MX2007008319A - Matrices suplementadas para la reparacion de fracturas oseas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a matrices suplementadas que comprenden una PTH liberablemente incorporada a esta, opcionalmente que contiene un material granular. La PTH es incorporada ya sea a traves de enlace covalente a la matriz o a traves de interaccion no covalente con la matriz y/o los granulos. Estas matrices suplementadas disminuyen el tiempo de cicatrizacion, comparado con el autoinjerto y/o activacion de cicatrizacion de fracturas oseas las cuales de otro modo, no podrian sanar. Las matrices son biocompatibles y biodegradables, y pueden ser formadas in vitro o in vivo al tiempo del implante. La PTH puede ser una parte de un peptido de fusion. La PTH puede ser incorporada en las matrices con retencion completa de su bioactividad. La PTH puede ser liberablemente incorporada, usando tecnicas que proporcionan control sobre como y cuando y a que grado la PTH es liberada usando la matriz como un vehiculo de liberacion controlada para cicatrizar fracturas oseas.

Description

MATRICES SUPLEMENTADAS PARA LA REPARACIÓN DE FRACTURAS ÓSEAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a matrices suplementadas y usos de las mismas para la reparación y cicatrización de fracturas óseas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En tanto Europa como los Estados Unidos, un estimado de 5 a 6 millones de personas sustentan fracturas óseas cada año debido a trauma, lesiones relacionadas con deportes o actividades u osteoporosis. La mayoría de estas lesiones pueden ser tratadas con una reducción manual y fijación externa (por ejemplo, una fusión) . Sin embargo, aproximadamente 20 a 25% de las fracturas que requieren hospitalización, usualmente con procedimientos quirúrgicos abiertos. Una fractura es definida como una discontinuidad en la estructura ósea cortical, usualmente que resulta de la fuerza mecánica en exceso. Una fractura completa es definida por una discontinuidad, o rompimiento, que ocurre a través de la estructura ósea completa, creando dos o más segmentos óseos distintos. Los fragmentos óseos no tienen que separarse por la lesión para ser clasificados como una fractura. En algunos casos, el periosteo mantiene los fragmentos óseos en su posición anatómica original. En otros casos, la fractura causa que la extremidad se curve, rasgando el periosteo o aún la piel circundante y el tejido muscular. En todavía otros casos, como es a menudo el caso con lesiones misiles a alta velocidad o accidentes serios, porciones grandes de hueso son fragmentadas o aún removidas de su ubicación original. Los objetivos primarios de tratamientos de fracturas son unión por sonido y restauración de la función ósea sin un resultado de deformidad. Obtener estas metas rápidamente, es un interés incrementadamente importante debido a emisiones de incapacidad y contención de costos. En una parte significante de la población de pacientes, ambas metas, es decir, uniones de sonido y restauración rápida de la función ósea, están en riesgo debido a la edad del paciente y/o condición de salud general, y/o el tipo y/o ubicación de la fractura. En particular, en el caso de pacientes osteoporóticos, el riesgo de no uniones y tiempos de cicatrización incrementados es alto. Como una enfermedad del esqueleto, la osteoporosis es caracterizada por masa ósea baja y deterioro estructural del tejido óseo que conduce a fragilidad ósea incrementada, tiempos de cicatrización incrementados y la incidencia de no unión. Los injertos óseos y sustitutos de injertos óseos, son ampliamente usados en muchos procedimientos ortopédicos para tratar problemas asociados con pérdida ósea, unión retardada y fracturas sin unión o como un material de fijación de implante. En el caso de fracturas severas y complicadas, injerto óseo y sustitutos de injertos óseos son usados para fortalecer el hueso antes que la fractura sea entonces estabilizada con hardware. Los materiales de injerto óseo pueden ser autogénicos, alogénicos, xenogénicos, de matriz ósea desmineralizada (DBM), de origen sintético y mezclas de los mismos. Los materiales de injerto óseo pueden ser clasificados en materiales con propiedades osteoconductivas, osteoinductivas y osteogénicas . Los materiales osteoconductivos no crean hueso; preferentemente, estimulan la migración de células de huesos vivientes cercanos. Los materiales osteoinductivos estimulan el sistema propio del paciente para generar tejido óseo. Los materiales osteogénicos directamente crean tejido óseo. Los materiales osteogénicos son confinados a osteoblastos y células troncales mesenquimales que generan tejido óseo. Algunos materiales exhiben más de una de las propiedades descritas. Autoinjerto se refiere a cualquier tejido o hueso que es colectado de una parte del cuerpo del paciente para ser usada en el sitio de la lesión. Los autoinjertos óseos son usualmente colectados de la cresta ilíaca. En cuanto a su ventaja de ser biocompatibles, seguros, de una composición vascularizada y que presentan propiedades osteoinductivas, las desventajas son mayores. Los autoinjertos requieren una segunda operación la cual puede conducir a complicaciones post-operativas las cuales incluyen, pérdida de sangre, infecciones y dolor. Los autoinjertos son costosos debido a permanencias prolongadas en hospitales y tiempo de operación. El suministro de autoinjertos por paciente está limitado, y el dolor post-operativo después de colectar el material autogénico es a menudo superior que la fractura ósea misma. En cuanto a las desventajas, el autoinjerto es considerado el "estándar de oro" en términos de materiales de injertos óseos. Los aloinjertos son tejido óseo tomado de varias ubicaciones en un cuerpo de cadáver humano, el cual puede ser maquinado con diferentes estructuras y en formas diferentes. Los aloinjertos son mínimamente osteoinductivos, existen solamente suministro limitad, y posan en el paciente el riesgo de infecciones debido a patógenos hospederos. Los materiales de injerto óseo sintéticos, son desarrollados como una alternativa "extra anaquel" para material de injerto óseo autogénico. El injerto óseo sintético sustituto incluye materiales cerámicos y polímeros auto-endurecidos que imitan propiedades de huesos humanos, como hidroxiapatito y polimetilmetacrilato, colágeno, fosfato tricálcico, sulfatos de calcio y fosfatos. Estos materiales muestran escasas propiedades de manipulación y una carencia de propiedades osteoinductivas. En años recientes, se han hecho esfuerzos por desarrollar sustitutos de injertos óseos, los cuales muestran propiedades osteoinductivas tales como una certeza de "alternativas extra anaquel" a autógrafos. La DBM es un ejemplo de un sustituto de injerto óseo teoinductivo. Sin embargo, la DBM como un material alogénico encara las mismas desventajas como un hueso alogénico. Otros ejemplos son Stryker Corp' s OP-1®, los cuales suministran la proteína 7 morfogénica ósea recombinantemente producida (BMP 7) de una matriz de colágeno o material sustituto de injerto óseo Meltronic Sofamor Danek' s INFUSE®, usando BMP2 recombinantemente producida a partir de esponjas de colágeno. Aparte del proceso de producción costoso y muy largo de la BMP, las proteínas en ambos productos son suministradas de una matriz de colágeno en altas concentraciones. Las matrices de colágeno de origen bovino llevan todos los riesgos de materiales xenogénicos, muestran escasas propiedades de manejo en procedimientos quirúrgicos, por ejemplo, no son moldeables para ajustarse estrechamente a la forma del sitio de la lesión, y la alta concentración de BMP suministrada al cuerpo puede conducir en algunos de los pacientes a calcificación de órganos o para formación ósea en otras partes del cuerpo. Otras matrices para el tratamiento local de defectos óseos incluyen, usar hormona paratiroides humana (PTH) o sus derivados, los cuales son suministrados al cuerpo como un inyectable in si tu que forma composición sellante de fibrina. La hormona paratiroides es un péptido de 84 aminoácidos que se elabora y secreta por la glándula paratiroides. La hormona de longitud completa, sirve en la regulación de los niveles de calcio sistémico y cambio óseo. La hormona paratiroides es un factor anabólico directo potente para osteoblastos precursores y un factor anabólico indirecto para osteoclastos. Regulando el balance de osteoblastos y osteoclastos, la hormona paratiroides tiene un efecto directo en el cambio óseo resultante y subsecuente liberación de calcio en el cuerpo. Muchos estudios animales han indicado los efectos anabólicos potenciales de la hormona paratiroides en la densidad mineral ósea (BMD) . Este receptor es conocido por encontrarse en los osteoblastos, las células que son responsables de formar nuevos huesos. El dominio de 34 aminoácidos N-terminal de la hormona paratiroides humana, ha sido reportado por ser biológicamente equivalente a la hormona de longitud comple-ta. La hormona paratiroides 1-34 y su modo de acción, han sido reportadas primero en la Patente Estadounidense No. 4,086,196. La hormona paratiroides?-3 se conoce por ser una versión truncada completamente activa de la hormona paratiroides, la cual no tiene enlaces disulfuro o estructura terciaria significante. Contiene una estructura secundaria moderada, que incluye varias hélices alfa. Se han llevado a cabo muchos estudios clínicos usando hormona paratiroides sistémicamente administrada, para incrementar la masa ósea total en pacientes con osteoporosis, con la mayoría que requiere inyecciones diarias de hormona paratiroides u hormona paratiroides?-34 sola, o en combinación con otros activos, por muchos meses. Se describen muchos detalles acerca de la PTH y hormona paratiroides 1 a 34 en el documento WO 03/052091, el contenido respectivo del mismo siendo incorporado en este documento por referencia. Otras versiones truncadas de la hormona paratiroides con actividad biológica incluyen, hormona paratiroides 1-25, 1-31 y 1-38. Mientras se ha hecho mucho trabajo estudiando los efectos sistémicos de la PTH, la administración local de PTH ha sido intensamente explorada. El documento WO 03/052091, describe matrices para la administración local de PTH. Específicamente, el documento WO 03/052091, describe la hormona paratiroides por ser covalentemente unida a matrices naturales y sistémicas, en particular, fibrina y matrices de polietilenglicol, para administración local y liberación en el sitio de necesidad en forma controlada. Sin embargo, el documento WO 03/052091 no describe matrices las cuales son adecuadas para la cicatrización de fracturas óseas, en particular, para varias fracturas óseas, como reparación de fracturas en riesgo de llegar a retardar uniones o sin uniones. Es por lo tanto, el objeto de la presente invención, proporcionar una matriz la cual es adecuada para la reparación local de fracturas óseas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado sorprendentemente, que una matriz que contiene PTH ("matrices suplementadas") , pueden ser usadas para suministrar localmente PTH en el sitio de una fractura ósea para reparar y curar la fractura. De este modo, la presente invención está relacionada con una formulación que comprende: (i) un péptido seleccionada del grupo que consiste de PTH y un péptido de fusión de PTH; (ii) un material granular que comprende un mineral de calcio y (iii) una composición capaz de formar una matriz de fibrina bajo condiciones fisiológicas que comprenden, un componente precursor de fibrinógeno y un componente precursor de trombina, en donde la PTH o el péptido de fusión de PTH está presente en un intervalo de concentración de entre 0.01 hasta 2 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, con la condición de que una concentración de 0.4 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, no está incluida. La presente invención también está relacionada con una matriz suplementada, que comprende: (i) PTH o un péptido de fusión de PTH; (ii) un material granular que comprende un mineral de calcio y (iii) fibrina; en donde dicha PTH o péptido de fusión de PTH están presentes en un intervalo de concentración de entre 0.01 hasta 2 mg/ml de matriz de fibrina, con la condición de que una concentración de 0.4 mg/ml de matriz de fibrina, no está incluida. La presente invención también se relaciona con el uso de dicha formulación y matriz suplementada para la manufactura de un medicamento para ser localmente administrada para la reparación de fracturas óseas. Preferiblemente, la PTH es liberablemente incorporada en la matriz, y la matriz suplementada es aplicada o formada en el sitio de la fractura. Preferiblemente, la PTH es covalentemente unida a la matriz. En una modalidad, la matriz es una matriz de fibrina. La hormona paratiroides puede ser PTH?-84 (nativa), PTH?_38, PTH!_34, PTH?-3?, ó PTH?-25, o cualquiera de las versiones modificadas o alélicas de PTH que exhiben propiedades, es decir, formación ósea, similares a las mencionadas anteriormente ("PTH") . Preferiblemente, la PTH es PTH?-34. En una modalidad preferida, la PTH es un péptido de fusión ("péptido de fusión de PTH") que contiene al menos, dos dominios, en donde el primer dominio comprende PTH y el segundo dominio comprende un dominio de sustrato covalentemente reticulable capaz de reticular la matriz durante o después de su formación. En una modalidad, una matriz de fibrina suplementada se forma de una formulación que comprende (i) un material granular, (ii) una composición adecuada para formar una matriz de fibrina que contiene fibrinógeno y trombina y (iii) PTH en un intervalo de entre 0.01 a 2 mg de PTH/ml de matriz de fibrina, la cual es adecuada para la reparación y cicatrización de fracturas óseas, con la provisión de que no está incluida una concentración de 0.4 mg de PTH/ml de matriz de fibrina. Un kit que comprende la formulación anterior también se proporciona, en donde al menos, uno de los componentes adecuados para formar una matriz, es almacenado separadamente de otros componentes para formar la matriz. Las formulaciones y matrices suplementadas son preferiblemente usadas para la reparación y cicatrización de fracturas óseas, en particular, para fracturas óseas con un riesgo de llegar a retardar uniones o no uniones. Indicaciones preferidas incluyen fracturas de la muñeca (fracturas de radio distal), fracturas de huesos largos, como tibia, y fracturas de cadera.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la bioactividad de variantes de PTH. Las células transfectadas con un gen reportero ligado a un promotor para un receptor de PTH, se trataron con cantidades iguales de ya sea PTH?-34, TG-pl-PTH?_34 (descrito posteriormente) , o el PTH estándar internacional de 84 aminoácidos. La inhibición de la expresión del gen reportero de luciferasa, se midió y comparó con células transfectadas que no se expusieron a PTH en solución (control) . La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de liberación de PTH a partir de una matriz de fibrina. La Figura 3 muestra los resultados de la prueba de estabilidad de defectos de tibia segmental después del tratamiento con la matriz suplementada, presentada como el registro de cicatrización. La Figura 4 muestra los resultados de una prueba de estabilidad de defectos de tibia segmental después del tratamiento con la matriz suplementada, presentados en porcentaje de articulaciones no estables restantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describen en este documento, matrices suplementadas comprende un PTH liberablemente incorporado en esta, opcionalmente que contiene un material granular. La PTH es incorporada ya sea a través de enlace covalente a la matriz o a través de interacción no covalente con la matriz y/o los granulos. Estas matrices suplementadas disminuyen el tiempo de cicatrización, comparado con autoinjertos y/o activación de cicatrización de fracturas óseas las cuales de otro modo, no podrían sanar. Las matrices son biocompatibles y biodegradables, y pueden ser formadas in vi tro o in vivo al tiempo del implante. La PTH puede ser incorporada en las matrices con retención completa de su bioactividad. La PTH puede ser liberablemente incorporada, usando técnicas que proporcionan control sobre como y cuando y a que grado la PTH es liberada usando la matriz como un vehículo de liberación controlada para cicatrizar fracturas óseas.

Definiciones "Si tio de adhesión o si tio de unión cel ular" como se usa en general en este documento, se refiere a una secuencia peptídica en la cual una molécula, por ejemplo, un receptor que promueve la adhesión en la superficie de una célula, se enlaza. Ejemplos de sitios de adhesión incluyen, pero no se limitan a, la secuencia RGD a partir de fibronectina, y la secuencia YIGSR (SEC ID NO: 1) de laminina. Los sitios de adhesión pueden ser opcionalmente, incorporados en la matriz, incluyendo un dominio de sustrato reticulable a la matriz de fibrina. "Acti vidad biológica" , como se usa en general en este documento, se refiere a eventos funcionales mediados por una proteína de interés. En algunas modalidades, estos incluyen eventos ensayados midiendo las interacciones de un polipéptido con otro polipéptido. También incluye ensayar el efecto en el cual, la proteína de interés tiene en el crecimiento, diferenciación, muerte, migración, adhesión celular, interacciones con otras proteínas, actividad enzimática, fosforilación o desfosforilación de proteína, transcripción o traducción. "Fractura ósea" como se usa en este documento, se refiere a una discontinuidad o rompimiento a través de la estructura ósea completa creando dos o más segmentos óseos distintos.

" Calcio mineral" como se usa en general en este documento, se refiere a sustancias homogéneas que se originan naturalmente, las cuales contienen iones de calcio. Un ejemplo para un mineral de calcio es hidroxiapatito (Cast (OH) (P04)3j), el cual es el componente principal de dientes y huesos. "Reticulación", como se usa en general en este documento, significa la formación de enlaces covalentes. " Uni ón retardada" como se usa en general en este documento, significa una fractura ósea que no ha sido cicatrizada dentro de 3-4 meses, es decir, un tiempo consumido que es considerado adecuado para la cicatrización ósea normal. La unión retardada sugiere que la unión es lenta pero eventualmente ocurrirá sin intervención quirúrgica adicional o no quirúrgica. Sin embargo, una unión retardada puede, en algunos casos, progresar a una no unión en un tiempo posterior. "Ma tri z de fibrina", como se usa en general en este documento, significa el producto de un proceso en el cual, sustancialmente todo los componentes precursores fibrinógeno y trombina, se reticulan en la presencia de una fuente de calcio y Factor Xllla para formar una red tridimensional . "Ma tri z" , como se usa en general en este documento, se refiere a un material propuesto a interfaz con sistemas biológicos para tratar, aumentar o reemplazar cualquier tejido o función del tejido, dependiendo del material ya sea permanentemente o temporalmente. La matriz puede servir como un dispositivo de suministro para PTH incorporados en este y/o como una matriz de crecimiento celular. Las matrices descritas aquí, se forman de componentes precursores líquidos los cuales son capaces de formar un andamiaje en el cuerpo en el sitio de necesidad. Los términos "matriz", "gel" o bio ateriales, son usados sinónimamente en este documento. Los términos "matriz" y "gel", se refieren a la composición formada después que los componentes precursores son mezclados en conjunto. De este modo, los términos "matriz" y "gel", abarcan redes poliméricas parcialmente o completamente reticuladas. Pueden estar en la forma de un líquido, semi-sólido, tal como pasta, o un sólido. Dependiendo del tipo de materiales precursores, la matriz puede expandirse con agua, pero no disolverse en agua, es decir, formar un hidrogel el cual permanece en el cuerpo por un cierto periodo de tiempo. "Polímeros o componentes precursores que se originan na turalmente" , como se usa en general en este documento, se refiere a moléculas las cuales podrían encontrarse en la naturaleza. "Sin unión", como se usa en general en este documento, significa una fractura ósea, que no muestra progreso de cicatrización de fractura dentro de 3 a 6 meses después de la lesión (dependiendo del tipo y ubicación de fractura) en estudios radiográficos mensuales. " PTH" , como se usa en este documento, incluye la secuencia humana de PTH?_84 y todas las versiones truncadas, modificadas y alélicas de PTH, la cual exhibe propiedades de formación ósea, en particular, cuando se incorpora preferiblemente covalentemente unido a una matriz de fibrina. Las versiones truncadas preferidas de PTH son PTH?-38, PTH?-34, PTH1-31, ó PTH?-25. Más preferida es PTH?-3,, .

Preferiblemente, la PTH es la PTH humana, aunque la PTH de otras fuentes, tales como PTH bovina, pueden ser adecuadas. " Péptidos de fusión de PTH" , como se usa en general en este documento, se refiere a un péptido o proteína la cual contiene al menos, un primer y un segundo dominio. Un dominio contiene una PTH, preferiblemente PTH 1-34, y el otro dominio contiene un dominio de sustrato reticulable a una matriz durante o después de su formación. Un sitio de degradación hidrolítica o enzimática, también puede estar presente entre el primer y el segundo dominio. "Periosteo", como se usa en este documento, significa la capa externa de huesos que forman una capa fibrosa, densa, con la excepción de aquellas porciones que forman una estructura articulada la cual cubre la estructura ósea completa y contiene la vasculatura que alimenta el tejido óseo exterior. "Fisiológi co", como se usa en este documento, significa condiciones que se pueden encontrar en vertebrados vivos. En particular, las condiciones fisiológicas se refieren a las condiciones en el cuerpo humano, tales como temperatura y pH. Las temperaturas fisiológicas significan, en particular, un intervalo de temperatura de entre 35°C hasta 42°C, preferiblemente aproximadamente 37 °C. "Reparaci ón o cicatri zación de fracturas óseas" , como se usa en general en este documento, significa reunión y realineación de los extremos de huesos rotos. "Matrices suplementadas" como se usa en general en este documento, se refiere a una matriz que tiene incorporada PTH.

I . Matrices Suplementadas A. Materiales de Matriz Para reparación o regeneración de tejido, las células deben migrar en un lecho de herida, proliferar, expresar componentes de matriz o formar matriz extracelular, y forman una forma de tejido final. Las poblaciones celulares múltiples a menudo, deben participar en esta respuesta morfogenética, frecuentemente que incluye vasculatura y células nerviosas. Las matrices han sido demostradas por mejorar mayormente, y en algunos casos, han sido encontradas ser esenciales para que esto ocurra. Se han elaborado procedimientos en el desarrollo de matrices de orígenes naturales o sintéticos o una mezcla de ambos. La matriz de fibrina, la cual se describe en el documento WO 03/052091, ha sido encontrada por ser un material de matriz adecuado para la reparación de fracturas óseas . La matriz se forma por reticulación iónicamente, covalentemente, o por combinaciones de las moléculas precursoras de los mismos, y/o por expansión de uno o más materiales poliméricos, es decir, matrices, para formar una red polimérica que tiene suficiente espaciamiento interpolímeros, para permitir crecimiento o migración en la matriz de células. En una modalidad, la matriz se forma de proteínas, preferiblemente proteínas naturalmente presentes en el paciente en el cual, la matriz es implantada. Una proteína de matriz particularmente preferida es fibrina, aunque matrices elaboradas de otras proteínas, tales como colágeno y gelatina, también pueden ser usadas. Polisacáridos y glicoproteínas, también pueden ser usados para formar la matriz.

Ma trices de fibrina La fibrina es un material natural, el cual ha sido reportado para varias aplicaciones biomédicas. Las matrices elaboradas de fibrina ha sido descritas como material para matrices en crecimiento celular en la Patente Estadounidense No. 6,331,422 por Hubell et al . La fibrina ha sido usada en sellantes debido a su capacidad para enlazarse a muchos tejidos y su papel natural en la cicatrización de heridas. Algunas aplicaciones específicas incluyen uso como un sellante para unión de injerto vascular, unión de válvula cardiaca. Adicionalmente, estas matrices han sido usadas como dispositivos de suministro de fármacos, y para regeneración neuronal. Aunque las matrices de fibrina proporcionan un soporte sólido para regeneración de tejido y crecimiento celular, existen algunas secuencias activas en el monómero que directamente mejoran este proceso. Los procesos por los cuales el fibrinógeno es polimerizado en fibrina, también han sido caracterizados. Inicialmente, una proteasa desdobla la molécula de fibrinógeno dimérico en los dos sitios simétricos. Existen varias proteasas posibles que pueden desdoblar el fibrinógeno, que incluyen trombina, peptidasa y proteasa III, y cada una sirve a la proteína en un sitio diferente. Una vez que el fibrinógeno es desdoblado, ocurre una etapa de auto-polimerización en la cual, los monómeros de fibrinógeno entran en conjunto y forman un gel de polímero no covalentemente reticulado. Este auto-montaje ocurre debido a que los sitios de enlace llegan a exponerse después que ocurre el desdoblamiento de proteasa. Una vez que se exponen, estos sitios de enlace en el centro de la molécula pueden enlazarse a otros sitios en las cadenas de fibrinógeno, las cuales están presentes en los extremos de las cadenas peptídicas. De esta manera, se forma una red polimérica. El factor Xllla, una transglutaminasa activada del Factor Xllla por proteólisis de trombina, puede entonces covalentemente reticular la red polimérica. Existen otras transglutaminasas y pueden también estar involucradas en reticulación covalente e injerto a la red de fibrina. Una vez que se forma una matriz de fibrina reticulada, la degradación subsecuente es herméticamente controlada. Una de las moléculas claves en controlar la degradación de fibrina es el inhibidor 2-plasmina. Esta molécula actúa por reticulación en la cadena a de fibrina a través de la acción del Factor Xllla. Uniendo el mismo a la matriz, a una alta concentración de inhibidor puede ser localizado en la matriz. El inhibidor entonces actúa previniendo el enlace de plasminógeno a fibrina e inactivación de plasmina. El inhibidor 2-plasmina contiene un sustrato de glutamina. La secuencia exacta ha sido identificada como NQEQVSPL (SEC ID NO: 2), con la primer glutamina siendo el aminoácido activo para reticulación. Se ha demostrado que los péptidos bi-dominios, los cuales contienen una secuencia de sustrato del factor Xllla y una secuencia peptídica bioactiva, pueden ser reticulados en la matriz de fibrina y que este péptido bioactivo retiene su actividad celular in vitro . Dependiendo en la indicación y sustancias mezcladas en la matriz de fibrina, la concentración de trombina podría variar. En una modalidad preferida, la matriz de fibrina contiene fibrinógeno en un intervalo de 5 a 65 mg por mililitro de matriz de fibrina, más preferiblemente, 15 a 60 mg por mililitro de matriz de fibrina, aún más preferiblemente desde 25 a 55 mg por mililitro de matriz de fibrina, y más preferiblemente, 30 a 45 mg por mililitro de matriz de fibrina. La trombina está presente en un intervalo de 0.5 a 5 I.U. por mililitro de matriz de fibrina, más preferiblemente en un intervalo de entre 1.25 a 3.25 I.U. por mililitro de matriz de fibrina, más preferiblemente de 1.5 a 2.5 I.U. por mililitro de matriz de fibrina. Adicionalmente, una fuente de ion de calcio, ayuda a formar la matriz de fibrina. La fuente de ion de calcio es preferiblemente CaCl2 * 2H20 en una concentración de 0.5 a 5 mg por ml de matriz de fibrina, aún más preferiblemente de 2 a 3.5 mg por ml de matriz de fibrina, más preferiblemente de 2.5 a 3 mg por ml de matriz de fibrina. Esta composición no toma en cuenta algo de agua usada para humedecer algunos granulos potenciales antes de mezclarlos en la matriz de fibrina, puesto que dicha agua permanece en los poros de los granulos a través del proceso de formación de matriz y de este modo, no tendrá algún defecto dilutivo en la concentración de fibrinógeno y trombina en la matriz de fibrina. La I.U. permanece para una unidad internacional de trombina y es definida como la actividad contenida en 0.0853 mg del Primer Estándar Internacional de Trombina Humana.

Componentes precursores para formar matrices de fibrina La matriz de fibrina es preferiblemente formada de dos componentes precursores los cuales pueden estar en la forma de soluciones. El primer componente precursor, típicamente en la forma de una solución, contiene fibrinógeno, preferiblemente en un intervalo de concentración de 10 a 130 mg de fibrinógeno por mililitro de solución precursora, más preferiblemente de 30 a 120 mg de fibrinógeno por mililitro de solución precursora, aún más preferiblemente, de 50 a 110 mg de fibrinógeno por mililitro de solución precursora, y más preferiblemente 60 a 90 mg de fibrinógeno por mililitro de solución precursora. Si la trombina ha sido agregada para formar la matriz, el segundo componente precursor, también típicamente en la forma de una solución, contiene trombina, preferiblemente en un intervalo de concentración de 1 a 10 I.U. de trombina por mililitro de solución precursora, más preferiblemente de 2.5 a 6.5 I.U. de trombina por solución precursora, más preferiblemente de 3 a 5 I.U de trombina por mililitro de solución precursora. Adicionalmente, una fuente de ion de calcio es una de las soluciones precursoras. La fuente de ion de calcio es preferiblemente CaCl2 * 2H20, en un intervalo de concentración de 1 a 10 mg por ml de solución precursora, aún más preferiblemente de 4 a 7 mg por ml de solución precursora, más preferiblemente de 5 a 6 mg por ml de solución precursora. Opcionalmente, una enzima capaz de catalizar la formación de matriz, tal como el Factor Xllla se agrega en una solución precursora. Preferiblemente, el Factor Xllla está presente en una concentración de 0.5 a 100 I.U por mililitro de solución precursora, más preferiblemente de 1 a 60 I.U por mililitro de solución precursora, y más preferiblemente de 1 a 10 I.U por mililitro de solución precursora.

B. Sitios de Uniones Celulares Las células interactúan con su ambiente a través de interacciones proteína-proteína, proteína-oligosacárido y proteína-polisacárido en la superficie celular. Las proteínas de matriz extracelular proporcionan un hospedero de señales bioactivas a la célula. Esta red densa es requerida por soportar las células, y muchas proteínas en la matriz han sido mostradas por controlar la adhesión celular, propagación, migración y diferenciación. Algunas de las proteínas específicas que se ha mostrado por ser particularmente activas incluyen, laminina, vitronectina, fibronectina, fibrina, fibrinógeno y colágeno. Se han conducido muchos estudios de laminina, y se ha mostrado que la laminina juega un papel vital en el desarrollo y regeneración de nervios in vi vo y células nerviosas in vi tro, así como en angiogénesis. Se han identificado algunas de las secuencias específicas que directamente interactúan con receptores celulares y causan ya sea adhesión, propagación o transducción de señal. La laminina, una proteína multidominio grande, ha sido mostrada por consistir de tres cadenas con varios dominios que se unen al receptor. Estos dominios que se unen al receptor incluyen la secuencia YIGSR (SEC ID NO: 1) de la cadena Bl de laminina, LRGDN (SEC ID NO: 3) de la cadena A de laminina y PDGSR (SEC ID NO: 4) de la cadena Bl de laminina. Otras secuencias de reconocimientos variadas para células se han identificado. Estas incluyen IKVAV (SEC ID NO: 5) de la cadena A de laminina y la secuencia RNLAEIIKDI (SEC ID NO: 6) de la cadena B2 de laminina. Particularmente preferida es la secuencia RGD de fibronectina. En una modalidad preferida adicional, se incorporan en la matriz los sitios del péptido para adhesión celular, llamados péptidos que se unen a receptores que promueven la adhesión en las superficies celulares. Tales péptidos que promueven la adhesión, incluyen aquellos descritos anteriormente. Particularmente preferidas son la secuencias RGD de fibronectina, la secuencia YIGSR (SEC ID NO: 1) de laminina. Los sitios de unión celular también pueden ser incluidos con algunas de las matrices naturales. La incorporación puede ser completada, por ejemplo, mezclando un péptido unido a la célula que contiene cisteína con la molécula precursora incluyendo el grupo insaturado conjugado, tal como acrilato PEG, acrilamida PEG o vinilsulfona PEG. Esta etapa puede ocurrir inmediatamente, por ejemplo, uno pocos minutos, antes del mezclado con lo restante del componente precursor, incluyendo el grupo nucleofílico, tal como componente precursor que contiene tiol. Si el sitio de unión celular no incluye una cisteína, puede ser químicamente sintetizado por incluir uno. Durante esta etapa, el péptido que promueve la adhesión llegará a ser incorporado en un extremo del precursor multiplicadamente funcionalizado con una saturación conjugada; cuando se agrega el resto del multi-tiol al sistema, se formará una red reticulada. La concentración de sitios de adhesión covalentemente unidos en la matriz, puede influenciar la velocidad de infiltración celular. Por ejemplo, para un hidrogel dado, se pueden incorporar un intervalo de concentración RGD en la matriz con células soportadas en crecimiento y migración celular en una ruta óptima. El intervalo de concentración óptima de sitios de adhesión similar a RGD es entre 0.04 y 0.05 mM y aún más preferible 0.05 mM en particular para una matriz que tiene un contenido de agua entre concentración de equilibrio y 92% en peso después de la terminación de absorción de agua.

C. PTH El término "PTH" como se usa en este documento, incluye la secuencia humana de PTH?-84 y todas las versiones truncadas, modificadas y alélicas de PTH, las cuales exhiben propiedades de formación de hueso cuando covalentemente se unen a matrices biodegradables naturales o sintéticas. Versiones truncadas preferidas de PTH son PTHi-38, PTH?-34, PTH?-31, PTH?_28 o PTH?-25- Más preferida es PTH1-34. Preferiblemente, la PTH es PTH humana, aunque puede ser adecuada PTH de otras fuentes, tal como PTH de bovino. La PTH en un intervalo de 0.01 hasta 2 mg de PTH/ml de matriz, es adecuada para la reparación y cicatrización de fracturas óseas, con la condición de que una concentración de 0.4 mg de PTH/ml de matriz no está incluida. Preferiblemente, la concentración de PTH está en un intervalo de entre 0.1 a 1.7 mg/ml de matriz, aún más preferiblemente, el intervalo de concentración está en un intervalo de entre 0.3 a 1.5 mg/ml de matriz y más preferiblemente, en un intervalo de concentración de entre 0.4 a 1.1 mg/ml de matriz, con la condición que una concentración de 0.4 mg de PTH/ml de matriz no está incluida. En una modalidad preferida, la matriz es una matriz de fibrina. c. Péptidos de Fusión de PTH En una modalidad preferida, la PTH es un péptido de fusión de PTH, el cual comprende al menos, dos dominios en donde el primer dominio comprende la PTH y el segundo dominio comprende un dominio de sustrato reticulable a la matriz antes de, durante o después de su formación. El dominio de sustrato puede ser un dominio para una enzima, preferiblemente un dominio de sustrato para una transglutaminasa ("dominio de sustrato transglutaminasa") , más preferiblemente para una transglutaminasa de tejido ("dominio de sustrato de transglutaminasa de tejido"), y más preferiblemente es un dominio de sustrato para el Factor Xllla ("dominio de sustrato del Factor Xllla") . Las reacciones de acil-transferasa de transglutaminasa catalizan entre el grupo ga ma-carboxamida de residuos de glutaminil unidos a la proteína y el grupo epsilo-amino de residuos lisina, que resulta en la formación de puentes de cadenas laterales N-epsilon- (gamma-glutamil) lisina isopéptido. Se puede diseñar la secuencia de aminoácido del péptido de fusión para contener adicionalmente un sitio de desdoblamiento enzimático o hidrolítico, así la PTH puede ser liberada con poca o sin modificación para la estructura primaria. Los dominios de sustrato de transglutaminasa y en particular, los dominios del sustrato del Factor Xllla, son adecuados para unirse al péptido de fusión a matrices naturales, tales como matrices de fibrina. Cuando se usan con una matriz de fibrina, el sitio de degradación en el péptido de fusión es preferiblemente enzimáticamente degradable, para que la liberación de PTH sea controlada por procesos específicos celulares, tales como proteólisis localizada. El dominio de sustrato reticulable incluye G.AKDV (SEC ID NO: 7), KKKK (SEC ID NO: 8), YRGDTIGEGQQHHLGG (SEC ID NO: 9), o NQEQVSPL (SEC ID NO: 2). El dominio de sustrato del Factor Xllla más preferido tiene una secuencia de aminoácido NQEQVSPL (SEC ID NO: 2) y es referenciado en este documento como "TG" y TG-PTH. El péptido de fusión PTH puede ser producido recombinantemente o por síntesis química. El péptido de fusión PTH 1-34 es preferiblemente producido por síntesis química. Los dominios de sustrato de transglutaminasa adecuados para propósitos de la presente invención, han sido descritos en detalle incluyendo sus secuencias de aminoácido, en el documento WO 03/052091, el contenido respectivo del mismo siendo incorporado en este documento por referencia. Como se describe en este documento, como una modalidad preferida, el dominio del sustrato del Factor Xllla, es ya sea directamente ligado a la PTH?_34, o puede incluir un sitio de degradación entre la PTH (primer dominio) y la secuencia NQEQVSP (SEC ID NO: 2) (segundo domino) . Como tal, el péptido de fusión PTH?-34, puede ser incorporado dentro de la fibrina durante la coagulación vía el sustrato del factor Xllla y liberación como PTH?_3 . Los sitios de degradación permiten a la PTH, ser liberada con poca o ninguna modificación en la secuencia peptídica primaria, la cual puede resultar en actividad superior del factor. Además, permite a la liberación del factor ser controlada por procesos específicos celulares. Esto permite a los factores ser liberados a diferentes velocidades dentro del mismo material dependiendo de la ubicación de las células dentro del material. Esto también reduce la cantidad de PTH?-34 necesaria, puesto que su liberación es controlada por procesos celulares. En una explicación posible para la cicatrización fuerte de los defectos óseos mencionados anteriormente con PTH incorporada y preferiblemente, unida a la matriz, se piensa es importante que la PTH es administrada localmente sobre un periodo prolongado de tiempo (es decir, sin solo una dosis pulsada única), pero sin una forma continua. Esto es realizado por una degradación lenta, a través de ya sea desdoblamiento enzimático o desdoblamiento hidrolítico de la matriz. De esta forma, la molécula es entonces suministrada a través de un efecto pseudo-pulsado que ocurre sobre un periodo sostenido de tiempo. Cuando una célula preosteoblástica infiltra la matriz, encontrará una molécula PTH la cual inducirá una proliferación adicional del preosteoblasto, así como también una síntesis de factores de crecimiento múltiples cruciales para nueva formación ósea. Sin embargo, si tal célula particular no continua liberando PTH unida de la matriz, no comenzará a producir interleucina-6, con ello, evitando la última etapa de efectos catabólicos en la formación de osteoclastos. El resultado puro es entonces densidad mineral ósea superior y formación pura de matriz ósea. Finalmente, los efectos terapéuticos del péptido están localizados en la región de defecto y son subsecuentemente amplificados.

Sitios de degradación del péptido de fusión Un sitio de degradación enzimática o hidrolítica puede estar presente entre el primero y segundo dominios del péptido de fusión. Los sitios de degradación pueden ser degradables por degradación enzimática específica. Este permite la liberación de la PTH ser controlada por procesos celulares específicos, tales como proteólisis localizada. Permite a la PTH ser liberada a diferentes velocidades dentro de la matriz, dependiendo de la ubicación de las células dentro del material. Preferiblemente, el sitio de degradación es desdobable por una enzima seleccionada del grupo que consiste de plasmina y metaloproteinasas de matriz. Por selección cuidadosa de Km y kcat de este sitio de degradación enzimática, la degradación podría ser controlada para que ocurra ya se antes o después de la formación de matriz y/o por utilización de enzimas similares o no similares para degradas la matriz. Estos sitios degradables permiten el diseño por ingeniería de liberación más específica de PTH a partir de matrices de fibrina. El sitio degradable puede ser desdoblado por enzimas liberadas de células las cuales invaden la matriz. El sitio de degradación permite a la velocidad de suministro ser variada en diferentes ubicaciones dentro de la matriz, dependiendo de la actividad celular en la ubicación y/o dentro de la matriz. Los beneficios adicionales incluyen la dosis de fármaco total inferior dentro del sistema de suministro y la regulación espacial de liberación la cual permite a un mayor porcentaje del fármaco ser liberado en el tiempo de mayor actividad celular. El sitio de degradación es abreviado en el contexto de la presente invención, como "pl". Los sitios de proteolítica ente degradables podrán incluir sustratos para activadores de colagenasa, plasmina, elastasa, estromelisina o plasminógeno. Sustratos ejemplares son listados abajo. N1-N5 denota posiciones de aminoácidos 1-5 hacia el término amino de la proteína a partir del sitio en donde ocurre la proteólisis. Nl'-N4' denota posiciones 1-4 de aminoácidos hacia el término carboxi de la proteína a partir del sitio en donde ocurre la proteólisis.

Tabla 1: Secuencias de sustrato de muestra para proteasa Referencia: 1. Tagaki and Doolittle, (1975) Biochem. 14:5149-5156. 2. Smith et al., (1995). J. Biol . Chem. 270:6440-6449. 3. Besson et al., (1996) 7?nalytical Biochemistry 237:216-223. 4. Netzel-Arnett et al., (1991) J. Biol . Chem. 266:6747-6755. 5. Coombs et al., 1998. J. Biol. Chem. 273:4323-4328 Una modalidad preferida es la secuencia YKNR (SEC ID NO. 18), entre el primer dominio y el segundo dominio y hace el enlace de plasmina degradable. Un péptido de fusión PTH particular preferido es TGpIPTH: NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEC ID NO: 19) .

Las proteínas de fusión preferidas incluyen: TG-PTH?_34: Esta es una forma modificada de PTH que comprende los aminoácidos 1-34 de la PTH nativa, así como también un dominio de sustrato de TG (transglutaminasa) : NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEC ID NO: 20) . TG-pl-PTHi-34: Esta forma corresponde a un TG-PTH excepto que adicionalmente contiene una secuencia degradable de plásmina (pl) entre la secuencia TG y la PTH?-3„ : NQEQVS-PLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEC ID NO: 19) .

Las enzimas que podrían ser usadas para degradación proteolíticas son numerosas. Los sitios proteolíticamente degradables podrían incluir sustratos para colagenasa, plasmina, elastasa, estromelisina o activadores de plasminógenos . En otra modalidad preferida, un dominio de oligoéster podría ser insertado entre el primer y segundo dominio. Esto puede ser realizado usando un oligo éster, tal como oligómeros de ácido láctico.

Combinación de Matrices o componentes precursores y PTH La PTH o péptido de fusión de PTH, está preferiblemente en un intervalo entre 0.01 y 2 mg de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz, los cuales son adecuados para la reparación y cicatrización de fracturas óseas, con la condición que una concentración de 0.4 mg de PTH/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, no están incluidos. Preferiblemente, la concentración de PTH está en un intervalo de entre 0.1 a 1.7 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, aún más preferiblemente, el intervalo de concentración está en un intervalo de entre 0.3 a 1.5 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz y más preferiblemente, en un intervalo de concentración de entre 0.4 a 1.1 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, con la condición de que una concentración de 0.4 mg de PTH/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, no están incluidos. Dependiendo de la edad del paciente, se prefieren ciertas concentraciones de PTH o péptido de fusión de PTH en las matrices. Si la formulación es aplicada a fracturas óseas en niños, la concentración de PTH o péptido de fusión de PTH es preferiblemente por debajo de 0.4 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz pero arriba de 0.01 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz. Específicamente, la concentración de PTH o péptido de fusión de PTH está en un intervalo de entre 0.01 y 0.35 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz, más preferiblemente en un intervalo de concentración de entre 0.1 a 0.3 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz y más preferiblemente, en un intervalo de concentración de entre 0.05 y 0.15 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz. Mientras si la formulación se aplica a adultos, la concentración de PTH o péptido de fusión de PTH es preferiblemente arriba de 0.4 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz, pero no superior de 2 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz. Específicamente, la concentración preferida de PTH o péptido de fusión de PTH, está en un intervalo de entre 0.45 y 2 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz, más preferiblemente entre 0.7 y 1.5 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores y más preferiblemente entre 0.9 y 1.1 mg de PTH o péptido de fusión de PTH/ml de matriz o componentes precursores que forman la matriz. En una modalidad preferida, la matriz es una matriz de fibrina.

E . Material Granular La matriz puede también contener un material granular, preferiblemente, el material granular contiene un mineral de calcio, este material granular principalmente soporta las propiedades mecánicas de la matriz de fibrina para adaptar la matriz a necesidades específicas de la indicación. El material granular puede ser cualquier material biocompatible que proporciona el soporte mecánico necesario a la composición, con lo cual, el grado de soporte mecánico es dependiente de la indicación. Preferiblemente, el material granular es un compuesto de cerámica. Los compuestos de cerámica biodegradables, han mostrado propiedades favorables en la matriz. El compuesto de cerámica preferiblemente comprende un mineral de calcio, como hidroxiapatito, fosfato de calcio o sulfato de calcio. Los materiales adecuados incluyen mezclas porosas biodegradables de hidroxiapatito y fosfato de tricalcio, como TRICOS® de Biomatlante (Francia) o CAMCERAM® de Cam Implants, Leiden (Holanda) . Más preferida es una mezcla biodegradable de hidroxiapatito y fosfato tricálcico. Un ejemplo es un producto comercializado bajo el nombre comercial TRICOS®, el cual contiene una mezcla de 60% de hidroxiapatito y 40% de fosfato de tricalcio. Otros granulos de hidroxiapatito/fosfato tricálcico porosos son CAM-CERAM®.

También es posible usar granulos de fosfato tricálcico/hidroxiapatito no poroso, granulos de hidroxiapatito puros (porosos o no porosos) , granulos de fosfato tricálcico (porosos o no porosos) , granulos de sulfato de calcio, fragmentos óseos (ya sea autoinjerto o aloinjerto) o fragmentos óseos de xenoinjertos. La cantidad de granulos en la matriz suplementada es regulada por el espacio muerto de los granulos. En una modalidad preferida, la relación es 1:1 de volumen de espacio muerto en los granulos a volumen total de líquidos en la matriz; esto podría constituir el límite superior de granulos en la matriz. Dependiente del tipo de fractura, cualquier cantidad de granulos menores que aquellas son posibles, si el tipo de fractura ósea requiere solamente un soporte mecánico menor.

III. Métodos de Aplicación Las matrices suplementadas pueden ser formadas in si tu en el sitio de necesidad o en el cuerpo o pueden ser reformadas y después implantadas en la ubicación deseada, es decir, en el sitio de fractura. La gelificación/formación in si tu puede ocurrir por mezclado de soluciones precursoras de fibrina que contienen la PTH con los granulos, si se presentan, y aplicar la matriz al sitio de fractura. En otra modalidad, la matriz puede ser formada fuera del cuerpo y después aplicada en la configuración preformada. Cuando una matriz de fibrina está siendo formada de los componentes precursores, debe mantenerse separada antes de la aplicación para prevenir la polimerización prematura. Para prevenir contacto prematuro antes de la administración, un kit el cual separa las soluciones precursoras entre sí, puede ser usado. Después de mezclar bajo condiciones que permiten la polimerización, las soluciones precursoras forman una red tridimensional suplementada de PTH. Dependiendo de los componentes precursores y sus concentraciones, el tiempo de gelificación puede ser ajustado a la necesidad. En una modalidad, la matriz es formada de fibrinógeno. El fibrinógeno, a través de una cascada de varias reacciones, gelifica para formar una matriz, cuando se lleva en contacto con trombina y una fuente de calcio a temperatura y pH apropiado. Los tres componentes, fibrinógeno, trombina y fuente de calcio, deben ser almacenados separadamente. Sin embargo, tan pronto como al menos uno de los tres componentes se mantiene separado, los otros dos componentes pueden ser combinados antes de la administración. La matriz suplementada debe ser diseñada de manera tal que la introducción de la matriz es posible como líquidos o en consistencia similar a pasta, la cual permea y llena el sitio de fractura ósea. La solidificación permite al andamiaje, y por lo tanto, al agente activo, ser retenido en el sitio de fractura. Las células también pueden ser agregadas a la matriz suplementada antes de o en el tiempo del implante, o aún subsecuente al implante, ya sea en o subsecuente a reticulación del polímero para formar la matriz. Esto puede ser además de o en lugar de reticulación de la matriz para producir espaciamiento intersticial diseñado para promover la proliferación celular o en crecimiento. En una modalidad, el fibrinógeno se disuelve (el cual puede contener adicionalmente aprotinina para incrementar la estabilidad) , en una solución amortiguada a pH fisiológico (en un intervalo desde pH 6.5 a 8.0, preferiblemente de pH 7.0 a 7.5) y se almacena separadamente de una solución de trombina en un amortiguador de cloruro de calcio. La solución amortiguadora para el fibrinógeno puede ser una solución amortiguadora de histidina que incluye adicionalmente NaCl o salina amortiguada con TRIS. .Ambas soluciones son típicamente almacenadas congeladas y tienen que ser descongeladas antes de la aplicación. En una modalidad preferida, se proporciona un kit, el cual contiene PTH, preferiblemente un péptido de fusión de PTH, un material granular, preferiblemente que contiene un mineral de calcio, fibrinógeno, trombina y una fuente de calcio. Opcionalmente, el kit puede contener una enzima de reticulación, tal como el Factor Xllla. La PTH, preferiblemente, la proteína de fusión de PTH, puede presente en ya sea el fibrinógeno o la solución precursora de trombina. En una modalidad preferida, la solución precursora de fibrinógeno contiene la PTH, preferiblemente, un péptido de fusión de PTH. Las soluciones de fibrinógeno y trombina, son preferiblemente mezcladas por un dispositivo de jeringa de dos vías, en la cual, ocurre el mezclado apretando los contenidos de ambas jeringas a través de una cámara de mezclado y/o aguja y/o mezclador estático. En una modalidad preferida, tanto el fibrinógeno como trombina son almacenados separadamente en forma liofilizada. Cualquiera de los dos componentes precursores puede contener la proteína de fusión y el material granular. Antes del uso, se agrega amortiguador tris o histidina al fibrinógeno, el amortiguador puede adicionalmente, contener aprotinina para formar una solución precursora de fibrinógeno. Antes del uso, la trombina liofilizada es disuelta en la solución de cloruro de calcio para formar la solución precursora de trombina. Subsecuentemente, las soluciones de fibrinógeno y trombina son colocadas en recipientes separados, viales o cuerpos de jeringa y mezcladas por un dispositivo de conexión de dos vías, tal como una jeringa de dos vías. Opcionalmente, los recipientes, viales o cuerpos de jeringa, son bipartitas, de este modo, teniendo dos cámaras separadas por una división ajustable la cual es perpendicular a la pared del cuerpo de jeringa, recipiente o vial. Una de las cámaras contiene el fibrinógeno liofilizado o trombina, mientras la otra cámara contiene una solución amortiguadora apropiada. Cuando el émbolo se presiona hacia abajo, la división mueve y libera el amortiguador en la cámara de fibrinógeno para disolver el fibrinógeno. Una vez que tanto el fibrinógeno como trombina son disueltos, ambos cuerpos de jeringa bipartitas se unen a un dispositivo de conexión de dos vías y los contenidos son mezclados apretándolos a través de la aguja de inyección uniéndolos al dispositivo de conexión. Opcionalmente, el dispositivo de conexión contiene un mezclador estático para mejorar el mezclado de los contenidos. El material granular puede ser proporcionado en una jeringa separada. De conformidad con una modalidad preferida, el material granular es humedecido inyectando agua estéril en la jeringa. Subsecuentemente, la jeringa de dos vías anterior que contiene las soluciones precursoras de fibrina y la PTH, es unida la jeringa que contiene el material granular humedecido. El contenido completo de la jeringa de dos vías es transferido en la jeringa que contiene el material granular. El contenido completo es subsecuentemente inyectado en el sitio de la fractura ósea y es moldeable por varios minutos. Adicionalmente, otros componentes además de los ingredientes mencionados anteriormente, pueden ser incorporados en las soluciones precursoras y/o matrices resultantes. Por ejemplo, un material que contiene un mineral de calcio, es decir, una sustancia homogénea que se origina naturalmente, que contiene iones de calcio tales como hidroxiapatito, puede ser usado. Mientras las composiciones y métodos han sido descritos en términos de modalidades preferidas, será aparente para aquellos expertos en la técnica, que pueden ser aplicadas variaciones a la composición, métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en este documento, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1: Bioactividad de PTH?-34 y TGpIPTH?_34 El péptido PTH?_3íj, muestra actividad similar a la PTH?-34 de longitud completa, y proteínas de esta longitud pueden ser sintetizadas por métodos de síntesis peptídica de estado sólido estándar. Todos los péptidos son sintetizados en resina sólida usando un sintetizador peptídico automatizado usando química estándar de 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Los péptidos son purificados por cromatografía de cld y analizados usando cromatografía de fase inversa vía CLAR para determinar la pureza, así como también espectroscopia de masas (MALDI), para identificar el peso molecular de cada producto. Usando este método, la PTHi-34, así como también TG-pl-PTHi-34 NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWL- RKKLQDVHNF (SEC ID NO: 19) y TGPTH?-34 NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEC ID NO: 20), fueron sintetizadas. Las TGplTPH?_34 y TGPTH?_34, difieren de PTH?_34 en que adicionalmente comprenden el dominio del sustrato del Factor Xllla, el cual está ligado a PTH?-34 vía la secuencia pl degradable de plasmina YKNR (SEC ID NO: 18), en el caso de TGplPTH?_34 y directamente en el caso de TGPTH?_34. Para estudiar la bioactividad de los péptidos de fusión de PTH, se estableció un ensayo de gen reportero. En este ensayo, un plásmido que contiene el gen reportero de luciferasa, el cual está ligado al promotor para el receptor de la hormona paratiroides, es transfectado en las células. Entonces, si la célula es expuesta a PTH y la PTH subsecuentemente se enlaza a su receptor en la célula, se inicia una cascada señal, dirigida a través de los niveles elevados de cAMP. A través de una regulación de retroalimentación natural, entonces esto conduce a una reducción de los niveles del receptor de PTH. Como la reducción se dirige a través del promotor, también entonces conduce a un decremento en la producción del gen reportero ligado. Usando este ensayo, la actividad de tanto PTH?-34 nativa, así como también TG-pl-PTH?_34, se estudiaron y compararon con un estándar internacional. Se observó que ambas de estas moléculas mostraron un nivel de actividad similar, conforme la reducción en la expresión del gen reportero para ambos fue la misma, y este nivel de actividad es el mismo como para el estándar internacional. Los resultados se muestran en la Figura 1.

Ejemplo 2: Liberación de PTH a partir de una matriz de fibrina Se hizo una matriz de fibrina de componentes precursores de fibrina del Kit TISSEEL® (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH) . La composición se lista en la Tabla 2. En la presencia de 0.1 µg/ml de PTH?_34 ó TGPTH?_34 entonces se agrega a la trombina, y se mezcla para formar una concentración homogénea. La TGPTH?_34 solamente tiene una secuencia de transglutaminasa en el término amino, sin un sitio de degradación. De este modo, la TGPTH?_34, puede solamente ser liberada por degradación de la matriz de fibrina misma. Este péptido se sintetizó como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Para el primer ensayo de liberación, se incubó una matriz de fibrina de 50 µl con 0.1 mg de PTH o TGPTH por ml de fibrina, a 37°C en 10 ml de amortiguador. Por lo tanto, la concentración de PTH o TGPTH en el amortiguador en el caso de una liberación total, podría ser 0.5 µg de PTH p TGPTH/ml de matriz de fibrina. Para comparar la estabilidad de PTH o TGPTH durante el ensayo, se diluyeron directamente en el amortiguador, muestras de PTH o TGPTH, a una concentración de 0.5 µg de PTH o TGPTH/ml de matriz de fibrina. Se probaron amortiguadores diferentes: agua destilada, salina amortiguada de fosfato, salina amortiguada por tris. Se tomaron alícuotas en los días 0, 1, 2, 4 y 6 y se analizaron directamente por ELISA. Los resultados mostraron que la PTH no fue estable por más de 2 días en cualquiera de los amortiguadores. Por lo tanto, la conclusión podría hacerse en los datos de liberación. La estabilidad de PTH fue ciertamente afectada por su baja concentración y amortiguadores que no fueron óptimos. El experimento de liberación se repitió usando un amortiguador de estabilización que contiene 50 mM de manitol en 10 M de amortiguador de acetato de sodio. Además, el amortiguador se intercambió cada 2 días para prevenir cualquier degradación peptídica. La concentración de PTH o TGPTH se incrementó a 1 mg de PTH o TGPTH/ml de matriz de fibrina en una matriz de fibrina de 100 µl y la incubación se logró en 1 ml de amortiguador. La concentración de PTH o TGPTH en el amortiguador en el caso de una liberación total, podría ser 100 µg/ml de matriz de fibrina (200 veces más que anteriormente) . Como en el primer experimento, muestras elegidas (la misma cantidad de PTH o TGPTH disuelta en el amortiguador como control), se prepararon para evaluar la estabilidad de PTH o TGPTH durante el experimento (100 µg/ml) . Las muestras se colectaron cada 2 a 4 días (con un cambio de amortiguador) durante 2 semanas y se analizaron por ELISA directo. Las muestras elegidas también se colectaron cada 2 días. Los resultados mostraron que bajo estas condiciones, la PTH y TGPTH son estables durante 2 semanas. Como se puede ver de la Figura 2, la liberación principal de la matriz de fibrina se logra dentro de 3 días. Casi 60% de PTH y 13% de TGPTH fueron liberados después de 3 días. Estos datos demuestran que la retención de PTH en la matriz de fibrina es altamente mejorada por la adición de la secuencia de TG.

Ejemplo 3: Modelo de Defecto de Tibia de Oveja La matriz de fibrina se formó partiendo del Kit TISSEEL® (Baxter AG, CH-8604 Volkestwil/ZH) , dando 4 ml de matriz de fibrina. El TISSEEL® se produjo de plasma combinado derivado de humano, y el contenido de los ingredientes activos puede variar de lote a lote dentro de intervalos predefinidos. Ma tri z : La matriz se preparó usando 3 jeringas separadas, una jeringa de dos vías que contiene solución precursora de fibrina y péptido de fusión de PTH (jeringas 1 y 2), y dos jeringas de una vía que contienen granulos (jeringas 3 y 4) . La tabla 2 lista la composición final usada.

Tabla 2: Composición Final que comprende TISSEEL® componente activo Primero, los granulos de hidroxiapatito/fosfato de calcio en la jeringa 4, se humedecieron por inyección del agua de la jeringa 3. La solución precursora de fibrina de la jeringa 1 (fibrinógeno y PTH suspendido en una solución con aprotinina, un inhibidor de proteinasa serina el cual ayuda a reducir la fibrólisis para retener la integridad de la matriz de fibrina) , se mezcló con la solución precursora de fibrina de la jeringa 2 (trombina en una solución de cloruro de calcio) . Se formuló la TGplPTH?-3 en el componente de fibrinógeno para dar una concentración final en la matriz que varía desde 0.1 mg/ml a 10 mg/ml de matriz de fibrina durante el proceso de gelificación de TGplPTH?-34, llegó a reticularse a la matriz. Las soluciones precursoras de fibrina también contienen otros componentes de matriz de fibrina, tales como plasma, fibronectina, Factor Xllla, plasminógeno y albúmina humana. Cuando las soluciones precursoras están en volúmenes iguales, ocurre un proceso de coagulación para formar la fibrina. El proceso de coagulación toma lugar durante varios minutos los cuales permiten la inyección simultánea de las soluciones mezcladas en la jeringa 4, las cuales contienen los granulos humedecidos. La matriz puede ser introducida en el sitio necesario, cuando se solidifican. Se coloca suficiente matriz en el defecto para llenarlo completamente. Animales : Un total de 42 ovejas hembras Alpinas Suizas, que varían entre 44-83 kg (media: 62.8 kg) , y 2.25- 4.75 años de edad, se eligieron como animales experimentales. Se formaron varios grupos con autoinjertos como positivos y matriz de fibrina más granulos de TCP como controles negativos. Los otros grupos consisten de la misma matriz de fibrina y los granulos de TCP, pero difieren solamente en la dosificación del TGplPTH?_34. Los grupos se siguieron por 12 semanas, cuando los animales se sacrificaron en un rastro propiedad de la universidad. Todos los experimentos animales se condujeron de conformidad con las Leyes Suizas de protección y bienestar animal y se autorizaron por Autoridades Veterinarias y Comité de Ética local. Cirugía: Se realizó un procedimiento medio al eje de la tibia, directamente arriba del hueso y se extendió desde el aspecto distal de la babilla hasta la articulación de corvejón, la fascia media de la tibia se le hizo una incisión y el aspecto medio de la tibia se expuso sin alterar el periosteo. Se encontró un agujero 11, de 3.5 mm de amplitud de placa de compresión dinámica (Synthes) en el eje con el extremo distal de la placa que termina arriba de la articulación tibiotarsal. La placa se ajustó al hueso usando once tornillos de 3.5 mm en una posición neutral y distribuyendo cinco agujeros de tornillos distalmente y seis de manera próxima al defecto planeado. Los tornillos y placas se removieron. Posteriormente, el defecto se marcó en el hueso con una cuchilla de escalpelo usando un calibre que asegura un defecto estandarizado de 1 cm entre el 5 y 6to. agujero de tornillo. Con una sierra oscilante, el defecto se cortó bajo irrigación constante y preservación de tejido blando. El segmento de 1 cm que incluye el periosteo circunferencial se removió cuidadosamente y el sangrado local de la médula ósea o tejido blando local, se detuvo aplicando presión con una gasa. La placa se reposicionó y todos los tornillos se reinsertaron antes de que la matriz se llenara en la apertura ósea como se describe anteriormente. Se tomó cuidado para distribuir la matriz igualmente por debajo de la placa, en el lateral y así también como la transcorteza. Para el grupo de control de autoinjerto positivo, el hueso autogénico se colectó a través de una incisión local directamente arriba de la cresta ilíaca. La médula ósea del íleo se abrió usando agujeros perforados múltiples de 3.5 mm. El hueso canceloso se colectó usando una cureta y fue inmediatamente colocado en el defecto quirúrgico en la tibia. Después de llenar los defectos, la fascia media se cerró rutinariamente y la piel se engrapó (Signet 35W®, Auto Sutures, Connecticut, USA) . Mientras los animales están todavía anestesiados, se toman radiografías usando vistas medio-lateral y caudo-craneal de la tibia. Se aplicaron fusiones completas (Scotch Cast™ Plus, Laboratories 3M Santé, Francia) , involucrando las extremidades distales completas que se extienden desde la mitad de la articulación de babilla al nivel de la rótula. La base de las garras se dejó abierta para asegurar el peso que porta en el sitio de fractura, pero previniendo las fuerzas de corte y torsión a través de la inmovilización del eje de la tibia a través de la fusión. Los animales se recuperaron en un sistema de suspensión que previene a los animales de acostarse y levantarse en un impulso ocasionando re-fracturación de la extremidad. Los animales se mantuvieron en el sistema de suspensión por 4-5 semanas, en donde podrían dormir, comer, defecar y orinar sin interferencia. Posteriormente, se mantuvieron en estables pequeños en grupos de 2-3 animales por el resto del periodo de estudio. Se realizaron cambios de fusión cada 7-10 días o antes, si los animales mostraron problemas con su peso de soporte, y en se dejaron en su lugar por mínimamente 4 semanas pero máximamente 12 semanas. Después de las radiografías hasta las fusiones, se tomaron de 4 a 8 semanas. Al tiempo del sacrificio (12 semanas), se tomaron radiografías usando un faxitron (HP Electronics) , después del tejido suave, las placas y tornillos se removieron. Eval uación Macroscópica : Después del sacrificio, el puenteado de la apertura se valoró microscópicamente enfocando en la placa y estabilidad de fractura, signos de inflamación y formación de callo periosteal. Todos los huesos se documentaron con una cámara digital (Minuta, Dimage 7) . La estabilidad mecánica se probó manualmente solamente, pero con cuidado de prevenir daño de tejido para preparación histológica futura. Eval uación radiológica : Se desarrolló un sistema de registro semi-cuantitativo para evaluar las radiografías. Los registros elevados fueron favorables para cicatrización ósea. Las radiografías se evaluaron a través de tres revisores independientes, quienes no fueron informados acerca de los grupos y puntos de tiempo durante el estudio. Todas las radiografías se registraron durante una sesión y si los registro difieren, se toman los registros medios para evaluación estadística. Histología : Brevemente, las secciones óseas se cortaron de manera tal que la apertura previa completa se adjunta y el corte se hace de manera próxima y distalmente del primer agujero de tornillo. Después de la fijación, se lavaron bloques de hueso en paraformaldehído al 4% pro 3-4 semanas, se deshidrataron en una serie ascendente de alcohol, desgrasaron en xileno y finalmente se infiltraron en la resina acrílica. Después de que la infiltración se completa, se realiza polimerización en la forma de Teflón. Las secciones se cortaron en la mitad y paralelas al eje del hueso largo usando una sierra de banda Exacta. .Antes que las secciones se cortaran, se montaron en laminillas de plástico acropal, se tomaron microradiografías con la fijación usando una película especial (Kodak PPL-2) . Entonces, las secciones se trituraron y pulieron a un espesor de 30-40 µm. La superficie de teñido con toluidina azul, permitió la diferenciación entre la matriz de hueso nuevo y viejo y también los granulos de TCP. Para las secciones delgadas (5 µm) , se cortaron bloques en piezas más pequeñas que contienen al menos, una corteza y parte del callo periosteal y endosteal. Se montaron secciones en laminillas de vidrio cubiertas con cromalauna, positivamente cargadas, desplastificadas y teñidas con ya sea toluidina azul o teñido de plata von Kossa, contrateñidas con McNeal . En el último, la matriz ósea mineralizada se tiñó de negro, mientras el osteoide no calcificado se tiñó de azul turquesa. Evaluación histológica cuanti tativa, se condujo enfocando en los tipos celulares, señales de inflamación y mecanismos de degradación de las matrices. Eval uaci ón semi -cuanti tativa, se concentró en apariencia en todos los tipos celulares usando un sistema de registro especialmente desarrollado, y las mediciones histomorfométricas sirvieron como base para la evaluación cuantitativa.

La capacidad regenerativa de la matriz (que contiene concentraciones diferentes de TGplPTH?-34) , se probó además en un defecto de segmento en las ovejas. Aquí, se crearon defectos de espesor completo de 1 cm, unilaterales, en la tibia de la oveja. Después de la osteomía, el periosteo fue cuidadosamente removido para asegurar que el defecto es una no unión por el periodo de tiempo a ser estudiado. Después de la creación del defecto, un material de gelificación in si t u se colocó en el defecto como se describe anteriormente en los métodos de la sección de aplicación. Para propósitos comparativos, se probaron diferentes dosis de TG-PTH: 0.4, 1, 2, 5 y 10 mg/ml, se realizaron dos tratamientos de control en donde no se agregó TGplPTH?-34 a la matriz de compuesto de granulo-fibrina (0 mg/ml) o se aplicó un autoinjerto (abreviado como "AG" en las Figuras 3 y 4) (control positivo) . Se tomaron fotografías por rayos X cada cuatro semanas, y los animales se sacrificaron después de doce semanas. En cada punto de tiempo, se analizaron las fotografías por rayos-X y la magnitud de cicatrización se determinó. Adicionalmente, en el punto final, la tibia se extrajo para análisis vía tomografía computarizada (CT) , así como también histología. Finalmente, como se realizó completa osteomía, y después se plaqueó en una laminilla, el defecto se sometió a fuerzas mecánicas y de tensión significantes. Si el material empleado para tratar el defecto no agrega resistencia significante, este puede conducir a doblado de la placa y deformación del ángulo. De las fotografías por rayos-X y muestras finales, este es otro parámetro que ha sido medido. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 3: Cuando la fibrina más el material de TCP solo (control negativo) se probó en este modelo, se observó una respuesta de cicatrización muy baja. De los cuatro animales tratados con este material de control, ninguno de ellos mostró cicatrización clínicamente relevante, con uno que mostró una respuesta de cicatrización moderada y los otros tres que mostraron signos clásicos de no unión después de 12 semanas. Además, dentro de las primeras cuatro semanas, todos los cuatro animales mostraron doblado significante de la placa y subsecuente distorsión del defecto. En la siguiente serie de animales, la matriz suplementada se probó con 0.4, 1, 2, 5 ó 10 mg/ml de TGplPTH?-34. Como una primer medida, estos animales fueron observados con análisis radiográficos para determinar la cantidad de cicatrización periosteal (formación de callo) . A partir de las radiografías subsecuentes, se observó que el tratamiento de estos animales con varias dosis de TGplPTH?-34, proporciona una respuesta dependiente de la dosis, durante el intervalo tratado. Específicamente, cuando las radiografías de estos animales se examinaron, se observó una respuesta de cicatrización periosteal mucho más fuerte en cada punto de tiempo para las dosis entre 0.4 y 2 mg/ml con 0.4 y 1 mg/ml, proporcionando cicatrización periosteal estadísticamente más fuerte, cuando se compara con aquellos tratados con el material de control negativo y la cicatrización que fue equivalente al autoinjerto así como también en las 12 semanas. Adicionalmente, con la dosis de 1 mg/ml, se observa que la mayoría de los animales logró una unión clínica estable dentro de 12 semanas (v áse Figura 14) . En el grupo tratado con 1 mg/ml de TGplPTH?_34, después de 4 semanas, el primer signo de cicatrización podría ya ser observado. Esta cicatrización se incrementó significantemente en el punto de tiempo de 8 semanas, en donde ya un animal mostró unión clínica, mientras los otros cinco mostraron cicatrización avanzada. Esta entonces progresa mucho después de 12 semanas, 5 animales mostraron uniones clínicas, estables. Además, se observó un mejoramiento significante en la estabilidad, con solamente un animal que muestra doblado de la placa, lo cual ocurre dentro de las primeras cuatro semanas. En la Figura 4, se muestra la estabilidad de los defectos de la tibia segmental después de 12 semanas.

Después que las ovejas se sacrificaron en la semana doce, la placa se removió y la estabilidad de la apertura original se determinó ligeramente. El porcentaje de defectos que fueron claramente inestables, entonces se determinó. Se puede ver que ninguno de los animales que se trataron con autoinjertos tiene defectos inestables, validando el modelo. Además, cuando los animales se trataron con 1 mg/ml de TGplPTH?-34, solamente un animal tiene un defecto inestable proporcionando una respuesta de cicatrización fuerte similar. Las dosis cercanas a 1 mg/ml también muestran alguna estabilidad mientras las dosis superiores y dosis cero, muestran una estabilidad muy inferior en el punto final. Como una medida final de cicatrización, la relación de formación de hueso endoesteal (formación de hueso en la capa interna de los huesos largos, es decir, dentro de la apertura) y resorción de granulo, se midió a través de histomorfometría. Se observó que con 1 mg/ml de dosis de TGplPTH?-34, la cantidad de formación ósea endosteal fue superior que con las otras concentraciones de TGplPTH?-34, con dosis superiores proporcionando cantidades inferiores de nueva formación ósea. Además, se observa que la relación de resorción de granulo fue directamente proporcional a la relación de formación ósea endosteal, con una vez más, la dosis de 1 mg/ml de TGplPTH?-34, proporcionando la mejor respuesta (es decir, la relación de resorción más alta) . Cuando se observa el intervalo de dosis completa, podría verse que las dosis superiores proporcionan relaciones inferiores de tanto formación ósea enodosteal como resorción de granulo, con las dosis alrededor de 1 mg/ml de TGplPTH?-3 , proporcionando la mejor respuesta. Los resultados mejorados en el grupo tratado con TGplPTH?_34, comparado con los grupos de control, demuestran que la presencia de dosis clínicamente relevantes de TGplPTH?-3 en las matrices suplementadas, pueden conducir a un fuerte mejoramiento en la cicatrización. La cicatrización más rápida, formación ósea mejorada, así como también la estabilidad mejorada en modelos altamente mecánicamente estresados, son características relevantes para justificar la aplicación de la matriz suplementada en fracturas de compresión radial distal. Además, en vista de los resultados a partir de la formación ósea periosteal, formación ósea endosteal y resorción de granulo y la estabilidad total, podría observarse que dosis de entre 0.4 mg/ml hasta 1.1 mg/ml de TGplPTH?-34 de matriz de fibrina, son los intervalos de concentración más preferidos.

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una formulación, caracterizada porque comprende: (i) un péptido seleccionado del grupo que consiste de PTH y péptido de fusión de PTH; (ii) un material granular que comprende un mineral de calcio y (iii) una composición capaz de formar una matriz de fibrina bajo condiciones fisiológicas que comprenden un componente precursor de fibrinógeno y un componente precursor de trombina, en donde la PTH o el péptido de fusión de PTH está presente en un intervalo de concentración de entre 0.01 hasta 2 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, con la condición de que una concentración de 0.4 mg/ml de matriz de fibrina o componentes precursores que forman la matriz, no está incluida.

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente precursor de fibrinógeno o el componente precursor de trombina además comprende una fuente de calcio.

3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el péptido de fusión de PTH comprende al menos, dos dominios, en donde el primer dominio comprende PTH y el segundo dominio comprende un dominio de sustrato reticulable.

4. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la PTH se selecciona del grupo que consiste de PTH?-84, PTH?_38, PTHi-34, PTHi-31, y PTH -2

5. 5. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la PTH es PT?_34.

6. La formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el segundo dominio comprende un dominio de sustrato de transglutaminasa.

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el dominio de transglutaminasa comprende un dominio de sustrato de Factor Xllla.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el péptido de fusión de PTH además comprende un sitio de degradación entre el primero y segundo dominios.

9. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el material granular es una mezcla de fosfato tricálcico e hidroxiapatito.

10. Un kit, caracterizado porque comprende la formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. El kit de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el componente precursor de fibrinógeno y componente precursor de fibrina son separados entre sí.

12. El kit de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el péptido de fusión de PTH además comprende un sitio de degradación entre el primero y segundo dominios, dicho sitio de degradación es un sitio de degradación enzimática o hidrolítica.

13. Una matriz suplementada, caracterizada porque comprende : (i) PTH o un péptido de fusión de PTH; (ii) un material granular que comprende un mineral de calcio y (iii) fibrina; en donde dicha PTH o péptido de fusión de PTH están presentes en un intervalo de concentración de entre 0.01 hasta 2 mg/ml de matriz de fibrina, con la condición de que una concentración de 0.4 mg/ml de matriz de fibrina, no está incluida.

14. La matriz suplementada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la PTH se selecciona del grupo que consiste de PTH!-84, TPH;L-38, TPHI_34, TPH?-31 Y PTHi-25.

15. La matriz suplementada de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la PTH es PTH?-34.

16. La matriz suplementada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque la matriz suplementada se forma de una composición capaz de formar una matriz de fibrina y un péptido de fusión, que comprende la PTH en un primer dominio, y un dominio de sustrato covalentemente reticulable en un segundo dominio.

17. La matriz suplementada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el segundo dominio comprende un dominio de sustrato del Factor Xllla.

18. La matriz suplementada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizada porque el péptido de fusión de PTH además comprende un sitio de degradación entre el primero y segundo dominios.

19. La matriz suplementada de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el sitio de degradación es un sitio de degradación enzimática.

20. La matriz suplementada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, caracterizada porque el material granular es una mezcla de fosfato tricálcico e hidroxiapatito.

21. Uso de una matriz suplementada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, para la manufactura de un medicamento para ser localmente administrado para la reparación de fracturas óseas.

22. Uso de una formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la manufactura de un medicamento para ser localmente administrado para la reparación de fracturas óseas.

23. Uso de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, en donde la fractura ósea es una fractura del radio distal o de la tibia.