MX2008003552A - Proceso para la produccion de bivalirudina. - Google Patents

Abstract

La invención está relacionada con métodos de preparación de Bivalirudina de alta pureza. El polipéptido se prepara en alta pureza de al menos 98,8% (por HPLC), caracterizado porque el total de impurezas representa menos del 1,5%, y comprende no más del 0,5% [Asp9-Bivalirudina] y cada impureza representa menos del 1,0%, y preferentemente posee un grado de pureza de 99,0% por HPLC, caracterizado porque el total de impurezas representa menos del 1,0%, y comprende no más del 0,5% [Asp9-Bivalirudina] y cada impureza representa menos del 0,5%.

Description

PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE BIVALIRUDINA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un proceso mejorado para la preparación de Bivalirudina . Además, comprende Bivalirudina de alta pureza.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El procesamiento proteolitico por trombina es fundamental para el control de la coagulación sanguínea y está indicado como anticoagulante para aquéllos pacientes que padecen angina inestable sometidos a una angioplastía coronaria transluminal percutánea (PTCA, en inglés) o como anticoagulante en pacientes sometidos a una intervención coronaria percutánea. La hirudina, potencial inhibidor clínico del péptido de la trombina que se obtiene de la sanguijuela medicinal o Hirudo medicinalís, está formada por 65 aminoácidos, mientras que segmentos peptídicos con un número menor de aminoácidos han resultado ser efectivos en el tratamiento de la trombosis, un trastorno que puede ocasionar la muerte . La solicitud de Patente estadounidense n° 5,196,404 divulga, entre otras, una de estas cadenas peptídicas cortas, se trata de un potente inhibidor de la trombina, la Bivalirudina , también conocida como Hirulog-8, cuyo nombre químico es: trifluoroacetato (sal), hidrato de D-fenilal-anil-L-prolil-L-arginil-L-prolil-glicil-glicil-glicil-glicil-L-asparagil-glicil-L-aspartil-L-fenilalanil-L-glutamil-L-glutamil-L-isoleucil-L-prolil-L-glutamil-L-glutamil-L-tirosil-L-leucina . Está formada por la siguiente secuencia de aminoácidos: H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH, (SEQ ID No: 1) . Otros nombres conocidos incluyen: hirulog-8, BG-8967, Efludan, Angiomax® e Hirulog®. La Solicitud de Patente WO98/50563 describe aparentemente un método para la producción de varios péptidos, entre los que se encuentra el Hirulog, mediante tecnología recombinante . El método consiste en expresar el péptido como parte de una proteína de fusión (PF), seguido de la liberación del péptido de la PF mediante un aceptor de acilo, por ejemplo, un sulfuro que contenga un reducíante. Okayama et al. (1996, Chem Pharm. Bull. 44:1344-1350) y Steinmetzer et al. (1999, Eur. J. Biochem. 265:598-605) comprobaron la síntesis en fase sólida de diferentes Hirulogs en la resina Wang. La resina ang requiere la separación del péptido y la resina por acción de ácido trifluoroacético concentrado. En una síntesis en fase sólida de similares características para la preparación de Bivalirudina , la Solicitud de Patente PCT O91/02750 divulga aparentemente un proceso secuencial que consiste en agregar aminoácidos protegidos por BOC simple en la fase sólida de la resina BOC-L-Leucina-0-divinilbenceno, simultáneamente desproteger y desacoplar mediante sulfato HF/p-cresol/etilmetil ; liofilizar y purificar el crudo de Hirulog-8. La separación de la resina requiere en ambos casos condiciones agresivas de acidez, lo que puede ocasionar una desprotección global y concomitante del péptido y provocar reacciones colaterales indeseables con los residuos de aminoácidos, a pesar del empleo de reactivos depuradores, y afectar así la pureza del producto. La pureza del compuesto activo es un parámetro sumamente importante específicamente para productos utilizados como Ingredientes Farmacéuticamente Activos (APIs, en inglés) . Al final del proceso de producción pueden obtenerse varios grados de pureza para el mismo producto. En general, la pureza del producto dependerá de la química del proceso y de varios parámetros relacionados con el proceso de producción. En el caso de los productos peptídicos la situación es aún más complicada ya que los péptidos son moléculas complejas y sensibles. Se obtienen en procesos formados por varias etapas mediante la aplicación de una extensa variedad de materiales de partida y tienden a contaminarse por las posibles reacciones colaterales, que forman parte de la química de los péptidos. Por lo tanto, el objeto de la presente invención consiste en obtener otros métodos, especialmente métodos mejorados, de síntesis de los respectivos péptidos de Bivalirudina , que carezcan de las desventajas de los métodos conocidos en el arte previo . La producción de un producto peptídico de alta pureza es un objetivo intensamente perseguido pero difícil de alcanzar. De hecho, para lograrlo sólo pueden utilizarse procesos especialmente diseñados para producir estos productos de alta pureza. La presente invención proporciona un proceso tal para obtener Bivalirudina de alta pureza.

EXTRACTO DE LA INVENCIÓN La presente invención comprende métodos mejorados de síntesis de los péptidos de Bivalirudina que carecen de las desventajas de los métodos conocidos en el arte previo. El método de producción puede estar basado en una síntesis en fase sólida o en una combinación de síntesis en fase sólida y en solución (método híbrido) . La síntesis de la cadena peptídica puede realizarse por secuencia o mediante acoplamiento de dos o más fragmentos pequeños para formar la secuencia final de la molécula de Bivalirudina . Estos fragmentos pueden prepararse en solución o en un soporte sólido, en forma protegida o parcialmente protegida, o desprotegida. El acoplamiento de los fragmentos puede realizarse mediante la activación del grupo carboxilo de un fragmento peptidico (extremo C-terminal) a otro fragmento (extremo N-terminal) a través de un reactivo de acoplamiento adecuado u otro método adecuado como el acoplamiento mediante un éster activo. Finalizada la síntesis, se remueven los grupos de protección de la cadena lateral y se purifica el péptido mediante algún método adecuado, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, en inglés) preparativa, hasta alcanzar un elevado nivel de pureza. En una realización ejemplar, se proporciona un proceso para la preparación de Bivalirudina que comprende (a) preparar la secuencia peptídica de Bivalirudina en una resina hiperlábil en medio ácido, donde el péptido contiene aminoácidos adecuadamente protegidos; (b) tratar el péptido de Bivalirudina acoplado a la resina con una solución ácida para obtener un péptido crudo desprotegido o semi-protegido libre de resina; (c) en el caso de un péptido crudo semi-protegido, remover los grupos protectores restantes; y (d) recuperar el péptido crudo de Bivalirudina. Preferentemente, el péptido crudo de Bivalirudina se purifica posteriormente .

En la realización ejemplar particularmente de preferencia de la presente invención, la secuencia peptidica de Bivalirudina adecuadamente protegida contiene residuos del grupo -amino protegidos por Fmoc mientras que otros residuos funcionales de los aminoácidos están protegidos por grupos protectores adecuados, estables en medio ácido. En otra realización ejemplar, el proceso de preparación de Bivalirudina comprende: preparación de un fragmento peptidico A protegido, extremo N-terminal, de Bivalirudina, preferentemente [Xa-D- Phe-Pro-Arg (X) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (X) -Gly-OH] (SEQ ID No: donde Xa es un grupo protector de a-amino adecuado, preferentemente BOC o FMOC, y X es un grupo protector adecuado, preferentemente Pbf para Arg y tBu o Trt para otros residuos; dicho fragmento A se prepara en una resina hiperlábil en medio ácido y posteriormente se separa la forma protegida mediante tratamiento en condiciones levemente ácidas, y opcionalmente se lo aisla; preparación de un fragmento B protegido de Bivalirudina, preferentemente [FMOC-Asp (X) -Phe-Glu (X) -Glu (X) -Ile-Pro- Glu (X) -Glu (X) -Tyr (X) -OH] (SEQ ID No: 3) - o FMOC-FRAGMENTO B, donde X es un grupo protector adecuado, preferentemente Trt; dicho fragmento B se prepara en una resina hiperlábil en medio ácido y posteriormente se separa la forma protegida mediante tratamiento en condiciones levemente ácidas, y opcionalmente se lo aisla; El acoplamiento del fragmento B con Leu-OtBu para formar un fragmento B elongado; La desprotección del grupo protector de a-amino del fragmento B elongado; El acoplamiento del fragmento A con el fragmento B elongado obtenido previamente en el paso (d) ; La eliminación de los restantes grupos protectores del péptido con un tratamiento en solución fuertemente ácida. Opcionalmente el crudo de Bivalirudina es aislado y purificado para obtener Bivalirudina de alta pureza y de alto rendimiento.

En otra realización ejemplar, se proporciona Bivalirudina de alta pureza con un grado de pureza de al menos 98,5%, preferentemente un grado de pureza de al menos 99,0%. En otra realización ejemplar, se proporciona una composición farmacéutica que comprende Bivalirudina de alta pureza con un grado de pureza de al menos 98,5% y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización ejemplar, se proporciona un método para preparar una composición farmacéutica que comprende Bivalirudina con un grado de pureza de al menos 98,5% que consiste en preparar Bivalirudina, ya sea en fragmentos o en su totalidad en una resina hiperlábil en medio ácido, y combinar Bivalirudina de alta pureza con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización ejemplar, se proporciona un método para tratar a los pacientes que lo necesiten que consiste en administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende Bivalirudina con un grado de pureza de al menos 98,5% y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención comprende métodos para la producción de Bivalirudina de alta pureza. Más específicamente, la invención comprende métodos para la producción de Bivalirudina en una forma tal que el péptido preparado y purificado es un péptido de alta pureza.

El término "alta pureza", utilizado en la presente, se refiere a una composición con un grado de pureza de al menos 98,5%.

Además, el término % de pureza, utilizado en la presente, se refiere al % de pureza del péptido con respecto al porcentual en peso . Una de las ventajas del proceso de la presente invención es que los pasos de síntesis se realizan en condiciones leves, lo que proporciona un bajo contenido de sub-productos y por lo tanto, alto rendimiento y alto grado de pureza en el producto final del péptido de Bivalirudina . Otra ventaja es que se utilizan aminoácidos protegidos disponibles regularmente en el comercio. Los péptidos sintetizados por alguno de los procesos de la invención están preparados mediante síntesis en fase sólida con una resina hiperlábil en medio ácido, extremadamente lábil en medio ácido o superlábil en medio ácido. Ejemplos de resinas hiperlábiles en medios ácidos están comprendidos en el estado de la técnica y se describen y se hace referencia a ellos en Bodanszky et al., Principies of Peptide Synthesis, 2nd ed., Springer Verlag Berlín Heidelberg 1989. Algunos ejemplos son: 2-Cl-Trt-Cl resin®, HMPB-BHA resin®, Rink acid resin®, o NovaSyn TGT alcohol resin®. Las resinas hiperlábiles en medios ácidos utilizadas en el método de la presente invención permiten la separación del péptido sintetizado en condiciones levemente ácidas, ya que la unión de un péptido con dicha resina es susceptible de separación en condiciones levemente ácidas. De esta manera, una resina hiperlábil en medio ácido adecuada para preparar el péptido de Bivalirudina de acuerdo a la invención puede ser seleccionada del grupo formado por 2-Cl-Trt-Cl resin®, HMPB-BHA resin®, Rink acid resin®, o NovaSyn TGT alcohol resin®. En una realización de preferencia, la resina hiperlábil en medio ácido utilizada en el proceso de la invención es 2-Cl-Trt-Cl Debido a la labilidad en medio ácido del conjunto en fase sólida, la estrategia de síntesis emplea la química Fmoc para realizar las reacciones de acoplamiento durante la síntesis en fase sólida, mientras que solamente el residuo D-Phe terminal puede estar protegido por Boc o Fmoc. En una realización ejemplar de preferencia de la presente invención, se utiliza la protección Fmoc y puede ser eliminada del péptido que permanece en la resina, mediante tratamiento standard con, p. ej . , 20% de piperidina u otro reactivo básico desprotector de Fmoc conocido en el estado de la técnica para separar el conjugado péptido-resina. Dichos reactivos básicos desprotectores de Fmoc incluyen, por ejemplo, una solución diluida de TFA en DCM, preferentemente del 0,5% al 10% de TFA en DCM (vol/vol), más preferentemente del 1% al 5% de TFA en DCM (vol/vol) , aún más preferentemente del 1% al 2% de TFA en DCM (vol/vol) , de óptima preferencia 2% de TFA en DCM (vol/vol), o una solución de ácido acético en DCM y Trifluoroetanol . El primer aminoácido se adhiere a la resina a través de un enlace de éster altamente lábil en medio ácido mientras que otros residuos de aminoácidos funcionales, distintos al grupo a-amino, están protegidos por grupos protectores más estables que no se separan o desprotegen en las condiciones requeridas para la separación del péptido y la resina. Dichos aminoácidos mult ifuncionales están protegidos por un grupo protector fuertemente lábil en medio ácido en los grupos funcionales distintos al grupo a-amino. Los grupos protectores estables en medio ácido más utilizados en residuos funcionales de los restantes aminoácidos incluyen, entre otros, Pbf, tBu, Trt, y Boc, preferentemente Pbf para residuos de Arg y tBu, Trt y Boc para los residuos de los restantes aminoácidos. Luego de completar la síntesis de la secuencia de Bivalirudina , los grupos protectores son removidos mediante algún método convencional. Por ejemplo, un método puede ser, entre otros, un cocktail a base de TFA que contiene además de TFA distintos depuradores como EDT, DDM, fenol, tioanisol, y agua. El desacoplamiento del péptido o de fragmentos peptídicos, de acuerdo con la presente invención, de la resina y la desprotección del péptido o de fragmentos peptídicos de sus grupos protectores puede realizarse en un proceso de un solo paso . Según se lo utiliza en la presente, el término solución fuertemente ácida se refiere a una solución de un ácido que está completa o casi completamente disociado. Los ácidos leves o débiles no reaccionan de esta manera. Los ácidos fuertes utilizados en la presente tienen generalmente un pKa inferior a 1, preferentemente inferior a 0,5.

El péptido final es purificado mediante métodos adecuados para obtener un péptido de alta pureza. Preferentemente, la purificación se realiza mediante HPLC de fase reversa (RP-HPLC) .

A los efectos de proporcionar claridad y como referencia en la comprensión de la invención, según se divulga y reivindica en la presente, los siguientes términos y abreviaturas se definen de la siguiente manera: AA - Aminoácido ACN - acetonitrilo Boc - t-But iloxicarbonilo BOP - Benzotriazol-l-il-oxi-tris (dimetilamino) fosfonio hexafluorofosfato Bzl - bencilo Cbz - benciloxicarbonilo DBU - 1, 8-Diazabiciclo [5. .0] undec-7-eno DCM - diclorometano DCC - N, N ' -Diciclohexilcarbodiimida DIC - 1 , 3-Diisopropilcarbodiimida DDM dodecilmercaptano DIPEA- diisopropiletilamina DMF - dimetilformamida EDT - etaneditiol Fmoc - 9-fluorenilmetoxicarbonilo HBTU - 2- ( lH-Benzotriazol-l-il ) -1 , 1 , 3 , 3-tetrametiluronio hexafluorofosfato HOBt - N-hidroxibenzotriazol MTBE - Éter Metil tert-but ilico Pbf - pentametildihidrobenzofuransulfonilo PyBOP- Benzotriazol-l-il-oxi-tris- (pirrolidina ) -fosfonio hexafluorofosfato SPPS - síntesis de péptido en fase sólida TBTU - O-Benzotriazol-l-il-1, 1, 3, 3-tetrametiluronio tetrafluoroborato tBu - éster tert-Butílico TFA - ácido trifluoroacético TIS - triisopropilsilano Trt - trifilo Él término péptido semi-protegido se utiliza en la presente para describir un péptido que está desprotegido salvo por la presencia de al menos uno pero no todos los restantes grupos protectores. Preferentemente, un péptido semi- protegido es un péptido desprotegido salvo por la presencia del restante grupo protector de a-amino terminal N. En una realización ejemplar de la presente invención, se proporciona un método para preparar Bivalirudina de alta pureza que comprende los siguientes pasos: La preparación de una secuencia peptidica de Bivalirudina en una resina hiperlábil en medio ácido, donde el péptido contiene residuos adecuadamente protegidos; La remoción del péptido protegido de la resina mediante una solución ácida que contiene al menos un agente depurador, para obtener un péptido crudo de Bivalirudina desprotegido o semi-protegido; El aislamiento del péptido crudo de Bivalirudina desprotegido o semi-protegido de la solución de separación mediante precipitación u otra técnica que resulte adecuada, y en caso de ser un péptido crudo de Bivalirudina semi-protegido, remover los grupos protectores restantes del péptido crudo de Bivalirudina semi-protegido, para obtener un péptido crudo de Bivalirudina desprotegido; y La purificación del péptido crudo de Bivalirudina mediante un método adecuado para obtener el producto final de Bivalirudina .

Preferentemente, el producto obtenido de Bivalirudina se seca para obtener un péptido final de Bivalirudina seco de alta pureza. Preferentemente, el secado del producto de Bivalirudina comprende liofilización . Además, el péptido de Bivalirudina resultante preferentemente tiene un grado de pureza de al menos 98,5%, más preferentemente de al menos 99,0%.

Preferentemente, se aisla el péptido crudo, por ejemplo, mediante precipitación, cristalización, extracción o cromatografía, para producir un péptido crudo aislado. El aislamiento del crudo de Bivalirudina desprotegido o semi-protegido como se explica en el paso (d) se lleva a cabo preferentemente mediante precipitación del material peptídico. La precipitación de un péptido crudo comprende la utilización de un solvente o combinaciones de solventes que disuelvan las impurezas y los subproductos, mientras se realiza la precipitación del péptido. Algunos ejemplos pueden ser, entre otros, éter alquilo C4 a C8, más preferentemente dietiléter o MTBE, más preferentemente MTBE. Preferentemente, la purificación del crudo de Bivalirudina consiste en la purificación por cromatografía para obtener una solución peptídica que comprende un péptido de Bivalirudina de alta pureza y el secado de la solución peptídica para obtener Bivalirudina de alta pureza. Preferentemente, el secado de la solución peptídica para obtener Bivalirudina de alta pureza se realiza mediante liofilización . En otra realización ejemplar de la presente invención, el método para preparar Bivalirudina de alta pureza comprende los siguientes pasos. En esta modalidad, se preparan y posteriormente se acoplan al menos dos fragmentos del péptido de Bivalirudina para obtener Bivalirudina. El proceso comprende los siguientes pasos: La preparación de un fragmento A protegido, de extremo N-terminal, de Bivalirudina en una resina hiperlábil en medio ácido y un fragmento B de Bivalirudina en una resina hiperlábil en medio ácido, donde los péptidos contienen residuos adecuadamente protegidos y al menos el grupo -amino del fragmento B está protegido por el grupo protector Fmoc; La remoción de ambos péptidos de sus respectivas resinas para formar un fragmento A protegido y un fragmento B protegido con una solución de separación adecuada; El acoplamiento del fragmento B protegido con Leu-OtBu para formar un fragmento B elongado; La desprotección del grupo a-amino protegido con Fmoc del fragmento B elongado mediante tratamiento con una solución básica adecuada; El acoplamiento del fragmento A protegido con el fragmento B elongado en una solución mediante un método adecuado; La desprotección de los restantes grupos protectores lábiles en medio ácido del péptido protegido mediante tratamiento con una solución ácida adecuada que contiene al menos un depurador; y La purificación del péptido crudo de Bivalirudina mediante un método adecuado para obtener el producto Bivalirudina de alta pureza, donde los fragmentos A y B juntos forman la secuencia peptídica D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe- Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-OH (SEQ ID No: 4) . Además, los fragmentos A y B luego de la separación de la resina hiperlábil en medio ácido, el fragmento B elongado desprotegido de Fmoc y el péptido crudo de Bivalirudina son aislados preferentemente en fragmentos A y B, y el crudo de Bivalirudina antes de su utilización en un paso posterior del proceso de la invención. El proceso de aislamiento opcional de los fragmentos A y B, y el crudo de Bivalirudina del proceso de la invención preferentemente comprende precipitación en un éter, de preferencia un éter alquilo inferior (C4 a C8) , más preferentemente TBE. Preferentemente, la solución fuertemente ácida para desproteger los restantes grupos protectores del polipéptido combinado del paso (f) comprende un ácido fuerte y al menos un depurador. Preferentemente, la purificación del péptido crudo de Bivalirudina comprende una cromatografía, de preferencia HPLC, y el secado de la solución peptídica para obtener Bivalirudina de alta pureza, preferentemente mediante liofilización . El proceso para preparar Bivalirudina puede también comprender la purificación del péptido de Bivalirudina semi-protegido obtenido del acoplamiento del paso (e) antes de la desprotección del paso (f) . Este proceso para preparar Bivalirudina puede comprender además la purificación del péptido de Bivalirudina semi-protegido que posee un grupo protector de a-amino y la separación de dicho grupo protector de -amino antes de la purificación del péptido crudo de Bivalirudina del paso (g) . Preferentemente, en el proceso anterior, la resina hiperlábil en medio ácido utilizada para preparar cada uno de los fragmentos A y B se selecciona del grupo formado por 2-Cl-Trt-Cl resin®, HMPB-BHA resin®, Rink acid resin®, y NovaSyn TGT alcohol resin®. En una realización ejemplar, la resina hiperlábil en medio ácido es 2-Cl-Trt-Cl . El grado de pureza del péptido de Bivalirudina obtenido de acuerdo al proceso de la presente invención es de al menos 98,5% según mediciones por HPLC. Preferentemente, el grado de pureza del péptido de Bivalirudina obtenido es de al menos 99% según mediciones por HPLC. En el método de la presente invención los Fragmentos A y B juntos forman la secuencia peptidica D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-OH (SEQ ID No: 4) . El Fragmento A comprende la secuencia N-terminal D-Phe-(AA)n de la anterior secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 4, donde n es un número entero entre 1 y 17, preferentemente entre 3 y 15, más preferentemente entre 5 y 12, de óptima preferencia entre 8 y 10. El Fragmento B es una secuencia que comprende los restantes aminoácidos que complementan el fragmento A para formar una secuencia completa de aminoácidos de SEQ ID No: 4, donde el fragmento B tiene una secuencia de (AA) m-Tyr-OH, donde m es un número entero entre 0 y 16, preferentemente entre 2 y 14, más preferentemente entre 5 y 12, de mayor preferencia entre 7 y 9. Los grupos protectores adecuados para el residuo terminal de a-aminoácido incluyen, entre otros, 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) y BOC . Un grupo protector de preferencia para residuos terminales de aminoácidos del fragmento B es Fmoc. Otros residuos funcionales en los aminoácidos para utilizar en la síntesis de Bivalirudina están protegidos con grupos protectores adecuados que incluyen, entre otros, Pbf, tBu, Trt, y Boc, preferentemente Pbf para los residuos de Arg, y los grupos protectores tBu y Trt para los residuos que contienen hidroxilo y carboxilo. El fragmento A protegido de preferencia tiene la secuencia [Xa -D-Phe-Pro-Arg ( Pbf ) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt ) -Gly-OH] (SEQ ID No:2), donde Xa representa un grupo protector Boc o Fmoc. El fragmento B protegido de preferencia tiene la secuencia [Fmoc-Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -OH] (SEQ ID No:3) . Los fragmentos peptídicos A y B son removidos de sus respectivas resinas hiperlábiles en medio ácido mediante una solución de separación adecuada. Las soluciones de separación adecuadas son soluciones levemente ácidas que comprenden, por ejemplo, una solución diluida de ácido trifluoroacético (TFA) en DCM, o una solución de ácido Acético en DCM y Trifluoroetanol . La solución levemente ácida de preferencia es un solución de TFA en una concentración de aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 10% vol/vol en DCM, más preferentemente una solución de TFA a una concentración de aproximadamente 1% hasta aproximadamente 5% vol/vol en DCM, aún más preferentemente 1% de TFA hasta 2% de TFA en DCM (vol/vol), de óptima preferencia 2% de TFA en DCM (vol/vol), o una solución de ácido acético en DCM y Trifluoroetanol . La solución ácida resultante debe ser neutralizada inmediatamente por cantidades equivalentes de una base adecuada. Una base adecuada es toda base capaz de neutralizar la solución ácida, sin remover el grupo protector lábil en medio básico. Preferentemente, pueden utilizarse DIPEA o colidina. La preparación del péptido de Bivalirudina o de un fragmento del mismo en una resina hiperlábil en medio ácido según el método de la presente invención puede realizarse mediante métodos conocidos de elongación de la cadena peptidica en una resina en estado sólido. Preferentemente, la síntesis de la secuencia peptidica se realiza mediante el método gradual de síntesis peptidica en fase sólida (SPPS, en inglés) de Fmoc que consiste en agregar el primer aminoácido protegido por Fmoc en la resina hiperlábil en medio ácido, preferentemente la resina es 2-Cl-Trt-Cl. Lavar la resina y remover el grupo protector Fmoc mediante tratamiento con una solución básica, preferentemente una solución de 20% de piperidina en DMF. Lavar para remover los reactivos residuales e introducir el segundo aminoácido protegido por Fmoc para comenzar el primer paso de acoplamiento. El aminoácido protegido por Fmoc se activa preferentemente in-situ, utilizando un agente de acoplamiento, preferentemente TBTU/HOBt (N-hidroxibenzotriazol ) y se acopla posteriormente a la resina en presencia de una base orgánica, preferentemente Diisopropilet ilamina . Lavar la resina y remover el grupo protector Fmoc del grupo a-amino mediante tratamiento con una solución básica, preferentemente una solución de 20% de piperidina en DMF. Estos pasos se repiten para cada aminoácido adicional de la secuencia peptidica. Preferentemente, agregar el primer aminoácido protegido por Fmoc comprende agitar la resina hiperlábil en medio ácido con una solución de un aminoácido protegido por Fmoc en un solvente orgánico, preferentemente DMF, en presencia de un agente de acoplamiento. Además, en las reacciones de acoplamiento se utilizan preferentemente tres equivalentes de los aminoácidos activados. La adición de aminoácidos al fragmento peptidico o al acoplamiento de los fragmentos A y B en el método de la presente invención utiliza preferentemente agentes de acoplamiento. Los agentes de acoplamiento adecuados incluyen, entre otros, 2-(lH-benzotriazol-l-il ) -1,1,3, 3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU) , DCC, DIC, HBTU , BOP, o PyBOP. El acoplamiento de un péptido protegido con un compuesto amino se lleva a cabo preferentemente en un solvente de acoplamiento. Los solventes no alcohólicos pueden utilizarse como solventes de acoplamiento con la condición de que el solvente permanezca inerte en la reacción de acoplamiento. Preferentemente, el solvente de acoplamiento se selecciona del grupo formado por DMF, DMSO, DMA, NMP, DCM, y dioxano, más preferentemente el solvente de acoplamiento es DMF. El solvente de acoplamiento también puede contener una base orgánica, preferentemente, diisopropilet ilamina (DIPEA) o Colidina. El grupo carboxilico del péptido protegido puede ser activado mediante un método adecuado ya sea in-situ o antes de la introducción del compuesto amino en la mezcla de la reacción. Además, en cada paso del proceso de preparación de Bivalirudina en el cual se lleva a cabo una reacción química, por ejemplo, una reacción de acoplamiento, se incluye preferentemente un paso de lavado para remover los materiales que no reaccionaron y otros subproductos. Solventes adecuados para utilizar en los pasos de lavado del método de la presente invención son los solventes bipolares que no interactúan con el péptido o la resina. El agua no es un solvente de lavado adecuado ya que produce la hidrólisis parcial del péptido e interactúa con la resina. Los solventes de preferencia para los pasos de lavado incluyen, entre otros, dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), metanol (MeOH) , o isopropanol (IPA) .

El grupo protector Fmoc de residuos terminales de aminoácidos se remueve mediante un método conocido utilizando soluciones básicas adecuadas, tales como una reacción con una solución de piperidina en DMF. Otras soluciones básicas adecuadas incluyen, entre otras, soluciones de DBU, DBU/piperidina , y dietilamina en un solvente inerte. La desprotección de los grupos protectores lábiles en medio ácido del péptido puede realizarse mediante la adición de una solución fuertemente ácida. La solución fuertemente ácida comprende preferentemente un ácido, tal como TFA, TFMSA, HBr/AcOH, y HF, al menos un reactivo depurador que puede ser, entre otros, etaneditiol (EDT) , tioanisol, TIS, DDM, fenol, y m-cresol, y agua. El coeficiente relativo de material ácido a depurador a agua en la solución fuertemente ácida utilizada en la presente invención preferentemente comprende desde aproximadamente 85% hasta aproximadamente 99% de ácido, desde aproximadamente 0,1% hasta aproximadamente 15% de depurador, y desde aproximadamente 0,1% hasta 15% de agua por peso. La solución fuertemente ácida de preferencia comprende aproximadamente 95% de TFA, aproximadamente 2,5% de EDT, y aproximadamente 2,5% de agua por peso . El péptido crudo de Bivalirudina puede ser purificado mediante cualquier método conocido. Preferentemente, el péptido se purifica mediante HPLC en columna de fase reversa (RP) . El método de preferencia para purificar el péptido crudo de Bivalirudina comprende un sistema de HPLC con columna de C18 de fase reversa. El producto purificado resultante preferentemente se seca, y se liofiliza. La Bivalirudina de alta pureza obtenida tiene un grado de pureza de al menos 98,5%, según mediciones por HPLC, donde el total de impurezas representa menos del 1,5%, según mediciones por HPLC, y comprende no más del 0,5% según mediciones por HPLC [Asp9-Bivalirudina] y cada impureza representa menos del 0,5% según mediciones por HPLC. Preferentemente, la Bivalirudina de alta pureza tiene un grado de pureza de 99,0% según mediciones por HPLC, donde el total de impurezas representa menos del 1,0% según mediciones por HPLC, y comprende no más del 0,5% [Asp9-Bivalirudina ] según mediciones por HPLC y cada impureza representa preferentemente menos del 0,5%, según mediciones por HPLC. Un método adecuado para determinar el grado de pureza del péptido de Bivalirudina incluye, entre otros, la HPLC. El método de preferencia para determinar el grado de pureza del péptido de Bivalirudina comprende un sistema de HPLC con columna de C12 de fase reversa, donde el péptido eluye con pendiente de TFA en agua/acetonitrilo . En otra realización ejemplar de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende Bivalirudina de alta pureza con un grado de pureza de al menos 98,5% aproximadamente según mediciones por HPLC y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, en otra realización ejemplar de la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición farmacéutica que comprende Bivalirudina con un grado de pureza de al menos 98,5% según mediciones por HPLC, que consiste en preparar Bivalirudina de alta pureza, ya sea en fragmentos o en su totalidad en una resina hiperlábil en medio ácido, y combinar la Bivalirudina de alta pureza con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención contienen Bivalirudina de alta pureza. La bivalirudina de alta pureza preparada mediante los procesos de la presente invención es ideal para las formulaciones farmacéuticas. Además del/ de los ingrediente/s activo/s, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes se agregan a la composición para una variedad de propósitos . Los diluyentes incrementan el tamaño de una composición farmacéutica en estado sólido, y simplifican la manipulación de la forma farmacéutica de dosificación que contiene a la composición, tanto para el paciente como para el profesional a cargo. Los diluyentes para las composiciones en estado sólido incluyen, por ejemplo, celulosa microcristalina (p. ej .

Avicel®) , celulosa microfina, lactosa, almidón, almidón pregelatinizado, carbonato de calcio, sulfato de calcio, azúcar, dextratos, dextrina, dextrosa, fosfato dibásico de calcio dihidratado, fosfato tribásico de calcio, caolín, carbonato de magnesio, óxido de magnesio, maltodextrina , manitol, polimetacrilatos (como Eudragit®, cloruro de potasio, celulosa en polvo, cloruro de sodio, sorbitol, y talco. Las composiciones farmacéuticas en estado sólido que se compactan en una forma de dosificación, como una tableta, pueden incluir excipientes cuyas funciones incluyen permitir la aglutinación del ingrediente activo con los excipientes después de la compresión. Los aglutinantes de composiciones farmacéuticas en estado sólido incluyen acacia, ácido algínico, carbomer (como carbopol), carboximet ilcelulosa de sodio, dextrina, celulosa etílica, gelatina, goma guar, aceite vegetal hidrogenado, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa (como Klucel®) , hidroxipropilmet il celulosa (como ethocel®) , glucosa líquida, silicato de aluminio y magnesio, maltodextrina, metilcelulosa, polimetacrilatos, povidona (como Kollidon®, Plasdone®) , almidón pregelatinizado, alginato de sodio, y almidón. La solubilidad de una composición farmacéutica compacta en estado sólido en el estómago del paciente puede incrementarse mediante el agregado de un desintegrante. Los desintegrantes incluyen ácido algínico, carboximet ilcelulosa cálcica, carboximetilcelulosa sódica (como Ac Di Sol®, Primellose®) , dióxido de silicio coloidal, croscaramelosa sódica, crospovidona (como Kollidon®, Polyplasdone®) , goma guar, silicato de aluminio y magnesio, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polacrilina potásica, celulosa en polvo, almidón pregelatinizado, alginato sódico, glicolato sódico de almidón (como Explotab®) , y almidón. Agentes deslizantes (glidantes) pueden agregarse para mejorar la fluidez de una composición en estado sólido no compactada y mejorar la precisión de la dosificación. Los excipientes que funcionan como deslizantes incluyen dióxido de silicio coloidal, trisilicato de magnesio, celulosa en polvo, almidón, talco, y fosfato tribásico de calcio. Para obtener una forma de dosificación como las tabletas, mediante compresión de una composición en polvo, la composición se manipula mediante la presión de herramientas, como punzones y matrices. Algunos excipientes e ingredientes activos tienden a adherirse a la superficie del punzón o la matriz, lo que puede ocasionar que el producto presente cavidades y otras irregularidades. Se puede agregar a la composición lubricantes para reducir la adhesión y facilitar la liberación del producto de la matriz. Los lubricantes incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, monoestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerilo, aceite de castor hidrogenado, aceite vegetal hidrogenado, aceite mineral, polietilenglicol , benzoato de sodio, lauril sulfato de sodio, estearil fumarato de sodio, ácido esteárico, talco, y estearato de zinc. Los agentes saborizantes y realzadores de sabor mejoran la percepción en el paladar del paciente. Los agentes saborizantes y potenciadores más comunes para los productos farmacéuticos que pueden incluirse en la composición de la presente invención incluyen maltol, vainillina, etilvainillina, mentol, ácido cítrico, ácido fumárico, etilmaltol y ácido tartárico. Las composiciones en estado sólido y líquido también pueden teñirse mediante colorantes farmacéuticamente aceptables para mejorar la apariencia y/o facilitar al paciente la identificación del producto y de la unidad de dosificación. En las composiciones farmacéuticas en estado líquido de la presente invención, la Bivalirudina de alta pureza y demás excipientes en estado sólido están disueltos o suspendidos en un portador en estado líquido, como agua, aceite vegetal, alcohol, polietilenglicol, propileneglicol , o glicerina. Las composiciones farmacéuticas en estado líquido pueden contener agentes emulsionantes para dispersar de manera uniforme en la composición el ingrediente activo o algún excipiente indisoluble en el portador líquido. Los agentes emulsionantes de la presente invención incluyen, entre otros, gelatina, yema de huevo, caseína, colesterol, acacia, tragacanto, chondrus, pectina, metilcelulosa , carbomer, alcohol cetoestearílico, y alcohol cetilico . Las composiciones farmacéuticas en estado liquido de la presente invención pueden contener agentes viscosantes para mejorar la percepción del producto en la boca y/o proteger el revestimiento del tracto gastrointestinal. Tales agentes incluyen acacia, bentonita ácido alginico, carbomer, carboximetilcelulosa cálcica o sódica, alcohol cetoestearilico, metilcelulosa, etilcelulosa, gelatina goma guar, hidroxietilcelulosa , hidroxipropilcelulosa , hidroxipropilmetilcelulosa, maltodextrina , alcohol polivinilico, povidona, carbonato de propileno, alginato de propilenglicol , alginato de sodio, glicolato sódico de almidón, almidón tragacanto, y goma xantana. Los agentes edulcorantes tales como sorbitol, sacarina, sacarina de sodio, sacarosa, aspartame, fructosa, manitol, y azúcar invertido pueden agregarse para mejorar el sabor. Agentes conservantes y quelantes como alcohol, benzoato de sodio, hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, y ácido tetracético de etilendiamina pueden agregarse en cantidades seguras para la ingestión para brindar condiciones más estables de almacenamiento. Según la presente invención, una composición en estado liquido también puede contener agentes amortiguantes como ácido glucónico, ácido láctico, ácido cítrico o ácido acético, gluconato de sodio, lactato de sodio, citrato de sodio o acetato de sodio. La elección de los excipientes y las cantidades que deben usarse serán determinadas fácilmente por el científico sobre la base de la experiencia y la consideración de procedimientos standard y material de referencia en la materia. Las composiciones en estado sólido de la presente invención incluyen polvos, granulados, agregados y composiciones compactas. La dosificación incluye formas adecuadas para la administración por vía oral, bucal, rectal, parenteral (incluidas la vía subcutánea, intramuscular, e intravenosa), y por inhalación. A pesar de que la forma de administración más adecuada dependerá en cada caso de la naturaleza y gravedad del trastorno sometido a tratamiento, a los efectos de la presente invención es conveniente la vía parenteral. Las formas de dosificación pueden presentarse en unidades y prepararse mediante métodos conocidos en el estado de la técnica farmacéutica. Las formas de dosificación pueden ser sólidas como tabletas, polvos, preferentemente composiciones en polvo liofilizadas , cápsulas, supositorios, sobres, pastillas y comprimidos, o líquidas, como jarabes, suspensiones y elíxires. La forma de dosificación de la presente invención puede ser una cápsula que contenga la composición, preferentemente una composición de la presente invención, en estado sólido, en polvo o gránulos, con una capa externa dura o blanda. La capa externa puede ser de gelatina, y, opcionalmente , puede contener un agente plastificador , como glicerina y sorbitol, y un agente opacificante o colorante. El ingrediente activo y los excipientes pueden elaborarse en composiciones y formas de dosificación de acuerdo con métodos conocidos en el estado de la técnica. La dosificación de las composiciones farmacéuticamente aceptables descriptas en la Patente de Invención de Estados Unidos de América N° 5,196,404 puede utilizarse como referencia. Una composición que deba elaborarse en forma de tabletas o relleno de cápsulas puede prepararse mediante a granulación húmeda. En la granulación húmeda, algunos o todos los ingredientes activos y excipientes en polvo se combinan, y luego se mezclan en presencia de un liquido, generalmente agua, para provocar la formación de gránulos. Los gránulos se tamizan y/o muelen, se secan, y finalmente se tamizan y/o muelen hasta obtener el tamaño deseado de las partículas. Con los gránulos se elaborarán finalmente las tabletas o bien, antes del tableteado, se pueden agregar otros excipientes, como agentes glidantes y/o lubricantes. Una composición que deba elaborarse en forma de tableta puede prepararse convencionalmente mediante granulación seca. Por ejemplo, la composición que se obtiene de mezclar los componentes activos y excipientes se puede compactar en una lámina o placa, y luego se puede comprimir en gránulos. Los gránulos compactos se pueden finalmente comprimir hasta el tamaño de una tableta. Como método alternativo de la granulación seca, la mezcla se puede someter a técnicas de compresión directa para obtener una forma de dosificación compacta. La compresión directa permite obtener una tableta más uniforme y sin gránulos. Los excipientes adecuados para la compresión directa de tabletas son celulosa microcristalina , lactosa secada por atomización, fosfato dicálcico dihidratado, y sílice coloidal. El uso adecuado de estos y otros excipientes para compresión directa resulta conocido para la persona con experiencia y habilidad en los desafíos que plantea la compresión directa de tabletas. El relleno de una cápsula que contenga la presente invención puede incluir cualquiera de las mezclas y gránulos mencionados anteriormente con referencia a las tabletas; sin embargo, no estará sujeto al paso final de elaboración en forma de tableta (tableteado) . La dosificación de preferencia es una solución para infusión que se administra en una dosis intravenosa en bolus o por infusión. Cuando se administra una dosis intravenosa en bolus la dosis de preferencia es aproximadamente 0,75 mg/kg. La dosis de preferencia para infusiones es de 1,75 mg/kg/h. En otra realización ejemplar de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento a los pacientes que lo necesiten que consiste en administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene Bivalirudina de alta pureza con un grado de pureza de al menos 98,5% aproximadamente, según mediciones por HPLC, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Preferentemente, el método consiste en administrar un anticoagulante a pacientes con angina inestable sometidos a una angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA, en inglés) o pacientes sometidos a una intervención coronaria percutánea. La invención se ha descripto con referencia a ciertas incorporaciones ejemplares de preferencia; sin embargo, otras incorporaciones resultarán aparentes de la consideración de las especificaciones para la persona con conocimiento en el estado de la técnica. Las referencias al arte previo incluidas en la solicitud de patente se incorporan a la presente por vía de referencia. La invención se define además por referencia a los siguientes ejemplos que describen en detalle el proceso y las composiciones de la invención. Resultará aparente para las personas con conocimientos en el estado de la técnica que pueden realizarse modificaciones, en los materiales y métodos, sin apartarse del alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de Bivalirudina de alta pureza por síntesis secuencial en fase sólida. La síntesis de la secuencia peptídica se lleva a cabo mediante el método gradual de síntesis peptídica en fase sólida (SPPS, en inglés) de Fmoc que consiste en agregar Fmoc-Leu-OH a la resina 2-Cl-Trt-Cl. La resina (resina 2-Cl-Trt-Cl, 20 grs . ) después del lavado se agita con una solución de Fmoc-Leu-OH (17,0 grs.) en DMF en presencia de diisopropiletilamina durante 2 horas. Después del lavado de la resina se remueve el grupo protector Fmoc mediante un tratamiento con 20% de piperidina en DMF. Posteriormente al lavado de los reactivos residuales se introduce el segundo aminoácido (Fmoc-Tyr (tBu) ) para comenzar el primer paso de acoplamiento. El aminoácido protegido por Fmoc es activado in- situ utilizando TBTU/HOBt (N-hidroxibenzotriazol ) y posteriormente acoplado a la resina por 50 minutos. Se utiliza diisopropiletilamina durante el acoplamiento como base orgánica. La prueba de ninhidrina indica que el acoplamiento se ha completado. Después del lavado de la resina, se remueve el grupo protector Fmoc del grupo a-amino con 20% de piperidina en DMF por 20 minutos. Estos pasos se repiten con cada aminoácido de acuerdo con la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos utilizados están protegidos por Fmoc-N con excepción del último aminoácido en la secuencia, Boc-D-Phe. Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena lateral de la siguiente manera: Ser(tBu), Arg(Pbf), Tyr(tBu), Asp(OtBu) y Glu(OtBu) . En las reacciones de acoplamiento se emplean tres equivalentes de los aminoácidos activados. Al final de la síntesis la resina peptídica se lava con DMF, después con MeOH, y se seca al vacío para obtener 57 grs. de resina peptídica seca. La separación del péptido y la resina con la desprotección simultánea de los grupos protectores se realiza de la siguiente manera: a. los 57 grs. de resina peptídica obtenidos mediante el procedimiento anterior se agregan al reactor que contiene una solución fría de 95% de TFA, 2,5% de TIS, 2,5% de EDT b. se mezclan durante 2 horas a temperatura ambiente; c. el producto es precipitado con el agregado de 10 volúmenes de éter (MTBE) , filtrado y secado al vacío para obtener 31,7 grs. de producto en crudo . El péptido crudo (31,7 grs.) obtenido mediante el procedimiento anterior, se disuelve en una solución acuosa de acetonitrilo . La solución resultante se agrega a un cromatógrafo de columna de Ci8 para una RP-HPLC y se purifica para obtener fracciones de Bivalirudina con un grado de pureza de >97.5%. Se recolectan las fracciones puras y se liofilizan para obtener un péptido seco final (4,4 grs.) con un grado de pureza de al menos 99,0% (según mediciones por HPLC) que contiene no más de 0,5% [Asp9-Bivalirudina ] y no más de 0,5% de impurezas. El grado de pureza de la Bivalirudina se determina mediante HPLC en un cromatógrafo Synergi Cí2 Max-RP con columna de 250 x 4,6 mm, 4µ??. La fase móvil A es 0,05% (v/v) de TFA en agua y la fase móvil B es 0,05% (v/v) de TFA en acetonitrilo . El siguiente gradiente se agrega a la columna cargada con 25 µ? de muestra, a to: A=83%, B=17%, a t30 A=60%, B=40%, a t33 A=10%, B=90%, y a t38 A=10%, B=90%. La tasa de fluidez es de 1,0 ml/min. a temperatura de horno de 40° grados centígrados. El detector UV se establece en 214 nm.

Ejemplo 2: Preparación del Fragmento Protegido A [Boc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf ) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt ) -Gly-OH] La síntesis de la secuencia peptídica se lleva a cabo mediante el método gradual de síntesis peptídica en fase sólida (SPPS, en inglés) de Fmoc que consiste en agregar Fmoc-Gly-OH a la resina 2-Cl-Trt-Cl. La resina (resina 2-Cl-Trt-Cl, 500 grs.) después del lavado se agita con una solución de Fmoc-Gly-OH en DMF en presencia de diisopropiletilamina durante 2 horas. Después del lavado de la resina se remueve el grupo protector Fmoc mediante un tratamiento con 20% de piperidina en DMF. Posteriormente al lavado de los reactivos residuales se introduce el segundo aminoácido ( Fmoc-Asn (Trt ) -OH) para comenzar el primer paso de acoplamiento. El aminoácido protegido por Fmoc es activado in situ utilizando TBTU/HOBt (N-hidroxibenzotriazol ) y posteriormente acoplado a la resina por 50 minutos. Se utiliza diisopropiletilamina o Colidina durante el acoplamiento como base orgánica. La prueba de ninhidrina indica que el acoplamiento se ha completado. Después del lavado de la resina, se remueve el grupo protector Fmoc del grupo a-amino con 20% de piperidina en DMF por 20 minutos. Estos pasos se repiten con cada aminoácido de acuerdo con la secuencia peptidica. Todos los aminoácidos utilizados estén protegidos por Fmoc-Na con excepción del último aminoácido en la secuencia, Boc-Phe-OH. Los aminoácidos trifuncionales estén protegidos en la cadena lateral de la siguiente manera: Arg ( Pbf ) -OH and Asn (Trt ) -OH . En las reacciones de acoplamiento se emplean tres equivalentes de los aminoácidos activados. Al final de la síntesis la resina peptidica se lava con DMF, después con DCM, y se seca al vacío para obtener 1200 grs. de resina peptidica seca. El péptido preparado según el procedimiento anterior, se separa de la resina con una solución de 1% de TFA en DCM por 3 lavados repetidos (de 15 minutos cada uno) . La solución peptidica ácida se neutraliza con DIPEA. El solvente se evapora bajo presión reducida y el péptido protegido se precipita mediante la adición de 10 volúmenes de agua, se filtra y se seca al vacío para obtener 680 grs. de polvo. Se lo identifica como Boc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf ) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-OH.

Ejemplo 3: Preparación del Fragmento Protegido B [Fmoc-Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu ( tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -OH] La síntesis de la secuencia peptídica se lleva a cabo mediante el método gradual de síntesis peptídica en fase sólida (SPPS, en inglés) de Fmoc que consiste en agregar Fmoc-Tyr (tBu) -OH a la resina 2-Cl-Trt-Cl. La resina (resina 2-Cl-Trt-Cl, 1000 grs.) después del lavado se agita con una solución de Fmoc-Tyr (tBu) -OH en DMF en presencia de diisopropiletilamina durante 2 horas. Después del lavado de la resina se remueve el grupo protector Fmoc mediante un tratamiento con 20% de piperidina en DMF. Posteriormente al lavado de los reactivos residuales se introduce el segundo aminoácido ( Fmoc-Glu (OtBu) -OH) para comenzar el primer paso de acoplamiento. El aminoácido protegido por Fmoc se activa in situ utilizando TBTU/HOBt (N-hidroxibenzotriazol ) y posteriormente se acopla a la resina por 50 minutos. Se utiliza diisopropiletilamina o Colidina durante el acoplamiento como base orgánica. La prueba de ninhidrina indica que el acoplamiento se ha completado. Después del lavado de la resina, se remueve el grupo protector Fmoc del grupo a-amino con 20% de piperidina en DMF por 20 minutos. Estos pasos se repiten con cada aminoácido de acuerdo con la secuencia peptídica. Todos los aminoácidos utilizados están protegidos por Fmoc-Na. Los aminoácidos trifuncionales están protegidos en la cadena lateral de la siguiente manera: Glu(OtBu)-OH y Asp (OtBu) -OH . En las reacciones de acoplamiento se emplean tres equivalentes de los aminoácidos activados. Al final de la síntesis la resina peptídica se lava con DMF, después con DCM, y se seca al vacío para obtener 2600 grs . de resina peptídica seca. El péptido preparado según el procedimiento anterior, se separa de la resina con una solución de 1% de TFA en DCM por 3 lavados repetidos (de 15 minutos cada uno) . La solución peptídica ácida se neutraliza con DIPEA. El solvente se evapora bajo presión reducida y el péptido protegido se precipita mediante la adición de 10 volúmenes de agua, se filtra y se seca al vacío para obtener 1650 grs. de polvo. Se lo identifica como Fmoc-Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -OH.

Ejemplo 4: Preparación de Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-OtBu. Se disuelven 1650 grs. de Fmoc-Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -OH en DMF y se agrega Leu-OtBu (224 grs.) a temperatura ambiente. La mezcla se agita en el reactor y se enfría a -5 °C. Se agrega una solución de HOBt en DMF (153 grs. en 300 mi) seguida de una solución de TBTU en DMF (321 grs. en 1 L) . Finalmente se agrega DIPEA (340 mi) y se continúa la reacción durante 3 horas a temperatura ambiente. Se observa mediante análisis HPLC la finalización de la reacción.

Se remueve el grupo Fmoc por adición de 450 mi de Piperidina a la mezcla de la reacción a temperatura ambiente. Se observa mediante análisis HPLC la finalización de la reacción. Se concentra la mezcla por evaporación parcial de DMF bajo presión reducida. El péptido protegido se precipita mediante la adición de agua. Se separa, se lava y se seca para obtener 1575 grs . de polvo. Se lo identifica como Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-OtBu.

Ejemplo 5: Preparación de Bivalirudina Boc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf ) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-OH (170 grs . ) y Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-OtBu (252 grs.) se disuelven en DMF (2 L) . Se agrega Colidina (20 mi) seguida de la adición de una solución de TBTU en DMF (35 grs. en 180 mi) . La mezcla se agita a temperatura ambiente y se agregan nuevamente TBTU y Colidina después de 2 horas para completar la reacción. Una vez finalizada la reacción de acoplamiento (observada mediante HPLC) se evapora DMF bajo presión reducida y la Bivalirudina protegida se precipita en agua. El precipitado se seca para obtener 416 grs. de Boc-D-Phe-Pro-Arg (Pbf ) -Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (tBu) -Phe-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Ile-Pro-Glu (tBu) -Glu (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-OtBu. La Bivalirudina protegida se disuelve en una solución fría de TFA con 5% de DDM y 2,5% de agua. Se agita la solución a temperatura ambiente durante una hora. Se concentra en el rotavapor y se agrega a MTBE frío (10 volúmenes). La Bivalirudina precipitada se separa por filtrado y se seca para obtener 355 grs. de producto en crudo. El péptido en crudo (355 grs.) obtenido según el procedimiento anterior, se disuelve en una solución acuosa de acetonitrilo . La solución resultante se incorpora a un cromatógrafo de columna C18 para una RP-HPLC y se purifica para obtener fracciones de Bivalirudina de un grado de pureza de >97.5%. Se recolectan las fracciones puras y se liofilizan para obtener un péptido seco final (110 grs.) con un grado de pureza de al menos 99,0% (según mediciones por HPLC) que contiene no más de 0,5% [Asp9-Bivalirudina] y no más de 0,5% de impurezas.

Claims (54)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar Bivalirudina que comprende los siguientes pasos: a) La preparación de una secuencia peptidica de Bivalirudina en una resina hiperlábil en medio ácido, caracterizado porque el péptido contiene residuos protegidos; b) La remoción del péptido protegido de la resina con una solución de separación que comprende un ácido y al menos un depurador, para formar un péptido crudo de Bivalirudina desprotegido o semi-protegido; c) El aislamiento del péptido crudo de Bivalirudina desprotegido o semi-protegido de la solución de separación, y si es un péptido crudo de Bivalirudina semi-protegido, remover todos los grupos protectores restantes del péptido crudo de Bivalirudina semi-protegido para formar un péptido crudo de Bivalirudina desprotegido; y d) La purificación del péptido crudo de Bivalirudina.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la resina hiperlábil en medio ácido se selecciona de un grupo que está formado por 2-Cl-Trt-Cl, HMPB-BHA, resina ácida Rink, y resina de alcohol NovaSyn TGT.

3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la resina hiperlábil en medio ácido es 2-Cl-Trt-Cl.

4. El método de alguna de las Reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la solución de separación comprende aproximadamente desde 85% hasta 99% de un ácido, desde 0,1% hasta 15% de depurador, y desde 0,1% hasta 15% de agua por peso.

5. El método de alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ácido es TFA.

6. El método de alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado el depurador se selecciona de un grupo que está formado por etaneditiol (EDT) , tioanisol, TIS, DDM, fenol, y m-cresol.

7. El método de alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución de separación comprende aproximadamente 95% de TFA, 2,5% de EDT, y 2,5% de agua por peso.

8. El método de alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque aislar el péptido crudo comprende precipitar el péptido crudo en un solvente que se selecciona del grupo formado por un éter alquilo inferior (C4-C8) y agua.

9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque el éter alquilo inferior es MTBE.

10. El método de alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque aislar el péptido crudo de Bivalirudina comprende una precipitación.

11. El método de alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la purificación del péptido crudo de Bivalirudina comprende la purificación por cromatografía y el secado del péptido de Bivalirudina purificado.

12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la cromatografía comprende la HPLC de fase reversa.

13. El método de la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque el secado comprende la liofilización .

14. El método de alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la Bivalirudina en el paso d) posee un grado de pureza de al menos 98,5% por peso.

15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la Bivalirudina tiene un grado de pureza de al menos 99,0% por peso.

16. Un método para preparar Bivalirudina que comprende los siguientes pasos: a) La preparación de un fragmento A protegido, N-terminal de Bivalirudina en una resina hiperlábil en medio ácido y un fragmento B protegido de Bivalirudina en una resina hiperlábil en medio ácido, caracterizado porque los fragmentos A y B juntos forman el péptido que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 4 y el fragmento A comprende la secuencia N-terminal D-Phe- (AA)n de la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 4, donde n es un número entero desde 1 a 17, y el fragmento B comprende la restante secuencia de aminoácidos que se complementa con el fragmento A para formar la secuencia completa de aminoácidos SEQ ID No: 4, el fragmento B tiene una secuencia de (AA)m-Tyr-OH donde m es un número entero desde 0 a 16, y donde los péptidos contienen residuos protegidos y al menos el grupo a-amino del fragmento B está protegido por el grupo protector Fmoc; b) La remoción de ambos péptidos de sus respectivas resinas para formar el fragmento A protegido y el fragmento B protegido con una solución de separación; c) El acoplamiento del fragmento B protegido con Leu-OtBu para formar un fragmento B elongado; d) La desprotección del grupo protector Fmoc del grupo examino del fragmento B elongado mediante tratamiento con una solución básica del que se obtiene un fragmento B elongado libre de terminal amino; e) El acoplamiento del fragmento A protegido con el fragmento B elongado libre de terminal amino en solución; f) La desprotección de los restantes grupos protectores lábiles en medio ácido del péptido protegido mediante tratamiento con una solución ácida adecuada que contiene al menos un depurador para obtener el péptido crudo de Bivalirudina; y g) La purificación del péptido crudo de Bivalirudina para formar el producto Bivalirudina.

17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque n es un número entero desde 3 hasta 15.

18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque n es un número entero desde 5 hasta 12.

19. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque n es un número entero desde 8 hasta 10.

20. El método de algunas de las reivindicaciones 16-19, caracterizado porque m es un número entero desde 2 hasta 1 .

21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque m es un número entero desde 5 hasta 12.

22. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque m 5 es un número entero desde 7 hasta 9.

23. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque el fragmento A es la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 2 y el fragmento B es la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 3. 10

24. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 23, caracterizado porque la resina hiperlábil en medio ácido se selecciona de un grupo formado por 2-Cl-Trt-Cl, HMPB-BHA, una resina ácida Rink, y una resina de alcohol NovaSyn TGT. 15

25. El método de la reividicación 24, caracterizado porque la resina hiperlábil en medio ácido es 2-Cl-Trt-Cl.

26. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 25, 20 caracterizado porque la remoción de los péptidos de sus respectivas resinas hiperlábiles en medio ácido comprende el tratamiento con una solución levemente ácida.

27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque la solución levemente ácida se selecciona de un grupo formado por una solución diluida de TFA en DCM y una solución de ácido acético en DCM y Trifluoroetanol .

28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque la 5 solución diluida de TFA en DCM tiene una concentración de aproximadamente 0,5% hasta 10% de TFA (vol/vol) .

29. El método de la reivindicación 28, caracterizado porque la solución diluida de TFA en DCM tiene una concentración de 10 aproximadamente 1% hasta 2% de TFA (vol/vol) .

30. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 29, caracterizado porque la solución básica se selecciona de un grupo formado por una solución de piperidina en DMF, una solución de 15 DBU, una solución de DBU/piperidina , y una solución de dietilamina .

31. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 30, caracterizado porque el acoplamiento en los pasos c) y e) se 20 lleva a cabo en presencia de un agente de acoplamiento en un solvente de acoplamiento.

32. El método de la reivindicación 31, caracterizado porque el agente de acoplamiento se selecciona de un grupo formado por 2- ( lH-benzotriazol-l-il ) -1,1,3, 3-tetramet iluronio tetrafluoroborato (TBTU), DCC, DIC, HBTU, BOP, y PyBOP.

33. El método de la reivindicación 31 o 32, caracterizado porque el solvente de acoplamiento es D F.

34. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 33, caracterizado porque la solución ácida comprende aproximadamente desde 85% hasta 99% de ácido, desde 0,1% hasta 15% de depurador, y desde 0,1% hasta 15% de agua en peso.

35. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el ácido es TFA.

36. El método de la reivindicación 34 o 35, caracterizado porque la solución ácida comprende aproximadamente 95% de TFA, 2,5% de EDT, y 2,5% de agua.

37. El método de alguna de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizado porque el depurador se selecciona de un grupo formado por etaneditiol (EDT) , tioanisol, TIS, DDM, fenol, y m-cresol .

38. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 37, que además comprende los pasos de aislar los fragmentos A y B obtenidos en el paso b) , aislar el fragmento B elongado desprotegido de Fmoc obtenido en el paso d) , y aislar el péptido crudo de Bivalirudina obtenido en el paso f) antes de su utilización en pasos subsiguientes.

39. El método de la reivindicación 38, caracterizado porque aislar el péptido comprende precipitar el péptido en un solvente que se selecciona del grupo formado por un éter alquilo (C4-Ce) inferior y agua.

40. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque el éter alquilo inferior es MTBE.

41. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 40, caracterizado porque la purificación del péptido crudo de Bivalirudina comprende la purificación por cromatografía y el secado del péptido crudo de Bivalirudina obtenido.

42. El método de la reivindicación 41, caracterizado porque la cromatografía comprende HPLC de fase reversa.

43. El método de la reivindicación 41, caracterizado porque el secado comprende liofilización .

44. El método de alguna de las reivindicaciones 16 a 43, caracterizado porque la Bivalirudina en el paso d) posee un grado de pureza de al menos 98,5%.

45. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque la Bivalirudina posee un grado de pureza de al menos 99,0% por peso.

46. El método de alguna de las reivindicaciones 1 a 45, caracterizado porque el grupo protector del grupo a-amino es Fmoc .

47. Una composición de Bivalirudina que posee un grado de pureza de al menos 98,5% por peso.

48. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque el total de impurezas representa menos del 1,5%, y comprende no más del 0,5% [Asp -Bivalirudina ] y cada impureza representa menos del 1,0% por peso.

49. La composición de la reivindicación 48, caracterizada porque el total de impurezas representa menos del 1,0%, y comprende no más del 0,5% [Asp9-Bivalirudina ] y cada impureza representa menos del 0,5% por peso.

50. La composición de alguna de las reivindicaciones 47 a 49, caracterizada porque la Bivalirudina posee un grado de pureza de al menos 99,0% por peso.

51. Una composición farmacéutica que comprende Bivalirudina que posee un grado de pureza de al menos 98,5% y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

52. La composición farmacéutica de la reivindicación 51, caracterizada porque la Bivalirudina posee un grado de pureza de al menos 99,0%.

53. La composición farmacéutica de la reivindicación 51 o 52, caracterizada porque la composición farmacéutica se presenta en formato de dosificación en polvo de una composición liofilizada.

54. El uso de Bivalirudina de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 47 a 53 para la producción de un medicamento para inhibir la formación de coágulos de sangre en un mamífero.