MX2007005466A

MX2007005466A - Modificacion dirigida al sitio del factor viii.

Info

Publication number: MX2007005466A
Application number: MX2007005466A
Authority: MX
Inventors: Thomas Barnett; John E Murphy; Clark Q Pan; Baisong Mei; Jonathan S Strauss; Hendri Tjandra; Jianmin Chen; Deqian Wang; Liang Tang
Original assignee: Bayer Healthcare Llc
Priority date: 2004-11-12
Filing date: 2005-11-14
Publication date: 2007-10-19
Also published as: HRP20180481A2; JP6559642B2; FR19C1031I1; EP2363414A2; JP2015134780A; SI3130601T1; LT2363414T; SI1824988T1; CN103102406B; KR101468345B1; CY1123384T1; HRP20070268A2; BR122016022033B1; EP3323829A1; NO344606B1; LTC1824988I2; CN105148287B; SI2371856T1; NO345800B1; HUE050542T2

Abstract

Esta invencion se refiere a muteinas de Factor VIII que se enlazan covalentemente, en un sitio predefinido que no es una amina N-terminal, a uno o mas polimeros biocompatibles tal como polietilenglicol. Los conjugados de muteina retienen la actividad procoagulante de FVIII y tienen propiedades farmacocineticas mejoradas.

Description

MODIFICACIÓN DIRIGIDA AL SITIO DEL FACTOR VIII CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a muteínas del Factor VIII (FVIII) que permiten el acoplamiento, en un sitio definido, a uno o más polímeros biocompatibles tal como polietilenglicol. Además, se proporcionan formulaciones relacionadas, dosis y métodos de administración de las mismas para propósitos terapéuticos. Estas variantes modificadas de FVIII, y composiciones y métodos asociados son útiles en proporcionar una opción de tratamiento con frecuencia reducida de inyección y respuesta inmunogénica reducida para individuos afligidos con hemofilia A.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hemofilia A es el trastorno hereditario más común de coagulación, con una incidencia estimada de 1 por 5,000 varones. Se provoca por deficiencia o defectos estructurales en el FVIII, un componente crítico de la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea. El tratamiento actual para la hemofilia A comprende inyección intravenosa FVIII humano. El FVIII humano se ha producido de manera recombinante como una molécula de cadena individual de aproximadamente 300 kD. Consiste que los dominios estructurales A1-A2-B-A3-C1-C2 (Thompson, 2003, Semin. REF.:181902 Hematol. 29, págs. 11-22). El producto precursor se procesa en dos cadenas de polipéptido de 200 kD (pesadas) y 80 kD (ligeras) en el aparato de Golgi, con las dos cadenas mantenidas conjuntamente por iones metálicos (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, p. 6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p. 2979). El dominio B de FVIII parece ser prescindible puesto que el FVIII suprimido del dominio B (BDD, 90 kD cadena pesada A1-A2 más cadena ligera 80 kD) también se ha mostrado que es efectivo como una terapia de reemplazo para hemofilia A. La secuencia de FVIII suprimido del dominio B contiene una supresión de casi los 14 aminoácidos del dominio B. Los pacientes con hemofilia A actualmente se tratan por administración intravenosa de FVIII a petición o como una terapia profiláctica administrada varias veces a la semana. Para el tratamiento profiláctico se dan 15-25 IU/kg de peso corporal del factor VIII tres veces a la semana. Se requiere constantemente en el paciente. Debido a su corta vida media en el hombre, el FVIII se debe administrar de manera frecuente. A pesar de su gran tamaño de más de 300 kD para la proteína de longitud completa, el FVIII tiene una vida media en humanos de sólo aproximadamente 11 horas.

(Ewenstein et al, 2004, Semin. Hematol. 41, págs. 1-16). La necesidad de inyección intravenosa frecuente crea barreras tremendas a la acatación por el paciente. Sería más conveniente para los pacientes si se pudiera desarrollar un producto de FVIII que tenga una vida media más prolongada y por lo tanto requieran una administración menos frecuente. Adicionalmente, se puede reducir el costo del tratamiento si se incrementara la vida media debido a que entonces se pueden requerir menos dosis. Una desventaja adicional a la terapia actual es que aproximadamente 25-30 % de los pacientes desarrollan anticuerpos que inhiben la actividad de FVIII (Saenko et al, 2002, Haemophilia 8, págs. 1-11). Los epítopos principales de los anticuerpos inhibitorios se localizan dentro del dominio A2 en los residuos 484-508, el dominio A3 en los residuos 1811-1818 y el dominio C2. El desarrollo de los anticuerpos impide el uso de FVIII como una terapia de reemplazo, forzando a este grupo de pacientes a buscar un tratamiento aún más costoso con terapia de inmunotolerancia y de factor Vlla recombinante de alta dosis. Los siguientes estudios identificaron epítopos de FVIII de anticuerpos inhibitorios. En un estudio de 25 muestras de plasma inhibitorias, 11 se encontraron que se unen al fragmento A3C1C2 de cadena ligera de 73 kD generado de trombino al dominio A2 , y 10 a ambos (Fulcher, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), págs. 7728-32). En otro estudio, seis de ocho inhibidores del dominio A2 de pacientes se neutralizaron por un polipéptido A2 recombinante (Scandella, D. et al., 1993, Blood 82(6), págs. 1767-75). Los epítopos para seis de los nueve inhibidores de pacientes se correlacionaron a los residuos A2 379-538 (Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci 85(16), págs. 6152-6). Un epítopo para 18 inhibidores de cadena pesada se localizó en el misma región de 18.3 kD N-terminal del dominio A2 (Scandella, D. et al., 1989, Blood 74(5), págs. 1618-26). Una molécula de FVIII humana/porcina híbrida, recombinante, activa, generada al reemplazar los residuos 387-604 del dominio A2 humano con la secuencia porcina homologa, fue resistente a un inhibidor A2 de paciente (Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), págs. 8639- 41) y resistente a un anticuerpo monoclonal murino mAB 413 IgG que compite con los inhibidores A2 de paciente para la unió a A2 (Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), págs. 665-71) . Este epítopo del dominio A2 se localizó adicionalmente a los residuos 484-508 del dominio A2 cuando los experimentos mostraron que mAB 413 IgG y cuatro inhibidores de paciente no inhibieron un FVIII humano/porcino híbrido en el cual los residuos 484-508 del dominio A2 se reemplazaron con aquél del porcino (Healey, J. et al . , 1985, J. Biol. Chem. 270(24), págs. 14505-9). Este FVIII híbrido también fue más resistente a al menos la mitad de los 23 plasmas de pacientes detectados (Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), págs. 564-8). La mutagénesis de exploración de alanina identificó que el residuo 487 es crítico para la unión a los cinco inhibidores de paciente probados, en tanto que los residuos 484-487, 489 y 492 fueron todos importantes para la interacción con mAB 413 IgG (Lubin I., J. Biol. Chem. 272(48), págs . 30191-5). Los títulos de los anticuerpos inhibitorios en ratones se reciben en el mutante R484A/R489A/P492A, pero no el mutante R484A/R489A, fueron significativamente menores que en ratones que reciben FVIII de BDD humano de control (Parker E. et al., 2004, Blood 104(3), págs. 704-10). En resumen, la región 484-508 del dominio A2 parece ser un sitio de unión para inhibidores de la actividad de FVIII. Además del desarrollo de una respuesta inmunitaria a FVIII, otro problema con la terapia convencional es que requiere dosificación frecuente debido a la corta vida media de FVIII in vivo. Se han estudiado los mecanismos de depuración de FVIII de la circulación. La depuración de FVIII de la circulación se ha atribuido parcialmente a la unión específica a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) , un receptor de depuración hepático con amplia especificidad de ligandos (Oldenburg et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl. 4, págs. 133-139). Recientemente, el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) también se mostró que juega un papel en la depuración de FVIII, tal como al cooperar con LRP en la regulación de los niveles en plasma de FVIII (Bovenschen et al., 2005, Blood 106, págs. 906-910). Ambas interacciones se facilitan por la unión a los proteoglicanos de sulfato de heparina de superficie celular (HSPG) . La vida media en plasma en ratones se puede prolongar por 3.3 veces cuando se bloquea la LRP ó 5.5 veces cuando se bloquean tanto LRP como los HSPG de superficie celular (Sarafanov et al., 2002, J. Biol. Chem. 276, págs. 11970-11979) . Se tiene como hipótesis que los HSPG concentran el FVIII en la superficie celular y lo presentan a la LRP. Los sitios de unión de LRP en FVIII se ha localizado en los residuos 484-509 de A2 (Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, págs. 37685-37692), los residuos 1811-1818 de A3 (Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, págs. 9370-9377) y un epítopo en el dominio C2 (Lenting et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, págs. 23734-23739). También se depura el FVIII de la circulación por la acción de proteasas. Para entender este efecto, uno debe entender el mecanismo por el cual el FVIII está comprendido en la coagulación sanguínea. El FVIII circula como un heterodímero de cadenas pesadas y ligeras, unidas a vWF . La unión de vWF comprende los residuos 1649-1689 de FVIII (Foster et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, págs. 5230-5234), y partes de los dominios Cl (Jacquemin et al., 2000, Blood 96, págs. 958-965) y C2 (Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), págs. 53691-8). Se activa FVIII por trombina, que escinde los enlaces peptídicos después de los residuos 372, 740 y 1689 para generar un heterotrímero de los dominios Al, A2, y A3-C1-C2 (Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, págs. 12434-12439). En la activación, FVIII se disocia de vWF y se concentra a la superficie celular de las plaquetas por la unión a fosfolípido. La unión a fosfolípido comprende los residuos 2199, 2200, 2251 y 2252 de FVIII (Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, págs. 6374-6381). Ahí se une a FIX a través de interacciones con los residuos 558-565 de FVIII (Fay et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, págs. 20522-20527) y 1811-1818 (Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, págs. 1935-1940) y FX a través de las interacciones con los residuos 349-372 de FVIII (Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, págs. 15763-15771) y actúa como un cofactor para la activación de FIX de FX, un componente esencial de la ruta intrínseca de coagulación. El FVIII activado (FVIIIa) se inactiva parcialmente por la proteína C activada por proteasa (APC) a través de la escisión después de los residuos 336 y 562 de FVIII (Regan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, págs. 3982-3987). El determinante predominante de inactivación, sin embargo, es la disociación del dominio A2 de Al y A3-C1-C2 (Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, págs. 8957-8962) .

Un método que se ha demostrado para incrementar la vida media in vivo de una proteína es la PEGilación. La PEGilación es la unión covalente de moléculas de polietilenglicol (PEG) de cadena larga a una proteína u otra molécula. El PEG puede estar en una forma lineal o en la forma ramificada para producir diferentes moléculas con diferentes características. Además de incrementar la vida media de péptidos o proteínas, se ha usado la PEGilación para reducir el desarrollo de anticuerpos, proteger la proteína de la digestión por proteasa y mantener el material fuera del filtro de ríñones (Harris et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, págs. 539-51). Además, la PEGilación también puede incrementar la estabilidad y solubilidad total de la proteína. Finalmente, la concentración sostenida en plasma de las proteínas PEGiladas puede reducir el grado de los efectos secundarios adversos al reducir los niveles declinatorios a picos de un fármaco, eliminando de esta manera la necesidad de introducir niveles súper-fisiológicos de proteína en puntos de tiempo tempranos. La modificación aleatoria de FVIII al seleccionar como objetivos aminas primarias (N-término y lisinas) con polímeros grandes tal como PEG y dextrano se ha intentado con grado variable de éxito (WO 94/15625, patente de los Estados Unidos número 4970300, patente de los Estados Unidos número 6048720) . La mejora más dramática, publicada en una solicitud de patente de 1994 (WO 94/15625), muestra una mejora de 4 veces de la vida media pero a un costo de pérdida de actividad de 2 veces después de hacer reaccionar FVIII de longitud completa con un exceso molar de 50 veces de PEG. La WO 2004/075923 describe conjugados de FVIII y polietilenglicol que se crean a través de la modificación aleatoria. Las proteínas aleatoriamente PEGiladas, tal como interferón-alfa (Kozlowski et al, 2001, BioDrugs 15, págs. 419-429) se ha aprobado como productos terapéuticos en el pasado. Este planteamiento aleatorio, sin embargo, es mucho más problemático para el FVIII heterodimérico . El FVIII tiene cientos de sitios potenciales de PEGilación, incluyendo las 158 lisinas, los dos N-términos, y múltiples histidinas, serinas, treoninas y tirosinas, todas las cuales pueden ser potencialmente PEGiladas con reactivos que tienen como objetivo principalmente las aminas primarias. Por ejemplo, el isómero posicional principal para el interferón Alfa-2b PEGilado se mostró que es una histidina (Wang et al., 2000, Biochemistry 39, págs. 10634-10640). Adicionalmente, el procesamiento heterogéneo de FVIII de longitud completa puede conducir a una mezcla de material de inicio que conduce a complejidad adicional en los productos PEGilados. Una desventaja adicional de no controlar el sitio de PEGilación en el FVIII es una reducción potencial de actividad si el PEG no se uniera en o cerca de sitios activos críticos, especialmente si se conjuga más de un PEG o un PEG grande individual a FVIII. Debido a que la PEGilación aleatoria producirá invariablemente grandes cantidades de múltiples productos PEGilados, la purificación para obtener sólo productos mono-PEGilados disminuirá dramáticamente el rendimiento total. Finalmente, la enorme heterogeneidad en el perfil del producto hará casi imposible la síntesis consistente y caracterización de cada lote. Puesto que la buena fabricación requiere un producto consistente y bien caracterizado, la heterogeneidad del producto es una barrera a la comercialización. Por estas razones, se desea un método más específico para PEGilar FVIII. Se han resumido varias estrategias de PEGilación de proteínas dirigidas al sitio en una revisión reciente (Kochendoerfer, G. , Curr. Opin. Chem. Biol. 2005, disponible en línea a partir del 15 de octubre de 2005, objeto directo identificado DOl: 10.1016/j . cbpa .2005.10.007 ) . Un planteamiento comprende la incorporación de un aminoácido no natural en proteínas por síntesis química o expresión recombinante seguido por la adición de un derivado de PEG que reaccionará de manera específica con el aminoácido no natural. Por ejemplo, el aminoácido no natural puede ser uno que contiene un grupo ceto no encontrado en proteínas nativas. Sin embargo, no es factible la síntesis química de proteínas para una proteína tan grande como FVIII. El límite actual de la síntesis de péptido es aproximadamente 50 residuos. Se pueden ligar varios péptidos para formar una pieza más grande de polipéptido, pero para producir aún el FVIII suprimido del dominio B requerirá más de 20 ligaciones, lo que dará por resultado menos de 1 % de recuperación aún bajo condiciones ideales de reacción. La expresión recombinante de proteínas con aminoácidos no naturales se ha limitado principalmente hasta ahora a los sistemas de expresión no de mamífero. Este planteamiento se espera que sea problemático para una proteína grande y compleja tal como FVIII que necesita ser expresada en sistemas de mamífero. Otro plantemiento a la PEGilación específica del sitio de proteínas es la selección como objetivo de la amina de estructura N-terminal con PEG-aldehídos . El bajo pH requerido bajo este proceso para lograr especificidad con respecto a otros grupos amina, sin embargo, no es compatible con el intervalo de pH casi neutral estrecho necesario para la estabilidad de FVIII (Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, págs. 1-15). Además, la PEGilación N-terminal de FVIII no puede conducir a vida media en plasma mejorada si esta región no está comprendida en la depuración en plasma. En realidad, la región N-terminal de la cadena ligera de FVIII se ha implicado en unión al factor de von Willebrand (vWF) , una proteína portadora que es crítica para la supervivencia de FVIII en circulación. Por modificación N-terminal del factor VIII, la asociación críticamente importante con vWF se puede interrumpir o debilitar. De esta manera, la PEGilación N-terminal de FVIII puede tener el efecto opuesto de reducir la vida media en plasma de FVIII. La WO 90/12874 describe modificación específica de sitio de IL-3 humana, factor de estimulación de colonia de granulositos y polipéptidos de eritropoyetina al insertar o sustituir una cisteína por otro aminoácido, luego al adicionar un ligando que tiene un grupo reactivo de sulfhidrilo. El ligando se acopla selectivamente a los residuos de cisteína. No se describe la modificación de FVIII o ninguna variante del mismo. Por las razones señaladas anteriormente, existe la necesidad de una variante mejorada de FVIII que posea mayor duración de acción in vivo e inmunogenicidad reducida, en tanto que retenga actividad funcional. Adicionalmente, es deseable que esta proteína se produzca como un producto homogéneo de una manera consistente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar un polipéptido de FVIII funcional conjugado a polímero biocompatible que tiene características farmacocinéticas y características terapéuticas mejoradas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una proteína de FVIII agotada del dominio B conjugada a polímero biocompatible que tenga propiedades farmacocinéticas mejoradas. Es aún otro objeto de la invención proporcionar un polipéptido de FVIII funcional conjugado a polímero biocompatible que tenga unión reducida a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP) , al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) , a los proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPG) y/o anticuerpos inhibitorios contra FVIII. Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar una variante mejorada de FVIII que posea mayor duración de acción in vivo e inmunogenicidad reducida, que es capaz de ser producida como un producto homogéneo de una manera consistente. En un aspecto de la invención se proporciona un conjugado que tiene actividad precoagulante del factor VIII que comprende un polipéptido de factor VIII funcional unido covalentemente en uno o más sitios predefinidos en el polipéptido a uno o más polímeros biocompatibles, en donde el sitio predefinido no es una amina N-terminal. La invención también incluye un método para la preparación de este conjugado que comprende mutar una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de factor VIII funcional para sustituir una secuencia purificante para un residuo de cisteína en un sitio predefinido; expresar la secuencia de nucleótidos mutada para producir una muteína mejorada de cisteína; purificar la muteína; hacer reaccionar la muteína con el polímero biocompatible que se ha activado para reaccionar con polipéptidos sustancialmente sólo en los residuos de cisteína introducidos tal que el conjugado se forme; y purificar el conjugado. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado y un adyuvante farmacéuticamente aceptable y métodos para tratar hemofilia al administrar cantidades terapéuticamente efectivas de estas composiciones farmacéuticas a un mamífero en necesidad del mismo. La invención también se refiere a un método para la PEGilación dirigida al sitio de una muteína de factor VIII que comprende (a) expresar una muteína de factor VIII dirigida al sitio en donde la muteína tiene un reemplazo de cisteína para un residuo de aminoácido en la superficie expuesta de la muteína de factor VIII y que la cisteína está rematada; (b) poner en contacto la muteína de cisteína con un reductor bajo condiciones para reducir suavemente la muteína de cisteína y para liberar el remate; (c) remover el remate y el reductor de la muteína de cisteína; y (d) al menos aproximadamente 5 minutos después de la remoción del reductor, tratar la muteína de cisteína con PEG que comprende una porción de acoplamiento de sulfhidrilo bajo condiciones tal que se produzca la muteína del factor VIII PEGilada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras la y lb. Mapas de vector y estrategia de mutagénesis para muteínas de PEG. Figura 2. Un perfil de absorbancia de UV 280 nm con respecto al tiempo para la proteína de PEG2 purificada sobre una columna de cromatografía de anticuerpo de FVIII monoclonal. La cromatografía se realizó usando un sistema de cromatografía AKTAMR Explorer 100 de Amersham Bioscience. Figura 3. Método de PEGilación dirigido a sitio de tres pasos. PEG representa un PEG reactivo a cisteína tal como PEG-maleimida . Las barras cerradas representan formación de disulfuro en tanto que las barras abiertas representan cisteínas reducidas. Figura 4. PEGilación dirigida al sitio de PEG2. Figura 5. PEGilación dirigida al sitio de PEG6. Figura 6a. PEGilación dirigida a sitio de BDD, PEG2 , 4, 5 y 6. Los paneles superiores se tiñeron con anticuerpo de cadena pesada (H) en tanto que los paneles de fondo se tiñeron con anticuerpo de cadena ligera (L) . "U" es material no procesado que contiene tanto H como L. Figura 6b. PEGilación de PEG15 y PEG7 con PEG2 y PEG6 como controles. Se reducen muteínas de PEG purificadas de inicio ("S") con TCEP y se PEGilan con un PEG de 12 kD ("12") o de 22 kD ("22") después de la remoción del reductor ("R"). Las muestras se corrieron en SDS-PAGE de Tris-glicina al 6 % y se tiñeron con el anticuerpo de cadena pesada ("HC") en el panel izquierdo o anticuerpo de cadena ligera ("LC") en el panel derecho. "U" es material no procesado que contiene tanto HC como LC . Las bandas PEGiladas se resaltan por puntos . Figura 6c. PEGilación de PEG2+6 con PEG2 y PEG6 como controles. Se reduce PEG2 , PEG6, ó PEG2+6 con TCEP y se PEGila con PEG de 5kd ("5") ó de 43 kD ("43") después de la remoción del reductor ("R"). PEG2+6 también se PEGila con PEG de 12, 22 y 33 kD. Se corrieron muestras con SDS-PAGE de Tris-glicina al 6 % y se tiñeron con coomassie para proteínas en el anticuerpo de cadena pesada o izquierda (H) o cadena ligera (L) . "U" es material no procesado que contiene tanto H como L. Las bandas PEGiladas se resaltan por puntos. Figura 6d. PEGilación de FVIII de longitud completa tipo silvestre (KG-2) con PEG2 como un control. Gel izquierdo teñido con tinción de coomassie para proteínas y gel derecho con yodo para PEG. "BDD U" es material de BDD no procesado que contiene tanto H como L. Las bandas PEGiladas se resaltan por puntos. Figura 7. Escisión por trombina de PEG2 PEGilado. La mitad N-terminal del dominio A2 se colorea en azul y la mitad C-terminal en verde, con el epítopo de anticuerpo R8B12 resaltado en verde oscuro (modelo de FVIII derecho) . Se trataron PEG2 (senda 1) y PEG2 PEGilado de 22 kD (senda 2) con trombina (sendas 3 y 4, respectivamente) y luego se corrieron en un gel de Tris-acetato al 7% (Invitrogen) y se tiñeron con el anticuerpo R8B12. Cada senda contiene aproximadamente 50 ng de FVIII. Figura 8. Escisión con trombina de FVIII de longitud completa, tipo silvestre, PEGilada (KG-2) . "S" = material KG-2 de inicio. "R" = KG-2 reducido y reductor removido. "P" = "R" PEGilado con PEG de 43 kD. "Puro" = "P" purificado de PEG de exceso. "L" = cadena ligera. Las bandas PEGiladas se resaltan por puntos. Figura 9. Tinción con yodo de PEG2 PEGilado. El PEG2 PEGilado de 22 ó 43 kD se corrió en un gel de TrisGlicina al 6 % y se tiñó con el anticuerpo FVIII R8B12 (sendas 1 y 2) o yodo (sendas 3 y 4) . Las dos tinciones se arreglaron de acuerdo a sus sendas de marcador de peso molecular. Las sendas 1 y 2 contienen cada una aproximadamente 30 ng de FVIII en tanto que las sendas 3 y 4 contienen aproximadamente 2 µg. Figuras 10a y 10b. Análisis de espectrometría de masas MALDI de PEG2 PEGilado y no PEGilado. Se realizó la espectrometría de masas MALDI en PEG2 (Figura 10a) o PEG2 PEGilado de 22 kD (Figura 10b) . En la PEGilación, el pico de cadena pesada (H) de PEG2 se redujo en su mayor parte y apareció un nuevo pico (H+PEG) , centrado a 111 kD (PEG de 22 kD + cadena pesada de 89 kD) . El pico de cadena derecha (L) no PEGilado, se espera que esté centrado a 100 kD (PEG de 22 kD + cadena ligera de 83 kD) se detecta. Figuras lia y 11b. Espectrometría de masas MALDI de PEG2 PEGilado y no PEGilado después de la escisión con trombina. Figura 12. Análisis por espectrometría de masas MALDI de PEG6 PEGilado antes y después de la escisión con trombina . Figura 13. El perfil de absorción UV a 280 nm de PEG2 PEGilado purificado en columna de exclusión de tamaño. Figura 14. El perfil de absorción UV a 280 nm de PEG6 PEGilado y no PEGilado purificado en columna de intercambio catiónico. Figura 15. El perfil de absorción UV a 280 nm de PEG6 PEGilado y no PEGilado purificado en columna de exclusión de tamaño. Figura 16. Actividad de proteína PEGilada se compara a actividad de la proteína no PEGilada como se mide por un ensayo cromogénico y un ensayo de coagulación. El FVIII purificado de longitud completa se representa como KG-2. El por ciento de actividad reportado se determinó al dividir el valor de la muestra tratada con PEG después de la reducción y la remoción del reductor por aquél de la muestra tratada con control de amortiguador tomando en consideración el rendimiento de PEGilación. Figura 17. Estudio de PK de conejo de PEG2 PEGilado en comparación a PEG2. Figura 18. Estudio de PK de conejo de PEG2 PEGilado en comparación a BDD y PEG2. Los valores P son comparaciones entre PEG2 PEGilado y BDD. Figura 19. Estudio de PK de conejo de PEG6 PEGilado en comparación a BDD y PEG6. Figura 20. Estudio de PK de conejo de FVIII de longitud completa ("fl") tipo silvestre PEGilado en comparación a FVIII fl no modificado. Figura 21. Estudio de PK de ratón hemofílico de PEG6 PEGilado en comparación a PEG6 y BDD. Figura 22. Estudio de PK de ratón normal de PEG2 PEGilado de 22 y 43 kD en comparación a BDD. Figura 23. Estudio de PK de ratón normal de PEG2 PEGilado de 22 kD en comparación a BDD, curso de tiempo completo. Figura 24. El histograma de recuperación de factor VIII de ratón hemofílico (BDD) que representa una valoración farmacocinética (PK) de la vida media de dos especies de factor VIII de BDD en un ensayo de ratón hemofílico. Figura 25. Estudio de laceración de riñon de ratón hemofílico de PEG2 PEGilado de 22 kD en comparación a BDD. Los ratones tratados con vehículos tienen una pérdida sanguínea de 25 Ul/g de peso corporal. Figura 26. Actividad cromogénica de PEG2 PEGilado y BDD en la presencia de cantidades crecientes de anticuerpos de FVIII. Se denota el epítopo de anticuerpo en paréntesis. Figura 27. Actividad cromogénica de PEG PEGilado en la presencia de cantidades crecientes de los anticuerpos mAB 413 de FVIII. Figura 28. Actividad cromogénica de BDD, PEG2 PEGilado de 43 kD, PEG6 PEGilado de 33 kD, y PEG2+6 diPEGilado de 33 kD en la presencia de plasma humano derivado de pacientes que han desarrollado inhibidores a FVIII . El título de inhibidor y la fecha de recolección de sangre se señalan en la parte superior. Los dos paneles superiores incluyen datos recolectados en dilución de plasma de paciente de 5 a 405 veces. El panel izquierdo inferior enfoca a una dilución de 1:15 veces para plasma HRF-828 de paciente. El panel derecho superior confirma que los 0.064 iU/mL usados para cada muestra de FVIII en los dos paneles superiores no fue una dosis de saturación. Figura 29. Método de detección de PEGilación y validación. El panel superior muestra una representación esquemática de la detección de PEGilación de muteína de PEG expresada de manera momentánea. El panel de fondo muestra un análisis Western de productos PEGilados usando un anticuerpo específico de cadena pesada ( "H" ) (izquierda) o un anticuerpo específico de cadena ligera ( "L" ) (derecha) . Las bandas PEGiladas se resaltan por puntos . "U" es material no procesado que contiene tanto H como L. Figura 30. Detección de PEGilación de PEG15-17. El análisis Western de productos PEGilados usando anticuerpos específicos de cadena pesada ( "H" ) (R8B12 y 58.12) o anticuerpos específicos de cadena ligera ( "L" ) (C7F7 y GM) . Las 3 muteínas son selectivas para la cadena pesada, con eficiencia de PEGilación relativa de PEG15-PEG16>PEG17. Las bandas PEGiladas se resaltan por puntos . "U" es material no procesado que contiene tanto H como L. Figura 31 . Gel que muestra la PEGilación de PEG2+14 como una función de la concentración de reductor . Se trató PEG2 +14 con 67 a 670 uM de TCEP durante 30 minutos a 4°C . El reductor se removió por columna giratoria seguido por PEGilación con un PEG de 12 kD. Las cadenas pesadas y ligeras de FVIII se resaltan por "H" y "L'J respectivamente. Los dos puntos señalan las cadenas pesada y ligera PEGiladas . Figura 32 . Espectros de masa no enrollados de PEG2+14 tratado con 67 a 670 uM de TCEP seguido por remoción redundante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento que se pueden unir covalentemente polipéptidos que tienen actividad de FVIII en un sitio predefinido a un polímero biocompatible que no es en una amina N-terminal , y que estos polipéptidos retienen sustancialmente su actividad coagulante . Adicionalmente , estos conjugados de polipéptido tienen tiempo de circulación mej orado y antigenicidad reducida . Los conjugados de la invención son ventaj osos con respecto a los conjugados de la técnica anterior que tienen uniones de polímero aleatorias a FVIII o uniones en una N-terminal . La unión dirigida al sitio permite diseñar modificaciones que eviten las regiones requeridas para la actividad biológica y de esta manera mantener actividad sustancial de FVTII . También se permite el diseño para unir polímeros para bloquear la unión a sitios conprendidos en la depuración de FVIII . La unión dirigida al sitio también permite un producto uniforme en lugar de los conjugados heterogéneos producidos en la técnica por acoplamiento aleatorio de polímeros . Al evitar la unión en una amina N-terminal de la cadena ligera, los conjugados de la presente invención evitan la posible pérdida de actividad de la unión de un ligando a un sitio activo del polipéptido de FVIII . La región N-terminal de la cadena ligera se cree que está comprendida en asociación del factor vWF a FVIII, que es una asociación estabilizadora en la circulación.

Definiciones Polímero biocompatible . Un polímero biocompatible incluye óxidos de polialquileno tal como sin limitación polietilenglicol ( PEG) , dextranos , ácidos colomínicos u otros polímeros basados en carbohidratos, polímeros de aminoácidos, derivados de biotina, alcohol polivinílico (PVA) , policarboxilatos, polivinilpirrolidona, anhídrido de ácido polietilen-co-maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-málico, polioxazolina, poliacriloilmorfolina, heparina, albúmina, celulosa, hidrolisatos de quitosán, almidones tal como hidroxietil-almidones, e hidroxipropil-almidones, glicógeno, azarosas y derivados de los mismos, goma de guar, pululano, inulina, goma de xantano, carrageenan, pectina, hidrolisados de ácido algínico, otros biopolímeros y equivalentes de los mismos. Se prefiere polietilenglicol y se prefiere aún más metoxipolietilenglicol (mPEG) . Otros compuestos útiles de polialquilenglicol son polipropilenglicoles (PPG) , polibutilenglicoles (PBG) , éteres de PEG-glicidilo (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG) , polietilenglicoles ramificados, polietilenglicoles lineales, polietilenglicoles bifurcados y polietilenglicoles de múltiples brazos o "súper ramificados" (estrella-PEG) . Polietilenglicol (PEG) . "PEG" y "polietilenglicol" como se usa en la presente son indistintos e incluyen cualquier poli (óxido de etileno) soluble en agua. Típicamente, los PEG para el uso de acuerdo con la invención comprenden la siguiente estructura " -- (OCHCH2)n-- " en donde (n) es 2 a 4000. Como se usa en la presente, PEG también incluye " --CH2CH2--0 (CH2CH20) n -- CH2CH2--" y " -- (OCH2CH2) n0-- ", dependiendo de sí o no se han desplazado los oxígenos terminales. A todo lo largo de la especificación de las reivindicaciones, se debe recordar que el término "PEG" incluye estructuras que tienen varios grupos terminales o "de remate de extremo", tal como sin limitación un grupo hidroxilo o C?_2oalcoxi . El término "PEG" también significa un polímero que contiene una mayoría, es decir, más de 50 %, de subunidades de repetición -OCH2CH2--. Con respecto a las formas específicas, el PEG puede tomar cualquier número de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías tal como ramificadas, lineales, bifurcadas y multifuncionales . PEGilación. La PEGilación es un proceso por el cual un polietilenglicol (PEG) se enlaza covalentemente a la molécula tal como una proteína. Grupo funcional activado o activo. Cuando un grupo funcional tal como un polímero biocompatible se describe como activado, el grupo funcional reacciona fácilmente con un electrófilo o un nucleófilo en otra molécula. FVIII suprimido del dominio B (BDD) . Como se usa en la presente, BDD se caracteriza por tener la secuencia de aminoácidos que contiene una supresión de casi los 14 aminoácidos del dominio B de FVIII. Los primeros 4 aminoácidos del dominio B (SFSQ, SEQ ID NO : 1) se enlazan a los 10 últimos residuos del dominio B (NPPVLKRHQR, SEQ ID NO: 2). (Lind, P. et al. 1985, Eur. J. Biochem. 232, págs. 19-27) . El BDD usado en la presente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 3. FVIII. El Factor VIII de coagulación sanguínea (FVIII) es una glicoproteína sintetizada y liberada en la corriente sanguínea por el hígado. En la sangre en circulación, se une al factor de von Willebrand (vWF, también conocido como el antígeno relacionado al factor VIII) para formar un complejo estable. En la activación por trombina, se disocia del complejo para interactuar con otros factores de coagulación en la cascada de coagulación, que conduce eventualmente a la formación de un trombo. El FVIII humano de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, aunque son posibles variantes alélicas. Polipéptido de factor VIII funcional. Como se usa en la presente, el polipéptido de factor VIII funcional denota un polipéptido funcional o combinación de polipéptidos que son capaces, in vivo o in vitro, de corregir deficiencias del factor VIII humano, caracterizado, por ejemplo, por hemofilia A. El factor VIII tiene múltiples formas de degradación o procesadas en el estado natural. Éstas se derivan proteolíticamente de un precursor, una proteína de cadena, como se demuestra en la presente. Un polipéptido de factor VIII funcional incluye esta proteína de cadena individual y también proporciona estos varios productos de degradación que tienen la actividad biológica de corregir la deficiencia del factor VIII humano. Existen igualmente variaciones alélicas. Los polipéptidos del factor VIII funcionales incluyen todas estas variaciones alélicas, versiones glicosiladas, modificaciones y fragmentos que dan por resultado derivados del factor VIII en tanto que contengan el segmento funcional del factor VIII humano y la actividad funcional esencial característica del factor VIII humano, permanece sin afectar en especie. Aquéllos derivados del factor VIII que poseen la actividad funcional necesaria se pueden identificar fácilmente por pruebas in vitro directas descritas en la presente. Adicionalmente, el polipéptido del factor VIII funcional es capaz de catalizar la conversión del factor X a Xa en la presencia del factor IXa, calcio y fosfolípido, así como de corregir el defecto de coagulación en plasma derivado de individuos afectados con hemofilia A. De la descripción de la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano y las regiones funcionales en la presente, los fragmentos que se pueden derivar mediante el corte por encima de restricción del ADN o degradación proteolítica u otra de la proteína del factor VIII humano serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. FIX. Como se usa en la presente, FIX significa factor IX de coagulación, que también se conoce como el factor IX de coagulación humana, o componente de tromboplastina plasmático. FX. Como se usa en la presente, FX significa factor X de coagulación, que también se conoce por los nombres del factor X de coagulación humana y por el factor de Stuart-Prower de epónimo . Farmacocinética. "Farmacocinética" ("PK") es un término usado para describir las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y eliminación de un fármaco en un cuerpo. Una mejora a la farmacocinética de un fármaco significa una mejora en aquéllas características que hacen al fármaco más efectivo in vivo como un agente terapéutico, especialmente su duración útil en el cuerpo. Muteína. Una muteína es una proteína genéticamente manejada que surge como resultado de una mutación inducida en laboratorio a una proteína o polipéptido. Proteína. Como se usa en la presente, proteína y polipéptido son sinónimos. Receptor de depuración de FVIII. Un receptor de depuración de FVIII como se usa en la presente significa una región de receptor en un polipéptido de FVIII funcional que se une o asocia con una o más moléculas diferentes para dar por resultado la depuración de FVIII de la circulación. Los receptores de depuración del factor VIII incluyen sin limitación las regiones de la molécula de FVIII que se unen a LRP, receptor de LDL y/o HSPG.

Análisis Se contempla que cualquier polipéptido de factor VIII funcional se puede mutar en un sitio predeterminado y luego unir covalentemente en ese sitio a un polímero biocompatible de acuerdo a los métodos de la invención. Los polipéptidos útiles incluyen, sin limitación, factor VIII de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO 4: y FVIII de BDD que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3. Se prefiere FVIII de BDD. El polímero biocompatible usado en los conjugados de la invención puede ser cualquiera de los polímeros analizados anteriormente. El polímero biocompatible se selecciona para proporcionar la mejora deseada en la farmacocinética. Por ejemplo, la identidad, tamaño y estructura del polímero se selecciona para mejorar la vida media en circulación del polipéptido que tiene actividad de FVIII o disminuye la antigenicidad del polipéptido sin una disminución inaceptable en la actividad. De manera preferente, el polímero comprende PEG, y de manera aún más preferente tiene al menos 50 % de su peso molecular como PEG. En una modalidad, el polímero es un polietilenglicol terminalmente rematado con una porción de remate de extremo tal como hidroxilo, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido. Aún más preferidos son los polímeros que comprenden metoxipolietilenglicol. Aún más preferidos son los polímeros que comprenden metoxipolietilenglicol que tiene un intervalo de tamaños de 3 kD a 100 kD, y de manera más preferente de 5 kD a 64 kD ó de 5 kD a 43 kD. De manera preferente, el polímero tiene una porción reactiva. Por ejemplo, en una modalidad, el polímero tiene una porción reactiva de sulfhidrilo que puede reaccionar con una cisteína libre en un polipéptido de factor VIII funcional para formar un enlace covalente. Estas porciones reactivas de sulfhidrilo incluyen porciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, S-piridilo o maleimida. Se prefiere una porción de maleimida. En una modalidad, el polímero es lineal y tiene un "remate" en un término que no es fuertemente reactivo hacia los sulfhidrilos (tal como metoxi) y una porción reactiva de sulfhidrilo en el otro término. En una modalidad preferida, el conjugado comprende PEG-maleimida y tiene un intervalo de tamaño de 5 kD a 64 kD. Se proporciona guía adicional para seleccionar polímeros biocompatibles útiles en los ejemplos que siguen. La mutación dirigida al sitio de una secuencia de nucleótido que codifica para el polipéptido que tiene actividad FVIII puede presentarse por cualquier método conocido en la técnica. Los métodos preferidos incluyen mutagénesis para introducir un codón de cisteína en el sitio elegido para unión covalente del polímero. Esto se puede lograr usando un equipo de mutagénesis dirigido al sitio comercialmente disponible tal como el equipo de mutagénesis dirigida al sitio Stratagene cQuickChange1^, el equipo de mutagénesis dirigida al sitio de Clontech Transformer número K1600-1, el sistema de mutagénesis dirigida al sitio de Invitrogen GenTaylor número 12397014, el quipo de sistema de mutagénesis in vitro de Promega Altered Sites II número Q6210, o el equipo de mutagénesis por PCR de Takara Mirus Bio LA número TAK RR016. Los conjugados de la invención se pueden preparar al reemplazar primero el codón por uno o más aminoácidos en la superficie del polipéptido de FVIII funcional con un codón para cisteína, produciendo la muteína de cisteína en un sistema de expresión recombinante, haciendo reaccionar la muteína con un reactivo de polímero específico de cisteína, y purificando la muteína. En este sistema, la adición de un polímero en el sitio de cisteína se puede lograr a través de una funcionalidad activa de maleimida en el polímero. Los ejemplos de esta tecnología se proporcionan infra. La cantidad de polímero reactivo de sulfhidrilo usada debe ser al menos equimolar a la cantidad molar de cisteínas que se van a derivatizar y de manera preferente está presente en exceso. De manera preferente, se usa al menos un exceso molar de 5 veces de polímero reactivo de sulfhidrilo, y de manera aún más preferente se usa al menos un exceso de diez veces de este polímero. Otras condiciones útiles para la unión covalente están dentro de la habilidad de aquéllos expertos en la técnica. En los ejemplos que siguen, las muteínas se llaman de una manera convencional en la técnica. La convención para nombrar mutantes se basa en la secuencia de aminoácidos para el factor VIII maduro de longitud completa como se proporciona en SEQ ID NO: 4. Como una proteína segregada, FVIII contiene una secuencia de señal que se escinde proteolíticamente durante el proceso de traducción. Después de la remoción de la secuencia de señal de 19 aminoácidos, el primer aminoácido del producto de FVIII segregado es una alanina . Como es convencional y se usa en la presente, cuando se refiere a aminoácidos mutados en FVIII de BDD, el aminoácido mutado se designa por su posición en la secuencia de FVIII de longitud completa. Por ejemplo, la muteína de PEG6 analizada más adelante se designa K1808C debido a que cambia la lisina (K) en la posición análoga a 1808 en la secuencia de longitud completa a cisteína (C) . El sitio predefinido para la unión covalente del polímero se selecciona mejor de los sitios expuestos en la superficie del polipéptido que no se proporcionan en la actividad de FVIII o que comprenden en otros mecanismos que estabilizan FVIII in vivo, tal como la unión a vWF . Estos sitios también se seleccionan mejor de aquéllos sitios conocidos como que están comprendidos en los mecanismos por los cuales el FVIII se desactiva o depura de la circulación. Se analiza en detalle más adelante la selección de estos sitios. Los sitios preferidos incluyen un residuo de aminoácido en o cerca de un sitio de unión para (a) proteína relacionada a receptor de lipoproteína de baja densidad, (b) un proteoglicano de sulfato de heparina, (c) receptor de lipoproteína de baja densidad y/o (d) anticuerpos inhibitorios de factor VIII. Por "en o cerca de un sitio de unión" se quiere decir un residuo que está suficientemente cerca a un sitio de unión tal que la unión covalente de un polímero biocompatible al sitio dará por resultado impedimento estérico del sitio de unión. Este sitio se espera que esté dentro de 20 Á de un sitio de unión, a manera de ejemplo. En una modalidad de la invención, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente al polipéptido de factor VIII funcional en un residuo de aminoácido en o cerca de (a) un receptor de depuración del factor VIII como se define supra, (b) un sitio de unión para una proteasa capaz de la degradación del factor VIII y/o (c) un sitio de unión para anticuerpos inhibitorios del factor VIII. La proteasa puede ser proteína C activada (APC) . En otra modalidad, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido del factor VIII funcional tal que la unión de la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no se conjuga, y de manera preferente más de dos veces menos. En una modalidad, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido de factor VIII funcional tal que la unión de los proteoglicanos de sulfato de heparina al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no se conjuga, y de manera preferente es más de dos veces menos . En una modalidad adicional, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido del factor VIII funcional tal que la unión de los anticuerpos inhibitorios del factor VIII al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no está conjugado, de manera preferente más de dos veces menos que la unión al polipéptido cuando no está conjugado. En otra modalidad, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido del factor VIII funcional tal que la unión del receptor de lipoproteína de baja densidad al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no está conjugado, de manera preferente más de dos veces menos. En otra modalidad, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido de factor VIII funcional tal que una proteasa plasmática degrada al polipéptido menos que cuando el polipéptido no está conjugado. En una modalidad adicional, la degradación del polipéptido por la proteasa plasmática es más de dos veces menos que la degradación del polipéptido cuando no está conjugado como se mide bajo las mismas condiciones durante el mismo periodo de tiempo. Se pueden determinar LRP, receptor de LDL, o la afinidad de unión de HSPG para FVIII usando tecnología de resonancia de plasmón superficial (Biacore) . Por ejemplo, el FVIII se puede revestir directamente o de manera indirecta a través de un anticuerpo de FVIII a un chip Biacore"11, y se pueden hacer pasar concentraciones variables de LRP sobre el chip para medir tanto la constante de asociación y la constante de disociación de la interacción (Bovenschen N. et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(11), págs. 9370-7). La relación de las dos constantes da una medida de la afinidad. Se desearía una disminución de dos veces, de manera preferente de cinco veces, de manera más preferente de diez veces, y de manera aún más preferente de 30 veces en la afinidad en la PEGilación. La degradación de un FVIII por la proteasa APC se puede medir por cualquiera de los métodos conocidos por aquéllos expertos en la técnica.

En una modalidad, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente al polipéptido en una o más de las posiciones 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 y 2284 de aminoácidos del factor VIII. En otra modalidad, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente al polipéptido en una o más posiciones 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 y 2284 de aminoácidos del factor VIII, y (1) la unión del conjugado a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad es menor que la unión del polipéptido no conjugado a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad; (2) la unión del conjugado al receptor de lipoproteína de baja densidad es menor que la unión del polipéptido no conjugado al receptor de lipoproteína de baja densidad; o (3) la unión del conjugado tanto a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad como al receptor de lipoproteína de baja densidad es menor que la unión del polipéptido no conjugado a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad y al receptor de lipoproteína de baja densidad. En una modalidad adicional, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente al polipéptido en una o más de las posiciones 377, 378, 468, 491, 504, 556 y 711 de aminoácidos del factor VIII y la unión del conjugado a proteoglicano de sulfato de heparina es menor que la unión del polipéptido no conjugado a proteoglicano de sulfato de heparina. En una modalidad adicional, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente al polipéptido en una más de las posiciones 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 y 2284 de aminoácidos del factor VIII y el conjugado tiene menos unión a los anticuerpos inhibitorios del factor VIII que el polipéptido no conjugado. En una modalidad adicional, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente al polipéptido en una o más de las posiciones 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 y 2284 de aminoácidos del factor VIII, y de manera preferente en una o más posiciones 377, 378, 468, 491, 504, 556 y 711 y el conjugado tiene menos degradación de una proteasa plasmática capaz de degradación de factor VIII lo que hace el polipéptido no conjugado. Más preferido, la proteasa plasmática es proteína C activada. En una modalidad adicional, el polímero biocompatible se enlaza covalentemente al factor VIII suprimido de dominio B en la posición 129, 491, 1804, y/o 1808 de aminoácidos, y de manera más preferente en 491 ó 1808. En una modalidad adicional, el polímero biocompatible se une al polipéptido en la posición 1804 de aminoácido de factor VIII y comprende polietilenglicol. De manera preferente, uno o más sitios predefinidos para la unión del polímero biocompatible se controlan por la mutación de cisteína específica del sitio. Uno o más sitios, de manera preferente uno o dos, en el polipéptido de factor VIII funcional pueden ser los sitios predefinidos para la unión del polímero. En modalidades particulares, el polipéptido está mono-PEGilado o diPEGilado. La invención también se refiere a un método para la preparación del conjugado que comprende mutar una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de factor VIII funcional para sustituir una secuencia codificante para un residuo de cisteína en un sitio predefinido; expresar la secuencia de nucleótidos mutada para producir una muteína mejorada en cisteína; purificar la muteína; hacer reaccionar la muteína con el polímero biocompatible que se ha activado para reaccionar con polipéptidos en residuos de cisteína sólo sustancialmente reducidos tal que se forme el conjugado; y purificar el conjugado. En otra modalidad, la invención proporciona un método para la PEGilación dirigida al sitio de una muteína de factor VIII que comprende: (a) expresar una muteína de factor VIII dirigida al sitio en donde la muteína tiene un reemplazo de cisteína para un residuo de aminoácido en la superficie expuesta de la muteína de factor VIII y que la cisteína está rematada; (b) poner en contacto la muteína de cisteína con un reductor bajo condiciones para reducir suavemente la muteína de cisteína y para liberar el remate; (c) remover el remate y el reductor de la muteína de cisteína; y (d) al menos aproximadamente 5 minutos, y de manera preferente al menos 15 minutos, de manera aún más preferente al menos 30 minutos después de la remoción del reductor, tratar la muteína de cisteína con PEG que comprende una porción de acoplamiento de sulfhidrilo bajo condiciones tal que se produzca la muteína de factor VIII PEGilada. La porción de acoplamiento de sulfhidrilo del PEG se selecciona del grupo que consiste de porciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, S-piridilo y maleimida, de manera preferente maleimida. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para administración parenteral que comprenden cantidades terapéuticamente efectivas de los conjugados de la invención y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes farmacéuticamente aceptables son sustancias que se pueden adicionar al ingrediente activo para ayudar a formular o estabilizar la preparación y no provocan efectos toxicológicos adversos significativos al paciente. Los ejemplos de estos adyuvantes son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica e incluyen agua, azúcares tal como maltosa o sacarosa, albúmina, sales, etc. Otros adyuvantes se describen por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad efectiva del conjugado de la presente junto con una cantidad adecuada de vehículo a fin de preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para administración efectiva al hospedador. Por ejemplo, el conjugado se puede administrar de manera parenteral al sujeto que sufren de hemofilia A, a una dosis que puede variar con la severidad del episodio de sangrado. La dosis promedio administrada intravenosamente está en el intervalo de 40 unidades por kilogramo para indicaciones pre-operativas, 15 a 20 unidades por kilogramo para hemorragia menor, y de 20 a 40 unidades por kilogramo administradas durante un periodo de 8 horas para una dosis de mantenimiento. En una modalidad, el método inventivo comprende reemplazar uno o más aminoácidos de BDD superficiales con una cisteína, producir la muteína de cisteína en un sistema de expresión de mamífero, reducir una cisteína que se ha rematado durante la expresión con cisteína del medio de crecimiento, remover el reductor para permitir que se reformen los disulfuros de BDD, y hacer reaccionar con un reactivo de polímero biocompatible específico de cisteína, tal como PEG-maleimida . Los ejemplos de estos reactivos son PEG-maleimida con tamaños de PEG tal como 5, 22 ó 43 kD, disponible de Nektar Therapeutics of San Carlos, CA bajo los números de catálogo de Néctar 2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000 Da, 2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 kD, 2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40 kD, respectivamente, ó 12 a 33 kD disponible de NOF Corporation, Tokyo, Japón bajo el número de catálogo NOF Sunbright ME-120MA y Sunbright ME-300MA, respectivamente. El producto PEGilado se purifica usando cromatografía de intercambio iónico para remover PEG sin reaccionar y usando cromatografía de exclusión de tamaño para remover BDD sin reaccionar. Este método se puede usar para identificar y proteger selectivamente cualquier interacción desfavorable con FVIII tal como depuración mediada por el receptor, unión a anticuerpo inhibitorio, y degradación por enzimas proteolíticas. Se señala que el reactivo de PEG suministrado por Néctar ó NOF como 5 kD probado como 6 kD en nuestro laboratorio, y de manera similar el reactivo de PEG suministrado como 20 kD lineal probado como 22 kD, que se suministró como 40 kD probado como 43 kD y que se suministró como 60 kD probado como 64 kD en nuestro laboratorio. Para evitar confusión, se usa el peso molecular como se prueba en nuestro laboratorio en el análisis en la presente, excepto para el PEG de kD, que se reportó como 5 kD como lo identificó el fabricante. Además de las mutaciones de cisteína en las posiciones 491 y 1808 de BDD (analizadas anteriormente) , se mutaron las posiciones 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, y 1804 a cisteína para permitir potencialmente el bloqueo de la unión de LRP en la PEGilación. También se mutaron las posiciones 377, 378 y 556 a cisteína para permitir el bloqueo tanto de la unión de LRP como de HSPG en la PEGilación. Se seleccionaron las posiciones 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091 y 2284 para estar igualmente espaciadas en BDD de modo que la PEGilación dirigida al sitio con PEG grandes (>40 kD) en estas posiciones junto con la PEGilación en los sitios de glicosilación nativos (41, 239 y 2118) y los sitios de unión de LRP deban cubrir completamente la superficie de BDD e identificar un nuevo mecanismo de depuración para BDD. En una modalidad, el medio de cultivo celular contiene cisteína que "remata" los residuos de cisteína en la muteína al formar enlaces de disulfuro. En la preparación del conjugado, la muteína de cisteína producida en el sistema recombinante se remata con una cisteína del medio y este remate se remueve por reducción suave que libera el remate antes de adicionar el reactivo de polímero específico de cisteína. También se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para la mutación específica del sitio de FVIII, como será evidente para un experto en la técnica.

Ejemplos Análisis de la relación estructura de una actividad para FVIII. El FVIII y FVIII de BDD son moléculas complejas muy grandes con muchos sitios diferentes comprendidos en las reacciones biológicas. Los intentos anteriores para modificarlos covalentemente para mejorar las propiedades farmacocinéticas tuvieron resultados mezclados. Fue sorprendente que las moléculas se pudieran mutar de manera específica y luego un polímero adicionado de una manera específica al sitio. Adicionalmente, los resultados de las propiedades farmacocinéticas mejoradas y la actividad retenida pueden ser sorprendentes también, dados los problemas con los conjugados poliméricos anteriores que provocan adición no específica y actividad reducida. En una modalidad, la invención se refiere a mutagénesis dirigida al sitio usando ligandos específicos de cisteína tal como PEG-maleimida. Un BDD no mutado no tiene ninguna cisteína disponible para reaccionar con un PEG-maleimida, de este modo sólo la posición de cisteína mutada será el sitio de PEGilación. De manera más específica, FVIII de BDD tiene 19 cisteínas, 16 de las cuales forman disulfuros y las otras 3 de las cuales son cisteínas libres (McMullen et al., 1995, Protein Sci. 4, págs. 740-746). El modelo estructural de BDD sugiere que las 3 cisteínas libres están enterradas (Stoliova-McPhie et al., 2002, Blood 99, págs. 1215-1223). Debido a que las cisteínas oxidadas no se pueden PEGilar por PEG-maleimidas, las 16 cisteínas que forman disulfuros en BDD no se pueden PEGilar sin ser primero reducidas. En base a los modelos estructurales de BDD, las 3 cisteínas libres en BDD no se pueden PEGilar sin desnaturalizar primero la proteína para exponer estas cisteínas al reactivo de PEG. De esta manera, no parece ser factible lograr la PEGilación específica de BDD por PEGilación en los residuos nativos de cisteína sin alterar dramáticamente la estructura de BDD, que destruirá más probablemente su función. Se desconoce el estado de reducción-oxidación de las 4 cisteínas en el dominio B de FVIII de longitud completa. Puede ser posible la PEGilación de las 4 cisteínas en el dominio B si no forman disulfuros y se exponen a la superficie. Sin embargo, debido a que FVIII de longitud completa y BDD tienen un perfil farmacocinética (PK) similar y vidas medias similares in vivo (Gruppo et al., 2003, Haemophilia 9, págs. 251-260), la PEGilación del dominio B es improbable que dé por resultado vida media plasmática mejorada a menos que el PEG intente proteger también las regiones que no son del dominio B. Para determinar el sitio predefinido en un polipéptido que tiene actividad de FVIII para la unión del polímero que retendrá la actividad del factor VIII y mejorará la farmacocinética, se presentan las siguientes guías en base a FVIII de BDD. Se deben dirigir las modificaciones hacia la depuración, inactivación y mecanismos inmunogénicos tal como sitios de unión a LRP, HSPG, APC, anticuerpos inhibitorios. Stoilova-McPhie, S. et al., 2002, Blood 99(4), págs. 1215-23 muestra la estructura de BDD. Por ejemplo, para prolongar la vida media, se puede introducir un PEG individual en un sitio específico en o cerca de los sitios de unión de LRP en los residuos 484-509 de A2 y los residuos 1811-1818 de A3. La introducción del PEG volumétrico en estos sitios debe interrumpir la capacidad del FVIII para unirse a LRP y reducir la depuración de FVIII de la circulación. Se cree también que para prolongar la vida media sin afectar significativamente la actividad que un PEG se puede introducir en el residuo 1648, que es en la unión del dominio B y el dominio A3 en la molécula de longitud completa y en el ligador I de 14 aminoácidos, el BDD entre los dominios A2 y A3. La especificidad de la PEGilación se puede lograr al manejar los residuos individuales de cisteína de los dominios A2 ó A3 usando técnicas de mutagénesis de ADN recombinante seguido por PEGilación específica del sitio de la cisteína introducida con un reactivo de PEG específico de cisteína tal como PEG-maleimida. Otra ventaja de PEGilar en 484-509 y 1811-1818 es que estos dos epítopos se presentan dos de las tres principales clases de sitios antigénicos inhibitorios en pacientes. Para lograr el efecto máximo de vida media en circulación mejorada y reducción de la respuesta inmunogénica, tanto los sitios de unión a LRP de A2 y A3 se pueden PEGilar para producir un producto diPEGilado. Se debe señalar que la PEGilación dentro de la región 1811-1818 puede conducir a pérdida significativa de actividad puesto que también está comprendida esta región en la unión a FIX. La PEGilación dirigida al sitio con 558-565 debe abolir la unión de HSPG, pero también reduce la actividad puesto que esta región también se une a FIX. Se pueden PEGilar sitios de superficie adicionales para identificar un nuevo mecanismo de depuración de FVIII. La PEGilación del dominio A2 puede ofrecer ventaja adicional ya que el dominio A2 se disocia de FVIII en la activación y se remueve presumiblemente de la circulación más rápido que el resto de la molécula de FVIII debido a su menor tamaño. A2 PEGilado, por otra parte, puede ser suficientemente grande para escapar a la depuración por el riñon y tener una vida media plasmática comparable al resto de FVIII y de esta manera puede reconstituir el FVIII activado in vivo. Identificación de sitios de PEGilación en las regiones A2 y A3. Se seleccionaron cinco posiciones (Y487, L491, K496, L504 y Q468 que corresponden a las posiciones de PEG1-5) en o cerca de la región de unión a LRP de A2 como ejemplos para la PEGilación dirigida al sitio en base a la alta exposición superficial y la dirección hacia fuera de su trayectoria Ca a Cß. Adicionalmente, estos residuos están aproximadamente equidistantes entre sí en la estructura tridimensional de la molécula, de modo que conjuntamente pueden representar esta región completa. Se seleccionaron ocho posiciones (1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804 que corresponden a PEG6-14) en o cerca de la región de unión a LRP de A3 putativa como ejemplos para la PEGilación dirigida al sitio. El PEG6 (K1808) está adyacente a 1811-1818 y el sitio de glicosilación N-enlazado natural en 1810. La PEGilación de la posición 1810 (PEG7) reemplazará el azúcar con un PEG. La mutación en la posición T1812 de PEG8 también abolirá el sitio de glicosilación. Aunque la posición de PEG9 (K1813) se predijo que apunta hacia dentro, se seleccionó en caso de que no sea correcto el modelo de estructura. El PEG10 (Y1815) es un aminoácido hidrófobo voluminoso dentro del asa de unión a LRP, y puede ser un residuo de interacción crítico puesto que se encuentran típicamente aminoácidos hidrófobos en el centro de las interacciones proteína-proteína. Debido a que la región 1811-1818 se ha reportado que está comprendida tanto en la unión a LRP como FIX, la PEGilación con esta asa se pensó posiblemente que dé por resultado actividad reducida. De esta manera, PEG11-PEG14 (1795, 1796, 1803, 1804) se diseñaron para estar cerca del asa 1811-1818 pero no dentro del asa, de modo que se pueda disociar la unión de LRP y FIX con diferentes tamaños de PEG. Para bloquear ambos sitios de unión a LRP de manera simultánea, se puede generar doble PEGilación en, por ejemplo, la posición PEG2 y PEG6. Puesto que se ha mostrado que la región 558-565 se une tanto a HSPG como FIX, no se diseñaron sitios dentro de esta región. En cambio, PEG15-PEG17 (377, 378 y 556) se diseñaron entre las regiones de unión a LRP y HSPG de A2 de modo que un PEG unido puede interferir ambas interacciones e interrumpir posibles interacciones entre estos. Los sitios adicionales que están expuestos en la superficie y que apuntan hacia fuera también se pueden seleccionar dentro o cerca de las regiones de unión a HPSG. Para identificar nuevos mecanismos de depuración, el FVIII se puede PEGilar de manera sistemática. Además de PEGl-17, los tres sitios de glicosilación naturales diferentes, específicamente, N41, N239 y N2118 que corresponden a PEG18-20 se pueden usar como puntos de unión para la PEGilación puesto que deben estar expuestos en la superficie. Las áreas superficiales dentro de un radio de 20 ángstrom desde los átomos Cß de PEG2 , PEG6 , y los cuatro sitios de glicosilación se correlacionaron sobre el modelo de BDD además de los sitios de interacción funcionales para vWF, FIX, FX, fosfolípido y trombina.

Entonces se seleccionaron PEG21-29 que corresponden a Y81, F129, K422, K523 , K570, N1864, T1911, Q2091, y Q2294 en base a su capacidad para cubrir casi la superficie de BDD restante completa con un radio de 20 ángstrom de cada uno de sus átomos Cß. Estas posiciones también se seleccionaron debido a que estaban completamente expuestas, apuntando hacia fuera, y lejos de las cisteínas naturales para reducir al mínimo las posibles formaciones incorrectas de disulfuro. El radio de 20 ángstrom se elige debido a que se espera que un PEG grande, tal como un PBG ramificado de 64 kD, tenga el potencial de cubrir una esfera con aproximadamente un radio de 20 ángstra . La PEGilación de PEG21-29 junto con PEG2 y PEG6 y los sitios de glicosilación PEG18, 19 y 20 es probable que protejan casi la superficie no funcional completa de FVTII . Las posiciones de PEGilación que conducen a propiedades mej oradas tal como perfil de PK mej orado , mayor estabilidad, o inmunogenicidad reducida se pueden combinar para generar un producto multi-PEGilado con propiedades aumentadas al máximo . Se diseñaron PEG30 y PEG31 al remover los disulfuros expuestos en el dominio A2 y A3 , respectivamente . PEG30 ó C630A, deben liberar su compañero de disulfuro C711 para la PEGilación . Igualmente , PEG31 , C1899A deben permitir que C1903 sea PEGilado . Mutagénesis . Los sustratos para la PEGilación dirigida al sitio de FVIII se pueden generar al introducir un codón de cisteína en el sitio elegido para la PEGilación . El equipo de mutagénesis dirigida al sitio Stratagene cQuickChamgeMR II se usó para hacer todos los mutantes de PEG (equipo de Stratagene 200523 de Stratagene Corporation, La Jolla, CA) . El método de mutagénesis dirigida al sitio de cQuikChangeMR se realizó usando ADN-polimerasa de PfuTurbo"* y un ciclador de temperatura. Se alargaron dos cebadores de oligonucleótidos complementarios, que contienen la mutación deseada, usando PfuTurbo, que no desplazará los cebadores. Se usa como una plantilla ADNds que contiene el gen FVIII tipo silvestre. Después de múltiples ciclos de alargamiento, el producto se digirió con Dpnl-endonucleasa, que es específica para ADN metilado. El ADN recién sintetizado, que contiene la mutación, no se metila, en tanto que se metila el ADN tipo silvestre de origen. El ADN digerido entonces se usa para transformar células súper competentes XL-1 Blue. La eficacia de mutagénesis es casi 80 %. Las reacciones de mutagénesis se realizaron en ya sea pSK207+BDD C2.6 ó pSK207+BDD (Figuras la y lb) . La mutagénesis exitosa se confirmó por secuenciación de ADN y fragmentos apropiados, que contienen la mutación, que transfirieron a la estructura de FVIII en el vector de expresión de mamífero pSS207+BDD. Después de la transferencia, todas las mutaciones se confirmaron nuevamente por secuencia. Para las muteínas PEG 6, 7, 8, 9 y 10 de A3, se realizó la mutagénesis en el vector pSK207+BDD C2.6. Después de que se confirme por secuenciación, el fragmento mutante, Kpnl/Pme se subclonó en pSK207+BDD. La muteína de BDD entonces se subclonó en el vector de expresión pSS207+BDD. Para las muteínas PEG 11, 12, 13, 14 de A3 , la mutagénesis se realizó directamente en el vector pSK207+BDD y entonces se subclonaron el BDD mutante confirmado por secuencia en pSS207+BDD. Para las muteínas PEG 1, 2, 3, 4, 5 de A2 , la mutagénesis se realizó en el vector pSK207+BDD C2.6. El mutante confirmado por secuencia se subclonó en pSK207+BDD y luego a pSS207+BDD.

Los cebadores (sólo se representan homosentido) usados para la mutagénesis se listan para cada reacción: PEG1, Y487C: GATGTCCGTCCTTTGTGCTCAAGGAGATTACCA (SEQ ID NO: 5) PEG2, L491C: TTGTATTCAAGGAGATGCCCAAAAGGTGTAAAAC (SEQ ID NO: 6) PEG3, F496C: TTACCAAAAGGTGTATGCCATTTGAAGGATTTTC (SEQ ID NO: 7) PEG4, L504C: AAGGATTTTCCAATTTGCCCAGGAGAAATATTC (SEQ ID NO: 8) PEG5, Q468C: GATTATATTTAAGAATTGCGCAAGCAGACCATAT (SEQ ID NO: 9) PEG6, K1808C: TAGAAAAAACTTTGTCTGCCCTAATGAAACCAAAAC (SEQ ID NO: 10) PEG7, N1810C: AACTTTGTCAAGCCTTGCGAAACCAAAACTTAC (SEQ ID NO: 11) PEG8, T1812C: GTCAAGCCTAATGAATGCAAAACTTACTTTTGGA (SEQ ID NO: 12) PEG9, K1813C: CAAGCCTAATGAAACCTGCACTTACTTTTGGAAAG (SEQ ID NO: 13) PEG10 , Yl815C : CTAATGAAACCAAAACTTGCTTTTGGAAAGTGCAAC (SEQ ID NO: 14) PEG11, D1795C: ATTTCTTATGAGGAATGCCAGAGGCAAGGAGCA (SEQ ID NO: 15) PEG12, Q1796C: TCTTATGAGGAAGATTGCAGGCAAGGAGCAGAA (SEQ ID NO: 16) PEG13, R1803C: CAAGGAGCAGAACCTTGCAAAAACTTTGTCAAGCCT (SEQ ID NO: 17) PEG14 , Kl804C : GGAGCAGAACCTAGATGCAACTTTGTCAAGCCT (SEQ ID NO: 18) PEG15, K377C: CGCTCAGTTGCCAAGTGTCATCCTAAAACTTGG (SEQ ID NO: 19) PEG16 , H378C : TCAGTTGCCAAGAAGTGTCCTAAAACTTGGGTA (SEQ ID NO: 20) PEG17, K556C: CTCCTCATCTGCTACTGCGAATCTGTAGATCAA (SEQ ID NO: 21) PEG18, N41C: CAAAATCTTTTCCATTCTGCACCTCAGTCGTGTAC (SEQ ID NO: 22) PEG19 , N239C : GTCAATGGTTATGTATGCAGGTCTCTGCCAGGT (SEQ ID NO: 23) PEG2 O , N2118C : CAGACTTATCGAGGATGTTCCACTGGAACCTTA (SEQ ID NO: 24) PEG21, Y81C: ATCCAGGCTGAGGTTTGTGATACAGTGGTCATT (SEQ ID NO: 25) PEG22, F129C: GAAGATGATAAAGTCTGTCCTGGTGGAAGCCAT (SEQ ID NO: 26) PEG23, K422C: CAGCGGATTGGTAGGTGTTACAAAAAAGTCCGA (SEQ ID NO: 27) PEG24 , K523C : GAAGATGGGCCAACTTGCTCAGATCCTCGGTGC (SEQ ID NO: 28) PEG25 , K57OC : CAGATAATGTCAGACTGCAGGAATGTCATCCTG (SEQ ID NO: 29) PEG26, N1864C: CACACTAACACACTGTGTCCTGCTCATGGGAGA (SEQ ID NO: 30) PEG27, T1911C, CAGATGGAAGATCCCTGCTTTAAAGAGAATTAT (SEQ ID NO: 31) PEG28 , Q2091C : ACCCAGGGTGCCCGTTGCAAGTTCTCCAGCCTC (SEQ ID NO: 32) PEG29 , Q2284C : AAAGTAAAGGTTTTTTGCGGAAATCAAGACTCC (SEQ ID NO: 33) PEG30 , C630A : TTGCAGTTGTCAGTTGCTTTGCATGAGGTGGCA (SEQ ID NO: 34) PEG31, C1899A: AATATGGAAAGAAACGCTAGGGCTCCCTGCAAT (SEQ ID NO: 35) Expresión de muteína. Después de la inserción en un vector que confiere resistencia a Higromicina B, las muteínas de PEG se transfectaron en células HKBll (patente US 6,136,599) vueltas complejas con el Reactivo de Transfección 293 Fectina (Invitrogen Corp. número de catálogo 12347-019) mediante las instrucciones del fabricante. Se valoró la expresión de FVIII a los tres días después de la transfección por el ensayo cromogénico Coatest (Chromogenix Corp. número de catálogo 821033, ver Ejemplo 12, ensayo cromogénico) (Tabla 1) . Las células transfectadas entonces se colocaron bajo presión selectiva con 50 µg/mL de Hyg B en un medio de crecimiento complementado con FBS al 5 % . Cuando aparecieron las colonias resistentes a Hyg B, se recolectaron manualmente y se seleccionaron para la expresión de FVIII por el ensayo cromogénico Coatest. Las células estables que expresan FVIII entonces se adaptaron a un medio que contiene complemento de HPPS . Las células se expandieron y se sembraron a 1 x 106 células/mL en matraces de agitación con medio fresco. El fluido de cultivo de tejido (TCF) , recolectado 3 días después, se usó para purificación de las muteínas de FVIII de BDD. La actividad de FVIII del TCF se valoró por Coatest (Tabla 1) .

Resumen de Títulos de Muteína de PEG Tabla 1. Nivel de expresión de muteínas de PEG de transfecciones transientes y estables Purificación de muteínas. Al recolectar el sobrenadante de cultivo celular que contiene la proteína de FVIII de muteína segregada, el sobrenadante se filtra a través de un filtro de membrana de 0.2 micrones para remover cualquier célula restante. El sobrenadante entonces se concentra ya sea por ultrafiltración o intercambio aniónico. Entonces se aplica a una columna de inmunoafinidad donde se remueven los componentes del medio de cultivo celular y la mayoría de las impurezas proteicas de las células hospedadoras. El producto eluido de la columna de inmunoafinidad entonces se intercambia con amortiguador por diafiltración en un amortiguador de formulación que contiene sacarosa y se congela. Se valoró el rendimiento y la recuperación de la proteína a través de una columna de anticuerpo monoclonal de FVIII por ensayo cromogénico. Las muestras de carga, flujo de paso, varias fracciones eluidas, tiras y el producto eluido diafiltrado de una corrida de cromatografía se valoraron para la actividad de FVIII (Tabla 2) . La Tabla 2 muestra la recuperación de la muteína PEG2 de una columna de anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos son anticuerpos C7F7. El por ciento de recuperación en la Tabla 2 se determina por el ensayo cromogénico. El rendimiento final fue 73 %. Mostrada en la Figura 2 está una gráfica de la absorbancia UV a 280 nm con respecto al tiempo para la proteína de PEG2 purificada sobre una columna de cromatografía de anticuerpo monoclonal de FVIII. La cromatografía se realizó usando un sistema de cromatografía AKTA R Explorer 100 de Amersham Bioscience. El instrumento emplea un monitor visible a UV de múltiples longitudes de onda y una celda de flujo de 2 mm. La muteína PEG2 se eluye de la columna en la presencia de alta concentración de sal y el pico de elución se indica tanto por la absorbancia a 280 nm como por el ensayo de actividad de FVIII. Tabla 2. Recuperación de la muteína PEG2 de la columna de anticuerpo monoclonal de FVIII PEGilación. El FVIII nativo de longitud completa o BDD no se puede PEGilar por PEG específicos de cisteína sin la reducción y desnaturalización a una relación de PEG: proteína de exceso de más de 100 veces (datos no mostrados) , que confirman la hipótesis basada en el modelo de estructura de BDD que todas las cisteínas nativas forman disulfuros o están cargadas dentro de FVIII. Las cisteínas-muteínas de FVIII expresadas y purificadas usando los protocolos normales listados anteriormente no se pueden PEGilar con un reactivo de PEG-maleimida específico de cisteína, presumiblemente debido a que la cisteína de FVIII introducida está "rematada" por reacción con grupos sulfhidrilo tal como cisteína y ß-mercaptoetanol presente en el medio de crecimiento celular.

Esta cuestión se puede resolver potencialmente al eliminar las cisteínas y el ß-mercaptoetanol del medio de cultivo, pero esto puede conducir a una menor producción de FVIII y no impediría que los sulfhidrilos liberados por las células bloqueen la cisteína de FVIII. Introducida. En otro aspecto de la invención, se desarrolló un método de tres pasos para permitir la PEGilación específica del sitio de FVIII (Figura 3) . En el paso 1, la cisteína-muteína de FVIII purificada a aproximadamente 1 µM se reduce suavemente con reductores tal como Tris (2-carboxietil) fosfina 0.7 mM (TCEP) o ditiotreitol 0.07 mM (DTT) durante 30 minutos a 4°C para liberar el "remate". En el paso 2, el reductor se remueve junto con el "remate" por un método de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) tal como se corre la muestra a través de una columna giratoria (BioRad1^) para permitir que los disulfuros de FVIII se reformen en tanto que dejan libre y reducida la cisteína introducida. En el paso 3, al menos 30 minutos después de la remoción del reductor, la cisteína-muteína de VIII liberada se trata con un exceso molar de al menos 10 veces de PEG-maleimida con tamaños que varían desde 5 a 64 kD (Néctar Therapeutics y N.O.F. Corporation) durante al menos 1 hora a 4°C. Este método produce un perfil de producto altamente consistente con datos reproducibles para docenas de reacciones repetidas por diferentes individuos. Debido a que no se puede poner a escala el método de columna giratoria para la remoción de TCEP, se seleccionó la cromatografía de desalineación por filtración en gel. Sin embargo, al probar este método usando una muestra larga de TCEP, se mostró que el TCEP eluyó a niveles medibles el hueco de la columna y no justo en la fracción de sal como se esperaría de una molécula con su bajo peso molecular. Los análisis por Transferencia Western mostraron PEGilación de fondos significativamente probablemente debida a remoción incompleta de TCEP. Entre tanto, experimentos separados muestran que el material purificado de C7F7 se puede purificar de manera significativa adicionalmente de otras impurezas de proteína usando un medio de cromatografía de intercambio aniónico combinado con un gradiente de sal. Entonces se decidió reducir el material de C7F7 con TCEP como se describe anteriormente y luego procesar el material sobre la columna de intercambio aniónico. Debido a la diferencia de carga, la proteína de FVIII se retendrá en tanto que el TCEP fluirá a través de la columna y no se retendrá. Al mismo tiempo durante la elución de sal de gradiente, la proteína de FVIII se purificará de la mayoría de las impurezas restantes de proteína. Esto significa que la PEGilación que se presenta al último será teóricamente más homogénea con material de inicio más puro. Sin embargo, al probar con una muestra larga de TCEP, se mostró que se encontraron niveles medibles de TCEP eluyendo en el gradiente con el FVIII. Por lo tanto, se decidió implementar cromatografía de desalineación por filtración en gel después de la cromatografía de intercambio aniónico de modo que estos dos pasos cuando se usaron en secuencia dieron por resultado remoción completa de TCEP y eliminación de PEGilación no específica. Análisis de PEGilación por SDS-PAGE y transferencia Western. El producto PEGilado se puede analizar por electroforesis en un gel de TrisGlicina-SDS-poliacrilamida al 6 %, reductor (Invitrogen) . Después de la electroforesis, el gen se puede teñir con Azul de Coomassie para identificar todas las proteínas o someter a un protocolo normal de Transferencia Western al identificar el patrón de PEGilación en diferentes regiones de FVIII. La tinción de la transferencia con un anticuerpo de R8B12 o C7F7 monoclonal de ratón formulado contra la región C-terminal de la cadena pesada de FVIII o la región N-terminal de la cadena ligera de VIII, respectivamente, debe identificar la PEGilación de las cadenas respectivas. La tinción con el anticuerpo 413 contra la región 484-509 de FVIII determinará si la PEGilación es en realidad específica del sitio o no para muteínas tal como PEG1-4. Igualmente, la tinción con el anticuerpo CLB-CAg A que reconoce la región 1801-1823 de FVIII determinará si la PEGilación es específica del sitio o no para muteínas tal como PEG6-10.

La PEGilación de PEG2 (L491C) se mostró que es selectiva para la cadena pesada con respecto a la cadena ligera y particularmente selectiva para la región 484-509 (Figura 4) en tanto que se mostró que PEG6 (K1808C) es selectiva para la cadena ligera con respecto a la cadena pesada (Figura 5) . Para el estudio representado en la Figura 4, la muteína PEG2 (sendas 1 y 8) se reduce con TCEP seguido por remoción de TCEP (sendas 2 y 9) y tratamiento con PEG-maleimida de 5, 12, 22, 33 ó 43 kD (sendas 3-7 y 10-14). El FVIII no PEGilado corre como bandas de cadena pesada (H) y ligera (L) no procesadas (H+L) y procesadas. Las tres bandas son detectables en el gel teñido con Azul de Coomassie (derecha inferior) en tanto que la Tinción Western con los anticuerpos específicos de la cadena revela sólo la cadena no procesada y la cadena correspondiente. Usando tinción con R8B12 (izquierda superior), la banda de cadena pesada (H) se reduce dramáticamente en intensidad cuando se trata PEG2 con PEG-maleimida y se crea una nueva banda que corre más alta que la banda H de origen proporcional al tamaño del PEG. Usando tinción con C7F7 (izquierda inferior) , las bandas de cadena ligera (L) (múltiples bandas debido a la glicosilación heterogénea) no cambian de intensidad. La banda H+L no procesada para ambas tinciones se cambian debido a que la cadena H es parte del FVIII no procesado. La tinción por coomassie también confirma mucho más PEGilación de la cadena pesada, es decir, reducción de la intensidad de banda ancha H, que la cadena ligera. Finalmente, las bandas PEGiladas pierden relativamente más intensidad en la tinción del anticuerpo 413 (derecha superior) que la tinción de R8B12 de una manera dependiente del tamaño de PEG presumiblemente debido a la PEGilación específica del sitio de 491, que bloquea la unión del anticuerpo 413 a 484-509. Las cantidades de FVIII cargadas por senda son aproximadamente 30 ng para los dos geles izquierdos, aproximadamente 1000 ng para el gel derecho superior, y aproximadamente 2000 ng para el gel derecho inferior. La reducción seguida por remoción del reductor no cambia la migración de FVIII (senda 1 vs 2 y 8 vs 9 ) . La adición de PEG de 22 kD a PEG2 bloquea la unión del anticuerpo 413, consistente con la PEGilación específica en la posición 491 (Figura 4, gel derecho superior) . Esto también sugiere que PEG2 PEGilada tendrá menor inmunogenicidad en el hombre debido a que se ha mostrado que el anticuerpo 413 comparte el mismo epítopo como los anticuerpos inhibitorios A2 humanos (Scandella et al., 1992, Thromb. Haemost. 67, págs. 665-71). Para el estudio representado en la Figura 5, la muteína PEG6 se reduce con TCEP seguido por remoción de TCEP (sendas 1 y 6) y tratamiento con PEG-maleimida de 5 , 12, 22 ó 33 kD (sendas 2-5 y 7-10). El FVIII no PEGilado corre como bandas de cadena pesada (H) y ligera (L) procesadas y no procesadas (H+L) . Debido a que la mutación de PEG6 (K1808) reside en la cadena ligera, se detectó PEGilación sólo en la cadena ligera y no en la cadena pesada. La cantidad de FVIII cargada por senda es aproximadamente 100 ng para el gel izquierdo y aproximadamente 30 ng para el gel derecho. El BDD que se corrió como un control no muestra ninguna PEGilación significativa en el tratamiento con un exceso molar mayor de 100 veces de PEG-maleimida aún después de la reducción y procedimiento de remoción de reductor descrito anteriormente (Figura 6a) . También se aplicó el mismo método a PEG4 y PEG5 (Figura 6a) . En comparación a PEG2 , estas muteínas no se PEGilaron tan eficientemente, pero fueron selectivas para la cadena pesada similar a PEG2 (L491C) . La eficiencia de PEGilación de PEG6 (K1808C) es relativamente baja, quizá debido a que está muy cerca al sitio de glicosilación N-enlazado en N1810, se puede bloquear la PEGilación en la posición 1808. De esta manera, se diseñó PEG7 (N1810C) para remover el sitio de glicosilación nativo en 1810. PEG7 muestra eficiencia de PEGilación mejorada en comparación a PEG6 en comparación frente a frente (Figura 6b) . De manera similar, PEG15 muestra una eficiencia de PEGilación ligeramente mejor que PEG2. PEG2+6, un doble mutante de BDD, se puede PEGilar tanto en las cadenas pesadas como ligeras puesto que PEG2 es una mutación de cisteína de cadena pesada en tanto que PEG6 es una mutación de cadena ligera (Figura 6c) . Este método también se aplicó a FVIII de longitud completa tipo silvestre (Figura 6d) . Se detectó la PEGilación para el fragmento más grande de la cadena pesada que incluye Al, A2 y la mayoría del dominio B. El patrón de PEGilación sugiere la monoPEGilación y que sólo hay una cisteína individual PEGilada. Análisis de PEGilación por escisión de trombina y transferencia Western. El producto PEGilado se puede tratar con trombina (40 IU/ug de FVIII) a 37°C durante 30 minutos. La trombina usada también contiene APC como un contaminante. La escisión con trombina generó los dominios Al de 50 kD y A2 de 43 kD de la cadena pesada en tanto que la escisión con APC dividió el dominio A2 adicionalmente en los fragmentos de 21 y 22 kD (Figura 7) . La tinción con el anticuerpo R8B12, que reconoce el C-término de la cadena pesada, identificará sólo el dominio A2 intacto y el fragmento C-terminal de 21 kD (FVIII 562-740) . De esta manera, si la PEGilación de PEG2 fue específica para la posición 491, el dominio A2 de 43 kD se debe PEGilar pero no el fragmento C-terminal de 21 kD. Esto se confirmó en realidad por la transferencia Western para la PEG2 PEGilada de 22 kD mostrada en la Figura 7. De esta manera, por eliminación, se ha localizado la PEGilación de PEG2 al fragmento de 22 kD N-terminal (FVIII 373-561) del dominio A2. Puesto que PEG-maleimida es completamente selectiva para cisteínas a pH 6.8 y sólo las cisteínas nativas de FVIII dentro de 373-561 vienen de un disulfuro cargado entre 528 y 554, PEG2 es muy probable que se PEGile en la cisteína introducida en la posición 491. La tinción Western de la PEG2 PEGilada tratada con trombina con un anticuerpo N-terminal de cadena pesada de FVIII no mostró PEGilación del dominio Al (datos no mostrados) . La PEGilación selectiva de PEG2 usando el método de escisión con trombina también se ha confirmado para PEG de 5 , 12, 33 y 43 kD (datos no mostrados) . La escisión con trombina de FVIII de longitud completa, tipo silvestre, PEGilado mostró que sólo el dominio B está PEGilado (Figura 8) . Análisis de PEGilación por tinción con yodo. Para confirmar que las bandas recién creadas en la tinción con Azul de Coomassie y Western fueron en realidad bandas PEGiladas, se usó la tinción de bario-yodo, que es específica para PEG, (Figura 9) . La PEG2 PEGilada se corrió en un gel de TrisGlicina al 6 % (Invitrogen) y se tiñó con el anticuerpo de cadena pesada R8B12 o una solución de bario-yodo (Lee et al. Pharm Dev Technol. 1999 4: 269-275). Las bandas PEGiladas correspondieron entre las dos tinciones usando el marcador de peso molecular para alinearlas, confirmando de esta manera la PEGilación de cadena pesada de FVIII.

Análisis de PEGilación por espectroscopia de masa-Maldi . Para confirmar la PEGilación del dominio A2 en la cadena pesada, la muestra de rFVIII, antes y después de la PEGilación se analizó por espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida con matriz (MALDI). Las muestras se mezclaron y cristalizaron en la placa objetivo MALDI con una matriz de ácido sinapínico en acetonitrilo al 30 %, 0.1 % de TFA. Entonces se analizaron en un espectrómetro Voyager DE-PRO en modo lineal positivo. Los resultados, mostrados en las Figuras 10a y 10b, mostraron la cadena ligera de PEG2 centrada a 83 kD y la cadena pesada (HC) a 89 kD. El espectro adquirido para la muestra PEGilada mostró una caída en el pico de HC y que se forma un nuevo pico, centrado en 111 kD. Esto confirma la PEGilación de la cadena pesada. No se observa cadena ligera PEGilada (a 105 kD) por arriba del límite de detección. Las muestras entonces se sometieron ambas a digestión con trombina a 20 unidades de trombina/mg de FVIII a 37°C durante 30 minutos, después de la detección de la concentración de FVIII por análisis de aminoácidos (Commonwealth Biotechnologies, Inc.). La cadena pesada se escindió en una fracción N-terminal de 46 kD (Al) y una fracción (A2) de 43 kD. El espectro MALDI ha adquirido para la muestra PEGilada (Figuras lia y 11b) muestran la pérdida del pico de 43 kD y el desarrollo de un nuevo pico de 65 kD, debido al dominio A2 PEGilado. La PEGilación del LC nuevamente no se observa por arriba del límite de detección. Estos resultados confirman nuevamente la PEGilación del dominio A2 de FVIII. El mismo análisis se aplicó a PEG6 PEGilada, confirmando la PEGilación del fragmento A3C1C2 de cadena ligera (Figura 12).

Medición de actividad Ensayo de coagulación. El método de prueba de FVIIIrC de coagulación es un ensayo de una etapa basado en el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) . FVIII actúa como un cofactor en la presencia del Factor IXa, calcio y fosfolípido en la conversión enzimática de Factor X a Xa. En este ensayo, las muestras de prueba diluida se incuban a 37 °C con una mezcla de sustrato de plasma deficiente en FVIII y el reactivo de aPTT. Se adiciona cloruro de calcio a la mezcla incubada y se inicia la coagulación. Existe una relación inversa entre el tiempo (segundos) tomado para que se forme un coágulo y el logaritmo de la concentración de FVIII:C. Los niveles de actividad para muestras desconocidas se interpolan al comparar los tiempos de coagulación de varias diluciones del material de prueba con una curva construida de una serie de diluciones de material estándar de actividad conocida y se reportan en unidades internacionales por mL (IU/mL) .

Ensayo cromogénico. El método de ensayo cromogénico consiste de dos pasos consecutivos donde la intensidad de color es proporcional a la actividad de FVIII. En el primer paso, el Factor X se activa a FXa por FlXa con su co-factor, FVIIIa, en la presencia de cantidades óptimas de iones de calcio y fosfolípidos. Las cantidades en exceso del Factor X están presentes tal que la velocidad de activación del Factor X es sólo dependiente de la cantidad de FVIII. En el segundo paso, el Factor Xa hidroliza el sustrato cromogénico para producir un cromóforo y la intensidad de color se lee fotométricamente a 405 nm. La potencia de un desconocido se calcula y se verifica la validez del ensayo con el método estadístico pendiente-relación. La actividad se reporta en unidades internacionales por mL (IU/mL) . La asa 1811-1818 está comprendida en la unión a FIX, pero no se ha determinado la importancia de las posiciones individuales dentro de esta asa. Las muteínas PEG7-10 exhiben actividad cromogénica específica casi idéntica con relación a FVIII nativo (Tabla 3) . La Tabla 3 muestra el por ciento de actividad específica (S.A.) de las muteínas de PEG y PEG2 o PEG6 PEGiladas con relación a BDD. Se determinó S.A. al dividir la actividad cromogénica, de coagulación, o de unión a vWF por el valor total de ELISA de antígeno (TAE) . La S.A. de las muteínas PEGiladas entonces se dividió por al S.A. de BDD (8 IU/ug cromogénica, 5 IU/ug de coagulación y 1 de vWF/TAE) y se multiplica por 100 para obtener el por ciento de S.A. listado en la Tabla 3 bajo los encabezados cromogénico, coagulación y vWF/TAE. Tabla 3. Por ciento de actividad específica (S.A.) de muteínas de PEG y PEG2 y PEG6 PEGiladas con relación a BDD Como se usa en la Tabla 3, "EG2 red" es la muteína PEG2 que se ha tratado con reductor seguido por la remoción del reductor. Este procedimiento de reducción no altera de manera significativa las tres actividades funcionales de FVIII. La muteína PEG2 conjugada a los PEG que varían de 5 kD (PEG2-5 kD) a 43 kD (PEG2-43 kD) no pierde una cantidad significativa de actividad cra ogénica, pero tiene una actividad de coagulación en su mayor parte menor conforme se incrementa el tamaño de PEG más allá de 5 kD. También puede haber una reducción modesta en la unión de vWF para PEG2 PEGilada de tamaño más grande. ELISA de antígeno total (TAE) . El FVIII se captura en una placa de microtítulo que se ha revestido con un anticuerpo FVIII policlonal. El FVIII -unido se detecta con un anticuerpo rFVIII policlonal biotinilado y conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano (HRP) . El complejo de peroxidasa-estreptavidina produce una reacción de color en la adición del sustrato de treta etilbenzidina (IMB) . Las concentraciones de la muestra se interpolan de una curva normal usando cuatro modelos de ajuste de parámetros. Los resultados de FVTII se reportan en µg/mL. ELISA de unión a vWF. El FVIII se deja unir a vWF en Plasma Hemofílico Severo en solución. El complejo de FVIII-vWF entonces se captura en una placa de microtítulo que se ha revestido con un anticuerpo monoclonal específica a vWF. El FVIII -unido al vWF se detecta con un anticuerpo policlonal FVIII y un conjugado anti-conejo de peroxidasa de rábano. El complejo de anticuerpo conjugado a peroxidasa produce una reacción de color en adición del sustrato. Las concentraciones de muestra se interpolan de una curva normal usando un modelo de ajuste de cuatro parámetros. Los resultados de unión de FVIII se reportan en µg/mL. No hay impacto significativo en ninguna de las actividades en la PEGilación, que serían consistentes con la PEGilación en el dominio B. Tabla 4. Actividad específica (S.A.) de FVIII de longitud completa tipo silvestre (KG-2) antes y después de la PEGilación con diferentes tamaños de PEG.

Purificación de FVIII PEGilado por cromatografía de intercambio iónico. El FVIII PEGilado se aplica a una columna de intercambio aniónico o columna de intercambio catiónico donde la proteína se une a la columna en tanto que cualquier reactivo de PEG libre en exceso no se une y se remueve en el flujo de paso. La muteína de PEG entonces se eluye de la columna con un gradiente de cloruro de sodio. Un gel de Bis-Tris al 4-12 % teñido con bario-yodo de las fracciones de carga, de flujo de paso y de gradiente se usó para confirmar que las fracciones de elución de la columna tienen muteína PEGilada. Purificación de FVIII PEGilado por cromatografía de exclusión de tamaño. Las fracciones de intercambio aniónico que contienen la mayoría de la muteína PEG2 se mezclan y concentran por ultrafiltración luego se aplican a una columna de exclusión de tamaño. La columna entonces se eluye usando el amortiguador de formulación. Debido a la diferencia en el tamaño y forma de la proteína que depende de si el PEG se une a la proteína, esta columna separa la muteína PEG2 PEGilada de aquella de cualquier PEG2 restante, que no está PEGilada. Las fracciones de FVIII de muteína PEGilada se mezclan en base a que tengan la mayor actividad FVIII luego se congelan para estudios subsiguientes en animales y caracterización molecular. La Figura 13 compara la elusión de la muteína de PEG2 no PEGilada versus aquella de la muteína PEG2 PEGilada de 43 kD. La PEG2 PEGilada se eluye de manera significativamente mejor, lo que indica un incremento en su tamaño y forma del PEG covalentemente unido . Con las muteínas tal como PEG6 que muestran menores eficiencias de PEGilación, es decir, menos de 50 %, el esquema de purificación más efectivo produce producto mono-PEGilado altamente puro para ser usado en una combinación de cromatografía de intercambio catiónico seguida por cromatografía de exclusión de tamaño. Por ejemplo, con PEG6, la cromatografía de intercambio catiónico purifica la PEG6 PEGilada (fracción de elución temprana, Figura 14) de la mayoría de la PEG6 no PEGilada (fracción de elución tardía, Figura 15). La cromatografía de exclusión de tamaño entonces pule la proteína PEGilada (fracción de elución temprana, Figura 15) del resto de la proteína no PEGilada (fracción de elución tardía, Figura 15) . Efecto de tamaño de PEG en la actividad. Para probar si los tamaños de PEG tienen un efecto tanto en las actividades de coagulación como cromogénicas de FVIII en la PEGilación, se redujeron FVIII purificado de longitud completa, PEG2 , PEG6 y PEG14 por TCEP seguido por remoción de reductor y reacción con un control de amortiguador o PEG que varían desde 6 kD a 64 kD. El FVIII PEGilado resultante se valoró directamente sin remoción de PEG en exceso o FVIII no PEGilado. Los experimentos de control mostraron que el PEG en exceso no tiene efecto en la actividad FVIII. La Figura 16 muestra los resultados de este estudio. El FVIII purificado de longitud completa se representa como KG-2 en la Figura 16. El por ciento de actividad reportado en la Figura 16 se determinó al dividir el valor de la muestra tratada con PEG después de la reducción y remoción redundante por aquella de la muestra tratada con control de amortiguador tomando en consideración el rendimiento de PEGilación. Los rendimientos de PEGilación fueron comparables a través de todos los PEG para cualquier construcción determinada de FVIII. Son aproximadamente 80 % para KG-2, PEG2 y PEG14 y aproximadamente 40 % para PEG6. Por ejemplo, el control de amortiguador de PEG14 tratado tiene una actividad de coagulación de 6.8 IU/mL vs 3.2 IU/mL para la muestra de PEG14 PEGilada de 12 kD. Sin embargo, la eficiencia de PEGilación fue aproximadamente 80 %, significando que los 3.2 IU/mL representan la actividad de agregado de aproximadamente 80 % PEGilado y aproximadamente 20 % no PEGilado. Asumiendo que la muestra no PEGilada tiene la misma actividad como el PEG14 tratado con control de amortiguador, el por ciento de actividad de PEG14 no PEGilada para la PEGilada resulta ser 34 % igual a (3.2-6.8 veces, 20 %) / (6.8 veces, 80 %) . La PEGilación dentro del dominio A2 ó A3 en la posición PEG2 , PEG6 o PEG14 de BDD conduce a pérdidas dramáticas de actividad de coagulación cuando el tamaño de PEG se incrementa más allá de 6 kD. Sin embargo, la PEGilación dentro del dominio B en una cisteína de dominio B nativo del FVIII de longitud completa no tiene efecto en la actividad de coagulación. De manera interesante, la actividad cromogénica no se afecta para todas las construcciones PEGiladas. Esto puede ser debido a las diferencias de ensayo. Es posible que el sustrato peptídico cromogénico pequeño tenga un acceso más fácil al complejo de FVIII/FIX/FX PEGilado que el sustrato de proteína más grande usado en el ensayo de coagulación. De manera alternativa, PEG puede afectar la activación de la muteína. Esto se detectará más fácilmente por un ensayo de coagulación de una etapa que por el ensayo cromogénico de dos etapas . Para confirmar la observación de los efectos de PEG en la actividad de coagulación de PEG2 , 6 y 14, varias construcciones PEGiladas se purificaron de PEG en exceso y no PEGiladas. Puesto que PEG no tiene ningún efecto en la actividad cromogénica, la relación de actividad cromogénica a coagulación es un buen estimado en el efecto relativo de PEG en la actividad de coagulación (Tabla 5) . Los PEG más grandes en una posición determinada tal como PEG2 y un número mayor de PEG como en el caso con la construcción PEG2+6 inducen una mayor pérdida de actividad de coagulación.

Tabla 5. Relación de cromogénico a coagulación para BDD PEGilado, purificado EG ramificado Estudio de PK de conejo. Para entender los efectos de la PEGilación en la farmacocinética (PK) de FVIII, se realizaron estudios de PK en varias especies. Se usaron conejos SPF de NZW para el estudio; 10 hembras, 5 conejos por grupo, 2 grupos (FVIII de PEG2 y PEG2 PEGilada de 22 kD) . Las muestras se diluyeron en PBS estéril con una concentración final de 100 IU/mL (unidades cromogénicas) . Cada conejo recibió una dosis de 1 mL/kg (100 IU/kg) de la prueba diluida o sustancia de control mediante vena marginal de oreja. En varios momentos después de la inyección, se retiraron muestras sanguíneas (1 mL) en una jeringa de 1 mL (cargada con 100 µl de Na-Citrato al 3.8 %) de la arteria central de la oreja en los puntos de tiempo definidos después de la dosificación. Las muestras de plasma se incubaron con anticuerpo de cadena pesada R8B12 revestido en una placa de 96 cavidades para capturar de manera específica el FVIII humano dosificado. La actividad del FVIII capturado se determinó por el ensayo cromogénico (Figura 17) . También se compararon PEG2 PEGilada y PEG6 PEGilada con BDD (Figuras 18 y 19), con muteínas PEGiladas que muestran una mejora en la recuperación plasmática en comparación a BDD. El FVIII de longitud completa tipo silvestre PEGilado no parece mostrar mucha mejora (Figura 20) . Estudio de PK de ratón. Como una segunda especie, se usaron ratones deficientes de FBI, he ofílicos o normales de ICR (Taconic. Hudson, NY) en estudios de PK. Se usaron ratones normales para el estudio, 5 ratones por grupo por punto de tiempo. Los materiales de prueba se diluyeron en amortiguador de formulación a una concentración final nominal de 25 IU/mL. A cada ratón se le pueden administrar 4 mL/kg (aproximadamente 0.1 mL de volumen total) del material de prueba diluido mediante la vena de la cola. Se retiran muestran sanguíneas (0.45 ó 0.3 mL para estudio en ratón normal o hemofílico, respectivamente) en una jeringa de 1 mL (cargada con 50 ó 30 µL de Na-Citrato al 3.8 % para estudio de ratón normal o hemofílico, respectivamente) de la vena cava inferior en el punto de tiempo indicado (un animal por muestra) . Las muestras plasmáticas se valoraron para la concentración de FVIII usando el método de ensayo cromogénico descrito anteriormente. La PEG6 PEGilada mostró mayor recuperación plasmática en comparación a BDD o PEG6 (Figura 21) . La PEG2 PEGilada mostró mayor recuperación plasmática en comparación a BDD (Figuras 22 y 23) . Tabla 6. Resumen de estudio de PK de FVIII PEGilado que muestra vidas medias en plasma en horas.

Construcción Vida media, hr Especie PEG2-PEG de 43 kD 8.0 Conejo Normal PEG6-PEG de 12 kD 8.2 Conejo Normal PEG6-PEG de 33 kD 9.6 Conejo Normal PEG6-PEG de 33 kD 17.4 Conejo Normal BDD 4.5 Ratón Normal PEG2-PEG de 22 kD 7.3 Ratón Normal PEG6-12 kD 5.3 Ratón Normal PEG14-PEG de 32i kD 7.3 Ratón Normal PEG14-PEG de 12 > kD 5.5 Ratón Normal PEG22-64 kD 9.2 Ratón Normal * Preparación inicial de PEG6 PEGilada de 33 kD con vida media de 9.6 hr en conejos no fue tan puro como preparación final que produjo 17.4 hr. Tabla 7. Recuperación plasmática de muteínas de PEG PEGiladas en ratones he of ílicos. Se reporta la mejora en veces de recuperación plasmática a las 16 horas después de la inyección en comparación al control de BDD realizado en la misma fecha. Muteína PEG Veces PEG 6 12 kD 2.9 PEG 6 33 kD 2.9 PEG 2+6 33 kD 3.3 PEG 14 33 kD 2.5 PEG 2+6 33 kD 4.4 PEG 2 + 14 33 kD 2.1 PEG22 64 kD 3.2 Recuperación de Factor VIII de ratón hemofílico (BDD) . El histograma de recuperación de Factor VIII de ratón hemofílico (BDD) mostrado en la Figura 24 representa una valoración farmacocinética (PK) de la vida media de dos especies de Factor VIII de BDD en un ensayo de ratón hemofílico. Este ensayo se diseña para medir las concentraciones en plasma tanto de Factor VIII de BDD (referido en la Figura 24 como "wt" o Factor VIII de BDD tipo silvestre) y la variante doble PEGilada de PEG 2 + 6 del Factor VIII de BDD (e identificada en otra parte de la presente como la doble variante L491C, K1808C del factor VIII de BDD) en tres puntos de tiempo después de la administración intravenosa en un modelo de ratón. En tanto que son comparables las valoraciones de PK tanto en los puntos de tiempo de 0.8 y 4 horas, la valoración de 16 horas es particularmente notable. A las 16 horas, aproximadamente cuatro veces (400 %) tanto como la variante del Factor VIII de BDD doblemente PEGilada (PEG 2+6) permaneció en el plasma de ratón 16 horas después de la administración en comparación a la molécula no PEGilada. Modelo de laceración de riñon. Para determinar si las muteínas de FVIII PEGiladas fueron eficaces en detener un sangrado en un ratón hemofílico, se empleó el modelo de laceración de riñon. Se anestesiaron ratones hemofílicos (C57/BL6 con un gen de FVIII interrumpido) bajo isofluorano y se pesaron. La vena cava inferior se expuso y se inyectaron 100 UL de ya sea solución salina o FVIII usando una aguja de calibre 31. La aguja se removió cuidadosamente y se aplicó presión en vista de la inyección durante 30-45 segundos para impedir el sangrado. Después de dos minutos, se expuso el riñon derecho y se mantuvo entre los fórceps a lo largo del eje vertical. Usando un escalpelo #15, el riñon se cortó horizontalmente a una profundidad de 3 mm. Para asegurar una profundidad uniforme de la lesión, el riñon se mantuvo ligeramente en la parte intermedia para exponer igual tejido en cualquier lado de los fórceps. La superficie expuesta del riñon se cortó a la profundidad de los fórceps. Se cuantificó la pérdida de sangre como se describe anteriormente. Se probaron diferentes dosis de FVIII en los ratones para caracterizar la relación de respuesta de dosis de FVIII en el sangrado del riñon. La PEG2 PEGilada mostró potencia comparable a BDD al reducir la pérdida sanguínea después de la lesión al riñon de ratón (Figura 25) . De esta manera, aunque la actividad de coagulación de PEG2 PEGilada es menor que aquella de BDD, este modelo de laceración de riñon muestra que la eficacia in vivo de PEG2 PEGilada no se reduce de forma medible en comparación a BDD, consistente con los datos del ensayo cromogénico. Ensayo de inhibición de anticuerpos. La adición de un polímero de alto peso molecular tal como polietilenglicol (PEG) específicamente en la posición 491 (es decir, PEG2) debe reducir la unión y sensibilidad a mAB 413, y por extensión a una gran proporción de anticuerpos inhibitorios del paciente puesto que muchos pacientes desarrollan anticuerpos inhibitorios contra el mismo epítopo de mAB 413. Para probar esto, se incubaron cantidades crecientes de mAB 413 con cantidades no saturantes (0.003 IU/mL) de BDD o PEG2 PEGilada de 43 kD y se probaron para actividad funcional en un ensayo cromogénico (Figura 26). El R8B12 , un anticuerpo no inhibidor, y el ESH4 , un anticuerpo inhibitorio que tiene como objetivo el dominio C2 se usaron como controles. La PEG2 PEGilada en realidad es más resistente a la inhibición por mAB 413 que el BDD y muestra un patrón de inhibición similar en la presencia de anticuerpos de control que no se unen cerca de la posición 491. Adicionalmente, el efecto de protección de PEG contra la inhibición de mAB 413 es dependiente del tamaño de PEG, con PEG más grandes que tienen un mayor efecto (Figura 27) . Para probar si el FVIII PEGilado es más resistente a los anticuerpos inhibidores de pacientes, se midió la actividad cromogénica en la presencia de un panel de plasma derivado de pacientes con hemofilia A quienes han desarrollado inhibidores a FVIII. De los 8 plasmas de pacientes probados, la PEG2 PEGilada de 43 kD fue más resistente a la inhibición del plasma de paciente que el BDD en 4 muestras plasmáticas de paciente. Por ejemplo, PEG2 PEGilada, P?G6 o PEG2+6 mostraron mayor actividad residual que BDD en un plasma de paciente pero no en otro plasma (Figura 28). La PEG2+6 diPEGilada parece ser más resistente que la PEG2 o PEG6 monoPEGilada . Estos resultados sugieren que las muteínas de PEG PEGiladas pueden ser más efectivas en el tratamiento de pacientes quienes desarrollan inhibidores a FVIII. Detección de PEGilación de alto rendimiento. La eficiencia de PEGilación de una muteína de PEG particular es impredecible, especialmente puesto que no hay información estructura directa de BDD. Por ejemplo, en base al modelo estructural de BDD, se predecirá si la eficiencia de PEGilación de PEG4 y PEG5 debe ser muy alta, similar a aquélla de PEG2 y PEG15 puesto que las tres posiciones están expuestas en la superficie y apuntan hacia fuera de acuerdo a la estructura. De esta manera, para usar PEG para buscar un nuevo mecanismo de depuración mediante PEGilación sistémica se requerirá que se detecten un gran número de muteínas. Para detectar rápidamente un gran número de muteínas de PEG, se ha desarrollado un nuevo método de alto rendimiento que puede probar la eficiencia de PEGilación y la actividad funcional de los productos PEGilados de muteínas transientemente transfectadas. Tan poco como 5-10 mL de muteínas de PEG transientemente expresadas con un valor cromogénico de FVIII tan bajo como 0.1-0.2 IU/mL se concentra por aproximadamente 50 veces usando el dispositivo Amicon-centra Ultra MWCO 30K de modo que la concentración de FVIII alcanza más de 1 nM, cerca del intervalo de afinidad de la interacción de anticuerpo a FVIII. La muteína de PEG concentrada (aproximadamente 300 uL) se incuba con aproximadamente 30 UL de la resina de anticuerpo de FVIII C7F7 durante la noche a 4°C, se lava, se eluye, se dializa y se reduce. El reductor se remueve y la muteína de PEG reducida se PEGilan y corren en un análisis Western como se describe anteriormente (figuras 29 y 30) . La eficiencia de PEGilación relativa de las muteínas de PEG transientemente expresadas corresponde exactamente a aquella de las muteínas de PEG purificadas. Se pueden detectar docenas de muteínas de PEG por este método en uno a dos meses. Por ejemplo, la PEG14 (BDD K1804C) tiene aproximadamente 80 % de PEGilación de cadena ligera con un PEG de 12 kD y ninguna PEGilación de cadena pesada (datos no mostrados) , consistente con la mutación K1804C localizada en la cadena ligera. La distancia C a C entre K1804 y K1808 (posición PEG6) es sólo de 8.4 ángstrom en base a la estructura de BDD, sugiriendo que la introducción de un PEG de 43 kD en esta posición tendrá mejora similar en la PK como la PEG6 PEGilada de 33 kD, con la ventaja de un mucho mayor rendimiento de PEGilación. El rendimiento relativo de PEGilación para todas las muteínas de PEG probadas se resumen en la Tabla 8. La PEGilación fue altamente selectiva para la cadena de FVTII en particular donde se introdujo la mutación de cisteína, ya que cada muteína con la cisteína en la cadena pesada sólo consigue PEGilarse en la cadena pesada en tanto que cada muteína con la cisteína en la cadena ligera consigue PEGilarse en la cadena ligera. Los números 2 a 31 de muteína representan las mutaciones de cisteína de BDD que reemplazan el aminoácido nativo en la posición listada con una cisteína. La PEG2+6 es una doble muteína de BDD donde la posición 491 y 1808 se sustituyeron con cisteínas. Al y A2 (y dominio B para KG-2, el FVEII de longitud completa) corresponden a la cadena pesada en tanto que A3, Cl y C2 corresponden a la cadena ligera. Se estimó la eficiencia de PEGilación al correr los productos PEGilados en un SDS-PAGE, comparando las intensidades de la banda PEGilada con la banda no PEGilada: +++ ~ >80 % de rendimiento de PEGilación, ++ - 30-70 % de rendimiento, + ~ 10-30 % de rendimiento, y - ~ <10 % de rendimiento. Tabla 8. Eficiencia de PEGilación para varios FVIII PEGilados Análisis de espectrometría de masa de muteínas de PEG reducidas. Para determinar la identidad del "remate" que impide la PEGilación directa de las muteínas de PEG o FVIII de longitud completa, se redujo PEG2+14 con TCEP a concentraciones que varían desde 67 uM a 670 uM. El rendimiento de PEGilación se incrementó en proporción a cantidades crecientes de TCEP (Figura 31) . Las mismas muestras también se analizaron por espectrometría de masas antes de la PEGilación (Figura 32) . A fin de tener un dominio de proteína que se puede estudiar directamente, las muestras se digirieron con trombina a una relación de 20 unidades/mg de FVIII durante 30 minutos a 37°C. La escisión con trombina produce un fragmento A2 que incluye los residuos 372 a 740 y ningún sitio ocupado de glicosilación. La muestra digerida se inyectó en un sistema de cromatografía líquida de fase inversa C4 y el eluyente de la columna se introdujo directamente en el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuádruple mediante una interfaz de electro-rociado. El espectro de masa desde bajo el pico cromatográfico que corresponde al dominio A2 se desplegó para proporcionar un valor de masa intacto. Antes de la reducción, el dominio A2 de PEG2+14 produce una masa que es 118 daltons mayor que la teóricamente prevista. Conforme se incrementa la concentración de TCEP, un nuevo pico que tiene la masa prevista precisa del dominio A2 aparece. La proporción de este nuevo pico se incrementa conforme se incrementa la concentración de TCEP. La diferencia de 118 daltons se puede justificar por la cisteinilización en el residuo Cys 491 mediante la formación de disulfuro con una cisteína (119 Da) y exactitud instrumental. De esta manera, esto muestra que las muteínas de PEG están rematadas por una cisteína, lo que impide la PEGilación directa. Todas las referencias descritas en la presente se incorporan de este modo en la presente en sus totalidades. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Conjugado que tiene actividad procoagulante de factor VIII, caracterizado porque comprende un polipéptido de factor VIII funcional enlazado covalentemente en uno o más sitios predefinidos en el polipéptido a uno o más polímeros biocompatibles, en donde el sitio predefinido no es una amina N-terminal.
2. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible comprende polietilenglicol .
3. Conjugado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polietilenglicol comprende metoxipolietilenglicol .
4. Conjugado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el metoxipolietilenglicol tiene un intervalo de tamaño de 5 kD a 64 kD.
5. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al polipéptido de factor VIII funcional en un residuo de aminoácido en o cerca a (a) un sitio de unión para un receptor de depuración de factor VIII, (b) un sitio de unión para una proteasa capaz de degradación del factor VIII y/o (c) un sitio de unión para anticuerpos inhibitorios del factor VIII.
6. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al sitio predefinido en el polipéptido de factor VIII funcional tal que la unión de la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no está conjugado.
7. Conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la unión de la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad al conjugado es más de dos veces menor que la unión al polipéptido cuando no está conjugado.
8. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido de factor VIII funcional tal que la unión de los proteoglicanos de sulfato de heparano al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no está conjugado.
9. Conjugado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la unión de proteoglicanos de sulfato de heparina al conjugado es más de dos veces menor que la unión al polipéptido cuando no está conjugado.
10. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido de factor VIII funcional tal que la unión de los anticuerpos inhibitorios del factor VIII al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no está conjugado.
11. Conjugado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la unión de los anticuerpos inhibitorios de factor VIII al conjugado es más de dos veces menor que la unión al polipéptido cuando no está conjugado.
12. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido de factor VIII funcional tal que la unión del receptor de lipoproteína de baja densidad al polipéptido es menor que al polipéptido cuando no está conjugado.
13. Conjugado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la unión del receptor de lipoproteína de baja densidad al conjugado es más de dos veces menor que la unión al polipéptido cuando no está conjugado.
14. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente en el sitio predefinido en el polipéptido de factor VIII funcional tal que una proteasa plasmática degrada el polipéptido menos que cuando el polipéptido no está conjugado.
15. Conjugado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la degradación del polipéptido por la proteasa plasmática es más de dos veces menor que la degradación del polipéptido cuando no está conjugado como se mide bajo las mismas condiciones durante el mismo periodo de tiempo.
16. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al polipéptido en una de las posiciones 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 y 2284 de aminoácidos del factor VIII.
17. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al polipéptido en una o más de las posiciones 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 y 2284 de aminoácido del factor VIII y en donde además (1) la unión del conjugado a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad es menor que la unión del polipéptido no conjugado a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad; (2) la unión del conjugado al receptor de lipoproteína de baja densidad es menor que la unión del polipéptido no conjugado al receptor de lipoproteína de baja densidad; o (3) la unión del conjugado tanto a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad como al receptor de lipoproteína de baja densidad es menor que la unión del polipéptido no conjugado a la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad y al receptor de lipoproteína de baja densidad.
18. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al polipéptido en una o más de las posiciones 377, 378, 468, 491, 504, 556 y 711 de aminoácido de factor VIII y en donde además la unión del conjugado a proteoglicano de sulfato de heparina es menor que la unión del polipéptido no conjugado a proteoglicano de sulfato de heparina .
19. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al polipéptido en una o más de las posiciones 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 y 2284 de aminoácidos del factor VIII y el conjugado tiene menos unión a anticuerpos inhibitorios de factor VIII que el polipéptido no conjugado.
20. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al polipéptido en una o más de las posiciones 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 y 2284 de aminoácidos del factor VIII y el conjugado tiene menos degradación de una proteasa plasmática capaz de degradación del factor VIII de lo que hace el polipéptido no conjugado.
21. Conjugado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la proteasa plasmática es proteína C activada .
22. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido del factor VIII funcional es factor VIII suprimido de dominio B.
23. Conjugado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polímero biocompatible está enlazado covalentemente al factor VIII suprimido del dominio B en la posición 129, 491, 1804 y/o 1808 de aminoácido.
24. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero biocompatible se une al polipéptido en la posición 1804 de aminoácido de factor VIII y comprende polietilenglicol.
25. Conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o más sitios predefinidos para la unión del polímero biocompatible se controlan por la mutación de cisteína específica del sitio.
26. Método para la preparación del conjugado de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: mutar una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de factor VIII funcional para sustituir una secuencia codificante por un residuo de cisteína en un sitio predefinido; expresar la secuencia de nucleótidos mutada para producir una muteína mejorada en cisteína; purificar la muteína; hacer reaccionar la muteína con el polímero biocompatible que se ha activado para reaccionar con polipéptidos en residuos de cisteína sólo sustancialmente reducidos tal que se forme el conjugado; y purificar el conjugado.
27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el polímero biocompatible comprende polietilenglicol .
28. Método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el polietilenglicol se activa por la adición de un grupo maleimida que puede reaccionar específicamente a cisteínas en proteínas.
29. Composición farmacéutica para administración parenteral, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado de la reivindicación 1 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
30. Método para tratar hemofilia, caracterizado porque comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 29.
31. Método para la PEGilación dirigida al sitio de una muteína de factor VIII, caracterizado porque comprende: (a) expresar una muteína de factor VIII dirigida al sitio en donde la muteína tiene un reemplazo de cisteína por un residuo de aminoácido en la superficie expuesta de la muteína de factor VIII y que la cisteína está rematada; (b) poner en contacto la muteína de cisteína con un reductor bajo condiciones para reducir suavemente la muteína de cisteína y para liberar el remate; (c) remover el remate y el reductor de la muteína de cisteína; y (d) al menos aproximadamente 5 minutos después de la remoción del reductor, tratar la muteína de cisteína con PEG que comprende una porción de acoplamiento de sulfhidrilo bajo condiciones tal que se produzca la muteína de factor VIII PEGilada.
32. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque en el paso (c) el remate y el reductor se remueven de la muteína de cisteína por cromatografía de exclusión de tamaño o por intercambio iónico.
33. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la muteína del factor VIII es una muteína del factor VIII suprimida del dominio B.
34. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la PEG-maleimida tiene un intervalo de tamaño de 5 kD a 64 kD.
35. Método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la porción de sulfhidrilo del PEG se selecciona del grupo que consiste de porciones de tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, S-piridilo y maleimida.