MXPA06014380A - Nueva explantacion de semilla dividida de maiz y metodos para la generacion de maiz in vitro. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un eficiente y nuevo sistema de regeneracion y transformacion de maiz basado en una nueva explantacion de semilla dividida. Las semillas de maiz maduras se dividen longitudinalmente para formar una explantacion de semilla dividida. La explantacion de semilla dividida puede utilizarse asi en las transformaciones para introducir un gen de interes en el genoma de maiz para producir nuevas lineas de maiz que tengan caracteristicas deseadas. La explantacion de semilla dividida tambien puede utilizarse para generar plantaciones con raices, multiples vastagos y/o callos.

Description

NUEVA EXPLANTACION DE SEMILLA DIVIDIDA DE MAÍZ Y MÉTODOS PARA LA REGENERACIÓN DE MAÍZ IN VITRO Esta invención se elaboró, al menos en parte, con apoyo del gobierno bajo ÜSDA-ARS Permiso No. 5836071193. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención .

SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de las solicitudes provisionales de E.ü. 60/578,496 presentadas el 10 de Junio del 2004 y 60/643,582 presentada el 14 de Enero del 2005. Ambas son solicitudes provisionales incorporadas en la presente para referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una transformación eficiente y novedosa del maiz y un sistema de regeneración en base a una explantación novedosa de semilla dividida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El maiz es uno de los cultivos más importantes en paises industrializados y muchos desarrollados. Los usos alimenticios del maiz, además del consumo humano de granos de maiz, incluyen tanto productos de industrias de molturación en seco como también en húmedo. El maiz, incluyendo ambas porciones de grano y de no grano de la planta, también se utiliza extensamente como alimento de ganado, básicamente para ganado vacuno, ganado lechero y aves de corral. Por consiguiente, existe una gran demanda de producción de maiz con características de valor agregado de alta calidad. No obstante, la habilidad de manipular el maiz en tallos de cultivo no solo parte del deseo de elucidar el control genético del desarrollo de la planta sino también para explotar su aplicación comercial. ün monocotiledóneo (monocotiledón) tiene un solo (mono) cotiledóneo en su semilla y por lo tanto no se separa en dos partes cuando se retira la cubierta de la semilla, mientras que los dicotiledóneos (dicotiledones) se separan en dos piezas cuando se retira la cubierta de la semilla. En un monocotiledóneo, el alimento de endoesperma se almacena alrededor del embrión en vez de en una sola hoja de la semilla. En un dicotiledóneo, las dos mitades son las hojas de la semilla, o áreas de almacenamiento de alimento. Las hojas iniciales de la semilla normalmente no parecen las hojas que se desarrollarán posteriormente en la planta en crecimiento. El grano maduro del maiz tiene tres partes principales; el pericarpio, endoesperma y embrión. Ver Figura 1. (T.A. Kiesselbach 1999) . El pericarpio es la capa externa del grano, se deriva de la pared del ovario y por consiguientes es genéticamente idéntico al padre materno. El endoesperma y el embrión representan la siguiente generación. El endoesperma conforma hasta el 85% del peso del grano y es la fuente de alimento para el embrión durante varios dias después de que germina. El embrión se localiza en el lado amplio del grano de frente al extremo superior de la mazorca, por debajo de la capa delgada de células de endoesperma. La mayoría del tejido del embrión es parte del órgano escutiforme, una estructura similar a una espada ocupada de digerir y transmitir hacia la semilla en germinación los nutrientes almacenados en el endoesperma. La regeneración de la planta a partir de cultivo de tejido de maiz se reportó primero por Green y Philips (1975) . A pesar de este experimento de descubrimiento, los problemas relacionados con el establecimiento de cultivos celulares estables y las limitaciones que surgen directamente relacionadas con la dependencia de genotipo, persistieron (Tomes y Swanson, 1982, Armstrong, 1992). Recientemente, sin embargo, Sairam et a l . , 2003, ha demostrado que las células totipotentes del meristema corto pueden producir grandes números de regenerantes independientes del genotipo, mientras se reduce significativamente el tiempo en el cultivo de tejido. Las células de planta totipotentes pueden experimentar regeneración in vi t ro a través de dos trayectorias: organogénesis y embriogénesis somática. En organogénesis, las células totipotentes producen una estructura unipolar, es decir, un vastago, el cual con frecuencia se conecta al tejido principal (Thorpe 1994) . En contraste, la embriogénesis somática ocurre cuando se producen una estructura bipolar que contiene una raiz y un vastago con un sistema vascular independiente cerrado (Thorpe 1994). Se han identificado un número de diferentes explantaciones en el maiz a través de los cuales puede ocurrir la regeneración de la planta. Específicamente, el maiz puede regenerarse en cultivo de tejido y transformarse mediante el uso de una variedad de tejidos. Las explantaciones utilizadas en estudios previos incluyen embriones inmaduros (Green and Philips 1975), embriones maduros (Wang 1987), espiguillas inmaduras (Songstad et al., 1992), nodos coleoptilares (Zhong et al., 1992a), inflorescencias inmaduras (Pareddy y Petolino 1990), glumas (Suprasanna et al. 1986), protoplastos (Priori y Sondahl 1989; Rhodes et al., 1988a), anteras (Buter et al., 1991), microesporas (Pescitelli et al., 1990), bases de hoja (Chang, 1983), puntas de vastago (Zhang et al., 1992; O' Connor - Sánchez et al., 2002), meristemas de vastago (Sairam et al., 2003) y cultivos de suspensión (Vasil et al., 1985). La regeneración a partir de cultivos de maiz se logró a través de organogénesis y embriogénesis somática (Harms et al., 1976; Potrykus et al., 1977; Rhodes et al., 1988; Vasil et al., 1984; Vasil y Vasil 1986; Priori y Sondhal 1989; Tomes y Smith 1985; Lu et al., 1982; Novak et al., 1983, Armstrong y Green 1985) .

Varias limitaciones son concomitantes al uso de estos protocolos de regeneración. Los problemas comunes asociados con la regeneración de maiz a partir de embriones inmaduros, inflorescencias inmaduras y cultivo de suspensión embriogénica son restricciones asociadas con especificidad de genotipo, variación somaclonal, quimeras, dificultades en el mantenimiento de totipotencia durante periodos de tiempo prolongados, y frecuencias bajas de inducción de callo. Además, todos estos tejidos requieren la constante disponibilidad de material de planta y por consiguiente estas tecnologías tienen la desventaja adicional de requerir de mucho trabajo. Los métodos de transformación en base a callo para el maiz son de igual modo restrictivos debido a que la regeneración a partir de callo no embriogénico (Tipo I) es muy baja, y la producción de callo embriogénico (Tipo II) solo ocurre en el genotipo A188 o sus derivados (Armstrong y Green 1985; Armstrong 1992) . Finalmente, se acepta ahora ampliamente que las explantaciones más adecuadas para transformación son aquellas que requieren de al menos la cantidad de tiempo en el cultivo de tejido antes y después de la etapa de transformación (Vasil 1999). Esto se debe a que muchos estudios han demostrado que los periodos prolongados de cultivo de tejido con frecuencia dan como resultado mutaciones genéticas somaclonales y movilización de transposón que impactan negativamente las plantas regeneradas con la esterilidad parcial o completa o pérdida de potencial de regeneración en conjunto. Por lo tanto, existe una necesidad de un método novedoso de regeneración de maiz in vi tro que proporciona frecuencia elevada de inducción de callo y que no requiere de mucho tiempo en el cultivo de tejido antes y después de la transformación. La presente invención satisface esta necesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una explantación novedosa de maiz que comprende una división de semilla de maiz por la mitad de manera longitudinal en dos mitades, en donde la división expone el órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y meristema apical de vastago, cada uno de los cuales es independientemente adecuado para transformación. La semilla de maiz puede provenir de una linea celular endogámica o una línea celular híbrida. En ciertas modalidades, puede ser preferible, antes de dividir la semilla de maíz por la mitad de manera longitudinal, germinar la semilla de maíz en un medio de imprimación de callo de pre-división que comprende sales básales de LS y 2, 4-D o germinada en un medio de imprimación de vastago de pre-división que comprende sales básales de MS y 2, 4-D. Esta generación previa incrementa ya sea la frecuencia de inducción de callo o la frecuencia de inducción de vastago. La presente invención también proporciona un método in vi tro para la transformación de maíz con un gen de interés. Este método involucra la generación de una explantación de semilla dividida de maíz, la cual expone el órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y meristema apical de vastago y 1-a transformación de cualquiera de estos tejidos con un gen de interés . La presente invención también proporciona métodos de generación in vi tro de al menos un vastago de maíz a partir de una explantación de semilla dividida de maíz. El al menos un vastago puede ya sea desarrollarse directamente en la explantación de semilla dividida o puede desarrollarse a partir de un callo que se desarrolló en la explantación de semilla dividida. La selección de un medio novedoso y condiciones de crecimiento (es decir, luz contra oscuridad) dicta cuál suerte ocurre.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una sección vertical de explantación de semilla dividida de maíz, mostrando la colocación de tejidos y órganos. La Figura 2 muestra comparaciones de diferentes líneas endogámicas de maíz e híbridas de maíz- para porcentajes de inducción de callo sobre diversas concentraciones de 2, 4-D. Medio: Números 1-7 corresponden a 2 concentraciones 4-D (0, 4.5, 9, 13.5, 18, 22.5 µM) . Las figuras 3A-3J muestran la regeneración de plantíos de maíz a partir de explantación de semilla dividida. La Figura 3A muestra un callo inducido a partir de una explantación de semilla dividida. La Figura 3B muestra la proliferación de callo. La Figura 3C muestra el desarrollo de callo embriogénico. La Figura 3D muestra la regeneración de raíz a partir del callo. La Figura 3E muestra el desarrollo de embrión somático. La Figura 3F muestra el alargamiento de vastago. Las Figuras 3G y 3H muestran la regeneración directa de múltiples vastagos a partir de una explantación de semilla dividida. La Figura 31 muestra un plantío regenerado en medio de echado de raíz. La Figura 3J muestra las plantas regeneradas de semilla dividida en el suelo. La Figura 4 muestra comparaciones de líneas híbridas y endogámicas de maíz para formación de múltiples vastagos en diversas concentraciones y combinaciones de BAP y Kinetina. Medio: MS + 9.2 µM Kinetina, Números 1-7 corresponden a concentraciones BAP 0-26.4 µM de BAP. La Figura 5A muestra un brote de vastago aislado que se origina del órgano escutiforme de una explantación de semilla dividida. La Figura 5B muestra un microscopio de luz de una sección transversal de un brote de vastago que se origina a partir del órgano escutiforme de una explantación de semilla dividida: "a" muestra activamente la división de células del órgano escutiforme; "b" muestra tejido meriste ático que se origina de callo; Xc" muestra células meristemáticas que forman un brote de vastago, y "d" muestra un brote de vastago que se origina a partir de tejido meristemático. Las Figuras 6A -6E muestran imágenes de microscopio de callo embriogénico y el inicio de brotes de vastago. La Figura 6A muestra callos embriogénicos . La Figura 6B muestra activamente la división de células. La Figura 6C-6E muestra un microscopio electrónico de exploración de células meristemáticas que se agrupan para formar brotes de vastago. La Figura 7 es una tabla que muestra el número de callos embriogénicos y el número de vastagos regenerados por callo. La Figura 8 es una tabla que muestra el número de vastagos formados en medio complementado solo con BAP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Con objeto de proporcionar un entendimiento claro y consistente de la especificación y reivindicaciones, incluyendo el alcance a ser dado a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones. "Sales básales de LS" se conocen en la materia y se describieron originalmente por Linsmaier y Skoog, Physi ol ogi a Pl an t a rum , 18:100-127 (1965) . En los métodos y medios de la presente invención, el "medio basal de LS" o "medio de LS" o "sales básales de LS", según se utilizan en la presente, incluyen el medio basal de LS según se describe por Linsmaier y Skoog, así como también las equivalencias de medio basal de LS. ün experto en la materia entendería que las equivalencias de medio basal de LS incluyen medios que son sustancialmente similares en contenido y concentraciones de sales, químicos, etc., de tal manera que un tejido o planta se desarrollaría/crecería de la misma manera cuando se exponga a medio basal de LS. La adición de vitaminas B5 se conoce en la materia y se describió originalmente por Ga borg en 1968. Ver O.L.; Miller, R.A.; Ojiva, K., Exp . Cel l Res . 50: 151-158 (1968) . Las "sales básales de MS" se conocen en la materia y se describieron originalmente por Murashige y Skoog, Physi ol ogy Pl an ta rum , 15: 473-497 (1962) . En los métodos y medios de la presente invención, "medio basal de MS" o "medio de MS" o "sales básales de MS", según se utilizan en la presente, incluyen medio basal de MS según se describe por Murashige y Skoog así como también las equivalencias de medio basal de MS . Un experto en la materia entenderla que las equivalencias de medio basal de MS incluyen medio que es sustancialmente similar en contenido y concentraciones de sales, químicos, etc., de tal manera que un tejido o planta se desarrollaría/crecerla de la misma manera cuando se expone a medio basal de MS. Las sales básales de MS descritas por Murashige y Skoog (1962) y con vitaminas B5 ("medio MSB5") son como se describe por Gamborg, O.L., Miller, R.A.; Ojiva, K., Exp . Cel l Res . 50: 151-158 (1968) . En los métodos y medios de la presente invención, según se utiliza en la presente, "MSB5" incluye medio basal de MS según se describe por Murashige y Skoog y vitaminas B5 según se describe por Gamborg así como también equivalencias de MSB5. ün experto en la materia entendería que las equivalencias de MSB5 incluyen medios que son sustancialmente similares en contenido y concentraciones de sales, químicos, vitaminas, etc., de tal manera que un tejido o planta se desarrolle/crezca de la misma manera cuando se expone a MSB5. "Auxinas" incluyen, pero sin limitarse, auxinas naturalmente ocurrentes y sintéticas. La auxina naturalmente ocurrente es ácido acético de índol ("IAA"), el cual se sintetiza a partir de triptofano. Una auxina sintética ejemplar en ácido diclorofenoxiacético ("2, 4-D") . Otras auxinas incluyen, pero sin limitarse, ácido 4-clorofenoxiacético ("4-CPA"), ácido 4-(2.4-diclorofenoxi)butírico ("2,4-DB"), tris[2-(2,4-diclorofenoxi) etilojfosfito ("2,4-DEP"), ácido 2- (2 , 4-Diclorofenoxi ) propiónico ( "dicloroprop" ) , ácido (RS ) -2- (2 , , 5-triclorofenoxi) propiónico ( "fenoprop" ) , naftalenoacetamida, ácido a-naftalenoacético ("NAA"), 1-naftol, ácido naftoxiacético, naftenato de potasio, ácido (2, 4, 5-triclorofenoxi) acético ("2,4,5-T"), ácido índol-3-acético, ácido índol-3-butírico ("IBA"), ácido 4-amino-3, 5, 6-tricloropiridina-2-carboxílico ( "picloram" ) , ácido 3 , 6-dicloro-o-anísico ("dicamba"), ácido índol-3-propiónico ("IPA"), ácido fenil acético ("PAA"), ácido benzof ran-3-acético ("BFA") y ácido fenil butírico ("PBA") . Un sitio primario de producción de auxina es el meristema de vastago apical y la función más estudiada de la auxina es la promoción de alargamiento y agrandamiento celular. Las auxinas también promueven el desarrollo de raíz lateral y venidera . Las "citoquininas" son un grupo de derivados de fenilurea de adenina. Las citoquininas promueven la citoquinesis (división del citoplasma para una célula después de la división del núcleo). Las citoquininas también retardan la senescencia de las hojas. La primer citoquinina naturalmente ocurrente, químicamente identificada, se llamó zeatina. Una citoquinina sintética ejemplar es 6-benzilamino purina ("BAP") . Los ejemplos de citoquininas incluyen, pero sin limitarse, 6-?, ?-Dimetilalilaminopurina ("2iP"), cinetina, zeatina, ribosida de zeatina y BAP. "Transformación mediada por barba" es la facilitación de inserción de ADN en agregados celulares de planta y/o tejidos de planta mediante microfibras similares a agujas alargadas o "barbas" y la expresión de dicho ADN en una manera ya sea transitoria o estable. (Ver, por ejemplo, Patentes de E.U. Nos. 5,302,523 y 5,464,765, las cuales se incorporan en la presente para referencia) . "Gen de interés" o puede ser ADN homólogo, ADN heterólogo, ADN ajeno, ADN genómico o cADN. La presente invención proporciona un método in vi tro para la transformación de maíz con un gen de interés y también proporciona un método in vi tro para la regeneración de ma í z . Tanto en la transformación como en la regeneración, es un pre-requisito esencial el iniciar con una explantación de cultivo de tejido que expone un mayor número de células competentes con objeto de lograr el máximo número de regenerantes. Hasta hace poco, los embriones inmaduros habían sido la única explantación confiable para la regeneración de maiz, especialmente cuando se acoplan a transformación (Lu et a l . , 1982; Vasil et a l . , 1984). Aparte de la dificultas inherente en mantener un suministro continuo durante todo el año, es complicada la selección de los embriones inmaduros en la etapa correcta para asegurar la respuesta de regeneración predecible. En contraste, las semillas maduras pueden almacenarse fácilmente y por lo tanto se encuentran disponibles a través de todo el año a fin de iniciar el cultivo de tejido. Sin embargo, las semillas maduras han sido consideradas más recalcitrantes a manipulaciones de cultivo de tejido que los embriones inmaduros en base al número limitado de reportes que han demostrado una baja frecuencia y regeneración dependiente de genotipo para semillas maduras de maíz (Wang, 1987; Huang y Wei, 2004). Contrario a lo que se creyó previamente era posible, las presentes invenciones utilizan una semilla madura para producir una explantación de cultivo de tejido que es adecuada para transformación. Los métodos de la presente invención involucran la división de una semilla de maíz de manera longitudinal en dos mitades, a fin de producir una explantación de semilla dividida. La explantación de semilla dividida se regenera en plantas más fuertes, más saludables y fértiles. Además, las semillas divididas son fáciles de manejar y se encuentran disponibles todo el año en cantidades a granel. Adicionalmente, en comparación con los protocolos de regeneración reportados en el maíz, el número de vastagos y la frecuencia de regeneración de callos son significativamente mayores que lo previamente reportado. Específicamente, el número de múltiples vastagos regenerados directamente a partir de semillas divididas a través de organogénesis se enumera hasta 28 vastagos por explante. Más significativamente, el tiempo necesario para producir plantas fértiles se reduce hasta cuatro meses desde el momento de la explantación inicial, cultivándose la semilla 42 días después . La división expone tres fuentes de células no diferenciadas del órgano escutiforme, anillo coleoptilar y meristema apical de vastago. Las células del órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y meristema apical de vastago son cada una independientemente adecuadas para la transformación genética con un gen de interés. Estas células pueden hacerse simultáneamente competentes para mejorar la regeneración y/o incrementar la habilidad de transferencia de ADN. La presente invención también proporciona así un método in vi tro para la transformación de maíz con el gen de interés. El maíz puede ser una línea celular endogámica o una línea celular híbrida.

MÉTODO IN VITRO DE TRANSFORMACIÓN DE MAÍZ Una modalidad de la presente invención proporciona un método in vi tro de transformación de maíz. Este método comprende enjuagar semillas secas maduras con jabón actibacterial y esterilizar la superficie de la semilla con 70% de etanol, seguida por inmersión en 0.1% de cloruro mercúrico (HgCl2) durante 7 minutos. Antes de que se dividan las semillas, es preferible germinarlas durante aproximadamente 48 horas en un "medio de imprimación de callos de pre-división" (que comprende sales básales de LS y un auxina, tal como ácido diclorofenoxiacético, comúnmente referido como "2, 4-D" o durante 3-4 días en un "medio de imprimación de vastago de pre-división" (que comprende sales básales de MS y una citoquinina, tal como 6-benzilamino purina, comúnmente referido como "BAP"), ambos cuales son también modalidades de la invención y se describen a continuación. La selección del medio depende de si se desean múltiples vastagos (se usa "medio de imprimación de vastago de pre-división") o si se desean callos (se usa "medio de imprimación de callos de pre-división") . Después de la germinación en ya sea un "medio de imprimación de callo de pre-división" o un "medio de imprimación de vastago de pre-división", una semilla de maíz se divide longitudinalmente en dos mitades (casi simétricas) con un escalpelo a fin de exponer el órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y meristemas apicales de vastago. Las células expuestas del órgano escutiforme, el anillo coleoptilar o meristemas apicales de vastago son adecuados a la transformación y pueden transformarse con un gen de interés . Un gen de interés preferentemente otorga una característica deseada tal como, pero sin limitarse, resistencia al frío, resistencias a las sequías, resistencia a herbicidas, resistencia fungal o senescencia retardada. Por ejemplo, el ADN que codifica el gen CBF (factor de enlace en frío) o genes de resistencia al frío aislados de des champia An tari ca o colban thus qui tensi s , pueden utilizarse para transformar el maíz a fin de generar plantas de maíz que son resistentes a frío, así como también a sequía. Otros genes de interés incluyen, pero sin limitarse, osmotina para resistencia fungal, SGT-1 para resistencia bacteriana y fungal de amplio espectro y VP-2 para resistencia a enfermedad de cavidad infecciosa. De manera adicional, los genes que codifican proteínas de interés humano también pueden utilizarse en la transformación. Por ejemplo, el gen GAD 65 para el tratamiento de diabetes tipo 2 puede utilizarse para transformar las plantas. Puede utilizarse cualquier método adecuado de transformación genética a fin de transformar el órgano escutiforme expuesto, el anillo coleoptilar o meristemas apicales de vastago. Los métodos conocidos de transformación, adecuados incluyen, pero sin limitarse, electroporación, bombardeo de partículas, transformación mediada por barbas y transformación mediada por Agroba ct eri um . Cuando el método de transformación comprende transformación mediada por Agroba cteri um , después de que se dividen las semillas de maíz, se unen los tejidos expuestos (órgano escutiforme, anillo coleoptilar y meristema apical de vastago) por transformarse. La transformación mediada por Agroba ct eri um se lleva a cabo entonces mediante métodos conocidos por un experto en la materia. Después de la transformación, las explantaciones de semilla dividida transformadas se cultivan entonces ya sea en una "explantación de semilla dividida hacia medio de co-cultivo de callo" o "explantación de semilla dividida para medio de co-cultivo de vastago directo", ambas cuales también son modalidades de la presente invención y se describen con mayor detalle a continuación. Una "explantación de semilla dividida para medio de co-cultivo de callo" se utiliza cuando se desea la generación de callos a partir de la explantación de semilla dividida. Un "explantación de semilla dividida para medio de co-cultivo de callo" comprende un medio de, LS complementado con vitaminas B5, 2, -D a 3 mg/l, 200 uM acetosiringona , L-cisteína a 300 mg/l. El medio de co-cultivo se ajusta a pH 5.3 y se coloca en autoclave a 121°C durante 20 mins. La explantación de semilla dividida transformada se incuba en la "explantación de semilla dividida para el medio de co-cultivo de callo" durante preferentemente tres días en la oscuridad a 25°C. Una "explantación de semilla dividida para medio de co-cultivo de vastago" se utiliza cuando se desea la generación directa de vastagos a partir de la explantación de semilla dividida. Una "explantación de semilla dividida para medio de co-cultivo de vastago" preferida comprende un medio de MS complementado con vitaminas B5, cinetina a 2 mg/L; BAP a 4 mg/L, 200 uM Acetosiringona y 300 mg/L de cisterna. El medio se ajusta a pH 5.3 y se coloca en autoclave a 121°C durante 20 mins. La explantación de semilla dividida transformada se incuba en una "explantación de semilla dividida para medio de co-cultivo de vastago" durante preferentemente tres días en la oscuridad a 25°C. Otros medio de co-cultivo conocidos son aceptables y pueden utilizarse en las modalidades de la presente invención . Después de una incubación de tres a cuatro días, las explantaciones de semilla dividida transformadas se transfieren ya sea hacia un "medio de inducción de callo de explantación de semilla dividida" (para inducir la formación de callos) o hacia un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" (para inducir la formación de vastagos), ambas cuales son modalidades de la presente invención y se describen a continuación. Cuando el método de transformación comprende biolísticos, la explantación de semilla dividida se coloca a fin de que los tejidos deseados (acutelo, anillo coleoptilar o meristema apical 'de vastago) sean accesibles a bombardeo de partículas. Después de que se lleva a cabo la transformación, la explantación de semilla dividida se transfiere hacia un "medio de inducción de callo de semilla dividida" de la presente invención para permitir la formación de callos . Sin tomar en cuenta el enfoque de transformación, mediante el uso de las modalidades de la presente invención, las plantas pueden regenerarse a partir de una semilla dividida a través de organogénesis, embriogénesis somática o a través de inducción directa de múltiples vastagos. Mediante el empleo de las modalidades de la presente invención, puede producirse un gran número de vastagos (es decir, alrededor de 28 por explantación de semilla dividida) en un tiempo muy corto, muchas transformaciones pueden llevarse a cabo en una cantidad de tiempo muy corta y manejable. No obstante, el uso de embrión somático proveniente de callo en base a semilla dividida es muy eficiente para cualquier enfoque de transformación ya que las células no diferencias se re-programan para diferenciarse en embriones somáticos.

MÉTODO DE GENERACIÓN JW VITRO DE VASTAGOS DE MAÍZ A PARTIR DE EXPLANTACIÓN DE SEMILLA DIVIDIDA A TRAVÉS DE GENERACIÓN DE CALLO EMBRIOGÉNICO/EMBRIÓN SOMÁTICO Otra modalidad de la presente invención proporciona un método in vi t ro de generación de vastagos de maíz a partir de una explantación de semilla dividida. Después de que se germina una semilla de maíz en un "medio de imprimación de callo de pre-división" y se prepara y divide como se describe arriba (incluyendo si se desea la transformación con un gen de interés), se expone a un "medio de inducción de callo de semilla dividida", lo cual es una modalidad de la presente invención y se describe a continuación. La exposición de una explantación de semilla dividida a un "medio de inducción de callo de semilla dividida" da como resultado el inicio de la formación de callo para formar callos primarios en aproximadamente una semana cuando la explantación de semilla dividida se cultiva en la oscuridad a 27°C. Los callos primarios se transforman entonces dos veces por semana durante aproximadamente 2-4 semanas de tiempo total para renovar el "medio de mantenimiento de callos primarios", lo cual también es una modalidad de la presente invención t se describe a continuación. Después de aproximadamente un mes, los callos primarios se vuelven callos proliferados . Los callos proliferados se cultivan entonces en un "medio de inducción de callo embriogénico" (lo cual es una modalidad de la presente invención y se describe a continuación) a fin de formar callos embriogénicos y embriones somáticos. Los callos proliferados se incuban en la oscuridad a 27°C en un "medio de inducción de callo embriogénico" desarrollado en aproximadamente cuatro días hacia callos embriogénicos que tienen embriones somáticos . Los callos embriogénicos/embriones somáticos se transfieren hacia un "medio de inducción de vastago de callo/embrión somático" (lo cual es una modalidad de la presente invención y se describe a continuación) y se permiten desarrollar vastagos. Los cultivos se mantienen a 27°C durante 16 horas de luz blanca suave. La frecuencia de regeneración de vastagos se determina mediante cálculo del número de callos embriogénicos que producen vastagos y el número de vastagos por callo. Ver Figura 7. Los vastagos regenerados pueden transferirse entonces hacia un medio de echado de raíz conocido en la materia, que incluye, pero sin limitarse, un medio de echado de raíz que comprende sales de MS (Murashige y Skoog 1962) complementado con 0.8 mg/l de 1-ácido naftalenáctico ("NAA") .

MÉTODO IN VITRO DE GENERACIÓN DE UN VASTAGO DE MAÍZ A PARTIR DE UNA EXPLANTACIÓN DE SEMILLA DIVIDIDA Otra modalidad de la invención proporciona un método para generación in vi tro de un vastago de maí z , lo cual no involucra la formación de un callo. Una semilla de maíz se germina en un "medio de imprimación de vastago de pre-división" y se prepara una explantación de semilla dividida como se describe arriba. La explantación de semilla dividida puede transformarse con un gen de interés como se describe arriba y después se incuba en un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" a fin de formar un vastago regenerado. El "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida", lo cual es una modalidad de la presente invención, y se describe a continuación. La explantación de semilla dividida se incuba en un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" bajo 16-h de luz blanca suave a 27°C, y se permiten desarrollar vastagos. El desarrollo de vastagos ocurre en aproximadamente tres a cuatro semanas.

MÉTODO IN VITRO DE GENERACIÓN DE UN PLANTÍO ENRAIZADO DE MAÍZ Otra modalidad de la presente invención proporciona un método in vi t ro de generación de un plantío enraizado de maiz. Después de que una explantación de semilla dividida ha desarrollado vastagos como se describe arriba (ya sea a través de inducción directa de vastago o a través de inducción de callos-vastago), el vastago se permite desarrollar durante aproximadamente tres a cuatro semanas. El vastago de maíz se expone entonces a un medio de alargamiento de vastago y se permite alargar. Los medios de alargamiento de vastago son conocidos en la materia e incluyen, pero sin limitarse, medio basal de MS complementado con vitaminas B5. El vastago alargado se permite formar raíces y formar un plantío enraizado mediante exposición del vastago a un medio de echado de raiz conocido en la materia tal como, pero sin limitarse a un medio de echado de raíz que comprende sales de MS y ácido 1-naftalenoacético ("NAA"). La concentración de NAA se encuentra a aproximadamente 0.5 mg/l hasta aproximadamente 2.0 mg/l. Preferentemente la concentración es de aproximadamente 0.8 mg/l. Los plantíos enraizados se transfieren a suelo y se mantienen en una cámara de crecimiento durante 16 h de luz blanca suave a 27°C y 67% de humedad durante una semana antes de transferirse al invernadero . Además de las modalidades anteriores de la invención, la presente invención también proporciona diversos medios utilizados en los métodos arriba descritos.

MEDIO DE IMPRIMACIÓN DE CALLO DE PRE-DIVISIÓN La presente invención proporciona un "medio de imprimación de callo de pre-división". Antes de que una semilla de maíz se divida a la mitad para generar una explantación de semilla de maíz, a semilla se sumerge preferentemente durante aproximadamente 48 horas en un "medio de imprimación de callo de pre-división" para "imprimir" la semilla en callo en desarrollo posteriormente cuando una explantación de semilla dividida generada a partir de la semilla "cargada" se germina posteriormente en un "medio de inducción de callo de semilla dividida", también una modalidad de la presente invención. La generación de una semilla de maíz en un "medio de imprimación de callo de pre-división" antes de preparar una explantación de semilla dividida, incrementa la frecuencia de inducción de callo (el número de callos generados en una explantación de semilla dividida) sobre la frecuencia de inducción de callo encontrada en una explantación de semilla dividida generada a partir de una semilla que no se había germinado en un "medio de imprimación de callo de pre-división". ün "medio de imprimación de callo de pre-división" comprende sales básales de LS y una auxina o mezclas de auxinas a una concentración desde aproximadamente 1.0 mg/l hasta 3.5 mg/l y más preferentemente es de 3.0 mg/l. En una modalidad preferida, una auxina es 2, 4-D y se presenta a 3.0 mg/l.

MEDIO DE IMPRIMACIÓN DE VASTAGO DE PRE-DIVISIÓN La presente invención proporciona un "medio de imprimación de vastago de pre-división" . Antes de que una semilla de maíz se divida por la mitad para generar una explantación de semilla dividida, la semilla se sumerge preferentemente durante aproximadamente tres a cuatro días en un "medio de imprimación de vastago de pre-división" para "cargar" la semilla en vastagos en desarrollo, posteriormente, cuando una explantación de semilla dividida generada a la partir de la semilla "cargada" se germina posteriormente en un "medio de inducción de vastago de semilla dividida", también una modalidad de la presente invención. La germinación de la semilla de maíz en un "medio de imprimación de vastago de pre-división" antes de preparar la explantación de semilla dividida, incrementa el número de vastagos generados en una explantación de semilla dividida en comparación con el número de vastagos generados en una explantación de semilla dividida generada a partir de una semilla que no se ha germinado en el "medio de imprimación de vastago de pre-división" antes de la división de semilla. Un "medio de imprimación de vastago de pre-división" comprende sales básales de MS y una auxina o mezclas de auxinas a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/l hasta aproximadamente 3.0 mg/l. Preferentemente una auxina o mezclas de la misma se encuentra a 1.0 mg/l hasta 2.5 mg/l y más preferentemente es de 2.0 mg/l. En una modalidad preferida, una auxina es 2, 4-D y se presenta a 2.0 mg/l .

MEDIO DE INDUCCIÓN DE CALLO DE SEMILLA DIVIDIDA Una modalidad de la presente invención proporciona un "medio de inducción de callo de pre-división". Las explantaciones de semilla dividida para el medio de inducción de callo iniciarán la formación de callo y desarrollarán callos primarios cuando se incuben en la oscuridad a 27 ° C . Un medio de inducción de callo comprende sales básales de LS { ver Linsmaier y Skoog 1965) y vitaminas B5 (Ver Gamborg et a l . , 1968), L-prolina a una concentración preferible de 900 mg/l, glicina a una concentración preferible de 1 mg/l, hidrolisado de caseína a una concentración preferible de 250 mg/l, sucrosa a una concentración preferible de 30 g/1, y una auxina o mezclas de auxinas. La auxina o mezclas de auxinas de las mismas pueden presentarse a una concentración de 1.0 mg/l hasta 7.0 mg/l. Preferentemente la concentración de auxina es desde aproximadamente 1.0 mg/l hasta aproximadamente 4.0 mg/l. Más preferentemente, la concentración de auxina es de 1.0 mg/l hasta 3.5 mg/l. Más preferentemente, la concentración de auxina es de aproximadamente 3.0 mg/l. En modalidades preferidas, una auxína comprende 2, 4-D y se presenta a aproximadamente 3.0 mg/l. Las concentraciones variantes de 2, 4-D afectan los porcentajes de inducción de callo. Ver Figura 2. Por lo tanto, el término "aproximadamente" significa que la concentración no necesita ser exactamente la concentración establecida sino que puede variar, siempre y cuando la concentración proporcione el porcentaje de inducción de callo deseado. El medio de inducción de callo puede molificarse con 8.0 g/1 de agar. El pH se ajusta a 5.8 antes de agregar el agar y el medio se coloca en autoclave a 121°C durante 20 minutos. La frecuencia de inducción de callo varía desde 32% hasta 95.5% como una función de la concentración de 2, 4-D. Ver Figura 2. Después de siete días de incubación en medio de proliferación de callo, se registró la frecuencia de inducción de callo. La frecuencia de inducción de callo se calculó mediante registro del número de semillas divididas que producen calos. Los resultados registrados en la Figura 2 demuestran que las concentraciones de 2, 4-D desde 1.0 mg/l hasta 7.0 mg/l indujeron callos. El número de callos inducidos por explantaciones se incrementó con el incremento de concentraciones de 2, 4-D hasta 3.0 mg/l. Unos cuantos callos se indujeron a partir de las líneas endogámicas B73 y R23, en ausencia de 2, 4-D. La Figura 2 también indica que a medida que la concentración de 2, 4-D se incrementa sobre 6.0 mg/l, los porcentajes de inducción de callo comienzan a declinar. Con el incremento de las concentraciones de 2, 4-D, la apariencia de la explantación se oscurece y el crecimiento del callo se detiene y comienza a ser letal a más de 4.0 mg/l. Se ha sugerido que las concentraciones mayores de 2, 4-D pueden originar mutaciones que a su vez matan las células somáticas (Choi et a l . , 2001; Vasil y Vasil 1985). La Figura 2 también indica que incluso con la misma concentración de 2, 4-D, existe una ligera variación en el porcentaje de inducción de callo en diferentes líneas endogámicas e híbridas de maí z .

MEDIO DE MANTENIMIENTO DE CALLOS PRIMARIOS Otra modalidad de la presente invención proporciona un "medio de mantenimiento de callos primarios". Después de que se forman callos primarios en una explantación de semilla dividida, y después de que se permiten desarrollar durante aproximadamente una semana, se incuban en un "medio de mantenimiento de callos primarios" para desarrollarse en callos proliferados. Un "medio de mantenimiento de callos primarios" comprende sales básales de LS, vitaminas B5 complementadas con auxina o mezclas de auxinas a una concentración desde aproximadamente 0.5 mg/l hasta aproximadamente 2.5 mg/l. Preferentemente, la auxina se presenta a una concentración de 1.0 mg/l hasta 2.0 mg/l y en modalidades preferidas la auxina es 2, -D.

MEDIO DE INDUCCIÓN DE CALLO EMBRIOGÉNICO Otra modalidad de la presente invención proporciona un "medio de inducción de callo embriogénico" que comprende sales básales de LS y vitaminas B5 complementadas con una auxina, o mezclas de auxinas, y una citoquinina, o mezclas de citoquininas. En modalidades preferidas, una auxina es 2 , 4-D y una citoquinina es benzila inopurina ("BAP"). Cuando los callos proliferados se exponen a un "medio de inducción de callo embriogénico" en la oscuridad, desarrollan callos embriogénicos y desarrollan embriones somáticos. Preferentemente, un "medio de inducción de callo embriogénico" comprende una auxina a una concentración de aproximadamente 1.0 mg/l y una citoquinina a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/l. Un "medio de inducción de callo embriogénico" preferido comprende además L-prolina a una concentración preferible de 900 mg/l, glicina a una concentración preferible de 1.0 mg/l, hidrolisado de caseína a una concentración preferible de 250 mg/l, y sucrosa a una concentración preferible de 30 g/1. En una modalidad preferida, un "medio de inducción de callo embriogénico" comprende 2, 4-D a 0.1 mg/l y BAP a 0.5 mg/l.

MEDIO DE INDUCCIÓN DE VASTAGO DE CALLO/EMBRIÓN SOMÁTICO Otra modalidad de la presente invención proporciona un "medio de inducción de vastago de callo/embrión somático". Cuando un callo embriogénico/embrión somático generado a partir de una explantación de semilla dividida se expone a un "medio de inducción de vastago de callo/embrión somático" bajo una luz blanca suave de 16 h a 27°C, el callo embriogénico/embrión somático genera al menos un vastago. Un "medio de inducción de vastago de callo/embrión somático" comprende sales básales de MS y vitaminas B5 complementadas con una citoquinina, o mezclas de citoquininas. Una citoquinina preferida es BAP. La concentración de una citoquinina preferentemente varía desde 0.1 mg/l hasta 2.0 mg/l. Preferentemente, la concentración de una citoquinina varía desde 0.5 mg/l hasta 2.5 mg/l y más preferentemente varía desde 0.75 mg/l hasta 1.0 mg/l. En una modalidad preferida, una citoquinina es BAP y se encuentra preferentemente a una concentración de 1.0 mg/l. Un "medio de inducción de vastago de callo/embrión somático" comprende además glicina a una concentración preferible de 1.0 mg/l, hidrolisado de caseína a una concentración preferible de 400 mg/l, y sucrosa a una concentración preferible de 30 g/1. Un medio de inducción de vastago puede solidificarse con 8.0 g/k de agar. El pH del medio se ajusta a 5.8 antes de agregar el agar y el medio se coloca en autoclave a 121°C durante 20 minutos.

MEDIO DE INDUCCIÓN DE VASTAGO DE EXPLANTACIÓN DE SEMILLA DIVIDIDA Otra modalidad de la presente invención proporciona un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida". Cuando se expone una explantación de semilla dividida a un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" y se incuba bajo una luz blanca suave 16-h a 27°C, la explantación de semilla dividida genera al menos un vastago. Un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" comprende sales básales de MS y vitaminas B5 complementadas con una citoquinina o mezclas de citoquininas. Una citoquinina preferida es BAP. La concentración de una citoquinina puede variar desde 1.0 mg/l hasta 6.0 mg/l. Preferentemente, la concentración de una citoquinina varía desde 1.0 mg/l hasta 5.0 mg/l y más preferentemente varía desde 1.5 mg/l hasta 4.5 mg/l. En una modalidad preferida, una citoquinina es BAP y se encuentra a una concentración de 3.0 mg/l hasta 4.0 mg/l. En una modalidad preferida, BAP se encuentra preferentemente a una concentración de 4.0 mg/l. Un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" comprende además glicina a una concentración preferible de 1.0 mg/l, hidrolisado de caseína a una concentración preferible de 400 mg/l, y sucrosa a una concentración preferible de 30 g/1. ün "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" puede solidificarse con 8.0 g/1 de agar. El pH del medio se ajusta a 5.8 antes de agregar el agar y el medio se coloca en autoclave a 121°C durante 20 minutos. En otra modalidad, un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" comprende además 6-furfurilaminopurina ("quinetina") . Aunque se desarrollan múltiples vastagos en un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" que comprende BAP, la adición de quinetina incrementa el número de vastagos inducidos. Preferentemente, la quinetina se presenta a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/l hasta aproximadamente 4.5 mg/l. Preferentemente, la concentración de quinetina varía desde 1.5 mg/l hasta 3.5 mg/l y más preferentemente varía desde 1.75 mg/l hasta 2.5 mg/l. Una concentración preferida de quinetina es de 2.0 mg/l. En una modalidad preferida, un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" comprende BAP a una concentración de 4.0 mg/l y quinetina a una concentración de 2.0 mg/l. La semilla dividida, a través de organogénesis, acoplada con múltiples vastagos es independiente de genotipo. La adición solo de BAP induce múltiples vastagos (Figura 8), sin embargo, el número de vastagos es mayor cuando BAP se utiliza con la combinación de quinetina. Múltiples vastagos se inducen en medio complementado con diversas combinaciones y concentraciones de BAP y quinetina (Figura 3 G y H) y (Figura 4). Todos los genotipos examinados respondieron bien a la concentración óptima de 4.0 mg/l de BAP y 2.0 mg/l de quinetina. El máximo número de múltiples vastagos por explantación fue de casi 28-30. Los vastagos regenerados pueden separarse y transferirse a medio de echado de raíz y después transferirse a suelo (Figura 3 I y J) . La etapa de las explantaciones, fuente de luz y el pre-tratamiento de las explantaciones de las semillas con un "medio de imprimación de vastago de pre-división" que comprende una auxina tal como 2, 4-D, son factores esenciales para la formación de múltiples vastagos (datos no mostrados). Las explantaciones de semilla dividida de tres hasta cuatro días de edad son más eficientes para la formación de múltiples vastagos y proporcionan el número más elevado de vastagos en comparación con las explantaciones de seis o más días de edad. El pre-tratamiento de las semillas con un "medio de imprimación de vastago de pre-división" que comprende una auxina como 2, -D tiene un efecto significativo sobre la formación de múltiples vastagos. Cuando los explantes no se tratan con "medio de imprimación de vastago de pre-división", solo unos cuantos explantes muestran múltiples vastagos y la mayoría de ellos solo germinados. Muchos reportes de maíz demostraron que la inducción de múltiples vastagos se obtuvo de cultivos incubados en la oscuridad (Zhong et a l . 1992a; Lowe et a l . , 1995). Sin embargo, en los métodos de la presente invención, que tienen una fuente de luz, es esencial para la inducción de múltiples vastagos. El mayor número de vastagos se obtiene mediante incubación de las explantaciones en luz suave blanca 16 horas a 27°C.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de semillas y pretratamiento con un "medio de imprimación" Las semillas secas maduras se enjuagan con jabón antibacterial y se esteriliza la superficie con 70% de etanol y se sumergen en 0.1% de cloruro mercúrico (HgCl2) durante 7 minutos. Para la inducción de callo, las semillas se enjuagan entonces varias ve ce s con agua estéril y se sumergen durante 48 horas en un "medio de imprimación de callo de pre-división" que comprende medio líquido de LS (Linsmaier y Skoog 1965) complementado con 2, 4-D a 3 mg/l. Para la inducción de múltiples vastagos, las semillas se sumergen en agua estéril durante 24 horas y después se germinan durante tres a cuatro días en un "medio de imprimación de vastago de pre-división" que comprende sales básales de MS (Murashige y Skoog 1962) complementadas con 2, 4-D a 2 mg/l . Ejemplo 2: Formación y mantenimiento de callo El callo blanco y suave formado en la superficie de las explantaciones de semilla divididas se retira después de una semana para crecimiento adicional en "medio de mantenimiento de callos primarios" (Figura 3B). El inicio de callo a partir de la semilla dividida se observa en cultivos de cuatro días de edad. Después de un mes en cultivo, los callos altamente proliferados (Figura 3C) se transfieren a un "medio de inducción de callo embriogénico" que contiene 2,4-D a 0.1 mg/l y BAP a 0.5 mg/l para mantener el callo embriogénico (Figura 3D) . El callo se sub-cultiva cada dos semanas. Después del sub-cultivo, de manera interesante se observan dos tipos de callo: callo embriogénico y callo organogénico . Los embriones somáticos organizados se observan a partir del callo embriogénico (Figura 3D, E y F) y (Figura 6) . Los brotes de vastago directos también se observan a partir del callo organogénico (Figura 3E) . Los callos se sub-cultivan además en un "medio de inducción de vastago de callo/embrión somático", el cual es un medio de MS modificado, complementado con diversas concentraciones de BAP. El número de vastagos regenerados varía desde 2 hasta 11 vastagos por cada callo embriogénico. El mayor número de vastagos se obtiene a partir de 1.0 mg/l de BAP en un periodo máximo de dos meses. Por consiguiente, este protocolo reduce drásticamente el tiempo de regeneración . Ejemplo 3: Formación de múltiples vastagos y generación de plantío Las semillas maduras germinadas (tres a cuatro días de germinación) se dividen a la mitad de manera longitudinal para crear explantaciones de semilla dividida. Las explantaciones de semilla dividida se incuban en un "medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida" bajo luz blanca suave 16 horas a 27°C a fin de permitir la formación de vastagos. Los vastagos se separan de las explantaciones de semilla dividida después de tres-cuatro semanas y se incuban en un medio de alargamiento de vastago que contiene sales básales de MS y vitaminas B5. Los vastagos alargados se exponen a un medio de echado de raíz que comprende sales básales de MS complementadas con 0.8 mg/l de NAA (ácido 1-naftalenoacético ) a fin de permitir la formación de plantíos enraizados. Los plantíos enraizados se transfieren a suelo y se mantienen en la cámara de crecimiento bajo luz blanca suave 16 horas a 27°C y 67% de humedad durante una semana antes de transferirse al invernadero.

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Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Explantación de maíz adecuada para transformación, comprendiendo la explantación una semilla de maíz dividida a la mitad de manera longitudinal en dos mitades, en donde la división expone el órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y meristema apical de vastago, y en donde el órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y meristema apical de vastago son cada uno independientemente adecuados para transformación.
2. 2. Explantación de maíz de la reivindicación 1 en donde la semilla de maíz proviene de una línea celular endogámica o una línea celular híbrida.
3. 3. Explantación de maíz de la reivindicación 1 en donde antes de la división de la semilla de maíz por la mitad de manera longitudinal, la semilla de maíz se germina ya sea en cualquier medio de imprimación de callo pre-dividido que comprende sales básales de LS y 2, 4-D o se germina en un medio de imprimación de vastago pre-dividido que comprende sales básales de MS y 2, 4-D.
4. 4. Método in vi tro para transformación de maíz con un gen de interés, comprendiendo el método la generación de una explantación de semilla dividida de maíz que comprende la división de una semilla de maíz de manera longitudinal en dos mitades a fin de generar la explantación de semilla dividida, en donde la división expone el órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y el meristema apical de vastago; y en donde el órgano escutiforme, el anillo coleoptilar y meristema apical de vastago son cada uno independientemente adecuados para transformación genética con un gen de interés; y la transformación ya sea del órgano escutiforme, el anillo coleoptilar o meristema apical de tiro con un gen de interés.
5. 5. Método de la reivindicación 4, en donde el gen de interés proporciona una característica deseada, seleccionada a partir del grupo que consiste en resistencia al frío, resistencias a la sequía, resistencia a herbicidas, resistencia fungal, resistencia a insectos y senescencia retardada.
6. 6. Método de la reivindicación 5, en donde la característica deseada es resistencia al frío .
7. 7. Método de la reivindicación 5, en donde el gen de interés codifica un CBF.
8. 8. Método de la reivindicación 4, en donde la transformación se lleva a cabo mediante un método seleccionado a partir del grupo que consiste en electroporación, bombardeo de partículas, transformación mediada por barbas y transformación mediada por Agroba c t eri um .
9. 9. Método de la reivindicación 4, en donde antes de dividir la semilla de maíz, la semilla de maíz se germina ya sea en un medio de imprimación de callo de pre-división que comprende sales básales de LS y 2, 4-D o se germina en un medio de imprimación de vastago de pre-división que comprende sales básales de MS y 2, 4-D.
10. 10. Método de generación in vi tro de al menos un vastago de maíz que comprende, a) germinación de una semilla en un medio de imprimación de callo de pre-división que comprende sales básales de LS y 2, 4-D; b) división de una semilla de maíz germinada, de manera longitudinal en dos mitades, a fin de generar una explantación de semilla dividida; c) inicio de la formación de callo primario en dicha explantación de semilla dividida que comprende la incubación de la explantación de semilla dividida en un medio de inducción de callo de semilla dividida que comprende sales básales de LS, vitaminas B5 y 2,4-D para formar un callo primario; d) formación de un callo proliferado que comprende la incubación del callo primario en un medio de mantenimiento de callos primarios que comprende sales básales de LS, vitaminas B5 y 2, 4-D para formar un callo proliferado; e) formación de un callo embriogénico que comprende la incubación del callo proliferado en un medio de inducción de callo embriogénico que comprende sales básales de LS, vitaminas B5, 2, 4-D y BAP a fin de formar un callo embriogénico; f) generación de al menos un vastago que comprende la incubación del callo embriogénico en un medio de inducción de vastago de callo/embrión somático que comprende sales básales de MS y BAP a fin de generar al menos un vastago.
11. 11. Método para la generación in vi tro de un vastago de maíz que comprende a) germinación de una semilla en un medio de imprimación de vastago de pre-división que comprende sales básales de MS y 2, 4-D; b) división de la semilla de maíz germinada, de manera longitudinal en dos mitades, a fin de generar una explantación de semilla dividida; c) incubación de la explantación de semilla dividida en un medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida que comprende sales básales de MS y BAP a fin de generar al menos un vastago de maíz.
12. 12. Método de la reivindicación 11 en donde el medio de inducción de vastago de explantación de semilla de maíz comprende además 6-furfurilaminopurina ("quinetina") .
13. 13. Método i n vi tro de generación de un plantío enraizado de maíz que comprende, a) exposición del al menos un vastago de maíz generado en la reivindicación 10, 11 o 12 a un medio de alargamiento de vastago que comprende sales básales de MS y vitaminas B5 y permitir que se alargue el al menos un vastago de maíz; y b) echar raíz el vastago alargado en un medio de echado de raíz que comprende sales básales de MS y ácido 1-naftalenoacético ("NAA") a fin de formar un plantío enraizado.
14. 14. Medio de imprimación de callo de pre-división para la germinación de una semilla de maíz antes de que la semilla de maíz se divida por la mitad a fin de generar una explantación de semilla dividida, comprendiendo el medio sales básales de LS y una auxina o mezclas de auxinas, en donde la auxina o mezclas de la misma se presenta a una concentración de 1.5 mg/l hasta 3.5 mg/l, y en donde la germinación de dicha semilla de maíz en dicho medio incrementa la frecuencia de inducción de callo de la explantación de semilla dividida sobre la frecuencia de inducción de callo de una explantación de semilla dividida que no ha germinado en un medio de imprimación de callo de pre-división.
15. 15. Medio de imprimación de callo de pre-división de la reivindicación 14 en donde la auxina es 2, 4-D y se presenta a 3.0 mg/l.
16. 16. Medio de imprimación de vastago de pre-división para la germinación de una semilla de maíz antes de que la semilla de maíz se divida por la mitad a fin de generar una explantación de semilla dividida, comprendiendo el medio sales básales de MS y una auxina o mezclas de auxinas, en donde la auxina o mezclas de la misma se encuentra a una concentración de 1.0 hasta 3.5 mg/l, y en donde la germinación de dicha semilla de maíz en dicho medio incrementa la frecuencia de inducción de vastago de la explantación de semilla dividida sobre la frecuencia de inducción de vastago de una explantación de semilla dividida que no ha germinado en un medio de imprimación de vastago de pre-división.
17. 17. Medio de imprimación de vastago de pre-división de la reivindicación 16 en donde la auxina es 2, 4-D y se presenta a 2.0 mg/l.
18. 18. Medio de inducción de callo de semilla dividida que comprende sales básales de LS, vitaminas B5 y 2, 4-D a una concentración de 1.0 mg/l hasta 3.5 mg/l, en donde una explantación de semilla dividida incubada en el medio de inducción de callo de semilla dividida en la oscuridad genera un callo.
19. 19. Medio de inducción de callo de semilla dividida de la reivindicación 18 en donde 2, 4-D se presenta a una concentración de 3.0 mg/l.
20. 20. Medio de mantenimiento de callos primarios que comprende sales básales de LS, vitaminas B5 y 2, 4-D a una concentración de 0.5 mg/l hasta 2.5 mg/l, y en donde un callo primario incubado en la oscuridad en el medio de mantenimiento de callos primarios se desarrolla en un callo proliferado.
21. 21. Medio de inducción de callo embriogénico que comprende sales básales de LS, vitaminas B5 y 2, 4-D a una concentración de 0.1 mg/l y BAP a una concentración de 0.5 mg/l, en donde cuando se incuba un callo proliferado, desarrollado en una explantación de semilla dividida de maíz, en un medio de inducción de callo embriogénico, el callo proliferado se desarrolla en un callo embriogénico.
22. 22. Medio de inducción de vastago de callo/embrión somático que comprende sales básales de MS, vitaminas B5 y BAP a una concentración de 1.0 mg/l, en donde, cuando se incuba un embrión somático en el medio de inducción de vastago de callo/embrión somático, el embrión somático desarrolla al menos un vastago.
23. 23. Medio de inducción de vastago de explantación de semilla dividida que comprende sales básales de MS, vitaminas B5 y BAP a una concentración de 2.0 mg/l hasta 5.0 mg/l, en donde cuando se incuba una explantación de semilla dividida de maíz en el medio de inducción de vastago, la explantación de semilla dividida genera al menos un vastago.
24. 24. Medio de inducción de vastago de la reivindicación 23, que comprende además 6-furfurilaminopurina ("quinetina") a una concentración de aproximadamente 1.75 mg/l hasta aproximadamente 2.5 mg/l.
25. 25. Medio de inducción de vastago de la reivindicación 24, en donde la concentración de Quinetina es de 2.0 mg/l y la concentración de BAP es de 4.0 mg/l .