MX2008001068A - Formulacion que inhibe la agregacion de proteina. - Google Patents

Abstract

Se revela una formulacion estable farmaceuticamente aceptable que contiene una cantidad farmaceuticamente aceptable de una proteina. Tambien se revelan metodos para preparar estas formulaciones y metodos para inhibir la formacion del agregado de proteina inducido por los esfuerzos fisicos asociados con el procesamiento, manufactura, envio, y almacenamiento de las formulaciones de proteina, particularmente el esfuerzo de congelamiento/descongelamiento.

Description

FORMULACIÓN QUE INHIBE LA AGREGACIÓN DE PROTEINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con formulaciones farmacéuticas que contienen proteína y con métodos de elaboración y uso de estas formulaciones. Más en particular, la invención se relaciona con formulaciones farmacéuticas -que contienen proteína que pueden inhibir la formación de agregado de proteína durante la elaboración y envío. La invención también se relaciona con métodos para inhibir la formación de agregado de proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN as proteínas tales como enzimas y los anticuerpos, y fragmentos de proteína son inestables y susceptibles a pérdida de la actividad y/o con la formación de agregados solubles o insolubles en soluciones acuosas y cuando se almacenan a bajas temperaturas (es decir, a 0aC o menor) . En la industria farmacéutica, los productos de fármacos con proteínas se sujetan a diferentes fuerzas de tensión durante la elaboración y envío incluyendo, por ejemplo, procedimientos de purificación que involucra las condiciones severas (p.ej., elusión acida, calor, pH extremos, etc.) manipulación con jeringa, ultrafiltración y liafiltración (altas presiones y fuerzas de corte) ; agitación y ciclos -de Ref . : 189540 congelamiento/descongelamiento. Para composiciones de proteína, almacenamiento prolongado (soluciones/liofilizados) se prefiere que estén congelados a fin de que se proteja la proteína de la degradación al disminuir la cinética de diferentes procesos de degradación. Esto permite la retención de la actividad de la proteína. Sin embargo, puede presentarse un poco de degradación de la proteína en estado de congelamiento, usualmente debido a las interacciones de interfase agua-en hielo/proteína y la formación de hielo por el choque osmótico (Chang, et al., J. Pharm . Sci . 1996; 85(12) :1325-1330; Carpenter and Crow, Cryobiology, 1988; 25:244-255). En particular los ciclos de congelamiento/descongelamiento tienden a incrementar la formulación de agregado de proteína, que puede presentarse en solución que vuelve a la solución que parece opaca (turbia) . Otra fuente de la agregación de la proteína es la agitación. En particular, durante el envío de una proteína -terapéutica, tal como un anticuerpo, se sujeta a agitación debido al movimiento por el transporte terrestre y aéreo. Durante el envío las proteínas pueden interactuar con superficies hidrofóbicas sobre un recipiente de vidrio o una jeringa de plástico así como también microburbujas de aire en solución o con la superficie de aire en el recipiente. Estas interacciones de proteínas con los materiales hidrofóbicos pueden inducir la agregación de la proteína. Durante el desarrollo, formulación, al-macenamiento y envío de un producto de proteína terapéutica, tal como un anticuerpo, la eliminación del agregado insoluble es crítica para la retención de la sustancia fármaco porque la formulación de agregado insoluble origina un material de proteína no usable. Se conocen números procesos y aditivos para la estabilización de las proteínas en solución. Por ejemplo la estabilización de las proteínas al adicionar proteínas de choque térmico tal como la HSP25 que se describe en el documento EP-A 0599344. La estabilización del anticuerpo por la adición de polímeros en bloques compuestos de polioxipropileno y polioxietileno en combinación con fosfolípidos se describe en el documento EP-A 0318081. "Se ha estabilizado inmunoglobulinas al adicionar una sal de una base que contiene nitrógeno, tal como la arginina, guanidina o imidazol. Otros aditivos adecuados para la estabilización son los poliésteres (EP-A 0018609), glicerina, albúmina y sulfato de dextrano (Patente U.'S. 4,808,7-05), detergentes y surfactantes como los surfactantes como -surfactantes a base de polisorbato (DE 2652636, GB 8514349), chaperones como GroEL (Mendoza, J.A. Biotechnol. Tech., (10)1991 535-540), tampón de citrato (WO 93/22335) o agentes cielantes (WO 91/15509).

Aunque estos aditivos permiten que se estabilicen las proteínas en algún grado -en solución, padecen de ciertas desventajas, por ejemplo, la necesidad de pasos adicionales de procesamiento para la eliminación del aditivo. Además, ninguno de los procesos descrito en la técnica es adecuado para estabilizar proteínas durante los procesos repetidos de congelamiento y descongelamiento tal que no se €ormen agregados solubles o insolubles (o cantidades despreciables para propósitos terapéuticos) durante la manipulación ('Patente U.S. 6,238,664) . Se considera útil y efectivo el secado por congelamiento (liofilización) para la conservación de muchos materiales biológicamente activos, incluyendo proteínas (Hershenson, Patente U.S. 6,020,469). Sin embargo, la liofilización induce su propio esfuerzo, incluyendo la concentración -extrema de la proteína durante el proceso de congelamiento y la eliminación del agua, que puede originar inestabilidad del producto. Por lo tanto, la liofilización puede originar el incremento en las velocidades de reticulación (formación de -oligómeros covalentes) y agregación no covalente, además de la desamidación y oxidación, ambos pueden presentarse en el estado de liofilización así como también en el estado líquido. Así, existe la necesidad en la técnica de formulaciones de proteínas que han incrementado la estabilidad durante el procesamiento, elaboración, envío y almacenamiento. En particular, las formulaciones de proteína que inhiben la formación del agregado inducida por uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento serían especialmente útiles en la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una formulación de proteína que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un anticuerpo seleccionado del anticuerpo C, anticuerpo D, anticuerpo A, anticuerpo B, y anticuerpo E, o fragmentos de estos, en combinación con una inhibidor de la formulación de agregados. En ciertas modalidades, el inhibidor de la formación del agregado insoluble es MgCl2, propilenglicol, Pluronic-F68, Poloxámero 188, etanol, o combinaciones de estos. Una descripción completa de anticuerpos A-E que incluyen como elaborarlos y usarlos puede encontrarse en la Patente U.S. y la Solicitud de Patente U.S. Nos: 10/180,648 (Anticuerpo A); 10/891,658 (Anticuerpo B) ; 5,789,554, 6,254,868, 09/038,955, 09/590,284, 10/153,882 (Anticuerpo C) ; 60/638,691 (Anticuerpo D) ; 6,235,883 (Anticuerpo E) ; los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad, incluyendo las figuras. La invención también se relaciona con una formulación de proteína que inhibe la formación del agregado de proteína inducido por uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento y por agitación, en donde la formulación comprende un inhibidor de formación de agregado insoluble. En ciertas modalidades, el inhibidor de la •formulación del agregado insoluble es MgCl2, propilenglicol, Pluronic-F68, Poloxámero 188, etanol o combinaciones de estos. La invención se relaciona con métodos para inhibir la formación del agregado de proteína en una solución de proteína sujeta a uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento y agitación que comprende: (a) seleccionar un sistema tampón, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento o agitación; <b) poner en contacto el sistema tampón de (a) con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado insoluble para inhibir la formación del agregado insoluble, previo a al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento o agitación; y (c) poner en contacto el sistema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble de (b) , con una cantidad de proteína o fragmento de proteína, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento o agitación. En ciertas modalidades, el inhibidor de la formación del agregado insoluble es MgCl2, propilenglicol, Pluronic-F68, Poloxámero 188, etanol o combinaciones de estos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que ilustra la dependencia de las cantidades totales de partículas a pH, con intervalo de 4.0 a 8.0 en tampón de K/P0 5mM, K/OAc 5mM. El punto isoeléctrico <pl) de cada proteína es: anticuerpo E = 6.5; anticuerpo B = 7.8; anticuerpo D = 8.1; anticuerpo A = 8.5; y anticuerpo C = 9.2. La Figura 2 es una gráfica que ilustra la dependencia de la cantidad total de partículas en concentración de MgCl2 para el anticuerpo E, sobre el mismo intervalo de pH que en la Figura 1. Los datos se recolectaron para las concentraciones totales de la formulación MgCl2 de 0.0 mM, 30 mM, 100 mM, y 300 mM. Las Figuras 3A-3D son gráficas que ilustran la dependencia de la cantidad total de partículas acumulativa en la concentración de MgCl2 para el anticuerpo A, anticuerpo B, anticuerpo C, anticuerpo D, sobre el mismo intervalo de pH -que en la Figura 1. Los datos recolectados para cada proteína con las concentraciones totales de la formulación MgCl2 de 0.0 mM y 100 mM. Las Figuras 4A-4B son gráficas que ilustran la dependencia de la cantidad total de partículas acumulativa en la concentración de etanol para el anticuerpo E. Los sistemas tampones ueados para esta adquisición de datos fueron 5 mM K/P04, 5 mM K/OAc, con o sin 100 mM de K-Cl ó 100 mM de NaCl (100 mM de KCl, a pH 5.0 y 7.0; 100 mM NaCl, a pH 5 y 6) . Las concentraciones de etanol tienen intervalos desde 0-10% (v/v) .

La Figura 5 es una gráfica que ilustra la dependencia de la cantidad total de partículas acumulativas en la concentración de propilenglicol para el anticuerpo E. Los sistemas tampones usados para esta adquisición de datos fueron 5 mM K/P0 , 5 mM K/OAc, con o sin 100 mM de KCl con o sin 100 mM de KCl a pH 5.0 y 7.0. Las concentraciones de propilenglicol tienen intervalos desde 0-10% (v/v) . La Figura 6 son gráficas que muestran la inhibición de la formación del agregado insoluble al adicionar ?luronic-F68.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona formulaciones de proteínas orue comprenden una cantidad al menos de un inhibidor de la formación del agregado insoluble en una cantidad efectiva para inhibir la formación de agregados insolubles en respuesta a uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento, así como también los métodos para estabilizar una formulación de proteína contra la formación del agregado inducida por uno o más métodos de congelamiento/descongelamiento, métodos para inhibir la formación del agregado de proteína en una solución de proteína que se sujeta a uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento, métodos para inhibir la formación del agregado de proteína inducida por uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento, y métodos para preparar una formulación de proteína estabilizada contra la formación del agregado de proteína inducida por uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento. Los métodos tienen en común el poner en contacto una solución que comprende una proteína o un fragmento de proteína con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado insoluble para inhibir la formación del agregado insoluble. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad, para todos los propósitos . Como se usa en la presente, "inhibir" la formación del agregado de proteína significa disminuir la cantidad de los agregados de proteína o prevenir la formación del agregado de proteína adicional en una solución que contiene la proteí-na. Así, inhibir puede abarcar tanto la disminución y prevención de la cantidad de agregado de proteína en una formulación o solución de proteína. Disminuyendo o previniendo se mide al comparar la cantidad de agregado preeente en una solución que contiene proteína que comprende al menos un inhibidor de la formación del agregado insoluble con la cantidad del agregado presente en una eolución que contiene proteína que . no comprende al menos un inhibidor de la formación del agregado insoluble. Como se usa en la presente, los términos "formulación de proteína" y "solución de proteína" son intercambiables. Además, el término "proteína" se entiende dentro del sentido de la invención que se presenta naturalmente y las proteínas recombinantes o fragmentos de proteínas así como también proteínas químicamente -modificadas y proteínas que contienen sustituciones y adiciones de aminoácidos. Las proteínas que se estabilizan para composiciones farmacéuticas son preferentemente anticuerpos, proteínas con fusión de anticuerpos como las inmunotoxinas, enzimas, y hormonas proteínas como eritropoyetina, somatostatina, insulina, citosina, interferonas, o activadores plasminógenos planeados para abarcar cualquier secuencia de aminoácidos, particularmente, polipéptidos, péptidos, enzimas, anticuerpos, y los similares y/o fragmentos de estos . Una "cantidad farmacéuticamente efectiva de la proteína o anticuerpo se refiere a la cantidad que proporciona efecto terapéutico en diferentes regímenes de adminietración. Eetae cantidades se determinan fácilmente por las personas con experiencia en la técnica. La cantidad del ingrediente activo dependerá de la severidad del padecimiento que se trate, la vía de administración, etc. Las composiciones de la invención pueden prepararse conteniendo cantidades de proteína al menos de aproximadamente 0.1 mg/mL, por arriba de aproximadamente 5 mg/mL. Para los anticuerpos A-E, las cantidades farmacéuticamente efectivas son preferentemente desde alrededor de 0.1 mg/mL a aproximadamente 20 mg/mL, o como se revela en la Patente U.S. y las eolicitudee de Patente U.S. Noe: 10/180,648 (Anticuerpo A); 10/891,658 (Anticuerpo B) ; 5,789,554, 6,254,868, 09/038,955, 09/590,284, 10/153,882 (Anticuerpo C) ; 60/638,961 (Anticuerpo D) ; 6,235,883 (Anticuerpo E) . El término "Anticuerpo A" se toma que significa el anticuerpo revelado en la Solicitud de Patente U.S. No: 10/180,648, o uno o más fragmentos, mutaciones, eliminaciones, adiciones, variantes, truncados, u ortólogos de estoe. El término "Anticuerpo B" se toma que significa el anticuerpo revelado en la Solicitud de Patente U.S. No: 10/981,658, o uno o más fragmentos, mutaciones, eliminaciones, adicionee, variantee, truncadoe, u ortologoe de estos . El término "Anticuerpo C" se toma que significa el anticuerpo revelado en la Patente U.S. y Solicitud de patente Nos: 5,789,554, 6,254,868, 09/038,955, 09/590,284, 10/, 153, 882, o uno o más fragmentos, mutaciones, eliminaciones, adiciones, variantes, truncados, u ortólogos de estos. El término "Anticuerpo D" se toma que significa el anticuerpo revelado en la Solicitud de Patente U.S. No: 60/638,961, o uno o más fragmentos, mutacionee, eliminaciones, adiciones, variantes, truncados, u ortólogos de estoe. El término "Anticuerpo E" e toma que eignifica el anticuerpo revelado en la Patente U.S. No: 6,235,883 o uno o máe fragmentoe, mutaciones, eliminaciones, adiciones, variantes, truncados, u ortólogos de estoe. Un "inhibidor de la formación del agregado insoluble" es cualquier compuesto o condición que puede inhibir efectivamente la formación de un agregado de proteína en una solución que comprende una proteína o un fragmento de proteína. En modalidadee preferidas, el inhibidor de la formación del agregado insoluble se selecciona de sales alcalinas y con metales álcali inorgánicas, como el MgCl2 y los similares; polioles como polietilenglicol, y los similaree; polímeros como los polímeros en bloquee y copolímeroe en bloques (polioxipropileno y polioxietileno, Pluronic-F68, Poloxámero 188, etanol, o combinaciones de estoe); alcoholee inferioree, como el etanol, y loe eimilaree; o combinacionee de doe o más de estos. En general, las formulaciones de la invención pueden contener otros compueetos en cantidades preferentemente que no perjudican a la preparación de lae formae eetablee y en cantidadee adecuadas para la administración farmacéutica, efectiva y segura. En ciertos aspectos la invención proporciona una formulación que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiete de anticuerpo A, anticuerpo B, anticuerpo C, anticuerpo D, anticuerpo E, o fragmentos de estoe; un tampón; y un inhibidor de la formación del agregado ineoluble. En otro aspecto la invención proporciona una formulación de proteína que tiene mayor estabilidad contra la formación del agregado insoluble inducido por uno o máe ciclos de congelamiento/ descongelamiento que comprende una proteína o fragmento de proteína; una cantidad efectiva para inhibir la formación del agregado insoluble de un inhibidor de la formación del agregado insoluble; y un sistema tampón. En otro aspecto la invención proporciona una formulación de proteína que ha mejorado eu eetabilidad contra la formación del agregado insoluble inducida por los esfuerzos en la agitación, que comprende una proteína o fragmento de proteína; una cantidad efectiva y un sietema tampón. Como ee usa en la presente, "esfuerzo de agitación" se toma que significa cualquier movimiento fíeico aplicado a la formulación de proteína ya sea pasiva o activamente. Ejemplos no limitantes de esfuerzo de agitación, incluye bombeo, goteo, agitación, arremolinado, verticidad, decantado, inyección, extracción (como en una jeringa desde un contenedor o recipiente) , y los similares. La formulación de proteína preferida de las invenciones estabiliza particularmente con respecto a las fuerzae de envío y transporte. En otros aspectos, la invención proporciona una formulación de proteína que incrementado su estabilidad contra la formación del agregado insoluble inducida por una o más esfuerzoe fíeicos o químicos, incluyendo ejemplos no limitantee de eefuerzo térmico, eefuerzo químico (p.ej., pH, bajo/alto contenido de eal, y loe similares), esfuerzo del fluido (p.ej., esfuerzos de compresión, como los originados por el movimiento del fluido a través de aberturas estrechae), y las similares, que comprenden una proteína o fragmento de proteína; una cantidad efectiva para inhibir la formación del agregado insoluble de un inhibidor de la formación del agregado insoluble; y un sietema tampón. En una modalidad preferida de loe anteriores aspectos de la formación del agregado insoluble se selecciona del pH, MgCl2, polietilenglicol, Pluronic-F68, Poloxámero 188 ó etanol. En una modalidad, el inhibidor de la formulación del agregado insoluble es MgCl2, en donde la concentración de MgCl2 es desde aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 300 mM, más preferentemente alrededor de 10 mM a aproximadamente 300 mM, aun más preferentemente alrededor de 30 mM a aproximadamente 300 mM. En otra modalidad el inhibidor de la formación del agregado insoluble es propilenglicol, en donde la concentración de propilenglicol es desde aproximadamente 0.01% a alrededor de 10% (v/v) más preferentemente alrededor de 1% a aproximadamente 10%. En otra modalidad el inhibidor de la formación del agregado insoluble es Pluronic-F68, en donde la concentración de Pluronic-F68 es desde 0.01% a 5% (v/v), máe preferentemente alrededor de 0.1% a aproximadamente 1%. En otra modalidad el inhibidor de la formación del agregado ineoluble ee etanol, en donde la concentración de etanol ee deede aproximadamente 0.01% a 10% (v/v), más preferentemente alrededor de O.1% a aproximadamente 10%, aun más preferentemente alrededor de 0.1% a aproximadamente 3%. En otra modalidad el inhibidor de la formación del agregado insoluble es pH, en donde el pH se mantiene desde aproximadamente ±1.0 unidades de pH o máe desde el punto isoeléctrico (pl) de la proteína en la formulación. Más preferentemente el pH se mantiene desde aproximadamente ±2.0 unidadee de pH o máe deede el punto isoeléctrico (pl) . En otro aepecto, la invención proporciona métodoe para eetabilizar una formulación de proteína contra la formación del agregado inducido por uno o máe cicloe de congelamiento/deecongelamiento. En este aspecto, el método de la invención comprende seleccionar un sistema tampón previo a por lo menos un ciclo de congelamient /descongelamiento; poner en contacto el sietema tampón con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado ineoluble para inhibir la formación del agregado insoluble, previo a por lo menos un ciclo de congelamiento/descongelamiento; y poner en contacto el sistema tampón y el inhibidor de la formación del agregado insoluble con una cantidad de una proteína o fragmento de proteína, previo a por lo menos un ciclo de congelamiento/descongelamiento. En otras modalidades de este aspecto, el método puede comprender poner en contacto con una cantidad de un inhibidor de la formación del agregado insoluble previo a, durante, o deepuée del ciclo de congelamiento/deecongelamiento. Aeí, ademáe de la adición de la formulación puede intercambiarse, sin embargo, la proteína de interés debe estar en solución previo al inicio del/los ciclo (s) de congelamiento/descongelamiento. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir la formación del agregado de proteína en una solución de proteína que se eujeta a uno o máe cicloe de congelamiento/deecongelamiento que comprende eeleccionar un sistema tampón, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento; poner en contacto el sistema tampón con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado insoluble para inhibir la formación de agregados insolublee, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento; y poner en contacto el eietema tampón y el inhibidor de formación del agregado insoluble con una cantidad de una proteína o fragmento de proteína, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento. Como con el aspecto descrito previamente, ciertas modalidades, de este método puede comprender el poner en contacto con una cantidad de un inhibidor de la formación del agregado insoluble previo a, durante, o despuée de los ciclo (s) de congelamiento/deecongelamiento . En otro aepecto, la invención proporciona métodos para estabilizar una formulación de proteína contra la formación del agregado inducida por la inducción del esfuerzo de agitación. En este aspecto, el método de la invención comprende seleccionar un eietema tampón previo a la solicitud (o coerción/elección de) esfuerzo de agitación; poner en contacto del sistema tampón con una cantidad efectiva de un inhibidor de la formación del agregado insoluble para inhibir la formación del agregado insoluble previo al esfuerzo de agitación; y poner en contacto el sietema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble con una cantidad de una proteína o fragmento de proteína, previo a la aplicación, coerción, oportunidad del esfuerzo de agitación. En otras modalidades de este aspecto, el método puede comprender el poner en contacto con una cantidad de un inhibidor de la formación del agregado insoluble previo a, durante o después del esfuerzo de agitación. Así, el orden de agitación a la formulación puede intercambiaree, ein embargo, la proteína de interés debe estar en eolución previo al inicio del/los esfuerzo (s) de agitación. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir la formación del agregado de proteína en una solución de proteína que se sujeta a uno o más esfuerzoe de agitación fíeica que comprende eeleccionar un eistema tampón, previo al esfuerzo de agitación; poner en contacto el sietema tampón con una cantidad de un inhibidor de formación de agregado insoluble para inhibir la formación del agregado insoluble, previo al esfuerzo de agitación; y poner en contacto el sietema tampón e inhibidor de formación de agregado insoluble 1*8 con una cantidad de una proteína o fragmento de proteína previo al esfuerzo de agitación. Al igual que el aspecto descrito previamente, ciertas modalidadee de eete método pueden comprender poner en contacto con una cantidad de un inhibidor de formación del agregado insoluble previo a, durante, o después del/los esfuerzos de agitación física. La invención también abarca las formulaciones que comprenden cantidades farmacéuticamente efectivas de proteínas junto con diluyentes adecuados, adyuvantee y/o portadoree. Otros excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidoe por lae pereonae con experiencia en la técnica también pueden formar una parte de las composiciones objetivos. Eetas incluyen, por ejemplo, diferentes agentes de esponjamiento, agentes adicionales amortiguadores, agentes quelantes, antioxidantes, coneervadoree , co-solventes, y loe similares; ejemplos específicoe de estos podrían incluir, salee de trimetilamina ("Tampón Trie"), y EDTA. En otra modalidad, máe de un tipo de proteína se incluye en la formulación. En otra modalidad, otrae que no sean proteínas de interés eon parte de la formulación. Los intervalos de pH adecuados para la preparación de las formulaciones dependerán de la proteína particular o fragmento de proteína de interés . Es particularmente ventajoso seleccionar un tampón con un intervalo de pH que retiene su capacidad de amortiguamiento en un intervalo mayor o igual a 1 unidad de pH o menor que el punto ieoeléctrico (pl) de la proteína de interés. Más preferentemente, el pH del sistema tampón es estable en un intervalo mayor o igual a 2 unidades de pH mayor o menor que el pl de la proteína. Además, es particularmente ventajoso seleccionar un sietema tampón que mantenga el pH sobre un gran intervalo de temperaturas, particularmente desde alrededor de 80aC a aproximadamente 25aC. Esto ee, el pH del eistema tampón es preferentemente no significativamente dependiente o responde a la temperatura. En una modalidad el tampón es un sistema tampón de fosfato de potasio/acetato de potasio mezclado, que tiene un intervalo de pH a aproximadamente 4 a alrededor de 8 , y un intervalo de concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 300 mM. Como se usa en la preeente "agregado de proteína" o agregación de proteína" ee toma como la proteína que ya no está en solución. Mientras el agregado de proteína puede significar aglomeración u oligomerización de dos o más moléculas de proteínas individuales, no se limita tal como una definición. Los agregadoe de proteína, como ee usa en la presente, puede ser eoluble o ineoluble; sin embargo para los propósitos de la invención, los agregados de la proteína usualmente se coneideran que eon ineolubles, a menos que se denote específicamente de otra forma. Los agregados insolubles cuya formación debe prevenirse en el proceso de acuerdo con la invención se entienden esencialmente como agregados de proteínas -que tienen un tamaño usualmente al menos de 1 u pero también puede estar en el intervalo de 10 µm. Las partículas pueden determinarse por métodos de conteo de partículas adecuadoe que uean inetru entoe de conteo de partículae comercialee como, por ejemplo, el instrumento de conteo de partículas AccuSizer 700 de PSS (Particle Sizing Systems, USA) o un sistema de conteo de partículas líquidas Pacific Scientific HIAC Royco, modelo 9703, equipado con un contador láser LD400. De acuerdo con la USP (farmacopea de los EUA) un máximo de 6000 partículas en el intervalo por arriba de 10 µm y un máximo de 600 partículas en el intervalo por arriba de 25 µm se permiten por dosie inyectada de una preparación farmacéutica. Eeto puede lograrse de acuerdo con la invención de forma simple para las composiciones terapéuticas de las proteínas. De acuerdo con esta invención cualquier proteína puede utilizarse. Ciertos aspectos de la invención se basan en el uso de la solución acuosa amortiguada e inhibidor de la formación de proteína como se recita en ciertas de las reivindicaciones y no deben interpretarse como limitantes por la proteína específica disuelta en esta. Las formulacionee ee preparan en general al combinar loe componentee usando generalmente técnicas de combinación farmacéutica dieponiblee, conocidae per se. Un método particular para preparar una formulación farmacéutica de eeta que emplea la proteína purificada de acuerdo con cualquier esquema de purificación de proteína estándar, así como también aquellas reveladas en las patentes y eolicitudee de patente que deecriben anticuerpos A-E.

Ejemplos Los diferentes anticuerpos usadoe en los Ejemplos se describen en detalle en otra parte en la Patente y la solicitud de Patente U.S. Nos: 10/180,648 (Anticuerpo A); 10/891,658 (Anticuerpo B) ; 5,789,554, 6,254,868, 09/038,955, 09/590,284, 10/153,882 (Anticuerpo C) ; 60/638,961 (Anticuerpo D) ; 6,235,883 (Anticuerpo E) ; los cualee ee incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Materiales : anticuerpos derivados CHO se expresa y purifica. El anticuerpo. El anticuerpo se dializa exclusivamente contra agua destilada y desionizada y se concentra a -30 mg/mL. Debido al intervalo de amortiguación requerido para los Ejemplos (pH 4-8) , ee ueó una combinación de tamponee de fosfato de potasio y acetato de potasio. Los tamponee a baee de potaeio ee seleccionaron debido a eu eetabilidad del pH con el congelamiento con relación a loe tampones a base de sodio. Se adquirieron el fosfato de potasio (K/P04) , mono- y dibásicoe, y acetato de potasio (K/OAc) de Mallinc rodt . Se adquirió el hexahidrato de cloruro de magnesio (MgCl2) de EM Science ('Gibbstown, NJ) . Se compró Pluronic-F68 (Poloxámero) de Sigma. Se adquirió Etanol (EtOH) y 1, 2-propanodiol (propilenglicol) de Aldrich Chemical Co.

Ejemplo 1 Preparación de la Formulación Se prepararon una serie de formulacionee para cada uno de loe agentee probados que inhiben la formación del agregado inducido por congelamiento/descongelamiento. Cada formulación ee preparó eimilarmente. Se prepararon muestras (2 mL) en frascos de 5 mL equipados con tapones Daikyo. Se adicionó el tampón de almacenamiento concentrado (K/OAc 20 mM, K/P0 20 mM, con cada valor de pH probado) a la muestra hasta una concentración final de K/OAc 5 mM, K/P04 5 mM, con cada valor de pH probado. Las soluciones de almacenamiento de proteína individuales (-30 mg/mL) se adicionaron a cada formulación hasta una concentración final de proteína de -10 mg/mL. Las solucionee de almacenamiento adicionalee de loe agentes que inhiben la formación del agregado que se prepararon incluyen MgCl2 5.0 M; Pluronic-F68 al 5%; EtOH 100% (v/v); y propilenglicol 100% (v/v) . Estae eolucionee de almacenamiento ee adicionaron a lae formulacionee haeta intervaloe de concentración final denotadoe en la revelación siguiente, típicamente (MgCl2) 30-300 mM; (Pluronic-F68) al 0.01-1.0%; (EtOH); y (propilenglicol) 1-10%. Si es necesario, se adiciona agua deeionizada para alcanzar el volumen final.

Procedimiento de CongelamientoJDescongelamiento Deepués de preparar cada formulación los frascos de muestra se sellaron con tapones y se colocaron en una caja de 5 cc x 16 con la inserción del separador del fraeco apropiado. La caja ee agitó suavemente par promover el mezclado completo suave de las muestrae. Después de mezclar, las muestrae ee colocaron en un congelador durante toda la noche (-80SC) . A la mañana eiguiente, ee retiraron lae mueetrae del congelador y ee colocaron a temperatura ambiente <-20-23 SC), ee permitió que ee descongelaran. Después que se completó el descongelamiento de las muestrae y se equilibraron a temperatura ambiente, las muestrae mientrae -ee agitó euavemente en la caja de nuevo por medio de una agitación anea. El proceeo de congelamiento/deecongelamiento se repitió durante un total de 3 ciclos .

Análisis de la Muestra Deepuée que ee completaron 3 ciclos de congelamiento/descongelamiento, se desarrolló un examen vieual inicial de la formación del agregado ineoluble de lae muestras. Después de esto, los agregados insolublee se contaron usando un sietema de contabilización de partículas líquidas Royco HIAC Pacific Scientific, modelo 9703, equipado con un contador láser LD400. La evaluación total del agregado insoluble se cuantificó ueando el límite de detección = 2 µm. El límite de detección del inetrumento es aproximadamente de 18,000 cuentas/mL. Si parece que ocurrió la formación del agregado/precipitación pesada, la mueetra se diluyó (típicamente 1:25 de dilución para cuantificar la formación del agregado con mayor exactitud y evitar las limitaciones del inetrumento.

Resultados A. Dependencia de la formación del Agregado Insoluble -en pH Se observa una tendencia general para el agregado insoluble y su dependencia del pH entre todos los IgG probados . Para todoe loe IgG probados , los valoree de pH de entre 4.0-4.5 dieron coneietentemente bajo contenido de partículae para la formación del agregado insoluble. De pH 6.0-8.0, el contenido de agregados insolubles fue altamente dependiente del punto isoeléctrico (pl) de la proteína específica. Como puede verse para el anticuerpo A, anticuerpo C, y anticuerpo D (valores de pl de 8.5, 9.2 y 8.7, respectivamente) , la cantidad de partículas totalee fue coneiderablemente menor (<1500) cuando se comparó con el anticuerpo B, y el anticuerpo E (valoree de pl de 7.8 y 6.5 reepectivamente) . La cantidad total de partículae para el anticuerpo B y el anticuerpo E con pH 6.0 eon -11,000 y -7,400, respectivamente. El anticuerpo B tiene un nivel alto de agregados insolubles mientras el pH alcanza el pl de la proteína. El anticuerpo C y el anticuerpo D parece ser ligeramente resietente a formar agregadoe ineolubles durante el congelamiento/descongelamiento y cambia en pH máe probablemente debido al intervalo de pH probado. Estas dos proteínas tienen pl de 9.2 y 8.7, que son los más altos pl de todas las proteínas probadas en este trabajo (Figura 1) . Estas tendencias indican que para inhibir la formación del agregado insoluble, los intervalos de pH tampón deben determinarse por el pl de la proteína particular en una formulación. Idealmente, el pH del sistema tampón debe ser al menos una unidad de pH total más alta o más baja que el valor del pl de la proteína.

B. Dependencia de la Formación del Agregado Insoluble en Cloruro de Magnesio Usando el tamiz de pH descrito en (A) antes como comparación, la adición de entre MgCl2 3 -30O mM puede suprimir la formación del agregado inducida -por tres ciclos de congelamiento/descongelamiento. Las condiciones que produce la mayoría de los agregados insolublee en lae formulaciones del anticuerpo E se eliminan significativamente con la introducción de MgCl2. Esto se ve más prominentemente entre el intervalo de pH de 6-7. La Figura 2 muestra la eliminación de los agregados entre MgCl2 30-300 mM solo para el antibiótico E. Las Figuras 3A-3D muestran el efecto del MgCl2 en la agregación insoluble en los anticuerpos A-D con MgCl2 con una concentración de 100 mM. La suspeneión de los agregados insolublee por el MgCl2 se observó generalmente un fenómeno en todas las proteínas excepto para el anticuerpo D. El anticuerpo A ee una proteína bien portada durante el congelamiento/deecongelamiento. Los agregados insolublee eon ligeroe con lae mayoría de lae condicionee probadae, excepto para el pH 8. Eeto es probablemente debido al hecho que el pH 8 es cercano al pl del anticuerpo A (8.5) y contiene agregados insolubles significativos (-16,000 unidades de cuenta/mL) . La inclusión del MgCl2 con pH de 8 para el anticuerpo A reduce significativamente la cantidad de agregados insolublee a < 50 unidades de cuenta/mL. El anticuerpo B tiene la menos cantidad de protección contra la formación del agregado insoluble después de la adición de MgCl2. Bajo todas las condiciones, la adición del MgCl2 contiene tanto menos agregados insolubles cuando se compara para ajustar la eolución amortiguada o una cantidad equivalente del agregado para el anticuerpo B. El anticuerpo D parece ser una excepción a esta observación. La adición del Mg.Cl2 en la formulación ya sea mantiene el nivel de agregados insolublee cuando se compara con el tampón solo, o también incrementa -el número de agregados insolublee en el intervalo de pH de 7-8.

C. Dependencia de la Formación de Agregado Ineoluble en etanol Ueando lae condicionee previas conocidas para generar altas cantidades de agregados insolubles con el anticuerpo E, la adición de bajas concentraciones de etanol disminuye el número de agregadoe insolubles. Estos tampones que forman agregados insolubles son K/P0 5 mM, K/OAc 5 mM, con o sin potasio o cloruro de eodio <KC1 100 mM, a pH 5.0 ó 7.0; NaCl 100 mM, a pH 5 ó 6) . Eetoe ciclos de congelamiento/descongelamiento del anticuerpo E en las anteriores condiciones de amortiguación inducen la formación del agregado de aproximadamente 15,000 unidades de cuenta/mL. Bajo las mismae condicionee la adición de etanol (a 0.1% (v/v) ) redujo la cantidad de la formación del agregado ineoluble por máe de 50%. La adición de 0.2% etanol (v/v) dieminuye la cantidad del agregado ineoluble en caei cerca de dos ordenes de magnitud. El etanol adicionado en cantidad de 0.8-10% (v/v) casi elimina los agregados insolubles inducidos por tres ciclos de congelamiento/descongelamiento. Lae Figuras 4A-4B iluetran loe efectoe del etanol en la formación del agregado insoluble para el anticuerpo E en los sietemas tampón que contienen (figura 4A) KCl y (figura 4B) NaCl.

D. Dependencia de la Formación del Agregado Insoluble en Propi 1 engl i col Usando las condiciones ya deecritae para la formación del agregado insoluble máximo (anterior (C) ) , la adición de diferentes cantidades de propilenglicol reduce la precipitación del anticuerpo E. En todas las condiciones probadas (K/P04 5 mM, HOAC 5 mM, ± KCl 100 M, pH 5 ó 7) , la adición de propilenglicol 1% reduce la cantidad de agregado insoluble por -1.5 ordenes de magnitud. Otro incremento en las cantidades de propilenglicol reduce el nivel del precipitado (> 2 órdenes de magnitud) . La Figura 5 ilustra loe efectos del anticuerpo que el propilenglicol tiene en la formación del agregado insoluble en los sietemas tampones desestabilizadores .

E. Dependencia de la Formación del Agregado Insoluble en el agente emulsionante/humectante El Poloxámero 188 y Plu-ronic-F68 se clasifican como emulsionantes grasoe y agentes humectantes cuando se presentan en intervalos de concentraciones de 0.01-5% (Rowe, et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th ed. , Weller, P.J. (ed) ; Pharmaceutical Press (Londres) y American Pharmaceutical Association (Washington D.C.), 2003. pp. 447-449). Usando el sistema tampón deseetabilizador anterior <C,D) , Pluronic-F68 se adicionó con una concentración de 0.01-1%. Adición de Pluronic-F68 en este intervalo de concentración inhibió la formación de la formación del agregado insoluble (Figura 6) .

Ejemplo 2 Inhibición de la formación del agregado de proteína durante el esfuerzo de agi tación . Cada formulación se preparó usando loe anticuerpos como ee describe en el Ejemplo 1, con las condicionee tampón que incluye: (a) acetato de sodio 5mM, fosfato de potasio 5 mM, pH 7 (muestra de control) ; (b) acetato de sodio 5 mM, fosfato de potaeio 5 mM, MgCl2 100 mM, pH 7; (c) acetato de eodio 5 mM, fosfato de potaeio 5 mM, Pluronic-F68 100 mM, pH 7; y acetato de sodio 5 mM, fosfato de potasio 5 mM, propilenglicol 10%, pH 7. Eetae formulaciones se preparan usando cualquier método conocidos por las personas con experiencia por las personae con experiencia, como diálieis, diafiltración, intercambio de tampón (cromatografía, centrífuga, filtración, etc.). Las personas con experiencia en la técnica son capaces de identificar los materiales apropiados necesarios para esta preparación (separación por peso molecular de diálisie por entubado y membranas de diafiltración, etc.). Una vez que ee logra una típica concentración de proteína (p.ej., -10 mg/mL), loe frascos de muestra ee eellan con taponee y se colocan en una caja de 5 cc x 16 con el separador del frasco apropiado. La caja se agita euavemente para promover y asegurar completamente, el mezclado suave de lae mueetras. Después de mezclar, las mezclas se sujetan a estimulación de envío (12 horas de vibración terrestre y 12 horas de vibraciones por ai e que son representativas de un camión y un avión) . Si no está dieponible la eetimulación de envío, lae condiciones de envío simuladae pueden lograree a travée de una variedad de formae, como en un agitador orbital {p.ej., agitador orbital VWR OS-500) que opera a 500 rpm durante 72 horae o mayor (agitador orbital VWR OS-500) .

Análisis de Muestra Deepuée que se completó el esfuerzo de agitación, se desarrolló un examen visual inicial de la formación del agregado insoluble de las muestras. Después de esto, los agregados insolubles se contaron usando un sistema de contabilización de partículas líquidae Royco HIAC Pacific Scientific, modelo 9703, equipado con un contador láser LD400. La evaluación total del agregado ineoluble se cuantificó usando el límite de detección = 2 µm. El límite de detección del instrumento es aproximadamente de 18,000 cuentas/mL. Si parece que ocurrió la formación del agregado/precipitación pesada, la muestra se diluyó (típicamente 1:25 de dilución para cuantificar la formación del agregado con mayor exactitud y evitar lae limitaciones del instrumento. Ya que se describió la invención en aepectos particulares y modalidades, la anterior descripción y Ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la invención. La invención cubre diferentes modificaciones y formulaciones equivalentes aparentee por las personas con experiencia en la técnica, y se incluyen dentro del alcance y perspectiva de las reivindicaciones anexas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el -que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientee reivindicacionee : 1. Formulación, caracterizada porque comprende: a) una cantidad farmacéuticamente aceptable de un anticuerpo eeleccionado del grupo que consiste de anticuerpo A, anticuerpo B, anticuerpo C, anticuerpo D, anticuerpo E, o fragmentos de estoe; b) un tampón; y c) un inhibidor de la formación del agregado insoluble.
2. 2. Formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el tampón tiene un intervalo de pH de aproximadamente 4.0 a alrededor de 8.0.
3. 3. Formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el inhibidor de la formación de agregado insoluble es al menos de MgCl2, propilenglicol, Pluronic-F68, Poloxámero 188, etanol, o combinaciones de eetoe.
4. 4. Formulación de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizada porque el tampón es un tampón de fosfato.
5. 5. Formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor de la formación del agregado insoluble es MgCl2.
6. 6. Formulación de conformidad con la reivindicación 5 , caracterizada porque la cantidad de MgCl2 es de aproximadamente 0.1 mM a alrededor de 300 mM.
7. 7. Formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el inhibidor de la formación del agregado insoluble es propilenglicol.
8. 8. Formulación de conformidad con la reivindicación 7 , caracterizada porque la cantidad de propilenglicol es aproximadamente 0.01% a alrededor de 10% (v/v).
9. 9. Formulación de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizada porque el inhibidor de la formación del agregado insoluble es Pluronic-F68.
10. 10. Formulación de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la cantidad de Pluronic-F 8 es aproximadamente 0.01% a alrededor de 5% (v/v).
11. 11. Formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el inhibidor de la formación del agregado insoluble es Poloxámero 188.
12. 12. Formulación de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la cantidad de Poloxámero 188 es aproximadamente 0.01% a alrededor de 5% (v/v).
13. 13. Formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el inhibidor de la formación del agregado insoluble es etanol .
14. 14. Formulación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la cantidad de etanol es aproximadamente 0.01% a alrededor de 10% (v/v).
15. 15. Método para estabilizar una formulación de proteína contra la formación del agregado inducida por uno o más ciclos de congelamiento/deecongelamiento, caracterizado porque comprende : (a) seleccionar un sietema tampón, previo al menoe a un ciclo de congelamiento/descongelamiento; (b) poner en contacto el sietema tampón de (a) con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado ineoluble para inhibir la formación del agregado ineoluble, previo al menoe a un ciclo de congelamiento/descongelamiento; y (c) poner en contacto el sietema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble de (b) , con una cantidad de proteína o fragmento de proteína, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento.
16. 16. Método para inhibir la formación del agregado de proteína en una eolución de proteína que ee sujeta a uno o más ciclos de congelamiento/deecongelamiento, caracterizado porque comprende : (a) seleccionar un eietema tampón, previo al menoe a un ciclo de congelamiento/deecongelamiento; (b) poner en contacto el sistema tampón de (a) con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado insoluble para inhibir la formación del agregado insoluble, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento; y (c) poner en contacto el sistema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble de (b) , con una cantidad de proteína o fragmento de proteína, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento.
17. 17. Método para inhibir la formación del agregado de proteína inducida por uno o máe cicloe de congelamiento/deecongelamiento, caracterizado porque comprende poner en contacto una solución que comprende una proteína o fragmento de proteína con una cantidad de un inhibidor de la formación del agregado insoluble a, durante, o después de al menos un ciclo de congelamiento/descongelamiento.
18. 18. Método para preparar una formulación de proteína estabilizada contra la formación del agregado inducida por uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento, caracterizado porque comprende: (a) seleccionar un sietema tampón; (b) poner en contacto el eistema tampón de (a) con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado insoluble para inhibir la formación del agregado ineoluble; y (c) poner en contacto el sistema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble de (b) , con una cantidad de proteína o fragmento de proteína, previo al menos a un ciclo de congelamiento/descongelamiento .
19. 19. Formulación de proteína que tiene mayor estabilidad contra la formación del agregado insoluble inducido por uno o más ciclos de congelamiento/descongelamiento, caracterizada porque comprende: a) una proteína o fragmento de proteína; b) una cantidad efectiva para inhibir la formación del agregado insoluble de un inhibidor de la formación del agregado insoluble seleccionado de MgCl2/ propilenglicol, Pluronic-F68, Poloxámero 188, o etanol; y c) un sietema tampón.
20. 20. Formulación de proteína de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el sistema tampón se selecciona en baee al punto ieoeléctrico de la proteína o fragmento de proteína de (a) .
21. 21. Formulación de proteína de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el sistema tampón es igual o mayor de 2 unidades de pH mayor o menor que el punto ieoeléctrico de la proteína o fragmento de proteína de (a) .
22. 22. Formulación de proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el tampón tiene un pH mayor de 2 unidadee de pH mayor o menor que el punto isoeléctrico del anticuerpo de (a) .
23. 23. Formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el anticuerpo es el anticuerpo E.
24. 24. Método para estabilizar una formulación de proteína contra la formación del agregado inducido por el esfuerzo de agitación, caracterizado porque comprende: (a) eeleccionar un sistema tampón, previo al esfuerzo de agitación; (b) poner en contacto el sietema tampón de (a) con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado insoluble para inhibir la formación del agregado insoluble, previo al eefuerzo de agitación; y (c) poner en contacto el sistema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble de (b) , con una cantidad de proteína o fragmento de proteína, previo al esfuerzo de agitación.
25. 25. Método para inhibir la formulación del agregado de proteína en una eolución de proteína que ee sujeta al esfuerzo de agitación, caracterizado porque comprende: (a) seleccionar un sistema tampón, previo al esfuerzo de agitación; (b) poner en contacto el sietema tampón de (a) con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado ineoluble para inhibir la formación del agregado ineoluble, previo al esfuerzo de agitación; y <c) poner en contacto el sistema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble de (b) , con una cantidad de proteína o fragmento de proteína, previo al esfuerzo de agitación.
26. 26. Método para inhibir la formación del agregado de proteína inducido por el esfuerzo de agitación caracterizado porque comprende poner en contacto una solución que comprende una proteína o fragmento de proteína con una cantidad de un inhibidor de la formación del agregado insoluble previo, durante o después del esfuerzo de agitación.
27. 27. Método para preparar una formulación de proteína estabilizada contra la formación del agregado de proteína inducido por el esfuerzo de agitación, caracterizado porque comprende: (a) seleccionar un sistema tampón; (b) poner en contacto el sistema tampón de (a) con una cantidad efectiva de un inhibidor de formación del agregado insoluble para inhibir la formación del agregado insoluble; y (c) poner en contacto el sistema tampón e inhibidor de la formación del agregado insoluble de (b) , con una cantidad de proteína o fragmento de proteína, previo al esfuerzo de agitación.
28. 28. Formulación de proteína que ha incrementado la estabilidad contra la formación del agregado insoluble inducido por el esfuerzo de agitación, caracterizada porque comprende : a) una proteína o fragmento de proteína; b) una cantidad efectiva para inhibir la formación del agregado de un inhibidor de la formación del agregado insoluble seleccionado de MgCl2, polipropileno, Pluronic-F68, Poloxámero 188, o etanol; y c) un sistema tampón.
29. 29. Formulación de proteína de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el sistema tampón se selecciona en base al punto isoeléctrico de la proteína o fragmento de proteína de (a) .
30. 30. Formulación de proteína de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el sistema tampón es igual o mayor de 2 unidades de pH mayor o menor que el punto isoeléctrico de la proteína o fragmento de proteína de (a) .
31. 31. Formulación de proteína de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque el esfuerzo de agitación se aplica a la muestra durante el envío terrestre o por mar, o por vía aérea.