MX2007013734A - Terapia genica para trastornos de la medula espinal. - Google Patents

Abstract

Esta invencion proporcionan metodos y composiciones para tratar trastornos o danos que afectan la funcion motora y el control en un individuo. En un aspecto, la invencion proporciona un metodo para repartir un transgen a la medula espinal de un sujeto al administrar un vector viral neutropico recombinante que contiene el transgen. El vector viral permite el transgen a una region de nucleos cerebrales profundos del cerebro. Tambien proporciona composiciones y metodos para administrar un transgen a la medula espinal de un individuo al administrar un vector viral neurotropico recombinante que contiene un transgen a la region del cortex motor del cerebro del individuo.

Description

TERAPIA GENICA PARA TRASTORNOS DE LA MEDULA ESPINAL Esta solicitud reivindica prioridad como 35 U.S.C. § 119 (e) para la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/677.213, presentada el 2 de Mayo de 2.005, y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 60/790.217, presentada el 8 de Abril de 2.006, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos para tratar trastornos que afectan a la función motora de un sujeto y en particular, a la función motora afectada por enfermedad o lesión en el cerebro y/o la médula espinal .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia génica es una modalidad de tratamiento emergente para los trastornos que afectan al sistema nervioso central (SNC) . La terapia génica del SNC ha sido facilitada por el desarrollo de vectores virales capaces de infectar eficazmente neuronas post-mitóticas . El sistema nervioso central está formado por la médula espinal y el cerebro. La médula espinal conduce información sensorial desde el sistema nervioso periférico al cerebro y conduce información motora desde el cerebro a diversos efectores. Para una revisión de los vectores virales para el reparto génico al sistema nervioso central, véase Davidson et al. (2.003) Nature Rev. 4:353-364.

Los vectores de virus adenoasociados (AAV) se consideran útiles para la terapia génica del SNC debido a que tienen una toxicidad y un perfil de inmunogen^cidad favorables, son capaces de transducir células neuron&les, y son capaces de mediar la expresión a largo plazo en el SNC (Kaplitt et al. (1.994) Nat. Genet. 8:148-154; Bartlett et al. (1.998) Hum. Gene Ther. 9:1181-1186; y Passini et al. (2.002) J. Neurosci. 22:6437-6446) .

Una propiedad útil de los vectores AAV reside en la capacidad de algunos vectores AAV para experimentar un transporte retrógrado y/o anterógrado en las células neuronales. Las neuronas de una región del cerebro están interconectadas por axones a regiones distales proporcionando de ese modo un sistema de transporte para el reparto de vectores. Por ejemplo, un vector AAV puede ser administrado en o cerca de los terminales axónicos: de las neuronas. Las neuronas internalizan el vector AAV y lo transportan de una manera retrógrada a lo largo del axón hasta el cuerpo celular. Se han demostrado propiedades similares de los adenovirus, HSV, y virus de la pseudórrabia para el reparto de genes a estructuras distales dentro del cerebro (Soudas et al. (2.001) FASEB J. 15:2283-2285; Breakefield et al. (1.991) New Biol. 3:203-218; y DeFalco et al. (2.001) Science, 291:2608-2613) .

Varios grupos han referido que la transducción del cerebro por el serotipo 2 de AAV (AAV2) se limita al sitio de la inyección intracraneal (Kaplitt et al. (1.994) Nat. Genet. 8:148-154; Passini et al. (2.002) J. Neurosci. 22:6437-6446; Y Chamberlin et al. (1.998) Brain Res. 793:169-175). Informes recientes sugieren que el transporte axónico retrógrado de los vectores virales neurotrópicos también se puede producir en circuitos seleccionados de cerebro de rata normal (Kaspar et al. (2.002) Mol. Ther. 5:50-56 (vector AAV); Kasper et al. (2.003) Science 301:839-842 (vector lentiviral) y Azzouz et al. (2.004) Nature 429:413-417 (vector lentiviral). Roaul et al. (2.005) Mat. Med. 11 (4) : 423-428 y Ralph et al. (2.005) Nat. Med. 11 (4) : 429-433 informan de que la inyección intramuscular de lentivirus que expresan el ARN de interferencia de la Cu/Zn superóxido dismutasa humana (S0D1) de silenciamiento retrasaba el comienzo de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) en un modelo de roedor con ALS terapéuticamente relevante.

Las células transducidas por los vectores AAV pueden expresar un producto transgénico terapéutico, tal como una enzima o un factor neurotrófico, para mediar efectos beneficiosos intracelularmente. Estas células también pueden secretar el producto transgénico terapéutico, que puede ser absorbido con posterioridad por las células distales donde media sus efectos beneficiosos. Este proceso se ha descrito como una corrección cruzada (Neufeld et al. (1.970) Science 169:141-146) .

No obstante, existe la necesidad de composiciones y métodos para tratar la disfunción de la médula espinal que da como resultado una pérdida de función motora en pacientes humanos. Esta invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona métodos y composiciones para repartir un transgen a la médula espinal y/o la región del tronco encefálico de un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene el transgen en al menos una región de los núcleos cerebelares profundos (NCP) del cerebro del sujeto. El repartq viral se realiza en condiciones que favorecen la expresión del transgen en la médula espinal y/o la región del tronco encefálico.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos y composiciones para repartir un transgen a la médula espinal de un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene el transgen a la región del córtex motor del cerebro del sujeto. El reparto del vector viral se realiza en condiciones que favorecen la expresión del transgen en la médula espinal. Los vectores virales administrados a la región del córtex motor son internalizados por las neuronas motoras a través de su región del cuerpo celular y el transgen es expresado. El transgen expresado puede experimentar después transporte anterógrado a la porción terminal del axón de la neurona motora, que está presente en la médula espinal. Debido a la naturaleza del córtex motor, los vectores virales administrados a esta región del cerebro también pueden ser internalizados por los terminales axónicos de las neuronas motoras. El vector viral también puede experimentar transporte retrógrado a lo largo del axón de la neurona motora y ser expresado en el cuerpo celular de la neurona motora.

Adicionalmente se proporcionan composiciones y métodos para repartir un transgen a una neurona motora en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene el transgen a al menos una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro del sujeto. El reparto del vector se realiza en condiciones que favorecen la expresión del transgen en una neurona motora distante del sitio de administración.

Asimismo se proporcionan métodos y composiciones para repartir un transgen a una neurona motora en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico que contiene el transgen en la región del córtex motor del cerebro de sujeto y donde la administración se realiza en condiciones que favorecen la expresión del transgen en una neurona motora distante del sitio de administración.

En un aspecto alternativo, la invención proporciona composiciones y métodos para tratad un trastorno de las neuronas motoras en un sujeto admini$trando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene un transgen terapéutico en al menos una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro del sujeto. La administración se realiza en condiciones que favorecen la expresión de una cantidad terapéuticamente eficaz del transgen en al menos una subdivisión de la médula espinal y/o la región del tronco encefálico.

En un aspecto adicional más, la invención proporciona composiciones y métodos para mejorar los síntomas de un trastorno de las neuronas motoras en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene el transgen terapéutico en la región del córtex motor del cerebro del sujeto y en condiciones que favorecen la expresión del transgen en una cantidad terapéuticamente eficaz en al menos una subdivisión de la médula espinal y/o la región del tronco encefálico.

Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son solamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invención reivindicada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un esquema de cómo se podrían utilizar los NCP para transportar virus terapéutico a la médula espinal. Las lineas que se originan en el recuadro negro esbozando los NCP representan terminales axónicos que se originan en los cuerpos celulares (cabezas de flecha) localizados en la médula espinal.

La Figura 2 es una reproducción de una sección transversal histológica a través de la unión ponto-medular y el cerebelo, que muestra las tres regiones de los NCP.

La Figura 3 es una vista esquemática del cerebelo que ha sido cortado a lo largo de la linea del vermis (sección sagital) y después aplanada, asi como una sección horizontal a través de la médula espinal y una representación de la musculatura esquelética. Se muestran las rutas aferentes (entradas) principales.

La Figura 4 es un diagrama que muestra las rutas eferentes principales (salidas) de los NCP.

La Figura 5 muestra esquemáticamente los circuitos neuronales en el córtex cerebral, conectando las entradas con las salidas. Las fibras trepadoras se originan en el núcleo olivar inferior, que a su vez recibe entradas del córtex cerebral, la médula espinal y los sentidos especiales (visual y auditivo) . Las entradas de las fibras musgosas se originan en todos los demás aferentes tales como los aferentes vestibulares, los aferentes espinales, los husillos musculares, los tendones del órgano de Golgi, los receptores de las articulaciones, los receptores de la piel y el córtex cerebral. Existen asimismo tres tipos de inter-neuronas inhibidoras en el sistema intrínseco, incluyendo las células en cesta, las células de Golgi y las células estrelladas. Estas están implicadas en la inhibición lateral y en la fina sintonización de la función de las neuronas motoras.

Las Figuras 2 a 5 son reproducidas de Williams et al. (2.005) The Human Brain: Capitulo 3: The Cerebellum, disponible en el sitio web: www. vh . o q/adul / pi ovider/anatomy/Bra-i nAna tomy/Ch3Tex'r./ SectJonO /-html .

Las Figuras 6A a 6E muestran la tinción inmunopositiva de esfingomielina acida humana ("hASM") en secciones cerebelares sagitales después de la inyección de diferentes vectores de serotipo AAV [(A)2/l, (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 y (E)2/8] que codifican la ASM humana en los núcleos cerebelares profundos de ratones ASMKO.

Las Figuras 7A a 7E demuestran el transporte de la proteina esfingomielina acida humana ("hASM") a la médula espinal desde los núcleos cerebelares profundos. Este efecto se observó en ratones tratados con AAV2/2-ASM, AAV2/5-ASM, AAV2/7-ASM y AAV2/8-ASM (A) hASM jumento 10X; (B) hASM aumento 40X; (C) hASM confocal; (D) ChAT confocal; y (E) hASM y ChAT confocal.

La Figura 8 muestra gráficamente los niveles de producto homogeneizado de tejido cerebelar después de la inyección de diferentes vectores de serotipo AAV (2/1, 2/2, 2/5, 2/7 y 2/8) que codifican ASM humana en los núcleos cerebelares profundos (n=5/grupo) . Los grupos no conectados por la misma letra son significativamente diferentes (p<0,0001).

Las Figuras 9A a 9G muestran la tinción inmunopositiva con calbindina en secciones cerebelares sagitales después de la inyección de diferentes vectores de serotipo AAV [(A) 2/1, (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 y (E)2/8)] que codifican la ASM humana en los núcleos cerebelares profundos de ratones ASMKO.

Las Figuras 10A y 10B muestran 1 funcionamiento de un rotarod en aceleración y balanceo (a las 14 semanas de edad) en ASMKO (inyectados con AAV-ßgal), WT, y ratones ASMKO tratados con AAV-ASM (n=8/grupo) . Los grupos no conectados por la misma letra son significativamente diferentes. Los ratones a los que se ha inyectado AAV2/1-ASM y AAV2/8-ASM demostraron una latencia significativamente más larga (p<0,0009) a caer que los ratones ASMKO inyectados con AAV2/l-ßgal en el ensayo del rotarod en aceleración. Para el ensayo del rotarod en balanceo, los ratones a los que se habia inyectado AA2/1-ASM demostraron una latencia significativamente más larga (p<0,0001) a caer que los ratones inyectados con AAV2/l-ßgal.

Las Figuras HA y 11B muestran fl funcionamiento de un rotarod en ratones ASMKO (n=8), WT (n=8), y tratados bilateralmente con AAV-ASM (a las 20 semanas de edad) . Para el ensayo tanto de aceleración como de balanceo, los ratones tratados con AAV-ASM se comportaron significativamente mejor (p<0,001) que los ratones tratados con AAV2/l-ßgal ASMKO. El comportamiento de los ratones a los que se habia inyectado AAV2/1-ASM no era distinguible de los ratones de tipo salvaje en los ensayos de aceleración y balanceo.

La Figura 12A ilustra las conexiones entre las regiones de los núcleos cerebelares profundos (media, interpuesta, y lateral) y las regiones de la médula espinal (cervical, torácica, lumbar, y sacra) . La Figura 12B ilustra la conexión entre las regiones de los núcleos cerebelares profundos (media, interpuesta, y lateral) y las regiones del tronco encefálico (mesencéfalo, pons y bulbo raquídeo) . Las conexiones están representadas por flechas, que empiezan en la región del cuerpo celular de una neurona y terminan en la región del axón terminal de la neurona. Por ejemplo, las tres regiones de los NCP tienen cada una neuronas con cuerpos celulares que envian axones que terminan en la región cervical de la médula espinal mientras la región cervical de la médula espinal tiene cuerpos celulares que envian axones que terminan en las regiones media o interpuesta de los NCP.

La Figura 13 ilustra la distribución de la proteina fluorescente verde en el tronco encefálico, o las neuronas motoras superiores, después del reparto en los NCP de AAV que codifica la proteina fluorescente verde (GFP) .

La Figura 14 ilustra la distribución de la proteina fluorescente verde en las regiones de la médula espinal después del reparto en los NCP de AAV que codifica la proteina fluorescente verde (GFP) .

La Figura 15 ilustra la reducción de la tinción de la proteina acida fibrilar glial (GFAP) en el tronco encefálico después del reparto en los NCP de AAV que codifica IGF-1 en comparación con el reparto en NCP de AAV que codifica PVF.

La Figura 16 ilustra la reducción de la tinción de la proteina acida fibrilar glial (GFAP) con los núcleos oromotores (núcleo del trigémino, núcleo del hipogloso, y núcleo del facial) después del reparto en los NCP de AAV que codifica IGF-1 en comparación con el reparto en los NCP de AAV que codifica GFP.

La Figura 17 ilustra la reducción de la tinción de la proteina acida fibrilar glial (GFAP) por la médula espinal después del reparto en los NCP de AAV que codifica IGF-1 en comparación con el reparto en los NCP de AAV que codifica GFP.

La Figura 18 ilustra la distribución del ARNm de IGF-1 en el sistema nervioso central (SNC) después del reparto en los NCP de AAV que codifica IGF-1 en comparación con el reparto en los NCP de AAV que codifica la GFP. Se utiliza beta-actina como control positivo para comparar los niveles de ARNm totales.

La Figura 19 ilustra que el reparto en los NCP de AAV-IGF-1 promovía la supervivencia de las neuronas motoras. La diferencia entre los ratones tratados con AAV que codifica IGF-1 en comparación con el reparto en los NCP de AAV que codifica la GFP es estadísticamente significativo a un valor de p = 0,01 como indica el asterisco.

La Figura 20 ilustra las mejoras funcionales en el funcionamiento de un rotarod, fuerza de agarre en el miembro posterior, y fuerza de agarre en el miembro anterior en ratones tratados con reparto en los NCP de AAV que codifica IGF-1 en comparación con el reparto en los NCP de AAV que codifica la GFP.

La Figura 21 ilustra el incremento de supervivencia mediado por el reparto en los NCP de AAV que codifica IGF-1 en comparación con el reparto en los NCP de AAV que codifica la GFP. La Figura 22 muestra la distribución de la GFP en el cerebro de ratón después del reparto bilateral de un vector AAV1 que expresa la GFP en los núcleos cerebelares profundos (NCP) . Además de los NCP, también se observó la tinción positiva para GFP en los bulbos olfatorios, el córtex cerebral, el tálamo, el tronco encefálico, el córtex cerebelar y la médula espinal. Todas estas zonas reciben proyecciones y/o envían proyecciones a los NCP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con el fin de que la presente invención pueda ser comprendida más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Las definiciones adicionales se muestran a lo largo de la descripción detallada.

En la práctica de la presente invención se emplearán, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, que están al alcance del experto en la técnica. Véase, p. ej . , Sambroo , Fritsch y Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición (1.989): CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel, et al . eds., (1.987)); la serie METHODS IN ENZIMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor Eds. (1.995)), Harlow y Lañe, eds. (1.988) ANTIBOIDES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1.987)).

Según se utiliza en la memoria y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "uno", "una" y "el", "la" incluyen referencias a los plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo las mezclas de las mismas.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "comprende" signifique que las composiciones y métodos incluyen los elementos citados, pero sin excluir otros. "Consiste esencialmente en" cuando se utiliza para definir composiciones y métodos, significará que se excluyen otros elementos de cualquier trascendencia esencial para la combinación. De este modo, una composición que consiste esencialmente en los elementos definidos en la presente memoria no excluirá los contaminantes vestigiales del método de aislamiento y purificación y de los portadores farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes, y similares. "Consiste en" significará que se excluyen más de los elementos vestigiales de otros ingredientes y etapas del método sustanciales para administrar las composiciones de esta invención. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención .

Todas las denominaciones numéricas, p. ej . , pH, temperatura, tiempo, concentración, y peso molecular, incluyendo los intervalos, son aproximaciones que varian (+) o (-) en incrementos de 0,1. Se debe entender, aunque no siempre se establezca explícitamente que todas las denominaciones numéricas están precedidas por el término "aproximadamente". Asimismo se debe entender, aunque no siempre se establezca explícitamente, que los reactivos descritos en la presente memoria son meramente ilustrativos y que los equivalentes de los mismos son conocidos en la técnica .

El término "transgen" hace referencia a un polinucleótido que es introducido en una célula y es capaz de ser transcrito a ARN y opcionalmente, traducido y/o expresado en las condiciones apropiadas. En un aspecto, confiere una propiedad deseada a una célula en la que se ha introducido, o conduce de otro modo a un resultado terapéutico o diagnóstico deseado. En otro aspecto, puede ser transcrito a una molécula que media el ARN de interferencia, tal como siARN.

Los términos "particulas dé genoma (pg)", o "equivalentes de genoma", según se utilizan en referencia a un titulo viral, hacen referencia al número de viriones que contienen el genoma de ADN de AAV recombinante, con independencia de la infectividad o funcionalidad. El número de particulas de genoma en una preparación de vector concreta se puede medir mediante procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos en la presente memoria, o por ejemplo, por Clark et al. (1.999) en Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2.002) Mol. Ther., 6:272-278.

Los términos "unidad de infección (ui)", "partícula infecciosa", o "unidad de replicación", según se utilizan como referencia a un titulo viral, haden referencia al número de particulas de vector AAV recombinante infecciosas y de replicación competente medido mediante el análisis del centro infeccioso, también conocido como análisis del centro de replicación, como describen por ejemplo, McLaughlin et al. (1.988) en J. Virol., 62:1963-1973.

El término "unidad de transducción (ut) " según se utiliza en referencia a un titulo viral, hace referencia al número de particulas de vector AAV recombinante infecciosas que dan como resultado la producción de un producto transgénico funcional medido en análisis funcionales tal como se describe en los Ejemplos de la presente memoria, o por ejemplo, por Xiao et al. (1.997) en Exp. Neurobiol., 144:113-124; o por Fisher et al., (1.996) en J. Virol., 70:520-532 (análisis LFU) .

Los términos "terapéutico", "cantidad terapéuticamente eficaz", y sus homólogos hacen referencia a la cantidad de un ARN, ADN o producto de expresión de ADN y/o ARN que da como resultado la prevención o retraso de un comienzo o mejora de los síntomas en un sujeto o una consecución de un resultado biológico deseado, tal como la corrección de la neuropatologia, p. ej . , patología celular asociada con una enfermedad neuronal motora tal como la ALS. El término "corrección terapéutica" hace referencia a aquél grado de corrección que da como resultado la prevención o el retraso del comienzo o la mejora de los síntomas en un sujeto. La cantidad eficaz puede ser determinada mediante métodos empíricos conocidos.

Asimismo se pretende que una "composición" abarque una combinación de agente activo y otro portador, p. ej . , compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente o marca detectable) o activo, tal como un coadyuvante, diluyente, aglutinante, estabilizador, tampones, sales, disolventes lipofílicos, conservantes, coadyuvantes o similares. Los portadores también incluyen excipientes farmacéuticos y proteinas, péptidos, aminoácidos, lipidos, y carbohidratos aditivos (p. ej . , azúcares, incluyendo monosacáridos, di-, tri-, tetra-, y oligosacáridos; azúcares transformados tales como alditoles, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares; y polisacáridos o polímeros de azúcares), que pueden estar presentes individualmente o combinados, que comprenden solos o combinados el 1-99,99% en peso o en volumen. Los excipientes proteicos esenciales incluyen seralbúmina tal como seralbúmina humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína, y similares. Los componentes aminoácidos/anticuerpos representativos, que también pueden funcionar con una capacidad tamponadora, incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo, y similares. También se pretende que estén dentro del alcancé de esta invención los excipientes carbohidratados, cuyos ejemplos incluyen pero no están limitados a monosacáridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol) y mioinositol .

El término portador incluye adicionalmente un tampón o un agente para el ajuste del pH; típicamente, el tampón es una sal preparada a partir de un ácido o base orgánica. Los tampones representativos incluyen sales de ácidos orgánicos tales como sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético, o ácido ftálico; tris, hidrocloruro de trometamina, o tampones fosfato. Los portadores adicionales incluyen excipientes/aditivos poliméricos tales como polivinilpirrolidonas, ficoles (un azúcar polimérico), dextratos (p. ej . , ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-cuadratura-ciclodextrina) , polietilen-glicoles, agentes aromatizantes, agentes anti-microbianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensioactivos (p. ej . , polisorbatos tales como "TWEEN 20" y "TWEEN 80"), lípidos (p. ej . , fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (p. ej . , colesterol), y agentes quelantes (p. ej . , EDTA) .

Según se utiliza en la presente memoria, el término "portador farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los portadores farmacéuticos normalizados, tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, y emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua o agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservantes y cualquiera de los portadores indicados antes con la condición adicional de que sean aceptables para su uso in vivo. Para los ejemplos de portadores, estabilizadores y coadyuvantes, véase Martin REMINGTON'S PHARM. SCI., 15a Ed . (Mack Publ. Co., Easton (1.975) y Williams & Williams, (1.995), y en "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 52a Ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1.998) .

Un "sujeto", "individuo" o "paciente" se utiliza indistintamente en la presente memoria, haciendo referencia a un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, múridos, ratas, simios, seres humanos, animales de granja, animales de deporte, y mascotas.

Un "control" es un sujeto o muestra alternativos utilizados en un experimento con fines comparativos. Un control puede ser "positivo" o "negativo". Por ejemplo, cuando el propósito del experimento es determinar la correlación de un nivel de expresión alterado de un gen con un tipo concreto de patología (véase, ALS, por ejemplo, más abajo), es preferible generalmente utilizar un control positivo (un sujeto o una muestra df un sujeto, que porta semejante alteración y que maestra los síntomas característicos de esa enfermedad) , y un control negativo (un sujeto o muestra de un sujeto que carece de la expresión alterada y el síntoma clínico de esa enfermedad) .

"Expresado diferencialmente" aplicado a un gen, hace referencia a la producción diferencial del ARNm transcrito a partir del gen o la proteína producto codificada por el gen. Un gen expresado diferencialmente puede ser expresado positivamente o expresado negativamente en comparación con el nivel de expresión de una célula normal o de control. En un aspecto, se refiere a un diferencial que es al menos 1,5 veces, o al menos 2,5 veces, o alternativamente al menos 5 veces, o alternativamente al menos 10 veces más alto o más bajo que el nivel de expresión detectado en una muestra de control. El término "expresado diferencialmente" también hace referencia a secuencias de nucleótidos de una célula o tejido que son expresadas cuando se silencian en una célula de control o no son expresadas cuando son expresadas en una célula de control.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "modular" significa variar la cantidad o intensidad de un efecto o resultado, p. ej . , intensificar, aumentar, disminuir o reducir.

Según se utiliza en la presente memoria "mejorar" es sinónimo de "aliviar" y significa reducir o aligerar. Por ejemplo se pueden mejorar los síntomas de una enfermedad o trastorno haciéndolos más llevaderos. En los aspectos en los que la transferencia génica está mediada por un vector viral de ADN, tal como un adenovirus (Ad) o un virus adenoasociado (AAV) , un constructo vector hace referencia al polinucleótido que comprende el genoma viral o parte del mismo, y un transgen. Los adenovirus (Ad) son un grupo homogéneo de virus, relativamente bien caracterizados, incluyendo más de 50 serotipos. Véase, p. ej . , Solicitud Internacional PCT Núm. WO 95/27071. Los Ad se hacen crecer fácilmente y no requieren integración en el genoma de la célula anfitriona. También se han construido vectores derivados de Ad recombínantes, concretamente aquellos que reducen el potencial de recombinación y generación de virus de tipo salvaje. Véanse, las Solicitudes Internacionales PCT Núms. WO 95/0655 y WO 95/11984. Los AAV de tipo salvaje tienen una elevada infectividad y especificidad al integrarse en el genoma de la célula anfitriona. Véase, Hermonat y Muzyczka (1.984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 y Lebkowski, et al. (1.988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996.

La invención proporciona un método de reparto de un transgen en la médula espinal y/o el tronco encefálico en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene un transgen en al menos una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro, donde el reparto se realiza en condiciones que favorecen la expresión del transgen en un sitio distante del sitio de administración. El reparto también puede dar como resultado la expresión del transgen en el sitio de administración .

A menos que se especifique lo Contrario, la expresión del transgen no está limitada a la traducción a un polipéptido o proteína sino que también incluye la replicación y/o transcripción del polinucleótido del transgen .

En otro aspecto, la invención proporciona un método de reparto de un producto transgénico t rapéutico a una célula diana del SNC, que es una neurona o una célula glial, en un mamífero aquejado de un trastorno neu?onal motor, p. ej . , ALS o lesión traumática de la médula espinal. El transgen' puede codificar IGF-1.

En otro aspecto, la invención consiste en un método para repartir un transgen a la médula espinal en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene dicho transgen en la región del córtex motor del cerebro, donde dicho reparto se realiza en condiciones que favorecen la expresión de dicho transden en un sitio distante de dicho sitio de administración.

En un aspecto adicional más de la invención el vector viral se administra en al menos una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro donde el producto transgénico es expresado y repartido en la médula espinal y/o la región del tronco encefálico del sujeto.

En otra realización, el vector viral se administra en al menos una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro que está interconectada con el tronco encefálico y la neuronas motoras de la médula espinal. Estas regiones elegidas como diana tienen conexiones directas con las células (p. ej . , interneuronas y astrocitos) que componen el entorno celular de las neuronas motoras. La administración reparte el producto transgénico en el entorno celular de las neuronas motoras, donde el producto media un efecto beneficioso sobre las células que lo componen.

En una realización, la invención es un método para repartir un transgen o modular su expresión, en una neurona motora en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico que contiene el transgen en la región del córtex motor del cerebro del sujeto, donde el transgen es expresado en una región de la neurona motora distante de dicho sitio de administración .

En una realización alternativa, la invención consiste en un método para tratar un trastorno de las neuronas motoras en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene un transgen terapéutico en al menos una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro de un sujeto, donde el transgen es expresado en una cantidad terapéuticamente eficaz en al menos una subdivisión de la médula espinal del sujeto. Estas subdivisiones incluyen una o más de las regiones cervical, torácica, lumbar o sacra (véanse Figura 1, Figura 12A) . El transgen también puede ser expresado en una cantidad terapéuticamente eficaz en al menos una región del tronco encefálico, tal como, por ejemplo, el cerebro medio, el pons, o el bulbo raquídeo (véase la Figura 12B) . También puede ser expresado en una cantidad terapéuticamente eficaz al menos en una región del tronco encefálico y al menos en una subdivisión de la médula espinal del sujeto.

Esta invención también consiste en un método para mejorar los síntomas de un trastorno de las neuronas motoras en un sujeto administrando un vector viral neurotrópico recombinante que contiene un trans?fen terapéutico en la región del córtex motor del cerebro, donde dicho transgen es expresado en una cantidad terapéuticamente eficaz en al menos una subdivisión de la médula espinal del sujeto. Estas subdivisiones incluyen una o más de las regiones cervical, torácica, lumbar o sacra (véase Figura 1, Figura 12A) .

Los vectores virales neurotrópicos adecuados para la práctica de esta invención incluyen, pero no están limitados a vectores virales adenoasociados (AAV) , vectores virales de herpes simplex (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.672.344) y vectores lentivirales.

En los métodos de la invención, se pueden utilizar AAV de cualquier serotipo. En ciertas realizaciones, se pueden utilizar AAV de cualquier serotipo con tal que el vector sea capaz de experimentar transporte axónico retrógrado en un cerebro comprometido por la enfermedad, o transporte axónico en un cerebro no comprometido. El serotipo del vector viral utilizado en ciertas realizaciones • de la invención se selecciona del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4 , AAV5, AAV6, AAV7, y AAV8 (véase, p. éj . , Gao et al. (2.002) PNAS, 99:11854-11859; y Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2.003). Se pueden utilizar otros serotipos además de los enumerados en la presente memoria. Además, también se pueden utilizar vectores AAV sometidos a pseudotipificación en los métodos descritos en la presente memoria. Los vectores AAV sometidos a pseudotipificación son aquellos que contienen el genoma de un serotipo de AAV en la cápsida de un segundo serotipo de AAV, por ejemplo, un vector AAV que contiene la cápsida de AAV2 y el genoma de AAV1 o un vector AAV que contiene la cápsida de AAV5 y el genoma de AAV2 (Auricchio et al., (2.001) Hum. Mol. Genet., 10 ( 26) : 3075-81 ) . Los vectores AAV están derivados de parvovirus de ADN de hebra sencilla (ss en sus siglas en inglés) que no son patógenos para los mamíferos (revisado en Muzyscka (1.992) Curr. Top. Microb. Immunol . , 158:97-129). Brevemente, los vectores basados en AAV tienen los genes virales rep y cap que representan el 96% del genoma viral separados, dejando las dos repeticiones terminales invertidas de 145 pares de bases (pb) contiguas (ITR), que se utilizan para iniciar la replicación del ADN viral, para el empaquetamiento y la integración. En ausencia de virus coadyuvante, el AAV de tipo salvaje se integra en el genoma de la célula anfitriona humana con una especificidad por el sitio preferente en el cromosoma 19q 13.3 o puede quedar expresado episómicamente . Una única partícula de AAV puede alojar hasta 5 kb de ADNss, dejando por lo tanto aproximadamente 4,5 kb para un transgen y elementos reguladores, lo que es típicamente suficiente. No obstante, los sistemas de empalme en trans descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.544.785, casi pueden duplicar este límite.

En una realización ilustrativa, el AAV es AAV2 o AAV1. Los virus adenoasociados de muchos serotipos, especialmente AAV2 , han sido estudiados intensamente y caracterizados como vectores de terapia génica. Aquellos expertos en la técnica estarán familiarizados con la preparación de vectores de terapia génica basados en AAV funcionales. Se pueden encontrar numerosas referencias a diversos métodos de producción de AAV, purificación y preparación para la administración a sujetos humanos en el extenso conjunto de la literatura publicada (véase, p. ej . , Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2.003). Adicionalmente, la terapia génica basada en AAV dirigida a las células del SNC ha sido descrita en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.180.613 y 6.503.888. Los vectores AAV ilustrativos son vectores de los subtipos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 y AAV2/8 que codifican proteínas humanas.

En ciertos métodos de la invención, el vector comprende un transgen conectado operablemente a un promotor. El transgen codifica una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el SNC da como resultado al menos una corrección parcial de una neuropatología . Las secuencias de ADNc genómico y funcional de ASM humana han sido publicadas (véanse, p. ej . , las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.773.278 y 6.541.218). El factor de crecimiento de tipo insulina-1 (IGF-1) tiene una estructura compleja, que es bien conocida en la técnica. Tiene al menos dos productos de ARNm empalmados alternativamente que surgen del transcrito del gen. Hay un péptido de 153 aminoácidos, conocido por numerosos nombres incluyendo GF-1A o IGF-lEa, y un péptido de 195 aminoácidos, conocido por numerosos nombres incluyendo IGF-1B o IGF-lEb. La forma madura de IGF-1 tiene un polipéptido de 70 aminoácidos. Tanto IGF-lEa como IGF-lEb contienen el péptido maduro de 70 aminoácidos, pero difieren en la secuencia y la longitud de sus prolongaciones carboxi terminales. Las secuencias peptídicas de IGF-lEa e IGF-lEb están representadas por los SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente. Los ADNc genómico y funcional de IGF-1 humano, así como información adicional referente al gen IGF-1 y sus productos, se encuentran disponibles con el Núm. de Acceso Unigene NM_00618.

El nivel de expresión del transgen en las células eucarióticas está en gran parte determinado por el promotor transcripcional dentro de la cásete de expresión del transgen. En algunas realizaciones se utilizan promotores que muestran actividad a largo plazo y son específicos de tejidos e incluso de células. Los ejemplos no limitantes de los promotores incluyen, pero no están limitados a, el promotor de citomegalovirus (CMV) (Kaplitt et al. (1.994) Nat. Genet. 8:148-154), el promotor CMV/globina ß3 humana (Mandel et al. (1.998) J. Neurosci. 18:4271-4284), el promotor GFAP (Xu et al. (2.001) Gene Ther. 8:1323-1332), el promotor de enolasa específica de las neuronas de 1,6 kb (NSE) (Klein et al. (1.998) Exp. Neurol. 150:183-194), el promotor de la beta actina de pollo (CBA) (Miyazaki (1.989) Gene 79:269-277), el promotor de la ß-glucuronidasa (GUSB) (Shipley et al. (1.991) Genetics 10:1009-1018), y los promotores de la ubiquitina tales como aquellos aislados de la ubiquitina A humana, la ubiquitina B humana, y la ubiquitina C humana como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.667.174. Para prolongar la expresión, se pueden conectar operablemente al transgen además otros elementos reguladores, tales como, p. ej . , el Elemento Regulador de Woodchuck del Virus de la Hepatitis (WPRE) (Donello et al., (1.998) J. Virol. 72:5085-5092) o el sitio de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGH) .

Para algunas aplicaciones de la terapia génica en el SNC, puede ser necesario controlar la actividad transcripcional. A este fin, se puede obtener la regulación farmacológica de la expresión génica con vectores virales incluyendo diversos elementos reguladores y promotores sensibles a fármacos como describen, por ejemplo, Haberma et al. (1.998) en Gene Ther. 5:1604-16011; y Ye et al. (1.995) en Science 283:88-91.

En los métodos de esta invención, se puede administrar el vector viral poniendo en contacto una terminación axónica del extremo de una neurona con una composición que contiene un vector viral que porta el transgen, permitiendo que las partículas virales sean sometidas a endocitosis y transportadas intracelularmente (retrógradamente) a lo largo del axón hacia el cuerpo celular de la neurona; permitiendo que el producto transgénico terapéutico sea expresado, donde el producto transgénico terapéutico alivia de ese modo la patología del sujeto. El efecto puede ser sobre las neuronas motoras, sobre las células que componen el entorno de la neurona motora (tales como las interneuronas y los astrocitos), o sobre ambos. En ciertas realizaciones, la concentración de vector en la composición es de al menos (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO12 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO9 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO10 ui/ml) .

En métodos adicionales de esta invención, el vector viral puede ser administrado poniendo en contacto el cuerpo celular de una neurona con una composición que contiene un vector viral que porta el transgen, permitiendo que la partícula viral sea sometida a endocitosis, permitiendo que el producto transgénico terapéutico sea expresado y transportado anterógradamente intracelularmente a lo largo del axón hacia el terminal del axón de la neurona, donde el producto transgénico terapéutico alivia de ese modo la patología del sujeto. El efecto puede ser sobre las neuronas motoras, sobre las células que componen el entorno de la neurona motora (tal como las interneu^onas y los astrocitos), o sobre ambos. En ciertas realizaciones, la concentración del vector en la composición es de al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO12 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO9 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO10 ui/ml).

En un aspecto, el transgen codifica una molécula biológicamente activa, cuya expresión en el SNC da como resultado al menos una reducción parcial de la neuropatología . En algunas realizaciones, el producto transgénico terapéutico es una molécula de ARN que inhibe la expresión de la SOD en un sujeto aliviando y evitando de ese modo los síntomas de la ALS. Véase Roaul et al. (2.005) Nat. Med. 11(4) :423-428 y Ralph et al. (2.005) Nat. Med. 11(4) :429-433.

En un aspecto cuando se realizan estos métodos, el transgen expresa una cantidad terapéutica de una proteína seleccionada del grupo que consiste en factor de crecimiento de tipo insulina-1 (IGF-1), calbindina D28, parvalbúmina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, EPO (eritropoyetina), CBP (proteína de unión de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc [CREB]), SMN-1, SMN-2, y CNTF (Factor neurotrófico ciliar) .

Alternativamente, el transgen inhibe la expresión de una forma mutante de una proteina, p. ej . , SOD mutante que produce la ALS. Roaul et al. (2.005) supra y Ralph et al. (2.005) supra.

Para la identificación de las estructuras en el cerebro humano, véase, p. ej . , The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional Anatomy With MRI, and Blood Supply, 2a Ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela, 1.999, Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1.997; y Coplanar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional Proportional System: An Approach to Cerebral Imaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medical Pub., 1.988. Para la identificación de las estructuras en el cerebro de ratón, véase, p. ej . , The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2a ed., Academic Press, 2.000. La Figura 1 muestra esquemáticamente la médula espinal y sus cuatro subdivisiones: cervical, torácica, lumbar y sacra.

La invención sujeto proporciona métodos para modular, corregir o aumentar la función motora en un sujeto aquejado de una lesión neuronal motora. Solamente con fines ilustrativos, el sujeto puede padecer una o más de esclerosis lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular espinal bulbar, atrofia muscular espinal, ataxia cerebelar espinal, esclerosis lateral primaria (PLS), o lesión traumática de la médula espinal.

Sin estar limitado por la teoría, la patología asociada con la lesión de las neuronas motoras puede incluir degeneración de las neuronas motoras, gliosis, anomalías neurofilamentosas, pérdida de fibras mielinicas en los tractos corticoespinales y la raices ventrales. Por ejemplo, se han reconocido dos tipos de comienzo: comienzo bulbar, que afecta a las neuronas motoras superiores (neuronas motoras del córtex y el tronco encefálico) , afecta a los músculos faciales, al habla, y a la hinchazón; y comienzo en los miembros, que afecta a las neuronas motoras inferiores (neuronas motoras de la médula espinal) , se refleja mediante espasticidad, debilidad generalizada, atrofia muscular, parálisis, e insuficiencia respiratoria. En la ALS, los sujetos presentan un comienzo tanto bulbar como en las extremidades. En la ELP, los sujetos presentan un comienzo bulbar .

Sin estar limitado por la teoría, una realización de la invención se encuentra en la capacidad para proporcionar una molécula terapéutica (por ejemplo, una proteína o péptido) para cada división de la médula espinal. Esto se puede lograr inyectando un vector AAV en los NCP. Además, puede ser importante buscar láminas individuales dentro de cada división de la médula espinal. Las láminas son regiones sub-específicas dentro de las regiones del cerebro y la médula espinal. Puede ser deseable en ciertas realizaciones buscar láminas especificas dentro de una cierta división de la médula espinal. Puesto que la lesión de las neuronas motoras se puede producir también dentro de las neuronas motoras superiores, también puede ser deseable proporcionar una molécula terapéutica (por ejemplo, una proteína o péptido) para las divisiones del tronco encefálico. En una realización, puede ser deseable proporcionar la molécula terapéutica tanto a la médula espinal, incluyendo algunas o todas las subdivisiones como al tronco encefálico, incluyendo algunas o todas las subdivisiones. La presente invención utiliza la introducción de un vector AAV en los NCP para completar el reparto anteriormente descrito de una molécula terapéutica a la región o las regiones de la médula espinal y/o el tronco encefálico. La Figura 12A ilustra las conexiones entre las regiones de los núcleos cerebelares profundos y la médula espinal mientras la Figura 12B ilustra las conexiones entre las regiones de los núcleos cerebelares profundos y el tronco encefálico.

La capacidad para organizar y ejecutar actos motores complejos depende de las señales de las zonas motoras del córtex cerebral, esto es, el córtex motor. Los comandos motores corticales descienden en das tractos. Las fibras corticobulbares controlan los núcleos motores del tronco encefálico que mueven los músculos faciales y las fibras corticoespinales controlan las neuronas motoras espinales que inervan los músculos del tronco y las extremidades. El córtex cerebral también influye indirectamente en la actividad motora espinal actuando sobre las rutas del tronco encefálico descendente .

El córtex motor primario se extiende a lo largo del girus precentral en la zona de Broadmann (4) . Los axones de las neuronas corticales que se proyectan a la médula espinal corren juntas en el tracto corticoespinal, un haz masivo de fibras que contiene aproximadamente 1 millón de axones. Aproximadamente un tercio de estos se origina en el girus precentral del lóbulo frontal. Otro tercio se origina en el zona 6. El resto se origina en las zonas 3, 2, y 1 en el córtex sensorial somático y regulan la transmisión de la entrada aferente a través del asta dorsal.

Las fibras corticoespinales corren junto con las fibras corticobulbares a través del limbo posterior de la cápsula interna hasta alcanzar la porción ventral del cerebro medio. Se separan en el pons en pequeños haces de fibras que transcurren entre los núcleos pontinos. Se reagrupan en el bulbo raquídeo para formar la pirámide medular. Aproximadamente tres cuartos de las fibras corticoespinales cruzan la línea media de la decusación piramidal en la unión del bulbo raquídeo y la médula espinal. Las fibras cruzadas descienden en la parte dorsal de las columnas laterales (columna dorsolateral) de la médula espinal, formando el tracto corticoespinal lateral. Las fibras no cruzadas descienden en las columnas ventrales como tracto corticoespinal ventral.

Las divisiones lateral y ventral del tracto corticoespinal terminan aproximadamente en las mismas regiones de la sustancia gris espinal que los sistemas laterales y medios del tallo encefálico. El tracto corticoespinal lateral se proyecta principalmente hacia los núcleos motores en la parte lateral del asta ventral y hacia las interneuronas en la zona intermedia. El tracto corticoespinal ventral se proyecta bilateralmente hacia la columna celular ventromedial y hacia las porciones colindantes de la zona intermedia que contienen las neuronas motoras que inervan los músculos axiales. La Figura 3 muestra esquemáticamente las rutas aferentes principales (entrada) .

En la profundidad del cerebelo se encuentra la sustancia gris denominada núcleos cerebelares profundos llamados núcleo medial (fastigial), núcleo interpuesto (interpositus) y núcleo lateral (dentado) . Según se utiliza en la presente memoria, el término "núcleos cerebflares profundos" hace referencia colectivamente a estas tres regiones. La Figura 2 muestra esquemáticamente las tres regiones de los NCP. La Figura 4 muestra esquemáticamente las rutas eferentes principales (salida) desde los NCP. La Figura 5 muestra esquemáticamente los circuitos neurales en el córtex cerebral. Las Figuras 12A y 12B muestran esquemáticamente conexiones entre los NCP y la médula espinal o el tronco encefálico, respectivamente.

Si se desea, la estructura cerebral humana se puede correlacionar con estructuras similares en el cerebro de otro mamífero. Por ejemplo, la mayor parte de los mamíferos, incluyendo los seres humanos y los roedores, muestran una organización topográfica similar de las proyecciones entorrino-hipocampales, con neuronas en la parte lateral del córtex entorrino tanto lateral como medial que se proyectan a la parte dorsal o al polo septal del hipocampo, mientras la proyección al hipocampo ventral se origina principalmente a partir de las neuronas de las partes mediales del córtex entorrinal (Principies of Neural Science, 4a ed., eds. Kandel et al., McGraw-Hill, 1.991; The Rat Nervous System, 2a ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1.995) . Además, las células de la capa II del córtex entorrinal se proyectan hacia el girus dentado, y terminan en los dos tercios superiores de la capa molecular del girus dentado. Los axones de las células de la capa III se proyectan bilateralmente hacia las zonas del cornu ammonis CAÍ y CA3 del hipocampo, terminando en la capa molecular stratum lacunosum.

En un aspecto, los métodos descritos incluyen administrar al SNC de un sujeto aquejado un vector viral neurotrópico que porta un transgen que codifica un producto terapéutico y que permite que el transgen sea expresado en el SNC de una manera distante del sitio de administración a nivel terapéutico. Además, el vector puede comprender un polinucleótido que codifica una molécula biológicamente activa eficaz para tratar el trastorno del SNC. Tales moléculas biológicamente activas pueden comprender péptidos incluyendo pero no limitados a versiones nativas o mutadas de proteínas completas, versiones nativas o mutadas de fragmentos de proteínas, polipéptidos sintéticos, anticuerpos, y fragmentos de anticuerpos tales como moléculas Fab.'. Las moléculas biológicamente activas también pueden comprender nucleótidos incluyendo polinucleótidos de ADN monocatenario o bicatenario y polinucleótidos de ARN monocatenario o bicatenario. Para una revisión de las tecnologías de nucleótidos ilustrativas que se pueden utilizar en la práctica de los métodos descritos en la presente memoria, véase Kurreck, (2.003) J., Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 [tecnologías antisentido]; Yu et al., (2.002) PNAS 99(9), 6047-6052 [tecnologías de ARN de interferencia]; y Elbashir et al., (2.001) Genes Dev., 15 (2) : 188-200 [tecnología de siARN] .

En una realización ilustrativa, la administración se completa mediante inyección directa de una solución con elevado título de vector en los NCP de un sujeto o paciente. Por ejemplo, la administración es mediante inyección directa en una o más regiones de los núcleos cerebelares profundos del cerebro seleccionada del grupo que consiste en la región medial (fastigial), la región interpuesta (interpositus ) y la región lateral (dentada) . Los NCP son un sitio atractivo para la inyección debido a sus extensas conexiones eferentes y aferentes con el tronco encefálico y la médula espinal. Estas células proporcionan un medio eficiente y mínimamente invasivo para repartir el vector viral y el transgen expresado a las regiones de la médula espinal y las regiones del tronco encefálico. Sin estar limitado por la teoría, el vector viral puede ser absorbido por los terminales axónicos y transportado retrógradamente a lo largo del axón al cuerpo celular de estas neuronas, que se proyectan por toda la región de la médula espinal y/o el tronco encefálico. Los cuerpos celulares de las neuronas también están presentes en los NCP que tienen extremos axónicos terminales que terminan, por ejemplo, en la región cervical de la médula espinal. El vector viral absorbido por estos cuerpos celulares, o el transgen expresado resultante del vector viral o ambos, pueden ser transportados anterógradamente a los extremos terminales axónicos de la región espinal cervical. Por lo tanto, utilizando los NCP como sitio de inyección, solamente un pequeño volumen de vector viral es inyectado pero esto media una expresión del transgen significativa por una o más regiones en la médula espinal y/o el tronco encefálico.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden la administración de un vector neurotrópico de título elevado que porta un transgen terapéutico de manera que el producto transgénico es expresado a nivel terapéutico en un segundo sitio dentro del SNC distante del primer sitio. En algunas realizaciones, el titulo viral de la composición es de al menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO12 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO9 ut/ml); o (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, o 50 (xlO10 ui/ml) . En realizaciones adicionales, la administración se completa mediante inyección intraparenquimal directa de una solución de vector neurotrópico de titulo elevado en el cerebro deseado, después de eso el transgen es expresado distalmente, contralateralmente o ipsilateralmente, con respecto al sitio de administración a un nivel terapéutico de al menos 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 mm del sitio de administración .

La distancia entre el primer y el segundo sitio se define como la región de distancia mínima entre el sitio de administración (primer sitio) y las proximidades de la transducción detectable del sitio distal (segundo sitio) medida utilizando procedimientos conocidos en la técnica o descritos en los Ejemplos, p. ej . , hibridación in situ. Algunas neuronas del SNC de mamíferos más grandes pueden abarcar grandes distancias en virtud de sus proyecciones axónicas. Por ejemplo, en seres humanos, algunos axones pueden abarcar una distancia de 1.000 mm o más. De este modo, en diversos métodos de la invención, el vector puede ser transportado axónicamente por toda la longitud del axón a una distancia tal que alcance o transduzca el cuerpo celular parental .

El sitio del vector de administración en el SNC se elige basándose en la región diana de la neuropatología deseada y en la topología de los circuitos del cerebro implicados con tal que el sitio de administración y la región diana tengan conexiones axónicas. La región diana puede ser definida, por ejemplo, utilizando las coordenadas estereotáxicas 3-D. En algunas realizaciones, el sitio de administración se selecciona de manera que al menos 0,1, 0,5, 1, 5, o 10í¡ de la cantidad total de vector inyectado sea repartida de manera distal en la región diana de al menfs 1, 200, 500, o 1.000 mm3. El sitio de administración puede estar localizado en una región inervada por neuronas con proyecciones que conectan las regiones distales del cerebro. Por ejemplo, la sustancia negra y el área tegmentada ventral enVian proyecciones densas al caudato y al putamen (conocidos colectivamente como cuerpo estriado) . Las neuronas de la sustancia negra y del tegmento ventral pueden ser elegidas como diana para la transducción mediante transporte retrógrado de AAV tras la inyección en el cuerpo estriado. Como otro ejemplo, el hipocampo recibe proyecciones axónicas predecibles, bien definidas de otras regiones del cerebro. Otros sitios de administración pueden estar localizados, por ejemplo, en la médula espinal, el tronco encefálico (médula, cerebro medio, y pons), el mesencéfalo, el cerebelo (incluyendo los núcleos cerebelares profundos), el diencéfalo (tálamo, hipotálamo), el telecénfalo (cuerpo estriado, córtex cerebral, o, en el córtex, lóbulos occipital, temporal, parietal o frontal), o combinaciones de los mismos.

El segundo sitio (diana) puecje estar localizado en cualquier región del SNC, incluyendo el cerebro y la médula espinal, que contiene neuronas que se proyectan hacia el primer sitio (administración). En algunas realizaciones, el segundo sitio está en una región del SNC elegida de entre la sustancia negra, la médula oblongata, el tronco encefálico, o la médula espinal.

Para repartir el vector específicamente en una región concreta del sistema nervioso central, especialmente una región concreta del cerebro, éste se puede administrar mediante microinyección estereotáxica . Por ejemplo, el día de la operación, los pacientes tendrán la base del marco estereotáxico fijado en su sitio (atornillado en el cráneo) . Se formarán imágenes del cerebro con la base del marco estereotáxico (MRI compatible con los marcadores fiduciarios) utilizando MRI de alta resolución. Las imágenes de MRI serán transferidas después a un ordenador que funciona con soporte lógico estereotáxico. Se utilizarán una serie de imágenes coronales, sagitales, y axiales para determinar el sitio diana de la inyección de vector, y la trayectoria. El soporte lógico traduce directamente la trayectoria a coordenadas tridimensionales apropiadas para el marco estereotáxico. Se taladran agujeros abultados por encima del sitio de entrada y el aparato estereotáxico se localiza con la aguja implantada a la profundidad dada. Después se inyectará el vector en un portador farmacéuticamente aceptable. Luego el vector es administrado mediante inyección directa en el sitio diana primario y transportado retrógradamente a los sitios diana distantes por medio de los axones. Se pueden utilizar rutas adicionales, p. ej . , aplicación cortical superficial bajo visualización directa, u otra aplicación no estereotáxica .

Además, debido a que cada región de los NCP se dirige a regiones específicas del SNC (véanse la Figura 1 y las Figuras 12A y 12B) , se puede seleccionar como diana específicamente la región del SNC en la cual se reparte el transgen preseleccionado la región de los NCP para la administración. Como resulta evidente para los expertos en la técnica, se pueden obtener una multitud de dosificaciones y repartos dirigidos variando la localización, la secuencia y el número de administraciones del transgen. El volumen total de material que se va a administrar, y el número total de partículas de vector que se va a administrar, serán determinados por los expertos en la técnica basándose en aspectos conocidos de la terapia génica. La efectividad terapéutica y la seguridad se pueden someter a ensayo en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, existen una variedad de modelos animales bien caracterizados para LSD, p. ej . , como se describe en la presente memoria o como describen Watson et al. (2.001) Methods Mol. Med. 76:383-403; o Jeyakumar et al. (2.002) Neuropath. Appl. Neurobiol., 28:343-357 ALS (véase Tu et al. (1.996) P.N. A.S. 93:3155-3160; Roaul et al. (2.005) Nat. Med. 11(4) :423-428 y Ralph et al. (2.005) Nat. Med. 11(4) :429-433) .

En ratones experimentales, el volumen total de solución de AAV inyectada está, por ejemplo, entre 1 y 5 µl . Para otros mamíferos, incluyendo cerebro humano, los volúmenes y las velocidades de reparto aumentan apropiadamente a escala. Por ejemplo, se ha demostrado que se pueden inyectar de forma segura volúmenes de 150 µl en el cerebro de primates (Janson et al. (2.002) Hum. Gene Ther. 13:1391-1412). El tratamiento puede consistir en una única inyección por sitio diana, o se puede repetir a lo largo del tracto dé la inyección, si fuera necesario. Se pueden utilizar múltiples sitios de inyección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, además del primer sitio de administración, se administra una composición que contiene un vector viral que porta un transgen a otro sitio que puede ser contralateral o ipsilateral con respecto al primer sitio de administración. Las inyecciones pueden ser únicas o múltiples, unilaterales o bilaterales.

Las preparaciones de AAV de título elevado se pueden producir utilizando mecanismos conocidos en la técnica, p. ej . , como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.658.776 y Viral Vectors for Gfne Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2.003.

Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones ilustrativas de la invención. Un experto normal en la técnica reconocerá las numerosas modificaciones y variaciones que se pueden realizar sin alterar el espíritu o alcance de la presente invención. Tales modificaciones y variaciones están abarcadas en el alcance de la invención. Los ejemplos no limitan en modo alguno la invención.

EJEMPLOS Titulación de Vectores Recombinantes Los títulos de los vectores AAV se midieron según el número de copias del genoma (partículas de genoma por mililitro) . Las concentraciones de las partículas de genoma estuvieron basadas en la PCR Taqman® del ADN vector como se ha referido previamente (Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278). Brevemente, se trató AAV-ASM con tampón de digestión de la cápsida (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, SDS 0,5%, 1,0 mg/ml de proteinasa K) a 50°C durante 1 hora para liberar el ADN vector. Las muestras de ADN se Colocaron a lo largo de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que hibridaban con secuencias específicas en el ADN vector, tales como la región promotora, el transgen, o la secuencia poli A. Los resultados de la PCR se cuantificaron después mediante un soporte lógico Taqman® a Tiempo Real, tal como el proporcionado por el Perkin-Elmer-Applied Biosystems (Foster City, CA) Prism 7700 Sequence Detector System.

Los vectores que portan un gen marcado analizable tal como el gen de la ß-galactosidasa o de la proteína fluorescente verde (GFP) se pueden titular utilizando un análisis de infectividad. Las células susceptibles (v.g., células HALS, o COS) son transducidas con el AAV y se realiza un análisis para determinar la expresión génica por ejemplo tiñendo las células transducidas con el vector de la ß-galactosidasa con X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactopiranósido) o microscopía fluorescente para las células transducidas con GFP. Por ejemplo, el análisis se realiza como sigue: se cultivan en placa 4 x 104 células HALS en cada pocilio de una placa de ultivo de 24 pocilios utilizando medio de crecimiento normal. Tras el anclaje, esto es, aproximadamente 24 horas después, las células se infectaron con Ad de tipo 5 a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y se transdujeron con diluciones seriadas del vector empaquetado y se incubaron a 37°C. De uno a tres días más tarde, antes de observar los extensos efectos citopáticos, se realiza el análisis apropiado en las células (p. ej . , tinción con X-gal o microscopía de fluorescencia). Si se utiliza un gen informador tal como el de la ß-galactosidasa, las células se fijan en paraformaldehído al 2%, glutaraldehído al 0,5% y se tiñen para la actividad ß-galactosidasa utilizando X-gal. Se Someten a recuento las soluciones de vector que proporcionan células separadas en los pocilios. Cada célula positiva representa 1 unidad de transducción (ut) del vector.

La Expresión de la Proteina Funcional Impide el Deterioro Motor en un Modelo de Ratón Terapéuticamente Relevante Los ratones ASMKO son un modelo aceptado de la enfermedad de Niemann-Pick de los tipos A y B (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics 10:288-293; Jin et al. (2002) J. Clin. Invest. 109:1183-1191; y Otterbach (1995) Cell 81:1053-1061). La enfermedad de Niemann-Pick (NPD) está clasificada como una enfermedad del almacenamiento lisosomal y es un trastorno neurometabólico heredado caracterizado por una deficiencia génica de esfingomielinasa acida (ASM; esfingomielina colinofosfohidrolasa, EC 3.1.3.12). La carencia de proteína ASM funcional da como resultado la acumulación de sustrato de esfingomielina en los lisosomas de las neuronas y la glía en todo el cerebro. Esto conduce a la formación de un gran número de lisosomas distendidos en el pericarion, que es un rasgo distintivo y al fenotipo celular primario de la NPD de tipo A. La presencia de lisosomas distendidos tiene correlación con la pérdida de la función celular normal y con un curso neurodegenerativo progresivo que conduce a la muerte del individuo afectado en la infancia temprana (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, eds. Scriver et al., McGraw-Hill, Nueva York, 2001, págs. 3589-3610). Los fenotipos celulares secundarios (v.g., anomalías metabólicas adicionales) también están asociados con esta enfermedad, notablemente la acumulación de alto nivel de colesterol en el compartimiento lisosomal. La esfingomielina tiene una fuerte afinidad por el colesterol, que da como resultado el secuestro de grandes cantidades de colesterol en los lisosomas de los ratones ASMKO y de los pacientes humanos (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem. 28:277-293; y Viana et al. (1990) J. Med. Genet. 27:499-504).

El siguiente experimento, evaluó la capacidad relativa de los vectores de serotipo AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 y AAV2/8 recombinantes que codifican ASM (hASM) humana para expresar la proteina hASM, corregir la patología de almacenamiento de colesterol, experimentar transporte, rescatar células de Purkinje, e iniciar la recuperación funcional en el ratón ASMKO tras la inyección unilateral en los núcleos cerebelares profundos. Un grupo adicional de ratones ASMKO recibió inyecciones bilaterales en los NCP con el fin de evaluar si el incremento de diseminación/expresión de la proteína del transgen podría mejorar la recuperación funcional del comportamiento.

Se criaron sesenta y seis ratones macho con la esfingomielinasa acida desactivada homocigotos (-/-) (ASMKO) y dieciséis camadas macho de tipo salvaje de control de apareamientos heterocigotos (+/-). Los ratones se sometieron a tipificación genotípica mediante PCR siguiendo el procedimiento descrito por Gal et al. (1975) N. Eng. J. Med: 293 : 632-636. Los ratones de la colonia original se sometieron a retrocruzamiento en la cepa C57/B16. Los animales se alojaron en un ciclo de 12:12 horas de luz : oscuridad y se les suministró alimento y agua ad libi tum . Todos los procedimientos se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee.

Después de anestesiarlos con isoflurano, a los ratones (~7 semanas de edad) se les inyectó unilateralmente en los núcleos cerebelares profundos (A-P: -5,75 del bregma, M-L: -1,8 del bregma, D-V: -2,6 de la dura, varilla de incisión: 0,0) con uno de los siguientes vectores con serotipo AAV (n=8/vector) : AAVl-CMV-ß-gal, AAV1-CMV-ASM, AAV2-CMV-ASM, AAV5-CMV-ASM, AAV7-CMV-ASM, y AAV8-CMV-ASM. Los vectores se repartieron con una jeringa de Hamilton de 10 µl montada sobre una bomba para jeringas a una velocidad de 0,5 µl/minuto para un total de 1,86 x ÍQ10 particulas de genoma por cerebro. El volumen de inyección final para cada vector fue de 4 µl . Una hora antes y veinticuatro horas después de la cirugía se administró a los raton s cetoprofeno (5 mg/kg; SC) para la analgesia.

Los ratones se sacrificaron 7 semanas post-inyección (14 semanas de edad) . En el momento del sacrificio se aplicó a los ratones una sobredosis de euthasfl (150 mg/kg; IP) y se decapitaron rápidamente (n=5/grupo) o se perfundieron transcardialmente (n=3/grupo) . Los cerebros de los ratones decapitados se retiraron rápidamente, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido, se diseccionaron en 3 secciones (hemisferio cerebral derecho, hemisferio cerebral izquierdo, y cerebelo) homogeneizadas, y se analizaron en cuanto a hASM mediante ELISA. Los cerebros y las médulas espinales de los ratones perfundidos se manipularon para la expresión de la proteína ASM, la acumulación de colesterol detectada mediante tinción con filipina y la supervivencia de las células de Purkinje mediante tinción con calbindina sobre secciones de vibratomo de 50 µm. Los ratones ASMKO que recibieron inyecciones bilaterales (~7 semanas de edad) de AAV2/l-ß-gal (n=8), AAV2/1-ASM (n=5), y AAV2/2-ASM (n=5) se sacrificaron a las 20 semanas de edad después de experimentar la prueba del rotarod. Los ratones se analizaron acelerando y balanceando el rotarod para la función motora en el Smartrod (AccuScan) utilizando métodos conocidos en la técnica. Los métodos ilustrativos son reproducidos por Sleat et al. (2004) J. Neurosci. 24:9117-9126. Las Figuras 10 y 11 muestran gráficamente los resultados de las pruebas en el rotarod como una medida de la recuperación de la función motora.

El ADNc de ASM humana completo bajo el control del promotor intermedio-temprano de citomegalovirus (CMV) humano, con una secuencia de poliadenilación de SV40, y un intrón híbrido, se clonó en un plásmido que contenía los ITR de serotipo 2 de AAV (AAV2 ITR). Jin et al. (2002) J. Clin. Invest. 109:1183-1191. Los vectores híbridos se produjeron mediante transfección triple utilizando una serie de plásmidos coadyuvantes que contenían dominios que codificaban cápsidas de serotipos específicos además de los genes de replicación de AAV de tipo 2. Esta estrategia permite el empaquetamiento de los vectores AAV2 ITR en cada virión de serotipo específico, Rabinowitz, et al. (2002) J. Virol. 76:791-801. Con este enfoque el genoma recombinante de hASM se utilizó para generar una serie de vectores rAAV-hASM de diferentes serotipos incluyendo AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 y AAV2/8. Los vectores AAV recombinantes se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico (Serotipos 2/1, 2/2 y 2/5). O'Riordan et al. (2000) J. Gene Med. 2:444-54 o centrifugación en CICs (serotipos 2/8 y 2/7) Rabinowitz et al. (2002) J. Urrol . 76:791-801. El título final de las partículas de virión AAV-ASM (partículas resistentes a la ADNasa), se determinó mediante PCR Taqman de la secuencia CMV. Clark et al (1999) Hum. Gene Therapy 10:1031-1039.

Los anticuerpos ASM humanos son específicos de los seres humanos y no experimentan reacción cruzada con ASM de ratón. Se incubaron 9018 placas Coster (Corning, NY) recubiertas (100 µl/pocillo) con anticuerpo ASM humano recombinante monoclonal (rhASM) (2 µg/ml) diluido en tampón carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) durante la noche a 2-8°C. El anticuerpo de recubrimiento en exceso se eliminó y se añadió diluyente de bloqueo (KPL, Inc., MD) durante 1 h a 37°C. Las placas se lavaron con un lavador automático de microplacas (Molecular Devices, CA) durante dos ciclos. Los patrones, los controles y las muestras diluidas en tampón de dilución patrón (PBS, Tween al 0,05%, HP-BSA al 1%) se pipetearon por duplicado y se dejaron incubando durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron como se ha descrito antes. Se añadieron 100 microlitros de anticuerpo ASM humano recombinante biotinilado (rhASM) (diluido 1:20K en tampón de dilución patrón) a cada pocilio, se dejaron incubando durante 1 hora a 37°C, y después se eliminaron con un lavador automático de microplacas. Después se añadió Estreptavidina - HRP (Pierce Biotechnology, Inc., IL) diluida 1:10K (100 µl/pocillo) y se dejó incubando durante 30 min a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron como se ha descrito antes y después se incubaron con SureBlue TMB (KPL, Inc., MD) durante 15 minutos a 36-38°C. La reacción se detuvo con Solución de parada (KPL, Inc., MD) y después se leyeron los valores de absorbancia a 450 nm con un lector de placas Spectra Max 340 (Molecular Devices, CA) . El análisis de los datos se completó utilizando un soporte lógico Softmax Pro 4.3 (Molecular Devices, CA) .

La concentración de proteína para cada muestra se determinó con el kit de análisis de proteínas BCA (Pierce Biotechnology, Inc., IL) utilizando seralbúmina bovina como patrón .

Los ratones fueron perfundidos transcardialmente con un fijador que contenía paraformaldehído al 2%, glutaraldehído al 0,03%, CaCl2 al 0,002% en tampón acetato de sodio 0, 1 M a pH 6,5, seguido de perfusión con el mismo fijador a pH 8,5. Los cerebros y las médulas espinales de los ratones se diseccionaron y se fijaron con posterioridad durante la noche a 4°C en fijador sin glutaraldehído a pH 8,5. Los tejidos se lavaron en tampón fosfato de potasio 0,1 M, pH 7,4, embebidos en agar al 3,5% y se cortaron en secciones sagitales de 50 µim con un vibratomo.

Los cerebros y las médulas espinales se seccionaron con un vibratomo sagitalmente a intervalos de 50 µm. Las secciones se manipularon para la inmunofluorescencia con anticuerpos primarios contra ASM humana (1:200). Las secciones se incubaron en suero de burro al 10%, Tritón X-100 al 0,3% en PBS durante 1 hora, seguido de incubación con anti-ASM humana de ratón biotinilada en suero de burro al 2%, Tritón X-100 al 0,2% en PBS durante 72 horas. Después del lavado, la señal se amplificó utilizando un kit Tyramide Signal Amplification (PerkinElmer, Bostón, MA) . La proteína ASM humana se visualizó con un microscopio fluorescente Nikon, y las imágenes se capturaron con una cámara SPOT y el soporte lógico Adobe Photoshop.

El complejo de filipina (Sigma, St. Louis, MO) se diluyó primero en metanol del 100% para una concentración de partida de 1 mg/ml. La solución de partida es estable durante 4 semanas a -20°C. Después de lavar con PBS, las secciones se incubaron en la oscuridad durante tres horas en una solución de filipina de 10 mg/ml recién elaborada en PBS. Las secciones se lavaron después tres veces con PBS. Los depósitos de colesterol se visualizaron en un filtro ultravioleta en un microscopio de fluorescencia.

Los cerebros se manipularon para la inmunofluorescencia utilizando anticuerpos primarios dirigidos contra la proteína de unión al calcio, calbindina. Las secciones se lavaron con tampón fosfato de potasio (KPB) y después se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato de potasio (KPBS). Las secciones se bloquearon después en suero de burro al 5%, Tritón X-100 al 0,25% en KPBS hasta durante 3 horas y después se incubaron en suero de burro al 5%, Tritón X-100 al 0,2% y anti-calbindina de ratón (1:2500, Sigma, St Louis, MO) en KPBS. Al cabo de 72 horas a 4°C las secciones se enjuagaron con KPBS con Tritón X-100 al 0,1% tres veces. El anticuerpo secundario, CY3 de burro anti-ratón (1:333, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) se añadió en KPBS + Tritón X-100 al 0,1% durante 90 minutos a la temperatura ambiente. Las secciones se lavaron con KPB y después se montaron sobre portas recubiertos de gel. Las células positivas a la calbindina se visualizaron bajo epifluorescencia . Con el fin de cuahtificar las células de Purkinje del cerebelo, se seleccionaron secciones cerebelares medias, de las cuatro caras complejas de cada animal. Las células de Purkinje inmunopositivas a la calbindina se observaron en un microscopio fluorescente y se contaron los cuerpos celulares a un aumento de 20X. Cada lóbulo se contó separadamente. Se contaron dos planos focales separados por lóbulo. Sólo se contaron las células del foco para asegurarse de que ninguna célula se contaba dos Veces. Primero se manipularon secciones de vibratomo de cincuenta (50) µm para la inmunofluorescencia con anticuerpos dirigidos contra ASM humana, como se ha descrito antes. Las secciones se lavaron después en PBS y se tiñeron para la colina acetiltransferasa (ChAT; policlonal de conejo, 1:500, Chemicon International, Temecula, CA) con el protocolo esbozado antes para la calbindina. En lugar de utilizar un anticuerpo secundario CY3, no obstante, se utilizó FITC de burro anti-conejo (1:200, Jáckson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) . La tinción se visualizó primero bajo epifluorescencia y las últimas imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal.

La tinción con filipina se cuantificó como sigue. Se obtuvieron imágenes de exposición semejante utilizando un microscopio de epifluorescencia vertical de campo amplio Nikon E600 equipado con una cámara digital SPOT. Primero se formó la imagen del grupo AAV2/l-ß-gal, y esta exposición se utilizó para obtener todas las imágenes adicionales. Cada imagen analizada representa un plano sagital medio a través de la longitud de cada hemiencéfalo. El análisis morfométrico se realizó con el soporte lógico Metamorph (Universal Imaging Corporation) . Se introdujo el valor umbral de las imágenes AAV2/l-ß-gal; una vez establecido, se utilizó el mismo umbral en todas las imágenes. Las siguientes regiones fueron seleccionadas manualmente por el usuario y analizadas separadamente: cerebelo, pons, bulbo raquídeo, cerebro medio, córtex cerebral, hipocampo, tálamo, hipotálamo y cuerpo estriado. Se midió la intensidad integrada en cada región, y todas las mediciones (n=3/grupo) de urt grupo dado de animales se utilizaron para generar las medias. La reducción de colesterol en los animales tratados se calculó después como el descenso del porcentaje de la intensidad integrada en comparación con los ratones inyectados con ß-gal desactivado. Se observó una inmunotinción de hASM positiva en cerebelo (Tabla 1), pons, bulbo raquídeo y médula espinal después de la inyección unilateral de AAV-ASM en los núcleos cerebelares profundos .

Tabla 1 Zonas con tinción de hASM positiva como función del serotipo AAV. *Indica que la hASM positiva estaba por debajo del limite de detección, pero todavía ocurría la corrección de la patología del colesterol.

En el cerebelo, los ratones se trataron con AAV2/1-ASM y tuvieron el nivel más amplio (esto es, diseminado entre los lóbulos dentro de la misma sección sagital) de expresión de hASM, mientras que los ratones tratados con AAV2/2-ASM tuvieron el nivel más restringido de expresión de la proteína ASM humana. La expresión de la proteina ASM humana en ratones tratados con AAV2/5-ASM, AAV2/7-ASM, y AAV2/8-ASM fue intermedia entre estos dos grupos. La diseminación media - lateral entre las secciones sagitales fue máxima en ratones tratados con los serotipos 1 y 8 y mínima en el ratón inyectado con el serotipo 2. Los serotipos 5 y 7 iniciaron patrones de diseminación media - lateral intermedios entre los serotipos 1 y 2. Cada capa del cerebelo (esto es, molecular, Purkinje y granular) fue transducida por cada serotipo AAV; no obstante, resultó evidente un incremento de afinidad para la capa molecular para todos los serotipos. La transducción de las células de Purkinje fue máxima en ratones tratados con los serotipos 1 y 5. Los ratones inyectados con el serotipo 7 tenían el menor número de células de Purkinje transducidas. Los ratones tratados cfn el serotipo 8 también tuvieron pocas células de Purkirtje transducidas, pero tuvieron menos expresión de ASM dentro de la capa granular cuando se compararon con los serotipos 1, 2, 5 y 7. Parecía que las células de Purkinje transdusidas con ASM tenían una citoestructura sana. El análisis cuantitativo de la expresión de la proteina hASM mediado por AAV mediante ELISA en productos homogeneizados de tejido cerebelar apoya estos hallazgos inmunohistoquímicos . Los ratones inyectados con los serotipos 1 y 8 demostraron niveles de proteína hASM en cerebelo significativamente superiores (p < 0,0001) cuando se compararon con todos los demás ratones. Los niveles de hASM cerebelar de ratones inyectados con los serotipos 2, 5, y 7 no estuvieron por encima de los niveles WT (esto es, fondo) . Como se esperaba, no se detectó ASM humana en ratones de tipo salvaje - los anticuerpos hASM utilizados en el ELISA son específicos de seres humanos.

Una ausencia de proteína ASM funcional da como resultado la acumulación lisosomal de esfingomielina, y los subsiguientes defectos metabólicos tales como el tráfico anormal de colesterol. Sarna et al. Éur J Neurosci. 13:1873-1880 y Leventhal et al (2001) J. Biol. Chem. 276:44976-4498. La acumulación de colesterol libre en el cerebro de ratón ASMKO se visualiza utilizando filipina, una molécula autofluorescente aislada de Streptomyces filipensis. Los cerebros de ratón de tipo salvaje no se tiñen positivamente para la filipina. En todos los ratones tratados con AAV (con excepción de AAV2/l-ßgal) el aclarado de la tinción con filipina (Tabla 2) se solapaba con zonas que eran positivas para la inmunotinción de hASM indicando que cada serotipo es capaz de generar un producto transgénico funcional.

Tabla 2 Porcentaje de reducción del aclaramiento de filipina (esto es, colesterol) en comparación con los ratones ASMKO tratados con AAV-ß-gal en regiones del cerebro seleccionadas después de la inyección intracerabelar de diferentes serotipos de AAV (n=3/serotipo; 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, y 2/8) que codifican ASM humana en los núcleos cerebelares profundos de los ratones ASMKO.

Como han demostrado previamente (Passini et al. (2003) en "Society for Neuroscience" New Orieans, LA), el aclaramiento de filipina también se produjo en zonas anatómicamente conectadas con el sitio de inyección, pero que no se teñían positivamente para hASM. El análisis MetaMorph indicó que se producía una reducción de la tinción con filipina a lo largo de todo el eje caudal rostral. En el cerebelo y el tronco encefálico la filipina se redujo máximamente en ratones tratados con ÁAV2/1-ASM y AAV2/8-ASM, mientras que en el diencéfalo y el córtex cerebral los ratones inyectados con AAV2/8-ASM tuvieron el mejor nivel global de aclaramiento de filipina (Tabla 2) . Sin embargo, estos resultados indican que el nivel de hASM requerido para corregir la patología de almacenamiento de colesterol en el SNC de los ratones ASMKO es mínimo (esto es, por debajo del límite de detección mediante inmunofluorescencia de hASM) .

Los estudios histológicos indican que el cerebelo de ratón ASMKO experimenta un rápido deterioro. Más específicamente, las células de Purkinje mueren progresivamente entre las 8 y 20 semanas de edad (Sarna et al. (2001) Eur. J. Neurosci. 13:1813-1880 y Stewart et al. (2002) in "Society for Neuroscience" Orland, FL) . La calbindina es un marcador de células de Purkinje ampliamente aceptado. La tinción positiva con calbindina en ratones tratados con AAV-ASM podría sugerir que la expresión mediada por AAV de hASM es terapéutica. En resumen, los resultados de los autores de la presente invención indican que la expresión de hASM mediada por AAV en el cerebelo previene la muerte de las células de Purkinje en el ratón ASMKO (Tabla 3). Como se esperaba, la supervivencia de las células de Purkinje no se producía en los lóbulos I-III; los ratones fueron inyectados a las 7 semanas de edad y a las 8 semanas la mayoría de estas células ya había muerto. La supervivencia de las células de Purkinje en los lóbulos IV/V fue máxima en los ratones tratados con el serotipo 1. En el lóbulo VI no se observó una supervivencia significativa de células de Purkinje. En el lóbulo VII solamente los ratones tratados con el serotipo 5 mostraron una supervivencia de las células de Purkinje significativa. En el lóbulo VIII de nuevo los ratones tratados con el serotipo 5 asi como con el serotipo 2 mostraron una supervivencia significativa de células de Purkinje. En los lóbulos IX y X no hubieron diferencias significativas entre los ratones WT y1 KO (o entre los ratones tratados con AAV) en los conteos de células de Purkinje. Esto se esperaba, puesto que a las 14 semanas de edad (esto es, la edad de sacrificio) las células de Purkinje en estos lóbulos todavía eran viables en los ratones ASMKO. En todos los lóbulos la supervivencia de las células de Purkinje fue máxima en ratones tratados con los serotipos 1, 2, y 5 y minima en los ratones tratados con los serotipos 7 y Tabla 3 Recuentos de células de Purkinje en los lóbulos cerebelares I-X en ratones WT y ASMKO tras la inyección intracerebelar de diferentes serotipos de AAV (n=3/serotipo; 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, y 2/8) que codifican ASM humana en los núcleos cerebelares profundos de ratones ASMKO. Los números que aparecen en cursiva negrita son significativamente diferentes de los ratones KO (esto es, ratones tratados con AAV2/l-ßgal) p<0,01.

En el ensayo del rotarod en aceleración, los ratones de ensayo inyectados unilateralmente con AAV2/1-ASM y AAV2/8-ASM demostraron una latencia significativamente mayor (p<0,0009) a caer que los ratones ASMKO inyectados con AAV2/l-ßgal. Los ratones inyectados con el serotipo AA2/1-ASM no fueron significativamente diferentes de los ratones de tipo salvaje. Los ratones inyectados con AA2/2-ASM y AAV2/5-ASM mostraron una tendencia hacia una mayor latencia a caer que los ratones ASMKO inyectados con AAV2/l-ßgal; mientras, los ratones inyectados con AAV2/7-ASM no. Para el ensayo con el rotarod en balanceo, sólo los ratones inyectados con AA2/1-ASM demostraron una latencia significativamente mayor (p<0,0001) a caer que los ratones inyectados con AA2/l-ßgal. En este caso, los ratones de tipo salvaje funcionaron significativamente mejor que los ratones inyectados con AA2/1-ASM. Los ratones ASMKO que recibieron una inyección bilateral de AAV2/1-ASM o de AAV2/2-ASM funcionaron significativamente mejor (p<0,001) que los ratones ASMKO tratados con AAV2/l-ßgal para los ensayos tanto de aceleración como de balanceo. Los ratones inyectados bilateralmente con AAV2/1-ASM funcionaron comparablemente a los ratones de tipo salvaje para ambos ensayos.

Una manera de determinar si la hASM generada por AAV es funcionalmente activa en el SNC de ASMKO es evaluar su influencia sobre la patología de almacenamiento de colesterol - un defecto metabólico secundario de la enfermedad NPA. En todos los ratones tratados con AAV (con excepción de AAV2/1-ßgal) la corrección de la patología de almacenamiento de colesterol se solapaba con zonas que eran positivas para la inmunotinción de hASM indicando que cada vector de serotipo es capaz de generar un producto transgénico funcional. Como se ha demostrado previamente, la corrección del metabolismo anómalo del colesterol también se produjo en zonas anatómicamente conectadas con el sitio de inyección, también en regiones que no se teñían positivamente para hASM, sugiriendo que el nivel de hASM requerido para la corrección de la patología de almacenamiento de colesterol es mínimo. En consonancia con estos resultados histoquímicos y bioquímicos de hASM, los ratones tratados con los serotipos 1 y 8 demostraron una notable reducción de la patología de almacenamiento de colesterol. Los ratones tratados con los serotipos 2, 5, y 7 también mostraron una reducción de la patología de almacenamiento de colesterol, pero no en el mismo grado que los ratones tratados Con los serotipos 1 y 8.

Modelo Terapéuticamente Relevante de Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS) . La esclerosis lateral amiotrófica (ALS) es una enfermedad neurodegenerativa fatal que está caracterizada por una pérdida selectiva de neuronas motoras en el córtex, tronco encefálico y médula espinal. El progreso de la enfermedad puede conducir a la atrofia de los músculos de las extremidades, axilales y respiratorios. La muerte de las células neuronales motoras está acompañada de gliosis reactiva, anomalías en los neurofilamientos, y una pérdida significativa de fibras mielínicas gruesas en los tractos corticoespinales y en las raíces ventrales1-6. Si bien la etiología de la ALS es escasamente comprendida, las evidencias acumuladas indican que la ALS esporádica (SALS) y familiar (FALS) comparten muchas características patológicas; proporcionando así la esperanza dé que el estudio de cualquier forma conduzca a un tratamiento común7. La FALS representa aproximadamente el 10% de casos diagnosticados, de los cuales un 20% están asociados Con mutaciones heredadas dominantemente en la Cu/Zn- superóxido dismutasa (S0D1)8. Los ratones transgénicos que expresan la proteína SOD1 humana mutante (p. ej . , ratones S0D1G93A) recapitulan muchas características patológicas de la ALS y constituyen un modelo animal disponible para el estudio de la ALS9. Para la SALS, una miriada de mecanismos patológicos han sido implicados como la causa subyacente, incluyendo la excitotoxicidad inducida por glutamato, la exposición a toxinas, la disfunción del proteasoma, el deterioro mitocondrial, la desorganización de los neurofilamentos y la pérdida de soporte neurotrófico10'11.

Hasta la fecha no hay una terapia efectiva para el tratamiento de la ALS. Se han investigado extensamente factores neurotróficos tales como el factor de crecimiento insulínico (IGF-1) en cuanto a su potencial utilidad en el tratamiento de la ALS. El reparto intracraneal de vectores virales (que son susceptibles de transporte axónico) a regiones del SNC que están interconectadas con el tronco encefálico y las neuronas motoras espinales proporciona un medio para administrar agentes terapéuticos potenciales, tales como IGF-1, a zonas a las que por otra parte sería difícil de llegar a través de los medios de la técnica anterior .

Sin estar limitados por la teoría, puede ser que estas regiones buscadas no necesiten necesariamente tener conexiones directas con las neuronas motoras; esto es, puede ser suficiente que estas regiones buscadas tengan conexión directa con células (p. ej . , internearonas y astrocitos) que simplemente componen el entorno celular de las neuronas motoras. Esta suposición está apoyada por estudios en ratones híbridos que son mezclas de células normales y que expresan SOD1 mutante. Estos experimentos demostraron que las células no neuronales que no expresan SOD1 mutante retrasaron la degeneración y prolongaron significativamente la supervivencia de las neuronas motoras que expresan el mutante13. Además, experimentos adicionales han demostrado que las células constituyen el entorno celular de una neurona motora (v.g., astrocitos y microglía) son fuentes importantes de factores neurotróficos, y se ha sugerido que el deterioro de estas células (como ocurre patológicamente en la ALS) es uno de los factores subyacentes que contribuye a la degeneración de las neuronas motoras11.

Una región del SNC que es probable que apoye el transporte de un vector viral terapéutico y/o una proteína expresada al entorno celular de las neuronas motoras son los núcleos cerebelares profundos (NCP) del cerebelo. Los NCP tienen conexiones aferentes y eferentes extensas tanto con el tronco encefálico como con la médula espinal (véase la Figura o l)14"19. La búsqueda de los NCP en un modelo de ratón de enfermedad neurometabólica con vectores virales susceptibles de transporte axónico dio como resultado la detección de proteína transgénica tanto en el tronco encefálico como en la médula espinal20. Interesantemente, la proteína transgénica se detectó en células que eran tanto positivas como negativas para la colina acetiltransferasa (ChAT) , un marcador de neuronas motoras.

La expresión positiva de mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa-1 (SOD-1) en ratones y ratas resume las características clínicas y patológicas de la ALS en seres humanos . Los compuestos activos para retrasar los síntomas en este modelo han demostrado ser predictivos de la eficacia clínica en pacientes con ALS, y por consiguiente es un modelo terapéuticamente relevante de esta enfermedad. Tales modelos de ratón han sido descritos previamente por Tu et al. (1996) P.N. A.S. 93:3155-3160; Kaspar et al. (2003) Science 301:839-842; Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11 (4) : 423-428 y Ralph et al. (2005) Nat. Med. 11 (4) : 429-433. Los experimentos actuales, por consiguiente, buscan investigar la influencia del reparto bilateral en los NCP de AAV-IGF-1 sobre el progreso de la enfermedad en ratones S0D1G93A (esto es, 90 días de edad) sintomáticos. Específicamente, los objetivos primarios fueron determinar si el reparto de AAV-IGF-1 daba como resultado (1) el reparto del vector y/o la proteína en el tronco encefálico y la médula espinal; (2) la reducción de la neuropatología en el tronco encefálico y la médula espinal; (3) la mejora de la función del comportamiento motor; y (4) una prolongación significativa de la duración de la vida. Los resultados indican que la inyección de vectores virales en regiones del SNC que están interconectadas con el tronco encefálico y la médula espinal es un enfoque viable para repartir transgenes terapéuticos potenciales en el tronco encefálico y la médula espinal. Por otra parte, los resultados de los autores de la presente invención apoyan el desarrollo de terapias que están diseñadas para tratar la degeneración de las neuronas motoras a través de la modificación de su entorno celular.

Se realizaron dos estudios en $0D1 G93A (ratón mutante S0D1G93A, referido hasta ahora como ratón S0D1). Este modelo imita íntimamente la ALS humana. Existe degeneración progresiva de las neuronas motoras con déficits motores en las extremidades posteriores que aparecen en torno a los 90 días de edad en los ratones. La muerte se produce en torno a los días 120-122. Cada estudio tuvo cuatro grupos de tratamiento: 1) ratones que recibieron AAV de serotipo 1 que codifica IGF-1 (AAV1-IGF1); 2) ratones que recibieron AAV de serotipo 1 que codifica para la proteína fluorescente verde (AAV1-GFP) : 3) ratones que recibieron AAV de serotipo 2 que codifica IGF-1 (AAV2-IGF1); 4) ratones que recibieron AAV de serotipo 2 que codifica para la proteína fluorescente verde (AAV2-GFP) .

Sin estar limitados por la teoría, la IGF-1 es una proteína terapéutica para el tratamiento de la ALS debido a sus acciones principales a diferentes niveles del neuroeje (véase Dore et al., Trends Neurosci, 1997, 20:326-331). En el cerebro: Se cree que reduce la apoptosis tanto neuronal como glial, protege las neuronas de la toxicidad inducida por hierro, colchicina, desestabilizadores de calcio, peróxidos, y citocinas. También se cree que modula la liberación de los neurotransmisores acetilcolina y glutamato. También se cree que induce la expresión de la protfina del neurofilamento, tubulina y básica de mielina. En la médula espinal: se cree que el IGF-1 modula la actividad ChAT y atenúa la pérdida del fenotipo colinérgico, aumenta el brote de neuronas motoras, aumenta la mielinización, inhibe la desmielinización, estimula la proliferación y diferenciación de neuronas motoras a partir de células precursoras, y promueve la división, la maduración y el crecimiento de las células de Schwan. En el músculo: se cree que el IGF-1 induce la formación de agrupamientos de receptores de acetilcolina en la conexión neuromuscular e incrementa la función neuromuscular y la fuerza muscular. En este experimento, se utilizó la forma IGF-lEa de la proteína.

La proteína fluorescente verde se utilizó como proteína de control, que también posibilitó la visualización de la expresión mediada por la inyección de los vectores AAV.

Noventa dias después del nacimiento, los ratones SOD1 fueron inyectados bilateralmente en los NCP con los vectores recombinantes AAV. En un estudio, la dosis fue de aproximadamente 2,0 elO gc/ml inyectado por sitio. Algunos ratones se sacrificaron aproximadamente 110 días después del nacimiento y sus cerebros y sus médulas espinales se analizaron para la tinción GFP, la expresión de IGF-1 a través de inmunohistoquímica, la expresión de IGF-1 a través de ELISA, la expresión de IGF-1 a través de RT-PCR, la localización de ChAT a través de inmunohistoquímica, la expresión de la proteína acida fibrilar de la glía (GFAP) , el recuento de neuronas motoras, el ensayo funcional (balanceo y aceleración) en el rotarod como se ha descrito aates, la fuerza de agarre tanto de la extremidad posterior como de la extremidad anterior utilizando un aparato para medir la fuerza de agarre, y la supervivencia.

Se introdujo un "evento de muerte" cuando los animales ya no se pudieron poner "derechos" en 30 segundos después de colocar al animal sobre su dorso, o los animales fueron encontrados muertos por los técnicos de cuidado animal. La clasificación del "evento de muerte" fue realizada por dos individuos con el grupo de animales (estando unidos GFP vs IGF-1) en el momento de la evaluación.

Se detectó GFP en el tronco encefálico y a lo largo de cada división de la médula espinal después de la liberación bilateral de un vector AAV que expresa GFP a los núcleos cerebelares profundos (NCP) (véanse las Figuras 13 y 14). La Figura 22 muestra la distribución de GFP en el cerebro de ratón. Además de los NCP, también se observó tinción positiva con GFP en los bulbos olfatorios, el córtex cerebral, el tálamo, el tronco encefálico, el córtex cerebelar y la médula espinal. Todas estas zonas reciben proyecciones de y/o mandan proyecciones a los NCP. Además, se observaron fibras y/o células positivas a GFP próximas a células positivas a ChAT.

Se detectó ARNm de IGF-1 en el tronco encefálico y en cada división de la médula espinal en ratones tratados con AAV-l-IGF-1 o AAV2-IGF-1 demostrando que el vector experimentó transporte retrógrado (véase la Figura 18). La proteína IGF-1 se detectó en el tronco cerebral y en la médula espinal en ratones tratados con AAV1-IGF-1 o AAV2-IGF-1. Se observó una reducción de la tinción de GFAP en los núcleos oromotores (por ejemplo, núcleo motor del trigémino, núcleo del facial, y núcleo del hipogloso) y en cada división de la médula espinal en ratones tratados con AAV-l-IGF-1 o AAV2-IGF-1 (véanse las Figuras 15-17). La GFAP es un marcador de la gliosis, que es un sello patológico de la ALS. El reparto de AAV1-AGF-1 o AAV2-IGF1 condujo a una mejora funcional significativa en las tareas del rotarod y la fuerza de agarre (véase la Figura 20). El reparto de AAV1-AGF-1 o AAV2-IGF1 también prolongó significativamente la duración de la vida de los ratones SODl (véase la Figura 21 donde la supervivencia media aumentó a 133,5 o 134 días en ratones tratados con AAV-l-IGF-1 en comparación con los 121 o 120 días en los ratones tratados con AAV-GFP) . En la Figura 19 se ilustra que la liberación en los NCP de AAV-IGF-1 promovía la supervivencia de las neuronas motoras. La diferencia entre los ratones tratados con AAV que codifican IGF-1 en comparación con la liberación en los NCP de AAV que codifican GFP es significativa estadísticamente a un valor de p = 0,01 como se indica mediante el asterisco.

Independientemente del serotipo, el tratamiento con AAV-IGF-1 promovió significativamente la supervivencia de las neuronas motoras, mejoró el funcionamiento motor en los ensayos del rotarod y de la fuerza de agarre, y prolongó significativamente la duración de la vida. La expresión de IGF-1 se detectó a lo largo del tronco cerebral y de la médula espinal utilizando PCR y ELISA.

La memoria se entiende más completamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la memoria. Las realizaciones en la memoria proporcionan una ilustración de las realizaciones de la invención y no se debe considerar que limitan el alcance de la invención. El artesano experto advierte fácilmente que muchas otras realizaciones están abarcadas por la invención. Todas las publicaciones, patentes, y secuencias biológicas citadas en esta descripción son incorporadas como referencia en su totalidad. En la medida en que el material incorporado como referencia contradiga o no sea congruente con la presente memoria, la presente memoria sobrepasará cualquiera de tales materiales. La mención de cualquier referencia en la presente memoria no es un reconocimiento de que tales referencias sean técnica anterior a la presente invención.

A no ser que se indique de otro modo, se debe entender que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivos celulares, condiciones de tratamiento, etcétera utilizados en la memoria, incluyendo las reivindicaciones, están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a no ser que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden ser muy dependientes de las propiedades deseadas buscadas a obtener por la presente invención. A no ser que se indique de otro modo, se debe entender que el término "al menos" que precede a una serie de elementos hace referencia a todos los elementos de las series. Los expertos en la técnica advertirán, o serán capaces de discernir utilizando sólo experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones especificas de la invención descrita en la presente memoria. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Referencias 1. Leigh, P.N. & Swash, M. Cytoskeletal pathology in motor neuron diseases. Adv Neurol 56, 115-24 (1991) . 2. Carpenter, S. Proximal axonal enlargement in motor neuron disease Neurology 18 841-51 (1968). 3. Gonatas, N.K. et al. Fragmentation of the Golgi apparatus of motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis. Am J Pa tho 140, 731-7 (1992). 4 . Hirano, A. et al. Fine structural study of neurofibrillary changes in a family with amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropa thol Exp Neurol 43, 471- 80 (1984) . 5 . Leigh, P. N. et al. Ubiquitin-immunoreactive intraneuronal inclusions in amyotrophic lateral sclerosis. Morphology, distribution, and specificity. Brain 114 (Pt 2), 775-88 (1991). 6. Delisle, M.B. & Carpenter, S. Neurofibrillary axonal swellings and amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci 63, 241-50 (1984) . 7. Hirano, A. Neuropathology of ALS: an overview. Neurology 47, S63-6 (1996) . 8. Rosen, D.R, et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Na ture 362, 59-62 (1993). 9. Gurney, M. E. et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science 264, 1772-5 (1994). 10. Rowland, L. P. & Shneider, N.A. Amyotrophic lateral sclerosis. N Engl J Med 344, 1688-700 (2001). 11. Bruijn, L.I., Miller, T.M. & Cleveland, D.W. Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci 27, 723-49 (2004) . 12. Cleveland, D.W. & Rothstein, J.D. From Charcot to Lou Gehrig; deciphering selective motor neuron death in ALS. Na t Rev Neurosci 2, 806-19 (2001) . 13. Lindsay, R.M. Neurotrophic growth factors and neurodegenerative diseases: therapeutic potential of the neurotrophins and ciliary neurotrophic factor. Neurobiol Aging 15, 249-51 (1994). 14 . Raspar, B. K., Liado, J., Sherkat, N., Rothstein, J. D. & Gage, F. H. Retrograde viral delivery of IGF-1 prolongs survival in a mouse ALS model. Science 301, 839-42 (2003) . 15. Clement, A.M. et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice.

Science 302, 113-7 (2003) . 1 6. Matsushita, M. Projections from the lowest lumbar and sacral-caudal segments to the cerebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 404, 21-32 (1999) . 1 7. Matsushita, M. and Gao, X. Projections from the thoracic cord to the cerebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 386, 409-21 (1997) . 18. Matsushita, M. & Xiong, G. Projections from the cervical enlargement to the cérebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 377, 251-61 (1997). 19. Matsushita, M. & Yaginuma, H. Afferents to the cerebellar nuclei from the cervical enlargement in the rat, as demonstrated with the Phaseolus vulgaris leucoagglutinin method. Neurosci Lett 113, 253-9 (1990). 20. Matsushita, M. & Yaginuma, H. Projections from the central cervical nucleus to the cerebellar nuclei in the rat, studied by anterograde axonal tracing. J Comp Neurol 353, 234-46 (1995); Voogd, J. The cerebellar nuclei and their efferent pathways. in The ra t nervous sys tem (ed. Paxinos, G J 208-215 ,'Elsevier Academic Press, San Diego, 2004)

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método que comprende administrar un vector viral neurotrópico recombinante que comprende un transgen al menos en una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro, donde dicha administración es en condiciones que favorecen el reparto del producto transgénico a la médula espinal y/o el tronco encefálico.

2. Un método que comprende administrar un vector viral neurotrópico recombinante que comprende un trans'gen en la región del córtex motor del cerebro, donde dicha administración es en condiciones que favorecen el reparto del producto transgénico a la médula espinal.

3. Un método para repartir un transgen en una neurona motora en un sujeto, que comprende administrar un vector viral neurotrópico recombinante que Comprende dicho transgen al menos en una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro, donde dicho transgen es expresado o repartido a una neurona motora distante de dicho sitio de administración.

4. Un método para repartir un transgen en una neurona motora en un sujeto, que comprende administrar un vector viral neurotrópico que comprende dicho transgen en la región del córtex motor del cerebro, donde dicho transgen es expresado o repartido a una neurona motora distante de dicho sitio de administración.

5. Un método para tratar un trastorno de las neuronas motoras en un sujeto, que comprende administrar un vector viral neurotrópico recombinante que comprende un transgen terapéutico al menos en una región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro, donde el producto transgénico es repartido en una cantidad terapéuticamente eficaz en al menos una subdivisión de la médula espinal y/o al menos una división del tronco encefálico.

6. Un método para mejorar los síntomas de un trastorno de las neuronas motoras en un sujeto, que comprende administrar un vector viral neurotrópico recombinante que comprende un transgen terapéutico en la región del córtex motor del cerebro, dónde dicho producto transgénico es repartido en una cantidad terapéuticarrtente eficaz al menos en una subdivisión de la médula espinal.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho vector viral neurotrópico es un vector viral adeno-asociado (AAV) .

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho vector viral neurotrppico es un vector viral adeno-asociado, seleccionado del grupo que consiste en AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 , y AAV8.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 5, donde dicha región de la región de los núcleos cerebelares profundos del cerebro se selecciona del grupo que consiste en la región medial, la región interpuesta y la región lateral.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho reparto es bilateral.

11. El método de las reivindicaciones 5 o 6, donde dicha subdivisión de la médula espinal se selecciona del grupo que consiste en la subdivisión cervical, la subdivisión torácica, la subdivisión lumbar, y la subdivisión sacra.

12. El método de las reivindicaciones 5 o 6, donde dicho transgen es repartido a todas las subdivisiones de la médula espinal .

13. El método de la reivindicación 12, donde al menos una de dichas múltiples administraciones es bilateral.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho transgen se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento de insulina-1 (IGF-1), calbindina D28, parvalbúmina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, SMN-1, SMN-2 y CNTF (Factor neurotrófico ciliar) .

15. El método de la reivindicación 6, donde la expresión de dicho transgen alivia los síntomas de un trastorno de las neuronas motoras seleccionado del grupo que consiste en esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , esclerosis lateral primaria (PLS), atrofia muscular bulbar espinal, ataxia cerebelar espinal, atrofia, y lesión traumática de la médula espinal .

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho sujeto es un paciente humano.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho transgen expresa una cantidad terapéutica de una proteína seleccionada del grupo que consiste en factor de crecimiento de insulina-1 (IGF-1), EPO (eritropoyetina), CBP (proteína de unión a la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc [CREB]), calbindina D28, parvalbúmina, HIFl-alfa, SIRT-2, VEGF, SMN-1, SMN-2, y CNTF (Factor neurotrófico ciliar) .