MX2007016068A - Uso de sanglifehrina en hcv. - Google Patents

Abstract

La presente invencion da a conocer el uso de un compuesto de macrolido, tal como una sanglifehrina, para el tratamiento y la prevencion de hepatitis C y enfermedades relacionadas, tal como fibrosis hepatica, cirrosis hepatica, y carcinoma hepatocelular.

Description

USO DE SANGLIFEHRINA EN HCV La presente invención se refiere a un nuevo uso para compuestos de macrólidos, tales como sanglifehrinas, que se enlazan con ciclofilinas. Las sanglifehrinas son una clase de compuestos de macrólidos policíclicos inicialmente aislados a partir de los caldos de fermentación de actinomicetos. Se ha encontrado que las sanglifehrinas exhiben actividades para enlazarse con las ciclofilinas, y en el caso de las sanglifehrinas A-D, exhiben actividades inmunosupresoras y actividades inhibidoras de la proliferación tanto de células-B como de células-T. Sin embargo, a diferencia de los compuestos inmunosupresores y anti-inflamatorios conocidos, tales como ciclosporina A y FK506, las sanglifehrinas no tienen actividad de enlace de FKBP o actividad inhibidora de calcineurina. Por consiguiente, las sanglifehrinas proporcionan una categoría novedosa de sustancia de fármaco, tanto en términos de estructura química como diferentes perfiles de actividad. Las sanglifehrinas y los métodos para su preparación se describen en las Patentes Números WO 97/02285, WO 98/07743, y US 006124453. Una serie de derivados de sanglifehrina, las mini-sanglifehrinas, se describen en J. Am. Chem. Soc. 2003, 125 (13), 3849-3859; J. Org. Chem. 2000, 65, 9255-9260; y Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38(16), 2443-2446. Ahora, de una manera sorprendente, se ha encontrado que las sanglifehrinas que se enlazan con ciclofilina, tienen un efecto inhibidor contra hepatitis C (HCV). De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona el uso de un compuesto que se enlaza con ciclofilina, tal como una sanglifehrina, para la prevención o el tratamiento de infecciones por hepatitis C, trastornos inducidos por el virus de hepatitis C, o inhibidores de la actividad de isomerasa cis-trans del peptidil-prolilo, o condiciones asociadas con enfermedades hepáticas. Los agentes también se pueden utilizar, por ejemplo, como un tratamiento profiláctico de neonatos nacidos de madres infectadas por el virus de hepatitis C, o de los trabajadores del cuidado de la salud expuestos al virus, o de receptores de trasplante, por ejemplo receptores de trasplante de hígado, para eliminar la posible infección recurrente por el virus de hepatitis C después del trasplante. La presente invención se refiere al uso de macrólidos, referidos en la presente colectivamente como "sanglifehrinas", en la prevención o el tratamiento de infecciones por hepatitis C. Las sanglifehrinas se aislan a partir de los caldos de fermentación de actinomicetos. Las sanglifehrinas comúnmente conocidas incluyen las sanglifehrinas A a D, por ejemplo de las Fórmulas: El anillo macrocíclico de las sanglifehrinas A a D se caracteriza porque i) las posiciones 1 a 6 comprenden un residuo de ácido 3-carboxi-piperidazinil-carboxílico, ii) las posiciones 7 a 9 comprenden un residuo de alfa-aminoácido aromático, y iii) las posiciones 10 a 12 comprenden un residuo de alfa-aminoácido alifático. El resto del anillo macrocíclico está comprendido por un residuo de ácido hidroxi-carboxílico, que proporciona, en el caso de las sanglifehrinas A a D, 11 átomos de carbono adicionales en el anillo macrocíclico primario.

De acuerdo con la práctica convencional en la química de macrólidos, los átomos del anillo macrocíclico primario de la sanglifehrina se enumeran como se indica anteriormente para la sanglifehrina A, empezando con el átomo de carbono del grupo carbonilo del enlace de lactona macrocíclico como la posición 1. Las sanglifehrinas A a D también se pueden caracterizar por la presencia de un novedoso sistema espiro bicíclico unido en la posición 23 del anillo macrocíclico por medio de un grupo enlazador de hidrocarbilo.

Las sanglifehrinas A a D se pueden someter a una extensa manipulación química para obtener macrólidos todavía adicionales de la clase de sanglifehrina. Estas manipulaciones incluyen la disociación del anillo macrocíclico, en particular en el grupo oxilo de lactona, la disociación del grupo enlazador entre el macrólido y los sistemas de anillos espiro, y la manipulación , por ejemplo la protección, derivación , u otra modificación química de las agrupaciones de sustituyentes; por ejemplo, como se describe posteriormente en la presente. Otros medios de modificación serán aparentes para los expertos en este campo. De acuerdo con la invención, se ha encontrado que las sanglifehrinas tienen un perfil característico y enteramente novedoso en términos de su actividad biológica contra las infecciones por hepatitis C. En particular, se ha encontrado que exhiben la combinación de actividades que se describen posteriormente en la presente. Las sanglifehrinas tienen un perfil de actividad que difiere de aquél de los compuestos inmunosupresores y anti-inflamatorios previamente conocidos, tales como las ciclosporinas y los macrólidos, por ejemplo de la rapamicina y N IM81 1 , indicando que las sanglifehrinas tienen un modo de acción diferente de estos compuestos. Por consiguiente, las sanglifehrinas proporcionan una categoría novedosa de sustancia de fármaco, tanto en términos de estructura como de actividad, que se puede anticipar que extenderán materialmente los límites de la terapia inmunosupresora, anti- inflamatoria, o anti-viral; por ejemplo, para evitar o reducir los efectos secundarios indeseables de las terapias inmunosupresoras y anti-inflamatorias anteriores, y/o para mejorar o extender esta terapia hasta nuevas áreas de enfermedad o nuevas categorías de pacientes. Las sanglifehrinas, por ejemplo, en donde el anillo de macrólido está en una forma de anillo abierto, en donde las posiciones 26 y 27 en el enlazador de hidrocarbilo entre el macrólido y los sistemas de anillo espiro están ambas sustituidas por hidroxilo, o en donde el residuo espiro unido al anillo macrocíclico se ha disociado o truncado, generalmente carecen de algunas o toda la combinación de actividades características de la sanglifehrina. Por ejemplo, las sanglifehrinas en donde el residuo espiro está disociado, típicamente poseen una actividad de enlace de ciclofilina, pero no poseen una actividad inmunosupresora significativa. Como será aparente para los expertos en este campo, sin embargo, estos compuestos proporcionan valiosos componentes, intermediarios, o bloques de construcción clave para la preparación de otras sanglífehrinas novedosas, y por consiguiente, extienden adicionalmente el potencial terapéutico de la clase de sanglifehrina. Debido a que su presencia parece ser material para la actividad biológica, por ejemplo, de las sanglifehrinas A a D, el sistema espiro bicíclico también se puede ver como que proporciona un componente estructural con un significado biológico clave, útil como un componente estructural para la derivación o modificación adicional , tanto en relación con la producción de sanglifehrinas adicionales, como para la aplicación en la derivación o modificación de otras sustancias de fármaco, por ejemplo, para modificar la actividad de otras sustancias de fármaco inmunosupresoras de la clase de macrólidos. De conformidad con lo anterior, en un primer aspecto, la invención proporciona: un macrólido en donde: i) las posiciones 2 a 6 inclusive del anillo macrocíclico son provistas por un residuo de ácido piperidazinil-carboxílico; y/o ii) las posiciones 7 a 9 inclusive del anillo macrocíclico son provistas por un residuo de alfa-aminoácido aromático; y/o iii) las posiciones 1 0 a 1 2 inclusive del anillo macrocíclico son provistas por un residuo de alfa-aminoácido alifático, en forma libre o protegida, o una sal de los mismos. Adecuadamente, los macrólidos de la invención comprenden dos, y en especial los tres rasgos estructurales característicos i), ii) , Y iü) - El residuo de ácido piperidazinil-carboxílico es adecuadamente un residuo de 1 ,2-piperidazin-3-carbox-1 -ilo, del cual la fracción de carboxilo ocupa la posición 1 , y el átomo de nitrógeno- 1 ocupa la posición 6 del anillo macrocíclico, por ejemplo, un residuo de la Fórmula I : en donde los números asignados representan la posición de los átomos del residuo en el anillo macrocíclico. Este residuo puede estar sustituido en el anillo, o puede estar insustituido. Adecuadamente, está insustituido. La fracción de carboxilo del residuo de alfa-aminoácido aromático adecuadamente ocupa la posición 7 del anillo macrocíclico, y la fracción de alfa-amino ocupa la posición 9. De una manera adecuada, el alfa-aminoácido aromático es una fenilalanina sustituida o insustituida, en especial por residuos de hidroxi lo, metoxilo, etoxilo , OnPr, OiPr, en forma libre, protegida, o activada. La fracción de carboxilo del residuo de alfa-aminoácido alifático adecuadamente ocupa la posición 1 0 del anillo macrocíclico, y la fracción de alfa-amino ocupa la posición 1 2. De una manera adecuada, el residuo de alfa-aminoácido alifático es un residuo de valina, en forma libre, protegida, o activada. El resto del anillo macrocíclico adecuadamente comprende un residuo de ácido hidroxi-carboxílico, cuya fracción de oxilo completa el enlace de lactona macrocíclico, y cuya fracción de carbonilo forma un enlace de amida con el grupo alfa-amino en la posición 1 2 del anillo macrocíclico. Este residuo de ácido hidroxi-carboxílico adecuadamente tiene una longitud de cadena de 6 a 20, más adecuadamente de 1 1 átomos de carbono. Puede estar sustituido o insustituido, y/o puede contener uno o más enlaces insaturados, en particular dobles enlaces acumulativos a lo largo de su longitud. Más adecuadamente, el resto del anillo macrocíclico comprende un residuo de 11-oxi-undecanoil-11-ilo, en especial de 11 -oxi-undeca-6,8-dienoil-11-ilo, opcionalmente sustituido, por ejemplo, en las posiciones 2, 3, 4, y/o 5. Más adecuadamente, el residuo de ácido hidroxi-carboxílico es un residuo de la Fórmula II: en donde Ri es H, OH, o representa un enlace extra, y R2 es H o representa un enlace extra; R3 es H, y R4 es --CO--CH3 o --CH(OH)--CH3, o R3 y R4 representan juntos una estructura de la Fórmula lll: <nu ocp> III en forma libre o protegida, o una sal de la misma. Los macrólidos preferidos de acuerdo con la invención, de conformidad con lo anterior, son aquéllos que comprenden un anillo macrocíclico de la Fórmula IV: x — Y — . IV en donde X, Y, y Z son los residuos i), ii), y ¡ii), como se definen anteriormente, y A es un residuo de ácido hidroxi-carboxílico como se define anteriormente, en forma libre o protegida, o una sal del mismo; en particular un anillo macrocíclico de la Fórmula V: V en forma libre o protegida, o una sal del mismo. En términos generales, en las sanglifehrinas, el anillo macrocíclico está sustituido en el átomo de carbono adyacente a la fracción de oxilo del puente de lactona. Típicamente, este sustituyente comprende un residuo de 1 -oxo-7-aza-espiro-[5.5]-undecan-8-ona-2-ilo, por ejemplo de la Fórmula VI : en donde --a-b-- es --(Me)C=CH- ó --(Me)CH--CH(OH)--, y R es H o Me (en donde Me y Et representan metilo y etilo, respectivamente) , en forma libre o protegida, o una sal del mismo, enlazado con el anillo de macrólido por medio de un enlazador que comprende una secuencia lineal de 6 a 1 1 , típicamente de 9 átomos de carbono, entre el residuo de espiro y el anillo de macrólido. El grupo enlazador puede estar sustituido o insustituido, y/o puede contener uno o más enlaces insaturados, en particular dobles enlaces acumulativos, a lo largo de su longitud. Adecuadamente, el grupo enlazador puede estar sustituido por metilo, por ejemplo por dos grupos metilo. De una manera adecuada, el grupo enlazador puede estar adicionalmente sustituido por hidroxilo, por ejemplo por tres sustituyentes de hidroxilo, y/o puede estar etilénicamente insaturado, por ejemplo puede contener dos dobles enlaces de carbono-carbono. Más adecuadamente, el grupo enlazador comprende un residuo de 1 J-dimetil-nonan-9-ilo, en especial de 1 ,7-dimetil-non- 1 -en-9-ilo, o de 1 J-dimetil-nona- 1 ,3-dien-9-ilo, opcionalmente sustituido, por ejemplo, en la posición 3, 4, y/u 8. De preferencia, el grupo enlazador es un grupo de la Fórmula Vil: Vil en donde c representa el enlace con el residuo de espiro; d representa el enlace con el anillo macrocíclico, y R6 y R7 son cada uno OH , o representan juntos un enlace adicional, en forma libre o protegida. El grupo enlazador generalmente se unirá al anillo macrocíclico en el átomo de carbono inmediatamente adyacente al grupo oxilo de lactona, es decir, cuando el anillo macrocíclico comprende un residuo de 1 1 -oxi-undecanoil-1 1 -ilo, en la posición 1 1 del mismo. De conformidad con lo anterior, la invención proporciona compuestos de la Fórmula VII I : S-L-M- VIH en donde S representa un residuo de espiro bicíclico, como se define anteriormente; L representa un grupo enlazador como se define anteriormente; y M representa un anillo de macrólido como se define anteriormente; en forma libre o protegida, o una sal del mismo. Los compuestos particulares de la invención son aquéllos de las Fórmulas IXa y IX: DXa ix en donde --a— b-- es como se define anteriormente, --e—f— es -CH(OH)"CH(OH)- ó -CH=CH--; -g-h- es como se define anteriormente para --a--b--, y R3, R4, y R5 son como se definen anteriormente, en forma libre o protegida, o una sal de los mismos. Los compuestos de las Fórmulas I a IX contienen átomos de carbono asimétricos, y por lo tanto, pueden existir en un número de formas epiméricas. Todos los posibles epímeros, así como las mezclas diaestereoisoméricas de los mismos, están abarcados en la invención. Sin embargo, los compuestos de las Fórmulas VI I I y IX, en donde el anillo de macrólido está en una forma de anillo cerrado, y que son de una estereoquímica apropiada, poseen actividades que son características de las sanglifehrinas, como se refiere en la presente. Los epímeros que poseen actividades características de la sanglifehrina son los preferidos. En general, por ejemplo, para uso farmacéutico de acuerdo con la invención , los epímeros que poseen actividades características de sanglifehrina en una forma pura o sustancialmente pura (es decir, libre o sustancialmente libre de epímeros que carezcan de las actividades características de la sanglifehrina), por ejemplo que comprenden cuando menos el 90 por ciento, por ejemplo cuando menos el 95 por ciento de epímero activo (es decir, que comprenden menos del 10 por ciento, por ejemplo menos del 5 por ciento del epímero inactivo) , serán los preferidos. De preferencia, el residuo de ácido 3-carboxi-piperidazinil-carboxílico i) en las posiciones 1 a 6 del anillo macrocícl ico tiene la siguiente conformación : De preferencia, el aminoácido aromático ii) en las posiciones 7 a 9 del anillo macrocíclico tiene la configuración L, por ejemplo es de la configuración: De una manera preferible, el aminoácido alifático ii) en las posiciones 1 0 a 12 del anillo macrocíclico, tiene la configuración L, por ejemplo es de la configuración: Cuando el resto del anillo macrocíclico comprende un residuo la Fórmula I I , de preferencia tiene la configuración: Cuando R3 y R4 son juntos de preferencia de la configuración: De preferencia el residuo de 1 -oxo-7-aza-espiro-[5.5]-undecan--ona-2-ilo tiene la configuración: en donde, cuando --a--b- es -(Me)CH--CH(OH)--, de preferencia tiene la configuración: Cuando el enlazador es de la Fórmula Vil, de preferencia es de la configuración: Cuando R6 y R7 son cada uno OH, la configuración en las posiciones 26 y 27 de preferencia es cualquiera de 26(S), 27(S) ó 26(R), 27(R). Cuando R6 y R7 representan juntos un enlace adicional, la configuración en las posiciones 26 y 27 es de preferencia: Los compuestos de la invención de la Fórmula IX de preferencia tiene la siguiente conformación: en donde, cuando --a--b-- es --(Me)CH--CH(OH)--, de preferencia tiene la configuración: cuando --e--f-- es --CH(OH)--CH(OH)--, de preferencia tiene la configuración (S),(S), o la configuración (R),(R); cuando --g--h-- es --(Me) CH--CH(OH)--, de preferencia tiene la configuración: cuando --g--h-- es (Me)C=CH--, de preferencia tiene configuración: y cuando R3 y R4 se fusionan entre sí, de preferencia tienen la configuración: Los compuestos de la invención pueden estar en una forma libre o protegida, por ejemplo, en formas protegidas, como se describen en "Protective Groups in Organic Synthesis" por T. W. G reene y P. G . M. Wuts, 2a Edición, 1 991 , John Wiley & Sons Inc. , N ueva York. En particular, los grupos OH pueden estar en una forma protegida, por ejemplo en la forma de silil-éteres, por ejemplo como se describe en las páginas 68 a 86 de Greene y Wuts, ¡bid) , esteres (véanse, por ejemplo, las páginas 87 a 103 de Greene y Wuts, ibid), y carbonatos (véanse, por ejemplo, las páginas 1 04 a 1 1 1 de Greene y Wuts, ibid) . Estas formas protegidas también incluyen las formas internamente protegidas; por ejemplo, en el caso de los macrólidos de la Fórmula IX , en donde --g--h- es --CH(CH3)--CH(OH)--, la forma protegida, en donde las posiciones 1 4 a 17 del anillo macrocíclico comprenden un residuo de la Fórmula X: También , por ejemplo, los 1 ,3-dioles presentes en las sanglifehrinas, se pueden proteger como estructuras de anillo apropiadas, por ejemplo como se describe en las páginas 1 1 8 a 142 de Greene y Wuts, ibid. Los compuestos de la invención también existen en una forma de sal. Los ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas para utilizarse de acuerdo con la invención incluyen las sales de adición de ácido y de base, como sea apropiado, teniendo consideración de los sustituyentes particulares presentes en el compuesto, por ejemplo las formas de sal de HCl. Como se indicó anteriormente, el anillo macrocíclico de los compuestos de la invención se puede disociar, en particular en el grupo oxilo de lactona, para proporcionar compuestos en donde el anillo macrocíclico esté en una forma de anillo abierto. En general, la disociación del grupo oxilo de lactona procede mediante hidrólisis (solvólisis), por ejemplo, para proporcionar compuestos macrocíclicos de anillo abierto de la Fórmula XI: R60-X--Y-Z-A-OH XI por ejemplo, de la Fórmula XII: XII por ejemplo, un compuesto de la Fórmula IX': IX ' en donde X, Y, Z, A, --a--b--, --e--f--, -g-h—, R3, R4, y Rs son como se definen anteriormente, y R6 es H o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo metilo. Estas formas de anillo abierto proporcionan medios intermediarios para la modificación del sistema de anillo macrocíclico de sanglifehrina básico, y también son parte de la presente invención. De conformidad con lo anterior, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona: un macrólido como se define anteriormente en la presente, en una forma de anillo abierto, estando este macrociclo de anillo abierto en forma libre o protegida o una sal del mismo; un compuesto R6 es O--X--Y--Z--A--OH , como se define anteriormente, en forma libre o protegida, o una sal del mismo; un compuesto R6 0--X--Y--Z--A'--CH (OH)--L--S, en donde --A'-CH(OH)-- es un residuo de ácido de ácido hidroxi-carboxílico, por ejemplo un residuo de la Fórmula II , como se define anteriormente, y los otros símbolos son como se definen en lo anterior, en una forma libre o protegida, o una sal del mismo; un compuesto de la Fórmula XI I': en forma libre o protegida, o una sal del mismo; un compuesto de la Fórmula IX': IX' en forma libre o protegida, o una sal del mismo. En las modalidades particulares de este aspecto, la invención proporciona un compuesto de la Fórmula IX": en donde --a--b-- es -(Me)C=CH-- ó -(Me) CH--CH(OH)--; R8 es H ó --C(O)--OR10, en donde R10 es H ó Me; R9 es H ó, cuando --a--b-- es -(Me)CH--CH(OH)--, y R es -- C(0)--OMe, R9 es Me, y X es H cuando --N — N-- representa un enlace individual entre los dos átomos de N , ó X, junto con --N — N-- representa un doble enlace entre los dos átomos de N , en forma libre o protegida, o una sal del mismo. De una manera más particular, la invención proporciona compuestos de las Fórmulas W, Y (Seco-sanglifehrina A), S (Se-sanglifehrina B) , y T: W La invención también incluye compuestos en donde el sistema illo de 1 -oxo-7-aza-espiro-[5.5]-undecan-8-ona-2-ilo está en forma de anillo abierto, por ejemplo un compuesto de la Fórmula XIII: XDDI en donde a, b, L, y M son como se definen anteriormente, en forma libre o protegida, o una sal del mismo. Los compuestos de anillo abierto de la invención de preferencia son de la conformación como las conformaciones preferidas identificadas anteriormente para los compuestos de anillo cerrado. El sistema de anillo bicíclico espiro de anillo abierto de los compuestos de la Fórmula XIII de preferencia es de la conformación: en donde, cuando --a--b-- es --(Me) CH--CH(OH)--. En particular, la invención proporciona un compuesto de la Fórmula Z (Sanglifehrina E): Z en forma libre o protegida, o una sal del mismo. Los compuestos de las Fórmulas IX", S, T, W, Y, XIII , y Z son intermediarios útiles para la preparación de sanglifehrinas, incluyendo en general las formas de anillo cerrado y las formas de anillo abierto y anillo expandido. Los compuestos de la Fórmula IX" se pueden preparar mediante la disociación del anillo de macrólido de una sanglifehrina de anillo cerrado, por ejemplo sanglifehrina A ó B, en, o en la vecindad de, el grupo oxilo de lactona. Por consiguiente, por ejemplo, los compuestos de las Fórmulas Y y T se preparan mediante el tratamiento de sanglifehrina A bajo condiciones básicas, por ejemplo, para el compuesto de la Fórmula l l l , en la presencia de un hidróxido de metal alcalino, y, por ejemplo, para el compuesto de la Fórmula IV, en la presencia de metanol y un carbonato de metal alcalino. De una manera alternativa, los compuestos de la Fórmula IX" se pueden obtener como aislados de cultivos de un microorganismo productor de sanglifehrina. Por ejemplo, los compuestos de las Fórmulas Y y S se pueden obtener como aislados de los cultivos de Streptomyces sp. A92-308110 como se describe posteriormente en la presente. El aislamiento de los compuestos de las Fórmulas Y y S a partir de cultivos de Streptomyces sp. A92-308110, se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6124453. El compuesto de la Fórmula Z se puede obtener mediante la disociación del sistema de anillo espiro-bicíclico, entre el átomo de nitrógeno y el átomo central del sistema espiro. De una manera alternativa, el compuesto de la Fórmula Z se puede obtener como un aislado a partir de un cultivo de un microorganismo productor de sanglifehrina. Por ejemplo, el aislamiento del compuesto de la Fórmula Z a partir de cultivos de Streptomyces sp. A92-308110, se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6124453. Los macrólidos de acuerdo con la invención, que tienen un residuo biciclo espiro unido al anillo macrocíclico, se pueden someter a disociación del grupo enlazador que interviene, por ejemplo, en relación con la Fórmula IX, en particular en el enlace entre los residuos 26 y 27, para proporcionar compuestos espiro-biciclo novedosos separados, y macrólidos adicionales. También como se indicó anteriormente, estos compuestos son útiles como intermediarios, teniendo la fracción bicíclica espiro de las sanglifehrinas en particular un papel funcional integral en la actividad biológica de las sanglifehrinas como una clase. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona un 1 -oxo-7-aza-espiro-[5.5]-undecan-8-ona-2-ilo, en forma libre o protegida, o una sal del mismo, en particular un compuesto de la Fórmula VI': vr en donde R7 es H , y opcionalmente un grupo OH protegido, un grupo funcional reactivo, o un grupo --CH2--CH(OH)--CH(CH3)--CH2--CH2--CHO, o el equivalente de delta-lactol del mismo, en una forma libre o protegida, o una sal del mismo. De preferencia, el compuesto de la Fórmula VI' tiene la siguiente configuración : en donde, cuando --a--b-- es --(Me)CH--CH(OH)--, de preferencia tiene la configuración como se define anteriormente en la presente. La invención también incluye un 1 -oxo-7-aza-espiro-[5.5]-undecan-8-ona-2-ilo de anillo abierto, en forma libre o protegida, o una sal del mismo, en particular un compuesto de la Fórmula XIII': XDDD' en donde --a--b-- y R7 son como se definen anteriormente, en forma libre o protegida, o una sal del mismo. El sistema de anillo bicíclico espiro de anillo abierto de los compuestos de la Fórmula XI I!' de preferencia es de la conformación: en donde, cuando --a-- b-- es --(Me)CH--(OH)--, de preferencia tiene la configuración como se define anteriormente. La invención también proporciona un macrólido de la Fórmula XIV: Cll, ,co. XDV en donde M es un anillo de macrólido como se define anteriormente, en particular un macrólido de la Fórmula XV: XV de preferencia de la conformación: en donde, cuando --g--h-- es --(Me) CH--CH(OH)--, de preferencia tiene la configuración como se define anteriormente, y cuando --g--h-- es --(Me)C = CH-- , de preferencia tiene la configuración como se define anteriormente, y cuando R3 y R4 se fusionan entre sí, de preferencia son de la configuración como se define en la presente, en forma libre o protegida o de anillo abierto, o una sal del mismo. La invención también proporciona un macrólido particular de la Fórmula XVI : XVI en donde X es H, metoxilo, etoxilo, OnPr, OiPr; R14 y Fl15 son independientemente H, metilo, alquilo, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), (C1-C4-)-CO-CH3, ó R14 y R.s se fusionan para formar un cicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o insustituido; seleccionado, por ejemplo, a partir de la Fórmula XVII: XVII R?6 es H, ó Me o alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono); R?7 es H, OH, -O-alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), o R14, R15, y R17 se fusionan para formar un cicloalquilo de la Fórmula XVIII: XVIII R23 es H, alquilo (de 1 a 10 átomos de carbono) de cadena ramificada o recta, y/o contiene uno o más enlaces insaturados, en particular dobles o triples enlaces acumulativos a lo largo de su longitud, de preferencia -CH=CH2,-CH2-OH, -CH2-OCH3, -CHO, -COOH, o de la Fórmula XIX': Adecuadamente, R23 puede estar sustituido como se describe en la presente. En otro aspecto de la invención, los macrólidos particulares se seleccionan a partir de la Fórmula XX: En un aspecto adicional, la invención incluye los macrólidos y compuestos de la invención, en particular aquéllos que son productos naturales en una forma sustancialmente purificada, por ejemplo en una forma cuando menos el 90 por ciento, de preferencia cuando menos el 95 por ciento, y en especial cuando menos el 98 por ciento pura. En una modalidad particular de la invención, las sanglifehrinas A, B, C, y D, entre otras, se aislan a partir de las novedosas Streptomyces sp. A92-308110. Las muestras de Streptomyces sp. A92-308110 se depositaron en el Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, el 3 de mayo de 1995, bajo los términos del Tratado de Budapest, y se les ha asignado el Número de Depósito DSM 9954. El aislamiento de las sanglifehrinas A, B, C, y D a partir de cultivos de Streptomyces sp. A92-308110, se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US6124453. Los macrólidos de acuerdo con la invención, por ejemplo los compuestos de la Fórmula IX; por ejemplo las sanglifehrinas A, B, C, y D, y sus sales farmacéuticamente aceptables, referidos posteriormente en la presente de una manera genérica como "los agentes de la invención", exhiben actividades características de sanglifehrina, es decir, la siguiente combinación de actividades: tienen actividad de enlace de ciclofilina; tienen actividad inhibidora contra la isomerasa cis-trans de peptidil-prolilo; tienen actividad inmunosupresora; inhiben la proliferación tanto de células-B como de células-T; pero no tienen actividad de enlace de proteína de enlace de FK, y no inhiben la actividad de la calcineurina. La actividad biológica de los macrólidos de la invención, por ejemplo, para la Fórmula XVI, se puede demostrar en métodos de prueba convencionales in vitro e in vivo, por ejemplo, como sigue. Se puede preparar la respuesta proliferativa de linfocitos al estímulo alogénico como sigue. Se co-incuban células de bazo (2x105) de ratones Balb/c (hembras, de 8 a 10 semanas) durante 4 días, con 2x105 células de bazo de ratones CBA (hembras, de 8 a 10 semanas). Las células alogénicas inducen una respuesta proliferativa en la población de células de bazo respondente, que se mide mediante la incorporación del precursor marcado en el ADN. Los macrólidos de la invención, por ejemplo los compuestos de la Fórmula IX y sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo las sanglifehrinas A, B, C, y D, tienen una IC50 en el intervalo de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 200 nM, comparándose con una IC50 de aproximadamente 20 nM para la ciclosporina A, cuando se prueban en este ensayo. (T. Meo (1979) The MLR in the mouse. En: "Immunological Methods", L. Lefkovits y B. Pernis, Eds. Academic Press, N. Y. páginas 227-239). Las células de bazo (2x105) de ratones CBA se incuban durante 48 horas con 50 microgramos/mililitro de lipopolisacárido más el compuesto de prueba. La proliferación se mide mediante la incorporación del precursor marcado en el ADN. Los macrólidos de la invención, por ejemplo los compuestos de la Fórmula IX y sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo las sanglifehrinas A, B, C, y D, inhiben la proliferación de células-B, y tienen una IC50 en el intervalo de aproximadamente 40 hasta aproximadamente 100 micromolar. (Greaves, M. y J. Janossy, 1972, Elicitation of selective T and B lymphocyte response by cell surface binding ligands, Transplant Rev., 11:87. Janossy, G. y M. F. Greaves, 1971, Lymphocyte activation, I, Response of T and B lymphocytes to phytomitogens, Clin. Exp. Immunol.9:483-498). La citotoxicidad se determina utilizando la línea celular monocítica humana THP1 (5x104 células/pozo), que se incuba en la presencia de IFNgamma (100 unidades/mililitro) y lipopolisacárido (5 microgramos/mililitro) más el compuesto de prueba (hasta 10 micromolar) durante 24 a 72 horas , a 37°C. Las células vivas se cuantifican utilizando el MTT de lectura colorimétrico que mide la actividad enzimática de deshidrogenasa mitocondrial en las células vivas (Mossman 1983) . Los macrólidos de la invención , por ejemplo los compuestos de la Fórmula IX, y sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo las sanglifehrinas A, B, C, y D, tienen una IC50 de aproximadamente 1 ,000 a 5,000 nM después de 24 horas de incubación en este ensayo. (Mossman T. J. ( 1 983) , Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assays, J. Imm. Methods, 65, 55-63) . Se preparan células mononucleares a partir de sangre periférica de voluntarios saludables utilizando la separación de densidad Ficoll-Hypaque de acuerdo con el método de Hansell y colaboradores ( 1 991 ) . Las células ( 105 células/pozo en 200 microlitros de RPM I , con FCS al 1 0 por ciento por volumen) se incuban con diluciones en serie de los compuestos de prueba durante 30 minutos a 37°C antes de la adición del estímulo. Se utiliza interferón-gamma ( 1 00 unidades/mililitro) y lipopolisacárido (5 microgramos/mililitro) cerno estímulo para inducir la liberación del factor de necrosis tumoral (TNF)alfa, por parte de las células mononucleares de sangre periférica. Después de 3 horas de incubación, las células se centrifugan (1 ,200 revoluciones por minuto durante 10 minutos), y se recolectan los sobrenadantes. La cantidad de TN F presente en los sobrenadantes celulares se determina utilizando un kit de ensayo inmunosorbente enlazado con enzima comercialmente disponible. Los macrólidos de la invención, por ejemplo los compuestos de la Fórmula IX, y sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo las sanglifehrinas A, B, C, y D, tienen una IC50 en el intervalo de aproximadamente 200 nM a aproximadamente 1 ,000 nM cuando se prueban en este ensayo. Un ensayo de enlace de ciclofilina adecuado es la prueba ELISA competitiva descrita por Quesniaux en Eur. J. Immunol. 1 987 1 7 1 359-1365. En esta prueba, el compuesto que se va a probar se agrega durante la incubación de la ciclofilina (ciclofilina A humana recombinante) con BSA-ciclosporina A recubierta, y entonces se calcula la concentración requerida para dar una inhibición del 50 por ciento de la reacción de control sin competidor (IC 0) . Un ensayo alternativo es la prueba de enlace competitivo descrita por Schneider y colaboradores, en Biochemistry ( 1 994), 33, 821 8-8224, que involucra la adición del compuesto de prueba durante la incubación de la ciclofilina biotinilada (ciclofilina A humana recombinante) con BSA-ciclosporina A recubierta. La cantidad de ciclofilina biotinilada enlazada en la presencia y en ausencia de un compuesto de prueba se determina mediante incubación con fosfatasa alcalina acoplada con estreptavidina. Los macrólidos de la invención, por ejemplo los compuestos de la Fórmula IX, por ejemplo las sanglifehrinas A, B, C, y D, tienen una IC50 en el intervalo de aproximadamente 1 0 a aproximadamente 100 nM, comparándose con una IC50 de aproximadamente 80 nM para la ciclosporina A cuando se prueba en estos ensayos .

Otros ensayos in vitro que se pueden utilizar para demostrar la actividad biológica de las sanglifehrinas son los ensayos del gen reportero IL-2, y los ensayos de células de bazo estimuladas por ConA (que indican el efecto sobre la activación de las células-T). Los macrólidos de la invención, por ejemplo los compuestos de la Fórmula IX, por ejemplo las sanglifehrinas A, B, C, y D, no tienen actividad de enlace de proteína de enlace de FK, y no inhiben la actividad de calcineurina cuando se prueban en las pruebas convencionales para determinar estas actividades. Los agentes de la invención son útiles como productos farmacéuticos, por ejemplo como inmunosupresores, así como agentes anti-inflamatorios y/o anti-virales. En particular, son útiles para la prevención de los trastornos asociados con infección viral por hepatitis, en particular hepatitis C. Adicionalmente, los agentes de la invención tienen uso terapéutico en la inhibición de los trastornos asociados con la actividad de la isomerasa cis-trans de peptidil-prolilo (PPIasa). Las PPIasas son un tipo de ciclofilina que sirven para acelerar el pliegue de la proteína mediante la catalización de la isomerización cis-trans de los enlaces peptídicos imídicos de prolina en los oligopéptidos. Los macrólidos de la invención se enlazan con las ciclofilinas e inhiben la actividad de PPI. Los agentes de la invención también son útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y de condiciones inflamatorias, en particular las condiciones inflamatorias con una etiología que incluye un componente autoinmune, tales como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis crónica progrediente, y artritis deformans) , y enfermedades reumáticas. En una serie de modalidades específicas o alternativas adicionales, la presente invención también proporciona: 1 .1 Un método para prevenir o tratar infecciones por hepatitis C o trastornos inducidos por el virus de hepatitis C, tales como fibrosis hepática, cirrosis hepática, y carcinoma hepatocelular, en un sujeto que lo necesite, el cual comprende administrar a este sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, por ejemplo un compuesto de la Fórmula Vi l , solo o en combinación con uno o más co-agentes. 1 .2 Un método para inhibir la réplica del virus de hepatitis C en un medio, el cual comprende aplicar a este medio una cantidad efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, por ejemplo un compuesto de la Fórmula Vi l . 1 .3 Un método para inhibir la réplica del virus de hepatitis C en un paciente que lo necesite, el cual comprende administrar a este sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, por ejemplo un compuesto de la Fórmula Vi l . 1 .4 Un método para prevenir la recurrencia de infección por el virus de hepatitis C en un receptor de trasplante que lo necesite, el cual comprende administrar a este receptor una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de oiclofilina, tal como una sanglifehrina, por ejemplo un compuesto de la Fórmula Vi l . 2. El uso de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, en la preparación de una composición farmacéutica para utilizarse en cualquier método como se define anteriormente. 3. Una composición farmacéutica para utilizarse en cualquier método como se define anteriormente, la cual comprende un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, junto con uno o más diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables para el mismo. En adición, las sanglifehrinas de la invención que poseen actividad de enlace de ciclofilina, pueden ser útiles como reactivos en inmunoensayos de desplazamiento para ciclosporinas y otros compuestos de enlace de ciclofilina, por ejemplo, en el procedimiento de ensayo descrito en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 95/07468. Esta solicitud de patente se refiere a un procedimiento de ensayo para determinar la concentración de un producto farmacéutico de enlace de inmunofilina, por ejemplo ciclosporina, en sangre; comprendiendo el procedimiento agregar un competidor de enlace que desplace al producto farmacéutico de los complejos de inmunosupresor-inmunofilina en la sangre; agregar un receptor que se enlace con el producto farmacéutico, pero no significativamente con el competidor de enlace; separar el complejo de receptor-producto farmacéutico de la muestra; y determinar la cantidad del producto farmacéutico. Las sanglifehrinas se pueden utilizar como el competidor de enlace en estos ensayos; por ejemplo, para desplazar las ciclosporinas de las ciclofilinas, liberando de esta manera a la ciclosporina para la cuantificación, por ejemplo, mediante un anticuerpo monoclonal que sea específico para la ciclosporina. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona, en un aspecto todavía adicional: 4. Una combinación farmacéutica, la cual comprende: a) Un primer agente que es un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I , y b) un co-agente, por ejemplo uno o más agentes de fármaco, como se disponen en la presente. 5. Un método como se define anteriormente, el cual comprende la co-administración, por ejemplo de una manera concomitante o en secuencia, de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I , y un coagente, por ejemplo uno o más agentes de fármaco, como se disponen en la presente invención . El compuesto de la invención se puede administrar por cualquier vía convencional , en particular enteralmente, por ejemplo oralmente, por ejemplo en la forma de soluciones para beber, tabletas o cápsulas, o parenteralmente, por ejemplo en la forma de soluciones o suspensiones inyectables. Las composiciones farmacéuticas preferidas, por ejemplo, pueden ser aquéllas basadas en microemulsiones, como se describen en la Patente del Reino Unido Número UK 2,222,770 A. En otro aspecto, los co-agentes adecuados se pueden co-administrar en un tratamiento de combinación o alternado. Los términos "co-administración" o "administración combinada", o similares, como se utilizan en la presente, pretenden abarcar la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un paciente, y pretenden incluir regímenes de tratamiento en donde los agentes no necesariamente se administran por la misma vía de administración o al mismo tiempo. Las combinaciones fijas también están dentro del alcance de la presente invención. La administración de una combinación farmacéutica de la invención da como resultado un efecto benéfico, por ejemplo un efecto terapéutico sinérgico o aditivo, comparándose con la monoterapia, en donde solamente se aplica uno de los ingredientes farmacéuticamente activos. Los coagentes adecuados para la co-administración con el compuesto de la invención ¡ncluyen, pero no se limitan a: (1) Interferones o conjugados de interferones, tales como: (a) Intron-A®, interferón alfa-2b (Schering Corporation, Kenilworth, NJ), (b) PEG-Intron®, peginterferón alfa-2b (Schering Corporation, Kenilworth, NJ), (c) Roferon®, ¡nterferón recombinante alfa-2a (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), (d) Pegasys®, peginterferón alfa-2a (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), (e) Berefor®, interferón alfa 2 disponible (Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc. , Ridgefield, CT), (f) Sumiferon®, una mezcla purificada de interferones alfa naturales (Sumitomo, Japón) , (g) Wellferon®, interferón alfa n 1 linfoblastoide (GlaxoSmithKIine) , (h) I nfergen®, interferón alfa en consenso ( InterMune Pharmaceuticals, I nc. , Brisbane, CA y Amgen, Inc. , Newbury Park, CA) , (i) Alterón®, una mezcla de interferones alfa naturales (Interferon Sciences, y Purdue Frederick Co., CT), (j) Viraferon®; (k) Los interferones conjugados incluyen, por ejemplo, Albuferón (Human Genome Science) , el cual se conjuga con la albúmina humana. El interferón conjugado con un polímero soluble en agua u homopol ímeros de poli-óxido de alquileno, tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos, y copolímeros de bloques de los mismos. Como una alternativa a los polímeros basados en poli-óxido de alquileno, se pueden utilizar los materiales efectivamente no antigénicos, tales como dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, poli-alcoholes vinílicos, polímeros basados en carbohidratos , y similares. Los conjugados de interferón- polímero se descríben en las Patentes Números US 47661 06 , US 4917888, EPA 0 236 987, EPA 0 510 356 y WO 95/13090. Debido a que la modificación polimérica reduce suficientemente las respuestas antigénicas, el interferón anterior no necesita ser completamente autólogo. El interferón utilizado para preparar los conjugados de polímeros se puede preparar a partir de un extracto de mamífero, tal como un interferón humano, de rumiante, o bovino, o se puede producir de una manera recombinante. Otras formas de interferones incluyen interferón beta, gamma, tau, y omega, tales como Rebit (interferón beta 1 a) por Serono, Omniferón (¡nterferón natural) por Viragen , o interferón Omega por Boehringer Ingelheim . Los interferones orales, tales como el interferón alfa oral por Amarillo Biosciences. En otro aspecto, los ejemplos adicionales de los interferones incluyen el interferón alfa pegilado, por ejemplo el interferón a-2a pegilado, el interferón a-2b pegilado, el interferón en consenso pegilado, o el producto de interferón-a purificado pegilado. El ¡nterferón a-2a pegilado se describe en la Patente Europea Número 593,868 (incorporada a la presente como referencia en su totalidad) , y está comercialmente disponible, por ejemplo, bajo el nombre comercial PEGASYS® (Hoffmann-La Roche) . El interferón-a-2b pegilado se describe, por ejemplo, en la Patente Europea Número 975,369 (incorporada a la presente como referencia en su totalidad) , y está comercialmente disponible, por ejemplo, bajo el nombre comercial PEG-INTRON A® (Schering Plough). El interferón en consenso pegilado se describe en la Publicación Internacional N úmero WO 96/1 1 953 (incorporada a la presente como referencia en su totalidad) . (2) Antivirales. Los agentes antivirales pueden ser compuestos o productos biológicos que sean efectivos para inhibir la formación y/o la réplica de un virus en un mam ífero. Esto incluye a los agentes que interfieren con los mecanismos ya sea del huésped o virales necesarios para la formación y/o réplica de un virus en un mam ífero, tales como ribavirina ( 1 -beta-D-ribofuranosil-1 H-1 ,2,4-triazol-3-carboxamida) de Valeant Pharmaceuticals, I nc. , Costa Mesa, CA, Rebetol® de Schering-Plough Corporation , Kenilworth, NJ , y Copegus® de Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ, análogos de ribavirina en desarrollo, tales como Levovirina y Viramidina por Valeant, y Monofosfato de Mizoribina. (3) Inhibidores de proteasa. Los inhibidores de proteasa de serina NS3-4A de HCV, tales como los inhibidores de proteasa basados en sustrato (Attwood y colaboradores, Antiviral peptide derivatives, Patente Internacional Número PCT WO 98/22496, 1 998; Attwood y colaboradores, Antiviral Chemistry and Chemotherapy 1 999, 1 0, 259-273; Attwood y colaboradores, Preparation and use of amino acid derivatives as antiviral agents, Publicación de Patente Alemana Número DE 1 9914474; Tung y colaboradores, Inhibitors of serine proteases, particularly hepatitis C virus NS3 protease; Publicación Internacional Número PCT WO 98/17679), incluyendo alfa-cetoamidas e hidrazino-ureas, y los inhibidores que terminan en un electrófilo, tal como un ácido borónico o fosfonato (Llinas-Brunet y colaboradores, Hepatitis C inhibitor peptide analogues, Publicación Internacional Número PCT WO 99/07734) . Los inhibidores de proteasa dados a conocer en las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica para el tratamiento del virus de hepatitis C, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,004,933 a Spruce y colaboradores, que da a conocer una clase de inhibidores de proteasa de cisteína para inhibir la endopeptidasa 2 del virus de hepatitis C; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,990,276 a Zhang y colaboradores, que da a conocer inhibidores sintéticos de la proteasa NS3 del virus de hepatitis C; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 5,538,865 a Reyes y colaboradores; los péptidos como los inhibidores de proteasa de serina NS3 del virus de hepatitis C, que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/008251 A Corvas International Inc., y las Publicaciones I nternacionales N úmeros WO 02/081 87 y WO 02/008256 a Schering Corporation ; los tripéptidos inhibidores del virus de hepatitis C que se dan a conocer en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica N úmeros 6,534,523, 6,41 0,531 , y 6,420,380 a Boehringer I ngelheim , y en la Publicación Internacional Número WO 02/060926 a Bristol Myers Squibb (incorporadas a la presente como referencia en su totalidad); los péptidos de diarilo como inhibidores de proteasa de serina NS3 del virus de hepatitis C, que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/481172 a Schering Corporation; las imidazolidinonas como inhibidores de proteasa de serina NS3 del virus de hepatitis C, que se dan a conocer en la Publicación Internacional Número WO 02/18198 a Schering Corporation, y en la Publicación Internacional Número WO 02/481157 a Bristol Myers Squibb (incorporadas a la presente como referencia en su totalidad); la Publicación Internacional Número WO 98/17679 a Vértex Pharmaceuticals, y la Publicación Internacional Número WO 02/48116 a Bristol Myers Squibb también dan a conocer inhibidores de proteasa del virus de hepatitis C (incorporadas a la presente como referencia en su totalidad). (4) Inhibidores de proteasa NS3 no basados en sustrato, tales como los derivados de 2,4,6-trihidroxi-3-nitro-benzamida (Sudo K. y colaboradores, Biochemiscal and Biophysical Research Communications, 1997, 238 643-647; Sudo K. y colaboradores, Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 1998, 9, 186), incluyendo RD3-4082 y RD3-4078. (5) Una fenantrenquinona que posee actividad contra la proteasa en un ensayo SDS-PAGE y de auto-radiografía, aislada a partir del caldo de cultivo de fermentación de Streptomyces sp., Sch 68631 (Chu M. y colaboradores, Tetrahedron Letters, 1996, 37, 7229-7232), (Chu M. y colaboradores, Tetrahedron Letters 37:7229-7232, 1996); Sch 351633, aislado a partir del hongo Penicillium grieofulvum (Chu M. y colaboradores, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1949-1952); inhibidores selectivos diseñados basándose en la macromolécula eglina c, que se aisla de la sanguijuela, y es un potente inhibidor de varias proteasas de serina, tales como las proteasas A y B de S. griseus, V-quimiotripsina, quimasa, y subtilisina (Qasim M. A. y colaboradores, Biochemistry 36:1598-1607, 1997). (6) Tiazolidinas y benzanilidas identificadas en Kakiuchi N. y colaboradores, J. FEBS Letters 421, 217-220; Takeshita N. y colaboradores, Analytical Biochemistry, 1997, 247, 242-246. Los derivados de tiazolidina que muestran una inhibición relevante en un ensayo de HPLC en fase inversa con una proteína de fusión NS3/4A y un sustrato NS5A/5B (Sudo K. y colaboradores, Antiviral Research, 1996, 32, 9-18), en especial el compuesto RD-16250 que posee una fracción de cinamoílo fusionada sustituida con una cadena de alquilo larga, RD46205 y RD46193. (7) Inhibidores de proteasa de serina NS3-4A de HCV, incluyendo BILN 2061 por Boehringer Ingelheim, VX-950 por Vértex, SCH-503034 y SCH-351633, por Schering-Plough, y otros inhibidores de proteasa del virus de hepatitis C en desarrollo preclíníco y clínico por GlaxoSmithKIine, Bristol Myers Squibb, Abbot, Roche, Merck, Pfizer, y Gilead. (8) Análogos de nucleósidos. Telbivudina por Idenix (Patentes Números US 6444652, US6596700, y WO01 96353) . Inhibidores de nucleósidos o no de nucleósidos de la polimerasa de ARN dependiente del ARN de NS5B de HCV, tales como la ribofuranosil-citidina de éster de 2'-C-metil-3'-O-L-valina (N M283, Idenix), como se da a conocer en la Publicación Internacional Número WO 2004/002422. Los nucleósidos ramificados dados a conocer por Idenix Pharmaceuticals, para utilizarse en el tratamiento de flavivirus (incluyendo HCV) y pestivirus, en las Publicaciones Internacionales N úmeros WO 01 /901 21 y WO 01 /92282 (incorporadas a la presente como referencia en su totalidad) . Específicamente, un método para el tratamiento de infección por hepatitis C (y flavivirus y pestivirus) en seres humanos y en otros animales huésped, se da a conocer en las publicaciones de Idenix, que incluye la administración de una cantidad efectiva de un nucleósido B-D ó B-L con ramificación 1 ', 2', 3', ó 4' , o una sal farmacéuticamente aceptable o pro-fármaco del mismo, administrado ya sea solo o bien en combinación con otro agente antiviral, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los análogos de nucleósidos de otras solicitudes de patente que dan a conocer el uso del tratamiento del virus de hepatitis C incluyen: PCTCA00/01 31 6 (WO 01 /321 53; presentada el 3 de noviembre de 2000) , y PCT/CA01 /001 97 (WO 01 /6031 5; presentada el 19 de febrero de 2001 ) , presentadas por BioChem Pharma, Inc. , (ahora Shire Biochem, I nc.) ; PCT/US02/01 531 (WO 02/057425; presentada el 1 8 de enero de 2002) y PCT/US02/03086 (WO 02/057287; presentada el 18 de enero de 2002) presentadas por Merck & Co. , Inc. , PCT/EP01 /09633 (WO 02/1 8404; publicada el 21 de agosto de 2001 ) , presentada por Roche, y Publicaciones del TCP N úmeros WO 01 /79246 (presentada el 13 de abril de 2001 ) , WO 02/32920 (presentada el 1 8 de octubre de 2001 ) , y WO 02/48165 por Pharmasset, Ltd. (cuyas divulgaciones se incorporan a la presente como referencia en su totalidad) . Los 2'-fluoro-nucleósidos dados a conocer en la Publicación del TCP Número WO 99/43691 a Emory University (incorporada a la presente como referencia en su totalidad) , titulada como "2'-Fluoronucleosides". Los nucleósidos 2'-modificados dados a conocer por Eldrup y colaboradores (Oral Session V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16a Conferencia Internacional Sobre Investigación Antiviral (27 de abril de 2003, Savannah , GA)) . Análogos de nucleósidos y nucleósidos 2'-modificados dados a conocer en Bhat y colaboradores (Sesión Oral V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae, 2003 (Sesión Oral V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16a Conferencia Internacional Sobre Investigación Antiviral (27 de abril de 2003, Savannah, Ga); p A75) . Los nucleósidos 2'-modificados dados a conocer en Olsen y colaboradores (Sesión Oral V, Hepatitis C Virus, Flaviviridae; 16a Conferencia Internacional Sobre Investigación Antiviral (27 de abril de 2003, Savannah, Ga)p A76) . Los compuestos preclínicos incluyen R803 (Rigel) , JTK-003 (Japan Tabacco), HCV-086 (ViroPharma/Wyeth), R-1479 (Roche). (9) Los inhibidores de polimerasa de nucleótido y gliotoxina (Ferrari R. y colaboradores, Journal of Virology, 1999, 73, 1649-1654), y el producto natural de cerulenina (Lohmann V. y colaboradores, Virology, 1998, 249, 108-118). (10) Los inhibidores de helicasa de NS3 de HCV, tales como VP_50406 por ViroPharma, y los compuestos de Vértex, otros inhibidores de helicasa dados a conocer en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,633,388 y en la Publicación Internacional Número PCT WO 97/36554. (11) Moléculas anti-sentido dirigidas contra el genoma del virus de hepatitis C o cualquier componente celular que se requiera para la réplica viral. Los oligodesoxinucleótidos de fosforotioato (S-ODN) complementarios los estiramientos de secuencia en la región no codificante 5' (NCR) del virus (Alt M. y colaboradores, Hepatology, 1995; 22, 707-717), o los nucleótidos 326-348 que comprenden el extremo 3' de la NCR y los nucleótidos 371-388 localizados en la región codificante del núcleo del ARN del virus de hepatitis C (Alt M. y colaboradores, Archives of Virology, 1997, 142, 589-599; Galderisi U. y colaboradores, Journal of Cellular Physiology, 199, 181, 251- 257); tales como ISIS 14803 por Isis Pharm/Elan, los oligonucleótidos anti-sentido por Hybridon, AVI bioPharma y Chugai, AVI-4065 (AVI BioPharma), o una secuencia anti-sentido complementaria para cualquier parte del genoma del virus de hepatitis C que aumente la efectividad de la terapia. (12) Los inhibidores de la traducción dependiente de IRES (Ikeda N, y colaboradores, Agent for the prevention and treatment of hepatitis C, Publicación de Patente Japonesa Número JP-08268890; Kai Y. y colaboradores, Prevention and treatment of viral diseases, Publicación de Patente Japonesa Número JP-10101591); tales como ISIS 14803 por Isis Pharm/Elan, inhibidores IRES por PTC Therapeutics, Anadys, Immusol, RiboTargets, y SomaGenics. (13) Ribozimas, tales como ribozimas resistentes a la nucleasa (Maccjak, D. J. y colaboradores, Hepatology 1999, 30, abstract 995), y aquéllas mencionadas en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,043,077 a Barber y colaboradores, y en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,869,253 y 5,610,054 a Draper y colaboradores (incorporadas a la presente como referencia en su totalidad), por ejemplo HEPTAZIME por RPI, y Sima Therapeutics, Inc.. (14) Un inhibidor de otros objetivos en el ciclo de vida del virus de hepatitis C, incluyendo la entrada, ensamble, y maduración viral, tal como Celgosivir (MBl 3253), un inhibidor del procesamiento de la glicoproteína por Migenix, un inhibidor de fusión por Trimeris, ACH-0137171 por Achillion. (15) Agentes inmuno-moduladores. Los agonistas del receptor, tal como el receptor tipo toll ("TLR") incluyen ANA245, ANA971, ANA975 (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5041426 y 4880784) por Anadys; CpG-1 0101 , un agonista de TLR-9 (Coley Pharmaceuticals) ; un inhibidor de I MPDH , ácido micofenólico, una sal o un pro-fármaco del mismo, micofenolato de sodio, o micofenolato-mofetil , o Merimebodib (VX-497, por Vértex) ; timosina alfa-1 (Zadaxina o su combinación, por SciClone) ; SCV-07 (SciClone) , Belerofón (I FN-a mejorado por Nautilus) ; CIVACI R (inmunoglobulina de hepatitis C) por NABI , o u n agonista del receptor S 1 P, por ejemplo FTY720 o un análogo del mismo opcionalmente fosforilado, por ejemplo como se da a conocer en las Patentes Números EP627406A1 , EP778263A1 , EP1002792A1 , WO02/1 8395, WO02/76995, WO 02/06268, JP200231 6985, WO03/291 84, WO03/29205 , WO03/62252 y WO03/62248, cuyas divulgaciones se incorporan a la presente como referencia en su totalidad; Resiquimod [VML 600] por 3M Pharmaceuticals, un análogo de imiquimod que es un potente inductor del interferón-a y otras citoquinas. ( 16) Un agente anti-fibrótico, tal como un derivado de N-fenil-2-pirimidin-2-amina, imatinib (Gleevac), I P-501 por Indevus, e interferón-gamma 1 b de I nterMune, Pirfenidona (Múltiple: agonista de TGF-beta, antagonista de FGF, antagonista de PDGF) por Intermune Marnac, Shionogi . (17) Vacunas terapéuticas por ¡ntercell (vacuna peptídica terapéutica IC41 HCV) , Epimmune/Genecor, Merix, Tripep (Chiron-VacC) , inmunoterapia (Therapore) por Avant, terapia de células-T por CellExSys, anticuerpo monoclonal XTL-002 por STL, ANA 246 y ANA 246 por Anadys, una vacuna terapéutica dirigida a E2 por Innogenetics, anticuerpo monoclonal contra la proteína de envoltura E2 por XTL Bio, G I-5005 (Globel mmune Ine) , I nnoVac-C (Publicación Internacional Número WO 9967285, Innogenetics) , IC-41 (Intercell) , interferón alfa-n3 (Interferon Sciences) , Engerix B (SmithKIine Beecham) . (1 8) Otros compuestos incluyen Ursodiol (Patente Europea Número EP00269516, Axcan Pharma) , HE-2000 (un análogo de DHEA, Colthurst Ltd) , EHC-1 8 (un inmunomodulador, Enzo biochem), diclorhidrato de histamina (un agonista de H2, Publicación Internacional Número WO09104037, Estero-Anstalt) , 1 -amino-alquil-ciclohexanos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 6,034, 1 34) , l ípidos de alquilo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,922,757) , vitamina E y otros antioxidantes (Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Número 5,922,757) , ácidos biliares (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,846,99964) , ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,830,905) , bencen-dicarboxamidas (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 5,633,388) , derivados de poli-ácido adenílico (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,496,546) , 2' ,3'-didesoxi-inosina (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,026,687) , bencimidazoles (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,891 ,874) , extractos de plantas (Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Número 5,837,257, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,725,859, y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,056,961 ) , y piperidinas (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,830,905) ; ácido N-(fosfonoacetil)-L-aspártico, bencen-dicarboxamidas, derivados de poli-ácido aden ílico, inhibidores de glicosilación, y agentes citoprotectores no específicos que bloqueen la lesión celular causada por la infección del virus. ( 1 9) Cualquier otro compuesto actualmente en desarrollo preclínico o clínico para el tratamiento del virus de hepatitis C, incluyendo lnterleucina-1 0 (Schering-Plough) , AMANTADI N EA (Symmetrel) por Endo Labs Solvay, inhibidor de caspasa IDN-6556 por Idun Pharma, HCV/MF59 por Chiron, CEPLEN E (dicloruro de histamina) por Maxim, I DN-6556 por Idun PHARM , T67, un inhibidor de beta-tubulina por Tularik, FK788 por Fujisawa Healthcare, ldB101 6 (Siliphos, fitosoma de silibin-fosfatidil-colina) , Dication por Immtech, hemopurificador por Aethlon Medical, UT 231 B por United Therapeutics; HepeX-C SM 1 , PPVO-Bay55-8800 (Parapoxvirus ovis) por Bayer; Refanalin (mimético de HGF) por Angion, R803 ( Rigel) , JTK-003, JTK-002, y JTK-1 09 (todos de Japan Tobacco) , HCV-086 (ViroPharma/Wyeth), ISIS-1 4803 (ISIS Pharmaceuticals), GS-9132 (un inhibidor de polimerasa por Achillion Pharmaceuticals) , HCV-793 (Pharmasset and Roche), R 1626 (Roche) . Los compuestos o fármacos en desarrollo preclínico pueden ser fácilmente identificados por un experto en la materia, mediante la búsqueda de información de estudios clínicos en la Internet, por ejemplo, y la información de edición de prensa de las compañías respectivas. (20) Los compuestos que aumentan la efectividad de la terapia de combinación , incluyendo un antifolato, una 5-fluoro-pirimidina (incluyendo 5-fluoro-uracilo) , un análogo de citidina, tal como ß-L-1 ,3-dioxolanil-citidina o ß-L- 1 ,3-dioxolanil-5-fluoro-citidina, antimetabolitos, incluyendo anti-metabolitos de purina, citarabina, fludarabina, floxuridina, 6-mercapto-purina, metotre?ato, y 6-tioguanina) , hidroxi-urea, inhibidores mitóticos (incluyendo CPT-1 1 , Etoposida (VP-21 ), taxol, y alcaloides vinca, tales como vincristina y vinblastina, un agente alquilante (incluyendo, pero no limitándose a, busulfano, clorambucil , ciclofosfamida, ifofamida, mecloretamina, melfalano, y tiotepa) , agentes alquilantes no clásicos , compuestos que contienen platino, bleomici na, un antibiótico anti-tumoral , una antraciclina, tal como doxorrubicina y danomicina, una antracenodiona, inhibidores de topoisomerasa I I , agentes hormonales (incluyendo, pero no limitándose a, corticosteroides (dexametasona, prednisona, y metil-prednisona), andrógenos, tales como fluoximesterona y metil-testosterona, estrógenos tales como dietil-etilbesterol , antiestrógenos, tales como tamoxifeno, análogos de LHRH tales como leuprolida, antiandrógenos tales como flutamida, amino-glutetimida, acetato de megestrol , y medroxiprogesterona; asparaginasa, carmustina, lomustina, hematil-melanina, dacarbazina, mitotano, estreptozocina, cisplatina, carboplatina, levamasol, y leucovorína. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar en combinación con agentes de terapia enzimática y moduladores del sistema inmune, tales como interleucina, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de colonias de macrófagos, y factor estimulante de colonias. La utilidad de un compuesto de enlace de ciclofilina o un agente terapéutico, tal como sanglifehrina, en el tratamiento de enfermedades y condiciones como se especifican anteriormente en la presente, se puede demostrar en pruebas convencionales in vitro o clínicas, por ejemplo de acuerdo con los métodos descritos posteriormente en la presente. A. In Vitro Se examinan los efectos de diferentes sanglifehrinas de la invención sobre la réplica del genoma del virus de hepatitis C, utilizando las células de replicón del virus de hepatitis C. La línea celular de replicón de HCV, clon A, tiene licencia de Apath LCC. Las células se cultivan en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco), conteniendo suero bovino fetal inactivado por calor al 10 por ciento (FBS, Gibco), L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1x (Gibco), y 1 miligramo/mililitro de G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Con el objeto de determinar el efecto antiviral de los compuestos, las células de replicón de HCV (clon A) se tratan con los compuestos diluidos en serie en DMEM complementado con suero bovino fetal al 2 por ciento y sulfóxido de dimetilo al 0.5 por ciento durante 48 horas, luego se extrae el ARN intracelular total, y se determina el nivel de ARN de HCV mediante una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (Taqman) utilizando cebadores específicos del virus de hepatitis C ((5'-TCT TCA CGC AGA AAG CGT CTA-3' y 5'-CTG GCA ATT CCG GTG TAC T-3) SEQ ID NO: 1, y sonda (5'-6-FAM-TCC TGG AGG CTG CAC GAC ACT CAT A-TAMRA-3') SEQ ID NO:2. Para cada tratamiento, la cantidad de ARN de HCV se normaliza contra la cantidad de ARN total extraído, que se determina en un ensayo Quant-IT (Molecular Probé). Cada punto de datos obtenido representa el promedio de seis réplicas en el cultivo celular. La IC50 es la concentración del compuesto en la cual se reduce el nivel de ARN de HCV en las células de replicón por el 50 por ciento. Para monitorear el efecto citotóxico de los compuestos, se determina la viabilidad de las células de replicón en seguida de 48 horas de tratamiento con el compuesto, utilizando un ensayo basado en un compuesto de tetrazolio (MTS) (CelITiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, Wl). La IC50 es la concentración del compuesto en la cual se reduce la viabilidad celular por el 50 por ciento. B. Estudio Clínico. Se inscriben un total de 15 a 30 pacientes con infección viral por hepatitis C en un estudio de 2 a 12 semanas. Cada paciente recibe una dosis terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina. Los niveles en suero de la carga de ARN viral se monitorean durante el transcurso del tratamiento, y en un período de seguimiento de dos semanas, típicamente para todos los pacientes. La duración del tratamiento y las dosificaciones requeridas para lograr respuestas virológicas sostenidas en los pacientes de hepatitis C se van a determinar en estudios clínicos adicionales que involucren un mayor número de pacientes y un tiempo de tratamiento más largo de hasta 1 2 meses, con un seguimiento de seis meses. Las dosificaciones diarias requeridas en la práctica del método de la presente invención variarán dependiendo, por ejemplo, del compuesto de enlace de ciclofilina empleado, del huésped, del modo de administración, y de la severidad de la condición que se vaya a tratar. La sanglifeh rina se puede administrar como el único ingrediente, o junto con otros fármacos, por ejemplo un fármaco que tenga actividad anti-HCV, por ejemplo un interferón-alfa, un interferón-alfa pegilado, ribavirina, un inhibidor de polimerasa de HCV, tal como N M283, o un inhibidor de proteasa de HCV, tal como SCH503034 y VX-950. Las dosificaciones diarias con respecto a los co-agentes utilizados variarán dependiendo, por ejemplo, de los efectos sinérgicos con el compuesto empleado, del huésped, del modo de administración , y de la severidad de la condición que se vaya a tratar.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para prevenir o tratar hepatitis C y enfermedades relacionadas, tales como fibrosis hepática, cirrosis hepática, y carcinoma hepatocelular, en un sujeto que lo necesite , el cual comprende administrar a este sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como un macrólido. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el macrólido es una sanglifehrina de la Fórmula Vi l : S-L-M en donde S representa un alquilo (de 1 a 1 0 átomos de carbono) de cadena ramificada o recta; L representa un enlazador que comprende una secuencia lineal de 6 a 1 1 átomos de carbono; y M representa un anillo macrocíclico, en donde las posiciones 2 a 6 de este anillo macrocíclico están provistas por un residuo de ácido piperidazinil-carboxílico sustituido o insustituido de la Fórmula I ; en donde las posiciones 7 a 9 del anillo macrocíclico son provistas por un residuo de alfa-aminoácido aromático, en donde la fracción de carboxilo del residuo de alfa-aminoácido aromático ocupa la posición 7 del anillo macrocíclico mencionado, y la fracción de alfa-amino del residuo de alfa-aminoácido aromático ocupa la posición 9 de este anillo macrocíclico; las posiciones 10 a 12 del anillo macrocíclico son provistas por un residuo de alfa-aminoácido alifático, en donde la fracción de carboxilo del residuo de alfa-aminoácido alifático ocupa la posición 10 de este anillo macrocíclico, y la fracción de alfa-amino del residuo de alfa-aminoácido alifático ocupa la posición 1 2 del anillo macrocíclico; comprendiendo el resto del anillo macrocíclico un residuo de ácido hidroxi-carboxílico que tiene una longitud de cadena de 6 a 20 átomos de carbono, cuya fracción de oxilo completa un enlace de lactona macrocíclico, y cuya fracción de carbonilo forma un enlace de amida con el grupo alfa-amino en la posición 1 2 del anillo macrocíclico, en forma libre o protegida, o una sal del mismo. 3. Un método para inhibir la réplica del virus de hepatitis C en un medio, el cual comprende aplicar a este medio una cantidad efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina. 4. Un método para inhibir la réplica del virus de hepatitis C en un paciente que lo necesite, el cual comprende administrar a este sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina. 5. Un método para prevenir la recurrencia de infección por el virus de hepatitis C en un receptor de trasplante que lo necesite, el cual comprende administrar a este receptor una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina. 6. El uso de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, en la prevención o el tratamiento de hepatitis C y enfermedades relacionadas, tales como fibrosis hepática, cirrosis hepática, y carcinoma hepatocelular. 7. El uso de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, en la preparación de una composición farmacéutica para utilizarse en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 8. Una composición farmacéutica para utilizarse en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la cual comprende un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, junto con uno o más diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables para el mismo. 9. Una combinación farmacéutica, la cual comprende: a) un primer agente que es un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, b) un co-agente que tiene propiedades anti-HCV. 1 0. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el cual comprende la co-administración de una manera concomitante o en secuencia, de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de enlace de ciclofilina, tal como una sanglifehrina, y un co-agente que tiene propiedades anti-HCV. 1 1 . Un método, uso, composición, o combinación , de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el compuesto de enlace de ciclofilina es un compuesto de la Fórmula: en donde X es H, metoxilo, etoxilo, OnPr, OiPr; R14 y R15 son independientemente H, metilo, alquilo, alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), (C1-C )-CO-CH3, ó R14 y R15 se fusionan para formar un cicloalquilo de 5 a 7 miembros sustituido o insustituido; seleccionado de la Fórmula: R16 es H, o Me, o alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono); R.7 es H, OH, -O-alquilo (de 1 a 4 átomos de carbono), o R14, R15, y R17 se fusionan para formar un cicloalquilo de la Fórmula: R23 es H, alquilo (de 1 a 10átomos de carbono) de cadena ramificada o recta, y/o contiene uno o más enlaces insaturados, en particular dobles o triples enlaces acumulativos a lo largo de su longitud. 12. Un método, uso, composición, o combinación de acuerdo con la reivindicación 11, en donde R23 se selecciona a partir del grupo que consiste en -CH=CH2,-CH2-OH, -CH2-OCH3, -CHO, -COOH, o de la Fórmula XIX': 13. Un método, uso, composición, o combinación, sustancialmente como se define y se describe anteriormente en la presente.