MX2007015716A

MX2007015716A - Polipeptidos relacionados con tension de proteina cinasa similar a lecitina y metodos para su uso en plantas.

Info

Publication number: MX2007015716A
Application number: MX2007015716A
Authority: MX
Inventors: Damian Allen; Nocha Van Thielen; Oswaldo Da Costa E Silva; Lori V Mills; Pilar Puente
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2008-02-15
Also published as: CN101203603B; US7880055B2; WO2006134162A3; CA2612016A1; EP1896575A2; EP1896575B1; CN101203603A; AR053638A1; WO2006134162A2; AU2006259019A1; US20090158454A1; AU2006259019B2; BRPI0611879A2

Abstract

Una planta transgenica transformada por un acido nucleico que codifica un Polipeptido relacionado con tension de proteina cinasa similar a lectina (LPKSRP), en donde la expresion de la secuencia de acido nucleico en la planta da como resultado crecimiento de planta incrementado y/o tolerancia incrementada a una tension ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la planta. Tambien se proveen productos agricolas incluyendo semillas, producidos por las plantas transgenicas. Tambien se proveen LPKSRP aislados, y acido nucleico aislado que codifica LPKSRP, y vectores y celulas huesped que contienen el ultimo.

Description

POLIPEPTIDOS RELACIONADOS CON TENSIÓN DE PROTEINA CIMASA SIMILAR A LECITINA Y MÉTODOS PARA SU USO EN PLANTAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención Esta invención se refiere generalmente a polipéptidos que codifican secuencias de ácidos nucleicos que se asocian con respuestas de tensión abiótica y tolerancia de tensión abiótica en plantas. En particular, esta invención se refiere a polipéptidos que codifican secuencias de ácidos nucleicos que confieren a la planta desarrollo incrementado y/o que confieren a las plantas tolerancia incrementada a sequedad, frío, y/o a sales.

Técnica Antecedente Las tensiones ambientales abióticas, tales como tensión por sequedad, tensión por salinidad, tensión por calor, y tensión por frío son actores limitantes principales de crecimiento de plantas y productividad. Las pérdidas de cultivos y pérdidas de productividad de cultivos de principales tales como soya, arroz, maíz, algodón y trigo ocasionado por estas tensiones representa un factor económico y político importante y contribuye a la escasez alimenticia en muchos países en desarrollo. Normalmente las plantas se exponen durante su ciclo de vida a condiciones de contenido de agua ambiental. La mayoría de las plantas han desarrollado e$trategias para protegerse así mismos contra las condiciones de desecación. Sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son muy grandes, son profundos los efectos sobre el desarrollo, crecimiento y producción de la mayoría de plantas de cultivo. La exposición continua a las condiciones de sequía ocasiona mayores alteraciones en el metabolismo de las plantas, lo cual finalmente conduce a muerte celular y consecuentemente a pérdidas de rendimiento. El desarrollo de plantas tolerantes a la tensión es una estrategia que tiene el potencial para resolver o mediar por lo menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias para desarrollar plantas tradicionales al desarrollo de nuevas líneas de plantas que exhiben resistencia (tolerancia) a esos tipos de tensiones son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicos para cruzarse con la línea deseada. Los recursos de plasma germinal limitados para tolerancia a la tensión e incompatibilidad en las cruzas entre las especies de plantas distantemente relacionadas representan problemas importantes encontrados en el desarrollo convencional. Adicionalmente, los procesos celulares conducen a la tolerancia a la sequía, frío y sal en plantas modelo tolerantes a sequía, frío y/o sal son complejos en la naturaleza e implican mecanismos múltiples de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas. Esta naturaleza de múltiples componentes de tolerancia a la tensión solo están hechos para desarrollar tolerancia en gran parte poco exitosa, sino también se limita a la capacidad de tratar genéticamente las plantas tolerantes a la tensión usando métodos biotecnológicos . Las tensiones por sequía, tensiones por calor, tensiones por frío y tensiones por sales tienen un tema común importante para crecimiento de plantas y es disponibilidad de aCjua. Como se trató antes, la mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra condiciones d desecación; sin embargo, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son muy grandes, son profundos los efectos sobre el desarrollo, crecimiento y producción de plantas de la mayoría de plantas de cultivo. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles a concentraciones de sales superiores en el suelo. Debido al alto contenido de sales en algunos suelos da como resultado que menos agua esté disponible para el consumo celular, la alta concentración de sales tiene un efecto en plantas similar al efecto de sequía en plantas. Adicionalmente, bajo las temperaturas de congelación, las células de plantas pierden agua como resultado de la formación de hielo que inicia en el apoplasto y retira el agua del simplasto. Un mecanismo de respuesta molecular de plantas para cada una de estas condiciones de tensión son comunes, y las proteínas cinasas, tales como proteínas cinasas similares a lectina, juegan un papel esencial en estos mecanismos moleculares. Las proteínas cinasas representan una superfamilia y los miembros de esta superfamilia cataliza la transferencia reversible de un grupo de fosfatos de ATP a cadenas laterales de los aminoácidos serina, treonina y tirosina en polipéptidos blanco. Las proteína cinasas son elementos primarios para señalar los proceso sen plantas y se ha reportado que juegan papeles cruciales en la percepción y transducción de señales que permiten que una célula (y la planta) respondan a estímulos ambientales. Un tipo de proteína cinasas es la proteína cinasa similar a lectina (LLPK, por sus siglas en inglés) o cinasa receptora de lectina. Los aspectos estructurales de este tipo de proteína cinasa incluyen una secuencia de señales que se dirige a membranas terminales en amino, un dominio e^tracelular similar a lectina de leguminosas, un dominio de expansión de membrana sencillo, y un dominio catalítico de cinasa de proteína serina/treonina característico. Se ha reportado que los miembros de esta familia están implicados en la comunicación de célula a célula, defensa contra depredadores y patógenos y desarrollo y reproducción de plantas (Barre y otros, 200, Crit. Rev. Plant. Sci. 21:379-399) . Cuarenta y dos receptores de cinasas de lectina putativos y nueve secuencias de lectina de leguminosas soluble se han identificado en Arabidopsis. Aunque se han caracterizado algunos genes que están implicados en respuesta a la tensión y agua usan eficiencia en plantas, la caracterización y clonación de genes de plantas que confieren tolerancia a la tensión y eficiencia de uso de agua sigue estando incompleta en gran parte y fragmentada. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que la tensión por sequía y sales en algunas plantas puede deberse a efecto de genes aditivos, en contraste con otra investigación que indica que los genes específicos se activan transcripcionalmente en tejido vegetativo de plantas bajo condiciones de tensión osmótica. Aunque generalmente se subone que las proteínas inducidas por tensión tienen un papel en la tolerancia, aún falta eficiencia directa, y se desconocen las funciones de muchos genes que responden a la tensión. Hay un intercambio fisicoquímicamente restringido I fundamental, en todos los organismos fotosintéticos, entre la absorción de C02 y pérdida de agua (Taiz y Zeiger 1991 Plant Physiology, Benjamin/Cummings Publishin Co., p94). El C02 necesita ser una solución acuosa para la acción de enzimas de fijación de C02 tal como Rubisco (Ribulosa 1, 5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa) y PEPC (fosfoenolpiruvato carboxilasa) . Así como se requiere una superficie de células húmeda para la difusión de C02, la evaporación inevitablemente se presentará cuando la humedad está por debajo de 100% (Taiz y Zeiger 1991 Plant Physiology, Benjamin/Cummings Publishing Co p257) . Las plantas tienen numerosos mecanismos fisiológicos para reducir pérdida de agua (v.gr., cutículas cerosas, cierre estomatal, hojas finas, huesos estomales hundidos) . Dado que estas barreras no discriminan entra flujo de agua y C02, estas medidas de conservación de agua también actuarán para incrementar la resistencia a la absorción a C02 (Kramer 1983 Water Relatins of Plants, Academic Press p305) . La absorción de C02 fotosintética ser requiere absolutamente para crecimiento de plantas y acumulación de biomasa en plantas fotoautotróficas, Eficiencia de Uso de Agua (WUE, por sus siglas en inglés) es u? parámetro usado frecuentemente para calcular el intercambio entre el consumo de agua y absorción de C02/crecimiento/Kramer 1983 Water Relatins of Plantas Academic Press p405) . WUE se ha definido y medido de múltiples formas. Un enfoque es calcular la relación del peso seco de plantas completas, al peso de agua consumida por la planta a través de su vida (Chu y otros, 1992 Oecologia 89:580). Otra variación es usar un intervalo más corto de tiempo cuando se mide la acumulación de biomasa y uso de agua (Mian y otros 1998 Amer J Bot 81:943). WUE también se ha definido como la relación de absorción de C02 a pérdida de vapor de agua de una hoja o porción de una hoja, medido con frecuencia durante un período de tiempo corto (Segundos/minutos) (Kramer 1983 Water Relations of Plants, Academic Press p406) . La relación de 13C/12C fijados en el tejido de plantas, y medido con un espectrómetro de masas de relación de isótopos, también se han usado para calcular WUE en plantas usando fotosíntesis de C3 (Martin y otros 1999 Crop Sci. 1775) . Un incremento en WUE es informativo alrededor de la eficiencia relativamente mejorada de crecimiento y consumo de agua, pero propiamente no se describe cual de estos dos proceso han cambiado (o ambos) . Para seleccionar rasgos para mejorar cultivos, un incremento en WUE debido a una disminución en uso de agua, sin un cambio en el crecimiento podría tener un mérito particular en un sistema agrícola irrigado en donde son altos los costos de consumo de agua. Un incremento en WUE impulsado principalmente por un incremento en crecimiento sin un salto correspondiente en uso de agua podría tener aplicación a todos los sistemas agrícolas. En muchos sistemas agrícolas en donde no se limita el suministro de agua, un incremento en el crecimiento, aún si viene a e pensas de un uso de agua incrementado (es decir, sin cambio en WUE), también podría incrementar la producción. Por lo tanto, se requieren nuevos métodos para incrementar WUE y acumulación de biomasa para mejorar la productividad agrícola. A medida de WUE integra muchos procesos fisiológicos que se refieren a metabolismo primario y uso de agua, normalmente hay una característica altamente poligénica con un gran genotipo por interacción ambiental (Richards y otros 2002 Crop Sci 42:111). Por estas y otras razones han tenido éxito algunos intentos para seleccionar cambios de WUE en programas de desarrollo tradicional. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar los genes expresados en plantas tolerantes a la tensión y plantas que son eficientes en uso de agua que tienen la capacidad de conferir tolerancia a la tensión y eficiencia de uSo de agua a su planta huésped y otras especies de plantas. Las plantas tolerantes a tensión recién generadas tendrán muchas ventajas, tales como una escala incrementada en la cual las plantas de cultivos se cultivan, mediante por ejemplo, disminución de requerimientos de agua de las especies de plantas. Otras ventajas convenientes incluyen resistencia incrementada para cargarse, la flexión de los brotes o tallos en respuesta al viento, lluvia, plagas o enfermedad.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención cumple en parte la necesidad de identificar nuevas secuencias únicas capaces de conferir tolerancia a tensión a plantas por la sobre-expresión. La presente invención describe un género novedoso de Polipéptidos Relacionados con Tensión de Proteína Cinasa similar a lectina (LPKSRP, por sus siglas en inglés) y LPKSRP que codifica ácidos nucleicos que son importantes para modular una respuesta de las plantas a una tensión ambiental. Más particularmente, la sobre-expresión de estos LPKSRP que codifican ácidos nucleicos en una planta da como resultado el crecimiento incrementado de las plantas y/o tolerancia incrementada a una tensión ambiental. Por lo tanto, la presente invención incluye una célula de planta aislada comprendiendo un LPKSRP que codifica ácido nucleico, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de plantas da como resultado el crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la célula de plantas. De referencia, LPKSRP es de Physcomitrella patens. A saber, en la presente se describe la Proteína Cinasa similar a Lectina-1 (PpLLPK-1, por sus siglas en inglés) de Physcomitrella patens. La invención provee en algunas modalidades que LPKSRP y ácido nucleico de codificación son aquellos que se encuentran en los miembros del género Physcomitrella. En otra modalidad preferida, la invención provee que las plantas que sobre-expresan LPKSRP demuestran un incremento en crecimiento. En una modalidad preferida, el incremento en crecimiento de plantas se debe al incremento de plantas en Eficiencia de uso en Agua (WUE) , comparado con una variedad tipo silvestre de la planta. En otra modalidad preferida, la invención provee las plantas que sobre-expresan LPKSRP demuestran Peso Seco (DW, por sus siglas en inglés) de plan tas incrementado, comparado con una variedad tipo silvestre de la planta. En otra modalidad, la invención provee que las plantas que sobre-expresan LPKSRP demuestran tolerancia incrementada a una tensión ambiental, comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención provee que la tensión ambiental puede ser tensiones por salinidad, sequía, temperatura, metal, químicos, patógenos y oxidativa, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, la tensión ambiental pueden seleccionarse de uno o más del upo que consiste de sequía, alto contenido de sales y baja temperatura . La invención además provee una semilla producida por una planta transgénica transformada por un LPKSRP que codifica ácido nucleico, en donde la planta se desarrolla para crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la planta. En una modalidad preferida, LPKSRP que codifica ácido nucleico es como se describe más adelante. La invención además provee un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas descritas como se describe más adelante. La invención provee además un LPKSRP que codifica ácido nucleicos, en donde el ácido nucleico que codifica a LPKSRP codifica un LPKSRP como se describe más adelante. La invención además provee un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico que codifica LPKSRP como se describe más adelante, en donde la expresión del vector en una célula huésped da como resultado el crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada de las plantas a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la célula huésped. La invención provee además una célula huésped que contiene el vector y una planta que contiene la célula huésped. La invención además provee un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica LPKSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado el crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada de las plantas a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la planta que comprende: (a) transformando una célula de planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica LPKSRP; y (b) que genera de la célula de la planta un a planta transgénica con crecimiento incrementado y/o una tolerancia incrementada a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de a planta. En modalidades preferidas, LPKSRP y ácido nucleico que codifica LPKSRP son como se describe más adelante. La presente invención provee además un método para identificar un LPKSRP novedoso, comprendiendo (a) elevar una respuesta de anticuerpos específico a un LPKSRP, o fragmento del mismo, como se describe más adelante; (b) tamizar material de LPKSRP putativo con el anticuerpo, en donde la unión específica del anticuerpo al material indica la presencia de un LPKSRP potencialmente novedoso; y (c) identificar del material unido un LPKSRP novedoso en comparación con LPKSRP conocido. Alternativamente, la hibridización con sondas de ácido nucleico como se describe más adelante se pueden usar para identificar ácidos nucleicos de LPKSRP novedosos. La presente invención provee también métodos para modificar tolerancia al crecimiento y/o tensión de una planta que comprende, modificar la expresión de un ácido nucleico de LPKSRP en la planta, en donde LPKSRP es como se describe más adelante. La invención provee que este método puede realizarse de manera que la tolerancia de crecimiento y/o tensión de las plantas se incrementa o disminuye. Preferiblemente, la tolerancia de crecimiento y/o tensión de plantas se incrementa en una planta vía la expresión creciente de un ácido nucleico de LPKSRP.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 1 La Fig. 1 muestra la secuencia de ADNc de PpLLPK-1 de Physcomitrella patens. i La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de PpLLPK-1 de Physcomitrella patens. | La Figura 3 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteína cinasa similar a lectina PpLLPK-1 de Physcomitrella patens con las secuencias de aminoácidos de cinco proteínas cinasas conocidas. La figura también indica la secuencia consensual de una proteína cinasa similar a lectina basada en las secuencias alineadas. La fuente blanca sobre negro son residuos consensúales derivados de¡ un bloque de residuos similares en una posición dada. La fuente negra sobre gris son aminoácidos consensúales o sigilares en una posición con un consenso de residuos en por ! lp menos el 50% de las secuencias. Ningún residuo similar en una posición dada se identifica como fuente negra sobre bl !anco. i La Figura 4 muestra una alienación de la secuencia de aminoácidos de de la proteína cinasa similar a lectina PpLLPK-1 de Physcomitrella patens con cinco secuencias de aminoácidos identificadas en una investigación de una base de datos de secuencia de patentes. La figura también indica la secuencia consensual de una proteína cinasa similar a lectina basada en las secuencias alineadas. La fuente blanco en negro son residuos consensúales derivados de un bloque de residuos similares en una posición dada. La fuente negra en gris es consensual o los aminoácidos similares en una posición con un consenso de residuos en por lo menos el 50% de las secuencias. Ningún residuo similar en una posición dada se identifica como fuente negra sobre blanco. La Figura 5 muestra la Tabla 7, las plantas de control solamente en el vector bajo las condiciones de ciclos con buena cantidad de riego y sequía. La Figura 6 muestra la secuencia de ADN de promotor para la expresión constitutiva en arroz. La Figura 7 muestra el vector de expresión p074 para la expresión constitutiva en arroz.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se puede entender más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en la presente. Sin embargo, antes de que se describan los compuestos, composiciones y métodos presente, se deberá entender que esta invención no se limita a los ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos de células específicos, células huésped específicas, condiciones específicas, o métodos específicos, etc. como pudiera, desde luego, variar y las numerosas modificaciones y variaciones de la presente serán evidentes para los» expertos en la materia. También se deberá entender que la terminología usada en la presente es para los fines de describir modalidades específicas solo no se pretende que se limiten. En particular, la designación de la secuencias de aminoácidos como polipéptido "Polipéptidos Relacionados con Tensión de Proteína Cinasa similar a Lectina" (LPKSRP) , de ninguna manera limita la funcionalidad de las secuencias. La presente invención describe un género novedoso de LPKSRP y ácidos nucleicos que codifican LPKSRP que son importantes para modular el crecimiento y/o respuesta de una planta a una tensión ambiental. Más particularmente, la sobre-expresión de estos ácidos nucleicos que codifican LPKSRP en una planta da como resultado el crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada de una planta a una tensión ambienta. Un miembro representativo del género de LPKSRP es PpLLPK-1. En una modalidad preferida, todos los miembros del género son proteína cinasas similares a lectina biológicamente activas. Consecuentemente, la presente invención abarca secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de LPKSRP y su uso para incrementar el crecimiento y/o tolerancia de una planta a una tensión ambiental. En una modalidad, las secuencias de LPKSRP son de un aplanta, preferiblemente una planta Physcomitrella, y más preferiblemente una planta de Physcomitrella patens. En otra modalidad, las secuencias de LPKSRP incluyen PpLLPK-1 (SEC ID NOS: 1 y 2 ) . La secuencia de aminoácidos de LPKSRP de Physcomitrella patens descrita tiene identidad porcentual importante para las proteína cinasas como lectina como se indica más adelante. La presente invención provee una célula de plantas transgénicas transformada por un ácido nucleico que codifica LPKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la célula de plantas da como resultado el crecimiento incrementado de la planta y/o tolerancia incrementada a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la célula de la planta. La invención además provee partes de plantas transgénicas y plantas transgénicas que contienen las células de plantas descritas en la presente. Las partes de plantas incluyen, pero no se limitan a, tallos, raíces, óvulos, estambres (órganos masculinos) , hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas y similares. En una modalidad, la planta transgénica es masculina estéril. También se provee una semilla de planta producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico de codificación de LPKSRP, y en donde la planta es desarrollada realmente para crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la planta. La invención además provee una semilla producida por una planta transgénica que expresa un LPKSRP, en donde la semilla contiene LPKSRP, y en donde la planta es de desarrollo real para crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada a una tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la planta. La invención además provee un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas, partes de plantas, y semillas de plantas descritas más adelante. Los productos agrícolas incluyen, pero no se limitan a, extractos de plantas, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, grasas, aceites polímeros, vitaminas, y similares. Como se usa en la presente, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparte características constantes que las separan de la forma normal y de otras variedades posibles dentro de tales especies. Mientras que tiene por lo menos una característica distintiva, también se caracteriza una variedad por alguna variación entre individuos dentro de la variedad, basado principalmente en la segregación Mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones futuras. Una variedad se considera "de desarrollo real" para un rasgo particular si es genéticamente homocigoto para dicho rasgo al grado que, cuando la variedad de desarrollo reales autopolinado, no se observa una cantidad importante de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo surge de la expresión transgénica de una o más secuencias de ADN introducidas en una variedad de plantas. La presente invención describe para el primer tiempo que LPKSRP de Physcomitrella patens PpLLPK-1 es útil para incrementar un crecimiento y/o tolerancia de plantas a una tensión ambiental. Como se usó en la presente, el término polipéptido se refiere a una cadena de por lo menos cuatro aminoácidos unidos por los enlaces de péptidos. La cadena puede ser lineal, ramificada, circular, o sus combinaciones. Consecuentemente, la presente invención provee LPKSRP aislado seleccionado de PpLLPK-1, y homólogos del mismo. En modalidades preferidas, LPKSRP incluye el polipéptido Proteína Cinasa similar a Lectina 1 de Physcomitrella patens (PpLLPK-l) como se definió en SEC ID NO: 2; y homólogos y ortólogos del mismo. Los homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos se definen en seguida. El LPKSRP de la presente invención preferiblemente se producen por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido se clona en un vector de expresión (como se describe más adelante) , el vector de expresión se introduce en una célula huésped (como se describe más adelante) y LPKSRP se expresa en la célula huésped. LPKSRP puede aislarse de las células por un esquema de purificación apropiado que usa técnicas de purificación de polipéptidos normales. Para los fines de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere aun polinucleótido que ha sido alterado, redispuesto, o modificado por ingeniería genética. Ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, y polinucleótidos que están ligados o unidos a secuencias heerólogas. El término "recombinante" no se refieren a alteraciones a polinucleótidos que resultan de eventos que se presentan en la naturaleza, tal como mutaciones espontáneos. Alternativo a la expresión recombinante, un LPKSRP, o péptido del mismo, puede sintetizarse químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos normales. Además, LPKSRP nativo puede aislarse de células (v.gr., células de Physcomitrella patens), por ejemplo usando un anticuerpo anti-LPKSRP, que se puede producir por técnicas normales usando un LPKSRP o fragmento del mismo. Como se usa en la presente, el término "tensión ambiental" se refiere a condiciones subóptimas asociadas con tensiones por salinidad, sequía, temperatura, metales, químicos, patogénicos y oxidativas, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, la tensión ambiental puede seleccionarse de uno o más del grupo que consiste de salinidad, sequía o temperatura o combinaciones de los mismos, y en particular, se puede seleccionar de uno o más del grupo que consiste de alta salinidad, bajo contenido de agua, o baja temperatura. También se deberá entender que como se usa en la especificación y en las reivindicaciones, "un", o "uno" pueden significar uno o más, dependiendo del contexto en el cual se usa. Por lo tanto, por ejemplo, eferencia a "Una célula" puede significar que por lo menos se puede usar una célula. También , como se usa en la presente, el término "eficiencia de uso de agua" se refiere a la cantidad de materia orgánica producida por una planta dividida por la cantidad de agua usada por la planta para producirla, es decir, el peso seco de una planta en relación con el uso de agua de la planta. Como se usa en la presente, el término "peso seco" se refiere a cada parte en la planta diferente al agua, e incluye, por ejemplo, carbohidratos, proteínas, aóeites y nutrientes minerales. También como se usa en la presente, el término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN qijie es lineal o ramificado, de una sola o doble hebra, o un híbrido del mismo. El término también abarca híbridos de A&N/ADN. Estos términos también abarcan secuencia no traducida localizada en los extremos 3' y 5' de la región de codificación del gen: por lo menos aproximadamente por lo m nos 1000 nucleótidos de secuencia corriente arriba del extremo 5' de la región de codificación y por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos de secuencia corriente abajo del extremo 3' de la región de codificación del gen. Las bases menos comunes, tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina, y otros, también se pueden usar para contrasentido, dsARN, y apareamiento de ribozimas. Por ejemplo, los polinucleótidos que contienen análogos de propine C-5 de uridina y citidina se han mostrado para unirse a ARN con alta afinidad y son inhibidores de contrasentido potentes de expresión de genes. Otras modificaciones, tal como modificación a la estructura de la base de fosfodiester, o 2 ' -hidroxi en el grupo de azúcar de ribosa de ARN también puede hacerse. Los polinucleótidos de contrasentido y ribozimas pueden consistir completamente de ribonucleótidos o pueden contener ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos mixtos. Los polinucleótidos de la invención se pueden producir por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, RCP-TA y trascripción invito o in vivo. Una molécula de ácidos nucleicos "aislados" es una que se separa sustancialmente de toas moléculas de ácidos nucleicos, .que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos) . Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de algunas secuencias, que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón presente en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. En varias modalidades, la molécula de ácidos nucleicos de LPKSRP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula de a cual se deriva el ácido nucleico (v.gr., una célula de Physcomitrella patens) . Un ácido nucleico también se considera aislado si se ha alterado por la intervención humana, o se coloca en un sitio o ubicación que no es su sitio natural, o si se introduce en una célula por agroinfección. Además, una molécula de ácido nucleico "aislado", tal como una molécula de ADNc, puede estar libre de algún otro material celular con el cual se asocia naturalmente, o medio de cultivo cuando se produce por las técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Excluidos específicamente de la definición de "ácidos nucleicos aislados" son: cromosomas presentes en la naturaleza (tal como difusión de cromosomas) , bancos de cromosomas artificiales, bancos genómicos, y bancos de ADNc que existen como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de células huésped transfectadas/transformadas, en donde las células huésped son una preparación heterogénea in vito o se siembran en placas como una población heterogénea de colonias sencillas. También excluidos específicamente están los bancos anteriores en donde un ácido nucleico específico conforma menos del 5% del número de insertos de ácidos nucleicos en las moléculas de vector. Además se excluyen específicamente los bancos anteriores en donde un ácido nucleico específico conforma menos del 5% del número de insertos de ácido nucleico en las moléculas de vectores. Además se excluyen específicamente los ADN genómicos de células completas o preparaciones de ARN de células completas (incluyendo preparaciones de células completas que se comparten mecánicamente o se digieren enzimáticamente) . Aun más específicamente se excluyen las preparaciones de células completas encontradas como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis en donde el ácido nucleico de la invención nO se ha separado de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de electroforesis (v.gr., además se separan cortando una sola banda de una población de banda heterogénea en un gel de agarosa o transferencia de nylon) . Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, v.gr., una molécula de ácido nucleico que tiene uña secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1, o una porción de la misma, puede aislarse usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencias provista en la presente. Por ejemplo, un ADNc de LPKSRP de P. patens puede aislarse de un banco de P. patens usando todo o una porción de las secuencias descritas en la presente. Además, una molécula de ácidos nucleicos que abarcan todo o una porción de la secuencia de SEC ID NO: 1, puede aislarse por la reacción en cadena de polimerasa usando iniciadores de oligonucléotidos diseñados basado en esta secuencia. Por ejemplo, ARNm puede aislarse de las células de patentes (v.gr., por el procedimiento de extracción de guanidinio-tiocianato de Chirgwin y otros, 1979, Biochemistry 18:5294-5299) , y el ADNc puede prepararse usando transcriptasa inversa (v.gr., transcriptasa inversa de Moloney MLV, disponible de Sikagaku America, inc., St . Petersburg, FL) . Iniciadores de oligonucleótidos sintéticos para amplificación de reacción en cadena de polimerasa puede diseñarse con base en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO: 1. Una molécula de 'ácidos nucleicos de la invención puede amplificarse usando ADNc o, alternativamente, ADN genómico, como un patrón e iniciadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo ca técnicas de amplificación de RCP normales. La molécula de ácidos nucleicos así amplificada puede clonarse en un vector apropiado y caracterizado por análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos que corresponden a una secuencia de nucleótidos de LPKSRP pueden prepararse pon técnicas sintéticas normales, v.gr., usando un sintetizador automático de ADN.

En una modalidad, una molécula de ácidos nucleicos aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO: 1. Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención puede comprender secuencias que codifican LPKSRP, (es decir, la "región de codificación"), así como secuencias no traducidas 5' y secuencias no traducidas 3' . Alternativamente, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender solo la región de codificación de la secuencia en SEC ID NO: 1, o pueden contener fragmentos genómicos completos aislados del ADN genómico. La presente invención también incluye ácidos nucleicos que codifican LPKSRP que codifican LPKSRP como se describió en la presente. En una modalidad preferida, el ácido nucleico que codifica LPKSRP codifica un PpLLPK-1 como se definió en SEC ID NO: 2. Además, la molécula de ácidos nucleicos de la invención puede comprender una porción de la región de codificación de SEC ID NO: 1, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como una sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de un LPKSRP. Las secuencias de nucleótidos determinadas de la clonación de los genes de LPKSRP de Physcomitrella patens permiten la generación de sondas e iniciadores diseñados para usarse en la identificación y/o clonación de homólogos de LPKSRP en otros tipos de células y organismos así como homólogos de LPKSRP de otros musgos y especies relacionadas. La porción de la región de codificación también puede codificar un fragmento biológicamente activo de un LPKSRP. Como se usa en la presente, el término "porción biológicamente activa de" un LPKSRP se pretende que incluye una porción, v.gr., un dominio/motivo, de un LPKSRP que participa en la modulación de crecimiento de plantas y/o tolerancia a la tensión en una planta. Para los fines de la presente invención, la modulación del crecimiento de plantas y/o tolerancia a la tensión se refiere a por lo menos un I incremento o disminución del 10% en el crecimiento y/o tolerancia a la tensión de una planta transgénica que comprende un cásete de expresión de LPKSRP (o vector de expresión) comparado con el crecimiento y/o tolerancia a la tensión de una planta de control no transgénica. Los métodos i para cuantificar el crecimiento y/o tolerancia a la tensión se proveen por lo menos en el siguiente Ejemplo 7. En una I modalidad preferida, la porción biológicamente activa de un i LPKSRP incrementa el crecimiento y/o tolerancia de la planta a una tensión ambiental. Las porciones biológicamente activas de un LPKSRP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivados de la secuencia de aminoácidos de LPKSRP, v.gr., una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido idéntico a un LPKSRP, que incluye menos aminoácidos que una longitud completa de LPKSRP o el polipéptido de longitud completa que es idéntico a LPKSRP, y exhibe por lo menos una actividad de LPKSRP. Normalmente, las porciones biológicamente activas (v.gr., péptidos que tienen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) comprende un dominio o motivo con por lo menos una actividad de LPKSRP. Además, otras porciones biológicamente activas, en la,s cuales se suprimen otras regiones del polipéptido, se pueden preparar por técnicas recombinantes y evaluarse para una o más de las actividades descritas en la presente. De preferencia, la porción biológicamente activa de LPKSRP incluye uno o más dominios/motivos seleccionados, o porciones dé los mismos, que tienen actividad biológica tal como el dominio de cinasa central conservado como se muestra en la Figura 3. En una modalidad, el "dominio de cinasa central" comprende residuos en las posiciones 235-546 de SEC ID NO: 2. En una modalidad preferida, el dominio de cinasa central conservado comprende cuatro regiones conservadas, en donde la primera región comienza con un residuo de tirosina en la posición 1 y tiene una leucina en la posición 3, un residuo de glicina en la posición 4, un residuo de glicina en la posición 8, un residuo de glicina en la posición 10, un residuo de fenilalanina en la posición 12, un residuo de glicina en la posición 13, y un residuo de treonina en la posición 15; la segunda región está corriente debajo de la primera región, comienza con un residuo de alanina en la posición 1, y tiene un residuo de lisina en la posición 3, un residuo de isoleucina en la posición 5, un residuo de lisina en la posición 7, un residuo de ácido glutámico en la posición 17, un residuo de ácido aspártico en la posición 18, un residuo de valina en la posición 19, un residuo de arginina en la posición 21, un residuo de ácido glutámico en la posición 22, un residuo de isoleucina en la posición 25, un residuo de leucina en la posición 29, un residuo de glicina en la posición 31, un residuo de asparagina en la posición 34, un residuo de valina en la posición 36, un residuo de ácido glutámico en la posición 43, un residuo de ácido aspártico en la posición 44, un residuo de valina en las posiciones 48 y 51, un residuo de metionina en la posición 523, un residuo de ácido glutámico en la posición 53, un residuo de leucina en la posición 54, un residuo de cisteina en la posición 55, un residuo de glicina en las posiciones 57 y 58, un residuo de ácido glutámico en la posición 59, un residuo de leucina en la posición 60, un residuo de ácido aspártico en la posición 62, un residuo de arginina en la posición 63, y un residuo de isoleucina en la posición 64; la tercera región está corriente debajo de la segunda región, comienza con un residuo de tirosina en la posición 1, y tiene un residuo de serina en la posición 2, un residuo de ácido glutámico en la posición 3, un residuo de alanina en la posición 6, un residuo de arginina en la posición 11, un residuo de valina en la posición 16, un residuo de cisteina en la posición 20, un residuo de histidina en la posición 21, un residuo de glicina en la posición 24, un residuo de valina en la posición 25, un residuo de histidina en la posición 27, un residuo de arginina en la posición 28, un residuo de ácido aspártico en la posición 29, un residuo de lisina en la posición 31, un residuo de prolina en la posición 32, un residuo de ácido glutámico en la posición 33, un residuo de asparagina en la posición 34, un residuo de fenilalanina en la posición 35, un residuo de leucina en las posiciones 36 y 46, un residuo de lisina en la posición 47, un residuo de ácido aspártico en la posición 50, un residuo de fenilalanina en la posición 51, un residuo de glicina en la posición 52, un residuo de leucina en la posición 53, un residuo de serina en la posición 54, un residuo de prolina en la posición 59, un residuo de ácido aspártico en la posición 65, un residuo de valina en la posición 67, un residuo de glicina en la posición 68, un residuo de serina en la posición 69, un residuo de tirosina en las posiciones 71 y 72, un resido de valina en la posición 73, un residuo de alanina en la posición 74, un residuo de prolina en la posición 75, un residuo de ácido glutámico en la posición 76, un residuo de valina en la posición 77, un residuo de leucina en la posición 78, un residuo de ácido glutámico en la posición 85, un residuo de ácido aspártico en la posición 87, un residuo de valina en la posición 88, un residuo de triptofano en la posición 89, un residuo de serina en la posición 90, un residuo de glicina en • la posición 92, un residuo de valina en la posición 93, un residuo de isoleucina en la posición 94, un residuo de tirosina en la posición 96, un residuo de isoleucina en la posición 97, un resido de leucina en las posiciones 98 y 99, un residuo de glicina en la posición 101, un residuo de prolina en la posición 104, un residuo de fenilalanina en la posición 105, un residuo de triptofano en la posición 106, un residuo de treonina en la posición 109, un residuo de ácido glutámico en la posición 110, un residuo de isoleucina en la posición 113, un residuo de fenilalanina en la posición 114, un residuo de prolina en la posición 128, un residuo de triptofano en la posición 129, un residuo de prolina en la posición 130, un residuo de isoleucina en la posición 132, un residuo de serina en la posición 133, un residuo de alanina en la posición 136, un residuo de lisina en la posición 137, un residuo de ácido aspártico en la posición 138, un residuo de leucina en la posición 144, un residuo de arginina en la posición 151, un residuo de alanina en la posición 154, un residuo de leucina en la posición 158, un residuo de histidina en la posición 160, un residuo de prolina en la posición 161, y un residuo de triptofano en la posición 162; y la cuarta región está corriente abajo de la tercera región, comienza con un residuo de prolina en la posición 1, y tiene un residuo de ácido aspártico en la posición 3, un residuo de valina en la posición 6, un residuo de alanina en la posición 23, un residuo de leucina en las posiciones 31 y 39, un residuo de fenilalanina en la posición 43, un residuo de glicina en la posición 52, un residuo de leucina en la posición 63, y un residuo de lisina en la posición 65. La invención también provee LPKSRP quimérico o polipéptidos de fusión. Como se usa en la presente, un "polipéptido quimérico" de LPKSRP o "polipéptido de fusión" comprende un LPKSRP ligado operablemente a uno que no es LPKSRP. Un LPKSRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a LPKSRP, mientras que uno que no es LPKSRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde un polipéptido que no es sustancialmente idéntico a LPKSRP, v.gr., un polipéptido que es diferente de LPKSRP y se deriva del mismo organismo o uno diferente. Con respecto al polipéptido de fusión, el término "ligado operablemente" se pretende que indique que LPKSRP y el que no es LPKSRP se fusionen entre ellos de manera que ambas secuencias cumplan con la función propuesta atribuida a la secuencia usada. El que no es LPKSRP puede fusionarse a la terminación N o terminación C de LPKSRP. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión de GST-LPKSRP. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de f sión es un polipéptido de fusión de GST-LPKSRP en el cual las secuencias de LPKSRP se fusionan a la terminación C de las secuencias de GST. Dichos polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de LPKSRP recombinantes. En otra modalidad, el polipépitido de fusión es un LPKSRP que contiene una secuencia de señal heteróloga en su terminación N. en ciertas células huésped (v.gr., células huésped de mamíferos) , expresión y/o secreción de un LPKSRP pueden incrementarse mediante el uso de una secuencia de señal heteróloga. Preferiblemente, un polipéptido quimérico o de fusión de LPKSRP de la invención se produce por las técnicas de ADN recombinante normal. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan en el marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando terminaciones terminadas en punta roma o terminadas de manera escalonada para ligación, la digestión de la enzima de restricción para proveer las terminaciones apropiadas, llenando los extremos cohesivos según es apropiado, el tratamiento de fosafatasa alcalina para evitar lá unión indeseable y la ligadura enzimática. En otra modalidad, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos.

Alternativamente, la amplificación de RCP de fragmentos de genes pueden llevarse a cabo usando iniciadores de ancla que originan colgantes complementarios entre do fragmentos de genes consecutivos que subsiguientemente pueden recocerse y reamplificarse para generar una secuencia de gen quimérico (Véase, por ejemplo, protocoles Actuales en Biología Molecular, Eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons: 1992). Además, muchos vectores de expresión están comercialmente disponibles los cuales ya codifican una porción de fusión (v.gr., un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica LPKSRP que puede clonarse en dicho vector de expresión de manera que la porción de fusión se liga en la trama al LPKSRP. Además, de los fragmentos y polipéptidos de fusión de LPKSRP descrito en la presente, la presente invención incluye homólogos y análogos de LPKSRP presentes en la naturaleza y ácidos nucleicos que codifican LPKSRP en una planta. "Homólogos" se definen en la presente como dos ácidos nucleicos o polipéptidos que tienen nucleótidos similares o "idénticos" o secuencias de aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de LPKSRP como se definió antes. El término "homólogo" que abarca además moléculas de ácidos nucleicos que difieren de la secuencia de nucleótidos mostradas en SEC ID NO: 1 (y porciones del mismo) debido a la degeneración del código genético y por lo tanto codifica LPKSRP como se codifica por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO: 1. Como se usa en la presente, un LPKSRP "presente en la naturaleza" se refiere a una secuencia de aminoácidos de LPKSRP que está presente en la naturaleza. Preferiblemente, un LPKSRP presente en la naturaleza comprende una secuencia de aminoácidos como se definió en SEC ID NO: 2. Un agonista de LPKSRP puede retener sustancialmente el mismo, un subgrupo de las actividades biológicas de LPKSRP. Un antagonista de LPKSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma presente en la naturaleza de LPKSRP. Las moléculas de ácidos nucleicos que corresponden a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos, y pafálogos de un ADNc de LPKSRP pueden aislarse con base en su identidad a los ácidos nucleicos de LPKSRP de Physcomitrella patens descritos en la presente usando ADNc de LPKSRP, o una porción de los mismos, como una sonda de hibridización de acuerdo con las técnicas de hibridización estándar bajo condiciones de hibridización estrictas. En una modalidad alternativa, los homólogos de LPKSRP pueden identificarse tamizando bancos combinatorios de mutantes, v.gr., mutantes de truncación, de LPKSRP para actividad agonista o antagonista de LPKSRP. En una modalidad, un banco sobresaliente de variantes de LPKSRP se genera por mutagénesis combinatorias en el nivel de ácidos nucleicos y se codifica por un banco de genes sobresalientes. Un banco sobresaliente de variantes de LPKSRP puede producirse, por ejemplo, por la unión enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias de genes de manera que un conjunto degenerado de secuencias de LPKSRP potencial puede expresarse como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de polipéptidos de fusión más granes (v.gr., para exhibición de fagos) que contienen el conjunto de secuencias de LPKSRP en el mismo. Hay una variedad de métodos que pueden usarse para producir bancos de homólogos de LPKSRP potencial de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. La síntesis química de una secuencia de genes degenerados puede realizarse en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético luego se liga en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias de LPKSRP potenciales. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en la materia (Véase, v.gr, Narang, S.A., 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura y otros, 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y otros, 1984, Science 198:1056; Ike y otros, 1983, Nucleic ACid Res. 11:477) .

Además, los bancos de fragmentos de las regiones de codificación de LPKSRP pueden usarse para generar una población sobresaliente de fragmentos de LPKSRP para tamizar y la selección subsiguiente de homólogos de un LPKSRP. En una modalidad, un banco de fragmentos de secuencias de codificación pueden generarse tratando un fragmento de RCP de doble hebra de una secuencia de codificación de LPKSRP con una nucleasa bajo condiciones en donde se presentan cortes solo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de doble hebra, renaturalizando el ADN para formar ADN de doble hebra, que puede incluir pares de sentido/contrasentido de diferentes productos cortados, removiendo pociones de una sola hebra de los pares reformados mediante tratamiento con nucleasa SI y ligando el banco de fragmentos resultantes en un vector de expresión. Mediante este método, se puede derivar un banco de expresión el cual codifica N-terminal, C-terminal y fragmentos internos de varios tamaños de LPKSRP. En la materia se conocen varias técnicas para tamizar productos de genes de bancos combinatorios hechos por mutaciones de punto o truncación, y para tamizar bancos de ADNc para productos de genes que tienen una propiedad seleccionada. Dichas técnicas se pueden adaptar para tamizado rápido de los bancos de genes generados por la mutagénesis combinatoria de homólogos de LPKSRP. Las técnicas más ampliamente usadas, las cuales son susceptibles a análisis de alto rendimiento, para tamizar bancos de genes grandes normalmente incluyen la clonación del banco de genes en vectores de expresión replicables, transformando células apropiadas con el banco resultante de vectores, y expresando los genes combinatorios bajo condiciones en los cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis de ensamble recursivo (REM, por sus siglas en inglés) , una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en los bancos, puede usarse en combinación con los análisis de tamizado para identificar homólogos de LPKSRP (Arkin y Yourvan, 1992, PNAS 89:7811-7815; Delgreve y otros, 1993, Polypeptide Engineering 6(3): 327-331). En otra modalidad, los análisis basados en células pueden explotarse para analizar un banco de LPKSRP sobresaliente, usando métodos bien conocidos en la materia. La presente invención además provee un método para identificar un KPKSRP novedoso, que comprende (a) elevar una respuesta de anticuerpos específico a un LPKSRP, o un fragmento del mismo, como se describió en la presente, (b) tamizar material de LPKSRP putativo con el anticuerpo, en donde la unión específica del anticuerpo al material indica la presencia de un LPKSRP potencialmente novedosos, y (c) analizar el material unido en comparación con LPKSRP conocido, para determinar su novedad.

Como se estableció antes, la presente invención incluye LPKSRP y homólogos del mismo. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos (v.gr., la secuencia de SEC ID NO: 2, y una mutante del mismo) , las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (v.gr., los espacios pueden introducirse en la secuencia de un polipéptido para alienación óptima con el otro polipéptido o ácido nucleico) . Los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes se comparan. Cuando una composición en una secuencia (v.gr., la secuencia de SEC ID NO: 2) se ocupa por el mismo residuo de aminoácidos que la posición correspondiente en la otra secuencia (v.gr., una forma de mutante de la secuencia de SEC ID NO: 2), entonces las moléculas son idénticas en dicha posición. El mismo tipo de comparación puede hacerse entre dos secuencias de ácidos nucleicos. El porcentaje de identidad de secuencias entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencias = números de posiciones idénticas/ números totales de posiciones x 100) . Preferiblemente, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención por lo menos son el 50-60%, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 60-70%, y más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 70-756%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95% y aún más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a una secuencia de aminoácidos completa mostrada en SEC ID NO: 2. En otra modalidad, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención por lo menos son de aproximadamente 50-60%, preferiblemente de por lo menos 60-70%, y más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y aún más preferiblemente por lo menos I " I aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a una secuencia de aminoácidos completa codificada por una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEC ID NO: 1. En otras modalidades, los homólogos de aminoácidos de LPKSRP i tienen identidad de secuencia sobre por lo menos 15 residuos de! aminoácidos contiguos, más preferiblemente de por lo menos 25 residuos de aminoácidos contiguos y aún más preferiblemente por lo menos 35 residuos de aminoácidos contiguos de SEC ID NO: 2. Preferiblemente, los homólogos de aminoácidos aislados incluidos en la presente invención por lo; menos son de aproximadamente 50-60%, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 60-70%, y aún más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 70.75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, ó 90-95%, y aún más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más I idénticos al dominio de proteína cinasa central de las secuencias de aminoácidos descritas mostradas como residuos 235 a 546 de SEC ID NO: 2. En otra modalidad, el homólogo de aminoácidos aislado de la presente invención se codifica por un ácido nucleico como se definió por nucleótidos en las posiciones 736 a 1671 de SEC ID NO: 1. En otra modalidad preferida, un homólogo de ácidos nucleicos aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que por lo menos es de aproximadamente 40-60%, preferiblemente de por lo menos aproximadamente 60-70%, más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más idéntico a una secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID NO: 1 o a una porción que comprende por lo menos 60 nucleótidos consecutivos del mismo. La longitud preferida de comparación de secuencias para ácidos nucleicos es de por lo menos 75 nucleótidos, más preferiblemente de por lo menos 100 nucleótidos, y aún más preferiblemente toda la longitud de la región de codificación. Es más preferible que los homólogos de ácidos nucleicos codifiquen polipéptidos que tienen homología con SEC ID NO: 2 sobre el dominio de cinasa central. Además se prefiere que el homólogo de ácidos nucleicos aislados de la invención codifique un LPKSRP, o porción del mismo que por lo menos es de aproximadamente 50-60%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60-70% y más preferiblemente de por lo menos 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95%, y aún más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticos a una secuencia de aminoácidos completa mostrada en SEC ID NO: 2 y que funciona como un modulador de crecimiento de plantas y/o una respuesta de tensión ambiental en una planta. En una modalidad más preferida, la sobre-expresión del homólogo de ácidos nucleicos en una planta incrementa el crecimiento de la planta y/o la tolerancia de la planta a una tensión ambiental. En una modalidad adicional preferida, el homólogo de ácidos nucleicos codifica un LPKSRP que funciona como una proteína sinasa similar a lectina. Para los fines de la invención, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido se determina usando el paquete de software Vector nTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsins Ave., Bethesda, MD 20814). Una penalidad de apertura de espacios de 15 y penalidad de extensión de espacios de 6.66 se usan para determinar el porcentaje de identidad de secuencias de dos ácidos nucleicos. Una penalidad de apertura de espacios de 10 y. una penalidad de extensión de espacios de 0.1 se usan para determinar el porcentaje de identidad de dos polipéptidos. Todos los demás parámetros se establecen en los ajustes por omisión. Para los fines de una alienación múltiple (Algoritmo Clustal W) , la penalidad de apertura de espacio es de 10, y la penalidad de extensión de espacios es de 0.05 con matriz de blosum62. Se deberá entender que para los fines de determinar la identidad de secuencia cuando se compara una secuencia de ADN a una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo. En otro aspecto, la invención provee un ácido nucleico aislado que comprende un polinucléotido que se hibridiza al polinucleótido de SEC ID NO: 1 bajo condiciones estrictas. Más particularmente, una molécula de ácidos nucleicos aislada de la invención por lo menos es de 15 nucleótidos de longitud y se hibridiza bajo condiciones estrictas a la molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1. En otras modalidades, el ácido nucleico es de por lo menos 30, 50, 100, 250, o más nucleótidos de longitud. De preferencia, un homólogo de ácidos nucleicos aislado de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones altamente estrictas a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NO: 1 y funciona como un modulador de crecimiento y/o tolerancia a la tensión en una planta. En una modalidad adicional preferida, la sobre-expresión del homólogo de ácidos nucleicos aislado en una planta incrementa el crecimiento y/o tolerancia de la planta a una tensión ambiental. En una modalidad aún adicional preferida, el homólogo de ácidos nucleicos aislado codifica un LPKSRP que funciona como una proteína cinasa similar a lectina. Como se usa en la presente, con respecto a la hibridización para ADN a una transferencia de ADN, el término "condiciones estrictas" se refiere a la hibridización durante la noche a 60°C en solución de Denhert al lOx, SSC 6x, 0.5% SDS, y 100 µg/ (ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Las transferencias se lavan secuencialmente a 62°C durante 30 minutos cada vez en SSC 3x /SDS 0.1%, seguido por SSC lx /SDS 0.1%, y finalmente SSC O.lx/SDS 0.1%. En otra modalidad, la frase "condiciones estrictas" se refiere a la hibridización en una solución de SSc 6x a 65°C. Como se usa también en la presente, "condiciones altamente estrictas" se refiere a la hibridización durante la noche a 65°C en solución de Denhart al 10X, SSC 6X, SDS al?.5%, y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. La inmuno-transferencia se lavan secuencialmente a 65°C durante 30 minutos cada vez en SSC 3X/SDS 0.1%, seguido por SSC 1X/SDS 0.1% finalmente SSC O.lx /SDS 0.1%. Los métodos para hibridizaciones de ácidos nucleicos se describieron en Meinkoth and Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138:267-284; Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel y otros, Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995; and Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hibridization with Nucleic Acid Probes. Part I, Capítulo 2, Elsevier, New York, 1993. De preferencia, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención que se hibridiza bajo condiciones extritas o altamente estrictas de una secuencia de SEC ID NO: 1 corresponde a una molécula de ácido nucleico presente en la naturaleza. Como se usa en la presente, una molécula de ácido nucleico "presente en la naturaleza", se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que está presente en la naturaleza (v.gr., codifica un polipéptido natural) . En una modalidad, el ácido nucleico codifica un LPKSRP de Physcomitrella patens presente en la naturaleza. Preferiblemente, una molécula aislada del ácido nucleico de la invención que se hibridiza bajo condiciones estrictas o altamente estrictas a una secuencia de SEC ID NO.: 1 corresponde a una molécula natural del ácido nucleico. Como se usa en la presente, una molécula del ácido nucleico "natural" se refiere a una molécula del ARN o del ADN que tiene una secuencia del nucleótido presente en naturaleza (v.gr., codifica un polipéptido natural). En una modalidad, el ácido nucleico codifica LPKSRP de un Physcomitrella patens presente en la naturaleza. Usando los métodos descritos antes, y otros conocidos por los expertos en la materia, alguien con experiencia ordinaria en la materia puede aislar homólogos de LPKSRP de Physcomitrella patens que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO: 2. Un subgrupo de estos homólogos son variantes alélicas. Como se usa en la presente, el término "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de un LPKSRP y que existe dentro de una población natural (v.gr., una especie o variedad de planta) . Dichas variaciones alélicas naturales pueden dar como resultado normalmente 1-5% de varianza en un ácido nucleico de LPKSRP. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácidos nucleicos de interés en un número de diferentes plantas, que puede llevase a cabo fácilmente usando sondas de hibridización para identificar los mismos sitios genéticos de LPKSRP en las plantas. Cualquiera y todas las variaciones de ácidos nucleicos y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes en un LPKSRP que son el resultado de variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de un LPKSRP, se pretende que estén dentro del alcance de la invención. Además, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican LPKSRP de la misma u otras especies tales como análogos, ortólogos y parálogos de LPKSRP, se pretende que estén dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en la presente, el término "análogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que tienen la misma función o similar, pero que se han desarrollado por separado en organismos no relacionados. Como se usa en la presente, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de diferentes especies, pero que se han desarrollado por separado en organismos no relacionados. Como se usa en la presente, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleicos de diferente especies, pero que han evolucionado de un gen ancestral común por especificación. Normalmente, los polipéptidos que codifican ortólogos que tienen las mismas funciones o similares. Como se usa también en la presente, el término "parálogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que se refieren por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones deberán relacionarse (Tatusov, R.L. y otros, 1997, Science 278 (5338) : 631-637) . Los análogos, ortólogos, y parálogos de un LPKSRP presente en la naturaleza puede diferir de LPKSRP presente en la naturaleza por las modificaciones post-traslacionales, por diferencias de secuencias de aminoácidos o ambos. Las modificaciones post-traslacionales incluyen derivatización química de polipéptidos in vivo e in vitro, v.gr., acetilación, carboxilación, fosforilación o glicosilación, y dichas modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis de polipéptidos o procesan o siguen el tratamiento con enzimas de modificación aisladas. En particular, los ortólogos de la invención generalmente exhibirán identidad de por lo menos 80-85%, más preferiblemente, 85-90%, o 90-95%, y aún más preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98%, o aún 99%, o identidad de secuencia del 100%, con todo o parte de una secuencia de aminoácidos de LPKSRP presente en la naturaleza y exhibirá una función similar a un LPKSRP. Prefeiblemente, un ortólogo de LPKSRP de la, presente invención funciona como un modulador de respesta de crecimiento de plantas y/o una tensión ambiental en una planta y/o funciona como una proteína cinasa similar a lectina. Más preferiblemente, un ortólogo de LPKSRP incrementa el crecimiento bajo condiciones limitadas a agua y/o incrementa la tolerancia de tensión de una planta. Además de las variantes presentes en la naturaleza de una secuencia de LPKSRP que puede existir en la población, el artesano experto además apreciará que se pueden introducir cambios por mutación en una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1, conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de LPKSRP codificado, sin alterar la actividad funcional de LPKSRP. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" pueden hacerse en una secuencia de SEC ID NO: 1. Un residuo de aminoácidos "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia tipo silvestre de uno de LPKSRP sin alterar la actividad de dicho LPKSRP, mientras que un residuo de aminoácidos "esencia" se requiere para actividad de LPKSRP. Sin embargo, otros residuos de aminoácidos (v.gr., aquellos que no se conservan o solo son semiconservados en el domino que tiene actividad de LPKSRP) pueden no ser esenciales para actividad y por lo tanto probablemente tienden a la alteración sin alterar la actividad de LPKSRP. Consecuentemente, otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácidos nucleicos que codifican LPKSRP que contiene cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de LPKSRP. Tal LPKSRP difiere en secuencias de aminoácidos de una secuencia contenida en SEC ID NO: 2, aún retienen por lo menos una de las actividades de LPKSRP descritas en la presente. En una modalidad, la molécula de ácidos nucleicos aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 50% idéntica a la región de proteína cinasa centra de una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2. Preferiblemente, el polipéptido codificado por la molécula de ácidos nucleicos por lo menos es 50-60% idéntica a la región de proteína cinasa central de una de las secuencias de SEC ID NO: 2, más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 60-70% idénticas a la región de proteína cinasa central de una de las secuencias de SEC ID NO: 2, aún mas preferiblemente por lo menos aproximadamente 70-70%, 75-80%, 80-85%, 85-90%. O 90-95% idénticas a la región de proteína cinasa central de una de las secuencias de SEC ID NO: 2, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 096%, 97%, 98%, ó 99% idénticas a la región de proteína cinasa central de SEC ID NO: 2. En otra modalidad, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico por lo menos es de aproximadamente 50-60% idéntico a la secuencia de SEC ID NO: 2, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 60-70% idéntico a la secuencia de SEC ID NO: 2, aún más preferiblemente aproximadamente por lo menos 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, o 90-95% idéntica a la secuencia de SEC ID NÓ: 2, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a la secuencia de SEC ID NO: 2. Los homólogos de LPKSRP preferidos de la presente invención participan preferiblemente en crecimiento de plantas y/o la respuesta a la tolerancia a la tensión en una planta, o más particularmente, funcionan como proteína cinasa similar a lectina. Una molécula de ácidos nucleicos aislados que codifican un LPKSRP que tiene identidad de secuencia con una secuencia de polipéptidos de SEC ID NO: 2 puede crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1, respectivamente, de manera que una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos se introducen en el polipéptido codificado. Las mutaciones pueden introducirse en la secuencia de SEC ID NO: 1 por técnicas normales, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por RCP. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservadores están hechas en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la cual se reemplaza el residuo de aminoácidos con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la materia. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.gr., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de ácidos (v.gr., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (v.gr., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (v.gr., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenillaanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas ( .gr., treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (v.gr., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Por lo tanto, un residuo de aminoácidos no esenciales previstos en un LPKSRP preferiblemente se reemplaza con otro residuo de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente junto con todo o parte de una secuencia de codificación de LPKSRP, tal como por mutagénesis por saturación, y las mutantes resultantes pueden tamizarse para una actividad de LPKSRP descrita en la presente para identificar mutantes que retienen actividad de LPKSRP. Después de la mutagénesis de una de las secuencias de SEC ID NO: 1, el polipéptido codificado puede expresase recombinantemente y la actividad del polipéptido puede determinarse analizando el crecimiento y/o tolerancia a la tensión de una planta que expresa el polipéptido como se describió en el Ejemplo 7. Adicionalmente, se pueden crear los ácidos nucleicos de LPKSRP optimizados. Preferiblemente, un ácido nucleico de LPKSRP optimizado codifica un LPKSRP que modula un crecimiento de la planta y/o modula una tolerancia de la planta a una tensión ambiental, y más preferiblemente incrementa un crecimiento de la planta y/o incrementa una tolerancia de la planta a una tensión ambiental en su sobre-expresión en la planta. Como se usa en la presente, "optimizada" se refiere a un ácido nucleico que se trata genéticamente para incrementar su expresión en una planta o animal dado. Para proveer ácidos nucleicos de LPKSRP optimizados para la planta, la secuencia de ADN del gen puede modificarse para 1) comprender codones preferidos por genes de plantas altamente expresados, 2) comprender un contenido de A + T en composición de base de nucleótidos al encontrado sústancialmente en las plantas; 3) de una secuencia de iniciación de plana; o 4) para eliminar secuencias que ocasionan desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o la que forma pasadores de estructura secundaria o sitios de separación de ARN. La expresión incrementada de ácidos nucleicos de LPKSRP en plantas puede lograrse usando la frecuencia de distribución de uso de codón en plantas en general o en una planta particular. Los métodos para optimizar la expresión de ácidos nucleicos en plantas puede encontrarse en EPA 0359472; EPA 0385962; Solicitud de PCT No. WO 91/16432; Patente de E.U.A. NO. 5,380,831; Patente de E.U.A. No. 5,436,391; Perlack y otros, 1991, proc. NatlAcad. Sci. EUA 88:3324-3328; y Murray y;otros, 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477-498. Como se usa en la presente, "frecuencia de uso de codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Para determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, el número de presentaciones del codón en el gen se divide por el número total de ocurrencias de todos los codones especificando el mismo aminoácido en el gen. Similarmente, la frecuencia de uso de codones preferido exhibido por una células huésped se puede calcular abreviando la frecuencia de uso de codón preferida en un gran número de genes expresados por la célula huésped. Es preferible que este análisis sea limitado a genes que se expresan altamente por la célula huésped. El porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de codones preferido para un gen sintético del empleado por una célula huésped se calcula primero determinando el porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de un solo codón de la célula huésped seguido obteniendo la desviación promedio sobre todos los codones. Como se definió en la presente, este cálculo incluye codones únicos (es decir, ATG y TGG) . En los términos generales, la desviación de promedio global del uso de codones de un gen optimizado del de una célula huésped se calcula usando la ecuación ÍA = n = 1 ZXn = frecuencia de uso para el codon en en la célula huésped; Yn = frecuencia de uso para codon en el gen sintético; n representa un codón individual que especifica un aminoácido; y el número total de los codones es Z. La desviación global de la frecuencia de u$o de codones, A, para todos los aminoácidos preferiblemente será menor que aproximadamente 25% y más preferiblemente menor que aproximadamente 10%. Por lo tanto, el ácido nucleico de LPKSRP puede ser optimizado de manera que su frecuencia de distribución del u$o de codones se desvía, preferiblemente no más del 25% de l?s genes de plantas, y más preferiblemente, no mas de aproximadamente 10%. Además, se da consideración al porcentaje de contenido de G + C de la tercera base d generada (las monocotiledóneas parecen favorecer G+C en esta posición, mientras que las dicotiledóneas no) . También se reconoce que el nucleótido XCG (en donde X es A, T, c, o G) es el codon menos preferido en dicotiledóneas mientras se evita el codon de STA en ambas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos de LPKSRP optimizado de esta invención también tienen preferiblemente los índices que evitan los pares de CG y TA aproximándose a aquellos de de lá planta huésped elegida (v.gr., Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, u Oryza sativa) . Más preferiblemente estos índices se desvían de los del huésped por no más de aproximadamente 10-15%. Además de las moléculas de ácidos nucleicos que codifican LPKSRP descrito antes, otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácidos nucleicos aislados que son un contrasentido a los mismos. Los polinucleótidos de contrasentido se piensa que inhiben la expresión de genes de un polinucleótido blanco y que interfiere con transcripción, separación, transporte, traslación y/o estabilidad del polinucleótido blanco. Los métodos se describieron en la técnica anterior para dirigir el polinucleótido en contrasentido al ADN cromosomal a una transcripción de ARN primario, o a un ARNm procesado. Preferiblemente, las regiones blanco incluyen sitios de separación, codones de iniciación de traslación, codones de terminación de traslación y otras secuencias dentro de la trama de lectura abierto. El término "contrasentido" para los fines de la invención, se refieren a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que es suficientemente complementario para todo o una porción de un gen. Transcripción primaria o ARNm procesado, de manera que interfiere con la expresión del gen endógeno. Los genes "complementarios" son aquellos que son capaces de aparearse con las bases de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson-Crick normales. Específicamente, las purinas formarán pares de base con pirimidinas para formar una combinación de guanina en par con citosina (G:C) y adenina en par con timina (A:T) en el caso de ADN o una adenina en par con uracilo (A:U) en el caso de ARN. Se entiende que dos polinucleótidos pueden hibridizarse entre ellos aún si no son completamente complementarios entre ellos, siempre y cuando cada uno tenga por lo menos una región que es sustancialmente complementaria con la otra. El término "ácido nucleico de contrasentido incluye ÁRN de una sola hebra así como casetes de expresión de ADN de doble hebra que pueden transcribirse para producir un ARN de contrasentido. Los ácidos nucleicos de contrasentido "activos" son moléculas de ARN de contrasentido que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos 80% con el polipéptido de SEC ID NO. 2. El ácido nucleico puede ser complementario a una hebra de codificación de LPKSRP completo, o solo a una porción del mismo. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de contrasentido es contrasentido para una "región de codificación" de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótido que codifica un LPKSRP. El término "región de codificación" de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un LPKSRP. El término "región de codificación" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos. En otra modalidad, la molécula de ácidos nucleicos de contrasentido es un contrasentido de una "región que no es de codificación" de la hebra de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica un LPKSRP. El término "región que no es de codificación" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región de codificación que no se traduce en aminoácidos (es decir, también denominados como regiones no traducidas 5' y j3'). La molécula de ácidos nucleicos de contrasentido puede ser complementaria a toda la región de codificación de ARNm de LPKSRP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es de contrasentido a solo una porción de la región de codificación o no de codificación de ARNm de LPKSRP. Or ejemplo, el oligonucleótido de contrasentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de traslación de ARNm de LPKSRP. Un oligonucleótido de contrasentido, puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, o 50 nucleótidos de longitud. Normalmente, las moléculas de contrasentido de la presente invención comprende un ARN que tiene una identidad de secuencia de 60-100% con por lo menos 14 nucleótidos consecutivos de SEC ID NO: 1, o un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID NO: 2. Preferiblemente, la identidad de secuencia será de por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98% y más preferiblemente 99%. Un ácido nucleico de contrasentido de la invención puede construirse usando la sintesis química y reacciones de unión enzimática usando procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, un ácido nucleico de contrasentido (v.gr., un oligonucléotido de contrasentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos presente en la naturaleza o nucleótidos modificados diversamente diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del par formado entre los ácidos nucleicos de contrasentido y sentido, v.gr., se pueden usar derivados de fosforotioato y se pueden usar nucleótidos sustituidos con aCridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar el ácido nucleico de contrasentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2, 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7 -metilguanina, 5-metilaminometil uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido u^acil-5-oxiacético (v) , vibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacetico (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2, 6-diaminopurina . Alternativamente, el ácido nucleico de contrasentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado el ácido nucleico en una orientación de contra-sentido (es decir, ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación de contrasentido a un ácido nucleico blanco de interés descrito además en la siguiente subsección) . En aún otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de contrasentido de la invención es una molécula de ácido nucleico a-anomérico. Una molécula de ácido nucleico -anomérico forma híbridos de doble hebra específicos con ARN complementario en el cual, contrario a las unidades ß, las hebras corren paralelas entre ellas (Gaultier y otros, 987, Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácidos nucleicos de contrasentido también pueden comprender un 2 ' -o-metil-ribonucleótido (Inoue y otros, 1987, FEBS Lett. 215:327-330). Las moléculas de ácidos nucleicos de contrasentido de la invención se administran normalmente a una célula o se generan in situ de manera que se hibridizan con un enlace a ARNm celular y/o ADN geonómico que codifica LPKSRP para inhibir así la expresión del polipépitdo, v.gr., inhibiendo la transcripción y/o traslación. La hibridización puede ser complementariedad de nucleótidos convencionales para formar un par estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácidos nucleicos de contrasentido que se une a pares de ADN, a través de interacciones específicos en la ranura principal de la doble hélice. La molécula de contrasentido puede modificarse de manera que se une específicamente a un receptor o antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, v.gr., ligando la molécula de ácidos nucleicos de contrasentido a un péptido o un anticuerpo que se une a un receptor de superficie celular o antígeno. La molécula de ácidos nucleicos de contrasentido también se pueden suministrar a células que usan los vectores descritos en la presente. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas de contrasentido, se prefieren construcciones de vectores en la cual la molécula de ácido nucleico de contrasentido se coloca bajo el control de un fuerte promotor procariótico viral, o eucariótico (incluyendo plantas) . Como una alternativa a los polinucleótidos de contrasentido, se pueden usar ribozimas, polinucleótidos en sentido o ARN de doble hebra (ARNds) para reducir la expresión de un polipéptido de LPKSRP. Como se usa en la presente, el término "ribozima" se refiere a una enzima basada en ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que es capaz de separar un ácido nucleico de una sola hebra, tal como ARNm a la cual tiene una región complementaria. Las ribozimas (v.gr, las ribozimas de cabeza de martillo descrita en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334:585-591) se pueden usar para separar cataíticamente transcripciones de ARNm de LPKSRP para inhibir así el ácido nucleico pueden diseñarse basado en la secuencia de nucleótidos de un ADNc de LPKSRP como se describió en la presente (es decir, SEC ID NO: 1) o sobre la base de una secuencia heteróloga para aislarse de acuerdo con los métodos enseñados en esta invención. Por ejemplo, un derivado de un ARN de Tetrahimena L-19 IVS puede construirse en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementario con la secuencia de nucleótidos que será separado en un ARNm que codifica LPKSRP. Véase, v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 4,987,071 y 5,116,742 de Cech y otros. Alternativamente, ARNm de LPKSRP puede usarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad de ribonucleasa específica de una combinación de moléculas de ARN. Véase, v.gr., Bartel, D. y Szostak, J.W., 1993, Science 261: 1411-1418. En modalidades preferidas, la ribozima contendrá una porción que tiene por lo menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 nucleótidos, y más preferiblemente 7 ú 8 nucleótidos. Que tienen 100% de complementariedad a una porción del ARN blanco. Los métodos para formar ribozimas son conocidas por los expertos en la materia. Véase, v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 6,025,167; 5,773,260; y 5,496,698. El término "ARNds", como se usa en la presente, se refiere a híbridos de ARN que comprenden dos hebras de ARN. El ARNds puede ser lineal o circular en la estructura. En una modalidad preferida, el ARNds es específico para un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID NO: 2, o un polipéptido que tiene identidad de secuencia de por lo menos 80% con un polipéptido de SEC ID NO: 2 sobre el dominio de proteína cinasa central. El ARN de hibridización puede ser sustancial o completamente complementario. Por "gustancialmente complementario" se entiende que cuando dos ARN de hibridización se alinean óptimamente usando el programa de BLAST como se describió antes, las porciones de hibridización por lo menos tienen complementariedad del 95%. Preferiblemente, el ARNds será de por lo menos 100 pares de base de longitud. Normalmente, el ARN de hibridización será de longitud idéntico sin extremos 5' o 3' colgantes y sin espacios. Sin embargo, los ARNds que tienen colgantes de 5 ' o 3' de hasta 100 nucleótidos pueden usarse en los métodos de la invención. Los ARNds pueden comprender ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos tales como residuos de 2 ' -O-metil ribosilo o combinaciones de los mismos. Véase, v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 4,130,641 y 4,024,222. Un ácido poli-riboinosinico: ácido poli-ribocitidilico de ARNds se describió en la patente de E.U.A. 4,283,293. Los métodos para formar y u ar ARNds son conocidos en la materia. Un método comprende la transcripción simultánea de dos hebras de ADN complementarias, ya sea in vivo o en una sola mezcla de reacción in vitro. Veas, v.gr., Patente de E.U.A. No. 5,795,715. En una modalidad, ARNds puede introducirse en una planta o célula de plantas directamente por procedimientos de transformación normales. Alternativamente, ARNds pueden expresarse en una célula de planta transcribiendo dos ARN complementarios . Otros métodos para la inhibición de expresión de gen endógeno, tal como formación de triple hélice (Moser y otros, 1987, Science 238:645-650 y Cooney y otros, 1988, Science 241:456-459) y la co-supresión (Napoli y otros, 1990, The Plant Cell 2:279-289) son conocidos en la materia. Los ADNc parciales y de longitud completa se han usado para la co-supresión de genes de plantas endógenos. Véase, v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 4,801,340, 5,034,323, 5,231,020, y 5,283,184; Van der Krooll y otros, 1990, The Plant Cell 2:291-299; Smith y otros, 1990, Mol. Gen. Genetics 224:477-481; y Napoli y otros, 1990, The Plant Cell 2:270-289. Para la supresión de genes, se piensa que la introducción de una trascripción de bloques de polinucleótidos en sentido del gen blanco correspondiente. El polinucleótido en sentido tendrá por lo menos una secuencia del 65% con el gen de plantas blanco o ARN. Preferiblemente, la identidad porcentual es de por lo menos 80%, 90%, 95%, o más. El polinucleótido de sentido introducido no será de longitud completa en relación con el gen blanco o transcripción preferiblemente, el polinucleótido de sentido tendrá por lo menos 65% de identidad de secuencia con por lo menos 100 nucleótidos consecutivos de SEC ID NO: 1. Las regiones de identidad pueden comprender intrones y/o exones y regiones no traducidas. El polinucleótido de sentido introducido puede estar presente en la célula de la planta temporalmente, o puede integrarse establemente un cromosoma de plantas o replicón extracromosomal . Alternativamente, la expresión de genes de LPKSRP puede inhibirse por secuencias de nucleótidos blanco complementariamente a la región reguladora de una secuencia de nucleótidos de LPKSRP (v.gr., un promotor y/o mejorador de LPKSRP) para formar triples estructuras helicoidales que vitan la transcripción de un gen de LPKSRP en células blanco. Véase generalmente, Helene, C, 1991, Anticaner Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. y otros, 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J., 1992, Bioassays 14 (12) : 807-15. Además de los ácidos nucleicos de LPKSRP y polipéptidos descritos en antes, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y polipéptidos unidos a una porción. Estas porciones incluyen, pero no están limitadas a, porciones de detección, porciones de hibridización, porciones de purificación, porciones de suministro, porciones de reacción, porciones de unión y similares. Las sondas e iniciadores comprenden normalmente un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido normalmente comprende una región de secuencia de nucleótidos que se hibridiza bajo condiciones estrictas a por lo menos 12, preferiblemente alrededor de 25, más preferiblemente de aproximadamente 40, 50, ó 75 nucleótidos consecutivos de una hebra en sentido de una de las secuencias exhibidas en SEC ID NO: 1; una secuencia de contrasentido de una de las secuencias exhibidas en SEC ID NO: 1, o mutantes presentes en la naturaleza del mismo. Los iniciadores basados en una secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 pueden usarse en reacciones de RCP para clonar homólogos de LPKSRP. Las sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de LPKSRP pueden usarse para detectar transcripciones o secuencias genómicas que codifican los mismos polipéptidos o sustancialmente idénticos. En las modalidades preferidas, la sonda además comprende un grupo de etiquetas unido a las mismas, v.br, el grupo de etiqueta puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima. Dichas sondas pueden usarse como parte de un equipo de prueba de marcador genómico para identificar células que expresan un LPKSRP, tal como midiendo un nivel de un ácido nucleico que codifica KPKSRP, en una muestra de células, v.gr., detectando niveles de ARNm de LPKSRP o determinando si un gen de LPKSRP genómico se ha mutado o suprimido. En particular, un método útil para evaluar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de ARNm disponible para traducción al producto de gen) es realizar una inmunoanálisis Northern (para referencia véase, por ejemplo, Ausubel y otros, 1988, Current Protocolos in Molecular Biology, Wiley: New York) . La información de un inmunoanálisis Northern demuestra por lo menos parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. El ARN celular total puede prepararse de células, tejidos, u órganos por varios métodos, todos bien conocidas en la materia, tal como la descrita en Bomann, E.R. y otros, 9992, Mol. Microbiol. 6:317-326. Para evaluar la presencia o cantidad relativa de polipéptido traducido de e$te ARNm, las técnicas normales tales como inmunoanálisis Western, puede emplearse. Estas técnicas son bien conocidas para alguien con experiencia ordinaria en la materia. (Véase, por ejemplo, Ausubel y otros, 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) . La invención además provee un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de LPKSRP como se describió antes, en donde la expresión del vector en una célula huésped da como resultado el crecimiento incrementado y/o tolerancia a la tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la célula huésped. Como se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector es un "t)lásmido" que se refiere a un bucle de ADN de doble hebra circular en la cual los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (v.gr., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales) . Otros vectores (v.gr., vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped mediante la introducción en la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los cuales están ligados operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinantes con frecuencia están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden usarse intercambiablemente dado que el plásmido es el más comúnmente usado de vectores. Sin embargo, se pretende que la invención incluye dichas otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (v.gr., retrovirus, adenovirus, y virus o adenoasociados defectuosos en replicación) , que- sirven para funciones equivalentes. Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped que serán usadas para la expresión, que se liga operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos que será expresado. Como se usa en la presente con respecto a un vector de expresión recombinante, "ligado operativamente" se pretende que signifique que la secuencia de nucleótidos de interés se liga a la secuencia reguladora en una forma que permite la expresión de secuencia de nucleótidos (v.gr., en un sistema de transcripción/traslación in viro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped) . El término "secuencia reguladora" se pretende que incluya promotores, mejoradores, y otros elementos de control de expresión (v.gr., señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras, se describen por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Aaademic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber and Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechn ology, eds. Glick and Thompson, Capítulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluyendo las referencias en la misma. Las secuencias reguladoras incluyen aquellos que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solo en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Se apreciará por loes expertos en la materia que el diseño del vector de expresión puede depender de dichos factores como la elección de la célula huésped que será transformada, el nivel de expresión de polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en las células huésped para producir así los polipéptidos o péptidos, incluyendo polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describió en la presente (v.gr., LPKSRP, formas de mutantes de LPKSRP, polipéptidos de fusión, etc. , ) . Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de LPKSRP en células procarióticas o eucarióticas. Por ejemplo, los genes de LPKSRP pueden expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), levaduras y otras células fúngales (Véase Romanos, M.A. y otros, 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M. J.J, y otros, 1991, Heterologous gene expression in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C.A.M. J.J. & Punt, P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. y otros, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge) , algae (Falciatore y otros, 1999, Marine Biotechnology 1 (3) :239-251) , ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del género Stylonychia lemnae con los siguientes vectores siguiendo un método de transformación como se describe en la solicitud de PCT No. WO 98/01572, u células de plantas multicelulares (Véase Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabldopsls thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes y otros, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225 y referencias citadas en la presente), o células de mamíferos. Las células huésped adecuadas se tratan además en Goeddel, Gene 1 Exipression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) . Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y trasladarse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras de promotor dé TI y polimerasa de T7. 1 La expresión de polipéptidos en procariotes se lleva a cabo más frecuentemente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que se dirigen a la e presión de polipéptidos de fusión o sin fusión. Los vectores de fusión agregan un número de aminoácidos a un polipéptido codificado en la presente, usualmente a la terminación amino del polipéptido recombinante pero también a la terminación C o fusionarse dentro de las regiones adecuadas en los polipéptidos. Dichos vectores de fusión normalmente sirven para tres fines: 1) para incrementar la expresión de un polipéptido recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de un polipéptido recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de un polipéptido recombinante actuando como un liganado en purificación de afinidad. Con frecuencia, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de separación proteolítica se introduce junto con la porción de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante de la porción de fusión subsiguiente a la purificación del polipéptido de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento conocidas, incluyen Factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión normales incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S., 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) , y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway,. NH) que fusionan glutationa S-transferasa (GST) , polipéptido de unión de maltosa E, o polipéptido A, respectivamente, al polipéptido recombinante blanco. En una modalidad, la secuencia de codificación de LPKSRP se clona en un vector de expresión de pGEX para crear un vector que codifica un polipéptido de fusión que comprende, de la terminación N a la terminación C, polipéptido del sitio X de separación de trombina de GST. El polipéptido de fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad usando resina de glutationa-agarosa. LPKSRP recombinante no fusionado a GST pueden recuperarse por separación del polipéptido de fusión con trombina. Ejemplos de vectores de expresión de E. coli sin fusión inducible adecuados incluyen pTrc (A-mann y otros, 1988, Gene 69:301-315) y PET lid (studier y otros, gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89) . La expresión de genes blanco del vector de pET lid se basa en la transcripción de un promotor de fusión de gnlO-lac T7 mediada por una polimerasa de ARN viral co-expresada (T7 gnl) . Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21(DE3) o HHS174 (DE3) de un profago ? residente que alberga un gen gnl T7 bajo el control transcripcional del promotor de lacUV5. Una estrategia para aumentar la expresión de polipéptido recombinante es expresar el polipéptido en una bacteria huésped con una capacidad dañada para separar proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128) . Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico que será insertada en un vector de expresión- de manera que los codones individuales para cada aminoácido son aquellos usados preferiblemente en la bacteria elegida para la expresión, tal como C. glutamicum (Wada y otros, 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas de síntesis de ADN normales. En otra modalidad, el vector de expresión de LPKSRP es un vector de expresión de levaduras. Ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecl (Baldari, y otros, 1987, Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Heskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (schultz y' otros, 1987, Gene 54:113.123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Los vectores y métodos para la construcción de vectores apropiada para usarse en otros hongos, tales como hongos filamentosos, incluyen aquellos detallados en: van den Hondel, C.A.M. J.J. & Punt, P.J., 1991, "Gene Transfer systems and vector development for filamentous füngi", en: Applied molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, y otros, eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge. Alternativamente, LPKSRP de la invención puede expresarse en células de insectos usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de polipéptidos en células de insectos cultivados (v.gr., células Sf9) incluyen las series de pAc (smith y otros, 1983, Mol. Cell Bio., 3:2156-2165) y la serie de pVL (Lucklo and Summers, 1989, Virology 170:31-39) . En aún otra modalidad, un ácido nucleico de LPKSRP de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamíferos. Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329:840) y PMT2PC (Kaufman y otros, 1987, EMBO J. 6:187-195). Cuando se usa en células de mamíferos, las funciones de control de vector de expresión con frecuencia provisto por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus, y Virus 40 de Simios. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procarióticas y eücarióticas, véase capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E.F., y Maniatis, T. Moleculr Cloning: A Laboratory Manual. Última ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. En otra modalidad, el vector de expresión de mamíferos recombinante es capaz de dirigir la expresión de ácido nucleico preferiblemente en un tipo de células particulares (v.gr., elementos reguladores específicos de tejidos se usan para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos para tejidos se conocen en la materia. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos para tejidos adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico para hígado; Pinkert y otros, 1987, Genes Dev., 1:268-277), promotores específicos para linfoides (Caíame y Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-275), en promotores particulares de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733), y las inmunoglobulinas (Banerji y otros, 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748), promotores específicos para neuronas (V.gr., el promotor neurofilamentoso; Byme and Fuddle, 1989, PNAS 86:5473-5477), los promotores específicos para páncreas (EJdlund 'y otros, 1985, Science 230:912-916), y promotores específicos para glándulas de mamíferos (v.gr., promotor de suero de leche; Patente de E.U.A. No. 4,873,316 y Publicación de Solicitud Europea no. 264,166). Los promotores regulados por el desarrollo también se abarcan, por ejemplo, los promotores homeóticos de murinos (Kessel and Gruss, 1990, Science 249:374-379) y el promotor de fetopolipéptido (Campes y Tilghman, 1989, Genes Dev. 3:537-546). Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y técnica de transfección usada, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (v.gr., resistencia a antibióticos o herbicidas) , generalmente se introduce en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato, o en plantas que confieren resistencia hacia un "herbicida tal como glifosato, glufosinato, o imidazolinona. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un marcador seleccionable pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica LPKSRP o puede introducirse en un vector separado. La estabilidad de células transfectadas con la molécula de ácido nucleicos introducida pueden identificarse, por ejemplo, por la selección de herbicidas (v.gr., células que tienen incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras las otras células se mueren) . En una modalidad preferida de la presente invención, el LPKSRP se expresa en plantas y células de plantas tales como células de plantas unicelulares (v.gr. algas) (Véase Falciatore y otros, 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 y las referencias en la presente) y las células de plantas de plantas superiores (v.gr., los espermatofitos, tales como plantas de cultivos) . Un LPKSRP puede "introducirse" en una célula de planta por cualquier medio, incluyendo transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección y similares. Un método de transformación conocido por los expertos en la materia es el sumergimiento de una planta que florece en una solución de Agrobacteria, en donde la Agrobacteria contiene el ácido nucleico de LPKSRP, seguido por la producción de los gametos transformados. Otros métodos adecuados para transformar o transfectar las células huésped incluyendo las células de plantas pueden encontrarse en Sambrook, y otros (Molecular Cloning: A laboratory Manual, última ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) yotros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, protocolos de Agrobacterium, ed: Garthland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que el crecimiento de plantas incrementado y/o tolerancia a tensión biótica y abiótica son rasgos generales deseados para ser heredados en una amplia variedad de plantas como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, colza y cañóla, yuca, pimienta, girasol y tagetes, plantas solanáceas similar a papa, tabaco, berenjena, y tomate, especies Vicia, chícharo, alfalfa, plantas de arbustos (café, cacao, té) , especies Salix, árboles (dátil, coco) , pastos perenes, y cultivos de forraje, estas plantas de cultivos también son las plantas blanco preferidas para un tratamiento genético como una modalidad adicional, de la presente invención. Los cultivos de forraje incluyen, pero no s^ limitan a, planta de trigo blando, alpiste, pasto de la familia Bromus, Pasto Guía Silvestre, Pasto de Gramíneas, Pasto de huerto, alfalfa, Salfoina, Trébol de Pata de Ave, Trébol Alsike, Trébol Rojo y Trébol Dulce. En una modalidad de la presente invenicón, la transfección de un LPKSRP en una planta se logra por la transferencia de genes mediada por Agrobacterium. La transformación de plantas mediada por Agrobacterium puede realizarse usando por ejemplo GV3101 (pMP90) Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech) . La transformación puede realizarse por transformación normal y las técnicas de regeneración (Deblaere y otros, 1994, Nucí. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. and Schilperocrt, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2a Ed. Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. ; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993360 S., ISBN 0-84935164-2). Por ejemplo, la colza puede transformarse vía transformación de cotiledóneas o hipocotiledóneas (Moloney y otros, 198:3, Plant Cell Report 8:238-242; De Block y otros, 1989, Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para Agrobacterium y selección de plantas depende del vector binario y la cepa de Agrobacterium usada para la transformación. La selección de semilla de colza normalmente se lleva a cabo usando canamicina como marcador de plantas seleccionables. La transferencia de genes mediada por Agrobacterium a lino puede realizarse usando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova y otros, 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de soya puede realizarse usando por ejemplo una técnica descrita en la Patente Europea No. 0424 047, Patente de E.U.A. No. 5,322,783, Patente Europea No. 0397 687, Patente de E.U.A. No. 5,376,543, o Patente de E.U.A. No. 5,169,770. La transformación de maíz puede lograrse por bombardeo de partículas, absorción de ADN mediada por polietilenglicol, o vía la técnica de fibras de carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling and Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la Patente de E.U.A. No. 5,990,387, y un ejemplo específico de transformación de trigo puede encontrarse en la Solicitud de PCT No. WO 93/07256. De acuerdo con la presente invención, LPKSRP introducido puede mantenerse en la célula de la planta de manera estable si se incorpora en un replicón autónomo no cromosomal o integrado los cromosomas de la planta. Alternativamente, LPKSRP introducido ' puede estar presente en un vector sin replicación extracromosomal y puede expresarse temporalmente o ser temporalmente activo.

En una modalidad, puede crearse un microorganismo recombinante homólogo en donde LPKSRP se integra en un cromosoma, se preparó un vector que contiene por lo menos una porción de un gen de LPKSRP en el cual se ha introducido una supresión, adición o sustitución para alterar así, v.gr., alteración de funcionalidad, el gen de LPKSRP. Preferiblemente, el gen de LPKSRP es un gen de LPKSRP de Physcomitrella patens, pero puede ser un homólogo de una planta relacionada o aún de una fuente de mamífero, levadura o insectos. En una modalidad, el vector está diseñado de manera que, por recombinación de homólogos, el gen de LPKSRP endógeno se altera funcionalmente (es decir, ya no codifica un polipéptido funcional; también denominado como un vector de eliminación) . Alternativamente, el vector puede estar diseñado de manera que, por recombinación homologa, el gen de LPKSRP endógeno se muta o de alguna manera se altera pero aún codifica un polipéptido funcional (v.gr., la región reguladora corriente arriba puede alterarse para alterar así la expresión de LPKSRP endógeno) . Para crear una mutación de punto vía recombinación homologa, los híbridos de ADN-ARN se pueden usar en una técnica conocida como quimioplastía (Cole-Strauss y otros (1999) Nucí. Acids Res. 27(5): 1323-1330; Kmiec (1999) Gene Therapy American Scientist 87(3): 240-247). Los procedimientos de recombinación homologa en Physcomitrella patens también son bien conocidos en la materia y se contemplan para usarse en la presente. Mientas que en el vector de recombinación homólogo, la, porción alterada del gen LPKSRP se flanquea en sus extremos 51 y 3' por una molécula de ácidos nucleicos adicional del gen de LPKSRP para permitir que ocurra la recombinación homologa entre el gen de LPKSRP exógeno llevado a cabo por el vector y un gen de LPKSRP endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácidos nucleicos de LPKSRP de flanqueo adicional tiene longitud suficiente para la recombinación homologa exitosa con el gen endógeno. Normalmente, varios cientos de estos pares de base de hasta kilobases del ADN de flanqueo (ambos en los extremos 5' y 3') se incluyen en el vector (véase, v.gr., Thomas KR y Capecchi MR (1987) Cell 51: 503; Strepp y otros (1998) Proc. Nati. Acád. Sci. EUA $5(8): 4368-4373 para recombinación basada en ADNc en Physcomitrella patens) . El vector se introdujo en un microorganismo o célula de planta (v.gr., vía ADN mediada por polietilenglicol) , y las células en las cuales el gen de LPKSRP introducido se ha recombinado homólogamente con el gen de LPKSRP endógeno se seleccionan usando técnicas conocidas en la materia. En otra modalidad, pueden producirse microorganismos recombinantes que contienen sistemas que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen de LPKSRP o un vector que lo coloca bajo el control del operon lac permite la expresión del gen de LPKSRP en la presencia de IPTG. Dichos sistemas reguladores son bien conocidos en la materia. Si está presente en un vector no replicante extracromosomal o un vector que se integra en un cromosoma, el polinucleótido de LPKSRP reside preferiblemente en un cásete de expresión de plantas. Un cásete de expresión de plantas contienen preferiblemente secuencias reguladoras capaces de impulsar la expresión de genes en células de plantas que se ligan operativamente de manera que cada secuencia puede cumplir con su función, por ejemplo, la terminación de transcripción por señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan de ADNt de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y otros, 1984, EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales de los mismos, pero también son adecuados los otros terminadores funcionalmente activos en plantas. Dado que la expresión de gen de plantas con frecuencia no se limita en niveles transcripcionales, un cásete de expresión de plantas contiene preferiblemente otras secuencias operativamente ligadas, como mejoradores traslacionales tales como la secuencia sobre impulsada que contiene la secuencia líder no trasladada 5' de virus de mosaico de trabajo que aufrienta la relación de polipéptido por ARN (Gallie y otros, 1987, Nucleic. Acids Research 15:8693-8711). Ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen aquellos detallados en: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. y Masterson, R., 1992. Los nuevos vectores de plantas binarias con marcadores seleccionables localizados próximos al extremo izquierdo, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucí. Acid. Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. La expresión de genes de plantas deberá ligarse operativamente a un promotor apropiado que confiere expresión de genes en una forma a tiempo, específica para células o específica para tejidos. Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor que e$ capaz de iniciar la transcripción en una célula de plantas. Dichos promotores incluyen, pero no están limitados a, aquellos que pueden obtenerse de plantas, virus de plantas y bacterias que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium. El promotor puede ser constitutivo, inducible, de desarrollo en etapas preferido, de tipo celular preferido, de tejido preferido o de órganos preferido. Los promotores constitutivos son activos bajo la mayoría de condiciones. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen promotores CaMV 19S y 35 S (Odell y otros, 1985, Nature 313:818-812), el promotor de sX CaMV 35S (Kay y otros, 1987, Science 236:1299-1302) el promotor Sepl, el promotor de actina de arroz (McElroy y otros, 190, Plant Cell 2:163-171), el promotor de actina de Arabidopsis, el promotor de ubiquitin (Christensen y otros, 1989, Lant Molec. Biol. 18:675-689), pEmu (Last y otros, 1991, Thero. Appl. Genet. 81:581-588), el promotor de vi us de mosaico Figwort (Velten y otros, 1984, EMBO J. 3, 2723-2730), el promotor de GRP1-8, el promotor de alcohol deshidrogenasa de cinamilo (Patente de E.U.A. No. 5,683,439), promotores de ADN-T de Agrobacterium, tal como manopina sintasa, nopalina sintasa, y octopina sintasa, la subunidad pequeña de promotor ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRO-BISCO) , y similares. Los promotores inducibles preferiblemente son activos bajo ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque patogénico, condiciones anaeróbicas y similares. Por ejemplo, el promotor hspdO de Brassica se induce por choque por calor; el promotor de pPDK se induce por luz; el promotor de PR-1 de tabaco, Arabidopsis, y maíz pueden inducirse por infección con un patógeno; y el promotor de Adhl se induce por ipoxia y tensón por frío. La expresión gen de plantas también puede facilitarse vía un promotor inducible (paa revisión, véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Los promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se desea que la expresión de genes ocurra en una forma específica para el tiempo. Los ejemplos de dichos promotores son un promotor inducible de ácido salicílico (Aplicación de PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y otros, 1992, Plant J. 2:397-404), y un promotor inducible por etanol (Solicitud de PCT No. WO 93/21334) . En una modalidad preferida de la presente invención, el promotor inducible es un promotor inducible por tensión. Para los fines de la invención, los promotores inducibles preferiblemente son activos bajo una o más de las siguientes tensiones: condiciones subóptimas asociadas con tensión por salinidad, sequía, temperatura, metal, química, patogénica y oxidativa. Los promotores inducibles por tensión i?cluyen, pero no se limitan a, Cor78 (Chak y otros, 2000, Planta 210:875-883; Hovath y otros, 1993, Plant Physiol. 103:1047-1053), Corl5a (Artus y otros, 1996, PNAS 93(23) : 13404-09) , Rci2A (Medina y otros, 2001, Plant Physiol. 125: 1655-66; Nylander y otros, 2001, Plant Mol. Biol. 45:341-52; Navarre and Goffeau, 2000, EMBO J. 19:2515-24; Capel y otros, 1997, Plant Physiol. 115:569-76), Rd22 (Xiong y otros, 2001, Plant Cell 13:2063-83; Abe y otros, 1997, Plant Cell 9:1859-68; Iwasaki y otros, 1995, Mol. Gen. Genet. 247:391-8), cDetd (Lang and Palve, 1992, Plant Mol. Biol. 20:951-62), ADH1 (Hoeren y otros, 1998, Genetics 149:479-90), KAT1 (Nakamura y otros, 1995, Plant Physiol. 109:371-4), KST1 (MullerRober y otros, 1995, EMBO 14:2409-16), Rhal (Terryn y otros, 1993, Plant Cell 5:1761-9; Terryn y otros, 1992, FEBS Lett. 299(3) :287-90) , ARSK1 (Atkinson y otros, 1997, # de Acceso GenSank L22302, y solicitud de PCT No. WO 97/20057), PtxA (Plesch y otros, # de Acceso GenBank X67427). SbHRGP3 (Ahn y otros, 1996, Plant Cell 8:1477-90), GH3 (Liu y otros, 1994, Plant Cell 3:645-57), El promotor de gen PRP1 inducible por patógeno (Ward y otros, 1993, Plant. Mol. Biol. 22:361- 366) , el promotor de hspdO inducible por calor de tomate (Patente de E.U.A. No. 5187267), promotor de alfa-amilasa inducible por frío de papa (Solicitud de PCT No. WO 96/12814), o el promotor pinll inducible por heridas (Patente europea No. 375091). Para otro ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío y sal, tal como el promotor RD29A, véase Yamaguchi-Shinozalei y otros, 1993, Mol. Gen. Gent. 236:331-340. Los promotores preferidos en etapa en desarrollo se expresan preferiblemente en ciertas etapas de desarrollo. Los promotores preferidos para tejidos y órganos incluyen aquellos que se expresan preferiblemente en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas o xilemas. Los ejemplos de tejidos preferidos o promotores preferidos de órganos incluyen, pero no están limitados a promotores preferidos para fruta, preferidos para óvulos, preferidos para tejido masculino, preferidos para semillas, preferidos para integumento, preferidos para tuberos, preferidos para pedúnculos, preferidos para pericarpo, y preferidos para hojas, preferido para estigmas, preferidos para polen, preferidos para anteras, preferidos para pétalos, preferidos para sépalos, preferidos para pedicelos, preferidos para silique, preferidos para tallos, preferidos para raíces, y similares. Los promotores preferidos para semillas preferiblemente se expresan durante el desarrollo . y/o germinación de semillas. Por ejemplo, los promotores preferidos para semillas pueden ser preferidos para embriones, preferidos para endoespermas y preferidos para cubiertas de semillas. Véase Thompson y otros, 1989, Bioessays 10:108. Ejemplos de promotores preferidos de semillas incluyen, pero no están limitado a, celulosa sintasa (celA) , Ciml, gama-zeina, globulina-1, zeina de maíz 19 kD (CZ19B1), y similares. Otros promotores preferidos para tejido preferidos para órganos adecuados incluye el promotor de gen de napina de colza (Patente de E.U.A. No. 5,608,152), el promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein y otros, 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3): 459-67), el promotor de oleosina de Arabidopsis (Solicitud de PCT No. WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente de E.U.A. No. 5,504,200), el promotor de Bce4 de Brassica (Solicitud de Pct No. WO 91/13980), o el promotor de B4 de leguminas (LeB4; Baeumlein y otros, 1992, Plant Journal, 2(2): 233-9), así como promotores que confieren expresión específica para semillas en plantas monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados no son el promotor de genes lpt2 o lptl de cebada /Solicitud de PCT No. WO 95/15389 y Solicitud de PcT No. WO 95/23230) o aquellos descritos en la Solicitud de PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen hordeina de cebada, gen de glutelina de arroz, gen de orizina de arroz, gen de prolamina de arroz, gen de gliadina de trigo, gen de glutelina de trigo, gen de glutelina de avena, gen de kasirina de sorgo, y gen de secalina de centeno) . Otros promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen, pero o están limitados a, el promotor de proteína de unión a/b de clorofila principal, promotores de histona, el promotor de Ap3, el promotor de ß-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lectina de soya, el promotor de zeina de maíz 15kD, el promotor de zeina 22kD, el promotor de zeina 27kD, el promotor de g-zeina, los promotores ceroso, encogido 1, encogido 2, y de bronce, el promotor de Zml3 (Patente de E.U.A. No. 5,086,169), los promotores de poligalacturonasa de maíz (PG) (Patentes de E.U.A. Nos. 5,412,085 y 5,545,546), y el promotor de SGB6 (Patente de E.U.A. No. 5,470,359), así como promotores sintéticos y otros naturales. La flexibilidad adicional para controlar la expresión de genes heterólogos en plantas puede obtenerse usando dominios de unión de ADN y elementos de respuesta de fuentes heterólogas (es decir, Dominios de unión de ADN de fuentes que no son plantas) . Un ejemplo de dicho dominio de unión de ADN heterólogo es el dominio de unión de ADN LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43:729-736). La invención además provee un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN LPKSRP de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación de contrasentido. Es decir, la molécula de ADN se li a operablemente a una secuencia reguladora en una forma que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que está en contrasentido a un ARNm de LPKSRP. Se pueden elegir las secuencias reguladoras ligadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación de contrasentido que dirige la expresión continua de la molécula de ARN de contrasentido en una variedad de tipos de células. Por ejemplo, los promotores virales y/o mejoradores, o secuencias reguladoras pueden elegirse las cuales dirigen la expresión constitutiva, específica para tejidos o específica para tipos de célula de ARN de contrasentido. El vector de expresión de contrasentido puede tener la forma de un plásmido, fagémido o virus atenuado recombinante en donde los ácidos nucleicos de contrasentido se producen bajo el control de una alta región reguladora de eficiencia. La actividad de la región reguladora puede determinarse por el tipo de células, en la cual es vector se introduce. Para una discusión de la regulación de expresión de genes usando genes de contrasentido, véase Weintraub, H. y otros, 1986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews -Trands in Genetics, Vol. 1(1), y Mol. y otros, 1990, FEBS Letters 268:427-430. Otro aspecto de la invención pertenece a células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan intercambiablemente en la presente. Se entiende que dichos términos se refieren no solo a la célula particular de atención sino que también se aplica a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un L^KSRP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insectos, células fúngicas, o células de mamíferos (tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) o células de COS) , algas, ciliados, células de plantas, hongos y otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células huésped adecuadas son conocidas por los expertos en la materia. Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo, se pueden usar para producir (es decir, expresar) un LPKSRP. Consecuentemente, la invención además provee métodos para producir LPKSRP usando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un LPKSRP, o en dicho genoma se ha introducido un gen que codifica un tipo silvestre o LPKSRP alterado) en un medio adecuado hasta que se produce LPKSRP. En otra modalidad, el método además comprende aislar LPKSRP del medio o la célula huésped. Otro aspecto de la invención pertenece a LPKSRP aislado y porciones biológicamente activas del mismo. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o porción biológicamente activa del mismo es libre de algún material celular cuando se produce por técnicas de ADN recombinantes, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de LPKSRP en el cual se separa el polipéptido de algunos de los componentes celulares de las células en las cuales se produce natural o recombinantemente. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un LPKSRP que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de material que no es LPKSRP (también denominado en la presente como un "polipéptido contaminante"), mas preferiblemente menor que aproximadamente 20% de material que no es LPKSRP, aún más preferiblemente menor a aproximadamente 10% de material que no es LPKSRP, y aún más preferiblemente menor. a aproximadamente 5% de material que no es LPKSRP. Cuando LPKSRP o porción biológicamente activa del mismo se produce recombinantemente, de preferencia también es sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y todavía más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación del polipéptido. El lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de LPKSRP ' en los cuales el polipéptido se separa de precursores químicos y otros químicos que se implican en la síntesis del polipéptido. En una modalidad, el lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos y otros químicos" incluye preparaciones de LPKSRP que tiene menos de aproximadamente 30% (por peso seco) de precursores químicos o químicos que no son de LPKSRP, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% precursores químicos o químicos qué no son LPKSRP, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o químicos que no so LPKSRP y aún más preferiblemente menos de aproximadamente 5%! de precursores químicos o químicos que no son LPKSRP. En modalidades preferidas, los polipéptidos aislados, o porciones biológicamente activas del mismo, carecen de polipéptidos contaminantes de los mismos organismos de los cuales se deriva el LPKSRP. Normalmente, dichos polipéptidos I se¡ producen por expresión recombinante de, por 'ejemplo, un i LPKSRP de Physcomitrella patens en una planta diferente a Physcomitrella patens, o microorganismos tales como C. gllutamicum, ciliados, algas u hongos. Las moléculas de ácidos nucleicos, polipéptidos, homólogos de polipéptidos, polipéptidos de fusión, iniciadores, vectores y células huésped descritas en la presente se pueden usar en uno o más de los siguientes métodos; identificación de Physcomitrella patens y organismos relacionados; mapear genomas de organismos relacionados con Physcomitrella patens, identificación y localización de secuencias de Physcomitrella patens de interés; estudios evolutivos; determinación de regiones de LPKSRP requeridas para la función; modulación de una actividad de LPKSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones de células; modulación de crecimiento de plantas o eficiencia de uso de riego de plantas; modulación de resistencia a la tensión; y modulación de expresión de ácidos nucleicos de LPKSRP. En una modalidad de estos métodos, las funciones de LPKSRP como una proteína cinasa similar a lectina. La Physcomitrella patens de moho se relaciona a otros mohos tales como Ceratodon purpureus, que pueden crecer en ausencia de luz. Los mohos como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de identidad de secuencia en la secuencia de ADN y nivel de polipéptido que permite el uso de tafniz heterólogo de moléculas de ADN con sondas que evolucinan de otros mohos o u organismos, permitiendo así la derivación de una secuencia consensual adecuada para tamizado heterólogo o anotación funcional y predicción de funciones de genes en terceras especies. La capacidad de identificar dicha funciones puede tener, por lo tanto, una relevancia significativa, v.gr., la predicción de especificidad de sustrato de enzimas. Además, estas moléculas de ácidos nucleicos pueden servir como puntos de referencia para el mapeo de los genomas de mohos o genomas de organismos relacionados. Las moléculas de ácidos nucleicos de LPKSRP de la invención tienen una variedad de usados. Más importantemente, las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de la presente invención pueden usarse para transformar plantas, induciendo así a la tolerancia a tensiones tales como sequía, alta salinidad, y frío. La presente invención provee, por lo tanto, una planta transgénica transformada por un ácido nucleico de LPKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta da como resultado la tolerancia incrementada a tensión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención además provee que la planta transgénica puede seleccionarse, por ejemplo, de maíz, trigo, centeno, avena triticale, arroz, cebada, soya, cacahuate, algodón, colza, cañóla, yuca, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, papa, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, chícharos, alfalfa, café, cacao, té, especies de Salix, aceite de palma, coco, pasto perenne, y cultivos de forraje. En particular, la presente invención describe el uso de la expresión de PpLLPK-1 de Physcomitrella patens para tratar plantas con eficiencia de uso de agua incrementada y/o planta tolerantes a sequía, tolerantes a sal y/o tolerantes al frío. Esta estrategia se ha demostrado en la presente para Arabidopsis thaliana, pero su aplicación no se restringe a e ta planta. Consecuentemente, la invención provee una planta transgéncia que contiene un LPKSRP tal como PpLLPK-1 como se definió en SEC ID NO: 2, en donde la planta tiene crecimiento incrementado y/o una tolerancia incrementada a una tensión ambiental seleccionada de uno o más del grupo que consiste de tensiones por sequía, sal, calor o congelación. En una modalidad preferida, la tensión ambiental es la sequía. Consecuentemente, la invención provee un método pata producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica LPKSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado . tolerancia incrementada a tehsión ambiental comparado con una variedad tipo silvestre de la planta que comprende: (a) introducir en una célula de planta un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de LPKSRP, y (b) generar de la célula de la planta una planta transgénica con crecimiento incrementado y/o tolerancia incrementada a una tensión ambiental comparado con una variedad del tipo silvestre de la planta. La célula de la planta incluye, pero no se limita a, un protoplasto, célula productora de gametos y una célula que se regenera en una planta completa. Como se usa en la presente, el término "transgénico" se refiera a cualquier planta, célula de plantas, callos, tejido de plantas, o parte de plantas que contiene todo o parte de por lo menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante se integra establemente en un cromosoma o elemento extracromosomal estable, de manera que se pasa a generaciones sucesivas. En modalidades preferidas, el ácido nucleico de LPKSRP codifica una proteína que comprende el polipéptido de SEC ID NO: 2.

La presente invención también provee un método para modular un crecimiento y/o tolerancia de planta a una tensión ambiental que comprende, modificar la expresión de un ácido nucleico que codifica KPKSRP en la plana. El crecimiento y/o tolerancia de la planta a la tensión ambiental puede incrementarse o disminuirse como se logra incrementando o disminuyendo la expresión de un LPKSRO, respectivamente. De preferencia, el crecimiento y/o tolerancia de las plantas a la tensión ambiental se incrementa aumentando la expresión de un LPKSRP. La expresión de un LPKSRP puede modificase por cualquier método conocido por los expertos en la materia. Los métodos para incrementar la expresión de LPKSRP pueden usarse en donde la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en donde la planta transgénica, la planta puede transformarse con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican LPKSRP descritos, o la planta puede transformarse con un promotor que dirige la expresión de LPKSRP nativos en la planta, por ejemplo. La invención provee que dicho promotor puede ser preferido para tejidos, con desarrollo regulado, tensión inducible, o una combinación de los mismos. Alternativamente, las plantas no transgénicas pueden tener expresión de LPKSRP nativa modificada induciendo un promotor nativo. La expresión de PpLLPK-1 como se definió en la SEC ID NO: 2 en las plantas blanco puede lograrse por, pero no se limita a, uno de los siguiente ejemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible para tensión, (c) promotor inducido químicamente, y (d) sobre-expresión de promotor tratada con, por ejemplo, factores de transcripción derivadas por dedos de zinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275:657). En una modalidad preferida, la transcripción de LPKSRP se modula usando factores de transcripción derivados de dedos de zinc derivadas de factores de transcripción (ZFPs) como se describió en Greisman y Pabo, 1997, Science 275:657 y manufacturado por Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFP comprenden un dominio de reconocimiento de ADN y un dominio funcional que ocasiona la activación o represión de un ácido nucleico blanco tal como un ácido nucleico de LPKSRP. Por lo tanto, la activación y represión de ZFP puede crearse lo cual reconoce específicamente los promotores de LPKSRP descritos antes y usado para incrementar o disminuir la expresión de LPKSRP en una planta, modulando así el crecimiento y/o la tolerancia a la tensión de la planta. La presente invención también incluye la identificación de los homólogos de PpLLPK-1 como se definió en SEC ID NO: 2 en una planta blanco, así como el promotor de homología. La invención también provee un método para incrementar la expresión de un gen de interés dentro de una célula huésped comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a un LPKSRP, que comprende: (a) transformar la célula huésped con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica LPKSRP, y (b) expresar el LPKSRP dentro de la célula huésped, incrementando así la expresión del gen transcrito en respuesta al LPKSRP, comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. Además de introducir las secuencias de ácidos nucleicos de LPKSRP en plantas transgénicas, estas secuencias también pueden usarse para identificar un organismo como Physcomitrella patens, o un pariente cercano de la misma. También, pueden usarse para identificar la presencia de Physcomitrella patens, o un pariente del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención provee las secuencias de ácidos nucleicos de un número de genes de Physcomitrella patens; sondeando el ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mixta de microorganismos bajo condiciones estrictas con una sonda que amplia una región de un gen de Physcomitrella patens que es único para este organismo, se puede asegurar si está presente este organismo. Además, el ácido nucleico y moléculas de polipéptido de la invención puede servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no solo en el mapeo del genoma, sino también en estudios funcionales de polipéptidos de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para identificar la región del genoma al cual se une un polipéptido de unión de ADN de Physcomitrella patens particular, el genoma de Physcomitrella patens podría digerirse y los fragmentos incubados con el polipéptido de unión de ADN. Los fragmentos que se unen al polipéptido pueden sondearse adicionalmente con las moléculas de ácidos nucleicos de la invención, preferiblemente con etiquetas fácilmente detectables. La unión de dicha molécula de ácido nucleico al fragmento de genoma permite la localización del fragmento al mapa de genoma de Physcomitrella patens, y, cuando se realiza múltiples veces con enzimas diferentes, facilita una rápida determinación de la secuencia de ácidos nucleicos a la cual se unen los polipéptidos. Además, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden ser suficientemente idénticas a las secuencias de especies relacionadas que estas moléculas de ácidos nucleicos puede servir como marcadores para la construcción de un mapa geónómico en mohos relacionados. Las moléculas de ácidos nucleicos de LPKSRP de la invención también son útiles para estudios estructurales evolutivos y de polipéptidos. Los procesos en los cuales las moléculas de la invención participan se utilizan por una amplia variedad de células procarióticas y eucarióticas, comparando las secuencias de las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención a aquellos que codifican enzimas similares de otros organismos, la relatividad evolutiva de los organismos pueden evaluarse. Similarmente, dicha comparación permite una evaluación de cuáles regiones de la secuencia se conservan y cuales no, que puede ayudar a determinar las regiones del polipéptido que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es de valor para los estudios tratados con polipéptido y puede dar una indicación de lo que el polipéptido puede tolerar en términos de mutagénesis sin perder la función. La manipulación de las moléculas de ácidos nucleicos de LPKSRP de la invención pueden dar como resultado la producción de LPKSRP que tienen diferencias funcionales de LPKSRP tipo silvestre. Estos polipéptidos pueden mejorarse en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en mayores números en la célula de lo que es usual, o pueden disminuirse en eficiencia o actividad. El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum, hongos, algs, o ciliados en crecimiento de plantas y/o tolerancia a la tensión se pueden evaluar por el crecimiento del microorganismo o planta modificado bajo condiciones menos que adecuadas y luego analizando las características y/o metabolismo de crecimiento de la planta. Dichas técnicas de análisis son bien conocidas para alguien experto en la materia e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de polipéptidos, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, regímenes de evapotranspiración, rendimiento de plantas y/o cultivos general, floración, reproducción, establecimiento de semillas, crecimiento de raices, regímenes de respiración, regímenes de fotosíntesis, etc. (Aplicaciones de CLAR en Bioquímica en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm y otros, 1993 Biotechnology, vol. 3, Capítulo III: Product recovery and purification, página 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. y/u otros, 19888 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaelwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988 Biochemical separations, en: Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Capítulo 11, página 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Püblications) . Por ejemplo, los vectores de expresión de levaduras que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o fragmentos de los mismos pueden construirse y transformarse en Saccharomyces cerevisiae usando protocolos normales. Las células transgénicas resultantes pueden analizarse para interrumpir o alterar su crecimiento y/o tolerancia a tenciones a la sequía, sal, y temperatura. Similarmente, los vectores de expresión de plantas que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente, o fragmentos del mismo, pueden construirse y transformarse en una célula de planta apropiada tal como Arabidopsis, soya, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., usando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes y/o plantas derivadas de las mismas pueden analizarse para interrumpir o alterar su crecimiento y/o tolerancia a las tensiones por sequía, sal, y temperatura. El tratamiento de uno o más de los genes de LPKSRP de la intención también pueden dar corao resultado LPKSRP que tienen actividades alteradas, que impactan indirectamente el crecimiento, respuesta a la tensión, y/o tolerancia a la tensión de algas, plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales de metabolismo dan como resultado la producción de una variedad de productos (v.gr., peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno reactivas) , que pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos. Por ejemplo, se sabe que el peroxinitrilo trata con nitrilos las cadenas laterales de tirosina, inactivando así algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J.T., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3 (2) :226-235) . Mientras que estos productos normalmente se excretan, las células pueden alterarse genéticamente para transportar más productos de no normal para una célula tipo silvestre. Optimizando la actividad de uno o más de LPKSRP de la invención que están implicados en la exportación de moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia a la tensión de la célula. Adicionalmente, las secuencias descritas en la présente, o fragmentos de las mismas, se pueden usar para generar mutaciones de eliminación en los genomas de varios organismos, tales como bacterias, célula de mamíferos, células de levaduras y células de plantas (Girke, T., 1998, Thé Plant Journal 15:39-48). Las células de eliminación resultantes pueden evaluarse por su habilidad o capacidad para tolerar varias condiciones de tensión, su respuesta a varias condiciones de tensión y el efecto en el fenotipo y/o genotipo de la mutación. Para otros métodos de ianctivación de genes, véase Patente de E.U.A. NO. 6,004,804, "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraju y otros, 1999, Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17:246-252. Las estrategias de mutagénesis mencionadas antes para LPKSRP que dan como resultado el crecimiento incrementado y tolerancia a la tensión incrementada no significa que sean limitantes las variaciones en estas estrategias será fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Usando dichas estrategias e incorporado los mecanismos descritos en la presente, las moléculas de ácidos 1 nucleicos y polipéptidos de la invención se pueden usar para generar algas, ciliados, plantas, hongos, u otros microorganismos como C. Glutamicum expresando moléculas de ácidos nucleicos y polipéptidos de LPKSRP mutados de manera que se mejora la tolerancia al crecimiento y/o tensión. La presente invención también provee anticuerpos que se unen específicamente a un LPKSRP, o una porción del mismo, codificado por un ácido nucleico descrito en la presente. Los anticuerpos pueden estar hechos por muchos métodos bien conocidos (Véase, v.gr., Harlow y Lañe, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). En resumen, el antígeno purificado puede inyectarse en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para producir una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden ser purificados directamente, o las células del bazo pueden obtenerse del animal. Las células entonces pueden fusionarse con una línea de células inmortales y tamizarse para secreción de anticuerpos. Los anticuerpos pueden usarse para tamizar los bancos de clones de ácidos nucleicos para células que secretan el antígeno. Los clones positivos pueden secuenciarse. (Véase por ejemplo, Kelly y otros, 1992, Bio/Technology 10:163-167; Bebbington y otros, 1992, BioTechnology 10:169-175). Las frases "se une selectivamente" y se "une específicamente" con el polipéptido se refiere a una reacción de unión que determina la presencia del polipéptido en una población heterogénea de polipéptidos y otros biológicos. Por lo tanto, bajo condiciones de inmunoanálisis disipadas, los anticuerpos específicos unidos a un polipéptido particular no se unen en una cantidad importante a otros polipéptidos presentes en la muestra. La unión selectiva de un anticuerpo bajo dichas condiciones pueden requerir un anticuerpo que se seleccionan por su especificidad para un polipéptido particular. Una variedad de formatos de inmunoanálisis se puede usar para seleccionar anticuerpos que se unen selectivamente con un polipéptido particular. Por ejemplo, los inmunoanálisis de ELISA en fase sólida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunoreactivos con un polipéptido. Véase Harlow y Lañe, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Srping Harbor Puglications, New York, (1988), para una descripción de formatos de inmunoanálisis y condiciones que podrían usarse para determinar la unión selectiva. En algunos casos, es conveniente preparar anticuerpos monoclonales de varios huéspedes. Una descripción de técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales pueden encontrarse en Stites y otros, eds. "Basic and Clinical Immunology" (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif. Fourth Edition) y las referencias citadas en la presente, y en Halow and Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York 1988. A través de esta solicitud, se h hecho referencia a varias publicaciones. Las descripciones de todas estas publicaciones y las referencias citadas dentro de estas publicaciones y sus totalidades se incorporan aquí por referencia en esta solicitud con el fin de describir más completamente el estado de la técnica la cual pertenece esta invención. Se deberá entender que lo anterior se refiere a modalidades de la presente invención y que se pueden hacer numerosos cambios en la misma sin alejarse del alcance de la invención. La invención además se ilustra por los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar de ninguna manera como limitaciones impositivas sobre el alcance de las mismas. Por el contrario, deberá entenderse claramente que se puede reclasificar a otras varias modalidades, modificaciones y equivalentes del mismo que, después de leer la presente descripción, pueden hacer referencia para los expertos en la materia sin alejarse del espíritu de la presente invención y/o el alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS Ejemplo lj Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens Para este estudio, se usaron las plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedsw.) B.S.G. de la recopilación de la sección de los estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo. Se originan de la cepa 16/14 recopilada por H.L.K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que se subcultivó de una espora por Engel (1968, Am J. Bot. 55, 438-446) . La proliferación de las plantas se llevó a cabo por medio de esporas y por medio de regeneración de gametofitos. El protonema desarrollado de la espora haploide como un cloronema rico en cloroplastos y caulonema bajo en cloroplastos, en el cual se formaron los brotes después de aproximadamente 12 días. Estos crecieron para dar las gemetoforas que contienen anteridia y arquegonia. Después de la fertilización, los esporofitos diploides con una seta corta y la cápsula de esporas resultante, en la cual maduraron las meioesporas. El cultivo se llevó a cabo en una cámara climática a una temperatura de aire de 25°C e intensidad de luz de 55 micromoles~lm2 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y un cambio con la luz/oscuridad de 16/8 horas. Los mohos se modificaron antes en cultivo líquido usando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165:354-358) o se cultivaron en medio sólido Knop usando agar de oxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra) . Los protonemas usados para aislamiento de ARN y ADN se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se fragmentan cada 9 días y se transfiere a medio de cultivo fresco. Ejemplo 2: Aislamiento de ADN total de las plantas. Los detalles para el aislamiento de ADN total se refieren al trabajo de un peso fresco de 1 g de material de planta. Los materiales usados incluyen los siguientes reguladores: regulador CTAB: bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB) al 2% (p/v); 100 mM Tris HCl pH 8.0; 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA; solución reguladora de N-laurilsarcosina: N-laurilsarcosina al 10% (p/v); 100 mM Tris HCl pH 8.0; y 20 mM EDTA. El material de plantas se trituró bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a 2 ml de recipientes Eppendorf. El material de planta congelado se cubrió con una capa de 1 ml de solución reguladora de descomposición (1 ml de solución reguladora de CTAB, 100 µl de solución reguladora de N-laurilsarcosina, 20 µl de ß-mercaptoetanol y 10 µl de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60°C durante una hora con agitación continua. El homogenado obtenido se distribuyó en dos recipientes de Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por agitación con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para separación de fases, la centrifugación se llevó a cabo a 8000 x g y temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El ADN luego se precipitó a -70°C durante 30 minutos usando isopropanol enfriado en hielo. El ADN precipitado se sedimentó a 4°C y 10,000 g durante 30 minutos y se resuspensión de 180 µl de solución reguladora de TE (Sambrook y otros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-8769-309-6). Para purificación adicional, el ADN se trató con NaCl (concentración final de 1.2 M) y se precipitó de nuevo a -70°C durante 30 minutos usando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con etanol al 70%, el ADN se secó y subsiguientemente de absorbió en 50 µl de H20 + ARNse (concentración final de 50 mg/ml) . El ADN se disolvió durante la noche a 4°C y la digestión con ARNse se llevó a cabo subsiguientemente a 37 °C durante 1 hora. El almacenamiento del ADN tomó lugar a 4°C.

Ejemplo 3: Aislamiento de ARN total y poli- (A) + ARN y construcción de banco de ADNc de Physcomitrella patens Para la investigación de transcripciones, se aislaron el ARN total y ARN poli-(A) + . El ARN Poly (A) + se aisló usando Cyna BeadsR (Dynal, Osio, Norway) siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. Después de determinar la concentración del ARN o del ARN Poly(A)+, el ARN se precipitó por adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3M pH 4.6 y 2 volúmenes de etanol y se almacenó a -70°C. Para la construcción del banco de ADNc, la primera síntesis de hebras se logró usando transcriptasa inversa del Virus de Leucemia de murinos (Roche, Mannheim, Alemania) e iniciadores oligo-d(T), segunda síntesis de hebras por incubación con polimerasa I de ADN, enzima de Klenow y digestión de RNAsaH a 12°C (2 horas), 16°C (1 hora), y 22°C (1 hora). La reacción se detuvo por incubación a 64°C (10 minutos) y subsiguientemente se transfirió a hielo. Las moléculas de ADN de doble hebra se despuntaron por polimerasa de ADN T4 (Toche Mannheim) a 37°C (30 minutos). Los núcleótidos se removieron por extracción con fenol/cloroformo y columnas de centrifuga de Sepahdex G50. Los adaptadores de EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) se ligaron a los extremos ADNc por T4-DNA-ligasa (Roche, 12 °C, durante la noche) y se fosforiló por incubación con polinucleótido cinasa (Roche, 37°C, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa con bajo punto de fusión, se eluyeron moléculas de ADH mayores a 300 pares de base se eluyeron del gel, se extrajo fenol, se concentró en columnas de Llutip-D (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania), y se ligaron a los brazos del vector y empacaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express usando el Equipo Gigapack Gol (Strtagene, Amsterdam, Holanda) , usando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4: Secuenciación y función de anotación de ESJT de Physcomitrella patens. 1 Los bancos de ADNc como se describió en el Ejemplo 3, se usaron para secuenciar ADN de acuerdo con los métodos estándar, y en particular, por el método de terminación de cadena usando el Equipo de Reacción Listo para Secuenciación de Ciclos Terminador de Tinción Grande ABl PRISM (PerkinElmer, Weiterstadt, Alemania) . La secuenciación aleatoria se llevó a cabo después de la recuperación del plásmido preparativo sembrando en placas de DH10B en placas de agar (material y detalles de protocolo de Stratagene, Amsterdam, Netherlads) . El ADN de plásmidos se preparó de cultivos de E. coli desarrollados durante la noche en medio de Caldo Luria conteniendo ampicilina (Véase Sambrook y otros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de ADN Qiagene (Qiagen Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se usaron iniciadores de secuenciación con las siguientes secuencias de nücleótidos. 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' SEC ID NO: 3 5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3' SEC ID NO: 4 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' SEC ID NO: 5 Las secuencias se procesaron y anotaron usando el paquete de software EST-MAX provisto comercialmente por BioMax (Munich, Alemania) . El programa incorpora prácticamente todos los métodos de bioinformática importante para caracterización funcional y estructural de secuencias de proteínas. Por referencia, véase el sito en la red en pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA (investigaciones de base de datos de secuencia muy sensibles con calculados de significancia estadística; Pearson W.R., 1990, Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP y FASTA. Methods Enzymol. 183:63-98); BLAST (investigaciones de base de datos de secuencia muy sensible que calcula la significancia estadística. Altschul S.F. y otros, Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215:403-10); PREDATOR (predicción de estructura secundaria con alta precisión de secuencias múltiples y sencillas. Frishman, D. y Argos, P., 1997, 75% de presión en predicción de estructura secuencias de proteínas Proteins, 27:329-335); CLUSTALW: Múltiple sequence alignment. Thompson, J.D. y otros, 1994, CLUSTAL W (mejorando la sensibilidad de alineación de secuencias múltiples progresivas mediante el pesado de secuencias, las multas de espacios específicos para las posiciones y la elección de matriz de peso, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680); TMAP (Transmembrane región prediction from multiply aligned sequences. Persson, B. and Argos, P., 1994, Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing múltiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237: 1 E2-192); AL0M2 (Transmembrane región prediction from single sequences. Klein, P. y otros, Prediction of prptein function from sequence properties: A discrimínate analysis of a datábase. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Versión 2 by Dr. K. Nakai) ; PROSEARCH (Detection of PROSITE protein sequence patterns. Kolakowski L.F. Jr., Leunissen J.A.M., Smith J.E., 1992, ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919- 921) ; BLIMPS (Similarity searches against a datábase of ungapped blocks, J.C. Wallace and Henikoff S., 1992); PATMAT (a searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8:249-254. Written by Bill Alford) .

Ejemplo 5: Identificación de Physcomitrella patens OfeF que corresponde a PpLLPK-1 El ADN parcial de physcomitella patens para PpLLPK- 1 parcial se identificó en el programa de secuenciación de EST de Physcomitrella patens usando el programa EST-MAX a través de análisis de BLAST. La secuencia de aminoácido sµpervista PpLLPK-1 compartida con identidad de secuencia importante con proteína cinasas similares a lectina como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 Grado de identidad de Aminoácido y similitud de proteínas de Hanólogos PpLLPK Ejemplo 6: Clonación de ADNc de Physcomitrella patens de longitud completa que codifica para la amplificación de longitud completa de PpLLPK-1 Como se describe más adelante, una secuencia de longitud completa que corresponde a PpLLPK-1 (SEC ID NO: 1) se obtuvo realizando reacción en cadena de polimerasa (PRC) cOn EST específica para genes como el patrón de ADN. Los iniciadores de oligonucleótidos sintéticos (tWG-Biotech) para la reacción en donde: CCCGGGCACCACCAGTACCTTTGCGTATGTG (SEC ID NO: 6) y GTTAACGCTCAAAGTAATCTTGCCGTTCC (SEC ID NO: 7). Los iniciadores designados contienen un sitio de Xmal en la región 5' y un sitio de HPal en la región 3' para fines de clonación. Las condiciones de la reacción fueron condiciones estándar con polimerasa de ADN PWO (Roche) . RCP se llevó a cabo de acuerdo con condiciones normales y a los protocolos del fabricante (Sambrook y otros, 1989, Biometra T3 Thermocycler) . Los parámetros para la reacción fueron, cinco minutos a 94 °C seguido por cinco ciclos de un minuto a 50 °C, y 4 minutos a 72°C. Esto se siguió por veinticinco ciclos de un minuto a 94°C, un minuto a 65°C, y 4 minutos a 72°C. Estos parámetros generaron un fragmento de 4.0 kilobases de largo. El fragmento se extrajo de gel de agarosa con un Equipo de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) y se eligió en el vector TOPO pCR 2.1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se trasnsformaron en células Top 10 (Invitrogen) usando condiciones normales (Sambrook y otros, 1989) . Las células transformadas se seleccionaron para agar de LB conteniendo 100 µg/ml de carbenicilina, 0.8 mg X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactosido) , y 0.8 mg IPTG (isopropiltio-ß-D-galactosido) desarrollado durante la noche a 37 °C. Las colonias blancas se seleccionaron y usaron para inocular 3 ml de LB líquido donteniendo 100 µg/ml de ampicilina y crecen durante la noche a 37 °C. El ADN de plásmido se extrajo usando el Equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiéndolas instrucciones del fabricante. Los análisis de clones subsiguientes, y mapeo de restricción se llevó a cabo de acuerdo con técnicas de biología molecular normal (Sambrook y otros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Tabla 2 Esquema e iniciadores usados para clonar clones de longitud completa La secuencia de ANDc de longitud completa de PpLLPK-1 de Physcomitrella patens (SEC ID NO: 1) se muestra en la Figura 1. La secuencia de aminoácidos deducida de PpLLPK-1 de Phycomitrella patens (SEC ID NO. 2) se muestra en la Figura 2. PpLLPK-1 se analizó con Biomax y el Vector NTI.

La secuencia de aminoácidos de PpLLPK-1 tiene homología para las cinasas de proteína similar a lectina o cinasas receptoras de lectina (Tabla 1 y Figura 3) . Una investigación expansiva de de la secuencia de proteína de PpLLPK-1 contra una base de datos de secuencia de patentes usando numerosas secuencias identificadas de Pedant Pro (<e-50) con homología importante a la secuencia de PpLLPK-1. El porcentaje de similitud e identidad de las cinco secuencias más similares para la secuencia de PpLLPK-1 se muestran en la Tabla 3, y una alineación de estas secuencias se muestra en la Figura 4.

Tabla 3 Grado de identidad de Aminoácido y similitud y Secuencias de Homólogos PpLLPK-1 en solicitudes de Patentes Publicadas.

Gen ID Número de publicación Asignación Similitud(%) Identidad (%) ABB93833 WO200210210-A2 B Baayyeerr 4 466 33 ABB92247 WO200210210-A2 B Baayyeerr 4 455 32 ABB93318 WO200210210-A2 B Baayyeerr 4 444 32 ABB92654 WO200210210-A2 B Baayyeerr 4 444 31 AAB25109 WO200042171-A1 G Géénneessiiss 4 422 32 Ej emplo 7 : Tratamiento de Plantas de Arabidopsis por la sobre-expresión del gen de Subclonación de PpLLPK-1 de PpLLPK-1 en el vector binario El fragmento que contiene la secuencia de PpLLPK-1 de Physcomitrella patens se subclonó del vector de PCR2 . 1 TOPO recombinante por digestión doble con enzimas de restricción (Véase Tabla 4) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento subsiguiente se extrajo del gel de agarosa con un Equipo de Extracción de Gel QIAquick (QIAgen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y ligadas en el vector binario que se separó con Smal y Hpal y se desfosforiló antes de la ligación. El vector recombinante resultante contuvo el factor de transcripción correspondiente en la orientación de sentido bajo el promotor constitutivo.

Tabla 4 Se enlistan los nombres de las estructuras para transformación de plantas Transformación de Agrobacterium. Los vectores recombinantes se transformaron en Agrobacterium Tumefacines C58C1 y PMP90 de acuerdo con las condiciones normales (Hoefgen y Willmitzer, 1990) . Transformación de Plantas. El Ecotipo de Arabidopsis thaliana C24 se desarrolló y transformó de acuerdo con condiciones normales (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris, 316:1194-1199; Bent y otros, 1994, Science 265:1856- 1860) . Tamiz de Crecimiento: Las plantas TI se tamizaron para resistencia al agente de selección conferido por el gen marcador seleccionable y se recopilaron las semillas. Las se-nillas de T2 y T3 se tamizaron para resistencia al agente de selección conferida por el gen marcador seleccionable en placas, y plantas positivas se transplantaron en suelo y se desarrollaron en una cámara de crecimiento durante 3 semanas. La humedad de suelo se mantuvo durante este tiempo aproximadamente a 50% de la capacidad de mantenimiento de agua máxima de suelo. La pérdida de agua total (transpiración) por la planta durante este tiempo se midió. Después de tres semanas, todo el material de plantas molido antes se recopiló, secó a 65 °C durante 2 días y se pesó. Los resultados se muestran en la Tabla 5. La relación del peso seco de plantas fundamentado antes para el uso de agua de las plantas es Eficiencia de Uso de Agua (WUE, por sus siglas en inglés) . La Tabla 5 muestra WUE medio, error estándar para WUE, peso seco de plantas medio (DW) , y error estándar para DW para PpLLPK-1 sobre-expresan plantas, los controles de tipo silvestre y controles d un solo vector transgénico. Los datos son de aproximadamente 50 plantas por genotipo, 5 plantas cada una dé 10 líneas transgénicas independientes, y 2 experimentos independientes .

Tabla 5 Ensayo PpLLPK-1 G 2.33 0.05 0.185 0.006 Control de G 1.95 0.05 0.112 0.006 tipo silvestre G 2.26 0.04 0.165 0.004 Control de vector solamente Control de J 1.94 0.08 0.119 0.008 tipo J 1.70 0.08 0.100 0.007 silvestre Control de J 1.66 0.07 0.082 0.007 Vector Solamente Los datos anteriores se resumen en la Tabla 6 siguiente presentando la diferencia porcentual del veto solamente y los controles de tipo silvestre para las plantas de sobre-expresión de PpLLPK-1. Los datos muestran que las plantas de PpLLPK-1 tiene un incremento importante en DW y WUE, comparado con los controles. Las plantas que expresan PpLLPK-1 demostraron un incremento de aproximadamente 29-42% se incrementa en peso seco comparado con los controles y un incremento aproximadamente de 10-17% en eficiencia de uso de agua comparado con los controles.

Tabla 6 Ensayo WUE(% diferencia) DW(% diferencia) Relativo a Relativo a Relativo a Relativo a G ' control de control de control de control J tipo solo vector tipo solo de silvestre silvestre vector +20 +3 +65 +12 +14 +17 +19 +46 +17 +10 +42 +29 Las plantas de sobre-expresión de PpLLPK-1, las plantas de control de tipo silvestre y plantas de control de un solo vector transgénico también se sometieron a cualquiera de las condiciones de buen riego o a varios ciclos de tensón por sequía, y se midió o la biomasa molida antes de las plantas. Los valores de peso seco medio y el error estándar para las plantas de sobre-expresión de PpLLPK-1, las plantas de control de tipo silvestre y las plantas de control de un solo vector se dan en la Tabla 7, que se presenta como Figura 5, bajo condiciones de buen riego y ciclización de sequía. Estos datos de DW se expresaron en la Tabla 8 como el porcentaje de diferencia del control tipo silvestre y demuestra que la sobre-expresión de PpLLPK-1 incrementó la DW por 25% bajo el buen riego y los ciclos repetidos de tensón por sequía: Tabla 8 DW con buen riego DW de sequía en ciclos (diferencia %) (diferencia %) +25 +25 Tamizado de Tolerancia de Sequía. Las semillas de TI se transfieren a papel filtro estéril, seco, en una placa petri y se dejó desecar durante dos horas a RH de 180% (humedad relativa) en un Gabinete de Crecimiento Sanyo MLR- 350H, micromoles~lm2 (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) . El RH luego se disminuyó a 60%, y las semillas se desecaron además durante ocho horas. Las semillas luego se removieron y colocaron en placas de 1/2 agar MS 0.6% suplementado con 2 µg/ml de benomilo (Sigma-Aldrich) y se clasificaron después de cinco días. Las plantas transgénicas se tamizaron luego para su tolerancia a la sequía mejorada, demostrando que el transgene confiere tolerancia a la sequía. Tamizado de Tolerancia a Congelación. Las semillas sé cambiaron a placas petri conteniendo 1/2 de agar MS 0.6% suplementado con 2% sacarosa y 2 µg/ml de benomilo. Después de cuatro días, las semillas se incubaron a 4°C durante 1 hora y luego se cubrieron con hielo rasurado. Las semillas se colocaron en una Cámara Ambiental ES2000 de Environmental Specialist y se incubaron durante 3.5 horas iniciando a - 1.0°C, y disminuyendo -1°C eda hora. Las semillas luego se incubaron durante 3.5 horas iniciando a -5.0°C durante 24 horas y luego se dejaron descongelar a 5°C durante 12 horas. El agua se vertió, y las semillas se clasificaron después de 5 días. Las plantas transgénicas se tamizaron para su tolerancia al frío mejoradas, demostrando que la expresión de transgenes confiere tolerancia al frío. Tamizado de Tolerancia de Sal. Las semillas se transfirieron a papel filtro remojado en 1/2 MS y se colocaron en 1/2 de agar de MS 0.6% suplementado con 2 µg/ml de benomilo la noche anterior al tamizado de tolerancia a la sal. Para el tamizado de tolerancia a la sal, el papel filtro con las semillas se cambió a las pilas de papel filtro estéril, se remojó en 50 mM NaCl, en una placa petri. Despés dé dos horas, el papel filtro con las semillas se cambió a las pilas de papel filtro estéril, se remojó con 200 mM NaCl., en una placa petri. Después de dos horas, el papel filtro con las semillas se cambiaron a las palcas de papel filtro estéril, se remojaron en 600 mM NaCl, en una placa petri. Después de 10 horas, las semillas se cambiaron a placas petri conteniendo 1/2 de agar de MS 0.6% suplementado con 2 µg/ml de benomilo. Las semillas se clasifican después de 5 días.

Ejemplo 8: Detección de los transgenes de pPSCL en las Líneas de Arabidopsis Transgénicas. Una hoja de un tipo silvestre y una planta de ARabidopsis transgénica es homogenizada en 250 µl de solución reguladora de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) (2% CTAB, 1.4 M NaCl, 8 mM EDTA, y 20 mM Tris, pH 8.0) y lµl ß-mercaptoetanol . Las muestras se incubaron a 60-65°C durante 30 minutos, y 250 µl de Cloroformo se agregaron luego a cada muestra. Las muestras se revolvieron durante 3 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos a 18,000 x g. El sobrenadante se tomó de cada muestra y se agregaron 150 µl de isopropanol. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos, y se centrifugaron durante 10 minutos a 18,000 x g. Cada pella se lavó con 70% de etanol, se secó y se resuspendió en 20 µl de TE. Luego, 2.5 µl de la suspensión anterior se usó en una reacción de RCP de 50 µl usando ADN polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido de vector binario con cada gen clonado puede usarse como control positivo y el ADN genómico de C24 tipo silvestre se usó como control negativo en las reacciones de RCP. Luego, 10 µl de cada reacción de RCP se analizó en gel de agarosa/bromuro de etidio a 10.8%. El programa de RCP puede ser el siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 30 segundos a 62°C y 1 minuto a 72°C, seguido por 5 minutos a 72°C. Los iniciadores específicas para genes se listan en seguida.

Ejemplo 9: Detección del ARNm del transgene de PpLLPK-1 en líneas de Arabidopsis transgénicas La expresión de transgenes se detecta usando RCP-TA. El ARN total se aisló de plantas tratadas por tensión usando un procedimiento adaptado de (Verwoerd y otros, 1989, NAR 17:2362). Las muestras de hojas (50-100 mg) se recopilaron y molieron a un polvo fino en nitrógeno líquido. El tejido molido se resuspendió en 500 µl de una mezcla al 1:1, 80°C, de fenol para la extracción de solución reguladora (100 mM LiCl, 100 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA, 1% SDS), seguid por remolino breve para su mezclado. Después de la adición de 250 µl de cloroformo, cada muestra se revolvió brevemente. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 12,000 x g. La fase acuosa superior se removió a un tubo de Eppendorf frescor. El ARN se precipitó agregando un volumen de l/10th de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol al 95%. Las muestras se mezclaron por inversión y se colocaron en hielo durante 30 minutos. El ARN se formó en pellas por centrifugación a 12,000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se removió y las pellas se secaron brevemente al aire. Las pellas de la muestra de ARN se resuspendieron en agua tratada de DEPC de 10 µl.

Para remover el ADN contaminante de las muestras, pueden tratarse con DNasa libre de RNasa (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ADNc se sintetizó de ARN total usando el Sistema de Síntesis de ADNc de la Primera Hebra Superscript para PCT-TA (Gibco-BRL) siguiendo la,s recomendaciones del fabricante. Para amplificación de RCP de un fragmento específico para genes del ADNc sintetizado se lleva a cabo usando Taq ADN polimerasa (Roche) e iniciadores específicos para genes (Véase Tabla 13 para iniciadores) en la siguiente reacción: solución reguladora de RCP IX, 1.5 mM MgCl2, 0.2 µM dNTPs, 1 unidad de polimerasa, 5 µl de ADNc de la reacción de síntesis. La amplificación se realizó bajo las siguientes condiciones: Desnaturalización, 95°C, 1 minuto; recocido, 62°C, 30 segundos; extensión, 72°C, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72°C, 5 minutos; mantenimiento por siempre de 4°C. Los productos de RCP se corren en gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio, y se visualizó bajo luz UV usando el sistema de documentación de gel Quantity-One (BioRad) .

Ejemplo 10: Tratamiento de plantas de soya tolerantes a tensión por la sobre-expresión del gen de PpSCL-1 Las semillas de soya son esterilizadas en su superficie con 70% de etanol durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por 20% (v/v) de Clorox suplementado con 0.05% (v/v) Tween durante 20 minutos con agitación continua. Luego las semillas se enjuagan 4 veces con agua destilada y se coloca en papel filtro estéril humectado en una placa Petri a temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Los revestimientos de semillas se desprenden y las cotiledóneas se separan del eje de embriones. El eje de embriones se recopilan en una placa petri estéril abierta a la mitad y secada al aire a un contenido de humedad menor a 20% (peso fresco) en una placa Petri sellada hasta uso adicional . El cultivo de Agrobacterium tumefaciens se preparó de una sola colona en medio sólido de LB mas antibióticos apropiados (v.gr., 100 mg/l de estreptomicina, 50mg/l de canamicina) seguido por el crecimiento de la única colonia en medio LB líquido a una densidad óptica a 600 nm de 0.8. Luego, el cultivo de bacterias se forma en pellas a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 100 µM de aCetosiringona. Los cultivos de bacterias se incubaron en este medio de preinducción durante 2 horas a temperatura ambiente antes de usarse. El eje de embriones de semilla cigótica de soya a aproximadamente un contenido de humedad del 15% se embebieron durante 2 horas a temperatura ambiente con el cultivo de suspensión de Agrobacterium preinducido.

Los embriones se removieron del cultivo de embebimiento y se transfirieron a placas Petri conteniendo medio de MS sólido suplementado con 2% de sacarosa e incubado durante 2 días, en la oscuridad a temperatura ambiente. Alternativamente, los embriones se colocaron en la parte superior del papel filtro estéril humectado (medio MS líquido) en una placa petri y se incubó bajo las mismas condiciones como se describió antes. Después de este período, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido suplementado con 500 mg/L de carbenicilina o 300 mg/L de cefotaxina para matar a las agrobacterias. El medio líquido se usó para humectar el papel filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25°C, bajo 150 µmoles m"2seg"1 de intensidad de luz y 12 horas de fotoperíodo durante aproximadamente 80 días. Las plantas transgénicas se tamizaron para su crecimiento mejorado y/o tolerancia a sequedad, sal y/o frío de acuerdo con el método tamizado descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión transgénica confiere crecimiento incrementado y/o tolerancia a la tensión incrementada.

Ejemplo 11: Tratamiento de plantas de Colza/Canola tolerantes a la tensión por la sobre-expresión del gen de PpLLPK-1. El método de la transformación de plantas descrito en la presente también se puede aplicar a Brassica y otros cultivos. Las semillas de cañóla son esterilizadas en la superficie con etanol al 70% durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por 20% (v/v) Clorox suplementado con 0.05% (v/v) Tween durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. Luego, las semilla se enjuagan 4 veces con agua destilada y se colocaron en papel filtro estéril en una placa petri a temperatura ambiente durante 18 horas. Luego los revestimientos de semillas se removieron y las semillas se secaron al aire durante la noche en una placa petri estéril abierta a la mitad. Durante este periodo, las semillas sueltan aproximadamente 85% de su contenido de agua. Las semillas se almacenan entonces a temperatura ambiente en una placa Petri sellada hasta que se usa. Las construcciones de ADN y el embebimiento de embrión son como se describió en el Ejemplo 10. Las muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) se analizaron por RCP para confirmar la presencia de ADN-T. Estos resultados se confirmaron por hibridización Southern en la cual el ADN se electroforó en un gel de agarosa al 1% y se transfirieron a una membrana de nylon cargada positivamente (Roche Diagnostics) . El Equipo de Síntesis de Sonda de RCP D?G (Roche Diagnostics) se usa para preparar una sonda marcada con digoxigenina por RCP, y se usa como se recomienda por el fabricante. Las plantas transgénicas se tamizan luego para su crecimiento mejorado y/o tolerancia de tensión de acuerdo con el método de tamizado descrito en el Ejemplo 7 demuestra que la expresión transgene confiere el crecimiento incrementado y/o tolerancia a la tensión incrementada.

Ejemplo 12: Tratamiento de plantas de maíz tolerantes a la tensión por el gen de PpLLPK-1 de sobre-expresión Transformación de maíz (Zea Mays L.) se llevó a cabo con el método descrito por Ishida y otros 1996, Nature Biotech 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que portan vectores "super binarios", y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Este procedimiento provee una eficiencia de transformación de entre 2.5% y 20%. Las plantas transgénicas se tamizan luego para su tolerancia al crecimiento y/o sequía, sal y frío mejorados de acuerdo con el método de tamizado descrito en el Ejemplo 7 que demuestra que la expresión de transgenes confiere tolerancia al crecimiento incrementado y/o tensión incrementada.

Ejemplo 13: Tamizado de Invernadero para plantas de maíz tolerante sde tensión - Tamiz de Desempeño de Sequía de Alto Rendimiento Las semillas de maíz transgénicas de segregación para un evento de transformación se plantan en pequeñas macetas. Cada una de estas plantas se marcan únicamente, se muestrean y analizan para el número de copias de transgenes. Los transgenes de plantas positivas y negativas se marcan y emparejan con tamaños similares para transplantarse juntos a macetas grandes. Esto provee un ambiente uniforme y competitivo para las plantas positivas y negativas de transgenes. Las macetas grandes se riegan a cierto porcentaje de la capacidad de agua de campo del suelo dependiendo de la severidad de tensión de agua deseado. El nivel de agua de suelo se mantiene regando cada otro día. Los rasgos de crecimiento y fisiología de plantas tales como altura, diámetro de tallo, enrollamiento de hojas, marchitamiento de plantas, régimen de extensión de hojas, estado de agua en las hojas, contenido de clorofila y régimen de fotosíntesis se midieron durante el período de crecimiento. Después de un período de crecimiento, la porción molida anterior de las plantas se recupera y el peso fresco y peso seco de cada plana se toman. Después se hace una comparación de fenotipo entre las plantas positiva y negativa transgénica.

Ejemplo 12: Tratamiento de plantas de maiz tolerantes a la tensión por la sobre-expresión del gen PpLLPK-1. La transformación de maíz (Zea Mays L.) se lleva a cabo con el método descrito por Ishida y otros. 1996. Nature Biotech 14745-50. Los embriones inmadures se co-cultivron con Agrobacterium tumefaciens que portan vectores "super binarios" y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Este procedimiento provee una eficiencia de transformación de entre 2.5% y 20%. Las plantas transgénicas luego se tamizan para su tolerancia a crecimiento y/o sequía, sal y al frío mejorada de acuerdo con el método de tamizado descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión de transgenes confiere crecimiento incrementado y/o tolerancia a la tensión incrementada.

Ejemplo 13: Tamizado de invernadero para planas de maíz tolerantes a la tensión - Tamizado de Desempeño de Sequía de Alto Rendimiento Semillas de maíz transgénicos de segregación para un evento de transformación se plantaron en macetas pequeñas. Cada una de estas plantas se marca, muestrea y analiza únicamente para el número de copias de transgenes. Las plantas positiva y negativa de transgenes se marca y empareja cOn tamaños similares para transplantar junto en macetas grandes. Esto provee un ambiente uniforme y competitivo para las plantas positivas y negativas de transgenes. Las macetas grandes se riegan a cierto porcentaje de la capacidad de agua del campo del suelo dependiendo de la severidad de tensión de agua deseado. El nivel de agua en el suelo se mantiene regando cada otro día. Las características de crecimiento y fisiología de plantas tales como altura, diámetro de tallos, enrollamiento de hojas, marchitamiento de plantas, régimen de extensión de hojas, estado de agua de hojas, contenido de clorofila y régimen de fotosíntesis se midieron durante el período de crecimiento. Después de un periodo de crecimiento de la porción molida anterior de las plantas se recupera y se toma el peso fresco y peso seco de cada planta. Luego se hace una comparación de fenotipo entre las plantas positivas y negativas de transgenes.

Análisis de Eficiencia de Uso de Agua (WUE) Las semillas de maíz positiva y negativa de transgenes para un evento de transformación se transplantan en una maceta con una cantidad de tierra y agua dadas. Las macetas se cubren con tapas que permiten que las semillas crezcan pero reduce la pérdida de agua. Cada maceta se pesa periódicamente y se agrega agua para mantener el contenido de a?ua inicial. Al final del experimento, el peso fresco y seco dé cada planta se mide, el agua consumida por cada planta se calcula y el WUE de cada planta se calcula. Los rasgos de crecimiento y fisiología de las plantas tal como WUE, altura, diámetro de tallo, enrollamiento de hojas, marchitamiento de plantas, régimen de extensión de hojas, estado de agua de hojas, contenido de clorofila y régimen de fotosíntesis se midió durante el experimento. Se hace una comparación de fenotipo entre las plantas transgénicas y plantas de control.

Análisis de Desecación Las semillas de maíz transgénica de segregación para un para un evento de transformación se planta en pequeñas macetas. Estas macetas se mantienen en un área en el invernadero que tiene condiciones ambientales uniformes, y se cultivan óptimamente. Cada una de estas plantas se marcan, muestrean y analizan únicamente para número de copias transgénicas. Las plantas se riegan repetidamente hasta saturación a intervalo fijo de tiempo. Este ciclo de agua/sequía se repitió mientras duró el experimento. Los rasgos de crecimiento y fisiología de plantas tales como altura, diámetro de tallo, enrollamiento de hojas, régimen de extensión de hojas, estado de agua en la hoja, contenido de clorofila y régimen de fotosíntesis se midieron durante el período de crecimiento. Al final del experimento, las plantas se recuperaron para peso fresco y seco molido, antes. Después se realizó una comparación del fenotipo entre las plantas positivas y negativas para el transgen. Tamizado de campo para plantas de maíz Segregación de tamizado de tolerancia a la sequía de maíz bajo condiciones libres de lluvia Se usó la tensión de sequía manejada en una sola ubicación o múltiples ubicaciones. La disponibilidad de agua de cultivos se controló por cinta de goteo o irrigación superior en una ubicación que tiene menos de 10 cm de lluvia y temperaturas mínimas mayores a 5°C esperado durante una temporada en promedio de cinco meses o una ubicación con precipitación en temporada esperada interceptada por un "refugio sin lluvia continua" automático que se retrae para proveer condiciones de campo abierto cuando no se requiere. Las prácticas agronómicas normales en el área se siguen para preparación, plantación, fertilización y control de plagas de suelo. Cada maceta se siembra con segregación de semillas para la presencia de un solo evento de inserción transgénico. Un análisis de números de copias de transgenes Taqman se usó en muestras de hojas para diferenciar los transgénicos de plantas de control de segregación nula. Las plantas que se han genotipificado de esta forma también se clasifican para una escala de fenotipos relacionados con tolerancia a la sequía, crecimiento y rendimiento. Estos fenotipos incluyen altura de plantas, peso de granos por planta, número de grano pOr planta, número de orejas por planta, peso seco molido antes, conductancia de hojas a vapor de agua, absorción de C02 de hojas, contenido de clorofila de hojas, parámetros de florecimiento de clorofila relacionada con fotosíntesis, eficiencia de uso de agua, potencial de agua de hojas, contenido de agua relativa en horas, régimen de flujo de savia de hojas, conductividad hidráulica del tallo, temperatura de hojas, reflectancia de hojas, absorbancia de luz de hojas, área de hojas, días de florecimiento, intervalo de antesis-formación de seda, duración de llenado de granos, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamaño de raíz, régimen de extensión de hojas, ángulo de hojas, enrollado de hojas y sobrevivencia. Todas las mediciones se hacen con instrumentación comercialmente disponible para fisiología de campo, usando los protocolos normales provistos por los fabricantes. Las plantas individuales se usaron como la unidad replicada por evento. Tamizado de tolerancia a la sequía de maíz sin segregación bajo condiciones libres de lluvia. Se usó la tensión de sequía manejada en una sola ubicación o múltiples ubicaciones. La disponibilidad de agua e? el cultivo se controló por cinta de goteo o irrigación superior en una ubicación que tiene menos de 10 cm de lluvia y temperaturas mínimas mayores a 5°C esperado durante una temporada en promedio de cinco meses o una ubicación con precipitación en temporada esperada interceptada por un "refugio sin lluvia continua" automático que se retrae para proveer condiciones de campo abierto cuando no se requiere. Las prácticas agronómicas normales en el área se siguen para preparación, plantación, fertilización y control de plagas de suelo. Cada maceta se siembra con segregación de semillas para la presencia de un solo evento de inserción transgénico. Un análisis de números de copias de transgenes Taqman se usó en muestras de hojas para diferenciar los transgénicos de plantas de control de segregación nula. Las plantas que se han genotipificado de esta forma también se clasifican para una escala de fenotipos relacionados con tolerancia a la sequía, crecimiento y rendimiento. Estos fenotipos incluyen altura de plantas, peso de granos por planta, número de grano por planta, número de orejas por planta, peso seco molido antes, conductancia de hojas a vapor de agua, absorción de C02 de hojas, contenido de clorofila de hojas, parámetros de florecimiento de clorofila relacionada con fotosíntesis, eficiencia de uso de agua, potencial de agua de hojas, contenido de agua relativa en horas, régimen de flujo de savia de hojas, conductividad hidráulica del tallo, temperatura de hojas, reflectancia de hojas, absorbancia de luz de hojas, área de hojas, días de florecimiento, intervalo de antesis-formación de seda, duración de llenado de granos, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamaño de raíz, régimen de extensión de hojas, ángulo de hojas, enrollado de hojas y sobrevivencia. Todas las mediciones se hacen con instrumentación comercialmente disponible para fisiología de campo, usando los protocolos normales provistos por los fabricantes. Las plantas individuales se usaron como la unidad replicada por evento. Tolerancia a la sequía de maíz con múltiples ubicaciones y tamizado de rendimiento Se seleccionan de cinco a veinte ubicaciones que abarcan las regiones de crecimiento de maíz principal. Estos se distribuyen ampliamente para proveer un rango de disposiciones de agua de maíz esperadas basado en la temperatura, humedad, precipitación y tipo de suelo promedio. La disponibilidad de agua en el cultivo no se modifica más allá de las prácticas agronómicas estándar. La distribución del ensayo se diseño para un par de gráficas que contienen un evento transgénico no segregante con una gráfica adyacente de controles de segregación nula. Una escala de fenotipos relacionados a tolerancia de sequedad, el crecimiento y rendimiento se clasificaron en loas gráficas en pares y se calcula a nivel d gráfica. Cuando la técnica de medición solo podría aplicarse a plantas individuales, estas se seleccionan en cada tiempo aleatorio desde la gráfica. Estos fenotipos incluyen altura de plantas, peso de granos por planta, número dé grano por planta, número de orejas por planta, peso seco molido antes, conductancia de hojas a vapor de agua, absorción de C02 de hojas, contenido de clorofila de hojas, parámetros de florecimiento de clorofila relacionada con fotosíntesis, eficiencia de uso de agua, potencial de agua de hojas, contenido de agua relativa en horas, régimen de flujo de savia de hojas, conductividad hidráulica del tallo, temperatura de hojas, reflectancia de hojas, absorbancia de lu? de hojas, área de hojas, días de florecimiento, intervalo de antesis-formación de seda, duración de llenado de granos, potencial osmótico, ajuste osmótico, tamaño de raíz, régimen de extensión de hojas, ángulo de hojas, enrollado de hojas y sobrevivencia. Todas las mediciones se hacen con instrumentación comercialmente disponible para fisiología de campo, usando los protocolos normales provistos por los fabricantes. Las plantas individuales se usaron como la unidad replicada por evento.

Ejemplo 14: Tratamiento de plantas de trigo tolerantes a la tensión sobre-expresando el gen PpLLPK-1 La transformación del trigo se llevó a cabo con el método descrito por Ishida y otros, 1996 Nature Biotech. 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que portan vectores "super binarios", y las plantas transgénicas se recuperaron a traes dé organogénesis. Este procedimiento provee una eficiencia de transformación entre 2.5% y 20%. Las plantas transgénicas se tamizan para su crecimiento mejorado y/o tolerancia a la tensión de acuerdo con el método de tamizado descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión de transgenes confiere tolerancia al crecimiento incrementado y/o tensión incrementada.

Ejemplo 15: Tratamiento de plantas de arroz tojerantes a la tensión por la sobreexpresion del gen de PpLLPK-1 El clon entrante que contiene ADNc de Physcomitrella patens que codifica PpLLPK-1 subsiguientemente se usa en una reacción de LR con p0831 un vector de destino usado para transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los límites de ADN-T: un marcador seleccionable de plantas; un cásete de expresión de marcador visual; y un cásete de Compuerta pretendido para recombinación de LR in vivo con la secuencia de interés ya clonado en todo el clon. Un promotor de arroz para expresión constitutiva (SEC ID NO: 11 - véase la Figura 6 anexa) se localiza corriente arriba de este cásete de Compuerta. Después del paso de recombinación de LR el vector dé expresión resultante de p074 (Figura 7 unida) se transformó en la cepa de Agrobacterium LBA4404 y subsiguientemente a las plantas de Oryza sativa. Las plantas de arroz se dejaron desarrollar y luego se examinaron para crecimiento incrementado y/o tolerancia a la tensión.

Se generaron de aproximadamente 15 a 20 transformantes de PpLLPK-1 independientes (TO) . Los transformantes primarios se trasfirieron de cámaras de cultivo de tejidos a un invernadero para desarrollo y cultivo de semillas TI. Se retienen cinco eventos de los cuales la progenie de TI segregó 3:1 para presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos eventos, las semillas 10 TI que contiene el transgene (hetero y homocigotos) , y semillas 20 TI que carecen del transgene (nulicigotos) , se seleccionan por tamizado de marcador visual. Las plantas TI seleccionadas se transfieren a un invernadero. Cada planta recibe una marca de código de barras única para enlazar inambiguamente los datos de fenotipificación a la planta correspondiente. Las plantas de TI seleccionadas se desarrollan en el suelo en macetas de 10 cm de diámetro bajo los siguientes establecimientos ambientales: fotoperíodo = 11.5 h, intensidad de luz de día = 30,000 lux o más, temperatura en el día = 28°C superior, temperatura en la noche = 22°C, humedad relativa = 60- 70%. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se desarrollan lado a lado en posiciones aleatorias. De la etapa de siembra hasta la etapa de madurez las plantas se pasan varias veces a través de un gabinete de formación de imágenes digital. En cada punto se toman imágenes digitales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones de colores) se toman para cada planta de por lo menos 6 diferentes ángulos. Los datos contenidos para PpLLPK-1 en el primer experimento se confirmaron en un segundo experimento con plantas T2. Las líneas que tienen el patrón de expresión correcta se seleccionan para análisis adicional. Los lotes de semillas de las plantas positivas (los hetero y homocigotos) en TI, se tamizan monitoreando expresión de marcador Para cada evento los lotes de semillas heterocigotas se retienen para evaluación de T2. Dentro de cada lote de semillas se desarrolla un número igual de plantas positivas y negativas en el invernadero para evaluación. Las plantas transgénicas se tamizan para su crecimiento mejorado y/o tolerancia a la ansión de acuerdo con el método de tamizado descrito en el Ejemplo 7 demostrando que la expresión transgénica del gen de PpLLPK confiere crecimiento incrementado y/o tolerancia a la tensión en las plantas de arroz.

Ejemplo 16: Identificación de Genes Homólogos y Héterólogos Las secuencias de genes se pueden usar para identificar genes homólogos o heterólogos de ADNc o bancos genómicos. Los genes homólogos (v.gr., clones de ADNc de longitud completa) pueden aislarse vía hibridización de ácidos nucleicos usanado por ejemplo bancos de ADNc. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, 100,000 hasta 1,000,000 de bacteriófagos recombinantes se siembran y transfieren a membranas de nylon. Después de la desnaturalización con álcali, El ADN se inmoviliza en la membrana, v.gr., por entrelazamiento de UV. La hibridización se lleva a cabo a condiciones de alta restricción en solución acuosa, hibridización y enjuague como se realizó a una resistencia iónica de NaCl 1M a una temperatura de 68 °C. Las sondas de hibridización se generaron, por ejemplo, por marcado de transcripción del "nick" radioactivo (32P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania) . Las señales se detectaron por autoradiofragía. Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que se relacionan peor no son idénticos pueden identificarse en una forma análoga al procedimiento descrito antes usando hibridización de baja restricción y condiciones de lavado. Para hibridización acuosa, la resistencia iónica normalmente se mantiene a 1 M NaCl mientras la temperatura se disminuye progresivamente de 68 a 42°C. Aislamiento de secuencias de genes con homologías (O identidad/similitud de secuencias) solamente en un dominio diferente de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) pueden llevarse a cabo usando sondas de oligonucleótidos radiomarcados. Los oligonucleótidos radiomarcados se prepararon por fosforilación del extremo 5' de dos oligonucleótidos complementarios son recocidos y ligados para formar concatámeros . Los concatámeros de doble hebra se radiomarcan por, por ejemplo, marcado por transcripción del nick radioactivo ( P) (High Primer, Roche, Mannheim, Alemania) . Las señales se detectan por autoradiografía. Los genes parcialmente homólogos o heterológos que se relacionan pero no son idénticos pueden identificarse en una manera análoga al procedimiento descrito antes usando hibridización con baja restricción y condiciones de lavado. Para la hibridización acuosa, la resistencia iónica normalmente se mantiene a 1M NaCl mientras la temperatura disminuye progresivamente de 68 a 42 °C. El aislamiento de secuencias de genes con homologías (o identidad/similitud de secuencias) solo en un dominio distinto de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) puede llevarse a cabo usando sondas de oligonucleótidos radiomarcadas. Los oligonucleótidos radiomarcados se preparan por fosforilación del extremo 5' de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido cinasa T4. Los oligonucleótidos de complementariedad se recosen y ligan para formar concatámeros. Los concatámeros de doble hebra luego se radiomarcan por ejemplo, por transcripción del nick. La hibridización normalmente se lleva a cabo en condiciones de baja restricción usando concentraciones de oligonucleótidos alta. Solución de hibridización de oligonucleótidos: 6 x SSC M fosfato de sodio mM EDTA (pH 8) 0.5% SDS lOOµg/ml de ADN de esperma de almidón desnaturalizado % de leche seca sin grasa Durante la hibridización, la temperatura se disminuye escalonadamente a 5-10 °C por debajo del oligonucleótido Tm, o por debajo de la temperatura ambiente, seguido por los pasos de lavado y autoradiografía. El lavado se lleva a cabo con baja restricción, tal como 3 pasos de lavado usando 4 X SSC. Los detalles adicionales se describen por Sambrook, J. y otros, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, F.M. y otros, 1994, "Current Protocols in molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 17: Identificación de Genes Homólogos Tamizando Bancos de Expresión con Anticuerpos Los clones de ADNc pueden usarse para producir proteína recombinante por ejemplo en E. coli (v.gr., Qiagen QIAexpress pQE system) . Las proteínas recombinantes luego tienen afinidad normalmente purificada vía cromatorgrafía de afinidad de Ni-NTA (Qiagen) . Las proteínas recombinantes luego se usan para producir anticuerpos específicos por ejemplo usando técnicas normales para inmunización de conejos. Los anticuerpos son purificados por afinidad usando una columna de Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como se describió por Gy y otros, 1994, BioTechniques 17:257-262. El anticuerpo puede usarse para tamizar bancos de expresión de ADNc para identificar genes homólogo so heterólogos vía un tamizado inmunológico (Sambrook, J. y otros, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, F.M y otros, 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) .

Ejemplo 18: Mutagénesis In vivo La mutagénesis in vivo de microorganismos puede llevarse a cabo por el paso de ADN de plásmidos (u otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (v.gr., Bacillus spp, o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) , que se interrupen en sus capacidades de mantener la integridad de su información genética. Las cepas de mutadores normales tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de ADN (v.gr., mutHLS, mulD, mutT, etc., por referencia, véase Rupp, W.D., 1996, DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella p. 2277-2294, ASM: Washington) . Dichas sepas son bien conocidas por los expertos en la materia. El uso de dichas' cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M., 1994, Strategies 7:32-34. La transferencia de moléculas de ADN mutadas en plantas preferiblemente se realiza después de la selección y prueba en microorganismos. Las plantas transgénicas se generan de acuerdo con varios ejemplos dentro de la ejemplificación de este documento.

Ejemplo 19: Purificación del Producto Deseado de Organismos Transformados La recuperación del producto deseado de material de plantas (es decir, Physcomitrella patens o Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente o el sobrenadarte de los cultivos descritos antes puede realizarse pOr varios métodos bien conocidos en la materia. Si el producto deseado no se secreta de las células, las células pueden cosecharse del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y las célula pueden usarse por técnicas normales, tales como fuerza mecánica o tratamiento con sonido. Los órganos de plantas pueden separarse mecánicamente de otro tejido u órganos. Después de la homogenización, los desechos celulares se remueven por centrifugación y la fracción de sobrenadante que contiene las proteínas soluble se retienen para purificación adicional del compuesto deseado. Si el producto se secreta de las células deseadas, entonces las células se retiran del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la fracción de sobrenadante se retiene para purificación adicional. La fracción de sobrenadante del método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula deseada se retiene para purificación adicional. La fracción de sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a la cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula deseada se retiene en una resina de cromatografía mientras muchas impurezas en la muestra no, o en donde las impurezas se retienen por la resina, mientras que la muestra no. Dichos pasos de cromatografía pueden repetirse según sea necesario uáar las mismas resinas de cromatografía o diferentes. Alguien experto en la materia podría conocer bien la selección de resinas de cromatografía apropiadas y su aplicación más eficaz para se purifique una molécula particular. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración y almacenarse a una temperatura la cual la estabilidad del producto se aumenta la máximo. Hay una amplia disposición de métodos de purificación conocido en el material y el método precedente de purificación no se pretende que sea limitante. Dichas técnicas de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, 1986, D.F. Biochemical Engineering Fundamentáis, McGraw-HilL: New York. Adicionalmente, la identidad y pureza de lo compuestos aislados pueden evaluarse por las técnicas normales en la materia. Estos incluyen cromatografía de líquido de alto rendimiento (CLAR) , métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía de capa fina, NIRS, análisis enzimática, o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis se revisaron en: Patek otros, 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova otros, 1996, Biotekhnologiya 11 :27 -32; and Schmidt y otros, 1998, Bioprocess Engineer. 19:67-70; Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 1996, vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581, y p. 581587; Michal, G., 1999, Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallón, A. otros, 1987, Applications of CLAR in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- El uso de un polipéptido relacionado con tensión de proteína cinasa similar a lectina aislada que codifica ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de: a) un polinucleótido de SEC ID NO: 1; b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID NO: 2; c) un polinucleótido que comprende de por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de a) o b) anteriores; d) un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 70% con la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 sobre la región de codificación; y e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia que tiene por lo menos el 70% con la secuencia del ácido amino que se muestra en SEC ID NO: 2; para la manufactura de una planta transgénica con tolerancia incrementada a tensión ambiental seleccionada del grupo que consiste de sequía y baja temperatura.

2.- El uso de la reivindicación 1, en donde en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID NO: 2. 3.- El uso de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos 90% a la secuencia del ácido amino que se muestra en

SEC ID NO: 2.

4.- El uso de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende por lo menos 60 nucléotidos consecutivos de cualquiera de los polinucléotidos de a) o b) de la reivindicación 1.

5.- El uso de la reivindicación 1, en donde el adido nucleico comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos 90% con la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 sobre la región de código.

6.- El uso de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico está presente en un vector.

7.- El uso de la reivindicación 1, en donde la sobre-expresión del ácido nucleico en una planta incrementa lá tolerancia de la planta a la tensión ambiental.

8.- El uso de un primer ácido nucleico aislado que hibridiza bajo estrictas condiciones a un segundo ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de: (a) un segundo ácido nucleico que comprende un polinucleótido de SEC ID NO: 1; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEC ID NO: 2, en donde el primer ácido nucleico codifica a un polipéptido que funciona como un modulador de una respuesta de tensión ambiental en una planta, para la manufactura de una planta transgénica con tolerancia incrementada a tensión ambiental seleccionada del grupo que consiste de sequía y baja temperatura.

9.- Un método para incrementar la tolerancia de plantas transgénicas a una tensión ambiental seleccionada del grupo que consiste de sequía y baja temperatura que comprende, incrementando la expresión de un polipéptido relacionado con tensión de proteína de cinasa similar a lectina que codifica ácido nucleico en la planta, en donde el ácido nucleico es seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido de SEC ID NO: 1; (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID NO: 1; (c) un polinucleótido que comprende por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de a) o b) anteriores; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 70% con la secuencia del ácido amino que se muestra en SEC ID NO: 2.

10.- El método de la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica el poiipéptido de SEC ID NON: 2. 11.- El. método de la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90% a la secuencia del ácido amino que se muestra en

SEC ID NO: 2.

12.- El método de la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico comprende de por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos de a) o b) de la reivindicación 9.

13.- El método de la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico agregado comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90% con la secuencia de nucleótidos

14.- El método de la reivindicación 9, en donde la planta es transformada con un promotor que dirige la expresión del ácido nucleico.

15.- El método de la reivindicación 14, en donde el promotor es específico para tejidos.

16.- El método de la reivindicación 14, en donde el promotor es regulado en el desarrollo,

17.- Un método de producir una planta transgénica que contiene un polipéptido relacionado con tensión de próteína de cinasa similar a lectina que codifica un ácido nucleico en donde la planta tiene una tolerancia aumentada a una tensión ambiental seleccionada del grupo que consiste de seguía y baja temperatura comparada con una variedad tipo silvestre de la planta que comprende, transformando una célula de planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico y generando de la célula de la planta la planta transgénica, en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido de SEC ID NO: 1; (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEC ID NO: 2; (c) un polinucleótido que comprende de por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de a) o b) anteriores; (d) un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 70% con la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 sobre el código de región; y (e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 70% cpn la secuencia del ácido amino que se muestra en SEC ID NO: 2 ,

18.- El método de la reivindicación 17, en donde la planta es un monocotiledónea.

19.- El método de la reivindicación 17, en donde la planta es un dicotiledónea.

20.- El método de la reivindicación 17, en donde la planta es seleccionada del grupo que consiste de maíz, trigo, centeno, cebada, soya, cacahuate, algodón, semilla de colza, cañóla, yuca, pimienta, semilla de girasol, tagetes, plantas solanáceas papa, tabaco, berenjena, tomate, especias de Vicia, chícharo, alfalfa, café, cacao, té, especias de Salís, dátiles, coco, pasto y forraje.

21.- El método de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC ID NO: 2.

22.- El método de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico comprende de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90% a la secuencia de ácido amino que se muestra en SEC ID NO: 2.

23.- El método de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico comprende de por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polipéptidos de a) o b) de la reivindicación 17.

24.- El método de la reivindicación 17, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90% con la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 sobre el código de región.

25.- El método de la reivindicación 17, en donde la tolerancia de tensión de la planta es aumentada por la expresión incrementada del ácido nucleico en la planta.

26.- El método de la reivindicación 17, en donde la planta es transformada con un promotor que dirige la expresión del ácido nucleico.

27.- El método de la reivindicación 26, en donde el promotor es específico para tejidos.

28.- El método de la reivindicación 26, en donde en donde el promotor es regulado en el desarrollo.

29.- Una célula de planta transgénica transformada con un ácido nucleico como se define en SEC ID NO: 1.

30.- Una planta transgénica transformada con un ácido nucleico como se define en SEC ID NO: 1.

31.- Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula de planta de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la semilla es reproducción real por una tolerancia incrementada a tensión de sequía comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula de la planta.

32.- Un polipéptido relacionado con tensión de proteína de cinasa similar a lectina aislada como se define en SEC ID NO: 2 y secuencias que son por lo menos un 60% homologas a la secuencia de ácido amino completa que se muestra en SEC ID NO: 2.

33.- Un polipéptido relacionado con tensión de prpteína de cinasa similar a lectina que codifica la secuencia del ácido nucleico como se define en SEC ID NO: 1.