MX2008000415A - Efecto sinergico de la asociacion de fitasas sobre la hidrolisis del acido fitico. - Google Patents

Abstract

Se describen las composiciones y procedimientos que asocian al menos dos fitasas para la hidrolisis del acido fitico (hexakisfosfato de mio-inositol) en monofosfatos inorganicos, en mio-inositoles de grado de fosforilacion inferior y en mio-inositol libre. Estas composiciones y procedimientos presentan en particular un interes para la alimentacion animal.

Description

EFECTO SINERGICO DE LA ASOCIACIÓN DE FITASAS SOBRE LA HIDRÓLISIS DEL ACIDO FITICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere al efecto sinérgico de la asociación de las fitasas sobre la hidrólisis del ácido fítico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las sales del ácido fítico (mioinositol-hexakis-fosfato) o los fitatos (mioinositol-hexakis (fosfato diácido) son la forma principal de almacenamiento del fósforo en los cereales, las plantas leguminosas y las oleaginosas. Estos constituyen así la fuente principal de fósforo en los alimentos para animales a base de plantas, compuestos principales de los regímenes de los animales monogástricos (aves de corral y cerdos) . No obstante, la biodisponibilidad de este fósforo en los alimentos está limitada para estos animales. En efecto, éstos no poseen las enzimas intestinales que degradan los fitatos en cantidad suficiente para permitir la hidrólisis de los fitatos, y proporcionar de este modo las cantidades de fósforo inorgánico que le son necesarias. El ácido fítico es un factor antinutricional, que forma complejos con las proteínas y los inones (Fe3+, Ca2+, Zn2+, Mg2+) y disminuye por lo tanto la disponibilidad de estos elementos. REF.: 189312 Las proporciones alimenticias de las aves de corral y de los cerdos deben ser pues suplementadas en fosfato inorgánico mientras que el fósforo de los fitatos es excretado y contribuye a la eutrofización de las aguas superficiales en las zonas de crianza intensiva de animales monogástricos . Las fitasas (3- y 6- fosfohidrolasas de hexakis-fosfato de mioinositol EC 3.1.3.8 y 3.1.3.26) forman parte de la familia de las histidinas-fosfatasas acidas. Las fitasas son hexakisfosfohidrolasas que hidrolizan los enlaces fosfoésteres presentes en el ácido fítico o la fitata.

También, Éstas catalizan la hidrólisis del hexakisfosfato de mioinositol (ácido fítico InsPß) en monofosfatos inorgánicos y en fosfato de mio-inositol de grado de fosforilación inferior (InsPs a InsPi) y en mio-inositol libre en ciertos casos. Existen dos subclases de fitasas, diferenciadas únicamente por la posición del primer fosfato hidrolizado. Las 3-fitasas (EC 3.1.3.8) hidrolizan el fosfato en la posición 3 y las 6-fitasas (EC 3.1.3.26) hidrolizan el fosfato en la posición 6. Estas enzimas utilizadas como aditivo en la alimentación animal, permiten por una parte aumentar la disponibilidad del fósforo fítico, por otra parte mejorar la digestibilidad de los alimentos. Además, la liberación de fosfato fítico disminuye considerablemente los costos debidos a la suplementación en fosfato, así como la contaminación provocada por un exceso de fosfatos excretados. Las fitasas son producidas por una gran variedad de organismos: plantas, animales y sobre todo microorganismos. Las fitasas poseen características bioquímicas muy diferentes, en particular su actividad en función del pH y su estabilidad a la temperatura. Además, estas enzimas presentan diferencias a nivel: (a) de su eficacia para hidrolizar la totalidad de los fosfatos, <b) de su estereospecificidad, (c) de su afinidad hacia los fosfatos de inositoles. Entre los microorganismos productores de fitasas se citarán principalmente: los hongos de los géneros Aepergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus, las bacterias: Pseudomonas sp. , Klebsiella sp. , Escherichia coli , Enterobacter sp. , Bacillus subtilis y las levaduras: Sa charomycee cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces caetellii , Debaryomyces occidentalis , (sinónimo Schwanniomyces caetellii) , Kluyveromycee fragilis . Numerosas fitasas de microorganismos han sido ya estudiadas y utilizadas en diversas aplicaciones agro-industriales. La eficacia de estas enzimas en los alimentos y en el curso de la digestión en el animal depende de su capacidad para mantener su potencial cualesquiera que sean las diferentes condiciones encontradas en el curso de las etapas de preparación del alimento, así como en el tracto digestivo. La preparación de los alimentos necesita las enzimas termorresistent.es mientras que los valores del pH varían por ejemplo de 5.02, 2.75, 6.28, 6.63, y 5.98 al momento del paso en los diversos compartimientos como el buche, estómago, duodeno, yeyuno, íleon de las aves de corral. La mayor parte de las fitasas descritas hasta hoy en día no hidrolizan más solo parcialmente el ácido fítico y algunos con cinéticas muy lentas. De este modo, numerosas fitasas no hidrolizan más que 5 enlaces fosfato del ácido fítico, o bien 83% del fósforo potencial. Hasta hoy en día, entre las levaduras, solo la fitasa de la levadura Schwanniomyces occidentalis ha sido descrita como hidrolizadora de todos los grupos fosfato del fitato (Patente europea EP 0 699 762 y Segueilha L., Lambrechts C, Boze H., Moulin G., Calzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces castellii, J. Ferm. Bioeng., 74, 7-11). En condiciones experimentales, no se obtiene sin embargo una hidrólisis completa del fitato o del ácido fítico. Para obtener una hidrólisis más eficaz del ácido fítico, se ha propuesto de este modo combinar diferentes fitasas. WO98/30681 describe la combinación de fitasas que tienen diferentes estereoespecificidades y principalmente la combinación de 3-fitasa y de 6-fitasa. Este documento describe en particular la combinación de una 6-fitasa de Peniophora lycii y de una 3-fitasa de Aepergiluus niger (fitasa Novo1 ) . La Patente de los Estados Unidos No. 6,183,740 describe igualmente la combinación de fitasas de diferentes estereoespecificidades así como la combinación con otras fosfatasas acidas. No obstante, no es observada una hidrólisis completa del ácido fítico en fosfato y en inositol. El problema que se propone resolver la presente invención consiste en mejorar la velocidad y la eficacia de hidrólisis del ácido fítico con el fin de obtener una hidrólisis completa del ácido fítico en diversas aplicaciones agroindustriales . Este problema es resuelto por las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de la presente invención en los cuales se asocian al menos dos fitasas específicas. De manera ventajosa, las composiciones de la presente invención permiten una hidrólisis completa de todos los grupos fosfato del ácido fítico gracias al efecto sinérgico observado. Ventajosamente, las composiciones de la presente invención son activas en un intervalo amplio de pH, adaptado a las aplicaciones agroindustriales de las fitasas, y principalmente a las aplicaciones en el dominio de la alimentación animal. Otra ventaja más de la presente invención es que las fitasas utilizadas son termoestables.

Descripción de las secuencias SEQ ID No. 1: Fitasa de Schwanniomycee caetellii . SEQ ID No. 2: Fitasa de Debaryomycee castellii . SEQ ID No. 3: Fitasa de Aspergillus niger. SEQ ID No. 4: Fitasa de Penicillium f?niculosum. SEQ ID No. 5: Fitasa de Peniophora lycii . SEQ ID No. 6: Secuencia que codifica para la fitasa de trigo.

SEQ ID No. 7: Fitasa de trigo (Triticum aes i um) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención tiene por objetivo una composición que asocia al menos dos fitasas para la hidrólisis del ácido fítico (1, 2 , 3 , 4, 5, 6-hexakisfosfato de mio-inositol) que comprende: - una primera fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: l o presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 2; una segunda fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 3. De preferencia, la primera fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de seis enlaces fosfato del ácido fítico. Preferentemente, la primera fitasa tiene una temperatura óptima que comprende entre 55°C y 80°C y un pH óptimo comprendido entre pH 3.5 y pH 5.

En una modalidad de realización preferida, la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanniomyces caetellii o una fitasa de la levadura Debaryomycee caetellii . En otra modalidad de realización preferida, la primera fitasa es la fitasa de la SEO. ID NO: 1 o la fitasa de la SEQ ID NO: 2. De preferencia, la segunda fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de al menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico. Preferentemente, la segunda fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 50°C y 60°C y un pH óptimo comprendido entre pH 2 y pH 6. En una modalidad de realización preferida, la segunda fitasa es una fitasa de Aepergillus niger. En una modalidad de realización preferida, la segunda fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 3. Preferentemente, las composiciones de acuerdo a la invención consisten de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales . La invención tiene igualmente por objetivo la utilización de una composición de acuerdo a la invención, para la fabricación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales. La invención tiene también por objetivo la utilización de una composición de acuerdo a la invención para aumentar la disponibilidad del fósforo fítico y mejorar la digestibilidad de los alimentos para animales. La presente invención se refiere también a un procedimiento de hidrólisis del ácido fítico (1,2,3,4,5,6-hexakis-fosfato de mio-inositol) en monofosfatos inorgánicos, en mio-inositoles de grado inferior de fosforilación y en mioinositol libre, que comprende las siguientes etapas: se coloca una primera fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 1 o que presentan al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 2; se coloca una segunda fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 3; se pone simultáneamente en contacto el ácido fítico con la primera fitasa y la segunda fitasa. De preferencia, la primera fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de seis enlaces fosfato del ácido fítico. Preferentemente, la primera fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 55°C y 80°C y un pH óptimo comprendido entre pH 3.5 y pH 5. En una modalidad de realización preferida, la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanniomycee caetellii o una fitasa de la levadura Debaryomyces caetellii . En una modalidad de realización particularmente ventajosa, la primera fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: l o la fitasa de la SEQ ID NO: 2. De preferencia, la segunda fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de al menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico. Preferentemente, la segunda fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 50°C y 60°C y un pH óptimo comprendido entre pH 2 y pH 6. En una modalidad de realización ventajosa, la segunda fitasa es una fitasa de Aspergí llus niger. En una modalidad de realización particularmente ventajosa, la segunda fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 3. La invención tiene también por objetivo un equipo o conjunto para la alimentación de animales, que comprende: - la fitasa de Schwanniomyces caetellii de la SEQ ID NO: 1 o la fitasa de Debaryomyces castellii de la SEQ ID NO: 2; la fitasa de Aspergillus niger de la SEQ ID NO: 3. Las composiciones de acuerdo a la invención asocian una primera fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: l o que presentan al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 2; y una segunda fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO : 3. De manera sorprendente, esta asociación específica de fitasas permite obtener un efecto sinérgico sobre la I? hidrólisis del ácido fítico. Las composiciones de acuerdo a la presente invención catalizan de este modo una hidrólisis rápida y total del ácido fítico en un amplio in-tervalo de pH. Se entiende por fitasa, las mio-inositol hexakisfosfato fosfohidrolasas (EC 3.1.3.8 y 3.1.3.26). Estas enzimas catalizan la hidrólisis . del 1, 2, 3 , 4, 5, 6-hexakisfosfato de mio-inositol (ácido fítico, InsPß) en monofosfatos inorgánicos y en fosfato de mio-inositol de grado inferior (Insps a Inspi) y en mio-inositol libre para ciertas fitasas. Las composiciones de acuerdo a la invención comprenden una primera fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: l o que presentan al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 2. La fitasa de la SEQ ID NO: 1 es una fitasa de la levadura Schwanniomycee caetellii mientras que la fitasa de la SEQ ID NO: es una fitasa de la levadura Debaryomyces caetellii . Estas fitasas tienen propiedades catalíticas muy parecidas y son pues intercambiables en las asociaciones de fitasas de acuerdo a la invención. De preferencia, la primera fitasa presenta al menos 80%, 90%, 95%, 98% y preferentemente al menos 99% de aminoácidos idénticos con la fitasa de la SEQ ID No. 1 o presente al menos 80 %, 90%, 95%, 98% y preferentemente al menos 99% de aminoácidos idénticos con la fitasa de la SEQ ID NO: 2. De preferencia, la primera fitasa tiene las mismas propiedades y principalmente las mismas propiedades catalíticas que las fitasas de la SEQ ID NO: 1 y de la SEQ ID NO: 2. Preferentemente, la primera fitasa es aislada de otras cepas de Schwanniomycee caetellii , de Debaryomycee caetellii o de otras levaduras. Alternativamente, la primera fitasa puede ser obtenida mediante técnicas de mutagénesis dirigida, por ejemplo. Por aminoácidos idénticos, se entiende los aminoácidos no variantes entre dos secuencias . La primera fitasa puede presentar una supresión, una adición o una sustitución de al menos un aminoácido con relación a las fitasas de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 2. Las fitasas de la SEQ ID NO: 1 y de la SEQ ID NO: 2 tienen propiedades catalíticas comunes. De acuerdo a la invención, la primera fitasa puesta en operación en las composiciones y los procedimientos de acuerdo a la invención, presenta un grado de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 1 y de la SEQ ID NO: 2 y conserva estas propiedades catalíticas comunes. De preferencia, primera fitasa tiene una actividad de 3-fitasa. Preferentemente, la primera fitasa cataliza la hidrólisis de seis enlaces fosfato del ácido fítico. Las 3-fitasas (EC 3.1.3.8) hidrolizan en primer lugar el fosfato en la posición 3. Una fitasa capaz de hidrolizar todos los enlaces fosfato del ácido fítico -(posiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6) cataliza la hidrólisis del 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexakisfosfato de mio-inositol (ácido fítico, InsP6) en monofosfatos inorgánicos y en mio-inositol libre. Numerosas fitasas no hidrolizan más que 5 enlaces fosfato del ácido fítico, o bien 83% del fósforo potencial. Estas enzimas hidrolizan el ácido fítico en monofosfato de mio-inositol, pero no en mio-inositol libre. Por "actividad de la fitasa", se entiende la actividad enzimática de la fitasa. Esta actividad se expresa en Unidades Internacionales (U.l). por miligramo de proteína. Una U.l. de actividad enzimática es la capacidad catalítica para transformar una micromol de sustrato por unidad de tiempo, a un pH y a una temperatura dados. De preferencia, la primera fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 55°C y 80°C y un pH óptimo comprendido entre pH 3.5 y pH 5. En una modalidad de realización preferida, la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanniomyces caetellii o una fitasa de la levadura Debaryomycee caetellii . En otra modalidad de realización particularmente ventajosa, la primera fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 1 o la fitasa de la SEQ ID NO: 2.

Las composiciones de acuerdo a la invención comprenden al menos una segunda fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 3. La fitasa de la SEQ ID NO: 3 es una fitasa del hongo filamentoso Aepergillue niger. De preferencia, la segunda fitasa presenta al menos 80%, 90%, 95%, 98% y preferentemente al menos 99% de aminoácidos idénticos con la fitasa de la SEQ ID NO: 3. De preferencia, la segunda fitasa conserva las propiedades y principalmente las propiedades catalíticas de la fitasa de la SEQ ID NO: 3. Preferentemente, esta fitasa es aislada de otras cepas de Aepergillue niger o de otros hongos filamentosos. Alternativamente, esta fitasa puede ser obtenida mediante las técnicas de mutagénesis dirigida, por ejemplo. Por "aminoácidos idénticos" se entiende los aminoácidos no variantes entre dos secuencias. La segunda fitasa puede presentar una supresión, una adición o una sustitución de al menos un aminoácido con relación a la fitasa de la SEQ ID NO: 3. De acuerdo a la invención, la segunda fitasa puesta en operación en las composiciones y los procedimientos de acuerdo a la invención, presenta por lo tanto un grado de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 3 y conserva las propiedades catalíticas de esta última.

De preferencia, la segunda fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de al menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico. Preferentemente, la segunda fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 50°C y 60°C y un pH óptimo comprendido entre pH 2 y pH 6. Todavía más preferentemente, la segunda fitasa tiene un primer pH óptimo entre pH 2.5 y 3.5 y un segundo pH óptimo entre pH 4.5 y 5.5. En una modalidad de realización preferida, la segunda fitasa es una fitasa de Aspergillue niger. En una modalidad de realización ventajosa, la segunda fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 3. La actividad enzimática de una fitasa varía principalmente en función del pH. Las fitasas tienen también gamas (o intervalos) de pH en los cuales su actividad enzimática es máe elevada u óptima. Por gama se entiende un intervalo de pH dado. Dos fitasas tienen actividades enzimáticas en los intervalos de pH complementarios mientras que estas fitasas tienen una actividad en los intervalos de pH diferentes. De preferencia, los intervalos se superponen o se trazaban parcialmente. Típicamente, las fitasas tienen una actividad enzimática más elevada a pH ácido. Dos fitasas que tienen intervalos de pH complementarios tienen también por ejemplo una actividad enzimática máxima entre pH 2 y pH 4 para la primera fitasa, y una actividad enzimática máxima entre pH 4 y pH6 para la segunda fitasa. En las composiciones y los procedimientos de la presente invención, la primera y la segunda fitasa tienen de preferencia intervalos de pH o pHs óptimos complementarios . Las composiciones y los procedimientos de acuerdo a la invención permiten de este modo una hidrólisis del ácido fítico en un intervalo de pH grande. Los métodos de la invención y de identificación del grado de identidad entre los polipéptidos son conocidos por el experto en la materia. Se pueden emplear por ejemplo Vector NTi 9.1.0, programa de alineamiento AlignX (algoritmo Clustal W) Clustal algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). De preferencia, se utilizan los parámetros por omisión. Las fitasas de las composiciones y procedimientos de acuerdo a la invención son aisladas o purificadas de su ambiente natural. Las fitasas pueden ser preparadas por medio de diferentes procedimientos. Estos procedimientos son principalmente la purificación a partir de fuentes naturales tales como las células que expresan naturalmente estas fitasas, la producción de fitasas recombinantes por las células hospederas apropiadas y su purificación ulterior, la producción por síntesis química o, finalmente, una combinación de estos diferentes procedimientos. Estos diferentes procedimientos de producción son bien conocidos por el experto en la materia. De este modo, las fitasas puestas en operación en las composiciones y los procedimientos de la presente invención pueden ser aisladas a partir de Schwanniomyces caetellii , de Debaryomycee caetellii o de Aepergillue niger. En otra modalidad de realización, las fitasas de la presente invención son aisladas a partir de organismos hospederos recombinantes . Preferentemente, las composiciones de acuerdo a la invención consisten de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales. La invención tiene igualmente por objetivo la utilización de una composición de acuerdo a la invención para la fabricación de un aditivo nutricional para animales o un alimento para animales . La presente invención se refiere pues igualmente a los aditivos alimentarios de acuerdo a una . actividad de fitasa. El aporte de este tipo de actividad enzimática permite mejorar la digestibilidad del alimento y mejorar su valor nutricional. Se entiende por "aditivo nutricional" una sustancia agregada intencionalmente a un alimento, en general en pequeñas cantidades, para mejorar sus características nutricionales o su digestibilidad. Los aditivos nutricionales para animales pueden por ejemplo contener vitaminas, sales minerales, aminoácidos y enzimas. La presente invención se refiere también a los alimentos para animales. Estos alimentos se presentan habitualmente bajo la forma de harinas o de granulos en los cuales se incorporan los aditivos de acuerdo a la invención. Por "alimento" se entiende cualquier cosa que pueda servir para la nutrición de los animales. Para la crianza intensiva de los animales, los alimentos para animales comprenden habitualmente una base nutricionai y aditivos nutricionales. Por "base nutricional" se entiende aquello que constituye lo esencial a la ración alimentaria del animal, constituida a manera de ejemplo, por una mezcla de cereales, de proteínas y de materias grasas de origen animal y/o vegetal . Las bases nutricionales para animales están adaptadas para la alimentación de estos animales y son bien conocidas por el experto en la materia. Habitualmente, estas bases nutricionales comprenden por ejemplo maíz, trigo, garbanzos y soya. Estas bases nutricionales, están adaptadas a las necesidades de las diferentes especies animales a las cuales están destinadas. Estas bases nutricionales pueden ya contener aditivos nutricionales como las vitaminas, sales minerales y aminoácidos. En una modalidad de realización preferida, la invención se refiere a los alimentos para animales monogástricos y principalmente para las aves de corral y los cerdos . Las aves de corral comprenden principalmente las gallinas ponedoras, los pollos para carne, pavos y patos. Los cerdos comprenden principalmente los cerdos de engorda y matanza así como los lechones. La invención tiene también por objetivo la utilización de una composición de acuerdo a la invención para aumentar la disponibilidad del fósforo fítico y mejorar la digestibilidad de los alimentos para animales. Las composiciones y los procedimientos de acuerdo a la invención asocian una primera fitasa capaz de hidrolizar todos los enlaces fosfato del ácido fítico, elegidas entre las fitasas de Schwanniomycee caetellii y las fitasas de Debaryomycee castellii , y una segunda fitasa capaz de hidrolizar al menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico y que tiene una actividad enzimática en una gama de pH complementaria a la gama de pH de la primera fitasa.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras la-Ib: Comparación de las cinéticas de hidrólisis del ácido fítico a diferentes pH para las 6 fitasas solas o asociadas dos a dos. Los resultados son expresados en % de los fosfatos teóricos liberados. Figuras 2a-2b: Porcentaje de hidrólisis del ácido fítico por las diferentes fitasas después de 120 minutos de reacción. (figura 2a) fitasas solas, (figura 2b) fitasas asociadas. Los trazos en líneas punteadas corresponden a la hidrólisis de 5 enlaces fosfato.

Figuras 3a-3b: Comparación de las velocidades iniciales de hidrólisis del ácido fítico (µmol .ml"1.min"1) para 6 fitasas a diferentes pH. {figura 3a) fitasas solas, (figura 3b) fitasas asociadas. Las velocidades son calculadas durante los primeros 10 minutos de la reacción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplos Materiales y Métodos 1. Orígenes de las fitasas • Aepergillue niger Natuphos (AN) : lote R2503 o lote: 057NPHO2 Wim van Hartingsveldt, Cora M. J. van Zeijl, G. Marian Harteveld, Robin J. Gouka, Marjon E. G. Suykerbuyk, Ruud G. M. Luiten, Peter A. van Paridon, Gérard C. M. Selten, Annemarie E. Veenstra, Robert F. M. van Gorcom y Cees A. M. J. J van den Hondel; Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aepergillue niger. Gene, 127, (1) 87-94 (1993) • Peniophora lycii (PL) : lote 172NHS02 Lassen. S.F., Breinholt. J., Ostergaard. P.R., Brugger, R. , Bischoff,A., Wyss. M. y Fuglsang. C.C; Expression, gene cloning, and characterization of five novel phytases from four basidiomycete fungi: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, a Ceriporia sp., and Trametes pubescens. Appl. Environ.

Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001) • Penicillium funiculoeum (PF) : Godo A1346 lote 1301 WO 03054199 • Ble (B) : Sigma referencia P1259 WO 0183763 • Schwanniomycee caetellii (SC) : producido en Candida boidiniii lote 10059 CN 25 EP0931837 • Debaryomycee caetellii cepa CBS 2923 (DC) . 2. Método enzimático La actividad fitásica o de fitasa es medida siguiendo la liberación del fosfato inorgánico en el curso del tiempo. La actividad es medida en presencia de 8 mM de fitato de sodio (Sigma) disuelto en un amortiguador de acetato de sodio pH 5.5, 200 mM a 37°C (5 volúmenes). La reacción es desencadenada por la adición del extracto enzimático (1 volumen) . La reacción es detenida por la acidificación del medio con ácido tricloroacético al 20% (1 volumen del medio de reacción + 1 volumen de ácido) . La cantidad de fosfato liberado es determinada después de diferentes tiempos de incubación. Una unidad enzimática (U) es definida como la cantidad de enzima que libera un µmol de fosfato inorgánico en un minuto. 3. Condición de hidrólisis de las fitasas a diferentes pH La hidrólisis es realizada a 40°C en 10 ml de amortiguador de acetato 250 mM, para los pH 4 a 6.5, o de amortiguador de glicina 200 mM a pH 3 , que incluye: 0.340 mM de fitato de sodio, 0.04 o 0.08 U/ml de fitasa. Estas deducciones son realizadas a tiempos diferentes durante 120 minutos. La reacción es detenida por la adición del ácido tricloroacético. Los fosfatos son dosificados directamente sin dilución. 4. Dosis de los fosfatos La cantidad de fosfato liberado es revelada por colorimetría . La solución de revelación, preparada extemporáneamente, contiene sulfato de hierro (380 mM, 1 volumen) y de heptamolibdato de amonio (12 mM, 4 volúmenes). La medición de la absorbancia a 700 mM, se realiza después de 30 minutos de revelación a temperatura ambiente (1 volumen del medio de reacción + 1 volumen de solución de revelación) , con la ayuda de un espectrofotómetro UV/visible (Beckman DU 530) .

Una curva patrón es previamente establecida con el fosfato diácido de potasio.

Resultados 1. Fitasas probadas Las fitasas probadas se distinguen según diferentes criterios: (1) características bioquímicas (pH óptimo, estereoespecificidad: 3, 4 ó 6 fitasas), (2) número de enlaces fosfato hidrolizados. Todas estas fitasas tienen un pH óptimo de hidrólisis cercana a 5, no obstante las fitasas de AN y PL tienen un segundo pH óptimo a 2.5. Tres hidrolizan totalmente los fosfatos (SC, DC, Trigo) . La posición hidrolizada en primer lugar es ya sea la posición 3 (AN, PL, DC) , o bien la posición 6 <PL) , o bien la posición 4 (Trigo) (Tabla 1) .

Tabla 1: Comparación de las características bioquímicas de las fitasas (1) Ullah, A. H. J y Sethumadhavan, K., (2003) PhyA gene product of Aepergill ue ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research Communications 303: 463-468 (2) WO 03054199 presentada el 13 de junio del 2003 Bohlmann, R. , Moussu, F., Nore, O., Pierrard, J., Saunier, D., Testeniere, O., New polynucleotide encoding fungal phytase, useful as feed additive to improve phosphate assimilation, also new strain of Peni cill i um . (3) Nakano, T., Joh, T., Narita, K., Hayakawa, T. (2000) The pathway of dephosphorylation of myo-Inositol Hexakisphosphate by Phytases from Wheat Bran of Trici cum aee tivum L. cv Nourin#61. Biosci . Biotechnol. Biochem., 64: 995-1003 (4) Segueilha, L., Lambrechts, C, Boze, H., Moulin, G. y Galzy, P. (1992) Purification and Properties of the Phytase from Schwanniomyces cae tel li i . J. Fermen t . Bioeng. 74(1) : 7-11. 2. Comparación de la eficacia de hidrólisis del ácido fítico con 6 fitasas a diversos pH El estudio es realizado en presencia de 0.340 mM de fitato. La cantidad de enzima aportada corresponde a 0.08 U/ml de fitasa, medida en las condiciones estándares a pH 5.5. Los valores de pH probados son de 3 , 4, 5.5, 6, 6.5. La reacción es seguida durante 120 minutos. Las tomas son efectuadas en el curso del tiempo, la reacción es detenida por acidificación, los fosfatos son dosificados mediante colorimetría . La comparación de las diversas fitasas es efectuada en función de la eficacia de la hidrólisis, es decir del porcentaje de fosfato liberado con relación al porcentaje teórico. Los resultados son presentados en la Figura ÍA. A partir de la literatura, 4 fitasas (PF, SC, DC, B) son capaces de hidrolizar totalmente el ácido fítico en inositol y fosfato; 2 fitasas (AN y PL) no hidrolizan más que 5 enlaces o bien 83% de fósforo potencial .

En las condiciones probadas a pH 3 y pH 4, 4 fitasas (SC, PF, DC y PL) hidrolizan 80% al menos del ácido fítico. La fitasa de trigo es poco activa a pH 3 y 4. Para los valores de pH superiores a pH 5.5, ninguna fitasa hidroliza más de 70% del ácido fítico. Las fitasas PF y DC son poco activas a pH 6.5. La fitasa AN es la menos sensible a las variaciones de pH, no obstante ésta no libera más que 60 a 70% de los fosfatos ya sea de valores 10 a 20% inferiores a aquellos esperados (Figura 2A) . La comparación de las velocidades iniciales de liberación de los fosfatos muestra una gran heterogeneidad entre las fitasas (Figura 3A) . La fitasa más funcional a pH ácido es aquella de Schwanni omycee cas tel l ii mientras que aquella A . niger es la más funcional a los valores de pH superiores a 5.5. La fitasa de trigo es la menos eficaz cualesquiera que sean las condiciones probadas. 3. Influencia del pH sobre la velocidad de liberación do fosfatos en presencia de fitasas asociadas Con el fin de mejorar la eficacia de la hidrólisis del ácido fítico, varias asociaciones de dos fitasas son probadas. Cada fitasa es aportada a 0.04 U/ml, o bien un valor total de 0.08 U/ml en el tubo de reacción. La fitasa DC , que hidroliza 6 enlaces fosfato, es sistemáticamente probada en asociación con las otras fitasas, que hidrolizan 5 ó 6 enlaces fosfato. Otras dos asociaciones son igualmente utilizadas para comparar por una parte otra asociación de las fitasas que pueden liberar 6 y 5 fosfatos (SC/AN) , por otra parte dos fitasas, PL/AN que tienen características bioquímicas muy parecidas (Figura IB) . Un análisis global permite mostrar que la asociación de 2 fitasas favorece la mayor parte del tiempo la eficacia de la hidrólisis del ácido fítico.

Mientras que en las mismas condiciones, ninguna fitasa hidroliza totalmente el ácido fítico, para 2 mezclas (DC/AN y SC/AN) , 100% a 85% de los enlaces fosfato son hidrolizados cualquiera que sea el pH . Para la asociación DC/PL se observa igualmente una ganancia de 20% aproximadamente a pH ácidos. Las asociaciones PL/AN, DC/PF y DC/SC aportan poco del mejoramiento (Figura 2B) . La comparación de las velocidades iniciales de hidrólisis muestra que existe un fuerte efecto sinérgico para la asociación SC/AN y para la asociación DC/AN con relación a las fitasas solas, y con relación a las otras asociaciones de las fitasas. Las diferencias de la velocidad de hidrólisis ligadas a pH son reducidas al mínimo al momento de la asociación. Las otras asociaciones son menos eficaces, el efecto sinérgico no es visible más que para ciertos pH, por ejemplo para DC/PL a los pH 3 y 4 (Figura 3) . El efecto sinérgico parece ser debido en gran parte a la capacidad de las fitasas para hidrolizar la totalidad de los fosfatos. Además, las mejores asociaciones conciernen a las fitasas que tienen pH óptimo de actividad complementarios (2.5-4.5) . No obstante, hay que hacer notar que existe poco efecto sinérgico para las fitasas menos funcionales, en términos de la eficacia de la hidrólisis, tal como aquella del trigo y de Peni ci l l i um funi cul oeu . 4. Influencia de las concentraciones y de la proporción de las fitasas sobre la eficacia de la hidrólisis del ácido fítico Hemos comparado la influencia de la cantidad de fitasa (efectos de dosis) y de la proporción de la mezcla de fitasas sobre la hidrólisis del ácido fítico. Son utilizadas tres asociaciones DC/AN, DC/PL y AN/PL, y 2 concentraciones (0.04 y 0.08 //ml) en las fitasas que son probadas (Tablas 2 y 3) .

Tabla 2: Comparación del porcentaje de hidrólisis del ácido fítico para las diferentes asociaciones, probadas a dos concentraciones finales de 0.04 y 0.08 U/ml. Las tres primeras columnas dan los valores para las tres fitasas solas a la concentración de 0.08 U/ml.

AÑ DC PL AÑ/DC AÑ/DC PÍ?DC PL/DC AÑ/PL AM/PL (0.08 U) (0.08 U) (0.08 U) (0.08 U) (0.04 U) <0.08U) (0.04 U) (0.08 U) <0.04U) pH3 66 82 80 92 67 (73%) 94 70(74%) 79 56(72(%) pH4 69 85 83 95 %ÍW%) 100 93 (94%) 86 76(89%) pH5.5 55 63 67 92 81 (87%)( 85 71 (84%9 70 66(94%) pH6 72 42 64 94 78(83%) 85 47 (56%) 74 67 (90%) pH6.5 63 6 34 75 42(56%) 35 10(30%) 61 52(86%) Los valores entre paréntesis representan la relación entre los valores obtenidos con 0.04 µ/ml y aquellos en presencia de 0.08 U/ml.

Los porcentajes de hidrólisis al momento del estudio en la mezcla (concentración global de 0.08 U/ml) son superiores a aquellos determinados con las enzimas solas (0.08 U/ml) y cercanas al 100% para las mezclas AN/DC y PL/DC, y aquella en una gama de pH que varía de 3 a 6. La mezcla AN/PL no aumenta de manera significativa el porcentaje de hidrólisis observado con cada fitasa tomada separadamente. La reducción por un factor de 2 de la cantidad global aportada (0.04 U/ml) no induce una disminución por 2 de los fosfatos liberados. En ciertos casos, AN/DC y PL/DC a pH 4 y pH 5.5, y AN/PL a pH 4 a 6, los porcentajes de hidrólisis son equivalentes a aquellos observados en presencia de 0.08 U/ml (Tabla 3) .

Tabla 3: Comparación de las velocidades iniciales de hidrólisis (µmol/ml/minuto) del ácido fítico para las diferentes asociaciones, probadas a dos concentraciones finales de 0.04 y 0.08 //ml . Las tres primeras columnas dan los valores para las tres fitasas solas a la concentración de 0.08 U/ml.

AÑ DC PL AN/DC AÑ DC PL DC PL/DC AÑ/PL AM/PL (0.08 U) (0.08 U) (0.08 U) (0.08 U) (0.04 U) (0.08 U) (0.04 U) (0.08 U) (0.04 U) ~pH 3 2O4 178 2-52 4Ü0 170 3Ü8 ?Í45 S?8 iÜCJ (42%) {37%) (73%) pH 4 4.98 3.96 5.36 6.49 2.85 8.61 3.33 4.29 2.73 (44%) (39%) (63%) pH 5.5 7.76 1.56 4.00 7.26 1.86 3.79 0.85 4.56 2.82 (26%) (22%) (62%) pH 6 7.91 0.39 2.87 7.53 1.04 2.10 0.04 (2%) 3.96 2.60 (14%) (66%) pH 6.5 5.09 0.00 0.85 3.71 0.26 (7%) 0.22 0.00 (0%) 1.89 0.74 (39%) Los valores entre paréntesis representan la relación entre los valores obtenidos con 0.04 µ/ml y aquellos en presencia de 0.08 U/ml.

La asociación de la fitasa permite pues disminuir la cantidad de fitasa en el medio de reacción por un factor de dos manteniendo una eficacia de hidrólisis idéntica y esto en un intervalo de pH extendido. Existe un efecto neto de dosis sobre la liberación del fosfato. Por el contrario, las velocidades iniciales de hidrólisis del ácido fítico son al menos dos veces más débiles en presencia de 0.04 U/ml de fitasa que en presencia de 0.08 U/ml (Tabla 3) . Estos resultados apoyan la hipótesis de que la sinergia entre las fitasas permite esencialmente la hidrólisis total de los fosfatos presentes. La proporción de cada fitasa en el medio de reacción no parece tener mucha influencia sobre la eficacia de la hidrólisis (Tabla 4) . En todos los casos, un aumento en la cantidad de fosfato liberado es observada, con una ligera ventaja para una asociación al 50% de cada fitasa, principalmente para los pH superiores a 5.5.

Tabla 4: Comparación del porcentaje de hidrólisis del ácido fítico en función de la proporción de cada fitasa en la mezcla. La cantidad global queda, en todo caso de 0.08 u/ml .

En las presentes condiciones experimentales, ninguna fitasa hidroliza totalmente el ácido fítico en inositol y fosfatos, aunque 4 de entre ellas sean capaces de liberar todos los fosfatos de acuerdo a la literatura. Cuatro fitasas, SC, PF, DC, PL hidrolizan 80% de los enlaces fosfato a los valores de pH 3 y 4. Dos mezclas DC/AN y SC/AN hidrolizan 80% a 100% de los enlaces fosfato a todos los pH probados . La asociación de la fitasa de tipo 3-fitasa (AN, DC, PF) , 4-fitasa (B) o 6-fitasa (PL) entre ellas no aportan ningún mejoramiento notable. La complementación y la sinergia entre las fitasas parece depender de 2 criterios adecuados para cada fitasa: (1) de su perfil de actividad en función del pH, (2) de su capacidad de hidrolizar la totalidad o no de los fosfatos. La utilización de tales asociaciones en nutrición animal podría permitir disminuir las cantidades de fitasas utilizadas de al menos 20% y por lo tanto disminuir los costos. La proporción de fosfato de origen fítico en el alimento sería igualmente aumentada, mejorando el valor alimentario y permitiendo así disminuir el aporte en fosfato inorgánico. La contaminación provocada por los rechazos de fosfato no disponible sería de este modo disminuida. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición que asocia al menos dos fitasas para la hidrólisis del ácido fítico (1,2,3,4,5,6-hexakisfosfato de mio-inositol) caracterizada porque comprende : a) una primera fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 1 o que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 2; b) una segunda fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 3.
2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de seis enlaces fosfato del ácido fítico. 3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la primera fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 55°C y 80°C y un pH óptimo comprendido entre pH
3. 3.5 y pH 5.
4. 4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanniomycee caetellii o una fitasa de la levadura Debaryomyces caetellii .
5. 5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la primera fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 1 o la fitasa de la SEQ ID NO: 2.
6. 6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la segunda fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de al menos cinco enlaces fosfato del ácido fítico.
7. 7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la segunda fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 50°C y 60°C, y un pH óptimo comprendido entre pH 2 y pH 6.
8. 8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la segunda fitasa es una fitasa de Aepergillue niger.
9. 9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la segunda fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 3.
10. 10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque ésta consiste de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales .
11. 11. El uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un aditivo nutricional para animales o de un alimento para animales .
12. 12. El uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para aumentar la disponibilidad del fósforo fítico y mejorar la digestibilidad de los alimentos para animales.
13. 13. Un procedimiento de hidrólisis del ácido fítico (1, 2 , 3 , 4, 5, 6-hexakisfosfato de mio-inositol) en monofosfatos inorgánicos, en mio-inositoles de grado de fosforilación inferior y en mio-inositol libre, caracterizado el procedimiento porque comprende las siguientes etapas: a) disponer de una primera fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: l o que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 2; b) disponer de una segunda fitasa que presenta al menos 80% de identidad con la fitasa de la SEQ ID NO: 3; c) colocar simultáneamente en contacto el ácido fítico con la primera fitasa y la segunda fitasa.
14. 14. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la primera fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisis de seis enlaces fosfato del ácido fítico.
15. 15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicacionee 13-14, caracterizado porque la primera fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 55°C y 80°C y un pH óptimo comprendido entre pH 3.5 y pH 5.
16. 16. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizado porque la primera fitasa es una fitasa de la levadura Schwanni omycee cae tel l i i o una fitaea de la levadura Debaryomycee caetel l i i .
17. 17. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado porque la primera fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 1 o la fitasa de la SEQ ID NO: 2.
18. 18. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17, caracterizado porque la segunda fitasa es una 3-fitasa que cataliza la hidrólisie de al menoe 5 enlaces fosfato del acido fítico.
19. 19. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, caracterizado porque la segunda fitasa tiene una temperatura óptima comprendida entre 50°C y 60°C, y un pH óptimo comprendido entre pH 2 y pH 6.
20. 20. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-19, caracterizado porque la segunda fitasa es una fitasa de Aepergi l l ue ni ger .
21. 21. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-20, caracterizado porque la segunda fitasa es la fitasa de la SEQ ID NO: 3.
22. 22. Kit o conjunto para la alimentación de los animales, caracterizado porque comprende: a) la fitasa de Schwanniomycee -caetellii de la SEQ ID NO: 1 o la fitasa de Debaryomycee caetellii de la SEQ ID NO: 2; b) la fitasa de Aepergillue niger de la SEQ ID NO: 3.