mL n-Tetradecil-P-D-maltopiranosida Glicósidos 2.5- 10 mg/mL n-Octil-P-D-maltopiranosida Glicósidos 10-20 mg/mL n-Hexadecil- -D-maltopiranosida Glicósidos 2.5- 10 mg/mL n-Octil-P-D-galactopiranosida Glicósidos 5- 10 mg/mL Octil-P-glucopiranosida Glicósidos 5- 10 mg/mL Octil-p-glucopiranosida Glicósidos 5 - 7.5 mg/mL n-Heptil-P-D-glucopiranosida Glicósidos 2.5- 10 mg/mL Dodecanoilsucrosa Glicósidos 1 - 5 mg/mL Decanoilsucrosa Glicósidos 1 - 5 mg/mL Caprato de Sodio (10) Acidos grasos insaturados 5-50 mg/mL Caprilato de Sodio (8) Ácidos graosos insaturados 20- 100 mg/mL Fosfotidil colina Fosfatidilcolinas 0.177- 1.77 mmol Dimiristoil Glicero Fosfatidilcolina (14:0) DMPC Fosfatidilcolinas 0.177- 1.77 mmol Dilauroil Glicero Fosfatidilcolina (12:0) DLPC Fosfatidilcolinas 0.177- 1.77 mmol Di Nonanoil Glicero Fosfatidilcolina (9:0) Di Non-PC Fosfatidilcolinas 0.177- 1.77 mmol Dipalmitoil Glicero Fosfatidilglicerol (16:0) DPPG Fosfatidilcolinas 0.177- 1.77 mmol Dimiristoil Glicero Fosfatidilglicerol (14:0) DMPG Fosfatidilcolinas 0.177- 1.77 mmol Palmitoil-DL-Carnitina Otro 1 - 5 mg/mL Glicolato de Sodio Otro 1 - 10 mg/mL nitroso-N-acetil-penicilamina S Otro 0.2 - 1 mg/mL Cremefor EL Otro 1 - 5 mg/mL Tabla 29 Formulaciones de Exenatida Transmucosal Recomendada Estudios Pre-clinicos EJEMPLO 9 Formulación de Exenatida Transcumosal que Induce Apertura de Uniones Fuertes in vitro Se realizaron ensayos TER, LDH, MTT y permeación in vitro para formulaciones de exenatida como se describe en los protocolos en el Ejemplo 2 anterior. Para todas las formulaciones de exenatida que contienen intensificadores , se reduce TER de aproximadamente 350-700 ohms x cm2 hasta aproximadamente 5-20 ohms x cm2 después de sesenta (60) minutos del periodo de incubación. Todas las formulaciones de exenatida, con la excepción de controles, contienen EDTA. Como un quelador de calcio, se conoce EDTA para abrir uniones fuertes por calcio depurador. En un ambiente estático similar al sistema de cultivo de tejido in vitro se usa en este documento, la remoción de calcio de la solución conduce para abrir uniones fuertes significantes. No se observó reducción ni TER en el control de glutamato más exenatida ( SG) que contiene únicamente exenatida en amortiguador de glutamato con cloruro de sodio como un tonificador. El control de glutamato más exenatida indica que la apertura de uniones fuertes no es una característica inherente de la misma exenatida. El TER de insertos después de sesenta (60) minutos expuesto al control de glutamato es similar a los de los insertos expuestos al medio por sesenta (60) minutos. El control X tritón es el TER más bajo posible, el cual resulta de la eliminación de la barrera celular como se espera. Para verificar que la reducción de TER por las formulaciones de exenatida resultó de modulación de uniones fuertes por los intensificadores y no muerte celular, se realizaron ensayos LDH y MTT usando la misma línea celular, MatTek Corp., como se usa en los ensayos TER. Las formulaciones de exenatida no muestran un incremento significante en citotoxicidad como se mide por % de LDH. Las formulaciones de exenatido tienen menos del 20% de pérdida de LDH. Similarmente , el medio de control no muestra citotoxicidad. En contraste, el grupo tratado con control Tritón X mostró significante toxicidad, como se espera. Se valoró la viabilidad celular usando el ensayo MTT (MTT-100, kit MatTek) . Las formulaciones de exenatida no muestran un incremento significante en toxicidad como se midió para el % de MTT con la excepción de tres formulaciones, JW-239-126-1 , JW-239-126-19, y J -239-126-24 , las cuales tienen alrededor del 50% de MTT. Por otra parte, las formulaciones de exenatida muestran mayor viabilidad que el 80% de MTT. Similarmente, el medio de control no muestra citotoxicidad. En contraste, el grupo tratado con control Tritón X mostró significante toxicidad como se esperaba. Los resultados del estudio de permeación se muestran en la Tabla 30.

Tabla 30 Formulaciones de Exenatida Transmucosal a partir de Estudios Previos Permeación MTT LDH Veces % Perm en reí < //o o //o desv. Vol. de al ctrl desv. desv. estd Muestra carga MSG 1 /o estd 0 //o estd /o AKL-225- 126-2 Lleno 346 6.0 1 .6 103.2 16.5 2.5 2.0 JW-239-9-21 Lleno 501 7.2 1 .6 73.3 18.7 7.2 4.1 JW-239- 126-3 Lleno 365 8.6 1 .7 90.6 20.7 3.4 1 .6 JW-239- 126-7 Lleno 430 8.2 4.7 84.5 17.9 6.1 2.9 JW-239-126- 14 Lleno 829 16.7 8.5 52.0 1 1.0 6.3 2.0 JW-239-126-15 Lleno 361 13.4 14.4 1 12.2 20.9 3.4 4.1 JW-239-126-19 Medio 1426 20.6 7.1 90.1 1 7.9 3.5 2.8 JW-239- 126-24 Medio 2264 32.7 8.2 98.5 15.9 7.3 1.4 JW-239-126-19 Lleno 492 7.1 1.1 41 .8 6.1 15.4 0.8 JW-239-126-24 Lleno 469 6.8 1 .1 45.6 6.4 13.9 1 .5 A L-310-27-12 lleno 306 4.4 1.5 101 .7 1 1.6 10.8 0.6 Los resultados de permeación para las formulaciones mostradas 300 hasta 830 veces incrementados en permeación en relación a una formulación control que contiene únicamente 3 mg/ml de exenatida y glutamato monosódico. Las formulaciones dosificadas a la mitad del volumen mostrado a 1400 y 2200 veces de incremento en permeación comparado al control.

EJEMPLO 10 Resultados de PK en Conejo para Formulaciones de Exenatida Transmucosal Se muestran formulaciones de Exendin-4 para pruebas in vivo en la Tabla 31.

Tabla 31 Formulaciones de Exenatida Transmucosal a partir de Estudios Previos Se realizó un estudio PK de exendin-4 en conejos que comparan resultados PK para exendin-4 administrado por IV e IN. Las formulaciones IN incluyen control IN (sin intensificadores ) , intensificador IN IX + gelatina, intensificador IIN 2X e intensificador IN 2X + gelatina (formulaciones mostrada en la Tabla 31). Los resultados del estudio PK se muestran en la Tabla 32 y Figura 4.

Tabla 32 Resultados de Farmacocinética para Exendin-4 en Conej Los resultados PK muestran que IN 2X intesif e IN 2X intensif + gel son las mejores formulaciones de exendin-4 desarrolladas, probadas en el estudio de conejo. Tanto IN 2X intensif como IN 2X intensif+gel resultan en valores PK mayores que los controles IV o IN.

EJEMPLO 11 Formulaciones de Exenatida Transmucosal Alternativas Se desarrollaron formulaciones de exendin-4 alternativos para administración transmucosal para probar lo siguiente: 1) estabilidad de almacenaje incrementada, 2) biodisponibilidad incrementada de exendin-4 y 3) efecto de farmacodinámica incrementada determinado midiendo niveles de insulina y glucosa. Se prepararon modificaciones de formulaciones exendin-4 previamente probadas para remover DDPC y gelatina completamente pero en una formulación. Se usó "OEF" para referirse a formulaciones que contienen 80 mg/ml de Me-b-CD y 5 mg/ml de EDTA (sin DDPC o gelatina) en 10 mM de amortiguador de acetato. Un segundo cambio en las formulaciones previamente probadas es la adición de arginina el algunas de las formulaciones. Las formulaciones OEF se describen en la Tabla 33.

Tabla 33 Formulaciones de Exenatida Transmucosal para Estudios Permeación in vitro Abreviaturas: DDPC = didecanoil L-a-fosfatidilcolina, EDTA = Edetato dihidrato de sodio, ?-ß-DC = metil^-ciclodextriña aleatorio .

Porcentaje de Permeación Estudios de permeación in vitro mostraron que las formulaciones OEF (sin DDPC y gelatina) intensificando la permeación de exendin-4 a una extensión mayor que las formulaciones de exendin-4 previamente probadas (véase formulaciones previamente probadas en la Tabla 31) mientras se proporciona viabilidad celular comparable o mejor. Los resultados de permeación que comparan las formulaciones se muestran en la Tabla 34.

Tabla 34 Resultados de Permeación in vitro para Formulaciones Exendin-4 después de 90 Minutos Estudio de Farmacocinética Un estudio de farmacocinética (PK) in vivo en conejos demostró que las formulaciones "OEF + arg" y "2x intensif + gel, arg" cuando se suministra intranasalmente produce biodisponibilidad intensificada de exendin-4, comparable a o superada que las formulaciones previamente probadas. El pico medio de la concentración de plasma exendin-4 es mayor que la formulación OEF + arg. La tabla 35 muestra una comparación de los parámetros PK medios (Tmax, AUC, ti/2 y Kel) para las formulaciones probadas. El coeficiente de varianza para cada parámetros PK se muestran en la Tabla 36, y la biodisponibilidad absoluta (%F) para cada formulación intranasal se muestra en la Tabla 37.

Tabla 35 Parámetros PK medios para Formulaciones de Exendin-4 Tabla 36 Coeficiente Medio de Variación Grupo T c AUClas, AUCinf Formulación # (min) (pg/mL) (min*pg mL) (min*pg/mL) IV 1 0.0 61 .6 46.0 52.0 ÍN Control 2 99.1 164.1 156.5 1 19.0 l x intensif + gel 3 53.5 79.8 80.3 75.8 2x intensif 4 73.8 52.6 51 .0 43.8 2x intensif+ gel 5 38.0 36.4 49.7 52.5 2x intensif+gel, arg 6 96.2 72.7 88.8 94.4 OEF + arg 7 46.5 42.7 40.2 48.4 Tabla 37 Biodisponibilidad Absoluta (%F) usando AUCúitimo Resultados para el estudio PK muestran que OEF + arg tienen % de biodisponibilidad mayor (16.6%). Otras dos formulaciones intranasales , 2x intensif y 2x intensif + gel, también tienen biodisponibilidad significantemente intensificada comparada al control IN (12.6% y 11.5%, respectivamente) .

Estudios de Farmacodinámica Un estudio in vivo en conejos proporcionó parámetros farmacodinámicos (PD) que muestran que las formulaciones "OEF + arg" y "2x intensif + gel, arg" cuando se suministra intranasalmente produce respuestas de insulina y glucosa, comparable a o superan a las formulaciones previamente descritas (véase Tabla 31) . La tabla 38 incluye parámetros PD para niveles de insulina medios (Tmax, Cmax y AUC) y la Tabla 39 muestra los niveles de glucosa medios (Tmax y Cmin) . Sorprendentemente, la formulación "2x intensif + gel, arg" provoca la respuesta PD mayor aún aunque no resulta en el incremento mayor en biodisponibilidad de exendin-4 en el estudio PK.

Tabla 38 Parámetros PD para Niveles de Insulina Después Dosificación de Formulaciones en Conejos T c AUClasl Formulación Grupo # N (min) (µ??/mL) (????*µ??/???) IV 1 3 15.0 40.2 490.3 IN Control 2 1 60.0 8.0 60.0 l x intensif + gel 3 1 5.0 8.5 1 12.5 2x intensif 4 4 21 .3 34.4 5 1 8.9 2x intensi + gel 5 2 17.5 38.5 247.5 2x intensif+gel, arg 6 2 30.0 58.5 121 1 .3 OEF + arg 7 3 16.7 38.3 513.5 Tabla 39 Parámetros para Niveles de Glucosa Después de la Dosificación de Formulaciones en Conejo Estabilidad Estudios de estabilidad acelerada muestra que las variantes de formulación "OEF" proporcionan estabilidad intensificada para exendin-4 en relación a la formulación "2x intensif+gel". La estabilidad de las formulaciones "OEF" son comparables a la de BYETTA© comercialmente disponible. Después de cuatro (4) semanas a 40°C, la pureza de las formulaciones "OEF" es 85.6 - 86.0%, mientras la pureza de "2x intensif + gel" es 83.7%. Después de cuatro (4) semanas a 50°C, la pureza de las formulaciones "OEF" es similar a BYETTA ® (72.2-72.9% contra 72.9) mientras la formulación "2x intensif + gel" han precipitado. No se observó precipitación en las formulaciones simples. En resumen, los estudios de estabilidad acelerada demostraron que el Amortiguador de acetato proporciona estabilidad física incrementada para formulaciones de exendin-4 en relación al amortiguador de tartrato. Se observó menos precipitación en formulaciones amortiguadas de acetato que en formulaciones amortiguadas de tartrato. Generalmente, los amortiguadores de mono-ionogénico (acetato, arginina, lactato) proporcionan mejor estabilidad que los amortiguadores poli-ionogénicos (tartrato, citrato) . El intervalo de pH 4.7-5.5 proporciona mejor estabilidad química para exendin-4 comparada a pH = 4.25. La arginina proporciona estabilidad química ligeramente mejorada. Además de metionina y ácido aspártico disminuyen la estabilidad química de exendin-4. La osmolalidad óptima para estabilidad química de exendin-4 es 200-250 mOsm/kg de H20. Adicionalmente , los estudios de estabilidad acelerada indican que las variantes de la formulación "OEF" proporcionan estabilidad intensificada para exendin-4 en relación a la formulación "2x intensif+gel" . La estabilidad de las formulaciones "OEF" es comparable a la de BYETTA® comercialmente disponible. A 40°C, después de cuatro semanas, la pureza de las formulaciones "OEF" es 85.8-86.0% mientras la pureza de "2x intensif +gel" es 83.7. Más dramáticamente, a 50°C, después de cuatro semanas, la pureza de las formulaciones "OEF" es comparable a BYETTA® (72.2-72.9% contra 72.9%) mientras la formulación "2x intensif + gel" ha precipitado . Aunque no se ha probado en este estudio, se advierte que los intensificadores de viscosidad se pueden agregar a las formulaciones. También se pueden incluir preservativos en las formulaciones, los cuales pueden incluir, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, metil y propil parabenos y/o clorobutanol . Ejemplos de otros preservativos previamente probados, los cuales pueden ser incluidos en las formulaciones para promover efectividad antimicrobiana incluyendo las siguientes combinaciones: 0.033% de metilparabeno + 0.017% de Propilparabeno; 0.18% de metilparabeno + 0.02% de Propilparabeno; 0.10% hasta 0.50% de clorobutanol; 0.10% hasta 0.25% de clorobutanol + 0.033% de metilparabeno + 0.017% de Propilparabeno; 0.10% hasta 0.25% de clorobutanol + 0.18% de Metilparabeno + 0.02% de Propilparabeno; 0.5% de alcohol bencílico; 0.5% de alcohol bencílico + 0.033% de metilparabeno + 0.017% propilparabeno; 0.5% de alcohol bencílico + 0.18% de metilparabeno + 0.02% de Propilparabeno; 0.5% de feniletanol + 0.1 hasta 0.25% de clorobutanol; 0.5% de feniletanol + 0.033% de Metilparabeno + 0.017% de Propilparabeno; 0.5% de feniletanol + 0.18% de Metilparabeno + 0.02% de Propiparabeno; 5 mg/ml de EDTA; 0.01-0.1% de cloruro de benzalconio; 7 mg/ml de etano; 5 mg/ml de alcohol bencílico + 2.5 mg/ml de alcohol feniletí lico .

Se pueden usar concentraciones variables de exenatida para lograr una dosis deseada, por ejemplo las concentraciones de 0.5 mg/ml hasta 6 mg/ml. Las formulaciones "OEF" y "OEF + arg" pueden proporcionar estabilidad y biodisponibilidad mejorada para otros GRP, que incluyen, pero no se limita a, otros análogos de GLP-1. Una formulación de exendin-4 para administración transmucosal con vida media incrementada, se identifican costos disminuidos de insumos y biodisponibilidad incrementada a partir de los mejoramientos OEF a la formulación. La vida media incrementada significa que el producto comercial durará más tiempo, los que permite que menos productos expire y reduciendo su fabricación. Biodisponibilidad incrementada significa eficacia y utilidad terapéutica potencialmente incrementada del producto del fármaco. También puede significar un ahorro en costos reduciendo la cantidad de API (exendin-4, GLP-1) requerido para la eficacia del producto del fármaco. La remoción de DDPC permite potencialmente mayor facilidad en aprobación del producto por la FDA ya que el DDPC es un excipiente nuevo. También disminuye el tiempo requerido para fabricación del producto. Además, el DDPC es un excipiente costoso y se eliminación significantemente reduce el costo de insumos asociados con el producto del fármaco. La eliminación de gelatina resulta en una disminución en el tiempo requerido para la fabricación del producto y también disminuye el costo de fabricación con la eliminación de un excipiente. La invención también incluye formulaciones GRP libres de preservativo Tales formulaciones no contienen un preservativo. En la ausencia de un excipiente antimicrobiano, la formulación se rellenara bajo condiciones estériles en un dispositivo de suministro libre de preservativo. Una formulación de exenatida libre de preservativo puede incluir formulaciones tales como aquellas mostradas en las Tablas 40 y 41. Las concentraciones de exenatida pueden variar de 2-12 mg/ml .

Tabla 40 Formulación Libre de Preservativo para "2x Intensificadores gelatina" Componente Concentración (mg/mL) (mM) Exenatida Depende de la potencia de formulación requerida Metil-ß ciclodextrina 80.0 - 29.4 - 30.4" L-Alfa-fosfatidilcolina didecanoil 2.0 1 .77 Edetato di sodio 5.0 6.72 Tartrato de sodio y potasio 7.566 26.81 Acido Tartárico 0.479 3.19 Gelatina 2.5 varias Agua purificada o agua estéril para CS irrigación Tabla 41 Formulación libre de Preservativo para "lx intensificadores + Gelatina" Otras modalidades pueden variar niveles de componentes intensificadores de permeación tales como los siguientes: ??-ß-CD (20 - 80 mg/ml), DDPC (0 - 2 mg/ml), E DTA (2 - 10 mg/ml), amortiguador de tartrato (0 - 30 mM) , gelatina, y cloruro de sodio. Otras modalidades pueden contener una formulación diferente: ?e-ß-?? (80 mg/ml), E DTA (5 mg/ml), arginina (2.8 ó 10 mM) y/o amortiguador de acetato (10 mM) , y cloruro de sodio con un pH de 4.9 - 5.6. Las concentraciones de estos excipientes pueden variar. Las formulaciones pueden además contener un intensificador de viscosidad tal como gelatina, hidroximetilcelulosa, carboximetilcelulosa o carbopol. Se pueden usar concentraciones variadas de exenatida para lograr una dosis deseada. Las concentraciones pueden variar de 0.5 mg/ml hasta 25 mg/ml, por ejemplo.

EJEMPLO 12 Estudio de Farmacodinámica (PD) en Dosis Única de Administración Intranasal de Proteínas que regulan la Glucosa (GRPs) en un Modelo de Rata de la Prueba de Tolerancia a la Glucosa (OGTT) Se probaron las acciones de farmacodinámica de GLP-1 (amida 7-36) y exendin-4 e glucosa sanguínea después de la instilación intranasal en un modelo de rata de la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) . Se evaluaron dos formulaciones de exendin-4 y se usó una formulación única de GLP-1. La formulación GLP-1 (en base a EDTA) (#2) contiene GLP-1 (amida 7-36) y los siguientes ingredientes: 10 mg/mL disodium EDTA; 10 mM citrate buffer, pH 3.5. The exendin-4 (EDTA-based) formulations (#2, #3, #4, and #5) contained exendin-4 and the following ingredients: 10 mg/mL EDTA de disodio y 10 mM de amortiguador de arginina, pH 4.0. Las formulaciones de exendin-4 (en base a PDF) (#6 y #7) contienen exendin-4 y los siguientes ingredientes: 45 mg/ml de ??-ß-Cd, 1 mg/ml de DDPC, 1 mg/ml de EDTA de disodio, 100 mM de sorbitol, 25 mM de lactosa, 5mg/ml de CB, y 10 mM de amortiguador de arginina, pH 4.0. Un sumario de las formulaciones probadas se muestra en la Tabla 42. El diseño de estudio y designaciones de grupo se muestran en la Tabla 43.

Tabla 42 Formulaciones usadas para Evaluar Dosificación Intranasal Exendin-4 y GLP-1 Abreviaturas: Me- -CD=metil-beta-ciclodextrina , EDTA edetato de disodio, DDPC=L-a-fosfatidilcolina didecanoil, CB=Clorobutanol .

Tabla 43 Diseño de Estudio y Designaciones de Grupo Se evaluaron farmacodinámicos monitoreando niveles de glucosa sanguínea e insulina en la sangre; se coadministró acetaminofen con glucosa para monitorear vaciado gástrico. El estudio incluye un tratamiento de dosis única en ratas ZDF de aproximadamente 11 semanas de edad (5 ratas por grupo de tratamiento) . Se condujo el OGTT como una dosis de 1 g/kg de bolo de una solución de glucosa administrada por sonda oral. Se administró acetaminofen, a una dosis de 100 mg/kg. Para propósitos de registro del tiempo el OGTT se designó como tiempo = 0 minutos. La administración de dosis para salina, GLP-1 o exendin-4 es a -10 minutos en relación al OGTT. Se evaluó la glucosa sanguínea a los siguientes puntos de tiempo: pre-OGTT (dos veces) y 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180 y 240 minutos post-OGTT. Se evaluó la insulina en sangre en los siguientes puntos de tiempo: pre-OGTT y 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, y 180 minutos post-OGTT. Se evaluó el nivel de sangre APAP en los siguientes puntos de tiempo: pre-OGTT y 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, y 180 minutos post-OGTT.

Resultados de Farmacodinámica La tabla 44 muestra resultados de armacodinámica del nivel de glucosa. Niveles de pico (Cmax) para glucosa son 70% de control en animales administrados con GLP-1; similarmente el AUC para glucosa para al estructura de tiempo de 0 hasta 60 (AUC0-60) minutos post-OGTT es 70% de control. La administración de Exendin-4 tienen efectos mínimos en Cmax (que varía de 86% hasta 99% del control) o AUC0-6o (que varía de 91% hasta 103% del control). No existe una clara respuesta a la dosis para exendin-4.

Tabla 44 Resultados de Farmacodinámica en Nivel de Glucosa para GRPs: GLP-1 y Exendin-4 La tabla 45 muestra los resultados de farmacodinámica del nivel de glucosa después de la corrección para glucosa endógena. Niveles de pico (Cmax) para glucosa son 51% de control en animales administrados con GLP-1; similarmente el AUC para glucosa para la estructura de tiempo de 0 hasta 60 (AUC0-6o) minutos post-OGTT es 46% de control, y AUCo-240 ( 0 hasta 240 minutos post-OGTT) es 88% de control. La administración de exendin-4 en las formulaciones a base de EDTA o a base de PDF tiene efectos moderados en Cmax (que varia de 73% hasta 87% del control) o AUC0-6o (que varia de 91% hasta 103% de control) . No se notó efecto mínimo para AUCo-24C que varia de 77% hasta 125% de control.

Tabla 45 Resultados de Farmacodinámica del Nivel de Glucosa (Corregidos para Glucosa Endógena) para GRPs : GLP-1 Exendin-4.

Los resultados de la respuesta a insulina (corregidos para insulina endógena) muestran que los niveles de insulina post-OGTT en animales de control son similares o ligeramente inferiores, comparados a valores post-dosis. La administración nasal de GLP-1 a 100 g/kg está asociada con hasta 2 veces incrementada en insulina de 5 hasta 45 minutos post-OGTT. Los niveles de insulina después de la dosificación de exendin-4 a 2, 10 y 20 pg/kg (formulación a base de EDTA) demostró que un incremento dependiente de la dosis en insulina con niveles de pico son aproximadamente 0.7 veces, 1.5 veces y 4 veces, respectivamente, abajo de los valores de pre-dosis para cada grupo. La respuesta se limita a aproximadamente 45 minutos post-OGTT. Después de la administración nasal de exendin-4 en la formulación a base de PDF a 2 ó 10 pg/kg dosis, niveles de pico de insulina son 1.5 veces o 2.7 veces, respectivamente, abajo de la pre-dosis. La respuesta se limita a aproximadamente 45 minutos post-OGTT.

Resultados de Vaciado Gástrico La tabla 46 muestra los resultados de acetaminofen (vaciado gástrico) . En controles, el pico de niveles de acetaminofen (Cmax) de 73 ng/ml ocurrido a 30 minutos postdosis (Tmax) . En animales administrados co GLP-1, se notó una Cmax ligeramente inferior (66 ng/ml); sin embargo, Tmax es mayor lo que sugiere y retraso en el vaciado gástrico en este nivel de dosis. La administración de exendin-4 en la formulación abase de EDTA a 2 ó 10 pg/kg o formulaciones a base de PDR a 2 ug/kg es similar al control para Tmax (30 hasta 45 minutos) y Cmax (aproximadamente 70 hasta 73 ng/ml). La administración de exedin-4 en la formación a base de EDTA a 20 pg/kg o formulaciones a base de PDF a 10 µg/kg demostró una disminución en Cmax (aproximadamente 51 hasta 54 ng/ml) y al menos para la 20 g/kg (formulación a base de EDTA) un perfil de exposición ligeramente prolongado. Los resultados sugieren que el vaciado gástrico es impactado a estos niveles de dosis .

Tabla 46 Sumario de Resultados de Acetaminofen GRP (Vaciado Gástrico) Sumario En base a los efectos farmacológicos de GLP-1 y exendin-4 con respecto a estimulación dependiente de glucosa de insulina liberada, las formulaciones intanasales a base de EDTA y a base de PDF efectivamente suministran el fármaco activo a los objetivos sistémicos. La estimulación para la insulina liberada es dependiente de la dosis. Se mostró la modulación de niveles del pico (Cmax) o exposición (AUC) para glucosa sanguínea en animales administrados con GLP-1 o exendin-4, comparado a controles. La estimulación de liberación de insulina y modulación de vaciado gástrico, por GLP-1 y exendin-4 son bases farmacológicas similares para modulación del perfil de glucosa sanguínea después de una carga de glucosa oral. La inhibición de vaciado gástrico es una acción farmacológica conocida de GLP-1 y exendin-4. El cambio en tiempo para la concentración del piso (Tmax) o concentración del pico (Cmax) para acetaminofen es consistente con la farmacología inducida por GLP-1 y exendin-4. Estos datos soportan la eficacia de las formulaciones de GLP-1 y exendin-4 descritas en estos ensayos para uso en el tratamiento de trastornos metabólicos tales como obesidad y diabetes. Aunque la invención precedente se ha descrito en detalle por medio de ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será aparente al técnico que ciertos cambios y modificaciones son comprendidas por la descripción y pueden ser practicados sin experimentación indebida del alcance de las reivindicaciones anexas, las cuales están presentadas por medio de ilustración, sin limitación.

Claims (57)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

1. Una formulación farmacéutica para suministro epitelial de péptido que regula la glucosa (GRP), caracterizada porque comprende un GRP e intensificadores de la permeabilidad, en donde los intensificadores comprenden un agente solubilizante, un agente activo de la superficie y un agente que intensifica la viscosidad.

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intensificadores incrementan la permeabilidad del GRP por al menos 10%.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intensificadores incrementan la permeabilidad del GRP por al menos 15-veces.

4. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intensificadores incrementan la biodisponibilidad de GRP por al menos aproximadamente 25-veces.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los intensificadores incrementan biodisponibilidad de GRP por al menos aproximadamente 50-veces.

6. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la biodisponibilidad de GRP es al menos aproximadamente 1% relativa a un suministro por inyección subcutánea.

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la biodisponibilidad de GRP es al menos aproximadamente 5% relativa a un suministro por inyección subcutánea.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la biodisponibilidad de GRP es al menos aproximadamente 10% relativa a un suministro por inyección subcutánea.

9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un tiempo para concentración máxima en la circulación del animal, Tmax, es menos de aproximadamente 45 minutos.

10. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un tiempo para concentración máxima en la circulación del animal, Traax, es mayor que aproximadamente 60 minutos.

11. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque un tiempo para concentración máxima en la circulación del animal, Tmax, es menos de aproximadamente 30 minutos.

12. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un agente quelante.

13. La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el agente quelante se selecciona del grupo que consiste de ácido etilen diamina tetraacético y ácido etilen glicol tetraacético .

14. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente solubili zante se selecciona del grupo que consiste de una ciclodextrina , hidroxipropil^-ciclodextrina, sulfobutiléter-ß-ciclodextrina y metil-p-ciclodextrina .

15. La formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el agente solubilizante es met??-ß-ciclodextrina .

16. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente activo de la superficie se selecciona del grupo que consiste de polioxietilenéter no iónico, ácido fusidico y sus derivados, taurodihidrofusidato sódico, didecanoil L-a-fosfatidilcolina, polisorbato 80, polisorbato 20, polietilenglicol , alcohol cetilico, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, lanolina y monooleato de sorbitán.

17. La formulación de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el agente activo de la superficie es didecanoil L-a-fosfatidilcolina .

18. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un GRP, metil- -ciclodextrina, y didecanoil L- -fosfatidilcolina .

19. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el GRP está presente a una concentración mayor de aproximadamente 50 mg/ml.

20. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el GRP está presente a una concentración de aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 50 mg/ml.

21. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el GRP está presente a una concentración de aproximadamente 0.25 hasta aproximadamente 10 mg/ml.

22. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el GRP consiste de GLP-1, análogos de GLP-1, fragmentos, o derivados.

23. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el GRP consiste de exendina-4, análogos de exendina-4, fragmentos, o derivados.

24. La formulación de conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizada porque el derivado de GRP comprende el GRP covalentemente ligado a una porción hidrofóbica .

25. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la porción hidrofóbica es una cadena álcali.

26. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la porción hidrofóbica es una cadena de ácido graso.

27. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación es una formulación no estéril.

28. La formulación de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque además comprende un preservativo seleccionado del grupo que consiste de clorobutanol , metil parabeno, propil parabeno, butil parabeno, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, benzoato de sodio, ácido sórbico, fenol y orto-, meta o para-cresol.

29. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulation es una formulación estéril.

30. La formulación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque además comprende un inhibidor de dipeptidil aminopeptidasa (DPP) IV.

31. La formulación de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el inhibidor DPP IV es lys ( 4 -nitro-Z ) -pirrólidido .

32. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque lys ( 4 -nitro-Z ) - pirrolidido está a una concentración de al menos aproximadamente 5 mM.

33. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque lys ( 4-nitro-Z ) -pirrolidido está a una concentración de al menos aproximadamente 30 mM.

34. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque lys ( -nitro-Z ) -pirrolidido está a una concentración de al menos aproximadamente 50 mM.

35. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación es adecuada para suministro intranasal de GLP-1.

36. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación tiene un pH de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6.

37. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación tiene un pH de 3.5 ± 0.50.

38. La formulación de conformidad con la reivindicación 36 o 37, caracterizada porque además comprende un amortiquador de citrato.

39. La formulación de conformidad con la reivindicación 36 o 37, caracterizada porque además comprende un amortiguador monoiontogénico .

40. Un uso de un GRP en la manufactura de un medicamento para tratar un síndrome metabólico en un mamífero, en donde el medicamento comprende una formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-39, y en donde tal medicamento comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del GRP.

41. El uso de la reivindicación 40, en donde la administración epitelial del medicamento a un mamífero incrementa los niveles de insulina del plasma.

42. El uso de la reivindicación 40, en donde la administración epitelial del medicamento a un mamífero reduce los niveles de glucosa en la sangre.

43. El uso de la reivindicación 40, en donde la administración epitelial del medicamento a un mamífero retarda el vacío gástrico.

44. Un método para tratar un síndrome metabólico, caracterizado porque comprende administrar intranasalmente a un mamífero la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el síndrome metabólico tratado se selecciona del grupo que consiste de diabetes Tipo 2, diabetes Tipo 1, tolerancia a la glucosa deteriorada, hiperglicemia, síndrome metabólico (síndrome X y/o síndrome de resistencia a la insulina), glucosuria, acidosis metabólica, artritis, cataratas, neuropatía diabética, nefropatía diabética, retinopatía diabética, cardiomiopatia diabética, obesidad, condiciones excacerbadas por obesidad, hipertensión, hiperlipidemia , aterosclerosis , osteoporosis , osteopenia, fragilidad, pérdida ósea, fractura ósea, síndrome coronario agudo, estatura corta debido a deficiencia de la hormona de crecimiento, infertilidad debido a síndrome de ovario poliquístico, ansiedad, depresión, insomnio, fatiga crónica, epilepsia, trastornos alimentacios , dolor crónico, adicción al alcohol, enfermedades asociadas con movilidad intestinal, úlceras, síndrome de intestino irritable, síndrome de intestino inflamatorio; síndrome de intestino corto; y la prevención y progreso de enfermedad en diabetes Tipos 2.

46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el síndrome metabólico tratado es diabetes tipo II.

47. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el síndrome metabólico tratado es obesidad.

48. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el síndrome metabólico tratado es hiperlipidemia .

49. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración reduce los niveles de glucosa en la sangre.

50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque dicha administración reduce los niveles de glucosa en la sangre por al menos 10%.

51. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración es post-prandial .

52. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración incrementa los niveles de insulina del plasma.

53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque dicha administración incrementa los niveles de insulina del plasma por al menos 10%.

54. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración retarda el vacio gástrico.

55. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración intranasal comprende suministrar un aerosol que comprende aproximadamente 0.3 hasta aproximadamente 30 g de GRP por kg de peso del mamífero.

56. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración intranasal comprende suministrar un aerosol que comprende 0.5 a 1.0 mg de GRP por 0.1 mi de solución.

57. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque dicha administración intranasal se da a una frecuencia de dosificación de entre 0.1 hasta 24 horas .