ME01198B - Prečišćavanje il-18 vezujućeg proteina - Google Patents

Description

PREČIŠĆAVANJE IL-18 VEZUJUĆEG PROTEINA POLJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak je iz oblasti prečišćavanja proteina. Preciznije, on se odnosi na prečišćavanje IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP) putem hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja. Preferentno, ovaj pronalazak dalje obuhvata korake purifikacije odabrane iz afinitetne hromatografije imobilisanih jona metala, hromatografije sa izmenom jona, hidrofobne interakcione hromatografije i hromatografije obrnute faze.

OBLAST TEHNIKE

Proteini su postali komercijalno važni kao lekovi koji se generalno nazivaju "biološki agensi". Jedan od najvećih izazova je razvoj ekonomičnog i efikasnog procesa purifikacije proteina u komercijalnom obimu. Iako su danas na raspolaganju mnoge metode za pripremu velikih količina proteina, neprerađeni proteini, kao što su telesne tečnosti, ne sadrže samo željeni proizvod već i onečišćenja koje je teško razdvojiti od željenog proizvoda. Sta više, biološki izvori kao što su supematanti ćelijskih kultura ćelija koje eksprimiraju neki proteinski proizvod na rekombinantan način mogu da sadrže manje onečišćenja, posebno ukoliko se ove ćelije gaje u medijumu bez seruma. Međutim, zdravstvene vlasti zahtevaju više standarde čistoće za proteine koji su namenjeni za primenu kod ljudi. Osim toga, mnoge metode purifikacije mogu da sadrže korake koji iziskuju primenu niske ili visoke pH, visoke koncentracije soli ili druge ekstremne uslove koji mogu da ugroze biološku aktivnost datog proteina. Iz tog razloga, kod bilo kog proteina izazov predstavlja ustanovljavanje nekog procesa purifikacije koji omogućava dovoljnu čistoću uz istovremeno očuvanje biološke aktivnosti proteina.

Hromatografski sistemi sa izmenom jona se široko koriste za razdvajanje proteina primamo na osnovu razlika u naelektrisanju. Kod hromatografije sa izmenom jona, naelektrisane mrlje na površini rastvorka bivaju privučene suprotnim naelektrisanjem hromatografske matrice, pod uslovom da je jonska snaga okolnog pufera mala. Elucija se generalno postiže povećanjem jonske snage (tj.provodjivosti) pufera kako bi on bio u kompeticiji sa rastvorkom za naelektrisana mesta matrice za izmenu jona. Promena pH a time i pramena naelektrisanja rastvorka je još jedan način da se postigne elucija rastvorka. Pramena provodljivosti ili pH može biti postepena (gradijentna elucija) ili korak po korak (elucija korak po korak).

Izmenjivači anjona se mogu klasifikovati kao slabi ili jaki. Grupa naelektrisanja na izmenjivaču slabih anjona je slaba baza, koja postaje deprotonirana pa tako gubi svoje naelektrisanje pri visokoj pH. DEAE-celuloza je primer izmenjivača slabih anjona, gde se amino grupa može pozitivno naelektrisati ispod pH - 9 i ona postepeno gubi svoje naelektrisanje pri višim pH vrednostima. Dietilaminoetil (DEAE) ili dietil-(2-hidroksi-propiljaminoetil (QAE) imaju na primer hlorid kao suprotni jon.

Snažni izmenjivač jona sa druge strane, sadrži neku jaku bazu koja ostaje pozitivno naelektrisana u okviru celokupnog pH opsega koji se normalno koristi kod hromatografije sa izmenom jona (pH 1-14). Q-sefaroza (Q označava kvaternami amonijum) je primer za snažni anjonski izmenjivač.

Katjonski izmenjivači se takođe mogu klasifikovati kao slabi ili jaki. Snažni katjonski izmenjivač sadrži neku jaku kiselinu (kao što je sulfopropil grupa) koja ostaje naelektrisana u opsegu pH 1 -14; dok slabi katjonski izmenjivač sadrži neku slabu kiselinu (kao što je karboksimetil grupa), koja postepeno gubi svoje naelektrisanje kako se pH smanjuje ispod 4 ili 5. Karboksimetil (CM) i sulfopropil (SP) imaju na primer natrijum kao suprotan jon.

Hromatografski sistemi koji imaju hidrofobnu stacionarnu fazu se takođe široko koriste za purifikaciju proteina. U ovu kategoriju je uključena hidrofobna interakciona hromatografija (HIC) i tečna hromatografija obrnute faze (RPLC). Fizičko-hemijska osnova za separaciju uz pomoć HIC i RPLC je hidrofobni efekat, proteini se odvajaju na hidrofobnu stacionarnu fazu na osnovu razlika u hidrofobnosti.

Kod HIC generalno, uzorci molekula u visoko slanom puferu uneti su u HIC kolonu. So u ovom puferu stupa u interakciju sa molekulima vode kako bi se smanjila solvatacija molekula u rastvoru, a time se izlažu hidrofobni regioni na molekulima uzorka koji posledično bivaju apsorbovani od strane HIC kolone. Što je molekul hidrofobniji, manje soli je potrebno da se pospeši vezivanje. Obično se koristi opadajući gradijent soli za eluciju uzoraka iz kolone. Sa smanjivanjem jonske snage, izlaganje hidrofilnih regiona molekula se povećava i dolazi do elucije molekula iz kolone kako bi se povećala hidrofobnost. Elucija uzorka se takođe može postići dodavanjem blagih organskih modifikatora ili deterdženata u pufer za eluciju.

Prikaz HIC je dat u npr. Purifikacija proteina, 2d Ed., Springer-Verlag, New York, str. 176-179(1988).

Kod HIC, postoje različite hromatografske podloge koje nose različite ligande. Ovi ligandi se razlikuju po svojoj hidrofobnosti. Hidrofobni ligandi koji se obično koriste su fenilni-, butilni- ili oktilni- ostatci.

Hidrofobna hromatografija sa indukcijom naelektrisanja je predmet HIC uz pomoć smola koje nose ligande kao što su derivati 4-merkaptoteilpiridina. Primer hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja smole je MEP-HyperCel® (Boschetti et al., Genetic Engineering Vol. 20. No. 13. July, 2000, Boschetti and Jungbauer, 2000). Hromatografija obrnute faze predstavlja metodu purifikacije proteina koja je blisko povezana sa HIC, obzirom da se obe zasnivaju na interakciji između nepolamih grupa koje su dostupne za rastvarao na površini biomolekula i hidrofobnih liganda matrice. Međutim, ligandi koji se koriste kod hromatografije obrnute faze su u većoj meri supstitucionisani hidrofobnim ligandima nego što je to slučaj kod HIC liganda. Iako se stepen supstitucije HIC adsorbenata može kretati u opsegu od 10-50 µmol/mL matrice C2-C8 arilnih liganda, nekoliko stotina µmol/mL matrice C4-C8 alkilnih liganda se obično koristi kod adsorbenata hromatografije obrnute faze.

Hidrofobna interakciona hromatografija i hromatografija obrnute faze se takođe razlikuju po tome što se hidrofobna interakciona hromatografija vrši u vodenom rastvaraču a promene jonske snage se koriste za eluciju kolone. Protein koji se obično vezuje u nativnom stanju preko hidrofobnih grupa je lociran na površini proteina, a nativno stanje se zadržava tokom uslova elucije. Nasuprot ovome, kod hromatografije obrnute faze koristi se neki hidrofobni rastvarač (obično acetonitril) a vezivanje liganda je u funkciji fazne particije između hidrofobne prirode rastvarača i kolone funkcionalne grupe. Proteini su obično denaturisani u određenoj meri u takvim rastvaračima i vezuju se zbog hidrofobne prirode celokupne polipeptidne sekvence. Obzirom da je većina hidrofobnih grupa locirana u jezgru globulamih proteina, vezivanje je povezano sa obimom denaturacije proteina i mogućnošću spajanja ovih grupa sa kolonom funkcionalnih grupa. Izvor 30RPC kolone je polimerna matrica obrnute faze. Ona se zasniva na rigidnim perlama od polistirena/divinil benzena jedne veličine prečnika od 30 mikrona. Njene karakteristike se mogu ukratko prikazati na sledeći način: Izuzetno širok pH opseg (1 -12), visoka selektivnost, visoka hemijska rezistentnost, visok kapacitet i visoka rezolucija pri velikim brzinama protoka.

Naredni tip hromatografije koji se široko koristi za purifikaciju proteina se naziva afiniteta hromatografija imobilisanih jona metala (IMAC). Godine 1975, Porath je uveo afinitetnu hromatografiju imobilisanih jona metala (IMAC) u frakcionisanje proteina [J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975)]. U Porathovom radu, IMAC obuhvata deri vati zac iju smole iminodiacetatnom kiselinom (IDA) i helaciju metalnih jona za smolu derivatizovanu uz pomoć IDA. Ovi proteini se razdvajaju na osnovu njihovog afiniteta za metalne jone koji su imobilisani helacijom.

Proteini se vezuju za metalne jone preko slobodnih mesta koordinacije i oni su imobilisani na koloni. Od tog momenta, drugi ligandi osim IDA su korišćeni za helaciju metalnih jona za smole. Studije sa serumskim proteinima su pokazale da je IMAC ekstremno specifična i selektivna tehnika separacije [J. Porath and B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983)]. Adsorbent se priprema spajanjem metalnih helata koji formiraju ligand, kao što je iminodisirćetna kiselina, sa sefarozom ili superozom i tretiranjem rastvorom jednog ili više divalentnih jona metala kao što su Zn2+, Cu2+, Cd2+, Hg2+, Co2+ Ni2+ ili Fe2+. Reakcija vezivanja zavisi od pH a elucija se vrši smanjenjem pH i povećanjem jonske snage pufera ili uključivanjem EDTA u pufer.

Stvarni mehanizmi koji dovode do vezivanja proteina za slobodne jone metala nisu sasvim shvaćeni i zavise od jednog broja činilaca, od kojih konformacija nekog određenog proteina nije najmanje važna. Međutim, kada su joni metala imobilisani, u igru ulazi najmanje tri ograničavajuća faktora, rečju, smanjeni broj raspoloživih mesta koordinacije na metalu, ograničena pristupačnost imobilisanog metala za mesta vezivanja na proteinu i zavisnosti od karakteristika smole, ograničen pristup imobilisanom metalnom jonu za proteine. Iz toga razloga je izuzetno teško a priori reći koji će proteini ispoljiti a koji neće ispoljiti afinitet prema imobilisanim jonima metala lnterleukin-18 vezujući protein (IL-18BP) je rastvorljivi protein koji se prirodno pojavljuje i koji je inicijalno purifikovan po pitanju afiniteta, na koloni IL-18 iz urina (Novick et al. 1999). IL-18BP ukida IL-18 indukciju IFN-y i IL-18 aktivaciju NF-kB in vitro. Osim toga, IL-18BP inhibira indukciju IFN-7 kod miševa kod kojih je injiciran LPS.

IL-18BP gen je bio lokalizovan na humani hromozom 11 i nijedan ekson koji je kodirao transmembranski domen nije mogao biti nađen u 8.3 kb genomskoj sekvenci koja je obuhvatala IL-18BP gen. Kod ljudi su do sada identifikovana četiri izoforma IL-18BP generisana alternativnim uplitanjem mRNK. Oni su označeni kao IL-18BP a, b, c, i d, i svi dele isti N-terminus a razlikuju se po C-terminusu (Novick et al 1999). Ovi izoformi se razlikuju po svojoj sposobnosti vezivanja IL-18 (Kim et al. 2000). Od ova četiri humana izoforma IL-18BP (hIL-18BP) za izoforme a i c je poznato da imaju neutrališuću sposobnost za IL-18. Izoform IL-18BP koji je prisutan u najvećoj količini, ispoljava visok afinitet prema IL-18 sa brzim on-rate i sporim off-rate, a disocijativna konstanta (Kd) iznosi približno 0.4 nM (Kim et al. 2000). IL-18BP se konstitutivno eksprimira u slezini i pripada superporodici imunoglobulina. Ostatci koji su uključenu u interakciju IL-18 sa IL-18BP su opisani kroz upotrebu kompjuterskog modeliranja. (Kim et al. 2000) i na osnovu interakcije između sličnih proteina IL-lp sa IL-1R tipa I (Vigers et al. 1997).

IL-18BP je konstitutivno prisutan u mnogim ćelijama (Puren et al. 1999) i cirkuliše kod zdravih ljudi (Urushihara et al. 2000), predstavljajući jedinstven fenomen u biologiji citokina. Zbog visokog afiniteta IL-18BP prema IL-18 (Kd = 0.4 nM) kao i zbog visoke koncentracije IL-18BP koja se nalazi u cirkulaciji (20-struki molami višak u odnosu na IL-18), pretpostavlja se daje većina, ako ne i svi molekuli IL-18 u cirkulaciji vezana za IL-18BP. Stoga, cirkulišući IL-18BP koji je u kompeticiji sa receptorima za IL-18 na površini ćelije može da deluje kao prirodni antiinflamatomi i imunosupresivni molekul. Ukazano je da IL-18BP predstavlja terapijski protein kod jednog boja bolesti i poremećaja, kao što su psorijaza, Kronova bolest, reumatoidni artritis, psorijatični artritis, oštećenje jetre, sepsa, ateroskleroza, ishemična bolest srca, alergije, itd. Videti npr. WO9909063, WO0107480, WO0162285, WO0185201, W002060479, WO02096456, WO03080104, WO02092008, WO02101049, WO03013577. Obzirom daje ukazano daje IL-18BP terapijski protein pri primeni npr. kod ljudi, postoji potrebna za odgovarajućim količinama IL-18BP koje su dovoljno čiste.

Međutim, do sada nije postojao nijedan proces purifikacije koji bi omogućio dobijanje purifikovanog IL-18BP.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak je zasnovan na razvoju procesa purifikacije IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP).

Stoga, iz prvog aspekta, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja za purifikaciju IL-18BP.

Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na proces purifikacije IL -18 vezujućeg proteina (IL-18BP) iz tečnosti koja čini jedan korak hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja.

Preciznije, proces purifikacije ovog pronalaska dalje obuhvata korak koji je odabran iz afinitetne hromatografije imobilisanih jona metala, hromatografije sa izmenom jona, hidrofobne interakcione hromatografije i hromatografije obrnute faze.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Sl.1 daje shematski prikaz preferentnog procesa purifikacije u okviru ovog pronalaska koji dovodi do purifikovanog IL-18BP ("IL-18BP BULK").

Sl.2 prikazuje dozno-responzivne krive referentnog materijala IL-18BP u KGg-1 in vitro bioeseju u 10 nezavisnih eksperimenata.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na razvoju procesa purifikacije IL-18BP koji dovodi do purifikovanog IL-18BP.

Prema prvom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja za purifikaciju IL-18BP. Prema jednom preferentnom konceptu, ovaj korak indukcije hidrofobnog naelektrisanja kod hromatografije se sprovodi kombinacijom jednog ili više koraka koji su odabrani iz afinitetne hromatografije imobilisanih jona metala, hromatografije sa izmenom jona, hidrofobne interakcione hromatografije i hromatografije obrnute faze.

Preferentno, korak indukcije hidrofobnog naelektrisanja se sprovodi na 4-merkapto-etil-piridinskoj (MEP) smoli.

Prema narednom preferentnom konceptu, korak indukacije hidrofobnog naelektrisanja se sprovodi u kombinacija sa jednim ili više koraka odabranih iz afinitetne hromatografije imobilisanih jona metala, hromatografije sa izmenom jona, hidrofobne interakcione hromatografije i hromatografije obrnute faze. Individualni hromatografski koraci se mogu sprovesti po bilo kom pogodnom redosledu.

Prema drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na proces purifikacije IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP) iz neke tečnosti uključujući i korak hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja.

Termin "smola", u smislu u kome je ovde korišćen se koristi za bilo koju matricu ili noseći materijal u nekoj hromatografskoj koloni, kao što je npr. agaroza, sefaroza, superosa, dekstran, sefadeks, polipropilen ili slično koji se mogu derivatzovati uz pomoć liganda ili funkcionalnih grupa kao što su na primer DEAE, CM, MEP, fenil, kako je detaljno objašnjeno u poglavlju "Stanje tehnike". Materijali korišćeni za matricu mogu biti prisutni u različitim unakrsno povezanim oblicima, u zavisnosti od specifične upotrebe. Zapremina određene smole kao i dužina i prečnik kolone koja će se koristiti zavise od nekoliko parametara kao što su zapremina tečnosti koju treba tretirati, koncentracija proteina u tečnosti koju treba podvrgnuti procesu pronalaska itd. a određivanje ovoga u velikoj meri zavisi od veštine stručnjaka iz ove oblasti.

Hidrofobna hromatografija sa indukcijom naelektrisanja se preferentno viši na smoli koja ima 4-merkaptoetil-piridin (MEP) kao imobilisani ligand. MEP-Hypercel® je smola koja je posebno pogodna za upotrebu u okviru ovog pronalaska.

Preferentno, ovaj proces dalje sadrži najmanje jedan korak odabran iz afinitetne hromatografije imobilisanih jona metala, hromatografije sa izmenom jona, hidrofobne interakcione hromatografije i hromatografije obrnute faze. Individualni hromatografski koraci se mogu sprovesti po bilo kom redosledu. Svaki pojedinačni korak se može sprovesti više puta ukoliko je to neophodno.

Afinitetna hromatografija imobilisanih jona metala se preferentno sprovodi na helacionoj smoli kao stoje helaciona sefaroza.

Korak hromatografije sa izmenom jona može da obuhvata izmenjivač jona ili neki katjonski izmenjivač. Preferentna je upotreba materijala za hromatografiju sa izmenom jona, posebno nekog materijala za slabu izmenu jona a visoko je preferentna upotreba neke karboksimetil (CM)-smole, kao što je CM sefaroza FF da bi se sproveo ovaj korak procesa purifikacije.

Korak hidrofobne interakcione hromatografije (HIC) se može sprovesti na bilo kojoj poznatoj HIC smoli, kao što je bilo koja smola koja alkilne ili arilne ostatke kao imobilisani ligand. Butil-, oktil- ili fenil-sefaroza (agaroza) su dalji primeri takvih HIC smola. Kod ovog koraka purifikacije preferentno je koristiti neku fenilnu smolu, kao što je fenil sefaroza FF.

Ovaj proces purifikacije može dalje da obuhvata korak hromatografije obrnute faze. Preferentni materijal kod ovog koraka je izvor reverzepaze 30 RPC.

Prema jednom veoma preferentnom konceptu, proces za purifikaciju IL-18BP iz neke tečnosti obuhvata korake:

(a) Podvrgavanja tečnosti afinitetnoj hromatografij i imobilisanih jona metala;

(b) Podvrgavanja eluata metalnog jona afinitetne hromatografije interakcionoj hromatografij i sa hidrofobnim naelektrisanjem;

(c) Podvrgavanja eluata interakcione hromatografije sa hidrofobnim naelektrisanjem hromatografij i sa izmenom jona;

(d) Podvrgavanja protočne hromatografije sa izmenom jona hidrofobnoj interakcionoj hromatografij i;

(e) Podvrgavanja eluata hidrofobne interakcione hromatografije hromatografij i obrnute faze.

Iako je gore navedeni redosled koraka (a) do (e) preferentan, koraci se u procesu ovog pronalaska mogu sprovesti po bilo kom redosledu koji dovodi do produkcije nekog purifikovanog proteina, Bilo koji korak purifikacije u okviru ovog pronalaska se takođe može sprovesti sam za sebe (izolovano) kako bi se postigao neki stepen čistoće ili eliminacija ćelija domaćina ili onečišćenja iz medijuma. Treba obratiti pažnju da se kod ovog preferentnog procesa purifikacije IL-18BP ne vezuje za smolu za izmenu katjona pa se stoga protok ove kolone koristi za dalju preradu. Druge smole koje su korišćene u okviru procesa purifikacije kod ovog pronalaska vezuju IL-18BP, dok se onečišćenja ne vezuju. Posle koraka vezivanja i ispiranja, IL-18BP se eluira pod određenim uslovima. U ovim koracima se eluat dalje koristi.

Korak (a) se preferentno sprovodi na koloni helacione sefaroze, kao što je kolona brzog protoka helacione sefaroze kod koje su joni Zn2+ helirani. Preferentno, vezivanje IL-18BP se sprovodi pri pH 8.5 ±0.1, preferentno u 50 mM natrijum fosfata i 0.5 M NaCI koja ima ovu pH. Korak ispiranja se mora sprovesti sa 15 mM amonijum hlorida u puferu za uravnoteživanje. Elucija se preferentno sprovodi pri pH 9.0 ±0.5, npr. pri pH 8.7 ili pri pH 9, npr. u 0.075 M amonijum acetata ili u 0.06 M amonijum acetata koji ima ovu pH.

Korak (b) se preferentno sprovodi na MEP (derivat 4-merkaptoetilpiridina) koloni, kao što je MEP HyperCel® (LifeSciences). Vezivanje IL-18BP se sprovodi preferentno pri pH 6.1 + 0.1, npr. u PBS IX + 1 NaCI koja ima ovu pH. Elucija se sprovodi preferentno pri pH 8.4 ±0.1, npr. sa 20 mM fosfatnog pufera plus 35% propilen glikola, što je mešavina čija je pH 8.4 ± 0.1.

Korak (c) se preferentno sprovodi na koloni od karboksimetil-sefaroze (CM). Ovo je korak kod koga se protok prikuplja radi dalje purifikacije. Ovaj korak se zasniva na činjenici da se pod određenim okolnostima koje su u vezi sa npr. slanim pH uslovima, IL-18BP ne vezuje za ovu smolu dok se onečišćenja (npr. proteini ćelija domaćina, proteini izvedeni iz seruma) koja su korišćena vezuju za nju. Preferentno, korak (c) se sprovodi pri pH 6.0±0.2, na primer u prisustvu 1 mM MES (N-morfolinoetanesulfonska kiselina).

Korak (d) se preferentno sprovodi na koloni fenil sefaroze, kao što je kolona brzog protoka fenil-sefaroze. Preferentno, vezivanje IL-18BP se sprovodi na oko pH 9.1 ± 0.2, npr. u 50 mM natrijum borata i 0.9 M amonijum sulfata ili 0.10 M amonijum sulfata koji ima ovu pH. Ova elucija iz kolone fenil-sefaroze se preferentno sprovodi pri pH 9.1 + 0.2 u prisustvu povišene koncentracije soli, kao na primer kod 50 mM natrijum borata 9.1 ± 0.2, 0.15M amonijum sulfata koji ima ovu pH.

Korak (e) se preferentno sprovodi na izvornoj 30 RPC koloni. Vezivanje IL-18BP za materijal kolone se preferentno sprovodi pri pH 9.1 ± 0.2, npr. u 50 mM natrijum boratnog pufera. Elucija se preferentno sprovodi uz pomoć nekog gradijenta, IL-18BP eluira oko 28-32% 0,1% trifluorosirćetne kiseline (TFA) u acetonitrilu.

Jasno je da se uslovi koji su gore opisani u vezi sa koracima purifikacije (a) do (e) mogu takođe primeniti kada se sprovode pojedinačni koraci iz ovog pronalaska ili (sub) kombinacije koraka.

Kod narednog preferentnog koncepta ovog procesa purifikacije, obavlja se jedan ili više koraka ultrafiltracije. Ultrafiltracija je korisna za uklanjanje komponenata male molekularne težine u eluatima dobijenim iz prethodnih hromatografskih koraka. Ova ultrafiltracija omogućava uklanjanje organskog rastvarača, TFA i soli iz prethodnog koraka, uravnoteživanje IL-18BP u zapreminskom puferu i koncentrisanje ovog molekula do željene koncentracije. Takva ultrafiltracija se može npr. obaviti na podlozi za ultrafiltraciju uz isključivanje komponenata čija je molekularna težina ispod 5 kDa. Preferentno, ultrafiltracija se sprovodi između koraka (b) i (c), i/ili posle koraka (e). Još preferentnije je da se sprovedu dva koraka ultrafiltracije, jedan između koraka (b) i (c) i jedan posle koraka (e).

Ukoliko je protein purifikovan prema procesu iz ovog pronalaska namenjen za primenu kod ljudi, korisno je dodatno uključiti jedan ili više koraka eliminacije virusa u ovaj proces.. Preferentno, korak filtracije radi eliminacije virusa se sprovodi između koraka (d) i (e). Dalje je preferentno da se korak filtracije radi uklanjanja virusa sprovodi posle koraka (e). Još preferentnije, ovaj korak obuhvata najmanje dva koraka eliminacije virusa, od kojih se jedan sprovodi između koraka (d) i (e), a drugi se sprovodi posle koraka (e). Ukoliko je inicijalna zapremina tečnosti iz koje se purifikuje IL-18BP velika, može biti korisno da se smanji zapremina materijala izdvajanjem proteina i njegovom re-suspenzijom u manjoj količini pufera pre stvarnog početka procesa purifikacije.

Stoga, proces iz ovog pronalaska dalje preferentno obuhvata inicijalni korak zahvatanja, tj. korak koji se sprovodi pre bilo kog od gore pomenutih koraka purifikacije i preferentno pre koraka (a) gore navedenog procesa.

Prema jednom preferentnom konceptu, ovaj korak izdvajanja se sprovodi uz pomoć hromatografije sa izmenom jona. Preferentno, smola za izmenjivanje jona koja se koristi u koraku izdvajanja predstavlja jednu snažnu matricu za izmenjivanje jona, kao stoje npr. Q Sefaroza brzog protoka. Veoma je preferentno koristiti trimetilaminoetil-derivatizovanu smolu, kao što je TMAE Fractogel® (ili TMAE HiCap®) kao materijal za izmenu jona. Prednost je ta što korak izdvajanja može da ukloni >60% ukupnih kontaminanata prisutnih u neprerađenom materijalu.

Da bi se olakšalo čuvanje ili transport, na primer, ovaj materijal se može zamrznuti i otopiti pre i/ili posle bilo kog koraka purifikacije iz ovog pronalaska.

U skladu sa ovim pronalaskom, IL-18BP koji treba purifikovati može biti nativni, tj. to može biti IL-18BP koji se prirodno javlja. Iz tog razloga se on može purifikovati iz bilo kog prirodnog izvora ili materijala, kao npr. iz telesnih tečnosti kao stoje urin.

IL-18BP se takođe može dobiti iz bilo kog životinjskog ili humanog izvora. Preferentno, IL-18BP koji treba da bude purifikovan je humanog porekla a još preferentnije to je rekombinantni IL-18BP. Rekombinantni IL-18BP se može proizvesti u prokariotskim ekspresionim sistemima, kao što su bakterijski sistem kao što je escherichia coli. On takođe može biti proizveden u eukariotskim ekspresionim sistemima, kao što su ćelije kvasnica, insekata ili sisara. U skladu sa ovim pronalaskom, preferentno je eksprimirati IL-18BP u ćelijama sisara kap što su životinjske ćelijske loze ili humane ćelijske loze. Ovarijalne ćelije kineskih hrčaka (CHO) su primer ćelijske loze koja je posebno pogodna za ekspresiju IL-18BP.

Ukoliko je IL-18BP koji treba purifikovati eksprimiran od strane ćelija sisara koje ga izlučuju, početni materijal u procesu purifikacije kod ovog pronalaska je supematant ćelijske kulture koji se takođe naziva ubrani ili neprerađeni IL-18BP. Ukoliko su ove ćelije kultivisane u medijumu koji sadrži životinjski serum, supematant ćelijske kulture će takođe sadržati serumske proteine kao onečišćenja.

Preferentno, ćelije koje eksprimiraju IL-18BP se kultivišu u uslovima bez seruma. U ovom slučaju, početni materijal u procesu purifikacije kod ovog pronalaska je supematant ćelijske kulture bez seruma koji uglavnom sadrži proteinske ćelije domaćina kao onečišćenja. Ukoliko su faktori rasta dodati u podlogu za ćelijsku kulturu, kao što je insulin, na primer, ovi proteini će preferentno biti takođe eliminisani tokom procesa purifikacije.

Obzirom daje IL-18BP rastvorljiv protein koji se sekretuje, on se oslobađa u supematant ćelijske kulture bilo uz pomoć prirodnog signalnog peptida ili uz pomoć heterolognog signalnog peptida, tj. signalnog peptida izvedenog iz drugog sekretovanog proteina koji može biti efikasniji kod određenog ekspresionog sistema koji je korišćen. Tečnost iz koje se IL-18BP purifikuje je stoga preferentno supematant i to preferentno supematant ćelijske kulture, kao stoje npr. supematant CHO-ćelija. Supematant ćelijske kulture može da sadrži serum dobijen od životinja, ukoliko su ćelije kultivisane na podlozi koja sadrži serum. Preferentno je purifikovati protein iz supematant ćelija koje su gajene na podlozi bez seruma, tj. na podlozi za kulturu koja ne sadrži serum izveden iz goveđeg seruma ili drugih životinjskih izvora.

Termin "IL-18 vezujući protein" is je ovde korišćen kao sinonim za "IL-18BP". Ovaj termin se odnosi na IL-18 vezujuće proteine kao što su oni definisani u WO 99/09063 ili u Novick et al., 1999. Termin IL-18BP uključuje povezane varijante i/ili izoforme IL-18 vezujućih proteina, kao što su one definisane u Kim et al. 2000, posebno humane izoforme a i c IL-18BP. Termin "IL-18PB", u smislu u kome je ovde korišćen, dalje uključuje muteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije, fuzionisane proteine, cirkulamo permutovane proteine i delove IL-18BP kako je definisano u WO 99/09063. IL-18BP koji se podvrgava procesu purifikacije prema ovom pronalasku može biti glikoziliran ili ne-glikoziliran , on može biti izveden iz prirodnih izvora, kao što je urin, ili preferentno može biti proizveden rekombinantno. Rekombinantna ekspresija se može sprovesti u prokariotskim ekspresionim sistemima kao što je E. coli, ili u eukariotskim ekspresionim sistemima, preferentno kod sisara.

U smislu u kome je ovde korišćen termin "muteini” se odnosi na analoge nekog IL-18BP, ili na analoge virusnog IL-18BP, kod kojih su ostatci jedne ili više amino kiselina prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP replicirani ostatcima različitih amino kiselina, ili su izbrisani ili su ostatci jedne ili više amino kiselina dodati u prirodnu sekvencu nekog IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, bez značajne promene aktivnosti proizvoda u poređenju sa divljim tipom IL-18BP ili virusnim IL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikama mutageneze usmerenim po mestima, ili uz pomoć bilo koje druge tehnike koja je za to pogodna.

Muteini prema ovom pronalasku uključuju proteine koje kodira nukleinska kiselina, kao što su DNK ili RNK, koji se hibridizuju u DNK ili RNK, koji kodiraju neki IL-18BP ili kodiraju virusni IL-18BP (oba opisana u W099/09063) pod strogim uslovima. Termin"strogi uslovi" se odnosi na hibridizaciju u potom uslove ispiranja, koje stručnjaci iz ove oblasti obično nazivaju "strogim". Videti Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Tekući protokoli u molekularnoj biologiji), supra, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992). Između ostalog, primeri strogih uslova uključuju uslove pranja 12-20°C ispod izračunatog Tm za ispitivani hibrid u npr., 2 x SSC i 0.5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0.1% SDS tokom 15 minuta; 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 37°C tokom 3060 minuta i zatim 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 68°C tokom 30-60 minuta. Stručnjaci iz ove oblasti će razumeti da strogost uslova takođe zavisi od dužine sekvenci DNK, oligonukleotidnih proba (kao što su baze 10-40) ili mešovitih oligonukleotidnih proba. Ukoliko se koriste mešovite probe, preferentno je koristiti tetrametil amonijum hlorid (TMAC) umesto SSC. Videti Ausubel, gore.

Identitet odražava odnos podudarnosti između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, što se određuje poređenjem ovih sekvenci. Generalno, identitet se odnosi na tačan odnos nukeotida prema nukleotidu ili amino kiseline prema amino kiselini kod dve polinukleotidne ili dve polipeptidne sekvence ćelom dužinom sekvence koja se poredi.

Kod sekvenci kod kojih nema tačne podudarnosti može se odrediti "% identiteta". Generalno, dve sekvence koje treba porediti su postavljene tako da daju maksimalnu korelaciju između te dve sekvence. To može da uključuje ubacivanje "praznina" u bilo koju ili obe sekvence kako bi se povećao stepen podudarnosti. % identiteta se može odrediti ćelom dužinom svake sekvence koja se poredi (takozvano globalno podudaranje), što je posebno pogodno kod sekvenci iste ili veoma slične dužine, ili na kraćim, definisanim dužinama (takozvano lokalno podudaranje), koje je pogodnije za sekvence nejednakih dužina.

Metode za poređenje identiteta i homolognosti dve ili više sekvenci su dobro poznate u ovoj struci. Stoga na se na primer mogu koristiti programi koji postoje u okviru Wisconsin Sequvence Analysis Package, verzija 9.1 (Devereux J et al., 1984), a na primer programi BESTFIT i GAP, se mogu koristiti za određivanje % identičnosti između dva polinukleotida i % identičnosti i % homolognosti izmeŠu dve sekvence polipeptida. BESTFIT koristi algoritam "lokalne homologije" koji su razvili Smith i Waterman (1981) i nalazi najbolji pojedinačni region sličnosti između dve sekvence. Drugi programi za određivanje identiteta i/ili sličnosti između sekvenci takođe su poznati u ovoj stručnoj oblasti, na primer BLAST porodica programa (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, koji su dostupni preko naslovne stranice NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990).

Svaki takav mutein preferentno ima sekvencu amino kiselina koja je dovoljno duplikativna za onu koju ima IF-18BP, ili dovoljno duplikativna za virusni IL-18BP, kao stoje posedovanje značajno slične aktivnosti onoj koju ima IF-18BP. Jedna od aktivnosti IF-18BP je njegova sposobnost vezivanja IF-18. Sve dok mutein ima značajnu aktivnost vezivanja za IL-18, on se može koristiti za purifikaciju IF-18, kao stoje to ona uz pomoć afinitetne hromatografije, pa se tako može smatrati da ima značajno sličnu aktivnosti onoj koju ima IF-18BP. Tako se može odrediti da li bilo koji dati mutein ima supstancijalno istu aktivnosti kao IF-18BP na osnovu rutinskih eksperimenata koji uključuju podvrgavanje takvog muteina npr., nekom jednostavnom sendvič eseju kompeticije kako bi se odredili da li se on vezuje ili ne vezuje za neki adekvatno obeleženi IF-18, kao što je radioimunoesej ili EFISA esej.

Kod jednog preferentnog koncepta, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnost ili homolognost sa sekvencom IF-18BP ili virusno-kodiranog IF-18BP homologa, što je definisano u WO 99/09063. Još preferentnije, on ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najpreferentnije, najmanje 90% identičnost ili homolognost sa njim.

Muteini polipeptida IL-18BP ili muteini virusnog IL-18BPs, koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom ili nukleinska kiselina koja ih kodira, obuhvataju ograničenu grupu supstancijalno odgovarajućih sekvenci u vidu supstitucionih peptida ili polinukeotida koje rutinski može da dobije stručnjak iz ove oblasti bez nepotrebnih eksperimenata na osnovu uputstava i smemica koje su ovde date.

Preferentne promene muteina u skladu sa ovim pronalaskom su one koje su poznate kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina IL-18BP polipeptida ili proteina ili virusnog 1L-18BPS, mogu da obuhvataju sinonimne amino kiselina u okviru jedne grupe koja ima dovoljno slična fizičko-hemijska svojstva tako da će supstitucija članova te grupe sačuvati biološku funkciju molekula (Grantham, 1974). Jasno je da insercije i delecije amino kiselina mogu takođe da se vrše kod gore definisanih sekvenci bez menjanja njihove funkcije, posebno ukoliko te insercije i delecije obuhvataju mali broj amino, npr., ispod trideset, a preferentno ispod deset, i ne uklanjaju niti pomeraju amino kiseline koje su ključne za funkcionalnu konformaciju, npr. ostatke cisteina. Proteini i muteini koji se proizvode takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u domen ovog pronalaska.

Preferentno, grupe sinonimnih amino kiselina su one koje su definisane u Tabeli 1. Još preferentnije, grupe sinonimnih amino kiselina su one definisane u Tabeli 2; and najpreferentnije grupe sinonimnih amino kiselina su one definisane u Tabeli 3.

TABELA

Preferentne grupe sinonimnih amino kiselina

TABELA II

TABELA III

Najpreferentnije grupe sinonimnih amino kiselina

Primeri proizvodnje supstitucije amino kiselina kod proteina koji se mogu koristiti za dobijanja muteina IL-18BP polipeptida ili proteina, ili muteina virusnog IL-18BPs, za upotrebu u ovom pronalasku obuhvataju korake svih poznatih metoda, kao što je prikazano u US patentima 4,959,314,4,588,585 i 4,737,462, Mark et al; 5,116,943 Koths et al., 4,965,195 Namen et al; 4,879,111 Chong et al; i 5,017,691 Lee et al; kao i kod proteina supstitucionisanih lizinom koji su prikazani u US patentu br. 4,904,584 (Shaw et al).

Termin "fuzionisani protein" se odnosi na polipeptid koji obuhvata IL-18BP, ili virusni IL-18BP, ili neki mutein ili neki njihov fragment, fuzionisanih sa drugim proteinom koji ima npr. produženo vreme otpornosti u telesnim tečnostima: Neki IL-18BP ili neki virusni

IL-18BP, se stoga mogu fuzionisati sa drugim proteinom, polipeptidom ili slično, npr. sa nekim imunoglobulinom ili njegovim fragmentom.

"Funkcionalni derivati" u smislu u kome su ovde korišćeni pokrivaju derivate IL-18BPs ili virusnog IL-18BP, i njihove muteine i fuzionisane proteine, koji se mogu pripremiti iz funkcionalnih grupa koje se pojavljuju kao bočni lanci na ostatcima N- ili C-terminalnih grupa, sredstvima koja su poznata u ovoj stručnoj oblasti i koja su uključena u ovaj pronalazak sve dok ona ostaju farmaceutski prihvatljiva, tj.ne uništavaju aktivnost proteina koja je supstancijalno slična aktivnosti IL-18BP, ili virusnog lL-18BPs, i ne prenosi toksična svojstva u jedinjenja koja ga sadrže.

Ovi derivati mogu, na primer, da obuhvataju bočne lance polietilen glikola koji mogu da maskiraju antigena mesta i produže rezistentnost nekog IL-18BP ili virusnog IL-18BP u telesnim tečnostima. U ostale derivate spadaju alifatični estri karboksilnih grupa, amidni derivati uključuju alifatične estre karboksilnih grupa, amide karboksilnih grupa koji stupaju u reakcije sa amonijumom ili sa primamim ili sekundarnim aminima, N-acilne derivate slobodnih amino grupa ostataka amino kiselina koji se formiraju sa acilnim delovima (npr. alkanoilne ili karbociklične aroilne grupe) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer onih koje pripadaju ostatcima serila ili treonila) formiranih sa acilnim delovima.

Kao "aktivne frakcije" nekog 1L-18BP, ili virusnog IL-18BP, muteina i fuzionisanih proteina, ovaj pronalazak pokriva sve fragmente ili prekursore polipeptidnog lanca samog molekula proteina ili zajedno sa udruženim molekulima ili ostatcima koji su za njih vezani npr., ostatke šećera ili fosfata ili agregate molekula proteina ili same ostatke šećera pod uslovom da navedena frakcija ima supstancijalno sličnu aktivnost aktivnosti IM8BP.

Termin "soli" se ovde odnosi na soli karboksilnih grupa i na soli dodate u kiseline amino grupa IL-18 inhibitomog molekula ili njegovog analoga. Soli karboksilne grupe se mogu formirati sredstvima koja su poznata u ovoj stručnoj oblasti i tu spadaju neorganske soli, na primer, natrijum, kalcijum, amonijum, soli gvožđa ili cinka i slično kao i soli sa organskim bazama kao što su one koje se formiranju na primer sa aminima, kao što je trietanolamin, arginin ili lizin, piperidin, prokain i slično. Soli sa dodatim kiselininima obuhvataju na primer, soli sa mineralnim kiselinama kao što su na primer hlorovodonična kiselina i sumporna kiselina i soli sa organskim kiselinama kao što su na primer sirćetna kiselina ili oksalna kiselina. Naravno, svaka ta so mora sa zadrži biološku aktivnosti inhibitora IL-18, kao stoje indukcija IFN-gama u krvnim ćelijama.

Sekvence IL-18BP i njegovih spojenih varijanti/izoforma se može uzeti iz W099/09063 ili iz Novick et al., 1999, kao i iz Kim et al„ 2000.

Funkcionalni derivati of IL-18BP se mogu konjugovati u polimere kako bi se poboljšala svojstva proteine, kao što su stabilnost, polu-život, biološka raspoloživost, podnošljivost od strane ljudskog tela ili imunogenost. Da bi se postigao ovaj cilj IL18-BP se može povezati npr. sa polietilen glikolom (PEG). PEGilacija se može sprovesti poznatim metodama koje su opisane u WO 92/13095, na primer. Stoga, prema preferentnom konceptu, funkcionalni derivati čine najmanje jedan deo koji je spojen sa jednom ili više funkcionalnih grupa koje se javljaju kao jedan ili više bočnih lanaca na ostatcima amino kiselina. Koncept prema kome je taj deo polietilen glikolni (PEG) deo je visoko preferentan.

Prema narednom preferentnom konceptu ovog pronalaska, IL-18BP obuhvata fuziju imunoglobulina, tj. inhibitor IL-18 je fuzionisani protein koji obuhvata celokupan ili deo nekog IL-18 vezujućeg proteina koji je fuzionisan sa celokupnim ili delom imunoglobulina. Metode za dobijanje proteina fuzionisanog sa imunoglobulinom su dobro poznate u ovoj stručnoj oblasti, kao što su to one opisane u WO 01/03737, na primer. Stručnjak iz ove oblasti će razumeti da dobijeni fuzionisani protein iz ovog pronalaska zadržava biološku aktivnost IL-18BP, posebno vezivanje za IL-18. Fuzija može biti direktna ili preko kratkog veznog peptida koji može biti tako kratak da obuhvata 1 do 3 ostatka amino kiselina ili duži, na primer, 13 ostataka amino kiselina. Navedeni vezni peptid može biti tripeptid čija je sekvenca E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili vezni peptid sa 13 amino kiselina čija sekvenca obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koje su uvedene između sekvence IL-18BP i sekvence imunoglobulina. Dobijeni fuzionisani protein ima poboljšana svojstva, kao što su produženo vreme rezistentnosti u telesnim tečnostima (polu-život), povećana specifična aktivnost, povećan nivo ekspresije ili je purifikacija fuzionisanog proteina olakšana.

Prema jednom preferentnom konceptu, IL-18BP je fuzionisan sa konstantnim regionom jednog Ig molekula. Preferentno, on je fuzionisan za regione teških lanaca kao što su domeni CH2 i CH3 humanog IgGl, na primer. Dobijanje specifičnih fuzionisanih proteina koji obuhvataju IL-18BP i protein nekog imunoglobulina je opisano u primeru 11 u WO 99/09063, na primer. Ostali izoformi Ig molekula su takođe pogodni za dobijanje fuzionisanih proteina prema ovom pronalasku, kao što je izoform IgG2 ili IgG4, ili druge Ig klase, kao što su IgM ili IgA, na primer. Fuzionisani proteini mogu biti monomemi ili multimemi, hetero ili homomultimemi.

Treći aspekt ovog pronalaska se odnosi na protein purifikovan procesom purifikacije prema ovom pronalasku. U daljem tekstu, takav protein se takođe naziva "purifikovani IL-18BP". Takav purifikovani IL-18BP je preferentno visoko purifikovani IL-18BP. Visoko purifikovani IL-18BP se određuje npr. na osnovu prisustva jedne trake u PAGE gelu prebojenom srebrom posle unošenja proteina u količini of 2 mg po liniji. Purifikovani IL-18BP se može takođe definisati kao kretanje u vidu jednog pika na HPLC. Purifikovani preparat IL-18BP dobijen procesom purifikacije iz ovog pronalaska može da sadrži manje od 20 % onečišćenja, preferentno manje od 10%, 5%, 3%, 2% ili 1% onečišćenja, ili može biti purifikovan do homogenosti, tj. može da ne sadrži proteinske kontaminante.

Purifikovani IL-18BP može da bude namenjen za terapijsku upotrebu, tj. za davanje pacijentima. Ukoliko se purifikovani IL-18BP daje pacijentima, on se preferentno daje sistemski i to preferentno subkutano ili intramuskulamo ili površinski odnosno lokalno. Rektalna ili intratekalna administracija takođe može da bude pogodna, u zavisnosti od specifične upotrebe purifikovanog IL-18BP.

U ove svrhe, purifikovani IL-18BP može biti formulisan kao farmaceutski sastav, tj. zajedno sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosačem, eksipijensima ili slično.

Definicija "farmaceutski prihvatljiv" ima za cilj da obuhvati sve nosače koji je utiču na efektivnost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i koji nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu administraciju aktivni protein(i) mogu biti formulisani u jediničnim dozama za injekcije u nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Aktivni sastojci ovog farmaceutskog sastava prema ovom pronalasku se mogu davati pojedincima na različite načine. Načini administracije uključuju intradermalni, transdermalni (npr. kod formulacija sa sporim oslobađanjem) intradermalni, intraperitonealni, intravenski, subkutani, oralni, intrakranijalni, epiduralni, lokalni, rektalni i intranazalni put. Mogu se koristiti i svi drugi terapijski efektivni načini administracije, na primer apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili putem genske terapije gde se molekul DNK koja enkodira aktivni agens daje pacijentu (npr. preko vektora), što dovodi do ekspresije i sekrecije aktivnog agensa in vivo. Osim toga, protein(i) prema ovom pronalasku se mogu davati zajedno sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, eksipijensi, nosači, rastvarači, i razblaživači.

Za parenteralnu administraciju (npr. intravensku, subkutanu, intramuskulamu) aktivni protein(i) se može formulisati kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofilizovani prah

zajedno sa nekim farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem (npr. voda, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i aditivima koji održavaju izotonost (npr. manitol) ili hemijsku stabilnost (npr. konzervansi i puferi). Ova formulacija se steriliše uz pomoć tehnika koje se obično koriste.

Biološka raspoloživost aktivnog proteina se prema ovom pronalasku takođe može poboljšati upotrebom postupaka konjugacije koji produžavaju polu-život ovog molekula u ljudskom telu, na primer vezivanjem tog molekula sa polietilen glikolont, kako je opisano u PCT Patentnom zahtevu WO 92/13095.

Terapijski efektivne količine aktivnih proteina će biti u funkciji mnogih promenljivih, uključujući i tip antagonista za IL-18, afinitet antagonista prema IL-18, bilo kakvu rezidualnu citotoksičnu aktivnost koju ispoljavaju ti antagonisti, način davanja, kliničko stanje pacijenta (uključujući i poželjnost održavanja ne-toksičnog nivoa endogene IL-18 aktivnosti).

"Terapijski efektivna količina” je takva količina koja kada se primeni, IL-18 inhibitor dovodi do inhibicije biološke aktivnosti IL-18. Primenjena doza, data kao pojedinačna ili višestruka doza nekom pojedincu će se razlikovati u zavisnosti od različitih faktora, uključujući i farmakokinetička svojstva IL-18 inhibitora, način davanja, stanja kod pacijenta i karakteristike (pol, starost, telesnu težinu, zdravlje, veličinu) obim simptoma, istovremene tretmane, učestalost tretmana i željeni efekat. Prilagođavanje i manipulacija ustanovljenim opsegom doza u velikoj meri zavisi od sposobnosti stručnjaka iz ove oblasti kao i in vitro i in vivo metode određivanja inhibicije kod neke osobe.

Purifikovani IL-18 se može koristiti u količini od oko 0.001 do 100 mg/kg telesne težine ili oko 0.01 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0. 1 do 5 mg/kg telesne težine ili oko 1 do 3 mg/kg telesne težine ili oko 2 mg/kg of telesne težine.

Prema narednim preferentnim konceptima, purifikovani IL-18BP se daje svakoga dana ili svakog drugog dana ili tri puta nedeljno ili jednom nedeljno.

Dnevne doze se obično daju u podeljenim dozama ili u obliku sa produženim oslobađanjem koji je efikasan kako bi se postigli željeni rezultati. Druga ili naredna primena može biti u dozi koja je ista, manja ili veća od inicijalne ili prethodne doze koja je data tom pojedincu. Druga ili naredna administracija se može obaviti tokom ili pre javljanja bolesti.

Prema ovom pronalasku, purifikovan IL-18BP se može davati profilaktički ili terapijski nekom pojedincu pre, istovremeno ili nakon drugih terapijskih režima ili agenasa (npr. režimi sa više lekova), u terapijski efektivnoj količini.

Purifikovani IL-18J3P se može koristiti za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju jednog broja bolesti ili poremećaja. Te bolesti ili poremećaji su preferentno poremećaji posredovani sa IL-18. Posebno, purifikovani IL-18BP se može koristiti za lečenje i/ili prevenciju psorijaze, psorijatičnog artritisa, Krononove bolesti, reumatoidnog artritisa, oštećenja jetre kap što je alkoholna ciroza jetre, sepse, ateroskleroze, ishemične bolesti srca, alergija, posebno preosetljivosti odloženog tipa, preosetljivosti i zatvorenih povreda glave.

Pošto smo u celosti opisali ovaj pronalazak, stručnjaci iz ove oblasti će shvatiti da se on može sprovesti u okviru širokog spektra ekvivalentnih parametara, koncentracija i stanja bez odstupanja od duha i domena ovog pronalaska i bez nepotrebnog eksperimentisanja. Iako je ovaj pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifičnim konceptima, treba razumeti da se on može dalje modifikovati. Ova primena ima za cilj da pokrije sve varijacije, upotrebe ili adaptacije ovog pronalaska uz generalno poštovanje principa ovog pronalaska i uključujući takva odstupanja od ovog testa koja predstavljaju poznatu i uobičajenu praksu u okviru stručne oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada i koja se može primeniti na esencijalne karakteristike koje su ranije ovde definisane sve dok se poštuju dopunjeni zahtevi.

Sve reference koje su ovde citirane, uključujući i članke iz časopisa i apstrakte, objavljene ili neobjavljene američke ili strane patentne zahteve, izdate američke ili strane patente ili bilo koje druge reference su sastavni deo ovog dokumenta, uključujući i sve podatke, tabele, slike i tekst koji je dat u citiranoj literaturi. Osim toga, celokupan sadržaj literature koja je citirana je sastavni deo ovog dokumenta.

Pozivanje na korake iz poznatih metoda, poznate metode ili konvencionalne metode ni na koji način ne predstavljaju dozvolu da se bilo koji aspekt, opis ili koncept iz ovog pronalaska otkrije, podučava ili da se na njega ukazuje u relevantnoj stručnoj oblasti. Prethodni opis specifičnih koncepta će u tolikoj meri otkriti opštu prirodu ovog pronalaska da će drugi moći, primenjujući znanje iz ove oblasti (uključujući i sadržaj i literature koja je ovde citirana) lako da ga modifikuju i/ili prilagode za različite primene takve specifične koncepte, bez nepotrebnog eksperimentisanja i bez odstupanja od opšteg koncepta ovog pronalaska. To znači da takva prilagođavanja i modifikacije treba da budu u okviru značenja i opsega ekvivalenata koji su ovde navedeni, zasnovani na doktrini i smemicama koje su ovde navedene. Treba razumeti da su fraze i termine korišćeni u ovoj specifikaciji radi opisa i ne predstavljaju ograničenje a te termine i fraze koji su dati u ovoj specifikaciji treba da tumači stručnjak u svetlu doktrine i smemica koje su ovde date u kombinaciji sa uobičajenim znanjem koje ima stručnjak iz ove oblasti.

PRIMER 1: PURIFIKACIJA REKOMBINANTNOG, HUMANOG IL-18BP IZ SUPERNATANTA CHO ĆELIJA BEZ SERUMA

1. Korak zahvatania

IL-18BP prisutan u 300 1 of supematanta ćelijske kulture bez seruma iz IL-18BP koji eksprimira CHO ćelije zahvaćan je na Q Sefaroza FF smolu. Zahvaćeni materijal je podešen na pH 8.5 + 0.1, a provodljivost na 50±5 mS/cm dodavanjem nekoliko kapi of 35% ortofosforne kiseline (H3PO4) i čvrstog NaCI u količini koja odgovara oko 0.35M.

2. Proces purifikacije

Proces purifikacije, počevši od zahvaćenog materijala prema gornjem stavu (1), je detaljno dole opisan. Dijagram toka procesa purifikacije je prikazan na Sl. 1.

Generalno, vrednosti pH i provodjivosti se odnose na vrednosti pri temperaturi od +25°C.

Kolone su kontinuirano praćene uz pomoć UV monitora, uz merenje apsorbance na 280 nm.

2.1. Korak a: IMAC na helacionoj sefarozi sa brzim protokom Oprema

• Hromatografska kolona: XK1.6 x 20cm (Amersham Biosciences);

• UV monitor (dužina optičke putanje 2.5 mm) opremljena sa dvokanalnim rekorderom (Amersham Biosciences ili ekvivalentno);

• Peristaltička pumpa (Minipuls Gilson ili ekvivalentno);

• UV Spektrofotometar (Shimadzu ili ekvivalentno);

• pH metar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Konduktometar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Vaga (MettlerToledo ili ekvivalentno).

Materijal

• Helaciona sefaroza - smola sa brzim protokom (Amersham Biosciences);

• Granule natrijum hidroksida- (Merck);

• Bakar sulfat (Merck);

• Glacijalna sirćetna kiselina (Merck);

• Etilenediaminetetrsirćetna kiselina - EDTA- (Fluka);

• Natrijum hlorid - NaCI - Merck;

• Prečišćena voda (Modulab ili ekvivalentno);

• Dinatrijum vodonik fosfat dihidrat - Merck;

• Amonijum acetat- Merck;

• 25% rastvor amonijaka - Merck;

• 85%-ortofosfoma kiselina - Merck;

• 50% Rastvor natrijum hidroksida- Baker.

P uf eri i rash’ori

• Rastvor metala za naelektrisanje: 0.2 M Bakar sulfat

• Acidifikovana voda

• Pufer za ekvilibraciju: 50 mM natrijum fosfata pH 8.5 ± 0.1,0.5 M NaCI.

• Pufer za eluciju: 0.075 M Amonijum acetata pH 9.0 ±0.1

• Rastvor za regeneraciju : 20 mM natrijum fosfata pH 5.8 ± 0.3, 0.5 M NaCI, 50 mM EDTA

• Rastvor za sanitaciju: 0.5 M NaOH

Kolona je punjena helacionom sefarozom - smolom sa brzim protokom u skladu sa uputstvima proizvođača. Radi sanitacije, kolona je isprana sa najmanje 3 BV NaOH 0.5 M, koji je inkubiran tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a potom je kolona isprana sa 3 BV prečišćene vode.

220-300 mg of koncentrisanog r-hIL-18BP dobijenog iz koraka zahvatanja koji je gore naveden pod (1) je otopljeno a pH je prilagođena na 8.5 ± 0.1 a provodljivost na 50±5 mS/cm dodavanjem nekoliko kapi 35% ortofosfome kiseline (H3PO4) i čvrstog NaCI u količini koja odgovara otprilike 0.35M.

Hromatografska kolona je prvo isprana sa 5-6 BV (zapremine sloja) acidifikovane voda dok pH nije bila <4.5. Potom, kolona je isprana sa 3 BV 0.2 M bakar sulfata i 4 BV acidifikovane vode dok absorbanca nije dostigla bazalni nivo.

Potom, kolona je ekvilibrisana ispiranjem sa 6 ili više BV pufera za ekvilibraciju, 50 mM natrijum fosfata pH 8.5 ± 0.1,0.5 M NaCl, provodljivost 50+5 mS/cm kroz kolonu. pH i provodljivost su proverene i ispiranje je nastavljeno ukoliko su parametri efluenta kolone bili izvan ciljnih vrednosti, tj.pH 8.5±0.1, provodljivost 50±5 mS/cm.

Početni materijal, tj. r-hIL-18BP posle zahvatanja pripremljen kako je gore navedeno, je potom unet na kolonu. Po završetku unošenja uzorka, kolona je isprana sa 5-10 BV pufera za ekvilibraciju. Ove frakcije su odbačene, obzirom da su sadržale samo onečišćenja ćelijske kulture.

Elucija je započeta sa 0.075 M amonijum acetata pH 9.0 +0.1, provodljivost 7.6+0.5 mS/cm. r-hIL-18BP je započeo eluciju u vidu glavnog pika posle otprilike 0.5 BV od početka.

3-5 BV glavnog pika je prikupljeno, glavni pik je počeo kada se on-line OD naglo povećala. Ova frakcija je sadržala polu-prečišćen r-hIL-18BP.

Po završetku elucije, kolona je isprana sa 3-5 BV pufera za regeneraciju koji je sadržao EDTA. Uzorkovane frakcije sadržale su bakar istisnut iz smole, kao i onečišćenja ćelijske kulture.

Radi sanitacije, kolona je isprana sa najmanje 3 BV NaOH 0.5 M, koji je inkubiran tokom 1 sata, a potom je kolona isprana sa 3 BV prečišćene vode. Kolona je potom isprana sa najmanje 3 BV rastvora za čuvanje, 10 mM NaOH i čuvana je na sobnoj temperaturi do narednog ciklusa.

22. Korak (b): HIC/IEC na MEP Hvpercel

Ovaj korak se sprovodi na MEP smoli, smoli za hidrofobnu hromatografiju sa indukcijom naelektrisanja, koja predstavlja mešavinu između hidrofobne interakcione hromatografije (HIC) i hromatografije sa izmenom jona (IEC).

Oprema

• Hromatografska kolona: XK1.6 x 20cm (Amersham Biosciences);

• UV monitor (dužina optičke putanje 2.5 mm) opremljena sa dvokanalnim rekorderom (Amersham Biosciences ili ekvivalentno);

• Peristaltička pumpa (Minipuls Gilson ili ekvivalentno);

• UV Spektrofotometar (Shimadzu ili ekvivalentno);

• pH metar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Konduktometar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Vaga (MettlerToledo ili ekvivalentno).

Materijal

• Post 1MAC r-hIL-18BP;

• MEP HyperCel® smola (BioSepra — Cypergen Biosystems);

• Granule natrij um hidroksida (Merck);

• Kalijum hlorid (Merck);

• Etilenediaminetetrsirćetna kiselina - EDTA- (Fluka);

• Natrijum hlorid - NaCI - Merck;

• Prečišćena voda (Modulab ili ekvivalentno);

• Dinatrijum vodonik fosfat heptahidrat - Merck;

• Dinatrijum vodonik fosfat monobazni dihidrat - Merck;

• Kalijum fosfat - Merck;

• 1 -2 propandiol (Propilenglikol) - Merck;

• 85%-Ortofosfoma kiselina - Merck;

• 50% rastvor natrijum hidroksida - Baker.

Puferi i rastvori

• Pufer za ekvilibraciju: Fiziološki rastvor puferovan fosfatima (PBS) IX pH 6.1 ±0.1, 1 NaCI, provodljivost 95 ± 5 mS/cm

• Pufer za ispiranje: PBS IX pH 6.1 ±0.1, provodljivost 16 ±2 mS/cm

• Pufer za eluciju: 20 mM fosfatnog pufera pH 8.4 ± 0.1, 35% propilen glikola provodljivost 1.1+ 0.3 mS/cm

• Rastvor za regeneraciju 1: prečišćena voda

• Rastvor za regeneraciju 2:100 mMEDTA

• Rastvor za sanitaciju: IM NaOH

Kolona je punjena MEP HyperCel® smolom u skladu sa uputstvima proizvođača.

Post IMAC IL-18BP, dobijen iz koraka (a), je dopunjen sa IM NaCI uz mešanje do provodjivosti od 95 ± 5 mS/cm.

Za sanitaciju kolone, kolona je isprana sa najmanje 1 BV of NaOH 0.5 M, potom isprana sa 3-5 BV prečišćene vode.

Radi ekvilibracije kolone, kolona je isprana sa 6 ili više BV pufera za ekvilibraciju, PBS IX pH 6.1 +0.1,1 NaCI, provodljivost 95 ± 5 mS/cm. pH and provodljivost su proverene, a ispiranje nastavljeno ukoliko su parametri efluenta kolone bili izvan ciljnih vrednosti, tj.pH 6.1 ±0.1,1 NaCI, provodljivost 95 ± 5 mS/cm.

Potom, materijal je unet sa materijalom dobijenim iz koraka (a).

Posle unošenja, kolona je isprana sa 6 BV pufera za ekvilibraciju PBS IX pH 6.1 ±0.1,1 NaCI, provodljivost 95 + 5 mS/cm. Ova frakcija je odbačena, obzirom da je sadržala samo onečišćenja ćelijske kulture. U slučaju preopterećenja kolone, ova frakcija može da sadrži nešto r-hIL-18BP.

Potom, kolona je isprana sa 10 BV pufera za ispiranje PBS IX pH 6.1 ± 0.1, provodljivost 16 + 2 mS/cm. Ova frakcija je takođe odbačena, pošto je sadržala samo onečišćenja ćelijske kulture. Ova frakcija može da sadrži nešto r-hIL-18BP ukoliko je kolona preopterećena.

Potom,je započeta elucija sa puferom za eluciju 20 mM fosfatnog pufera pH 8.4 ± 0.1, 35% propilen glikola provodljivost 0.8 ± 0.1 mS/cm. r-hIL-18BP je počeo da eluira u vidu glavnog pika posle otprilike 0.5 BV od početka. 8-10 BV glavnog pika je prikupljeno, počevši od naglog povećanja apsorbance, približno posle prvih 0.5 BV

(odbačenih), prema hromatografskom profilu. Ovaj eluat je sadržao polu-prečišćen r-hli_-18BP.

Radi regeneracije, kolona je isprana sa najmanje 6 BV rastvora za regeneraciju 1, a zatim sa 10 BV rastvora za regeneraciju 2. Kolona je ostavljena u rastvoru za regeneraciju preko noći kao bi se dodatno popravio efekat regeneracije. Kolona je potom isprana sa najmanje 6 BV prečišćene vode. Ova onečišćenja ćelijske kulture koja su sadržala frakcije su odbačena.

Radi sanitacije, kolona je isprana sa najmanje 6 BV of IM NaOH, protok je zaustavljen na 1 sat, a kolona potom isprana sa najmanje 6 BV prečišćene vode.

Radi čuvanja, kolona je isprana sa najmanje 3 BV rastvora za čuvanje, 0.1 M NaOH, i čuvana na sobnoj temperaturi do narednog ciklusa.

2.3. Intermediiami korak: ULTRAFILTRACIJA Oprema

• Uređaj za ultrafiltraciju Vivaflow 200, opseg 5000D (RC, PES ili HydroSart) -Sartorius ili ekvivalentno;

• Peristaltička pumpa tip Masterflex ili ekvivalentno;

• UV spektrofotometar (Shimadzu ili ekvivalentno);

• pH metar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Konduktometar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Vaga (Mettler Toledo ili ekvivalentno).

Materijal

• Post MEP r-hIL-18BP među-proizvod;

• Granule natrijum hidroksida- Merck;

• Prečišćena voda (Modulab ili ekvivalentno).

Rash’ori za dijafiltraciju

• Prečišćena voda koju proizvode Modulab ili Milli Q systems.

• Rastvor za sanitaciju: 0.5 M NaOH .

Postupak

Korak ultrafiltracije je obavljen na sobnoj temperaturi (+20±5°C).

Radi sanitacije ultrafiltera, oko 500 mL 0.5 M NaOH je filtrirano najmanje 30 minuta, a potom je ultrafilter ispiran prečišćenom vodom sve dok pH permeata nije pala ispod 7.5.

Post MEP frakcija je razblažena 1:2 sa prečišćenom vodom, i filtrirana u ultrafilteru. Rastvor je koncentrisan na oko 1-2/10 početne zapremina a frakcija retentate je dijalizirana preko prečišćene vode sve dok provodljivost retentate nije bila <100uS/cm. Provodljivost retentate je prilagođena posle razblaženja vodom na oko 150-200 mL. Frakcija retentate je prikupljena a ultrafilter ispran prečišćenom vodom. Frakcije ispirka su prikupljene i objedinjene sa frakcijom retentata (finalna zapremina 200-250 mL). Sanitacija ultrafiltera je izvršena sa 500 mL of 0.5 M NaOH, tokom najmanje 30 minuta i to posle ispiranja ultrafiltera sa prečišćenom vodom sve dok pH permeata nije bila ispod 7.5. Ultrafilter je čuvan u 0.05M NaOH na +4°C ± 3°C do narednog ciklusa.

2.4. Korak (c): EC na CM sefarozi sa brzim protokom Oprema

• Hromatografske kolona: AC 10/20 cm (Amersham Bibsciences);

• UV monitor (dužina optičke putanje 2.5 mm) opremljen sa dvokanalnim rekorderom (Amersham Biosciences ili ekvivalentno);

• Peristaltička pumpa (Minipulse Gilson ili ekvivalentno);

• UV Spektrofotometar (Shimadzu ili ekvivalentno);

• pH metar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Konduktometar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Vaga (Mettler Toledo ili ekvivalentno).

Materijal

• Ultrafiltrirani r-hIL-18BP među-proizvod post MEP;

• Smola CM sefaroza FF (Amersham Biosciences);

• Granule natrijum hidroksida- Merck;

• MES (2- [N-Morpfolino) etanesulfonska kiselina) (Sigma ili ekvivalentno);

• Prečišćena voda (Modulab ili ekvivalentno);

• Natrijum hlorid - Merck.

Puferi i rastvori

• Preekvilibracioni pufer: 20 mM MES pH 5.0+0.5 provodljivost 150±50 u.si/cm

• Ekvilibracija: 1 mM: 1.5MNaCI

• Rastvor za sanitaciju: 0.5 M NaOH

• Rastvora za čuvanje: 0.01 M NaOH

Kolona je punjena sa smolom CM sefaroza brzog protoka smola u skladu sa uputstvima proizvođača.

U1 trafiltrirani r-hIL-18BP post MEP (videti korak (b)) je doveden na pH 6.0 ± 0.2 sa nekoliko kapi 20 mM MES pH 5+0.5 i provodljivost 100 ± 15 uS/cm neposredno pre stavljanja u kolonu.

Radi sanitacije kolone, kolona je isprana sa 1 BV of NaOH 0.5 M i isprana sa 15-20 BV prečišćene vode.

Potom, kolona je preekvilibrirana ispiranjem kroz kolonu sa 15-20 BV of 20 mM MES pH 5+0.5, provodljivost 150+50 uS/cm. pH i provodljivost su proverene i ispiranje je nastavljeno ukoliko su parametri efluenta kolone bile izvan ciljnih vrednosti, tj.pH 5.0+0.5, provodljivost 150+50 uS/cm.

Potom, kolona je ekvilibrisana ispiranjem kroz kolonu sa 5 ili više BV pufera za ekvilibraciju, 1 mM MES pH 6.0+0.2, provodljivost 45+15 uS/cm. pH i provodljivost su proverene, a ispiranje nastavljeno ukoliko su parametri efluenta kolone bili izvan ciljnih vrednosti, pH 6.0+0.2, provodljivost 45+15 uS/cm.

Posle ekvilibracije, r-hIL-18BP, pripremljen kako je gore navedeno, je unet. Protok je prikupljen čim je apsorbanca počela da raste, obzirom da ova frakcija sadrži polu-prečišćeni r-hIL-18BP.

Kada je unošenje uzorka završeno, kolona je isprana sa 3-4 BV pufera za ekvilibraciju, 1 mM MBS pH 6 ± 0.2, provodljivost 45 ± 15 uS/cm, a protok je kontinuirano prikupljan sve dok apsorbanca nije dostigla bazalni nivo.

Posle prikupljanja, rastvor je odmah doveden do pH 9.1 ±0.1 dodavanjem 50 mM čvrstog natrijum tetraborat. Prikupljene frakcije sadrže polu-prečišćen r-hIL-18BP.

Radi regeneracije kolone, kolona je isprana sa najmanje 4 BV pufera za regeneraciju 1.5 M NaCI. Uzorci su uzeti a ova frakcija je odbačena. Ova frakcija sadrži onečišćenja ćelijske kulture i bazičnije izoforme r-h IL-18BP.

Radi sanitacije, kolona je isprana sa najmanje 3 BV of NaOEl 0.5 M, protok je zaustavljen na 1 sat, a potom je kolona isprana sa 3 BV prečišćene vode.

Radi čuvanja, kolona je isprana sa najmanje 3 BV rastvora za čuvanje, a potom čuvana do narednog ciklusa.

2.5. Korak (d): Hidrofobna interakcija na fenil sefarozi FF HS Oprema

• Hromatografske kolona: XK16/20 (Amersham Biosciences);

• UV monitor (dužina optičke putanje 2.5 mm) opremljen sa dvokanalnim rekorderom (Amersham Biosciences ili ekvivalentno);

• Peristaltička pumpa (Minipulse 2 Gillson ili ekvivalentno);

• UV Spektrofotometar (Shimadzu ili ekvivalentno);

• pH metar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Konduktometar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Vaga (Mettler Toledo ili ekvivalentno).

Materijal

• r-hlL-18BP post CM među-proizvod;

• Smola fenil sefaroza FF FIS (Amersham Biosciences);

• Dinatrijum tetraborat dekahidrat - Merck;

• Amonijum sulfat (Merck);

• Prečišćena voda koju proizvodi Modulab ili ekvivalentno;

• Granule natrijum hidroksida- Merck;

• 50% rastvor NaOH - J.T. Baker.

Puferi i rastvori

• Pufer za ekvilibraciju: 50 mM natrijum borata 9.1 + 0.2, 0.9M amonijum sulfata provodljivost 122 ± 6 mS

• Pufer za eluciju: 50 mM natrijum borata 9.1 ± 0.2, 0.15M amonijum sulfata provodljivost 30 ± 2mS/cm

• Pufer za regeneraciju: Prečišćena voda

• Rastvor za sanitaciju: 0.5 M NaOH

• Kolona je punjena smolom fenil sefarozom FF HS u skladu sa uputstvima proizvođača.

Za pripremu početnog materijala, čvrst amonijum sulfat je dodat do koncentracije od 0.9M u post CM IL-18BP (rezultat koraka (c)). Po završetku rastvaranja soli, materijal je doveden na pH to 9.1 ± 0.2 dodavanjem 50% NaOH u rastvor.

Radi sanitacije kolone, kolona je isprana sa najmanje 1 BV of NaOH 0.5 M a kolona je isprana sa 6 BV prečišćene vode.

Kolona je ekvilibrisana ispiranjem kroz kolonu 5-7 ili sa više BV pufera za ekvilibraciju 50 mM natrijum borata pH 9.1 ± 0.2, 0.9 M amonijum sulfata provodljivost 122 ± 6 mS. pH i provodljivost su proverene, a ispiranje nastavljeno ukoliko su parametri efluenta kolone bile izvan ciljnih vrednosti, tj.pH 9.1 ± 0.2, provodljivost 122 ±6 mS.

Početni materijal, tj.r-hIL-18BP post CM, je potom unet na kolonu. Kada je unošenje uzorka završeno, kolona je isprana sa 7-9 BV pufera za ekvilibraciju. Ova frakcija sadrži osatke onečišćenja ćelijske kulture.

Elucija je započeta sa puferom za eluciju - 50 mM natrijum borata pH 9;1 ± 0.2, 0.15M amonijum sulfata provodljivost 30 ± 2mS/cm. r-hIL-18BP je počeo da eluira u vidu glavnog pika posle otprilike 0.5-0.8 BV od početka. 6-8 BV glavnog pika je prikupljeno, počevši od povećanja apsorbance. Ova eluciona frakcija je sadržala polu-prečišćeni r-hlL-18BP.

Po završetku elucije. kolona je regenerisana ispiranjem kolone sa najmanje 3 BV prečišćene vode. Ova frakcija je odbačena, obzirom da sadrži onečišćenja ćelijske kulture i agregatne oblike IL-18BP.

Radi sanitacije, kolona je isprana sa najmanje 3 BV of 0.5 M NaOH, protok je zaustavljen na 1 sat, a potom je kolona isprana sa 6 BV prečišćene vode.

Radi čuvanja, kolona je isprana sa najmanje 3 BV rastvora za čuvanje, 10 mM NaOH, i kolona je čuvana na sobnoj temperaturi do narednog ciklusa.

2.6. Korak 5 (e): Obrnuta faza na izvoru 30 RPC Oprema

• Hromatografska kolona: AC10//20 (Amersham Biosciences);

• UV monitor (dužina optičke putanje 2.5 mm) opremljen sa dvokanalnim rekorderom (Amersham Biosciences ili ekvivalentno);

• Peristaltička pumpa (Minipulse 2 Gilson ili ekvivalentno);

• UV Spektrofotometar (Shimadzu ili ekvivalentno);

FPLC sistem ili ekvivalentno radi primene linearnog gradijenta (Amersham Biosciences);

• pH metar (Metrohm ili ekvivalentno);

• Konduktometar (Metrohm ili ekvivalentno).

Materijal

• IL-18BP post HIC

• Izvor 30 RPC smola (Amersham Biosciences);

• Natrijum hlorid - Merck;

• Dinatrijum tetraborat dekahidrat- Merck;

• 50% rastvor NaOH - Baker;

• Prečišćena voda (Modulab ili ekvivalentno);

• Acetonitril -Merck;

• Trifluorosirćetna kiselina -J.T.Baker;

• Univerzalni indikator pH 0-14 -Merck.

Puferi i rastvori:

• Rastvor A: 0,1 % TFA u vodi

• Rastvor B: 0,1 % TFA u ACN

• Pufer za ekvilibraciju: 50 mM natrijum borata pH 9.1 ±0.2, provodljivost 5 ± 2 mS/cm

• Rastvor za sanitaciju: 0.5 M NaOH

Kolona je punjena sa izvorom 30 RPC smole u skladu sa uputstvima proizvođača.

Za sanitaciju kolone, kolona je isprana povratnim protokom sa najmanje 3 BV NaOH 0.5 M i potom isprana sa 4-5 BV prečišćene vode.

Potom, kolona je ekvilibrisana ispiranjem kroz kolonu (protok unapred) sa 5-6 ili više BV pufera za ekvilibraciju 50 mM natrijum borata pH 9.1 ±0.2, provodljivost 5 + 2 mS/cm. pH and provodljivost su proverene, a ispiranje nastavljeno ukoliko su parametri efluenta kolone bile izvan ciljnih vrednosti, tj. pH 9.1 ± 0.2 a provodljivost 5 ± 2mS/cm. r-hIL-18BP post HIC (rezultat koraka (d)) na pH 9,1 ± 0,2 provodljivost 30+2 mS/cm bio je početni materijal ovog koraka. On je unet u kolonu a kada je unošenje uzorka završeno, kolona je isprana sa 2-3 BV pufera za ekvilibraciju. Ova frakcija je odbačena.

Potom, kolona je ispirana rastvorom A sve dok pH efluenta kolone nije bio ispod 4. Ova frakcija jed objedinjena sa privim delom gradijenta elucije (pre 28% ACN). Ova frakcija sadrži neke ostatke onečišćenja ćelijske kulture pa je stoga odbačena.

Elucija je sprovedena u gradijentnom modu uz korišćenje kombinacije rastvora za eluciju A i rastvora za eluciju B kako je dole detaljno prikazano:

Tabela IV:

r-hIL-18BP je počeo da eluira sa oko 28-32% rastvora B (videti gore podebljanim slovima) i potpuno je elurirao u roku od 60 minuta (35% B). Eluat je odmah doveden na pH 8,0 + 0,5 đilucijom u odnosu 1:2 sa 50 M natrijum borata pH 9.1+0.2 i provodljivošću 5 + 2mS/cm.

Ova frakcija sadrži prečišćeni r-hIL-18BP.

Regeneracija kolone je izvršena na kraju elucionog gradijenta. Regeneraciona frakcija je prikupljena prema profilu apsorbance. Ova frakcija sadrži ostatke onečišćenja ćelijske kulture i agregatne oblike IL-18BP.

Radi samtacije, kolona je isprana sa 2-3 BV vode, isprana sa najmanje 3-4 BV NaOH a flotom protok je zaustavljen na 1 sat. Potom , kolona je isprana sa 3-4 BV prečišćene vode.

Kolona je isprana sa najmanje 3 BV rastvora za čuvanje, i čuvana do narednog ciklusa.

3. Kratak prikaz klirensa proteina ćelija domaćina iz preparata IL-18BP Količina proteina ćelija domaćina je izmerena uz pomoć ELISA upotrebom poliklonog anliseruma koji je dobijen kod zečeva u odnosu na kontaminante izvedene iz CHO koje su bile prisutne u podlozi za ćelijsku kulturi bez seruma. Količina proteina ćelija domaćina je izražena u vidu ppm (delova na milion) kontaminirajućih proteina u odnosu na purilikovani IL-18BP. Količina IL-18BP je izmerena određivanjem optičke gustine (OD) na 280 nm (koeficijent molame ekstinkcije e= 1.26) u purifikovanom preparatu IL-18BP, tj. posle završnog koraka purifikacije uz pomoć hromalografije obrnute faze.

Ova analiza je sprovedena u okviru tri nezavisna eksperimenta.

Tabela V: Klirens proteina ćelija domaćina

PRIMER 2: MODIFIKOVANI PROTOKOL ZA PURIFIKACIJU

REKOMBINANTNOG HUMANOG IL-18BP IZ SUPERNATANTA CHO ĆELIJA KOJI NE SADRŽI SERUM

Primer 1 je sprovedena kako je gore navedeno uz sledeće modifikacije:

The korak zahvatanja je sproveden na Fractogel® TMAE HiCap®, kupljenom od Mercka.

U koraku (a), korak IMAC purifikacije na koloni brzog protka sa helacionom sefarozom dodat je još jedan korak ispiranja uz korišćenje 15 mM amonijum hlorida u puferu za uravnoteži vanje.

Osim toga u koraku (a) elucija je izvršena upotrebom 0.06 M amonijum acetata na pH

8.7.

U koraku (d), elucija je započeta sa puferom za eluciju u vidu 50 mM natrijum borata pH 9.1 ± 0.2 i 0.10 M amonijum sulfata.

Metod:: Određivanje IL-18BP specifične aktivnosti

Određivanje biološke snahe uz pomoć KG-1 ćelija u in vitro bioeseju.

Biološka karakterizacija referentnog materijala r-hIL-18BP je bila zasnovana na proceni njegove sposobnosti da specifično vezuje r-hIL-18, neutrališući njegovu biološku aktivnosti na ćelijskoj lozi akutne humane mijelogene leukemije KG-1. Ova ćelijska loza može da proizvodi IFN-y kao odgovora na humani IL-18 plus humani TNF-a na dozno zavisni način a tako r-hIL-18BP suprimira produkciju IFN-y.

Ukratko, KG-1 ćelije su u količini od lxl0s ćelija/udubljenju dodatne na pločicu sa 96 udubljenja koja je već sadržala različite koncentracije r-hIL-18BP u prisustvu fiksno određene koncentracije r-hIL18 (40 ng/ml u udubljenju) plus fiksna koncentracija r-hTNF-a (10 ng/ml u udubljenju ). Koncentracija svake od ove dve supstance koje su međusobno kombinovana mogla je da dovede do sub-maksimalne indukcije proizvodnje IFN-y Na KG-1 ćelijama. Posle 24 h na 37°C, 5% CO2, pločica je stavljena na -20°C kako bi se tretirane ćelije podvrgle ciklusu smrzavanja i rastapanja pre obavljanja imunoeseja kako bi se odredila količina IFN-y prisutna u ćelijskom supematantu. Ovi ćelijski supematanti su prikupljeni a humani IFN-7 je meren uz pomoć specifičnog imunoeseja (ELISA h-IFN-y, Duo Set R&D Systems kit). Količina FN-y koju su proizvele tretirane ćelije izračunata je interpolacijom y vrednosti (O.D.) na standardnoj krivoj IFN-y, koja je data uz kit, i koja je opremljena sa sigmoidnim dozno-reaktivnim (4PL) Log/Log transformatorom, što je omogućilo dobijanje x vrednosti (koncentracije IFN-y) (Graph Pad Prism). Razblaženje rastvora referentnog materijala r-hIL-18BP

(ST 1 PO 1 /r-hIL-18 BP) koji može da inhibira za 50% (EC50) količinu proizvodnje IFN-y indukovanu fiksnom koncentracijom r-hIL-18 + a fiksna koncentracija r-hTNF + a je određena kao 1 jedinica (U).

Obavljeno je deset nezavisnih eseja a svake od 10 krivih koje su pokazivale odgovor na dozu je grafički prikazana tako što je na y osi dat % proizvodnje IFN-y dok su na x-osi data razblaženja STlP01/r-hIL-18BP. Dozno responzivna kriva r-hIL-18BP dobijena u svakom eksperimentu je prvo normalizovana tako što je pretpostavljeno daje jednaka 0% odnosno 100% najviše vrednosti INF-y.

Najviša vrednosti lFN-y je data preko kombinovanih koncentracija r-hIL-18 plus r-hTNF-a u odsustvu r-hIL-18BP, dok je najniža data najviših ispitivanih koncetracija r-hIL-18BP. Sigmoidni dozni odgovor sa promenljivm algoritmom nagiba (4PL) je potom korišćen za interpolaciju normalizovane vrednosti i EC50 određene za svaki od eksperimenata.

Titar referentnog materijala je izračunat u svakom eseju na sledeći način:

Titar (U/ml)=Recipročan u odnosu na diluciju pri 50% odgovoru x predilucija Finalni titar STlP01/r-hIL-18BP je izračunat izračunavanjem prošeka 10 pojedinačnih titara u svakom eksperimentu.

SI. 2 prikazuje krive doznog odgovora STlP01/r-hIL-18BP uz pomoć KG-1 in vitro bioeseja koje su dobijene u 10 nezavisnih eksperimenata.

Ove krive su normalizovane tako što je obezbeđena najniža vrednost INF-y koja je bila jednaka 0% odnosno najviša vrednost INF-y koja je bila jednaka 100%. Najviša vrednosti IFN-y je data kombinovanom koncentracijom r-IL-18 plus r-hTNF-a u odsustvu r-hIL-18BP, dok je najniža data preko najviših ispitivanih koncentracija r-hlL-18BP. Sigmoidni dozni odgovor sa varijabilnim algoritmom nagiba (4PL) je potom primenjen za interpolaciju normalizovane vrednosti a EC50 je određena za svaki eksperiment uz pomoć GraphPad Prism.

Individualni titri za STlP01/r-hIL-18BP dobijeni u svakom pojedinačnom eksperimentu zajedno sa standardnom devijacijom, koeficijentom varijacije (%) i 95% granicama pouzdanosti dati su dole.

Tabela VI: Procena jačine STlP01/r-hIL-l 8BP dobijena u deset nezavisnih eksperimenata

Ispostavilo se daje srednja procenjena jačina referentnog materijala STlP01/r-hIL-18BP jednaka 895869 U/ml sa %CV od 17.6.

In vitro bioesej KG-1 ćelija

Ovaj esej se sprovodi na pločicama sa 96 udubljenja.

CC = Kontrolne ćelije (dodat je samo medijum za kulturu) TNF = r-hTNF-α salO ng/mi u udubljenju IL-18 = r-hIL-18 sa 40 ng/ml u udubljenju

0= r-hIL-18 + r-hTNF-sa 40+10 ng/ml u udubljenju

Redovi B and C -r-hIL-18BP kriva doznog odgovora pri koraku dilucije 1:1.5 SI, S2 i S3 = Uzorci pri 2 različite koncentracije koji padaju u linearni deo krive doznog odgovora (2 replikata/uzorak) npr. S11 = uzorak 1 pri koncentraciji 1; Sl2= uzorak 1 pri koncentraciji 2).

Prikazani položaji uzorka na pločici predstavljaju primer

• Dodati 50 µl podloge za kulturu (500 ml IMDM dopunjeno sa 20% FBS Zagrevati 30 min na 56 °, 5 ml inaktiviranog 2-merkaptoetanola 3 mM, 5ml 2mM 1-glutamine i 5 ml Pen/Strep; 10,000 U/ml /10,000 µg/ml) u udubljenja 2 do 12 u redovima B-C.

• Dodati 150 µg referentnog materijala r-hIL-18BP na 1500 ng/ml (300 ng/ml u otvor) u privi otvor u redovima B-C.

• Koristeći višekanalnu pipetu, izvršiti serijska razblaženja 1:1.5 prenošenjem 100 µl iz udubljenja na koloni 1 do udubljenja kolone 9 (redovi B-C), odbacujući višak 100 µl iz udubljenja u koloni 9.

• Dodati 50 µl uzorka r-hIL-18BP koji je pripremljen kao jedna od 2 koncentracije koje padaju u linerani deo krive doznog odgovora (npr. S11 na 600 ng/ml što odgovara 120 ng/ml u udubljenju) u udubljenja na kolonama 1-2 reda D (2 replikata).

N.B. navedeni položaji na pločici su dati kao primer.

• Ponoviti tačku 4 kod uzorka druge koncentracije (Sl“).

• Dodati 50 µl r-hIL-18 na 200 ng/ml (40 ng/ml u udubljenju) u sva udubljenja u redovima B-C osim onih u koloni 12 i udubljenja koja sadrže uzorka (npr. kolone 1-2 redovi D-E).

• Dodati 50 µl r-r-hTNF-a na 50 ng/ml (10 ng/ml u udubljenju) u sva tri udubljenja u redovima B-C osim onih u koloni 11 i u udubljenja koja sadrže uzorak (npr. kolone 1-2 redovi D-E).

• Dodati 50 µl podloge za kulturu to u udubljenja na kolonama 11 i 12 u redovima B-C

• Dodati 150 µl podloge za kulturu u sva udubljenja u redu A (udubljenja kontrolnih ćelija).

• Dodati 100 µl suspenzije KG-1 ćelija u količini od lxl06 ćelija/ml u sva udubljenja na pločici sa 96 udubljenja.

NB: Finalna zapremina u udubljenju je 250 μl; finalno razblaženje r-hIL-18BP je 1:5. Ćelijska suspenzija je pripremljena iz bočice T75 koja sadrži najmanje 20-24xl06 ćelija (15 ml podloge za kulturu).

• Inkubirajte pločicu 24 h na 37°C, 5% CO2

• Izvadite pločicu iz inkubatora u stavite je na -20°C kako bi se imunoesejom utvrdila količina IFN-y prisutnog u supematantu ćelija.

Ovaj supematant ćelija se prikuplja a humani IFN-y meri uz pomoć specifičnog imunoeseja (ELISA h-IFN-y, Duo Set R&D Systems kit).

NB: Prema dodatoj koncentraciji r-hIL-18BP izvršiti ukoliko je potrebno više od jedne dilucije uzorka ćelijskog supematanta kako bi ste bili sigurni da se izmerena O.D. može kvantifikovati na standardnoj krivoj IFN-y.

ELISA je obavljen prema opštem protokolu koji je dat uz kit sa manjim modifikacijama:

• Broj koraka ispiranja je povećan sa 3 na 4 i sa 4 na 5 kod poslednjeg.

• Blokirajte pripremljeni pufer dodavanjem 1 % BSA u PBS (bez saharoze se ne dodaje ni NaN3).

• Rastvarač reagens je pripremljen dodavanjem 0.1% BSA i 0.0% Tween-20 u PBS umesto Tris-puferovanog rastvora.

Količina IFN-y proizvedenog od strane tretiranih ćelija je izračunata na standardnoj krivoj IFN-y (koja je data uz kit) koja je Log/Log je transformisana i interpolirana uz pomoć sigmoidnog doznog odgovora sa različitim algoritmima nagiba (Graph Pad softver).

Izračunavanje specifične aktivnosti IL-I8BP Specifična aktivnost IL-18BPje izračunata prema sledećoj formuli:

Rezultati:

Naredne tabele pokazuju rezultate dobijene za nekoliko parametara tokom procesa purifikacije kako je opisano u ovom primeru.

Tabela VII: Klirens proteina ćelija domaćina:

Tabela VIII: Prinos i nivo HCP:

Tabela IX: Osnovni atributu purifikovanog rasutog IL-18BP (prosečno 3 serije)

REFERENCE

1. Altschul S Fet al, J Mol Biol, 215,403-410,1990

2. Altschul S Fet al, Nucleic Kiselinas Res., 25:389-3402,1997

3. Boschetti, E., Jungbauer, Sep. Sci. & Tech. 2 No. 15, Acad. Press (2000) 53

4. Boschetti et al., Genetic Engineering Vol. 20, No. 13, July, 2000

5. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12,387-395,1984.

6. Grantham et al., Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)

7. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:1190-1195.

8. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello,

C, and Rubinstein, M

(1999). Immunity 10,127-136.

9. Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98.

10. J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975)

11. J. Porath and B. Olin, Biochemistry 22,1621-1630 (1983)

12. Puren et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 2;96(5):2256-61.

13. Urushihara, J Pediatr Surg. 2000 Mar;35(3):446-9.

14. Vigers etal., Nature. 1997 Mar 13;386(6621): 190-4. 15.WO9909063

16. WO0107480

17. WO0162285 18.W00185201 19.W002060479 20.W002096456 21.W003080104 22. W002092008 23.W002101049 24.WO03013577

25. WO 92/13095

26. WO 01/03737

27. US 4,959,314

28. US 4,588,585

29. US 4,737,462

30. US 5,116,943 31 US 4,965,195

32. US 4,879,111

33. US 5,017,691

34. US 4,904,584

Claims (21)

1.    Upotreba hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja za produkciju purifikovanog IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP).

2.    Upotreba prema zahtevu 1, stoje naznačeno time da se hromatografija sa indukcijom hidrofobnog naelektrisanja sprovodi na 4-merkapto-etil-piridinskoj (MEP) smoli.

3.    Upotreba prema zahtevu 1 ili 2, što je naznačeno time da se hromatografija sa indukcijom hidrofobnog naelektrisanja koristi u kombinaciji koristi sa nekim korakom odabranim iz afinitetne hromatografije imobilisanih jona metala, hromatografije sa izmenom jona, hidrofobne interakcione hromatografije i hromatografije obrnute faze.

4.    Proces za produkciju purifikovanog IL-18BP koji obuhvata korak hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektrisanja.

5.    Proces prema zahtevu 4, što je naznačeno time da se hidrofobna hromatografija sprovodi na 4-merkapto-etil-piridin (MEP) smoli.

6.    Proces prema zahtevu 4 ili 5, koji dalje obuhvata korak odabran iz afinitetne hromatografije imobilisanih jona metala, hromatografije sa izmenom jona, hidrofobne interakcione hromatografije and hromatografije obrnute faze.

7.    Proces prema zahtevu 6, što je naznačeno time da se afinitetna hromatografija jona metala sprovodi na helacionoj smoli.

8.    Proces prema zahtevu 6, Stoje naznačeno time daje hromatografija sa izmenom jona hromatografija sa izmenom katjona.

9.    Proces prema zahtevu 8, što je naznačeno time da se hromatografija sa izmenom katjona sprovodi na karboksimetil (CM) smoli.

10. Proces prema zahtevu 6, što je naznačeno time da se hidrofobna interakciona hromatografija sprovodi na fenilnoj smoli.

11.    Proces prema zahtevu 6, što je naznačeno time daše korak hromatografije obrnute faze sprovodi na polimemoj matrici obrnute faze.

12.    Proces prema zahtevu 11, stoje naznačeno time daje polimema matrica obrnute faze izvor 30 RPC obrnute faze

13.    Proces prema bilo kom zahtevu od 4 - 12, koji obuhvata korake: (a)    Podvrgavanja tečnosti afinitetnoj hromatografiji jona metala; (b)    Podvrgavanja eluata afinitetne hromatogrtafije metalnih jona hidrofobnoj hromatografiji sa indukcijom naelektrisanja; (c)    Podvrgavanja eluata hidrofobne hromatografije sa indukcijom naelektri sanja hromatografiji sa izmenom katjona. (d)    Podvrgavanja protoka hromatografije sa izmenom katjona hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji; (e)    Podvrgavanja eluata hidrofobne interakcione hromatografije hromatografiji obrnute faze.

14.    Proces prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji dalje obuhvata jedan ili više koraka ultrafiltracije.

15.    Proces prema bilo kom od prethodnih zahteva koji dalje obuhvata jedan ili više koraka filtracije radi uklanjanja virusa.

16.    Proces prema bilo kom od prethodnih zahteva koji obuhvata inicijalni korak zahvatanja.

17.    Proces iz zahteva 16, što je naznačeno time da se korak zahvatanja sprovodi uz pomoć snažne hromatografije sa izmenom anjona.

18.    Proces prema zahtevu 17, što je naznačeno time da se korak zahvatanja sprovodi na kvatemamoj (Q) smoli amonijuma.

19. Proces iz zahteva 17, što je naznačeno time da se korak zahvatanja sprovodi na TMAE smoli.

20.    Upotreba prema bilo kom od zahteva od 1 do 3 ili proces prema bilo kom od zahteva od 4 do 19, stoje naznačeno time daje IL-18BP humani rekombinantni IL-18BP.

21.    Upotreba prema bilo kom od zahteva od 1 do 3 ili proces prema bilo kom od zahteva od 4 do 19, stoje naznačeno time daje tečnost supematant ćelijske kulture koji ne sadrži serum.