MX2007004398A - Agentes para el control de la palomilla de la manzana en huertos frutales. - Google Patents

Abstract

La invencion provee de un metodo para identificar repelentes volatiles para insectos y/o atrayentes liberados de sus glucosidos no-volatiles por la accion de extractos de glucosidasa sobre extractos de tejidos vegetales; por este metodo, geraniol fue identificado como repelente de la palomilla de la manzana y salicilato de metilo, (2R,5R)-teaspirano, y (2S, 5R)-teaspirano, y en menor cantidad linalol y alcohol de bencilo como atrayentes de la palomilla de la manzana; la invencion provee composiciones que comprenden dichas repelentes y atrayentes y metodos de control de la palomilla en fruta, preferiblemente en huerto de manzanas.

Description

AGENTES PARA EL CONTROL DE LA PALOMILLA DE LA MANZANA EN HUERTOS FRUTALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención esta relacionada con un método para identificación de repelentes y atrayentes de insectos y para el uso de ciertos repelentes y atrayentes para el control integrado de palomillas de la manzana en huertos frutales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La larva de la palomilla de la fruta es una plaga muy destructiva. Los adultos de esta palomilla son pequeños con una envergadura alar de 1.27 a 1.9 cm, cerca del tamaño de una mosca domestica. Su apariencia gris moteada se mezcla bien con la corteza, haciéndolas difícil de detectar. Si los adultos son atrapados, la palomilla de la fruta puede ser distinguida de otras palomillas asociadas con la fruta por su color café oscuro en las puntas de las alas que tienen marcas de color cobrizo brillante. Los huevos son puestos uno por uno en fruta, frutos secos, o en hojas próximas. En peras, los huevos también pueden ser puestos en la base de racimos de hojas. Sobre las manzanas y las peras, las larvas penetran la fruta y la perforan hacia el corazón dejando un hueco de color café en la fruta que esta llena con cadenas de excremento (excremento de larvas). En ciruelas y ocasionalmente otras frutas de semilla grande, la palomilla de la manzana perfora toda la fruta hasta llegar a la semilla. La palomilla de la manzana (CM) Cydia pomonella (L.) es el insecto con mayor importancia económica para el cultivo de la manzana a nivel mundial. Tiene una cercana asociación ecológica con las manzanas así como con otras plantas (Shel'deshova, 1967). Bengtsson et al. observó el comportamiento de respuesta de adultos de la palomilla de la manzana a las ramas de manzanos con y sin fruta verde en el túnel aerodinámico y encontró que tanto las manzanas verdes como las hojas solas atraen a hembras de la palomilla de manzana (Bengtsson et al., 2001 ). Esta asociación, se ha sabido desde hace mucho tiempo que esta grandemente mediada por la liberación de algunos atrayentes volátiles de las plantas hospederas (Bengtsson et al., 2001 ; Sutherland and Hutchins, 1972; Yan et al., 1999; Knight and Light, 2001 , Light et al., 2001 ). (E,E)-a-farneseno (Sutherland and Hutchins, 1972; Wearing and Hutchins, 1973), linalol and ß cariofileno (Bengtsson et al., 2001 ) han sido identificados como atrayentes para adultos o larvas neonatas de la palomilla de la manzana (Knight and Light, 2001 ; Light et al., 2001 ). Sin embargo algunos de estos componentes están también presentes en perfiles volátiles de una amplia variedad de plantas no hospederas. Es por lo tanto es razonable asumir que alterar la composición volátil de las plantas hospederas puede cambiar su asociación con el insecto de la palomilla de la manzana.

Es bien sabido que muchas plantas contienen cantidades significativas de volátiles entrelazados glucosídicamente. Usualmente, las plantas de las hojas muestran la más alta variabilidad de aglicones, seguidos de flores, ramas, y raíces (Stahl-Biskup et al., 1993). Algunos componentes volátiles entrelazados glucosídicamente en hojas de manzanas y frutas han sido aisladas e identificadas (Scwab y Screier, 1988; Stingl et al., 2002). Además, un exitoso mejoramiento del aroma de los jugos de fruta y de vinos por aplicación erógena de ß-glucosidasa ha sido demostrado (Belancic et al,. 2003; Shoseyov et al., 1990; Yanai y Sato, 1999). La palomilla de la manzana puede ser muy difícil de manejar, especialmente si se ha permitido crecer a su población a lo largo de una estación o dos. En donde las poblaciones son altas y con muchos árboles infectados en la cercanía, las aplicaciones de insecticidas pueden ser necesarias para hacer que las poblaciones disminuyan a niveles muy bajos. Sin embargo es muy difícil de programar con precisión el uso de los insecticidas y el único material efectivo disponible es toxico a sus enemigos y abejas. Por lo tanto métodos no químicos son preferidos. El control de la palomilla del manzano en huertos comerciales pueden depender de instrumentos no químicos incluyendo la revisión regular de árboles y frutos (exploración de la planta), trampas para feromonas y el uso de modelos de monitoreo del clima y temperatura diaria. Sería muy deseable encontrar compuestos naturales no tóxicos que pudieran ser útiles contra la palomilla de la manzana en huertos frutales.

Geraniol, es un alcohol terpeno olefínico encontrado en muchos aceites esenciales como en el aceite de rosas, aceite de palmarosa, citronelo, hierba limón, etc., y es descrito en el índice The Merck (13 edición, 2001 , #4415) como atrayente de insectos. Sin embargo varias publicaciones describen geraniol como un repelente volátil de insectos. US 4,774,081 revela geraniol como ejemplo un repelente de insectos contacto contra las cucarachas y otros insectos rastreros. Chem. Abstracts, Vol. 105:204742q, revela que compuestos de las hojas de laurel (Laurus nobilis L.) son repelente útiles para Tribolium cataneum (Herbsts) y estos componentes ¡ncluyen inter alia, geraniol cuando presente en 50 ppm. Chem. Abstracts, Vol. 113:11095w (abstract de JP 02/67202) revela que, inter alia, linalol, geraniol, citronelol and nerol son repelentes cuando son incorporados dentro de microcápsulas porosas inorgánicas contra cucarachas, babosas y hormigas, etc. US 5,227,406, US 5,648,398 y US 5,621 ,013 revelan un repelente de insectos para humanos y animales para repeler garrapatas portadoras de la enfermedad de Lyme así como moscas de establos y triatomas (Chagas, chinche) dicho repelente comprende terpineol, citronela y ya sea uno o los dos de rodinol extra y geraniol como activos provistos en un medio de transporte. Los activos son usados en pequeños porcentajes, ej. tan poco como 0.01 % preferiblemente entre 0.05% y 0.08% y preferiblemente a menos de 1 %, aun teniendo una sinergia eficaz, particularmente contra garrapatas portadoras de la enfermedad de Lyme.

US 5,633,236 describe un método para repeler a Musca domestica L. (Díptera: Muscidae), Aedes aegypti, Culex nigripalpus, Aedes atlanticus, Culex salinarius, Aedes vexans, Cules spp., Simulium spp., Psoroferia feroz, Aedes infirmatus, Drosophila melanogaster, Coccinelidae, Anopheles crucians, Psoroferia columbiaes, Culicoides spp., y Aedes spp., por un periodo de tiempo finito, consistiendo esencialmente en el paso de exponer un espacio tri-dimensional a una concentración y cantidad efectiva repelente de geraniol o una composición conteniendo un precursor de geraniol consistiendo esencialmente del 50-100% de geraniol o un precursor del geraniol (por ejemplo, geraniloxi-1 ,3,2-dioxaborinano, digeraniloxidimetilsilano y geranil glucósidos, por ejemplo, geranil 6-O-(alfa-L-ramnopiranosi)-beta-D-glucopiranosido) con el remanente de la composición (si en efecto la composición no es 100%geraniol) siendo un compuesto seleccionado por el grupo contendiendo citronelol y nerol. Los repelentes mencionados anteriormente son descritos útiles como tales o por contener un polímero el cual puede ser biodegradable tal como composiciones conteniendo una proporción mayor de poli-homopolímeros (epsilon caprolactone). US 5,401 ,500, US 6,143,288, US 5,635,173 y US 5,666,781 describe tal método para repeler Musca domestica L. (Diptera:Muscidae) y/o Aedes aegyptae como consistiendo en la exposición a una composición que contiene geraniol consistiendo esencialmente de 50-100% de geraniol con el remanente de la composición formado por un compuesto selecto de un grupo consistente en citronelol y nerol.

US 5,753,686 describe un método para repeler al menos una de las especies de estos insectos: (i) Haematobia irritans (Linnaeus) (conocida comúnmente como la mosca del cuerno); y (ii) Solenopsis invicta Burén (conocida comúnmente como hormiga roja de fuego) de la superficie o volumen que habitan al menos una de estas especies de insectos, y que consiste en aplicar a dicha superficie o volumen una mezcla repelente para la "hormiga roja de fuego" y/o "la mosca del cuerno" que contiene geraniol en una cantidad y concentración que consiste en: (i) de 0 hasta cerca de 20% por peso de nerol; (ii) cerca de 20 hasta casi 40% por peso de citronelol; y (iii) cerca de 70% por peso de geraniol la cual es una mezcla que contiene geraniol que esta definida de acuerdo al perfil específico de GLC indicado en las cifras e índice de refracción y densidad expuestos en las especificaciones de dicha patente. Los productos que contienen geraniol están disponibles comercialmente en la forma de bandas, toallas y botellas con bombas de rocío, para usarlo como repelente de insectos. Rociando el líquido directamente sobre la piel o ropa el geraniol se evapora y forma una barrera protectora para detener la picadura de insectos chupadores de sangre. Se ha probado que estos productos son efectivos contra mosquitos, pulgas, garrapatas, moscas negras, jején, coloradillas, mosquillas y muchos otros. Hasta donde se sabe de los actuales inventores, geraniol no ha sido descrito en la literatura como repelente de la palomilla de la manzana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método para identificación de repelentes y/o atrayentes volátiles para insectos liberados por sus glucósidos no volátiles por la acción de ß-glucosidasa sobre los extractos de tejidos de la planta. Aplicando este método en extractos de hojas de manzana, geraniol fue identificado como repelente de la palomilla de la manzana y salicilato de metilo, los isómeros de (2R.5R)- y (2S,5R)-aspirano, linalol y alcohol de bencilo, fueron identificados como atrayentes de la palomilla de la manzana. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con composiciones que comprenden el uso de geraniol como repelente de palomillas de la manzana, y métodos para repeler la palomilla de la manzana en huertos frutales tratando los huertos con dicha composición repelente con geraniol. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con composiciones que comprenden salicilato de metilo, un isómero aspirano, linalol, alcohol de bencilo, o una combinación de los mismos para su uso como atrayentes de la palomilla de la manzana, y con métodos para atracción de la palomilla de la manzana hacia los huertos frutales a través del tratamiento de los huertos con dicha composición atrayente.

En aún otro aspecto, la presente invención se relaciona con unos métodos para control integral la palomilla de la manzana en huertos frutales tratando a los huertos con ambas mencionadas composiciones repelentes y atrayentes de geraniol.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra atracción de extractos de hojas de manzana tratadas con el recombinante ß-glucosidasa (BGL1 ) y glucoimidasol (inhibidor ß-glucosidasa). Hoja BGL 1- trampas con extracto de hoja tratada con ß-glucosidasa; Hoja Inhi-trampas con extracto de hojas tratadas con glucoimidasol; Hoja - trampas con extracto de hojas; Agua-trampa con agua. La misma letra minúscula y mayúscula indicaron diferencia no significativa en el numero de insectos capturados en diferentes trampas y alrededor de las trampas respectivamente, p=0.05, prueba múltiple de Turkey. Las figuras 2A y 2B muestran incremento en los niveles de compuestos liberados (cv. Anna) de los extractos de manzana añadidos con ß-glucosidasa externa. (2A) GC cromatógrafo de extractos de hojas de manzanas añadidos con ß-glucosidasa (BGL1 ), glucoimidazol (inhibidor), o nada. Niveles pico 1 , alcohol de bencilo; 2, linalol; 3, salicilato de metilo; 4, geraniol; 5, (2R,5R)-teaspirano; 6, (2S, 5R)-teaspirano. (2B) Aumento en los niveles de compuestos en los extractos de hoja con ß-glucosidasa BGL1. La misma letra indicó no diferencia significativa en el número de insectos capturados en las diferentes trampas p=0.05 prueba múltiple de Turkey. La figura 3 muestra efecto atracción/repulsión de compuestos enriquecidos de ß-glucosidasa en insectos de la palomilla de la manzana. Se realizaron pruebas de trampeo en cajones con malla metálica con trampas en pares y 60 insectos adultos. El número de insectos capturados en las trampas fueron registradas y analizadas con la prueba t (p < 0.05) +G, con adición de geraniol en una concentración de 39.4 ng mi"1; Mezclado, mezcla de todos los atrayentes en concentraciones detectadas en los extractos de hoja.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método para identificación de repelentes y/o atrayentes volátiles para insectos liberados por glucósidos no volátiles por la acción del ß-glucosidasa sobre los extractos de tejidos de la planta comprendiendo: (i) homogeneizando el tejido de la planta y sometiendo el tejido homogeneizado a la acción de un regulador de extracción; (ii) tratando el extracto de la planta con ß-glucosidasa o con inhibidor ß-glucosidasa; (iii) identificando con GC-MS volátiles específicos liberados en paso (ii), niveles los cuales fueron enriquecidos en los extractos tratados con ß-glucosidasa relativa a extractos tratados con inibidor ß-glucosidasa; y (¡v) probando cada uno de los volátiles identificados en el paso (iii) sobre su efecto en el comportamiento de los insectos, de esta manera identificando volátiles son repelentes o atrayentes de cada uno de los insectos probados. Cualquier ß-glucosidasa puede ser usada en el método de la invención, preferiblemente un recombinante inhibidor ß-glucosidasa puede ser usado tal como, pero no limitado a, glucoimidasol. En la presente aplicación, el recombinante Aspergillus níger ß-glucosidasa (de aquí en adelante llamado BGL1 ) producido en Pichia pastoris fue utilizado para hidrolizar los glucósidos de volátiles presentes en las hojas de manzanas (Malus domestica, cv. Anna). El efecto de los componentes volátiles liberados enzimáticamente cuyo nivel fue más alto en el extracto de hoja tratado con BGL1 comparado con el extracto de hoja tratado con glucoimidasol, fue evaluado sobre el comportamiento de los adultos de la palomilla de la manzana. De acuerdo con la invención, los volátiles entrelazados glicosidicamente y liberados de los extractos de hojas de manzana (cv. Anna) fueron analizados por SPME-GC-MS y sus efectos en el comportamiento de adultos de la palomilla de la manzana (CM, por sus siglas en inglés) fueron evaluados en cajas de bio-ensayo. Los niveles de 1 -octanol, linalol, geraniol, alcohol de bencilo, salicilato de metilo, (2R, 5R)-teaspirano y (2S, 5R)-teaspirano aumentaron significativamente en los extractos de hoja con A. níger ß-glucosidasa (BGL1 ) comparada con los extractos conteniendo glucoimidasol. La atracción de componentes individuales a los adultos de CM fue encontrada en el siguiente orden decreciente: salicilato de metilo y mezcla de dos isómeros teaspirano, seguidos por linalol y alcohol de bencilo. Geraniol se encontró como repelente para adultos de CM. La adición de geraniol (39.4 ng mi"1) a cualquiera de los volátiles individuales o a la mezcla de esos atrayentes eliminaron su poder de atracción. Nuestros datos sugieren la posible aplicación de geraniol como un repelente y de salicilato de metilo o teaspiranos como atrayentes para control integral de CM en huertos de manzanos. El propósito de algunos experimentos de la presente invención fue el determinar el potencial de liberar volátiles de plantas en hojas de manzana por la amplia especificidad de A. Níger BGL1 y determinar interacciones potenciales entre volátiles liberados y el insecto más importante para la manzana, la palomilla de la manzana. Hasta aquí has sido encontrado, de acuerdo con la presente invención que geraniol es un repelente para la palomilla de la manzana. De esta manera, la presente invención se relaciona con composiciones que comprenden geraniol para su uso como repelente de la palomilla de la manzana. La composición puede contener solo geraniol, natural o sintético, o puede comprender otros ingredientes tales como nerol y citronelol, preferiblemente de 50 hasta cerca de 70% por peso de geraniol, de cerca de 0 hasta alrededor de 20% por peso de nerol y de cerca de 20 hasta cerca de 40% por peso de citronelol. Además se ha encontrado, de acuerdo con la presente invención, que salicilato de metilo, los isómeros (2R, 5R) y (2S, 5R) de teaspirano, linalol y alcohol de bencilo son atrayentes de la palomilla de la manzana. La invención además de esta manera se relaciona con las composiciones que comprenden un agente seleccionado del grupo consistente en salicilato de metilo, un isómero teaspirano, linalol, alcohol de bencilo y una combinación de estos para su uso como atrayentes de la palomilla de la manzana. Estos atrayentes, usados solos o en combinación, son útiles como enriquecedores del cebo para toxinas agudas y/o dispositivos para trampeo. En las realizaciones preferidas, el atrayente es salicilato de metilo, ((2R, 5R)-teaspirano, (2S, 5R)-teaspirano, o una combinación de estos. Repelentes y atrayentes volátiles para insectos como se definen aquí tienen la desventaja de dar protección solamente por periodos relativamente cortos de tiempo debido a su rápida evaporación y/o absorción por el substrato tratado. Estos dos factores, absorción y evaporación, llevan a la necesidad de aplicaciones frecuentes, las cuales son molestas y pérdida de tiempo. Varios materiales como se conoce en esta arte pueden ser usados para extender la actividad residual de los repelentes y atrayentes volátiles para insectos de acuerdo con la presente invención y todos ellos son abarcados en la presente invención.

La composición consistiendo de geraniol o un atrayente de la palomilla de la manzana como se define aquí, puede estar en combinación con polímeros compatibles naturales o sintéticos los cuales pueden o no ser biodegradables. El polímero puede ser una celulosa derivada incluyendo pero no limitado a éteres de celulosa, por ejemplo metil celulosa, etil celulosa, celulosas de carboximetilo, celulosas de hidroxietilo, celulosas de hidroxipropilo, celulosas esteres, por ejemplo acetil cellulosas. Los polímeros pueden ser también materiales revestidos basados en gelatina y otros materiales, para crear portadores de perlas microencapsuladas y revestidas con almidón de maíz. El polímero puede también ser un polietileno de alta densidad o polietileno de baja densidad, o biodegradable tal como poliuretanos termoplásticos biodegradables, polímeros de etileno biodegradables que tienen ligamentos esteres en la cadena principal y poli-homopolímeros (epsilon-caprolactone) como se revela en la patente de E.U.A. 4,496,467; 4,469,613 y 4, 548,764 aquí incorporada por referencia. La composición de la invención puede ser rociada, en tal caso también comprende un diluyente acuoso, o puede ser un concentrado que requiera dilución, dispersión o disolución en agua para lograr una composición que pueda ser rociada. En una realización preferida de la invención, la composición de la invención comprende microcápsulas conteniendo geraniol o uno o mas atrayentes de la invención. Estas microcápsulas proveen varias ventajas incluyendo la lenta liberación del geraniol o del atrayente. En adición, las microcápsulas pueden ser lo suficientemente pequeñas para ser apropiadamente usadas en una composición que se pueda rociar sin bloquear los orificios del aspersor. Asimismo, geraniol o el/los atrayentes se "pegaran" y serán efectivamente retenidos sobre el follaje (ejemplo, las hojas y otros órganos fotosintetizadores) o sobre la corteza de las plantas por ejemplo en forma de gotas. En una realización adicional de la invención, el geraniol o composición atrayente puede también ser incorporado en un granulado que sea capaz de ser liberarlo lentamente y de manera controlada. Como las microcápsulas anteriormente mencionadas, el granulado esta presente en la matriz y es distribuido en forma de gotas o unidades semejantes a gotas. Los granulados pueden consistir de pequeñas partículas inorgánicas portadoras y/o polímeros orgánicos tales como aquellos familiares a la persona con habilidad en esta arte. La invención presente también provee un proceso para repeler la palomilla de la manzana el cual comprende tratar un ambiente infestado o inminentemente capaz de ser infestado con dicha palomilla con una composición repelente de la palomilla de la manzana que consista de geraniol. La presente invención además se relaciona con un método para repeler la palomilla de la manzana por un periodo de tiempo finito en huertos frutales habitados por la palomilla de la manzana, dicho método consiste en tratar el huerto con una composición del repelente geraniol.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para atraer a la palomilla de la manzana en huertos frutales , dicho método consiste en tratar a los huertos frutales con un atrayente seleccionado del grupo que consiste de salicilato de metilo, un isómero teaspirano, linalol, alcohol de bencilo, y una combinación de estos. En una realización, la invención provee un método para atraer a la palomilla de la manzana en huertos a una trampa que consiste en exponer el ambiente que rodea a la trampa a un atrayente de insectos que contenga polímeros que consisten de una mezcla de un polímero y al menos 1% por el peso de dicho polímero de un atrayente seleccionado del grupo que consiste en salicilato de metilo, un isómero de teaspirano, linalol, alcohol de bencilo y una combinación de estos. La invención además se relaciona con un método para control integrado de la palomilla de la manzana por un periodo finito de tiempo en huertos de frutas habitadas por la palomilla de la manzana, dicho método comprende tratar el huerto con un repelente compuesto de geraniol y una composición que comprende un atrayente de la palomilla de la manzana seleccionado del grupo consistente de salicilato de metilo, un isómero de teaspirano, linalol, alcohol de bencilo y una combinación de estos. Los huertos frutales que pueden ser tratados con la composición repelente de geraniol y la composición atrayente de la invención son aquellos atacados por la plaga de la palomilla de la manzana e ¡ncluyen huertos de manzanos, peras, membrillos, nuez, espinos blancos, manzanos silvestres. En una de las más preferidas realizaciones, el método de la invención es aplicado a los huertos de manzanos y los árboles son rociados durante la estación de la fruta. La invención ahora será ¡lustrada por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Materiales y Métodos (i) Insectos - huevos de la CM Cydia pomonella L. fueron incubados a temperatura ambiente en una placa de Petri. Las larvas fueron alimentadas con una dieta artificial (Manduca Premix-Heliothis Premix, Stonefly Inc., Bryan, TX) mantenidas a una temperatura 25 ± 0.5°C, humedad relativa 60 ± 1 % y un fotoperíodo de 16.8 h (L:D) hasta la quinta fase de crecimiento, las cuales fueron transferidas a tiras de papel corrugado (2cm2). Una vez que emergieron los insectos adultos de edades y sexo mezclados (dentro de 2 días) fueron usados en las cajas para bio-ensayo. (ii) Tratamientos con extracto de hojas de manzanas - Renuevos de manzana (cv. Anna) ambos con hoja y frutos fueron cortadas de un huerto comercial en los suburbios de Rehoboth, Israel en junio 2004. Las hojas fueron cortadas de los renuevos, lavadas con agua doblemente destilada (DDW) y secadas con un papel filtro. Las hojas secas fueron homogeneizadas en nitrógeno líquido. Tres veces el peso de extracción congelado del regulador conteniendo 10mM EDTA y 4mM DTT en 50mM de regulador de citrato, pH 4.3, fue añadido a la hoja homogeneizada (4-5 g por tratamiento). La mezcla entonces fue girada por 1 h a 4"C y centrifugada a 16,000g por 5 min. El sobrenadante (10 ml por tratamiento) fue colectado. En un tratamiento, la unidad 1 recombinante A. Níger BGL1 producida en P. pastoris (Dan et al., 2000) fue añadida y la solución fue guardada a 37°C por 4 horas. En otro tratamiento, 2 µM glucomidasol (un inhibidor ß-glucosidasa) fue añadido al homogeneizado de hoja inmediatamente después de la adición del regulador de extracción con el objeto de bloquear cualquier actividad de ß-glucosidasa endógena. La actividad cuantitativa de ß-glucosidasa fue ensayada usando p-nitrofenil ß-D-glucopiranosido (PNPG) como sustrato de acuerdo con Shoseyov et al (1990). (iü) Colección de volátiles y GC-MS (análisis de cromatografía de gas (GC, por sus iniciales en inglés) y espectrometría de masa (MS, por sus iniciales en inglés). Volátiles de la parte superior liberados de las mezclas de extractos de hojas y jugos de fruta fueron colectados con una microextracción en fase sólida (SPME) de fibra cubierta de 100 µM polidimetilsiloxano (PDMS). La fibra fue expuesta a los volátiles de la parte superior por 30 min. Durante el SPME la temperatura del extracto de la hoja adentro del vial fue de 60°C sin agitar. La fibra cargada SPME fue entonces desorbida por 3 min en el puerto de inyección de un sistema Varian-3 GC-MS equipado con una columna capilar de 30 mm, 0.25 mm ID DB-5 (J&W, Folson, CA). Los tiempos de muestreo y desorpción fueron controlados precisamente por un equipo Automuestreador Varian 8200 (Varian, Palo Alto, CA). 3-Octanol (0.1 ppm) fue añadido a cada muestra como un estándar interno. Cada muestra fue analizada en triplicados separados. Parámetros GS-MS fueron establecidos de acuerdo a Shalit et al (2003). La temperatura del inyector fue 250°C establecida por inyección no fraccionada. La columna fue establecida a 50°C por 1 min y entonces la temperatura fue aumentada a 200°C a una tasa de 4°C por min"1. El rango de masa registrado fue de 45 a 450 proporción masa-carga con energía electrónica de 70 eV. La mayoría de los volátiles fueron identificados comparando su datos de masa espectral y datos de retención con aquellos de compuestos auténticos, complementado con la biblioteca Wiley de espectros de masa (McLafferty, 1994) y datos de la literatura (Adams, 1995). Los volátiles fueron cuantificados calculando las concentraciones relativas a aquellos de estándar interno. Las áreas de los niveles máximos de los componentes volátiles fueron normalizadas por el área del nivel máximo del estándar interno. (iv) Químicos - La mayoría de los estándares sintéticos fueron comprados en Sigma/Aldrich (St. Louis, MO). Purezas variaron de 98 a 99.5%. Mezclas de (2R,5R)-teaspirano y (2S,5R)-teaspirano fueron de Fluka (Buchs SG, Switzerland). (v) Cajas de bio-ensayo - Las pruebas de trampeo fueron realizadas en cajas con malla metálica (96 x 68 x 45 cm) en el laboratorio a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) basado en el método de Zhu eí al. (2003). Sesenta adultos de la palomilla de la manzana de edades y sexos diferentes (2 días después de emerger de la pupa) fueron liberados en cajas conteniendo trampas con diferentes tratamientos. Las trampas fueron construidas con vasos de precipitado de 100ml cubiertos con una tapa de papel blanco que tenía un hoyo (de 5 mm de diámetro) en el centro. Una mecha de papel Whatman (10 cm de largo) fue usada como dispensador. Para examinar los efectos de añadir el recombinante BGL1 al extracto de hojas. Cuatro trampas fueron construidas y puestas dentro de las mismas cajas. La primera trampa contenía 10 ml del extracto de hojas con la adición del recombinante BGL1. La segunda trampa contenía la misma cantidad de extracto de hojas con la adición de glucimidasol. La tercera caja contenía solo extracto hojas y la cuarta trampa contenía agua. Los insectos capturados en las trampas, o alrededor de las trampas, fueron contados 12 horas después de su liberación. Los insectos alrededor de la trampa fueron definidos como sigue: el espacio de la malla de la caja fue dividido en cuatro partes iguales. Cada trampa fue puesta en el centro de cada parte. El número de insectos presentes en cada espacio especifico, no incluyendo los que estaban adentro de la trampa, fue obtenido en los experimentos. Para la prueba de atracción de los compuestos sintéticos, las trampas fueron hechas con químicos individuales que primero fueron disueltos en etanol a una concentración determinadas por el análisis SPME-GC-MS sobre los extractos de hojas tratados con BGL1. La concentración final de etanol fue 0.01 %. Cada trampa fue guardada en la caja con una sola trampa de agua como control con 0.01% de etanol. Los experimentos fueron llevados a cabo durante la noche (9AM a 9PM) para cubrir su tiempo de actividad antes del crepúsculo temprano en la mañana. Cada experimento fue replicado cinco veces a excepción del que tenía el control 1 -octanol, en el cual la palomilla de la manzana no mostró ningún comportamiento activo en los experimentos preliminares. Este experimento fue replicado 3 veces. Las trampas fueron colocadas al azar en las réplicas para evitar posibles efectos por la posición de las trampas. Los estudios sobre la proporción de sexos de los insectos en trampas fueron omitidos debido a la complicada participación de las feromonas de los insectos.

EJEMPLO 1 El efecto de la actividad de ß-glucosidasa sobre la atracción/repulsión del extracto de hojas para adultos de la palomilla de la manzana El ensayo cuantitativo de ß-glucosidasa usando p-nitrofenil ß-D-glucopiranosido (pNPG) como sustrato confirmó la actividad residual de la ß-glucosidasa endógena en los extractos de hojas de manzanas (0.24 unidad g" peso fresco min"1). El tratamiento con glucomidasol (Heightman y Vasella, 1999) resulto en niveles indetectables de actividad de ß-glucosidasa en el extracto de hojas. Las trampas que contenían el extracto de hojas y 2 µM glucoimidasol capturaron significativamente más adultos de la palomilla de la manzana dentro de las trampas que las trampas que contenían extracto de hojas, extracto de hojas tratado con BGL1 o agua. Adicionalmente, alrededor de las hojas mas trampas con inhibidores, habían significativamente más insectos (fig. 1 ) que en ninguna otra trampa. Estos resultados bien consistentes sugieren que los aglicones liberados por la actividad de ß-glucosidasa tienen un efecto repelente sobre los insectos de la palomilla de la manzana. Asimismo, inhibición completa de la actividad de ß-glucosidasa por glucoimidasol y la significativa atracción del extracto de hojas tratada con el inhibidor ß-glucosidasa indica que estos glucósidos y la ß-glucosidasa están ubicados en diferentes compartimentos de la hoja intacta. Las respuestas de atracción u orientación de insectos fitófagos al olor de la planta hospedera pueden ser enriquecidos o aumentados con una lesión de la planta. El aumento de la respuesta de las larvas y los adultos de la palomilla de la manzana a las frutas de manzanas infectadas por otras larvas de la misma palomilla han sido reportadas (Landolt et al., 200; Reed and Landiot, 2002). En este estudio, demostramos que hojas de manzanas machacadas con glucoimidasol retienen su atracción para los adultos de la palomilla de la manzana.

EJEMPLO 2 Análisis GC-MS de los extractos de las hojas de manzana tratadas con BGL1 o el inhibidor ß-glucosidasa.

Los volátiles de la parte superior de los extractos de hojas tratadas con BGL1 , con el inhibidor ß -glucosidasa o nada, fueron colectados con fibra SPME y analizados con GC-MS. La identificación y cuantificación de los volátiles detectados fueron llevadas a cabo por comparación de su masa espectral e índices de retención con estándares auténticos sintéticos. Los niveles de 1 -octanol (CV, el coeficiente de variación, 32.6%), linalol (28.6%), geraniol (22.4%), alcohol de bencilo (32.1%), salicilato de metilo (41.9%), (2R,5R)-teaspirano (38.7%) y (2S, 5R)-teaspirano (32.4%) aumentaron significativamente en los extractos de hoja tratados con BGL1 en relación a los extractos de hojas tratados con el inhibidor ß-glucosidasa (figs. 2A-2B), indicando que estos componentes están presentes principalmente como glucósidos en hojas de manzanos. A. niger BGL1 liberó significativamente más aglicones del extracto comparado con extracto de hojas sin ß-glucosidasa exógena o el inhibidor ß-glucosidasa. Esto puede reflejar ya sea las diferencias en la especificidad del sustrato entre A. Níger BGL1 y ß-glucosidasa o simplemente una actividad mas alta de A. Niger BGL1 en el vial de reacción. La mayoría de los volátiles identificados son considerados comunes aglicones en muchas especies de plantas (Sthal-Biskup et al., 1993).

Datos sobre aglicones de la manzana es muy limitada. Una cantidad sustancial de C13-noriprenoides ha sido encontrada presente como compuestos ligados glicosidicamente en el fruto y hojas de la manzana (Schwabb y Schreier, 1988; Stingl et al., 2003, Sin embargo, no hubo reportes sobre geraniol, salicilato de metilo, e ¡someros de teaspirano con los aglicones de la manzana anteriormente. La presencia de ciertos aglicones puede también variar entre cultivos. Teaspiranos diasteromericos son encontrados en la naturaleza (Schmidt et al., 1992). Dos de ellos fueron identificados como un aglicon en la fruta de maracuya {Pasiflora edulis Sims) (Winterhalter, 1990). Schmidt et al. (1992) sintetizaron cuatro isómeros de teaspirano que difirieron claramente en sus propiedades sensoriales. (2R, 5R)-teaspirano fue encontrado con una débil nota canforados mientras que (2S,5R)-teaspirano exhibió una fuerte nota canforados casi como naftaleno). En este estudio la identificación fue basada en estos dos isómeros sintéticos estándar de teaspirano. Hasta donde tenemos conocimiento este es el primer reporte de isómeros de teaspirano presentes como aglicones en hojas de manzana. 1 -Octanol, alcohol de bencilo, salicilato de metilo, fueron detectados solamente en la presencia de A. Níger BGL1. Esto podría ser debido a las diferencias en la especificidad en sustrato de BGL1 y la ß-glucosidasa endógena de la manzana o la ineficiente extracción de la ß-glucosidasa endógena. Se sabe que algunas glucosidasas de plantas tales como glucosidasas de uvas cerezas son enzimas ligadas por membranas (Günata et al., 1998). Su extracción necesita condiciones específicas. Esta bien documentado que la especificidad de los radicales de aglicon-moiety de ß-glucosidasas varían considerablemente con el origen de la enzima (Hósel y Conn, 1982; Günata et al, 1990; Bancock y Esen, 1994). En este estudio, un bajo nivel de linalol y teaspiranos fueron detectados en extracto de hojas tratados con glucomidasol, el cual inhibió completamente la actividad de ß-glucosidasa en las condiciones de prueba, sugiriendo que formas libres de estos compuestos existen en hojas de manzanas. Bengtsson et al. (2001 ) también detecto una pequeña cantidad de linaloll libre en la parte superior de las hojas de "Jonathan" pero no mencionaron teaspiranos. Deberá mantenerse en mente que en adición a los compuestos mencionados anteriormente, hubo muchos otros volátiles liberados por los extractos de hojas. Debido a la limitada sensibilidad del GC-MS, es posible que pudiera haber otros atrayentes de insectos o repelentes presentes en el headspace de la hoja de manzana.

EJEMPLO 3 Efecto de atracción/repulsión de compuesto ß-glucosidasa enriquecida sobre los insectos de la palomilla de la manzana En cajas de bio-ensayo, trampas con cada uno de los compuestos individuales a concentraciones detectadas en los extractos de hojas fueron puestas en parejas con una trampa control que solo contenía agua y etanol. La atracción de los compuestos para insectos adultos siguieron el orden decreciente: salicilato de metilo y mezcla de otros dos isómeros de teaspiranos, seguidos de linalol y luego alcohol de bencilo. Estos tres compuestos fueron más atractivos que el agua como blanco (fig.3). Interesantemente, la trampa con la mezcla de los tres componentes no capturo a la mayoría de los insectos. Hasta donde sabemos, este es el primer reporte de isómeros de teaspirano como atrayentes de la palomilla de la manzana. Estos compuestos pueden ser usados cono cebos en el trampero masivo de insectos adultos, en adiciona la ampliamente aceptada técnica de interrupción del apareamiento de los insectos (Calkins y Faust, 2003). La trampa con 70 ng mi'1 1 -octanol no capturo ningún insecto y la adición de la misma cantidad de 1 -octanol a cualquier otro compuesto no afecto significativamente el numero de insectos atrapados comparados con estos compuestos solos (datos no mostrados). Esto indico que 1 -octanol no tiene un efecto significativo sobre el comportamiento de los adultos de la palomilla de la manzana. Extraordinariamente, 39.4 ng mi'1 de geraniol exhibió un efecto repelente sobre los adultos de la palomilla de la manzana. Las trampas con cualquiera de los compuestos atrayentes mencionados más la misma cantidad de geraniol no capturaron ningún insecto, sugiriendo que geraniol a esa concentración elimina la atracción de estos compuestos usados en los experimentos. Geraniol h sido reportado como ingrediente clave en algunos productos comerciales como repelente de mosquitos (Xue et al., 2003) y como el principal componente de los aceites naturales esenciales de las plantas cirrosa (Matsuda et al., 1996), lo cual ha sido mercadeado como repelente biológico en contra de mosquitos. El control de insectos se enfoca en la protección de tanto cultivos como animales y la protección de la salud publica. Un área de interés involucra el desarrollo y producción de repelentes de insectos ambientalmente seguros y no tóxicos. Nuestros resultados indican que en la planta de la manzana como hospedera de la palomilla de la manzana, el geraniol existe como un repelente glicoside inactivado contra la palomilla de la manzana. Solo a partir de la lesión de la hoja la descompartamentalización del glucósido y ß-glucosidasa toma lugar, resultando en la liberación de geraniol. Mas recientemente, hemos mostrado que la expresión de el gen ß-glucosidasa en A. niger (BGL1 ) en tabaco transgénico resulta en una alteración significativa de los volátiles tanto en hojas enteras como machacadas (Wei et a., 2004).

EJEMPLO 4 Microcápsulas conteniendo geraniol Microcápsulas con geraniol fuero preparadas absorbiendo primero geraniol liquido en fosfato tricálcico (TCP) y después cubriéndolas con los materiales en las líneas 1-3 y 5 o como se describen la línea 4 del Cuadro 1.

CUADRO 1 Microcápsulas que contienen geraniol REFERENCIAS Adams, R.P. Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography/Mass Spectroscopy. Allured Publishing, Carol Stream, IL, 1995. Babcock, OW.; Esen, A. Substrate specificity of maize ß-glucosidase. Plant Sci. 1994,101 , 31-39. Belancic, A.; Gunata, Zr, Vallier, M.J.; Agosin, E. Beta-glucosidase from the grape native yeast Debaryomyces vanrijiae: purification, characterization, and its effect on monoterpene content of a Muscat grape juice. J Agrie. Food Chem. 2003, 51 , 1453-1459. Bengtsson, M; Backman, A.C.; Liblikas, J.; Ramírez, M.I.; Borg-Karlson, A.K.; Ansebo, L.; Anderson, P.; Lofqvist, J.; Witzgall, P. Plant odor analysis of apple: antennal response of codling moth females to apple volátiles during phenological development. J. Agrie. Food Chem. 2001 , 49, 3736-3741. Calkins, C.O.; Faust, R.J. Overview of área wide programs and the program 15 for suppression of codling moth in the western USA directed by the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Manag. Sci. 2003, 59,601-604. Dan, S.; Marión, 1.; Dekel, M.; Bravdo, B-A.; He, S.; Wither, S.G.; Shoseyov, O. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus níger ß-glucosidase. J. Biol. Chem. 2000, 275, 4973-4980.

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Claims (28)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición que comprende el uso de geraniol como repelente de la palomilla de la manzana.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el geraniol esta mezclado con ingredientes adicionales tales como nerol y citronelol.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque consta de cerca de 50 hasta casi 70% por peso del geraniol, de 0 hasta casi 20% por peso de nerol y de casi 20 hasta casi 40% por peso de citronelol.

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a 3, caracterizada además porque el geraniol o la mezcla de geraniol es contenida en una matriz de polímero.

5.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, es caracterizada además porque puede ser rociada.

6.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizada además porque se provee como una concentración para dilución, dispersión o disolución en agua para lograr una composición que pueda ser rociada.

7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizada además porque consiste de microcápsulas que contienen geraniol o la mezcla de geraniol.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque es de lenta liberación de geraniol o la mezcla de geraniol.

9.- Un método para repeler la palomilla de la manzana la cual comprende el tratamiento de un ambiente infestado o inminentemente capaz de ser infestado por dicha palomilla de la manzana con una composición repelente para la palomilla de la manzana que consiste de geraniol.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque comprende una mezcla de geraniol con ingredientes adicionales tales como nerol y citonelol.

11.- El método de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizad además porque dicha composición se puede rociar y consiste de microcápsulas que contienen geraniol o una mezcla de geraniol.

12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 , caracterizado además porque dicho ambiente es un huerto frutal que incluye perales, manzanos, membrillo, nuez, espino blanco y manzano silvestre.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicho huerto frutal es un huerto de manzanos.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizada además porque la composición se puede rociar en el huerto frutal.

15.- Un método para repeler al palomilla de la manzana en huertos de manzanos, dicho método consiste en tratar los huertos de manzanos con una composición repelente de geraniol.

16.- Una composición consistente en un agente seleccionado del grupo consistente en salicilato de metilo, un isómero teaspirano, linalol, alcohol de bencilo y una combinación de éstos, para usarlos como atrayentes de la palomilla de la manzana.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque dicho agente es salicilato de metilo, (2R, 5R) teaspirano, (2S, 5R) teaspirano o una combinación de éstos.

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizada además porque el atrayente o la combinación de la misma esta contenida en una matriz polímero.

19.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada además porque se puede rociar.

20.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada además porque se puede proveer como un concentrado para dilución, dispersión o disolución en agua y así proveer una composición que pueda ser rociada.

21.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizada además porque puede estar en la forma de microcápsulas.

22.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque puede ser de liberación lenta del atrayente o combinación de atrayentes de la palomilla de la manzana.

23.- Un método para atraer a la palomilla de la manzana a una trampa de insectos, el cual consiste en tratar un ambiente infestado o inminentemente capaz de ser infectado por la palomilla de la manzana y que rodee a dicha trampa, con un atrayente para la palomilla seleccionado del grupo que cosiste en salicilato de metilo, un isómero teaspirano, lonalol, alcohol de bencilo, y una combinación de estos.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho ambiente es un huerto de frutales, incluyendo huertos de perales, manzanos, membrillo, nuez, espino blanco y manzanos silvestres.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque dicho huerto de frutales es un huerto de manzanos.

26.- Un método para control integral de la palomilla de la manzana en huertos frutales, el cual consiste en tratar el ambiente del huerto infestado o inminentemente capaz de ser infectado por la palomilla de la manzana con una composición repelente para la palomilla que cosiste en geraniol y una composición de atrayentes seleccionados del grupo que consiste en salicilato de metilo, un isómero teaspirano, lonalol, alcohol de bencilo, y una combinación de estos.

27.- Un método que consiste en identificar volátiles repelentes de insectos y/o atrayentes liberados por sus glucósidos no volátiles por la acción de ß-glucosidasa sobre el extracto del tejido de la planta, consistente en: (i) homogeneizar tejido de planta y sometiendo al tejido homogeneizado a la acción de un regulador de extracción; (ii) tratar el extracto de la planta con una ß-glucosidasa o con un inhibidor de ß-glucosidasa; (iii) identificar con GC-MS volátiles específicos liberados en el paso (ii) cuyos niveles fueron aumentados en los extractos tratados con ß-glucosidasa relativa a los extractos tratados con el inhibidor ß-glucosidasa; (iv) probar cada uno de los volátiles identificados en el paso (iii) en su efecto sobre el comportamiento de los insectos; de esta manera se identifican los volátiles que son repelentes o atrayentes de cada uno de los insectos probados.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque la ß-glucosidasa es un recombinante ß-glucosidasa y el inhibidor ß-glucosidasa es glucoimidasol.