MX2007015930A

MX2007015930A - Identificacion de un receptor de sabor amargo novedoso t2r76 que especificamente responde a los ligandos amargos brucina y prop.

Info

Publication number: MX2007015930A
Application number: MX2007015930A
Authority: MX
Inventors: Xiaodong Li; Hong Xu
Original assignee: Senomyx Inc
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2006-07-17
Publication date: 2008-03-06
Also published as: IL187827A0; EP1904527A4; CA2610237A1; WO2007011859A2; US20060019346A1; WO2007011859A3; NO20076201L; EP1904527A2; CN101595118A; AU2006270110A1; JP2009514507A

Abstract

Acidos nucleicos aislados que codifican polipeptidos T2R76, polipeptidos T2R76 expresados recombinantes, sistemas de expresion heterologos para la expresion recombinante de polipeptidos T2R76, metodos de ensayo empleando los mismos, y metodos para alterar la percepcion de sabor por la via de la administracion de un modulador T2R76. Estos polipeptidos T2R76 se pueden expresar solos o co-expresados con otro polipeptido T2R, preferiblemente un polipeptidos T2R humano diferente. Estos polipeptidos T2R76 responden especificamente a los ligandos amargos que incluyen brucina y propiltiouracilo (PROP) y por lo tanto se pueden utilizar en ensayos que identifican compuestos que modulan, preferiblemente bloquean el sabor amargo.

Description

IDENTIFICACIÓN DE UN RECEPTOR DE SABOR AMARGO NOVEDOSO T2R76 QUE ESPECÍFICAMENTE RESPONDE A LOS LIGANDOS AMARGOS BRUCINA Y PROP Campo de la Invención La presente invención se relaciona generalmente a polipéptidos T2R76 que constituyen un receptor de sabor amargo humano novedoso en la familia T2R y la percepción de sabor amargo mediada por los mismos. Más particularmente, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican polipéptidos T2R76, polipéptidos T2R76 aislados y funcionales que funcionan como receptores de sabor amargo, un sistema de expresión heterólogo para la expresión recombinante de los polipéptidos T2R76, métodos para identificar los moduladores de percepción de sabor mediado por T2R76, especialmente compuestos que son de sabor amargo o que bloquean el sabor amargo y usos de los mismos. Aún más particularmente la presente invención involucra el descubrimiento de que los polipéptidos T2R76 responden específicamente a los ligandos amargos que incluyen brucina y propiltiouracilo (PROP). Descripción de la Técnica Relacionada Una de las modalidades de sabor básicas que los humanos pueden reconocer es el sabor amargo. Los compuestos amargos se creen que producen sabor amargo al interactuar con receptores de superficie celular. La activación de los receptores inicia las cascadas de señalización intracelulares que culminan en la liberación del neurotransmisor. Las fibras del nervio aferente de los ganglios del nervio craneal luego transmiten las señales a los centros de sabor corticales, donde la información se procesa como percepción de sabor. Estos receptores pertenecen a la familia de receptores de dominio de siete transmembranas que interactúan con las proteínas G intracelulares, también llamados receptores acoplados a proteina G (GPCRs) . Ver Lindemann (2001) Nature 413(6852) : 219-25. Una familia novedosa de GPCRs, llamados T2Rs, ha sido identificada en humanos o roedores (Adler y colaboradores, 2000; Chandrashekar y colaboradores, 2000; Matsunami, 2000; Nos. de publicación internacional de PCT WO 01/18050 y WO 01/77676) . Varias lineas de evidencias sugirieron que los T2Rs pueden mediar la percepción de los compuestos amargos. Primero, los genes de T2R se expresan específicamente en el subconjunto de células receptoras de sabor de la lengua y los epitelios del paladar. Segundo, los T2Rs se enlazan genéticamente a los sitios asociados con la percepción amarga en ratones y humanos (Conneally y colaboradores, 1976; Capeless y colaboradores, 1992; Reed y colaboradores, 1999; Adler y colaboradores, 2000) . Tercero en los estudios in vitro han mostrado que los T2Rs pueden activar la gustducina, una proteina G específicamente expresada en las células de sabor y enlazada a la transducción de los estímulos amargos (Wong y colaboradores, 1996) y que la activación de la gustducina mediante los T2Rs ocurre selectivamente en respuesta a la aplicación de compuestos amargos (Chandrashekar y colaboradores, 2000) . Basado en estos datos, las familias de receptor mT2R y hT2R se proponen mediar la respuesta de sabor amargo en ratones y humanos respectivamente. Los sabores amargos son frecuentemente indeseables en alimentos, bebidas, lavados orales, dentífricos, cosméticos y sustancias farmacéuticas. Un sabor amargo se puede enmascarar mediante la adición de compuestos dulces, tales como azúcar; sin embargo, la adición de un edulcorante puede alterar indeseablemente un sabor alimenticio e incrementar la captación de colorias. En el caso de las sustancias farmacéuticas, se han desarrollado métodos de elaboración y formulación costosa (por ejemplo recubrimientos y cápsulas) para reducir el sabor amargo en la captación oral. No han sido descritos métodos para bloquear directamente el sabor amargo por la via de la inhibición de los receptores de sabor. Recientemente, varios T2Rs humanos han sido identificados como receptores para ciertos ligandos amargos (Chandrashekar y colaboradores, (Id.) 2000; Bufe y colaboradores, (Id.) 2002; Kim y colaboradores, Science 299, 2003; Pronin y colaboradores, Chemical Senses 29, 2004; Behrens y colaboradores, BBRC 319, 2004; Kuhn y colaboradores, J. Neuroscience 24, 2004; Bufe y colaboradores, Current Biology 15, 2005. También ha sido sugerido que cada hT2R es capaz de usar múltiples ligandos. Esta hipótesis se basa sobre el hecho de que los humanos pueden reconocer muchos cientos de compuestos estructuralmente diversos como amargos. Las secuencias de los hT2Rs se divulgan en las solicitudes de PCT publicadas por Zuker y colaboradores, el documento WO 01/18050 A2 (2001) y Adler y colaboradores, WO 01/77676 A2 (2001), ambos de los cuales se incorporan por referencia en sus totalidades en la presente asi como la as solicitudes de patente anteriores que se relacionan a hT2R76 identificadas supra. Una de las dificultades en el estudio de la función de T2R es que estos receptores no se expresan fácilmente en lineas celulares de mamíferos cultivadas. Para mejorar la expresión de T2R una secuencia N-terminal de los GPCRs bien expresada tal como rodopsina se puede unir a una secuencia T2R particular (ver Chandrashekar y colaboradores, (Id.) 2000) . Esta marca N-terminal también permite la facilidad de monitoreo de la expresión de proteina debido a un anticuerpo libre. Mientras que la incorporación de la marca de rodopsina mejora la expresión de algunos T2Rs en las lineas celulares de mamífero, algunas de ellas todavia se expresan suficientemente para estudios funcionales. En un procedimiento diferente el mT2R5 se expresó exitosamente en células de insecto Sf9 y se utilizó para estudios funcionales utilizando el ensayo de enlace de GTP bioquímico (Chandrashekar y colaboradores, (Id.) 2000). En la solicitud de patente anterior por el presente Cesionario Senomyx Inc., No. de Serie de los Estados Unidos 10/191,058 incorporada por referencia en su totalidad en la presente, los solicitantes descubrieron que los ligandos amargos enlazan específicamente a tres T2Rs humanos diferentes. Adicionalmente los solicitantes presentarán recientemente una solicitud de patente provisional 60/00000 que divulga ligandos amargos que enlazan específicamente a siete otros T2Rs humanos. Asi, existe una necesidad en la técnica para identificar y caracterizar funcionalmente receptores de sabor amargo como objetivos para el desarrollo de inhibidores de la percepción de sabor amargo. Para cumplir esta necesidad, la presente invención proporciona ácidos nucleicos T2R76 y polipéptidos novedosos. La presente invención también proporciona métodos para identificar y utilizar moduladores de T2R76 para alterar la percepción de sabor, particularmente la percepción de sabor amargo mediada por los ligandos amargos tales como brucina, PROP y otros compuestos, por ejemplo, compuestos estructuralmente relacionados que modulan el sabor mediado con T2R76. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona ácidos nucleicos T2R76 aislados y polipéptidos T2R76 codificados por los mismos y el descubrimiento relacionado que los polipéptidos T2R76 responden específicamente al PROP (propiltiouracilo) y brucina. Los polipéptidos y ácido nucleicos son útiles en métodos y ensayos de detección divulgados en la presente, preferiblemente los ensayos basados en células de alto rendimiento para identificar compuestos que bloquean o inhiben el sabor amargo mediado con T2R76, por ejemplo, inducido por la brucina, PROP u otros ligandos amargos. De acuerdo a la invención, un ácido nucleico T2R76 puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID N0:1; o (c) una molécula de ácido nucleico aislada "sustancialmente similar" (definida infra) a SEQ ID NO:l. Un ácido nucleico TR76 también puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID NO:l; (c) una molécula de ácido nucleico que hibridiza una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:l bajo condiciones de severidad de lavado representado por una solución de lavado que tiene menor que aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una temperatura de lavado de mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; o (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislada de uno de (a) , (b) , y (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el acido nucleico aislado de uno de (a) , (b) , e (c) anteriores que codifica un polipéptido que retiene el ligando y/o las propiedades funcionales del polipéptido T2R76 nativo contenido en SEQ NO: 2, es decir, específicamente responde a brucina y/o PROP. Preferiblemente, el ácido nucleico T2R76 aislado comprende: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; o (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID NO: 1. Un polipeptido T2R76 aislado puede comprender: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido "sustanclalmente idéntico" (definido infra) a SEQ ID NO: 2; (c) un polipeptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; o (d) un polipeptido codificado por una molécula de polipéptido sustanclalmente idéntica a SEQ ID NO: 1. Un polipéptido T2R76 también puede comprender un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID NO: 1; (c) una molécula de ácido nucleico aislada que hibrida a un ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de severidad altas, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislada de uno de (a) , (b) , o (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de (a), (b) , o (c) anteriores. Preferiblemente, un polipéptido T2R76 comprende SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que posee por lo menos 90% de identidad de secuencia con el mismo más preferiblemente por lo menos 95-99% de identidad de secuencia con el mismo. La presente invención proporciona adicionalmente métodos para detectar un ácido nucleico T2R76, el método que comprende: (a) procurar una muestra biológica que tiene material de ácido nucleico; (b) hibridar una molécula de ácido nucleico T2R76 aislado bajo condiciones de hibridación severas a la muestra biológica de (a) , de esta manera formar una estructura doble entre el ácido nucleico T2R76 aislado y un ácido nucleico dentro de la muestra biológica; y (c) detectar la estructura doble de (b) , mediante la cual una molécula de ácido nucleico T2R76 es detectada. La presente invención proporciona adicionalmente anticuerpos que reconocen específicamente un polipéptido T2R76, y métodos para producir el mismo. Una modalidad representativa del método comprende: (a) producir recombinante o sintéticamente un polipéptido T2R76; (b) formular el polipéptido de (a) mediante el cual es un inmunógeno efectivo; (c) administrar a un animal la formulación de (b) para generar una respuesta inmune en el animal que comprende la producción de anticuerpos; en donde los anticuerpos están presentes en el suero sanguíneo del animal; y (d) recolectar el suero sanguíneo del animal de (c) que comprende anticuerpos que reconocen específicamente un polipéptido T2R76. El método divulgado puede comprender adicionalmente preparar un anticuerpo monoclonal. También se proporcionan métodos para detectar un nivel de un polipéptido T2R76. En una modalidad representativa, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica que tiene material peptidico; (b) detectar un polipéptido T2R76 en la muestra biológica (a) mediante la reacción inmunoquimica con el anticuerpo de la presente invención, mediante el cual se determina una cantidad de polipéptido T2R76 en una muestra. También se proporcionan sistemas para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76. Un sistema de expresión recombinante puede comprender: (a) un polipéptido T2R76 de la invención (por ejemplo, una modalidad representativa expuesta como SEQ ID NO: 2); y (b) una célula hospedera heteróloga que expresa el polipéptido T2R76. Preferiblemente, la célula hospedera comprenderá una célula hospedera de mamífero tal como las células HEK-293, HEK-293T, COS, CHO, BHK o MDCK. Más Mucho más preferiblemente, las células hospederas son células HEK-293 que expresan una proteina G que acopla funcionalmente T2R76, por ejemplo, una proteina G promiscua tal como Galfa 15 o Galfa 16, gustducina, transducina, o una quimera de las mismas. Adicionalmente, el sistema de expresión recombinante puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos T2R diferentes que T2R76. En particular, el sistema de expresión recombinante puede incluir cualquiera de las secuencias de ácido nucleico T2R divulgadas en la patente norteamericana No. 6,558,910 expedida el 6 de Mayo del 2003 de Zuker y colaboradores, solicitud publicada de los estados unidos US 20020094551, por Adler, John Elliot publicada el 18 de Julio del 2002, y solicitud publicada de los Estados Unidos 20030022278 por Zuker y colaboradores, publicada el 30 de Enero del 2003, todas de las cuales se incorporan por referencia en su totalidad. Se debe notar que otro nombre para los polipéptidos T2R es polipéptidos SF o GR, como se divulga en las solicitudes de Zuker incorporadas por referencia en la presente. El hT2R76 sujeto se puede expresar con uno o más de otros polipéptidos T2R para producir un receptor de sabor heteroménico funcional. Los otros polipéptidos T2R puede ser otro T2R o T2R de otras especies, por ejemplo, rata o ratón. Una célula hospedera puede comprender cualquier célula adecuada. Una célula hospedera preferida comprende una molécula de mamífero, más preferiblemente una célula de humano. Como se nota, preferiblemente la célula hospedera además comprende una subunidad alfa de proteina G capaz de acoplarse a un polipéptido T2R76, por ejemplo, una proteina G promiscua tal como Gal5, gustducina o transducina. Utilizando el sistema divulgado para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76 la presente invención además proporciona un método para identificar moduladores de un polipéptido T2R76. En una modalidad preferida de la invención, el método comprende: (a) proporcionar un sistema de expresión recombinante mediante el cual un polipéptido T2R76 se expresa en una célula hospedera heteróloga; (b) proporcionar una sustancia de prueba al sistema de (a); (c) analizar un nivel o calidad de la función de T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba y opcionalmente en la presencia de un ligando conocido para activar específicamente T2R76, por ejemplo, PROP o brucina; (d) comparar el nivel de calidad de la función de T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba y opcionalmente de manera adicional un ligando T2R76 conocido con un nivel de control o calidad de la función de T2R76; e (e) identificar una sustancia de prueba como un modulador T2R76 al determinar un nivel o calidad de la función de T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba, y opcionalmente otro ligando especifico T2R76 conocido, ya que se cambia significantemente cuando se compara a un nivel de control o calidad de la función T2R76. El ensayo puede comprender determinar una cantidad de enlace GTP?S en la presencia de la sustancia de prueba comparada al enlace en la ausencia de esta sustancia de prueba. Preferiblemente, los moduladores T2R76 se identifican en los ensayo basados en células que monitorea cambios del calcio intracelular en la presencia o ausencia de un compuesto de prueba, y opcionalmente un ligando T2R76 conocido tal como PROP o brucina. En otra modalidad de la invención, un método para identificar un modulador de un polipéptido T2R76 comprende: (a) expresar un polipéptido T2R76 y expresar el polipéptido o combinaciones de polipéptido solas o en combinación con uno o más de otros polipéptidos T2R a una o más sustancias de prueba y opcionalmente además un ligando T2R76 conocido tal como PROP o brucina; (b) analizar el enlace de una sustancia de prueba al polipéptido T2R76 aislado o combinación de polipéptido que contiene T2R76 o su efecto sobre el enlace de ligando T2R76 conocido; y (c) seleccionar una sustancia candidato que demuestra el enlace especifico al polipéptido T2R76 o que modula, preferiblemente inhibe, el enlace especifico del ligando T2R76 conocido, por ejemplo, PROP o brucina . También se proporcionan moduladores, que incluyen agonistas e inhibidores de un polipéptido T2R76, que se identifican por los métodos divulgados. Un modulador puede comprender una proteina, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico, una molécula pequeña, o combinaciones de los mismos que modula T2R76, por ejemplo, inhibe o bloque la activación especifica y/o enlace de un ligando amargo con un polipéptido T2R76, por ejemplo, brucina o PROP o un compuesto estructuralmente relacionado que enlaza específicamente a un polipéptido T2R76. Preferiblemente, tales moduladores T2R76 se confirman en pruebas de sabor humanas para modular la percepción de sabor amargo mediada con T2R76. La presente invención proporciona adicionalmente métodos para modular la percepción de sabor amargo en un sujeto que utiliza moduladores T2R76 identificados utilizando sistemas de ensayo descritos en la presente. Preferiblemente, el sujeto es un sujeto mamífero, y más preferiblemente un sujeto humano. También preferiblemente, la percepción de sabor amargo que se altera en un sujeto comprende una función medida con T2R76 y potencialmente sabor amargo mediado por otros T2Rs. En una modalidad de la presente invención, un método para modular la percepción de sabor amargo en un sujeto comprende: (a) preparar una composición que comprende un modulador T2R76 identificado de acuerdo a los métodos divulgados; y (b) administrar, preferiblemente mediante la ingestión, un alimento, bebida, sustancia medicinal que contiene una dosis efectiva de un modulador T2R76 de acuerdo a la invención a un sujeto, mediante el cual la percepción de sabor amargo en el sujeto se altera. Por ejemplo, la presente invención proporciona métodos para reducir la percepción de sabor amargo de un compuesto amargo por la via de la co-administración de un inhibidor T2R76 y el compuesto amargo a un sujeto. La presente invención también proporciona métodos para aumentar la percepción de sabor amargo de un compuesto por la via de la co-administración de un agonista T2R76 y el compuesto. La co-administración puede comprender administra una composición que comprende el inhibidor T2R76 mezclado por el compuesto el cual el sabor va a ser modulado. En modalidades preferidas de la invención, la composición puede comprender un alimento, una bebida, un lavado oral, un dentífrico, un cosmético, o una sustancia farmacéutica. La presente invención también proporciona métodos para aumentar la percepción de sabor amargo de un compuesto por la via de la co-administración de un agonista T2R76 y el compuesto que el sabor va a ser modulado. El agonista T2R76 y el compuesto se pueden mezclar como una sola composición. Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar ácidos nucleicos y polipéptidos T2R76 novedosos, métodos para detectar un ácido nucleico T2R76, sistemas de expresión heterólogos mediante los cuales un polipéptido T2R76 se expresa, métodos y ensayos que emplean un sistema de expresión T2R76 heterólogo, y métodos para modular y detectar un polipéptido T2R76 o compuesto modulador T2R76. Este objetivo se logra en conjunto o en parte mediante la presente invención. Un objetivo de la invención ha sido establecido en lo anterior, otros objetivos y ventajas de la presente invención llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica después de un estudio de la siguiente descripción de la invención y los ejemplos no limitativos. Breve Descripción de las Figuras 1 y 2 La Figura 1 contiene las estructuras de Brucina y PROP. La Figura 2 contiene datos de los ensayos basados en células que revelaron que el T2R76 responde específicamente a la Brucina y PROP. Breve Descripción de las Secuencias en el Listado de Secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 contienen respectivamente secuencias de nucleótidos y aminoácidos T2R76 humanos de acuerdo a la invención. Descripción Detallada de la Invención I . Definiciones Mientras que los siguientes términos se creen que son bien entendidos por uno de habilidad ordinaria en la técnica, las siguientes definiciones se exponen para facilitar la explicación de la invención. Los términos "un", "una" y "el" se utilizan de acuerdo con la convención duradera para referirse a uno o. más . El término "aproximadamente", como se utiliza en la presente cuando se refiere a un valor medible tal como un porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, cuando compara secuencias de nucleótidos y aminoácidos como se describe en la presente enseguida) , una longitud de nucleótido o proteina, una cantidad de enlace, etc. se propone abarcar variaciones de ±20% o ±10%, más preferiblemente ±5%, aun más preferiblemente ±1%, y todavia más preferiblemente ±0.1% de la cantidad especifica como tales variaciones son apropiadas para realizar un método divulgado o de otra manera llevar a cabo la presente invención. II. Ácidos Nucleicos y Péptidos T2R76 La presente invención proporciona ácidos nucleicos T2R76 novedosos y polipeptidos T2R76 novedosos, que incluyen polipéptidos T2R76 funcionales. Un ácido nucleico T2R76 representativo de la presente invención se expone como SEQ ID N0:1, que codifica el polipeptido T2R76 expuesto como SEQ ID NO: 2. El termino "T2R76" y los términos que incluyen "T2R76" (por ejemplo, hT2R76) se refieren generalmente a ácidos nucleicos T2R 76, polipeptidos aislados codificados por ácidos nucleicos T2R 76, y actividades de los mismos. Los ácidos nucleicos y polipeptidos T2R76 se pueden derivar de cualquier organismo. Los términos "T2R76" y los términos que incluyen "T2R76" también se refieren a polipéptidos que comprenden receptores que se activan mediante compuestos amargos tales como PROP, brucina y los similares, a ácido nucleicos que codifican los mismos. Un receptor T2R76 puede comprender otros polipeptidos T2R, es decir, puede ser un receptor heteromerico u homomerico. El termino "aislado", como se utiliza en el contexto de un acido nucleico y polipeptido, indica que el ácido nucleico o polipéptido existe a parte de su medio ambiente nativo y no es un producto de naturaleza. Un ácido nucleico o polipeptido aislado puede existir en una forma purificada o puede existir en un medio ambiente no nativo tal como una célula hospedera transgenica.

Como se divulga adicionalmente en la presente enseguida, la presente invención también proporciona un sistema para la expresión funcional de un polipéptido T2R76. El sistema emplea un ácido nucleico T2R76 recombinante, que incluye SEQ ID NO: 1, que se puede expresar en asociación con otro ácido nucleico T2R y una proteina G apropiada. II.A. Ácidos Nucleicos T2R76 Los términos "molécula de ácido nucleico" y "ácido nucleico" cada uno se refiere a desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos y polimeros de los mismos en forma de una hebra, dos hebras o de tres. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades similares como la referencia del ácido nucleico natural. Los términos "molécula de ácido nucleico" o "ácido nucleico" también se pueden utilizar en lugar de "gen", "cDNA'J "mRNA" o "cRNA'J Ácidos nucleicos se pueden sintetizar, o se pueden derivar de cualquier fuente biológica, que incluyen cualquier organismo. Métodos representativos para clonar un cDNA T2R76 de longitud completa se describen en el Ejemplo 1. El término "T2R" o "SF" se refiere a ácidos nucleicos que codifican un miembro de una familia de receptores acoplados a proteina G específicos de célula de sabor. Estos ácidos nucleicos y los polipéptidos que El término "ácido nucleico" o "secuencias de ácido nucleico" se refiere a un desoxi-ribonucleótido ribonucleótido, oligonucleótido en forma ya sea de una o dos hebras. El término incluye ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también incluye estructuras similares a ácidos nucleico con cadenas principales sintéticas . A menos que de otra manera se indique, una secuencias de ácido nucleico particular también incluye implícitamente variantes conservadoramente modificados de los mis mismos (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y secuencias complementarias, asi como la secuencia implícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codón de generadas se pueden lograr al generar, por ejemplo, secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados que sustituye con residuos de base mezclados y/o desoxiinosina (Batzer y colaboradores, Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-08 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). El término de ácido nucleico se utiliza intercambiablemente con el gen, cDNA, mRNA, oligonucleótido, y polinucleótido. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteina" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse (SF46) ; GR47 (SF47); GR48 (SF48); GR49 (SF49); GR50 (SF50); Estos T2Rs, SFs, TAS2Rs, y colaboradores, o GRs como se refieren alternativamente pueden ser de diferentes especies, incluyendo humano, ratón y rata y preferiblemente son humanos . También abarcados son los que son "sustancialmente idénticos" o que poseen una identidad de secuencia especifica con los mismos, o que hibridizan específicamente a cualquiera de estas secuencias como definidas infra . Los términos "T2R76" y los términos que incluyen "T2R76" (por ejemplo, hT2R76) se utilizan en la presente para referirse a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido T2R76. Asi, el término "T2R76" se refiere a ácido nucleicos aislados de la presente invención que comprenden: (a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; o (b) a secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 1. El término "sustancialmente idéntico", como se utiliza en la presente para describir un grado de similaridad entre las secuencias de nucleótidos, han se refiere a dos o más secuencias que tienen por lo menos aproximadamente 60%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 70%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%, más preferiblemente de manera aproximada 90% a aproximadamente 99%, todavia más preferiblemente de manera aproximada 95%, 96%, 97%, 98% o aproximadamente 99%, y mucho más preferiblemente de manera aproximada 99% de identidad de nucleótidos, cuando se comparan y se alinean para correspondencia máxima, como se mide utilizando una de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante la inspección visual. Preferiblemente, la identidad sustancial existe en las secuencias de nucleótidos de por lo menos aproximadamente 100 residuos, más preferiblemente en la secuencia de nucleótidos de por lo menos aproximadamente 150 residuos y mucho más preferiblemente en las secuencias de nucleótidos que comprenden una secuencia de codificación de longitud completa. El término "longitud completa" se utiliza en la presente para referirse a una estructura de lectura abierta completa que codifica un polipéptido T2R76 funcional, como se describe en la presente adicionalmente enseguida. Métodos para determinar la identidad por ciento entre dos polipéptidos se definen en la presente enseguida bajo el titulo "Comparaciones de Secuencia de Nucleótidos y Aminoácido". En un aspecto, las secuencias sustancialmente idénticas pueden ser secuencias polimórficas. El término "polimórficos" se refiere la ocurrencia de dos o más secuencias alternativas genéticamente determinadas o alelos en una población. Una diferencia alélica pude ser tan pequeña como un par base. En otro aspecto, la secuencia sustancialmente idénticas pueden comprender secuencias mutagenizadas que incluyen secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutación puede comprender uno o más cambios de residuo, una supresión de residuos o una inserción de residuos adicional que preferiblemente no impacta el enlace del ligando T2R76, por ejemplo, PROP o brucina. Otra indicación de que dos secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridizan específicamente a o hibridizan sustancialmente a cada una bajo condiciones severas. En el contexto de la hibridación de ácido nucleico, dos secuencias de ácido nucleico que se comparan se pueden designar una "zonda" y una "objetivo". Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico de referencia, y un "objetivo" es una molécula de ácido nucleico de prueba, frecuentemente encontrados dentro de una población heterogénea de moléculas de ácido nucleico. Una "secuencia objetivo" es sinónimo con una "secuencia de prueba". Una secuencia de nucleótidos preferida empleada para los estudios o ensayos de hibridación incluye secuencias de sonda que son complementarios a o iguales por lo menos una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 14 a 40 de una molécula de ácido nucleico de la presente invención.

Preferiblemente, las sondas comprenden 14 a 20 nucleótidos, o aun más largos donde se desee, tal como 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300, o 500 nucleótidos o hasta la longitud completa de cualquier SEQ ID NO: 1. Tales fragmentos se pueden preparar fácilmente mediante, • por ejemplo, sintesis clínica del fragmento, mediante la aplicación de tecnología de amplificación de ácido nucleico, o al introducir secuencias seleccionadas en los vectores recombinantes para la producción recombinante. La frase "que hibridiza específicamente a" se refiere al enlace, duplicación, o hibridación de una molécula solamente a una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones severas cuando condiciones severas cuando esa secuencia está presente en una mezcla de ácido nucleico de complejo (por ejemplo, DNA o RNA celular total) . La frase "que hibridiza sustancialmente a" se refiere a la hibridación complementaria entre una molécula de ácido nucleico de sonda y una molécula de ácido nucleico objetivo y comprende desigualdades menores que se pueden alojar al reducir la severidad de los medios de hibridación para lograr la hibridación deseada. "Condiciones de hibridación severas" y "condiciones de lavado de hibridación severas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tal como análisis de manchado del Sur y del Norte ambos son dependientes de secuencia y medio ambiente. Las secuencias más largas se hibridizan específicamente a temperaturas más altas. Una guia extensiva a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I capitulo 2, Elsevier, Nueva York, Nueva York. Generalmente, la hibridación altamente severa y condiciones de lavado se seleccionan para estar aproximadamente 50°C más abajo que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia especifica en una resistencia iónica definida y f. Tipicamente, bajo "condiciones severas" una sonda hibridizará específicamente a su secuencia objetivo pero no a otras secuencias. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) en la cual 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una zonda perfectamente igualada. Las condiciones muy severas se seleccionan para ser iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridizaciones severas para los análisis de manchado del Sur o del Norte de ácido nucleicos complementarios que tienen más que aproximadamente 100 residuos complementarios es la hibridación durante la noche en formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42°C. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente severas es de 15 minutos en 0. I X SSC a 65°C. Un ejemplo de condiciones de lavado severas es de 15 minutos en 0.2 X de solución reguladora de SSC al 65°C. Ver Sambrook y colaboradores, eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York para una descripción de la solución reguladora de SSC. Frecuentemente, un lavado de severidad alta se procede mediante un lavado de severidad baja para remover la señal de sonda de fondo. Un ejemplo de condiciones de lavado de severidad media para un doble de más que aproximadamente 100 nucleótidos, es de 15 minutos en 1 X de SSC a 45°C. Un ejemplo de lavado de severidad baja para un doble de más de aproximadamente 100 nucleótidos, es de 15 minutos en 4X a 6X de SSC a 40°C. Para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones severas involucran tipicamente concentraciones de sal de menor que aproximadamente ion de Na+ 1 M, tipicamente a de manera aproximada concentración de ion Na+ 0.01 a 1 M (u otras sales) a f 7.0-8.3, y la temperatura es tipicamente por lo menos aproximadamente 30°C. Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. En general, una señal a la relación de ruido de dos veces (o más alta) que aquella observada para una sonda no relacionada en ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación especifica . Los siguientes son ejemplos de condiciones de hibridación y lavado que se pueden utilizar para identificar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a las secuencias de nucleótidos de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótidos de sonda hibridiza preferiblemente a una secuencia de nucleótidos objetivo en dodecilsulfato de sodio al 7% (SDS), NaP04 0.5M, EDTA I mM a 50°C seguido al lavar en 2X SSC, 0.1% de SDS a 50°C; más preferiblemente, una secuencia de sonda y objetivo se hibridiza en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C seguido por el lavado en IX de SSC, SDS al 0.1% a 50 °C; más preferiblemente, una secuencia de sonda y objetivo se hibridizan en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C seguido por el lavado en 0.5X de SSC, SDS al 0.1% a 50°C; más preferiblemente, una secuencia de sonda y objetivos se hibridizan en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50°C seguido por el lavado en 0.1X de SSC, SDS al 0.1% a 50°C; más preferiblemente, una secuencia de sonda y objetivos se hibridizan en dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), NaP04 0.5 M, EDTA 1 mM a 50 °C seguido por el lavado en 0. I X SSC, SDS al 0.1% a 65°C. Una indicación adicional que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las proteínas codificadas por los ácido nucleicos son sustancialmente idénticos, comparten una estructura tridimensional total, o son equivalentes biológicamente funcionales. Estos términos se definen adicionalmente bajo el titulo "Polipéptidos T2R76" enseguida en la presente. Moléculas de ácido nucleico que no hibridizan a cada uno bajo condiciones severas son todavia son sustancialmente idénticas y las proteínas correspondientes son sustancialmente idénticas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando dos secuencias de nucleótidos comprenden variantes conservadoramente sustituidos como es permitido por el código genético. El término "variantes conservadoramente sustituidas" se refiere a secuencias de ácido nucleico que tienen sustituciones de codón degeneradas en donde la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituyen con los residuos de base mezclada y/o desoxiinosina. Ver Batzer y colaboradores, ( 1991) Nucleic Acids Res 19 : 5081 ; Ohtsuka y colaboradores, ( 1985) J Biol Chem 260 : 2605-2608; y Rossolini y colaboradores, (1994) Mol Cell Probes 8 : 91 -98. El término " T2R " también abarca ácidos nucleicos que comprenden subsecuencias y secuencias alargadas de un ácido nucleico T2R, preferiblemente T2R76 que incluye ácidos nucleicos complementarios a un ácido nucleico T2R, moléculas de RNA T2R, y ácido nucleicos complementarios a RNAs T2R (cRNAs) .

El término "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una parte de una secuencia de ácido nucleico más larga. Una secuencia ejemplar es una sonda, descrita en la presente en lo anterior, o un cebador. El término "cebador" como se utiliza en la presente se refiere a una secuencia contigua que comprende aproximadamente 8 o más desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente 10-20 nucleótidos, y más preferiblemente 20-30 nucleótidos de una molécula de ácido nucleico seleccionada. Los cebadores de la invención incluyen oligonucleótidos de longitud suficiente y secuencia apropiada para proporcionar la polimerización sobre una molécula de ácido nucleico de la presente invención. El término "secuencia alargada" se refiere ana adición de nucleótidos (u otras moléculas análogas incorporadas en el ácido nucleico. Por ejemplo, una polimerasa por (por ejemplo, una DNA polimerasa) puede adicionar secuencias al 3' terminal de la molécula de ácido nucleico. Además, la secuencia de nucleótidos se puede combinar con otras secuencias de DNA tal como promotores, regiones promotoras, aumentadores, señales de poliadenilación, secuencias intrónicas, sitios de enzima de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, y otros segmentos de codificación. El término "secuencias complementarias" como se utiliza en la presente, indica dos secuencias de nucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos antiparalelos capaces de emparejarse entre si en la formación de enlaces de hidrógeno entre los pares base. Como se utiliza en la presente, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de nucleótidos que son sustancialmente complementarias, ya que se pueden estimar por los mismos métodos de comparación de nucleótidos expuestos enseguida, o se define como que son capaces de hibridizar al segmento de ácido nucleico en cuestión bajo condiciones relativamente severas tales como aquellas descritas en la presente. Un ejemplo particular de un segmento de ácido nucleico complementario es un oligonucleótido antisentido. La presente invención también proporciona genes quiméricos que comprenden los ácidos nucleicos T2R 76 divulgados y ácidos nucleicos T2R 76 recombinantes. Asi, también se incluyen construcciones y vectores que comprenden ácidos nucleicos T2R 76, opcionalmente expresados en combinación con otros ácidos nucleicos T2R. El término "gen" se refiere ampliamente a cualquier segmento de DNA asociado con una función biológica. Un gen incluye secuencias que incluyen pero no se limitan a una secuencias de codificación, una región promotora, una secuencia cis-reguladora, un segmento de DNA no expresado que es una secuencia de reconocimiento especifica para proteínas reguladoras, un segmento de DNA no expresado que contribuye a la expresión del gen, un segmento de DNA designado por tener parámetros deseados, o combinaciones de los mismos. Un gen se puede obtener mediante una variedad de métodos, que incluyen la clonación de una muestra biológica, sintesis basadas sobre información de secuencia conocida o predicha, o derivación recombinante de una secuencia existente. El término "gen quimérico", como se utiliza en la presente, se refiere a una región promotora operativamente enlazada a una secuencia T2R, por ejemplo, un cDNA T2R, un ácido nucleico .que codifica una molécula de T2R de antisentido, un ácido nucleico T2R que codifica una molécula de RNA que tiene estructura terciaria (por ejemplo, una estructura de orquilla) o un ácido nucleico T2R que codifica una moléculas de RNA de dos hebras. El término "gen quimérico" también se refiere a una región promotora T2R operativamente enlazada a una secuencia heteróloga. La preparación de un gen quimérico de la presente invención se describe en el Ejemplo 2. Preferiblemente, el T2R es T2R76. El término "operativamente enlazado", como se utiliza en la presente, se refiere a una combinación funcional entre una región promotora y una secuencia de nucleótidos tal que la transcripción de la secuencia de nucleótidos se controla y se regula por la región promotora. Técnicas para enlazar operativamente una región promotora a una secuencia de nucleótidos se conoce en la técnica. El término "recombinante" se refiere generalmente a un ácido nucleico aislado que es replicable en un medio ambiente no nativo. Asi, un ácido nucleico recombinante puede o comprender un ácido nucleico no replicable en combinación con ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo ácido nucleico vector, que permite su replicación en la célula hospedera. El término "vector" se utiliza en la presente para referirse a una molécula de ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos que permiten su replicación en una célula hospedera. Un vector también puede incluir secuencias de nucleótidos para permitir la ligación de las secuencias de nucleótidos dentro del vector, en donde tales secuencias de nucleótidos también se replican en una célula hospedera. Los vectores representativos incluyen plásmidos, cósmidos y vectores virales. Un vector también puede mediar la reproducción recombinante de un polipéptido T2R76, como se describe adicionalmente enseguida en la presente. El término "construcción" como se utiliza en la presente para describir un tipo de construcción que comprende un construcción de expresión, se refiere a un vector que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos insertada operativamente con el vector, tal que la secuencia de nucleótidos se expresa recombinantemente. Los términos "recombinantemente expresado" o "recombinantemente producido" se utilizan intercambiablemente para referirse generalmente a los procesos mediante los cuales un polipéptido codificado por un ácido nucleico recombinante es producido. Asi, los ácidos nucleico, T2R preferiblemente recombinante, es decir, ácidos nucleicos T2R76 comprenden ácidos nucleicos heterólogos. El término "ácido nucleico heterólogo. El término "ácido nucleico heterólogo" se refiere a una secuencia que se origina de una fuente extraña a una célula hospedera compuesta o, si de la misma fuente, se modifica de su forma original. Un ácido nucleico heterólogo en una célula hospedera puede comprender un ácido que es endógeno a la célula hospedera particular pero ha sido modificado, por ejemplo, mediante la mutagénesis o mediante aislamiento de secuencias cis-reguladoras nativa. Un ácido nucleico heterólogo también incluye múltiples copias que ocurren no naturalmente de una secuencia de nucleótidos nativa. Un ácido nucleico heterólogo también puede comprender un ácido nucleico que se incorpora en los ácidos nucleicos de una célula hospedera en una posición en donde tales ácidos nucleicos no se encuentran ordinariamente. Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden clonar, sintetizar, alterar, mutagenizar o combinaciones de los mismos. Técnicas de DNA recombinante estándares y de clonación molecular utilizadas para aislar ácidos nucleicos se conocen en la técnica. La mutagénesis especifica de sitio para crear cambios pares base, supresiones, o inserciones pequeñas también son conocidas en la técnica. Ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (eds.) (1989) Molecular Cloning Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Silhavy y colaboradores, (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach. 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/Nueva York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, Nueva York. III.B. Polipéptidos T2R76. La presente invención proporciona polipéptidos T2R76 novedosos, una modalidad representativa de la cual se expone como SEQ ID NOs: 2. Preferiblemente, un polipéptido T2R76 aislado de la presente invención comprende un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. También preferiblemente, los polipéptidos T2R76 aislados comprenden polipéptidos T2R76 funcionales. Estos polipéptidos T2R76 se pueden expresar en combinación con uno o más de otros polipéptidos T2R. Asi, los polipéptidos T2R76 novedosos útiles en los métodos de la presente invención comprenden (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID N0:1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1. Un polipéptido T2R76 también puede comprender: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID N0:2; (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID N0:1; (c) una molécula de ácido nucleico aislada que hibridiza una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones severas de lavado representadas por una solución de lavado que tiene menor que aproximadamente 200 mM de concentración de sal y una cantidad temperatura de lavado de mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislada de uno de (a) , (b) , y (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y el cual codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) , y (c) anteriores. El término "sustancialmente idéntico", como se utiliza en la presente para describir un nivel de similaridad entre un T2R y una proteina sustancialmente idéntica del mismo, se refiere a una proteina que es por lo menos 75% idéntica del mismo. Por ejemplo, en el caso de T2R76 y una proteina sustancialmente idéntica a esta proteina T2R76, esto se refiere a una secuencia que es por lo menos aproximadamente 75% idéntica a SEQ ID NO: 2, cuando se compara sobre la longitud completa de una proteina T2R76. Preferiblemente, Una proteina sustancialmente idéntica a una proteina T2R76 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 75% a aproximadamente 85% idéntica a SEQ ID NO: 2, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85% a aproximadamente 95% idéntica a SEQ ID NO: 2, aun más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% a aproximadamente 95% idéntica a SEQ ID NO: 2, todavia más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% a aproximadamente 99% idéntica a SEQ ID NO: 2, es decir 86, 97, 98 o 99% idéntica a SEQ ID NO : 2 cuando se compara sobre la longitud completa de un polipéptido T2R76. El término "longitud completa" se refiere a un polipéptido T2R76 funcional, como se describe en la presente adicionalmente enseguida. Métodos para determinar la identidad por ciento entre dos polipéptidos también se define en la presente enseguida bajo el titulo "Comparaciones de Secuencia de Nucleótidos y Aminoácidos". El término "sustancialmente idéntico", cuando se utiliza para describir polipéptidos, también incluye dos o más polipéptidos que comparten una estructura tridimensional conservada. Métodos convencionales se pueden utilizar para comparar representaciones estructurales, y modelos estructurales se pueden generar y afinar fácilmente para identificar similaridades alrededor de sitios activos importantes o sitios de enlace de ligando. Ver Saqi y colaboradores, (1999) Bioin orma tics 15:521-522; Barton (1998) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54:1139-1146; Henikoff y colaboradores, (2000) Electroforesis 21:1700-1706; y Huang y colaboradores, (2000) Pac Symp Biocomput : 230-241. Proteínas sustancialmente idénticas también incluyen proteínas que comprenden aminoácidos que son funcionalmente equivalentes a aminoácidos de SEQ ID NO: 2. El término "funcionalmente equivalente" en el contexto de aminoácidos es conocido en la técnica y se basa sobre la similaridad relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos. Ver Henikoff & Henikoff (2000) Adv Protein Chem 54:73-97. Factores relevantes para consideración incluyen hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga y tamaño de la cadena lateral. Por ejemplo, arginina, lisina, e histidina todas son residuos positivamente cargados; esa de alanina, glicina, y serina todas son de tamaño similar; y esa de fenilalanina, triptofanó, y tirosina todas tienen una forma generalmente similar. Mediante este análisis, descrito adicionalmente en la presente enseguida, arginina, lisina, e histidina; alanina, glicina, y serina; y fenilalanina, triptofano, y tirosina; se definen en la presente como equivalentes biológicamente funcionales. Al hacer las sustituciones de aminoácidos equivalentes biológicamente funcionales el Índice hidrofóbico de aminoácidos se puede considerar. Cada aminoácido ha sido asignado a un Índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y caracteristicas de carga, estas son; isoleucina (+ 4.5); valina (+ 4.2); leucina (+ 3.8); fenilalanina (+ 2.8); cisteina (+ 2.5); metionina (+ 1.9); alanina (+ 1.8); glicina 0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9) y arginina (4.5) . La importancia de el Índice de aminoácidos hidropático en conferir función biológica interactiva sobre una proteina se entiende generalmente en al técnica (Kyte y colaboradores, 1982). Es conocido qué ciertos aminoácidos se pueden sustituir para otros aminoácidos que tienen un Índice o registro hidropático similar y todavía retienen una actividad biológica similar. Al hacer cambios basados en el Índice hidropático, la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2 del valor original es preferido, aquellos que están dentro de ±1 del valor original se prefieren particularmente, y aquellos dentro de ±0.5 del valor original son aún más particularmente preferidos.

También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer efectivamente sobre la base de hidrofilicidad. La patente norteamericana No. 4,554,101 describe que la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteina, como es gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlacionan con su inmunogenicidad y antigenicidad, por ejemplo, con una propiedad biológica de la proteína. Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtenga una proteína biológicamente equivalente. Como se detalla en la patente norteamericana No. 4,554,101, los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a residuos de aminoácidos: arginina (+ 3.0); lisina (+ 3.0); aspartato (+ 3.0±1); glutamato (+ 3.0±1); serina (+ 0.3); asparagina (+ 0.2); glutamina (+ 0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5+1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). Al hacer cambios basados en los valores de hidrofilicidad similares, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 del valor original es preferida, aquellos que están dentro de ±1 del valor original son particularmente preferidos, y aquellos dentro de ±0.5 del valor original son aun más particularmente preferidos . El término "sustancialmente idéntico" también incluye polipéptidos que son equivalentes biológicamente funcionales de un polipéptidos T2R por ejemplo, polipéptido T2R76. El término "funcional" incluyen una actividad de un polipéptido T2R76, por ejemplo activando rutas de señalización intracelulares (por ejemplo, acoplando con gustducina) y mediando la percepción de sabor. Preferiblemente, tal activación muestra una magnitud y cinética que son sustancialmente similares a aquellas de un polipéptido T2R cognado, por ejemplo, polipéptido T2R76 in vivo. Métodos representativos para estimar las actividades T2R76 se describen en la presente enseguida. La presente invención también proporciona fragmentos funcionales de un polipéptido T2R76. Tal porción funcional no necesita comprender todo o sustancialmente todo de la secuencia de aminoácidos de un producto de gen T2R76 nativo . La presente invención también incluye secuencias de polipéptido funcionales que son secuencias más largas que aquellas de un polipéptido de T2R nativo por ejemplo, polipéptido T2R76. Por ejemplo, uno o más aminoácidos se pueden adicionar al N-terminal o C-terminal de un polipéptido T2R por ejemplo, polipéptido T2R76. Tales aminoácidos adicionales se pueden emplear en una variedad de aplicaciones, que incluyen pero no se limitan a aplicaciones de purificación. Métodos para preparar proteínas alargadas son conocidos en la técnica. II. C. Comparaciones de Secuencias de Nucleótidos y Aminoácidos Los términos "idéntico" o "identidad por ciento" en el contexto de dos o más secuencias de nucleótidos o polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son lo mismo o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son lo mismo, cuando se comparan y se alinean para correspondencia máxima, como se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias divulgados en la presente o mediante inspección visual. El término "sustancialmente idéntico" en consideración a una secuencia de nucleótidos o polipéptidos significa que una secuencia particular varía de la secuencia de una secuencia que ocurre naturalmente mediante una o más supresiones, sustituciones, o adicionales, el efecto neto del cual es retener la función biológica de un ácido nucleico o polipéptido T2R por ejemplo, ácido nucleico T2R76 o un polipéptido T2R76. Para comparación de dos o más secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia por lo cual una o más secuencias de prueba son comparadas. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en un programa de computadora, coordenadas de subsecuencia son designadas si es necesario, y se seleccionan los parámetros de programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación se secuencia luego calcula la identidad de secuencia por ciento para la secuencia (s) de prueba designada relativa a la secuencia de referencia, basada sobre los parámetros de programa seleccionados. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman (1981) Adu Appl Ma th 2:482-489, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch (1970) J Mol Biol 48:443-453, mediante la búsqueda para el método de similaridad de Pearson & Lipman (1988) Proc Na ti Acad Sci USA 85:2444-2448, mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) , o mediante la insepección visual. Ver generalmente, Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3ra ed. Wiley, Nueva York. Un algoritmo preferido para determinar la identidad de secuencia por ciento y la similaridad de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y colaboradores, (1990) J Mol Biol 215:403-410. El software para realizar los análisis BLAST es públicamente disponible a través del Centro Adicional para Información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencia de registro alto (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que ya sea iguala o satisface a un registro T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de registro de palabra de vecindad. Estos aciertos de palabra de vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contengan. Los aciertos de palabra luego se extienden en ambas direcciones junto con cada secuencia hasta que el registro de alineación acumulativa se puede incrementar. Los registros acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (registro de recompensa para un par de residuos de igualación; siempre > 0) y N (registro de penalización para residuos desiguales; siempre < 0) . Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de registro para calcular el registro acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando el registro de alineación acumulativa cae por la cantidad X de su valor logrado máximo, el registro acumulativo va de cero abajo debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de registro negativo, o el extremo de cada secuencia se alcanza. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determina la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencia de nucleótidos) utiliza como omisiones una longitud de palabra W=ll, una expectación E=10, un corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como omisiones una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62. Ver Henikoff & Henikoff (11992) Proc Na ti Acad Scí U S A 89:10915- 10919. Además de calcular la identidad de secuencia por ciento, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias. Ver por ejemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc Na ti Acad Sd U S A 90:5873-5877. Una medición de similaridad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una igualación de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos que ocurrirían por casualidad. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de prueba se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de la secuencia de ácido nucleico de prueba a la secuencia de ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.1, más preferiblemente menor que aproximadamente 0.01, y mucho más preferiblemente menor que aproximadamente 0.001. III Métodos para Detectar Un Ácido Nucleico T2R76 En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido T2R76. Tales métodos se pueden utilizar para detectar variantes del gen T2R76 o expresión del gen alterado. Por ejemplo la detección de un cambio en la secuencia o expresión T2R76 se puede utilizar para la 'diagnosis de diferencias relacionadas al T2R76 en la percepción de sabor. Preferiblemente, un ácido nucleico utilizado para este método comprende la secuencia de SEQ ID NO:l. Secuencias detectadas por métodos de la invención pueden ser detectadas, subclonadas, secuenciadas, y evaluadas adicionalmente mediante cualquier medición bien conocida en la técnica que utiliza cualquier método usualmente aplicado a la detección de una secuencia de DNA especifica. Asi, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden utilizar para clonar genes y DNA genómico que comprende las secuencias divulgadas. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden utilizar para clonar genera y DNA genómico de las secuencias relacionadas. Utilizando las secuencias de ácido nucleico divulgadas en la presente tales métodos son conocidos por uno de habilidad en la técnica. Ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores eds (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Métodos representativos también se divulgan en los Ejemplos 1-4. En una modalidad de la invención, los niveles de una molécula de ácido nucleico T2R76 se miden, por ejemplo, al utilizar un ensayo de RT-PCR. Ver Chiang (1998) J Chroma togr A 806:209-218, y referencias citadas en la presente . En otra modalidad de la invención, los ensayos genéticos basados sobre moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden utilizar para clasificar variantes genéticos, por ejemplo mediante el análisis de sonda de oligonucleótidos especifico de alelo (ASO) (Conner y colaboradores, 1983), ensayos de ligación de oligonucleótidos (OLAs) (Nickerson y colaboradores, 1990) , análisis de polimorfismo de conformación de una hebra (SSCP) (Orita y colaboradores, 1989) , análisis de SSCP/heterodoble, escisión de desiguladad de enzima, análisis de secuencia directa de exones amplificados (Kestila y colaboradores, 1998; Yuan y colaboradores, 1999) , hibridación específica de alelo (Stoneking y colaboradores, 1991), y análisis de restricción de DNA genómico amplificado que contiene la mutación especifica. Métodos automatizados también se pueden aplicar a la caracterización de escala grande de polimorfismos de nucleótidos solos (Wang y colaboradores, 1998; Brookes, 1999) . Métodos de detección preferidos son no electroforéticos, que incluyen, por ejemplo, el ensayo de discriminación alélico TAQMAN TM, PCR-OLA, balizas moleculares, sondas de candado, y buena fluorescencia. Ver Landegren y colaboradores, (1998) Genome Res 8:769-776 y referencias citadas en la presente. IV. Sistema para la Expresión Recombinante de Un Polipéptido T2R76 La presente invención además proporciona un sistema para la expresión de un polipéptido T2R76 recombinante de la presente invención. Este polipéptido TR276 se puede expresar con uno o más de otros T2Rs que pueden ser T2Rs humanos o no humanos. Tal sistema se puede utilizar para purificación y/o caracterización subsecuente de un polipéptido T2R76. Por ejemplo, un polipéptido T2R76 purificado se puede utilizar como un inmunógeno para la producción de un anticuerpo T2R76, descrito adicionalmente en la presente enseguida. Un sistema para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76 también se puede utilizar para la identificación de moduladores de un polipéptido T2R76. Alternativamente, los polipéptidos T2R76 divulgados se pueden utilizar como un polipéptido de control cuando se analiza la activación de otros polipéptidos de prueba. Tales polipéptido de prueba se pueden incluir otros T2Rs que se implican en la percepción de sabor, por ejemplo, cualquiera de uno de aquellos polipéptidos divulgados en Adler y colaboradores, (2000) Cell 100:693-702 y in Matsunami y colaboradores, (2000) Na ture 601-603. El termino "sistema de expresión" se refiere a una célula hospedera que comprende un ácido nucleico heterólogo y el polipéptido codificado por el ácido nucleico heterólogo. Por ejemplo, un sistema de expresión de un heterólogo puede comprender una célula hospedera transfectada con un construcción que comprende un ácido nucleico T2R76 recombinante, una célula hospedera transfectada con cRNA T2R76, o una línea celular producida mediante la introducción de ácidos nucleicos heterólogos en un genoma de célula hospedera. Como se nota, estos sistemas de expresión pueden incluir en ácidos nucleicos T2R. Un sistema para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76 puede comprender: (a) un polipéptido T2R76 recombinantemente; y (b) una célula hospedera que comprende el polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. Por ejemplo, un cRNA T2R76 se puede transcribir in vitro y luego se introduce en una célula hospedera, mediante la cual el polipéptido T2R76 se expresa. El sistema puede comprender adicionalmente uno o más polipéptido T2R adicionales, a fin de producir un receptor T2R heteroménico que comprende hT2R76 y otro polipéptido T2R. Un sistema para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76 también puede comprender: (a) un construcción que comprende un vector y una molécula de ácido nucleico que codifican un polipéptido T2R76 operativamente enlazado a un promotor heterólogo; y (b) una célula hospedera que comprende el construcción de (a) , mediante el cual la célula hospedera expresa un polipéptido T2R76. El sistema puede comprender adicionalmente construcciones que codifican uno o más polipéptidos T2R adicionales. Adicionalmente, un solo construcción por si mismo puede codificar un polipéptido T2R76 y uno o más polipéptido T2R adicionales. Los polipéptidos aislados y los polipéptido recombinantemente producido se pueden purificar y formar en categorías utilizando una variedad de técnicas estándares que son conocidas por la persona expuesta. Por ejemplo, Schroder & Lubke (1965) The Peptides. Academic Press, Nueva York; Schneider & Eberle (1993) Peptides. 1992: Proceedings of the Twenty-Second European Peptide Symposium, September 13-19, 1992, Interlaken, Switzerland. Escom, Leiden; Bodanszky (1993) Principies of Peptide Synthesis, 2nd rev. ed. Springer- Verlag, Berlin/ Nueva York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, Nueva York.

Preferiblemente, un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado comprende un receptor de sabor funcional, más preferiblemente un receptor de sabor amargo. Así, un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado exhibe preferiblemente activación en respuesta a los compuestos amargos. También preferiblemente, un polipéptido T2R76 recombinante muestra respuestas de activación similares a un polipéptido T2R76 nativo. Métodos representativos para determinar la función T2R76 se describen en la presente enseguida. IV. . Construcciones de Expresión Una construcción de expresión de un polipéptido T2R76 incluye un vector y una secuencia de nucleótidos T2R76, en donde la secuencia de nucleótido T2R76 se enlaza operativamente a una secuencia promotora. Una construcción para la expresión T2R76 recombinante también puede comprender señales y secuencias de terminación de trascripción requeridas para la translación apropiada de la secuencia de nucleótidos. La preparación de una construcción de expresión, incluye la adición de secuencias de señal de translación y terminación, es conocida por un experto en la técnica. La producción recombinante de un polipéptido T2R, por ejemplo, polipéptido T2R76 se puede dirigir utilizando un promotor constitutivo o un promotor inducible. Los promotores representativos que se pueden utilizar de acuerdo cpn la presente invención incluyen el promotor temprano de virus 40 de Simio, un promotor de repetición de terminal larga de retrovirus, un promotor de activa, un promotor de choque de calor, y una proteina de metal metalotien. Vectores adecuados que se puede utilizar para expresar un polipéptido T2R76 incluyen pero no limitan a virus tales como virus de vaccínea o adenovirus, vectores baculovirus, vectores de levadura, vectores de bacteriófago (por ejemplo, fago lambda), vectores de DNA de plásmido y cósmido, vectores de transformación mediados con transposón, y derivados de los mismos. Las construcciones se introducen en una célula hospedera utilizando un método de transfección compatible con el vector empleado. Los métodos de transfección estándares incluyen electroporación, transfección DEAE-Dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección de mediada con liposoma, transformación mediada con transposón, infección que optimiza un retrovirus, transferencia de gen mediada con particula, transferencia de gen de hiper velocidad, y combinaciones de los mismos. IV.B. Células Hospederas El termino "célula hospedera" como se utiliza en la presente, se refiere a una célula en la cual una molécula de ácido nucleico heteróloga se puede introducir. Cualquier célula hospedera adecuada se puede utilizar, incluyendo pero no limitado a hospederos eucarióticos tales como células de mamífero (por ejemplo, células HEK-293, células CHO, células BHK, células MDCK, células HeLa, células CV-1, células COS), células de anfibio (por ejemplo, o oocitos Xenopus) , células de insecto (por ejemplo, células Sf9) , células de levadura, asi como hospederos procarióticos tales como E. coli y Bacill us subti l is . Las células hospederas preferidas carecen sustancialmente de un polipéptido T2R76 y preferiblemente comprenderán células humanas o de otro mamífero. Una cepa de célula hospedera se puede elegir la cual modula la expresión de la secuencia recombinante, o modifica y procesa el producto de gen en la forma especifica deseada. Por ejemplo, las células hospederas diferentes tienen caracteristicas y mecanismos específicos para el procesamiento de tracción y postraducción y modificación (por ejemplo, glicosilación, fosforilación de proteínas). Las líneas celulares apropiadas o sistemas hospedero se pueden elegir par asegurar la modificación deseada y procesamiento de la proteina extraña expresada. Por ejemplo, la expresión de un sistema bacteriano se puede utilizar para producir un producto de proteina de núcleo no glicosilado. La presente invención incluye adicionalmente la expresión recombinante de un polipéptido T2R76 en una línea celular estable. Métodos para generar una línea celular estable después de la transformación . de una construcción heteróloga en una célula hospedera se conocen en la técnica. Ver por ejemplo, Joyner (1993) Gene Tarneting: A Practical Approach . Oxford University Press, Oxford/Nueva York. Asi, las células transformadas, tejidos u organismos no humanos se entiende que incluyen no solamente el producto final de un proceso de transformación, si no también la progenie transgénica o formas propagadas de las mismas. La presente invención además incluye la crioconservación de células que expresan un polipéptido T2R76 recombinante como se divulga en la presente. Asi, las células transientemente transfectadas y células de una línea células estables que expresan T2R76 se pueden congelar y almacenar para uso posterior. Las células congeladas se pueden transportar fácilmente para el uso en una ubicación remota. El medio de crioconservación consiste generalmente de un medio base, crioconservador, y una fuente de proteina. El crioconservador y la proteina protegen las células del estrés del proceso de congelamiento/descongelamiento. Para el medio que contiene suero, se prepara un medio de crioconservación tipico como medio completo que contiene glicerol al 10%; el medio completo que contiene DMSO al 10% (dimetiisulfóxido), o 5.0% de medio acondicionado con célula con 50% de medio fresco con glicerol al 10% o DMSO al 10%. Para el medio libre de suero, las formulaciones de crioconservación típicas incluyen 50% de medio libre suero acondicionado con células con 50% de medio libre de suero fresco que contiene DMSO de 7.5%; o medio libre de suero fresco que contiene DMSO al 7.5% y DMSO de grado de cultivo celular al 10%. Preferiblemente, una suspensión celular que comprende aproximadamente 10 ! ! 6 a aproximadamente 10! !7 células por ml se mezclan con el medio de crioconservación. Las células se combinan con el medio de crioconservación en un frasquito de vidrio u otro contenedor adecuado para almacenamiento en congelación, por ejemplo NUNC® CRYOTUBESTM (disponible de Applied Scientific of South San Francisco, California) . Las células también se pueden poner en alicotas de cavidades de una placa de multi cavidades, por ejemplo una placa de 96 cavidades diseñada para ensayos de alto rendimiento, y congelar en formato de placa. Las células se enfrian preferiblemente de temperatura ambiente a una temperatura de almacenamiento en una proporción de aproximadamente -1°C por minuto. La proporción de enfriamiento se puede controlar en, por ejemplo, al colocar frasquitos de vidrio que contiene células en un deposito llenado con agua aislado que tiene aproximadamente 1 capacidad liquida de un litro, y colocar tal cubo en un congelador mecánico a -70°C. Alternativamente, la proporción del enfriamiento de las células se puede controlar a aproximadamente -1°C por minuto al sumergir los frasquitos de vidrio en un volumen de refrigerante líquido tal como un alcohol alifático, el volumen del refrigerante líquido que es más que quince minutos en volumen total del cultivo de células a ser congeladas, y colocar los frasquitos de vidrio de cultivo sumergido en un congelador convencional a una temperatura abajo de aproximadamente -70 °C. Los dispositivos comerciales para congelar las células también son disponibles, por ejemplo, Mini-Congelador Planer R202/20OR (Planer Products Ltd. de Gran Bretaña) y el Congelador Biológico BF-5 (Union Carbide Corporation of Danbury, Connecticut, Estados Unidos de América) . Preferiblemente, las células congeladas se almacenan en o abajo de aproximadamente -70CC a aproximadamente -80°C, y más preferiblemente en o abajo de aproximadamente -130CC. Para obtener la menor supervivencia celular posible, el descongelamiento de las células se debe realizar tan rápido como sea posible. Una ves que un frasquito de vidrio, u otro deposito que contiene células congeladas se remueven del almacenamiento, se debe colocar directamente en un baño de agua a 37 °C y agitar levemente asta que se descongele completamente. Si las células son particularmente sensibles a los crioconservadores, las células se centrifugan para remover el crioconservador antes del crecimiento adicional . Métodos adicionales par ala preparación y manejo de las células congeladas se pueden encontrar en Freshney (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 2nd ed. A.R. Liss, Nueva York and in U.S. Patent Nos. 6,176,089; 6,140,123; 5,629,145,- y 4,455,842; entre otros lugares. V. Animales Transgénicos La presente invención también proporciona un animal transgénico que comprende una interrupción de la expresión del gen T2R76 y opcionalmente otro interruptor T2R. La expresión alterada puede incluir expresión de un nivel alterado o variante mutado de un gen T2R76. La presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican T2R76 que se puede utilizar para preparar construcciones para generar un animal transgénico. También se proporciona datos de localización genómicos útiles para la preparación de construcciones dirigidas al sitio T2R76. En una modalidad de la presente invención, el animal transgénico puede comprender un ratón con modificación de objetivo de sitio T2R76 de ratón y puede comprende tradicionalmente cepas de ratones con inactivación funcional completa o parcial de los genes T2R76 en todas las células asomáticas . En una modalidad alternativa, un animal transgénico de acuerdo con la presente invención se prepara utilizando construcciones T2R76 antisentido o de ribosoma, dirigidas por un promotor universal o especifico de tejido para reducir los niveles de la expresión de gen T2R76 en las células somáticas, de esta manera logrando un fenotipo de "desactivación". La presente invención también proporciona la generación de cepas de murino con inactivación condicional o inducible de T2R76. Tales cepas de murino también pueden comprender mutaciones que ocurren naturalmente o sintéticas adicionales, por ejemplo una mutación en cualquier otro gen T2R. La presente invención también proporcionan cepas de ratones con modificaciones "en desactivación" especificas en el gen T2R76, por ejemplo para crear un fenotipo negativo de sobre expresión o dominante. Asi, las modificaciones "en desactivación" incluyen la expresión de tanto de formas de tipo silvestre como mutadas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido T2R76. Técnicas para la preparación de animales transgénicos son conocidas en la técnica. Técnicas ejemplares se describen la Patente Norteamericana No. 5,489,742 (ratas transgénicas); las patentes Norteamericanas Nos. 4,736,866, 5,550,316, 5,614,396, 5,625,125 y 5,648,061 (ratones transgénicos); Patente Norteamérica No. 5,573,933 (cerdos transgénicos); 5,162,215 (especies de aves transgénicas) y Patente Norteamericana No. 5,741,957 (especies bobinas transgénicas), los contenido totales de cada uno que se incorporan en la presente por referencia.

Por ejemplo, un animal transgénico de la presente invención puede comprender en un ratón con una modificación de objetivo del ratón T2R76. Cepas de ratones con inactivación funcional completa o parcial del gen T2R76 en todas las células somáticas se pueden generar utilizando técnicas estándares de recombinación especifica de sitio en células madre embriónicas de murino. Ver Capecchi (1989) Science 244:1288-1292; Thomas & Capecchi (1990) Nature 346:847-850; y Delpire y colaboradores, (1999) Na t Genet 22:192195. VI. Anticuerpos T2R76 En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para introducir un anticuerpo que enlaza específicamente un polipéptido T2R76. De acuerdo al método, se formula un polipéptido T2R76 recombinante de longitud completa para que se puede utilizar como un inmunógeno efectivo, y se utiliza para inmunizar un animal para generar una respuesta inmune en el animal. La respuesta inmune se caracteriza por la producción del anticuerpo que se pueden recolectar del suero sanguíneo del animal. La presente invención también proporciona anticuerpos producidos mediante métodos que emplean los polipéptido T2R76 novedosos divulgados en la presente, que incluyen SEQ ID NO: 2. El termino "anticuerpo" se refiere a una proteina de inmunoglobulina, o porción funcional de la misma, que incluye un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo híbrido, un anticuerpo de cadena sola, un anticuerpo mutagenizado, un anticuerpo humanizado, y fragmentos de anticuerpos que comprende un sitio de enlace de antigeno (por ejemplo, Fragmentos de anticuerpos Fab y Fv) . En una modalidad preferida de la invención, un anticuerpo T2R76 comprende un anticuerpo monoclonal. Asi, la presente invención también incluye anticuerpos y líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales como se describe en la presente. El termino "específicamente enlaza" cuando se utiliza para describir - el enlace de un anticuerpo a un polipéptido T2R76, se refiere al enlace de un polipéptido T2R76 en una mezcla heterogénea de otros polipéptido. Las frases "sustancialmente falta de enlace" o "substancialmente sin enlace" como se utiliza en la presente para describir el enlace de un anticuerpo a un polipéptido de control o muestra, se refiere a un nivel de enlace que incluye enlace no especifico o de fondo, pero no incluye en enlace especifico. Técnicas para preparar y caracterizar anticuerpos son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Harlow & Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York y U.S. Patent Nos. 4,196,265; 4,946,778; 5,091,513; 5,132,405; ,260,203; 5,677,427; 5,892,019; 5,985,279; y 6,054561. Los anticuerpos T2R76 preparadas como se divulgan en la presente se pueden utilizar en métodos conocidos en la técnica ya que se relacionan a la ubicación y actividad de los polipéptido T2R76, por ejemplo, para la clonación de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido T2R76, inmunopurificación de un polipéptido T2R76, formación de imágenes de un polipéptido T2R76 en una muestra biológica, y niveles de medición de un polipéptido T2R76 en muestras biológicas apropiadas. Para realizar tales métodos, un anticuerpo de la presente invención puede comprender adicionalmente una marca detectable, que incluye pero no se limita a una marca radioactiva, una marca fluorescente, una marca de epitope, y una marca que se puede detectar in vivo. Métodos para la selección de una marca adecuada para una técnica de detección particular, y métodos para conjugar a o de otra manera asociar una marca detectable con un anticuerpo son conocidos por uno de habilidad en la técnica. VIII. Moduladores T2R76 La presente invención además divulga ensayos para identificar moduladores de la actividad T2R76. Un ensayo puede emplear un sistema par ala expresión de un polipéptido T2R76, como se divulga en la presente en lo anterior, o un polipéptido T2R76 aislado producido en tal sistema en donde tal polipéptido T2R se puede expresar con otros polipéptidos T2R. La presente invención también proporciona moduladores de la actividad T2R76 identificados utilizando los métodos divulgados . El término "modular" significa un incremento, disminución, u otra alteración de cualquiera o todas las actividades químicas y biológicas o propiedades de un polipéptido que T2R76. Así, el método para identificar moduladores involucra el ensayo de un nivel o calidad de la función T2R76. Un método para identificar un modulador de la función de T2R76 puede comprender: (a) proporcionar un sistema de expresión recombinante mediante el cual un polipéptido T2R76 se expresa en una célula hospedera, y en donde el polipéptido T2R76 comprende un polipéptido T2R76; (b) proporcionar una sustancia de prueba al sistema de (a); (c) analizar el nivel o calidad de la función T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba; (d) comparar el nivel o 1 calidad de la función de T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba con un nivel de control o calidad de la función T2R76; y (e) identificar una sustancia de prueba como un modulador T2R76 al determinar un nivel o calidad de la función T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba como es cambiada significativamente cuando se compara a ' un nivel de control o localidad de la función T2R76. En algunas modalidades la función T2R76 o enlace será analizada en la presencia de la sustancia de prueba y un ligando T2R76 conocido (PROP o brucina como se muestra en los ejemplos infra) al fin de detectar el efecto de la sustancia de prueba sobre el enlace o activación de T2R76 por un ligando T2R76. En algunas modalidades, el sistema de expresión también puede proporcionar T2R76 a ser co-expresado por lo menos uno de otro de T2R. Un nivel de control o calidad de la actividad de T2R76 se refiere a un nivel o calidad de la actividad de T2R76 de tipo silvestre sola o en presencia de un agente de activación de T2R76 conocido, por ejemplo, PROP o brucina. Preferiblemente, un sistema para la expresión recombinante de un polipéptido T2R76 expresará un polipéptido que tiene SEQ ID NO: 2. O un polipéptido t2R76 substancialmente idéntico que posee substancialmente el mismo enlace de ligando y/o propiedades funcionales. Al evaluar la capacidad de modulación de una sustancia de prueba, un nivel o calidad de control de la actividad de T2R76 que comprende un nivel o calidad de actividad en ausencia de una sustancia de prueba. El término "significantemente cambiado", como se utiliza en la presente para referirse a un nivel o actividad alterada de un polipéptido T2R, por ejemplo, polipéptido T2R76, y se refiere a un cambio cuantificado en una calidad medible que es más grande que el margen de error inherente en la técnica de medición, preferiblemente un incremento o disminución mediante aproximadamente 2 veces o mayor relativo a una medición de control, más preferiblemente un incremento de disminución mediante aproximadamente 5 veces o mayor, y mucho más preferiblemente un incremento disminución mediante aproximadamente 10 veces o motor. En una modalidad de la invención, el ensayo de la función T2R76 comprende determinar un nivel de la expresión de gen T2R76. En otra modalidad de la invención, el ensayo de la función T2R76 comprende analizar la actividad de enlace de un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. Por ejemplo, una actividad T2R76 puede comprender una cantidad o una resistencia de enlace de un modulador a un polipéptido T2R76. En todavia otra modalidad de la invención, el ensayo de la función T2R76 puede comprender analizar una conformación activa de un polipéptido T2R76. En una modalidad preferida de la invención, el ensayo de la función T2R76 comprende analizar la activación de eventos de señalización intracelular sin respuesta a el enlace de un ligando o modulador a un polipéptido T2R76. por ejemplo, la estimulación mediada por ligando de la actividad de intercambio de la proteina G se puede analizar al medir una cantidad de enlace de [35S]GTPyS a un polipéptido T2R76, como se describe adicional ente en la presente enseguida y en el Ejemplo 3.

En otra modalidad preferida los compuestos moduladores T2R76 se identifican en los ensayos basados en células que detectan para cambio en el casi intracelular, mediante métodos de formación de imágenes que utilizan tintes fluorimétricos sensibles al calcio en la presencia y ausencia del compuesto de prueba. (Ver ejemplo 4 infra) . Moduladores identificados mediante los métodos divulgados pueden comprender agonistas y antagonistas. Como se utiliza en la presente, el término "agonista" significa una sustancia que activa, sinergiza, o hace más potente la actividad biológica de un polipéptido T2R76 tal como PROP o brucina u otro ligando amargo. Como se utiliza en la presente, el termino "antagonista" se refiere a una sustancia que bloquea o mitiga la actividad biológica de un polipéptido T2R76, por ejemplo, al inhibir el enlace o activación de T2R76 mediante los ligandos amargos tales como brucina, PROP u otros T2R76 que enlazan los ligandos amargos. Un modulador también puede comprender un ligando o sustancia que enlaza específicamente a un polipéptido de T2R76. La actividad y los ensayos de enlace para la determinación de un modulador T2R76 se pueden realizar in vi tro o in vivo . Preferiblemente, los moduladores serán detectados utilizando ensayos basados en células como se describe en la presente. En una modalidad de la invención, tales ensayos son útiles para la identificación de los moduladores T2R76 que se pueden desarrollar como aditivos para alterar el sabor de una composición para el uso oral, que incluye pero no se limita a comida, bebidas, lavados orales, dentífricos, cosméticos, y productos farmacéuticos, como se describe adicionalmente en la presente enseguida bajo el título "Aplicaciones." Por ejemplo, un inhibidor o bloqueador de T2R76 se puede utilizar para redecir el sabor amargo. En otra modalidad de la invención, tales ensayos son útiles para la identificación de moduladores T2R76 que se pueden desarrollar como aditivos para alterar el sabor de un compuesto que es uso oral posible pero indeseable, por ejemplo, limpiadores domésticos, venenos, etc. Así, una antagonista de T2R76 se puede utilizar para introducir o incrementar el sabor amargo de una composición para de esta manera desalentar su uso oral. En todavia otra modalidad de la invención, los ensayos que utilizan un polipéptido T2R76 recombinantes se pueden realizar para el propósito de preseleccionar agentes bioactivos, en donde una interacción entre el agente y el T2R76 es indeseable. Por ejemplo, un fármaco propuesto para la administración a un sujeto se puede probar para la actividad de modulación T2R76 que puede dar por resultado un sabor amargo indeseable. En todavia otra modalidad de la invención, un ensayo divulgado en la presente se puede utilizar para caracterizar un polipéptido T2R76 mutante, por ejemplo, un polipéptido mutante que se enlaza a unas diferencias en la presesión de sabor amargo. La expresión recombinante de los polipéptidos T2R76 mutados permitirá análisis adicionales de los polipéptidos T2R76 relacionados al desorden. De acuerdo con la presente invención también se promociona un método de clasificación rápida y de rendimiento alto que depende de los métodos descritos en la presente. Este método de clasificación comprende poner en contacto separadamente un polipéptido T2R76 con una pluralidad de sustancias de prueba. En tal método de clasificación la pluralidad de sustancias de sustancias objetivo comprende preferiblemente más que aproximadamente 1,0000 muestras, comprende preferiblemente más que aproximadamente 100000 muestras y todavia más preferiblemente comprende más de 1,000,000 muestras. Los ensayos in vitro y celulares de la invención pueden comprender ensayos solubles, o pueden comprender adicionalmente un sustrato en fase sólida para inmovilizar uno o más componentes del ensayo. Por ejemplo, un polipéptido T2R76, o una célula que expresa un polipéptido T2R76, y opcionalmente otro polipéptido T2R se pueden enlazar directamente a un componente de estado sólido por la via de un enlace covalente o no covalente. Además, opcionalmente, el enlace puede incluir una molécula enlazadora o marca que media el enlace directo de un polipéptido T2R76 a un sustrato o que proporciona la detección o expresión de un receptor sobre la superficie de una célula. Enlazadores representativos incluyen pares de enlace conocido (por ejemplo, biotina y avidina) , anticuerpos que reconocen antígenos conocidos, polimeros sintéticos (por ejemplo, poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, sulfuros de poliarileno, polisiloxanos, poliimidas, y poliacetatos) , péptido, éteres. Un enlazador puede comprender opcionalmente un enlazador flexible, por ejemplo enlazadores de poli (etilenglicol) (disponibles de Shearwater Polymers, Inc. of Huntsville, Alabama, Estados de Unidos de América) . Opcionalmente, un enlazador puede comprender adicionalmente amida, sulfidrilo, o sitios de enlace heterofuncionales . Los enlazadores se pueden fijar a un sustrato sólido que utiliza cualquiera de una variedad de métodos actuales, que incluyen derivación de un substrato mediante el cual reacciona con un enlazador o procedimientos no químicos que emplean reticulación con calor o ultravioleta. Los protocolos representativos se pueden encontrar, por ejemplo, en Merrifield (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154 (que describe la síntesis en fase sólida de, por ejemplo, Péptidos); Geysen y colaboradores, (11987) J Immun Meth 102:259-274 (que describe la sintesis de componentes o componentes en fase sólida sobre alfileres); Frank & Boring (1988) Tetrahedron 44:60316040 (que describe la sintesis de varias secuencias de péptido sobre discos de celulosa) ; Fodor y colaboradores, (1991) Science 251:767-777; y Kozal y colaboradores, (1996) Na t Med 2(7):753759 (que describe arreglos de biopolimeros fijados a sustratos sólidos), Merrifield (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154 (que describe sintesis en fase sólida de, por ejemplo, péptido); Geysen y colaboradores, (1987) J Immun Meth 102:259-274 (que describe síntesis de componentes en fase sólida sobre alfileres); Frank & Doring (1988) Tetrahedron 44:60316040 (que describe síntesis de varias secuencias de pépticos sobre discos de celulosa) ; Fodor y colaboradores, (1991) Science 251:767-777 ; y Kozal y colaboradores, (1996) Na t Med 2(7):753759 (que describe arreglos de biopolímeros fijados a sustratos sólidos), entre otros lugares) . VII. . Sustancias de Prueba Un modulador potencial analizado que utiliza los métodos de la presente invención comprende una sustancia o candidato. Como se utiliza en la presente, los términos "sustancia candidato" y "sustancia de prueba" se utilizan intercambiablemente, y cada uno se refiere a una sustancia quien se sospecha interactúa con un polipéptido T2R76, que incluye cualquier producto o composición sintética, recombinante o natural. Una sustancia de prueba sospechada de interactuar con un polipéptido se puede evaluar para tal interacción utilizando los métodos divulgados en la presente. Sustancias de prueba representativas incluyen pero no se limitan a polipéptido, oligómeros, ácidos nucleicos (por ejemplo, aptameros), moléculas pequeñas (por ejemplo, compuestos químicos), anticuerpos o fragmentos de los mismos, fusiones de ácido nucleico-proteína, cualquier otro agente de afinidad, y combinaciones de los mismos. Una sustancia de prueba puede comprender adicionalmente un carbohidratos, una vitamina o derivado de la misma, una hormona, un neurotransmisor, un virus o receptor que enlaza el dominio del mismo, un ops o rodopsina, aun odorante, un feromona, una toxina, un factor de crecimiento, un factor de activación de plaqueta, un péptido neuroactivo, o una neuro hormona. Preferiblemente, una sustancia candidato induce la percepción de sabor amargo. Una sustancia candidato a ser probada puede ser un molécula purificada, una muestra homogénea, o una muestra de molécula o compuestos. El término "molécula pequeña" como se utiliza en la presente se refiere a un compuesto, por ejemplo un compuesto orgánico, con un peso molecular de menor que aproximadamente 1,000 daltons, más preferiblemente menos que aproximadamente 750 daltons, todavia más preferiblemente menos que aproximadamente 600 daltons, y todavia más preferiblemente menos que aproximadamente 500 daltons. Una molécula pequeña también tiene preferiblemente un coeficiente de división de octanol-agua lo computarizado en el intervalo de aproximadamente -4 a aproximadamente +14, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente -2 a aproximadamente +7.5. Estas moléculas pequeñas puede ser comprendidas en librerías de compuestos de diversos o estructuralmente similares, por ejemplo, librerías sintetizadas de química combinatoria. Preferiblemente estos compuestos incluirán compuestos amargos que ocurren naturalmente, por ejemplo, derivados de extractos de planta y los similares. Las sustancias de prueba se pueden obtener o preparar como una librería. Como se utiliza en la presente, el término "librería" significa una colección de moléculas. Una librería puede contener pocos o un número grande de moléculas diferentes que varían de aproximadamente diez moléculas a varios billones de moléculas o más. Una molécula puede comprender una molécula que ocurre naturalmente, una molécula recombinante, o una molécula sintética. Una pluralidad de sustancias de prueba en una librería se pueden analizar simultáneamente. Opcionalmente, las sustancias de prueba derivadas de las librerías diferentes se pueden acumular para la evaluación simultánea. Librerías representativas incluyen pero no se limitan a una librería de polipéptidos (Patentes norteamericanas Nos. 6,156,511, 6,107,059, 5,922,545, y 5,223,409), una librería de oligómero (Patentes Norteamericanas Nos. 5,650,489 y 5,858,670), una librería de aptameros (Patentes Norteamericanas Nos. 6,180,348 y 5,756,291), una librería de molécula pequeña (Patentes Norteamericanas Nos. 6,168,912 y 5,738,996), una librería de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o (Patentes Norteamericanas Nos. 6,174,708, 6,057,098, 5,922,254, 5,840,479, 5,780,225, 5,702,892, y 5,667988), una librería de fusiones de ácido nucleico-proteína (Patente Norteamericana No. 6,214,553), y una librería de cualquiera de otro agente de afinidad que puede enlazar potencialmente a un polipéptido T2R76 (por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,948,635, 5,747,334, y 5,498,538) . Una librería puede comprender una colección aleatoria de moléculas. Alternativamente, una librería puede comprender una colección de moléculas que contiene una propensión para una secuencia particular, estructura o conformación. Ver por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,264,563 y 5,824,483. Métodos para preparar las librerías que contienen diversas poblaciones de varios tipos de moléculas son conocidas en la técnica, por ejemplo como se describe en las Patentes Norteamericanas citadas en la presente en lo anterior. Las numerosas librerías también son comercialmente disponibles. VII. B. Ensayos de Enlace En otra modalidad de la invención, un método para identificar un modulador T2R76 comprende determinar el enlace especifico de una sustancia de prueba a un polipéptido T2R76 o un receptor heteroménico que comprende un polipéptido T2R76 y uno o más de otros polipéptido T2R. El término "enlace" se refiere a una afinidad entre dos moléculas. Preferiblemente, el enlace especifico también incluye una calidad o estado de la acción mutua tal que una actividad de una proteina o compuesto sobre otra proteína es inhibidora (en el caso de un inhibidor o antagonista) o aumento (en el caso de un activador o agonista) . La frase "enlaza específicamente (o selectivamente) ", cuando se refiere a la capacidad de enlace de un modulador candidato, o se refiere a una reacción de enlace que es determinativa de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros materiales biológicos. El enlace de un modulador a un polipéptido T2R76 se puede considerar específicos y la afinidad de enlace es de aproximadamente 1X104M-1 a aproximadamente 1X106M-1 o mayos. La frase "enlaza específicamente" también se refiere al enlace saturable. Para demostrar el enlace saturable de una sustancia de prueba a un polipéptido T2R.76, el análisis Scatchard se puede llevar a cabo como se describe, por ejemplo, por Mak y colaboradores, (1989) J Biol Chem 264:21613-21618.

Las frases "sustancialmente falta de enlace" o "sustancialmente sin enlace", como se utiliza en la presente para describir el enlace de un modulador a un polipéptido de control o muestra, se refiere a un nivel de enlace que incluye enlace no especifico o de fondo, pero no incluye en enlace especifico. Diversas técnicas se pueden utilizar para detectar interacciones entre un polipéptido T2R76 y una sustancia de prueba sin emplear un modulador competitivo conocido. Métodos representativos incluyen pero no limitan a, Espectroscopia de Correlación de Fluorescencia, Espectroscopia de tiempo de vuelo de Desabsorción/Ionización de láser aumentado de superficie, y tecnología Biacor, cada técnica de describe en la presente enseguida estos métodos son dóciles a la clasificación de alto rendimiento, automatizado. La Espectroscopia de Correlación de Fluorescencia (FCS) mide la proporción de difusión promedio de una molécula fluorescente de un volumen de muestra pequeño (Tallgren, 1980) . El tamaño de muestra puede ser tan bajo como 10. ! !3 moléculas fluorescentes y el volumen de muestra tan bajo como el citoplasma de una sola bacteria. La proporción de difusión es una función de la masa de la molécula y disminuye conforme se incrementa. La FCS se puede aplicar por lo tanto al análisis de interacción del polipéptido-ligando al medir el cambio en la masa y por lo tanto en la proporción de difusión de una molécula en el enlace. En un experimento tipico, el objetivo a ser analizado (por ejemplo, un polipéptido de T2R76) se expresa como un polipéptido recombinante con una marca de secuencia tal como una secuencia de pol-histidina, insertada en la N-terminal o C-terminal. La expresión es mediada en una célula hospedera, tal como E. coli, levadura, u oocitos Xenopus, o células de mamífero. El polipéptido se purifica utilizando métodos cromatográficos. Por ejemplo, la marca de poli-histidina se puede utilizar para enlazar el polipéptido expresado a una columna de quelato de metal tal como Ni2+ quelatados sobre agarosa de ácido e iminodiacético. El polipéptido luego se marca con una marca fluorescente de tal como carboxitetrametilroda mina o reactivo BODIPYTm (disponible de Molecular Probes of Eugene, Oregon) . El polipéptido luego se expone en solución a ligando potencial y su proporción de difusión se determina mediante la FCS utilizando la instrumentación disponible de Cari Zeiss, Inc.

(Thornwood, Nueva York) . El enlace de ligandos se determina mediante cambios en la proporción de difusión del polipéptido. La Desabsorción/Ionización de láser aumentada de superficie (SELDI) se desarrollo por Hutchens & Yip (1993) Rapid Commun Mass Spectrom 7:576-580. cuando se acopla a un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo (TOF) , la SELDI proporciona una técnica para analizar rápidamente moléculas retenidas sobre una plaquita. Se puede aplicar al analizas de interacción de ligando de proteina al enlazar covalentemente la proteína objetivo, o la porción de la misma, sobre la plaquita y analizar mediante la espectrometría de masa las moléculas pequeñas que enlazan a esta proteína (Wo.rrall y colaboradores, 1998). En un experimento típico, un polipéptido objetivo (por ejemplo, un polipéptido T2R76) se expresa y se purifica recombinantemente. El polipéptido objetivo se enlaza a una plaquita de SELDI ya se al utilizar una marca de histidina o mediante otra interacción tal como intercambio de iones o interacción hidrofóbica. Una plaquita asi preparada luego se expone a ligando potencial por la via de, por ejemplo, un sistema de suministro capaz de pipetear los ligandos en una manera secuencial (automostrador) . La plaquita luego se lava en soluciones para incrementar la severidad, por ejemplo una serie de lavados con soluciones reguladoras que contienen una resistencia iónica de incremento. Después de cada lavado, el material de enlace se analiza al someter la plaquita a SELDI-TOF. Los ligandos que enlazan específicamente a un polipéptido objetivo se identifican mediante la severidad de lavado necesario para de ligarlos . El Biacore depende de los cambios en el índice refractivo en la capa superficial en el enlace de un ligando a un polipéptido objetivo (por ejemplo, un polipéptido T2R76) inmovilizados sobre la capa. En este sistema, una colección de ligandos pequeños se inyecta secuencialmente en una celda de microlito de 2-5, en donde el polipéptido objetivo se inmoviliza dentro de la celda. El enlace se detecta mediante la resonancia de plasmon de superficie (SPR) al registrar la refracción de luz láser de la superficie. En general, el cambio de índice refractivo para un cambio dado de concentración de masa en la capa superficial es prácticamente el mismo para todas las proteínas y péptidos, permitiendo un solo método a ser aplicable en cualquier proteína (Liedberg y colaboradores, 1983. en un experimento típico, una proteína se expresa, se purifica y se enlaza recombmantemente a una plaquita de Biacore. El enlace se puede facilitar al utilizar una marca de polihistidina o mediante otra interacción tal como intercambio de iones* o interacción hidrofobica. Una plaquita asi preparada luego se expone a uno o mas ligandos potenciales por la vía del sistema de suministro incorporado en los instrumentos vendidos por Biacore (Uppsala, Suiza) para pipetear los ligandos en una manera secuencial (automostrador) . La señal SPR sobre la plaquita se registra y los cambios en el índice refractivo indican una interacción del objetivo inmovilizado y el ligando. Análisis de la cinética de señal de una proporción y proporción les permite la discriminación entre la interacción no específica y especifica. Ver también Homola y colaboradores, (1999) Sensors y Act ua tors 54:3-15 y referencias de la misma. VII. C. Ensayo Adaptativo o Conformacional La presente invención proporciona un método para identificar un modulador T2R76 que depende de un cambio adaptativo de un polipéptido T2R76 expresado solo o en asociación con otro polipéptido T2R cuando se enlaza a o de otra manera interactuar con un modulador T2R76. La aplicación del dicroísmo circular a la soluciones de las macromoléculas revela los estados adaptativos de estas macromoléculas. La técnica puede distinguir una serpentina aleatoria, alfa-hélice, y estados adaptativos de cadena beta Para identificar los moduladores de un polipéptido T2R76, el análisis de dicroismo circular se puede realizar utilizando un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado. Un polipéptido T2R76 se purifica, por ejemplo mediante el intercambio de iones y la cromatografía de exclusión de tamaño, y se mezcla con una sustancia de prueba. La mezcla se somete a un dicroísmo celular. La conformación de un polipéptido T2R76 en la presencia de una sustancia de prueba se compara a una conformación de un polipéptido T2R76 en la ausencia de una sustancia de prueba. Un cambio en el estado adaptativo de un polipéptido T2R76 en la presencia de una sustancia de prueba puede a si ser utilizado para identificar un modulador T2R76. Métodos representativos se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,776,859 y 5,780,242. El polipéptido T2R76 puede ser comprendido en un receptor heteroménico que comprende otro polipéptido T2R. VII.D. Ensayos de Activación de Receptor En una modalidad preferida de la invención, un método para identificar un modular T2R76 que emplea un polipéptido T2R76 funcional. Los polipéptidos T2R76 novedosos divulgados en la presente incluyen SEQ ID NO: 2. Los métodos representativos para determinar la función de T2R76 incluyen el enlace de la activación mediada por el ligando de los eventos de señalización intracelulares, como se describe en la presente enseguida. El efecto de una sustancia de prueba sobre la función T2R76 puede comprender el ensayo de cualquier cambio fisiológico levigado por la actividad T2R76, que incluye pero no se limita a fosforilación de un polipéptido T2R76, la proteina G que enlaza a un polipéptido T2R76, el flujo de iones en una célula que expresa un polipéptido T2R76, cambios en la transcripción del gen, cambios en el metabolismo de la célula (por ejemplo, crecimiento celular), cambios en los segundos mensajeros intracelulares (por ejemplo, cambios in Ca2+ , IP3, cGMP, cAMP) , y cambios en la liberación del transmisor u hormona. La transducción de señal GPCR y métodos para el ensayo del mismos se describen en Methods in Enzyinology volúmenes 237 y 238 (1994). Ver también Berridge & Irvine (1984) Na ture 312:315-321; Bourne y colaboradores, (1991) Na ture 10:349:117-27; Bourne y colaboradores, (1990) Na ture 348:125-32; Felley-Bosco y colaboradores, (1994) Am J Resp Cell and Mol Biol 11:159-164; Mistili & Spector (1997) Na t Biotech 15:961-964; Offermanns & Simón (1995) J Biol Chem 270:15175-15180; Pitcher y colaboradores, (1998) Annu Rev Biochem 67:653-92; y las patentes norteamericanas Nos. 4,115,538; 5,436,128; 6,004,808,-6,403,305, y 6,255,059. En una modalidad preferida de la invención, el ensayo de la función T2R76 comprende analizar el acoplamiento de un polipéptido T2R76 recombinantemente expresado solo o en asociación con otro polipéptido T2R a gustducina o una proteína G promiscua tal como Gq o transducina o una quimera de la misma. Un nivel representativo de la actividad T2R76 asi puede comprender una cantidad de intercambio de GDP para GTP?S gustducina como se describe en el Ejemplo 3 o cambios en el calcio intracelular como se describe en el Ejemplo 4. Una calidad representativa de la actividad T2R76 puede comprender por ejemplo, la activación selectiva de la proteína G a subunidades. De acuerdo con el método, las células que expresan T2R76 se pueden proporcionar en la forma de un equipo útil para realizar un ensayo de la función T2R76. Asi, las células se pueden congelar como se describe en la presente en lo anterior y se transportan mientras que están congeladas a otras para la realización de un ensayo. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, un equipo de prueba se proporciona para detectar un modulador T2R76, el equipo comprende: (a) células congeladas transfectadas con DNA que codifica un polipéptido T2R76 de longitud completa; y (b) un medio para el cultivo de las células. Preferiblemente, una célula utilizada en -tal ensayo comprende una célula que está desprovista sustancialmente de T2R76 nativo y polipéptidos sustancialmente similares a T2R76. Una célula preferida comprende una célula eucariótica, por ejemplo una célula HEK-293. El término "sustancialmente desprovisto de" como se utiliza en la presente para describir una célula hospedera o una célula de control, se refiere a una calidad para tener un nivel de T2R76 nativo, un nivel de un polipéptido sustancialmente similar a T2R76, o un nivel de actividad del mismo, que comprende un nivel de fondo. El término "nivel de fondo" incluye mediciones no específicas de la expresión o actividad que se detectan típicamente en una célula libre de T2R76 y libre de polipéptidos sustancialmente similares a un polipéptido T2R76. Las células utilizadas en los ensayos de la invención comprenden preferiblemente una proteína G funcional que es capaz de acoplar un receptor T2R76 a una ruta de señalización intracelular. En una modalidad de la invención, la proteína G funcional puede comprender una proteina G que exhibe acoplamiento promiscuo, por ejemplo Ga 15 y Ga 16 u otra proteína G tal como transducina o gustducina o una quimera de las mismas como se divulga en el Ejemplo 4 (G16gust44) . Ver Wilkie y colaboradores, (1991) Proc Nad Acad Sci USA 88:10049-10053 y la patente norteamericana No. 6,004,808. También preferiblemente, todos los ensayos que emplean células que expresan T2R76 recombinante emplean adicionalmente células de control que están desprovistas sustancialmente de T2R76 y polipéptidos sustancialmente similares a un polipéptido T2R76. Al utilizar las células transientemente transfectadas, una célula de control puede comprender, por ejemplo una célula hospedera no transfectada. Al utilizar una línea celular estable que expresa un polipéptido T2R76, una célula de control puede comprender, por ejemplo, una línea celular de origen utilizada para desviar la línea celular que expresa T2R76. Los ensayos de la actividad T2R76 que emplean células transientemente transfectadas incluyen preferiblemente un marcador que distingue las células transfectadas de las células no transfectadas. El término "marcador" se refiere a cualquier molécula detectable que se puede utilizar para distinguir una célula que expresa recombinantemente T2R76 de una célula que no expresa recombinantemente un polipéptido T2R76. Preferiblemente, un marcador se codifica mediante o de otra manera asociado con una construcción para la expresión T2R76, tal que las células se transfectan simultáneamente con una molécula de ácido nucleico que codifica T2R76 y el marcador. Moléculas detectables representativas que son útiles como marcadores incluyen pero no se limitan a un ácido nucleico heterólogo, un polipéptido codificado por una construcción transfectada (por ejemplo, una enzima o un polipéptido fluorescente) , una proteina de enlace y un antigeno. Por ejemplo, un marcador puede comprender una etiqueta de rodoxon, que se puede detectar inmunológicamente, como se describe en el Ejemplo 2. Ejemplos de enzimas que son útiles como marcadores incluyen fosfatasas (tales como fosfatasa de ácido o alcalinas), ß-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, glucoamilasa, maleato deshidrogenasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ß-glucosidasa, proteasas, piruvato descarboxilasa, esterasas, luciferasa, alcohol deshidrogenasa, o peroxidasas (tal como peroxidasa de rábano picante) . Un marcador que combina una enzima se puede detectar basado sobre la actividad de la enzima. Así, un sustrato va a ser adicionado para catalizar una reacción del producto final del cual es detectable, por ejemplo utilizando un fotómetro de espectro, un lumunómetro, o un fluorímetro.

Sustratos para la reacción para las enzimas mencionadas anterior y que producen un producto de reacción detectable, son conocidos por uno de habilidad en la técnica. Un marcador preferido comprende un polipéptido , codificado que se puede detectar en la ausencia de un sustrato adicionado. Polipéptidos representativos que se pueden detectar directamente incluyen GFP y EGFP. El equipo de búsqueda común ha sido desarrollado para realizar la detección de alto rendimiento de fluorescencia, por ejemplo fluorescencia GFP o EGFP, que incluyen instrumentos de GSI Lumonics (Watertown, Massachusetts, Estados Unidos de América) , Amersharn Pharmacia Biotech/Molecular Dynamics (Sunnyvale, California, Estados Unidos de América) , Applied Precisión Inc. (Issauah, Washington, Estados Unidos de América), y Genomic Solutions Inc. (Ann Arbor, Michigan, Estados Unidos de América) . La mayoria de los sistemas comerciales utilizan alguna forma de tecnología de exploración con la detección de tubo fotomultiplicador. VII. E. Diseño Racional El conocimiento de la estructura de un polipéptido T2R76 nativo proporciona un procedimiento para el diseño racional de moduladores y agentes de diagnóstico. En breve, la estructura de un polipéptido T2R76 se puede determinar mediante la cristalografía de rayos X y/o mediante los algoritmos computacionales que generan representaciones tridimensionales. Ver Saqi y colaboradores, (1999) Bioinf orma tics 25:521-522; Huang y colaboradores, (2000) Pac Symp Biocomput : 230-241; y publicación Internacional PCT No. WO 99/26966. Alternativamente, un modelo de trabajo de una estructura de polipéptido T2R76 se puede derivar mediante la modelación de homología (Maalouf y colaboradores, 1998). Los modelos de computadora pueden predecir adicionalmente el enlace de una estructura de proteina a varias moléculas de sustrato que se pueden sintetizar y probar analizando los ensayos descritos en la presente en lo anterior. Técnicas de diseño de compuesto adicionales se describen en las patentes norteamericanas Nos. 5,834,228 y 5,872,011. En general, un polipéptido T2R76. es una proteína de membrana, y se puede purificar en forma soluble utilizando detergentes u otras moléculas amfifilicas adecuadas. El polipéptido T2R76 resultante está en una pureza y concentración suficiente para cristalización. El polipéptido T2R76 purificado corre preferiblemente como una sola banda bajo la electroforesis de gel de poliacrilamida de reducción y no de reducción (PAGE) . El polipéptido T2R76 purificado se puede cristalizar bajo condiciones variantes de por lo menos uno de lo siguiente: pH, tipo de solución reguladora, concentración de solución reguladora, tipo de sal, tipo de polímero, concentración de polímero, otros ligandos de precipitación, y concentración de T2R76 purificado. Métodos para generar un polipéptido cristalino son conocidos en la técnica y se pueden adaptar razonablemente para determinación de un polipéptido T2R76 como se divulga en la presente. Ver por ejemplo, Deisenhofer y colaboradores, (1984) J Mol Bi ol 180:385-398; Weiss y colaboradores, (1990) FEBS Lett 267:268-272; o los métodos proporcionados en un equipo comercial tal como el equipo CRISTALES SCREENt (disponible de Hampton Research of Riverside, California, Estados Unidos de América) . Un polipéptido T2R76 cristalizado se puede probar para la actividad funcional y los cristales diferencialmente dimensionados y formados se prueban adicionalmente para la aplicabilidad en la difracción de rayos X. Generalmente, los cristales más grandes proporcionan mejor cristalografía que los cristales más pequeños, y los cristales más gruesos proporcionan mejor cristalografía que los cristales más delgados. Preferiblemente, los cristales T2R76 varían en tamaño de 0.1-1.5 mm. Estos cristales difractan los rayos X a por lo menos resolución de 10 A, tal como 1.5-10.0 A o cualquier intervalo de valor en la misma, tal como 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 o 3, con 3.5 A o menor que se prefiere para la resolución más alta. VIII. Métodos para Detectar un polipéptido T2R76 La presente invención proporciona adicionalmente métodos para detectar un polipéptido T2R76. Los métodos divulgados se pueden utilizar para determinar niveles alterados de la expresión T2R76 que se asocian con diferencias relacionadas a T2R76 en la percepción de sabor. En una modalidad de la invención, el método involucra realizar una reacción inmunoquímica con un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido T2R76, en donde el anticuerpo se preparó de acuerdo a un método de la presente invención para producir tal anticuerpo. Asi, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica que comprende material peptídico: (b) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo que enlaza específicamente un polipéptido T2R76 y que se produjo de acuerdo a los métodos divulgados, en donde el anticuerpo comprende una marca detectable; y (c) detectar la marca detectable mediante la cual un polipéptido T2R76 en una muestra se detecta. Técnicas para detectar tales conjugados o complejos de anticuerpo-antígeno se conocen en la técnica e incluyen pero no se limitan a la centrifugación, cromatografía de afinidad y otros métodos inmunoquimicos . Ver por ejemplo, Manson (1992) Immunochemical Protocols. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, Estados Unidos de América; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassays . Elsevier, Amsterdam/Nueva York, Estados Unidos de América; Law (1996) Immunoassay: Practical Guide. Taylor & Francis, London/Bristol , Pennsylvania, Estados Unidos de América: Chan (1996) Immunoassay Automation : An Updated Guide to Systems. Academic Press, San Diego; Liddell & Weeks (1995) Antibody Technology. Bios Scientific Publishers, Oxford, United Kingdom; Masseyeff y colaboradores, (1993) Methods of Immunological Analysis . VCH Verlagsgesellschaft/VCH Publishers, Weinheim, Federal Republic of Alemania/Nueva York, Estados Unidos de América; Waiker & Rapley (1993) Molecular and Antibody Probes in Diagnosis. Wiley, Chichester, Nueva York; Wyckoff y colaboradores, (1985) Diffraction Methods for Biological Macromolecules. Academic Press, Orlando, Florida, Estados Unidos de América; y referencias citadas en la presente. En otra modalidad de la invención, un modulador que muestra enlace especifico a un polipéptido T2R76 se utiliza para detectar un polipéptidos T2R76. Análogos para detección de un polipéptido T2R76 que utilizan un anticuerpo, el método comprende: (a) obtener una muestra biológica que comprende material peptídico; (b) poner en contacto la muestra biológica con un modulador de un polipéptido T2R76, en donde el modulador comprende una marca detectable; y (c) detectar la marca detectable, mediante la cual un polipéptido T2R76 en una muestra se detecta. Cualquier marca detectable adecuada se puede utilizar, por ejemplo una marca de fluoróflora o epítope . IX. Aplicaciones La presente invención proporciona métodos para identificación de moduladores de un polipéptido T2R76. Los moduladores de la invención son útiles para alterar la percepción de sabor amargo, por ejemplo para suprimir o aumentar la percepción de sabor amargo. IX. . Sujetos El término "sujetos" como se utiliza en la presente incluye cualquiera de las especies vertebradas, preferiblemente vertebrados de sangre caliente tales como mamíferos y pájaros. Más particularmente, los métodos de la presente invención se contemplan para el tratamiento de tumores en mamíferos tales como humanos, así como aquellos mamíferos de importancia debido a que están en peligro (tal como tigres siberianos), de importancia económica (animales criados en granjas para el consumo por humanos) y/o importancia social (animales mantenidos como mascotas o en zoológicos) para humanos, por ejemplo, carnívoros diferente a humanos (tales como gatos y perros), porciones (cerdos, puercos y jabalís silvestres), rumiantes y ganado (tales como ganado vacuno, bueyes, ovejas, jirafas, venados, cabras, bisontes, y camellos) y caballos. También se contempla el tratamiento de aves, que incluyen aquellas clases de aves que están en peligro o se mantienen en zoológicos, así como aves de corral y más particularmente aves de corral domesticadas o aves domésticas, tales como pavos, pollos, patos, gansos, aves de corral de Guinea, y los similares, ya que también son de importancia económica a los humanos. IX.B. Composiciones De acuerdo con los métodos de la presente invención, una composición que se administra para alterar la percepción de sabor en un sujeto comprende una cantidad efectiva de un modulador T2R76. Un modulador T2R76 puede comprender cualquiera de los tipos de sustancias de prueba descritas en la presente en lo anterior. Los moduladores T2R76 identificados como se divulga en la presente se pueden utilizar para preparar una composición para el uso oral, que incluyen pero no se limita a alimentos, bebidas, lavados orales, dentífricos, cosméticos, y productos farmacéuticos, por ejemplo cualquiera de aquellos compuestos listados en la presente enseguida. Los moduladores T2R76 también se pueden utilizar como aditivos para alterar el sabor de una composición que es posible pero no indeseable de uso oral, por ejemplo limpiadores domésticos, venenos, etc. Alimentos representativos que tienen un sabor indeseable o amargo incluyen, pero no se limitan a, frutas cítricas tales como toronja, naranja, y limón; vegetales tales como tomate, pimiento, apio, melón, zanahoria, papa y espárrago; materiales de condimento o de sabor tales como sabor, salsas, salsa de soya y pimiento rojo, alimentos que se originan de soya; alimentos de emulsión tales como crema, aderezos, mayonesa, y margarina; productos marinos procesados tales como carne de pescado, carne de pescado molida y huevos de pescado; nueces tales como cacahuates; alimentos fermentados tales como soya fermentada; carnes y carnes procesadas; pepinillos, fideos; sopas que incluyen sopas en polvo; productos lácteos tales como queso; panes y pasteles; confiterías tales como dulces, goma de mascar, y chocolates; y alimentos específicamente preparados para la salud. Cosméticos representativos que inducen el sabor amargo (por ejemplo, lociones de la piel, cremas, paquetes faciales, lápices labiales, maquillajes, preparaciones para afeitarse, lociones después de afeitar, espumas limpiadoras, y geles limpiadores) incluyen pero no se limitan a aquellas composiciones que incluyen surfactantes tales como alquil sulfato de sodio y monoalquil fosfato de sodio; fragancias tales como metanol, linalol, alcohol feniletilico, propionato de etilo, geraniol, acetato de linalilo y acetato de bencilo; antimicrobianos tales como metilparabeno, propilparabeno y butilparabeno; humectantes tales como ácido láctico y lactato de sodio; agentes desnaturalizantes de alcohol tales como octaacetato de sacarosa y brucina: y astringentes tales como lactato de aluminio. Productos farmacéuticos representativos que tienen un sabor amargo incluye acetaminofen, terfenadina, guaifenesina, trimetoprima, prednisolona, ibuprofeno, prednisolona fosfato de sodio, metacolina, neostigmina, epinefrina, albuterol, pseudoefedrina clorhídrica, difenidramina, maleato de clorfeniramina, fenotiazina, clorpromazina, cloroiazepoxido, amitriptilina, barbituratos, difenilhidantoina, cafeína, morfina, demerol, codeina, lomotil, lidocaina, ácido salicilico, sulfonamidas, cloroquina, preparaciones de vitamina, minerales y penicilinas. Los moduladores también se pueden administrar como parte de alimento preparado, bebida, lavado oral, dentífrico, cosmético, o fármaco. Para preparar una composición a la administración de un sujeto, un modulador T2R76 se puede mezclar con un compuesto cuyo sabor va a ser modulado en una cantidad que comprende aproximadamente 0.001% a aproximadamente 10% en peso, preferiblemente de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 8% en peso, más preferiblemente de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5% en peso, y mucho más preferiblemente de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 2% en peso. Formulaciones adecuadas incluyen soluciones, extractos, elixires, esencias, jarabes, suspensiones, polvos, granulos, cápsulas, pelotillas, tabletas, y aerosoles. Opcionalmente, una formulación puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión, un solubilizante, un agente espesante, un estabilizantes, un conservador, un sabor, un colorante, un edulcorante, un perfume, una combinación de los mismos. Los moduladores T2R76 y composiciones se pueden presentar en contenedores de dosis unitaria o multidosis sellados, tales como ampolletas y frasquitos de vidrio. IX. C. Administración Los moduladores T2R76 se pueden administrar directamente a un sujeto para la modulación de la percepción de sabor. Preferiblemente, un modulador de la invención se administra oral o nasalmente. De acuerdo con los métodos de la presente invención, una cantidad efectiva de un modulador T2R76 se administra a un sujeto. El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de una composición suficiente para modular la activación T2R76 y/o para modular la percepción de sabor amargo. Una cantidad efectiva se puede variar para administrar una cantidad de un modulador T2R76 que es efectivo para lograr la percepción de sabor deseada. El nivel de dosificación seleccionado dependerá sobre una variedad de factores que incluyen la actividad del modulador T2R76, la formulación, combinación, otras composiciones (por ejemplo, alimento, fármacos, etc.), el uso propuesto (por- ejemplo, como aditivo de alimento, dentífrico, etc.), y la condición física e historial médico previo del sujeto que es tratado. En una cantidad o dosis efectiva se puede determinar fácilmente utilizando ensayos m vivo de percepción de sabor como son conocidos en la técnica. Los métodos representativos para analizar la percepción de sabor se describen en el Ejemplo 4. Ejemplos Los siguientes Ejemplos han sido incluidos para ilustrar modos de la invención. Ciertos aspectos de los siguientes ejemplos se describen en términos de técnicas y procedimientos encontrados o contemplados por los presentes co-inventores para trabajar bien en la práctica de la invención. Aquellos ejemplos ilustran prácticas de laboratorio estándares de los co-inventores . En vista de la descripción presente y el nivel general de habilidad en la técnica, aquellos de habilidad apreciarán que los siguientes ejemplos se proponen ser ejemplares solamente y que, numerosos cambios, modificaciones y alteraciones se pueden emplear sin apartarse del alcance de la invención. Ejemplo 1. Clonación de T2R 76 Humano. Un gel novedoso que codifica un receptor de sabor amargo humano se identificó en las bases de datos de secuencia de genoma humano. El miembro h T2R novedoso, hT2R76 se localiza sobre el cromosoma humano 7. La ubicación cromosomal de la secuencia de DNA T2R76 se determinó mediante la clasificación del sitio de Internet Genomics de la Universidad de California (Santa Cruz, California). Este análisis mostró que el T2R76 se localiza sobre el cromosoma 7 en la región 144062692-144063648. El sabor amargo de ciertos compuestos, de tales feniltiocarbarnato, han sido enlazados genéticamente a los cromosomas 5 y 7. (Guo y colaboradores, (2001) Ann Hum Biol 28:111-42). Así, el T2R76 es predicho a ser involucrado en el enlace y reconocimiento de ciertos saborizantes amargos. El T2R 76 humano se identificó inicialmente mediante la búsqueda de secuencia reiterada de las bases de datos de secuencia de DNA con las secuencias hT2R previamente descritas. Una estructura de lectura abierta de longitud completa que codifica el hT2R76 luego se aisló mediante la amplificación de PCR del DNA genómico. La secuencia de aminoácidos de hT2R76 se derivó mediante la traducción conceptual de la estructura de lectura abierta correspondiente. El nucleótido hT2R76 y las secuencias de aminoácidos se exponen como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente . La estructura abierta sin int'rón de hT2R76 codifica unos residuos de los aminoácidos 318 de la proteína receptora putativa en la longitud. Una comparación de la secuencia de la proteina hT2R76 con todas las proteínas conocidas en las bases de datos de secuencias públicas que utilizan el algoritmo BLASTP reveló su homología fuerte a los miembros de la familia receptora amarga de mamífero. Ejemplo 2. Construcción de rhod-hT2R 76. Una técnica de extensión de PCR de sobreposición de puente se utilizó para generar quimeras rhod-hT2R 76, que contiene los primeros 38 aminoácidos del rodopsina bovino y la estructura con el T2R 76 humano que codifica las secuencias como describe Chandrashekar y colaboradores, (2000) Cell 100:703-711. El gen rhod-h T2R 76 quimérico luego se clonó en el vector pFastBac-1 , y los baculovirus que contienen el hT2R76 marcado con rodopsina se produjo utilizando el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen Corporation of Carlsbad, California, Estados Unidos de América) . La expresión de h T2R 76 se confirmó mediante el inmunomanchado que utiliza anticuerpos de marca antirosopsina (136-30). Las células Sf9 infectadas con baculovirus que codifica el hT2R76 producen una proteína del peso molecular esperado (-35 kDa). Ejemplo 3. Acoplamiento de Proteína G In Vi tro de T2R76. Un bácmido infeccioso que codifica el rhod-hT2R76 se prepara como se describe en el Ejemplo 2. Células larvales de insectos se infectan durante 60 horas con bácmido recombinantes y las membranas se preparan como se describe por Ryba & Trindelli (1995) J Biol Chem 270 : 6757-6767.

Proteínas periféricas se remueven mediante tratamiento con urea 5M y las membranas se resuspenden en HEPES 1 OmM de pH 7.5, EDTA 1 mM, y DTT 1 mM. La expresión de rh?d-hT2R76 se puede estimar mediante el manchado de Western que utiliza el anticuerpo monoclonal B6-30. Proteínas G se aislan, por ejemplo como se describe por Hoon y colaboradores, (1995) Cell 96 629-636 y por Ryba & Trindelli (1995) J Biol Chem 270 : 6757-6767. El intercambio catalizado con receptor de GDP para GTP?S gustducina se mide en la presencia de rhod-hT2R76 10 nM, GDP 100 µtM, y Gßl?8 20 µM. El intercambio de GDP-GTP?S sobre las proteínas G promiscuas (por ejemplo, Gal5 o transducina) se realiza como se describe en la solicitud de patente norteamericana No. de Seria 60/372089. Las mediciones hechas en puntos de tiempo de aproximadamente 15-60 minutos reflejan la proporción inicial del enlace GTP?S. Ejemplo 4. Ensayos de Formación de Imágenes de Calcio que Detectan los ligandos T2R76 Específicos En este ejemplo los inventores muestran que el T2R76 humano sujeto reconoce los ligandos amargos de brucina y propiltiouracilo (PROP) (Ver estructuras compuestas en la Figura 1) . La brucina es un alcaloide amargo tóxico aislado de semillas de Strchnos, con un umbral de sabor amargo de 0.01 mM. El PROP es un químico amargo con un lumbral de sabor amargo de 0.01 nM para los probadores de PROP.

La activación de hT2R76 por la brucina y PROP se miden en un ensayo basado en células que detecta cambios en la concentración de calcio intracelular. Esencialmente, las células de riñon embriónicas humanas se siembran en placas de cultivo de tejido de 48 cavidades. 24 horas después, las células se transfectan transientemente con un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico hT2R76, y un plásmido que expresa una proteina G quimérica (G16gust44). Después de otras 24 horas, las células se incuban con un tinte fluorescente específico para calcio (Fluo-4; Sondas Moleculares) que proporciona un método rápido, simple y confiable para detectar cambios en el calcio dentro de la célula. La activación del T2R induce una' cascada de señalización, la cual conduce a la activación de PLC y un incremento subsecuente en la concentración de de calcio intracelular. Esto incrementa en los cambios de concentración de calcio las propiedades fluorescentes del calcio dentro de las células. Estos cambios se monitorean utilizando la microscopía fluorescente y el software específicamente diseñado (Imaging Workbench, Axon). Utilizando esta metodología se mostró que tanto que el PROP como la brucina activan específicamente el T2R76 en las células HEK-293 que dan por resultados incrementos en los niveles de calcio intracelulares. Mediante las células de control de contraste también que expresan el receptor T2R76, se pusieron en contacto con algunos otros ligandos amargos, es decir, L-triptofano, salicina, y N-feniltiourea no dieron por resultado incrementos detectables en los niveles de calcio intracelulares. (Ver datos de formación de imágenes contenidos en la Figura 2) . Así, ha sido mostrado que dos ligandos amargos diferentes, PROP y brucina, un compuesto relacionado a estricnina, activan específicamente T2R76 que confirma que T2R76 es un receptor de sabor humano que se involucra activamente en la transducción de sabor amargo. Ejemplo 5: Estudio de Sabor. Se conduce un estudio de aceptación de sabor que utiliza una composición de prueba que comprende un modulador T2R76 identificado como se divulga en la presente. Una composición de control que carece del modulador T2R76, pero que de otra manera sustancialmente similar o idéntico de la composición de prueba, también se utiliza. El estudio emplea un diseño cruzado de dos rutas, con todos los sujetos que evalúan ambas composiciones, que se administran en una o más de las mismas cantidades o dosis. Las composiciones de prueba y de control se evalúan sobre un solo día de estudio. La secuencia para administrar las composiciones de prueba y de control se dan al zar entre los sujetos. Todos los sujetos enrolados completan todos los aspectos del protocolo de estudio. Los sujetos responden a cada una de las composiciones de prueba y de control que utilizan registros de sabor ordinales (por ejemplo, l=muy amargo, 2=amargo, 3=indiférente, 4=que no es amargo, 5=no es amargo en lo absoluto) . Se registran eventos adversos. La efectividad de un modulador T2R76 se determina al medir una diferencia significante en la aceptabilidad de la composición de sabor cuando se compara a la composición de control. Ejemplo 6. Respuesta de hT2R76 a los Compuestos Amargos . Se efectúa un ensayo que enlaza GTP?S utilizando una línea celular de mamífero (HEK293) que expresa hT2R76 así como una linea celular de control que expresa un hT2R diferente (hT2R64) . Estas líneas celulares se ponen en contacto con compuestos amargos que incluyen 6-n-propiltiouracilo (PROP), octaacetato de sacarosa, undacaacetato de rafinosa, (RÚA), glicinato de cobre, denatonio y quinina en concentraciones diferentes que varían de 0.5 a 2 mm. Los resultados de estos ensayos se utilizan para confirmar que el hT2R76 es un receptor de sabor amargo que se activa específicamente mediante estímulos de sabor amargos conocidos. En esta actividad de ensayo que enlaza GTP?S se determina ya se a en la presencia o ausencia de concentraciones especificas de compuestos amargos conocidos. Ejemplo 7. Ensayo de Clasificación de alto rendimiento Utilizando el ensayo de enlace de GTP?S, una librería de más de 15,000 compuestos se clasifica para identificar otros compuestos que activan específicamente hT2R76. La estructura de los compuestos específicos que activan hT276 en este ensayo se comparan a fin de predecir los compuestos que tienen estructura similar que activarán potencialmente el hT2R76. Las librerías de compuestos que tienen estas estructuras similares luego se evalúan en concentraciones diferentes en el mismo ensayo de enlace de GTP?S para identificar estos compuestos que activan el hT2R76. Ejemplo 8. Prueba de Sabor Humana. Los compuestos que activan el hT2R76 en los ensayos de enlace de GTP?S se evalúan den pruebas de sabor humano. Estas pruebas de sabor humanas se realizan en el consentimiento de adultos quienes se les administra oralmente el compuesto identificado en la concentración en la cual activan el hT2R76 in vitro. En estas pruebas de sabor un compuesto identificado (que activa el hT2R76) se disuelve en agua para lograr una concentración de compuesto que activa el hT2R76 en el ensayo de enlace de GTP?S in vitro. En esta prueba de sabor, una muestra de por lo menos 5 personas prueba una serie de soluciones acuosas que contienen un sabor amargo. (En el ejemplo preferido, el compuesto amargo es un agonista T2R76) . Cada una de las personas clasifica el grado de amargura en una escala de magnitud marcada que varia de 0 a 100 (0 es "apenas detectable" y 100 es "imaginable más fuerte"). Enseguida, cada persona prueba una serie de soluciones acuosas que contiene el compuesto amargo y el inhibidor T2R76 y clasifica el grado de amargura para cada muestra. La reactividad del inhibidor T2R76 se mide mediante la reducción en el grado de amargura. Como un medio de comparación, un compuesto amargo conocido (sulfato de quinina) también se prueba y se evalúa para cada sujeto. El resultado de las pruebas de sabor se representa como la clasificación promedio en todos los suj etos . CONCLUSIÓN Los resultados de estos ensayos proporcionan una demostración de que los ensayos de formación de imagen de calcio se pueden utilizar para identificar compuestos amargos que enlazan específicamente a los polipéptidos hT2R76 de acuerdo a la invención y confirman que el hT2R76 es un receptor de sabor amargo en humanos. Por lo tanto, este receptor se puede utilizar en los ensayos de clasificación de acuerdo a la invención para identificar compuestos que modulan, preferiblemente inhiben el sabor amargo asociado con por lo menos el polipéptido receptor T2R76. En este respecto, los compuestos amargos encontraron que enlaza T2R76 incluyen brucina un alcaloide tóxico que ocurre naturalmente encontrado en las semillas de Strychnos, que indican un umbral de sabor amargo de 0.01 M en humanos y PROP un químico amargo con un umbral de sabor amargo de 0.01 mM para los probadores de PROP. Por lo tanto, el T2R76, como se anticipa enlaza a una pluralidad de ligandos amargos y probablemente desempeña un papel funcional en la habilidad de humanos para probar muchos cientos de compuestos amargos diferentes . Los moduladores identificados utilizando los ensayos presentes por lo tanto se pueden utilizar para proporcionar amargura a alimentos y bebidas. Alternativamente, estos compuestos se pueden utilizar como agonistas en ensayos para identificación de bloqueadores y moduladores amargos y otros compuestos amargos. Referencias . 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Además, la descripción anterior es para el propósito de ilustración solamente, y no para el propósito de limitación ia invención que es definida por las reivindicaciones adjuntas en la presente.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico T2R 76 aislada, caracterizada porque comprende: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codi fica el polipéptido contenido en SEQ ID NO : 2 ; (b) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende SEQ ID N0:1; o (c) una molécula de acido nucleico aislada que codifica un polipéptido que posee por lo menos 90% de identidad de secuencia al polipéptido codificado por SEQ ID NO: 1 y el polipéptido que responde específicamente a por lo menos un J gando amargo que enlaza específicamente al polipeptido contenido en SEQ ID NO 2. 2. Una molécula de ácido nucleico T2R76 aislada, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) una molécula de acido nucleico aislada que codifica un polipéptido que contiene el polipéptido comprendido en SEQ ID NO:
2. (b) una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de ácido nucleico contenida en SEQ ID NO: 1; (c) una molécula de acido nucleico aislada que hibpdiza a una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de severidad de lavado representadas por una solución de lavado que tiene menor que aproximadamente concentración de sal 200 M y una temperatura de lavado de mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76 que enlaza específicamente a por lo menos un ligando amargo que enlaza específicamente al polipéptido T2R76 contenido en SEQ ID NO: 2; (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislada de uno de (a) , (b) , y (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) , y (c) anterior.
3. La molécula de ácido nucleico T2R 76 aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; o (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID NO: 1.
4. Un método para detectar una molécula de ácido nucleico T2R 76, el método caracterizado porque comprerde: (a) procurar una muestra biológica que tiene material de acido nucleico; (b) hibpdizar una molécula de ácido nucleico T2R 76 aislada bajo condiciones de hibridación severas a la muestra biológica de (a) , de esta manera formar una estructura doble entre el acido nucleico T2R 76 aislado y un ácido nucleico dentro de la muestra biológica; y (c) detectar la estructura doble de (b) , mediante la cua] una molécula de acido nucleico T2R 76 en la muestra biológica se detecta.
5. Un polipéptido T2R76 aislado, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustanclalmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de acido nucleico de SEQ ID NO: 1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de acido nucleico sustanclalmente idéntica a SEQ ID NO: 1.
6. El polipéptido T2R76 aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; (c) una molécula de ácido nucleico aislada que hibpdiza a una secuencia de ácido nucleico T2R 76 bajo condiciones severas de lavado representadas por una solución de lavado que tiene menor que aproximadamente concentración 200 mM de sal y una temperatura de lavado de mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico asilada de uno de (a) , (b) , y (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) , y (c) anteriores.
7. El polipéptido T2R76 aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 2.
8. Un polipéptido T2R aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se asocia con por lo menos uno de otro polipéptido T2R. 9. El polipéptido T2R aislado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el otro polipéptido
T2R es otro T2R humano.
10. El polipéptido T2R aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el otro T2R humano se selecciona del grupo que consiste de T2R51, T2R54, T2R55, T2461, T2R63, T2R64, T2R65, T2R67, T2R71, T2R75, T2R59 y T2R33 humano.
11. Un método para producir un anticuerpo, caracterizado porque reconoce específicamente un polipéptido T2R76 clonado mediante la secuencia de ácido nucleico aislada de (a), (b) , y (c) citados en la reivindicación 1.
12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido T2R76 aislado comprende ID NO: 2.
13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende preparar un anticuerpo monoclonal .
14. Un anticuerpo, caracterizado porque se produce mediante el método de conformidad con la reivindicación 11.
15. Un método para detectar un nivel de un polipéptido T2R76, el método caracterizado porque comprende: (a) obtener una muestra biológica que tiene material peptídico; (b) detectar un polipéptido T2R76 en la muestra biológica de (a) mediante la reacción inmunoquímica con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, mediante el cual una cantidad de polipéptido T2R76 en una muestra se determina.
16. Un sistema para la expresión heteróloga de un polipéptido T2R76, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido T2R76; y (b) una célula hospedera heteróloga que expresa el polipéptido T2R76.
17. El sistema de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido T2R76 comprende : (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustanclalmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un poLipeptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustanclalmente idéntica a SEQ ID NO: 1.
18. El sistema de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipeptido T2R76 además comprende un polipeptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de acido nucleico aislada de SEQ ID NO: 1; (c) una molécula de ácido nucleico aislada que hibpdiza a una secuencia de ácido nucleico T2R76 ba o condiciones severas de lavado representadas por una solución de lavado que tiene menor que aproximadamente concentración de sal de 200 mM y una temperatura de lavado de mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos de un codón funcionalmente equivalente de la molécula de acido nucleico aislada de uno de (a) , (b) , e (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el acido nucleico aislado de uno de (a), (b) , e (c) anteriores.
19. El sistema de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el polipéptido T2R76 aislado comprende SEQ ID NO: 2.
20. El sistema de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque además comprende un ácido nucleico que codifica otro T2R.
21. El sistema de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula hospedera comprende una célula de mamífero.
22. El sistema de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la célula de mamífero comprende una célula humana.
23. El sistema de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula hospedera además comprende una subunidad de alfa de proteína G capaz de acoplarse a un polipéptido T2R76.
24. EJ sistema de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la subunidad alfa de proteína G comprende una proteína G promiscua.
25. El sistema de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína G promiscua comprende Gal5.
26. El sistema de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la proteina G comprende transducina o gustducina, o una proteína G quimérica.
27. Un método para identificar un modulador de un polipéptido T2R76, el método caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un sistema de expresión recombinante mediante el cual un polipéptido T2R76 se expresa en una célula hospedera heteróloga sola o en combinación con por lo menos uno de otro polipéptido T2R, (b) proporcionar una sustancia de prueba al sistema de (a) ; (c) analizar un nivel o calidad de la función T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba; (d) comparar el nivel o calidad de la función de T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba con un nivel de control o calidad de la función T2R76; y (e) identificar una sustancia de prueba como un modulador T2R76 al determinar un nivel o calidad de la función T2R76 en la presencia de la sustancia de prueba como se cambia signi icantemente cuando se compara el nivel de control o calidad de la función T2R76.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el polipéptido T2R76 comprende: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 1.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido T2R76 además comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID NO: 1; (c) una molécula de ácido nucleico aislada que hibridiza a una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones severas de lavado representadas por una solución de lavado que tiene menor que aproximadamente concentración de sal de 200 mM y una temperatura de lavado de mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos de un codón funcionalmente equivalente de la molécula de ácido nucleico aislada de uno de (a) , (b) , e (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el ácido nucleico aislado de uno de (a), (b) , e (c) anteriores.
30. El sistema de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polipéptido T2R76 aislado comprende SEQ ID NO: 2.
31. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la célula hospedera comprende una célula de mamífero.
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la célula de mamífero comprende una célula humana.
33. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la célula hospedera además comprende una subunidad de alfa de proteina G capaz de acoplarse a un polipéptido T2R76.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la subunidad alfa de proteína G comprende una proteína G promiscua.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína G promiscua comprende Gal 5.
36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la proteína G comprende transducina o gustducina, o una proteína G quimérica.
37. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el ensayo comprende determinar una cantidad de enlace de GTP?S.
38. Un modulador T2R76, caracterizado porque se identifica por el método de conformidad con la reivindicación 27.
39. El modulador T2R76 de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende un modulador seleccionado del grupo que consiste de una proteina, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña.
40. Un método para modular la percepción de sabor amargo en un sujeto, el método caracterizado porque comprende: (a) preparar una composición que comprende un modulador de la reivindicación 38; (b) administrar una dosis efectiva de la composición a un sujeto, mediante la cual la percepción de sabor amargo se alter en el sujeto .
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la composición además comprende un alimento, una bebida, un lavado oral, un dentífrico, un cosmético, o un producto farmacéutico.
42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque además comprende co-administrar la composición que comprende un modulador y una composición seleccionada del grupo que consiste de un alimento, una bebida, un lavado oral, un dentífrico, un cosmético y un producto farmacéutico.
43. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el 'mamífero es un humano.
45. Un método para identificar el modulador de un polipéptido T2R76, caracterizado porque comprende: (a) exponer un polipéptido T2R76 solo o un polipéptido T2R76 expresado en asociación con por lo menos uno de otro polipéptido T2R a una o más sustancias de prueba; (b) analizar el enlace de una sustancia de prueba al polipéptido T2R76 aislado o una combinación de polipéptido T2R76; y (c) seleccionar una sustancia candidato que demuestra el enlace específico al polipéptido T2R76.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el polipéptido T2R76 comprende: (a) un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) un polipéptido sustancialmente idéntico a SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; o (d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 1.
47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el polipéptido T2R76 además comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2; (b) una molécula de ácido nucleico aislada de SEQ ID NO: 1; (c) una molécula de ácido nucleico aislada que hibridiza a una secuencia de ácido nucleico T2R76 bajo condiciones severas de lavado representadas por una solución de lavado que tiene menor que aproximadamente concentración de sal de 200 mM y una temperatura de lavado de mayor que aproximadamente 45°C, y que codifica un polipéptido T2R76; y (d) una molécula de ácido nucleico aislada que difiere mediante por lo menos de un codón funcionalmente equivalente de la molécula de acido nucleico aislada de uno de (a) , (b) , e (c) anteriores en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético, y que codifica un polipéptido T2R76 codificado por el acido nucleico aislado de uno de (a), (b) , e (c) anteriores.
48. Fl sistema de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el polipeptido T2R76 aislado comprende SEQ ID NO: 2.
49. Un modulador T2R76, caracterizado porque se identifica por el método de conformidad con la reivindicación 48.
50. El modulador T2R76 de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque además comprende un modulador seleccionado del grupo que consiste de una proteina, un peptido, un anticuerpo, un acido nucleico y una molécula pequeña .
51. Un método para modular la percepción de sabor amargo en un sujeto, el método caracterizado porque comprende : (a) preparar una composición que comprende un modulador de la reivindicación 49; (b) administrar una dosis efectiva de la composición a un sujeto, mediante la cual la percepción de sabor amargo se alter en el sujeto.
52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la composición además comprende un alimento, una bebida, un lavado oral, un dentífrico, un cosmético, o un producto farmacéutico.
53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque además comprende co-administrar la composición que comprende un modulador y una composición seleccionada del grupo que consiste de un alimento, una bebida, un lavado oral, un dentífrico, un cosmético y un producto farmacéutico.
54. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el modulador T2R76 se selecciona del grupo que consiste de una proteína, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña.
55. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el sujeto es un mamífero. 56. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el mamífero es un humano.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el mamífero es un humano.
57. Un método para reducir la percepción de sabor amargo de un compuesto amargo, el método caracterizado porque comprende co-administrar un inhibidor T2R76 y el compuesto amargo a un sujeto.
58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la co-administración comprende administrar una composición que comprende el inhibidor T2R76 mezclado con el compuesto amargo.
59. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el inhibidor T2R76 además comprende un modulador seleccionado del grupo que consiste de una proteína, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña.
60. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la composición además comprende un alimento, una bebida, un lavado oral, un dentífrico, un cosmético, o un producto farmacéutico.
61. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el mamífero es un humano.
63. Un método para aumentar la percepción de sabor amargo de un compuesto, el método caracterizado porque comprende co-admin Lstrar un agonista T2R76 y el compuesto a un sujeto.
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque al co-administración comprende administrar una composición que comprende el agonista T2R76 mezclado con el compuesto amargo.
65. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el agonista T2R76 además comprende un modulador seleccionado del grupo que consiste de una proteína, un péptido, un anticuerpo, un ácido nucleico y una molécula pequeña.
66. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el mamífero es un humano.
68. Un ensayo para identificar un compuesto que modula el receptor de sabor T2R76, caracterizado porque comprende : (i) analizar un compuesto para su efecto sobre la activación inducida con PROP o brucina de por lo menos un polipéptido T2R76 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 7; (ii) determinar si el compuesto modula el polipéptido hT2R76 basado sobre su efecto en la activación del polipéptido receptor por la PROP o brucina.
69. El ensayo de conformidad con la reivindicación 68 caracterizado porque el polipéptido hT2R76 es por lo menos 90% idéntico al polipéptido contenido en SEQ ID NO: 2.
70. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 posee por lo menos 95% de identidad de secuencia al polipéptido contenido en SEQ ID NO: 2.
71. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 posee por lo menos 96% de identidad de secuencia al polipéptido contenido en SEQ ID NO: 2.
72. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 posee por lo menos 97% de identidad de secuencia al polipéptido contenido en SEQ ID NO: 2.
73. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 posee por lo menos 98% de identidad de secuencia al polipéptido contenido en SEQ ID NO: 2.
74. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 posee por lo menos 99% de identidad de secuencia al polipéptido contenido en SEQ ID NO: 2.
75. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 tiene la secuencia contenida en SEQ ID NO: 2.
76. El ensayo de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el polipéptido T2R76 se fusiona a otro polipéptido.
77. El ensayo de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque es un polipéptido de rodopsina.
78. El ensayo de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la rodopsina es rodopsina humana, de roedor o bovino.
79. El ensayo de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque el polipéptido fusionado es un polipéptido detectable.
80. El ensayo de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido fluorescente verde.
81. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 se expresa en una membrana de célula aislada.
82. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 se expresa mediante una célula intacta.
83. El ensayo de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque la célula es una célula eucariótica.
84. El ensayo de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque la célula es una célula de mamífero, de anfibio, de insecto o de levadura.
85. El ensayo de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque la célula se selecciona del grupo que consiste de células HEK293, BHK, COS, HEK293T, CHO y de Xenopus .
86. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, es un ensayo fluorométrico .
87. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque es un ensayo de enlace.
88. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, porque detecta el efecto del compuesto sobre la concentración de ion intracelular,
89. El ensayo de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el ion es sodio o calcio.
90. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque detecta el efecto del compuesto sobre el potencial de la membrana celular.
91. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque detecta el efecto del compuesto sobre la transcripción del polipéptido T2R76.
92. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque se selecciona para compuestos que bloquean la interacción del polipéptido T2R76 con PROP o brucina.
93. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque detecta el efecto del compuesto sobre cAMP, cGMP o IP3.
94. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque detecta cambios en el calcio utilizando un tinte fluorescente especifico de calcio o sodio .
95. El ensayo de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el tinte es Fluo-3, Fluo-4 o Fura-2.
96. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el polipéptido T2R76 está contenido en solución.
97. El ensayo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido T2R76 se une a un sustrato de fase sólida.
98. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque es un ensayo de clasificación de alto rendimiento.
99. El ensayo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque clasifica una librería de compuestos estructuralmente diversos.
100. El ensayo de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque clasifica una librería de compuestos estructuralmente relacionados.
101. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el receptor se expresa por una célula HEK-293.
102. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la célula expresa una proteína G que se acopla funcionalmente con el polipéptido T2R76.
103. El ensayo de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque la proteína G es transducina, gustducina, Galfa 15, Galfa 16, o una quimera de los mismos.
104. El ensayo de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque la proteína G es gust44Galfa 16.
105. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque detecta el efecto sobre las caracteristicas espectroscópicas, característica hidrodinámica o solubilidad
106. El ensayo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque es un ensayo de polarización de fluorescencia .
107. El ensayo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque detecta el efecto del compuesto sobre el complejo del polipéptido T2R76 con una proteína G.