CN102816213A - 使用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法，所述方法包括利用固相化学分别合成1-12，13-20，21-28和29-37四个肽中间体片段，然后利用液相化学缩合得到普兰林肽。通过本发明路线制备普兰林肽，操作步骤简短，后处理简单，副产物少，产率高，污染小，适合大规模的工业化生产。

Description

使用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法

技术领域

本发明涉及多肽药物合成技术领域，具体涉及一种固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法。

背景技术

普兰林肽（Pramlitide，结构见式I，2-7；二硫键）是一种人工合成的胰淀素（Amylin，淀粉不溶素）类似物，其结构特征为胰淀素第25位（丙氨酸）、第28位（丝氨酸）和第29位（丝氨酸）的氨基酸分别用脯氨酸替代。它充分保留了内源性胰淀素的生理作用，克服了人胰淀素在溶液中不稳定、易水解、易凝集的物理特性。临床研究表明，普兰林肽可抑制胰高糖素的释放，延缓胃排空及抑制摄食；与胰岛素联合应用，能有效地控制血糖、减轻体重、减少胰岛素用量。普兰林肽最早由美国Amylin Pharmaceuticals公司研制，于2005年3月16号获得美国FDA批准，适用于使用胰岛素但无法达到预期疗效的I型和II型糖尿病患者的辅助治疗。

已知普兰林肽的合成可以通过固相合成法（WO-A-93/10146，US-A-5424394，CN102206266A，CN101747426A），将C端酪氨酸的羧基以共价键的形式固定在不溶性树脂上，再以此氨基酸的氨基为起点，依次缩合氨基酸，延长肽链，在树脂上完成肽链的合成后，氧化第2位和第7位半胱氨酸的巯基形成分子内二硫键，再将该肽链从树脂上切割下来并脱除侧链保护基，最终制备得到普兰林肽。很显然，对于含有37个氨基酸的普兰林肽来说，这一合成途径需要重复几十步偶联和脱保护步骤，合成路线冗长，操作工艺繁琐；且随着肽链的延长和可能存在的二级结构的影响，缩合效率越来越差，导致杂质变多且难以分离，目标产物收率极低，成本很高，不适合工业化生产。

使用固相和液相结合的片段缩合技术，适合于合成含有较长氨基酸序列的多肽，其优点在于副产物较少且易于纯化，产物纯度高。然而，片段缩合策略有时会受阻于（i）有增加消旋的危险；（ii）大的保护片段溶解度差；（iii）片段间的低缩合率并伴有副反应发生的危险。为了消除或减少消旋，一般选择Gly或Pro作为片段的C端残基，如果不能实现这一点，则选择Ala或Arg作为C端残基，因为它们不易消旋。在应用片段缩合策略时，对目标序列进行合理的分段可以大大改善结果。除了合理选择C端残基，尽量减少消旋的风险，还应考虑在固相上合成的片段的纯度要高，溶解性要好；参与缩合的片段的C端和N端残基的空间位阻要小，以提高片段间的缩合率。

普兰林肽由37个氨基酸残基组成，因而存在许多种可能的片段和缩合顺序，例如CN101824086A采用1-8（片段1），9-19（片段2），20-28（片段3），29-37（片段4）四个片段，以【（4+（3+2））+1】的顺序缩合的方法；CN102164608A（同族专利US2010/0081788A1）报道的方法与之类似，采用1-8（片段1），9-19（片段2），20-29（片段3），30-37（片段4）四个片段，从C端到N端【（（4+3）+2）+1】顺序依次缩合；CN101790535A（同族专利WO2009/00366A1）报道了采用1-12（片段1），13-24（片段2），25-37（片段3）三个片段从C端到N端顺序缩合的方法；CN102180943A则采用1-16（片段1），17-28（片段2），29-37（片段3）三个片段从C端到N端依次缩合的方法。以上片段缩合合成策略中，前两种方法中第19位Ser（C端）和第20位Ser（N端）以及第四种方法中第16位Leu（C端）和第17位Val（N端）均不是理想的断点，因为在实际操作中这些片段间的缩合效率不高；第三种方法虽然断点选择较为合适，但片段3在固相合成上纯度不佳，将影响片段缩合反应效率。

鉴于普兰林肽重要的药学应用价值，有必要提供更有效的普兰林肽合成方案，能够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的普兰林肽的制备方法，该方法能够克服现有制备方法的不足与缺陷，并适合工业化生产。

本发明中普兰林肽的制备方法，采用的是固相合成片段和片段液相缩合的组合技术。首先利用固相化学在树脂载体上合成普兰林肽的4个侧链保护的中间体片段肽：片段a（1-12），片段b（13-20），片段c（21-28），片段d（29-37），然后在液相中将侧链保护的中间体片段肽缩合，最后脱除氨基端及侧链保护基得到普兰林肽。本方法中选择了适宜的4个片段肽，通过常规固相合成法均可以高效率、高产率、高纯度的获得各个片段肽；各个片段肽在液相缩合体系中溶解度高，且参与缩合的片段的C端和N端空间位阻小，缩合产率高，产物易于纯化。

具体而言，本发明提供的普兰林肽制备方法，包括以下步骤：

(1) 利用固相化学方法，以氨基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段a：AA₂₉-AA₃₇-氨基树脂，片段a的实例：

；

氨基树脂的实例为：9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen -3 – yloxy -polystyrene (Sieber Amide树脂）]或9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基乙酰甲基树脂（9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl Resin）。

(2) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段b：AA₂₁-AA₂₈-三苯甲基树脂，片段b的实例：

(3) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段c：AA₁₃-AA₂₀-三苯甲基树脂，片段c的实例：

(4) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体，然后形成2,7二硫桥键，得到肽中间体片段d：AA₁-AA₁₂-三苯甲基树脂，片段d的实例：

片段a、c、d中P表示伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）或tBu保护基，优选伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）；片段d中的K表示Fmoc保护基或者Boc保护基，优选Boc保护基。

合成2，7二硫桥键的环化试剂的实例是用I₂，溶剂为DMF，环化时间为1-4h，环化温度为15-25℃。

步骤(2)、(3)、(4)中的三苯甲基树脂实例为2-氯-三苯甲基氯树脂(CTC树脂)，氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂。片段合成采用常规固相合成肽的方法（SPPS）。例如，步骤(1)-(4)中可以采用在树脂上依肽序逐步偶联保护氨基酸，偶联体系为DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的偶联体系。

(5) 将侧链保护的肽中间体片段a、b、c、d从树脂上裂解下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽（d-c-b-a）；

液相缩合的方法可以参考Shumpei Sakakibara的文献Chemical Synthesis of Proteins in Solution（Biopolymers(Peptide Science),. 1999; 51(4) : 279-296），例如所用的溶剂可以为NMP或DMF，偶联体系为DCC与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。

(6) 脱除侧链保护肽（d-c-b-a）的氨基端保护基和侧链保护基，得到普兰林肽粗肽；

(7) 经纯化后得到普兰林肽。

本发明中所使用的术语“伪脯氨酸（Pseudoprolines）”是指脯氨酰环中C^γH₂基被氧或硫原子所取代的脯氨酸类似物（CN101472939A）。伪脯氨酸是丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸与醛或者酮环化缩合而成。本发明实施例中用到的丝氨酸和苏氨酸的伪脯氨酸二肽结构如下：

通过采用伪脯氨酸保护策略，不仅提高了在固相合成中困难序列的合成效率，而且降低了C端消旋的危险。

在上述步骤(5)中，片段a、b、c、d可以通过不同的顺序缩合。例如，可以分别缩合片段b和片段a，得到片段（b-a），缩合片段d和片段c，得到片段（d-c），然后片段（b-a）再与片段（d-c）缩合得到侧链保护肽（d-c-b-a）；也可以先缩合片段c和片段b，得到片段（c-b），然后再分别与片段a和片段d缩合得到侧链保护肽（d-c-b-a）。优选的方案是按照从C端到N端的顺序依次缩合，具体如下：

(5.1) 将片段a从树脂上裂解下来，脱除氨基端保护基；将片段b从树脂上裂解下来，二者在溶液中缩合，得到片段（b-a），片段（b-a）的实例：

(5.2) 脱除片段（b-a）的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的c片段在溶液中缩合，得到片段（c-b-a），（c-b-a）的实例：

(5.3) 脱除片段（c-b-a）的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的d片段在溶液中缩合，得到侧链保护肽（d-c-b-a），侧链保护肽（d-c-b-a）的实例：

以上结构式中，Boc(叔丁氧羰基)，Fmoc(芴甲氧羰基)，Trt(三苯甲基)，tBu(叔丁基)，Pbf(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)都是保护基。但本发明并不局限于这几种保护基，本领域技术人员也可以采用其他合适的保护基。

附图说明

图1：普兰林肽的ESI-MS分析图谱。

具体实施方式

本发明包含但不局限于以下实施例。

试剂名称缩写

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

NMP：N-甲基吡咯烷酮

DCC：二环己基碳二亚胺

TFA：三氟乙酸

DCM：二氯甲烷

TIS：三异丙基硅烷

DIEA：N,N-二异丙基乙胺

HOBt：1-羟基苯并三唑

HOAt：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑

Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三氮唑

HBTU：苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐

HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

PyAOP： (3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

实施例1：片段a的制备

将Fmoc-Tyr(tBu)-OH偶联到50g取代度为0.69mmol/g的Seiber Amide不溶性树脂上，以HBTU/HOBt/DIEA为偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2当量投料，先活化然后在室温偶联反应。每次偶联完成度可以通过Kaiser测试监测，偶联完成后，用20%的哌啶的DMF溶液在室温去除Fmoc保护基。片段偶联完成后用2-5%的TFA/DCM溶液分三次把合成的多肽从树脂上洗脱下来。浓缩后用乙醚洗涤得白色固体12g。

可以通过类似的方式制备30位的Thr(tBu)的以伪脯氨酸的替代的片段a′，伪脯氨酸单元采用Fmoc-Pro-Thr（ψ^Me, Me Pro）-OH二肽导入。

实施例2：片段b的制备

将Fmoc-Pro-OH偶联到50g取代度为0.74mmol/g的CTC不溶性树脂上，以HBTU/HOBt/DIEA为偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2当量投料，先活化然后在室温偶联反应。每次偶联完成度可以通过Kaiser测试监测，偶联完成后，用20%的哌啶的DMF 在室温去除Fmoc保护基。片段偶联完成后用1%的TFA/DCM溶液把合成的多肽从树脂上洗脱下来。浓缩后用乙醚洗涤得白色固体25g。

实施例3：片段c的制备

将Fmoc-Ser(tBu)-OH偶联到50g取代度为0.74mmol/g的CTC不溶性树脂上，以HBTU/HOBt/DIEA为偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2当量投料，先活化然后在室温偶联反应。每次偶联完成度可以通过Kaiser测试监测，偶联完成后，用20%的哌啶的DMF溶液在室温去除Fmoc保护基。片段偶联完成后用1%的TFA/DCM溶液把合成的多肽从树脂上洗脱下来。浓缩后用乙醚洗涤得白色固体11g。

可以通过类似的方式制备20位的Ser(tBu)的以伪脯氨酸的替代的片段c′，伪脯氨酸单元采用Fmoc-Ser（tBu）- Ser（ψ^Me, Me Pro）-OH二肽导入。

实施例4：片段d的制备

将Fmoc-Leu-OH偶联到50g取代度为0.74mmol/g的CTC不溶性树脂上，以HBTU/HOBt/DIEA为偶联试剂，将待偶联的氨基酸以2当量投料，先活化然后在室温偶联反应。每次偶联完成度可以通过Kaiser测试监测，偶联完成后，用20%的哌啶的DMF溶液在室温去除Fmoc保护基。片段偶联完成后用10当量的碘合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键，接着用1%的TFA/DCM溶液把合成的多肽从树脂上洗脱下来。浓缩后用乙醚洗涤得淡黄色固体12g。

可以通过类似的方式制备4位的Thr(tBu)的以伪脯氨酸的替代的片段d′，伪脯氨酸单元采用Fmoc-Asn（Trt）- Thr（ψ^Me, Me Pro）-OH二肽导入；或者制备6位的Thr(tBu)的以伪脯氨酸的替代的片段d′′，伪脯氨酸单元采用Fmoc-Ala- Thr（ψ^Me, Me Pro）-OH二肽导入。

实施例5：片段（b-a）的制备

将3.12g片段b先在HOBt，DIEA和HBTU的DMF溶液中活化5分钟，然后加入3.31g片段a，进行偶联。反应完全后将混合物倒入冷水中，有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体化合物5.83g，产率90.6%。

实施例6：片段（c-b-a）的制备

将3.22g片段（b-a）溶于20%的哌啶的DMF溶液中，待反应完全后将混合物倒入冷水中有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体。将1.70g片段c先在HOBt，DIEA和HBTU的DMF溶液中活化5分钟，然后加入白色固体，进行偶联。反应完全后将混合物倒入冷水中，有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体化合物4.42g，产率94.6%。

实施例7：侧链保护肽（d-c-b-a）的制备

将2.34g片段（c-b-a）溶于20%的哌啶的DMF溶液中，待反应完全后将混合物倒入冷水中有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体。将1.35g片段d先在HOBt，DIEA和HBTU的DMF溶液中活化5分钟，然后加入白色固体，进行偶联。反应完全后将混合物倒入冷水中，有沉淀析出，过滤洗涤得白色固体化合物3.09g，产率90.0%。

实施例8：普兰林肽的制备

将2.10g侧链保护肽（d-c-b-a）溶解在苯酚(Phenol)：TIS：TFA=2.5：2.5：95的体积比配置而成的20ml 溶液中。反应2.5h后加入大量冷乙醚，有固体析出，过滤洗涤得普兰林肽粗品。将普兰林肽粗品用HPLC进行纯化：层析柱：SinoChrom ODS-BP （10um）；10mm×200mm。检测波长：220nm。梯度洗脱:B%:28%-48% (20分钟)，洗脱剂A：0.8‰TFA/水,B: 0.8‰TFA/乙腈。去除乙腈后冻干得纯度为95%的普兰林肽纯品1.06g，产率87.9%。

通过ESI-MS图谱确定其结构，见图1。

Claims (10)

1.一种利用固相和液相组合技术制备普兰林肽的方法，普兰林肽结构式如式I所示，

所述方法包括以下步骤：

(1) 利用固相化学方法，以氨基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段a：AA₂₉-AA₃₇-氨基树脂；

(2) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段b：AA₂₁-AA₂₈-三苯甲基树脂；

(3) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段c：AA₁₃-AA₂₀-三苯甲基树脂；

(4) 利用固相化学方法，以三苯甲基树脂为载体，合成侧链保护的肽中间体片段d：AA₁-AA₁₂-三苯甲基树脂；

(5) 将侧链保护的肽中间体片段a、b、c、d从树脂上裂解下来，在溶液中进行缩合反应，得到侧链保护肽（d-c-b-a）；

(6) 脱除侧链保护肽（d-c-b-a）的氨基端保护基和侧链保护基，得到普兰林肽粗肽；

(7) 纯化后得到普兰林肽。

2.根据权利要求1 所述的方法，步骤(1)中所用的氨基树脂为9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基聚苯乙烯树脂[9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-polystyrene (Sieber Amide树脂）]或9-Fmoc-氨基呫吨-3-氧基乙酰甲基树脂（9-Fmoc-Aminoxanthen-3-yloxy-acetamidomethyl Resin），优选Sieber Amide树脂。

3.根据权利要求1 所述的方法，步骤(2)-(4)中所用的三苯甲基树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂（CTC 树脂），氯化三苯甲基树脂，4-甲基氯化三苯甲基树脂或4-甲氧基氯化三苯甲基树脂，优选CTC 树脂。

4.根据权利要求1 所述的方法，步骤(1)-(4)采用在树脂上依肽序逐步偶联保护氨基酸，偶联体系为DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的偶联体系。

5.根据权利要求1 所述的方法，步骤(4)合成2，7两个半胱氨酸的二硫桥键的环化试剂是I₂，溶剂为DMF，环化时间为1-4h，环化温度为15-25℃。

6.根据权利要求1 所述的方法，步骤(5)中所用的溶剂为NMP或DMF，缩合体系为DCC与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合，或者DIEA与HOBt，HOAt或Cl-HOBt中的任意一个或一个以上的组合与HBTU，HATU，PyBOP或PyAOP中的任意一个或一个以上的组合组成的缩合体系。

7.根据权利要求1 所述的方法，步骤(5)-(6)中脱除氨基端Fmoc保护基的方法在含有哌啶的DMF或NMP的溶液中进行。

8.根据权利要求1 所述的方法，步骤(5) 包括：

(5.1) 将片段a从树脂上裂解下来，脱除氨基端保护基；将片段b从树脂上裂解下来，二者在溶液中缩合，得到片段（b-a）；

(5.2) 脱除片段（b-a）的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的c片段在溶液中缩合，得到片段（c-b-a）；

(5.3) 脱除片段（c-b-a）的氨基端保护基，与从树脂上裂解下来的d片段在溶液中缩合，得到侧链保护肽（d-c-b-a）。

9.根据权利要求8 所述的方法，其中：

片段（b-a）是 

片段（c-b-a）是

片段（d-c-b-a）是

片段a、c和d中的P表示伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）或tBu保护基，优选伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）。

10.根据权利要求1所述的方法，其中：

片段a是

；

片段b是

；

片段c是

；

片段d是

片段a、c和d中的P表示伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）或tBu保护基，优选伪脯氨酸保护基（ψ^Me, Me Pro）；片段d中的K表示Fmoc保护基或Boc保护基，优选Boc保护基。