BRPI0611379A2 - terapia genética para distúrbios neurometabólicos - Google Patents

Abstract

A descoberta diz respeito a métodos e composicões para tratar distürbios que afetam o sistema nervoso central (SNC). Estes distürbios incluem distürbios neurometabolicos tais como doencas de armazenamento lisossomico que afetam o sistema nervoso central, por exemplo, doenca de Niemann-Pick A. Também incluem distürbios tais como doenca de Alzheimer. Os métodos descritos envolvem contactar uma extremidade axonal de um neuronio com uma composicao contendo maior título de AAV carregando um transgene terap²utico de modo que o vetor AAV é transportado axonalmente em um modo retrogrado e o produto transgenético é expressado distalmente para o sítio de administracao.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIAGENÉTICA PARA DISTÚRBIOS NEUROMETABÓLICOS".

Este pedido reivindica prioridade segundo 35 U.S.C. § 119(e) aoRequerimento Provisório dos Estados Unidos No. 60/677.057, arquivado em2 de maio de 2005, e ao pedido Provisório dos Estados Unidos No.60/685.808, arquivado em 31 de maio de 2005, cujos conteúdos são aqui, aeste requerimento de patente, incorporados por meio de referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composições e métodos paratratar distúrbios que afetam o sistema nervoso central (SNC) e em particular,a medula espinhal. A invenção adicionalmente refere-se a composiçõescompreendendo vetores virais tais como vetores de vírus adeno-associados(AAV), e métodos de administração dos mesmos.

Antecedentes da Invenção

Um grupo de distúrbios metabólicos conhecidos como doençasdo armazenamento lisossômico (LSD) inclui mais de quarenta distúrbios ge-néticos, muitos dos quais envolvem defeitos genéticos em várias hidrolaseslisossômicas. Doenças de armazenamento lisossômico representativas e asenzimas defeituosas associadas são listadas na Tabela 1.

Tabela 1

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* envolvimento do sistema nervoso central

A característica patognomômica da doença do armazenamentolisossômico é o acúmulo anormal de metabólitos nos Iisossomas o qual levaà formação de grandes números de Iisossomas distendidos no pericário. Umdesafio importante para tratar doença do armazenamento lisossômico (aocontrário de tratar uma enzimopatia específica do fígado) é a necessidadede reverter a patologia do armazenamento lisossômico em múltiplos tecidosseparados. Algumas doenças do armazenamento lisossômico podem sertratadas de modo eficaz por infusão intravenosa da enzima que falta, conhe-cida como terapia de reposição enzimática (TRE). Por exemplo, pacientescom Gaucher tipo 1 têm somente doença visceral e respondem favoravel-mente a terapia de reposição enzimática com glucocerebrosidase recombi-nante (Cerezyme®, Genzyme Corp.). No entanto, pacientes com doençametabólica que afeta o sistema nervoso central (por exemplo, doença deGaucher tipo 2 ou 3) não respondem a terapia de reposição enzimática in-travenosa porque a enzima de reposição é impedida de penetrar no cérebropela barreira sangüínea cerebral (BSC). Além disso, tentativas de introduziruma enzima de reposição no cérebro por injeção direta não têm tido sucessoem parte devido à citotoxicidade enzimática em altas concentrações locais(observações não publicadas) e limitados índices de difusão parenquimal nocérebro (Pardridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, 1991).A doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio que afeta o sistemanervoso central (SNC) caracterizado pelo acúmulo de β-peptídeo amilóide(Αβ) devido à redução do catabolismo do Αβ. À medida que Αβ se acumula,agrega-se em placas extracelulares, causando disfunção da função sinápticae perda de neurônios. A patologia leva a demência, perda de coordenação, emorte.

A terapia genética é uma modalidade de tratamento emergentepara distúrbios que afetam o sistema nervoso central, inclusive doenças doarmazenamento lisossômico e doença de Alzheimer. Nesta abordagem, arestauração do caminho metabólico normal e reversão da patologia ocorretransduzindo as células afetadas com um vetor carregando uma versão sau-dável ou uma versão modificada do gene.

A terapia genética do sistema nervoso central tem sido facilitadapelo desenvolvimento de vetores virais capazes de infectar de modo eficazneurônios pós-mitóticos. Para uma revisão de vetores virais para liberaçãogenética para o sistema nervoso central, vide Davidson et al. (2003) NatureRev., 4:353-364. Vetores de vírus adeno-associados (AAV) são considera-dos ótimos para terapia genética do sistema nervoso central porque têm umperfil favorável de toxicidade e imunogenicidade, são capazes de transduzircélulas neuronais, e são capazes de mediar expressão de longo termo nosistema nervoso central (Kaplitt et al. (1994) Nat. Genet., 8:148-154; Bartlettet al. (1998) Hum. Gene Ther., 9:1181-1186; e Passini et al. (2002) J. Neu-rosci., 22:6437-6446).

Um produto de transgene terapêutico, por exemplo, uma enzima,pode ser secretado por células transduzidas e subseqüentemente capturadopor outras células, nas quais então alivia a patologia. Este processo é co-nhecido como correção cruzada (Neufeld et al. (1970) Science, 169:141-146). No entanto, a correção da patologia, tal como patologia de armazena-mento no contexto de doença do armazenamento lisossômico, é tipicamenteconfinada à vizinhança imediata do sítio de injeção devido à limitada difusãoparenquimal do vetor injetado e do produto transgenético secretado (Tayloret al. (1997) Nat. Med., 3:771-774; Skorupa et al. (1999) Exp. Neurol.,160:17-27). Portanto, neuropatologia afetando múltiplas regiões cerebraisrequer liberação vetorial disseminada, usando múltiplas injeções difundidasespacialmente, especialmente em um cérebro grande tal como o humano.

Isto aumenta significativamente o risco de lesão cerebral. Além disso, algu-mas regiões do cérebro podem ser difíceis de acessar cirurgicamente. Por-tanto, seriam benéficos outros modos de transporte vetorial dentro do siste-ma nervoso central, além de difusão.

Quando administrados em terminais axonais, alguns vírus sãointernalizados e transportados retrogradamente ao longo do axônio para onúcleo. Os neurônios em uma região cerebral são interconectados por axô-nios a regiões cerebrais distais deste modo proporcionando um sistema detransporte para liberação vetorial. Estudos com adenovírus, HSV, e pseudo-rabies vírus têm utilizado propriedades de tráfego destes vírus para liberargenes a estruturas distais dentro do cérebro (Soudas et al. (2001) FASEB J.,15:2283-2285; Breakefield et al. (1991) New Biol., 3:203-218; e deFalco etal. (2001) Science, 291:2608-2613).

Vários grupos relataram que a transdução do cérebro por AAVsorotipo 2 (AAV2) está limitada ao sítio de injeção intracraniana (Kaplitt et al.(1994) Nat. Genet., 8:148-154; Passini et al. (2002) J. Neurosci., 22:6437-6446; e Chamberlin et al. (1998) Brain Res., 793:169-175). Um relatório re-cente sugere que transporte axonal retrógrado de AAV2 também pode ocor-rer em circuitos selecionados do cérebro de rato normal (Kaspar et al. (2002)Mol. Then, 5:50-56). No entanto, não se sabe quais parâmetros específicosforam responsáveis pelo transporte axonal observado, e se ocorreria trans-porte axonal suficiente e eficaz em um neurônio doente que está em um es-tado de disfunção celular. Na verdade, foi relatado que as lesões observadasem doença do armazenamento lisossômico neurônios interferem com oumesmo bloqueiam o transporte axonal (revisado em Walkley (1998) BrainPathol., 8:175-193), sugerindo que neurônios comprometidos por doençanão suportariam tráfego de AAV ao longo de seus axônios.

Portanto, existe a necessidade na técnica de desenvolver novosmétodos terapêuticos para tratar distúrbios metabólicos que afetam o siste-ma nervoso central.

Sumário da Invenção

A invenção proporciona métodos e composições para tratar ouprevenir distúrbios metabólicos, tais como doenças do armazenamento Ii-sossômico (LSD) ou função de armazenamento de colesterol anormal quesão caracterizados por ou estão associados a um risco de diminuição dafunção do sistema nervoso central.

A invenção proporciona métodos e composições para tratar ouprevenir distúrbios que afetam o sistema nervoso central (CNS), tais comodoença de Alzheimer que são caracterizados por ou estão associados a umrisco de diminuição da função do sistema nervoso central.

A invenção adciionalmente proporciona métodos para liberaçãoorientada minimamente invasiva de um transgene para regiões selecionadasno cérebro de um sujeito afetado.

Vantagens adicionais da invenção serão deteminadas em partena descrição a seguir, e em parte serão entendidas a partir da descrição, oupodem ser aprendidas pela prática da invenção.

A camundongos de nocaute de esfingomielinase ácida (ASM),um modelo de doença de Niemann-Pick Tipo A, foi administrado um vetor deAAV2 carregando o gene humano ASM (AAV-ASM) por uma única injeçãointracranial dentro de um hemisfério cerebral. A presente invenção se basei-a, em parte, na descoberta e na demonstração de que a injeção de alto títulode AAV.-ASM dentro do cérebro doente resulta em expressão de AAV-ASMdentro de múltiplos sítios distais em um padrão consistente com a organiza-ção topográfica dos neurônios de projeção que inervam o sítio de injeção. Ainvenção se baseia ainda, em parte, na descoberta e na demonstração deextensiva correção de patologia do armazenamento lisossômico no sítio deinjeção e nos sítios distais apra os quais AAV-ASM foi transportado e onde aASM foi expressada.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para cor-rigir a patologia do armazenamento do colesterol e iniciar a recuperação fun-cional no camundongo ASMKO depois de injeção unilateral ou alternativa-mente, bilateral dentro dos núcleos cerebelares profundos.

São adicionalmente proporcionados os métodos mencionadosacima em que o transgene é liberado em um vetor de AAV recombinanteselecionado entre o grupo consistindo nos sorotipos AAV2/1 , AAV2/2, A-AV2/5, AAV2/7 e AAV2/8. Para o fim de ilustração somente, os vetores re-combinantes codificaram proteína ASM humana funcional em um modelo decamundongo.

Por conseguinte, em um aspecto, a presente invenção propor-ciona métodos para tratar distúrbios neurometabólicos em mamíferos. Aspopulações tratadas pelos métodos da invenção incluem, mas não estãolimitadas a, pacientes tendo ou em risco de desenvolver uma doença do ar-mazenamento lisossômico, tais como distúrbios listados na Tabela 1 , parti-cularmente, se a doença referida afeta o sistema nervoso central. Em umamodalidade ilustrativa, a doença é doença de Niemann-Pick A e/ou a patolo-gia de armazenamento do colesterol secundária comumente associada com NPA.

Em um aspecto, os métodos descritos incluem administrar aosistema nervoso central de um sujeito doente um vetor viral de AAV carre-gando um transgene codificando um produto terapêutico e possibilitando queo transgene seja expressado dentro do sistema nervoso central distalmentedo sítio de administração em um nível terapêutico. Além disso, o vetor podecompreender um polinucleotídeo codificando para uma molécula biological-mente ativa eficaz para tratar o distúrbio do sistema nervoso central. As mo-léculas biologicalmente ativas referidas podem compreender peptídeos inclu-indo mas não limitados a versões nativas ou mutadas de proteínas de exten-são total, versões nativas ou mutadas de fragmentos de proteínas, polipeptí-deos sintéticos, anticorpos, e fragmentos de anticorpos tais como moléculasFab. Moléculas biologicalmente ativas também podem compreender nucleo-tídeos incluindo polinucleotídeos de DNA de filamento único ou de filamentoduplo e polinucleotídeos de RNA de filamento único ou de filamento duplo.

Para uma revisão de tecnologias de nucleotídeo exemplares que podem serusada na prática dos métodos descritos aqui, vide Kurreck, (2003) J., Eur. J.Biochem. 270, 1628-1644 [antisense technologies]; Yu et al., (2002) PNAS99(9), 6047-6052 [RNA interference technologies]; e Elbashir et al., (2001)Genes Dev., 15(2): 188-200 [siRNA technology].

Em uma modalidade ilustrativa, a administração é realizada porinjeção intraparenquimal direta de uma solução de alto título de vetor deAAV dentro do cérebro doente. Depois disso o transgene é expressado dis-talmente, contralateralmente ou ipsilateralmente, ao sítio de administraçãoem um nível terapêutico no mínimo 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,ou 50 mm do sítio de administração.

Em outro aspecto, a invenção também proporciona um métodopara liberar um genoma do AAV recombinante no núcleo de um neurôniocomprometido por doença in vivo. EM algumas modalidades, a patologiacelular apresentada pelo neurônio é a de uma doença do armazenamentolisossômico tal como distúrbios listados na Tabela 1. Em uma modalidadeilustrativa, a doença é doença de Niemann-Pick A. Em outras modalidades,a patologia celular apresentada é a da doença de Alzheimer. O método paraliberar um genoma do AAV recombinante no núcleo de um neurônio com-prometido por doença compreende contactar um terminal axonal do neurôniocomprometido por doença com uma composição compreendendo uma partí-cuia viral de AAV compreendendo o genoma do AAV recombinante e possi-bilitar que a partícula viral seja

endocitosada e transportada retrogradamente e intracelularmen-te ao longo do axônio para o núcleo do neurônio. A concentração do vetor nacomposição é no mínimo: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50(x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (xIO9 tu/ml); ou(c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x1010 iu/ml). Em algumas mo-dalidades, o neurônio é um neurônio de projeção e/ou a distância do terminalaxonal para o núcleo do neurônio é no mínimo 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, ou 50 mm.

Esta invenção proporciona métodos e composições para liberarum transgene para a medula espinhal e/ ou a região do tronco cerebral deum sujeito administrando um vetor viral neurotrópico recombinante contendoo transgene a no mínimo uma região da região dos núcleos cerebelares pro-fundos (DCN) do cérebro do sujeito. A liberação viral é sob condições quefavorecem a expressão do transgene na medula espinhal e/ ou na região dotronco cerebral. Em uma modalidade ilustrativa, a doença é doença de Nie-mann-Pick A. Em outras modalidades, a patologia celular apresentada é ada doença de Alzheimer.

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos e composi-ções para liberar um transgene para a medula espinhal de um sujeito admi-nistrando um vetor viral neurotrópico recombinante contendo o transgene àregião do córtex motor do cérebro do sujeito. A liberação do vetor viral é sobcondições que favorecem a expressão do transgene na medula espinhal.

Vetores virais administrados à região do córtex motor são internalizados porneurônios motores através de sua região do corpo celular e o transgene éexpressado. O transgene expressado pode então sofrer transporte anteró-grado para a porção terminal do axônio do neurônio motor, que está presen-te na medula espinhal. Devido à natureza do córtex motor, vetores viraisadministrados a esta região do cérebro também podem ser internalizadospelos terminais axonais dos neurônios motores. O vetor viral também podesofrer transporte retrógrado ao longo do axônio do neurônio motor e ser ex-pressado no corpo celular do neurônio motor. Em uma modalidade ilustrati-va, a doença é doença de Niemann-Pick A. Em outras modalidades, a pato-logia celular apresentada é a da doença de Alzheimer.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para libe-rar um produto transgenético terapêutico a uma célula alvo do sistema ner-voso central, a qual é um neurônio ou um célula glial, em um mamífero afe-tado com um distúrbio neurometabólico, por exemplo, uma doença do arma-zenamento lisossômico que afeta o sistema nervoso central. O método incluicontactar um terminal axonal de um neurônio com uma composição conten-do um vetor de AAV carregando no mínimo uma parte de um gene codifi-cando um produto transgenético terapêutico, permitindo que a partícula viralseja endocitosada e transportada retrogradamente e intracelularmente aolongo do axônio para o núcleo do neurônio; permitindo que o produto trans-genético terapêutico seja expressado e secretado pelo neurônio, e permitin-do que a célula alvo capte o produto transgenético terapêutico, em que oproduto transgenético terapêutico deste modo alivia a patologia na célulaalvo. Em algumas modalidades, a concentração do vetor na composição éno mínimo: (a) 5, 6, 7, 8, 8.4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x1012 gp/ml); (b) 5,6, 7, 8, 8,4, 9, 9.3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (*109 tu/ml); ou (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9,9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x1010 iu/ml).

Nos métodos da invenção, o transgene terapêutico codifica umamolécula biologicamente ativa, cuja expressão no sistema nervoso centralresulta em no mínimo correção parcial da neuropatologia. Em algumas mo-dalidades, o produto transgenético terapêutico é uma hidrolase lisossômica.

Em uma modalidade ilustrativa, a hidrolase lisossômica é ASM. Em outrasmodalidades, o transgene terapêutico é uma metaloendopeptidase, por e-xemplo, neprilisina.

Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedentequanto a descrição detalhada que se segue são típicas e explanatórias so-mente e não são restritivas da invenção conforme reivindicada.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 A representa uma representação de uma seção trans-versai do cérebro de camundongo ASMKO, em 5 ou 15 semanas depois deuma injeção de 2 μΙ de alto título (9,3 χ 1012 gp/ml) de AAV-ASM no hipo-campo. O sítio de injeção é mostrado por uma linha vertical; a expressão deRNAm de ASM, conforme detectado por hibridização in situ, é representadapelos círculos menores; e a expressão de proteína ASM, conforme detecta-do por coloração imunohistoquímica, é representada pelos círculos sombre-ados maiores. O padrão de expressão resultou em uma área extensiva dereversão de patologia (representada pelo sombreamento claro) no hipocam-po e regiões corticais em ambos os hemisférios do cérebro.

A Figura 1 B representa o transporte axonal de AAV para regi-ões distais do cérebro de camundongo depois de uma injeção de alto títulode AAV no hipocampo conforme descrito para a Figura 1A. A injeção no hi-pocampo (10) resultou em transporte axonal do vetor viral através do circuitointrahipocampal para o hipocampo contralateral (20) e através do circuitoentorrinodentado para o córtex entorrinal (30). O sítio de injeção é mostradopor uma linha vertical.

A Figura 1C é um diagrama esquemátíco mostrando as cone-sões dos circuitos intrahipocampal e entorrinodentado do cérebro de camun-dongo. Injeção dentro do hipocampo (10) resulta em infecção e transduçãode corpos celulares localizados na área do cornu ammonis 3 (CA3) e na ca-mada de células do grânulo dentado (G). Além disso, um subgrupo do vetorde AAV injetado infecta os terminais axonais dos neurônios da projeção i-nervando o sítio de injeção, sofre transporte axonal retrógrado, e libera otransgene para o campo CA3 (CA3) e hilo (H) na parte contralateral do hipo-campo (20), e ipsilateralmente no córtex entorrinal (30).

A Figura 2A representa uma representação de uma seção trans-versal do cérebro de camundongo ASMKO, em 5 ou 15 semanas depois deuma injeção intrahipocampal de alto título de AAV-ASM conforme descrito naFigura 1A. A expressão de RNAm de ASM, conforme detectado por hibridi-zação in situ, é representada pelos menores círculos; e a expressão de pro-teína ASM, conforme detectado por coloração imunohistoquímica, é repre-sentada pelos círculos sombreados maiores. A injeção resultou em proteínae RNAm da ASM serem detectados no septo. Este padrão de expressão re-sultou em uma área extensiva de reversão de patologia (representada pelosombreamento claro).

A Figura 2B representa o transporte axonal de AAV para regiõesdistais do cérebro de camundongo, depois de uma injeção de alto título den-tro do hipocampo conforme descrito na Figura 1A. A injeção dentro do hipo-campo (10) resultou em transporte axonal do vetor viral através do circuitoseptohipocampal a partir do sítio de injeção (representada por uma linha ver-tical) para o septo (40).

A Figura 2C é um diagrama esquemátíco mostrando as cone-xões do circuito septohipocampal. A injeção dentro do hipocampo resultouem transdução para copos celulares localizados no campo CA3 (11). Alémdisso, um subgrupo do vetor de AAV infecta os terminais axonais dos neurô-nios de projeção inervando o sítio de injeção, sofre transporte axonal retró-grado, e libera o transgene para o septo mediai (40).

A Figura 3 representa o transporte axonal de AAV no circuitonigrostriatal, depois de uma injeção de alto título de AAV dentro do corpoestriado (50) do cérebro de camundongo. Ocorre transporte axonal de AAVdo sítio de injeção (representada por uma linha vertical) para a substâncianegra (60).

A Figura 4 representa o transporte axonal de AAV no circuitomedulocerebelar, depois de uma injeção de alto título de AAV-ASM dentrodo cerebelo (70) do cérebro de camundongo ASMKO. Ocorre transporte a-xonal de AAV2 a partir do sítio de injeção (representada por uma linha) paraa medula oblongata (80).

A Figura 5 representa transporte axonal de AAV nos circuitosintrahipocampal, nigrostriatal, e entorrinodentado depois de injeção de altotítulo de AAV7-ASM no hipocampo ispilateral (-10). Foram detectadas, célu-las transduzidas, conforme determinado por hibridização in situ, ao longo detodo o eixo rostral-caudal do hipocampo contralateral (90), do septo mediai(40), e do córtex entorrinal (100) depois de injeção de AAV7-ASM do hipo-campo ipsilateral (representada por uma linha).

As Figuras 6A a 6E mostram coloração imunopositiva para ASMhumana em seções cerebelares sagitais depois de injeção de diferentes ve-tores de sorotipos AAV [(A)2/1 , (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 e (E)2/8] codificandopara ASM humana nos núcleos cerebelares profundos de camundongosASMKO.

As Figuras 7A a 7E demonstram transporte de hASM para amedula espinhal dos núcleos cerebelares profundos. Este efeito foi observa-do em camundongos tratados com AAV2/2-ASM, AAV2/5 -ASM1 AAV2/7-ASM e AAV2/8-ASM (A) hASM ampliação de 10X; (B) hASM ampliação de40X; (C) hASM confocal; (D) ChAT confocal; e (E) hASM e ChAT confocais.

A Figura 8 mostra os níveis de homogenado de tecido cerebelardepois de injeção de diferentes vetores de sorotipos AAV (2/1 , 2/2, 2/5, 2/7e 2/8) codificando para ASM humana dentro dos núcleos cerebelares pro-fundos (η = 5/ grupo). Grupos não conectados pela mesma letra são signifi-cativamente (p<,0001) diferentes.

As Figuras 9A a G mostram coloração imunopositiva para cal-bindina nas seções cerebelares sagitais depois de injeção de diferentes ve-tores de sorotipos AAV [(A)2/1 , (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 e (E)2/8] codificandopara ASM humana dentro dos núcleos cerebelares profundos de camundon-gos ASMKO.

As Figuras 10A e 10B mostram performance da barra giratória(rotarod) aceleradora e oscilante (em 14 semanas de idade) em camundon-gos ASMKO (injetados com AAV-pgal), WT, e ASMKO tratados com AAV-ASM (n = 8/grupo). Grupos não conectados pela mesma letra são significati-vamente diferentes. Camundongos injetados com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM demonstraram uma latência significativamente (p<0.0009) mais longapara cair do que camundongos ASMKO injetados com AAV2/1-pgal no testeda barra giratória acelaradora. Para o teste da barra giratória oscilante, ca-mundongos injetados com AA2/1-ASM demonstraram uma latência significa-tivamente (p<0,0001) mais longa para cair do que camundongos injetadoscom AAV2/1-Pgal.

As Figuras 11 A e 11B mostram a performance da barra giratóriaem camundongos ASMKO (n = 8), WT (n = 8), e tratados bilateralmenteAAV-ASM (n = 5/grupo) (em 20 semanas de idade). Tanto para o teste ace-lerador quanto oscilante, camundongos tratados com AAV-ASM tiveram per-formance significativamente (p < .001) melhor do que camundongos ASMKOtratados com AAV2/1-Pgal. A performance de camundongos injetados comAAV2/1-ASM foi indistinguível de camundongos selvagens tanto nos testesacelerador quanto oscilante.

A Figura 12 mostra os níveis de esfingomielina cerebral (em 20semanas de idade) em camundongos ASMKO injetados bilateralmente comAAVI-PgaI ou com sorotipos AAV 1 e 2 codificando para hASM. Os cérebrosforam divididos em 5 seções rostrocaudais (SI = mais rostral e S5 = maiscaudal. Um asterisco indica que o ponto de dados é significativamente dife-rente de camundongos ASMKO (p<0,01).A Figura 13A ilustra as conexões entre as regiões dos núcleoscerebelares profundos (mediai, interposta, e lateral) e as regiões da medulaespinhal (cervical, torácica, lombar, e sacral). A Figura 13B ilustra as cone-xões entre as regiões dos núcleos cerebelares profundos (mediai, interposta,e lateral) e as regiões do tronco cerebral (mesencéfalo, ponte, e medula). Asconexões são representadas por setas, as quais começam na região do cor-po celular de um neurônio e terminam na região terminal do axônio do neu-rônio. Por exemplo, as três regiões dos núcleos cerebelares profundos têmcada neurônios com corpos celulares que enviam axônios que terminam naregião cervical da medula espinhal enquanto a região cervical da medulaespinhal tem corpos celulares que enviam axônios que terminam ou nas re-giões mediai ou interposta dos núcleos cerebelares profundos.

A Figura 14 ilustra a distribuição de proteína verde fluorescenteno tronco cerebral, ou neurônios motores superiores, depois de liberaçãopelos núcleos cerebelares profundos de AAV codificando para proteína ver-de fluorescente (GFP).

A Figura 15 ilustra a distribuição de proteína verde fluorescentenas regiões da medula espinhal depois de liberação pelos núcleos cerebela-res profundos de AAV codificando para proteína verde fluorescente (GFP).

A Figura 16 mostra a distribuição de proteína verde fluorescentedentro do cérebro de camundongo depois da liberação bilateral de uma pro-teína verde fluorescente expressando vetor de AAV1 para os núcleos cere-belares profundos (DCN). Além dos núcleos cerebelares profundos, tambémfoi observada coloração positiva para proteína verde fluorescente nos bulbosolfatórios, no córtex cerebral, no tálamo, no tronco cerebral, no córtex cere-belar e na medula espinhal. Todas estas áreas ou recebem projeções dee/ou enviam projeções para os núcleos cerebelares profundos.

Descrição detalhada da Invenção

De modo a que a presente invenção possa ser mais prontamen-te entendida, primeiro são definidos alguns termos. Definições adicionais sãoestabelecidas do início ao fim da descrição detalhada.

O termo "transgene" se refere a um polinucleotídeo que é intro-duzido em uma célula de e é capaz de ser traduzido e/ou expressado sobcondições apropriadas e confere uma propriedade desejada a uma célula naqual foi introduzido, ou leva de modo diverso a um resultado terapêutico de-sejado.

Os termos "partículas de genoma (gp)," ou "equivalentes de ge^noma," conforme usado em referência a um título viral, se referem ao núme-ro de virions contendo o genoma do DNA de AAV recombinante, indepen-dente de infectividade ou funcionalidade. O número de partículas de genomaem uma preparação vetorial em particular pode ser medido por meio de pro-cedimentos tal como descrito nos exemplos aqui, ou por exemplo, em Clarket al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol.Ther., 6:272-278.

Os termos "unidade de infecção (iu)," "partícula infecciosa," ou"unidade de replicação," conforme usado em referência a um título viral, sereferem ao número de partículas vetoriais de AAV recombinantes infecciosase competentes para replicação conforme medido pelo ensaio do centro in-feccioso, também conhecido como ensaio do centro de replicação, conformedescrito, por exemplo, em McLaughIin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.

O termo "unidade transdutora (tu)" conforme usado em referên-cia a um título viral, se refere ao número de partículas vetoriais de AAV re-combinantes infecciosas que resultam na produção de um produto transge-nético funcional conforme medido em ensaios funcionais tal como descritonos exemplos aqui, ou por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobial.,144:113-124; ou em Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (LFU assay).

Os termos "terapêutico," "quantidade terapeuticamente eficaz," eseus cognatos se referem à quantidade de um composto que resulta emprevenção ou retardo do início ou melhora dos sintomas de em um sujeito ouuma obtenção de um resultado biológico desejado, tal como correção deneuropatologia, por exemplo, patologia celular associada com uma doençado armazenamento lisossômico tal como a descrita aqui,, ou em Walkley(1998) Brain Pathol., 8:175-193. O termo "correção terapêutica" se refere aograu de correção que resulta em prevenção ou retardo do início ou melhorados sintomas em um sujeito. A quantidade eficaz pode ser determinada pormeio de métodos de conhecimento geral na técnica e conforme descrito nasseções subseqüentes.

Métodos e Composições

Camundongos ASMKO são um modelo aceito de doença de Ni-emann-Pick tipos AeB (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics, 10:288-293;Jin et al. (2002) J. Clin. Invest1 109:1183-1191; e Otterbach (1995) Cell181:1053-1061). A doença de Niemann-Pick (NPD) é classificada como umadoença do armazenamento lisossômico e é um distúrbio neurometabólicohereditário caracterizado por uma deficiência genética na esfingomielinaseácida (ASM; sphingomyelin cholinephosphohydrolase, EC 3.1.3.12). A faltade proteína ASM funcional resulta no acúmulo de substrato de esfingomieli-na dentro dos Iisossomas dos neurônios e da glia por todo o cérebro. Istoleva à formação de grandes números de Iisossomas distendidos no pericá-rio, os quais são uma característica patognomônica e o fenótipo celular pri-mário da doença de Niemann-Pick tipo A. A presença de Iisossomas disten-didos se correlaciona com a perda da função celular normal e um coursoneurodegenerativo progressivo que leva à morte do indivíduo afetado o inícioda infância (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Diseases, eds.Scriver et al., McGraw-HiII, New York, 2001 , pp. 3589-3610). Fenótipos celu-lares secundários (por exemplo, anormalidades metabólicas adicionais) tam-bém estão associados com esta doença, notavelmente o alto nível de acú-mulo de colesterol no compartimento lisossômico. A esfingomielina tem forteafinidade pelo colesterol, o que resulta na seqüestração de grandes quanti-dades de colesterol nos Iisossomas de camundongos ASMKO e de pacien-tes humanos (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:44976-44983; Slot-te (1997) Subcell. Biochem., 28:277-293; e Viana et Ia. (1990) J. Med. Ge-net, 27:499-504.)

A presente invenção se baseia, em parte, na descoberta e de-monstração de que uma injeção intrahipocampal de alto título de AAV-ASMnos cérebros doentes de camundongos ASMKO resulta na expressão deproteína e RNAm de ASM distalmente do sítio de injeção em um padrãoconsistente com a organização topográfica dos neurônios de projeção queinervarn o sítio de injeção. Além da robusta expressão no sítio de injeção,Proteína e RNAm de ASM também são detectados em várias regiões distaisfora do hipocampo ipsilateral (injetado), especificamente, no giro dentadohipocampal contralateral e CA3, e no septo mediai e córtex entorrinal. A in-venção se baseia adicionalmente, em parte, na descoberta e demonstraçãoda extensiva correção da patologia do armazenamento lisossômico nos sí-tios distais deste modo possibilitando um maior volume de correção atravésde um menor número de sítios de injeção.

Por conseguinte, em um aspecto, a presente invenção propor-ciona métodos para tratar distúrbios neurometabólicos em mamíferos. Aspopulações tratadas pelos métodos da invenção incluem, mas não estãolimitadas a, pacientes tendo ou em risco de desenvolver um distúrbio neu-rometabólico, por exemplo, uma doença do armazenamento lisossômico, talcomo doenças listadas na Tabela 1, particularmente, se uma doença seme-lhante afeta o sistema nervoso central. Em uma modalidade ilustrativa, a do-ença é doença de Niemann-Pick tipo A. Em algumas modalidades, distúrbiosneurometabólicos podem excluir doenças de Alzheimer, Parkinson, Hunting-ton, Tay Sachs, Lesch-Nyan, e Creutzfeldt-Jakob. No entanto, os métodosda invenção utilizando uma metaloendopeptidase como um transgene tera-pêutico, são especificamente úteis para o tratamento da doença de Alzhei-mer e de distúrbios relacionados com amilóide.

Em algumas modalidades, o método para tratar um distúrbioneurometabólico compreende a administração de um alto título de vetor deAAV carregando um transgene terapêutico de modo que o produto transge-nético é expressado em um nível terapêutico em um segundo sítio dentro dosistema nervoso central distai ao primeiro sítio. Em algumas modalidades, otítulo viral da composição é no mínimo: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20,25, ou 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x109tu/ml); ou (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x1010 iu/ml). Emmodalidades adicionais, a administração é realizada por injeção intraparen-quimal direta de uma solução de alto título de vetor de AAV dentro do doentecérebro, depois disso o transgene é expressado distalmente, contralateral-mente ou ipsilateraimente, ao sítio de administração em um nível terapêuticono mínimo 2, 3, 5, 8 ,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mm do sítio deadministração.

A distância entre o primeiro e o segundo sítios é definida como aregião de distância mínima entre o sítio de administração (primeiro sítio) e olimite da transdução detectável do sítio distai (segundo sítio) conforme medi-do usando procedimentos conhecidos na técnica ou conforme descrito nosExemplos, por exemplo, hibridização in situ. Alguns neurônios no sistemanervoso central de mamíferos maiores podem abarcar grandes distânciasem virtude de suas projeções axonais. Por exemplo, em seres humanos,alguns axônios podem abarcar uma distância de 1000 mm ou maior. Portan-to, em vários métodos da invenção, AAV pode ser transportado axonalmenteao longo de toda a extensão do axônio em uma distância semelhante paraatingir e transduzir o corpo celular parental.

Um sítio de vetor administração dentro do sistema nervoso cen-tral é escolhido com base na região alvo desejada da neuropatologia e natopologia dos circuitos do cérebro envolvidos na medida que um sítio de ad-ministração e a região alvo tenham conexões axonais. A região alvo podeser definida, por exemplo, usando coordenadas esterotáxicas 3-D. Em algu-mas modalidades, o sítio de administração é escolhido de modo que no mí-nimo 0,1, 0,5, 1 , 5, ou 10 % da quantidade total de vetor injetado seja libe-rada distalmente na região alvo de no mínimo 1, 200, 500, ou 1000 mm3. Umsítio de administração pode estar localizada em uma região inervada porneurônios de projeção conectando regiões distais do cérebro. Por exemplo,a substância negra e a área tegmental ventral enviam densas projeções parao caudado e putâmen (conhecidos coletivamente como o corpo estriado).

Neurônios dentro da substância negra e do tegmento ventral podem ser vi-sados para transdução por transporte retrógrado de AAV depois de injeçãodentro do corpo estriado. Como outro exemplo, o hipocampo recebe proje-ções axonais previsíveis e bem definidas de outras regiões do cérebro. Ou-tros sítios de administração podem estar localizados, por exemplo, na medu-Ia espinhal, no tronco cerebral (medula e ponte), no mesencéfalo, no cerebe-Io (inclusive nos núcleos cerebelares profundos), no diencéfalo (tálamo, hi-potálamo), no telencéfalo (corpo estriado, córtex cerebral, ou, dentro do cór-tex, os lobos ocipital, temporãos, parietais ou frontal), ou combinações dosmesmos.

Para identificação de estruturas no cérebro humano, vide, porexemplo, The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Sectional AnatomyWith-MRI1 and Blood Supply, 2nd ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela,1999; Atlas of the Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; andCo-Planar Sterotaxic Atlas of the Human Brain: 3-Dimensional ProportionalSystem: An Approach to Cerebral lmaging, eds. Tamarack et al., Thyme Me-dicai Pub., 1988. Para identificação de estruturas no cérebro de camundon-go, vide, por exemplo, The Mouse Brain in Sterotaxic Coordinates, 2nd ed.,Academic Press, 2000. Caso desejado, a estrutura do cérebro humano podeser correlacionada a estruturas similares no cérebro de outro mamífero. Porexemplo, a maioria dos mamíferos, inclusive seres humanos e roedores, a-presentam uma organização topográfica similar das projeções hipocampo-entorrinais, com neurônios na parte lateral tanto do córtex entorrinal lateralquanto mediai se projetando para a parte dorsal ou polo septal do hipocam-po, ao passo que a projeção para o hipocampo ventral se origina essencial-mente de neurônios nas partes mediais do córtex entorrinal (Principies ofNeural Science, 4th ed., eds Kandel et al., McGraw-HiII, 1991; The Rat Ner-vous System, 2nd ed., ed. Paxinos, Academic Press, 1995). Além disso, cé-lulas da camada Il do córtex entorrinal se projetam para o giro dentado, eterminam nos dois terços exteriores da camada molecular do giro dentado.

Os axônios de células da camada Ill se projetam bilateralmente às áreas dohipocampo CA1 e CA3 do hipocampo, terminando na camada molecular dostratum lacunoso.

O segundo sítio (alvo) pode estar localizado em qualquer regiãodo sistema nervoso central, inclusive o cérebro e a medula espinhal, quecontenha alguns neurônios que se projetem para o primeiro sítio (de admi-nistração). Em algumas modalidades, o segundo sítio está em uma regiãodo sistema nervoso central escolhida entre a substância negra, a medulaoblongata, ou a medula espinhal.

Para liberar o vetor especificamente para uma região particulardo sistema nervoso central, especialmente para uma região em particular docérebro, pode ser administrado por microinjeção esterotáxica. Por exemplo,no dia da cirurgia, os pacientes terão a base da estrutura esterotáxica fixadano local (aparafusada no crânio). O cérebro com base da estrutura esterotá-xica (MRI-compatível com marcações fiduciárias) será estudado por imagensusando MRI de alta resolução. As imagens de MRI serão entãotransferidas para um computador que roda esterotáxico software. Uma sériede imagens coronais, sagitais e axiais serão usadas para determinar o sítioalvo de injeção de vetor, e a trajetória. O software traduz diretamente a traje-tória em coordenadas tridimensionais apropriadas para a estrutura esterotá-xica. Furos de Burr são perfurados acima do sítio de entrada e o equipamen-to esterotáxico é localizado com a agulha implantada na profundidade dada.

O vetor em um veículo farmaceuticamente aceitável será então injetado. Ovetor de AAV é então administrado por injeção direta no sítio alvo primário etransportado retrogradamente para sítios alvos distais através dos axônios.

Podem ser usadas vias de administração adicionais, por exemplo, aplicaçãocortical superficial sob visualização direta, ou outra aplicação não estereotá-xica.

O volume total de material a ser administrado, e o número totalde partículas vetoriais a serem administradas, serão determinados por aque-les versados na técnica com base em aspectos conhecidos de terapia gené-tica. A eficácia e a segurança terapêuticas podem ser testadas em um mo-delo animal apropriado. Por exemplo, existem uma variedade de modelosanimais caracterizados para doenças do armazenamento lisossômico, porexemplo, conforme descrito aqui,, ou em Watson et al. (2001) Methods Mol.Med., 76:383-403; ou Jeyakumar et al. (2002) Neuropath. Appl. Neurobiol.,28:343-357.

Em camundongos experimentais, o volume total de solução deAAV injetado é por exemplo, entre 1 a 5 μΙ. Para outros mamíferos, inclusiveo cérebro humano, volumes e índices de liberação são apropriadamente es-calonados. Por exemplo, foi demonstrado que volumes de 150 μΙ podem serinjetados com segurança no cérebro de primatas (Janson et al. (2002) Hum.Gene Then, 13:1391-1412). O tratamento pode consistir em uma única inje-ção por sítio alvo, ou pode ser repetido ao longo do trato de injeção, casonecessário. Podem ser usados múltiplos sítios de injeção. Por exemplo, emalgumas modalidades, além do primeiro sítio de administração, uma compo-sição compreendendo AAV carregando um transgene é administrada emoutro sítio o qual pode ser contralateral ou ipsilateral ao primeiro sítio de ad-ministração.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para libe-rar um genoma do AAV recombinante através de transporte axonal retrógra-do para o núcleo de um neurônio comprometido por doença in vivo. Em al-gumas modalidades, a patologia celular apresentada por um neurônio é a deuma doença do armazenamento lisossômico tal como listado na Tabela 1(vide, por exemplo, Walkley (1998) Brain Pathol., 8:175-193). Em uma moda-lidade ilustrativa, a doença é a doença de Niemann-Pick A. O método deliberação de um genoma do AAV recombinante para o núcleo de um neurô-nio comprometido por doença compreende contactar um terminal axonal deum neurônio comprometido por doença com uma composição compreen-dendo uma partícula viral de AAV compreendendo o genoma do AAV re-combinante e permitir que a partícula viral seja endocitosada e transportadaretrogradamente intracelularmente ao longo do axônio para o núcleo do neu-rônio, em que a concentração de genomas de AAV na composição é no mí-nimo: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (*1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7,8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x109 tu/ml); ou (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3,10, 15, 20, 25, ou 50 (x1010 iu/ml). Em algumas modalidades, o neurônio éum neurônio de projeção e/ou a distância do terminal axonal para o núcleodo neurônio é no mínimo 2, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mm.

Em várias modalidades, o genoma de AAV é transportado ao longo de todaa extensão do axônio, em distâncias variando dependendo da extensão doaxônio. Em seres humanos, estas distâncias podem ser tanto quanto 1000mm ou maiores.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para libe-rar um produto transgenético a uma célula alvo do sistema nervoso central, aqual é um neurônio ou uma célula glial, em um mamífero afetado com umdistúrbio, por exemplo uma doença do armazenamento lisossômico confor-me listado na Tabela 1. O método compreende contactar um terminal axonalde um neurônio com uma composição compreendendo um vetor de AAVcarregando no mínimo uma parte de um gene codificando um produto trans-genético terapêutico; permitir que as partículas virais sejam endocitosadas etransportadas retrogradamente intracelularmente ao longo do axônio para onúcleo do neurônio; permitir que o produto transgenético seja expressado esecretado pelo neurônio; e permitir que uma segunda célula capte o produtotransgenético, em que o produto transgenético deste modo alovia patologiana segunda célula. Em algumas modalidades a concentração do vetor deAAV na composição é no mínimo: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou50 (*1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x109 tu/ml);ou (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (χ 1010 iu/ml). Por exemplo,hidrolases lisossômicas podem ser secretadas por células transduzidas esubseqüentemente captadas por outra célula através de endocitose mediadapor receptor de manose-6-fosfato, a segunda célula sendo transduzida ounão-transduzida (Sando et al. (1977) Cell, 12:619-627; Taylor et al. (1997)Nat. Med., 3:771-774; Miranda et al. (2000) Gene Ther., 7:1768-1776; e Jinet al. (2002) J. Clin. Invest, 109:1183-1191).

Nos métodos da invenção, AAV de qualquer sorotipo pode serusado contanto que o vetor seja capaz de suportar transporte axonal retró-grado em um cérebro comprometido por doença. O sorotipo do vetor viralusado em algumas modalidades da invenção é selecionado entre o grupoconsistindo em AAV1 , AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, e AAV8(vide, por exemplo, Gao et al. (2002) PNAS1 99:11854-11859; e Viral Vectorsfor Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press,2003). Pode ser usado outro sorotipo além daqueles listados aqui,. Alémdisso, vetores AAV pseudotipados também podem ser utilizados nos méto-dos descritos aqui. Vetores AAV pseudotipados são aqueles que contêm ogenoma de um sorotipo AAV no capsídeo de um segundo sorotipo AAV; porexemplo, um vetor de AAV que contém o capsídeo AAV2 e o genoma AAV1ou um vetor de AAV que contém o capsídeo AAV5 e o genoma AAV2. (Au-ricchio et al„ (2001) Hum. Mol. Genet, 10(26):3075-81.) No entanto, AAV5pode ser especificamente excluído dos métodos da invenção utilizando umametaloendopeptidase, por exemplo, neprilisina, como um transgene terapêutico.

Os vetores de AAV são derivados de parvovírus de DNA de fila-mento único (ss) que são não patogênicos para mamíferos (revisado emMuzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). Em resumo, ve-tores à base de AAV têm os genes virais rep e cap que são responsáveis por96% do genoma viral removido, deixando as duas repetições terminal inver-tidas (ITRs) de 145 pares de bases (bp) flanqueantes, que são usadas parainiciar a replicação, acondicionamento e integração do DNA viral. Na ausên-cia de vírus auxiliar, AAV selvagem se integra no genoma da célula hospe-deira humana com sítio-especificidade preferential no cromossoma 19q 13.3ou pode permanecer expressado epissomicamente. Uma única partícula deAAV pode conciliar até 5 kb de ssDNA, portanto deixando cerca de 4,5 kbpara um transgene e elementos regulatórios, o que é tipicamente suficiente.

No entanto, sistemas de transunião conforme descrito, por exemplo, na Pa-tente dos Estados Unidos No. 6.544.785, podem quase dobrar este limite.

Em uma modalidade ilustrativa, AAV é AAV2 ou AAV1. Vírusadeno-associados de muitos sorotipos, especialmente AAV2, têm sido ex-tensivamente estudados e caracterizados como vetores de terapia genética.

Os versados na técnica estarão familiarizados com a preparação de vetoresde terapia genética à base de AAV funcional. Numerosas referências a vá-rios métodos de produção, purificação e preparação de AAV para adminis-tração em sujeitos humanos podem ser encontradas no extensivo corpo daliteratura publicada (vide, por exemplo, Viral Vectors for Gene Therapy: Me-thods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003). Adicionalmente,terapia genética à base de AAV orientada para células do sistema nervosocentral foi descrita nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.180.613 e6.503.888.

Em alguns métodos da invenção, o vetor compreende um trans-gene encadeado operavelmente a um promotor. O transgene codifica umamolécula biologicalmente ativa, cuja expressão no sistema nervoso centralresulta em no mínimo correção parcial da neuropatologia. Em algumas mo-dalidades, o transgene codifica uma hidrolase lisossômica, em uma modali-dade ilustrativa, a hidrolase lisossômica é ASM. As seqüências de cDNA ge-nômico e funcional de ASM humana foram publicadas (vide, por exemplo, asPatentes dos Estados Unidos Nos. 5.773.278 e 6.541.218). Outras hidrola-ses lisossômicas podem ser usadas para doenças apropriadas, por exemplo,conforme listado na Tabela 1.

A invenção adicionalmente proporciona métodos para tratar do-ença de Alzheimer em mamíferos, inclusive seres humanos. Em semelhan-tes métodos, o transgene codifica uma metaloendopeptidase. A metaloen-dopeptidase pode ser, por exemplo, a enzima amilóide-beta degradante ne-prilisina (EC 3.4.24.11; número de acesso da seqüência, por exemplo,P08473 (SWISS-PROT)), a enzima insulina-degradante insulisina (EC3.4.24.56; número de acesso da seqüência, por exemplo, P14735 (SWISS-PROT)), ou thimet oligopeptidase (EC 3.4.24.15; número de acesso da se-qüência, por exemplo, P52888 (SWISS-PROT)).

O nível de expressão de transgene em células eucarióticas élargamente determinado pelo promotor transcripcional dentro do cassete deexpressão de transgene. São usados em algumas modalidades promotoresque apresentam atividade de longo termo e são tecido- e mesmo célula-específicos. Exemplos não Iimitantes de promotores incluem, mas não estãolimitados a, o promotor de citomegalovírus (CMV) (Kaplitt et al. (1994) Nat.Genet, 8:148-154), promotor de CMV/p3-globina humana (Mandei et al.(1998) J. Neurosci., 18:4271-4284), promotor GFAP (Xu et al. (2001) GeneTher., 8:1323-1332), o promotor da enolase neurônio-específica (NSE) de1,8 kb (Klein et al. (1998) Exp. Neurol., 150:183-194), o promotor da betaactina de frango (CBA) (Miyazaki (1989) Gene, 79:269-277) e o promotor daβ-glucuronidase (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics1 10:1009-1018). Pa-ra prolongar a expressão, outros elementos regulatórios podem ser adicio-nalmente encadeados operavelmente ao transgene, tais como, por exemplo,o Elemento Pós-Regulatório do Vírus da Hepatite de Woodchuck (WPRE,Woodchuck Hepatitis Virus Post-Regulatory Elemeni) (Donello et al. (1998)J. Virol., 72, 5085-5092) ou o sítio de poliadenilação do hormônio de cresci-mento bovino (BGH).

Para algumas aplicações de terapia genética do sistema nervosocentral, será necessário controlar a atividade transcripcional. Até o momento,a regulação farmacológica da expressão genética com vetores de AAV podeser obtida, inclusive, por vários elementos regulatórios e promotores fárma-co-responsivos conforme descrito, por exemplo, em Habermaet al. (1998)Gene Ther., 5:1604-16011 ; e Ye et al. (1995) Science, 283:88-91.

Preparações de alto título de AAV podem ser produzidas usandotécnicas conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito na Patentedos Estados Unidos No. 5.658.776 e Viral Vectors for Gene Therapy: Me-thods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003.

Os exemplos seguintes proporcionam modalidades ilustrativasda invenção. Uma pessoa versada na técnica reconhecerá as numerosasmodificações e variações que podem ser realizadas sem alterar o espírito ouo âmbito da presente invenção. As modificações e variações referidas sãoenglobadas dentro do âmbito da invenção. Os exemplos não limitam de mo-do algum a invenção.

EXEMPLOS

TITULAÇÃO DE VETORES RECOMBINANTES

Os títulos do vetores de AAV foram medidos de acordo com onúmero de cópias do genoma (partículas de genoma por mililitro). As con-centrações de partículas de genoma foram baseadas em PCR Taqman® doDNA vetorial conforme previamente reportado (Clark et al. (1999) Hum. Ge-ne Then, 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol.. Ther., 6:272-278). Emresumo, AAV-ASM purificado foi tratado com tampão de digestão de capsí-deo (50 mM de Tris-HCI pH 8.0, 1,0 mM de EDTA, 0,5% de SDS, 1,0 mg/mlde proteinase Κ) a 50°C por 1 hora para liberar DNA vetorial. Amostras deDNA foram submetidas a uma reação de cadeia polimerase (PCR) com ini-ciadores que aneIaram a seqüências específicas no DNA vetorial, tais comoa região promotora, transgene, ou a seqüência poli A. Os resultados da rea-ção de PCR foram então quantificados por um software Real-time Taqman®,tal como o proporcionado pela Perkin Elmer-Applied Biosystems (Foster City,CA) Prism 7700 Sequence Detector System.

Vetores carregando um gene marcador analisávei tal como ogene de β-galactosidase ou proteína verde fluorescente (GFP) podem sertitulados usando um ensaio de infectividade. Células suscetíveis (por exem-plo, células HeLa1 ou células COS) são transduzidas com o AAV e é realiza-do um teste para determinar a expressão genética tal como coloração decélulas transduzidas com vetor de β-galactosidase com X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-galactopiranosídeo) ou microscopia por fluorescência paracélulas GFP-transduzidas. Por exemplo, o teste é realizado como se segue:

4 *104 células HeLa são laminadas em cada cavidade de uma lâmina de cul-tura de 24 cavidades usando meio de crescimento normal. Depois de fixa-ção, isto é, cerca de 24 horas depois, as células são infectadas com Ad tipo

5 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 e transduzidas com dilui-ções seriais do vetor acondicionado e incubado a 37°C. Um a três dias de-pois, antes de extensivos efeitos citopáticos serem observados, o testes a-propriado é realizado sobre as células (por exemplo, coloração com X-gal oumicroscopia por fluorescência). Se for usado um gene repórter tal como β-galactosidase, as células são fixadas em 2% de paraformaldeído, 0,5% deglutaraldeído e coradas para atividade de β-galactosidase usando X-gal. Asdiluições vetoriais que dão células bem separadas são contadas. Cada célu-la positiva representa 1 unidade de transdução (tu) de vetor.

Correção de patologia de doença do armazenamento lisossômi-co no cérebro de camundongo

Camundongos ASMKO de dez semanas de idade contêm impor-tante patologia de doença de Niemann-Pick no sistema nervoso central. Aidentificação de mutantes homozigotos recessivos foi verificada por PCR.Dezesseis camundongos ASMKO de dez semanas de idade foram anestesi-ados com isoflurano e montados sobre uma estrutura esterotáxica, foi feitauma incisão para expor o crânio subjacente, e foi feito um único furo de bro-ca sobre um hemisfério de cada camundongo. Dois microlitros de alto título(9,3 *1012 gp/ml) de AAV2-CMV-ASM (Targeted Genetics, Seattle, WA) fo-ram injetados no hipocampo em uma coordenada esterotáxica final de 2,0mm rostral do bregma, 1,5 mm à direita da linha média, e 2,0 mm ventral àsuperfície piai. Estas coordenadas hipocampais asseguraram que o vetor deAAV2 fosse exposto a neurônios do giro dentado e da área 3 do hipocampo(CA3), bem como a terminais axonais de neurônios de projeção do hipo-campo contralateral, do septo mediai e do córtex entorrinal. As injeções fo-ram realizadas em um índice de 0,2 μΙ/minuto, e um total de 1,86 x1010 partí-culas genômicas foram administradas em cada cérebro.

Os camundongos foram testados por barra giratória aceleradorae oscilante para função motora no Smartrod (AccuScan) usando métodosconhecidos na técnica e reproduzidos em Sleat et al. (2004) J. Neurosci.24:9117-9126. As Figuras 10A/B e as Figuras 11A/B mostram graficamenteos resultados de testes da barra giratória como uma medição da recupera-ção da função motora.

Em seguida os camundongos foram sacrificados ou em 5 (n = 8)ou em 15 (n = 8) semanas pós injeção (pi). Oito cérebros (n = 4 cada em 5 esemanas pi) foram analisados para distribuição de RNAm e proteína deASM, e para a redução dos níveis suprafisiológicos de colesterol nos Iisos-somas. Os 8 cérebros remanescentes (n = 4 cada em 5 e 15 semanas pi)foram processados por histopatologia para analisar a correção de Iisosso-mas acumulados e distendidos, a qual é o método mais direto e preciso paradeterminar a reversão da patologia de armazenamento para doenças do ar-mazenamento lisossômico.

Foi detectada robusta transdução no hipocampo injetado (ipsila-teral) em 5 e 15 semanas pi. A camada de células granular e hilo do girodentado, e as camadas de células piramidais e oriens de CA3 foram extensi-vamente transduzidas pelo vetor de AAV2. Este padrão impressivo de trans-dução se estendeu a outras regiões do hipocampo ipsilateral, tais como osubiculum e cornu ammonis área 1 (CA1) e 2 (CA2). Imunofluorescênciacom um anticorpo monoclonal contra ASM anti-humano confirmou a presen-ça de proteína ASM em muitas células. O padrão protéico global foi similarao padrão do RNAm, com alguma difusão de proteína localizada adicional.

RNAm e proteína ASM humana também foram detectados emregiões fora do hipocampo ipsilateral em ambos os pontos de tempo. O girodentado contralateral e CA3, e o septo mediai e o córtex entorrinal forampositivos para hibridização in situ e imunofluorescência (Figuras 1A e 2A). Opadrão de transdução nestes sítios distais foi consistente com a organizaçãotopográfica dos neurônios de projeção que inervam o sítio de injeção (Figu-ras 1 B e 2B). Isto demonstrou que AA V2 sofreu transporte axonal retrógra-do nos circuitos intrahipocampal, septohipocampal e entorrinodentado decérebros de camundongos ASMKO, e que o vetor viral foi orientado para onúcleo depois de transporte até os axônios (Figuras 1C e 2C). O padrão detransdução não suporta difusão parenquimal como a razão para transportede AAV2 para estes sítios distais. Se semelhante difusão tivesse ocorrido,estruturas entre os sítios injetado e distai teriam sido expostas a vírus mi-grante. Mas estas estruturas intermediárias foram negativas para hibridiza-ção in situ. Por exemplo o corpo estriado, o qual possui um forte tropismonatural para AAV2, foi negativo para transferência genética apesar de estarno caminho direto entre o hipocampo e o septo mediai. Portanto, a transfe-rência genética para os sítios distais deve ser originada por transporte axo-nal retrógrado, o que indica que um neurônio de projeção afetado pode fun-cionar como um sistema de transporte de via de comunicação eficaz paramovimento de AAV2 através de um cérebro doente.

Adicionalmente foi investigada a capacidade de ASM para rever-ter as anormalidades do colesterol no cérebro de camundongos ASMKO.Filipin é uma molécula autofluorescente isolada do Streptomyces filipinensisque liga a complexos de colesterol (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem.,276:44976-44983; e Sarna et al. (2001) Eur. J. Neurosci., 13:1-9). CérebrosASMKO não injetados tinham altos níveis de coloração por filipin devido aestes abundantes complexos de colesterol, ao passo que cérebros de ca-mundongos normais não produziram coloração por filipin.

Injeção de AAV2-CMV-ASM resultou na perda completa de colo-ração por filipin por todo o hipocampo ipsilateral e contralateral, o septo e ocórtex entorrinal em 5 e 15 semanas pi de camundongos ASMKO (Figuras1A e 2A). Isto foi em completo contraste com camundongos ASMKO contro-les com idades combinando não injetados, onde altos níveis de coloraçãopor filipin foram detectados nestas mesmas estruturas. A perda de coloraçãopor filipin em cérebros injetados com AAV2 demonstra que foi corrigido umfenótipo celular secundário (por exemplo, defeito metabólico) de doença daesfingomielinase ácida. Isto sugere fortemente que a proteína ASM foi orien-tada para o Iisossoma e interagiu com o complexo de esfingomielina-colesterol. Esta interação provavelmente resultou na liberação de colesterola partir da esfingomielina, e subseqüente ingresso do colesterol dentro deseus caminhos biológicos normais (tais como degradação ou translocaçãopara a membrana plasmática (Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem.,276:44976-44983)).

A perda de coloração por filipin foi observada em todas as ca-madas celulares e subcampos dos circuitos intrahipocampal, septohipocam-pai e entorrinodentado. A área de correção do colesterol foi bem maior emais extensiva do que o padrão de proteína ASM. Isto indica que, depois detransporte axonal retrógrado de AAV2, neurônios de projeção podem ter fun-cionado como "bombas enzimáticas" e secretado proteína ASM no tecidocircundante. Significativamente, somente uma pequena quantidade de ASMé necessária para ter um efeito terapêutico sobre o acúmulo de colesteroldentro de células afetadas por ASMKO, uma quantidade abaixo do limite dedetecção do protocolo imunofluorescente.

Também foi avaliado se o transporte axonal do vetor AAV2-ASMresulta na correção do fenótipo celular primário da doença de Niemann-Pick.

Seções cerebrais de histopatologia de um mícron de espessura demonstra-ram uma notável redução de patologia lisossômica acumulada e distendidaem cérebros injetados com AAV2-CMV-ASM em 5 semanas pi (Tabela 2).Ocorreu reversão da patologia resultando em restauração parcial ou comple-ta da arquitetura celular normal em todas as regiões ipsilaterais e dos hemis-férios contralaterais do hipocampo. O septo mediai e o córtex entorrinal tam-bém apresentaram uma substancial redução em lesões por armazenamento.

Similar aos dados de filipin, o número de células corrigidas foi maior e maisdifundido do que o padrão de proteína ASM. A reversão da patologia foi evi-dente dentro de regiões conhecidas para projetar para o hipocampo inclusiveos circuitos intrahipocampal, septohipocampal e entorrinodentado. Global-mente, o volume de correção foi de 30-35 mm3 ou mais no hipocampo con-tralateral, 5-8 mm3 ou mais no córtex entorrinal ipsilateral, 1-2 mm3 ou maisno córtex entorrinal contralateral, e 2-3 mm3 ou mais no septo mediai. Istocorrobora adicionalmente que o transporte axonal do vetor viral foi respon-sável por este efeito terapêutico, porque estruturas próximas (que não con-tribuem para estes circuitos) teriam sido corrigidas se a distribuição viral fos-se mediada meramente por difusão (vide, "corpo esfriado ipsilateral" e "corpoestriado contralateral" na Tabela 2).

Para demonstrar que a reversão da patologia foi específica paraASM, um grupo adicional de camundongos ASMKO foi injetado com um ve-tor controle carregando um gene repórter, AAV2-CMV-3-gal (n = 2 cada em5 e 15 semanas pi), e processada para histopatologia. Em todos os quatrocérebros, as células permaneceram inundadas com Iisossomas distendidos,e continham outras anormalidades tais como dilatação citoplasmática e ca-madas celulares desorganizadas.

Tabela 2

<table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table>

++++ alto nível de patologia em virtualmente todas as células

+++ patologia em muitas células, é observada correção em algumas células

++ patologia em algumas células, é observada correção em muitas células

+ existe pouca ou nenhuma patologia na maioria das células, virtualmentetoda célula é corrigida

Portanto, de acordo com a presente invenção, uma única injeçãode alto título de vetor AAV2 é suficiente para transferir o gene de ASM paraestruturas que inervam o hipocampo afetado por ASMKO. O número de es-truturas positivas para vetor AAV2 foi maior do que o demonstrado por umrecente estudo no hipocampo de rato normal, o qual mostrou transporte a-xonal somente no circuito entorrinodentado (Kaspar et al. (2002) Mol. Ther.,5:50-56). Os resultados descritos aqui,, demonstram que pode ocorrer trans-porte axonal em neurônios de projeção infligidos com patologia de armaze-namento, e que este modo de transporte resulta na depuração da patologiade armazenamento em estruturas proximais e múltiplas regiões distais aosítio de injeção. Foi também demonstrado que o transporte axonal não estálimitado a somente aqueles circuitos associados a hipocampo. Ocorreutransporte axonal retrógrado nos circuitos nigrostriatal (Figura 3) e no medu-Iocerebelar (Figura 4). Isto demonstra que o transporte axonal de AAV2 emneurônios comprometidos por doença é uma propriedade geral do vetor viral.Um estudo similar foi realizado com AAV1-ASM nas concentra-ções de 1-4*1013 gp/ml e AAV7-ASM na concentração de 8,4X1012 gp/ml.Apesar de AAV1 não ter apresentado transporte axonal retrógrado detectá-vel, AAV7 não sofreu transporte axonal retrógrado, similar a AAV2, e produ-ziu correção da patologia de doença do armazenamento lisossômico em re-giões distais (vide Figura 5).

Injeção de AAV no Cerebelo

Camundongos ASMKO foram anestesiados com isoflurano emontados sobre uma estrutura esterotáxica. O bregma foi localizado comoum ponto de referência para determinar a localização da perfuração parainjeção na região dos núcleos cerebelares profundos do cerebelo. Uma vezlocalizada, foi feita uma incisão para expor o crânio subjacente, e foi feito umúnico furo de broca dentro do crânio sem perfurar a superfície do cérebro.

Uma seringa Hamilton foi baixada dentro do cérebro através do furo e AAV2-CMV-ASM foi injetado dentro dos núcleos cerebelares profundos em um ín-dice de 0,5 microlitro por segundo. Três microlitros foram injetados para umadose total de 1 χ 1010 partículas de genoma. Os camundongos foram sacrifi-cados 7 semanas pós injeção. Os cérebros e medula espinhais foram avali-ados para expressão de RNAm de ASM, expressão de proteína ASM, colo-ração por filipin, e coloração por calbindina.

Filipin é uma molécula autofluorescente que liga a complexos decolesterol. Camundongos ASMKO não-tratados têm altos níveis de colora-ção por filipin devido a abundantes complexos de colesterol, os quais se a-cumulam em conseqüência de sua doença. Em contraste, cérebros de ca-mundongos normais não apresentam coloração por filipin.

Calbindina é um marcador das células de Purkinje, as quais sãoencontradas no cerebelo e estão envolvidas em movimentos coordenados.

No camundongo ASMKO, as células de Purkinje morrem nestes camundon-gos à medida que estes envelhecem, resultando em redução do comporta-mento de movimentos coordenados. Esta perda das células de Purkinje e aperda correlata de comportamento de movimentos coordenados não sãoobservadas em camundongos normais.Depois de injeção de AAV2 no núcleo cerebelar profundo, o ce-rebelo foi positivo para RNAm de ASM, proteína ASM, e coloração por cal-bindina. Estes resultados demonstram a capacidade de AAV2 para transdu-zir o cerebelo depois de injeção nos núcleos cerebelares profundos. Alémdisso, a transdução cerebelar e expressão de ASM resultante preveniu amorte das células de Purkinje conforme evidenciado pela presença de colo-ração de calbindina nos camundongos tratados. Em camundongos tratadoscom AAV-ASM, a expressão de proteína hASM também foi observada portodo o tronco cerebral, tálamo, e mescencéfalo. A expressão de proteínahASM nestas regiões coincidiu com depuração regional de coloração de fili-pin / colesterol. Globalmente, houve no cerebelo uma relação positiva entreos níveis de proteína ASM, clearance de filipin, e sobrevida das células dePurkinje.

RNAm de ASM e proteína ASM também foram detectadas forado cerebelo. Especificamente, a medula espinhal foi positiva para expressãode RNAm de ASM conforme evidenciado por hibridização in situ. A medulaespinhal também foi positiva para proteína ASM conforme evidenciado porimunofluorescência ASM-específica. Estes resultados indicam que a medulaespinhal foi transduzida depois de uma injeção distai do vetor AAV nos nú-cleos cerebelares profundos. Este padrão de transdução foi consistente coma organização topográfica dos neurônios de projeção que inervam a regiãodos núcleos cerebelares profundos. Estes resultados indicam que o vetorAAV2 foi captado por células da medula espinhal distai e expressado.

Tratamento da Doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer (AD) é um distúrbio neurodegenerativo

caracterizado pelo acúmulo de amilóide β-peptídeo (Αβ) devido a redução docatabolismo Αβ. À medida que Αβ se acumula, agrega nas placas extracelu-lares, causando disfunção da função sináptica e perda de neurônios. A pato-logia leva a demência, perda de coordenação, e morte.

Neprilisina é um zinco metaloendopeptidase ligado a membranade 97 kD que é a enzima índice-limitante na degradação normal de Αβ. Aintrodução de neprilisina pode desacelerar a progressão da doença remo-vendo grupos de Αβ antes da agregação. Na verdade, foi mostrado que aneprilisina degrada formas oligoméricas de Αβ deste modo removendo asplacas existentes em um modelo animal dq doença de Alzheimer (Kanemitsuet al. (2003) Neurosci. Lett., 350:113-116). Camundongos de nocaute deneprilisina apresentam altos níveis de Αβ (Iwata et al. (2001) J. Neurosci.,24:991-998.). Inibidores da neprilisina, tais como tiorfano e fosforamidon,aumentam os níveis de Αβ no cérebro de camundongo (Iwata et al. (2000)Nat. Med., 6:143-150). Adicionalmente, foram encontrados níveis reduzidosde RNAm de neprilisina em áreas de alta carga de placas amilóides em cé-rebros humanos, demonstrando adicionalmente a ligação entre neprilisina ea doença de Alzheimer (Yasojima et al. (2001) Neurosci. Lett., 297:97-100).

As áreas do cérebro mais afetadas pela doença de AIzheimerDsão o hipocampo, córtex, cerebelo, corpo estriado e tálamo (vide, por exem-plo, Iwata et al. (2001) supra; Yasojima et al. (2001) supra). Estas são asmesmas áreas do cérebro que apresentam transporte axonal retrógrado efi-ciente com AAV.

Por conseguinte, AAV pode ser usado para liberar transgenesterapêuticos para regiões de alta carga de placas por injeção direta e subse-qüente translocação de vírus através dos circuitos cerebrais para os sítiosalvo. A transferência genética de neprilisina mediada por vetor viral foi eficazno tratamento de modelos da doença de Alzheimer em camundongo (Marr etal. (2003) J. Neurosci., 23:1992-1996; Marr et al. (2004) J. Mol. Neurosci.,22:5-11; Iwata et al. (2004) J. Neurosci., 24:991-998). Um recente relatóriomostrou que AAV5- neprilisina removeu Αβ dos terminais pré-sinápticos dohipocampo em camundongos deficientes de neprilisina, desacelerando aformação de placas nas sinapses (Iwata et al. (2004) supra). Neste relatório,foi encontrada neprilisina no hipocampo contralateral mas permanece des-conhecido se isto é atribuível a transporte retrógrado de vírus ou a transporteanterógrado da proteína expressada.

Correção de Patologia de Armazenamento de Colesterol

O experimento seguinte avaliou a capacidade relativa de vetoresde sorotipos recombinantes AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8codificando ASM humana (hASM) para expressar proteína hASM, corrigirpatologia de armazenamento de colesterol, sofrer transporte, recuperar ascélulas de Purkinje, e iniciar a recuperação funcional no camundongo ASM-KO depois de injeção unilateral dentro dos núcleos cerebelares profundos.

Um grupo adicional de camundongos ASMKO recebeu injeções bilateraisdentro dos núcleos cerebelares profundos de modo a avaliar se a difu-são/expressão de proteína transgenética aumentadas melhorariam a recupe-ração funcional comportamental.

Sessenta e seis camundongos de nocaute de esfingomielinaseácida (ASMKO) homozigotos (-/-) machos e dezesseis filhotes selvagensmachos controle foram criados de cruzamentos heterozigotos (+/-). Os ca-mundongos foram genotipados por PCR seguindo o procedimento descritoem Gal et al. (1975) N Engl J Med:293:632-636. Os camundongos da colôniaoriginal foram retrocruzados sobre a cepa C57/BI6. Os animais foram aloja-dos sob ciclo de 12:12 horas de luz/escuridão e providos com alimento eágua à vontade. Todos os procedimentos foram realizados sob um protocoloaprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee.

Depois de ser anestesiado com isoflurano, os camundongos (~7semanas de idade) foram injetados unilateralmente dentro dos núcleos cere-belares profundos (DCN) (A-P: -5,75 do bregma, M-L: -1,8 do bregma, D-V: -2,6 da dura, barra incisora: 0,0) com um dos seguintes vetores de sorotipoAAV (n=8/vetor): AAVI-CMV-PgaI1 AAV1-CMV- ASM, AAV2-CMV-ASM, A-AV5-CMV-ASM, AAV7-CMV-ASM, e AAV8-CMV- ASM. Os vetores foramliberados com uma seringa Hamilton de 10 μΙ montada sobre um êmbolo deseringa em um índice de 0,5 μΙ/minuto para um total de 1,86 χ 1010 partículasde genoma por cérebro. O volume de injeção final para cada vetor foi 4 μΙ.

Uma hora antes e vinte e quatro horas depois da cirurgia, foi administradoaos camundongos cetoprofen (5 mg/kg; SC) para analgesia. Os camundon-gos foram mortos 7 semanas pós-injeção (14 semanas de idade). Por ocasi-ão do sacrifício os camundongos foram superdosados com eutasol (150mg/kg; IP) e rapidamente decapitados (n = 5/grupo) ou perfundidos trans-cardialmente (n = 3/grupo). Os cérebros dos camundongos decapitados fo-ram rapidamente removidos, instantaneamente congelados em nitrogêniolíquido, dissecados em 3 seções (hemisfério cerebral direito, hemisfério ce-rebral esquerdo, e cerebelo) homogenizadas, e analisados para hASM porEUSA. Os cérebros e medulas espinhais de camundongos perfundidos fo-ram processados para expressão de proteína ASM humana, acúmulo decolesterol conforme detectado por coloração por filipin, e sobrevida de célu-las de Purkinje com coloração por calbindina sobre seções de vibratone de50 μιτι.

Usando um protocolo similar, camundongos ASMKO (~7 sema-nas de idade) foram injetados bilateralmente com AAV2/1-pgal (n=8), A-AV2/1-ASM (n=5), e AAV2/2-ASM (n=5) e sacrificados em 20 semanas deidade depois de serem submetidos ao teste da barra giratória. Os cérebrosforam instantaneamente congelados em nitrogênio líquido, seccionados nalinha média e em seguida divididos em cinco seções (S1, S2, S3, S4, e S5)usando uma matriz de cérebro de camundongo (ASI Instruments, Inc, Ml.)

As seções 1-4 estavam separadas aproximadamente 2 mm com S1 sendo amais rostral e S4 a mais caudal. A seção 5 continha somente o cerebelo. Ohemisfério direito foi usado para quantificar os níveis de esfingomielina nocérebro e o esquerdo os níveis de hASM.

O cDNA de ASM humana de extensão total sob o controle dopromotor de citomegalovírus imediato-precoce (CMV) humano, com umaseqüência de poliadenilação SV40, e um íntron híbrido, foi clonado em umplasmídeo contendo ITRs de AAV sorotipo 2 (AAV2 ITR). Jin et al. (2002) JClin Invest. 109:1183-1191. Vetores híbridos foram produzidos por transfec-ção tripla usando uma série de plasmídeos auxiliares contendo capsídeosorotipo específico codificando domínios além dos genes de replicação deAAV tipo 2. Esta estratégia possibilita o acondicionamento de vetores AAV2ITR e, cada virion sorotipo-específico Rabinowitz, et al. (2002) J Virol.76:791-801. Com esta abordagem o genoma recombinante hASM foi usadopara gerar uma série de vetores rAAV-hASM de vários sorotipos inclusiveAAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8. Vetores AAV recombinantesforam purificados por cromatografia por permuta iônica (Sorotipos 2/1 , 2/2 e2/5). O1Riordan1 et al. (2000) J Gene Med 2: 444-54 ou centrifugação CsCI(sorotipos 2/8 e 2/7) Rabinowitz et al. (2002) J. Urrol. 76:791-801. O títulofinal de partículas de virion AAV-ASM (partículas DNAse-resistentes), foi de-terminado por PCR TaqMan da seqüência de citomegalovírus (CMV). Clarket al. (1999) Hum. Gee Therapy 10:1031-1039.

Anticorpos contra ASM humana são humano específicos e nãopossuem reação cruzada com a ASM de camundongo. Lâminas Coster (Cor-ning, NY) 9018 revestidas (100 μΙ/cavidade) com anticorpo contra ASM hu-mana recombinante monoclonal (rhASM) (2 Mg/ml) diluído em tampão a 50mM de carbonato de sódio (pH 9.6) foram incubadas de um dia para o outro@ 2-8°C. Excesso de anticorpo de revestimento foi removido e diluente debloqueio (KPL1 Inc., MD) foi adicionado por 1 hora @ 37°C. As lâminas fo-ram lavadas com uma lavadora de microlâminas (Molecular Devices, CA)por dois ciclos. Padrões, controles e amostras diluídos em tampão de dilui-ção padrão (PBS, 0,05% de Tween, 1% de HP-BSA) foram pipetados emduplicata e foram deixados para incubar por 1 hora @ 37°C. As lâminas fo-ram lavadas conforme descrito acima. Cem microlitros de anticorpo contraASM humana recombinante biotinilada (rhASM) (diluídoa a 1:20K em tam-pão de diluição padrão) foi adicionado a cada cavidade, foram deixadas paraincubar por 1 hora @ 37°C, e em seguida removidas com uma lavadora demicrolâminas. Streptavidina - HRP (Pierce Biotechnology, Inc., IL) diluída a1:1 OK foi em seguida adicionada (100 μΙ/cavidade) e deixada para incubarpor 30 min em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas conformedescrito acima e em seguida incubadas com SureBIue TMB (KPL, Inc., MD)por 15 minutos @ 36-38°C. A reação foi interrompida com solução de parada(KPL, Inc., MD) e valores de absorvência foram em seguida lidos a 450 nmcom uma leitora de lâminas Spectra Max 340 (Molecular Devices, CA). Aanálise de dados foi completada usando o programa Softmax Pro 4.3 (Mole-cular Devices, CA).

A concentração protéica para cada amostra foi determinada comum kit de teste protéico BCA (Pierce Biotechnology, Inc., IL) usando albumi-na sérica bovina como padrão.Os camundongos foram perfundidos íranscardialmente com fi-xador contendo 2% de paraformaldeído, 0,03% de glutaraldeído, 0,002% deCaCI2 em tampão a 0,1 M de acetato de sódio a pH 6.5, seguido por perfu-são com o mesmo fixador a pH 8.5. Os cérebros e medulas espinhais decamundongos foram dissecados e pós-fixados de um dia para o outro a 4o Cem fixador em pH 8.5 sem glutaraldeído. Os tecidos foram lavados em tam-pão a 0,1 M de fosfato de potássio, pH 7.4, embutido em ágar a 3,5% e cor-tado em seções sagitais de 50 μηη com um vibratome.

Os cérebros e medulas espinhais de foram seccionados sagital-mente por vibratome em intervalos de 50 μηη. As seções foram processadaspor imunofluorescência com anticorpos primários contra ASM humana(1:200). As seções foram incubadas em 10% de soro de asno, 0,3% de Tri-ton X-100 em PBS por 1 hora, seguido por incubação com ASM anti-humanode camundongo biotinilado em 2% de soro de asno, 0,2% de Triton X-100em PBS por 72 horas. Depois de lavagem, o sinal foi amplificado usando umkit Tyramide Signal Amplification (PerkinElmer, Boston MA). Proteína ASMhumana foi visualizada com um microscópio fluorescente Nikon, e as ima-gens foram capturadas com uma SPOT câmera e software Adobe Photoshop.

Filipin Complex (Sigma, St. Louis, MO) foi primeiro diluído em100% de metanol para uma concentração de matéria-prima de 1 mg/ml. Asolução de matéria-prima é estável por 4 semanas a -20° C. Depois de lavarcom PBS, as seções foram incubadas no escuro por três horas em uma so-lução de 10 pg/ml de filipin recém preparada em PBS. Em seguida as se-ções foram lavadas três vezes com PBS. Depósitos de colesterol foram vi-sualizados sob um filtro ultravioleta em um microscópio de fluorescência.

Os cérebros foram processados para imunofluorescência usandoanticorpos primários dirigidos contra a proteína de ligação de cálcio, calbindi-na. As seções foram lavadas com tampão de fosfato de potássio (KPB) e emseguida enxaguadas com solução salina tamponada com fosfato de potássio(KPBS). Em seguida as seções foram bloqueadas em soro de asno a 5%,0,25% de Triton X-100 em KPBS por até 3 horas e em seguida incubadas emsoro de asno a 5%, 0,2% de Triton X-100 e anti-calbindina de camundongo(1:2500, Sigma, St. Louis, MO) em KPBS. Depois de 72 horas a 4o C as se-ções foram enxaguadas com KPBS com 0,1% de Triton X-100 três vezes. An-ticorpo secundário, de anticamundongo de asno CY3 (1:333, Jackson Immu-noresearch Laboratories, West Grove, PA) foi adicionado em KPBS + 0,1% deTriton X-100 por 90 minutos em temperatura ambiente. As seções foram lava-das com KPB e em seguida montadas sobre lâminas revestidas com gel. Cé-lulas positivas para calbindina foram visualizadas sob epifluorescência. Demodo a quantificar as células de Purkinje do cerebelo, foram selecionadasquatro seções cerebelares mediais de frente, de cada animal. Células de Pur-kinje imunopositivas para calbindina foram visualizadas sob um microscópiofluorescente e os corpos celulares foram contados em uma ampliação de 20X.

Cada lobo foi contado separadamente. Dois planos focais separados foramcontados por lobo. Somente foram contadas células dentro do foco para as-segurar que nanhuma célula fosse contada duas vezes.

Seções de vibratome de cinqüenta (50) pm foram primeiro pro-cessadas por imunofluorescência com anticorpos dirigidos contra ASM huma-na, conforme descrito acima. As seções foram em seguida lavadas em PBS ecoradas para colina acetiltransferase (ChAT; rabbit polyclonal, 1:500, Chemi-con International, Temecula, CA) com o protocolo resumido acima para cal-bindina. Ao invés de usar um anticorpo secundário CY3, no entanto, foi usadoFITC anti-coelho de asno (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories,West Grove, PA). A coloração foi primeiro visualizada sob epifluorescência eimagens posteriores foram adquiridas com um microscópio confocal.

A coloração por Filipin foi quantificada como se segue. Imagenscombinadas por exposição foram capturadas usando um microscópio de epi-fluorescência vertical de campo amplo Nikon E600 equipado com uma câ-mera SPOT digital. O grupo AAV2/1 -β-gal foi estudado por imagens primeiro,e a exposição foi usada para adquirir todas as imagens adicionais. Cada i-magem analisada representa um plano sagital mediai através da extensãode cada metade cerebral. Foi realizada análise morfométrica com o softwareMetamorph (Universal Imaging Corporation). Foi estabelecido o limiar dasimagens de AAV2/1- β-gal; uma vez estabelecido, foi usado o mesmo limiarem todas as imagens. As regiões seguintes foram selecionadas manualmen-te pelo usuário e analisadas separadamente: cerebelo, ponte, medula, me-sencéfalo, córtex cerebral, hipocampo, tálamo, hipotálamo e corpo estriado.

A intensidade integrada foi medida em cada região, e todas as medições (n= 3/grupo) de um dado grupo de animais foram usadas para gerar médias. Aredução no colesterol nos animais tratados foi em seguida calculada como apercentagem de redução da intensidade integrada comparada com os ca-mundongos injetados com β-gal de nocaute.

Foi observada imunocoloração positiva para hASM por todo ocerebelo (Figura 6, Tabela 3), ponte, medula e medula espinhal (Figura 7)depois de injeção unilateral de AAV-ASM dentro dos núcleos cerebelaresprofundos.

Tabela 3

Áreas com coloração positiva para hASM em função do sorotipode AAV. * indica que hASM positivo estava abaixo do limite de detecção,mas ainda ocorreu patologia de correção de colesterol

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Dentro do cerebelo, camundongos foram tratados com AAV2/1 -ASM e tiveram o nível de expressão de hASM mais difundido (isto é, difusãoentre lóbulos dentro da mesma seção sagital), ao passo que camundongostratados com AAV2/2-ASM tiveram o nível mais restrito de expressão de pro-teína ASM humana. A expressão de proteína ASM humana em camundon-gos tratados com AAV2/5-ASM, AAV2/7-ASM, e AAV2/8-ASM foi intermediá-ria entre estes dois grupos. A difusão medial-lateral entre seções sagitais foimáxima em camundongos tratados com os sorotipos 1 e 8 e mínima em ca-mundongos injetados com o sorotipo 2. Os sorotipos 5 e 7 iniciaram padrõesde difusão mediai -lateral intermediária entre os sorotipos 1 e 2. Cada cama-da do cerebelo (isto é, molecular, Purkinje e granular) foi transduzida porcada sorotipo AAV; no entanto, uma afinidade aumentara para a camadamolecular foi evidente para todos os sorotipos. A transdução de células dePurkinje foi máxima em camundongos tratados com os sorotipos 1 e 5. Oscamundongos injetados com o sorotipo 7 tiveram o menor número de célulasde Purkinje transduzidas. Os camundongos tratados com o sorotipo 8 tam-bém tiveram poucas células de Purkinje transduzidas, mas tiveram menosexpressão de ASM dentro da camada granular quando comparados com ossorotipos 1 , 2, 5 e 7. Células de Purkinje transduzidas com ASM pareceramter uma citoestrutura saudável. A análise quantitativa por ELISA da expres-são de proteína hASM mediada por AAV em homogenados de tecido cere-belar corrobora esses achados imunohistoquímicos. Os camundongos inje-tados com os sorotipos 1 e 8 demonstraram níveis protéicos de hASM nocerebelo significativamente maiores (p < 0,0001) quando comparados a to-dos os outros camundongos (Figura 8). Os níveis cerebelares de hASM decamundongos injetados com os sorotipos 2, 5, e 7 não estavam acima dosníveis de WT (isto é, fundo). Conforme esperado, não foi detectada ASMHumana em camundongos selvagens - os anticorpos hASM usados no ELI-SA são específicos para humanos.

Uma ausência de proteína ASM funcional resulta em acúmulolisossômico de esfingomielina, e defeitos metabólicos secundários subse-qüentes tais como tráfego de colesterol anormal. Sarna et al. Eur. J. Neuros-ci. 13:1873-1880 e Leventhal et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:44976-4498. Aformação de colesterol livre no cérebro de camundongos ASMKO é visuali-zada usando filipin, uma molécula autofluorescente isolada de streptomycesfilipinensis. Cérebros de camundongos selvagens não coram positivamentepara filipin. Em todos os camundongos tratados com AAV (com exceção deAAV2/1-Pgal) a depuração de coloração com filipin (Tabela 4) coincidiu comáreas que foram positivas para imunocoloração com hASM indicando que ovetor de cada sorotipo é capaz de gerar um produto transgenético funcional.

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Percentagem de Redução no clearance de Filipin (isto é, coles-terol) comparado com camundongos ASMKO tratados com AAV-PgaI emregiões cerebrais selecionadas depois de injeção intracerebelar de diferen-tes sorotipos AAV (n=3/sorotipo; 2/1 , 2/2, 2/5, 2/7, e 2/8) codificando paraASM humano nos núcleos cerebelares profundos de camundongos ASMKO.

Conforme previamente demonstrado por (Passini et al. (2003)em "Society for Neuroscience" New Orleans, LA), a depuração de filipin tam-bém ocorreu em áreas anatomicamente conectadas com o sítio de injeção,mas que não coraram positivamente para hASM. Análise MetaMorph indicouque uma redução na coloração com filipin ocorreu por todo o eixo rostralcaudal. No cerebelo e no tronco cerebral filipin foi reduzida maximamenteem camundongos tratados com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM, ao passo queno diencéfalo e no córtex cerebral camundongos injetados com AAV2/8-ASMtiveram o melhor nível global do clearance de filipin (Tabela 4). Não obstan-te, estes resultados indicam que o nível de hASM requerido para corrigir apatologia de armazenamento de colesterol no sistema nervoso central decamundongos ASMKO é mínimo (isto é, abaixo do limite de detecção de i-munoflourescência de hASM).

Tabela 5

Estudos histológicos indicam que o cerebelo dos camundongosASMKO sofre rápida deterioração. Mais especificamente, as células de Pur-kinje morrem progressivamente entre 8 e 20 semanas de idade (Sarna et al.(2001) Eur. J. Neurosci. 13:1813-1880 and Stewart et al. (2002) em "Societyfor Neuroscience" Orland1 FL). Calbindina é um marcador das células dePurkinje amplamente aceito. Coloração com calbindina positiva em camun-dongos tratados com AAV-ASM sugeriria que a expressão de hASM media-da por AAV é terapêutica. Globalmente esses resultados indicam que a ex-pressão de hASM mediada por AAV no cerebelo previne a morte das célulasde Purkinje no camundongo ASMKO (Tabela 5, Figura 9). Conforme espera-do, não ocorreu sobrevida das células de Purkinje nos lóbulos I a III; os ca-mundongos foram injetados em 7 semanas de idade e por volta de 8 sema-nas a maioria destas células já morrera. A sobrevida das células de Purkinjenos lóbulos IV/V foi máxima em camundongos tratados com o sorotipo 1. Nolóbulo Vl não foi observada sobrevida das células de Purkinje significativaem camundongos tratados com AAV. No lóbulo Vll somente camundongostratados com o sorotipo 5 apresentaram significativa sobrevida das célulasde Purkinje. No lóbulo Vlll novamente camundongos tratados com o sorotipo5 bem como com o sorotipo 2 apresentaram significativa sobrevida das célu-las de Purkinje. Nos lóbulos IX e X não houve diferenças significativas entrecamundongos WT e KO (ou entre camundongos tratados com AAV) nascontagens de células de Purkinje. Isto foi esperado, porque em 14 semanasde idade (isto é, idade no sacrifício) as células de Purkinje nestes lóbulosaindas são viáveis em camundongos ASMKO. Através de todos os lóbulos asobrevida das células de Purkinje foi máxima em camundongos tratadoscom os sorotipos 1, 2, e 5 e mínima em camundongos tratados com os soro-tipos 7 e 8. A sobrevida das células de Purkinje (com base on em coloraçãocom calbindina) nos lóbulos cerebelares anteriores foi maior em camundon-gos que foram injetados com o sorotipo 1.

Contagens de células de Purkinje nos lóbulos cerebelares I-Xem camundongos WT e ASMKO depois de injeção intracerebelar de diferen-tes sorotipos AAV (n = 3/sorotipo; 2/1 , 2/2, 2/5, 2/7, e 2/8) codificando paraASM humano dentro dos núcleos cerebelares profundos de camundongosASMKO. Os números que aparecem em negrito e itálico são significativa-mente diferente de camundongos KO (isto é, camundongos tratados comAAV2/1 -3gal) ρ <0,01.

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No teste da barra giratória acelaradora, camundongos injetadosunilateralmente com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM demonstraram uma latên-cia significativamente (p<0,0009) mais longa para cair do que camundongosASMKO injetados com AAV2/1^gal (Figura 10). Os camundongos injetadoscom sorotipo AA2/1 -ASM não foram significativamente diferente de camun-dongos selvagens. Os camundongos injetados com AAV2/2-ASM e AAV2/5-ASM apresentaram uma tendência para uma latência mais longa para cairdo que çamundongos ASMKO injetados com AAV2/1-Pgal; ao passo quecamundongos injetados com AAV2/7-ASM não. Para o teste da barra girató-ria oscilante, somente camundongos injetados com AA2/1- ASM demonstra-ram uma latência significativamente (p<0,0001) mais longa para rica do quecamundongos injetados com AA2/1-pgal. Neste caso, camundongos selva-gens tiveram performance significativamente melhor do que camundongosinjetadoscom AA2/1-ASM (Figura~10). Camundongos ASMKO que recebe-mance significativamente melhor (p <0,001) do que camundongos ASMKOtratados com AAV2/1-3gal tanto para os testes de aceleradora e oscilante(Figura 11). Camundongos injetados bilateralmente com AAV2/1-ASM tive-ram performance comparável a camundongos selvagens para ambos os testes.

Um modo para determinar se hASM gerado por AAV é funcio-nalmente ativo dentro do sistema nervoso central de camundongos ASMKOé avaliar sua influência sobre a patologia de armazenamento de colesterol -um defeito metabólico secundário da doença de NPA. Em todo os camun-dongos tratados com AAV (com exceção de AAV2/1 -Pgal) a correção de pa-tologia de armazenamento de colesterol coincidiu com áreas que foram posi-tivas para imunocoloração por hASM indicando que vetor de cada sorotipo écapaz de gerar um produto transgenético funcional. Conforme demonstradopreviamente, a correção do metabolismo do colesterol anormal também o-correu em áreas conectadas anatomicamente com o sítio de injeção, mastambém em regiões que não coraram positivamente para hASM, sugerindoque o nível de hASM requerido para correção da patologia de armazena-mento de colesterol é mínimo. Consistente com esses resultados de hASMhistoquímicos e bioquímicos, camundongos tratados com sorotipos 1 e 8demonstraram uma acentuada redução na patologia de armazenamento decolesterol. Os camundongos tratados com sorotipos 2, 5, e 7 também apre-sentaram uma redução na patologia de armazenamento de colesterol, masnão na mesma extensão que os camundongos tratados com sorotipos 1 e 8.Enquanto alterações da patologia de armazenamento de coles-terol são ilustrativas, uma medição mais direta da atividade enzimática dehASM é através da análise dos níveis de esfingomielina, a qual é o substratoprimário acumulado nos tecidos de mamíferos com a doença de Niemann-Pick. O tecido cerebral de camundongos que receberam injeções bilateraisde AAV sorotipo 1 e 2 foi testado para os níveis de esfingomielina (SPM) (oprocedimento de homogenização tecidual para detecção de esfingomielinanão é compatível com a detecção de hASM.) Uma redução significativa(p<0,01) no teor tecidual de esfingomielina no cerebelo foi observada emcamundongos tratados com ambos os sorotipos 1 e 2 (Figura 12). Os níveisdo teor tecidual de esfingomielina também foram reduzidos significativamen-te nas seções 2, 3, e 4 (cada seção estando separada 2 mm da próxima) emcamundongos injetados com o sorotipo 1 mas não em camundongos injeta-dos com o sorotipo 2.

Camundongos ASMKO que receberam injeções intracerebelaresbilaterais de AAV sorotipos 1 e 2 codificando para hASM apresentaram umaredução significativa no armazenamento de esfingomielina dentro do cerebe-lo. Conforme observado com acúmulo do armazenamento de colesterol, umaredução significativa no armazenamento de esfingomielina também ocorreuem regiões fora do cerebelo em camundongos ASMKO tratados bilateral-mente com AAVI.

Globalmente, estes resultados indicam que AAV1 é preferencialaos sorotipos 2, 5, 7, e 8 em sua capacidade relativa para iniciar a expres-são enzimática, patologia de armazenamento correto no cérebro, prevenirneurodegeneração (por exemplo, prevenindo morte das células de Purkinje),e melhorar o resultado funcional motor. Além disso, os núcleos cerebelaresprofundos podem ser explorados como um sítio de injeção para maximizar aexpressão enzimática por todo o sistema nervoso central.

Para avaliar a distribução da expressão transgenética depois dainjeção de vetores de AAV nos núcleos cerebelares profundos, G93A SOD1(camundongo mutante SOD1G93A, referido aqui no camundongo S0D1) fo-ram injetados vetores de AAV recombinantes codificando para proteína ver-de fluorescente (GFP). Um grupo de camundongos foi injetado com AAVsorotipo 1 codificando para proteína verde fluorescente (AAV1-GFP) en-quanto outro grupo foi injetado com AAV sorotipo 2 codificando para proteínaverde fluorescente (AAV2-GFP).

Os camundongos foram injetados bilateralmente nos núcleoscerebelares profundos com os vetores recombinantes de AAV usando méto-dos similares aos descritos acima. A dose foi de aproximadamente 2,0 e 10gc/ml injetado por sítio. Os camundongos foram sacrificados cerca de 110dias depois do nascimento e seu cérebro e medula espinhal foram analisa-dos para coloração por proteína verde fluorescente.

Foi observada distribuição de proteína verde fluorescente notronco cerebral (vide Figura 14) e nas regiões da medula espinhal (vide Figu-ra 15) depois de liberação nos núcleos cerebelares profundos de AAV codifi-cando para proteína verde fluorescente (GFP). Também foi observada colo-ração por proteína verde fluorescente nos núcleos cerebelares profundosbem como nos bulbos olfatórios, no córtex cerebral, no tálamo, no troncocerebral, no córtex cerebelar e na medula espinhal. Todas estas áreas ourecebem projeções de e/ou enviam projeções para os núcleos cerebelaresprofundos (vide Figura 16).

O relatório descritivo é o mais completamente entendido à luzdos ensinamentos das referências citadas dentro do relatório descritivo. Asmodalidades dentro do relatório descritivo proporcionam uma ilustração dasmodalidades da invenção e não devem ser consideradas como Iimitantes doâmbito da invenção. O técnico versado prontamente reconhece que muitasoutras modalidades são englobadas pela invenção. Todas as publicações,patentes, e seqüências biológicas citadas nesta descoberta são incorpora-das por meio de referência em sua totalidade. Na medida que o material in-corporado por meio de referência contradiz ou é inconsistente com o presen-te relatório descritivo, o presente relatório descritivo suplanta qualquer mate-rial referido. A citação de quaisquer referências aqui, não é uma admissãode que as referências referidas são técnica anterior à presente invenção.

A menos que indicado de modo diverso, todos os números ex-pressando quantidades de ingredientes, cultura celular, condições de trata-mento, e assim por diante usados no relatório descritivo, inclusive reivindica-ções, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casospelo termo "cerca de." Por conseguinte, a menos que indicado de modo di-verso ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podemvariar dependendo das propriedades desejadas que se procura que sejamobtidas pela presente invenção. A menos que indicado de modo diverso, otermo "no mínimo" precedando uma série de elementos deve ser entendidocomo se referindo a cada elemento na série. Os versados na técnica reco-nhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experi-mentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas dainvenção descritas aqui,. Pretende-se que os equivalentes referidos sejamenglobados pelas reivindicações a seguir.

Claims (32)

1. Método compreendendo administrar uma composição com-preendendo um vetor AAV codificando para uma molécula biologicamenteativa para um sítio no sistema nervoso central comprometido com doença deum mamífero, sob condições por meio das quais os referidos vetores AAVinjetados transduzem células localizadas em um sítio distai no sistema ner-voso central e a referida molécula biologicamente ativa codificada é traduzida.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a moléculabiologicamente ativa traduzida é em seguida expressada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o mamíferotem uma doença de armazenamento lisossômico ou metabolismo do coles-terol anormal.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a doença dearmazenamento lisossômico é doença de Niemann Pick A.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o mamíferoé ser humano.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o sítio distaié contralateral ao sítio de administração.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o sítio deadministração está em uma região do sistema nervoso central selecionadaentre o grupo consistindo na medula espinhal, do tronco cerebral, do hipo-campo, do corpo estriado (striatum), da medula, da ponte (ponte de Varólio),do mesencéfalo, do cerebelo, do tálamo, do hipotálamo, do córtex cerebral,do lobo occipital, do lobo temporal, do lobo parietal, e do lobo frontal.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o sítio deadministração está no hipocampo e o sítio distai está em uma região do cé-rebro selecionada entre o grupo consistindo no giro dentado contralateral e oCA3 contralateral, e o septo mediai, e o córtex entorrinal.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o sítio deadministração está em uma região do cérebro selecionada entre o grupoconsistindo do estriato e do cerebelo, e o sítio distai está em uma região docérebro selecionada entre o grupo consistindo na substância negra e da me-dula oglongata.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o sítio deadministração está no núcleo cerebelar profundo do cerebelo.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vetorAAV tem um capsídeo de AAV soro tipo 1.

12. Método das reivindicações 3 ou 4, em que o vetor AAV temum capsídeo de AAV sorotipo 1.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o vetorAAV tem um capsídeo de AAV sorotipo 1.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vetorAAV é AAV1 ou AAV2/1.

15. Método da reivindicação 3 ou 4, em que o vetor AAV é AAV1ou AAV2/1.

16. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o vetorAAV é AAV1 ou AAV2/1.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadicionalmente administração de uma composição a um segundo sítio nosistema nervoso central do mamífero, em que a composição compreendeum vetor AAV compreendendo um polinucleotídeo codificando um produtomolecular biologicamente ativo.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o segun-do sítio de administração é contralateral ao primeiro sítio de administração.

19. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a moléculabiologicamente ativa é uma hidrolase lisossômica.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a hidrola-se lisossômica é qualquer uma das hidrolases lisossômicas listadas na Tabela 1.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a hidrola-se lisossômica é esfingomielinase ácida.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o sítio deadministração está no núcleo cerebelar profundo e o sítio distai é a medulaespinhal.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a distânciaentre o sítio de administração e o sítio distai é no mínimo 2 mm.

24. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a concen-tração do vetor AAV na composição é no mínimo 5 X 1012 gp/ml.

25. Método compreendendo administrar uma composição com-preendendo um vetor AAV codificando para uma molécula de metaloendo-peptidase para um sítio no sistema nervoso central de um mamífero comdoença de Alzheimer, sob condições por meio das quais os referidos vetoresAAV injetados transduzem células localizadas em um sítio distai no sistemanervoso central e a referida metaloendopeptidase codificada é expressada.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a metalo-endopeptidase é selecionada entre o grupo consistindo de neprilisina, insuli-sina, e oligopeptidase thimet.

27. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 25, em que ovetor AAV é selecionado entre o grupo consistindo em AAV2, AAV3, AAV4,AAV5, AAV6, AAV7, e AAV8.

28. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a distân-cia entre o sítio de administração e o sítio distai é no mínimo 2 mm.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a concen-tração do vetor AAV na composição é no mínimo 5 X 1012 gp/ml.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o AAV éselecionado entre um grupo consistindo de AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, A-AV6, AAV7, e AAV8.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o AAV éum vetor AAV recombinante.

32. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o vetorAAV recombinante é selecionado entre o grupo consistindo de vetores soro-típos AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8.