MX2007001564A - Metodo y aparato para aislar sustancialmente tejidos de planta. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe y reclama metodos y dispositivos para el aislamiento mecanico rapido de tejidos vegetales de monocotiledoneas adecuados para transformacion o cultivo tisular; la invencion incluye dispositivos mecanicos para aislar sustancialmente tejidos vegetales objetivo para utilizarse como plantas transformables, y propagacion de plantas transgenicas y tejidos vegetales.

Description

MÉTODO Y APARATO PARA AISLAR SUSTANCIALMENTE TEJIDOS DE PLANTA Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de EE. UU. No. 10/911 ,191 , presentada el 4 de agosto de 2004, que reclama el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. No. 60/493,011 , presentada el 5 de agosto de 2003, las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En términos generales, la presente invención se refiere a la propagación de plantas y a métodos mecánicos para aislar sustancialmente tejidos de planta objetivo, tales como embriones, que son adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La preparación de tejidos para la propagación, regeneración y transformación de plantas es tardada y laboriosa, especialmente porque usualmente incluye la excisión manual de tejidos de planta transformables o cultivables. Por ejemplo, para proveer explantes genéticamente transformables de maíz (Zea mays), normalmente se remueven manualmente embriones inmaduros individuales. La excisión manual de los tejidos embriónicos es laboriosa y expone al trabajador a una lesión ergonómica. Además, cuando se requieren grandes cantidades de tejido de planta transformable para una transformación de alto rendimiento y la producción de una planta, se debe emplear y entrenar a muchos trabajadores para satisfacer la mayor demanda. Adicíonalmente, puede haber una variabilidad significativa de la calidad de los tejidos de planta obtenidos, dependiendo del grado de entrenamiento, cuidado, atención y fatiga de los trabajadores individuales. Esta variabilidad de tejido es problemática, ya que los tejidos de baja calidad impactan negativamente la eficiencia del cultivo de tejidos subsiguiente, la transformación genética y la propagación de la planta. De esta manera, existe la necesidad de métodos de preparación de tejidos de planta objetivo que sean más rápidos, que reduzcan la carga ergonómica general de los trabajadores, que reduzcan la cantidad de trabajadores requeridos para procesar los materiales vegetales, y/o que produzcan tejidos de planta que sean de mayor calidad o de calidad más consistente que los tejidos producidos manualmente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe métodos y aparatos para simplificar, mejorar la seguridad, aumentar la fiabilidad, reducir la lesión ergonómica, reducir el número del personal requerido, y/o aumentar la velocidad del aislamiento sustancial de tejidos de planta objetivo para usar en el cultivo de tejidos de planta y la transformación genética. En particular, la presente invención expone y reclama métodos y aparatos útiles para aislar sustancialmente embriones. En algunas modalidades, los métodos y dispositivos se pueden usar para aislar sustancialmente embriones de monocotiledóneas, tales como embriones de maíz. Preferiblemente los embriones sustancialmente aislados son adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Los métodos y aparatos descritos en la presente son particularmente útiles para el procesamiento de alto rendimiento (esto es, para aislar sustancialmente grandes cantidades de tejidos objetivo y/o procesar grandes cantidades de semillas). Un aspecto de esta invención incluye métodos para aislar sustancialmente tejidos objetivo de monocotiledóneas, tales como embriones, que son adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. El método comprende (a) proveer semillas de monocotiledóneas que contienen embriones inmaduros que tienen una abertura en el pericarpio o tegumento de las semillas; y (b) aplicar fuerza a las semillas, suficiente para aislar sustancialmente los embriones inmaduros de las semillas. En algunas modalidades se aislan sustancialmente embriones de maíz inmaduros de semillas de maíz. Preferiblemente, los embriones inmaduros así obtenidos son adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Otro aspecto de esta invención provee un aparato para aislar sustancialmente tejidos de planta objetivo, tales como embriones, adecuado para transformación genética o cultivo de tejidos. El dispositivo comprende por lo menos una abertura para guiar una corriente de fluido. En una modalidad, la corriente de fluido hace contacto con los granos en una mazorca de maíz y ocasiona el aislamiento sustancial de los embriones de los granos. Preferiblemente, los embriones sustancialmente aislados son adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. En una modalidad, el aparato comprende por lo menos un componente seleccionado de entre: (a) por lo menos una superficie sólida adecuada para aplicar presión mecánica positiva al exterior de una semilla; (b) por lo menos una abertura para guiar un flujo de fluido; (c) por lo menos una abertura para aplicar presión de fluido negativa; y combinaciones de los mismos. El componente se puede usar para dirigir una fuerza física sobre la semilla, suficiente para aislar sustancialmente un tejido objetivo, tal como un embrión. Por consiguiente, el aparato se puede usar para aislar sustancialmente embriones de maíz adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos, de una mazorca de maíz. En algunas modalidades, la abertura para guiar un flujo de fluido dirige el flujo de fluido para hacer contacto con semillas o granos de maíz en una mazorca de maíz. En algunas modalidades, la abertura para aplicar presión de fluido negativa dirige la presión de fluido negativa para hacer contacto con semillas o granos de maíz en una mazorca de maíz. Preferiblemente, los tejidos objetivo sustancialmente aislados por medio de dicho aparato son adecuados para el cultivo de tejidos o transformación genética.

La invención también provee plantas transgénicas, tejidos de planta y semillas. La planta transgénica y los tejidos de planta se pueden producir (a) aislando sustancialmente un tejido objetivo usando los métodos y/o aparatos descritos en la presente, (b) introduciendo una molécula de ácido nucleico heterólogo en el tejido objetivo para producir un explante transformado, y (c) cultivar el explante transformado bajo condiciones de crecimiento adecuadas para producir un tejido de planta o una planta transgénica. Cualquier método de transformación es adecuado y son conocidos para los expertos en la materia. Las condiciones adecuadas de cultivo y regeneración también son conocidas y rutinarias. Preferiblemente, la planta transgénica, tejido de planta o semilla es una monocotiledónea como el maíz. La invención también incluye todas las plantas, tejidos de planta y semillas de la progenie que son producidas del tejido de planta o planta transgénica. En la siguiente descripción detallada se exponen otras modalidades de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa una modalidad de un aparato de la presente invención que usa presión mecánica positiva para aislar sustancialmente embriones como se describe en el ejemplo 4. La figura 2 representa una modalidad de un aparato de la presente invención que usa presión positiva de chorro de fluido para desalojar embriones de semillas mediante un método de la invención que se describe en el ejemplo 7. Leyenda: (A) robot con movimiento en las dimensiones X, Y, y Z, (B) motor para girar la mazorca de maíz, (C) asidero, (D) mango para sostener la mazorca de maíz, (E) deflector para impedir que el material salpique hacia arriba, (F) pestaña para impedir que el material salpique hacia arriba, (g) abertura para guiar el fluido, (H) tubo transparente, (I) mazorca de maíz, (J) tamiz de agitación, (K) estopilla u otro material poroso, y (L) contenedor de desperdicio. La figura 3 representa una modalidad de un mecanismo de montaje que usa un "mango" magnético mediante el cual se puede asegurar una mazorca de maíz en un brazo de robot, como se describe en el ejemplo 7. La figura 4 representa una modalidad de una boquilla útil en los métodos de la invención, como se describe en el ejemplo 7. Esta boquilla genera un chorro de fluido sustancialmente uniforme de tipo de lámina plana. Las figuras 5A-5B representan una modalidad de un aparato útil en los métodos de la invención, como se describe en el ejemplo 13. Este dispositivo incluye una boquilla para generar un chorro de fluido sustancialmente plano y una cabeza de succión opcional. Las figuras 5A representa una vista transversal de una modalidad de dicho dispositivo, que muestra como se pueden colocar la boquilla, la cabeza de succión opcional y la mazorca de maíz, una con respecto a otra. La figura 5B representa esquemáticamente una mazorca de maíz colocada en el dispositivo.

Leyenda: (A) base, (B) sostén, (C) boquilla, (D) cabeza de succión, (E) mazorca de maíz, y (F) abertura para guiar el flujo de fluido. La figura 6 representa una modalidad de un componente útil para aplicar presión de fluido negativa útil en los métodos de la invención, como se describe en detalle en el ejemplo 13. Leyenda: (A) una o más aberturas para guiar el flujo de fluido. La figuras 7A a 7C representan diferentes vistas de una modalidad de un dispositivo que utiliza una combinación de fuerzas y es útil en los métodos de la invención, como se describe en detalle en el ejemplo 13. Este dispositivo incluye una cabeza con un borde saliente capaz de aplicar una cantidad predefinida de presión mecánica a la base de granos, a los que previamente se les ha abierto o truncado el pericarpio, y un componente para aplicar presión de fluido negativa. Este dispositivo también puede incluir unos medios para dispensar fluido o para guiar el flujo de fluido. La figura 8 representa una modalidad de la presente invención en la que la parte de arriba del cilindro es cubierta parcial, total o sustancialmente con una membrana o lámina de material blando, que es ligeramente más pequeña que el diámetro de la mazorca de maíz; y un mango al cual se fija. La figura 9 representa un diseño alternativo de la modalidad representada en la figura 8, en el cual se hicieron incisiones pequeñas en la membrana para proveer flexibilidad adicional. La figura 10 representa una vista lateral de las modalidades representadas en la figura 8 o 9, en las cuales se proveen unos medios para asegurar la membrana en el aparato. La figura 11 representa un sistema de fijación de membrana alternativo para usar en la presente invención. La figura 12 representa una prueba del salpicadero de membrana superblanda de silicón de dureza 10A (0.7937 mm de grosor) de McMaster-Carr #9010K12. Se hizo un agujero de 2.54 cm de diámetro en la membrana. La mazorca era capaz de moverse hacia abajo a través de la abertura y también de nuevo hacia arriba a través de la misma. La figura 13 representa una mazorca de maíz que muestra la localización del embrión dentro de un grano individual. También se muestra una modalidad de la invención en la cual un chorro de líquido es dirigido al lado basípeto del grano, opuesto al lado acropétalo en donde se localiza el embrión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado entendido comúnmente por el experto en la materia a la que pertenece esta invención, tomados en el contexto de la presente especificación. Cuando haya inconsistencias entre el texto de la especificación y el material incorporado como referencia, se consideran las definiciones y significados provistos en la presente especificación. La nomenclatura usada y los procedimientos de fabricación o laboratorio que se describen más abajo son muy conocidos y empleados comúnmente por los expertos en la materia. Las frases "sustancialmente aislado" o "extraído" se refieren al procesamiento de un tejido objetivo (por ejemplo un embrión u otro explante de tejido) que reside o forma parte de un complejo de tejido más grande (por ejemplo una semilla), de tal manera que el tejido objetivo se separa físicamente de por lo menos la mitad del complejo más grande. En algunas modalidades, un tejido objetivo sustancialmente aislado puede estar separado físicamente de por lo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 85%, 90%, 95%, 96%>, 97%o, 98% o 99% del complejo más grande, o cualquier fracción del mismo. En otras modalidades, el tejido físico se separa físicamente de aproximadamente más del 80% a aproximadamente 100%, o de aproximadamente 90% a aproximadamente 100%), o de aproximadamente 99% a aproximadamente 100% del complejo más grande, o cualquier fracción intermedia. En algunas modalidades, el tejido objetivo se puede separar físicamente de aproximadamente 100% del complejo más grande. Aunque un tejido objetivo sustancialmente aislado está físicamente separado de algún porcentaje del complejo más grande, no necesariamente se tiene que purificar de ese complejo. En otras palabras, el tejido objetivo sustancialmente aislado puede permanecer en un lote con el complejo de tejido más grande, siempre que el tejido objetivo esté físicamente separado del complejo (según se describe arriba). Sin embargo, en algunas modalidades puede ser deseable remover parcial o totalmente el complejo separado del tejido objetivo sustancialmente aislado. Todas estas modalidades están dentro del alcance de la presente invención. El término "tejido de planta objetivo" se refiere a una porción de un tejido de planta o semilla que se busca aislar sustancialmente. En la presente invención, el tejido de planta objetivo se refiere a cualquier porción de una planta o semilla de planta que se pueda aislar sustancialmente y usar para transformación genética o cultivo de tejidos. En algunas modalidades, el tejido de planta objetivo es un embrión, en particular, un embrión inmaduro de una monocotiledónea como el maíz. Los términos "adecuado para transformación genética" y "adecuado para cultivo de tejidos" se refieren a tejidos de planta que son competentes para transformación o crecimiento bajo las condiciones adecuadas de cultivo de planta, respectivamente. Usando experimentación de rutina, el experto en la materia puede determinar fácilmente si un tejido objetivo particular es adecuado para transformación genética o cultivo de tejidos. Por ejemplo, una muestra de un lote de tejidos objetivo sustancialmente aislados se puede cultivar en un medio de planta adecuado (conocido también para los expertos en la materia), para determinar si los tejidos son capaces de crecer y regenerarse. Similarmente, muestras de tejidos objetivo sustancialmente aislados se pueden someter a transformación y se pueden examinar y seleccionar por la presencia de una molécula de ácido nucleico heterólogo. Estas técnicas son rutinarias y pueden identificar rápidamente qué tejidos son competentes para transformación o cultivo de tejidos y cuales no lo son, si los hubiera. Cuando se provee un término en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de ese término.

Métodos para aislar sustancialmente tejidos de planta objetivo La presente invención provee métodos para aislar sustancialmente tejidos de planta objetivo adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos, que comprende: (a) proveer semillas que contienen una abertura en el pericarpio o tegumento de las semillas; y (b) aplicar una fuerza a las semillas, suficiente para aislar sustancialmente un tejido de planta objetivo de las semillas. En algunas modalidades, el tejido de planta objetivo es un embrión. Los embriones son preferiblemente embriones de monocotiledóneas como el maíz. En algunas modalidades, el tejido objetivo sustancialmente aislado se puede aislar parcial o totalmente. Por ejemplo, un lote de embriones inmaduros sustancialmente aislados puede incluir embriones intactos, embriones parciales o mezclas de los mismos.

Preferiblemente, los tejidos intactos y/o parciales son adecuados para transformación genética, propagación de tejido, regeneración de planta y otras aplicaciones de cultivo de tejidos. Como los tejidos se aislan usando por ejemplo corrientes de agua, se puede proveer un receptáculo de recolección. En algunas modalidades, es útil proveer una cobertura para tales recipientes de recolección para mejorar la eficiencia del aparato, reducir la mezcolanza, impedir la salpicadura indeseable de la corriente de chorro y/o limitar cualquier escape de los tejidos extraídos durante la cosecha. Se puede usar cualquier receptáculo o cubierta de receptáculo adecuado. En otra parte de esta solicitud se dan ejemplos y también son conocidos para el experto en la materia. Las coberturas adecuadas para el receptáculo pueden incluir las hechas de metales, madera, vidrio, malla, tela, plástico, hule, látex, acrílico, y materiales funcionalmente equivalentes. En algunas modalidades, el material es flexible a fin de permitir la penetración y remoción de una mazorca de maíz, manteniendo al mismo tiempo un sello sustancialmente hermético al agua alrededor de la mazorca durante el proceso de extracción. El material puede ser provisto de una abertura adecuada para permitir la entrada y remoción de una mazorca de maíz. En algunas modalidades, el material es sólido y contiene un agujero flexible para recibir y retener la mazorca durante la extracción. En otras modalidades, el material es flexible. Tales materiales flexibles se pueden estirar sobre el receptáculo para formar un ajuste hermético a líquido, pero permiten la inserción de una mazorca ya sea penetrando el material o proveyendo una abertura para recibir la mazorca de maíz. En otras modalidades, el material es una malla o tamiz que tiene una abertura flexible. Las cubiertas pueden ser removíbles o se pueden fijar de manera semipermanente. En algunas modalidades, los materiales son sostenidos por una banda elástica o medio de un aseguramiento equivalente. En otras modalidades, la cubierta se mantiene en su lugar por medio de pesos, collares de fricción, ganchos, ajustes de presión u otros medios de aseguramiento funcionalmente equivalentes. La cubierta puede estar hecha de un material flexible y puede tener grosores variables. Estos factores se pueden variar para obtener los efectos deseados para inserción y extracción de mazorcas de maíz. El siguiente cuadro ilustra algunos parámetros de dureza y grosor para cubiertas de silicón. Sin embargo, la invención no está limitada en modo alguno a estas pocas opciones. Dureza en el durómetro Grosor de la membrana (milímetros) 10A 0.794 10A 1.587 20A 0.794 20A 1.587 40A 0.794 40A 1.587 En una modalidad, el receptáculo de recolección se cubre con una membrana o lámina de material blando que es ligeramente más pequeña que el diámetro de la mazorca de maíz y el mango al que se fija. En una modalidad alternativa, se hacen pequeñas incisiones en la membrana para proveer más flexibilidad. Las figuras 8-11 proveen varias modalidades de las cubiertas y medios de fijación anteriormente descritos.

En algunas modalidades el material es esterilizable en autoclave. Los materiales esterilizares en autoclave son muy conocidos de los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede usar un material blando, tal como una lámina de hule de silicón blando. El experto en la materia conoce los posibles materiales y las disposiciones físicas que permitirían la extracción con un recipiente de recolección, reduciendo el escape del tejido extraído e impidiendo las salpicaduras indeseables. Los procedimientos adecuados para el cultivo y regeneración de los tejidos de planta son muy conocidos. Véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,550,318, de Adams y otros; la patente de EE. UU. No. 5,780,708, de Lundquist y otros; la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 2004/0210958, de Duncan y otros; la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 2004/0016030, de Lowe y otros; y la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 2004/0244075, de Cai y otros, que describen métodos de transformación útiles para el maíz; y la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 2003/0024014, de Cheng y otros, que describe métodos de transformación útiles para el trigo; todos estos documentos se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Estas aplicaciones de cultivo de tejidos pueden incluir por lo menos un proceso seleccionado de transformación, formación de callo, embriogénesis directa, formación de tejido de planta diferenciado, formación de por lo menos una planta madura, formación de por lo menos una planta madura fértil, y combinaciones de estos procesos. Las plantas regeneradas de los embriones inmaduros extraídos se pueden regenerar, por ejemplo, mediante diferenciación del tejido desdiferenciado (callos) o por embriogénesis directa de los embriones inmaduros extraídos. Preferiblemente, las plantas regeneradas se pueden desarrollar hasta la madurez para proveer plantas maduras, y muy preferiblemente plantas maduras fértiles. Los embriones inmaduros extraídos y los tejidos no embriónicos extraídos también se pueden usar para otros fines, tales como por ejemplo, sin limitación, análisis genético o bioquímico. Los métodos y aparatos de la presente invención se pueden aplicar a cualquier planta monocotiledónea de interés. Las monocotiledóneas preferidas incluyen, sin limitación, miembros de la familia Poaceae, que incluye pastos y cultivos de grano tales como maíz, trigo y arroz. Las monocotiledóneas particularmente preferidas incluyen especies de Zea, que incluyen el maíz (Zea mays), que tiene múltiples granos (semillas) normalmente sostenidos en hileras sobre una mazorca. En general, las semillas de monocotiledóneas de las cuales se aislan sustancialmente los tejidos objetivo son provistas de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, las semillas pueden estar fijas en la mazorca o el repollo donde crecen; en algunas modalidades las semillas monocotíledóneas se pueden remover de la mazorca o repollo antes de purificar sustancialmente el tejido objetivo. En algunas modalidades se provee una abertura en el pericarpio o tegumento de las semillas de monocotiledóneas. Esto se puede realizar mediante cualquier técnica adecuada, tal como por ejemplo, sin limitación, haciendo un hoyo, por punción, o incisión con una aguja, lezna, cuchilla u otro instrumento adecuado. En algunas aplicaciones del método no es necesario remover el tejido del pericarpio; en otras modalidades la apertura del pericarpio puede incluir la remoción de por lo menos una parte del pericarpio y posiblemente algo de tejido no embriónico (por ejemplo endospermo). Preferiblemente, la abertura es suficiente para separar sustancialmente el embrión de la semilla. En algunas modalidades puede ser necesario solo debilitar suficientemente el pericarpio (por ejemplo por abrasión o mediante otro tratamiento físico, químico o enzimático), de tal manera que la aplicación de fuerza a la semilla produzca el aislamiento sustancial del tejido objetivo, tal como el embrión. El método incluye el paso de aplicar fuerza a las semillas, suficiente para aislar sustancialmente el tejido objetivo, tal como un embrión inmaduro, de las semillas, en donde el tejido objetivo sustancialmente aislado es adecuado para transformación genética y cultivo de tejidos. Se puede aplicar fuerza a múltiples semillas consecutivamente o simultáneamente. La fuerza aplicada puede ser continua o discontinua (por ejemplo, una fuerza de impulsos o de tipo de onda), y generalmente se aplica mecánicamente, es decir, la fuerza se obtiene usando un dispositivo o máquina en lugar de la mano humana. Preferiblemente, la cantidad de fuerza aplicada es suficiente para vencer la adhesión entre el objetivo (por ejemplo el embrión) y lo que no es el objetivo (por ejemplo tejido no embriónico como el endospermo), permitiendo así la separación de los tejidos objetivo y no objetivo. Se puede emplear cualquier fuerza o fuerzas adecuadas para remover el tejido objetivo de su semilla, y se pueden usar múltiples fuerzas en combinación, secuencialmente o simultáneamente. Las fuerzas adecuadas incluyen, sin limitación, presión positiva de chorro de fluido, presión positiva de chorro de fluido, presión positiva de chorro de líquido, presión mecánica positiva, presión negativa, fuerza centrífuga, aceleración lineal, desaceleración lineal, corte de fluido, flujo de fluido turbulento, y flujo de fluido laminar. Las fuerzas de fluido pueden ser ejercidas por medio de cualquier fluido, gas o líquido, o combinaciones de ambos. Puesto que un embrión de maíz se localiza en el lado acropétalo de un grano, es posible dirigir un chorro de líquido al lado basípeto del grano, si se desea, para expulsar sucesivamente el embrión (véase por ejemplo la figura 13). En tal disposición, la fuerza completa del chorro no choca directamente contra el embrión. Más bien, la cantidad sustancial de la fuerza es aplicada solo indirectamente al embrión mismo. De esta manera se pueden aplicar fuerzas más grandes en el aparato para acelerar la remoción de los embriones, sin aumentar sustancialmente el daño a los embriones que se remueven. Se pueden proveer fuerzas de impacto más altas forzando cantidades más altas de líquido a través del aparato de la presente invención. Sin embargo, en algunas modalidades se pueden generar fuerzas de impacto más grandes sin usar más líquido. Por ejemplo, en algunas modalidades, el tamaño de la abertura del chorro se reduce de tal manera que se puede usar el mismo volumen de líquido a una velocidad más alta. Puesto que la energía de un objeto movible es proporcional al cuadrado de la velocidad, un chorro con el mismo volumen puede tener mucho mayor energía. Una ecuación simple de energía cinética de un objeto movible es igual a (1/2)(m)(v2). Para calcular la energía de impacto real de un chorro de líquido también se tomarían en consideración otros factores conocidos. Además, algunas modalidades pueden usar una combinación de incremento de fluido y cambios del tamaño de las aberturas del chorro para obtener la fuerza o energía deseada. En la presente invención se pueden usar boquillas con calificaciones de gpm de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.25, o de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.2, o de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 , o de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, o 0.015, o cualquier número o fracción entre estas cantidades. En algunas modalidades se pueden usar boquillas con calificaciones gpm bajas, como 0.033 o 0.021 gpm. Cuando se usan tales boquillas con presión más alta, pero dirigidas al lado opuesto del grano del embrión, se puede lograr una cosecha acelerada del embrión evitando al mismo tiempo la lesión del embrión. En algunas modalidades se proveen múltiples chorros en el aparato de la presente invención. Tal aparato es útil para reducir el tiempo necesario para cosechar los embriones de una mazorca de maíz. En algunas modalidades, el aparato puede tener 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aberturas o boquillas de chorro para transportar la fuerza del fluido. En algunas modalidades hay 2, 3, 4, 5 o 6 aberturas o boquillas de chorro. En una modalidad hay tres aberturas. Tal dispositivo se representa en la figura 12. En algunas modalidades, las aberturas se proveen como chorros de corriente plana de ángulo reducido, orientados horizontalmente. Sin embargo, en otra parte de esta solicitud se proveen otras modalidades de las aberturas de chorro. El método también puede incluir el paso de separar el tejido objetivo sustancialmente aislado, tal como embriones inmaduros, del tejido no embrional asociado, tal como tejido de endospermo, glumas, y tegumento o pericarpio. La separación se puede hacer mediante una o más técnicas adecuadas que incluyen, sin limitación, separación por exclusión de tamaño (por ejemplo por filtración en uno o más pasos de filtración), separación basada en hidrofobicidad, hídrofilicídad, lipofilicidad u otras fuerzas atrayentes, y separación por diferenciales de masa o densidad (por ejemplo separación por centrifugación, sedimentación y decantación). El paso o pasos de separación pueden ser opcionales, por ejemplo cuando no se requiere aislamiento adicional de los embriones intactos o parciales para su uso en el cultivo de tejidos. El método de la invención es particularmente adecuado para aplicaciones en donde se debe proveer una gran cantidad de tejidos objetivo, por ejemplo en procesos de alto rendimiento o examen y selección, o en el procesamiento de lotes para transformación genética o cultivo de tejidos. Es posible la automatización del método, por ejemplo, empleando robótica o manejo mecánico de las mazorcas de maíz o semillas, apertura del pericarpio, aplicación de fuerza a la semilla, o los pasos de separación opcionales. Dicha automatización puede usar sensores ópticos o mecánicos para ayudar a colocar las mazorcas o semillas con respecto a la fuerza o fuerzas aplicadas, o en los pasos de aislamiento. En una modalidad preferida, el método provee embriones sustancialmente aislados a una velocidad de aproximadamente 250 a 100,000 o más embriones por empleado-día; o entre aproximadamente 250 y aproximadamente 100,000, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 50,000, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 20,000, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 10,000, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 5000, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 3000, o de aproximadamente 250 a aproximadamente 1000 embriones por empleado-día; o entre aproximadamente 800 y aproximadamente 100,000, o de aproximadamente 800 a aproximadamente 50,000, o de aproximadamente 800 a aproximadamente 20,000, o de aproximadamente 800 a aproximadamente 10,000, o de aproximadamente 800 a aproximadamente 5000, o de aproximadamente 800 a aproximadamente 3000, o de aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 embriones por empleado-día; o entre aproximadamente 2500 y aproximadamente 100,000, o de aproximadamente 2500 a aproximadamente 50,000, o de aproximadamente 2500 a aproximadamente 20,000, o de aproximadamente 2500 a aproximadamente 10,000, o de aproximadamente 2500 a aproximadamente 5000, o de aproximadamente 2500 a aproximadamente 3000 embriones por empleado-día; o entre aproximadamente 5000 y aproximadamente 100,000, o de aproximadamente 5000 a aproximadamente 50,000, o de aproximadamente 5000 a aproximadamente 20,000, o de aproximadamente 5000 a aproximadamente 10,000 embriones por empleado-día, o cualquier fracción o entero entre las escalas anteriormente mencionadas. Como referencia, un empelado-día es equivalente a un día de trabajo de un empleado de habilidad promedio. Aunque el rendimiento promedio del empleado puede variar, lo siguiente se da como guía con la finalidad de comparar la presente invención con el rendimiento promedio actual del empleado. Para manejar la carga ergonómica, actualmente se sugiere que los trabajadores corten aproximadamente una mazorca de maíz por día (aproximadamente de 200 a 300 embriones por día), aproximadamente dos veces por semana. De esta manera, un empleado promedio siguiendo dichas recomendaciones puede producir hasta 600 embriones por semana aproximadamente. Es posible que un empleado promedio pudiera producir hasta 500-800 embriones cortados en un día aproximadamente. Sin embargo, no es recomendable mantener dicho rendimiento durante varios días, o incluso semanas, debido al incremento de carga ergonómica y a problemas de calidad. Como se indicó arriba, la presente invención supera estas limitaciones significativas del rendimiento.

Aparatos para aislar sustancialmente los tejidos de planta objetivo La presente invención también provee aparatos para aislar sustancialmente los tejidos objetivo, como los embriones de maíz, que son adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. En una modalidad para separar embriones de maíz, dicho aparato comprende por lo menos una abertura para guiar una corriente de fluido, en donde la corriente de fluido hace contacto con los granos en la mazorca de maíz y aisla sustancialmente los embriones de los granos. Generalmente se prefiere que la corriente de fluido haga contacto con tantos granos como sea conveniente en un periodo dado, a fin de aislar más rápidamente los embriones. La abertura (por lo menos una) puede incluir una sola abertura o múltiples aberturas (por ejemplo una boquilla o múltiples boquillas, que pueden incluir boquillas planas, redondas, ovaladas, de abanico u otros modelos, y boquillas ajustables, movibles o estacionarias), y puede generar un flujo de fluido de cualquier tipo y medio adecuados. Los fluidos pueden ser gases (tales como aire, nitrógeno, o mezclas de gases), líquidos (tales como agua, solución salina fisiológica, o varios medios de cultivo), o combinaciones. Los flujos de fluido adecuados incluyen, sin limitación, chorros de fluido (tales como chorros columnares sencillos o múltiples; chorros o atomizaciones planas, de cono o de abanico; y chorros de tipo de lámina), flujo de fluido laminar y flujo de fluido turbulento. Los flujos de fluido adecuados pueden dar como resultado una variedad de fuerzas para remover el embrión de su grano, incluyendo presión positiva o presión negativa, o ambas; tales fuerzas pueden ser uniformes o no uniformes, continuas o discontinuas (tales como una fuerza de impulsos o de tipo de onda), o cualquier combinación de las mismas. El aparato de la invención, además, puede incluir unos medios para mover el tejido objetivo que se purifica sustancialmente y la corriente de fluido, uno con respecto a la otra. Por ejemplo, se puede mover la mazorca de maíz que contiene las semillas, o la corriente de fluido, o ambas cosas. Se pueden usar varias modalidades del aparato con una mazorca de maíz o múltiples mazorcas de maíz, intactas o parciales. Por ejemplo, la mazorca o mazorcas de maíz se pueden asegurar en un sostén o asidero, que se mueve con respecto a la corriente de fluido. Sin embargo, en otras modalidades no es necesario asegurar individualmente la mazorca o mazorcas de maíz en un sostén, sino que pueden ser libremente movibles a fin de que se pueda hacer contacto con múltiples granos por medio de la fuerza usada para remover los embriones de los granos. Los medios para mover por lo menos una mazorca de maíz con respecto a la corriente de fluido pueden girar la mazorca de maíz (por lo menos una) y la abertura (por lo menos una), una con respecto a la otra, o pueden mover la corriente de fluido por el eje longitudinal de la mazorca de maíz (por lo menos una), o pueden proveer cualquier movimiento tridimensional de la mazorca de maíz (por lo menos una) y la abertura (por lo menos una), una con respecto a la otra, tal como una combinación de rotación y movimiento longitudinal. Además, el aparato de la invención puede incluir por lo menos un separador para separar los tejidos objetivo de los tejidos no objetivo. Por ejemplo, se pueden separar los embriones de los tejidos no embriónicos, en donde los embriones separados comprenden por lo menos algunos embriones de maíz adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Los separadores pueden trabajar por medio de cualquier mecanismo adecuado que incluye, sin limitación, separación por exclusión de tamaño (por ejemplo usando una malla, tamiz, superficie perforada, u otro dispositivo capaz de excluir objetos de un cierto tamaño), separación basada en hidrofobicidad u otras fuerzas atrayentes (por ejemplo usando un material, sólido o fluido que puede atraer o repeler los embriones), y separación por medio de diferenciales de masa o densidad (por ejemplo usando una centrífuga, o usando soluciones para sedimentación diferencial). En algunas modalidades, el separador (por lo menos uno) puede ser opcional, por ejemplo cuando no sea necesario el aislamiento adicional de embriones intactos o parciales para su uso en transformación genética o cultivo de tejidos. Los embriones inmaduros sustancialmente aislados (y opcionalmente separados) incluyen por lo menos algunos embriones, tales como embriones inmaduros intactos o parciales, adecuados para aplicaciones de cultivo de tejidos, transformación, formación de callo, embriogénesis directa, formación de tejido de planta diferenciado, formación de por lo menos una planta madura, formación de por lo menos una planta madura fértil, y combinaciones de estos procesos, como se describe arriba. Los embriones inmaduros sustancialmente aislados y los tejidos no embrionales también se pueden usar para otros fines, por ejemplo, sin limitación, análisis genético o bioquímico. La presente invención también provee un aparato para aislar sustancialmente de forma mecánica múltiples embriones de maíz adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos de por lo menos una mazorca de maíz inmadura, que incluye por lo menos un componente seleccionado de: (a) por lo menos una superficie sólida adecuada para aplicar presión mecánica positiva al exterior de granos de la mazorca de maíz inmadura (por lo menos una); (b) por lo menos una abertura para guiar un flujo de fluido, en donde el flujo de fluido hace contacto con los granos de la mazorca de maíz inmadura (por lo menos una); (c) por lo menos una abertura para aplicar presión de fluido negativa, en donde la presión de fluido negativa hace contacto con los granos de la mazorca de maíz inmadura (por lo menos una); y en donde el componente (por lo menos uno) aplica fuerza a los granos, suficiente para aislar sustancialmente los embriones de los granos, los embriones sustancialmente aislados incluyendo múltiples embriones inmaduros adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Un aparato adecuado aplica una o más fuerzas suficientes para aislar sustancialmente los embriones inmaduros de las semillas, en donde los embriones inmaduros sustancialmente aislados incluyen embriones adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Las fuerzas (una o más) pueden ser aplicadas a múltiples semillas consecutivamente o simultáneamente, de manera continua o discontinua, y por lo general se aplican mecánicamente y no manualmente. Se pueden usar múltiples fuerzas en combinación, secuencialmente o simultáneamente. Las fuerzas adecuadas incluyen, sin limitación, presión positiva de chorro de fluido, presión positiva de chorro de líquido, presión mecánica positiva, presión negativa, fuerza centrífuga, aceleración lineal, desaceleración lineal, corte de fluido, flujo de fluido turbulento, y flujo de fluido laminar. Las fuerzas de fluido pueden ser ejercidas por cualquier fluido, gases o líquidos, o combinaciones de ambos. Opcionalmente, los aparatos de combinación de la invención pueden incluir medios para mover la mazorca de maíz (por lo menos una) con respecto a la fuente o fuentes de fuerza (es decir, la superficie sólida para aplicar presión mecánica positiva, la abertura para guiar un flujo de fluido, o la abertura para aplicar presión de fluido negativa). Preferiblemente, la mazorca o mazorcas son movidas con respecto a la fuente de la fuerza, de tal manera que la fuerza o las fuerzas hagan contacto con tantos granos como sea conveniente en un periodo dado, a fin de aislar más rápidamente los embriones. Los aparatos de combinación de la invención también pueden incluir por lo menos unos medios para separar adicionalmente los embriones inmaduros sustancialmente aislados adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos, en donde los embriones separados comprenden por lo menos algunos embriones de maíz adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Los separadores pueden trabajar mediante cualquier mecanismo adecuado que incluye, sin limitación, separación por exclusión de tamaño, separación basada en fuerzas atrayentes, y separación por diferenciales de masa o densidad.

Plantas transformadas y métodos para su producción La presente invención también provee una planta monocotiledónea transformada, producida por los pasos que incluyen: (a) proveer por lo menos un tejido objetivo transformable usando los métodos o aparatos descritos en la presente; (b) introducir una molécula de ácido nucleico heterólogo en el tejido objetivo transformable para producir un explante transformado; y (c) desarrollar una planta monocotiledónea transformada del explante transformado. Las monocotiledóneas preferidas de la invención son miembros transformados de la familia Poaceae, que incluye pastos y cultivos de grano tales como maíz, trigo y arroz. Las plantas monocotiledóneas particularmente preferidas incluyen especies de Zea transformadas, tales como Zea mays. Preferiblemente el maíz transformado contiene por lo menos una molécula de ácido nucleico heterólogo capaz de conferir un rasgo deseado al maíz transformado, tal como resistencia a herbicida, resistencia a plaguicida, tolerancia de germinación en frío, tolerancia de déficit de agua, mayor productividad, mayor rendimiento, y similares. Los métodos prácticos de transformación y el material para hacer plantas monocotiledóneas transgénicas para esta invención (por ejemplo varios medios y células objetivo receptoras, transformación de embriones inmaduros y regeneración subsiguiente de plantas transgénicas fértiles), se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 6,194,636, de McEIroy y otros, la patente de EE. UU. No. 6,232,526, de McEIroy y otros, la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2004/0216189, de Houmard y otros, la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2004/0244075, de Cai y otros, que describe métodos útiles para el maíz, y la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2003/0024014, de Cheng y otros, que describe métodos útiles para el trigo; todas incorporadas aquí como referencia. Para transformar las plantas monocotiledóneas de la invención se pueden usar moléculas de ácido nucleico heterólogo únicas o múltiples; por ejemplo, se describen construcciones para decremento e incremento coordinados de la expresión genética en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2004/0126845, de Van Eenennaam y otros, que se incorpora aquí como referencia. Las semillas de las plantas transgénicas fértiles resultantes de la invención se pueden cosechar y usar para desarrollar generaciones de progenie, incluyendo generaciones híbridas, de plantas transformadas que incluyen en su genoma la molécula de ácido nucleico heterólogo. De esta manera, la presente invención incluye tanto plantas transformadas primarias (plantas "R0", producidas por transformación de los embriones provistos por un método de la invención), como su progenie que lleva la molécula de ácido nucleico heterólogo. Estas plantas transgénicas de progenie se pueden preparar cruzando una planta monocotiledónea transformada de la invención, que tiene la molécula de ácido nucleico heterólogo, con una segunda planta que carece de la construcción. También, una planta monocotiledónea transformada de la invención se puede cruzar con una línea de planta que tiene otras moléculas de ácido nucleico heterólogo que confieren otro rasgo, para producir plantas de progenie que tienen moléculas de ácido nucleico heterólogo que confieren múltiples rasgos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Método para extruir múltiples embriones de maíz Este ejemplo muestra un método que utiliza presión mecánica positiva de un dispositivo extrusor para producir embriones adecuados para cultivo de tejidos o transformación genética. Las partes superiores de los granos de una mazorca de maíz (Zea mays) inmaduro se removieron en condiciones estériles con un pelador de vegetales común. El pelador se empujó desde el extremo basal de la mazorca de maíz hasta el extremo apical usando un ligero movimiento de sierra para obtener un truncamiento rápido y claro de los granos. Aunque en esta modalidad los granos individuales se truncan para exponer los tejidos internos, en otras modalidades puede ser necesario solo asegurarse de hacer una abertura en el pericarpio (tal como una punción o incisión o abrasión), sin remoción real de material del pericarpio. Cuando se requieren embriones intactos (por ejemplo embriones intactos para transformación), preferiblemente el tamaño de cualquier abertura debe ser suficiente para permitir la remoción del embrión sin dañarlo. La apertura del pericarpio se puede efectuar usando cualquier dispositivo adecuado que incluye, sin limitación, cuchillas y materiales abrasivos. Por ejemplo, se diseña un pelador de vegetales relativamente seguro y rápido de usar; tiene una profundidad de corte regulada y también su uso requiere menos destreza que un escalpelo. Se pueden usar otras herramientas con funciones similares. Preferiblemente, los dispositivos para abrir el pericarpio son esterilizables, por ejemplo por autoclave o calentamiento, o por esterilización química. Estos procesos de tratamiento del pericarpio se pueden automatizar; por ejemplo, se pueden motorizar una o más cuchillas o un dispositivo raspador. Un extrusor estéril (en este caso una varilla de 4 milímetros de diámetro) se empujó contra la base de los granos truncados. Se pueden usar otros dispositivos de extrusión adecuados. Preferiblemente, dichos dispositivos tendrían un tamaño y forma capaces de aplicar una fuerza relativamente localizada a la base de los granos truncados para expulsar los embriones y endospermos. Preferiblemente, la fuerza aplicada es de suficiente magnitud y se aplica en una dirección adecuada, de tal manera que el extrusor que avanza no "se suba" sobre los granos de adelante. Preferiblemente, el borde rezagado del extrusor también provee una superficie sobre la cual se acumulan los embriones y endospermos expulsados; por ejemplo, se podría usar una pieza plana de acero inoxidable con un borde frontal redondo. En este ejemplo los embriones se sacaron suavemente del pericarpio, seguidos por los endospermos. Los embriones y los endospermos extruidos llegan a descansar sobre la parte superior de la varilla extrusora en que avanza y no se machacaron durante el proceso. La mezcla de embriones y endospermos se lavó con un medio fluido acuoso (agua, medio líquido o solución salina) sobre una malla estéril que tiene - aberturas en forma de diamante (aproximadamente 2 x 3 milímetros). Se observó que los endospermos eran bien retenidos, y los embriones más pequeños y algunos desechos de endospermo se lavaron a través del tamiz en un receptáculo de recolección. Los embriones recogidos se lavaron dos veces para remover los desechos pequeños. Los embriones lavados se purificaron adicionalmente por medio de un proceso de flotación. En el primer paso del proceso de flotación, el medio fluido acuoso se retiró completamente del receptáculo de recolección, lo que permitió secar brevemente (por ejemplo, aproximadamente un minuto), de tal manera que el medio acuoso remanente se retiró de la superficie cerosa de los embriones exponiéndolos directamente al aire. Se le añadió medio acuoso nuevo, y la mayoría de los embriones flotaron porque su superficie cerosa no fue remojada por el fluido. Los tejidos no embriónicos, tales como los desechos de endospermo, permanecieron sumergidos en el medio, y se obtuvo una clara separación de los embriones y los tejidos no embriónicos.

La flotación de los embriones extruidos se podría mejorar retirando el medio acuoso más rápidamente, más completamente o reproduciblemente, por ejemplo usando aspiración o acción capilar (por ejemplo de un absorbente estéril colocado en el receptáculo de recolección, para absorber el fluido fuera de los embriones extruidos). En este experimento preliminar se obtuvo un rendimiento de aproximadamente 100 embriones aislados, en donde se procesó solo una porción del material de embrión-endospermo de toda la mazorca. Estos resultados demuestran que los métodos de la presente invención son prácticos y convenientes para cosechar grandes cantidades de embriones inmaduros de mazorcas de maíz. Los embriones aislados mediante un método de la invención se pueden usar entonces en procedimientos de cultivo de tejidos, por ejemplo en métodos de regeneración para generar plantas de maíz transgénico. La transferencia de los embriones aislados al medio de cultivo se hizo fácilmente colocando unos fórceps, con las puntas juntas, debajo de los embriones flotantes, levantando con los fórceps los embriones para separarlos del líquido, y colocándolos los embriones sobre medio de cultivo. Otra técnica podría ser recoger los embriones aislados con un instrumento que tiene una superficie hidrofóbica. Una técnica adicional sería transferir los embriones por hidrofobicidad, por ejemplo, transferirlos a la superficie del medio mediante un pequeño soplido de aire o movimiento mecánico repentino, de tal manera que su energía cinética rebase la fuerza hidrofóbica que los retiene en el instrumento.

EJEMPLO 2 Confirmación visual del tamaño del embrión Este ejemplo describe un mejoramiento de una modalidad del método de la presente invención que se describe en el ejemplo 1. Usando el enfoque descrito en el ejemplo 1 , se requieren embriones de maíz inmaduros que estén muy cerca de la parte truncada del grano para ser expulsados en mayor número. La variación del tamaño del embrión de maíz inmaduro es una consideración importante para calibrar la cantidad por remover de la parte superior del grano. Los embriones tienden a ser más grandes en la sección media de la mazorca, con embriones un poco más pequeños hacia los extremos. Los embriones más pequeños, por ejemplo de menos de 1.5 milímetros de longitud aproximadamente, son más difíciles de remover a menos que estén cerca del truncamiento. Una forma de asegurar que sea descabezado suficiente grano sobre los embriones de tamaño variable es observar la mazorca durante el proceso de descabezado bajo un pequeño aumento. Por ejemplo, se usaron gafas de poco aumento (amplificador binocular con banda para la cabeza Op-7-VISOR de Donegan, equipado con unos lentes del No.7, que proveen un aumento de 2.75X), para ayudar a la confirmación visual del tamaño del embrión y truncamiento adecuado del pericarpio. Si el primer corte no remueve suficiente ápice del grano, se puede hacer un segundo corte. Se pueden usar otros dispositivos de poco aumento que utilizan los mismos aumentos o similares. Por ejemplo, los lentes disponibles de OpfV-VISOR proveen aumentos que varían de 1.5 a 3.5X.

EJEMPLO 3 Extrusión de los embriones y endospermos Este ejemplo describe un mejoramiento de una modalidad del método de la presente invención descrito en el ejemplo 1. Se pueden usar dispositivos alimentados con potencia para ayudar a la extrusión de los embriones y endospermo. Por ejemplo, se puede usar un cincel de potencia, tal como un cincel de potencia WeCheer 320, equipado con un dispositivo extrusor redondo, para reducir la fuerza que una persona necesita ejercer para expulsar los embriones y endospermos. Se tienen disponibles otros dispositivos de potencia y se pueden usar de manera similar.

Preferiblemente, la porción de "cincel" de dicha herramienta (o cualquier parte de la herramienta que pudiera hacer contacto con los embriones), se puede esterilizar convenientemente, por ejemplo, por inserción en un esterilizador de esferas. En un experimento, la hoja de una espátula para pesar de acero inoxidable se dobló hacia atrás sobre sí misma para proveer un dispositivo extrusor que tiene un borde delantero redondo. Después de la inserción en un cincel de potencia WeCheer 320, se extendió una porción de aproximadamente 10 centímetros de largo desde el mango del cincel de potencia. Este ensamble se usó para expulsar los embriones y endospermos de hileras individuales de granos descabezados. Como el dispositivo extrusor (espátula modificada) se mueve por una hilera de granos, se observó una ligera tendencia de la espátula a resbalarse del centro a la izquierda o a la derecha; sin embargo, esta tendencia pudo ser corregida incluyendo una pequeña extensión similar a una quilla de la espátula en cada borde externo.

EJEMPLO 4 Extrusión mecanizada del embrión Este ejemplo describe un mejoramiento de una modalidad del método de la presente invención descrito en el ejemplo 1. La mecanización del proceso de extrusión del embrión se puede hacer usando un dispositivo adecuado, tal como por ejemplo, sin limitación, el dispositivo descrito en la presente y mostrado esquemáticamente en la figura 1. Este dispositivo incluye dos motores. El primer motor D es un motor de paso a paso que puede girar la mazorca de maíz de tal manera que nuevas hileras de granos son expuestas a las dos varillas de extrusión G, que aplican fuerza para sacar los embriones y endospermos de sus pericarpios. Las varillas G están localizadas convenientemente en lados opuestos de la mazorca para balancear la presión aplicada a la mazorca con respecto al eje longitudinal de la mazorca. Sin embargo se puede usar una sola varilla o más de dos varillas; cuando se usan múltiples varillas, es preferible colocarlas a fin de distribuir uniformemente la presión mecánica resultante alrededor de la mazorca. No es necesario que la varilla sea una varilla recta; en una modalidad del dispositivo se usa un "collar" que rodea la circunferencia de la mazorca en lugar de una varilla rígida. En otra modalidad, se disponen múltiples varillas cortas o rodillos en una configuración flexible circular que se puede deslizar a lo largo del eje longitudinal de la mazorca, aplicando presión mecánica simultáneamente a muchas o todas las hileras de los granos. El segundo motor está conectado al engranaje de piñón E que se une a una cremallera F, de tal manera que ocurre movimiento lineal hacia arriba y hacia abajo de la mazorca. La base de la mazorca es sostenida firmemente en un mango B por medio de un tornillo que se extiende desde el mango a lo largo de la base de la mazorca. La porción media estrechada del mango es cuadrada, de tal manera no gira a menos que el sostén C al que está unido sea girado por el motor de paso a paso D. Antes de su inserción en la máquina, las partes superiores de los granos son descabezadas como en el ejemplo 1 , de modo que se puedan sacar los embriones y endospermos. Para empezar el proceso, la mazorca se baja hasta que las dos varillas G están cerca de la base de la mazorca justo abajo del mango B. Entonces las varillas son oprimidas contra ambos lados de la mazorca y el ensamble de cremallera y piñón tira hacia arriba de la mazorca. Conforme esto sucede, los embriones y endospermos son removidos de un par de hileras, caen al plato de recolección H que descansa sobre la base I, y se reúnen en una pila J. Cuando las varillas se aproximan al extremo apical de la mazorca, esta es retirada hacia arriba a su posición inicial original, y es girada ligeramente por el motor de paso a paso hasta tener en posición dos nuevas hileras de granos. Son posibles varios grados de automatización de esta máquina, que incluyen sensores para ajustar automáticamente las posiciones verticales de inicio y terminación, así como las posiciones rotativas de inicio y terminación. El método de piñón y cremallera no es el único mediante el cual se puede obtener un movimiento lineal. Para algunas aplicaciones puede ser preferible neumática o hidráulica. Las varillas G se pueden abrir automáticamente por medio de un mecanismo adecuado. Cuando se carga una mazorca nueva puede ser preferible elevar la mazorca a una posición suficientemente alta para despejar las varillas.

EJEMPLO 5 Separación hidrofóbica de los embriones Este ejemplo describe un mejoramiento de una modalidad del método de la presente invención descrito en el ejemplo 1. En aplicaciones de separación, el material de interés frecuentemente aparece en la interfaz de fases distintas (por ejemplo entre disolventes acuoso y lipofílico). La remoción del material de interés de dicha interfaz puede presentar problemas, y en el pasado ha sido un proceso manual que incluye estrecho contacto entre el extractor y el material por extraer. Frecuentemente la única manera de separar exitosamente un componente es usar un material de la misma polaridad o hidrofobicidad/hidrofilicidad. En el caso de embriones de maíz inmaduros extruidos por medio de un método de la invención, los embriones se encuentran en la ¡nterfaz agua/aire. La superficie de los embriones de maíz es cerosa, esto es, lipofílica o hidrofóbica, y cuando la cutícula de un embrión se pone en contacto con una sustancia de hidrofobicidad similar, el embrión tenderá a pegarse a la superficie hidrofóbica. La hidrofobicidad del embrión reduce la tensión superficial del agua alrededor del mismo, lo que ayuda al embrión a "flotar" en la superficie de la interfaz agua/aire. Un enfoque que aprovecha estas características físicas sería tocar los embriones flotantes con un material hidrofóbico (tal como papel filtro hidrofóbico, por ejemplo papel Whatman No. 1 PS, que es un papel de separación de fase repelente al agua impregnado con silicón; véase por ejemplo www.whatman.com/repository/documents/s3/tech appli 010.html). En un ejemplo, una pieza de papel filtro hidrofóbico estéril se puede bajar sobre todo el contenedor de embriones flotantes, y estos se recogen todos a la vez. En otro ejemplo se puede usar una pieza pequeña de papel hidrofóbico para recoger sucesivamente una cantidad de embriones y transferirlos al siguiente contenedor. En un tercer ejemplo se usaría una pieza pequeña del papel hidrofóbíco o una punta de pipeta hidrofóbica para hacer contacto con los embriones individuales, recogerlos y después dispensarlos con un soplido de aire del pipeteador. Para tal uso también se pueden modificar las puntas de pipetas ordinarias insertando la punta de una pipeta en un tramo corto de tubería hidrofóbica (por ejemplo tubería de silicón); entonces se podría recoger el embrión por atracción hidrofóbica hacia el extremo distante de la tubería hidrofóbica, y después liberarse dispensando un soplido de aire desde la pipeta. La reducción de la tensión superficial alrededor de los embriones hidrofóbicos los ayuda a flotar sobre una superficie acuosa, y los embriones flotantes también se podrían transportar moviéndolos sobre la superficie acuosa (por ejemplo por medio de un chorro de aire dirigido a los embriones). La recolección y dispensación de los embriones se pueden automatizar usando modificaciones de dispositivos existentes, tales como máquinas diseñadas para recolección de colonias o para recuperar manchas de proteína de los geles de proteína 2-D teñidos.

EJEMPLO 6 Métodos adicionales para expulsar o extruir los embriones El método de la presente invención abarca el uso de varios tipos de fuerza, o combinación de fuerzas, para separar el embrión de su semilla.

Este ejemplo describe modalidades adicionales. En un método básico descrito en el ejemplo 1 se aplica presión mecánica positiva a la base de una semilla truncada (tal como un grano de maíz) para expulsar el embrión fuera de la semilla a través de la parte superior truncada. En otra modalidad, se puede usar fuerza centrífuga para expulsar el embrión. Por ejemplo, una mazorca de maíz (cuyos granos han sido previamente truncados) se puede hacer girar alrededor de su eje longitudinal a una velocidad suficiente para expulsar los embriones y/o endospermos en una trayectoria radial. La rotación se puede obtener por medio de cualquier técnica adecuada, tal como por ejemplo, sin limitación, poner en contacto el extremo apical de una mazorca de maíz con un cono libremente rotativo, en donde la rotación de la mazorca se mantiene dentro de una escala longitudinal limitada, por ejemplo, uniendo el extremo basal de la mazorca a un mango, que se inserta entonces en un sostén dentro del cual puede girar. En una modalidad ejemplar que usa fuerza centrífuga, aproximadamente un tercio de la parte superior de cada grano de una mazorca de maíz se removió con un escalpelo, y la mazorca se rodó sobre una superficie para aflojar el embrión y el endospermo dentro de los granos. La mazorca se rompió en dos piezas, cada una de aproximadamente 750 milímetros de longitud. Cada pieza se puso en un recipiente de centrífuga de 250 mililitros con aproximadamente 100 mililitros de agua. Estas se centrifugaron 15 minutos a 5000 rpm para expulsar los embriones. El examen de las mazorcas después de la centrifugación mostró que, en algunas porciones de la mazorca, todos los embriones habían sido removidos por la centrifugación, mientras que en otras áreas se removieron pocos embriones o ninguno. El material expulsado se centrifugó y el sobrenadante se removió para dejar una suspensión que contenía embriones intactos (se estimó que incluían aproximadamente 20 por ciento del número total de embriones). En otro ejemplo, una mazorca inmadura de maíz se cosecha (normalmente entre 10 y 14 días después de la polinización). La mazorca se desinfesta y la parte superior de cada grano se corta bajo condiciones estériles. La mazorca se monta sobre una broca de un taladro eléctrico (o dispositivo similar) y se rodea con un recipiente de recolección estéril grande (por ejemplo un matraz de vidrio grande). La mazorca se centrifuga a una rotación suficiente para expulsar los embriones inmaduros y los tejidos expulsados se recogen del contenedor estéril. Los embriones inmaduros se recogen, por ejemplo, por medio de recolección manual, o enjuagando el contenedor con medio de cultivo de tejidos estéril y recuperando una fracción enriquecida que contiene los embriones (por ejemplo tamizando, mediante el uso de un gradiente de densidad de líquido, o mediante otro método para separar los embriones de los tejidos no embriónicos como se describe en otra parte de esta descripción). Los embriones inmaduros (o callos derivados de los embriones inmaduros) se pueden usar subsiguientemente para transformación. Se pueden obtener mejores resultados usando estos y otros métodos de centrifugación determinando los tiempos y velocidades de centrifugación preferidos por medio de análisis rutinario. Otra modalidad emplea maceración en masa de los granos. Se cosecha una mazorca inmadura de maíz (normalmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 14 días después de la polinización).

La mazorca se desinfesta. El pericarpio se puede abrir bajo condiciones estériles o los granos se pueden dejar intactos. Los granos se remueven de la mazorca mediante cualquier procedimiento adecuado que incluye, sin limitación, el uso de un escalpelo u otra herramienta de cuchilla. Los granos, una vez separados de la mazorca, se colocan en un medio de cultivo de tejidos. La mezcla grano-medio se puede someter a rompimiento de tejido adicional usando un dispositivo de corte adecuado, tal como por ejemplo, sin limitación, un mezclador. Los embriones inmaduros se recogen, por ejemplo, mediante recolección manual, o enjuagando el contenedor con un medio de cultivo de tejidos estéril y recuperando una fracción enriquecida que contiene los embriones (por ejemplo tamizando o usando un gradiente de densidad de líquido u otros métodos para separar los embriones de los tejidos no embriónicos, como se describe en otra parte de esta descripción). Los embriones inmaduros (o callos derivados de embriones inmaduros) se pueden usar subsiguientemente para transformación. En una modalidad adicional se pueden usar chorros de fluido (de gases o líquidos o combinaciones de los mismos) para desalojar los embriones. Un ejemplo de este enfoque es girar automáticamente una mazorca de maíz de una manera gradual o continua (helicoidal) por un chorro estacionario, recogiendo el material expulsado que contiene los embriones y además aislando los embriones si es necesario, por ejemplo por separación por tamaño en una malla o tamiz o similar. Cuando la mazorca de maíz se orienta verticalmente (con respecto a su eje longitudinal) puede ser preferible girar la mazorca en una dirección helicoidal ascendente, o de otra manera mover la mazorca con respecto al chorro de tal manera que los embriones extraídos puedan lavarse en dirección descendente. En otra modalidad se puede usar desaceleración lineal o aceleración lineal para desalojar o expulsar los embriones. Por ejemplo, a una mazorca de maíz se le puede administrar un choque, paralelo al eje longitudinal de la mazorca y de fuerza suficiente para expulsar los embriones y endospermos. Una mazorca de maíz se puede encerrar en un sostén estéril adecuado, resistente a impactos fuertes, que puede ser sometido a aceleración o desaceleración repentina, por ejemplo por medio de un impacto penetrante (por ejemplo, como de un mazo). Otro mejoramiento del método sería facilitar la expulsión o extrusión del embrión de la semilla truncada. Por ejemplo, los embriones se pueden aflojar o desalojar de su posición natural dentro de la semilla aplicando una fuerza a las partes superiores de semillas intactas (por ejemplo aplicando un rodillo u otros medios para aplicar presión a las partes superiores de las hileras de los granos de maíz en una mazorca intacta, o rodando u oprimiendo las mazorcas mismas sobre una superficie antes de descabezar las partes superiores de los granos). Los embriones también se pueden aflojar dentro de la semilla por aplicación de vibración, por ejemplo por ultrasonido. Otro enfoque sería remover tejido no embriónico adicional, tal como material de la pared lateral (pericarpio) adicional, antes de la expulsión o extrusión del embrión. Por ejemplo, se puede usar una cuchilla en forma de V u otro instrumento para remover parte de las paredes laterales de los granos de maíz de las hileras de la mazorca.

EJEMPLO 7 Aislamiento automático de embriones usando presión positiva de chorro de fluido Este ejemplo describe una modalidad adicional de la presente invención. En este ejemplo, un dispositivo automático utiliza presión positiva de chorro de fluido para desalojar los embriones de las semillas. Haciendo referencia a la figura 2, un asidero robótico (preferiblemente capaz de moverse en tres dimensiones por medio del robot A y el motor B, o unos medios equivalentes) toma una mazorca de maíz I (por medio de un mango D que tiene un deflector E) en una posición definida para una cremallera sobre la cubierta del robot. El robot inserta la mazorca de maíz en el tubo H (hecho opcionalmente de un material transparente para facilitar la observación visual) en una posición inicial debajo de la pestaña F. Se introduce presión positiva de chorro de fluido a través de la abertura G y simultáneamente la mazorca se eleva (en la dimensión Y) y es girada por el robot A y el motor B, preferiblemente ocasionando que cada grano sea golpeado por el chorro de fluido, desalojando el embrión y endospermo. El fluido que pasa a través de la abertura G puede ser por lo menos un gas, por lo menos un líquido, o cualquier combinación de los mismos. El chorro de fluido puede ejercer fuerza continuamente o discontinuamente, por ejemplo como en impulsos. Conforme los embriones y endospermos son desalojados por la presión positiva del chorro de fluido de la abertura G, caen en el tamiz agitado J, que retiene los endospermos permitiendo que los embriones caigan a través de la superficie de recolección K (por ejemplo estopilla estéril) hacia abajo. Opcionalmente el exceso de fluido puede ser recogido en el receptáculo de desecho o reciclado L. Después de terminar el proceso de remoción del embrión de cada mazorca de maíz, el interior del tubo se puede lavar brevemente de forma manual o mediante chorro automático arriba o debajo de la pestaña F.

EJEMPLO 8 Métodos de procesamiento de preparaciones de embrión crudo Las preparaciones de embrión obtenidas mediante los métodos que se describen en los ejemplos 1 a 7 pueden incluir tanto embriones intactos como embriones parciales, que pueden estar acompañados por tejidos no embriónicos tales como endospermo y glumas. Algunas aplicaciones pueden no requerir otros pasos de separación o tratamiento, por ejemplo, en una transformación en masa de dicha preparación "cruda" de embriones, en donde los embriones (intactos o parciales) no necesitan ser separados del tejido no embriónico. Por ejemplo, puede usarse callo derivado de embriones de maíz inmaduros intactos o parciales para transformación, regeneración y producción de plantas transgénicas fértiles. De esta manera, embriones intactos y parciales pueden servir como explantes transformables, y no necesitan ser separados unos de otros. Sin embargo, en otros casos, puede ser deseable purificar adicionalmente los embriones de una preparación cruda de embriones. Procedimientos en donde pueden encontrarse algunas dificultades en el procesamiento de preparaciones crudas de embriones, incluyen: (1) enjuague de tejido no embriónico (por ejemplo, restos de células, granos de almidón, proteínas no deseables), (2) remoción eficiente del exceso de líquido de los embriones después de extrusión o enjuague usando líquido, y (3) adición de líquido con turbulencia mínima, de modo que los embriones floten y no lleguen a sumergirse. Un material poroso es útil para separar tejido no embriónico de los embriones. Puede usarse cualquier material poroso adecuado, de preferencia que tenga un tamaño de malla o agujero bastante pequeño para que retenga los embriones, pero que deje que pasen tejidos o restos no embriónicos más pequeños, y capaz de ser esterilizado (por ejemplo, por tratamiento en autoclave, calor, irradiación o esterilización química). La conveniencia de los materiales es juzgada o puesta a prueba fácilmente por medio de experimentación simple por el experto en la técnica. Ejemplos de materiales adecuados incluyen estopilla u otro material tejido, y otras mallas o tamices. En algunas modalidades, pueden usarse materiales sólidos perforados, que incluyan materiales cerámicos perforados, polímeros, metales o vidrios (por ejemplo, en la forma de un embudo de Büchner o embudo de separación similar). La estopilla de calibre adecuado, por ejemplo, tiene un tamaño de malla bastante pequeño para retener los embriones, pero permite que los restos más pequeños pasen a través de ella, y es tratada en autoclave. La estopilla puede ser unida a un armazón o collar (por ejemplo, el armazón que sostiene la superficie de recolección K de embriones en la figura 2 y descrita en el ejemplo 7), que permite que la estopilla y todos los embriones retenidos sean sumergidos simultáneamente para fácil enjuague. Por ejemplo, la estopilla puede ser unida fácilmente al armazón por medio de una banda elástica, o su similar (por ejemplo, tubería de silicón); dichos armazones se fabrican fácilmente, por ejemplo, de un vaso de precipitado o cilindro graduado hecho de material esterilizable en autoclave cortado en secciones (por ejemplo, polipropileno, polimetilpenteno, policarbonato o vidrio esterilizable en autoclave). La estopilla tiene fuerte capilaridad, que permite que el líquido sea apartado eficientemente de los embriones, exponiendo de esta manera su epidermis cerosa al aire antes de la flotación. En el paso de flotación, la estopilla simplemente es sumergida en un líquido acuoso que permite que los embriones floten.

EJEMPLO 9 Aislamiento sustancial de embriones usando un chorro de fluido Este ejemplo describe otra modalidad de la presente invención.

En este ejemplo, se desalojaron embriones múltiples de semillas por presión positiva de chorro de fluido. En el ejemplo más simple, se unió la punta de una pipeta de 200 microlítros a una boquilla disipadora vertical con Parafilm®. Cuando se abrió el agua corriente, emerge un chorro de la punta de la pipeta con fuerza considerable. Se calculó que la presión del agua corriente es de aproximadamente 4.218 kg/cm2. Este chorro de fluido (líquido) fue arrastrado sobre una mazorca de maíz inmadura (contenida en un vaso de precipitado), en donde los granos habían sido descabezados como se describió en el ejemplo 1. Conforme el chorro se adhería a cada grano, el endospermo y el embrión eran expulsados y recolectados en el vaso de precipitado. Puesto que el endospermo en esta etapa es un tejido relativamente blando, fue fragmentado en muchas piezas más pequeñas por el chorro, mientras los embriones parecieron seguir intactos. El tejido del embrión y el endospermo desalojado por el chorro se vertió directamente sobre una estopilla número 60 (podía sustituirse con otro material poroso adecuado, tal como malla hidrofílica del tamaño de malla adecuado). Diferentes "grados" de estopilla están disponibles (por ejemplo, los grados 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 y 90, en donde las aberturas de la malla disminuyen con los grados superiores), y el grado o tamaño de malla adecuado para el tamaño promedio y la forma de un tipo de embrión determinado, se selecciona fácilmente por experimentación simple. Los embriones y fragmentos más grandes del endospermo se retuvieron sobre la superficie superior de la estopilla. Antes del siguiente paso, se dejó que la estopilla se secara parcialmente eliminando el exceso de líquido. Este líquido se arrastró de los tejidos, y expuso las superficies de los embriones al aire. Cuando se redujo el contenido de líquido acuoso de la estopilla, los embriones flotaron debido a que su epidermis cerosa no se remojó. En un plan simple, la estopilla (u otro material poroso adecuado) puede estirarse manualmente o mantenerse sobre un receptáculo o contenedor de desecho conforme el líquido que contiene a las preparaciones crudas de embriones se vierte a través de la estopilla. Para trabajo estéril, la estopilla puede ser unida a armazones rígidos, los cuales se pueden esterilizar en autoclave antes de su uso. También podrían usarse en el método tamices con asas ensamblados a presión, tales como los disponibles en almacenes de suministros de cocinas,.

EJEMPL0 10 Dispositivos para la extracción de embriones usando un chorro de fluido Este ejemplo describe varias modalidades de un aparato para preparar mecánicamente embriones de maíz múltiples adecuados para cultivo de tejidos. Una modalidad incluye un aparato para preparar múltiples embriones de maíz usando un chorro de fluido, en general similar al dispositivo descrito en la figura 2. Se hizo un cilindro transparente de extremos abiertos cortando los extremos de un cilindro graduado de 1 litro de polimetilpenteno (PMP) esterilizado en autoclave. La punta de una pipeta (Gilson Distritip de 1250 microlitros, ahusada para evitar la acumulación de contrapresión) se aseguró al costado del cilindro, y sirvió como una abertura para guiar una corriente de fluido como un chorro a través de un agujero hecho en la pared del cilindro. Se alimentó fluido (en este caso, agua) a través de la punta de la pipeta a partir de tubería de bomba peristáltica de alta presión PharMed® esterilizada en autoclave; el agua se suministró desde la terminal de un vertedero de laboratorio, pero podría ser un fluido acuoso suministrado desde una bomba u otra fuente. Se prefiere el uso de una bomba capaz de suministrar un fluido estéril cuando, por ejemplo, se encuentra que el medio de cultivo estéril o una solución salina estéril es superior al agua como un líquido para el aislamiento sustancial de embriones. Un ejemplo de una bomba adecuada es una bomba Masterflex con la cabeza de bombeo de alta presión L/S, la cual puede suministrar líquido estéril hasta 7.03 kg/cm2 cuando se usa con tubería de alta presión. Una mazorca de maíz con granos previamente descabezados se colocó manualmente dentro del cilindro. Una vez que la mazorca se colocó adecuadamente dentro del cilindro, cada grano se sometió a presión positiva del chorro de agua. Esto hizo que los embriones y tejidos no embriónicos fuesen extruidos de los granos. El examen de la mazorca después de este tratamiento indicó remoción eficiente de los embriones de los granos. El material extruido se arrastró de las paredes interiores del cilindro hacia un recolector de embriones colocado bajo el cilindro. El recolector de embriones incluía: (1 ) un tamiz de plástico grueso (sobre el cual se atraparon restos más grandes), fusionado con calor a la parte superior cortada de un vaso de precipitado de plástico Tri-Pour™, y apilado arriba de (2) un tamiz más fino (estopilla grado 60, sobre la cual los embriones extruidos fueron atrapados), asegurado con una banda elástica a la parte superior cortada de un segundo vaso de precipitado de plástico Tri-Pour™, y apilado arriba de (3) un vaso de precipitado de recolección de desechos u otro contenedor (en el cual se recolectaron desechos finos, tejidos no embriónicos y líquido de desecho). Modificaciones a estas modalidades y modalidades similares, son hechas fácilmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, con respecto a la colocación de la mazorca o semilla de maíz para la aplicación del chorro de fluido, la mazorca pudo mantenerse manualmente en su lugar, o de preferencia montarse con seguridad dentro del cilindro por medio de un soporte movible capaz de mover la mazorca en tres dimensiones. Por ejemplo, la mazorca pudo montarse a una varilla de polímero o metal roscada, tal como una varilla de polipropileno, la cual pudo usarse para mover la mazorca a lo largo de su eje longitudinal, así como para que girara la mazorca). Otro ejemplo de un mecanismo de montaje se describe en la figura 3, que ilustra un "mango" magnético mediante el cual se puede asegurar una mazorca en un brazo robótico. En otras modalidades, sin embargo, la mazorca o mazorcas de maíz no necesitan ser aseguradas individualmente a un sostén, pero pueden ser movibles libremente para permitir que múltiples granos hagan contacto por la fuerza usada para remover los embriones de los granos. Por ejemplo, por lo menos una mazorca, o múltiples mazorcas, pueden ser llevadas sobre por lo menos un soporte o mantenidas entre el mismo, tal como por ejemplo, sin limitación, por lo menos un plano, armazón, rejilla, tamiz, malla, plataforma, rodillo, alambre guía o varilla, y correa, rueda o transportador de rodillos. Dicho soporte podría ser movible, o podría hacer que la mazorca o las mazorcas se muevan, por ejemplo, por vibración, movimiento rodante, gravedad, u otros mecanismos. Embriones sustancialmente aislados podrían pasar a través de la plataforma misma, si la plataforma fuese porosa (por ejemplo, hecha de malla). La mazorca o las mazorcas pueden hacerse flotar también sobre un fluido en una forma que permita que cada mazorca gire o de otra manera se mueva libremente mientras flota. El fluido, tal como un líquido que contiene a los embriones sustancialmente aislados, podría ser drenado continuamente, opcionalmente a través de un dispositivo de filtración o sedimentación, o podría ser recolectado por centrifugación. Dispositivos para lograr movimiento a lo largo del eje longitudinal de una mazorca de maíz incluyen, sin limitación, correderas accionadas por tornillos de bola, o correderas accionadas por correas, tales como las disponibles comercialmente de varios fabricantes tales como Techno, Inc. (technoisel.com). Para obtener movimiento giratorio para hacer girar una mazorca de maíz, puede usarse un motor paso a paso, por ejemplo, un motor paso a paso unido a una placa corrediza. El movimiento giratorio puede ser provisto también por dispositivos rodantes, por ejemplo, por rodillos redondos o tubulares paralelos entre los cuales la mazorca de maíz sea sostenida y se haga girar. La forma del chorro de fluido puede modificarse en forma ventajosa de acuerdo a la aplicación deseada. Por ejemplo, un chorro en forma de columna estrecha de diámetro uniforme es útil para remover embriones de una semilla a la vez. En donde sea deseable incrementar la velocidad a la cual los embriones son aislados sustancialmente, pueden removerse simultáneamente embriones múltiples de su semilla por medio de un chorro de fluido; esto puede lograrse, por ejemplo, usando por lo menos un chorro de fluido individual que cubra una gran área, o usando simultáneamente chorros múltiples. En una modalidad, chorros múltiples, tales como chorros columnares, estrechos, paralelos y múltiples (por ejemplo, producidos por boquillas múltiples similares a las usadas en el ejemplo 9 y conectadas opcionalmente entre sí por un múltiple), se usan para dirigir chorro de fluido de presión positiva sobre semillas múltiples para aislar sustancialmente sus embriones sustancialmente en forma simultánea. La automatización de estos y otros dispositivos puede incluir además sensores ópticos o de masa que ayudan en la colocación mutua de la mazorca y el chorro de fluido. En otra modalidad, puede usarse por lo menos un chorro de fluido que cubra una gran área (por ejemplo, en donde el chorro de fluido impacte simultáneamente granos múltiples, o hileras múltiples de granos en una mazorca de maíz). Las dimensiones de dicho chorro permiten de preferencia que el chorro entre a los granos y arrastre el embrión. Típicamente, los embriones de maíz usados en experimentos de genética son inmaduros, y generalmente en la escala de tamaño de aproximadamente 1.8 a aproximadamente 2.2 mm de longitud; los granos que contienen a estos embriones inmaduros, están generalmente en la escala de tamaño entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5 mm de ancho. Para embriones de este tamaño puede usarse un chorro de fluido adecuado, por ejemplo, entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 1 mm de ancho. Puede usarse cualquier medio adecuado para producir dicho chorro de fluido más grande, tal como por ejemplo, sin limitación, boquillas que generen chorros de fluido no columnares. Ejemplos de boquillas adecuadas incluyen, sin limitación, boquillas que generan un patrón de rociadura plano y boquillas que generan un patrón de rociadura en forma de cono o abanico. En un ejemplo, se usó una boquilla rociadora plana disponible comercialmente (número 23990-1/4-04, de Spraying Systems Co., Dillburg, PA), con una bomba Masterflex L/S (modelo 77250-62), para bombear líquido a 1 litro por minuto y 2.109 kg/cm2; se extirparon embriones de una mazorca de maíz bajo estas condiciones. Otro ejemplo de una boquilla preferida, es una boquilla que genere un chorro de fluido en la forma de una "lámina" plana de fluido, tal como se describe en la figura 4. Dicha boquilla es de preferencia capaz de generar un chorro de fluido plano uniforme que mantiene un flujo tipo lámina uniforme coherente por cuando menos una distancia suficiente para permitir que el flujo haga contacto con más de una semilla (y de preferencia varias semillas) al mismo tiempo. La boquilla novedosa descrita en la figura 4 está diseñada para generar un chorro plano uniforme de tipo lámina que tiene de aproximadamente 0.5 mm a aproximadamente 1 mm de espesor, más de aproximadamente 20 mm de ancho, y mantiene el flujo de tipo lámina sobre una distancia de aproximadamente 20 mm a aproximadamente 25 mm desde la abertura de la boquilla. Esta última distancia permite que el chorro sea movido a lo largo de las hileras de granos con ajuste mínimo necesario para diferencias en distancia entre la superficie de los granos y la abertura de la boquilla. Sin considerar el área o la forma del chorro o patrón de rociadura generado por la boquilla o abertura a través de la cual fluye el líquido, se usan de preferencia boquillas o aberturas con magnitudes de flujo y presiones suficientes para generar suficiente fuerza de fluido para desalojar el embrión de su semilla, sin dañar el embrión. En algunas modalidades, se prefiere usar una magnitud de flujo menor y posiblemente una presión mayor, para reducir al mínimo el consumo de fluido (tal como medio), así como para minimizar el desecho generado.

EJEMPL0 11 Uso de un chorro de gas para aislar sustancialmente embriones Este ejemplo describe otras modalidades de métodos y dispositivos para preparar mecánicamente múltiples embriones de maíz adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Como se describe en el ejemplo 6, pueden usarse también chorros de gas para el aislamiento sustancial de múltiples embriones. Un aparato similar al descrito en el ejemplo 10 fue modificado para su uso con gas. Se aseguró la punta de una pipeta de 1 mm (número de catálogo TN1300RS, Marsh Bio Products) al costado del cilindro, y sirvió como una abertura para guiar una corriente de aire como un chorro a través de un agujero hecho en la pared del cilindro. Se suministró aire desde un compresor presurizado entre aproximadamente 4.218 y aproximadamente 7.03 kg/cm2. Se colocó por conveniencia una válvula de aire en línea entre el compresor y la punta de la pipeta. El chorro de aire que emerge de la punta de esta pipeta se usó para desalojar los embriones de una mazorca de maíz preparada. El examen de los granos después de que habían sido sometidos al chorro de aire mostró que el pericarpio grueso permaneció en su lugar, y estuvo rodeado de glumas delgadas como el papel, y que el contenido del pericarpio (embrión y endospermo) había sido removido. El examen del tejido retenido por la estopilla grado 60 mostró que ésta incluía embriones desalojados, así como algunas glumas desalojadas por el chorro de aire a alta presión. Las glumas de maíz tienen una superficie cerosa tal como los embriones, y flotan también siguiendo el procedimiento de flotación. El uso de presiones de aire menores, puede reducir la contaminación de las glumas.

EJEMPLO 12 Aislamiento sustancial de embriones usando otras fuerzas de fluido Este ejemplo describe otras modalidades de métodos y dispositivos para preparar mecánicamente múltiples embriones de maíz adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. Pueden usarse fuerzas ejercidas por fluidos, más que la presión de fluido positiva de un chorro de fluido, para aislar sustancialmente los embriones. En un experimento, se removieron los ápices de los granos de una mazorca de maíz, la cual se puso dentro de una botella que contenía agua destilada estéril, y se agitó vigorosamente con la mano. Esto resultó en el aislamiento sustancial de 90 de los 200 embriones de la mazorca. Otro experimento repitió el procedimiento anterior, salvo que la agitación se llevó a cabo en un agitador de pintura mecánico. En este experimento, se aislaron sustancialmente 56 embriones de los 190 embriones de la mazorca. En un tercer experimento se llevó a cabo un procedimiento similar, salvo que la mazorca de maíz fue pre-remojada en medio 211 , y la agitación se llevó a cabo en un agitador de pintura. En este experimento, se aislaron sustancialmente 109 embriones de los 210 embriones de la mazorca. En estos casos, la fuerza de fluido no del chorro del movimiento del líquido alrededor de la mazorca de maíz, resultó en el aislamiento sustancial de los embriones; la fuerza de fluido podría incluir flujo de fluido turbulento, flujo de fluido laminar, corte de flujo de fluido, presión de fluido negativa (por ejemplo, que resulta de cavitación), o combinaciones de los mismos. Las fuerzas pueden incluir también fuerzas generadas por técnicas acústicas, tales como por una onda u ondas acústicas (impulsadas o continuas) en fase de gas o fluido. Los ejemplos anteriores (incluyendo los ejemplos 9 a 11 ) describieron el uso de un chorro de fluido para remover embriones de una mazorca inmadura. Durante estos procedimientos, se observó que el chorro de fluido hizo también generalmente que por lo menos parte del endospermo fuese liberado del grano. Se observó que el tejido del endospermo es más blando y más friable que los embriones, y tendió a desintegrarse a grados variables (en contraste a los embriones, los cuales tendieron a permanecer intactos). Es posible que los endospermos se desintegren tras la exposición al esfuerzo cortante causado por el chorro de fluido. Se piensa que este esfuerzo cortante no es uniforme, resultando en la variabilidad de la desintegración observada; no obstante, una gran proporción del material del endospermo que se desintegró suficientemente pasa a través de la estopilla, dejando un material retenido formado de una preparación semipura de embriones. Cuando un chorro de baja presión de una botella de chorro de laboratorio ordinaria fue dirigido al material retenido de la estopilla, más del tejido restante del endospermo fue desintegrado y lavado a través de la estopilla, dejando atrás una preparación relativamente más pura de embriones. De esta manera, es razonable predecir que si el material retenido es uniformemente expuesto a una fuerza de corte de la intensidad correcta, todo o sustancialmente todo el endospermo restante debe desintegrarse y pasar a través de la estopilla. Dicha fuerza de corte podría ser generada por cualquier medio adecuado tal como por ejemplo, sin limitación, un chorro individual, chorros múltiples, un chorro de tipo cortina o de tipo lámina, chorros de movimiento rápido, y aceleración o desaceleración de los endospermos. Además, si el chorro usado para liberar inicialmente los contenidos del grano está diseñado para exponer una mayor proporción de los endospermos a esfuerzo cortante durante la expulsión, podría obtenerse una preparación de embriones de pureza inicial mayor. Se describe a continuación una modalidad no limitada para la aplicación de esfuerzo cortante para purificar adicionalmente los embriones. Una vez que los embriones y endospermos parcialmente desintegrados se liberan de una mazorca de maíz, el resto del endospermo puede fragmentarse rápidamente por medio de flujo de fluido, por ejemplo, de una boquilla rociadora, que golpee al endospermo uniformemente y simultáneamente. Un tipo adecuado de boquilla, es una boquilla de cono completo. Las boquillas de cono completo generan un patrón de rociadura completamente lleno de gotas. Un aspa interna dentro de la boquilla imparte turbulencia controlada al líquido antes de que salga hacia el orificio, permitiendo la formación del patrón de rociadura. Boquillas disponibles comercialmente tienen patrones de rociadura que son redondos, cuadrados u ovaladas. Un ejemplo de una boquilla de cono completo adecuada, se conoce como "boquilla rociadora UniJet, de rocío estándar de capacidad pequeña" (número de parte TG-SS0.3).

EJEMPLO 13 Dispositivos de combinación Este ejemplo describe varias modalidades adicionales del método de la invención, las cuales usan una combinación de fuerzas para aislar sustancialmente embriones múltiples de semillas. Las figuras 5A-5B ¡lustran un dispositivo que usa un chorro de fluido más grande (como se describe en el ejemplo 10). Este dispositivo incluye una boquilla para generar un flujo de fluido tal como un chorro de fluido más grande (por ejemplo, un chorro de fluido plano) y, opcionalmente, una cabeza de succión, o componente para aplicar presión de fluido negativa (por ejemplo, por vacío o succión), para desalojar embriones y/o para colectar los embriones desalojados. La figura 5A describe una vista en sección transversal de un ejemplo de dicho dispositivo, que muestra cómo la boquilla, la cabeza de succión opcional y la mazorca de maíz, pueden ser colocadas una respecto de la otra. La mazorca de maíz, boquilla y cabeza de succión opcional pueden ser movidas una respecto de la otra; por ejemplo, la mazorca de maíz puede ser estacionaria, mientras que la boquilla y la cabeza de succión opcional son movibles, o la boquilla y la cabeza de succión pueden ser estacionarias, mientras que la mazorca de maíz es movible. La figura 5B describe esquemáticamente una mazorca de maíz colocada en el dispositivo, y muestra la boquilla colocada para generar un chorro de fluido plano en donde el chorro choca con múltiples granos en una hilera. La figura 6 describe una modalidad de una cabeza de succión o componente adecuado para aplicar presión de fluido negativa (por ejemplo, por medio de vacío o succión), tal como se usa opcionalmente en el dispositivo de las figuras 5A-5B y la cual puede usarse también para aislar sustancialmente embriones. La cabeza de succión puede incluir una o más aberturas a través de las cuales puede aplicarse presión de fluido negativa. La cabeza de succión puede incluir también medios para dispensar fluido (tal como gas o líquido, por ejemplo, agua o medio), por ejemplo, aberturas múltiples en la cabeza de succión. Para su uso con maíz, de preferencia la cabeza de succión está configurada para seguir los contornos de una mazorca de maíz típica, y de preferencia es capaz de atrapar múltiples embriones de granos o de múltiples hileras de granos. Se contempla que la cabeza de succión pueda fabricarse de un material rígido (tal como acero inoxidable u otros metales), o de un material flexible que permita la conformación más fácil de la cabeza de succión a los contornos de una mazorca de maíz, o de combinaciones de los mismos. Los embriones pueden aislarse sustancialmente por medio de cualquier combinación de presión positiva mecánica (ejercida, por ejemplo, por un borde saliente de la cabeza de succión), presión de fluido negativa (por ejemplo, succión o vacío) y fuerza de fluido (tal como por ejemplo, sin limitación, presión positiva de un chorro de fluido, flujo de fluido turbulento y flujo de fluido laminar que atrape material de interior del grano). Dispositivos para la aplicación de fuerza para aislar sustancialmente embriones, tal como se describe en los ejemplos 1 , 3, 4, 6, 7, 9, 10 y el presente ejemplo (incluyendo, sin limitación, los dispositivos ilustrados en las figuras 5A-5B y 6), pueden ser movidos respecto a la mazorca de maíz. La mazorca puede ser estacionaria, o el dispositivo puede ser estacionario, o ambos pueden ser movibles. Debido a que la semilla de maíz ocurre típicamente en hileras relativamente uniformes dispuestas paralelas al eje longitudinal de la mazorca de maíz, el dispositivo es movido típicamente (respecto a la mazorca), de modo que el dispositivo pasa paralelo al eje longitudinal de la mazorca de maíz, y siguiendo una hilera o hileras múltiples de granos. Sin embargo, el movimiento de dichos dispositivos respecto a la mazorca de maíz puede seguir la circunferencia de la mazorca, o puede ser al azar, o puede ser una combinación de movimientos adecuados. Las figuras 7A a 7C representan diferentes vistas de una modalidad de un dispositivo que usa una combinación de fuerzas para aislar sustancialmente embriones múltiples de semilla (en este ejemplo, maíz). Este dispositivo incluye una cabeza con un borde saliente capaz de aplicar una cantidad predefinida de presión mecánica a la base de los granos, que previamente han tenido el pericarpio abierto o truncado, de modo que los embriones son extruidos de los granos en una forma similar a la descrita en los ejemplos 1 , 3 y 4. El dispositivo incluye además un componente para aplicar presión de fluido negativa (por ejemplo, por vacío o succión) para desalojar embriones, y/o para colectar los embriones desalojados. Los embriones extruidos (y tejidos no embriónicos acompañantes) son de esta manera separados de la mazorca de maíz, y pueden colectarse por aplicación de fuerza de fluido negativa. Los embriones y tejidos no embriónicos colectados pueden separarse además, si se desea, por medios adecuados, tales como por separación por tamaño, separación hidrofóbica o centrifugación diferencial. Una variación de este dispositivo podría incluir medios para dispensar fluido (tal como líquido, por ejemplo, agua o medio), por ejemplo, múltiples aberturas en la cabeza de succión. Los dispositivos para la extracción de embriones descritos en las figuras 5A-5B, 6 y 7A-7C, se describen como ejemplos ilustrativos que no se consideran limitativos. Estos y otros de dichos dispositivos pueden incluir componentes adicionales, por ejemplo, medios para separar los embriones de los tejidos no embriónicos, o de fluidos usados sustancialmente en el proceso de aislamiento.

EJEMPLO 13 Datos de viabilidad Los múltiples embriones de monocotiledóneas provistos por el uso de los métodos y dispositivos de la presente invención, son muy preferiblemente embriones adecuados para transformación genética o aplicación en cultivo de tejidos, tal como la transformación y regeneración de plantas. Este ejemplo ¡lustra además la utilidad de los métodos de la invención para proveer múltiples embriones de monocotiledóneas que son viables y adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. En este ejemplo, se comparó la calidad de los embriones de maíz inmaduros obtenidos por diferentes métodos de excisión, en su respuesta a la transformación por Agrobacterium tumefaciens. Para la transformación, se usó un plásmido que contenía secuencias de borde izquierdo y derecho, un gen para resistencia a glifosato para selección, y un gen reportero (gfp, que codifica para proteína fluorescente verde). Se sembró por estría Agrobacterium que contenía este plásmido de una reserva de glicerol congelada sobre una placa de LB y desarrollada por 3 días en una incubadora a 28 grados Celsius. Se preparó un cultivo de semillas inoculando tres colonias de la placa de LB en 25 ml de caldo de LB, el cual se incubó 15 horas a 27 grados Celsius con agitación (200 rpm). Este cultivo de semillas (10 mililitros) se diluyó con 40 mililitros de caldo fresco de LB, y se desarrolló por 6 horas a 200 rpm a 27 grados. Se centrifugó el Agrobacterium por 10 minutos, y la pella se resuspendió a una densidad óptica de 0.2 a 660 nanómetros en medio de inducción mínimo AB. Este se incubó 15 horas a 27° Celsius con agitación (200 rpm). El cultivo de Agrobacterium se centrifugó por 10 minutos, y la pella se lavó con 10 ml de Lynx 1040 y se resuspendió en 5 ml de medio de inoculación. La densidad óptica se ajustó a 1.0, y se usó para inoculación.

Se llevaron a cabo cuatro experimentos (designados como A, B, C y D, respectivamente). Cada experimento comparó embriones obtenidos por excisión manual con embriones obtenidos por medio de un método de la presente invención: excisión por un chorro de líquido (experimentos A, B y D) o excisión por un chorro de gas (experimento C). El chorro de líquido en los experimentos A y B usó agua corriente ordinaria, y una boquilla hecha de la punta de una pipeta. El experimento C puso a prueba un chorro de gas usando aire de una bomba de aire comprimido y una boquilla hecha de la punta de una pipeta. El chorro de líquido en el experimento D usó la mitad de medio MSPL como el líquido, y una boquilla de corriente de sólido con un diámetro de orificio equivalente de 0.0508 cm (número de catálogo TP000050-SS, División Agrícola de Spraying Systems Co., Dillburg, Pennsylvania). Se cosecharon mazorcas de maíz doce días después de la polinización, y se esterilizaron por remojo en una botella de 1 litro de etanol a 80% por 3 minutos. Los embriones se extirparon manualmente cortando el tercio superior del grano con un escalpelo, y removiendo el embrión del grano usando una espátula angosta. Los embriones recogidos se extirparon en 1 ml de medio MSPL 1/_> en un tubo de microcentrífuga individual (Eppendorf). El medio se removió y se reemplazó con 1 ml de Agrobacterium tumefaciens preparado como se describe a continuación. Se aislaron también sustancialmente embriones usando un chorro de fluido (líquido o gas), siguiendo procedimientos similares a los descritos en los ejemplos 10 y 11. El chorro de fluido se usó para extirpar los embriones restantes en las mazorcas después de remover la tercera parte superior del grano con un escalpelo. Se colocó la mazorca de modo que el chorro de fluido fuese dirigido a granos cortados individuales en sucesión para desalojar tanto el embrión como el tejido no embriónico (endospermo). Los contenidos del grano removidos de la mazorca se hicieron pasar a través de un tamiz grueso para remover grandes piezas de endospermo, y los embriones se recolectaron sobre estopilla estéril. Se transfirieron los embriones usando una espátula pequeña de la estopilla en un tubo de microcentrífuga que contenía 1 ml de la mitad de medio MSPL. Después de que se recolectaron todos los embriones, el medio MSPL Vi se removió y se reemplazó con 1 ml de inoculante de Agrobacterium tumefaciens. Los embriones preparados por medio de los varios métodos de excisión, se sometieron a los mismos procedimientos de inoculación, selección y regeneración. Se han descrito procedimientos adecuados, que incluyen descripciones de medios y reactivos, para la transformación de plantas usando selección por glifosato y GFP como un reportero, en la solicitud de patente de EE. UU. número de publicación 2004/0244075 de Cai y otros, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Se inocularon embriones con 1.0 ml de Agrobacterium por 5 minutos. Los contenidos del tubo de microcentrífuga se vertieron sobre una placa de medio de cocultivo, y se cocultivaron por 18 horas a 23 grados Celsius. Se transfirieron después los embriones a medio MS de inducción, y se cultivaron a 30 grados Celsius por 13 días. Los callos derivados de la transformación se cultivaron a 27 grados Celsius por 11 días antes de la regeneración. En este tiempo, se hizo el conteo de sectores positivos para GFP usando un microscopio de fluorescencia. Para la regeneración, los callos derivados de cada embrión se transfirieron individualmente a medio MS/6 BA, y se cultivaron en un sitio iluminado por 7 días, después de lo cual cada callo en proceso de enverdecimiento se transfirió a medio MSOD, y se regresó al sitio iluminado por otros 17 días. Los brotes resultantes se transfirieron a Phytatrays que contenían medio de regeneración (que consistía de 2.165 g de sales básales MS, 5 ml de vitaminas MS 100X y 20 g de sacarosa, completados hasta 1 litro en agua, y esterilizado en autoclave, pH ajustado con KOH a 5.8, solidificado por esterilización en autoclave con 3 g de Phytagel, y con 0.75 ml de 1 mg por ml de ácido indol-3-butírico, 0.5 ml de 1 mg por ml de ácido 1-naftalenacético y 0.2 ml de glifosato 0.5 molar añadido). Después de aproximadamente 3 semanas, las plantas transgénicas se robustecieron trasplantando brotes enraizados en macetas de turba que contenían mezcla de suelo, y se desarrollaron a 26 grados Celsius. Los resultados de estos experimentos se resumen en el cuadro 1. El número de embriones que fueron transformables se calcula a partir del número de embriones positivos para GFP. La frecuencia de regeneración y transformación general se da como el porcentaje de plantas positivas para GFP regeneradas de los embriones inoculados. Estos resultados demuestran que varios métodos y dispositivos de la presente invención, son útiles para proveer múltiples embriones de monocotiledóneas adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos. CUADRO 1 n/a: datos no disponibles.

Todos los materiales y métodos descritos y reclamados en la presente pueden ser obtenidos y usados por el experto en la técnica según se instruye en la descripción anterior y sin mayor experimentación. Aunque los materiales y métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas y ejemplos ilustrativos, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a los materiales y métodos descritos en la presente, sin que se aparten del concepto, espíritu y alcance de la invención. Se considera que todos estos sustitutos y modificaciones similares, evidentes para los expertos en la técnica, están dentro del concepto, espíritu y alcance de la invención como se define además por las reivindicaciones anexas.

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para proveer embriones de monocotiledóneas adecuados para transformación y cultivo de tejidos, que comprende: (a) proveer semillas de monocotiledóneas que contienen embriones inmaduros que tienen una abertura en el pericarpio de dichas semillas; y (b) aplicar una fuerza a las semillas, .suficiente para extraer dichos embriones inmaduros de dichas semillas; en donde dichos embriones inmaduros extraídos comprenden embriones o piezas de embriones adecuados para transformación genética o cultivo de tejidos.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende separar dichos embriones inmaduros extraídos del tejido no embriónico asociado, en donde dichos embriones inmaduros extraídos separados comprenden embriones adecuados para cultivo de tejidos.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha monocotiledónea es de la familia Poaceae.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha monocotiledónea es una especie de Zea.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dichas múltiples semillas de monocotiledóneas comprenden múltiples granos de maíz en por lo menos una mazorca de maíz.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos embriones adecuados para cultivo de tejidos comprenden embriones intactos.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichos embriones adecuados para cultivo de tejidos comprenden embriones parciales.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho cultivo de tejidos comprende transformación.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho cultivo de tejidos comprende regeneración.

10.- El método de . conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicha regeneración resulta en la formación de callos.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicha regeneración resulta en por lo menos una planta fértil.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha fuerza es una fuerza aplicada mecánicamente.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha fuerza comprende una o más fuerzas seleccionadas de presión positiva de chorro de fluido, presión positiva de chorro de líquido, presión mecánica positiva, presión negativa, fuerza centrífuga, aceleración lineal, desaceleración lineal, corte de fluido, flujo de fluido turbulento y flujo de fluido laminar.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha separación comprende el uso de por lo menos una de exclusión por tamaño, separación hidrofóbica y diferenciales de densidad.

15.- Un aparato para preparar múltiples embriones de maíz adecuados para cultivo de tejidos, que comprende por lo menos una abertura para guiar una corriente de fluido, en donde dicha corriente de fluido hace contacto con los granos en dicha mazorca de maíz y extrae los embriones de dichos granos, dichos embriones extraídos siendo adecuados para transformación o cultivo de tejidos.

16.- El aparato de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende medios para mover por lo menos una mazorca de maíz respecto a dicha corriente de fluido.

17.- El aparato de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende por lo menos un separador para separar los embriones de los tejidos no embriónicos, en donde dichos embriones separados comprenden por lo menos algunos embriones de maíz adecuados para cultivo de tejidos.

18.- El aparato de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dichos medios para mover por lo menos una mazorca de maíz respecto a dicha corriente de fluido, hacen girar dicha mazorca de maíz (por lo menos una) y dicha abertura (por lo menos una), una respecto a la otra.

19.- El aparato de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dichos medios para mover por lo menos una mazorca de maíz respecto a dicha corriente de fluido, mueven dicha corriente de fluido a lo largo del eje longitudinal de dicha mazorca de maíz (por lo menos una).

20.- El aparato de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicha corriente de fluido es una corriente de líquido.

21.- El aparato de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicha corriente de fluido es una corriente de gas.

22.- El aparato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho separador (por lo menos uno) comprende un dispositivo de exclusión por tamaño.

23.- El aparato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho separador (por lo menos uno) separa dichos embriones de dichos tejidos no embriónícos por hidrofobicidad.

24.- El aparato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho separador (por lo menos uno) separa dichos embriones de dichos tejidos no embriónicos por diferenciales de densidad.

25.- Un aparato para extraer mecánicamente múltiples embriones de maíz adecuados para cultivo de tejidos de por lo menos una mazorca de maíz inmadura, que comprende por lo menos un componente seleccionado de: (a) por lo menos una superficie sólida para aplicar presión mecánica positiva al exterior de los granos en dicha mazorca de maíz inmadura (por lo menos una); (b) por lo menos una abertura para guiar un flujo de fluido, en donde dicho flujo de fluido hace contacto con los granos en dicha mazorca de maíz inmadura (por lo menos una); y (c) por lo menos una abertura para aplicar presión de fluido negativa, en donde dicha presión de fluido negativa hace contacto con los granos en dicha mazorca de maíz inmadura (por lo menos una); y en donde dicho componente (por lo menos uno) aplica una fuerza a dichos granos, suficiente para extraer los embriones de dichos granos, dichos embriones extraídos comprendiendo múltiples embriones inmaduros adecuados para cultivo de tejidos.

26.- Una planta monocotíledónea transformada, producida por medio de los pasos que comprenden: (a) proveer por lo menos un explante transformable derivado de los embriones adecuados para cultivo de tejidos que se reclaman en la reivindicación 1 ; (b) introducir una molécula de ácido nucleico heterólogo en dicho explante transformable (por lo menos uno), dando como resultado un tejido transformado; y (c) desarrollar una planta monocotiledónea transformada a partir de dicho tejido transformado.

27.- Una planta monocotiledónea transformada de progenie que se deriva de la planta monocotiledónea transformada que se reclama en la reivindicación 26.