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MX2007009403A - Anticuerpos que se unen a epha2 y metodos para usar los mismos. - Google Patents

Anticuerpos que se unen a epha2 y metodos para usar los mismos.

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MX2007009403A
MX2007009403A MX2007009403A MX2007009403A MX2007009403A MX 2007009403 A MX2007009403 A MX 2007009403A MX 2007009403 A MX2007009403 A MX 2007009403A MX 2007009403 A MX2007009403 A MX 2007009403A MX 2007009403 A MX2007009403 A MX 2007009403A
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MX
Mexico
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epha2
antibody
antibodies
luca40
luca19
Prior art date
Application number
MX2007009403A
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English (en)
Inventor
Jennie P Mather
Penelope E Roberts
Original Assignee
Raven Biotechnologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Se ha provisto aqui la descripcion acerca del desarrollo y caracterizacion de un anticuerpo que se une al entigeno EphA2 el cual esta presente en un variedad de canceres humanos del pecho, pulmon, prostata, y colon. Tambien se describen aqui los metodos de diagnostico y tratamiento de los diversos canceres mediante el uso de tales anticuerpos dirigidos contra este antigeno.

Description

ANTICUERPOS QUE SE UNEN A EPHA2 Y MÉTODOS PARA USAR LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está en el campo de la biología y de la inmunoterapia. Más específicamente, se relaciona con el descubrimiento de una familia de anticuerpos que se unen al EPHA2. La invención suministra adicionalmente el diagnóstico y/o el tratamiento de una variedad de enfermedades humanas y cánceres asociados con el EphA2 utilizando la familia de anticuerpos anti-EphA2 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Adicionalmente a sus cursos conocidos en diagnósticos, los anticuerpos han mostrado ser útiles como agentes terapéuticos. Por ejemplo, la inmunoterapia, o el uso de anticuerpos para propósitos terapéuticos ha sido usado en años recientes para tratar el cáncer. La inmunoterapia pasiva involucra el uso de anticuerpos monoclonales en tratamientos de cáncer. Ve por ejemplo, Cáncer: Principies and Practice of Oncology, sexta edición (2001) capítulo 20 páginas 495-508. Estos anticuerpos pueden tener una actividad biológica terapéutica inherente tanto mediante dirigir la inhibición del crecimiento celular del tumor o la supervivencia y por su habilidad para reclutar la actividad natural de las células para matar del sistema inmune del cuerpo. Estos agentes pueden ser administrados solos o en conjunto con radiación o REF: 184689 agentes quimioterapéuticos. Rituximab y Trastuzumab, aprobados para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin y el cáncer de pecho, respectivamente, son dos ejemplos de tales terapéuticas. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser usados para hacer conjugados de anticuerpo caracterizado porque el anticuerpo esta unido a un agente tóxico y se dirige ese agente al tumor mediante la unión especifica al tumor. Gemtuzumab ozogamicina es un ejemplo de un conjugado de anticuerpo aprobado usado para el tratamiento de la leucemia. Los anticuerpos monoclonales que se unen a las células de cáncer y tienen usos potenciales para el diagnóstico y la terapia han sido descritos en publicaciones. Ver, por ejemplo, las siguientes solicitudes de patente que describen, inter alia, algunos pesos moleculares de proteínas objetivo: la Patente Estadounidense número 6,054,561 (c-erbB-2 (Her2) de 200 KD) , y otros, antígenos conocidos entre 40 a 200 KD en tamaño) y la patente Estadounidense número 5, 656, 444 (proteína oncofetal de 50 KD y de 55 KD) . Ejemplos de anticuerpos en ensayos clínicos y/o aprobados para el tratamiento de tumores sólidos incluye: Trastuzumab (antígeno: HER2/neu de 180 KD) , Edrecolomab (antígeno: Ep-CAM de 40 a 50 KD) , glóbulos de grasa de leche antihumanos (HMFG1) (antígeno > 200 KD, HMW Mucin) , Cetuximab (antígenos: de 150 KD y 170 KD, receptor de EGF) , Alemtuzumab (antígeno: 21 a 28 KD, CD52) , y Rituximab (antígeno: 35 KD CD20) .
Los antígenos objetivos del trastuzumab (receptor Her-2) , que es usado para tratar el cáncer de mama, y el cetuximab (receptor EGF) , los cuales están en ensayos clínicos para el tratamiento de diversos cánceres están presentes en algún nivel detectable en gran número de tejidos de humano adulto normales incluyendo la piel, el colon, pulmones, ovarios, hígado, y páncreas. El margen de seguridad al usar estos terapéuticos está posiblemente suministrado por la diferencia en el nivel de expresión o en el acceso de o la actividad del anticuerpo de sus sitios. Otro tipo de inmunoterapia es la inmunoterapia activa, o vacunación, con un antígeno presente sobre un cáncer específico o una construcción de ADN que dirige la expresión del antígeno, la que entonces provoca la respuesta inmune en el individuo, es decir, inducir al individuo a producir activamente anticuerpos contra su propio cáncer. La inmunización activa no ha sido usada tan frecuentemente como la inmunoterapia pasiva o las inmunotoxinas. Diversos modelos de progresión de enfermedad (incluyendo el cáncer) se ha sugerido. Las teorías varían desde la causación por una infección única / evento de transformación hasta la evolución de un tipo de tejido "similar a enfermedad" o "similar a cáncer" en ultimas a uno con capacidad patogénica o maligna completa. Alguna explicación con el cáncer, por ejemplo, un evento mutacional único es suficiente para causar la malignidad, mientras que otros arguyen que las alteraciones subsecuentes son también necesarias . Algunos otros han sugerido que incrementando la carga mutacional y el grado de tumor son necesarios tanto para la iniciación lo mismo que la progresión de la neoplasia mediante eventos de mutación-selección continuos a nivel celular. Algunos objetivos de cáncer se han encontrado solamente en tejidos de tumor, mientras que otros están presentes en tejidos normales y son reguladores y/o sobre expresores en tejidos de tumor. En tales situaciones, algunos investigadores han sugerido que la sobre expresión está ligada a la adquisición de la malignidad, mientras que otros sugieren que la sobre expresión es meramente un marcador de una tendencia a lo largo de un trayecto hacia un estado de enfermedad incremental. Un aspecto requerido para el diagnóstico ideal y/o el anticuerpo terapéutico es el descubrimiento y caracterización de un antígeno que está asociado con una variedad de cánceres . Existen pocos antígenos que son expresados sobre un número de tipos de cáncer (por ejemplo, el antígeno "pan-cáncer") que tiene expresión limitada sobre células no cancerosas. El aislamiento y purificación de tal antígeno sería útil para hacer anticuerpos (por ejemplo, diagnóstico y terapéuticos) que activen el antígeno. Un anticuerpo que se une al antígeno "pan-cáncer" podría ser capaz de activar una variedad de cánceres encontrados en diferentes tejidos en contraste a un anticuerpo contra un antígeno asociado con solamente un tipo específico de cáncer. El antígeno sería útil también para el descubrimiento de fármacos (por ejemplo moléculas pequeñas) y para la caracterización adicional de la regulación, crecimiento y diferenciación celular. Lo que se necesita son objetivos novedosos sobre la superficie de células enfermas y/o de cáncer que puedan ser usados para tratar tales enfermedades y/o cánceres con anticuerpos y otros, agentes que reconozcan específicamente los objetivos de superficie celular. Existe una necesidad adicional, con base en los descubrimientos descritos aquí, para anticuerpos novedosos y otros, agentes que reconozcan específicamente objetivos sobre la superficie de las células que puedan modular, sea mediante reducir o promover, las actividades promotoras de la enfermedad del EphA2. El EphA2 , previamente conocido como ECK, es una tirosina cinasa receptora de transmembrana de 130 KD que es expresada sobre células epiteliales adultas. Ver Lindberg, y otros, (1990) Mol . Cell . Biol . 10: 6316-6324. La EphA2 es un miembro de la familia EPH de tirosina cinasas receptoras, que son únicos en que ellos reconocen los ligandos, conocidos como ef iñas, que son anclados a la membrana de células adyacentes. Ver Bartley, y otros, (1994) Nature 368: 558-560.
La secuencia del receptor humano del EphA2 es conocida en la literatura. Esta involucra un dominio extra celular de 534 aminoácidos, un dominio transmembrana de 24 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 418 aminoácidos que contienen el dominio de la tirosina quinasa. El EphA2 está sobre expresado en un gran número de células de cáncer, por ejemplo, en el seno, la próstata, el pulmón, y los carcinomas de colon, y en melanomas agresivos, pero se ha reportado que no está sobre expresado en lesiones no cancerosas de estos mismos tejidos. Ver, por ejemplo, Rosenberg, y otros, (1997) Am. J. Physiol . 273: G824-G832; Easty y otros, (1995) Int . J. Cáncer 60: 129-136; Walter- Daniels. y otros, (1999) Prostate 41: 275-280; Zantek y otros, (1999) Cell Growth & Differ. 10: 629-638; Zantek y otros, (2001) Clin . Cáncer Res . 1 : 3640-3648; Zelniski y otros, (2001) Cáncer Res . 61: 2301-2306; WO 01/121172; y WO 01/ 12840. Más aún, las células que han sido transformadas para sobre expresar el EphA2 demuestran un crecimiento maligno y un enlazado al ligando, lo que causa que el EphA2 sea internalizado y degradado, e invierta el efecto oncogénico de la sobre expresión del EphA2. Ver Zelniski y otros, (2001) Cáncer Res . 61: 2301-2306; y Walker-Daniels, y otros, (2002) . Mol . Cáncer Res 1: 79-87. Usar el EphA2 como un objetivo terapéutico ha sido propuesto por otros en la técnica. Un autor sugirió usar ligandos de EphA2 tal como una fusión de la efrina Al a la inmunoglobulina G humana. La exposición de células que expresan el EphA2 a la proteína de fusión efrina Al-FC resultó en una sub-regulación de la expresión de EphA2. Ver Duxbury, y otros, (2004) BBRC 320 1096-1102. Los anticuerpos para eck/ EphA2 son conocidos, ver por ejemplo, Lindberg, y otros, (1990) Mol . Cell . Biol . 10: 6316-6324. El uso de los anticuerpos anti-EphA2 que usan objetivado con base en anticuerpo han sido descritos por otros, ver por ejemplo, Charles-Kinch y otros, (2002) Cáncer Res . 62:2840-2847, que describe usar el dominio extracelular del EphA2 fusionado a la inmunoglobulina humana para generar anticuerpos monoclonales contra el EphA2. El tratamiento de células cancerosas con estos anticuerpos monoclonales anti-EphA2 resultó en cambios morfológicos y en la inhibición del crecimiento celular sobre agar suave. Los anticuerpos para el EphA2 han sido hechos y propuestos como útiles en el tratamiento de cáncer (ver por ejemplo. Patente Estadounidense 6,997,203; publicación de Patente Internacional números WO 01/12840 y WO 01/12172; la solicitud de Patente provisional Estadounidenses números 60/379,322 y 60/ 379,368; la Patente Estadounidense 5,824, 303) . La WO 2003 US 15044 describe métodos que comprenden la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se une al EphA2 y agoniza al EphA2 , incrementando así la fosforilación del EphA2 y disminuyendo los niveles de EphA2. En otras modalidades, esa solicitud describe la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se une al EphA2 e inhibe la formación de colonias de células cancerosas en agar suave, inhibe la formación de redes tubulares en membranas de base tridimensional o preparación de matriz extracelular, preferencialmente se une a un epítopo del EphA2 que está expuesto sobre las células de cáncer pero no sobre células que no tengan cáncer, y/o tiene un bajo crecimiento de célula tumoral de inhibición tipo Koff, por lo tanto y/o una metástasis. La Patente Estadounidense 6, 927, 203 describe anticuerpos que impiden la proliferación de células de tumor que utiliza un anticuerpo que incrementa el contenido de fosfotirosina del EphA2. La solicitud de Patente PCT WO 200391383 describe péptidos derivados del EphA2 y su uso en la inmunoterapia anti-tumor. Esta describe la vacunación por péptido o la inmunoterapia con base en un epítopo de EphA2 que puede ser utilizado para inducir o imitar una respuesta a la célula linfocito T citotóxica a la células tumorales que sobre expresan el EphA2. Aunque los anticuerpos EphA2 son conocidos, permanece una necesidad para anticuerpos particulares anti-EphA2 que sean extremadamente efectivos en inhibir el crecimiento de células de tumor, más allá del nivel de efectividad mostrado por los anticuerpos EphA2 mostrados en el estado de la técnica. Todas las referencias, publicaciones, y solicitudes de patente descritas se incorporan como referencia en su totalidad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención descrita aquí se relaciona con anticuerpos que se unen a un antígeno, EphA2 , que es expresado sobre una variedad de cánceres humanos . De acuerdo a lo anterior, en un aspecto, la invención es una familia de anticuerpos, o un anticuerpo o un polipéptido (que puede o no ser un anticuerpo) que se une preferencialmente al antígeno EphA2. Los anticuerpos reclamados en la presente invención son sorprendentemente y muy efectivos para inhibir el crecimiento de células de tumos, más allá del nivel o de efectividad mostrado por los anticuerpos EphA2 mostrados en el estado de la técnica. Algunos de estos anticuerpos se han llamado aquí como LUCA19, SPL1 ; 1UCA40, o SG5. En aspectos de esta invención, ciertos anticuerpos han sido descubiertos que pueden tener la habilidad de impedir la proliferación de células de tumor mientras que no se incrementa el contenido de fosfotirosina del EphA2. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo monoclonal anti-EphA2 que es producido por cualquiera de las siguientes líneas de células anfitrionas: PTA-5070 depositada en Marzo 20, 2003 en el Colección del Cultivo de Tipo Americano, PTA-6056 depositada en Junio 8, 2004 en el Colección del Cultivo de Tipo Americano, PTA-6059 depositada en Junio 8, 2004 en el Colección del Cultivo de Tipo Americano, y una línea celular anfitriona que produce SG5 (SG.3.15.B4.1F9) que fue depositada en la Colección del Cultivo de Tipo Americano, en Febrero 2, de 2006. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo o un polipéptido (que puede o no ser un anticuerpo) que inhibe competitivamente el unido específico del anticuerpo anti-EphA2 al EphA2. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo o un polipéptido (que puede o no ser un anticuerpo) que se une preferencialmente al mismo epítopo sobre el EphA2 como se une preferencialmente LUCA19, SPL1, SG5 o 1UCA40. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo que comprende un fragmento o una región del anticuerpo anti-EphA2. En una modalidad, el fragmento es una cadena ligera o liviana del anticuerpo anti-EphA2. En otra modalidad, el fragmento es una cadena pesada del anticuerpo anti-EphA2. Todavía en otra modalidad, el fragmento contiene una o más regiones variables de una cadena liviana y/o de una cadena pesada del anticuerpo anti-EphA2. Todavía en otra modalidad, el fragmento contiene uno o más regiones que determinan la complementariedad (CDR) de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención suministra polipéptidos (que pueden o no ser anticuerpos) que comprenden cualquiera de los siguientes: a) uno o más CDR; b) tres CDR de la cadena liviana; c) tres CDR de la cadena pesada; d) tres CDR de la cadena liviana y tres CDR de la cadena pesada; e) la región variable de la cadena liviana; f) la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo humanizado derivado de LUCA19, SPL1, SG5 , o LUCA40. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado comprende uno o más CDR del anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención suministra un anticuerpo humanizado que se une al mismo o epítopos que en el anticuerpos anti-EphA2. Generalmente, un anticuerpo humanizado de la invención comprende uno o más (1, 2, 3, 4, 5, 6) CDR que son iguales y/o derivados de los CDR del anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención suministra un anticuerpo humano que se une al mismo o mismos epítopos sobre el EphA2 que lo hace el anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables de una cadena pesada y de una cadena liviana de el anticuerpo anti-EphA2 y regiones constantes derivadas de las regiones constantes de una cadena pesada y de una cadena liviana de una anticuerpo humano. Todavía en otro aspecto, la invención es una célula anfitriona (ATCC No. PTA-5070, PTA-6056, PTA-6059, o SG.3.15.B4.1F9 (ATCC No. PTA-XXXX) ) o la progenie de ellos que producen anticuerpo monoclonal anti-EphA2. En otro aspecto, la invención es un polinucleótido aislado que codifica para el anticuerpo anti-EphA2 que es producido mediante una célula anfitriona con un número de depósito de ATCC No. PTA-5070, PTA-6056, o PTA-6059, o una célula anfitriona SG.3.15. B4.1F9 (ATCC No. PTA-XXXX) ) o su progenie. En otro aspecto, la invención suministra polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo) Lo mismo que cualquiera de otros polipéptidos descritos aquí. En otro aspecto, la invención es un complejo de EphA2 unido mediante cualquiera del anticuerpo o polipéptido descritos aquí. En algunas modalidades el EphA2 está presente en células de melanomas de cáncer de mama, colon, de pulmón, o de próstata. En algunas modalidades, la invención es un complejo de EphA2 unido mediante el anticuerpo anti-EphA2 o un anticuerpo que se une preferencialmente al epítopo al cual el anticuerpo anti-EphA2 se une preferencialmente. En una modalidad, el anticuerpo anti-EphA2 o cualquier anticuerpo que se une preferencialmente al epítopo al cual se une el anticuerpo anti-EphA2 preferiblemente está unido a un agente terapéutico (tal como una toxina) . En otro aspecto, la invención es un complejo de una célula de cáncer que expresa el EphA2 unido mediante cualquiera del anticuerpo o polipéptido descritos aquí. En algunas modalidades, la célula de cáncer es melanomas, células de pecho, colon, pulmón, o próstata. En algunas modalidades, el anticuerpo es SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40 o cualquier anticuerpo que se ligue preferencialmente a un epítopo de cualquiera de estos anticuerpos anti-EphA2 se une preferencialmente. En algunas modalidades, SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40 o cualquier anticuerpo que se ligue preferencialmente a un epítopo de cualquiera de estos anticuerpos anti-EphA2 se une preferencialmente está vinculado a un agente terapéutico (tal como una toxina) . En otro aspecto, la invención es un complejo de un epítopo sobre el EphA2 que el SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40 preferiblemente une, el que a su vez se une con cualquiera de los anticuerpos o polipéptidos descritos aquí. En algunas modalidades, el epítopo es sobre células de cáncer de melanomas, pecho, colon, pulmón o próstata. En algunas modalidades, el anticuerpo es SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40 o cualquier anticuerpo que se ligue preferencialmente a un epítopo al cual cualquiera de estos anticuerpos anti-EphA2 se une preferencialmente. En algunas modalidades, SPL1, 1UCA19, SG5 o LUCA40 o cualquier anticuerpo que se ligue preferencialmente a un epítopo en el cual cualquiera de estos anticuerpos anti-EphA2 se une preferencialmente está unido a un agente terapéutico (tal como una toxina) . En otro aspecto, la invención es una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos (incluyendo cualquiera de los polipéptidos tal como el anticuerpo anti-EphA2) o los polinucleótidos descritos aquí, tal como las composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo anti-EphA2, el anticuerpo anti-EphA2 unido a un agente terapéutico, un anticuerpo que comprende un fragmento del anticuerpo anti. EphA2 , un anticuerpo humanizado del anticuerpo anti.-EphA2, un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA2 y regiones constantes derivadas de las regiones constantes de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humano con uno o más propiedades del anticuerpo anti-EphA2, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Todavía en otro aspecto, la invención es un método para generar un anticuerpo monoclonal anti-EphA2 que reacciona con células enfermas y/o cancerosas que comprende las etapas de: a) inmunizar un mamífero anfitrión con un inmunógeno; b) obtener linfocitos del mamífero; c) fundir los linfocitos; con una línea de células de mieloma para producir un hibridoma; d) Cultivar el hibridoma de ® para producir anticuerpos monoclonales; y e) tamizar los anticuerpos para seleccionar solamente aquellos anticuerpos que se unen a las células enfermas y/o cancerosas o a las líneas celulares enfermas y/o cancerosas pero que no se unen a células no cancerosas o normales o líneas de células no cancerosas o normales, o se une a células normales a un nivel inferior o a de una manera diferente. En otro aspecto, la invención es un método para generar un anticuerpo de la familia anti-EphA2 que comprende cultivar una célula anfitriona que codifica tal anticuerpo o progenie del mismo bajo condiciones que permitan la producción del anticuerpo, y purificar el anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención es un método para generar un anticuerpo de la familia anti-EphA2 que comprende cultivar una célula anfitriona o progenie de ella bajo condiciones que permitan la producción del anticuerpo, y purificar el anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención suministra métodos para generar cualquiera de los anticuerpos (o polipéptido) descritos aquí mediante expresar uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo (que pueden ser expresados separadamente como una cadena liviana o pesada única, o ambas una cadena liviana y pesada expresadas de un vector) en una célula adecuada generalmente seguido por la recuperación y/o aislamiento del anticuerpo o polipéptidos de interés.
En otro aspecto, la invención es un anticuerpo anti-EphA2 o un polipéptido (que puede ser o no un anticuerpo) que inhiba competitivamente el unido preferencial de un anticuerpo anti-EphA2 al EphA2. En algunas modalidades, la invención es un anticuerpo o un polipéptido (que puede o no ser un anticuerpo) que se une preferencialmente al mismo epítopo o a diferentes epítopos sobre el EphA2 como lo hacen otros anticuerpos anti-EphA2. En todavía otro aspecto, la invención es una composición que comprende el EphA2 unido por un anticuerpo específico para un epítopo de EphA2. En una modalidad, el anticuerpo es anti-EphA2. En otras modalidades, dos o más anticuerpos anti-EphA2 son administrados, con tales anticuerpos mapeando dos o más epítopos diferentes de EphA2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-EphA2 está unido a un agente terapéutico o a una etiqueta detectable. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo que comprende un fragmento o una región de un anticuerpo anti-EphA2. En una modalidad, el fragmento es una cadena liviana del anticuerpo. En otra modalidad el fragmento es una cadena pesada del anticuerpo. Todavía en otra modalidad, el fragmento contiene uno o más regiones variables de una cadena liviana y/o de una cadena pesada del anticuerpo. Todavía en otra modalidad, el fragmento contiene una o más regiones que determinan la complementariedad (CDR) de una cadena liviana y/o una cadena pesada del anticuerpo. En otro aspecto, la invención suministra polipéptidos (que pueden o no ser anticuerpos) que comprenden cualquiera de los siguientes: a) uno o más CDR (o fragmentos de ellos) de la cadena liviana o pesada; b) tres CDR de la cadena liviana; c) tres CDR de la cadena pesada; d) tres CDR de la cadena liviana y tres CDR de la cadena pesada; e) la región variable de la cadena liviana; f) la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado comprende uno o más CDR de un anticuerpo Anti-EphA2 no humano. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado se une al mismo o a diferentes epítopos como otros anticuerpos anti-EphA2. Generalmente, un anticuerpo humanizado de la invención comprende uno o más (1, 2, 3, 4, 5, 6 o fragmentos de ellos) CDR que son iguales y/o derivados de los CDR del anticuerpo anti-EphA2 no humano original. En algunas modalidades, el anticuerpo humano se une al mismo o a diferentes epítopos como otros anticuerpos anti-EphA2. En otro aspecto, la invención es un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables de una cadena pesada y de una cadena liviana de un anticuerpo anti-EphA2 no humano y regiones constantes derivadas de las regiones constantes de una cadena pesada y de una cadena liviana de una anticuerpo humano. En otro aspecto, la invención es un polinucleótido aislado que codifica cualquiera uno de los anticuerpos SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40 que es producido mediante una célula anfitriona con un número de depósito de ATCC No. PTA-5070, PTA-6056, o PTA-6059, respectivamente y la célula anfitriona SG.3.15.B4.1F9 (ATCC No. PTA-XXXX) o su progenie. Esta invención involucra polipéptido de anticuerpo que tienen el actividades de unido o biológicas inherentes de cualquiera de los anticuerpos anteriormente especificados. En otro aspecto la invención suministra polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo) Lo mismo que cualquiera de otros polipéptidos descritos aquí. En otro aspecto, la invención es una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos (incluyendo cualquiera de los anticuerpos descritos aquí) o polinucleótidos descritos aquí, tal como composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-EphA2 unido a un agente quimioterapéutico, un anticuerpo que comprende un fragmento de un anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo humanizado de un anticuerpo anti-EphA2 no humano, un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables de un anticuerpo anti-EphA2 no humano y secciones constantes derivadas de las regiones constantes de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humano con una o más propiedades de un anticuerpo anti-EphA2 no humano, o cualquiera del anticuerpo anti-EphA2 descrito aquí unido a un agente quimioterapéutico (tal como una parte radioactiva), y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la invención es una composición que comprende un anticuerpo anti-EphA2 unido al EphA2 presentes en una célula enferma o cancerosa. En las modalidades preferidas, la célula de cáncer es seleccionada del grupo que consiste de células de cáncer de ovario, pulmón, próstata, pancreático, colon, y pecho. En algunas modalidades, la célula de cáncer es aislada. En algunas modalidades, la célula de cáncer es una muestra biológica. Generalmente, la muestra biológica es de un individuo, tal como un humano. En otro aspecto, la invención es un método para diagnosticar la enfermedad en un individuo al detectar EphA2 en células del individuo, particularmente enfermedades o desórdenes asociados con respuestas inflamatorias o auto inmunes en individuos. En otros aspectos de la invención, los métodos son suministrados para modular las respuestas inflamatorias y auto inmunes en individuos. Las enfermedades y condiciones resultantes de los desórdenes de inflamación y auto inmune que puedan ser sujetos a tratamiento utilizando las composiciones y métodos de la invención incluyen. Como vía de ilustración y no como limitación, esclerosis múltiple, meningitis, encefalitis, infarto, otros traumas cerebrales, enfermedad inflamatoria del intestino incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Chron, miastenia gravis, lupus, artritis reumatoide, asma, diabetes establecida juvenil aguda, Sida, demencia, aterosclerosis, nefritis, retinitis, dermatitis atópica, soriasis, isquemia miocardial y daño pulmonar mediado por leucocitos agudos. Todavía otras indicaciones para el uso terapéutico de los anticuerpos y otros, agentes terapéuticos de la invención incluyen la administración a individuos en el riesgo de rechazo de órganos o injertos. Durante años recientes ha habido una considerable mejora en la eficiencia de las técnicas quirúrgicas para el trasplante de tejidos y órganos tales como piel, riñon, hígado, corazón, pulmón, páncreas y médula ósea. Quizás los problemas principales más destacados es la carencia de agentes satisfactorios para inducir inmunotolerancia en el receptor con efecto al injerto u órgano trasplantado. Cuando las células alogénicas u órganos son trasplantados en un anfitrión (es decir el donante y el receptor son individuos diferentes de las mismas especies) , el sistema inmune anfitrión similar en montaje de una respuesta inmune a antígenos extraños en el trasplante (anfitrión contra enfermedad de injerto) llevando a la destrucción del tejido trasplantado. En otro aspecto, la invención es un método para diagnosticar si un individuo tiene cáncer, que comprende determinar si existe expresión de EphA2 en células seleccionadas del individuo, caracterizado porque la expresión de EphA2 en dichas células es un indicativo de dicho cáncer. En algunas modalidades, la expresión del EphA2 está determinada utilizando un anticuerpo anti-EphA2. En algunas modalidades, el método involucra detectar el nivel de expresión de EphA2 de las células. El término "detección" como se utiliza aquí incluye detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia o un control . En todavía otro aspecto, la invención es un método de diagnóstico del cáncer en un individuo al detectar el EphA2 liberado de células del individuo, caracterizado porque el cáncer es seleccionado del grupo que incluye pero no se limita a tumores de glándula adrenal, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma de la parte suave alveolar, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de célula transicional) , cáncer de hueso (adamantinoma, cistos de hueso aneurismal, osteocondroma, osteosarcoma) , cánceres del cerebro y de la médula espinal, tumores metastáticos de cerebro, cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosarcoma, dordoma, carcinoma de célula renal cromófoba, carcinoma de célula clara, cáncer de colon, cáncer colorectal, histiocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores de células redondas pequeñas desmoplásticas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extra esqueletal, ossium imperfecta de fibrogénesis, displasia fibrosa del hueso, cánceres del ducto de la vejiga y de la bilis, enfermedad trofoblástica gestacional, tumores de las células germen, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células islet, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma celular renal papilario) , leucemias, tumores lipomatosos de lipoma/ benignos, liposarcoma / tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepato celular), linfomas, cánceres de pulmón (carcinoma de célula pequeña) , Adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula grande, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas , neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplástico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cánceres de ovario, cánceres pancreáticos, carcinomas de tiroides papilaria, tumores paratiroides, cánceres pediátricos, tumores de la pantalla de nervios periférica, facromositoma, Tumores de pituitaria, cánceres de próstata, melanoma desvelada posterior, desórdenes hematológicos raros, cáncer metastático renal, tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido suave, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastático de tiroides, y cánceres uterinos (carcinoma de la cerviz, carcinoma endometrial, y leiomioma). En otro aspecto, la invención es un método para ayudar al diagnóstico del cáncer (tal como pero sin limitarse a cáncer de los ovarios, del pulmón, de la próstata, pancreático, del colon, o del pecho) en un individuo que comprende determinar la expresión del EphA2 en una muestra biológica del individuo. En algunas modalidades, la expresión del EphA2 está determinada utilizando un anticuerpo anti-EphA2. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-EphA2 es un miembro de la familia específicamente nombrado aquí. En algunas modalidades, el método es detectar el nivel de la expresión de EphA2 de las células. Todavía en otro aspecto, la invención es un método para tratar el cáncer a través de la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se une al EphA2 suficiente para reducir el crecimiento de la célula cancerosa. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo anti-EphA2. En ciertas modalidades, las células cancerosas son seleccionadas del grupo que incluye pero sin limitarse a tumores de glándula adrenal, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma de la parte suave alveolar, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de célula transicional) , cáncer de hueso (adamantinoma, cistos de hueso aneurismal, osteocondroma, osteosarcoma) , cánceres del cerebro y de la médula espinal, tumores metastáticos de cerebro, cáncer de mama, tumores del cuerpo carótido, cáncer cervical, condrosarcoma, dordoma, carcinoma de célula renal cromófoba, carcinoma de célula clara, cáncer de colon, cáncer colorectal, histiocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores de células redondas pequeñas desmoplásticas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extra esqueletal, ossium imperfecta de fibrogénesis, displasia fibrosa del hueso, cánceres del ducto de la vejiga y de la bilis, enfermedad trofoblástica gestacional, tumores de las células germen, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células de isleta, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon (nefroblastoma, carcinoma celular renal papilario) , leucemias, tumores lipomatosos de lipoma/benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, cánceres de pulmón (carcinoma de célula pequeña) , Adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula grade, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas , neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplástico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos , cánceres de ovario, cánceres pancreáticos, carcinomas de tiroides papilaria, tumores paratiroides, cánceres pediátricos, tumores de la pantalla de nervios periférica, facromositoma, Tumores de pituitaria, cánceres de próstata, melanoma desvelada posterior, desórdenes hematológicos raros, cáncer metastático renal, tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas del tejido suave, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastático de tiroides, y cánceres uterinos (carcinoma de la cerviz, carcinoma endometrial, y leiomioma) . En ciertas modalidades preferidas, las células cancerosas son seleccionadas del grupo de tumores sólidos incluyendo pero sin limitarse a cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, sarcoma, cáncer metastático renal, cáncer metastático de tiroides, y carcinoma de células claras. Todavía en otro aspecto, la invención es un método para retardar el desarrollo de la metástasis en un individuo que tiene cáncer que comprende administrar una cantidad efectiva de por lo menos uno de una familia de anticuerpos que se une específicamente al EphA2. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-EphA2. En otro aspecto, la invención es un método para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células de cáncer in vi tro o en un individuo que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo anti-EphA2 asociado con (incluyendo unido a) un agente quimioterapéutico al cultivo celular o a la muestra, o al individuo. Todavía en otro aspecto, la invención es un método para suministrar un agente terapéutico a una célula cancerosa en un individuo al administrar al individuo una cantidad efectiva de por lo menos un miembro de una familia de anticuerpos, que se unen específicamente al EphA2. En otras modalidades, un anticuerpo anti-EphA2 es suministrado a un individuo en combinación con (incluyendo unido a) otro agente terapéutico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-Eph_A2 es un anticuerpo humanizado derivado de un miembro de la familia de anticuerpos nombrada aquí (generalmente, pero no necesariamente, comprende uno o más CDR parciales o intactos del anticuerpo) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-EphA2 es un anticuerpo humano con una o más propiedades del miembro de la familia de anticuerpos nombrada. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico (tal como una toxina o una molécula radioactiva) es suministrado dentro de las células cancerosas (es internalizado) . En algunas modalidades, el agente es saporina. En otro aspecto, la invención es un método de tratar cáncer en un individuo que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo anti-EphA2 asociado con (incluyendo unido a) un agente quimioterapéutico al individuo) .
La presente invención suministra adicionalmente métodos para modular, sea mediante mejorar o reducir, la asociación del EphA2 con el socio de señalización citoplásmica. La asociación del EphA2 con el socio de señalización citoplásmica puede ser impactado mediante poner en contacto una molécula de EphA2 que presenta sobre una superficie de células, con una agente que modula el unido del socio de señalización al EphA2. Los agentes que bloquean o reducen la asociación de EphA2 con sus socios de unido y/o señalización puede ser utilizados para modular procesos biológicos y patológicos que se encuentran involucrados en las respuestas de inflamación o inmune mediadas por el EphA2. Los procesos patológicos que involucran esta acción incluyen crecimiento celular asociado con tumores. Los agentes pueden ser ensayados en cuanto a su habilidad para bloquear, reducir, mejorar o de otra manera modular la asociación del EphA2 con su socio de unido, tal como un anticuerpo anti-EphA2. Específicamente, una agente puede ser ensayado en cuanto a la habilidad para modular iteración mediante incubar un péptido que comprende el sitio de interacción del EphA2 (típicamente en su conformación nativa tal como existe sobre las células vivientes intactas) con un socio de unido y un agente de ensayo, y determinar si el agente de ensayo reduce o mejora el unido del socio unido al péptido EphA2. Agonistas, antagonistas, y otros, moduladores son contemplados expresamente. En ciertos aspectos, la invención es un método para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad en un individuo que comprende las etapas de (i) ensayar la presencia del EphA2 en una muestra de sangre o de tejido obtenida de un individuo; (ii) detectar si dicha muestra tiene una cantidad incrementada de un marcador EphA2 relativo a una muestra de sangre o tejido normal (no enferme y (iii) correlacionar una cantidad incrementada de dicho marcador a un diagnóstico positivo o correlacionar la ausencia de una cantidad incrementada de dicho marcador a un diagnóstico negativo para la enfermedad. En ciertas modalidades, el marcador es detectado utilizando un anticuerpo anti-EphA2. En ciertas modalidades, el método es efectuado mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste de producción de imágenes radio núcleos, citometría de flujo, e inmunohistoquímica. En otro aspecto, la invención es un método para diagnosticar cáncer o cáncer metastático en un individuo al detectar EphA2 en las células del individuo utilizando el anticuerpo anti.-EphA2 o cualquier parte de unido del EphA2 (polipéptidos, que incluyen, pero no se limitan a, diversos anticuerpos y derivados de anticuerpos) descritos aquí. En algunas modalidades, el cáncer es melanomas, de pecho, de colon, de pulmón y de próstata. En algunas modalidades, el método en detectar el nivel de EphA2 de las células. La presencia del EphA2 es detectada mediante detectar un complejo entre EphA2 y una parte de unido del EphA2. El término "detección" como se utilizó aquí incluye detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia a un control. En otro aspecto, la invención es un método para tratar el cáncer mediante la administración de una cantidad efectiva de una composición que comprende el anticuerpo anti-EphA2 , o cualquiera de los anticuerpos (incluyendo polipéptido) o polinucleótidos de las modalidades descritas aquí, incluyendo pero sin limitarse al anticuerpo anti-EphA2 asociado con un agente terapéutico, un anticuerpo que comprende un fragmento o una región del anticuerpo anti-. EphA2 , un anticuerpo humanizado (generalmente, pero no necesariamente, comprende uno o más CDR del anticuerpo anti-EphA2) , un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA2 y regiones constantes derivadas de las regiones constantes de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humano con una o más propiedades del anticuerpo anti-EphA2, suficiente para reducir el crecimiento de células cancerosas. En algunas modalidades, el cáncer es melanomas, de pecho, de colon, de pulmón, o de próstata. En ciertas modalidades, la invención es un método para tratar el cáncer en un paciente, dicho método comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo EphA2 que se une específicamente al EphA2, y tiene por lo menos uno, y preferiblemente dos o más, de las siguientes características de SPll, LUCA19, SG5, o LUCA40 : a. la habilidad para unirse a EphA2 en una célula de cáncer; b. la habilidad para unirse a una porción del EphA2 que está expuesta sobre la superficie de una célula de cáncer viviente in vi tro o in Vivo; c. la habilidad para impedir la proliferación de células de tumor sin incrementar el contenido de fosfotirosina del EphA2 ; d. la habilidad para suministrar un agente terapéutico o un marcador detectable a una célula de cáncer que expresa el EphA2 ; y e. la habilidad para suministrar un agente terapéutico o marcador detectable dentro de una célula de cáncer que expresa el EphA2. En otro aspecto, la invención es un método para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas en un individuo al administrar al individuo una cantidad efectiva de una composición que comprende el anticuerpo anti-EphA2, o cualquiera de los anticuerpos (incluyendo polipéptidos) o modalidades de polinucleótidos descritas aquí, incluyendo pero sin limitarse al anticuerpo anti-EphA2 asociado con un agente terapéutico, un anticuerpo que comprende un fragmento o una región del anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo humanizado (generalmente, pero no necesariamente, comprende uno o más CDR del anticuerpo anti-EphA2) , un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA2 y regiones constantes derivadas de las regiones constantes de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humano con una o más propiedades del anticuerpo EphA2, suficiente para reducir el crecimiento de las células cancerosas. En algunas modalidades, el cáncer es melanomas de pecho, de colon, de pulmón, o de próstata. En otro aspecto, la invención es un método para prevenir o retardar el desarrollo de la metástasis, tratar el cáncer metastático, o inhibir la proliferación de células de cáncer metastático en un individuo con cáncer al administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende el anticuerpo anti-EphA2, o cualquiera de los anticuerpos (incluyendo polipéptidos) o modalidades de polinucleótidos descritos aquí, incluyendo pero sin limitarse a el anticuerpo anti-EphA2 asociado con un agente terapéutico, un anticuerpo que comprende un fragmento o una región del anticuerpo anti-EphA2 o un anticuerpo humanizado (generalmente, pero no necesariamente, comprende uno o más CDR del anticuerpo anti- EphA2 , un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA2 y regiones constantes derivadas de las regiones constantes de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humano con una o más propiedades del anticuerpo anti-EphA2, suficiente para reducir el crecimiento de células cancerosas. En algunas modalidades, el cáncer es melanomas, de pecho, de colon, de pulmón, o de próstata. En otro aspecto, la invención es un método para suministrar un agente terapéutico (tal como una toxina, o una molécula radiactiva) a células cancerosas en un individuo por medio de la administración al individuo de una cantidad efectiva de un anticuerpo de unido EphA2 o cualquier parte de unido del EphA2 (polipéptidos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos o derivados de anticuerpos) descritos aquí que son unidos a un agente terapéutico (tal como una toxina o una molécula radiactiva) . La parte de unido del EphA2 incluye, pero no se limita al anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo que comprende un fragmento o una región del anticuerpo anti-EphA2, o un anticuerpo humanizado (generalmente, pero no necesariamente, comprende una o más CDR del anticuerpo anti-EphA2) , un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables derivadas de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA2 y regiones constantes derivadas de las regiones constantes de un anticuerpo humano, o un anticuerpo humano con una o más propiedades del anticuerpo anti-EphA2. En algunas modalidades, las células cancerosas son de melanomas, de pecho, de colon, de pulmón, o de próstata. En otra modalidad, el agente terapéutico (tal como una toxina o una molécula radiactiva) es suministrada dentro de las células cancerosas (es internalizado) . De acuerdo a lo anterior, la invención suministra métodos para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células de cáncer tal que el agente terapéutico es suministrado dentro de aquellas células de cáncer. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los resultados de xenoinjertos de tumor A549 tratados subcutáneamente con SPL1 y su recrecimiento lento después de la cesación de la dosis. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención descrita aquí suministra anticuerpos y polipéptidos que se unen a un antígeno, EphA2 y métodos para hacer y usar estos anticuerpos y polipéptidos para el diagnóstico y el tratamiento de diversas enfermedades de cánceres humanos asociados con la expresión y/o la sobre expresión del EphA2. El EphA2 ha mostrado que está presente y su expresión es incrementada en una variedad de cánceres humanos. Los anticuerpos anti-EphA2 tal como aquellos producidos por cualquiera una de las células anfitrionas identificadas en el siguiente parágrafo han sido generados y han mostrado que se unen específicamente al EphA2. De acuerdo con el tratado de Budapest, el hibridoma que produce mLUCA19 ha sido depositado en el Colección del Cultivo de Tipo Americano (ATCC, por sus siglas en inglés) 10801 en la Universidad Boulevard, Manassas VA 20110-2209 en Marzo 20, de 1993 con una designación de depósito de patente del PTA-5070, el hibridoma que produce el SPL1 ha sido depositado en el Colección del Cultivo de Tipo Americano (ATCC) en Junio 8, 2004 con una designación de depósito de Patente del PTA-6059, el hibridoma que produce el LUCA40 ha sido depositado en el Colección del Cultivo de Tipo Americano (ATCC) en Junio 8, 2004 con una designación de depósito de Patente del PTA- 6056, y el hibridoma que produce el SG5 ha sido depositado en el Colección del Cultivo de Tipo Americano (ATCC) en Febrero 2, 2006 con una designación de depósito de Patente del PTA-XXXX. I. Técnicas generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro del estado de la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual , segunda edición (Sambrook y otros, 1989) Cold Spring Harbor Press ; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed. , 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed. , 1998) Academia Press; Animal Cell Cul ture (R.l. Fresheney, ed. , 1987); Introduction to Cell and Tissue Cul ture (J.P. Mather and P. E. Roberts, 1998)Plenun Press; Cell and Tissue Cul ture : Laboratory Procedures (?.Doyle, J.B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and sons ; Methods in enzimology (Academic Press, Ine); Handbook of Experimental Innunology (O . M. Weir y C.C. Blackwell, eds) ; Gene Transfer Vectors for Mammalians Cells (J.M. Millar and M.P. Calos, eds., 1987); Current protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel y otros, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís y otros, eds., 1994); Current Protocols in Immunology K(J . E. Counen y otros, eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ; Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies : a practical approach (D. Catty., ed. , IRL Press, 1988-1989; Monoclonal Antibodies : a practical approach (P.Shepard y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) ; Using Antibodies : A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The antibodies (M.Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academia Publishers, 1995) ; y Cáncer: Principies and Practic of Oncology (V.T. DeVita y otros, eds., J.B. Lippincott Company, 1993) .
JJ. Definiciones El EphA2 se refiere a ese antígeno de polipéptido con un peso molecular de aproximadamente 130 KD, contra el cual los anticuerpos de la presente invención están dirigidos. Como se describió en más detalle aquí, este antígeno tiene más de un epítopo diferente. Algunas de las modalidades de anticuerpo preferidas de esta invención están dirigidas contra uno de dos o más epítopos específicos del antígeno EphA2. Se cree actualmente que el EphA2 está sobre expresado en ciertas células de cáncer en combinación con sus contra partes de tejido normal. Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de la unión especifica a un objetivo, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc.; mediante por lo menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utilizó aquí, el término involucra no solamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de ellos (tal como Fab, Fab', F(ab') , Fv) , cadena única (ScFv), mutantes de ellos, variantes que ocurren naturalmente, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida. El término "anticuerpo monoclonal" involucra no solamente los anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de ellos (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , cadena única (ScFv), mutantes de ellos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la habilidad para unirse a un antígeno. No sucede el propósito de limitarse con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en la cual está hecho (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de Fago, expresión recombinante, ademanes transgénicos, etc. Anticuerpos "humanizados" se refieren a una molécula que tiene un sitio de unido de antígeno que es sustancialmente derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y el resto de la estructura de inmunoglobulina de la molécula con base en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unido de antígeno puede comprender en dominios variables completos fundidos en dominios constantes o solamente las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones de estructura apropiadas en los dominio variables. Los sitios de unido de antígeno pueden ser del tipo silvestre o modificado por uno o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, modificado para parecerse a la inmunoglobulina lo más cercanamente posible. Algunas formas de anticuerpos humanizados preservan todas las secuencias CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene todas las CDR de los anticuerpos del ratón) . Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (1, 2, 3, 4, 5,6) que son alterados con respecto al anticuerpo original, lo que también se llamó uno o más CDR "derivados de" uno o más CDR de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. "Anticuerpos quiméricos" se refiere a aquellos anticuerpos caracterizados porque una porción de cada uno de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y livianas es homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenezcan a una clase particular, mientras que el resto del segmento de las cadenas es homólogo para las secuencias correspondientes en otro. Típicamente, en estos anticuerpos quiméricos, la región variable tanto de las cadenas pesadas como livianas imitan las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homologas a las secuencias en anticuerpos derivados de otro. Una ventaja clara de tales formas quiméricas, es que, por ejemplo, las regiones variables pueden ser derivadas convenientemente de fuentes actualmente conocidas utilizando hibridomas o células B fácilmente disponibles de organismos anfitriones no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Aunque la región variable tiene la ventaja de la facilidad de preparación, y la especificidad no es afectada por su fuente, la región constante siendo humana, es menos probable de producir una respuesta inmune de un sujeto humano cuando los anticuerpos son inyectados que si la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no está limitada a este ejemplo particular. Un epítopo que "une específicamente" o "une preferencialmente" (usado de manera intercambiable aquí) a un anticuerpo o a un polipéptido es un término bien entendido en la técnica, y los métodos para determinar tal unido específico o preferencial también son bien conocidos en la técnica. Una molécula se dice que exhibe "unido específico" o "unido preferencial" si esta reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que lo que lo hace con células alternativas o sustancias alternas . Un anticuerpo "se une específicamente" o "se une preferencialmente" a un objetivo si este se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración que lo que se une con otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que específicamente o preferencialmente se une a un epítopo de EphA2 es un anticuerpo que se une a este epítopo EphA2 con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración que de lo que se une con otro epítopo de EphA2 o epítopos que no son EphA2. También es entendido por la lectura de esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o parte o epítopo) que se une específicamente o preferencialmente a un primer objetivo puede o no unirse específicamente o preferencialmente a un segundo objetivo. Como tal, "el unido específico" o "el unido preferencial" no necesariamente requiere (aunque puede incluir un unido exclusivo) . Generalmente, pero no necesariamente se refiere a unido de medios por unido preferencial. El término "inmunológicamente activo" en referencia a un epítopo que es o "permanece activo inmunológicamente" se refiere a la habilidad de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-EphA2 para unirse al epítopo bajo condiciones diferentes, por ejemplo, después de que el epítopo ha sido sometido a reducción y a condiciones de desnaturalización. Como se utilizó aquí, los términos "LUCA19, SPL1, LUCA40, o SG5" , "anticuerpo anti-EphA2" y "anticuerpo anti-EphA2 monoclonal "son utilizados de manera intercambiable para referirse a inmunoglobulina producida por cualquiera de las células anfitriones con un número de depósitos de ATCC número PTA-5070, PTA-6056, o PTA-6059, o la célula anfitriona SG, 3.15 B4, 1F9 (ATCC número PTA.-XXXX) o su progenie. Diferentes funciones biológicas están asociadas con LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, incluyendo, pero sin limitarse a, la habilidad para unirse al EphA2 ; la habilidad para unirse al dominio extra celular del EphA2 ; la habilidad para unirse al EphA2 en células de cáncer expuestas sobre la superficie de una célula viva in vi tro o in Vivo; la habilidad para suministrar un agente quimioterapéutico a células cancerosas 8tal como células de cáncer de ovario, próstata, pancreático, de pulmón, de colon, o de pecho) que expresan el EphA2; la habilidad para suministrar un agente terapéutico o un marcador detectable en células de cáncer que expresan EphA2. Como se discutió aquí, los polipéptidos (incluyendo anticuerpos) de la invención pueden tener cualquier de una o más de estas características. Un "anticuerpo equivalente anti-EphA2" o "polipéptido equivalente a anti-EphA2" se refiere a un anticuerpo o a un polipéptido que tiene una o más funciones biológicas asociadas con un anticuerpo anti-EphA2, tal como, por ejemplo, especificidad en el unido. Como se utilizó aquí, "agentes" se refiere a un compuesto biológico, farmacéutico, o químico. Ejemplos no limitativos incluyen moléculas simples o complejas orgánicas o inorgánicas, un péptido, una proteína, un oligonucleótido, un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un derivado de vitamina, un carbohidrato, una toxina, o un compuesto quimioterapéutico. Diversos compuestos pueden ser sintetizados, por ejemplo, moléculas pequeñas y oligómeros (por ejemplo, oligopéptidos y oligonucleótidos) , y compuesto orgánicos sintéticos con base en diversas estructuras de núcleo. En adición, varias fuentes naturales pueden suministrar compuestos para tamizar, tal como extractos de plantas o animales, y similares, un artesano versado puede fácilmente reconocer que no existe límite en cuanto a la naturaleza estructural de los agentes de la presente invención. Los agentes que son empleados en los métodos de esta invención pueden ser seleccionados aleatoriamente o seleccionados racionalmente o diseñados. Como se utilizó aquí, un agente se dice que es seleccionado aleatoriamente cuando el agente es escogido aleatoriamente sin considerar las secuencias específicas involucradas en la asociación de EphA2 con sus socios de unido nativos o anticuerpos conocidos. Un ejemplo de agentes seleccionados aleatoriamente es el uso de una librería química o de una librería combinatoria de péptidos . Como se utilizó aquí, un agente se dice que es seleccionado racionalmente o diseñado cuando el agente es escogido sobre una base no aleatoria que tiene en cuenta la secuencia del sitio objetivo y/o su conformación en conexión con la acción del agente. Con respecto a agentes anti-EphA2, actualmente se cree que existe por lo menos tres epítopos en el EphA2 contra los cuales los anticuerpos pueden ser conseguidos y por lo tanto en por lo menos tres sitios de acción para los agentes que bloquean la interacción EphA2/anti-EphA2. Esta invención también involucra agentes que actúan en los sitios de interacción entre el EphA2 y su socio de unido nativo, aunque otros ligandos y sus sitios interactivos de EphA2 activos están también involucrados dentro del alcance de esta invención, sea que san conocidos actualmente o que sean identificados posteriormente. Los agentes pueden ser seleccionados racionalmente o diseñados racionalmente mediante el uso de las secuencias de péptido que forma los sitios de contacto del complejo de receptor/ ligando y/o EphA2/anticuerpo anti-EphA2. Por ejemplo, un agente de péptido seleccionado racionalmente puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a un epítopo que aparece en el EphA2 tal como está expuesto en la superficie de una célula viva en su ambiente nativo. Tal agente reducirá o bloqueará la asociación del anticuerpo anti-EphA2 con el EphA2 , o la asociación del EphA2 con su ligando nativo, como se deseó mediante unirse al anticuerpo anti-EphA2 o al ligando nativo. Como se utilizó aquí, el término "marcado", con respecto al anticuerpo, tiene el propósito de involucrar el marcado directo del anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, unido físico) a una sustancia detectable, tal como un agente radioactivo o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) ) al anticuerpo, lo mismo que un marcado indirecto de la probeta o del anticuerpo mediante la reactividad con una sustancia detectable . Como se utilizó aquí, el término "asociación", con respecto al anticuerpo, incluye una sujeción o unido covalente y no covalente a un agente (por ejemplo un agente quimioterapéutico) . El anticuerpo puede estar asociado con un agente (por ejemplo agente quimioterapéutico) mediante unido directo o unido indirecto vía la sujeción a una plataforma común, tal que el anticuerpo dirige la localización del agente a la célula cancerosa a la cual el anticuerpo se une y caracterizado porque el anticuerpo y el agente no disocian sustancialmente bajo condiciones fisiológicas de modo que el agente no es objetivado en la misma célula cancerosa a la cual el anticuerpo se une o tal que la potencia del agente no se disminuya. Una "muestra biológica" involucra una variedad de tipos de muestra obtenidos de un individuo y pueden ser utilizados en un ensayo de diagnóstico o de monitoreo. La definición involucra sangre y otras muestras líquidas de Orion biológico, muestras de tejido sólido tal como especímenes de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de ellos, y la progenie de ellos, por ejemplo, células obtenidas de una muestra de tejido recolectada de un individuo que se sospecha que tiene cáncer, en modalidades preferidas de tejidos de ovarios, de pulmón, próstata, páncreas, colon, y seno. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier manera después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento de ciertos componentes, tal como proteínas o polinucleótidos, o en bebidas en una matriz semisólida o sólida para propósitos de seccionamiento. El término "muestra biológica" involucra una muestra clínica, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes de células, lisatos celulares, suero, plasma, tejido biológico, y muestras de tejidos. Los términos "polipéptido, "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable aquí para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por ácidos no amino. Los términos también involucran un polímero de aminoácido que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, la formación del enlace de disulfuro, glicosilación, lapidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcado. También se han incluido dentro de la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contiene uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), lo mismo que otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención se basan en un anticuerpo, los polipéptidos pueden ocurrir como cadenas únicas o cadenas asociadas. Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena liviana del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, sea sola o en combinación. Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena liviana del anticuerpo o a la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, sea sola o en combinación. Como se utilizó aquí "sustancialmente puro" se refiere a material que está por lo menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes) , más preferiblemente por lo menos 90% puro, más preferiblemente por lo menos 95% puro, más preferiblemente por lo menos 98% puro, más preferiblemente por lo menos 99% puro. Una "célula anfitriona" incluye una célula individual o cultivo celular que puede estar o ha estado en un recipiente para vectores con el objeto de la incorporación de los insertos de polinucleótido. Las células anfitriones incluyen la progenie de una célula anfitriona única, y la progenie puede que no necesariamente sea completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula pariente original debido a mutación, accidental o deliberada. Una célula anfitriona incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido o polinucleótidos de esta invención. Como se utilizó aquí, "retardar el desarrollo de la metástasis" significa diferir, esconder, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la metástasis. Este retardo puede tener longitudes variables de tiempo, dependiendo de la historia del cáncer y/o el individuo a ser tratado. Como es evidente para una persona versada en la técnica, un retardo suficiente o significativo puede, en efecto involucrar la prevención, en que el individuo no desarrolle la metástasis. Una "cantidad efectiva" de un fármaco, compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar resultados benéficos o deseados incluyendo, sin limitación, resultados clínicos tales como encogimiento del tamaño del tumor (en el contexto del cáncer, por ejemplo, cáncer de pecho o de próstata) , retardación del crecimiento celular canceroso, retardación del desarrollo de la metástasis, disminución de uno o más de los síntomas resultantes de la enfermedad, incremento en la calidad de vida de aquellos que sufren de la enfermedad, disminución de la dosis de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, mejoramiento del efecto de otra mediación tal como vía objetivado y/o internalización, retardado de la progresión de la enfermedad, y/o prolongación de la supervivencia de los individuos. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. Para propósitos de esta invención, una cantidad efectiva de la droga, compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para reducir la proliferación de (o destruir) células neoplásticas y/o reducir y/o retardar el desarrollo, o crecimiento, de metástasis de células neoplásticas, sea directa o indirectamente. Como se entendió en el contexto clínico del cáncer, una cantidad efectiva de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no lograrse en conjunto con otro fármaco, compuesto, o composición farmacéutica. Así, una "cantidad efectiva" puede ser considerada en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y un agente único puede ser considerado que se da en una cantidad efectiva si, en conjunto con uno o más de otros agentes, un resultado deseable puede ser o es logrado. Como se utilizó aquí, "tratamiento" o "tratar" es un modelo para obtener resultados benéficos o deseados incluyendo resultados clínicos preferiblemente. Para propósitos de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) células neoplásticas, reducir la metástasis de células neoplásticas encontradas en los cánceres, encogimiento del tamaño del tumor, disminución de los síntomas resultantes de la enfermedad, incremento de la calidad de vida de aquellos que sufren de la enfermedad, disminución de la dosis de otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, retardación del progreso de la enfermedad y/o prolongación de la supervivencia de los pacientes . Como se utilizó aquí, "retardar el desarrollo de la metástasis" significa diferir, esconder, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de la metástasis. Este retardo puede ser de longitud variable en el tiempo, dependiendo de la historia del cáncer y/o del individuo a ser tratado. Como es evidente para aquellos versados en la técnica, un retardo suficiente o significativo puede, por ejemplo, puede, en efecto, involucrar la prevención, en que el individuo no desarrolle la metástasis. Una "muestra biológica" involucra una variedad de tipos de muestras obtenidas de un individuo que pueden ser utilizadas en ensayos de diagnóstico o de monitoreo. La definición involucra sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como especímenes de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de ellos, y la progenie de ellos. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier manera después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización, o enriquecimiento en cuanto a ciertos componentes, tal como proteínas y polinucleótidos, o embebidos en una matriz semisólida o sólida para propósitos de seccionamiento. El término "muestra biológica" involucra una muestra clínica, y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico, y Muestras de tejido. Un "individuo" es un vertebrado (preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano) . Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a animales de fincas, animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros, caballos), primates, ratas y ratones. "Toxina" o "citotoxina" se refiere a cualquier sustancia, que efectúa una respuesta adversa dentro de una célula. Por ejemplo, una toxina dirigida a una célula cancerosa podría tener un efecto adverso algunas veces de deterioro, sobre la célula cancerosa.
Como se utiliza aquí "agente" se refiere a un compuesto biológico, farmacéutico o químico. Ejemplos no limitativos incluyen moléculas simples o complejas orgánicas o inorgánicas, un péptido, una proteína, un oligonucleótido, un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo. Diversos compuestos pueden ser sintetizados, por ejemplo, moléculas pequeñas y oligómeros (por ejemplo oligopéptidos y oligonucleótidos) , y compuestos orgánicos sintéticos con base en diversas estructuras de núcleo. En adición, diversas fuentes naturales pueden suministrar compuestos para tamizado, tal como extractos de plantas o animales y similares. Como se utilizó aquí, un "agente terapéutico" significa cualquier agente útil para terapia (aquí, generalmente en el contexto del cáncer) incluye fármacos antitumor, toxinas o citotoxinas, agentes de citotoxinas, y agentes radiactivos. "Respuesta inmune activa" se refiere al desarrollo de, y al establecimiento de la producción de, anticuerpos in vivo dirigidos contra un antígeno, en respuesta a la administración del antígeno, o a vectores de ADN que codifican para ese antígeno, al mamífero anfitrión mediante administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o de otro modo con o sin un adyuvante. La respuesta inmune activa también puede incluir otros aspectos de la respuesta inmune, tal como respuesta inmune celular. Composiciones y métodos para hacer las composiciones Esta invención involucra composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos, polipéptidos y proteínas que se unen al EphA2, y polinucleótidos que comprende secuencias que codifican anticuerpos, polipéptidos y proteínas que se unen al EphA2. Como se utilizó aquí, las composiciones comprenden uno o más anticuerpos, polipéptidos y/o proteínas que se unen al EphA2, y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos, polipéptidos y proteínas que se unen al EphA2. Estas composiciones pueden comprender adicionalmente excipientes adecuados, tal como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen reguladores de pH, que son bien conocidos en la técnica. La presente invención también involucra diversas formulaciones de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, y anticuerpos equivalentes o fragmentos de polipéptido (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv) , anticuerpos quiméricos, cadenas únicas (ScFv) , mutantes de ellos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, que comprenden un antígeno (EphA2), sitio de reconocimiento de la especificidad requerida. La invención también suministra anticuerpos humanos que muestran uno o más características biológicas del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Los anticuerpos equivalentes de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, (incluyendo anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos) , fragmentos de polipéptido de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, y polipéptidos que comprenden cualquiera de estos fragmentos son identificados y caracterizados mediante una o más características del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En algunas modalidades, los anticuerpos, polipéptidos y proteínas de la invención que se unen al EphA2 son anticuerpos, polipéptidos y proteínas que inhiben competitivamente el unido preferencial del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, al EphA2 o que se unen preferencialmente al mismo epítopo en el EphA2 que el anticuerpo anti-EphA2 preferencialmente une. De acuerdo a lo anterior, la invención suministra cualquiera de lo siguiente (o composiciones que incluyen composiciones farmacéuticas) , que comprenden cualquiera de las siguientes: (a) anticuerpo anti-EphA2 producido por la célula anfitriona con un número de depósito de ATCC No. PTA-5070, PTA-6056 o PTA-6059 o la célula anfitriona SG.3.15.B4.1F9 (PTA-XXXX) o su progenie; (b) una forma humanizada del anticuerpo anti-EphA2; (c) un anticuerpo que comprende uno o más de la cadena liviana y/o la cadena pesada de las regiones variables del anticuerpo anti-EphA2; (d) un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables homologas o derivadas de las regiones variables de una cadena pesada y una cadena liviana del anticuerpo anti-EphA2, y regiones constantes homologas o derivadas de las regiones constantes de una cadena pesada y de una cadena liviana de un anticuerpo humanos; (e) un anticuerpo que comprende uno o más de la cadena liviana y/o la cadena pesada de los CDR (por lo menos 1, 2, 3, 4,5,6 ) de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40; (f) un anticuerpo que comprende una cadena pesada y/o liviana de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, (g) un anticuerpo humano que es equivalente a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Una forma humanizada del anticuerpo puede o no tener CDR idénticos a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, o anticuerpo producido por la célula anfitriona con un número de depósito de ATCC No. PTA-5070, PTA-6056 o PTA-6059 o la célula anfitriona SG.3.15.B4.1F9 (ATCC No. PTA-XXXX) . La determinación de las regiones CDR está dentro de la experiencia de la técnica. En algunas modalidades, la invención suministra un anticuerpo que comprende por lo menos un CDR que es sustancialmente homólogo a por lo menos un CDR, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco CDR de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 (o, en algunas modalidades sustancialmente homólogo a todos los seis CDR de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o derivado de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40) , o anticuerpo producido por la célula anfitriona con un número de depósito de ATCC No. PTA-5070, PTA-6056 o PTA-6059 o la célula anfitriona SG.3.15.B4.1F9 (ATCC No. PTA-XXXX) . Otras modalidades incluyen anticuerpos que tienen por lo menos 2, 3, 4,5, o 6 CDR que son sustancialmente homólogos a por lo menos 2, 3, 4,5 o 6 CDR de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o derivados de LUCA1 , SPL1, SG5 o LUCA40, o anticuerpos producidos por la célula anfitriona con un número de depósito de ATCC No. PTA-5070, PTA-6056 o PTA-6059 o la célula anfitriona SG.3.15.B4.1F9. Se entiende que, para propósitos de esta invención, la especificidad de unido y/o la actividad general (que puede darse en términos de reducción del crecimiento y/o proliferación de células cancerosas, inducción de muerte de células apoptóticas en la célula de cáncer, retardo en el desarrollo de la metástasis, y/o tratamiento paliativo) es generalmente retenido, aunque el grado de actividad puede variar comparado al LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 (puede ser mayor o menor) . La invención también suministra métodos para hacer cualquiera de estos anticuerpos. Los métodos para hacer anticuerpos son conocidos en la técnica y son descritos aquí. La invención también suministra polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácido de los anticuerpos de la invención, tal como LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En algunas modalidades, el polipéptido comprende uno o más de las regiones variables de cadena liviana y/o cadena pesada del anticuerpo anti-EphA2. En algunas modalidades, el polipéptido comprende uno o más CDR de cadena liviana y/o cadena pesada de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En algunas modalidades, el polipéptido comprende tres CDR de la cadena liviana y/o cadena pesada del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 que tiene cualquiera de las siguientes: por lo menos cinco aminoácidos contiguos de una secuencia de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, por lo menos ocho aminoácidos contiguos, por lo menos cerca de diez aminoácidos contiguos, por lo menos cerca de quince aminoácidos contiguos, por los menos cerca de veinte de aminoácidos contiguos, por lo menos cerca de 25 aminoácidos contiguos, por lo menos cerca de 30 aminoácidos contiguos, caracterizado porque por lo menos tres de los aminoácidos son de una región variable del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En una modalidad, la región variable es de una cadena liviana de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En otra modalidad, la región variable es de una cadena pesada de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En otra modalidad los cinco (o más) aminoácidos contiguos son de una región determinante de complementariedad (CDR) del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Los anticuerpos pueden ser policlonales (por ejemplo, no homogéneos) o monoclonales. Los métodos para hacer anticuerpos monoclonales son conocidos en la técnica.
Un método que puede ser empleado es el método de Kholer y Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) o una modificación de este. En general, un ratón o rata es utilizado para la inmunización pero otros animales pueden también ser utilizados. El inmunógeno puede ser, peo no se limita a, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, ácidos nucleicos, tejidos, o péptidos. El EphA2 de longitud completad o cualquier fragmentos de EphA2 (por ejemplo, dominio extra celular) o células de cáncer que expresan el EphA2 son utilizadas como inmunógeno. Las células utilizadas para inmunógeno, por ejemplo, células de cáncer que expresan el EphA2 pueden ser cultivadas durante un periodo de tiempo (por lo menos 24 horas) antes de su uso como un inmunógeno. Las células pueden ser utilizadas como inmunógenos por ellos mismas o en combinación con adyuvantes no desnaturalizantes tal como Ribi. En general, las células deben mantenerse intactas y preferiblemente viables cuando son utilizadas como inmunógeno. Los métodos para generar anticuerpos que utilizan células intactas como inmunógeno se describen en WO 00/37503. Las células intactas puede permitir que los antígenos sean detectados mejor que las células rotas. En adición, los anticuerpos monoclonales generados utilizan células intactas como inmunógeno son más probablemente contra un determinante antigénico sobre la superficie celular o contra el dominio extra celular de un receptor de transmembrana. El uso de adyuvantes desnaturalizantes o de límite, por ejemplo, adyuvante de Froyd, puede romper las células y por lo tanto no se anima a usar. El inmunógeno puede ser administrado en múltiples tiempos a intervalos periódicos tal como bisemanalmente, o semanalmente, o puede ser administrado de tal manera que se mantenga la viabilidad en el animal (por ejemplo en un tejido recombinante) . Para monitorear la respuesta del anticuerpo, una muestra biológica pequeña (por ejemplo, sangre) puede ser obtenida del animal y ensayada en cuanto al título de anticuerpo contra el inmunógeno. El vaso y/o varios nodos linfáticos grades pueden ser removidos y disociados en células únicas. Si se desea, las células de vaso pueden ser tamizadas (después de la remoción de células adherentes no específicamente) mediante aplicar una suspensión celular a una placa o a un cavidad recubierto con el antígeno. Las células B, que expresan la inmunoglobulina de unión a membrana específica para el antígeno se unirán a la placa, y no se enjuagarán con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células de vaso disociadas, pueden entonces ser fundidas con células de mieloma (por ejemplo X63-AG8. 653 y aquellas del instituto Salk, Cell Distribution Center, San Diego, CA) . el polietilenglicol (PEG) puede ser usado para fundir vaso o linfocitos con células de mieloma para formar un hibridoma. El hibridoma es entonces cultivado en un medio selectivo (por ejemplo, hipoxantina, aminoterina, medio de timidina, u otros conocidos como "medio HAT"). Los hibridomas resultantes son entonces colocados en placas por dilución limitante, y son ensayados en cuanto a la producción de anticuerpos que se unen específicamente al inmunógeno (por ejemplo, la superficie de líneas celulares de cáncer, EphA2 , etc.) utilizando FACS, inmunohistoquímica (tamizado IHC) , y Western blot. Los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal seleccionado son entonces cultivados sea in vi tro (por ejemplo en botellas de cultivo de tejidos o reactores de fibra huecos) , o in Vivo (por ejemplo como ascitos en ratones) . Los métodos de cultivo de hibridoma bajo condiciones para generar el anticuerpo anti-EphA2 y purificar el anticuerpo son conocidos en la técnica. Los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal descritos anteriormente pueden ser seleccionados para producir anticuerpos que se unen preferencialmente al epítopo sobre EphA2 que el anticuerpo anti-EphA2 al cual el anticuerpo anti-EphA2 preferencialmente se une. Los métodos para seleccionar tales anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ensayos de composición de unido pueden ser usados para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo al cual lo hace LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Una composición de anticuerpo con LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 ara unirse el EphA2 indica que el anticuerpo se une preferencialmente al epítopo al cual LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 se une. Los ensayos de composición de unido son bien conocidos en la técnica. Los ensayos de composición de unido que pueden ser configurados en un número de formatos diferentes, utilizando sea antígeno marcado o anticuerpo marcado. Usualmente, el antígeno es inmovilizado en una placa de 96 cavidades, y la habilidad de desmarcar anticuerpos para bloquear el unido de los anticuerpos marcados es medida utilizando etiquetas de enzima o radioactivas. Los polipéptidos que se unen preferencialmente al epítopo el EphA2 al cual el anticuerpo anti-EphA2 se une preferencialmente también pueden ser ensayados e identificados utilizando métodos similares. Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, las células B inmortalizadas por EBV pueden ser utilizadas para producir anticuerpos monoclonales de la invención objeto. Los hibridomas son expandidos y subclonados, si se desea, y los sobrenadantes se ensayan en cuanto a actividad anti-inmunógenica, mediante procedimientos de ensayo convencional (por ejemplo, FACS, y IHC, radio inmunoensayo, inmunoensayo de enzima, inmunoensayo de fluorescencia, etc.). En otra alternativa, los anticuerpos pueden ser hechos de manera recombinante. Los métodos para hacer anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica. El anticuerpo monoclonal LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 y cualquier otro anticuerpo equivalente pueden ser secuenciados y producidos recombinantemente in vi tro . En una modalidad, el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 son secuenciados y la secuencia del polinucleótido es entonces clonada en un vector para la expresión o la propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede ser mantenida en un vector en una célula anfitriona y la célula anfitriona puede entonces ser expandida y congelados para usos futuros. En otra alternativa, los anticuerpos pueden ser hechos recombinantemente mediante tecnología de visualización de fagos. Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense números 5, 565, 332; 5, 580, 717; 5, 733, 743; 6, 265, 150; y Winter y otros, Annu. Rev. Inmunol. (1994)12: 433-455. En otra alternativa, el anticuerpo anti-EHPA2 o cualquiera otros anticuerpos o proteínas de interés pueden ser sometidos a secuenciación mediante degradación Edman, la cual es bien conocida por aquellos versados en la técnica. La información del péptido generada de la espectrometría de masa o la degradación de Edman puede ser utilizada para diseñar probetas o iniciadores que son utilizados para clonar la proteína de interés . Un método alterativo de clonar la proteína de interés es mediante "criba" utilizando el EphA2 para células que expresan el anticuerpo o la proteína de interés. El procedimiento "criba" es conducido mediante obtener una librería de ADNc de tejidos o células que expresan el anticuerpo o proteína de interés, sobre expresar los ADNc en un segundo tipo de célula, y tamizar las células transfectadas del segundo tipo de célula para un unido específico al EphA2. Descripciones detalladas de los métodos utilizados en la clonación de genes de mamíferos que codifican para las proteínas de la superficie celular mediante "criba" se pueden encontrar en la técnica. Ver, por ejemplo, Aruffo, A. y Seed, B. Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 84, 8573-8577 (1987) y Stephan J. y otros, Endocrinology 140: 5841-5854 (1999) . Los ADNc pueden ser obtenidos mediante trascripción inversa de los ARNm a partir de un tipo de célula particular de acuerdo con métodos estándar en la técnica. Específicamente, el ARNm puede ser aislado utilizando diversas enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con los procedimientos establecidos en Sambrook, y otros, Supra o extraídos mediante resinas de unido de ácido nucleico disponibles comercialmente siguiendo las instrucciones adjuntas provistas por los fabricantes (por ejemplo, Qiagen, Invitrogen, Promega) . Los ADNc sintetizados son entonces introducidos dentro de un vector de expresión para producir el anticuerpo o proteína de interés en las células de un segundo tipo. Está implicado que un vector de expresión debe ser replicable en las células anfitrionas sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen pero no se limitan a plásmidos, vectores virales, incluyendo adeno virus, virus asociados con adeno, retrovirus y cósmidos . Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden ser introducidos dentro de la célula anfitriona mediante cualquiera de un número de medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrina, u otras sustancias; bombardeo de micro proyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, donde el vector es un agente infeccioso tal como un virus de vacuna) . La escogencia de introducir vectores o polinucleótidos frecuentemente dependerá en los rasgos o características de la célula anfitriona. Cualquier células anfitrionas capaces de sobre expresar ADN heterólogos pueden ser utilizadas para el propósito de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o proteína de interés. Ejemplos no limitativos de células anfitrionas de mamíferos incluyen pero no se limitan a COS, HeLa, y células CHO. Preferiblemente, las células anfitrionas expresan los ADNc en un nivel de alrededor de 5 veces mayor, más preferiblemente 10 veces más alto, aún más preferiblemente 20 veces mayor que aquel del anticuerpo endógeno correspondientes o proteína de interés, si está presente, en las células anfitrionas. El tamizado de las células anfitriona para un unido específico al EphA2 se actuado mediante un inmunoensayo o FACS. Una célula que sobre expresa el anticuerpo o proteína de interés puede ser identificada. La invención incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácido de los anticuerpos de esta invención, tal como LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Los polipéptidos de esta invención pueden ser hechos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden ser producidos mediante degradación proteolítica u otra degradación de los anticuerpos, mediante métodos recombinantes (es decir polipéptidos únicos o de fusión) según se describió anteriormente o mediante síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente polipéptidos más cortos de hasta cerca de 50 aminoácidos, son convenientemente hechos mediante síntesis química. Los métodos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, un polipéptido LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 podría ser producido mediante un sintetizado de polipéptido automatizado empleando el método de fase sólida. La invención también involucra fragmentos de la región variable de cadena única ("ScFv") de los anticuerpos de esta invención, tal como LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Los fragmentos de región variable de cadena única son hechos mediante unirse las regiones variables de cadena liviana y/o pesad mediante el uso de un péptido de enlace corto. Bird et al (1998) Science 242: 423-426. Por ejemplo un péptido de enlace puede puentear aproximadamente 3.5 nm entre los terminales carboxi de una región variable y el terminal amino de la otra región variable. Los enlazadores pueden a su vez ser modificados para funciones adicionales, tal como la adición de fármacos o la adición a soportes sólidos. Las variantes de cadena única pueden ser producidas sean recombinantemente o sintéticamente. Para la producción sintética del ScFv, un sintetizador automatizado puede ser utilizado. Para la producción recombinante del ScFv, un plásmido adecuado que contiene al polinucleótido que codifica el ScFv puede ser introducido dentro de una célula anfitriona, se eucariótica, tal como levadura, de plantas, de insectos, o células de mamíferos, o procariótica, tal como la E. Coli. Los polinucleótidos que codifican el ScFv de interés pueden ser hechos mediante manipulaciones de rutina tal como ligación de los polinucleótidos. El ScFv resultante puede ser aislado utilizando técnicas de purificación de proteína estándar conocidas en la técnica. La invención incluye modificaciones a los anticuerpos, tal como el anticuerpo anti-EphA2 que incluye anticuerpos funcionalmente equivalentes y polipéptidos de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 que no afectan de manera significativa sus propiedades y variantes que pueden tener actividad mejorada o disminuida. La modificación de polipéptidos es práctica de rutina en la técnica y no requiere ser descrita en detalle aquí. Ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de residuos de aminoácido, una o más eliminaciones o adiciones de aminoácidos que no cambian de manera perjudicial significativamente la actividad funcional, o uso de los análogos químicos. Los residuos de aminoácidos que pueden ser sustituidos conservativamente por otro incluyen pero no se limitan a: glicina/alanina, valina/isoleucina/leucina, asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico, serina/treonina; lisina/ arginina; y fenilalanina/ triosina. Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, lo mismo que polipéptidos con otras modificaciones post-transducción, tal como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación fosforilación. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácido serían conservativas, es decir, el aminoácido sustituido posee propiedades químicas similares que aquellas del aminoácido original. Tales sustituciones conservativas son conocidas en la técnica, y ejemplos han sido suministrados anteriormente. Las modificaciones de aminoácido pueden variar desde cambiar o modificar uno o más aminoácidos para completar el rediseño de una región, tal como la región variable . Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unido y/o la especificidad. Otros métodos de modificación incluye utilizar técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica que incluye, pero no se limitan a, medios enzimáticos, sustituciones oxidativas, y quelación. Las modificaciones pueden ser utilizadas, por ejemplo, para la sujeción de etiquetas para inmunoensayos, tal como la sujeción de partes radioactivas para los radio inmunoensayos. Los polipéptidos LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 modificados están hechos utilizando procedimientos establecidos en la técnica que pueden ser tamizados utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica, algunos de los cuales se han descrito más adelante y en los ejemplos. La invención también involucra proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos de esta invención, tal como LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. En una modalidad, un polipéptido de fusión se suministra el cual comprende por lo menos 10 aminoácidos contiguos de la región de la cadena liviana variable y por lo menos 10 aminoácidos de la región variable de la cadena pesada. En otra modalidad, el polipéptido de fusión contiene una región constante de inmunoglobulina heteróloga. En otra modalidad, el polipéptido de fusión contiene una región variable de cadena liviana y una región variable de la cadena pesada de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Para propósitos de esta invención, una proteína de fusión de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 contiene uno o más polipéptidos de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 y otra secuencia de aminoácidos a la cual no está sujeta en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homologa de otra región. Un polipéptido de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 puede ser creado mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, sintéticamente o de manera recombinante. En otras modalidades las quimeras de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 se suministran en las cuales las cadenas pesada y/o liviana son proteínas de fusión. En algunas modalidades, el dominio constante de las cadenas es de una espacie particular y/o clase particular, y el dominio variable es de una especie y/o clase diferente. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico (en algunas modalidades) es uno en el cual las regiones constantes son derivadas de origen humano y las regiones variables son homologas o derivadas de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 (es decir, murina) . También involucra dentro de la invención un anticuerpo con una región variable humanizada, en la cual (en algunas modalidades) , las regiones CDR comprenden secuencias de aminoácidos de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, mientras que las regiones de estructura son derivadas de secuencias humanas. Otras formas de anticuerpos humanizados son conocidas en la técnica y descritas aquí. También se cubren fragmentos funcionales de quimeras. Un ejemplo de un fragmento Fab humanizado que contiene una región de bisagra humana, una primer región constante humana, una región ligera o liviana kappa humana o una región de cadena pesada kappa humana, y la región variable de la cadena liviana y/o pesada del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Los fragmentos Fab del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 pueden a su vez ser hechos para formar dímeros Fab. Típicamente, las proteínas de fusión de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 y las quimeras de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 de esta invención están hechas mediante preparar una expresión de un polinucleótido que las codifica utilizando métodos recombinantes descritos aquí, aunque ellos también pueden ser preparados por otros medios conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis química. Ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses números 5, 807, 715,4, 816, 567; y 6, 331, 415. La invención también involucra anticuerpos humanizados. La secuencia de polinucleótidos de un anticuerpo, tal como LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 u otros anticuerpos equivalentes pueden ser utilizados para la manipulación genética para generar un anticuerpo "humanizado", o para mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo. El principio general en humanizar un anticuerpo involucra retener la secuencia básica de la porción de unido al antígeno del anticuerpo, mientras se barre el reto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpo humano. Existen cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1) determinar el nucleótido y secuencias de aminoácidos predichos de la partida de los dominios variable de liviano y pesado del anticuerpo (2) designar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región de estructura de anticuerpo se utiliza durante el proceso de humanización (3) metodologías reales de humanización/técnicas y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, la región constante puede ser trabajada por ingeniería para parecerse a las regiones constantes humanas para evitar respuestas inmune si el anticuerpo es utilizado en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Ver, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses números 5, 997, 867 y 5, 866, 692. Un número de moléculas de anticuerpo "humanizado" comprende un sitio de unido a antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana que ha sido descrita, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones de roedores y sus regiones determinantes de complementariedad asociadas (CDR) fusionadas a los dominios constantes humanos. Ver, por ejemplo, Winter y otros, Nature 349. 293-299 (1991); Lobuglio y otros, proa . Nat . Acad. Sci . USA. 86: 4220-4224 (1989); Shaw y otros, J Immunol . 138: 4534-4538 (1987); y Brown y otros, Cáncer Res . 47: 3577-3583 (1987). Otras referencias describen los CDR de roedores injertados en regiones de estructura de soporte humanas (FR) antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado. Ver, por ejemplo, Riechmann y otros, Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Sciencie 239: 1534-1536 (1988); y Jones y otros, Nature 321: 522-525 (1986). Otra referencia describe CDR de roedores soportados mediante regiones de estructura de roedores unidos recombinantemente. Ver, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea número 519, 596. Estas moléculas (humanizadas) son diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia las respuestas de anticuerpo anti humano de roedor que limita la duración y efectividad de las aplicaciones terapéuticas de aquellas partes en los receptores humanos . Otros métodos de humanizar anticuerpos que pueden ser utilizados se han descrito por Daugherty y otros, Nucí . Acids Res . , 19: 2471-2476 (1991) y en las Patentes Estadounidenses números 6, 180, 377; 6, 054, 297; 5, 997, 867; 5, 866, 692, 6, 210, 671; 6, 350, 861; y la PCT WO 01/27160. En todavía otra alternativa, anticuerpos completamente humanos pueden ser obtenidos mediante el uso de ratones comercialmente disponibles que han sido trabajados por ingeniería genética para expresar proteínas de inmunoglobulina humanas específicas. Los animales transgénicos que son diseñados para producir una respuesta inmune más deseable (por ejemplo anticuerpos completamente humanos) o más robusta pueden también ser utilizados para la generación de los anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de tal tecnología son los Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y HuMab-Mouse® y TCMouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ) . Esta invención también suministra composiciones que comprenden anticuerpos o polipéptidos equivalentes a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 conjugados (por ejemplo enlazados) a un agente terapéutico, tal como una molécula radiactiva, una toxina (por ejemplo, caliqueamicina) , o una molécula quimioterapéutica, o liposomas u otras vesículas que contengan compuestos quimioterapéuticos. Las composiciones, cuando se administran a un individuo, pueden activar estos agentes a las células de cáncer que expresan el EphA2 reconocidos por el anticuerpo o polipéptidos y por lo tanto, puede, por ejemplo, eliminar las células cancerosas y/o suprimir la proliferación y crecimiento de las células cancerosas. Para simplicidad, se hará referencia generalmente a anticuerpos de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 con el entendimiento de que estos métodos aplican a cualquiera de las modalidades que se unen al EphA2 descritas aquí. Con estos métodos, la conjugación en general se refiere a enlazar estos componentes como se describió aquí. El enlazado (que es generalmente fijar estos componentes en asociación próxima por lo menos para la administración) puede ser logrado de un número de maneras, como se describe más adelante. Una molécula radioactiva de esta invención incluye cualquier radio isótopo que es efectivo para destruir una célula cancerosa. Ejemplos incluyen pero no se limitan a, cobalto- 60 y rayos X. adicionalmente, los elementos radioactivos de ocurrencia natural tal como uranio, radio, torio y que representan típicamente mezclas de radio isótopos, son ejemplos adecuados de una molécula radioactiva. Una toxina de la invención incluye, pero no se limita a, Taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de Etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glococorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanolol, y puromicina y análogos o homólogos de ellos. Los anticuerpos de esta invención pueden ser internalizados dentro de las células de carcinoma a loa cuales ellos se unen y por lo tanto son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, suministrar dentro de las células toxinas que requieren ser internalizadas para su actividad adversa. Ejemplos de tales toxinas incluye, pero no se limitan a saporina, caliqueamicina, auristatina, y maitansinoide . Los anticuerpos o polipéptidos de la invención pueden ser conjugados (enlazados) a una molécula radiactiva, una toxina, y otros, agentes terapéuticos, o a liposomas u otras vesículas que contienen agentes terapéuticos covalentemente o no covalentemente, directamente o indirectamente. El anticuerpo puede ser unido a la molécula radioactiva, la toxina, o la molécula terapéutica en cualquier localización a lo largo del anticuerpo siempre que el anticuerpo sea capaz de unirse su objetivo EphA2. Una toxina o un agente terapéutico puede estar acoplado (por ejemplo, pegado covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado sea directa o indirectamente (vía un grupo enlazador, o, alternativamente, por medio de una molécula de enlace con sitios de unido apropiados tal como una molécula plataforma como se describió en la Patente Estadounidense 5, 552, 391). La toxina y el agente terapéutico de la presente invención pueden ser acoplados directamente a las proteínas objetivo particulares utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo de partida (por ejemplo, un haluro) en el otro. Los anticuerpos o polipéptidos también pueden ser unidos a un agente terapéutico mediante un micro portador. El micro portador se refiere a una partícula biodegradable o no biodegradable que es insoluble en agua y la cual tiene un tamaño menor a cerca de 150, 120 o 100 mm en tamaño, más comúnmente menos que cerca de 50 a 60 µm, preferiblemente menos de cerca de 10, 5, 2.5, 2 o 1.5 µim. Los microportadores incluyen "nanoportadores" , que son micro portadores que tienen tamaños menores a cerca de 1 µm, preferiblemente menos de cerca de 500 nm. Tales partículas son conocidas en la técnica. Los micro portadores de fase sólida pueden ser partículas formadas de polímeros de existencia natural biocompatibles, polímeros sintéticos o copolímeros sintéticos, que pueden incluir o excluir micro portadores formados de agarosa o agarosa reticulada, lo mismo que otros materiales biodegradables conocidos en la técnica. Los micro portadores de fase sólida biodegradables pueden ser formados de polímeros que son degradables (por ejemplo poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) y copolímeros de ellos) o erosionables (por ejemplo poli (orto esteres tales como 3,9- dietiliden-2, 4, 8, 10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU) o poli (anhídrido) tales como poli (anhídrido) de ácido sebásico) bajo las condiciones fisiológicas del mamífero. Los microportadores pueden también ser de fase líquida (por ejemplo, con base en aceite o lípidos) tal como liposomas, iscomas (complejos estimulantes inmunes, que son complejos estables de colesterol y fosfolípidos, saponina activa como adyuvante) sin antígeno o góticas o micelas encontradas en emulsiones aceite en agua o agua en aceite, siempre que los micro portadores de fase líquida sean biodegradables. Los microportadores de fase líquida biodegradables típicamente incorporan un aceite biodegradable, un número de los cuales son conocidos en la técnica, incluyendo escualeno y aceites vegetales. Los micro portadores son típicamente esféricos en su forma, pero los mico portadores que se desvían de su forma esférica también son aceptables (por ejemplo, elipsoides, en forma de varillas, etc.). Debido a su naturaleza insoluble (con respecto al agua) , los microportadores son filtrables desde el agua y soluciones con base en agua (acuoso) . Un conjugado de anticuerpo o de polipéptido de la presente invención puede incluir un enlazador bifuncional que contiene tanto un grupo capaz de acoplarse a un agente tóxico o agente terapéutico y un grupo capaz de acoplarse al anticuerpo. Un enlazador puede funcionar como un espaciador para distancia un anticuerpo de un agente para poder evitar interferencia con las capacidades . de unido. Un enlazador puede ser separable o no separable . Un enlazador puede servir para incrementar la reactividad química de un sustituyente sobre un agente o un anticuerpo, y por lo tanto incrementar la eficacia de acoplamiento. Un incremento en la reactividad química puede también facilitar el uso de agentes, o grupos funcionales sobre los agentes, que de otra manera no sería posible. Los enlazadores bifuncionales pueden ser acoplados al anticuerpo por medios que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un enlazador que contiene una parte de éster activo, tal como un éster de N-hidroxisuccinimida, puede ser utilizado para acoplarse a residuos de lisina en el anticuerpo mediante un enlace de amida. En otro ejemplo, un enlazador que contiene una amina nucleofílica o residuo de hidracina puede ser acoplado a los grupos aldehido producidos por oxidación glicolítica de los residuos de carbohidrato del anticuerpo. En adición a estos métodos directos de acoplamiento, el enlazador puede ser acoplado indirectamente al anticuerpo mediante un portador intermedio tal como un amino dextrina. En estas modalidades el enlace modificado se hace vía lisina, carbohidrato, o un portador intermedio. En una modalidad, el enlazador está acoplado selectivamente a sitio a residuos libres de tiol en la proteína. Las partes que son adecuadas para el acoplamiento selectivo a grupos tiol sobre las proteínas son bien conocidos en la técnica.
Ejemplos incluyen compuestos de disulfuro, alfa-halocarbonilo y compuestos de alfa-halocarboxilo, y maleimidas. Cuando una función de amina nucleofílica está presente en la misma molécula como una alfa-halocarbonilo o grupo carboxilo el potencial existe de ciclización vía alquilación intramolecular de la amina. Los métodos para impedir este problema son bien conocidos para una persona versada en la técnica, por ejemplo mediante la preparación de las moléculas en las cuales las funciones amina y alfa-halo son separadas mediante grupos inflexibles, tales como grupos arilo o trans-alquenos, que hacen que la ciclización indeseada sea estereoquímicamente desfavorecida. Ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense número 6, 441, 163 para la preparación de conjugados de maitansinoides y anticuerpos vía una parte de disulfuro. Uno de los enlazadores separables que pueden ser utilizados para la preparación de conjugados de anticuerpo-droga es un enlazador lábil ácido con base en ácido cis-aconítico que tiene la ventaja del ambiente acídico de diferentes compartimentos intracelulares tal como las endosomas encontradas durante la endocitosis mediada por receptor y los lisosomas. Ver, por ejemplo, Shen y otros, Biochem. Biophys . Res . Commun . 102: 1048-1054 (1981) para la preparación de conjugados de daunorubicina con portadores macro moleculares; Yang y otros, J. Nati . Canc . Inst . 80: 1154-1159 (1988) para la preparación de conjugados de daunorubicina a un anticuerpo anti-melanoma; Dillman y otros, Cáncer Res . , 48: 6097-6102 (1988) para usar un enlazador lábil ácido de una manera similar a preparar conjugados de daunorubicina con un anticuerpo de anti-célula T; Trouet y otros, Proc, Nati , Acad. Sci . 79: 626-629 (1982) para enlazar la dauorubicina a un anticuerpo mediante un brazo espaciador de péptido. Un anticuerpo (o polipéptido) de esta invención puede ser conjugado (enlazado) a una molécula radioactiva mediante cualquier método conocido en la técnica. Para una discusión de los métodos para radio marcar anticuerpos ver "Cáncer Therapy with Monoclonal AntibodiesT" , D.M. Goldenberg ed. (CRC Press, Boca Ratón, 1995) . Un anticuerpo (o polipéptido) de esta invención puede ser enlazado a un agente enmarcado o etiquetado (alternativamente llamado "etiqueta") tal como una molécula fluorescente, una molécula radioactiva o cualquier otra etiqueta conocida en la técnica. Las etiquetas son conocidas en la técnica en que generalmente suministran (sea directa o indirectamente) una señal. La habilidad de los anticuerpos, polipéptidos y proteínas de esta invención, tal como su habilidad para inhibir el crecimiento de células cancerosas que expresan EphA2, su habilidad para retardar el desarrollo de la metástasis en un individuo con cáncer que expresa el EphA2, habilidad para suministrar un agente terapéutico, tal como una toxina, o un compuesto radiactivo, a células cancerosas que expresan EphA2, incluyendo la habilidad para suministrar un agente terapéutico en células cancerosas que expresan EphA2 , puede ser ensayado utilizando métodos conocidos en la técnica, algunos de los cuales son descritos en los ejemplos. La invención también suministra composiciones (Incluyendo composiciones farmacéuticas) que comprenden anticuerpos anti-EHPA2 o anticuerpos equivalentes a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 8los cuales, como se hace claro en esta discusión, incluyen todos los anticuerpos descritos aquí) o polipéptidos y un agente terapéutico. Métodos para tamizar anticuerpos monoclonales Diversos métodos pueden ser utilizados para tamizar adicionalmente anticuerpos monoclonales que se unen a células cancerosas en EphA2. Un método que puede ser empleado es la inmunohistoquímica (IHC) . Las técnicas estándar de inmunohistoquímica son conocidas para aquellos conocedores de la técnica. Ver, por ejemplo, Animal Cell Cul ture Methods (J.P. Mather y D. Barners, eds., Academia Press, Vol. 57, Ch. 18 y 19, pp. 314-350, 1998). Las muestras biológicas (por ejemplo, tejidos) pueden obtenerse de biopsias, autopsias o necropsias. Para determinar si el EphA2 está presente en células cancerosas, se puede utilizar el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 para detectar la presencia del EphA2 en los tejidos de individuos con cáncer mientras que otros tejidos no cancerosos del individuo que sufre de cáncer o tejidos de los individuos sin cáncer son usados como un control. El tejido puede estar embebido en un sólido o sustancias semisólida que impida el daño durante el congelamiento (por ejemplo, gel de agarosa o OCT) y luego seccionada para el manchado. Los cánceres de diferentes órganos y en diferentes grados pueden utilizados para tamizar anticuerpos monoclonales. Ejemplos de tejidos que pueden ser utilizados para propósitos de tamizado incluyen pero no se limitan a ovario, pecho, pulmón, próstata, colon, riñon, piel, tiroides, cerebro, corazón, hígado, estómago, nervios, vasos sanguíneos, huesos, tracto digestivo superior, y páncreas. Ejemplos de diferentes tipos de cáncer que pueden utilizados para propósitos de tamizado incluyen pero no se limitan a carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, adeno sarcomas, linfomas, y leucemias. Todavía otra alternativa, las líneas de células cancerosas tales como SK-Ov-3 (ATCC No HTB 77) , LnCap (ATCC No CRL-1740), COLÓ 205 (ATCC No CCL 222), A549 (ATCC No CCL 185),PANC-1 (ATCC No CRL 1469), SK-BR-3 (ATCC No HTB 30), SK-MES-1 (ATCC No HTB 58), HT-29 (HTB-38), SW 480 (ATCC No CCL 228), AsPC-1 (ATCC No CRL 1682), Capan-1 (ATCC No HTB 79), CÁPAC-1 (ATCC No CRL 1918) , HPAF-II (ATCC No CRL-1997) , HS, 700T (ATCC No HTB 147) , Du-145 (ATCC No HTB-81) , CaLu-1 (ATCC No HTB-54) , 786-0 (ATCC No CRL-1932), CaKi-2 (ATCC No HTB-47), A498 (ATCC NoHTB-44), BT474 (ATCC No HTB-20), y PC-3 (ATCC No CRL1435) y las células normales de sus tejidos respectivos pueden ser utilizadas para tamizar para anticuerpos monoclonales para específicos para tejido canceroso. Principalmente, cultivos celulares primarios o de bajo pasaje de tejidos normales de diferentes órganos, incluyendo pero sin limitarse a ovario, pecho, pulmón, próstata, colon, riñon, piel, tiroides, músculo suave aórtico, y células endoteliales pueden utilizarse como controles negativos. Las células cancerosas o no cancerosas se hacen crecer en plaquetas de vidrio o cubiertas deslizantes, o sobre superficies plásticas, o preparadas en CellArray™' según se describió en la WO 01/43869, y se tamizaron para el unido del anticuerpo utilizando IHC como se describió anteriormente para los tejidos. Alternativamente, las células pueden ser removidas de la superficie de crecimiento utilizando medios no proteolíticos y giro en granulos que luego son embebidos y tratados como tej idos para el análisis IHC como se describió anteriormente. En otra alternativa, las células únicas pueden ser tamizadas mediante incubarlas con el anticuerpo primario, un anticuerpo "reportero" secundario enlazado a una molécula fluorescente y luego analizados utilizando una máquina de clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) .
Varios sistemas de detección diferentes pueden ser utilizados para detectar el unido de los anticuerpos a la sección del tejido. Típicamente, la inmunohistoquímica involucra el unido de un anticuerpo primario al tejido y luego un anticuerpo secundario reacciona contra las especies desde el anticuerpo primario generado y conjugado a un marcador detectable (por ejemplo, peroxidasa de rábano, HRP, o diaminobencedina, DAB) . Un método alternativo que puede ser utilizado es la técnica de anticuerpos complementarios tipo espejo policlonales o poliMICA. La técnica de la poliMICA (anticuerpos complementarios de imagen de espejo policlonales), descrita por D.C. Mangham y P. G. Isaacson (Histopathology (1999)35(2): 129-33), puede ser utilizada para ensayar el unido de anticuerpos primarios (por ejemplo LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40) a tejido normal y canceroso. Varias clases de kits de detección poliMICA™ están disponibles comercialmente de The Binding Site Limited (P.O. Box 4073 Birmingham B29 6AT England) . El producto número HK004.D es un kit de detección poliMICA™ que utiliza el cromagen DAB. El producto número HK004. A es un kit de detección poliMICA™ que utiliza el cromagen AEC. Alternativamente, el anticuerpo primario puede estar directamente marcado con el marcador detectable. La primera etapa en el tamizado IHC para selecciona un anticuerpo apropiado es el unido de los anticuerpos primarios hecho en ratones (por ejemplo LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40) a uno o más inmunógenos (por ejemplo muestras de células o tejidos) . En una modalidad, la muestra de tejido es seccionada de tejido congelado a partir de diferentes órganos. Las células o muestras de tejido pueden ser cancerosas o no cancerosas. Los tejidos congelados pueden ser preparados, seccionados, con o sin fijación y el IH6 se lleva a cabo mediante un número de métodos conocidos a aquellos familiarizados con la técnica. Ver, por ejemplo, Stephan y otros, Dev. Biol . 212:264-277 (1999), y Stephan y otros, Endocrinology 140: 5841-54 (1999). Los anticuerpos monoclonales que reaccionan cruzadamente con células humanas y que se unen a células cancerosas o tejidos cancerosos, pero que no lo hacen a células o tejidos normales al mismo grado, son seleccionados, los anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos expresados sobre uno o más tipos de cáncer pero no sobre células normales también se seleccionan. El LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 es un ejemplo de un anticuerpo que se une al antígeno EphA2 presente en un número de cánceres diferentes, pero tiene un unido limitado a tejidos normales. El mapeado del epítopo puede ser utilizado para caracterizar adicionalmente al anticuerpo. Servicios disponibles comercialmente (por ejemplo, Pepscan Systems, Apartado Postal 2098, 8203 AB Lelystad, Holanda) se puede utilizar para determinar el epítopo sobre el antígeno EphA2 , al cual un anticuerpo, tal como el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, se une. Métodos de diagnóstico del cáncer utilizando LUCA19, SPL1 , SG5 o LUCA40, anticuerpos equivalentes o polipéptidos equivalentes que se unen al EphA2. El anticuerpo anti-EphA2 monoclonal y sus anticuerpos equivalentes o derivados de polipéptidos de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 que se unen al EphA2 hechos por los métodos descritos aquí pueden utilizarse para identificar o detectar la presencia o ausencia de células cancerosas en una variedad de tejidos, incluyendo pero sin limitarse a ovarios, pecho, pulmón, próstata, colon, riñon, piel, tiroides, cerebro, corazón, hígado, estómago, nervios, vasos sanguíneos, huesos, tracto digestivo superior, y páncreas para propósitos de diagnóstico. Para simplicidad, se hará referencia generalmente a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o anticuerpos con el entendimiento de que estos métodos aplican a cualquiera de las modalidades que se unen al EHPA2 descritas aquí. La detección generalmente involucra poner en contacto células con un anticuerpo o un polipéptido descrito aquí el cual se une al EphA2 y la formación de un complejo entre el EphA2 y un anticuerpo (por ejemplo LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, un anticuerpo humanizado de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, un anticuerpo humano o cualquier otra parte que se une al EphA2) que se une específicamente al EphA2. La formación de tal complejo puede hacerse in vi tro o in vivo. Sin estar sujeto a ninguna teoría, el anticuerpo anti-EphA2 puede unirse al EphA2 mediante el dominio extracelular del EphA2. Como se utiliza aquí, la detección puede incluir detección cualitativa y/o cuantitativa y puede incluir comparar el nivel medido a una célula normal para un nivel incrementado de expresión de EphA2 en células cancerosas. Un método para utilizar los anticuerpos para el diagnóstico es la formación de imágenes de tumor in vivo mediante enlazar el anticuerpo a una parte de etiquetado (por ejemplo, un agente fluorescente, un agente radioactivo o radio fago) , administrar el anticuerpo al paciente y utilizar rayos X u otra máquina de formación de imágenes para visualizar la localización del anticuerpo marcado en la superficie de células cancerosas que expresan 1 antígeno. Las partes marcadas son conocidas en la técnica. En otros métodos, las células cancerosas son removidas y el tej ido es preparado para inmunohistoquímica mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, embeber en un compuesto congelado, congelar y seccionar, con o sin fijación; la fijación y embeber en parafina con o sin diversos métodos de recuperación de antígeno y contra manchado) . Los anticuerpos monoclonales también puede utilizarse para identificar neoplasmas en diferentes etapas de desarrollo. Los anticuerpos también pueden ser utilizados para determinar que tumores del paciente expresan el antígeno sobre su superficie a un nivel predeterminado y por lo tanto son candidatos para inmunoterapia utilizando anticuerpos directamente contra dicho antígeno. Los anticuerpos (o polipéptidos) que reconocen el antígeno se pueden también utilizar para crear inmunoensayos de diagnóstico para detectar el antígeno liberado o secretado de células de cáncer vivas o que están muriendo en fluidos corporales, incluyendo pero sin limitarse a, sangre, saliva, orina, fluido pulmonar o fluido de ascitos. Como se discutió en detalle adicional, en los ejemplos, el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 puede unirse a varias formas de cáncer en diferentes etapas desde los tejidos incluyendo pero sin limitarse a melanomas, pecho, pulmón, próstata, y colon. Los métodos para utilizar LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 para propósitos de diagnóstico es útil tanto y después de cualquier forma de tratamiento anticáncer, por ejemplo, quimioterapia o terapia de radiación, para determinar que tumores más probablemente responden a un tratamiento dado, para prognosis de paciente, subtipo de tumor u origen de enfermedad metastático, y progresión de la enfermedad o respuesta al tratamiento. Métodos de utilizar LUCA19, SPL1 , SG5 o LUCA40, o anticuerpos equivalentes o polipéptidos equivalentes para propósi tos terapéuticos.
El anticuerpo anti-EphA2 monoclonal y anticuerpos equivalentes (lo mismo que otras modalidades de polipéptido de la invención) hechos por los métodos descritos aquí pueden utilizarse para propósitos terapéuticos en individuos con cáncer, incluyendo pero sin limitarse a melanomas, cáncer de pecho, pulmón, próstata, y colon. Estos métodos terapéuticos también aplican a modalidades enligadas descritas anteriormente. Para simplicidad, se hace referencia en general a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o anticuerpos con el entendimiento de que estos métodos aplican a cualquiera de las modalidades que se unen al EphA2 descritas aquí, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos descritos aquí incluyendo modalidades enlazadas. La terapia con LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 puede involucrar la formación de complejos de tal anticuerpo y EphA2 tanto in vi tro y/o in vivo como se describió anteriormente. En una modalidad, el anticuerpo anti-EphA2 monoclonal puede unirse a y reducir el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas. En otra modalidad, el anticuerpo anti-EphA2 monoclonal puede unirse a inducir la muerte apoptótica de células en las células de cáncer. En otra modalidad, el anticuerpo anti-EphA2 monoclonal puede unirse a células cancerosas y retardar el desarrollo de la metástasis. En otra modalidad, el anticuerpo anti-EphA2 monoclonal puede unirse a células cancerosas y suministrar un agente terapéutico (tal como una toxina, o un compuesto radiactivo) unido a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 a células cancerosas. Para algunas modalidades, el agente terapéutico (tal como una toxina) es introducido dentro de una célula (es decir, es internalizado) . Agentes adecuados particularmente para estos métodos incluyen agentes que son activos al interior de la célula. Ejemplos de tales agentes incluyen pero sin limitarse a saponina, caliqueamicina, auristatina, y maitancinoide . Generalmente, en estas modalidades una cantidad efectiva (una cantidad suficiente para suministrar un agente terapéutico a y/o en células cancerosas objetivo) es administrada a un individuo. Todavía en otra modalidad, un individuo con cáncer se le da un tratamiento paliativo con LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. El tratamiento paliativo de un paciente con cáncer involucra tratar o disminuir los síntomas adversos de la enfermedad o síntomas iatrogénicos resultantes de otros tratamientos dados para la enfermedad sin afectar directamente la progresión del cáncer. Esto incluye tratamientos para aliviar el dolor, soporte nutricional, problemas sexuales, esfuerzo psicológico, depresión fatiga, desórdenes psiquiátricos, náuseas, vómitos etc. Esta invención también suministra métodos para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células de cáncer utilizando el anticuerpo de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o un anticuerpo que se ligue preferencialmente al mismo epítopo que el epítopo al cual cualquiera del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 se une preferencialmente. Todavía en otra modalidad, el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o cualquiera de las modalidades EphA2 descritas aquí pueden unirse al EphA2 que expresa las células cancerosas e induce una respuesta inmune activa contra las células cancerosas que expresan el EphA2. En algunos casos, la respuesta inmune activa puede causar la muerte de las células cancerosas (por ejemplo el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 se une a células de cáncer que inducen la muerte apoptótica u oncótica de las célula) , o inhibe el crecimiento (por ejemplo, bloquea la progresión del ciclo de las célula) de las células cancerosas. En otros casos, el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o cualquiera de los anticuerpos EphA2 descritos aquí puede unirse a células cancerosas y la fitotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) puede eliminar las células cancerosas a las cuales el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 se unen. De acuerdo a lo anterior, la invención suministra métodos para estimular una respuesta inmune que comprende administrar cualquiera de las composiciones descritas aquí. El anticuerpo anti-EphA2 puede ser administrado con agentes que promuevan o dirijan una respuesta inmune propia del individuo, tal como un agente que fortalezca el ADCC. En una modalidad, por lo menos un residuo fucoso presente en un anticuerpo anti-EphA2 se remueve de los oligosacáridos de ese anticuerpo, una modificación para promover el ADCC. En modalidades similares, los residuos fucosos presentes en un anticuerpo anti-EphA2 son modificados para alterar su composición al grado requerido para mejorar o promover el ADCC comparado con el anticuerpo original sin modificación. En algunos casos, la unión de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 pueden también activar tanto respuestas inmune celulares y humorales y reclutar más células asesinas naturales o incrementar la producción de citosinas (por ejemplo, IL-2, IFN-g, IL-12, TNF-a, TNF-b, etc.) que activan adicionalmente un sistema inmune del individuo para destruir las células cancerosas. En todavía otra modalidad, el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 pueden unirse a células cancerosas, y macrófagos u otras células fagosíticas pueden opsonizar las células cancerosas. En algunas modalidades, la invención suministra métodos para conferir inmunidad pasiva que comprende administrar cualquiera de las composiciones descritas aquí. La invención suministra métodos para suministrar cualquiera de las composiciones (incluyendo conjugados) descritos aquí a una célula que expresa el EphA2 tal como las células de cáncer con expresión del EphA2. Estos métodos conllevan a administrar las composiciones (incluyendo conjugados) descritos aquí a un individuo. En algunas modalidades, los métodos suministran la introducción, por ejemplo, de un conjugado en una célula objetivo. En todavía otra modalidad, el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 pueden estar conjugados a un agente terapéutico tal como una molécula radioactiva, una toxina, por ejemplo, saporina, caliqueamicina, auristatina o maitancinoide, u otras moléculas quimioterapéuticas, o a liposomas u otras vesículas que contienen compuestos quimioterapéuticos y ser administrados a un individuo para activar estos compuestos a la célula de cáncer que contiene el antígeno reconocido por el anticuerpo y así eliminar las células cancerosas. En todavía otra modalidad, el anticuerpo puede ser empleado como terapia de adyuvante en el momento de la remoción quirúrgica de un cáncer que expresa el antígeno para poder retardar el desarrollo de la metástasis. El anticuerpo también puede ser administrado antes de la cirugía (terapia neoadyuvante) en un paciente con un tumor que exprese el antígeno para poder disminuir el tamaño del tumor y así permitir una cirugía más simple, esparcir el tejido durante la cirugía, y/o disminuir la desfiguración resultante. Varias formulaciones de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 y anticuerpos equivalentes o fragmentos equivalentes (por ejemplo Fab, Fab', F(ab')2, Fv, FC, etc.), tal como anticuerpos quiméricos, cadenas única (ScFv) , mutantes de ellos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno EphA2 de especificidad requerida, pueden se pueden utilizar para la administración. En algunas modalidades, los anticuerpos de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o varias formulaciones de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 del mismo pueden ser administrados de manera nítida. En otras modalidades, el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 o varias formulaciones de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 (incluyendo cualquier modalidad de composición descrita aquí) de los mismos y un excipiente farmacéuticamente aceptable son administrados, y pueden venir en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente efectiva. Por ejemplo, un excipiente puede dar la forma o consistencia, o actuar como diluyente. Excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a agentes estabilizadores, agentes humectantes o emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, reguladores de pH, y mejoradores o promotores de la penetración en la piel. Los excipientes también como formulaciones para suministro de fármacos parenteral y no parenteral se establecen en Remington, The Sciencie and Practice of Pharmacy, 20th edición. Mack Publishing (200) . Generalmente estos agentes son formulados para la administración mediante inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.), aunque otras formas de administración (por ejemplo oral, mucosal, etc.) también se pueden utilizar. De acuerdo a lo anterior el anticuerpo de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 y sus equivalentes son combinados preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como salina, solución de ringer, solución de dextrosa, y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, la temporización, y la repetición dependerá del individuo particular y de la historia médica del individuo. Generalmente, cualquiera de las siguientes dosis se pueden utilizar: una dosis de por lo menos cerca de 50 mg/kg de peso de cuerpo; por lo menos cerca de 10 mg/kg del peso de cuerpo; y por lo menos cerca de 3 mg/kg del peso del cuerpo; en por lo menos cerca de 1 mg/kg del peso de cuerpo; por lo menos cerca de 750 µg/kg del peso del cuerpo; por lo menos cerca de 500 µg/kg del peso del cuerpo; por lo menos cerca de 250 µg/kg del peso del cuerpo; por lo menos cerca de 100 µg/kg del peso del cuerpo; por lo menos cerca de 50 µg/kg del peso del cuerpo; por lo menos cerca de 10 µg/kg del peso del cuerpo; por lo menos cerca de 1 µg/kg del peso del cuerpo; o más, es administrado. Consideraciones empíricas, tales como la vida promedio, generalmente contribuirá a la determinación de la dosificación. Los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmune humano tal como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, se pueden utilizar para prologar la vida promedio del anticuerpo y para impedir que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmune del anfitrión. En algunos individuos, más de una dosis puede ser requerida. La frecuencia de administración puede ser determinada y ajustada durante el curso de la terapia, y está basada en la reducción del número de células cancerosas, mantener la reducción de las células cancerosas, reducir el crecimiento y/o la proliferación de las células cancerosas, o recargar el desarrollo de la metástasis. La presencia de células cancerosas puede ser identificadas por cualquier número de métodos conocidos para aquellos versados en la técnica o discutidos aquí (por ejemplo, detección por inmune histoquímica o citometría de flujo de biopsias o de muestras biológicas) . En algunos casos ? , las formulaciones de liberación continua sostenida de anticuerpos LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 pueden ser apropiadas. Varias formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida se conocen en la técnica. En una modalidad, las dosificaciones para los anticuerpos de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 se pueden determinar empíricamente en individuos a quienes se les ha dado una o más administraciones. Los individuos de les dan dosificaciones increméntales de LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40. Para determinar la eficacia del LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 u otro anticuerpo equivalente, los marcadores del estado de enfermedad del cáncer específico puede ser monitoreado. Estos marcadores incluyen: medidas directas del tamaño de tumor mediante palpación u observación visual; medidas indirectas del tamaño del tumor mediante rayos X u otras técnicas de formación de imágenes; una mejora como se determinó por la biopsia directa del tumor y examen microscópico de la muestra de tumor; la mediad de un marcador indirecto (por ejemplo PSA para cáncer de próstata) , una disminución en el dolor o parálisis; mejora del habla, visión, respiración, u otras discapacidades asociadas con el tumor, apetito incrementado; o un incremento en la calidad de vida según se mide mediante ensayos aceptados o por la prolongación de la supervivencia. Será aparente o evidente para aquellos versados en la técnica que la dosis variará dependiendo del individuo, el tipo de cáncer, el estado del cáncer, si el cáncer ha iniciado la metástasis u otra localización a otras localizaciones del individuo, y el pasado y tratamiento concurrente está siendo utilizado. Otras formulaciones incluyen formas de suministro adecuadas conocidas en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a vehículos tales como liposomas. Ver, por ejemplo, Mahato y otros, (1997) Pharm. Res . 14: 853-859. Las preparaciones liposómicas incluyen, pero no se limitan a, citofectinas, vesículas multilaminares y vesículas unilaminares . En algunas modalidades, más de un anticuerpo puede estar presente. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Tales composiciones pueden contener por lo menos 1 , por lo menos 2 , por lo menos 3 , por lo menos 4 , por lo menos 5, diferentes anticuerpos que so reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas o adenosarcomas . El anticuerpo LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 se puede mezclar con uno o más anticuerpos reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas o adenosarcomas en órganos incluyendo pero sin limitarse a ovario, pecho, pulmón, próstata, colon, riñon, piel, tiroides, cerebro, huesos, tracto digestivo superior, y páncreas. Una mezcla de anticuerpos, como usualmente se les llama en la técnica, puede ser particularmente útil para tratar un rango más amplio de población de individuos. La evaluación de la enfermedad se lleva a cabo utilizando los métodos estándar en la técnica, tales como métodos de formación de imágenes y monitoreo de marcadores apropiados . Kits que comprenden anticuerpos y polipéptidos de la invención que se unen al EphA2- La invención también suministra kits que comprenden los anticuerpos o cualquiera de las composiciones descritas aquí que se unen al EphA2 para uso en diagnóstico y/o terapia. De acuerdo a lo anterior, los kits, comprenden un anticuerpo que se puede unirse al EphA2 preferencialmente y/o formar un complejo con el EphA2 (útil, por ejemplo, para detectar células cancerosas de pecho, colon, pulmón, o próstata) . En algunas modalidades, los kits comprenden un anticuerpo anti-EphA2 o un anticuerpo que se une preferencialmente al mismo epítopo al cual lo hace el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 preferencialmente. En algunas modalidades, los kits comprenden un anticuerpo anti-EphA2 o un anticuerpo que se une preferencialmente al mismo epítopo al cual lo hace preferencialmente el LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40 unido a un agente terapéutico o a un agente de etiquetado o marcado. Estos kits pueden incluir adicionalmente instrucciones y/o reactivos para unirse el anticuerpo o cualquier anticuerpo o modalidades de polipéptido descritas aquí al agente o agentes terapéuticos o al agente o agentes de etiquetado. En algunos aspectos, el unido de un anticuerpo (por ejemplo, monoclonal, policlonal, humano, humanizado, etc.) al EphA2 es utilizado para diagnosticar cáncer en un individuo, por ejemplo, kits para detectar la presencia o ausencia de células cancerosas, y kits para detectar la presencia o ausencia de células cancerosas del seno, colon, pulmón, o próstata. En otros aspectos, los kits se pueden utilizar, por ejemplo para tratar un individuo con cáncer o una historia de familia de cáncer. Los kits para tratar individuos con cáncer incluyen pero no se limitan a kits para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células de cáncer, para suministra un agente terapéutico a células cancerosas, para suministrar un agente terapéutico dentro de las células cancerosas. Los kits de esta invención vienen en empaque adecuados, y pueden opcionalmente suministrar componentes adicionales tales como reguladores de pH e instrucciones para determinar el unido al EphA2, tal como reactivos de captura, reactivos de desarrollo, etiquetas, superficies de reacción, medios para detección, muestras de control, e información interpretativa. Las instrucciones pueden ser para cualquier medida de unido de antígeno, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos ensayos descritos aquí. En otras modalidades, las instrucciones pueden ser para cualquiera de los métodos descritos aquí, incluyendo: instrucciones para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas tales como pecho, colon, pulmón, o próstata para suministrar un agente terapéutico a células cancerosas, para suministrar un agente terapéutico dentro de células cancerosas . En algunas modalidades, los reactivos descritos anteriormente son suministrados de modo que las medidas múltiples se pueden hacer, tales como permitir mediciones en el mismo individuo durante el tiempo o en múltiples individuos. Cualquier medio apropiado para detectar el unido de los anticuerpos puede ser empleado (y suministrados en los kits) tal como anticuerpo anti-humano marcado, caracterizado porque la etiqueta puede ser una enzima, un fluoróforo, material quimioluminiscente, radio isótopo o de coenzima. Generalmente, la etiqueta utilizada será una enzima. Los siguientes ejemplos se suministran para ilustrar, pero no limitar, la invención. Ejemplos Ejemplo 1 . Preparación de líneas de células de cáncer como un inmunógeno . Células completas aisladas de tejido o de cultivos celulares fueron utilizadas como un inmunógeno para producir anticuerpos monoclonales que son específicos para antígenos de superficie representativos de un tipo de célula particular. Tales métodos, adecuados para la práctica de esta invención, se describen en la Patente Estadounidense número 6,541,225. Generalmente, para producir anticuerpos monoclonales dirigidos a antígenos de superficie celular de un tipo de célula específico, es deseable inmunizar células B no transformadas con células viables e intactas de ese tipo, preferiblemente con aquellas células cuyas superficies están libres de suero. Las líneas de células que son adecuadas para la generación de anticuerpos monoclonales contra el antígeno EphA2, tal como pero sin limitarse a LUCA19, SPL1, SG5 o LUCA40, incluyen: BT474 (ATCC No HTB-20) , MDA-MB-175VII (ATCC No HB 25) , MDA-MB-361 (ATCC No HB 27) , SKBR3 (ATCC No HTB-30), SKMES-1 (ATCC No HTB-58) , ES-2 (ATCC No CRL-1978 58), SKOV3 (ATCC No HTB-77), HPAFII (ATCC No CRL-1997), HS700T (ATCC No HTB 147), COLO205 (ATCC No CCL 222), HT-29 (HTB-38), SW480 (ATCC No CCL 228), SW948 (ATCC No CCL 237), A498 (ATCC No HTB-44) ,y CaKi-2 (ATCC No HTB-47) . Las células se cultivaron en un medio nutriente apropiado suplementado con factores de crecimiento, pero libre de suero. La inmunización con las células que habían sido propagadas en un medio suplementado con suero puede tener desventajas extremas. El suero contiene una mezcla compleja de biomoléculas pequeñas y grades con actividades indefinidas . Estas biomoléculas se pueden adherir a las superficies de las células y por lo tanto dirigirse a la generación de anticuerpos de reacción cruzadas con las moléculas no representativas del tipo de células típico. Adicionalmente, el unido de las biomoléculas del suero a la superficie celular puede llevar a enmascarar los objetivos de antígeno de superficie celular deseados. Un número de preparaciones de medio libre de suero se conoce comercialmente y está disponible públicamente, tal como por ejemplo F12/DME (1:1) un medio de nutriente con los siguientes suplementos: insulina (10 µg/ml concentración final) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) (5 µg/ml concentración final), ácido de selenio (2,5 X 10"8 m de concentración final) , y extracto pituitario de porcino (PPE) (5 µg/ml concentración final) . Para cosechar las células, las monocapas celulares fueron enjuagadas una vez con solución salina Hanks libre de calcio y de magnesio, y se incubo en 10 nm de EDTA en solución salina hanks a 37 °C durante 15 minutos. Las células fueron luego liberadas de la superficie del cultivo mediante pipeteado gentil. la suspensión celular fue granulada mediante centrifugación a 1000 por g durante 5 minutos. El sobre nadante fue removido y las células fueron resuspendidas en un medio libre de suero con un adyuvante no desnaturalizante según es apropiado. Ejemplo 2. Generación de anticuerpos monoclonales Un adyuvante no desnaturalizante (Ribi, R730, Corixa, Hamilton MT) se rehidrató a 2 ml en salina amortiguada con fosfato. 100 µl de este adyuvante rehidratado fue entonces mezclados suavemente con algunos de los granulos celulares del ejemplo 1 para usarse en la inmunización. Aproximadamente 106 células por ratón fueron inyectadas en las plantas de los pies Balb/ratón, aproximadamente 1 o 2 veces a la semana. El programa de inmunización preciso es como sigue: día 0, inmunización más Ribi. Día 3, inmunización más Ribi. Día 7, inmunización más Ribi. Día 24, inmunización menos Ribi. Día 29, inmunización menos Ribi. Día 32, inmunización menos Ribi. Día 36, inmunización menos Ribi. Día 44, inmunización menos Ribi. Día 51, inmunización menos Ribi. Día 69, toma de sangre para muestra para ensayo de título. Día 74, inmunización más Ribi. Día 81, inmunización más Ribi. Día 91, estímulo de pre-fusión (sin Ribi). Día 104, cosechar nodos por fusión. En el día 69, una gota de sangre se retiró de la cola de cada animal inmunizado para ensayar el título de los anticuerpos contra la línea celular utilizada para inmunizar utilizando análisis FACS. Cuando el título alcanzó por lo menos 1:2000, los ratones se sacrificaron utilizando C02 seguido por dislocación cervical. Los nodos linfáticos se cosecharon para la preparación del hibridoma. Los linfocitos de los ratones se fusionaron con la línea de mieloma de ratón X63-AG8. 653 utilizando 35% de polietilenglicol 4000. Sobre el día 10 luego de la fusión, los sobrenadantes del hibridoma se tamizaron en cuanto a la presencia de anticuerpos monoclonales específicos a la inmunización de las células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . El medio acondicionado de cada hibridoma se incubó durante 30 minutos con una alícuota de células de riñon fetal humano. Después de la incubación, las muestras de células se lavaron, resuspendidas en 0,1 de diluyente e incubadas con un µg/ml FITC conjugado con fragmento F(ab')2 de IgG anti ratón de cabra durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron, resuspendidas en 0,2 ml de FACS como diluyente y se analizaron utilizando el analizador de células FACScan (Becton Dickinson; San José, CA) . Los clones de hibridoma se seleccionaron para una expansión adicional, clonación y caracterización con base en su unido a la superficie de las células de riñon fetal humanos mediante FACS. Un hibridoma que hace un anticuerpo monoclonal designado mu-SPLl que se une a un antígeno designado Ag-SPLl y un epítopo de ese antígeno designado AgSPL1 se seleccionó. Un hibridoma que hace un anticuerpo monoclonal designado LUCA-19, que se une a un antígeno designado Ag-LUCA19 y un epítopo sobre ese antígeno designado Ag-LUCA19.1 se seleccionó. Un hibridoma que hace el anticuerpo monoclonal designado mu-LUCA40 que se une un antígeno designado Ag-LUCA40 y un epítopo sobre ese antígeno designado Ag-LUCA40.1. Un hibridoma que hace un anticuerpo monoclonal designado mu-SG5, que se une a un antígeno designado Ag-SG5 y un epítopo sobre ese antígeno designado Ag-SG5.1. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales, mu-SPL-1, mu-LUCA19, mu-LUCA40 y mu-SG5 se expandieron en cultivos para la purificación de los anticuerpos monoclonales en un medio de cultivo que es capaz de soportar el crecimiento del anticuerpo monoclonal y la purificación del anticuerpo. Ejemplo 3 . Purificación de anticuerpos anti -EphA2 Las células de cáncer humano tales como pero sin limitarse a SUMES-1, 786-0, y Colo205 se liberaron de los frascos de cultivo de tejido en la presencia de 10.0 mn de EDTA, se centrifugaron a 1400 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en PBS que contenía 1% de BSA y 2 mm de EDTA (diluyente FACS) . Las células se contaron y ajustaron a 107 células/ml. Cerca de 0.1 ml de las células se incubaron con 10 µl de diluyente FACS durante 30 minutos a 37 °C. Los anticuerpos monoclonales que se unen a las líneas de células de cáncer humano se purificaron de sobrenadantes del cultivo de tejido utilizando la cromatografía por afinidad de proteína G. Si se requirió el sobre nadante del cultivo de tej ido se puede pasar sobre una columna de IgG bovino antes de la purificación del anticuerpo para remover el exceso de IgG bovino. Los siguientes materiales se utilizaron para el proceso de purificación del anticuerpo: sobre nadante de cultivo de tejido de hibridoma, regulador de pH que se une el IgG (G) inmunopuro (Pierce No 21011 Rockford, IL) , regulador de pH de elusión de IgG inmunopuro Pierce No 21009) , HCL concentrado (para ajustar el pH) , un litro de PES Corning (polisulfona de poliéter), 0.22 µm de filtro (Corning No 431098, Corning, NY) , sistema explorador AKTA de Amersham farmacia (Amersham Biosciencies, Piscataway, NJ) , sefarosa 4 de proteína-G de flujo rápido (Amersham Biosciencies No 17-0618-03) , regulador de pH de corte que consiste en tiocianato de potasio al 3 m (50 mm de tris pH 7.8), y PBS (salina amortiguada con fosfato), tris al 3 m con pH 9.0. Para purificar el SPL1 antihumano de ratón, el LUCA19 antihumano de ratón y el LUCA40 antihumano de ratón preferidos aquí como mu-SPLl, mu-LUCA19 y mu-LUCA40, respectivamente, el volumen del sobre nadante se midió y un volumen igual de regulador de pH de unido se agregó al sobre nadante. La mezcla se le permitió equilibrarse a temperatura ambiente. El sobre nadante se clarificó mediante pasarlo a través de un filtro de 0.22 µm. El sobre nadante se cargó sobe una columna de proteína-G sefarosa utilizando el sistema explorador AKTA (Amersham Biosciencies) , y luego se lavó con 5 a 10 volúmenes de columna de regulador de pH de unido. El anticuerpo monoclonal se eluyó con el regulador de pH de elusión y las fracciones se recolectaron. Las fracciones se neutralizaron luego de la elusión con la adición de tris al 3 m, pH 9.0 en tubos vacíos (1/60 volumen de las fracciones). Las fracciones pico que contenían el anticuerpo monoclonal se agruparon. Las muestras agrupadas se inyectaron en un cásete analizador de deslizamiento prehúmedo (10000 MW de corte; Pierce No 66810) y se dializó en 1 por PBS a 4°C (con tres cambios de regulador de pH de cada uno 4 horas de diálisis por cambio) . El anticuerpo monoclonal purificado fue filtrado estéril (0.2 µm Acrodisc) y almacenado entre 2 a 8 °C. Una muestra de anticuerpo purificado se toma para la determinación de la concentración mediante absorbancia UV (A28o) y electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) . El SDS-PAGE se corre bajo tanto condiciones no reductoras como condiciones reductoras para el análisis del peso molecular, la identificación del patrón de la unión típico de anticuerpos monoclonales y la determinación de la pureza . Después de la purificación del mu-SPLl, mu-LUCA19 y mu-LUCA40 del sobre nadante de hibridoma, este se reensayó en cuanto a la unión para la inmunización respectiva o las células objetivas de interés. Las muestras de células se prepararon como se describió anteriormente y se incubaron con el anticuerpo purificado en varias concentraciones. Después de la incubación las células se lavaron, resuspendidas en 0.1 ml de diluyente e incubadas 1 µg de fragmento F(ab)'2 conjugado con FITC de IgG anti-ratón de cabra durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron, resuspendidas en 0.5 ml de diluyente FACS y analizadas utilizando el clasificador de células FACScan (Becton Dickinson, San José, CA) . Un cambio a la derecha en el histograma del FACScan indicó que el anticuerpo purificado todavía se ligaba a las células. En otros experimentos, el unido mu-SPLl, mu-lUCA19 y mu-LUCA40 a SPL1, LUCA19 y LUCA40, respectivamente, se ensayo y se confirmó utilizando el HELISA en células vivas. El siguiente método se utilizó aunque otros métodos comúnmente conocidos en el campo son aplicables . Células (HT-29, SKOV3, SUMES-1, SW480, SKBR-3 y HPAFII) se cultivaron en 10 % de suero bovino fetal (FBS) que contenía el medio para la confluencia sobre el cultivo de tejido tratado en placas de 96 cavidades (Falcon) . Las células se lavaron con PBS y se incubaron con 50 µl de anticuerpos deseados a una concentración deseada en solución de sal balanceada de Hank (HBSS) que contiene 1% de BSA y 0,1% de azida de sodio durante una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron entonces tres veces con 100 µl por peso de HBSS antes de la incubación con peroxidasa de rábano (HRP) anticuerpo secundario (50 µil por cavidad diluido en HBSS) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron finalmente tres veces con HBSS y el sustrato de cambio de color (sustrato TMB, KPL) se agregó a cada cavidad a 100 µl por cavidad. La reacción de cambio de color se detuvo con la adición de 100 µl por cavidad de ácido fosfórico al 1 m. Las placas se leyeron entonces en O.D. 450 nm. Ejemplo 4 . Análisis Western blot de la expresión de SPL1 , LUCA19 y LUCA40 en línea celular de cáncer SW480 La línea de células de carcinoma de célula renal SW480 (ATCC No CCL-228) se hizo crecer para proliferar sobre 175 cm2 de platos de cultivo. La mono capa confluente se lavó tres veces con solución de sal balanceada de Hank (HBSS más bicarbonato que no contenía sodio o fenol rojo; regulado en el pH con 10 mm de HEPES, pH 7.4; Sigma Chemicals) y bioteñido con 200 µg de sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce Endogen) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células entonces se lavaron con HBSS+ tris al 0.1 m, pH 7.4 (Sigma Chemicals) e incubadas en HBSS+ un contenido de tris al 0.1 m, pH 7.4 durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron finalmente tres veces con HBSS+ y usadas para su incubación durante cinco minutos, sobre hielo, en regulador de pH de lisis (HBSS+ con 2% de Tritón X-100, 2 mm de PMSF, 0.1% de azida de sodio, y una tableta por 5 ml de regulador de pH de lisis de EDTA libre en un cóctel miniproteasa completo (Roche Molecular Biochemicals) ) . Las células se rasparon en el regulador de pH de lisis y los lisatos recolectados. Los lisatos se centrifugaron a 14000 por g durante una hora a 4°C. El lisato clarificado fue entonces preclarificado durante dos horas a 4°C con 5 µl de perlas de sefarosa 4MB CNBr conjugadas con IgG humano (1 mg/ml) (Amersham Farmacia) . Las perlas de IgG humano fueron centrifugadas y removidas, y luego el lisato preclarificado se incubó con anticuerpo monoclonal mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 conjugado con perlas de sefarosa 4MD CNBr (conjugado a un mg/ml) durante dos horas a 4°C. Las perlas de mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 se centrifugaron y removieron después de dos horas de incubación. Tanto el IgG humano y las perlas de mu-SPLl, mu- LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 se lavaron lavadas individualmente tres veces con 1 ml de regulador de pH de lisis y entonces lavadas tres veces con 1 ml de HBSS+ . Las perlas lavadas se eluyeron mediante la adición de 30 µl de un regulador de pH de muestra SDS-PAGE y se hicieron hervir a 99 °C durante 5 minutos . Las muestras se resolvieron entonces sobre un gel de gradiente novel de 4 a 20% (Invitrogen) , y se transfirieron en una membrana de nitrocelulosa de 0.2 µm (Invitrogen) y se visualizó mediante estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) (Pierce Endogen) o manchadas western con 5 µg/ mancha de mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40. Para la detección con la estreptavidina conjugada con HRP, la nitrocelulosa se bloqueó primero durante una hora con regulador de pH de bloque (5% de leche seca sin grasa en salina amortiguada con tris con 0.05% de tween-20 (TBST)). La estreptavidina conjugada con HRP se diluyó en TBST a 1 µg/ml y se expuso a la microcelulosa durante 30 minutos a temperatura ambiente. La nitrocelulosa se lavó tres veces con TBST antes de la visualización con ECL+ (Amersham) . Para el Western blot con mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 0 mu-LUCA40, la nitrocelulosa se bloqueó similarmente durante 1 hora en regulador de pH de bloqueo. La nitrocelulosa se incubó entonces en una bolsa plástica sellada al calor que contenía 1 ml de 5 µg/ml de mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 mu.LUCA40 diluidos en regulador de pH de bloqueo. La nitrocelulosa se lavó tres veces con TBST antes de la incubación con 10 ml de IgG anti-ratón de burro conjugado con HRT 1 µg/ml (cadena pesada y liviana específica, absorbido de malla cruzada contra proteínas de suero bovino, pollo, cabra, conejillo de indias, Hámster chino, caballo, humano, conejo, oveja; Jackson Immunoresearch Cat. No 709-035-149) durante una hora a temperatura ambiente. La nitrocelulosa fue finalmente lavada tres veces con TBST y se visualizó mediante SL+ (Amersham) . Ejemplo 5. Métodos inmunohistoquímicos Muestras de tejido congelado de pacientes con cáncer fueron embebidos en un compuesto OCT con congelamiento rápido en isopentano con hielo seco. Las criosecciones se cortaron con un bisturí Leica 3050 CM en un espesor de 8 a 10 µm y se montaron descongeladas el portaobjetos SuperFrost Plus (VWR No 48311-703) . Las secciones se fijaron con 75% de acetona/25 % de etanol a 10 °C y se les permitió secarse al aire 2 a 4 horas a temperatura ambiente. Las secciones fijas se almacenaron a -80°C hasta el uso. Para la inmunohistoquímica, las secciones de tejido se recuperaron lavadas en tris amortiguado con 0.05% de tween (TB-T) y bloqueadas en regulador de pH de bloqueo (TB-T, 5% de suero de cabra normal y 100 µg/ml de avidina) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las portaobjetos fueron entonces incubadas con los anticuerpos monoclonales mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 y de control diluidos en regulador de pH de bloqueo (1 µg/ml) . Durante 60 a 90 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron entonces tres veces con el regulador de pH de bloqueo. Los anticuerpos monoclonales unidos fueron detectados con conjugados de IgG anti-ratón de cabra más IgM (H+L) F (ab' ) 2-peroxidasa y la diaminobencidina en el sustrato de perodixidasa (1 mg/ml, Sigma Cat. No. de 5637) en 0,1 m de regulador de pH de acetato de sodio a pH 5.05 y 0.003% de peróxido de hidrógeno (Sigma Cat. No. H1009) . Los portaobjetos teñidos fueron contra-teñidos con hematoxilina y examinadas bajo el microscopio Nikon. En algunos casos, la parafina embebida en tejidos fijados por formaldehido se puede utilizar para la inmunohistoquímica después de que los métodos de recuperación de antígeno apropiados fueron empleados. Uno de tales métodos de recuperación de describe en Mangham e Isaacson, Histopatology 35129-33 1999) . Otros métodos de recuperación de antígeno y/o detección se pueden utilizar por aquellos versados en la técnica. Los resultados de experimentos similares llevados a cabo utilizando tejidos congelados o, cuando es apropiado, tejidos fijos con la recuperación de antígeno y la detección de polyMICA se llevaron a cabo. El unido de los anticuerpos anti-LUCA19, anti-SPLl, y anti- LUCA40 a una variedad de tejidos normales y de cáncer se determinó. En todos los casos, el anticuerpo se ligó en tejidos fijos de control fue correlacionado con aquella de los tejidos congelados. Los resultados de los tejidos congelados se usaron solamente si dos no casaban en los controles . Para la conveniencia, un resumen de los resultados combinados de diversos experimentos que utilizan tejido quirúrgico congelado de diferentes fuentes se muestra abajo en las tablas 1 a 7. Las tablas 1 a 4 resumen la distribución de los antígenos LUCA19, SPL1, SG5 y LUCA40 sobre tejidos humanos normales. Las tablas 5 a 7 resumen la distribución de los antígenos LUCA19, SPL1, y LUCA40 sobre varios tejidos de tumor humano.
Ejemplo 6. Resultados de la inmunocitoquímica Los anticuerpos monoclonales mu-SPLl, mu-LUCA19,y mu-LUCA40 se utilizaron para el ensayo de reactividad con varias líneas de células de diferentes tipos de tejidos. Los resultados se registraron como "+" para un manchado positivo y "++" para un manchado positivo moderado, "+++" para un manchado fuerte positivo y "-"para manchado negativo. Los resultados de la inmunohistoquímica se obtuvieron utilizando la tecnología CellArray™, como se describió en la WO 01/43869. Las células de diferentes líneas celulares establecidas se removieron de la superficie de crecimiento sin utilizar proteasas, se empacaron y embebieron en el compuesto OCT. Las células se congelaron y seccionadas, y se mancharon utilizando un protocolo IHC estándar. Los resultados de la unión de los anticuerpos de mu-SPLl, mu-LUCA19, y mu-LUCA40 a diversas líneas de células de tumor y normales humanas establecidas son compiladas para conveniencia en las tablas 8-10. Los experimentos representados en la tabla 8 incluyen el HELISA de célula viva, el arreglo de sarcoma y el CellArray™ como experimentos de unido con el mu-LUCA19 utilizando los métodos descritos aquí. Los experimentos representados en la tabla 9 incluyen los experimentos de unido por HELISA de célula viva, el arreglo de sarcoma y el CellArray™ con mu-LUCA40 utilizando los métodos descritos aqui. Los experimentos representados en la tabla 10 incluyen los experimentos de unido por HELISA de célula viva, el arreglo sarcoma y el CellArray™ con el mu-SPL1 utilizado los métodos descritos aquí.
* CC-2251 BioWhittaker Tabla 9. Unión del Mu-LUCA40 * CC-2251 BioWhitaker Tabla 10. Unión del Mu-SPLl *CC-2251 BioWhitaker Los resultados de la unión de los anticuerpos de mu-LUCA19, mu-LUCA40 y mu-SPLl a diversas líneas de células de tumor establecidos del Instituto Nacional de Cáncer (NCI) con compilados para conveniencia en la tabla 11 utilizando los métodos descritos aquí.
Los anticuerpos monoclonales mu-LUCA19, mu-LUCA40 y mu-SPLl fueron usados para ensayar la reactividad con líneas de células derivadas de glioma. Los resultados de la inmunocitoquímica fueron obtenidos utilizando protocolos similares a los descritos anteriormente para la tecnología CellArray™ Technology. Las líneas de células derivadas de gliomas fueron removidas de la superficie de crecimiento sin usar proteasas, se empacaron y se embebieron en el compuesto OCT. Las células fueron congeladas y seccionadas, y luego se manchó usando un protocolo IHC estándar. El Mu-LUCA19 positivo sobre 17 de 25 líneas de células derivadas de glioma tapizadas. La intensidad del manchado vario entre +/-a 3+ en manchado. El Mu-LUCA40 fue positivo sobre 18 de 25 líneas de células derivadas de glioma tapizadas. La intensidad del manchado varió entre +/-a 3+ en manchado. El Mu-SPL-1 fue positivo fue sobre 14 de 25 líneas de células derivadas de glioma tamizadas. La intensidad del manchado varió entre +/-a 3+ en manchado. Ejemplo 7. Aislamiento y caracterización del antígeno Ag-SPLl , Ag-LUCA19, Ag-SG5 y Ag-LUCA40 Para identificar el antígeno con el cual el SPL1, LUCA19, SG5 y LUCA40 fueron reactivos, un experimento de inmunoprecipitación (Ippt) fue llevado a cabo. Para la inmunoprecipitación, 30 frascos de 175cm2 células S 480 fueron lisados con 30ml de regulador de pH de lisis. El regulador de pH de lisis consistió de una solución de sal balanceada de Hank (HBSS+) fortificada con 2% de Tritón X-100, cóctel de inhibidor de proteasa (1 tableta por 5ml de regulador de pH de lisis de cóctel de proteasa libre de mini de EDTA completo de Roche Molecular Biochemicals), 0.1% de azida de sodio, y 2Mm PMSF. El lisato celular fue clasificado a 24000xg durante 30 minutos a 4°C antes de ser pasado por una columna que consiste de 1 ml de proteínas G (Amersham Pharmacia) . El lisato de S 480 pre-clarificado fue entonces incubado con muSPL1, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 absorbidos con proteínas G (lOµg de mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 fueron reincubados durante 30 minutos a temperatura ambiente con 5µl de proteínas G) durante 2 horas a 4°C. Las perlas (tanto de las perlas de proteínas G pre-claras y las perlas de mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 absorbidos con proteínas G) fueron entonces lavadas 3 veces con regulador de pH de lisis antes de la elusión con 30µl de regulador de pH de muestra SDS (3% de SDS, 20 glicerol, lOmM de DTT, 2% de bromo fenol azul, 0,1M tris, pH8.0). 25µ?l del eluato fueron entonces resueltos por SDS-PAGE y visualizados mediante el manchado Coomassie. 5µl del eluato fue resuelto por SDS-PAGE y transferido adicionalmente a nitrocelulosa para el manchado western. La mancha fue entonces probada con mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 y se desarrolló usando un kit de Western Blotting (Invitrogen Cat. No. WB7103) para confirmar el reconocimiento del antígeno. Mediante el manchado Western el mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 y el eluato de IgG de ratón contra el mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40, una proteína única al eluato de mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 fue observado. Las bandas de la proteína manchada del gel NuPAGE fue cortada usando cuchillas de escalpelo limpias y se colocaron en tubos Eppendor limpios. Las bandas cortadas fueron almacenadas a -20°C hasta que se usaron para la identificación de la proteína mediante espectrometría de masa. Ejemplo 8. Caracterización del antígeno al cual el mu-SPLl , mu-LUCA19 , mu -SG5 o mu-LUCA40 se une usando espectrometría de masa en derivación (MS/MS) Los antígenos a los cuales mu-SPLl, mu-LUCA19, mu- SG5 y mu-LUCA40 se unen fueron aislados como se escribió en el ejemplo 7 sometidos a espectroscopia de masa paralelo Tándem de acuerdo con el método de Kane y otros J Bio Chem. 2002 Junio 21; 277 (25) : 22115-8 , Epub Mayo 06. Las proteínas son separadas mediante SDS-PAGE, y el gel es manchado con el reactivo azul Coomassie coloidal (Invitrogen) . Las proteínas de interés son digeridas en el gel con tripsina. Los péptidos trípticos son secuenciados mediante cromatografía liquida micro capilar MS/MS sobre un espectrómetro de masa de trampa iónica (Termo-Finnigan LCDQ DECA XP) , según se describió en Wu y otros, Nature 405:477-482(2000). Alternativamente, otros métodos comúnmente conocidos de espectrometría de masa, tales como la espectrometría de masa MALDI, también son usados en la práctica de esta invención. Los resultados del análisis de espectroscopia de masa mostró que antígeno al cual mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 y mu-LUCA40 era EphA2. Ejemplo 9. Emparedado ELISA para mapeado del epítopo del mu-SPLl , mu-LUCA19 , mu-SG5 y mu-LUCA40 El epítopo especifico sobre el EphA2 1 cual el mu- SPL1, mu-LUCA19, mu-SG5 y mu-LUCA40 se une fue determinado usando un Sandwich ELISA competitivo. 50µl/ poso de 10µg/ ml concentración mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 o mu-LUCA40 fueron diluidos en HBSS (solución de sal balanceada de Hank sin bicarbonato de sodio y fenol rojo) y se le permitió unirse a placas micro título Maxisorb de 96 cavidades durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas recubiertas son entonces bloqueadas durante 30 minutos con HBSS que contiene 1% BSA (P/V) . Las células HT-29 fueron lisadas como se describió en el ejemplo 7. El lisato es entonces aplicado a los cavidades del micro título bloqueados en un volumen de 150µl por cavidad. Se le permite a los lisatos incubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, la placa es entonces lavada muy bien con regulador de pH de bloqueo. El mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 y mu-LUCA40 bioteñidos , a una concentración de 50µl/ cavidad, lµl/ ml, son agregados a los cavidades micro títulos y se le permite encubarse durante 1 hora a temperatura ambiente. El mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 y mu-LUCA40 bioteñidos fueron preparados mediante encubar lµg de 200 mg/ml de sulfo-NHS-LC-Botín diluido en DMSO por cada lmg de anticuerpo purificado durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos bioteñidos son entonces calmados con una concentración final de 0.1M Tris, pH 7.4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo bioteñido es entonces separado de la biotina libre mediante concentrar por un filtro de corte de peso molecular de 30 kDa. Después de 1 hora de incubación de los anticuerpos bioteñidos, las placas son lavadas muy bien con HBSS. Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (SA-HRP) es diluida en HBSS a una concentración de 1:10000. El SA-HRP diluido es agregado en los cavidades micro títulos lavados a razón de 50 µl/ cavidad y se le permitió incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de SA-HRP, la placa es finalmente lavada muy bien con HBSS y desarrollada con la adición de 100 µl/cavidad de sustrato TMB de una etapa para una reacción de cambio de color. El desarrollo es detenido con la adición de 100 µl/ cavidad de ácido fosfórico al 1M diluido en agua Milli-Q. La placa desarrollada es entonces analizada con el lector de placa de micro titulo ThermoMax a 450 NM.
De los resultados del Sandwich ELISA competitivo, podemos concluir que el mu-SPLl, mu-LUCA19, mu-SG5 y mu-LUCA40 representan 3 anticuerpos que se unen al EphA2 mediante dos epítopos distintivos, 1 representado por el mu-LUCA40, y el segundo por mu-SPLl. El mu-LUCA19 parece compartir, pero no sobreponerse directamente al epítopo representado por el mu-SPLl. El sobre posicionamiento no se extiende dentro del epítopo representado por el epítopo mu-LUCA40. Ejemplo 10. Caracterización adicional del mu-LUCA19 y mu-SG5 La estimulación del EphA2 en células G55, una línea de células de glioma que expresa EphA2 endógeno, fue estudiada usando mu-LUCA19 y mu-SG5. Las células fueron tratadas con mu-LUCA19 o mu-SG5 en concentraciones increméntales hasta 30 µl/ml y el contenido de fosfotirosina del EphA2 inmunoprecipitado fue medido mediante análisis Western blot con anticuerpos específicos a fosfotirosina (4G10, Upstate Cell Signaling Solutions, New York) . Ninguna diferencia en el contenido de fosfotirosina en el EphA2 inmunoprecipitado de las células G55 tratadas sea con mu-LUCA19 o mu-SG5 se dio. Los controles del western blots para el contenido de EphA2 total se llevaron a cabo para asegurar que la proteína EphA2 total que fue inmunoprecipitada era la misma para cada condición del tratamiento. Resultados similares fueron vistos usando células A549 y mu-LUCA19 y anticuerpos mu-SG5. Estos resultados indican que el tratamiento de las células que expresan el EphA2 endógeno con mu-LUCA19 o mu-SG5 no incrementa o disminuye el contenido de fosfotirosina del EphA2. Ejemplo 11. Efecto del mu-SPLl , mu-LUCA19 Y mu-LUCA40 sobre líneas de células de cáncer La habilidad de los anticuerpos para reducir el número celular in vitro cuando se hacen crecer como una monocapa puede ser determinada usando monocapas de células cultivadas en la presencia o ausencia de cantidades variables de anticuerpo purificado de ensayo o de control y el cambio en el numero celular determinado usando MTT. El MTT es una tintura que mide la actividad de las enzimas mitocondriales y correlaciona con el número celular viable relativo. Las células de interés fueron colocadas en placas y cultivadas en F12/DMEM (1:1) como medio de crecimiento suplementado con 10% de suero bovino fetal en placas de 96 cavidades. Las líneas celulares fueron colocadas en placas en cavidades triplicados del plato de 96 cavidades en un rango de densidad ente 1500 a 2500 células/cavidad. Inmediatamente después de la colocación en placas, el n mu-SPLl, mu-LUCA19, o mu-LUCA40 fueron agregados. Las células fueron encubadas a 37°C en un incubador unificado a 5% de CO2/ aire durante 5 días. Al final del ensayo, el MTT fue disuelto en PBS (5mg/ml) y se agrego directamente a los cavidades en una dilución de 1:10. Las placas fueron colocadas de nuevo en el incubador durante 4 horas. Después de la incubación el medio fue removido y se agrego lOOµl de DMSO para solubilizar el precipitado MTT. Las placas fueron leídas en O.D. 540nm. En estos experimentos, el mu-LUCA40 inhibió el crecimiento de 786-0, A547, Caki-2, ES-2, SKMES-1, y SK0V3, y SPL1 y LUCA19 no lo hicieron. Ejemplo 12. Internalización del mu-LUCA19, mu-SG5 y mu-LUCA40 y el IgG ant i -ratón conj ugado con toxina El Mab-ZAP (Advance Targeting Systems, San Diego, CA) es IgG de anti-ratón conjugado a la saporina, una toxina que inhibe la síntesis de la proteína. Esta toxina es impermeable a la membrana celular. Si un anticuerpo monoclonal es unido al antígeno de superficie celular que es internalizable, el conjugado de toxina puede unirse al enlace monoclonal y, por lo tanto, ser internalizado y eventualmente matar la célula. Siendo dependiente de la internalización para la demostración de la actividad toxica, el Mab-ZAP puede servir para evaluar si o no un antígeno de superficie dado servirá como objetivo adecuado para cualquier toxina que sea dependiente de internalización para expresar los efectos tóxicos celulares. Como tal Mab-ZAP sirve como un modelo para tales toxinas dependientes de internalización tal como la maitansinoides y la caliqueamicina. Para ensayar la internalización del mu-LUCA19 y mu- LUCA40 y el IgG anti-ratón conjugado con saporina por las células de tumor y efectuar la matanza de las células de tumor después de la internalización de la saporina, células de glioma humano, G130 fueron removidas de frascos de material con 10 Mm de EDTA y se centrifugaron. Las células fueron resuspendidas a razón de 50000/ ml en medio apropiado y 100 µl colocadas en placas por cavidad en placas de 96 cavidades. El anticuerpo mu-SPLl, mu-LUCA19 o mu-LUCA40 fue agregado inmediatamente a los cavidades apropiados en lOx de concentrado, para hacer una concentración de 10 µg/ml . Después de 15 minutos a temperatura ambiente el Mab-ZAP (Cat. # IT-40, Advance Targeting Systems, San Diego CA) se agrego a los cavidades apropiados como lOx concentrado, para hacer una concentraron final entre .OOlnm en 10 NM. Después de 4 días de crecimiento, el MTT fue agregado (material de 5mg/ml de PBS, 1:10 en dilución en cavidad) durante 4 horas a 37°C. El medio fue entonces removido de todos las cavidades y se agrega 100 µl/ cavidad de DMSO. Las placas fueron balanceadas suavemente para solubilizar el precipitado de MTT azul y las placas fueron leídas en O.D. 540 NM. Hubo una disminución en el manchado MTT en las células G130 en la presencia de mu-LUCA19 y mu-LUCA40 en comparación con el manchado en la ausencia de aquellos anticuerpos . Esto indica que el crecimiento de las células G130 fue inhibido en la potencia mu-LUCA19 y mu-LUCA40 y el Mab-ZAP y estos resultados son indicativos de que el mu-LUCA19 y el mu-LUCA40 y el IgG anti-ratón conjugado con la toxina fueron internalizados en las células G130. Los resultados similares fueron vistos usando células ES-2, una línea de células de carcinoma de ovario, y anticuerpos mu-SG5. Hubo una disminución en el manchado MTT en las células ES-2 en la presencia de mu-SG5 comparado con el manchado en la ausencia de este anticuerpo. Esto indica que el crecimiento de las células ES-2 fue inhibido en la presencia de mu-SG5 y Mab-ZAP. Este resultado es indicativo de que el mu-SG5 y el IgG anti-ratón conjugado con la toxina fueron internalizados en las células ES-2. Ejemplo 13. Eficacia del anticuerpo anti -EphA2 , SPL1 y LUCA40 con células humanas en ratones desnudos Células de tumor humano fueron injertadas debajo de la cápsula de riñon en ratones desnudos (nu/nu) . 3 líneas de células de tumor fueron usadas. Las líneas de células derivadas de tumor de ovario ES-2 y SKOV3-3, y las líneas de células derivadas de tumor de riñon Caki-2 fueron obtenidas del ATCC. En algunos estudios ambos riñones recibieron xenoinjerto. Para los animales tratados como a los injertos fueron hechos en la cápsula de riñon (50 k células en gel de colágeno). El anticuerpo monoclonal anti-EphA2, SPL1 o LUCA40 fueron inyectados intraperitonealmente a una concentración de 50mg/kg y un volumen de 0.01 ml/g por peso del cuerpo. La dosificación fue iniciada en el día 2 luego de la implantación, y las dosis de SPL1, LUCA40 o PBS fueron administradas 3 veces semanalmente como inyecciones únicas rápidas. Los ratones de control fueron inyectados con PBS solamente. Tres días después de la inyección final, los animales fueron eutanizados y los riñones con los injertos fueron examinados . La cantidad de ADN humano en los tumores fue cuantificada usando PCR en tiempo real sobre un sistema Applied Biosystems (Foster City, CA) SDS7000, con iniciadores y probetas especificas para el gen ribosómico humano RPL19 de acuerdo con los métodos publicados. Cada muestra de tumor fue analizada en reacciones PCR triplicadas y las concentraciones de ADN promedio fueron determinadas. La concentración de ADN promedio y el error estándar de la media fueron determinados para cada grupo de muestras de tumor. La significancia estadística fue determinada usando el ensayo t de Student (2 colas, tipo 1) . La inhibición del crecimiento del tumor fue calculada como el valor absoluto de [ (volumen de tumor promedio del grupo tratado/volumen de tumor promedio del grupo de control con PBOxlOO] -100. En datos no mostrados el, SPL1 apareció sobre la visual y le examen manual redujo el tamaño de los tumores, con relación a los tumores, usando líneas celulares Caki-2 y ES-2. Resultados similares fueron vistos en los ratones tratados con LUCA40 e implantados con tumores Caki-2. Las cuantificaciones de ADN para los tumores Caki-2 de los ratones tratados con anticuerpos LUCA40 confirmaron que los ratones tratados con LUCA40 tenían tumores más pequeños en relación a los controles. La tabla 12 muestra otros diseños de estudio de xenoinjerto de cápsula sub-renal con anticuerpos SPL1 y resultados de cuantificaron de ADN de estos estudios. Tabla 12. Diseño de estudio de modelos de xenoinjertos de cápsula sub-renal con SPL1 y resultados *TGI = Inhibición de crecimiento de tumor vs . Grupo de control con PBS; los valores p-fueron determinados por el ensayo T de Student, no emparejado. Ejemplo 14. Eficacia del anti - tumor del SPL1 en un modelo subcutáneo de tumores ovarios humanos Este estudio fue diseñado para ensayar los datos anti-tumor con respuesta a dosis para el anticuerpo SPL1 en un modelo subcutáneo de cáncer de ovario y cáncer de pulmón. Las líneas de células derivadas de tumor de ovario ES-2 fue re derivada de un tumor de crecimiento rápido identificado como un estudio de modelo de tumor subcutáneo piloto. Las células derivadas del tumor de pulmón A549 fueron obtenidas de ATCC. Las células cultivadas fueron triptinizadas, lavadas en el medio, hechas girar y resuspendidas en el medio a 100 millones de células por mm de medio. (5 millones de células x 0.05 ml . de volumen), entonces se mezclaron en un volumen igual de Matrigel® para un volumen de inyección final de 0.1 ml . Ratones homocigotos nu/nu CRL hembras fueron usados. Las células fueron inoculadas mediante inyección subcutánea en la parte trasera del cuello del ratón. Las dosis fueron iniciadas sea sobre el día de implantación o cuando los tumores fueron establecidos inmedibles. La dosificación del día 0, los tumores fueron implantados en la mañana y los animales fueron dosificados por la tarde el mismo día. Para tumores establecidos, los animales fueron aleatorizados entre grupos como sigue: volúmenes de tumor fueron determinados, animales fueron clasificados por volumen de tumor, la media fue determinada y el numero apropiado de animales (12 a 15 por grupo dependiendo del de modelo) fueron seleccionados por encima y por debajo de la media, removiendo del estudio aquellos con tumores muy pequeños o muy grades . El resto de animales fueron aleatorizados por número de tarjetas en las orejas dentro del tratamiento y los grupos de control . La distribución aleatoria de los grupos finales fue confirmada por el ensayo T(p > 0.1 fue considerado aleatorizado) . Para cada grupo de dosis de tratamiento, el SPL1 fue diluido en PBS a una dosis de concentración apropiada (50 mg/kg para el estudio de las células ES-2 y un rango de concentración de 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg para el estudio de células a A549) y el control PBS se administro a un volumen de 0.01 Ml/g por peso de cuerpo. Las dosis de SPL1 o PBS fueron administradas dos veces por semana como inyecciones únicas rápidas en la cavidad intraperitoneal. Los ratones de control fueron inyectados con PBS solamente. La fue iniciada en grupos de 12 a 15 ratones cuando los tumores alcanzaron el tamaño apropiado, dependiendo del estudio. Se le permitió a los tumores crecer durante aproximadamente 6 días antes de la medida de tumor inicial. Los tumores fueron lo suficientemente medidos dos veces por semana mediante tal y digital en 3 dimensiones, y el volumen del tumor fue calculado como la mitad del producto de las 3 medidas. El volumen del tumor durante el tiempo fue el punto final principal para todos los estudios. Las observaciones clínicas fueron hechas diariamente. El peso del cuerpo fue determinado para cada animal dos veces en la semana. Los volúmenes de tumor promedio y el error estándar de la media fueron determinados para cada grupo en cada medida. Las significancia estadística fue determinada usando el ensayo T de Student (2 colas, tipo 1) . La inhibición de crecimiento de tumor fue calculada como el valor absoluto de [ (volumen de tumor promedio del grupo tratado/volumen de tumor promedio del grupo de control con PBS)X 100] -100. La tabla 13 muestra los diseños de xenoinjertos subcutáneos y los resultados. Tabla 13: Diseño del estudio del modelo de xenoinjerto SPL1 SC y los resultados *TGI = Inhibición del crecimiento del tumor contra grupo de control de PBC Como muestra la Figura 1, un subconjunto de SPL1 tratado con xenoinjerto A549 se encontró que vuelve a crecer lentamente después de la cesación de la dosis, con el recrecimiento del tumor definido como un incremento en el volumen de 2 veces o más después de la cesación de la dosis. 7 de 16 ratones en el grupo de tratamiento de 100 mg/kg tenían recrecimiento del tumor, mientras que 9 de 16 ratones en el grupo de tratamiento de 100 mg/kg permanecieron libres de tumor después de la cesación de la dosis. Similarmente, 3 de 15 ratones en el grupo de 30 mg/kg tuvieron recrecimiento de tumor, mientras que 12/15 ratones en el grupo de 30 mg/kg permanecieron libres de tumor luego de la cesación de la dosificación. Los resultados graficados en la figura 1 después del "para la dosis" representa solamente el tamaño del tumor de los ratones que tenían un recrecimiento de tumor .
Se entiende que los ejemplos y modalidades descritos aquí tienen propósitos ilustrativos solamente y que diversas modificaciones o cambios a la luz de lo anterior puede ser sugeridos por personas basada en la técnica y que deben estar incluidos dentro del espíritu y visión de esta solicitud. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes patentes solicitadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado que si cada publicaron individual, patente o solicitud patente fuera especifica e individualmente indicada que se incorpora como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Una inmunoglobulina o un fragmento que se une a antígeno sustancialmente purificado de la misma caracterizado porque es SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40. 2. - Una inmunoglobulina sustancialmente purificada o un fragmento que se une al antígeno de la misma, caracterizada porque se une específicamente al EphA2, y tiene por lo menos una de las características del SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40: a. la habilidad para unirse al EphA2 sobre una célula de cáncer; b. la habilidad para unirse a una porción del
  2. EphA2 que está expuesto sobre la superficie de una célula de cáncer viva in vi tro o in vivo; c. La habilidad para impedir la proliferación de células de tumor sin incrementar el contenido de fosfotirosina del EphA2 ; d. la habilidad para suministrar un agente terapéutico o marcador detectable a una célula de cáncer que expresa el EphA2 ; y e. la habilidad para suministrar un agente terapéutico o marcador detectable dentro de una célula de cáncer que expresa el EphA2.
  3. 3. - Una secuencia de ácido nucleico aislada caracterizada porque codifica para la inmunoglobulina o el fragmento que se une al antígeno de la misma de conformidad con la reivindicación 1.
  4. 4. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor.
  5. 5.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el promotor y el ácido nucleico son contenidos en un vector de expresión.
  6. 6. - El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal.
  7. 7.- Una línea de células transfectada, transformada, o infectada con un vector caracterizada porque contiene un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3.
  8. 8. - Un método para producir una inmunoglobulina sustancialmente purificada, o un fragmento que se une al antígeno de la misma, caracterizado porque comprende las etapas de : a. hacer crecer una línea de células transformada con el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3 bajo condiciones en las cuales la inmunoglobulina o el fragmento que se une al antígeno son expresados; y b. cosechar la inmunoglobulina o el fragmento expresados .
  9. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la línea de células es un hibridoma.
  10. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el hibridoma es ATCC No. PTA- 5070, PTA-6056, o PTA-6059, o el hibridoma SG3.15B4.1F9.
  11. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal .
  12. 12.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una dosis terapéuticamente efectiva de la inmunoglobulina purificada o del fragmento que se une al antígeno de conformidad con la reivindicación 1, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  13. 13. - Un hibridoma caracterizado porque está depositado en la Colección de Cultivo de Tipo Americano que tiene el numero de acceso PTA- 5070, PTA- 6056, o PTA- 6059, o el hibridoma SG3.15B4.1F9 ( PTA-XXXX) .
  14. 14.- Un anticuerpo caracterizado porque es producido por un hibridoma depositado en la Colección de Cultivo de Tipo Americano que tiene el numero de acceso PTA- 5070, PTA-6056, o PTA-6059, o el hibridoma SG3.15B4.1F9 (PTA-XXXX) .
  15. 15. - La inmunoglobulina o el fragmento que se une al antígeno de la misma de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque es humanizada.
  16. 16. - La inmunoglobulina o el fragmento que se une al antígeno de la misma de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque es quimerizada.
  17. 17. - La inmunoglobulina o el fragmento que se une al antígeno de la misma de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque es un anticuerpo humano.
  18. 18.- La inmunoglobulina o el fragmento que se une al antígeno de la misma de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque que es un derivado.
  19. 19.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque la inmunoglobulina purificada o fragmento que se une al antígeno es LUCA19, LUCA40, SG5 o SPL1.
  20. 20.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque la inmunoglobulina purificada o fragmento que se une al antigeno compite para unirse al EphA2 con LUCA19, LUCA40, SG5 o SPL1.
  21. 21.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque la inmunoglobulina purificada o fragmento que se une al antígeno es humanizado.
  22. 22.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12 caracterizada porque la inmunoglobulina purificada o fragmento que se une al antígeno es quimerizado.
  23. 23.- Un método para tratar el cáncer en un paciente que lo requiere, caracterizado porque comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo EphA2 que se une específicamente al EphA2 y tiene por lo menos una de las siguiente características de SPL1, LUCA19, SG5 o LUCA40: a. la habilidad para unirse al EphA2 sobre una célula de cáncer; b. la habilidad para unirse a una porción del EphA2 que está expuesto sobre la superficie de una célula de cáncer viva in vi tro o in vivo; c. La habilidad para impedir la proliferación de células tumorales sin incrementar el contenido de fosfotirosina del EphA2 ; d. la habilidad para suministrar un agente terapéutico o marcador detectable a una célula de cáncer que expresa el EphA2; y e. la habilidad para suministrar un agente terapéutico o marcador detectable dentro de una célula cancerosa que expresa el EphA2.
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