MX2007016542A - 4-anilino-3-quinolinocarbonitrilos para el tratamiento de cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invencion esta dirigida a un metodo para prevenir, tratar y/o inhibir cancer utilizando los compuestos de formula (I) (ver formula (I)): o una sal farmaceuticamente aceptable de este; esta invencion tambien esta dirigida a composiciones farmaceuticas que tienen los compuestos de formula (I).

Description

4-ANILINO-3-QUINOLINOCARBONITRILOS PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a un método para utilizar 4-(2,4-dicloro-5-metoxi-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-metil-piperacin-1-¡l)-propoxi]-quinolina-3-carbonitrilo (SKI-606), el compuesto de fórmula (I), para tratar cáncer y una composición que contiene la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Varios derivados de 4-anilino-3-quinolinocarbonitrilos han mostrado tener actividad anti-tumoral que los pueden hacer útiles como quimioagentes en el tratamiento de varios cánceres, incluyendo cánceres pancreático, linfático y de próstata. Las Patentes U.S. No. 6,002,008, 6,384,051 , 6,432,979 y 6,617,333 describen ciertos derivados de 4-anilino-3-quinolinocarbonitrilos que se muestra que poseen actividad anti-tumoral. Las proteínas tirosina cinasas consisten de un receptor funcionalmente relacionado y enzimas de señalización no receptoras que regulan el crecimiento celular, la activación, la diferenciación, el desarrollo y la transformación a través de fosforilación de los residuos de tirosina específicos. El receptor de las tirosina cinasas, tal como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), consiste de un dominio de unión de ligando extracelular, un dominio de trans-membrana simple y un dominio de tirosina Cinasa intracelular. La tirosina cinasas no receptoras, tales como el Src y el Abl, son enzimas citoplasmáticas solubles con múltiples dominios de unión regulatorios y de proteína. La familia de la tirosina Cinasa Src es un grupo de 9 tirosina cinasas no receptoras definidas tanto por la similitud funcional como la secuencia. Tres miembros de esta familia están ampliamente expresados: Src, Yes, y FynB. Los otros 6 miembros, Lck, Lyn, FynT, Fgr, Hck, y Blk, están predominantemente expresados en células hematopoyéticas. Se han publicado revisiones extensivas sobre la estructura y la función de las proteínas tirosina cinasas no receptoras y su relevancia en los cánceres humanos. La proteína tirosina Cinasa no receptora Src es el prototipo de la familia Src. El Src es un componente clave corriente abajo de las rutas mediadas por los receptores de factor de crecimiento y los receptores acoplados a proteína G, y se cree que coordinan las señales provenientes de estas varias rutas. La lista de las proteínas objetivo intracelulares conocidas por ser fosforiladas por las cinasas de la familia Src es grande y continúa creciendo, incluyendo las integrinas, las cinasas de adhesión, las cadherinas, el stat3, la cortactina, la ezrina, las proteínas de adhesión focal (FAK), y muchas otras. El Src se regula en forma ascendente en la mayoría de los cánceres incluyendo la vasta mayoría de los cánceres pancreático, de melanoma, de cabeza y cuello, y de ovario. El Src también se activa en las líneas tumorales prostéticas. Los niveles del mARN del Src fueron superiores en tumores parotídeos humanos comparados con las muestras de tejido normales. Los carcinomas esofágicos y de esófago de Barrett también sobreexpresan el Src. En razón a que la tirosina Cinasa c-Src es determinante del comportamiento celular maligno en una variedad de cánceres humanos, buscamos determinar el efecto de suprimir la expresión del c-Src sobre la quimiosensibilídad del adenocarcinoma pancreático a la gemcitabína. Con base en las anteriores observaciones, los compuestos que inhiben el Src pueden ser útiles en el tratamiento de pacientes con estos y otros cánceres. El 4-(2,4-Dicloro-5-metoxi-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-metil-piperacin-1-il)-propoxi]-quinolina-3-carbonitrilo se ha identificado como útil para prevenir, tratar o inhibir el cáncer mediante estos criterios.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a un método para prevenir, tratar o inhibir el cáncer que comprende, administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I): 4-(2,4-dicloro-5-metoxi-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-met¡l-piperacin-1-¡l)-propoxi]-quinolino-3-carbonitrilo, o una sal farmacéuticamente aceptable de ésta. Esta invención también está dirigida a un método para tratar cáncer pancreático que comprende, administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I), o sales farmacéuticamente aceptables de ésta, en combinación con gemcitabina, o una sal farmacéuticamente aceptable de ésta. Otro aspecto de esta invención es una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de ésta, y un portador farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. Muestra la respuesta de la línea HN5 de cabeza y cuello al 4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-5-metoxi-7-[3-(4-metil-piperacinil)propoxi]-3-quinolina-carbonitrilo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "cáncer" se refiere a cualquier crecimiento maligno o tumor causado por una división celular anormal o no controlada. Ésta se puede esparcir a otras partes del cuerpo a través del sistema linfático o el torrente sanguíneo. Para los propósitos del método de tratar cáncer descrito en esta solicitud, el cáncer incluye los cánceres pancreático, linfático y de próstata. Las sales farmacéuticamente aceptables, por, ejemplo, son aquellas derivadas de tales ácido orgánicos e inorgánicos como: ácidos acético, láctico, carboxílico, cítrico, cinámico, tartárico, succínico, fumárico, maléico, malónico, mandélico, málico, oxálico, propiónico, clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, glicólico, pirúvico, metanosulfónico, etanosulfónico, toluenosulfónico, salicílíco, benzoico, y similarmente ácidos aceptables conocidos. El compuesto de fórmula (I) se puede suministrar oralmente, mediante inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa, infusión, suministro mediado por liposoma, suministro tópico, nasal, anal, vaginal, sublingual, uretral, transdérmico, intratecal, ocular u ótico. Con el fin de obtener consistencia en suministrar el compuesto de fórmula (I) se prefiere que el compuesto esté en la forma de una dosis unitaria. Las formas de dosis unitarias adecuadas incluyen tabletas, cápsulas y polvos en sacos o frascos. Tales formas de dosis unitaria pueden contener desde 0.1 a 300 mg del compuesto de fórmula (I), y preferiblemente de 2 a 100 mg. Aún las formas de dosis unitarias preferidas contienen 50 a 150 mg del compuesto de fórmula (I). El compuesto de fórmula (I) se puede administrar oralmente. Éste se puede administrar de 1 a 6 veces al día, más usualmente de 1 a 4 veces al día. La cantidad efectiva será conocida por un experto en la técnica; ésta también dependerá de la forma del compuesto. Un experto en la técnica podría desarrollar rutinariamente pruebas de actividad empírica para determinar la bioactividad del compuesto en bioensayos y determinar así que dosis administrar. Esta invención está también dirigida a composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de 4-(2>4-dicloro-5-metoxi-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-metil-piperacin-1-¡l)-propoxi]-quinolina-3-carbonítrilo, el compuesto de fórmula (I), o las sales farmacéuticamente aceptables de ésta, y un portador farmacéuticamente aceptable. El portador puede ser, por ejemplo, un diluyente, un aerosol, un portador tópico, una solución acuosa, una solución no acuosa o un portador sólido. El portador puede ser un polímero o una pasta dental. Un portador en esta invención comprende cualquiera de los portadores estándar farmacéuticamente aceptados, tales como una solución salina amortiguada de fosfato, la solución salina amortiguada de acetato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o una emulsión de triglicérido, varios tipos de agentes humectantes, tabletas, tabletas recubiertas y cápsulas. Las composiciones que contienen el compuesto de fórmula (I) se pueden formular con excipientes convencionales, tales como un llenador, un agente desintegrante, un ligador, un lubricante, un agente saborizante o un aditivo de color. Cuando se suministra oralmente o tópicamente, tales compuestos se suministrarían a un sujeto mediante suministro en diferentes portadores. Típicamente, tales portadores contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, o glicoles. El portador específico necesitaría ser seleccionado con base en el método deseado de suministro, por ejemplo, la solución salina amortiguada de fosfato (PBS) se podría utilizar para el suministro intravenoso o sistémíco y las grasas vegetales, cremas, bálsamos, ungüentos o geles se pueden utilizar para el suministro tópico. El compuesto de fórmula (I) se puede suministrar junto con diluyentes adecuados, preservantes, solubilízantes, emulsificadores, adyuvantes y/o portadores útiles en el tratamiento o prevención de neoplasma. Tales composiciones son líquidas o liofilizadas o formulaciones secadas de otra manera y que incluyen diluyentes de un contenido de amortiguador vario (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y concentración iónica, adivitos tales como albúminas o gelatina para evitar la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, TWEEN 20, TWEEN 80, PLURONIC F68, sales de ácido biliar), agentes solubilizantes (por ejemplo, glicerol, polietileno glicerol), antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfato de sodio), preservantes (por ejemplo, timerosal, bencil alcohol, parabenos), sustancias de masa o modificadores de tonicidad (por ejemplo, lactosa, manitol), uniones covalentes de polímeros tales como polietilenglicol, complejación con iones de metal, o incorporación del compuesto en o sobre preparaciones de partículas de hidrogeles o liposomas, micro-emulsiones, micelas, vesículas unilamelar o multilamelar, eritrocito acrómicos, o esferoblastos. Tales composiciones influenciarán el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo, y la tasa de despeje in vivo del compuesto o composición. La elección de las composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas del compuesto capaz de tratar o evitar un neoplasma. El compuesto de fórmula (I) se puede suministrar localmente por vía de una cápsula que permite una liberación sostenida del compuesto durante un período de tiempo. Las composiciones de liberación controlada o sostenida incluyen formulación en depósitos lipofílicos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras, aceites). La presente invención suministra además un método para utilizar el compuesto de fórmula (I) como una sustancia terapéutica activa para prevenir, tratar y/o inhibir cáncer. Con base en los resultados obtenidos y presentados aquí, el SKI-606 es útil para evitar, tratar o inhibir cánceres al suprimir la proliferación de células malignas. El SKI-606 inhibe la fosforilación catalizada por Src de las proteínas intracelulares asociadas con la proliferación de células. Por lo tanto, dosificar un humano con una cantidad terapéuticamente efectiva de SKI-606 puede prevenir o inhibir las formaciones de cánceres al suprimir la proliferación, o puede tratar un humano que ya sufre de un cáncer al evitar o inhibir un crecimiento adicional de tumores y/o originar una reducción en el tamaño o la erradicación de los tumores. Para el propósito de esta invención el término "inhibición" se refiere al retardo, supresión o detención de la proliferación de células malignas, presumiblemente al bloquear, o suprimir la fosforilación catalizada por Src. Para los propósitos de esta invención el término "prevenir" se refiere a impedir o anticipar el desarrollo de crecimientos malignos o de tumor mediante un tratamiento profiláctico, o impedir, inhibir o cesar la progresión adicional de la enfermedad. Para los propósitos de esta invención el término "tratar" se refiere administrar a un paciente necesitado de éste una cantidad terapéuticamente efectiva del SKI-606 con el fin de evitar profilácticamente el desarrollo de un cáncer, inhibir o cesar la progresión de un cáncer, o un crecimiento maligno o de tumor, reversar la progresión de un cáncer, o un crecimiento maligno o de tumor, o erradicar un cáncer, o un crecimiento maligno o de tumor. La presente invención además suministra un método para tratar cáncer en humanos, que comprende administrar al individuo infectado una cantidad efectiva de 4-(2,4-dicloro-5-metoxi-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-metil-piperac¡n-1-il)-propoxi]-quinolina-3-carbonitr¡lo, unas sales farmacéuticamente aceptables de éstos, o una composición farmacéutica que contiene los mismos. La dosis suministrada a un paciente variará dependiendo de lo que se administre, el propósito de la administración, la manera de la administración, y similares. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad suficiente para curar o mejorar los síntomas de un cáncer. El compuesto de fórmula (I) se puede suministrar solo o en combinación con otros compuestos utilizados para tratar cáncer. Tales compuestos incluyen pero no están limitados a mesilato de imatinib (GLEEVEC), hidroxíurea, IFN-a, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, NSAIDS, gemcitabína, inhibidores EGFR, inhibidores MEK, farnesiltransferasa, gemcitabina, avastina o wortmanina, o sales farmacéuticamente aceptables de éstos. Una modalidad preferida del método de la presente invención comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la fórmula (I) en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de gemcitabina o avastina. Más preferiblemente el compuesto de la fórmula (I) se administra en combinación con gemcitabina. Otra modalidad preferida del método de la presente invención comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de fórmula (I) en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de gemcitabina y avastina.

Otra modalidad preferida del método de la presente invención involucra administrar el compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de éste, en combinación con gemcitabina y avastina, o sales farmacéuticamente aceptables de éstos, para tratar cáncer pancreático. Un compuesto preferible para practicar el método y/o para uso en una composición de esta invención es 4-(2,4-dicloro-5-metoxi-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-metil-piperacin-1-il)-propoxi]-quinolina-3-carbon¡trilo y una sal farmacéuticamente aceptable de éste. El compuesto de fórmula (I) se prepara de acuerdo con los métodos de la patente U.S. 6,002,008, y tales métodos se incorporan aquí como referencia. Las reacciones se desarrollan en un disolvente apropiado a los reactivos y materiales empleados y adecuados para la transformación que se está efectuando. Se entiende por aquellos expertos en la técnica de síntesis orgánica que varias funcionalidades presentes en la molécula deben ser consistentes con las transformaciones químicas propuestas. Cuando no se especifica, el orden de las etapas sintéticas, la elección de los grupos protectores y las condiciones de desprotección serán fácilmente evidentes por aquellos expertos en la técnica. Además, en algunos casos, los sustituyentes sobre los materiales de partida pueden ser incompatibles con ciertas condiciones de reacción. Las restricciones pertinentes a los sustituyentes dados serán evidentes para un experto en la técnica. Las reacciones fueron corridas bajo atmósferas inertes cuando era apropiado. El compuesto de fórmula (I), es fácilmente obtenido mediante el tratamiento de 7-(3-cloropropoxi)-4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metoxi-3-quinolinocarbonitrilo con N-metilpiperacina en la presencia de yoduro de sodio sea puro o en un disolvente tal como etilenglicol dimetil éter. La preparación de estos compuestos se ha reportado en la literatura, [Boschelli, D. H. et. al., J. Med. Chem., 44, 3965 (2001 )], incorporada aquí como referencia. Figura 1. Respuesta de la línea HN5 de tumor de cabeza y cuello a la 4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-5-metoxi-7-[3-(4-metil-1-p¡peracinil)propoxi]-3-quinol¡nocarbonitrilo. Las células HN5 privadas de suero fueron tratadas con el compuesto durante 4 horas, después de lo cual se agregó EGF a 50 ng/ml durante diez minutos. Los lisados se analizaron para fosforilación Stat3, Y705, c-Cbl Y731 y Y774 y caveollin Y14. Los resultados demuestran que la fosforilación del caveolin Y4, c-Cbl Y731 , y Y705 del Stat3 se redujo mediante 4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-5-metoxi-7-[3-(4-metil-1-piperac¡n¡l)propoxi]-3-quínol¡nocarbonitrilo.

Ensayos de Enzima El compuesto de fórmula (I) inhibe la fosforilación catalizada por Src de un péptido objetivo. La 4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-5-metoxi-7-[3-(4-metil-1-p¡perac¡n¡l)propoxi]-3-quinolínocarbon¡trilo inhibió la fosforilación catalizada por Src en un ensayo de enzima homogéneo (formato FRET/Lance) con un IC50 de 3.5 nM. Una comparación de la actividad de la 4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-5-metoxi-7-[3-(4-metil-1-piperacinil)propoxi]-3-quinolinocarbonitrílo contra varias enzimas se da en el cuadro 1. Ensayos Src y Abl Cinasa Lance: La enzima Src humana recombinante se obtuvo de Pan Vera (P3044). El péptido biotinilado que corresponde a los residuos 6 - 20 del Cdk1 se utilizaron como un sustrato en el ensayo de enzima src (Biotín-KVEKIGEGTYGWYK-COOH). El c-Abl y el v-Abl tipo silvestre se compraron de Panvera (P3049) y Calbiochem (#102555), respectivamente. El péptido biotínilado para el ensayo de Abl Cinasa se obtuvo de Synpep (Biotin-NHKEEEAIYAAPFAKKK-COOH). Tanto para los ensayos de Src como de Abl Cinasa, se desarrollaron ensayos de Cinasa con transferencia de energía de resonancia de fluorescencia homogénea utilizando un formato de detección europio/APC (LANCE, Perkin Elmer). La enzima Src (10 ng) o la enzima Abl (2.5 ng c-Abl, 2.5 ng v-Abl) se mezcló con péptido biotinilado (concentración final 2 µM para ambos péptidos de sustrato), 50 mM Hepes (pH 7.5), 10 mM de MgCI2, 20 µg/ml de BSA, y 0.001% de Brij-35 (Sigma). El compuesto se agregó con una concentración de DMSO final del 1 %, y se incubó durante diez minutos a 37°C para un ensayo Src y 27°C para un ensayo Abl. La reacción de Cinasa se inició mediante la adición del ATP a una concentración final de 100 µM, y se incubó durante 70 minutos a 37°C para Src, y 30 minutos a 27°C para Abl. La reacción se detuvo con EDTA a una concentración final de 30mM de EDTA/25mM de Hepes (pH 7.5)/10 µg/ml de BSA. La mezcla se combinó con anticuerpo PT66 de fosfotírosina marcado con Eu (Perkin Elmer, AD0068) y Estreptavidina Surelight-APC (Perkin Elmer, CR130-100) en 50 mM de Hepes (pH 7.5)/20 µg/ml de BSA, y se incubó durante 30 min de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La reacción se monitoreó sobre un Wallac Víctor con excitación a 340 nm y emisión a 665 nm. Los datos se analizaron con el análisis de datos LSW conectado para Excel (Microsoft).

Ensayos de PKA. PKC. S6 Cinasa. CAMKII v p38 Cinasa. El ensayo de Scintiplate se utiliza para el ensayo de Cinasa con PKA (Upstate #14-114), PKC (Upstate #14-232) y S6K (Upstate #14-333). Se utiliza un formato ELISA para CAMK-II (Upstate # 14-217 y p38 (Proteína recombinante producida y purificada en casa).

Ensayo scintiplate Placas SA Cov Scintiplate de 96 pozos (#1450-551 ) se lavaron 4 veces (250 ?) en PBS (0.1% Tritón X100) antes del ensayo de Cinasa. • 60 µl de mezcla* (Ver siguiente cuadro) • 20 µl de compuestos (en 10% DMSO) 20 min de preincubación • 20 µl de sustrato 1 uM (ver siguiente cuadro) Los volúmenes mostrados en el siguiente cuadro son para una placa de 96 pozos.

Péptido 1323 (LSP16Bio: Bío-RTPKLARQASIELPSM: LSP-1 aa 43-258. Ser 252 es el sitio de fosforilación) Péptido 1463 (sustrato PKA: Bio-GRTGRRNSI) Péptído 1464 (sustrato S6K: Bio-RRRLSSLRA) La reacción inicia cuando se agrega el sustrato. 1- Detención de la reacción con 20 µl de 0.5M de EDTA de acuerdo con el tiempo mostrado en el cuadro. Mantener incubación de la placa hasta una hora después de iniciar la reacción u 80 min en el caso del S6K. 2- Lavados (PBS + 0.1 % de Tritón X100) seis lavados (250 ?/pozo) Conteo (contador Wallac Trilux) II ELISA Las siguientes son las condiciones de ensayo para las cinasas utilizadas en los ELISA. El p38 se activa con un mutante activo dominante de MKK6.

Péptido 1738 (MK2 T334: Bio-QSTKVPQTPLHTSRVL) Péptido 1895 (Gastrin 1-17: Bio-KKEGPWLEEEEEAYGWND) El ensayo de Cinasa se desarrolló en la misma forma que el ensayo de scintiplate: Ver etapa 1 a 3 anterior. La placa de detección es un Nunc MaxiSorb prerecubierta con un anticuefo anti-GST de cabra Amersham 1 :400 en PBS a 100 ul/pozo durante 2 horas. La placa de reacción es una placa de poliestíreno Costar prebloqueada con un amortiguador de bloqueo a 0.1 % de Gelatina durante dos horas con 200 ul/pozo. Preparar una mezcla de ERK/ADB como sigue: 10 ul de GST-ERK2 por ml de ADB Poner 60 ul de mezcla de ERK/ADB en pozos de control negativo (Hilera 12) Preparar mezcla de MEK/ERK/ADB (MEA) al agregar MEK1 activo Poner 60 ul/pozo de MEA en una placa de ensayo. Agregar 20 ul compuesto 10% DMSO Preparar 5x ATP/ADB al agregar 500 uM de ATP a ADB. 20 ul de ATP/ADB a cada pozo para iniciar la reacción. Incubar 1 hr a 30 C. Detener la reacción al agregar 20 ul de 0.5M de EDTA a cada pozo. 4- Detección del fosfopéptido: Anticuefos: Para la detección del péptido fosforilado, los anticuerpos fosfo-específicos policlonales purificados para afinidad 60521 y 64273 se utilizan contra 1323 y 1738 respectivamente. - Agregar 100 µl de amortiguador de bloqueo suplementado con 1% de BSA con 60521 purificado (0.46 mg/ml) a 1 :20000 y un anti conejo-Eu (PE #AD0105) a 1 :4000 o 64273 purificado a 1 :4000 y anti-conejo-Eu a 1 :2000 para la detección del 1323 y el 1738 fosforilado respectivamente. -Agregar 100 µl de amortiguador de bloqueo suplementado con 1% de BSA con anti-fosfotirosina PT100 (Señalización de Célula #9411) a 1 :1000 y anti-ratón-Eu (PE #AD0124) para la detección de 1895 fosforilado.

Incubar 1 hora Temperatura Ambiente (Agitador) Lavar 6x 250 µl de PBS 0.1% Tween 20 Agregar 100 µl de Solución de Mejoramiento (Wallac Cat# 1244-105) Incubar a 10 min TA (Agitador) Leer sobre Víctor II (Protocolo de Europa HTS sobre nuestro lector) Amortiguadores Amortiguador de Cinasa 10X: 200 mM Hepes pH 7.5, 100 mM MgCI2 ADB 1X: 20 Mm MOPS 7.2, 25 mM ß-glocerofosfato, 5 mM EGTA, 1 mM Na Ortovanadoato, 20 mM MgCI2, 1 mM DTT Amortiguador de Bloqueo: 10 mM MOPS 7.5, 150 mM NaCI, 0.05% Tween 20, 0.1 % Gelatina, 0.02% NaN3 Raf/MEK Cinasa ELISA Reactivos: Lisado de célula de insecto Sf9 que contiene c-Raf humano recombinante etiquetado con 6his de longitud completa. (Actividad Específica: ~200U/ml). Mek-1 Humano no activo y GST-MAP Cinasa humana (proteínas recombinantes producidas en E. coli).

Procedimiento de Ensayo de Cascada Raf1 Cinasa: El Raf-1 (c-Raf) se utiliza para fosforilar y activar el GST-MEK1 inactivo que entonces se puede fosforilar y activar el p42 GST-MAPK inactivo, que posteriormente se mide para fosforilación de la secuencia TEY (los aa 202-204) mediante un anticuerpo fosfo-específico de Sígma (cat.# 77439219041 ) Protocolo de Ensayo de Cinasa Soluciones Madre: Ensayo Raf 1. Amortiguador de Dilución de Ensayo (ADB): 20 mM MOPS, pH 7.2, 25mM ß-glicerol fosfato, 5mM EGTA, 1 mM ortovanadato sodio, 1 mM ditiotreitol. 2. Cocktail Magnesio/ATP: 500µM ATP frío y 75 mM de cloruro de magnesio en ADB. 3. Cinasa Activa: c-Raf Activo Humano: Uso de 0.4U por punto de ensayo. 4. GST-MEK1 no activo: Uso a 0.1 µg por punto de ensayo. 5. Cinasa MAP GST-p42 no activa: Uso a 1.0 µg por punto de ensayo.

ELISA 1. TBST - Tris (50 mM, pH 7.5), NaCI (150 mM), Tween-20 (0.05%) 2. Superbloque (Pierce) 3. Anti-GST Ab (Farmacia) 4. Anti-Fosfo MAPK (Sigma) 5. Anti-Ratón Ab / Conjugado de Europio (Wallac) Procedimiento de Ensayo: Primera Etapa: Activación Dependiente de c-Raf del GST-MEK y el GST-MAPK 1. Agregar 20 ml de ADB por ensayo (es decir, por pozo de una placa de 96 pozos) 2. Agregar 10 ml de 0.5 mM de ATP frío y 75 mM de cloruro de magnesio en ADB. 3. Agregar 2 ml de c-Raf (0.4U/ensayo), en conjunto con 1.6ml de MEK1 no activo (0.4 mg/ensayo). 4. Agregar 4 ml de Cinasa MAP GST-p42 no activa (1.0 mg/ensayo) 5. Incubar durante 60 minutos a 30°C en una incubadora de agitación. 6. Transferir la mezcla a una placa de 96 pozos recubierta con anti-GST Ab (placas de Nunc Immunosorb recubiertas o/n con un GST, luego bloquear con Pierce Superblock). 7. Incubar durante 60 minutos a 30°C en una incubadora de agitación. 8. Lavar 3X con TBST, agregar Anti-Fosfo MAPK (Sigma) (1 :3000) 9. Incubar durante 60 minutos a 30°C en una incubadora de agitación. 10. Lavar 3X con TBST, agregar Ab Anti-Mouse / Conjugado de Europio (Wallac) (1 :500) 11. Incubar durante 60 minutos a 30°C en una incubadora de agitación. 12. Lavar 3X con TBST, Leer las placas en un Lector de Placa modelo Wallac Víctor.

Ensayo de KDR Cinasa Materiales: 1 ) Nunc MaxiSorb 96F ELISA VWR 62409-024 2) Sustrato de Péptído: poli(Glu4-Tyr), Sigma (P-0275): Preparar madre de 5 mg/ml en agua. 3) TBS: BupH TBS Pierce (#28376); 25 mM Tris pH 7.2, 150 mM NaCI final 4) TBST: Amortiguador de Lavado=TBS+0.05% Tween-20: Para 500 ml: TBS(anterior) + 2.5 ml de 10% de Tween (hecho en TBS). 5) Compuesto: Preparado en DMSO. Almacenar compuestos a - 80°C. 6) Amortiguador de 5X KDR Cinasa: 5X 1X Para 50 ml de 5X 20 mM HEPES pH 7.4 4 mM HEPES 1 ml de 1 M HEPES 5 mM MnCI2 1 mM MnCI2 1.25 ml de 200 mM MnCI2 100 uM Na3VO4 20 uM Na3VO4 0.1 ml de 50 mM Na3V04 7) Diluyente de enzima: 0.1 % de BSA en 4 mM de HEPES, pH 7.4 8) 2.5X ATP [10 uM final]/ solución MgCI2 en HEPES: 2.5X conc. 1X en rxn Para 10 ml de 2.5X 25 uM ATP 10 uM ATP 0.25 ml de 1 mM ATP 25 mM MgCI2 10 mM MgCI2 1 ml de 250 mM MgCI2 10 mM HEPES 4 mM HEPES 0.1 ml de 1 M HEPES 8.65 ml de agua 9) Solución de 2.5X / MgCI2 en HEPES (sin ATP): 2.5X conc. 1 X en rxn Para 5 ml de 2.5X 25 mM MgCI2 10 mM MgCI2 0.5 ml de 250 mM gCI2 10 mM HEPES 4 mM HEPES 0.05 ml de 1 M HEPES 4.45 ml de agua 10) ATP (FW 551 ): AmerchamFarmacia #27-2056-01 (25 umol): 100 mM madre 11 ) 250 mM MgCI2: Sigma M-8266, anhidro, FW 95.21 ; 1.19 g / 50 ml de agua 12) Amortiguador de Ensayo: PerkinElmer 1244-106 13) Eu-anti-PY (PT66): PerkinElmer AD0040 (50 ug, clon Sígma PT66, anticuerpo anti-fosfotirosina) 14) Solución de Mejoramiento: PerkinElmer 1244-105 Métodos: 1. A las placas Nunc MaxiSorb, agregar 100 ul de péptido poli(Glu4-Tyr) a 25 ug/ml en TBS. Incubar 1 - 4 hr a TA. [Alternativa: variar la concentración final del péptido poli(Glu -Tyr) desde ~1 - 50 ug/ml; O utilizar péptido poli(Glu6-Ala3-Tyr)] 2. Lavar los pozos que contienen péptido 3 veces con 200 ul de TBS. 3. Agregar a cada pozo: 29 ul de Mezcla Maestra de KDR Cinasa [= KDR-IC + amortiguador 5X KDR Cinasa + agua (mezclada 1 :1 :0.9)] Combinar 10 ul de prep KDR-IC purificado, diluido (es decir, 1 :5 a 1 :20 dependiendo de la prep) en 0.1 % BSA / 4 mM HEPES + 10 ul de amortiguador de 5X KDR Cinasa + 9 ul de agua POR pozo de reacción. Ajustar el volumen de agua de acuerdo con esto si se utiliza más o menos volumen de compuesto. Estas adiciones se pueden hacer con un multi-pipeteador Matriz. 4. Agregar 1 ul de compuesto (madre 5X en DMSO dependiendo de la concentración del compuesto final deseado) a cada pozo (TV= 30 ul en este punto). 5. Incubar -15 min a TA para permitir la unión de los compuestos a la enzima. 4. Agregar 20 ul de 2.5X de ATP/MgCI2/solución HEPES a los pozos de muestra. Para KDR, rango lineal de reacción es -1 - 100 nM así 10 uM es típicamente utilizado. [Alternativa: concentración de ATP final se puede variar; uso de 2.5X MgCI2/HEPES sin ATP para algunas reacciones se permite la determinación del rango final bajo factible para la prep de cualquier enzima]. 5. Incubar durante 40 min a temperatura ambiente. [Alternativa: reacción de ensayo 30 a 60 min; o una temperatura de reacción de 37C, aunque esto hace mínima diferencia con las tandas corrientes de KDR]. 6. Lavar las placas 3X con 200 ul de TBST. 7. Agregar 75 ul de Eu-PY a 1 :2000 en un Amortiguador de Ensayo. 8. Incubar 45 - 60 min @ TA. 9. Lavar las placas 3X con 200 ul de TBST. 10. Agregar 100 ul de Solución de Mejoramiento (equilibrada a TA). 11. Leer las placas sobre un lector de placa fluorescente VÍCTOR TR.

Los conteos de europio curdo (fluorescencia) son convertidos a inhibición porcentual y/o IC50 basado en pozos de control no tratados (sin compuesto) utilizando plantillas Excel.

CUADRO 1 Actividad de 4- [ (2, 4-dicloro-5- metoxi fenil) amino] -5-metoxi-7- [ 3- ( 4- metil- 1-pipe racinil) propoxi] -3- quinolinocarbonitrilo contra varias quinasas ICso (µM) p38 0. 95 CAMKII 6. 25 PKA 5. 03 PKC-a 1. 47 p7 g S6K 6. 09 KDR 7. 00 Ra /me 0. 50 Src 0. 003. 5 c-Abl 0. 001 ICso = Concentración en la cual existe inhibición del 50% .

Datos de Proliferación de Célula Los compuestos de fórmula (I) es un inhibidor selectivo de las cinasas de la familia Src Cinasa y de las Abl cinasas. Los ensayos basados en célula también se utilizaron para examinar la selectividad de 4-[(2,4-dicloro-5- metoxifenil)amino]-5-metoxi-7-[3-(4-metil-1-piperacinil)propoxi]-3-quinolinocarbonitrilo. Los fibroblastos Rat que sobreexpresan una forma oncogénica de Src, donde el dominio catalítico del c-Src humano se insertó en lugar del dominio catalítico v-Src para crear una proteína c-Src de fusión v- Src/humano. Las sustituciones similares se hicieron con FynB, Lck, Lyn, y Hck, otros miembros de la familia Src. Además, el mismo tipo de célula que expresa las formas oncogénicas de v-Abl, receptor del factor-1 de crecimiento similar a insulina, receptor de factor de crecimiento de fibroblasto, receptor de factor de crecimiento de plaqueta y Her2 también se construyeron. La actividad del compuesto en estas células se determinó utilizando un ensayo de crecimiento independiente de anclaje, con base en la adquisición de la independencia de anclaje mediante fibroblastos que expresan las proteínas oncogénicas. El crecimiento bajo estas condiciones es dependiente de la actividad Cinasa, y la inhibición de la actividad Cinasa debe bloquear el crecimiento de la célula de una manera que refleje la inhibición de la fosforilación de las proteínas objetivo celulares. El cuadro 2 muestra los datos de proliferación obtenidos de 4-[(2,4-d¡cloro-5-metoxifeníl)amino]-5-metox¡-7-[3-(4-metíl-1-piperacinil)propoxi]-3-qu¡nol¡nocarbonitrílo bajo estas condiciones.

CUADRO 2 ENSAYOS BASADOS EN CÉLULA DE PENDIENTE DE QUINASA IC5o (µM) S rc 0 . 1 Lck 0 . 02 Fyn 0 . 4 Lyn 0 . 15 Hck 0 . 8 v-Abl 0 . 1 He 2 2 ICso = Concent ración en la cual existe inhibición del 50% .

Líneas de Tumor de Cabeza y Cuello Los compuestos de fórmula (I) son inhibidores potentes de la proliferación de célula tumoral en las líneas celulares de cabeza y cuello que sobreexpresan Src. Un perfil de proliferación representativo de 4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-5-metoxi-7-[3-(4-metil-1-piperacinil)propoxi]-3-quinolinocarbonitrilo con la línea HN5 se muestra en la Figura 1 , junto con evidencia para la inhibición de fosforilación de las proteínas objetivo corriente abajo.

Descripción de los Procedimientos de Prueba Biológicos.

Condiciones de crecimiento estándar. Para los experimentos descritos en el cuadro 3, 1000 células fueron puestas en placa en cada pozo de un disco de cultivo de célula de 96 pozos en el día 0 en medio de crecimiento estándar para esa línea celular particular. El compuesto se agregó en el día 1. Se determinó el número de células relativo en el día 4.

Método CelITiter-Glo. El ensayo de viabilidad de célula luminiscente CelITiter-Glo (Promega # G7573) se utilizó donde las células fueron usadas con el reactivo CelITiter Glo, agitado brevemente y se les permitió asentarse a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de analizar sobre un lector de placa Wallac equipado para lecturas de luminiscencia.

Ensayo MTS Algunos ensayos se monitorearon con la ayuda del ensayo CelITiter 96 (Promega # G3580). Con este ensayo, en el día 4, se agregó el reactivo de detección a la placa de 96 pozos y se midió la absorbancia a 490 nM. Ensayo SRB El ensayo de sulforodamina B (SRB) se utilizó para ciertas líneas de melanoma. En este ensayo, la concentración de suero en el medio de crecimiento fue del 5% y el volumen de medio de cultivo fue de 0.2 ml. En el día 4, se agregó 0.05 ml de 50% de ácido trifluoroacético al medio y a la placa se le permitió asentarse a temperatura ambiente durante 1 hora. El medio se decantó y la placa se lavó 3 veces con agua. Las placas lavadas se secaron, y luego se agregó 0.08 ml de reactivo SRB (SRB se obtuvo de Sigma; 0.4% SRB en 1% de ácido acético). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, las placas se lavaron con 1% de ácido acético hasta que no permaneció color rojo libre en la solución. El reactivo SRB unido se solubilízó con 0.15 ml 10 mM Tris (sin agregar ácido). Después de agitar durante 5 minutos sobre un agitador, se leyó la absorbancia a 540 nM.

Estudios In vivo Todos los estudios de animales se condujeron bajo un protocolo aprobado del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales. Las células tumorales fueron suspendidas en 50 millones de células/ml y 0.2 ml de la suspensión celular se inyectó subcutáneamente en un flanco de ratones desnudos hembra de 6-7 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA). Los ratones con tumores mayores de 200 mm3 después de una semana se les administró vehículo o compuesto mediante inyección intraperitoneal a las dosis indicadas en 0.2 ml del vehículo que contiene 0.5% de metilcelulosa y 0.4% de polisorbato 80 (Tween 80). El cuadro 3 resume los resultados del ensayo de proliferación obtenidos luego de tratar líneas de tumor de leucemia de célula T, próstata, pancreático, melanoma y cabeza y cuello con 4-(2,4-dicloro-5-metox¡-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-metil-piperacin-1-il)-propoxi]-qu¡nolina-3-carbonitrilo. También se muestra la capacidad de la administración de 4-(2,4-dícloro-5-metoxi-fenilamino)-6-metoxi-7-[3-(4-met¡l-piperac¡n-1-il)-propox¡]-quinolina-3-carbonitrilo para retardar el crecimiento de los xenoinjertos de tumor subcutáneo de melanoma A375 en ratones desnudos.

CUADRO 3 IC50 (uM) método Leucemia cé lula T HSB-2 0.014 MTS J Molt-4 8.2 MTS Próstata DU1 5 1.6 Célula-glo LnCap 3.5 Célula-glo Pancreático MiaPaca 1.3 Célula-glo BxPC3 3.9 Célula-glo 4 Capan 5.9 Célula-glo Melanoma A375 1.2 Célula-glo A375 0.9 SRB RPMI-7951 1.2 SRB HS-294-T 0.6 SRB Cabeza y cuello HM5 0.3 Célula-glo Estudio in vivo Dosis T/C Melanoma A375 30 mg/kg 39%, dia 12 Bid iP 9 dias

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de éste, para la fabricación de un medicamento útil para prevenir, tratar o inhibir cáncer.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el cáncer es cáncer pancreático.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el cáncer es cáncer linfático.

4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el cáncer es cáncer de próstata.

5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el cáncer es cáncer de cabeza y cuello.

6.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el cáncer es melanoma.

7.- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) o sales farmacéuticamente aceptables de ésta y un portador farmacéuticamente aceptable.

8.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento se adapta para ser sumínistrable solo o en combinación con uno o más compuestos utilizados para tratar cáncer.

9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde los otros compuestos se seleccionan de imatinib mesilato, hidroxiurea, IFN-a, agentes citotóxicos, genfitanib, gemcitabina, avastina y wortmanina, o sales farmacéuticamente aceptables de éste.

10.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde el otro compuesto es gemcitabina.

11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde los otros compuestos son gemcitabina y avastina.

12.- El uso de un compuesto de fórmula (I): o una sal farmacéuticamente aceptable de ésta, en combinación con gemcitabina, o una sal farmacéuticamente aceptable de éste, para la fabricación de un medicamento útil para tratar cáncer pancreático.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde el medicamento es además adaptado para ser administrable con avastina, o una sal farmacéuticamente aceptable de éste.