MX2008000962A - Polipeptidos estimuladores del crecimiento para uso en peces y crustaceos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion esta relacionada con polipeptidos que muestran una actividad superior a la hormona de crecimiento de tilapia; estos polipeptidos son capaces de estimular el crecimiento, la sobrevida y calidad de las larvas de peces y crustaceos; ademas, incrementan la defensa del organismo contra agentes patogenos y estimulan parametros relacionados con el sistema inmune de organismos acuaticos; los genes que codifican para dichos polipeptidos fueron clonados en un vector de expresion en Pichia pastoris que permite la obtencion de la proteina de forma extracelular; el sobrenadante de cultivo que contiene los polipeptidos de interes fue administrado por banos de inmersion o como suplemento en el pienso a organismos acuaticos.

Description

POLIPEPTIDOS ESTIMULADORES DEL CRECIMIENTO PARA USO EN PECES Y CRUSTÁCEOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología acuática, en particular con polipéptidos con actividad superior a la hormona de crecimiento de tilapia y el uso de dichos polipéptidos para promover el aumento de la sobrevida y la calidad de las larvas mediante la administración vía inmersión o como suplemento en el pienso de sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris.

TÉCNICA ANTECEDENTE La búsqueda de agentes capaces de potenciar el crecimiento en organismos acuáticos constituye un tema de atención para numerosos laboratorios de investigación. La hormona de crecimiento (HC) ha sido el principal foco de atención de dichas investigaciones. Se ha reportado la existencia de la HC en mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. La HC o somatotropina es un polipéptido sintetizado y secretado por los somatotrofos en la glándula pituitaria anterior en respuesta a péptídos hipotalámicos (Barinaga M., et al. (1985) Independent effects of growth hormone releasing factor on growth hormone reléase and gene transcriptíon. Nature 314: 279- 281 ). La HC está involucrada en la regulación del crecimiento, desarrollo, metabolismo, apetito y osmoregulacíón en peces (Donaldson E. M., et al. (1979) Hormonal enhancement of growth. Fish Physiol. 8: 455-597). Además de sus efectos anabólicos sobre el crecimiento somático post-natal, en los peces tiene efectos sobre las células del sistema inmune. Se sabe de su estimulación en la proliferación de células T y de su actividad receptora de antígenos, actúa como coestimulador de la maduración de estos línfocitos (Harris H. and Bird D. J. (1997) The effects of a-MSH and MCH on the proliferetions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) lymphocytes in vitro. In: Kawashima, S., Kikuyama, S., (Eds), Advances in Comparative Endocrinology. Monduzzi Editoire, Bologn pp. 1023-1026a). Es interesante su semejanza estructural con un número de citoquinas, incluidas las interleuquinas IL-2, IL-4, IL-5, el factor estimulador de la colonia de granulocitos, el factor estimulador de la colonia de macrófagos-granulositos y el interferón (Sprang S. R. and Bazan J. F. (1993) Cytokine structural taxonomy and mechanisms of receptor engagement. Curr. Opin. Struc. Biol. 3: 815-827). En mamíferos estimula la fagocitosis, la maduración y diferenciación de timocitos (Ortega E., et al. (1996) Effects of prolactin on the in vitro phagocytic capacity of macrophages. Comp. Immunol. Immunopathol. 61 : 389-393) y la apoptosis de células productoras de células T (Murphy W. J. and Longo D. L. (2000) Growth hormone as an immunodulating therapeutic agent. Immunol. Today 121 : 211-213). Similarmente ha sido probado su efecto estimulador de la linfopoesís y la fagocitosis en Spaurus aurata y Soaurus sarba, unido a la mitogénesis de los leucocitos en Oncorhynchus keta (Sakai M., et al. (1996) Increase in Haemolytic activity of serum from rainbow trout Oncorhyncus mykiss injected with exogenous growth hormone. Fish Shellfish Immunol. 6: 615-617), fagocitosis, activación de las células NK, producción de anticuerpos y la actividad hemolítica del complemento en Oncorhynchus mykiss (Yada T., et al. (1999) Effects of prolactin and growth hormone on plasma immunoglobulin M levéis of hipophysectomized rainbow trout, Oncorhyncus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 115: 46-52) y el Burst respiratorio de los leucocitos en la trucha arcoiris (Oncorhyncus mykiss) y en Dicentrarchus labrax (Muñoz P., et al. (1998) Modulation of the respiratory burst activíty of Mediterranean sea bass (Dícentrarchus labrax L.) phagocytes by growth hormone and parasitíc status. Fish Shellfish Immunol. 8: 25-36). Además se ha demostrado que al transferir Salmo trutta de agua dulce a agua de mar se incrementa el título de HC en el plasma mientras se reduce el título de hormonas tiroideas y esto a su vez se correlaciona con el incremento de la actividad fagocítica de los leucocitos del riñon y eleva la concentración de lisozima plasmática. Algunos estudios señalan la expresión de receptores específicos para la HC en la superficie del linfocito T (L0T) y receptores para los factores de crecimiento tipo insulina (en inglés "insulin-like growth factor-I", abreviado IGF-I) (Tapson V. F., et al. (1988) Structural and functional characterization of the human T lymphocyte receptor for insulin-like growth factor I in vitro. Clin, C. Invest. 82: 950-957). Se ha comprobado in vitro su efecto inductivo sobre la proliferación de los L0T. Se sabe del efecto inductivo del IGF-I sobre los linfocitos B, inmunoglobulinas y células plasmáticas, resultando los primeros los de más alto grado de expresión del receptor de la HC de todas las células plasmáticas (Badolato R., et al. (1994) Differential expression of surface membrane growth hormone receptor on human peripheral blood lymphocytes detected by dual fluorochrome flow cytometry. J Clin Endocrinol Metab. 79: 984-990). La HC puede afectar a los linfocitos B (L0B) y L0T indirectamente por su efecto inductor sobre los macrófagos (M0) y los monocitos (Edwards C. K., et al. (1988) A newly defined property of somatotropin: priming of macrophages for production of superoxide anión. Science 239: 769-771), en estos últimos también promueve la quimiotaxis. Estas células a su vez influyen sobre los linfocitos a través de las citoquinas que secretan. Además, la HC revierte la deficiencia de células NK (Davila D. R., et al. (1987) Role of growth hormone in regulating T-dependent immune events in aged, nude, and transgenic rodents. Neurosci. Res. 18: 108-116). El ADN complementario (ADNc) de hormonas de crecimiento de peces ha sido clonado y secuenciado y se ha demostrado que la HC recombínante ejerce un potente efecto sobre el crecimiento en peces por inyección (Tsai H. J., et al. (1993) Expressíon of raínbow trout growth hormone cDNA in yeast. Bull. Inst. Zool. Acad. Sin. 32: 162-170) o por inmersión (Moriyama S. and Kawauchi H. (1990) Growth stímulation of juvenile salmonids by immersíon in recombinant salmón growth hormone. Nippon Suisan Gakkaishi 56: 31-34).

La HC humana existe como un heterogéneo grupo de proteínas relacionadas estructuralmente y que se encuentran en la glándula pituitaria (Baumann G., et al. (1983) The molecular nature of circulating growth hormone in normal and acromegalic man: evidence for a principal and minor monomeric forms. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56: 946-952), el plasma (Baumann G., et al. (1985) Molecular forms of circulating growth hormone during spontaneous secretory episodes and ¡n the basal state. J. Clin. Endocrinol. Metab. 60: 1216-1220) y la orina (Baumann G. and Abramson E. C. (1983) Urinary growth hormone in man: evidence for múltiple molecular forms. Endocrinology 56: 305-311). La forma predominante de HC humana es un polipéptído de 22 Kda formado por una única cadena polipeptídica y que constituye el 85% de las HC humanas inmunorreactivas (Lewis U. J., et al. (1994) Variant forms and fragments of human growth hormone in serum. Acta Paediatr. Suppl. 399: 29-31 ). Otras moléculas de HC humanas incluyen un polipéptido formado por una única cadena polipeptídíca con un peso molecular de 20 Kda (Lewis U. J., et al. (1978) A naturally occurring structural variant of human growth hormone. J. Biol. Chem. 253: 2679-2687), formas acetiladas y deamidadas de la proteína de 22Kda (Lewis U. J., et al. (1981 ) Altered proteolytic cleavage of human growth hormone as a result of deamidation. J. Biol. Chem. 256: 11645-11650) y una variante cortada proteolíticamente para formar una proteína de dos cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro (Singh R. N., et al. (1974) Modified forms of human growth hormone with ¡ncreased biological activities. Endocrinology 94: 883-891 ). Varios estudios han demostrado que la forma más activa de HC humana es esta última variante que es el resultado de digestiones limitadas por proteinasas entre los residuos de aminoácidos 134 y 150 de la HC humana de 22 Kda (Wroblewski V. J., et al. (1991 ) Proteolytic cleavage of human growth hormone (hGH) by rat tissues in vitro: influence on the kinetics of exogenously adminístered hGH. Endocrinology 129: 465-474). Se sugiere que la mayor actividad biológica de esta variante se debe a que es más estable y es aclarada de la circulación más lentamente que el resto de las variantes (Baumann G. (1979) Metabolic clearance rates of isohormones of human growth hormone in man. J. Clin. Endocrinol. Metab. 49: 495-499). El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha permitido emplear bacterias y levaduras como sistemas hospederos para la producción de proteínas de interés en un proceso relativamente barato. La levadura Pichia pastoris constituye actualmente un hospedero muy utilizado para producir proteínas heterólogas. Este organismo ofrece los beneficios de sistemas como Escherichia coli consistentes en altos niveles de expresión, fácil manipulación y cultivo, y es capaz de combinarlos con las ventajas de un sistema eucariótico que realiza modificaciones post-traduccionales como el procesamiento proteolítíco, el empaquetamiento, la glicosilación y la formación de enlaces disulfuro (Higgíns D. R. and Cregg J. M. (1998) Introduction to Pichia pastoris. Píchia protocols. Humana Press Inc., Towota 1-15). Como sistema de expresión, requiere un manejo genético y molecular sencillo. Es menos caro que la expresión en células de insectos o en cultivos celulares de mamíferos, pues los medios para su crecimiento y expresión no requieren suplementos ni aditamentos especiales. Esta levadura se adapta fácilmente a fermentaciones a gran escala y tiene preferencia por el crecimiento respiratorio, un rasgo fisiológico que facilita su cultivo a altas densidades celulares. Existen varios reportes de estimulación del crecimiento mediante el uso de levaduras recombinantes que expresan hormona de crecimiento. Ha sido demostrado el efecto sobre el crecimiento de pollos alimentados con pienso enriquecido con P. pastoris recombinante que expresa HC (Chen C. M. et al. (2000) Growth enhancement of fowls by dietary administration of recombinant yeast cultures containíng enriched growth hormone. Life Sciences 67: 2103-2115). Además, Tsai y colaboradores reportaron en 1993 un crecimiento acelerado en tilapias por administración, como suplemento en la dieta, de levadura Saccharomyces cerevisiae que expresa HC (Tsai H. J., et al. (1993) Enhancement of tilapia growth by dietary adminístration of recombinant yeast lysates as a supplement. J. Fish. Soc. Taiwan 20: 339-345) En la patente US 6,239,100 se protege un polipéptido con una actividad similar a la hormona de crecimiento de peces y su uso para promover el crecimiento y reducir la mortalidad en larvas de peces. Promover el crecimiento en los peces, aumentar la sobrevida y mejorar la calidad de las larvas se mantiene como un problema importante a resolver en la acuicultura.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La presente invención resuelve el problema antes mencionado proporcionando polipéptidos con las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 7 y 8 y que muestran actividad superior a la hormona de crecimiento para su uso en peces y crustáceos. Como resultado principal se encontró que los polipéptídos, los cuales comprenden las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente, expresados de forma extracelular en Pichia pastoris y administrados por baños de inmersión o como suplemento del pienso a peces y crustáceos produce un incremento marcado en el crecimiento, aumenta la sobreviva y calidad de las larvas y mejora el sistema inmune. Además se demostró su superioridad con respecto a la hormona de crecimiento de tilapia. El uso de estos polipéptidos en la acuicultura ofrece varias ventajas entre las cuales se encuentran: (1 ) son moléculas más pequeñas que la hormona de crecimiento de peces por lo que puede ser absorbida por el organismo y llegar al torrente sanguíneo con mayor facilidad; (2) al ser fragmentos de la hormona de crecimiento de peces no tienen actividad biológica en humanos; (3) tienen un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento que la hormona de crecimiento de peces; (4) ejerce marcados efectos sobre el crecimiento, la sobrevida y la calidad de las larvas en una variedad de peces.

En la patente US 6,239,100 se protege el uso de un polipéptido con actividad similar a la hormona de crecimiento de peces para estimular el crecimiento y disminuir la mortalidad en larvas de peces. La secuencia reportada para dicho polipéptido tiene un 73% de homología comparado con la hormona de crecimiento de tilapia y carece de 51 nucleótidos de la porción N terminal. Los polipéptidos de nuestra invención fueron obtenidos a partir de la hormona de crecimiento de tilapia. El polipéptido SEQ ID NoJ carece de un fragmento de la porción C terminal correspondiente a 46 aminoácidos y el polipéptido SEQ ID No.8 carece de este fragmento y además de un fragmento en su porción N terminal correspondiente a 17 aminoácidos. A diferencia de la patente US 6,239,100, la cual reporta un polipéptido con actividad similar a la hormona de crecimiento, los polipéptídos de nuestra invención tienen una actividad superior a la hormona de crecimiento, la cual no es especie específica. Además el polipéptido SEQ ID NoJ que carece de un fragmento de la porción C terminal tiene una actividad promotora del crecimiento superior al polipéptido SEQ ID No.8. En una materialización de la invención, las composiciones que comprenden cualquiera de los polipéptidos definidos en las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 7 y 8 estimulan el crecimiento de peces y crustáceos. La presente invención involucra el clonaje de la secuencia codificante de los polipéptidos antes mencionados en un vector de expresión en Pichia pastoris denominado pPStO.

Las secuencias codificantes para dichos polipéptidos fueron obtenidas mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (en inglés Polymerase Chain Reaction, abreviado PCR) a partir de ADNc de hormona de crecimiento de tilapia previamente clonado en el vector pR17 (Guillen I. I., et al. (1998) Physiological changes in the juvenile euryhaline teleost, the tilapia Oreochromis homorum, injected with E. coli-derived homologous growth hormone. J Mar. Biotechnol. 6: 142-51 ). La hormona de crecimiento de tilapia fue también amplificada por PCR a partir del vector pR17. El vector utilizado en la construcción genética para la expresión de las proteínas de interés en P. pastoris contiene el promotor AOX1 de P. pastoris (pAOX1 ), la señal de secreción de la sucrosa invertasa 2 de S. cerevisiae (spSUC 2) y la señal de terminación de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPt) de S. cerevisiae. Está presente además una secuencia de ADN cromosomal de P. pastoris correspondiente a la región 3'AOX necesaria para la recombinación de homólogos con la levadura y el gen HIS3 de S. cerevisiae que constituye el marcador de selección en levaduras. El vector contiene además un origen de replicación funcional en E. coli y el gen de resistencia a ampicillina como marcador de selección en bacterias. Los vectores usados para generar cepas recombinantes de P. pastoris son generalmente integratívos. Previo a la transformación los plasmidios deben ser linealizados con vistas a favorecer la recombinación homologa por el gen AOX1.

La cepa MP36 de P. pastoris fue utilizada para la producción extracelular de las proteínas recombínantes. Dicha cepa es un mutante auxotrófico his3 obtenido a partir de la cepa de Pichia pastoris BKM-90 (EP 00438200), la cual luego de la transformación con el vector de expresión adquiere un fenotipo Hís+ (Yong V., et al. (1992) HIS-3 gene of Saccharomyces cerevisiae complement his mutation in yeast Pichia pastoris. Biotecnología Aplicada 9: 55-61). Varios estudios han demostrado un efecto estimulador del crecimiento por la administración vía inmersión de hormona de crecimiento recombinante en varias especies de peces. Sin embargo, esta invención constituye el primer reporte sobre la estimulación del crecimiento en peces por inmersión en sobrenadante de cultivo de Pichia pastoris conteniendo polipéptidos con actividad superior a la hormona de crecimiento sin previa purificación de las proteínas de interés. El efecto de los polipéptidos que son objetivo de la presente invención sobre el crecimiento, la resistencia a patógenos y los parámetros del sistema inmune fue probado en larvas de tilapias y comparado con la hormona de crecimiento de tilapia. La vía de administración fue por inmersión. Los grupos experimentales fueron sobrenadante de cultivo de la cepa recombinante MP36 de P. pastoris que contiene los polipéptidos, sobrenadante de cultivo de la cepa recombinante MP36 de P. pastoris que contiene la hormona de crecimiento de tilapia, un control negativo que se le administró sobrenadante de cultivo de la cepa negativa de MP36 de P. pastoris y un grupo no tratado. Los resultados muestran que el grupo de larvas de tilapía tratadas con los polipéptidos incrementó significativamente su peso comparado con la hormona de crecimiento de tilapia, el control negativo y el grupo no tratado. Para analizar el efecto sobre el sistema inmune se maceraron 20 animales por grupo y se midieron diferentes parámetros de stress oxidativo y la presencia de diferentes factores humorales no específicos como lisozima y la presencia de lectínas. Se midió: «Glutatión reducido (GSH): Es un cofactor de la Glutatión peroxidasa y por tanto, uno de los sistemas de defensa del organismo contra el stress oxidativo. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos, aunque hay una tendencia a aumentar en los polipéptídos 1 y 2. •Superóxido dismutasa: Enzima de los sistemas de defensa antioxidante. Captura radicales libres superóxido. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos, aunque hay una tendencia a aumentar en los polipéptidos 1 y 2. •Organoperóxidos totales: Es uno de los elementos del sistema pro-oxidante, constituye un precursor de radicales hidroxilo y puede ser además inductor de genes, mecanismos de activación celular y regulador de fosfatasas y quinasas. Es además cofactor de la glutati?n S transferasa que interviene en la detoxificacíón de xenobiótícos. No hay diferencias significativas entre los grupos.

•Catalasa: Es un indicador de stress oxidativo que se expresa en la oxidación de las biomoléculas. Cuando los niveles están aumentados es un indicador de la presencia de radicales libres que no pueden ser metabolizados por la vía de la glutatión peroxidasa. A los 21 días no se observaron diferencias significativas entre los grupos. Sin embargo, a los 45 días hubo una disminución significativa de los niveles de catalasa en los grupos tratados con los polipéptidos con respecto a los grupos no tratados. •Potencial de peroxídación: Proporciona una medida del desplazamiento de los lípidos a lípídos oxidados. Se obtuvieron diferencias significativas de los grupos experimentales con respecto al grupo no tratado, con una mayor tendencia para los grupos tratados con los polipéptidos 1 y 2. •Productos avanzados de la oxidación proteica: Proporciona una medida del desplazamiento de las proteínas a proteínas oxidadas. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos. Debido a que el potencial de peroxidación es una medida del stress oxidatívo en los organismos, los polipéptídos ensayados producen un stress oxídativo de leve a moderado en comparación con el grupo no tratado. El stress oxidativo es un importante evento fisiológico regulatorio, esto lo demuestra el hecho de que a los 45 días de iniciado el tratamiento aunque se mantiene el stress oxidativo con efecto sobre la oxidación lipídica comienzan a disminuir los niveles de catalasa significativamente en los grupos tratados con los polipéptidos 1 y 2 respecto al grupo no tratado lo cual es un indicador de la disminución de radicales libres y por tanto, del stress oxidatívo. Los lípídos proporcionan el mayor cociente energía/masa respecto a las otras bíomoléculas que almacenan energía. Se ha demostrado que la HC inhibe la lipogénesis y activa la lipólísis y que los ácidos grasos resultantes son sustratos oxidativos ideales, desviando de esta forma los aminoácidos del proceso oxidativo hacia el de crecimiento, por lo que la oxidación de los lípidos observada en nuestro experimento puede estar relacionada con este proceso. Otros parámetros relacionados con el sistema inmune son la lisozima y las lectinas. Se conoce que la lisozíma es un componente de las funciones inmunes no específicas contra infecciones virales y bacterianas y se ha observado correlación entre los niveles de lisozima y de hormona de crecimiento en peces (Yada T., et al. (2002) Immunomodulatory effects of prolactin and growth hormone in the tilapia, Oreochromis mossambicus. J Endocrinol. 173: 483-492). Las lectinas reaccionan con un número diverso de patógenos y se piensa que confieren inmunidad innata (Alexander J.B. and Ingram G.A., (1992) Noncellular nonspecific defence mechanismof fish. Annu. Rev. Fish. Dis. 2: 249-279). Tanto en las lisozimas como en las lectinas se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados con los polipéptidos 1 y 2 con respecto al grupo no tratado.

El efecto de los polipéptidos fue ensayado además en larvas de peces ornamentales demostrándose que eran capaces de estimular significativamente el crecimiento y la sobreviva de los peces tratados comparado con el control negativo, así como mejorar la coloración de dichos peces lo cual es un parámetro crucial para su comercialización. Se demostró también que el efecto provocado por estos polipéptidos se mantenía en el tiempo luego de eliminados los tratamientos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una estrategia de clonaje de las proteínas de interés en el vector de expresión en Pichia pastoris. La figura 2 es un análisis de expresión de los clones transformantes que muestran un fenotipo Muts. Western Blot de las proteínas de interés presentes en el sobrenadante de cultivo de P. pastoris. Carril 1 : MP36 no transformada; Carril 2: Polipéptido 1 ; Carril 3: Polipéptido 2; Carril 4: Hormona de crecimiento de tilapia. La figura 3 es un experimento de crecimiento en larvas de tilapia por inmersión en sobrenadante de cultivo conteniendo las proteínas de interés a una dosis de 0.1 mg/litro de agua. La gráfica representa el promedio del peso corporal de los grupos tratados comparados con sus controles negativos. La figura 4 es un experimento de crecimiento en larvas de goldfish por inmersión en sobrenadante de cultivo conteniendo las proteínas de interés a una dosis de 0.1 mg/litro de agua. La gráfica representa el promedio del peso corporal de los grupos tratados comparados con el control negativo. La figura 5 es un experimento de crecimiento en larvas de goldfish por inmersión en sobrenadante de cultivo conteniendo las proteínas de interés a una dosis de 0.1 mg/litro de agua. La gráfica representa el porciento de sobrevida de los grupos experimentales a los 45 días de iniciados los tratamientos. La figura 6 es un experimento de crecimiento en larvas de goldfish por inmersión en sobrenadante de cultivo conteniendo las proteínas de interés a una dosis de 0.1 mg/lítro de agua. Los peces tratados muestran una coloración más brillante que los controles negativos. La figura 7 es un experimento de crecimiento en larvas de carpa por inmersión en sobrenadante de cultivo conteniendo el polipéptido 1 a tres dosis diferentes (0.02; 0.1 y 0.5mg/litro de agua). La gráfica representa el promedio del peso corporal de los grupos tratados comparados con el control negativo. La figura 8 es un experimento de crecimiento en tilapia por administración en el pienso de sobrenadante de cultivo conteniendo el polipéptido 1 a dos dosis diferentes (4.8 mg de polipéptido/Kg de pienso y 38.4 mg de polipéptido/Kg de pienso). La gráfica representa el promedio del peso corporal de los grupos tratados comparados con el control negativo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de los vectores de expresión en Pichia pastoris conteniendo las secuencias codificantes para los polipéptidos que son obietivo de esta invención y la hormona de crecimiento de tilapia, transformación de la cepa MP36 y expresión de las proteínas de interés Las secuencias codificantes para los polipéptidos antes mencionados fueron obtenidas por PCR a partir del ADN complementario de la hormona de crecimiento de tilapia previamente clonado en el vector pR17 con olígonucleótidos específicos. Para amplificar la secuencia codificante para el polipéptido SEQ ID NoJ se utilizaron los oligonucleótidos cebadores correspondientes a las secuencias SEQ. ID No.1 y SEQ. ID No.2. Para amplificar la secuencia codificante para el polipéptido SEQ ID No.8 se utilizaron los oligonucleótidos cebadores correspondientes a las secuencias SEQ. ID No.3 y SEQ. ID No.4. La secuencia codificante para la hormona de crecimiento de tilapia fue amplificada por PCR a partir del vector pR17 empleando los oligonucleótidos cebadores correspondientes a las secuencias SEQ. ID No.5 y SEQ. ID No.6. Los productos de PCR fueron tratados con la enzima polinucleótido quinasa con el objetivo de fosforilar los extremos del gen y facilitar su clonaje en el vector de expresión. El vector de expresión en Pichia pastoris pPS10 fue digerido enzimátícamente con la endonucleasa de restricción Nael, y sometido a un tratamiento con fosfatasa alcalina para la desfoforilación de los extremos y la inserción de los genes que codifican para los polipéptidos de interés y la hormona de crecimiento de tilapia (Fig. 1 ). Previo a la transformación, los plasmidíos son linealizados con la enzima de restricción Sphl. La cepa MP36 de P. pastoris fue transformada mediante electroporación con el vector de expresión recombinante. Dicha cepa es un mutante auxotrófico his3 la cual luego de la transformación adquiere un fenotipo His+. Los clones transformantes identificados mediante Dot Blot fueron analizados por Southern Blot para determinar en cuales había ocurrido la integración mediante reemplazamiento del gen AOX1 de P. pastoris por el cásete de expresión del plásmido recombinante, lo cual corresponde con un fenotipo Muts (baja utilización del metanol) e His+. El reemplazamiento génico de AOX1 ocurre por entrecruzamientos de las regiones del promotor de AOX1 y 3 AOX1 entre el vector y el genoma. Como resultado de estos entrecruzamientos ocurre la deleción de la región codificadora del gen AOX1. Las cepas recombinantes con fenotipo Muts basan la producción del alcohol oxidasa (AOX) en el gen AOX2 y su tasa de crecimiento en metanol es baja. Los genes que codifican para los polipéptidos de interés y la hormona de crecimiento de tilapia están bajo la regulación del promotor A0X1 , el cual es inducible por metanol y tienen una señal de secreción. La P. pastoris secreta solamente bajos niveles de proteínas propias y su medio de cultivo no necesita suplementos proteicos, por tanto, se puede esperar que una proteína heteróloga que se secreta, constituya la mayoría del total de proteínas en el medio (hasta más de un 80 %) (Tschopp y col.; Bio/Technology 1987, 5: 1305-1308; Barr et al.; Pharm. Eng. 1992, 12: 48-51 ). La producción de las proteínas recombínantes presentes en esta invención se realizó en fermentadores de 5L medíante la adición de metanol al cultivo. Como se muestra en la Fig. 2, para chequear la expresión de las proteínas en el sobrenadante de cultivo se realizó Western Blot utilizando un anticuerpo monoclonal específico para hormona de crecimiento de tilapia.

EJEMPLO 2 Experimento de estimulación del crecimiento y efecto sobre el sistema inmune en larvas de tilapia por baños de inmersión con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo los polipéptidos de interés Se tomaron cuatro grupos de larvas de tilapia y se les aplicaron tres baños de inmersión semanales, de una hora y media de duración. La dosis administrada fue 0.1 mg de proteína de interés/litro de agua. Los grupos experimentales fueron: 1. Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipóptido 1 (Tratamientol ). 2.Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptido 2 (Tratamiento 2). 3.Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo la hormona de crecimiento de tilapia (Tratamiento 3). 4.Grupo control tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris negativa (Control negativo). 5. Grupo no tratado. La dosis administrada de cada uno de los polipéptidos y de la hormona de crecimiento de tilapia fue sobrenadante de cultivo correspondiente a 0.1 mg de proteína de interés/litro de agua. Como resultado se obtuvo que a los 45 días de iniciado el tratamiento las larvas tratadas con el polipéptido SEQ ID NoJ tuvieron un incremento en peso 3.6 veces superior con respecto al grupo no tratado, 2.1 veces superior con respecto al control negativo y 1.6 veces superior con respecto al grupo tratado con hormona de crecimiento de tilapia. Por otra parte, las larvas tratadas con el polipéptido SEQ ID No.8 tuvieron un incremento en peso 3.2 veces superior con respecto al grupo no tratado, 1.9 veces superior con respecto al control negativo y 1.4 veces superior al grupo tratado con hormona de crecimiento de tilapia (Fig. 3).

CUADRO 1 Pesos de las larvas (q) Los datos se presentan como el promedio del peso ± la desviación estándar.

CUADRO 1.1 Análisis estadístico de los datos a los 45 días de iniciados los Estos resultados son de gran importancia ya que al acelerar el crecimiento de los peces de importancia económica en los estadios iniciales de su vida, provoca una mayor sobrevida en la fase del cultivo lo que es vital para aumentar la productividad.

Para analizar el efecto sobre el sistema inmune a los 21 y 45 días de iniciado el experimento se tomaron 20 animales por grupo, se maceraron y se midieron diferentes parámetros del stress oxidativo: .Glutatión reducido (GSH) •Superóxído dismutasa •Órgano peróxidos totales •Catalasa •Potencial de peroxidacíón •Productos avanzados de la oxidación proteica. De los parámetros analizados a los 21 días solo se observaron diferencias significativas en el potencial de peroxidación entre los grupos tratados y el control negativo. Se midió actividad lisozima en los extractos de larvas a los 45 días de iniciados los tratamientos. Para ello se utilizó el método basado en la habilidad de la lisozima de lisar la bacteria Micrococcus lysodeikticus (Ellis, Techniques in Fish Immunology. Faír haven, N.J: SOS Publícations 1990: 101-103). En una placa de 96 pocilios se aplicaron 100 µL de muestra y se mezcló con 100 µL de una suspensión a 3 mg/mL de Micrococcus lysodeikticus (Sigma) en buffer fosfato 0.05M pH 6.2 la placa se incubó a 22°C y se leyó la D.O a 450 nm a los 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30 y 45 min. Como control positivo se utilizó lisozima de clara de huevo de gallina en diluciones seriadas a partir de 8 µg/mL y como control negativo se usó buffer en lugar de los extractos de larvas. Se definió como una unidad de actividad de lisozima a la cantidad de extracto de las larvas que causa un decremento en la D.O de 0.001 min"1. Se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados con los polípéptídos SEQ ID NoJ y SEQ ID No.8 respecto al grupo no tratado (cuadro 2). Se realizó además un ensayo de hemoaglutinación para determinar la presencia de lectinas en los extractos. Para esto se realizaron diluciones seriadas partiendo de 100 µL de extracto, utilizando PBS pH 7.2 en una placa de 96 pocilios con fondo en U (Costar). Se añadió igual cantidad de una solución de eritrocitos de conejo al 2%. Se incubaron las placas 1h a temperatura ambiente y se leyó el título de hemoaglutinación visualmente. La actividad de las lectinas fue expresada como el título: el recíproco de la dilución más alta que mostró hemoaglutinación completa. Se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados con los polipéptidos SEQ ID No.J y SEQ ID No.8 respecto al grupo no tratado (cuadro 3).

CUADRO 2 Concentración de lisozima (µg/mL) en los extractos de larvas a los 45 días de iniciado el experimento La concentración está dada como el promedio ± la desviación estándar ANOVA, test de Turkey. Denota diferencias significativas (p<0.05) CUADRO 3 Título de hemoaglutinación (el recíproco de la dilución más alta que mostró hemoaglutinación completa) en los extractos de larvas a los 45 días de iniciado el experimento ANOVA, test de Turkey. Denota diferencias significativas (p<0.05) EJEMPLO 3 Experimento de estimulación del crecimiento y mejora de la calidad de las larvas en goldfish por baños de inmersión con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo los polipéptidos de interés Se tomaron cuatro grupos de larvas de goldfish y se les aplicaron tres baños de inmersión semanales, de una hora y media de duración. La dosis administrada fue 0.1 mg de proteína de interés/litro de agua. Los grupos experimentales fueron: 1. Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptido SEQ ID NoJ (Tratamientol ). 2.Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptido SEQ ID No.8 (Tratamiento 2). 3. Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo la hormona de crecimiento de tilapia (Tratamiento 3). 4.Grupo control tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris negativa (Control negativo). La dosis administrada de cada uno de los polipéptidos de la presente invención y de la hormona de crecimiento de tilapia fue sobrenadante de cultivo correspondiente a 0.1 mg de proteína de interés/litro de agua. A los 45 días de iniciado el experimento los tratamientos 1 y 2 mostraron un incremento significativo en el peso corporal comparados con los tratamientos 3 y 4. A los 75 días las larvas tratadas con los polipéptido SEQ ID No.7 y SEQ ID No.8 tuvieron un incremento en peso 2 veces superior con respecto al control negativo y 1.5 veces superior con respecto al grupo tratado con hormona de crecimiento de tilapia. (cuadro 4; cuadro 4.1 ; Fig. 4). Además los tratamientos 1 , 2 y 3 mostraron un aumento de la sobreviva comparados con el control negativo (Fig. 5). La coloración de los peces ornamentales es un parámetro importante a tener en cuenta para su comercialización. En este experimento se observó que las larvas sometidas a los tratamientos 1 y 2 adquirían la coloración en un estadio más temprano del desarrollo que las del control negativo y a los 75 días de iniciado el experimento tenían una coloración más brillante (Fig. 6). Estos resultados se repitieron en otras especies de peces ornamentales.

CUADRO 4 Pesos de las larvas (g) Los datos se presentan como el promedio del peso ± la desviación estándar.

CUADRO 4.1 Análisis estadístico de los datos a los 75 días de iniciados los EJEMPLO 4 Experimento de crecimiento en carpas por baños de inmersión con diferentes dosis del polipéptido 1 Se determinó el efecto de diferentes dosis del polipéptidol sobre el crecimiento en larvas de carpa. Se tomaron cuatro grupos experimentales: 1. Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptído SEQ ID NoJ a una dosis de 0.02mg de polipéptido/lítro de agua (Tratamientol ). 2. Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptido SEQ ID NoJ a una dosis de 0.1 mg de polipéptido/litro de agua (Tratamiento2). 3.Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptido SEQ ID No.7 a una dosis de 0.5mg de polipéptido/litro de agua (Tratamiento3). 4.Grupo no tratado. A los 30 días de iniciado el experimento las larvas tratadas con la dosis de 0.5mg de polipéptido SEQ ID No.7/litro de agua tuvieron un incremento en peso 2J5 veces superior con respecto al grupo no tratado y las larvas tratadas con 0.1 mg de polipéptído SEQ ID No.7/litro de agua tuvieron un incremento en peso 1.8 veces superior con respecto al grupo no tratado. No se observaron diferencias significativas entre el grupo no tratado y la dosis mínima, (cuadro 5; cuadro 5.1 ; Fig. 7).

CUADRO 5 Pesos de las larvas (g) Los datos se presentan como el promedio del peso ± la desviación estándar.

CUADRO 5.1 Análisis estadístico de los datos a los 30 días de iniciados los tratamientos EJEMPLO 5 Experimento de crecimiento en camarones Litopenaeus scmitti por baños de inmersión con el sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo los polipéptidos de interés Se tomaron tres grupos de larvas de camarones y se les aplicaron tres baños de inmersión semanales, de una hora y media de duración. La dosis administrada fue 0.1 mg de proteína de interés/litro de agua. Los grupos experimentales fueron: 1. Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptido SEQ ID NoJ (Tratamientol ). 2.Grupo tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris conteniendo el polipéptído SEQ ID No.8 (Tratamiento 2). 3.Grupo control tratado con sobrenadante de cultivo de P. pastoris negativa (Control negativo). Como resultado se observó que en los grupos tratados con los polipéptídos de la presente invención se mejoraba la calidad de las larvas de los camarones Litopenaeus schmitti. Esto estaba evidenciado en que las larvas tratadas con los polipéptido SEQ ID No.7 y SEQ ID No.8 tuvieron un incremento en peso 2.3 veces superior con respecto al control negativo, un mayor número de pares de ramificaciones branquiales y modificaciones rostrales. Para cada parámetro se realizó el test estadístico correspondiente encontrándose en todos los casos diferencias significativas.

EJEMPLO 6 Experimento de crecimiento en tilapias mediante la inclusión en la dieta de diferentes dosis del polipéptido SEQ ID NoJ Se determinó el efecto de dos dosis del polipéptido SEQ ID NoJ sobre el crecimiento en tilapias juveniles que tenían un peso inicial de 72.99±3.25 g. Las dosis ensayadas fueron 4.8 mg de polipéptido SEQ ID No.7/Kg de pienso y 38.4 mg de polipéptido SEQ ID NoJ/Kg de pienso. La formulación oral fue preparada por inclusión en dieta basal del sobrenadante de P. pastoris conteniendo la dosis correspondiente del polipéptido de interés. El control negativo fue tilapias alimentadas con dieta basal enriquecida con sobrenadante de P. pastoris negativa. Durante el experimento los peces fueron alimentados dos veces al día con una cantidad de pienso equivalente al 5% de su peso corporal durante 6 semanas. A los 45 días de iniciado el experimento el polipéptido SEQ ID No.7 incluido en la dieta a una dosis de 4.8 mg de polipéptido SEQ ID No.7/Kg de pienso incrementó el crecimiento de las tilapias en un 22 % respecto al control. Con diferencias altamente significativas (p<0.001 ). La dosis 38.4 mg de polipéptido SEQ ID NoJ/Kg de pienso no mostró diferencias significativas respecto al control negativo, (cuadro 6; cuadro 6.1 ; Fig. 8).

CUADRO 6 Pesos de los peces (g) Los datos se presentan como el promedio del peso ± la desviación estándar.

CUADRO 6.1 Análisis estadístico de los datos a los 30 días de iniciados los tratamientos Los organismos acuáticos son actualmente una fuente importante de proteínas, pero su captura de forma natural se encuentra al límite máximo de su explotación, por lo que para aumentar su producción se hace necesario su cultivo. Se ha demostrado que en la mayoría de estos organismos existe un margen amplio en el cual se puede manipular el crecimiento por la administración de hormonas, la modificación genética de los animales, entre otras vías (Pullin y col.; Conference Proceeding 7, 432 p. International Center for living Aquatic Resources Monagement. Manila, Philippines. 1982, ISSN 0115-4389). Los polipéptídos presentados en esta invención tienen como ventajas que no tienen especificad de especie y por tanto pueden ser aplicables en diversos organismos acuáticos para múltiples funciones, entre ellas, aumentar el crecimiento, la sobrevida y la calidad de las larvas, así como mejorar parámetros involucrados en el sistema inmune. Además se demostró que poseen un efecto sobre el crecimiento significativamente superior a la hormona de crecimiento. Por otra parte, dichos polipéptidos no tienen actividad biológica en humanos, disminuyendo los inconvenientes que tienen los productos que son aplicados a especies que consume el hombre. Además su uso en peces ornamentales resulta muy atractivo no solo porque reduce el tiempo de cultivo al acelerar el crecimiento, sino también por el efecto de estos polipéptidos sobre la coloración de los peces.

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un polipéptído cuya cadena de polipéptidos consiste en una secuencia de aminoácidos contenida en las secuencias SQ ID No. 7 o SEQ ID NO. 8.

2.- El polipéptído de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque se obtuvo en Pichia pastoris,

3.- Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos definidos en la reivindicación 1 para estimular el crecimiento en peces y crustáceos. 4.- El uso de sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contoenen los polipéptidos descritos en la reivindicación 1 , en formulaciones de alimento para estimular el crecimiento y/o la resistencia a enfermedades en peces y crustáceos en una dosis eficiente como

4.8 mg del polipéptido/kg de alimento.

5.- El uso de sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contoenen los polipéptidos descritos en la reivindicación 1 , para tratamientos vía inmersión en peces y crustáceos para estimular el crecimiento, supervivencia y calidad de larvas en una concentración entre 0.05 y 0.5 mg del polipéptido/litro de agua.

6.- Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos de la reivindicación 1 para estimular el sistema inmune innato humoral de los peces y crustáceos.

7.- Una composición que comprende cualquiera de los polipéptídos definidos en la reivindicación 1 para el tratamiento de peces ornamentales.