MXPA04006021A - Matrices de proteina modificada con factor de crecimiento para ingenieria de tejidos. - Google Patents

Abstract

Se incorporan proteinas en el interior de una proteina o matrices de polisacaridos para utilizarse en la reparacion, regeneracion, y/o remodelacion de tejidos y/o suministro de farmaco. Las proteinas se pueden incorporar de tal forma que se liberen mediante la degradacion de la matriz, por accion y/o difusion enzimatica. Segun se demuestra por los ejemplos, un metodo es unir heparina a la matriz mediante metodos ya sea covalentes o no covalentes, para formar una matriz de heparina. Entonces la heparina no covalentes se une a los factores de crecimiento de union con heparina a la matriz de proteina. Alternativamente, se puede construir una proteina de fusion que contenga una region reticulante tal como por ejemplo, un substrato del Factor XIIIa y la secuencia de proteina natural. La incorporacion de enlaces degradables entre la matriz y los factores bioactivos puede ser particularmente util cuando se desea un suministro de farmacos a largo plazo, por ejemplo, en el caso de regeneracion nerviosa, en donde es conveniente variar la velocidad de liberacion de farmacos espacialmente como una funcion de regeneracion, por ejemplo, rapidamente cerca de la interfaz de tejido viviente y mas lentamente lejos en la zona herida. Los beneficios adicionales incluyen la menor dosis de farmaco total dentro del sistema de suministro, y la regulacion espacial de liberacion que permite que se libere un mayor porcentaje del farmaco en el momento de una mayor actividad celular.

Description

MATRICES DE PROTEÍNA MODIFICADA CON FACTOR DE CRECIMIENTO PARA INGENIERÍA DE TEJIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con proteínas de fusión o péptidos que contienen PTH y una secuencia de aminoácidos que permite interacciones de unión con matrices y con el uso de proteínas de fusión o péptidos en la reparación y regeneración de tejidos, y en la liberación controlada de la PTH.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona paratiroides (PTH, por sus siglas en inglés) es un péptido de 84 aminoácidos que se elabora y. . secreta por la glándula paratiroides. Esta hormona desempeña una función primaria en el control de los niveles de calcio sérico a través de su acción sobre diversos tejidos, entre los que se incluyen los huesos. Los estudios en seres humanos con diversas formas de PTH han demostrado un efecto anabólico sobre los huesos, lo cual los hace interesantes para el tratamiento de osteoporosis y trastornos óseos relacionados (patente de los Estados Unidos No. 5,747,456 de Chorev, et al. y WO 00/10596 de Eli Lilly & Co . ) .

La hormona paratiroides actúa sobre las células mediante la unión a un receptor de superficie celular. Se sabe que este receptor se encuentra sobre osteoblastos, las células que son responsables de la formación de huesos nuevos. Se ha reportado que el dominio de 34 aminoácidos N-terminal de la hormona humana es equivalente biológicamente a la hormona de longitud total. La PTH 1-34 y su modo de acción se reportó primero en la patente de los Estados Unidos No. 4,086,196. Debido a que la investigación se ha realizado sobre PTH 1-34 y otras versiones truncadas de la forma de PTH humana natural, como por ejemplo, PTH1-25, PTH1-31 y PTH1-38 (véase, por ejemplo, Rixon RH, et al., J Bone Miner. Res., 9(8) :1179-89 (Agosto de 1994) . El mecanismo mediante el cual la PTH influye en la remodelación ósea es complicado, lo cual ha conducido a resultados conflictivos y posteriormente-, a un número significativo de estudios sobre el mecanismo exacto implicado. Se ha demostrado que si la PTH se administra sistémicamente de una manera continua, disminuirá la densidad ósea. Por el contrario, se ha reportado que si la misma molécula se administra en forma pulsátil, aumentará la densidad ósea (véase, por ejemplo, WO 99/31137 de Eli Lilly & Co.) · Esta aparente contradicción se puede explicar por el mecanismo mediante el cual la PTH modula la remodelación ósea y posteriormente el parámetro visible de la densidad ósea. Dentro del hueso maduro, el receptor de PTH sólo ha mostrado estar presente sobre la superficie de las células del linaje de osteoblastos , pero no sobre osteoclastos . La función que desempeña la PTH en la remodelación ósea se dirige a través de los osteoblastos en oposición con los osteoclastos. Sin embargo, las células en diferentes etapas del linaje de osteoblastos responde de manera diferente cuando se unen a la PTH. Por lo tanto, las dramáticas diferencias que se observan cuando la PTH se administra utilizando diferentes métodos se pueden tomar en cuenta para la comprensión de los diferentes efectos que la misma molécula tiene sobre las diferentes células dentro del linaje de osteoblastos . Cuando la PTH se une a un hemocitoblasto mesenquimal, la célula se induce a diferenciarse en un proteoblasto . De esta forma, al agregar la PTH al sistema, existe un aumento en la población de proteoblastos . Sin embargo, estas células proteoblásticas también tienen el receptor de la PTH, y la posterior unión de la PTH al receptor sobre estas células conduce a una respuesta diferente. Cuando la PTH se une al proteoblásto , esto da por resultado en dos consecuencias separadas que conducen a la reabsorción ósea, En primer lugar, inhibe la diferenciación adicional de los proteoblás tos en osteoblastos . En segundo lugar, aumenta la secreción de Interleucina 6 (IL-6) proveniente de los proteoblastos . La IL-6 tanto inhibe la diferenciación de proteoblasto, como también aumenta la diferenciación de proteoclastos en el interior de los osteoclastos . Esta respuesta dual de las células dentro del linaje de osteoblastos es que proporciona la reacción compleja entre la remodelación ósea y la exposición a la PTH. Si la PTH se dosifica periódicamente durante periodos cortos de ( tiempo, entonces los hemocitoblastos mesenquimales se inducen a diferenciarse en osteoblastos. Los periodos cortos de dosificación entonces evitan que los proteoblástos recién formados produzcan IL-6, evitando la activación de los osteoclastos. Por lo tanto, durante los intervalos de dosificación, estos preos eoblastos recién formados se pueden diferenciar adicionalmente en osteoblastos , dando por resultado en la formación ósea. Sin embargo, si se aplica una dosis constante de PTH, entonces los preosteoblastos tendrán la oportunidad de iniciar la producción de IL-6, activando asi los osteoclastos e inhibiendo los mismos, conduciendo al efecto opuesto: reabsorción ósea. Para reparación o regeneración de tejidos, las células deben migrar al interior de una masa herida, proliferar, expresar los componentes matriz o formar la matriz extracelular , y constituir una conformación de tejido final. En esta respuesta morfogenética con frecuencia deben participar múltiples poblaciones celulares, incluyendo f ecuentemente células vasculares y nerviosas. Para que esto ocurra se ha demostrado que las matrices mejoran bastante y se ha encontrado que en algunos casos son esenciales. Se han elaborado procedimientos para desarrollar matrices provenientes de orígenes naturales o sintéticos o una mezcla de ambos. Las matrices en crecimiento de células naturales se someten a remodelación mediante influencia celulares, todas basadas en proteólisis, por ejemplo, mediante plasmina (fibrina degradante) y metaloproteinazas matriz (colágeno degradante, elastina, etc.). Esta degradación está bastante localizada y se presenta únicamente en el momento del contacto directo con la célula migrante. Además, el suministro de proteínas de señalización celular específica, tales como por ejemplo, los factores de crecimiento, está controlada rigurosamente. En el modelo natural, no se utilizan matrices en crecimiento de células macroporosas , en lugar de las matrices microporosas las células se pueden degradar, localmente y en el momento de la demanda, a medida que las células migran al interior de la matriz. Debido a asuntos que se relacionan con la inmunogenicidad, producción costosa, disponibilidad limitada, variabilidad y purificación de lotes, se han desarrollado matrices con base en moléculas precursoras sintéticas, tales como por ejemplo, polietilenglicol modificado en y/o sobre el cuerpo . Mientras que se ha realizado mucho trabajo en el estudio de los efectos sistémicos de la PTH, la investigación no ha explorado la administración local o tópica de la PTH. A media que la PTH tiene un efecto directo anabólico sobre el linaje celular de osteoblastos , debe tener un potencial importante para curar los defectos óseos además de influir en la densidad ósea si se presenta adecuadamente dentro de un sitio defectuoso. Una vez que el defecto se ha rellenado con preosteoblastos, si la señal de la PTH se anula, los preosteoblastos recién formados entonces se pueden diferenciar en osteoblastos e iniciar la conversión de la masa herida, en primer lugar en tejido óseo herido y luego en una estructura ósea madura. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención s proporcionar una PTH en una forma que se pueda unir a una matriz para reparación, regeneración y remodelación de tejidos. ün objetivo adicional es presentar una PTH en una forma adecuada para administración tópica o local a un paciente para curar los defectos óseos.

SÜMARIO DE LA INVENCIÓN Se exponen en la presente, los péptidos de fusión que contienen una hormona paratiroides (PTH) en un dominio y un dominio substrato capaz de reticularse covalentemente a una matriz en otro dominio y las matrices, y los equipos que contiene estas proteínas de fusión o péptidos. Las proteínas de fusión se unen covalentemente a materiales d naturales o sintéticos para formar matrices, se pueden utilizar para curar defectos óseos. Opcionalmente, todos . los componentes para la formación de la matriz se aplican a un defecto óseo y la matriz se forma en el sitio de aplicación. El péptido de fusión se puede incorporar en la matriz de tal forma que el péptido de fusión como un todo o sólo la secuencia de PTH respectiva del primer dominio se libera mediante la degradación de la matriz, por acción enzimática y/o hidrolitica.

También, el péptido de fusión puede contener un enlace degradable. entre el primero y segundo dominio que contiene sitios de escisión hidrolitica o enzimática. En particular, el péptido de fusión contiene la PTH en un dominio, un dominio substrato capaz de ser reticulado covalen emente a una matriz en un segundo dominio, y un sitio de degradación entre el primero y el segundo dominio. De preferencia, la PTH es PTH humana, aunque puede ser adecuada una PTH proveniente de otras fuentes, tales como por ejemplo, PTH de bovino. La PTH puede ser PTH 1-84 (natural), PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31, o PTH 1-25, o cualesquiera versiones modificadas o alélicas de PTH que exhiben propiedades, es decir, formación ósea, similar a la anterior. El sitio de degradación, permite que la velocidad de suministro varié a diferentes ubicaciones dentro de la matriz dependiendo de la actividad celular en esa ubicación y/o dentro de la matriz. Beneficios adicionales incluyen la inferior dosis total de fármacos dentro del sistema de suministro, y la regulación espacial de la liberación que permite un mayor porcentaje del fármaco que será liberado en el momento de mayor actividad celular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS O FIGURAS La Figura 1 es un cromatograma para detección por fluorescencia de geles de fibrina que contienen péptido degrádados con plasmina y péptido libre. Se muestra la cromatografía por exclusión de tamaños de un gel de fibrina degradada con el péptido a2???-7-? ????2?-?34 incorporado (-), con el mismo péptido libre agregado al gel de fibrina degradada que contiene el péptido incorporado (¦""), y el péptido libre solo (--) . El residuo de leucina N-terminal se dansiló (abreviado dL) . El péptido libre eluido a mayores tiempos, que corresponde a un peso molecular inferior, de lo que lo hizo el péptido incorporado en el gel de fibrina durante la coagulación, demostrando la unión covalente a la fibrina degrada y de esta forma la incorporación covalente via la acción de la actividad del Factor XlIIa . La Figura 2 es una gráfica de la incorporación de dLNQEQVSPLRGD (SEQ ID NO: 1) en los geles de fibrina con el Factor XIII exógeno agregado. Cuando se agregó 1 U/mL, el nivel de incorporación aumentó de tal forma que se pudieran alcanzar más de 25 moles de péptido/moles de fibrinógeno . La Figura 3 es una gráfica de la incorporación del péptido bidominio dLNQEQVSPLRGD (SEQ ID NO: 1), en goma de fibrina sin diluir. Se probaron tres equipos de reactivos separados y en cada caso se podría ¦ observar un alto nivel de incorporación, alcanzando 25 moles de péptido/moles de fibrinógeno. La concentración de péptido exógeno requerido para una incorporación máxima fue de al menos 5 iriM, posiblemente debido a limitaciones de difusión dentro de la matriz de fibrina bastante densa que se crea. El nivel de incorporación fue muy consistente, con cada equipo de reactivos que proporciona un perfil de incorporación similar.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente los productos y métodos para la reparación, regeneración o remodelación de tejido duro, en particular para crecimiento óseo, utilizando matrices naturales y sintéticas que tengan la PTH que se puede distribuir incorporada en la presente. Las matrices naturales son biocompatibles y biodegradables y se pueden formar in vitro o in vivo, en el momento de la implantación. La PTH · se puede incorporar en las matrices y mantener su bioactividad total. La PTH se puede incorporar de manera que se pueda distribuir, utilizando técnicas que proporcionen control sobre la forma y el momento y a cual grado se libere la PTH, de tal forma que la matriz se pueda utilizar para reparar tejidos directa o indirectamente, utilizando la matriz como un vehículo de liberación controlada.

Definiciones "Biomaterial" , en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un material destinado a interconectarse con sistemas biológicos para evaluar, tratar, aumentar, o reemplazar cualquier tejido, órgano o función del cuerpo dependiendo del material ya sea permanente o temporalmente. Los términos "biomaterial " y "matriz" se utilizan indistintamente en la presente y significan una red polimérica degradada que, dependiendo de la naturaleza de la matriz, puede aumentar con el agua aunque no disolverse en el agua, es decir, formar un idrogel que permanece en el cuerpo durante un cierto periodo de tiempo cumpliendo ciertas funciones de apoyo para tejido duro traumatizado o defectuoso. "Péptido de fusión de la PTH" en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a un péptido que contiene al menos un primero y un segundo dominio. Un dominio contiene una PTH (formas naturales o truncadas, en particular PTH 1-34), y el otro dominio contiene un dominio substrato que será degradado a una matriz. Un sitio de degradación enzimática o hidrolítica también puede estar presente entre el primero y el segundo dominio. "Nucleófilo fuerte", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a una molécula que es capaz de donar un par de electrones a un . electrófilo en una reacción formadora de enlaces polares. De preferencia, el f nucleófilo fuerte es más nucleofílico que el agua a un pH fisiológico. Los ejemplos de nucleófilos fuertes son troles y aminas. "Enlace insaturado conjugado", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a la alternancia de múltiples enlaces carbono-carbono, carbono-he eroátomo o het eroátomo-heteroátorno con enlaces individuales, o la unión de un grupo funcional a una macromolécula , tal como por ejemplo, un polímero sintético o una proteína. Estos enlaces pueden experimentar reacciones de adición. "Grupo insaturado conjugado", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a una molécula o una región de una molécula, que contiene una alternancia de enlaces carbono-carbono, carbono-heteroátomo o heteroátomo-heteroátomo , con enlaces individuales, que tienen un enlace múltiple que puede experimentar reacciones de adición. Los ejemplos de grupos insaturados conjugados incluyen de manera enunciativa: vinilsulfonas , acrilatos, acrilamidas, quinonas, y vinilpiridinios , por ejemplo, 2- o 4-vinilpiridinio e itaconatos. "Moléculas precursoras sintéticas", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a moléculas que no existen en la naturaleza. "Componentes o polímeros precursores que se presentan en la naturaleza", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a moléculas que se podrían encontrar en la naturaleza. " Funcional! zar" , en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a la modificación de una molécula de una manera que de por resultado en la unión de un grupo funcional o entidad. Por ejemplo, una molécula puede tener un grupo funcional mediante la introducción de una molécula que convierta a la molécula en un nucleófilo fuerte una insaturación conjugada. De preferencia, una molécula, por ejemplo PEG, se proporciona con un grupo funcional para que se convierta a un tiol, amina, acrilato, o quinona. Las proteínas, en particular, también se les puede integrar grupos funcionales eficazmente mediante la reducción parcial o completa de enlaces disulfuro para crear tioles libres. "Funcionalidad", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente se refiere al número de sitios reactivos en una molécula.

"Funcionalidad de los puntos de ramificación", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere al número de ramificaciones que se extienden desde un punto en la molécula. "Sitio de adhesión o sitio de unión celular", en el sentido en el que se utiliza en generalmente en la presente, se refiere a una secuencia de péptidos a la cual se une una molécula, por ejemplo, un receptor estimulador de adhesión sobre la superficie de una célula. Los ejemplos de sitios de adhesión incluyen de manera enunciativa: la secuencia RGD proveniente de fibronectina , y la secuencia YIGSR (SEQ ID NO: 2) proveniente de laminina. De preferencia, los sitios de adhesión se incorporan en el biomaterial al incluir un dominio substrato que se pueda degradar con una matriz. "Actividad biológica", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente se refiere a eventos funcionales provocados por una proteina de interés. En algunas modalidades, esto incluye los eventos analizados al medir las interacciones de un polipéptido con otro polipéptido. También incluyen analizar el efecto que la proteina de interés tiene sobre el crecimiento, diferenciación, muerte, migración, adhesión, interacciones celulares con otras proteínas, la actividad enzimática, la fosforilación proteínica o la desfosfoxilación, transcripción o traducción. "Molécula biológica sensible" en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a una molécula que se encuentra en una célula, o en un cuerpo, o que se puede utilizar como un agente terapéutico para un célula o un cuerpo, que puede reaccionar con otras moléculas en su presencia. Los ejemplos de moléculas biológicas sensibles incluyen de manera enunciativa: péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y fármacos. Se pueden producir biomateriales en presencia de materiales biológicos sensibles, sin afectar negativamente los materiales biológicos sensibles. "Regenerar", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, significa hacer crecer nuevamente una porción o la totalidad de algo, tal como por ejemplo, tejido duro, en particular huesos. "Multifuncional" , en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, se refiere a más de un grupo funcional electrofílico y/o nucleofílico por molécula (es decir, monómero, oligo y polímero ) . "Reacción auto-selectiva" en el sentido en que se utiliza generalmente en la presente, significa que el primer componente precursor de una composición reacciona mucho más rápido con el segundo componente precursor de la composición y viceversa que con otros compuestos presentes en una mezcla o en sitio de la reacción. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el nucleófilo de preferencia se une a un electrófilo y un electrófilo de preferencia se une a un nucleófilo fuerte, en lugar de otros compuestos biológicos. "Degradación", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, significa la formación de enlaces covalentes. Sin embargo, también puede hacer referencia a la formación de enlaces no covalentes, tales como por ejemplo, enlaces iónicos, o combinaciones de enlaces covalentes y no covalentes. "Red polimérica", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, significa el producto de un proceso en el cual prácticamente todos los monómeros, oligo o polímeros se unen mediante enlaces covalentes intermoleculares a través de sus grupos funcionales disponibles para producir una molécula grande. "Fisiológico", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente, significa las condiciones según se pueden encontrar en vertebrados vivientes. En particular, condiciones fisiológicas, se refiere a las condiciones en el cuerpo humano tales como por ejemplo, temperatura pH, etc. Temperaturas fisiológicas significa en particular una variación de temperatura entre 35°C hasta 42°C, de preferencia aproximadamente 37 °C. "Densidad de degradación", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente se refiere al peso molecular promedio entre dos degradaciones (Me) de las moléculas respectivas. "Peso equivalente", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente se refiere a mmol del grupo funcional/g de la sustancia. "Aumento de volumen", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente se refiere al aumento de volumen y masa mediante la proporción de agua por parte del biomaterial. Los términos "absorción de agua" y "aumento de volumen" se utilizan indistintamente en toda esta solicitud. "Estado de equilibrio", en el sentido en el que se utiliza generalmente en la presente significa el estado en el cual, un hidrogel no experimenta aumento o disminución de masa cuando se almacena bajo condiciones constantes en agua.

I . Matrices y PTH A. Materiales para la matriz La matriz se forma al degradar iónica, covalentemente , o mediante combinaciones de los mismos, las moléculas precursoras para una red polimérica o al aumentar de volumen uno o más materiales poliméricos, es decir, las matrices, para formar una red polimérica que tenga suficiente separación inter-polimérica para permitir el crecimiento interior o migración en la matriz de las células . En una modalidad, la matriz se forma de proteínas, de preferencia proteínas presentes naturalmente en el paciente, dentro del cual la matriz será implantada. üna proteina matriz particularmente preferida es fibrina, aunque también se pueden utilizar las matrices elaboradas de otras proteínas, tales como por ejemplo, colágeno o gelatina. También se pueden utilizar polisacáridos y glucoproteinas para formar la matriz. También es posible utilizar polímeros sintéticos que se pueden degradar mediante aglutinación iónica o covalente.

Matrices de fibrina La fibrina es un material natural que se ha reportado para diversas aplicaciones biomédicas. La fibrina se ha descrito, como material para matrices de crecimiento interno celular en la patente de los Estados Unidos No. 6,331,422 de Hubbell et al. Los geles de fibrina se han utilizado como selladores debido a su capacidad de unirse a muchos tejidos y su función natural es la curación de heridas. Algunas aplicaciones específicas incluyen el uso como un sellador para la unión de injertos vasculares, la unión de válvulas cardiacas, la colocación de huesos en fracturas y reparación de tendones (Sierra, D.H., Journal of Eiomaterials Applications, 7:309-352 (1993)). Adicionalmente , estos geles se han utilizado como dispositivos para suministro de fármacos, y para regeneración neuronal (Williams, et al., Journal of Comparative Neurobíology, 264:284-290 (1987)). Aunque la fibrina proporciona un soporte sólido para la regeneración de tejidos y el crecimiento interno celular, existen pocas secuencias activas en el monómero que mejoran directamente estos procesos. También se ha caracterizado el proceso mediante el cual el fibrinógeno se polimeriza en el interior de la fibrina. Inicialmente, una proteasa escinde la molécula de fibrinógeno dimérico en dos sitios simétricos. Existe diversas proteasas posibles que pueden escindir el fibrinógeno, incluyendo trombina, reptilasa, y proteasa III, y cada una sirve a la proteina en un sitio diferente (Francis, et al., Blood Cells, 19:291-307,1993). Una vez que el fibrinógeno se escinde, se presenta un pas.o de autopolimeri zación en el cual los monómeros de fibrinógeno se juntan y forman un gel de polímero degradado no covalentemente (Sierra, 1993) . Este auto-ensamble sucede debido a que los sitios de unión se exponen después de que se presenta la escisión de la proteasa. Una vez que se exponen, estos sitios de unión en el centro de la molécula se pueden unir a otros sitios de las cadenas de fibrinógeno, que están presentes en los extremos de las cadenas peptídicas (Stryer, L. In Biochemistry, W.H. Freeman & Company, NY , 1975). De esta forma, se forma una red polimérica. El Factor XlIIa, una transglutaminasa activada a partir del Factor XIII mediante proteólisis de trombina, entonces puede degradar covalentemente la red polimérica. Existen otras transglutaminasas y también pueden estar implicadas en la degradación covalente y formación de injerto con la red de fibrina. Una vez que se forma un gel de fibrina degradado, la posterior degradación se controla rigurosamente. Una de las moléculas clave para controlar la degradación de fibrina es el inhibidor a2-plasmina (Aoki, N., Progress in Cardiovascular Disease, 21:267-286,1979) . Esta molécula actúa al degradar a la cadena a de fibrina a través de la acción del Factor XlIIa (Sakata, et al., Journal of Clinlcal Investigation , 65:290-297, 1980). Al unirse por si misma al gel, se puede localizar una alta concentración del inhibidor con el gel. El inhibidor entonces actúa al evitar la unión del plasminógeno con fibrina (Aoki, et al.,- Thrombosis and Haemostasis, 39:22-31, 1978) y al activar la plasmina (Aoki, 1979). El inhibidor a2-plasmina contiene un substrato de glutamina. La secuencia exacta se ha identificado como NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12), con la primera glutamina que será el aminoácido para la degradación. Se ha demostrado que los péptidos bi-dominio, que contienen una secuencia de substrato del Factor XlIIa y una secuencia de péptido bioactivo, se pueden degradar en geles de fibrina y que este péptido bioactivo mantiene su actividad celular in vitro (Schense, J.C., et al. (1999) Bioconj . Chem. 10:75-81).

Matrices sintéticas Las reacciones de degradación para la formación de matrices sintéticas para la aplicación en el cual se incluyen (i) la polimeración de radicales libres entre dos o más precursores que contienen dobles enlaces sin saturar, según se describe en Hern et al., J Biomed Mater. Res. 39:266-276 (1998), (ii) la reacción de substitución nucleofilica tal como por ejemplo, entre un precursor que incluye un grupo amina y un precursor que incluye un grupo succinimidilo según se expone en la patente de los Estados Unidos No. 5,874,500 de Rhee et al., (iii) las reacciones de condensación y adición y (iv) la reacción de adición tipo Michael entre un nucleófilo fuerte y un grupo insaturado conjugado o enlace (como un electrófilo fuerte) . En particular se prefiere la reacción entre una molécula precursora que tenga un grupo tiol o amina como el grupo nucleofílico y las moléculas precursoras que incluyen grupos acrilato o vinilsulfona como grupos electrofilicos . El grupo tiol es el más preferido como el grupo nucleófilico . Las reacciones de adición tipo Michael se describen en la WO 00/44808 de Hubbell et al., el contenido de la misma se incorpora en la presente como referencia. Las reacciones de adición tipo Michael permiten la degradación in situ de al menos un primero y un segundo componente precursor bajo condiciones fisiológicas de una forma autoselectiva, incluso en presencia' de materiales biológicos sensibles. Cuando uno de los componentes precursores tiene un grupo funcional de al menos dos, y al menos uno de los otros componentes precursores tiene un grupo funcional mayor a dos, el sistema reaccionará autoselectivamente para formar un biomaterial tridimensional degradado. De preferencia, los grupos insaturados conjugados o enlaces insaturados conjugados son acrilatos, vinilsulfonas , metacrilatos , acrilamidas, metacrilamidas , acrilonitrilos , vinilsulfonas , 2- o 4 -vinilpiridinio , maleimidas, o quinonas . Los grupos nucleofilicos de preferencia son grupos tiol, grupos amino, o grupos hidróxilo. Los grupos tiol son prácticamente más reactivos que los grupos amina sin protonar. Como se estableció anteriormente, el pH es importante en esta consideración: el tiol desprotonado es prácticamente más reactivo que el tiol protonado. Por lo tanto, las reacciones de .adición que incluyen una insaturación conjugada, tal como por ejemplo, un acrilato o una quinona, con un tiol para convertir dos componentes precursores en una matriz con frecuencia se llevarán a cabo mejor más rápidamente y auto-selectivamente a un pH de aproximadamente 8. En el pH de aproximadamente 8, la mayoría de los tioles de interés se desprotonan (y de esta forma son más reactivos) y la mayoría de las aminas de interés todavía se protonan (y de esta forma son menos reactivas). Cuando se utiliza un tiol como la primera molécula precursora, es bastante conveniente una estructura de conjugado que sea selectiva en su reactividad para el tiol con relación a las aminas. La primera y segunda moléculas precursoras adecuadas incluyen proteínas, péptidos, polioxialquilenos , poli (alcohol vinílico) , poli (alcohol etilen,-co-vinílico ) , poli (ácido acrílico) , poli (ácido etilen-co-acrílico) , poli (etiloxazolina) , poli (vinilpirrolidona) , poli ( etilen-co-vinilpirrolidona ) , poli (ácido maleico), poli (ácido etilen-co-maleico) , poli (acrilamida) , y copolimeros en bloque de poli (óxido de etileno) -co-poli ( óxido de propileno) . Una molécula precursora particularmente preferidas polietilenglicol. El polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés) proporciona un bloque constitutivo, conveniente. Los PEG lineales (lo que significa con dos extremos) o ramificados (lo que significa más de dos extremos) se pueden adquirir o sintetizar fácilmente y luego agregar grupos funcionales a los grupos extremo de PEG, para introducir cualquier nucleófilo fuerte, tal como por ejemplo, un tiol, o una estructura conjugada, tal como por ejemplo, un acrilato o una vinilsulfona . Cuando estos componentes se mezclan ya sea entre si o con un componente correspondiente en un entorno ligeramente básico, se formará una matriz mediante la reacción entre el primero y segundo componente precursor. Un componente PEG se puede hacer reaccionar con un componente sin PEG , , y el peso molecular o hidrofilicidad de cualquier componente se puede controlar para manipular las características mecánicas, la permeabilidad, y el contenido de agua del biomaterial resultante. Estos materiales en general son útiles en implantes médicos, según se describirá con mayor detalle más delante. En la formación de matrices, en especial las matrices que se desean para degradar in vivo, péptidos, proporcionan un bloque constitutivo muy conveniente. Es sencillo sintetizar péptidos que contengan dos o más residuos cisteina, y este componente entonces puede servir fácilmente como el primer componente precursor con los grupos nucleofilicos . Por ejemplo, un péptido con dos residuos de cisteina libre formarán fácilmente una matriz cuando se mezcla con un PEG tri-vinilsulfona (un PEG que tiene tres ramificaciones con vinilsulfonas en cada una de sus ramificaciones) a un pH fisiológico o ligeramente superior (por ejemplo, 8 hasta 9). La gelificación también puede proseguir bien a un pH incluso superior, aunque con la pérdida potencial de auto-selectividad. Cuando los dos componentes precursores líquidos se mezclan juntos como los mismos reaccionan durante un periodo de unos cuantos minutos para formar un gel elástico, que consiste de una red de cadenas de PEG, que portan los nodos de la red, con los péptidos como enlaces conectores.

Los péptidos se pueden seleccionar como substratos de proteasa, con el fin de hacer que la red sea capaz de ser infiltrada' y degradada por las células, como se hace en una red con base de proteínas, tal como por ejemplo, en una matriz de fibrina. De preferencia, las secuencias en los dominios son substratos para enzimas que están implicadas en la migración celular (por ejemplo, como substratos para enzimas tales como por ejemplo, colagenaza, plasmina, metaloproteinaza (MMP) o elastasas), aunque los dominios adecuados no estarán limitados a esta secuencia. Una secuencia particularmente útil es un substrato para la plasmina enzimática (véanse los Ejemplos). Las características de degradación de los geles se pueden manipular al cambiarlos del péptido que sirve como los nodos degradantes. Se puede producir un gel que sea degradable por colagenaza, pero no por plasmina, o por plasmina pero no por colagenaza. Además, es posible hacer que el gel se degrade más rápido o más lento en respuesta a esta enzima, simplemente al cambiar la secuencia de aminoácidos para alterar el Km o Kcatr o ambos, de la reacción enzimática. De esta forma se puede elaborar un biomaterial que sea biomimético, y que sea capaz de ser remodelado mediante las características de remodelación normales de las células. Por ejempld, este estudio muestra los sitios de substrato para la proteasa plasmina importante. La gelificación del PEG con el péptido es auto-selectiva. Opcionalmente, se pueden incorporar agentes biof ncionales en la matriz para proporcionar enlazamiento químico · con otras especies (por ejemplo, una superficie de tejido) . Tener substratos de proteasa incorporados en la matriz es importante cuando se forma la matriz a partir de PEG vinilsulfona . Aparte de las matrices formadas a partir de la reacción de los PEG acrilatos y los PEG tioles, las matrices formadas a partir de PEG vinilsulfonas y PEG tioles no contienen enlaces degradables hidrolíticamente . Por lo tanto, la incorporación de substratos de proteasa permite que la matriz se degrade en el cuerpo. Las matrices sintéticas son operacionalmente simples de formar. Se mezclan dos precursores líquidos, un precursor contiene una molécula precursora con grupos nucleofílicos y la otra molécula precursora contiene los grupos electrofílicos . Como el solvente puede servir solución salina fisiológica. Se genera calor mínimo por la reacción. Por 'lo tanto, la gelificación se lleva a cabo in vivo o in vitro, en contacto directo con el tejido, sin toxicidad perjudicial. De esta forma, se pueden utilizar polímeros distintos a PEG, ya sea modificados telehelicoidalmente o modificados en sus grupos laterales. Para la mayoría de indicaciones de salud, el índice de crecimiento interno celular o migración de las células en la matriz en combinación con una velocidad de degradación adaptada de la matriz es decisivo para la respuesta de curación total. El potencial de las matrices hidrolíticamente no degradables que serán invadidas por las células es principalmente una función de la densidad reticular. Si el espacio existente entre los puntos de ramificación o nodos es demasiado pequeño con relación al tamaño de las células o si el índice de degradación de la matriz, que da por resultado en la creación de más espacio dentro de la matriz, es muy lento, se observará una respuesta de curación muy limitada. Las matrices de curación encontradas en la naturaleza, como por ejemplo, las matrices de fibrina, que se forman como una respuesta al daño en el cuerpo se sabe que consisten de una red muy separada que se puede invadir muy fácilmente por células. La infiltración se promueve por ligandos para la adhesión celular que son una parte integrada de la red de fibrina. Las matrices elaboradas a partir de moléculas precursoras hidrofílicas sintéticas, similares a polietilenglicol , aumentan de volumen en un entorno acuoso después de la formación de la red polimérica. Con el fin de alcanzar un tiempo de gelificación suficientemente corto (entre 3 hasta 10 minutos a un pH entre 7 hasta 8 y a una temperatura en una variación de 36 hasta 38°C) y una reacción cuantitativa durante la formación in situ de la matriz en el cuerpo, la concentr ción inicial de las moléculas precursoras debe ser suficientemente alta. Bajo estas condiciones, se podría llevar a cabo el aumento de volumen después de la formación de la red, y las concentraciones iniciales necesarias podrían conducir a matrices demasiado densas para la infiltración celular , cuando la matriz no es degradable en un entorno acuoso. De esta forma, el aumento de volumen de la red polimérica es importante para alargar y aumentar el espacio entre los puntos de ramificación. Independientemente de la concentración inicial de las moléculas precursoras, los hidrogeles producidos a partir de las mismas moléculas precursoras sintéticas, tales como por ejemplo, una PEG vinilsulfona de -cuatro ramificaciones y un péptido con grupos SH, aumentarán de volumen al mismo contenido de agua en el estado de equilibrio. Esto significa que entre mayor sea la concentración inicial de las moléculas precursoras, mayor será el volumen final del hidrogel cuando este alcance su estado de equilibrio. Si el espacio disponible en el cuerpo es demasiado pequeño para permitir un aumento de volumen suficiente y en particular si el enlace formado a partir de los componentes precursores no es hidroliticamente degradable, el índice de infiltración celular y la respuesta de curación disminuirán. Como consecuencia, se debe encontrar el óptimo entre los dos requerimientos contradictorios para la aplicación en el cuerpo. Se han observado buena infiltración celular y posteriores respuestas de curación con una red polimérica tridimensional formada a partir de la reacción de un polímero ramificado trifuncional con al menos tres ramificaciones prácticamente similares en peso molecular y una segunda molécula precursora que es al menos una molécula bifuncional. El índice de peso equivalente de los grupos funcionales de la ! primera y segunda moléculas precursoras está entre i 0.9 y 1.1. Los 'pesos moleculares de las ramificaciones de la primera molécula precursora, el peso molecular de la segunda molécula precursora y la funcionalidad de los puntos de ramificación se seleccionan de tal forma que el contenido de agua de la red polimérica resultante esté entre el % en peso de equilibrio y 92% en peso del peso total de la red polimérica después de terminar la absorción de agua. De preferencia, el contenido de agua está entre 93 y 95% en peso del peso total de la red polimérica y el agua después de completar la absorción de agua. El término de la absorción de agua se puede alcanzar ya sea cuando la concentración de equilibrio se alcanza o cuando el espacio disponible en el biomaterial no permite un aumento de volumen adicional. Por lo tanto se prefiere que la selección de las concentraciones iniciales de los componentes precursores sea tan baja como sea posible. Esto es verdadero para todas las matrices que pueden aumentar de volumen aunque en particular para aquellas matrices que experimentan una degradación , i suministrada por células que no contienen enlaces hidroliticamente degradables en la red polimérica. El equilibrio entre el tiempo de gelificación y la baja concentración de inicio en j particular para los geles hidroliticamente no degradables se debe optimizar con base en la estructura de las moléculas precursoras. En particular, el peso molecular de las ramificaciones de la primera molécula precursora, el peso molecular de la segunda molécula precursora y el grado de ramificación, es decir, la funcionalidad de los puntos de ramificación, se debe ajustar por consiguiente. El mecanismo de reacción real tiene una influencia menor sobre esta interacción. Está primera molécula precursora es un ¡ polímero de tres o cuatro ramificaciones con un grupo funcional en el extremo de cada ramificación y la segunda molécula precursora es una molécula bifuncional lineal, de preferencia, un péptido que contiene al menos dos grupos cisterna, entonces el peso molecular de las ramificaciones de la primera molécula precursora y el peso molecular de la segunda molécula precursora de preferencia se seleccionan de tal forma que los enlaces entre los puntos de ramificación después de la formación de la red tengan un peso molecular en el intervalo entre 10 hasta 13 kD (bajo las condiciones en que los enlaces son lineales, no ramificados), de preferencia entre 11 y 12 kD . Esto permite una concentración inicial de la suma de la primera y segunda moléculas precursoras en el intervalo entre 8 hasta 12% en peso, de preferencia entre 9 y 10% en peso del peso total de la primera y segunda molécula precursora en solución (antes de la formación de la red) . En caso de que el grado de ramificación del primer componente precursor aumente a ocho y la segunda molécula precursora todavía sea una molécula bifuncional lineal, el peso molecular de los enlaces entre los puntos de ramificación de preferencia aumenta a un peso molecular entre 18 hasta 24 kDa . En caso de que el grado de ramificación de la segunda molécula precursora aumente del lineal a un componente precursor de tres o cuatro ramificaciones, el peso molecular, es decir, la longitud de los enlaces por consiguiente aumentará. En una modalidad preferida de la presente invención, una composición se selecciona para que incluya como la primera molécula precursora un polímero 15 kD, de tres ramificaciones trifuncional , es decir, cada ramificación que tenga un peso molecular de 5 kD y como la segunda molécula precursora, una molécula lineal bifuncional de un peso molecular en el intervalo entre 0.5 hasta 1.5 kD, incluso de mayor preferencia aproximadamente 1 kD. De preferencia, el primero y el segundo componente precursor es un polietilenglicol . En una modalidad preferida, el primer componente precursor incluye como grupos funcionales los grupos o enlaces insaturados conjugados, se prefiere en mayor medida un acrilato o una vinilsulfona y los grupos funcionales de la segunda molécula precursora incluyen un grupo nucleofilico, de preferencia, un grupo tiol o amino . En otra modalidad preferida de la presente invención, la primera molécula precursora es un polímero 20 kD de cuatro ramificaciones ' (cada ramificación tiene un peso molecular de 5k Da) que tiene grupos funcionales en el término de cada ramificación y la segunda molécula precursora es una molécula lineal bifuncional de un peso molecular en el intervalo entre 1 hasta 3 kD, de preferencia entre 1.5 y 2 kD. De preferencia, la primera molécula precursora es un polietilenglicol que tiene grupos vinilsulfona y la segunda molécula precursora es un péptido que tiene grupos cisterna. En ambas modalidades preferidas, la concentración inicial de la suma de la primera y segunda molécula precursora varía de 8 hasta 11% en peso, de preferencia entre 9 y 10% en peso del peso total de la primera y segunda molécula precursora y agua (antes de la formación de la red polimérica) , de preferencia entre 5 y 8% en peso hasta alcanzar un tiempo de gelificación menor de 10 minutos. Estas composiciones tienen un tiempo de gelificación a pH 8.0 y 37°C de aproximadamente 3-10 minutos después del mezclado. Cuando la matriz contiene enlaces hidroliticamente degradables, formados, por ejemplo, por la reacción preferida entre acrilatos y tioles, la densidad reticular con respecto a la infiltración celular es especialmente importante en el inicio, aunque en un entorno acuoso, los enlaces se hidrolizarán y la red se separará, para permitir la infiltración celular. Con un aumento en el grado de ramificación total de la red polimérica, el peso molecular de los entrelazamientos, es decir, la longitud de los enlaces debe aumentar.

B. Sitios de unión celular Las células interactúan con su entorno a través de las interacciones proteína-proteína. Proteina-oligosacárido y proteína-polisacárido en la superficie celular. Las proteínas de matriz extracelular proporcionan un hospedero de señales bioactivas a la célula. Esta red densa se requiere para soportar las células, y se ha mostrado que muchas proteínas en la matriz controlan la adhesión, dispersión, migración y diferenciación celular (Carey, Annual Review of Physiology, 53:161-177, 1991) . Algunas de las .proteínas específicas que han mostrado ser particularmente activas incluyen laminina, vitronectina, fibronectina , fibrina, fibrinóngeno y colágeno (Lander, Journal of Trends in Neurological Science, 12:189-195, 1989) . Se han conducido muchos estudios de laminina, y se ha mostrado que la laminina desempeña una función vital en el desarrollo y regeneración de los medios in vivo y células nerviosas in vitro (Williams, Neurochemical Research, 12:851-869, 1987), así como también en angiogénesis . Se han identificado algunas de las secuencias específicas que interactúan directamente con receptores celulares y provocan ya sea adhesión, dispersión o transducción de señal. Se ha mostrado que la laminina, una proteína de multidomino grande (Martin, Annual Review of Cellular Biology, 3:57-85, 1987), consiste de tres cadenas con diversos dominios de unión con receptores. Estos dominios de unión con receptores incluyen la secuencia YIGSR (SEQ ID NO: 2) de la cadena de laminina Bl (Graf, et al., Cell, 48:989-996, 1987; Kleinman, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, 272:39-45, 1989; y Massia, et al, J: of. Biol. Chem., 268:8053-8059, 1993), LRGDN ( SEQ ID NO: 3) de la cadena de laminina A (Ignatius, et al., J: of Cell Biology, 111:709-720, 1990) y PDGSR (SEQ ID NO: 4) de la cadena de laminina Bl (Kleinman, et al., 1989). También se han identificado otras diversas secuencias de reconocimiento. Estas incluyen IKVAV (SEQ ID NO: 5) de la cadena de lamina A (Tashiro, et al., J; of Biol. Chem., 264:1617 -16182, 1989) y la secuencia RNIAEI I DI (SEQ ID NO: 6) de la cadena de laminina B2 (Liesi, et al., FEBS Letters, 244:141-148, 1989). Con frecuencia también se han identificado los receptores que se unen a estas secuencias especificas. Un subconjunto de receptores celulares que ha mostrado ser responsable de la mayoría de la unión es la superfamilia de integrina (Rouslahti, E., J. of Clin. Investigation, 87:1-5, 1991). Las integrinas son heterodí-meros proteínicos que constan de sub-unidades a y ß. Un trabajo anterior ha mostrado que el tripéptido RGD se une a diversas integrinas ß? y ß3 (Hynes, R. O., Cell, 69:1-25, 1992; Yamada, K.M., J; of Biol. Chem. , 266:12809-12812, 1991), IKVAV (SEQ ID NO : 5) se une a un receptor 110 kDa (Tas iro, et al., J of Biol. Chem.., 264:16174-16182, 1989); Luckenbill-Edds , et al., Cell Tissue Research, 279:371-377,1995), YIGSR (SEQ ID NO: 2) se une a un receptor 67 kDa (Graf, et al., 1987) y DGEA ( SEQ ID NO: 7), una secuencia de colágeno, se une a la integrina (*2,ß? (Zutter & Santaro, Amer. J. of Patholody, 137:113-120, 1990). El receptor para la secuencia RNIAEIIKDI (SEQ ID NO: 6) no se ha reportado. En una modalidad preferida adicional, se incorporan sitios peptidicos para la adhesión celular en la matriz, a saber los péptidos que se unen a los receptores para estimular la adhesión sobre las superficies de las células en los biomateriales de la presente invención. Estos péptidos para estimular la adhesión se pueden seleccionar del grupo según se describió anteriormente. En particular se prefieren la secuencia RGD proveniente de fibronectina, la secuencia YIGSR (SEQ ID NO: 2) proveniente de laminina. La incorporación de sitios de unión es una modalidad particularmente preferida con matrices sintéticas, aunque también se puede incluir con algunas de las matrices naturales. La incorporación se puede realizar, por ejemplo, simplemente al mezclar un péptido de' unión celular que contiene cisteina con la molécula precursora que incluye el grupo insaturado conjugado, tal como por ejemplo, PEG acrilato, PEG acrilamida o PEG vinilsulfona unos cuantos minutos antes de mezclar con el resto del componente precursor incluyendo el grupo nucleofilico , tal como por ejemplo, el componente precursor que contiene tiol. Si el sitio de unión celular no incluye una cisteina, este se puede sintetizar químicamente para incluir uno. Durante este primer paso, el péptido para estimular la adhesión se incorporará en un extremo del precursor con múltiples grupos funcionales y con una insaturación conjugada; cuando se agregue al sistema el multitiol restante, se formará una red degradada. Otra implicación importante de la forma en que se preparan las redes aquí, es la eficiencia de incorporación de los ligandos bioactivos colgantes tales como por ejemplo, las señales de adhesión. Este paso debe ser cuantitativo debido a que, por ejemplo, los ligandos sin unir (por ejemplo, sitios de adhesión) podrían inhibir la interacción de las células con la matriz. Como se describirá más tarde, la derivación del precursor con estos oligopéptidos colgantes se conduce en un primer paso en gran exceso estequiométrico (mínimo: 40 veces) de precursores electrofílieos multiramificados sobre tioles y por lo tanto definitivamente cuantitativos. Aparte de evitar la inhibición no deseada, este logro es incluso biológicamente más significativo: el comportamiento celular es extremadamente sensible a pequeños cambios en las densidades de ligandos y un conocimiento preciso de ligandos incorporados ayuda a diseñar y comprender las interacciones de la matriz celular. En resumen, la concentración de los sitios de adhesión unidos covalentemente en la matriz influye significativamente en el índice de infiltración celular. Por ejemplo, para un hidrogel determinado, se puede incorporar una concentración RGD en la matriz con soportes de crecimiento interno celular y migración celular de una forma óptima. La variación de concentración óptima de los sitios de adhesión similares a RGD está entre 0.04 y 0.05 mM e incluso de mayor preferencia 0.05 mM en particular para una matriz que tenga un contenido acuoso entre la concentración de equilibrio y 92% en peso después del término de la absorción de agua. Se han alcanzado excelentes resultados de curación ósea al mantener el índice de migración celular y el índice de degradación de la matriz en ayunas. Con respecto al diseño de la matriz (en particular PTH 1-34 ' unida covalentemente) , un polietilenglicol de cuatro ramificaciones con un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da degradado con un sitio de degradación de proteasa GCRPQGI GQDRC (SEQ ID NO: 8) y 0.050 mM GRGDSP (SEQ ID NO: 9) proporciona resultados de crecimiento internos celular particularmente buenos y curación de defectos óseos. La concentración inicial de PEG y péptido interior al 10% en peso del peso total de las moléculas y agua (antes del aumento de volumen) . Los geles tienen una consistencia utilizable y permiten que los osteoblastos y la célula precursora infiltren fácilmente la matriz. El material matriz de preferencia es biodegradable por las enzimas presentes naturalmente. El índice de degradación se puede manipular por el grado de degradación y la inclusión de inhibidores de proteasa en la matriz.

C. Dominios del substrato degradable El péptido de fusión con PTH se puede degradar y unir covalentemente a las matrices a través del dominio de substrato degradable del péptido de fusión con PTH. El tipo de dominio de substrato depende de la naturaleza de la matriz. Para la incorporación en las matrices de fibrina se prefieren en particular los dominios de substrato de transglutaminasa . El dominio de substrato de transglutaminasa puede ser un dominio del substrato del Factor XlIIa. Este dominio del substrato del Factor XlIIa se puede incluir GAKDV (SEQ ID NO: 10), KKK (SEQ ID NO: 11), o NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12). El acoplamiento entre la PTH y el dominio de substrato de transglutaminasa se puede realizar mediante síntesis química. El dominio del substrato de transglutaminasa puede ser un substrato para una transglutaminasa distinta del Factor XlIIa. El dominio del substrato del Factor XlIIa más preferido tiene una secuencia de aminoácidos de NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12) (en la presente denominada como WTG") . Otras proteínas que reconocen la transglutaminasa, tal como por ejemplo, fibronectina , se podrían acoplar al péptido del substrato de transglutaminasa .

Tabla 1: Dominios del substrato de transglutaminasa SEQ ID NO: 13 YRGOTIGEGQQHHLGG (SEQ ID NO: 13) ün péptido con glutamina en el sitio de acoplamiento con transglutaminasa en la cadena de fibrinógeno SEQ ID NO : 14 GAKDV (SEQ ID NO: 14) ün péptido que imita el sitio de acoplamiento con lisina en la cadena de fibrinógeno SEQ ID NO : 11 KKKK (SEQ ID NO :11) ün péptido con una polilisina en un sitio de acoplamiento aleatorio SEQ ID NO: 12 NQEQVSPL (SEQ ID NO: 12) Un péptido que imita el sitio de degradación en un inhibidor de plasmina a2 (abreviado TG) Para la incorporación de PTH en una matriz formada a partir de componentes precursores sintéticos, el péptido de fusión son la PTH o cualquier otro péptido que será incorporado se debe sintetizar con al menos un grupo cisteina adicional (-SH) de preferencia en el término N de la PTH como el dominio del substrato degradable. La cisteina ya sea se puede unir directamente a la PTH o a través de una secuencia enlazante. La secuencia enlazante adicionalmente puede incluir una secuencia de aminoácidos degradable enzimáticamente , de tal forma que la PTH se pueda escindir de la matriz mediante enzimas prácticamente en la forma natural. El grupo de cisteina libre reacciona con el grupo insaturado conjugado del componente precursor en una reacción de adición tipo Michael. En el caso de la PTH 1-34, el enlace con una matriz sintética para PTH 1-34 se hace posible mediante la unión de una secuencia de aminoácidos adicional con el término N de PTH 1-34 que contiene al menos una cisteina. El grupo tiol de la cisteina puede reaccionar con un enlace insaturado conjugado sobre el polímero sintético para formar un enlace covalente. La posibilidad de que (a) únicamente una cisteina se una al péptido, en la posibilidad de que (b) una degradable enzimáticamente, una secuencia degradable de plasmina se une como un enlazante entre la cisteina y el péptido. La secuencia GYKNR (SEQ ID NO: 15) entre el primer dominio y el segundo dominio, la cisteina, hace que el enlace de plasmina sea degradable . De esta forma, los péptidos de fusión con la PTH, se pueden modificar adicionalmente para que contengan un sitio degradable entre el sitio de unión, es decir, el segundo dominio (es decir el dominio del substrato del Factor XlIIa o la cisteina) y la PTH, es decir, el primer dominio. Estos sitios se pueden degradar ya sea mediante hidrólisis no especifica (es decir, un enlace éster) o pueden ser substratos para la degradación enzimática especifica (degradación ya sea proteolitica o de polisacáridos ) . Estos sitios degradables permiten el tratamiento mediante ingeniería de la liberación más específica de la PTH a partir de las matrices similares a geles de fibrina. Por ejemplo, la degradación con base en la actividad enzimática permite la liberación de PTH que será controlada mediante un proceso celular en lugar de la difusión del factor a través del gel. El sitio degradable o enlace se escinde mediante las enzimas liberadas de las células que invaden la matriz . Los sitios de' degradación permiten que la PTH sea liberada con poca o ninguna modificación con la secuencia de péptidos primarios, que pueden dar por resultado en una mayor actividad del factor. Además, permite que la liberación del factor sea controlada mediante procesos específicos celulares, tales como por ejemplo', proteólisis localizada, en lugar de la difusión proveniente de algunos materiales porosos. Esto permite que los factores sean liberados a diferentes velocidades dentro del mismo material dependiendo de la ubicación de las células dentro del material. Esto también reduce la cantidad de la PTH total necesaria, debido a que su liberación se controla mediante procesos celulares. La conservación de la PTH y su biodisponibilidad son ventajas distintas de la explotación de la actividad proteolitica específica celular con respecto al uso de los dispositivos para liberación controlada de difusión. En una posible explicación para la buena curación de un defecto óseo con la PTH unida covalentemente a una matriz, parece importante que la PTH se administre . localmente' durante un periodo prolongado de tiempo (es decir, no sólo una dosis individual pulsada) pero no en una forma continua. Esto se lleva a cabo mediante una lenta degradación, a través de ya sea escisión enzimática o escisión hidrolítica de la matriz. De esta forma, la molécula luego se suministra a través de un efecto pseudo-pulsado que se presenta durante un periodo de tiempo sostenido. Cuando una célula . rogenitora infiltra la matriz, ésta encontrará una molécula de PTH y se podrá diferenciar en un proteoblasto . Sin embargo, si esta célula particular no continua liberando la PTH unida de la matriz, se convertirá eficazmente en un osteoblasto e iniciará la producción de la matriz ósea. Por último, los efectos terapéuticos del péptido se localizan en la región defectuosa y se aumentan posteriormente. Las enzimas que se podrían utilizar para la degradación proteolítica son muchas. Los sitios proteoliticamente degradables podrían incluir substratos para activadores de colagenaza, plasmina, elastasa, estomelisina, o plasminógeno . Enseguida se listan substratos de ejemplo. P1-P5 denota las posiciones 1-5 de aminoácidos hacia el término amino de la proteína desde el. sitio donde se presenten las proteólisis. Pl'-P4' denotan las posiciones 1-4 de aminoácidos hacia el término carboxi de la proteína proveniente de donde se presente la proteólisis.

Tabla 2 : Secuencias del substrato muestra para proteasa Proteasa P P4 P3 P2 Pl Pl' P2' P3' P4' Referencia Plasmina L I K M K P Takagi and Doolittle, (1975) Biochem. 14:5149-5156 Plasmina N F K S Q L Takagi and Doolittle, 1975 Estromelisína Ac G P L . A L T A L Smith et al., (1995). J. Bio. Chem. 270: 6440- 6449 Estromelisina Ac P F E L R A NH2 Smith et al., 1995 Elastasa z- A A F A N¾ Besson et al., (1996) ñnalytical Biochemistry 237:216-223 Colagenaza G P L G I A G P Netzel- Arnett et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 6747- 6755 t-PA P H Y G R S G G Coombs et al. , 1998. J. Biol. Chem. 273: 4323- 4328 u-PA P G s G R S A S G Coombs et al., 1998 En otra modalidad preferida, un dominio oligo-éster se podría insertar entre el primero y el segundo dominio. Esto se podría llevar a cabo utilizando un oligo-éster tal como por ejemplo, los oligómeros de ácido láctico. El substrato para degradación no enzimática podría consistir de cualquier enlace que experimente hidrólisis mediante un mecanismo catalizado por ácido o base. Estos substratos pueden incluir oligo-ésteres tales como por ejemplo, oligómeros de ácido láctico o glicólico. La velocidad de degradación de estos materiales se puede controlar a través de la elección del oligómero.

D . PTH El término "PTH" en el sentido en el que se utiliza en la presente, incluye la secuencia humana de la PTH 1-84 y todas las versiones modificadas y alélicas, truncadas, de la PTH que exhiben propiedades para la formación de huesos cuando se unen covalentemente a matrices naturales o sintéticas biodegradables . Las versiones truncadas preferidas de la PTH son PTH 1-38, PTH 1-34, PTH 1-31 o PTH 1-25. La más preferida es la PTH 1-34. De preferencia la PTH es PTH humana, aunque puede ser adecuada la PTH proveniente de otras fuentes, tales como por ejemplo, PTH bovina.

Métodos para. incorporación y/o liberación de ¿actores bioactivos En una modalidad preferida para la incorporación de una PTH dentro de la matriz, la matriz incluye fibrina que se forma a partir de fibrinógeno, una fuente de calcio y trombina y el péptido de fusión con la PTH se incorporará dentro de la fibrina durante la coagulación. El péptido de fusión de la PTH se designa como péptido de fusión que incluye dos dominios, uno primero y uno segundo, un dominio, el segundo, es un substrato para una enzima degradante tal como por ejemplo el Factor XlIIa. , El Factor XlIIa es una transglutaminasa que es activa durante la < coagulación. · Esta enzima, formada naturalmente a partir del Factor XIII mediante la escisión por trombina, funciona para unir las cadenas de fibrina entre si via enlaces amida, formados entre las cadenas laterales de glutamina y las cadenas laterales de lisina. La enzima también funciona para unir otros péptidos a la fibrina durante la coagulación, por ejemplo, los sitios de unión celular proporcionados también incluyen un Factor XlIIa. Específicamente, la secuencia NQEQVSP (SEQ ID NO: 16), ha demostrado que funciona como un substrato eficaz par el Factor XlIIa. Como se describió anteriormente en la presente, esta ya sea se enlaza directamente a la PTH o puede incluir un sitio de degradación entre la PTH (primer dominio) y la secuencia NQEQVSP ( SEQ ID NO: 16) (segundo dominio) . Como tal, el péptido de fusión con la PTH se puede incorporar dentro de la fibrina durante la coagulación vía un substrato del Factor XlIIa.

Diseño de las proteínas de fusión para, incorporación El péptido de fusión con la PTH que incluye un primer dominio incluyendo la PTH, un segundo dominio incluyendo un dominio del substrato para una enzima de degradación y opcionalmente un sitio de degradación .entre el primero y el segundo dominio se pueden incorporar en los geles de fibrina utilizando diversos esquemas diferentes. De preferencia, el segundo dominio incluye un dominio del substrato de transglutaminasa e incluso de mayor preferencia incluye un dominio del substrato del Factor XlIIa. Con la máxima preferencia el dominio del substrato del Factor XlIIa incluye NQEQVSP (SEQ ID NO: 16) . Cuando este péptido de fusión con la PTH está presente durante la polimerización del fibrinógeno, es decir, durante la formación de la matriz de fibrina, se incorpora directamente en la matriz. El sitio de degradación entre el primero y el segundo dominio del péptido de fusión con la PTH pueden ser un sitio de degradación enzimática según se describió anteriormente. De preferencia, el sitio de degradación se puede escindir mediante una enzima que seleccionada del grupo que consiste de plasmina y metaloproteinaza matriz. Mediante la selección cuidadosa de Km y cat de este sitio de degradación enzimática, la degradación se podría controlar para que se presente ya sea antes o después de la matriz proteínica y/o al utilizar enzimas similares o ¡distintas para degradar la matriz, con la colocación del sitio de degradación que se prepara para cada tipo de proteína y aplicación. Este péptido de fusión con la PTH se podría degradar directamente en la matriz de fibrina según se describió anteriormente. Sin embargo, la incorporación de un sitio de degradación enzimática altera la liberación de la PTH durante la proteólisis. Cuando las proteasas derivadas de células alcanzan el péptido de fusión secuestrado, pueden escindir la proteina sometida a ingeniería y el sitio de degradación recién formado. Los productos de degradación resultantes podrían incluir la PTH liberada, que ahora podría estar casi libre de cualesquiera secuencias de fusión sometidas a ingeniería, así como también cualquier fibrina degradada .

II. Método de uso Las matrices se pueden utilizar para la reparación, regeneración, o remodelación de tejidos, y/o la liberación de PTH, antes o en el momento de la implantación. En algunos casos será conveniente inducir la degradación en el sitio de administración para conformar la matriz al tejido en el sitio de implantación. En otros casos, será conveniente preparar la matriz antes de la implantación. Las células también se pueden agregar a la matriz antes o en el momento de la implantación, o incluso después de la implantación, ya sea en el momento o después de ,1a degradación del polímero para formar la matriz. Esto se puede realizar además o en lugar de la degradación de la matriz para producir la separación intersticial diseñada para estimular la proliferación celular o el crecimiento interno. Aunque en la mayoría de los casos será conveniente implantar la matriz para estimular el crecimiento o proliferación celular, en algunos casos los factores bioactivos se utilizaran para inhibir la tasa de proliferación celular. Una aplicación especifica es inhibir la formación de adhesiones después de la cirugía.

III. Métodos de aplicación En la modalidad preferida, el material se gelifica in situ en el interior o sobre el cuerpo. En otra modalidad, la matriz se puede formar fuera del cuerpo y luego ser aplicada en la conformación preformada. El material matriz se puede producir a partir de componentes precursores sintéticos o naturales. Sin importar el tipo de componente precursor utilizado, los componentes precursores se deben separar antes de la aplicación de la mezcla al cuerpo para evitar la .combinación o contacto entre si bajo condiciones que permitan la polimerización o gelificación de los componentes. Para realizar el contacto antes de la administración, se puede utilizar un equipo de reactivos que separe las composiciones entre si. En el momento del mezclado a condiciones que permitan la polimerización, las composiciones forman una red tridimensional complementada con el factor bioactivo. Dependiendo de los componentes precursores y sus concentraciones, la gelificación se puede presentar casi instantáneamente después del mezclado. Esta gelificación rápida hace casi imposible la inyección, es decir, la extracción por presión del material gelificado a través de la aguja de inyección . En una modalidad, la matriz se forma a partir de fibrinógeno. El fibrinógeno, a través de una, cascada de varias reacciones se gelifica para formar una matriz, cuando se pone en contacto con trombina y una fuente de calcio a la temperatura y pH adecuados. Los tres componentes, fibrinógeno, trombina y la fuente de calcio, se deben almacenar por separado. Sin embargo, siempre que al menos uno de los tres componentes se mantenga separado, los otros dos componentes se pueden combinar antes de la administración . En una primera modalidad se disuelve el fibrinógeno (que puede contener adicionalmente aprotinina para aumentar la estabilidad) en .una solución amortiguadora a un pH fisiológico (en el intervalo de pH 6.5 hasta 8.0, de preferencia de 7.0 hasta 7.5) y se almacena por separado de una solución de trombina en un amortiguador de cloruro de calcio (por ejemplo, a una concentración que varia de 40 hasta 50 mM) . La solución amortiguadora para el fibrinógeno puede ser una solución amortiguadora de histidina a una concentración preferida de 50 mM incluyendo adicionalmente NaCl a una concentración preferida de 150 mM o solución salina TRIS amortiguada (de preferencia a una concentración de 33 mM) . En una modalidad preferida, se proporciona un equipo de reactivos, que contiene una proteina de fusión, fibrinógeno, -trombina y una fuente de calcio. Opcionalmente , el equipo de reactivos puede contener una enzima degradante, tal como por ejemplo, el Factor XlIIa. La proteina de fusión contiene un factor bioactivo, un dominio de substrato para una enzima degradante y un sitio de degradación entre el dominio del substrato y el factor bioactivo. La proteina de fusión puede estar presente en la solución ya sea de fibrinógeno o trombina. En una modalidad preferida, la solución de fibrinógeno contiene la proteina de fusión.

Las soluciones de preferencia se mezclan con un dispositivo de jeringa de dos vías, en el cual se presenta el mezclado al extraer por presión el contenido de ambas jeringas a través de una cámara mezcladora y/o aguja y/o mezcladora estática. En una modalidad preferida, tanto el fibrinógeno como la trombina se almacenan por separado en forma liofilizada. Cualquiera de los dos puede contener la proteina de fusión. Antes de utilizarse, se agrega Tris o amortiguador de histidina al fibrinógeno, el amortiguador puede contener adicionalmente aprotinina. La trombina liofilizada se disuelve' en la solución de cloruro de calcio. Posteriormente, las soluciones de fibrinógeno y trombina se colocan en recipientes viales /j eringas por separado y se mezclan mediante un dispositivo de conexión de dos vías, tal como por ejemplo, una jeringa de dos vias . Opcionalmente, los recipientes viales /j eringa se dividen en dos partes teniendo asi dos cámaras separadas por una división ajustable que es perpendicular a la pared del cuerpo de la jeringa. Una de las cámaras contiene el fibrinógeno o la trombina liofilizada, mientras que la otra cámara contiene una solución amortiguadora adecuada. Cuando el émbolo se presiona hacia abajo, la división se mueve y libera el amortiguador en el interior de la cámara de fibrinógeno para disolver al fibrinógeno. Una vez que se disuelven tanto el fibrinógeno como la trombina, ambos cuerpos de la jeringa divididos en dos partes se unen a un dispositivo de conexión de dos vías y los contenidos se mezclan al extraerlos por presión a través de la aguja para inyección unida al dispositivo de conexión. Opcionalmente, el dispositivo de conexión contiene una mezcladora estática para mejorar el mezclado de los contenidos. En una modalidad preferida, el fibrinógeno se diluye ocho veces y la trombina se diluye 20 veces antes del mezclado. Esta proporción da por resultado en un tiempo de gelificación de aproximadamente un minuto. En otra modalidad preferida, la matriz se forma a partir de componentes precursores sintéticos capaces de experimentar una reacción de adición Michael. Debido a que el componente precursor nucleofilico (el multitiol) únicamente reacciona con el componente multiaceptor (el grupo insaturado conjugado) a pH básico, los tres componentes que se deben almacenar por separado antes del mezclado son: la base, el componente nucleofilico y el componente multiaceptor . Tanto el multiaceptor como el componente multitiol se almacenan como una solución en amortiguadores. Las dos composiciones pueden incluir el sitio de unión celular y adicionalmente la molécula bioactiva. De esta forma, la primera composición del sistema por ejemplo puede incluir las soluciones del componente nucleofilico y la segunda composición del sistema puede incluir la solución del componente multiaceptor. Cualquiera o las dos composiciones pueden incluir la base. En otra modalidad, el multiaceptor y el multitiol se pueden incluir como solución en la primera composición y la segunda composición puede incluir la base. La conexión y el mezclado se presentan en la misma forma según se describió anteriormente para el fibrinógeno. El cuerpo de la jeringa dividido en dos partes es igualmente adecuado para los componentes precursores sintéticos. En lugar del fibrinógeno y la trombina, el multiaceptor y los componentes multitiol se almacenan en forma pulverizada en una de las cámaras y la otra cámara contiene el amortiguador básico. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Mientras que las composiciones y métodos se han descrito en los términos y modalidades preferidas, será evidente para alguien con experiencia en la técnica que se pueden aplicar variaciones a la composición, métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente sin aparatarse del concepto espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1: Matrices que contienen TGPTH unida covalentemente . Síntesis de TGPTH El péptido PTH 1-34-mer que muestra actividad similar con la proteína entera, y las proteínas de esta longitud se pueden sintetizar mediante métodos de síntesis para péptidos en estado sólido estándar. Todos los péptidos se sintetizaron sobre resina sólida utilizando un sintetizador de péptidos automático utilizando la química de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo estándar. Los péptidos se purificaron mediante cromatografía cl8 y se analizaron utilizando cromatografía en fase inversa vía HPLC para determinar la pureza, así como también, espectroscopia másica (MALDI) para identificar el peso molecular de cada producto.

Utilizando este método, se sintetizó el siguiente péptido, (denominado en la presente como "TGPTH") : NH3-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-COOH ( SEQ ID NO: 17) .Resultados in vivo La actividad de TGPTH para mejorar la regeneración ósea se probó en una matriz TISSUCOL® en un defecto por orificio perforado en una oveja. Se crearon orificios de ocho mm y 12 mm de profundidad en el fémur y húmero próximo y distal de una oveja. Estos orificios se rellenaron con un gel de fibrina polimeri zante in situ. Los defectos se dejaron vacíos, se rellenaron con TISSUCOL® o se agregó TGPTH a la fibrina TISSUCOL® a 400 g/mL antes de la polimerización. En cada ejemplo en el cual se utilizó TISSUCOL®, este se diluyó cuatro veces a partir de la concentración estándar disponible, conduciendo a una concentración de fibrinógeno de 12.5 mg/mL. Los defectos se dejaron curar durante ocho semanas. Después de este periodo de curación, los animales se sacrificaron, y las muestras de hueso se retiraron y analizaron mediante topografía microcomputarizada (pCT) . Luego se determinó el porcentaje del volumen defectuoso rellenado con tejido óseo calcificado. Cuando los defectos se dejaron vacíos, no hubo formación de tejido calcificado en el interior de la matriz de fibrina. Cuando se agregó únicamente un gel de fibrina, prácticamente tampoco hubo curación de huesos. Sin embargo, con la adición de 400 g/mL de TGPTH, el nivel de curación aumentó dramáticamente, con el defecto relleno al 35% 'con hueso calcificado.

EJEMPLO 2: Respuesta. curación con PTH 1-34 modificado unido a una matriz de fibrina. Materiales La versión modificada de PTH1-34 que se puede incorporar en una matriz de fibrina se ha probado para la respuesta de curación en el defecto craneal de tamaño crítico en ratas . Se elaboró un gel de fibrina a partir de componentes precursores selladores de fibrina del equipo para reactivos TISSÜCOL® (Baxter AG, CH-8604 Volketswil/ZH) . El fibrinógeno se diluyó en solución Tris amortiguada 0.03M estéril (TBS, pH 7.4) para formar una solución de aproximadamente 8 mg/mL y la trombina se diluyó en solución de CaCl2 50 mM estéril para formar una solución de 2 U/mL. La concentración final de fibrinógeno fue la formulación TISSUCOL® original 1:8 (aproximadamente 100 mg/mL) y la concentración de trombina TISSUCOL® original 1:160 (aproximadamente 500 IE/mL) . Luego se agregó una cantidad predeterminada de TG-pl-PTHi-34 o TGPTH1-.34 a la trombina, y se mezcló para formar una concentración homogénea. Para formar el gen de fibrina, los precursores diluidos se mezclaron juntos al inyectarse fibrinógeno en le interior de un tubo que contenia la trombina. En el caso del defecto perforado en una oveja (como se describirá más adelante), esta mezcla luego se inyectó inmediatamente en un efecto perforado creado en un hueso canceloso de la oveja, en donde se formó un gel de fibrina en 1-5 minutos. En la primera serie de experimentos animales, se probó la eficacia de una proteina de fusión que contenia PTHi_34 como el facto bioactivo (NQEQVSPLYKNRSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF, SEQ ID NO: 18) en la curación de huesos corticales en un modelo de animal pequeño. La secuencia YKNR (SEQ ID NO: 19), hace al enlace plasmina degradable ("TG-pl-????-34) ¦ El TG-pl-PTHi-34 se produce mediante síntesis química. La purificación se llevó a cabo a través de HPLC en fase inversa (Columna C18) al utilizar un TFA como el contraión que dio por resultado en un producto final que fue una sal de TFA. La pureza del TG-pl-PTHi_34 se determinó para ser 95%. La respuesta de curación se exploró en tiempos de curación tanto cortos (3 semanas) como largos (7 semanas) para determinar si se podría observar una mejora en la curación.

Defecto craneal de tamaño crítico en ratas Las ratas se anestesiaron y se expuso el huso craneal. El periostio sobre la superficie externa del cráneo se retrajo de tal forma que no pudiera desempeñar una función en el proceso de curación, y se creo un defecto individual redondo de 8 mm. Este tamaño de defecto se seleccionó ya que se había determinado anteriormente que los defectos de 8 mm o mayores no se curan espontáneamente por sí mismos, y son defectos de tamaño crítico. El defecto luego se dotó con una matriz de fibrina preformada y se dejó que el animal se curara durante 3 y 7 semanas. La región defectuosa luego se explantó y se analizó via radiología así como también, histología.

.Resultados Cuando se estudió TG-pl-PTHi_34 en el tiempo de 3 semanas, el nivel de curación fue muy similar al observado con una matriz de fibrina sola. El tiempo de 3 semanas se seleccionó como un tiempo temprano según otros potentes morfógenos, incluyendo rhBMP-2, mostraron un efecto importante de curación en 3 semanas. Por el contrario, el efecto de curación para TG-pl-PTHi_34 , no se pudo observar en este punto de tiempo temprano. Sin embargo, cuando se analizó el tiempo mayor (7 semanas), se observó una mejora que depende- de una dosis moderada en la curación en el defecto craneal de tamaño crítico en ratas con la adición de PTH1-.34 modificada a matrices de fibrina. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Cuando se empleó la alta dosis de PTH1-34 modificada, la respuesta a la curación aumentó en un 65% .

Tabla 3: Respuesta de curación en el defecto craneal en ratas con PTH modificada Estos resultados demuestran que cuando PTH1--34 se incorporó en una matriz de fibrina, esta mantuvo alguna actividad según resulta evidente por el aumento' modesto en la formación de "huesos.

Defecto de perforación de huesos en ovejas TG-pl-PTHi-34 se probó también en un modelo con gran defecto óseo para probar el efecto de esta hormona en la curación del hueso. En el modelo con defecto de perforación en ovejas, se colocaron defectos de perforación cilindrica de 8 mm que tuvieron aproximadamente 15 mm de profundidad tanto en la región distal como en la próxima de los huesos de fémur y húmero. Debido a que el defecto se colocó en la epífisis de huesos largos, el defecto se rodeó por hueso trabecular con una capa fina de hueso cortical en el borde del defecto. Los defectos entonces se rellenaron con una fibrina polimerizante in sítu (aproximadamente 750 L) que contuvo diversas dosis de TG-pl-PTH!-34 , o TGPTHi_34. Se dejó que los animales se curaran durante ocho semanas y luego se sacrificaron. El defecto se analizó con pCT e histología. Para esta serie de experimentos, se probaron tres tipos de composiciones. En primer lugar, se probó TG-pl-PTHx-^ sobre una gran variación de concentración. En segundo lugar, se empleó otra PTRX-3i , modificada, la TGPTHi_34 (NQEQVSPLSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF; SEQ ID NO: 17) que solamente tuvo una secuencia de transglutaminasa en el término amino, y un sitio de degradación. De esta forma, la TGPTH1-34 solamente se podría liberar mediante la degradación de la matriz de fibrina misma. TGPTHi_34 se produjo y se purificó de manera similar a G-pl-P H!-34. Se determinó que la pureza fue del 95%. GP H!-34 se probó a diversas concentraciones que fueron similares a las concentraciones de TG-pl-PTHi-34 para comparar la eficacia. Por último, las matrices se produjeron en presencia de material granular, con ya sea TGPTHi-34 o TG-pl-PTHi_34. El material granular fue una mezcla de fosfato tricálcico estándar/hidroxiapatita que se incorporó en la matriz durante la gelificación . Se exploró el efecto de agregar estos gránulos sobre la eficacia de la PTH1-34. Como un .control, se probó fibrina sin modificar .

Resultados Cuando cualquiera de las moléculas de PTHi_34 modificada se colocó en defectos de hueso largo, se observó una mejora significativa en la respuestas de curación con respecto al uso de matrices de fibrina (control) solas. El uso de fibrina sola dio por resultado en poca curación, en donde únicamente el 20% del defecto original se rellenó con hueso recién formado. Se probó TG-pl-PTHi-34 , en una serie de concentración de 20-1000 µg/mL. Para cada dosis probada, se observó un aumento significativo en la respuesta de curación. Por ejemplo, cuando se utilizaron 100 pg/mL de TG-pl-PTHi_34 , el índice de curación se aumentó casi en un 60%. En una segunda serie de experimentos, se probó TGPTH!-34. El uso de TGPTHi-34 también aumentó la curación ósea. Por ejemplo, el uso de 400 pg/mL mejoró la respuesta de curación al 40%, y 1000 pg/mL aumentó la curación ósea al 65%. De esta forma, la adición de cualquier secuencia de PTHi_34 modifcada dio por resultado en una respuesta de curación más importante que el control. Por último, cuando cualquier molécula de PTHi-3 modificada se unió a la matriz y se empleó una mezcla de gánulo/matriz , se mantuvo la eficacia de la P Hi_34. Esto se probó tanto para TG-pl -PTH1-34 (véase la Tabla 4) como para TGPTHi_3 (véase la Tabla 5) .

Tabla 4 : Curación de un defecto de perforación en ovejas con TG-pl-PTHi-34 incorporada en una matriz de fibrina; tiempo de curación de 8 semanas Tabla 5: Curación de un defecto de perforación en ovejas con PTH1-34 unida a una matriz de fibrina; -tiempo de curación de 8 semanas La evaluación histológica mostró alta infiltración en el defecto original de las células progenitoras fusiformes' y de osteoblastos soportadas sobre una matriz extracelular . Los osteoides activos con grandes osteoblastos redondeados fueron comunes, y se observaron señales de dosificación indocondral ( condrocitos ) . Durante ocho semanas, se podrían encontrar osteoclastos y señales saludables de remodelación. Aunque a diferencia de los resultados obtenidos a partir de la exposición continua a PTH sistémica, no se observó ninguna respuesta manifiesta a partir de osteoclastos y la formación de huesos nuevos fue significativamente mayor a la de la absorción en el área de defecto y alrededor de la misma. No se detectó ninguna respuesta inflamatoria de cuerpo extraño (es decir, no hubo células gigantes y solamente una leve presencia de monocitos). Todavía estuvieron presentes gránulos en las muestras con partículas minerales agregadas.

Ejemplo 3: Preparación de los componentes precursores para matrices sintéticas. Preparación de PEG—vlnilsulfonas Los PEG ramificados disponibles comercialmente (PEG de 4 ramificaciones, peso molecular de 14, 800, PEG de 4 ramificaciones, peso molecular de 10, 000 y PEG de 8 ramificaciones, peso molecular de 20,000; Shearwater Polimers, Huntsville, AL, USA) fueron grupos funcionales en el término OH. Las PEG vinilsulfonas se produjeron bajo atmósfera de argón al hacer reaccionar una solución de diclorometano de los polímeros precursores (secados previamente sobre tamices moleculares) con NaH y luego, después de la evolución con hidrógeno, con divinilsulfona (proporciones molares: OH 1: NaH 5: divinilsulfona 50) . La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 3 días bajo argón con agitación constante. Después de la neutralización de la solución de reacción con ácido acético concentrado, la solución se filtró a través de papel hasta que estuvo clara. El polímero derivado se aisló mediante precipitación en dietiléter enfriado con hielo. El producto se volvió a disolver en diclorometano y se volvió a precipitar en dietiléter (con lavado riguroso) dos veces para eliminar todo el exceso de divinilsulfona . Por último, el producto se secó bajo vacío. La derivación se confirmó con 1H NMR. El producto mostró picos de vinilsulfona característicos a 6.21 ppm (dos hidrógeno) y 6.97 ppm (un hidrógeno). Se encontró que el grado de conversión del grupo final fue del 100% . Preparación de PEG-acrilatos Se produjeron PEG acrilatos bajo atmósfera de argón al hacer reaccionar una solución de tolueno seada azeotropicamente de los polímeros precursores con cloruro de acriloilo, en presencia de trietilamina (proporciones molares: OH 1: cloruro de acriloilo 2: trietilamina 2.2). La reacción prosiguió con agitación durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. La solución amarillo pálido resultante se filtró a través de un lecho de alúmina neutra; después de la evaporación del solvente, el producto de reacción se disolvió en diclo ometano , se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se precipitó en dietiléter frió. Rendimiento: 88%; conversión de OH a acrilato: 100% (a partir del análisis de 1H-NMR) 1H-NMR (CDC13) : 3.6 (341H (14800 4 ramificaciones: 337H teórico), 230 (10000 4 ramificaciones 227H teórico), o 210H (20000 8 ramificaciones: 227H teórico) , Protones de cadena de PEG) , 4.3 (t, 2H , -CH2-C¾-0-CO-CH=CH2 ) , 5.8 (dd, 1H, CH2=CH-COO-) , 6.1 y 6.4 (dd, 1H, CH2=CH-COO- ) ppm.

FT-IR (película sobre una placa ATR) : 2990-2790 (? C-H), 1724 (o C=0), 1460 (us CH2), 1344, 1281, 1242, 1097 (uas C-O-C), 952, 842 (?3 C-O-C ) crrT1.

Síntesis de péptidos Todos los péptidos se sintetizaron sobre resina sólida utilizando un sintetizador de péptidos automático (9050 Pep Plus Synthesizer, Millipore, Framingham, USA) con química de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo estándar. Los depuradores hidrofóbico s y los grupos protectores escindidos se retiraron mediante la precipitación del péptido en dietiléter frío y disolución en agua desionizada. Después de la liofilización, los péptidos se volvieron a disolver en solución salina Tris-amortiguada 0.03 M ( TBS , pH 7.0) y se purificaron utilizando HPLC (Waters; Milford, USA) sobre una columna de enclusión por tamaños con TBS, pH 7.0 como el amortiguador en curso.

Formación de la matriz mediante reacciones de adición conjugada Se formaron geles sensibles a MMP mediante la adición conjugada con un nucleófilo enlazado por péptidos y una insaturación conjugada enlazada por PEG que permite la migración de células proteoliticas . La síntesis de los geles se lleva a cabo por completo a través de una reacción de adición tipo Michael de' tiol-PEG sobre PEG con grupo funcional de vinilsulfona . En un primer paso, se unieron de manera colgante péptidos de adhesión (por ejemplo, el péptido Ac-GCGYGi¾GDSPG-NH2 ( SEQ ID NO: 20)) a una PEG-vinilsulfona multiramificada y luego este precursor se degrado con un péptido que contiene ditiol (por e.jemplo, el substrato MMP Ac-GCRDGPQG2AG£TJRCG-NH2 ( SEQ ID NO: 21)). En una preparación de gel típica para estudios in vitro tridimensional, se disolvió PEG-vinilsulfona de 4 ramificaciones (peso molecular de 15000) en un amortiguador TEOA (0.3M, pH 8.0) para proporcionar una solución al 10% (p/p) · Con el fin de hacer que los geles fueran adhesivos con células, el péptido disuelto Ac-GCGYG-RGDSPG-NH2 (SEQ ID NO: 20) (mismo amortiguador) se agregó a esta solución. El péptido de adhesión se dejó reaccionar durante 30 minutos a 37°C. Después de esto, el péptido degradante Ac-GCRDGPQGJiGGDRCG-NH2 ( SEQ ID NO: 21) se mezcló con la solución anterior y los geles se sintetizaron. La gelificación se presentó en unos cuantos minutos, sin embargo, la reacción de degradación se llevó a cabo durante una hora a 37 °C para garantizar la reacción completa. Se formaron geles no sensibles a MMP mediante la adición de conjugados con un nucleófilo enlazado con PEG y una insaturación conjugada enlazada con PEG que permite la migración celular no proteolitica. La síntesis de geles también se llevó a cabo por completo a través de la reacción de adición tipo Michael del tiol-PEG sobre PEG con grupo funcional de vinilsulfona . En un primer paso, los péptidos de adhesión se unieron de manera colgante (por ejemplo, el péptido Ac-GCGyGi?GÜSPG-NH2 (SEQ ID NO: 20)) a una PEG vinilsulfona multiramificada y luego este precursor se degrado con un PEG-ditiol (p. m. 3.4 kD) . En una preparación de gel típico para estudios in vitro tridimensionales, la PEG vinilsulfona de 4 ramificaciones (peso molecular 15000) se disolvió en un. amortiguador TEOA (0. 3M, pH 8.0) para proporcionar una solución al 10% (p/p) . Con el fin de hacer los geles adhesivos celulares, el péptido disuelto Ac-GCGYGi¾GD5PG-NH2 ( SEQ ID NO: 20) (en el mismo amortiguador) se agregó a esta solución. Se permitió que el péptido de adhesión reaccionara durante 30 minutos a 37°C. Después de esto, el precursor PEG-ditiol se mezcló con la solución anterior y los geles se sintetizaron. La gelificación se presentó en unos cuantos minutos, sin embargo, la reacción de degradación se llevó a cabo durante una hora a 37°C para garantizar la reacción completa.

Formación de la matriz mediante reacciones de condensación Se formaron geles sensibles a MP mediante reacciones de condensación con un X-enlazante peptídico que contiene múltiples aminas y un PEG electrofílicamente activo que permite la migración celular proteólítica . También se crearon hidrogeles sensibles a MMP al conducir una reacción de condensación entre el oligopéptido sensible a MMP que contiene dos substratos MMP y tres Lys {Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NH2 (SEQ ID NO: 22) y una PEG-N-hidroxisuccinimida de éster doble difuncional disponible comercialmente (Shearwater polimers) (NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS) . En un primer paso, uno de los péptidos de adhesión (por ejemplo, el péptido AC-GCGYG.RGDSPG-NH2) (SEQ ID NO: 20) se hizo reaccionar con una pequeña fracción de NHS-HBS-CM-PEG-CM-HBA-NHS y luego este precursor se degradó a una red al mezclar con el péptido Ac-GKGPQGIAGQKGPQGIAGQKG-NE2 (SEQ ID NO: 22) que porta tres e-aminas ( (y uria amina primaria) . En una preparación de gel típica para estudios in vitro tridimensionales, los dos componentes se disolvieron en PBS 10 mM a pH 7.4 para proporcionar una solución al 10% (p/p) y los hidrogeles se formaron en menos de una hora. Por contraste -con los hidrogeles presentes formados mediante la reacción tipo Michael, no se garantizó la autoselectividad deseada en este procedimiento, debido a que las aminas presentes en materiales biológicos similares a células o tejidos también reaccionaran con los ásteres dobles activados difuncionales, . Esto también es verdadero para otros PEG que portan grupos funcionales electrofilicos tales como por ejemplo, PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG) , o carbonato de PEG nitrofenilo. Se formaron hidrogeles n_o sensibles a M P mediante reacciones de condensación con un degradante de PEG-amina y un PEG electrofilicamente activo que permite la migración celular no proteolitica. También se formaron hidrogeles al conducir una reacción de condensación entre las PEG-aminas ramificadas, disponibles comercialmente (Jeffaminas) y la misma PEG-N-hidroxisuccinimida de doble éster difuncional (NHS-HBS-CM-PEG-C -HBA-NHS ) . En un primer paso, los péptidos de adhesión (por ejemplo, el péptido Ac-GCGYGi?G£>5PG-NH2 ) (SEQ ID NO: 20) se hicieron reaccionar con una pequeña fracción de NHS-HBS -CM-PEG-CM-HBA-NHS y luego este precursor se degradó a una red al mezclar con la PEG amina multiramificada . En una preparación de gel típica para estudios ín vitro tridimensionales, los dos componentes se disolvieron en PBS 10 mM a pH 7.4 para proporcionar una solución al 10% (p/p) se formaron hidrogeles en menos de una hora. Nuevamente, por contraste con los hidrogeles presentes formados mediante la reacción tipo Mic ael, no se garantizó la autoselectividad deseada en este procedimiento, debido a que las aminas presentes en materiales biológicos similares a células o tejidos tampoco reaccionaran con los dobles ésteres activados dif ncionales . Esto también es verdadero para otros PEG que portan grupos funcionales electrofilicos tales como por ejemplo, PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG) , o PEG carbonato de PEG nitrofenilo.

Ejemplo 4: regeneración ósea con matrices degradables enzimáticamente sintéticas Se emplearon dos concentraciones de inicio diferente de los geles · degradables enzimáticos. En cada' una de estas, la concentración de RGD y el factor activo (CplPTH a 100 g/mL) se mantuvieron constantes. la red polimérica se formó a partir de un PEG con grupo funcional de cuatro ramificaciones con cuatro grupos finales de vinilsulfona de un peso molecular de 20 kD (peso molecular de cada una de las ramificaciones 5kD) y péptido de ditiol de la siguiente secuencia Gly-Cys-Arg-Asp- ( Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln) -Asp-Arg-Cys-Gly (SEQ ID NO: 21) . Los dos componentes precursores se disolvieron en trietanolamina 0.3 M. Se variaron la concentración inicial del PEG con grupo funcional (primera molécula precursora) y el péptido ditiol (segunda molécula precursora). En un caso la concentración fue del 12.6% en peso del peso total de la composición (primero y segundo componente precursor + solución de trietanolamina). El 12.6% en peso corresponde a una solución al 10% en peso cuando se calcula sobre la base de únicamente el primer componente precursor (100 mg/mL de la primera molécula precursora) . La segunda concentración de inicio fue del 9.5% en peso del peso total de la composición (primero y segundo componente precursor + solución de trietanolamina) que corresponde al 7.5% en peso sobre la base de únicamente la primera molécula precursora (75 mg/mL de la primera molécula precursora) del peso total. Esto tuvo la consecuencia de que la cantidad del péptido ditiol se cambió de tal forma que se mantuvo la proporción molar entre las vinilsulfonas y los troles. El gel que se inicio a partir de una concentración inicial de 12.6% en peso aumentó de volumen a una concentración del 8.9% en peso del peso total de la red polimérica más agua, de esta forma la matriz tuvo un contenido acuoso de 91.1.

El gel que se inició a partir de una concentración inicial de 9.5% en peso aumentó de volumen a una concentración final del 7.4% en peso del peso total de la red polimérica más agua, de esta forma tuvo un contenido acuoso de 92.6. Con el fin de, explorar el efecto de este cambio, estos materiales se probaron en el defecto de perforación en una oveja. Aquí, se colocó un defecto de 750 yL en el hueso canceloso del diáfisis del fémur y húmero de la oveja y se rellenó con un gel enzimático gelatinizante in situ. Se obtuvo la siguiente cantidad de tejido calcificado, determinado vía µ??, con cada grupo a N=2.

Concentración inicial del gel Tejido calcificado 12.6% 2.7% 9.5% 38.4% Al hacer los geles menos densos y más fáciles para la penetración celular, la respuesta de curación resultante con la adición de un factor activo fue más fuerte. El efecto de tener concentraciones sólidas finales menores a 8.5% en peso es obvio a partir de estos resultados. Entonces claramente, el diseño de la matriz es crucial para permitir la curación en defectos de heridas. Cada uno de estos hidrogeles estuvo compuesto de grandes cadenas de polietilenglicol, enlazados en el extremo para crear una matriz. Sin embargo, los detalles de la forma en que se enlazaron, via sitios de degradación enzimática, la densidad de los enlazantes y otras diversas variables fueron cruciales para permitir una respuesta de curación funcional. Estas diferencias se observaron muy claramente en el modelo de defecto de perforación en la oveja.

Ejemplo 5: Formación ósea con matrices hidrolíticamente degradables sintéticas Se probó un péptido de fusión con PTH 1-34 en un gel sintético asi como también en el modelo de defecto de perforación en una oveja exactamente según se describió para las matrices de fibrina. Se creo una red de hidrogel al mezclar co juntamente polietilenglicol de 4 ramificaciones acrilado, PM 15,000 (Peg 4*15 Acr) con un polieitlenglicol ditiol lineal de PM 3400. A través de una reacción tipo ichael, cuando los dos componentes se mezclaron en un amortiguador de trietanolamina 0.3 M a pH 8.0, los tiolatos resultantes que se formaron a este pH luego se hicieron reaccionar con la insaturación conjugada del acrilato para crear un enlace covalente. Al mezclar juntos los precursores multifuncionales , de tal forma que la multif ncionalidad combinada fue mayor o igual a cinco, se formó un hidrogel. Además, se pueden agregar factores biactivos a la matriz a través de un esquema de reacción idéntico. En este caso, los factores bioactivos, incluyendo los motivos de adhesión celular o los factores morfogénicos o mitogénicos se podrían unir a la matriz al agregar una cisteina, el tiol que contiene aminoácidos, a la secuencia. Aquí, se tuvieron que agregar una cisteina a la secuencia de adhesión celular, RGD, y más específicamente, RGDSP (SEQ ID NO: 23), así como también a la secuencia de PTtÍ!_34 y ambas se unieron a la matriz vía los acrilatos en el degradante. Posteriormente, estos hidrogeles recién formados, entonces tuvieron muchos ésteres cercanos a un tiol, lo cual ha mostrado ser hidrolíticamente inestable.

Esta inestabilidad permite que los geles se degraden lentamente y sean reemplazados por tejido recién formado . Estos geles particulares, degradables hidrolíticamente con RGD y PTH unidos covalentemente a la matriz, se probaron en el modelo de defecto de perforación en una oveja para probar la capacidad de la C- PT H1-.34 unida a la matriz para mejorar el desarrollo óseo. Con el fin de determinar la cantidad de mejora, se agregaron a la matriz 0, 100 y 400 pg/mL del péptido de fusión con la PTH1-34. Cuando se realizó esto, se observó un aumento en la formación ósea con la .adición de PTH 1-34. En cada prueba se midió la respuesta de curación en el mismo tiempo de ocho semanas. Esto se comparó con los defectos que se dejaron vacíos. Cuando se empleó la matriz hidrolíticamente degradable sintética sin el péptido de fusión con la PTH, se midió la respuesta de curación en aproximadamente 40%. Esto significa que el 40% del volumen de defecto original se rellenó con tejido óseo recién formado. Después, cuando se emplearon 400 g/mL del péptido de fusión con la PTH1-34 modificada, la respuesta de curación aumentó a aproximadamente 60%. En comparación, cuando los defectos se dejaron vacíos, aproximadamente el 10% se rellenó con tejido calcificado. Estos datos se muestran en la siguiente Tabla 6.

Tabla 6: Respuesta de curación con matrices sintéticas con y sin PTH modificada En comparación con un defecto vacío, la adición del gel de peg hidrolíticamente degradable sólo tuvo un gran efecto sobre la curación ósea, aumentando la cantidad de tejido calcificado en un 300%. Cuando la' PTH 1-34 se unió a esta matriz, la curación aumentó incluso más con el nivel que fue de hasta el 50% superior que cuando se empleó la matriz sola y en un 500% superior que el nivel de curación obtenido cuando el defecto se dejó vacío.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Eidgenossiche Te'chnische Hochschule Zurich, Universidad de Zurich,- y Jeffrey A. Hubbell <120> Matrices de proteina modificada con factor de crecimiento de tejidos <130> ETH 107 CIP(3) <150> 10/024,918 <151> 2001-12-18 <150> PCT/EP02/12458 <151> 2002-11-07 <160> 23 <170> Patenln versión 3.1 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> péptido bidominio <220> <221> MOD_RES <222> (1) .. (1) <223> leucina de dansilo <40Q> 1 . Leu Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Arg Gly Asp 1 5 10 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr lie Gly Ser Arg 1 5- <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Arg Gly Asp Asn 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Asp Gly Ser Arg 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 lie Lys Val Ala Val 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Asn lie Ala Glu lie lie Lys Asp lie 1 5 10 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Gly Glu Ala 1 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Cys Arg Pro Gln Gly lie Trp Gly Gln Asp Arg Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gly Ala Lys Asp Val 1 5 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Lys Lys Lys Lys 1 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu 1 5 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Tyr Arg Gly Aso Thr lie Gly Glu Gly Gln Gln His His Leu Gly Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Ala Lys Asp Val 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Lys Tyr Asn Arg 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro 1 5 <210> 17 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Ser Val Ser Glu lie Gln Leu Mefc 1 5 10 15 His Asn Leu Gly Lys . His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu 20 25 30 Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe 35 40 <210> 18 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asn Gln Glu Gln. Val Ser Pro Leu Tyr Lys Asn Arg Ser Val Ser Glu 1 5 10 15 lie Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg 20 25 30 Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe 35 40 45 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Tyr Lys Asn Arg 1 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1) .. (1) <223> ACETILACIÓN <220> <221> M0D_RES <222> (11) - . (11) <223> A IDACIÓN <400> 20 Gly Cys Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> M0D_RES <222> (1) .. (1) <223> ACETILACIÓN <220> <221> MOD_RES <222> (16) .. (16) <223> AMIDACIÓN <400> 21 Gly Cys Arg Asp Gly Pro Gln Gly lie Trp Gly Gln Asp Arg Cys Gly 1 5 . 1° 15 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> OD RES <222> (1) · · (i) <223> ACETILACIÓN <220> <221> MOD RES <222> (21) .. (21) <223> A IDACIÓN <400> 22 Gly Lys Gly Pro Gln Gly lie Ala Gly Gln Lys Gly Pro Gln Gly lie 1 5 10 15 Ala Gly Gln Lys Gly 20 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Gly Asp Ser ?ro 1 5 6

Claims (19)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Un péptido de fusión, caracterizado porque comprende: un primer dominio que comprende PTH y un segundo dominio que comprende un dominio del substrato covalentemente degradable.
2. 2. El péptido de fusión según la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende un sitio de degradación entre el primero y el segundo dominio.
3. 3. El péptido de fusión según la reivindicación 1, caracterizado porque la PTH se selecciona del grupo que consiste de PTH 1-84, PTH 1-28,. PTH 1-34,- PTH 1-31 y PTH 1-25.
4. 4. El péptido de fusión según la reivindicación 3, caracterizado porque la PTH es PTH 1-34.
5. 5. El péptido de fusión según la rei indicación 1 , caracterizado porque el segundo dominio comprende un dominio del substrato de transglutaminasa .
6. 6. El péptido de fusión según la reivindicación 5, caracterizado porque el segundo dominio comprende un dominio del substrato del Factor XlIIa.
7. 7. El péptido de fusión según la reivindicación 6, caracterizado porque el dominio del substrato del Factor XlIIa comprende la SEQ ID NO: 12.
8. 8. El péptido de fusión según la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo dominio comprende al menos una cisteina.
9. 9. El péptido de fusión según la reivindicación 2, caracterizado porque el sitio de degradación es un sitio de degradación enzimática o hidrolitica .
10. 10. El péptido de fusión según la reivindicación 8, caracterizado porque el sitio de degradación es un sitio de degradación enzimática, que se escinde mediante una enzima seleccionada del grupo que consiste de plasmina y metaloproteinaza matriz.
11. 11. Un equipo de reactivos caracterizado porque comprende el péptido de fusión según las reivindicaciones 1-10.
12. 12. El equipo de reactivos según la reivindicación 11, caracterizado además porque comprende fibrinógeno, trombina y una fuente de calcio .
13. 13. El equipo de reactivos según la reivindicación 11, caracterizado porque el equipo de reactivos también comprende una enzima degradante.
14. 14. Una matriz adecuada para crecimiento o crecimiento interno celular, que comprende el péptido de fusión según las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque el péptido de fusión está enlazado covalentemente a la matriz.
15. 15. La matriz según la reivindicación 14, caracterizado porque la matriz es fibrina.
16. 16. La matriz según la reivindicación 14, caracterizado porque la matriz se forma mediante una reacción de adición tipo Michael entre una primera molécula precursora que comprende n grupos nucleofilicos y una segunda molécula precursora que comprende m grupos electrofilicos , en donde n y son al menos dos y la suma n + m es al menos cinco.
17. 17. La matriz según la reivindicación 16, caracterizado porque los grupos electrofilicos son grupos insaturados conjugados y los grupos nucleofilicos se seleccionan del grupo que consiste de tioles y aminas.
18. 18. La matriz- según la reivindicación 14, caracterizado porque la matriz comprende polietilenglicol.
19. 19. Un método para elaborar una matriz carac erizado porque comprende: proporcionar al menos un material matriz capaz de formar una matriz degradada, en donde el material matriz se selecciona del grupo que consiste de proteínas y materiales sintéticos; agregar el péptido de fusión según las reivindicaciones 1-10 al material matriz, y degradar el material matriz, de tal forma que el péptido de fusión se una a la matriz a través del segundo dominio. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se incorporan proteínas en el interior de una proteína o matrices de polisacárido para utilizarse en la reparación, regeneración y/o remodelación de tejidos y/o suministro de fármaco. Las proteínas se pueden incorporar de tal forma que se liberen mediante la degradación de la matriz, por acción y/o difusión enzimática. Según se demuestra por los ejemplos, un método es unir heparina a la matriz mediante métodos ya sea covalentes o no covalentes, para formar una matriz de heparina. Entonces la heparina no covalente se une a los factores de crecimiento de unión con heparina a la matriz de proteína. Alternativamente, se puede construir una proteína' de fusión que contenga una región reticulante tal como por ejemplo, un substrato del Factor XlIIa y la secuencia de proteína natural. La incorporación de enlaces degradables entre la matriz y los factores bioactívos . puede ser particularmente útil cuando se desea un suministro de- fármacos a largo plazo, por ejemplo, en el caso de regeneración nerviosa, en donde es conveniente variar la velocidad de liberación de fármacos espacialmente como una función de regeneración, por ejemplo, rápidamente cerca de la interfaz» de tejido viviente y más lentamente lejos en la zona herida. Los beneficios adicionales incluyen la menor dosis de fármaco total dentro del sistema de suministro, y la regulación espacial de liberación que permite que se libere un mayor porcentaje del fármaco en el momento de una mayor actividad celular.