MX2007009349A - Recombinasas de serina de sitio especifico y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para obtencion de una recombinacion de sitio especifico en una celula eucariotica, el metodo comprende proporcionar una celula eucariotica que comprende un primer sitio de union por recombinacion y un segundo sitio de union por recombinacion, hacer contacto del primero y segundo sitios de union por recombinacion con un polipeptido de recombinasa procariotica, lo que resulta en una combinacion entre los sitios de union por recombinacion, en donde el polipeptido por recombinasa puede mediar la recombinacion entre el primero y segundo sitios de union por recombinacion, el primer sitio de union por recombinacion es un sitio de union por recombinacion genomico de fagos (attP) o un sitio de union por recombinacion genomica bacteriana (attB), el segundo sitio de recombinacion es attB o attP y la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de una recombinasa por fago de Listeria monocytogenes, una recombinasa por fago de Streptococcus pyogenes, una recombinasa de fago de Bacillus subtilis, una recombinasa de fago de Mycobacterium tuberculosis y una recombinasa de fago de Mycobacterium smegmatis, con la condicion de que cuando el primer sitio de union por recombinacion es attB, el segundo sitio de union por recombinacion es attP y cuando el primer sitio de union por recombinacion es attP, el segundo sitio de union por recombinacion es attB. La invencion tambien describe composiciones, vectores y metodos de uso de los mismos, para la generacion de celulas transgenicas, tejidos, plantas y animales. Las composiciones, vectores y metodos de la presente invencion tambien son utiles en aplicaciones de terapia genica.

Description

durante la escisión del genoma, partir del genoma hospedero. En estos sist.emas, los irequerimientos mínimos para la reacción de recombinación son: una enzima recombinasa que cataliza el evento de recombinación dos sitios de recombinación (Sadowski (1986) JJ Bacteriol. 165: 341-347; Sadowski (1993) FASEB J. 7: 760 767). En los sistemas de integración por fago, éstos son referidos como sitios de unión { a tt ) , con un elemento attP del ADN del fago y el I interés. Entre ellos, I el desarrollo de cepas de ratón transgénico y tecnologías de direccionamiento del gen que han resultado ser particularmente útiles (Brandon, E., P., Idzerda, R. L. y McKnighjt, G., S. (1995) CurrBiol, 5, 625-34; I Brandon, E., P., Idzeraa, R. L. y McKnight, G., S. (1995) Curr Biol, 5, 758-65) . Estas técnicas han experimentado un nuevo adelanto con la caracterización y aplicación de recombinasas de sitio especifico Kilby, N., J., Snaith, M. , R. y Murray, J. , A. (1993) Trends Genet, 9,413-21). Las recombinasas de! sitio especifico pueden separarse en dos principales familias. La prji-mera, (familia Int o la familia de la recombinasa de la tirosina) comprende estas enzimas que catalizan i la recombinación entre los sitios I localizados ya sea en la misma molécula de ADN (recombinación intramolecular que conduce a la resolución, escisión, o inversión) o en las molétculas de ADN separadas (recombinación intermolecular que conduce a la integración) (Sauer, B., (1993) Methods Enzymol, '225, 890-900; Dymecki, S., M. (1996) I Proc Nati Acad Sci USA.' 93, 6191-6; Abremski, K. , y Hoess, R., (1984) J Biol Chan, ¡259, 1509-14; Nash, H., A. (1996) en i Escherichia coli and i Salmonella cellular and molecular I biology., ed. F. C. Neidhart, R. , ¡I. Curtis, J. , L. Ingraham, E . , Rezaikof f , M . , Riley, M., M. Press, Washington D.C. se ha explotado para I catalizan las reacciones1 intramoleculares e intermoleculares podrían tener una ventaja sobre la familia Int de las recombinasas. Las recomibinasas de serina que catalizan la integración del fago (integrasas) jse adaptan bien sobre todo i 5 para el uso como herramientas d'e la ingeniería genética.

Hasta ahora, tres recombinasas ae la serina, fC31, R4 y TP901-1, se han examinado en las células de mamifero (Groth, I i A.C. y Calos, M.P. (2004) J. Mol. Biol. 335, 667-678). Estas recombinasas fueron observadas para ser autónomas, tener 10 secuencias a t t simples y tener la capacidad de funcionar en las células de mamifero. Debido ¡a que se ha observado una : pequeña o ninguna recombinacion eintre cualquier combinación de sitios distintos a los attP o attB, las integraciones son unidireccionales y existe una frecuencia de integración alta. 15 '20 genoma de una célula hospedera o cortar un polinucleótido del genoma de una célula hospedera.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para obtener una recombinación de sitio especifico estable en una célula I eucariótica. Contrariamente a los reconocidos por el polipélptido de la recombinasa. ! I Los métodos involucran proporcionar una célula 1 J 0 eucariótica que comprende un primer sitio de recombinación y un segundo sitio de recombinación, én el que el segundo sitio de recombinación puede .servir como un substrato para la I recombinación con el pirimer sitio de recombinación. El 1 , primero y segundo sitio de recombinación se pone en contacto 5 con un polipéptido de r.ecombinasal procariótica, resultando una recombinación entre los sitios de recombinación.

Cualquiera o ambos sitios de recombinación pueden estar presentes en un cromosoma de la célula eucariótica. En algunas modalidades, uno! de los sitios de recombinación está objetivo o plásmido del ensayo como se describe en los Ejemplos . La figura 2 muestra los resultados del TIRA para varias recombinasas realizados en célul as de riñon embrionario humano (HEK293) . ' j La figura 3 muestra' los resultados del TIRA para varias recombinasas realizado en células N IH3T3 de ratón. La figura 4 muestrai los resultados del TIRA para varias i recombinasas realizado en células (CHO) de ovarios de hámster chino. La figura 5 muestra los resultados del TIRA para varias recombinasas realizado en células HeLa de humano. i La figura 6 muestra 'los resultados del TIRA, para varias recombinasas realizado ein células estromales de médula ósea de rata. La figura 7 muestra' los resulfc -ados del TIRA para varias recombinasas realizado en I células madre neuronales de ratón.

La figura 8 muestra los resultados del ensayo TIRA para la recombinasa A118 realizados en las células BY2 del tabaco. | La figura 9 describe una representación esquemática de la integración estable del ADN del plásmido que contiene una secuencia attP o attB en el cromosorna HEK293 que contiene el sitio attB o attP. La figura 10 muestrai los resultados de amplificación por PCR de los sitios attL y attR siguiendo la integración En una modalidad especifica, él término "alrededor de" o tirosina o la familia de la integrasa ? (por ejemplo, Cre, Flp, Xer D) y la familia de la resolvasa/integrasa o familia de la recombinasa de serina (por ejemplo, fC31, TP901-1, Tn3, delta gama) . Los "sitios de unión para la recombinación" son secuencias del polinucleótido especificas que están reconocidas por las enziraas de la recombinasa descritas en la presente. Tipicamente, dos sitios diferentes están involucrados (llamado "sitios complementarios") , uno presente en el ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un cromosoma o episoma de una eucariota o proca::iota) y otro en el ácido nucleico que será integrado al sitio de recombinación objetivo. Los términos "attB" y "attP", que se refieren a sitios de unión (o recombinaci ón) originalmente de un objetivo bacteriano y un donador del fago, respectivamente, se usan en la presente,! aunque los sitios de recombinación I I para las enzimas particulares pueden tener nombres diferentes. Los sitios de recombinación incluyen tipicamente extremos izquierdos y extremos derechos separados por un centro o región más espacial. Asi, un sitio de recombinación attB consiste de BOB', en donde B y B' son los extremos izquierdo y extremos derechos, respectivamente, y O es la región del centro. Semej¬antemente, el attP es POP', en dónde el P y P' son los extremos y O es de nuevo la región del centro. Luego de la recombinación entre los sitios attB y attP y la integración c¡oncomitante de un ácido nucleico al objetivo, los sitios del recombinación que flanquean al ADN integrado son referidos como "attLl' y "attR". Los sitios attL y attR, usando la terminología de arriba, consisten en BOP' y POB', respectivamente, j En algunas representaciones en la i presente, la "O" se omite y attB y atiP, por ejemplo, se designan como BB' y PP',| respectivamente. i El término "substancialmente libre" significa una composición que comprende "A (donde "A" es una sola proteina, molécula dé ADN, vector, célula hospedera ! recombinante, etc.) está substancijalmente libre de "B" (donde VB" comprende una o más proteinas icontaminantes, moléculas de ADN, vectores, etc.) cuando por lo menos aproximadamente 75% en peso de las proteinas, ADN, vectores (dependiendo de la categoria de especies en las que A y B pertenecen) en la composición es "A". Preferentemelnte, "A" comprende por lo menos aproximadamente 90% en peso de las especies A + B en la composición, más preferentemente por lo menos aproximadamente 99% en peso. También se prefiere que una composición que está substancialmente libre de contaminación contenga sólo especies de peso moleci-lar simple que tienen la actividad o caracteristica de las especies de interés . El término "aislado" para les propósitos de la presente invención designa un material biológico (ácido nucleico o proteina ) que ha sido rjetirado de su ambiente original (el ambiente en que está naturalmente presente) . Por ejemplo, un polinucleótido presente en estado natural en una planta o un animal no se aisla, sin embargo, los mismos polinucleótidos separados de los ácidos nucleicos adyacentes en los que están relativa. Un polinucleótido está en el estado "purificado" después de la purificación del material < de inicio o del material natural por lo menos en i¡un orden die magnitud, preferentemente 2 o 3 y preferentemente |4 o 5 órdenes de magnitud, Un "ácido nuclei Ico" es un compuesto polimérico 1 comprendido de subunidades enlazajdas covalentemente llamadas nucleótidos. El ácido nucleico incluye ácido poliribonucleico (ARN) y ácido polidesjoxiribonucleico (ADN) ambos de los cuales pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. El ADN incluye pero no se limita a cADN, ADN genómico, ADN de plásmidos, ADN sintéticp, y ADN semi-sintético. El ADN puede ser lineal, circular o de superhélice. Una "molécula de á -ccido nucleico" se refiere a una forma polimérica de éster fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o | citidina' "moléculas de ARN") o desoxiribonucleósidos ' (desoxiadejnosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, o desoxic tidina"|; "moléculas de ADN) , o cualquier análogo del ¡ fosfoéster del mismo, tales como sólo se refiere a la estructura primaria y secundaria de la I molécula, y no se limita a cualquier forma terciaria particular. Asi, este término incluye el ADN de hebra doble encontrado, ínter, alia,! en las moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, los fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas, Al discutir la estructura de las moléculas de ADN de hebra doble particulares, las secuencias pueden describirse en , la presente de acuerdo con la convención normal de dar i sólo la secuencia en la dirección 5' I | a 3' a lo largo de la hebra no transcrita de ADN (es decir, la hebra que tiene una secuencia homologa al mARN) . Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido una manipulación ¡biológica molecular. El término "fragmeríto" se entenderá para significar a I i una secuencia del nucleótiido de longitud reducida relativa al ácido nucleico de referencia y , que comprende, sobre la porción común, una secuencia del nucleótido idéntica al ácido nucleico de referencia. ¡Tal fragmento del ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser, cuando sea apropiado, incluido en un polinúcleótido más grande del cual es constituyente. Tales fragmentos comprenden, alternativamente consisten de, oligonucleótidos que se encuentran en un rango de longitud de por lo menos 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 7?[ 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000 o 1500 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Como se usa en la¡ presente, un "fragmento del ácido nucleico aislado" es un polimero de ARN o ADN que son de una sola hebra o de hebra doble, opcionalmente que contienen bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento del ácido nucleico aislado en la forma de í un polimero de ADN puede comprende r de uno o más segmentos de cADN, ADN genómico o ADNJ sintético I Un "gen" se refiere a una reunión de nucleótidos que I codifican a un polipéptido, e incluye cADN y ácidos nucleicos de ADN genómico. El "gep" también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteina especifica o polipéptido, que incluye secuenc as reguladoras precedentes (secuencias no codificantes 5') que siguen a la (secuencias I I no codificantes 3') secuencia jde codificación. El "gen nativo" se refiere a i un gen como se encuentra en la 10 15 :20 célula. Preferentemente!, el ADN heterólogo incluye un gen !25 externo a la célula.

El término "genoma" ¡ incluye a los cromosomas asi como a los ADN o ARN de mitocondrias , cloroplastos y virales. 0.25% de leche, y ninguna formamida; o 30% de formamida, 5x SSC, 0.5% SDS). Las condiciones de hibridación de severidad moderada corresponden a una Tm superior, por ejemplo, 40% de formamida, con 5x o 6x SCC. Las condiciones de hibridización de severidad altas cor|responden ja la Tm más alta, por ejemplo, 50% de formamida, 5x o 6x |SCC. La hibridización requiere que¡ los dos ácidos nucleicos contengan las secuencias! complementarias, aunque dependiendo de la severidad de la hibridización, son posibles las I discrepancias entre las bases. El término "complementario" se usa para describir la relación entre las bases del nucleótido que son capaces de hibridizar entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenqsina es complementaria a la timina y citosina es complementario a la guanina. Por consiguiente, la invención instantánea t Jambién incluye fragmentos de ácido nucleico aislados que son complementarios a las secuencias completas descritas o usa'das en la presente así como aquéllas I I secuencias de ácidos nucleicos substancialmente similares. i l En una modalidad iespecífica. de la invención, los polinucleótidos son detectados empleando condiciones de hibridización que comprenden una etapa de hibridización a la la Tm es 65°C. . I Los lavados de post-'hibridizacion también determinan las condiciones de severidad. Un conjunto de condiciones preferidas usa una serie ¡ de lavados que empiezan con 6X SSC, 0.5% SDS a la temperatura ambiente durante 15 minutos (min), luego se repiten con 2X SSC, 0.5% SDS a 45°C durante 30 minutos, y luego se repiten dos veces con 0.2X SSC, 0.5% SDS a 5°°C durante 30 minujtos. Un conjunto más preferido de condiciones de severidad usa temperaturas superiores en las que los lavados son idénticos a (aquéllos anteriores salvo para la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en 0.2X SSC, 0.5% el SDS se incrementó a 6°°C. Otro conjunto preferido de condiciones muy severas usa dos lavados finales en 0.1X SSC, 0.1% SDS a 65°C. La hibridización requiere que los dos ácidos njucleicos ¡ comprendan secuencias complementarias, aunque ¡dependiendo de la severidad de la I hibridización, las discrepancias! entre las bases son i i posibles . La severidad apropiada para la hibridización de los ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables bien i i ¡ i conocidas en el arte. El mayor grado de similitud u homología i entre las dos secuencias d iel nu ! I i cleótiido, el may Jor valor de Tm i para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas i I secuencias. La estabilidad I relativa !! (que corresponden a la Tm ' superior) de hibridizacio!nes de ácido nucleico disminuyen en menos de 30 nucleótidos. Además,j el experto en el arte reconocerá que la temperatura y concentración de sal en la solución de lavado puede ajustarse como sea necesario de acuerdo con los factores tales como la longitud de la sonda, El término "sonda" se refiere a una molécula de ácidos nucleicos de una sola hebra que puede tener un par base con un ácido nucleico objetiivo de una | sola hebra complementario formar una molécula de doble hebra. Como se usa en la presente, el término "oligonucleótido' se refiere a un ácido nucleico, generalmente de por lo menos 18 nucleótidos, que es hibridizable a una molécula de ADN genómico, una molécula del ADNc, un ADN del plásmido o una i molécula del mARN. Los oligonucleótidos pueden etiquetarse por ejemplo, con 32P-nucleótidos o ucleótidos a la cual, una '5 etiqueta tal como la biotina ha sido conjugada covalentemente. Un oligonucleótido etiquetado puede usarse como una sonda para detectar la presencia de un ácido I i nucleico. Los oligonucle'ótidos (uno o ambos de los cuales pueden ser etiquetados) pueden usarse como los cebadores PCR, '0 ya sea para la clonación de longitud completa o un fragmento 1 de un ácido nucleico, ¿ para detectar la presencia de un ácido nucleico. Un oligonucleótido también puede usarse para formar una hélice triple con | una molécula de ADN. i Generalmente, se preparan los oligonucleótidos ¡5 sintéticamente, preferentemente en un sintetizador de ácidos La "reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa" se abrevia RT-PCR y significa un método in vitro para producir enzimáticamente una molécula de ADNc objetivo o moléculas de una moléculja o molécula de ARN, seguido por la sitio de procesamiento 'del ARN, jsitio de enlace efecto y i cada polinucleótido procede fuera del extremo 5' del otro polinucleótido. El térmi?o "cabeza- a-cabeza" puede abreviarse (5') -a- (5') y también puede indicarse por los símbolos (<— -») o (3' -5'5'?3' ) . I El término "cola-atcola" se usa en la presente para describir la orientación I de dos secuencias del polinucleótido i con una relación entre si. Dos poüjinucleótidos se posicionan en una orientación cola -a-cola cuando el extremo 3' de la hebra de codificación de un polinucleótido adyacente al extremo 3' de la hebra de codificación del otro polinucleótido, por el ual la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede hacia el otro polinucleótido. El término "cola-a-cola" puíede abrevia.rse (3') -a- (3') y también puede indicarse por los símbolos (- -) o (5'-3'3'<-5' ) . El término "cabeza a-cola" se usa en la presente para describir la orientaciónl de dos secuencias del polinucleótido i i ! I con una relación entre sí. Dos polinucleótidos se posicionan en una orientación cabeza-a-cola cuando el extremo 5' de la hebra de codificación de un polinucleótido está adyacente al extremo 3' de la hebra de codificación del otro i polinucleótido, por el cual la dirección de transcripción de cada polinucleótido, procede en la misma dirección al del otro polinucleótido. El término "cabeza-a-cola" puede abreviarse (5') -a- (3') y también I puede indicarse por los símbolos (? ?)o (5'?3' '5' ?3'). I j El término "cadena abajo" se refiere a una secuencia del nucleótido que se localiza 3' a la ¡secuencia de nucleótido de ^ i ! i I referencia. En particular, las secuencias del nucleótido I cadena abajo generalmente se refieren a secuencias que siguen el punto de inicio de la ¡transcripción. Por ejemplo, el codón de iniciación de traducción de u'n gen se localiza cadena abajo del sitio de inicio de la transcripción, El término "cadena arriba" se refiere a una secuencia del nucleótido que se i localiza 5 ' a la secuencia de nucleótido de referencia L En particular, las secuencias del nucleótido en cadena i'rriba gené.ralmente se refieren secuencias que se localizjan en el lado 5' de una secuencia de 5 I codificación o punto de inicio de la transcripción. Por I | ejemplo, la mayoría de lps promotores se localizan en cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Los términos "endonu'cleasa de ¡restricción" y "enzima de I i i restricción" se refieren) a una enzima que enlaza y corta 0 dentro de una secuencia del nucleótido específico dentro de i un ADN de hebra doble. La "recombinación homologa" se refiere a la inserción de i una secuencia de ADN extranjera en otra molécula de ADN, por ejemplo, la inserción de un vector en un cromosoma. 5 Preferentemente, los obpetivos del vector en un sitio ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de! replicación bajo su propio control.

El término "vector" incluye ambos medio viral y no viral para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo i i o in vivo. Un número grande de vectores conocido en el arte y I I i i puede usarse para manipular a los ácidos nucleicos, elementos de respuesta incorporados y promotores en los genes, etc., Los posibles vectores incluyen por ejemplo, plásmidos o virus que incluyen por ejemplo, bacteriófagos tales como los derivados de lambda, o plásmidos tales como pBR322 o los derivados de plásmido pUC, o el vector Bluescript. Por ejemplo, la inserción ¡ de los fragmentos de ADN que corresponden a los elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado puede realizarse ligando los fragmentos de ADN apropiados en un vebtor seleccionado que tiene termino i cohesivo complementario. ¡Alternativamente, pueden modificarse ! | los extremos de las moléculas de ADN enzimáticamente o ( cualquier sitio puede producirse ligando las secuencias del nucleótido (enlazadores; en las terminaciones del ADN. Tales vectores pueden diseñarsje genéticamente para contener genes I ' marcadores seleccionables que proporcionan la selección de células que han incorporado el marcador en el genoma celular. Tales marcadores permiten la identificación y/o selección de células hospederas que incorporan) y expresan las proteínas codificadas por el marcador. ! 1 Los vectores viral s, y particularmente los vectores retrovirales, se han usado en una amplia variedad de aplicaciones de suministro de genes en las células, así como en sujetos animales vivientes. Los vectores virales que pueden usarse incluyen pero no se limitan a retrovirus, virus adeno-asociados, varicella, baculovirus, vacunas, herpes simplex, Epstein-Barr, ádenovirus, geminivirus, y vectores caulimovirus . Los vectores no vi]rales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos cargados eléctricamente (citofectinas) , complejos de ADN-proteína, y biopolímeros . Además de un ácido nucleico, un vector pulede comprender también una o más regiones reguladoras, y/o marcadores seleccionables útiles para seleccionar, medir j y supervisar los resultados de la transferencia de los ácidos nucleiicos (transferencia a los i I última década, ha habidoj uso creciente de liposomas para la encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos diseñados para I limitar las dificultades y peligros encontrados con la ¡5 transfección mediada por 1 los lipiosomas para preparar los liposomas para una trainsfeccicon in vivo de un gen que codifica a un marcador ¡(Felgner ét al., 1987, Proc. Nati Acad. Sci. U.S. A. 84: 7413; Mackey, et al., 1988, Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031; y Ulmer et al., 1993, Science io 259: 1745-1748). El uso de lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos negativamente cargados, y también promueve la fusión con las membranas celulares i negativamente cargadas ¡(Felgner y Ringold, 1989, Science I 337:387-388). Los compuestos de lípidos y composiciones 5 particularmente útiles para transferir ácidos nucleicos se I describen en las Publidaciones de Patente Internacionales W095/18863 y W096/17823; y en 1 'a Patente de E.U.A. No. 5,459,127. El uso de llipofecciójn para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene ciertas ¡O ventajas prácticas. EjL direccionamiento molecular de liposomas a las células específicas representa un área de beneficio. Está claro que dirigiendo la transfección a tipos I celulares particulares sfe preferir1ían particularmente en un i i ! tejido con heterogeneidad celular , tal como el páncreas, I 5 hígado, riñon, y el celebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas con el propósito del direccionamiento (Mackeyl et al, 88, supra). Los péptidos direccionados, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como los anticuerpos, moléculas sin 5 péptidos podrían acoplarse químicamente a los liposomas. Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ej emplo, W095/21931), los péptidos derivados de proteínas que enlazan al ADN (por 10 ejemplo, WO96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, W095/21931) . i I I También es posible introducir un vector in vivo como un I plásmido de ADN desnudo (ver las Patentes americanas l 5,693,622, 5,589,466 y 5,580,859). También pueden usarse las Í5 metodologías de suministro de ADN mediadas por el receptor (Curiel et al., 1992, Il?m. Gene Ther. 3: 147-154; y Wu y Wu, 1987, J., Biol. Chem. 26?: 4429- 4^32) . El término "transfefcción" significa la captación de ARN o ADN exógeno o heterólogo por una célula. Una célula ha sido i 20 "transfectada" mediante ARN o ADN exógeno o heterólogo cuando tal ARN o ADN se ha introducido dentro de la célula. Una célula se ha "transform -Ja--d--:o--"„ medii_•aInte ARN o ADN exógeno heterólogo cuando el ARN o ADN tramsfectado efectúa un cambio fenotípico. El ARN o ADN de transformación puede integrarse enlazados covalentemente) en ¡el ADN cromosomal que una célula u organismo que han heredado el ácido nucleico de interés. Ejemplos de ' genes marcadores seleccionables conocidos y usados eh el arte incluyen: genes que I proporcionan resistencia? a la ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, ¡ higromicina, herbicida bialaphos, sulfonamida, y similares;1 y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir, genes reguladores de la antocianina, gen de transferasa de isopentanilo y similares. El término "gen repprtero" sí ¡gnifica un ácido nucleico que codifica a un factor de identificación que puede ser identificado en base al e.fecto del gen reportero, en donde el efecto se usa para rastrear la herencia de un ácido nucleico de interés, identificar una célula u organismo que han heredado el ácido nucleico de interés, y/o para medir la inducción trascripción de expresión del gen. Ejemplos de genes reportero conocidos y usados! en el arte incluyen: la I luciferasa (Luc) , la proteína fluorescente verde (GFP) , I i acetiltransferasa de clpranfenicol (CAT) , ß-galactosidasa ! (LacZ), ß-glucuronidasa ? (Gus), y similares. Los genes I marcadores seleccionablesI también I' pueden ser considerados I i como genes reporteros . El "promotor" se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión del una secuencia de codificación o ARN funcional. En general, ¡una secuencia de codificación se 5 localiza en 3' para una secuencia del promotor. Los reguladoras no han estado completamente definidos, los j fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener I actividad promotora idéntlica. ¡ Una "secuencia del promotor" es una región reguladora de ¡5 ADN capaz de enlazar polimerasa de ARN en una célula y i comenzar la transcripción de una secuencia de codificación I cadena abajo (dirección ¡3'). Para los propósitos de definir la presente invención, la secuencia del promotor se limita a su término 3' mediante el sitio de iniciación de 0 transcripción y se extie de en cac.ena arriba (dirección 5') para incluir el número mí -nimo de ba?ses o elementos necesarios para comenzar la traniscripción en niveles detectables anteriormente. Dentro dé la secuencia del promotor, se encontrará un sitio de iniciación de transcripción 5 (convenientemente definído por e;jemplo, trazando con la nucleasa Sl), así como los dominios que enlazan a la proteína (secuencias de consenso) responsable del enlace de la polimerasa de ARN. Una secuencia de la codificación está "bajo el control" 0 de secuencias de control transcripcional y traduccional en una célula cuando la polimerasa de ARN transcribe la secuencia de codificación ¡ en el ARNm, que se empalma entonces al ARN-trans (si la secuencia de la codificación contiene I intrones) y se traduce ¡en la proteína codificada por la secuencia de codificación J secuencias de ADN para los elementos de respuesta del hospedera. El término ¡'vector de expresión" significa un vector, plásmido o vehículo diseñado para permitir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos siguiendo la transformación en la hospedera. El gen clonado, es decir, la ¡5 secuencia de ácidos nucleicos insertada, normalmente se coloca bajo eil control dé elementos de control tales como un promotor, un promotor mínimo, un mejorador, o similares. La iniciación de las regiories de control o promotores que son útiles para conducir la expresión de un ácido nucleico en la ib célula hospedera deseada son numerosos y familiares para aquellos expertos en el arte, Virtualmente, cualquier promotor capaz de conducjir estos genes es adecuado para la presente invención, que incluye pero no se limita a: promotores virales, promotores bacterianos, promotores 15 animales, promotores de mamíferos, promotores sintéticos, 2 2 enfermedades, el virus 3¡5S tipo mosaico de la coliflor, CMV 35S mínima, virus de mosaico de la vena de yuca (CsVMV) , proteína que enlaza a/b clorofila, ribulosa 1, 5-bisfosfato de carboxilasa, específico de retono, específico de raíz, quitinasa, inducible por tensión, virus baciliforme tungro de arroz, super-promotor de plantas, aminopeptidasa de leucina de papa, nitrato reductasa, manopina sintasa, nopalina 1 sintasa, ubiquitina, prbteína de | zeína, y promotores de i antocianina (útiles para ¡la expresión en células de plantas) ; i0 promotores de animales !y mamíferos conocidos en el arte | I incluyen, pero no se limitan a, la región promotora temprana I I SV40 (SV40e) , el promotor¡ contenido en la repetición terminal 1 larga 3' (LTR) del virus de sarcoma Rous (RSV) , los promotores E1A o principales genes promotores tardíos (MLP) 5 de adenovirus (Ad) , el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) , el virus del herpes simples (HSV) promotor de timidina quinasa (TK) , un promotojr del bacúlovirus IE1, un promotor Un "polipéptido" es ¡ un compue'sto polimérico comprendido de residuos del aminoá Icido enlaIzado covalentemente. Los aminoácidos tienen la siguiente estructura general: R-C-COOH significa excluir las mezclas artificiales o sintéticas con I otros compuestos, o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad biológica, y qué puede estar I presente, por ejemplo, debido a la purificación incompleta, adición de estabilizadores, o componentes en una preparación farmacéuticamente aceptable. ' Una "variante" de un polipéptido o proteína es cualquier análogo, fragmento, derivado, o mutante que se derivan de un polipéptido o proteína y¡ qué retiene al menos una propiedad ,0 biológica del polipéptido o proteína. Las diferentes ! variantes del polipéptido o proteína pueden existir en la I naturaleza. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por las diferencias en las secuencias del nucleótido del gen estrucitural que codifica a la proteína, o 5 i puede involucrar un empal Ime diferencial o modificación post- traduccional . El experto en el arte puede producir variantes que substituciones de aminoácidos múltiples o simples, supresiones, adiciones oj reemplazos. Estas variantes pueden I i incluir, ínter, alia: (a) variantes en las que uno o más 0 residuos de aminoácidos se sustituyen con aminoácidos conservativos o no conservativos, (b) variantes en las que uno o más aminoácidos se agregan a1 polipéptido o proteína, (c) variantes en las qué uno o más aminoácidos incluye un grupo substituyente, (d) var Jantes en las que el 5 polipéptido o la proteína I se fusiona con otro polipéptido tal ADN. Las secuencias que son substancialmente homologas pueden I I ser identificadas compa-rando la? secuencias usando el 5 software estándar disponible en |los bancos de datos de secuencia, o en un experimento de ibridización Southern bajo I I por ejemplo, las condiciones severas como las definidas por el sistema particular. Se def:-nen las condiciones de hibridización apropiadas' por un experto en el arte. Ver por ejemplo, Sambrook a., 1989, supra. ¡ Como se usa en la presente, substancialmente similar" s a s a e s a a e n o o n e a s a n 5 de la actividad biológica i de los productos codificados. polipéptido o dos o más secuencias del polinucleótido, determinado al comparar las secuencias. En el arte, i "identidad" también sig ifica el¡ grado relevante de la secuencia entre las secuencias ( del polipéptido o del i polinucleótido, cuando el' caso pueda ser, determinado por la coincidencia entre las ¡cuerdas de tales secuencias. La "identidad" y "similitud^' pueden ser calculadas fácilmente O 5 i ¡ ! I i I [ 0 usando el método de Clustal de alineación (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros predefinidos (PENALIDAD DE ESPACIO±IO, PENALIDAD DE LONGITUD DE ESPACIO=10). Pueden seleccionarse los parámetros predefinidos para alineaciones en pares usando él método Clustal: KTUPLE 5 1, PENALIDAD DE ESPACIO=3 VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. gen completo. "Químicamejnte sintetizado", como se refiere a una secuencia de ADN, ¡significa que los nucleótidos del componente se congregaron in vitro. La síntesis química manual de ADN puede realizarse usando los procedimientos bien establecidos, o la síntesis quíímica automatizada puede realizares usando una | variedad de máquinas disponibles I comercialmente. Por consiguiente, los genes pueden personalizarse para una expresión de gen óptima basada en la optimización de la secuencia del nucleótido para reflejar el codón predispuesto a la célula hospedera. El experto en el arte aprecia la probabilidad de la expresión del gen exitosa si el uso de un codón está predispuesto hacia estos codones favorecidos por el hospedero. La determinación de codones preferidos puede estar basada en un estudio de genes derivado de células hospederas en donde la información de la secuencia está disponible.

I recombinación entre los sitios híbridos que se forman mediante esta recombinación. El inj ¡ventor ha identificado las nuevas recombinasas que! cada una dirige la recombinación I entre un sitio de unión bacteriano (attB) y un sitio de unión del fago (attP) . La ¡ recombinasa no puede mediar la recombinación entre los ¡sitios a t .zL y a ttR híbridos que se I forman luego de la recomoinación enltre el attB y attP. Debido i t a que tales recombinasás no pueden catalizar la reacción I j inversa, la recombinacüón attB y attP es estable. Esta propiedad es una que establece las composiciones y métodos de la presente invención j aparte de otros sistemas de recombinación actualmente usados para las células eucarióticas, tales como el sistema FLP-FRT en donde las reacciones de recombinación son reversibles. El uso de los sistemas de recombinación de j la presente invención I proporciona nuevas oportunidades para dirigir las reestructuraciones del transgen y el cromosoma estables en i las células eucarióticas J i Los métodos de la presente invención involucran poner en 1 I contacto una par de sitios de unio? de recombinacion, attB y attF que están presentes en una célula eucariótica con una recombinasa correspondiente. La recpmbinasa media entonces la recombinación entre los sitios de unión de la recombinación.

Dependiendo de las ubicaciones relativas de los sitios de unión de recombinación, cualquiera de una variedad de eventos recombinación que pueden servir como un substrato para la recombinación con el primer sitio de unión de recombinación se coloca en un segundo cromosoma, Luego de poner en contacto los sitios de unión de recombinaciÓn con una recombinasa, la ¡5 recombinación ocurre tal que se produce una conmutación con los dos extremos del cromosoma. Por ejemplo, uno puede construir dos cepas de un organismo, una cepa que incluye el primer sitio de unión de recombinación y la segunda cepa que contiene el segundo sitio de unión de recombinación. Las dos 0 cepas se cruzan entor.ces, para obtener una cepa de I descendencia que incluye ambos' sitios de unión de recombinación. Luego de poner en co¡intacto los sitios de unión con la recombinasa, ocuhrre una alternancia del brazo del cromosoma 5 Recombinasas Las recombinasas usadas en la práctica de la presente invención pueden ser introducidas en una célula objetivo, antes, concurrentemente don, o después de la introducción de 0 I un vector e direccion'a'miento , Las recombinasas pueden i I introducirse directamente J en una célula como una proteína, por ejemplo, usando liposomas, articulas revestidas, o microinyección. Alternativamente, un polinucleótido, ya sea ADN o ARN mensajero, que codifica a las recombinasas pueden 5 introducirse en la célula usando un vector de expresión nucleico que es por lo menos 90% ijdéntico a la secuencia del ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, y SEQ ID NO: 9, en donde el ácido nucleico tiene actividad recombinasa.

Más preferentemente, la| recombinasa es una secuencia del i polinucleótido aislada que comprende la secuencia del ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 9. secuencias marcadoras, ¡ las secjuencias de selección y similares como se discute a continuación. La presente invención también proporciona medios para la inserción dirigida de un polinucleótido (o secuencia (s) de los ácidos nucleicos de' interés en un genoma, por ejemplo, (i) proporcionar una recbmbinasa, en donde la recombinasa es capaz de facilitar la recombinación entre un primer sitio de I j recombinación y un segundo sitio de recombinación, (ii) I proporcionar un constructo de direjccionamiento que tiene una 0 primera secuencia de re,combinació¡n y un polinucleótido de i interés, (iii) introduci !r la recom Ibinasa y el constructo de direccionamiento en una célula que contiene en su ácido nucleico el segundo sitio de recombinación, en donde dicha introducción se hace bajo condiciones que permiten a la i I5 recombinasa facilitar un evento de recombinación entre los primero y segundos sitios! de recombinación. : i La presente invención también se refiere a un vector para la integración de síitio específico de una secuencia del polinucleótido en el denoma de una célula eucariótica ¡0 aislada, dicho vector comprende un polinucleótido de interés, y un segundo sitio attB o attP de recombinación, en donde ¡ dicho segundo sitio attB o attP de recombinación comprende I i ¡ una secuencia del poliríucleótido | que se recombina con un ! i ' ¡ primer sitio de recombihación atriP o attB o seudo attP o ¡15 sitio seudo attB en el !i genoma de¡! dicha célula eucariótica ,0 5 0 ;? of the Bacilli, Academia Press, Iric, NY (1982)), promotores de Streptomyces (Ward et at. Mol Gen. Genet. 203:468-478, I i 1986), y similares. Los) promotores procarióticos ejemplares son revisados por Glick (J. Ind. Microtiot. 1:277-282, 1987); Cenatiempo (Biochimie 68 505-516, 1986); y Gottesman (Ann Rev. Genet. 18:415-442, 11984). Los promotores eucarióticos preferidos incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente: el promotor de la secuencia del gene I de metalotioneina de ratón (Hamer et al., J. Mol. especificación presente, Los vectores procarióticos adecuados incluyen plásmidos tales como aque los capaces de replicación en E. coli (por ejemplo, pBR322, CólEl, el pSClOl, PACYC 184, itVX, PRSET, pBAD ( Invitrogen Carlsbad, Calif. y similares) . Tales plásmidos son descritos por Sambrook (cf.

'Molecular Cloning: A Laboratory Manual" segunda edición, editada por Sambrook, Fritsch, & Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) ) . Los plásmidos del Bacillus incluyen pC194, pC221, pT127, y similares, y se describen por Gryczan (En: Te Molecular Biology of te Bacilli, Academia Press, NY (1982), pp. 307-329). Los plásmidos de Streptomyces adecuados incluyen plilOl (Kendall et al., J. Bacteriol. 169:4177-4183, 1987), y bacteriófagos de Strepton-yces tales como fC31 (Chater et al., En: Sixth Intternational Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungría ¡1986), pp. 45-54). Los plásmidos de Seudomonas son revisados por John et al (Rev. Infiecte. Dis. 8:693-704, 1986), e Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742, 197¡8 ) Los plásmidos eucarióticos adecuados incluyen, por ejemplo, BPV, EBV, vacunas, SV40, círculo 2-micras, pADNc3.1, pADNc3.1/GS, pDual, pYES2/GS, pMT, p IND, pIND(Spl), pVgRXR Invitrogen) , y similares, o sus derivados. Tales plásmidos son bien conocidos en el arte (Botstein et al., Miami Wntr.

SyTnp. 19:265-274, 1982, Broach, Én: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spbing harbor, N., Y., pág. 445-470, 1981; Broach, Cell 28:203-204, 1982; Dilon et al., J. Clin. Hematol. Oncol.10: 39 - 48, 1980; Maniatis, En: Cell Biology: A Comprehensivé Treatise, Vol., 3, gene Sequence Expresión, la Expresión de Secuen ia de gen, Academic Press, NY, pp, .563-608, 1980. Los casetes de direccionamiento i descritos en la presente pueden construirse utilizando metodologías conocidas en el arte de la biología molecular I I (ver por ejemplo, Ausubel o Maniatis) en vista de las enseñanzas de la especificación. Como se describió anteriormente, los constructos de direccionamiento se congregan insertando, en una estructura del vector adecuado, un sitio de unión de redombinació?, secuencias que codifican I a los polinucleótidos de i interés enlazados operablemente a un promotor de interés; y, opcionalmente una secuencia que codifica a un marcador dé selección positiva. I i Un método preferido para obtener polinucleótidos, que incluyen secuencias reguladoras donvenientes (por ejemplo, I promotores) es la PCR. ÍSe enseñan procedimientos generales para PCR en MacPherson et al., PCR: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press at Oxford Universilj-y Press, (1991)). Las condiciones de la PCR para cada reacción de aplicación pueden determinarse I I empíricamente. Una variedad de parámetros influye en el éxito de una reacción. Entre estos parámetros se encuentra la reducción de la temperatura y tiempo, tiempo de extensión, recombinasa puede mediar la recombiJnación entre los primero y segundos sitios de r combinació?, el primer sitio de recombinación es attP ¡ o attB, el segundo sitio de recombinación es attB o áttP, y la recombinasa se selecciona ¡5 del grupo que consiste de una recombinasa del fago Listeria I recombinacion. La recombmacion entre los sitios debido a la i introducción de una recombinasa conduce a una eliminación del ADN y la inactivación del gen. En otro tipo de aplicación, una recombinasa puede mediar la escisión de una señal de i I detención transcripcional (presente entre el promotor y el i gen) del genoma, uniéndole así al elemento del promotor de i ¡ estructura de lectura abierta de uh transgen y activando la i expresión del gen. La recombinasa puede expresarse usando un promotor constitutivo o -nducible o introduciendo un vector vira que expresa la recombinasa . i En una modalidad adicional, la recombinación de sitio específico produce un intercambío del ADN. Primero, un aceptador del cásete se crea en una localización de interés en el cromosoma. El aceptador del cásete contiene ADN de interés, muy a menudo un gen marcador seleccionable ya sea en un lado mediante un primer sitio de recombinación (por ejemplo, attB) . Segundo, un vector de intercambio que contiene el cásete de ADN de reemplazo flanqueado ya sea en un lado por el sitio de recombinaci]on (por ejemplo, attP) se introduce en las células junto con el plásmido de expresión de recombinasa o la proteína de ¡la recombinasa. El doble I cruzamiento entre los sitios j de reconocimiento de recombinación del similar conduce al reemplazo del ADN entre los primeros sitios de recombinac ion que son transportados por el vector de intercambio. En otro ejemplo, el primer ^ i sitio de recombinación !i es attP ¡ y el segundo sitio de recombinación es attBl Este procedimiento se llama frecuentemente intercambio del cásete mediado por la ! recombinasa. j En una modalidad adicional, la recombinación de sitio específico produce transilocalizaciones cromosomáticas. Para la translocalización cromosomática, un primer sitio de I recombinación se introduce en un primer cromosoma y un segundo sitio de recombilnación se introduce en un segundo cromosoma. El suministro de células con una recombinasa la recombinasa puede mediar la recombinación entre el primero y tercer sitios de recombinación y el segundo y cuarto sitios de recombinación, los primero y segundos sitios de recombinación son attP o attB, el tercer y cuarto sitios de recombinación son attB o attP, y la recombinasa se selecciona del grupo que consiste ¡de una recombinasa del fago Listeria monocytogenes, una recombinasa del fago Streptococcus pyogenes, una recombinása del fago Bacillus subtilis, una recombinasa del fago j Mycobacterium tuberculosis y una recombinasa del fago Mycobacteri um smegma tis, con tal de que cuando los primero y segundos sitios de unión de recombinación sean attB, el tercer y cuartos sitios de unión de recombinación son attP, y cuando los primeros y segundos sitios de unión de recombinación sean a ttR, el tercer y cuarto sitios de ur.ión de recombinación sean attB. Preferentemente la recombinasa se selecciona del grupo que i ! consiste de una recombtí-nasa A118, una recombinasa SF370.1, una recombinasa SPßc2, una Irecombinasa fRvl, y una recombinasa Bxbl. Otra modalidad de i la presente invención proporciona un i ! método para la integración de' sitio específico de un polinucleótido de interés en el genoma de un sujeto transgénico, en donde el genpma comprende una primer recombinación sitio att-? o attB o sitio seudo attB o attP, el método que comprende introducir un ácido nucleico que contacto el primero y segundo sitios de recombinación con un primer polipéptido de recombinasa procariótica, poner en contacto el tercer y cuarto sitios de recombinación con un segundo polipéptido de recombinasa procariótica, que resulta en una recombinación e tre el primero y segundo sitios de recombinación y la recombinación entre el tercer y cuarto sitios de recombinación, j en donde el primer polipéptido de la recombinasa pueden mediar la recombinación entre el primero y segundo sitios de recombinación y el segundo polipéptido de I la recombinasa puede mediar la recombinación entre el tercer y cuarto sitios de recombinación, la primera y segunda recombinasa se seleccionan del grupo que consiste de una recombinasa del fago Listeria monocytogenes , una recombinasa del fago Streptococcus pyogenes, una recombinasa del fago Ba cillus subtilis, una recombinasa del fago Mycobacterium tuberculosis y una recombinasa del fago Mycobacteri um smegma tis, con tal de | que el primer polipéptido de la recombinasa y el segundo polipéptido de la recombinasa sean diferentes. El método puede comprender además, un quinto sitio de recombinación y ! un sexto sitio de recombinación y un tercer polipéptido de la recombinasa, en donde el tercer polipéptido de la recomrjinasa puede mediar la recombinación i i entre el quinto y el sexto sitio de recombinación, con tal de que el tercer polipéptido de la recombinasa sea diferente del primer y segundo polipéptidos de la recombinasa, una recombinasa SPßc2¡, una recombinasa fRvl, y una recombinasa Bxbl . I Células ¡ Las células adecuadas para la modificación que emplean los métodos de la invención incluyen células procarióticas y células eucarióticas. Las células procarióticas son células que carecen de un núdleo definjido. Ejemplos de células procarióticas adecuadas incluyen células bacterianas, células de micoplasma y célullas arqueobacteriales . Las células 0 procarióticas particularmente pre¡feridas incluyen aquéllas que son útiles en los varios tipos de sistemas de prueba (discutidos con mayor detalle) o aquéllos que tienen alguna utilidad industrial tal como Klebsiella oxytoca (producción de etanol), Clostridi um a cetobutylicum (producción de 5 butanol) , y similares ¡ (ver Green y Bennet, Biotech & Bioengineering 58:215-221, 1998; Ingram, et al, Biotech & Bioengineering 58:204-20,6, 1998). Las células eucarióticas I adecuadas incluyen ambas células animales (tales como de i insecto, roedor, vaca, icabra, conejo, oveja, primates no ,0 humano, humano, y similares) y células de plantas (tal como arroz, maíz, algodón, tabaco, tomate, patata, y similares) . Los tipos celulares aplicables a los propósitos particulares se discuten en detalle más abajo. Aun otra modalidad I de la invención comprende células 5 genéticamente diseñadas i aisladas Las células adecuadas de sitio específico como! se describió arriba para promover la integración de la secuencia del ácido nucleico de interés en el genoma. A modo de ejemplo solamente, para preparar un ratón transgénico, se inducen los ratones hembras a la superovulación. Después de que se permiten aparear, las hembras son sacrificadas por asfixia con C02 o dislocación i i cervical y los embriones se recuperan de los oviductos cortados. Las células del cúmulo circundantes se mueven. Se lavan los embriones pronucleares y se guardan hasta el tiempo de inyección. Se aparean los ratones hembras adultas aleatoriamente en ¡orma cíclica con los machos vasectomizados. Las hembras del recipiente se aparean al mismo tiempo como las hembras donadoras. Los embriones se transfieren entonces quirúrgicamente. El procedimiento para generar ratas transgénieas es similar a la de los ratones. Ver Hammer, et al, Célula 63: 1099-1112, 1990). Los roedores adecuados para los experimentos transgénicos pueden obtenerse de fuentes comerciales normales como Charles River (Wilmington, Masa.), Taconic (Germantown, N., Y.), Harían Sprague Dawley (Indianapblis, Ind.), etc. Los procedimientos para la manipulación del embrión del roedor y para la microinyección dé ADN en el pro núcleo del cigoto se conocen bien] por aqué'llos expertos en el arte (Hogan, et al, supra) . ¡Los procedimientos de Microinyección i T humanas , virus de la iinfluenza , ¡el virus del papiloma , el 1 virus de la hepatitis, é Il virus del herpes, virus Epstein- ! i 0 Bar, virus de inmunojdeficiencija (VIH, y similares), citomegalovirus, y similaires. Tambié.n se incluyen infecciones con otros organismos patogénicos tales como la Mycobacterium I Tuberculosis, Mycoplasma ! pneumoniae y similares o parásitos tales como Plasmadium falciparum y similares.

El término "trastqrno adquirido" como se usa en la I presente se refiere ai un trastorno no congénito. Tales 1 trastornos generalmente ¡se consideran más complejos que los trastornos monogénicos y puede resultar de una actividad impropia o no deseada dé uno o más genes. Ejemplos de tales trastornos incluyen enfermedad de las arterias periféricas, artritis reumatoide, enfermedad de las arterias coronarias, y similares. Un grupo particular de trastorno adquirido tratable empleando los métodos de la invención incluye varios cánceres, que incluyen tanto tumores sólidos como cánceres hematopoyéticos tales como las leucemias y los linfomas. Los tumores sólidos que son tratables que utilizan el método de la invención incluyen 1os carcinomas, sarcomas, osteomas, fibrosarcomas, condrosarcomas, y similares. Los cánceres específicos incluyen cáncer de pecho, cáncer de cerebro, cáncer pulmonar (célula no pequeña y célula pequeña) , cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de riñon, cáncer de cabeza y cuello, y similares La aplicabilidad del lugar particular en el genoma es en parte dependiente del trastorno particular a tratarse. Por ejemplo, si el trastornó es un trastorno monogénico y el tratamiento deseado es !la adición de un ácido nucleico terapéutico que codifica a un forma no mutada del ácido reconocerían prontamente ¡ cuales fragmentos del ácido nucleico de interés serían útiles I en el tratamiento de un trastorno particular. ' El constructo del áicido nucleico puede administrarse al sujeto a ser tratado usando una variedad de métodos. La administración puede tener lugar in vivo o ex vivo. Por "in vivo" significa en el cuerpo viviente de un animal. Por "ex vivo" significa que células u órganos son modificados fuera del cuerpo, tales células o órganos típicamente regresan a un cuerpo viviente. nucleico de interés. E|s probable que la proteína de la recombinasa sólo sea requerida para un período limitado de tiempo, para la integración de la secuencia del ácido nucleico de interés. Por consiguiente, si se introduce un gen de la recombinasa, el vector que lleva el gen de la recombinasa carecerá de secuencias que medien la retención prolongada. Por ejemplo, ¡ el plásmido convencional del ADN se descompone rápidamente ¡en la mayoría de las células de mamífero. El gen de la irecombinasa también puede equiparse con secuencias de expresijón del gen que limitan su expresión, Por ejemplo, un promotor inducible puede usarse para que la expresión de la recombinasa pueda regularse temporalmente mediante la exposición limitada del agente inductor. Tal grupo ejemplar de promotores son os promotores sensibles a ecdisona, la expresión que puede regularse usando ecdisteroides u otros agonistas no esteroidales. Otro de grupo de promotores soh los promotores sensibles a la tetraciclina, la expresión que puede regularse usando tetraciclina o doxiciclina.

EJEMPLOS Métodos Generales Las técnicas de clonación molecular y ADN recombinante molecular usadas en la presente son bien conocidas en el arte GC se han evitado hasta donde es posible. Por otra parte, durante la optimización ¡se evitaron las siguientes porciones i que actúan con cis para optimizar la estabilidad de ARN y traducción: - cajas TATA internas, sitioís chi y sitios de entrada ribosomal . - Las extensiones de la secuencia rica en GC o rica en AT. - secuencias de repjetición y estructuras secundarias de ARN. sitios donador y aceptor de emplame (críptica) puntos de ramificación - sitios poli (A) . El codón y optimización del ARN resultó en una diferencia de 20-30% de la secuericcía entre la secuencia de ADN nativa disponible a Genbank) yj los genes sintéticos. Los genes sintéticos que codifican a a recombinasa se clonaron en el plásmido pDual de expresión E. coli y de mamífero obtenido de Stratagene Corporation (La Jolla, CA, catalogo #214501) . El vector de expresión pDual dirige la expresión de genes heterólogos en células de mamífero y procarióticas. Para la expresión constitutiva en las células de mamífero, el vector contiene el prpmotor/mej orador del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) . El gen de la recombinasa se clona ál único sitio de la enzima de expresión pJXTAB358 dé la planta entre la secuencia terminadora NOS del promotor tipo mosaico de la veta de la yuca (Verdaguer, B., A. Kochko et al. 1998, Functional organization of the cassava vein mosaic virus (CsVMV) promoter. Plant MoL Biol 37: 1055-67). El ADN del plásmido pILTAB se obtuvo de Donald Danforth Center for Plant Research, St., Louis, MF. Los constructos son similares al i plásmido A118 de expresión usado en las células animales sólo que se reemplazaron en el promotor CMV y terminador SV40 con el promotor mosaico de la veta de yuca y el terminador 35S respectivamente .

Diseño y construcción! de plásmidos en ensayos de recombinación intramolecular Los plásmidos en un ensayo de recombinación I intramolecular se construyeron usando el plásmido gWiz™ Luc I (Gene Therapy Systems, Sah Diego, CA) . Este plásmido confiere resistencia a la canamiciha en la E¡. coli y expresa un gen de i ] luciferasa constitutivamente del i promotor CMV cuando se introduce en células de mamífero. El vector también contiene sitios de restricción únicos Sal 1 y Not I entre el promotor CMV y el codón de inicio del gen de luciferasa. Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción Apa I y Nhe I se crearon insertando un oligonucleótido entre los sitios Sal y Notl. Los oligonucleótidos que coijitiene el sitio attP de la 0 I5 0 5i Las células (20,000 células por pozo en una placa de 96 pozos) se transfectaron ¡con 25 ng del plásmido del Ensayo de Recombinación Intramolecular y Oj, 10, 25, o 75 ng del plásmido de la recombinasa correspondiente se incubó durante 24 horas. Las células se usaron con 50 µl de solución amortiguadora de lisis pasiva y se ensayaron 25 µl de los i extractos. Se realizaroni de seis a veinte ensayos por replica y las proporciones de Luc/RLuc (valores medios) se trazaron ± SE. Los valores mostrados arriba en las barras de la Figura 2 son las inducciones del pliegue (proporción de actividad de luciferasa en presencia del plásmido de la recombinasa para la actividad en ausencia del plásmido de la recombinasa) Como se muestra en la Figura 2, la transfección del plásmido de Ensayo de Recombináción Intramolecular solo 5 mostró ninguna o muy poca actividad de luciferasa (dada como ¡ la proporción de Luc/RLuc) . La transfección de cantidades i I crecientes del plásmido de expresión A118 de recombinasa (10, I I I 25, o 75 ng) junto con el plásmido A118 del Ensayo de ¡ Recombinación Intramolecular aumentaron la actividad de la 0 luciferasa. También se observaron l resultados similares para ¡ SF370.1, SPßc2, fRVl, y Bxbl. Estos resultados indicaron i claramente que las rec!bombinasas'! son funcionales en las células HEK293. Las reqombinasas mediaron la recombinación entre sus sitios attP y ¡attB y anularon la secuencia STOP en el plásmido del Ensayo de Recombinación Intramolecular y activaron la expresión del gen de luciferasa. 2.2 Ensayo de Recombinación Intramolecular temporal en células NIH3T3 de ratón Las células (5,000 células por pozo en una placa de 96 pozos) se transfectaron con 25 ng del plásmido del Ensayo de Recombinación Intramolecular y 0, 10, 25, o 75 ng del plásmido de expresión de recombinasa correspondiente y se incubó durante 24 horas Las célul as se usaron con 50 µl de , ° la solución amortiguadora de lisis pasiva y se ensayaron 25 µl de extractos. Se realizaron de! dos a catorce ensayos por replicado, y las proporc :iones de Luc/RLuc (valores medios) se trazaron ± SE. Los valores mostrados sobre las barras en la Figura 3 son las inducciones del pliegue. La figura 3 15 muestra los datos obtenidos de la transfección de NIH3T3 con el plásmido del Ensayo de Recombinación Intramolecular solo o junto con las cantidades crecientes (10, 25, o 75 ng) del transfección con 25 ng' Bxbl del plásmido del ensayo de recombinación intramolecular. Similar a Bxbl, las i i 1 recombinasas A118, SF370¡.1, SPßc2, y fRVl también aumentaron la actividad de la ludiferasa ( Figura 3) demostrando que estos recombinasas son .funcionales en las células NIH3T3 de ratón y son eficaces al recombinar i sus sitios attP y attB. 2.3 Ensayo de Recombinación Intramolecular temporal en células (CHO) de ovariioo atiec- hámster chino. Las células (15,000 células por pozo en una placa de 96 pozos) se transfectaron con 25 ng del plásmido del ensayo de recombinación intramole :ular y 0, 10, 25, o 75 ng del plásmido de expresión de recombilnasa correspondiente y se incubó durante 24 horas Las células se usaron con 50 µl de la solución amortiguadora de lisis pasiva y 25 µl de los extractos se ensayaron. Se realiza.ron de dos a ocho ensayos de la réplica y las proporciones ce Luc/RLuc (valores medios) se trazaron ± SE. Los valores mostrados sobre las barras en I I la Figura 4 son las inducciones de-1 pliegue. ! Como se muestra ein la Figu-ra 4 , la transfección del plásmido del ensayo de recombinación intramolecular A118, SF370.1, o fRVl solo mcstró ninguna o muy poca actividad de la luciferasa. La qo-transfección con las cantidades crecientes de A118 correspondiente, SF370.1, o fRVl del plásmido de expresión de recombinlasa incrementó la actividad de la luciferasa. Estos ¡ resultados indicaron claramente que las recombinasas son funcionales en las células CHO. Las recombinasas mediaron la recombina Ición entre sus sitios attP y attB y anularon la secuencia STOP en el plásmido de ensayo de recombinación intramoll-ecular y activaron la expresión del gen de luciferasa. 2.4 Ensayo de Recojnbinación llntramolecular temporal en células HeLa humanas Las células (15,000 células por pozo en una placa de 96 pozos) se transfectaron Icón 25 ng del plásmido del ensayo de Institute, La Jolla, CA | y se mantuvieron usando el protocolo recomendado (Ryder, E. Y. Snyder, et al. 1990.

Establishment and charaqterizationj of multipotent neural cell lines using retrovirus ector-mediated oncogene transfer. J.

Neurobiol 21:356-75) Las células se dividieron un día previo a la transfección y se colocaron en placas de 48 pozos a una densidad de 120 ,000 células por pozo. Después de una incubación durante toda! la nochel el medio de cultivo se reemplazó con el medio libre de suero. Las células se transfectaron con 50 ng del plásmido del ensayo de recombinación intramolecular solo o junto con 0, 25, 50, 100, o 200 ng del ADN del plásmido d la recombinasa usando el reactivo de la transfección Lipofectamine 2000™ de acuerdo con las instrucciones I de los I fabricantes (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El plásmido reportero de luciferasa Renilla (pRL-CMV, Promega, Madison, Wl) se co-transfectó (4 ng/well) como un control interno para normalizar los datos. Dos días I después de la transfección, los medios se descartaron y las células se usaron con 75 µl de la solución amortiguadora de lisis pasiva (Promega, Madison, Wl). Los extractos (50 µl) se ensayaron para realizar actividades de luciferasa y actividades de lucíferassa Renilla usando el kit de Ensayo de Luciferasa Dual (Promegá, Madison,1 Wl) en una placa lectora I | equipada con inyectores ! (Tecnologías Dynex, Chantilly, VA) .

Los datos mostrados en la Figura 7 son las proporciones de la luciferasa (Luc) y las actividades de la luciferasa Renilla (RLuc) , y es el promedio de 4 transfecciones por tratamiento. Las barras del error representan el error estándar. Similar a los resultados observados en HEK293, NIH3T3, CHO, HeLa, y células estromales de médula ósea de rata, recombinasas A118, SF3 70.1, SPßc2, fRVl, y Bxbl fueron funcionales en mNSCs y aumentaron la actividad de la luciferasa (Figura 7).¡ la co-transfección de cantidades crecientes (25, 50, 100,¡ o 200 ng del plásmido de expresión de recombinasa con el plásmido del ensayo de recombinación intramolecular correspondiente (50 ng) produjo actividades de luciferasa superiores y las inducciones del pliegue fueron de I I entre 72-5349 . 2 . 7 Ensayo de Recojnbinación ¡Intramolecular temporal en I células BY2 del tabaco , Los cultivos de suspensión celular del Nicotiana tobacum 10 BY2 se mantuvieron en el medio MS en la oscuridad y subcultivadas semanalmente (Nagata, T., T. Nemoto, and S.

Hasezawa .1992. Tobacco BjY-2 cell line as the Hela cell in the cell biology of higher pilants. Intl. Rev. Cytol . , 132: 1-30).

Los protoplastos preparados de los 3 cultivos de días pasados 15 se volvieron a suspender en 0.4 M manitol y distribuidos en placas petri de 35mm en alícuota de 1 ml (células de ~5xl05) . Los protoplastos se mezblaron conj el ADN del plásmido y se electroporaron a 0.56 V|oltios para 80 µ segundos usando un i sistema de electroporación de onda cuadrada con el electrodo ^ I : i ! 20 Petripulser (BTX, San ¡Diego, CA, USA.). Las células se transfectaron con 10 µg para los plásmidos de la prueba de recombinación intramolecular y 0 o 10 µg para el plásmido de expresión de la recombinasa. Siguiendo la electroporación, i I los protoplastos se diluyeron con 1 mL de 2x del medio de 25 cultivo del protoplasto ¡ (Watanabe, Y., T. Meshi, y Y. Okada. clonación múltiples entre el promotor CMV y la secuencia de terminación BGH. El plásmido de cllonación pADNc/FRT tiene un sitio FRT que precede al gen de higromicina. Al gen de higromicina carece de un promotor y codón de iniciación ATG. Por consiguiente, la tránsfección de plásmido pADNc/FRT que contiene el sitio attP o attB en Las células de mamífero no conferirán resistencia al la higromicina. La integración del plásmido pADNc/FRT ocurre en el sitio FRT en 293 células Flp- In™- siguiendo solo la co-transfección con el plásmido de expresión de recombinasa Flp (pCG44, Itivitrogen, Carlsbad, CA) . La integración produce una resistencia a la higromicina y pérdida de resistencia a la zeocina y expresión de la ß-galactosidasa . El procedimiento se muestra esquemáticamente en la Figura 9. Los attP o attB que contieinen el ADN del plásmido pADNc/FRT se integraron I en 293 bélulas Flp-In™ y líneas clónales para cada sitiol attP o aütB se seleccionaron en el H I I medio que contenía la higromicina J Como se esperaba, estas células perdieron la ctividad lß-galactosidasa y fueron sensibles a la zeocina. ¡La presenqia del plásmido pADNc/FRT con la secuencia attB en el lugar FRT también se confirmó por PCR 10) . En el análisis PCR, se detectó la integración de la secusncia attP o attB en el lugar FRT en el genoma usando un cebador que en aza a attP o attB y otro cebador que enlaza a la secuencia del lugar FRT adyacente.

Por consiguiente, el clon sólo sería PCR positivo si el sitio attP o attB se integra en el cromosoma. Como se espera, las líneas seleccionadas son positivas para el attP o attB. La PCR no amplificó una ¡banda espeecífica del ADN genómico aislado de las 293 células Flp-! In™-parentales (sendas P, Panel C en la Figura 10) pero amplificaron una banda de ADN aislado de células integ radas con el plásmido pADNc/FRT que contiene attP o attB (sendas I, panel C en la figura 10) para cada recombinasa probadal. Las 293 células estables con los sitios attP o attB se usaron para integrar el plásmido que contiene los sitios attB ¡o a t tR, respectivamente . Integración del ADN del plásmido en el sitio attP o attB cromosomático . Los plásmidos del ensayo de integración se construyeron colocando la secuencia attP o attB de cada recombinasa inmediatamente antes del gen de resistencia a la puromicina.

En este plásmido, el gen de puromicina no tiene su propio promotor. Sin embargo, la recombinación entre el attP en el i cromosoma y attB en el plásmido del ensaye de integración (o attB en el cromosoma y¡ attP en el plásmido del ensayo) integraría el gen de la puromicina inmediatamente al promotor CMV presente inmediatamente antes del sitio attP o attB en las 293 células Flp-Int generadas arriba (Figura 9) . La integración producirá una expresión del gen de puromicina y crecimiento de tales células en presencia de antibióticos de puromicina. No se espera que la integración aleatoria del plásmido del ensayo proporcione resistencia a la puromicina.

La línea celular establie de 293 Flp-In™- que contiene la I secuencia attP se transfecto con el plásmido del ensayo de integración que contiene el sitio attB y con o sin el plásmido de expresión de recombinasa correspondiente usando los protocolos normales.j En otro ¡ejemplo, la línea celular estable de 293 Flp-In™- con la secuencia attB establemente integrada fue generada y usada para integrar el attP del plásmido de ensayo de integración Las 293 células Flp-In™ que contienen el sitio ¿ ttP o attB cromosomático (150,000 a 300,000 células) se trans fectaron con 100 ng del plásmido del ensayo de integración y 400 ng del plásmido de expresión de recombinasa. Las células se seleccionaron entonces en un medio que contenía el antibiótico de puromicina. Si la recombinasa es funcional,] se espera que la secuencia attB que contiene el plásmido integre al sitio attP en el cromosoma o viceversa .

EJEMPLO 4: ELIMINACIÓN ¡DE ADN CROMOSOMATICO FLANQUEADO POR LOS SITIOS attP Y attB. El ensayo para la I el-,i.minacIión de la secuencia de attP:STOP:attB localizada en el cromosoma se hizo en un proceso de dos etapas. En el primer paso, las líneas de la célula estables que contienen una sola copia del promotor CMV- attP: STOP: attB-gen de Luciferasa- Constructo terminador se generó para cada re¡combinasa y se caracterizó. En el segundo paso, el plásmido de expresión de recombinasa se transfectó temporalmente en las células estables con el promotor CMV - attP: STOP: ttB gen de Luciferasa Terminator y se ensayaron las células para la actividad de la luciferasa. Si la recombinasa es activa en las células de mamífero, la recombinación entre ¡ los sitios attP y attB cromosomáticos producirá en una eliminación de la secuencia STOP y activación de l¡a expresi¡qn de la luciferasa. El ' ! formato del ensayo se describe gráficamente en la Figura 11.

Generación de clones estables HEK293 con el constructo del gen CMV promotor-atfP-STO -atfB-Luciferasa en el i cromosoma ¡ Una sola copia del constructo terminador del promotor CMV -attP: STOP: attB - gen de Lucifecasa se introdujo al lugar FRT de 293 células Flp-In™ obtenidas de Invitrogen, Carlsbad, CA (catálogo #R750-07) aomo se describió anteriormente. La secuencia del gen de luciferasa aatP: STOP: attB -que estaba 5 Debe notarse que la integración aleatoria de plásmido de direccionamiento (es decir, en sitios no seudo) también podría producir la generación de h:-gromicina resistente a los clones. Sin embargo, cuando el plásmido objetivo se introduce en las células junto con el plásmido de expresión de recombinasa, el número de clones HEK293 resistentes a la higromicina se esperan s san superiores si el genoma contiene los sitios de unión seudo. También, por ejemplo, si la integración se debe a l 1a recombináción entre el sitio seudo attB en el genoma y el sitio attP en el sitio attP del plásmido de direccibnamiento en el plásmido de direccionamiento precisamente se corta y se inserta en los sitios seudo attB en el genoma, resultando en la creación de sitios seudo attL y attR que pueden identificarse por la secuenciación del ADN de plásmidos rescatados. En contraste, las integraciones aleatorias conservan generalmente el sitio attP intacto después de la integracion. Los clones HEK293 resistentes a la higromicina obtenidos I en presencia del plásmido de expresión de recombinasa se í I combinaron, la preparación de ADN genómica se hizo y se i i digirió con las enzimas de restricción que recortaron el lado I del plásmido integrado ( , e1 s decir , ¡fuera de la región de pUC ! i orí y el gen marcador I seleccionable bacteriano) , el ADN digerido se autoligó, y l ADN lig do se transformó en la E. coli para rescatar el plásmido integrado que contiene el ADN naturalmente para integración que pueden usarse en muchas aplicaciones de biotecno Logia y médicas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 5 10 25 2. Un método para obtener la recombinación de sitio específico en una célula eucariótica, el método caracterizado porque comprende: proporcionar una célula eucariótica que comprende un primer sitio de recombinación y un segundo sitio de recombinación; poner en contacto el primero y segundo sitios de recombinación con un polipéptido de recombinasa procariótica, resultando en una recombinación entre los sitios de recombinación, en donde el polipéptido de la recombinasa puede mediar¡ la recomblinación entre el primero y segundo sitios de recombinación, el primer sitio de recombinación es attP attB, el segundo sitio de recombinación es un sitio seudo unión, y la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de una recombinasa del fago Listeria monocytogenes una recombinasa del fago Streptococcus pyogenes, una recombinasa del fago Bacillus subtilis, una recombinasá del fago \ Mycobacterium tuberculosis y una recombinasa del fago Mycobacterium smegma tis . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el polipéptido de la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de una recombinasa A118, una recombinasa SF370 1, una recombinasa SPßc2, una recombinasa fRvl, y una recombinasa Bxbl. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el polinucleótido que codifica a la recombinasa se enlaza operablemente a un promotor que media expresión del polinucleótido en la célula eucariótica. 5. El método de con ormidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el polipéptido de la recombinasa se introduce en la célula éucariótica mediante la expresión de un polinucleótido que codifica al polipéptido de la recombinasa . 6. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, i caracterizado porque el polipépt:-do de la recombinasa se introduce en la célula eucariótica como un polipéptido. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el polipéptido de la recombinasa se introduce en la célula eucapotica mediante el ARN mensajero que codifica al polipéptido de la re.combinasa. El método de conformidad cbn la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque los I resultados de recombinación de sitio específicos resultan ¡en la integración, eliminación, inversión, translocalización o intercambio de ADN, 9. Un método para obtener una célula eucariótica que tiene una secuencia del po inucleótido establemente integrada, caracterizado porque el método comprende: introducir un polinucleótido en una célula eucariótica que comprende un primer sitio attB o attP de recombinación, en donde el polinucleótido j comprende una secuencia del ácido nucleico y un segundo sitio attP o attB, y poner en contacto el primero y el segu do sitio de recombinación con un polipéptido de recomb >inasa procariótica, en donde el polipéptido de la recombinasa puede mediar la recombinación de sitio específica entre el primero y segundo sitios de recombinación, y la recombinasa se selecciona del grupo que I consiste de una recombinasa del fago Listeria monocytogenes, i ! una recombinasa del I fago Streptococcus pyogenes, una recombinasa del fago Bacillus subtilis, una recombinasa del fago Mycobacterium tuberculosis y una recombinasa del fago Mycobacteri um smegma tis con tal de que cuándo el primer sitio de recombinación sea at'tB, el segundo sitio de recombinación sea attP y cuando el primer sitio de recombinación sea attP, el segundo sitio de recombinación sea attB. I 10. Un método para obtener una célula eucariótica que tiene una secuencia ' del polinucleótido establemente integrada, caracterizado porqu| |e el método comprende: i introducir un polinucléótido en una célula eucariótica que comprende una primera recombinasión en el seudo sitio de unión, en donde el poli?ucleótido comprende una secuencia del ácido nucleico y una segunda recombinación en el sitio attB o attP, y poner en contacto el primero y los segundos sitios de recombinación con un poLipéptido de recombinasa procariótica, en donde el polipéptido de la recombinasa puede mediar la recombinación de sitio específico entre el primero y segundo sean attP, el tercer cuartos sitios de unión de recombinación sean attB., 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el polipéptido de la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de una recombinasa A118, recombinación; poner en contacto el primero y segundo sitios de recombinación con un primer polipéptido de recombinasa procariótica, poner en contacto el tercer y cuartos sitios de recombinación con un segundo polipéptido de recombinasa procariótica, que resulta en 1a recombinación entre el primero y segundo sitios de recombinación y la recombinación entre el tercer y cuart os sitios de recombinación, en donde el primer polipéptido de la reccombinasa puede mediar la recombinación entre el primero y segundo sitios de recombinación y los segundos polipéptidos de la recombinasa pueden mediar la recombinación entre el tercer y cuartos sitios de recombinación, la primera y segunda recombinasa son seleccionadas del grupo que consiste de una recombinasa del fago Listeria monocytogenes , una recombinasa del fago Streptococcus pyogenes, una recombinasa del fago Ba cillus subtilis, una recombinafea del fago Mycobacterium tuberculosis y una recombinasa del fago Mycobacteri um smegma tis, con tal de que los primeros polipéptidos de la recombinasa y los segundos polipéptidos de la recombinasa sean diferentes. 22. El método de ponformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende además un quinto sitio de recombinación y un sexlo sitio d'e recombinación y un tercer polipéptido de la recom inasa, en donde el tercer polipéptido de la recombinasa, puede mediar la recombinación entre el quinto y sextos sitios de recombinación, con tal de que el 27. Una célula eucariótica que comprende un polipéptido de recombinasa procariótica o un ácido nucleico que codifica a una recombinasa procariótica, caracterizada porque la recombinasa puede mediar la recombinación de sitio específico entre un primer sitio de recombinación y un segundo sitio de recombinación que pueden servir como un substrato para la recombinación con el primer sitio de recombinación, en donde el primer sitio de recombinación es attP, seudo attP, attB o seudo attB, el segundo sitio de recombinación es attB, seudo attB, attP o seudo att; y la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de una recombinasa del fago Listeria monocytogenes , una recombinasa del fago Streptococcus pyogenes, una recombinasa del fago Bacillus subtilis, una recombinasa del fago Mycobacteri um tuberculosis y una recombinasa del fago Mycobacteri um smegma tis, con tal de que cuando el primer sitio de recombinación es attB, el segundo sitio de recombinación sea attB o seudo attP, cuando el primer sitio de recombinación es seudo attB, el segundo sitio de recombinación sea I attP, cuando el primer sitio de i | recombinación es a tP, ¡el segundo sitio de recombinación sea attB o seudo attB, y cuando el primer sitio de recombinación es seudo attP, el segundo sitio de recombinación sea attB. 28. La célula éucarióticá de conformidad con la reivindicación 27, caraicterizado porque el polipéptido de la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de una recombinasa A118, una -trecombinasa! SF370.1, una recombinasa SPßc2, una recombinasa fRvl, y una recombinasa Bxbl. 29. Un método para la integración de sitio específico de un polinucleótido de interés en el genoma de un sujeto transgénico, en donde el genoma comprende un primer sitio de recombinación attB o attP o seudo sitio attB o seudo sitio a tP, caracterizado porque el método comprende: introducir un recombinación sea attB. ¡ 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el polipéptido de la recombinasa se selecciona del grupo que consiste de una recombinasa A118, una recombinasa SF37Q.1, una recombinasa SPßc2, una recombinasa fRvl, y una recombinasa Bxbl. 31. Una secuencia del polinucleótido aislada que D NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 35 Una secuennci:a del polinucleótido aislada, caracterizada porque comprende la secuencia del ácido 5 nucleico seleccionado del grupo que consiste de: i a) una secuencia del ácido nucleico que codifica a una recombinasa SPßc2; b) una secuencia del ácido nucleico que codifica a una recombinasa SF370.1; ¡10 c) una secuencia del ácido nucleico que codifica a una recombinasa Bxbl; d) una secuencia del ácido nucleico que codifica a una recombinasa A118; y i ! e) una secuencia del ácido nucleico que codifica a una ¡15 recombinasa fRvl . por recombinación es attP, el segundo sitio de unión por recombinación es attB] La invención también describe composiciones, vectores y métodos de uso de los mismos, para la generación de célul s transgénicas, tejidos, plantas y animales. Las composiciones, vectores y métodos de la presente invención también son útiles en aplicaciones de terapia génica.