ME01122B - Jedinjenja i postupci za liječenje raka dojke - Google Patents

Abstract

Tema ovog izuma je relevantna za područje liječenja raka. Ovaj je izum posebno relevantan za liječenje i/ili prevenciju raka dojke kod pacijenata. Takođe su objelodanjenja jedinjenja za primjenu postupaka, uključujući selektivne modulatore receptora progesterona, koji funkcionišu kao agonisti progesterona u materici i kao antagonisti progesterona u tkivu dojke i pokazuju samo niski afinitet za glukokortikoide i receptore estrogena. Oblici ovog izuma takođe objelodanjuju postupke za sprječavanje razvitka raka dojke kod pacijenata koji su podvrgnuti hormonskoj zamjenskog terapiji iliestrogenskoj terapiji.

Description

U ovom zahtjevu traže se povlastice na osnovu Privremene prijave u SAD, koja je podnesena 28. aprila 2008. godine pod brojem 61/048, 472, a čiji tekst se nalazi u prilogu radi reference.

POLJE IZUMA

Ovaj izum se odnosi na jedinjenja i postupke za liječenje raka dojke. Tačnije, ovaj se izum odnosi na jedinjenja uključujući jedan ili više selektivnih modulatora receptora progesterona s niskom glukokortikoidnom aktivnošću za liječenje raka dojke.

OSNOVNE INFORMACIJE O IZUMU Kod oko 200. 000 Amerikanki, 2007. godine postavljena je dijagnoza raka dojke. Noviji podaci ukazuju na to da progesteron igra ulogu u razvitku te bolesti. Nekoliko je studija pružilo dokaze da progesteron ima oprečne funkcije u materici i dojkama: funkcije progesterona kao agensa diferencijacije koji potiskuje aktivnosti proliferacije estrogena u materici i kao mitogenskog agensa u dojci. Konkretno, pokazalo se da progestini povećavaju pojavu spontanih mamamih tumora kod pasa i miševa. Osim toga, ispitivanja nokaut miševa s receptorom progesterona pokazuju da hemijski karcinogeni koji su usmjereni na mliječne žlijezde zavise od receptora progesterona. Uz to, opiti s kulturom tkiva pokazuju da uticaji progestina mogu biti ograničeni na jednu rundu proliferacije praćene zaustavljanjem. Utvrđeno je da progestini mogu ushodno regulisati receptore za EGF, c-erbB2 i c-erbB3 ili pojačati njihovu aktivnost "down-stream" od mesta vezivanja faktora rasta. To povećava mogućnost da progestini "pripreme" tkiva za proliferaciju i mogli bi omogućiti prebacivanje iz stanja hormonske zavisnosti u stanje zavisnosti od faktora rasta

Na ulogu progesterona u razvitku raka dojke ukazuju i obimne nedavne studije koje su obavile Organizacija za inicijativu zdravlja žena (Women’s Health Initiative)(WHI) i Ispitivanje milion žena (The Million Women Study), koje idu u prilog zaključku da postoji povećan rizik od raka dojke za žene koje primaju zamjensku hormonsku terapiju (HRT) sastavljenu od konjugovanih ekvin estrogena (CEE) i progestin medroksi-progesteron acetata (MPA) preko placeba. U ispitivanju milion žena (The Million Women Study), svaka upotreba estrogena s jednim ili više antagonista progesterona (MPA, noretisteron, norgestrel / levonorgestrel), povećavala je rizik u odnosu na upotrebu samog estrogena, a taj se rizik povećavao dužinom upotrebe. U prilog tim statističkim podacima idu i histološki podaci na osnovu kojih žene koje koriste acetat progestina medroksi-progesterona (MPA) kao deo HRT pokazuju veći stepen proliferacije terminalne duktalno-lobulame jedinice. Osim kliničkih podataka, podaci iz opita gdje su majmuni makak na hirurški način dovedeni do menopauze, pokazuju daje režim kombinovanja estrogena i progesterona doveo do višeg nivoa proliferacije i hiperplazije dojki nego što je to slučaj kod uzimanja čistog estrogena. U ispitivanju koje je pratilo ovo prvo, Cline et al. se došlo do zaključka daje kombinacija MPA i konjugovanog ekvin estrogena (tj.

standardna kombinacija HRT kod žena) povećala proporciju žljezdanog epitela dojke i Ki-67 markere (proliferaciju) u lobulama ćelija mamarnog epitela kod majmuna makak.

Progestini postižu svoju funkciju putem interakcije s receptorom progesterona (PR) koji pripada klasi strukturalno povezanih regulatora gena poznatih kao "ligand-zavisni transkripcioni faktori" (R. M. Evans, Science, 240, 889, 1988. ). Familija receptora progesterona je podskup familije intraćelijskog receptora koji takođe podrazumijeva receptor estrogena (ER), receptor androgena (AR), receptor glukokortikoida (GR) i receptor mineralokortikoida (MR). Intraćelijski receptor progesterona (PR) u centru je gotovo svih aktivnosti progesterona. Kod ljudi, pošto je dvije različite izoforme receptora progesterona: PR-A i PR-B. Oba PR-a su hormonski aktivirani transkripcioni faktori, koji nakon aktiviranja vrše direktnu interakciju s genomskim sekvencama za regulisanje transkripcije i drugim transkripcionim faktorima. Transkripcione funkcije receptora progesterona zavise od interakcije s progestinom. Tkivo osjetljivo na progesteron, kod žene u reproduktivnim godinama uveliko se razlikuje u nivou ekspresije PR-a tokom menstrualnog ciklusa. U struci su poznata mnoga različita jedinjenja koja utječu na progesteron-zavisno aktiviranje PR-a. Za neka od tih jedinjenja se zna da blokiraju funkciju progesterona u svim tkivima. Ta jedinjenja se zovu čisti antagonisti i trebalo bi ih razlikovati od selektivnih modulatora receptora progesterona (SPRM) koji mogu da djeluju ili kao agonisti progesterona ili kao antagonisti progesterona u zavisnosti od tkiva. Primjeri SPRM-ova poznati u struci uključuju antiprogestine RU 486 i

ZK112993.

Pokazalo se da RU 486 (mifepriston) odgađa pojavu tumora kod pacova kada im se svakodnevno daje tokom 3 sedmice nakon početka kancerogeneze sa 7, 12, -dimetilbenz(a)antracenom (DMBA). Pokazalo se takođe da RU 486 smanjuje veličinu tumora u odnosu na kontrole kod životinja s utvrđenim tumorima. Međutim, smanjenje veličine tumora postignuto je povišenim ER serumom i progesteronom Dva mala klinička ispitivanja kod žena s metastatičkim rakom dojke pokazala su da RU 486 postiže neku efikasnost protiv te bolesti, iako to nije postignuto u većem ispitivanju Faze II. U kasnijem ispitivanju, primjećeni su simptomi adrenalne insuficijencije. Ti neželjeni efekti nisu bili iznenađujući kada se uzme u obzir znatna antiglukokortikoidna aktivnost RU 486 i njegova tendencija da povisi ER serum, pri čemu i jedno i drugo odvraćaju od njegove hronične primjene kod žena.

Statistički podaci pokazuju a od 200. 000 Amerikanki kod kojih je u toku 2005. godine uspostavljena dijagnoza raka dojke, gotovo 60% nisu imale metastatičku bolest u vrijeme hirurškog zahvata mada će se kod 30% pripadnica te iste grupe bolest vjerovatno ponovo javiti. Žene čija primarna lezija sadrži receptor estrogena (ER) i receptor progesterona (PR), prvenstveno se liječe hormonskom terapijom koristeći anti-ER poput tamoksifena ili inhibitora aromataze. Gotovo 70% pacijenata koji su pozitivni na ER i PR, reaguju su na tamoksifen. Iako prisustvo i ER-a i PR-a jeste od ključnog značaja za reagovanje, a ER izaziva PR, relativno je malo napora uloženo u razvitak antiprogestina kao mogućih modulatora razvitka i napredovanja raka dojke. Znači da terapija koja koristi osjetljivost na progesteron kod ljudskog raka dojke, može biti od velike pomoći kod raka dojke koji reaguje na hormone. U izjavi o koncenzusu Nacionalnog instituta za rak (NCI) iz 1998. godine, saopšteno je da bi tamoksifen mogao biti profilaktički koristan za sprječavanje razvitka raka dojke. Takve terapije mogu imati posebnu prednost u sprječavanju razvitka raka dojke kod pacijenata koji su podvrgnuti HRT terapiji. Po mogućstvu, takve terapije izbjegavaju visoku anti-glukokortikoidnu aktivnost koja se dovodi u vezu s brojnim jedinjenjima antiprogestina.

SAŽETAK O IZUMU

Ovaj izum odnosi se na postupke korištenja antiprogestina za liječenje raka dojke osjetljivog na hormone kod žena. Preciznije, ovaj izum koristi antiprogestine s niskim afinitetom za receptor glukokortikoida i niskom estrogenskom/antiestrogenskom aktivnošću za potiskivanje proliferacije tkiva dojke. Antiprogestin može biti čist antiprogestin ili selektivni modulator receptora progesterona (SPRM), sve dok antiprogestin pokazuje nizak afinitet za receptor glukokortikoida i dok se dozira u količinama koje su efikasne u potiskivanju proliferacije tkiva dojke. Postupci ovog izuma mogu biti korišteni za sprječavanje hiperproliferacije i naknadnog razvitka raka dojke kod pacijenata koji su podvrgnuti hormonskom tretmanu poput hormonske zamjenske terapije u menopauzi.

Jedinjenje ovog izuma može se koristiti i za liječenje drugih oboljenja poput endometrijalne hiperproliferacije, mentalne depresije, oboljenja žučnog mjehura, hipertenzije, abnormalne tolerancije na glukozu i stanja hiperkoagulacije.

KRATAK OPIS CRTEŽA

|00012| Slika 1 je grafikon koji prikazuje obrazac rasta neliječenog tumora kod pacova (C = kontrola), uz primjenu tretmana s 10 mg RU-486 (RU), tretmana s 10 mg progesterona (P4), tretmana s 20 mg, 10 mg, 2 mg, 1 mg, 0, 1 mg CDB-4124 (4124) i tretmana s istim koncentracijama CDB-4124 + 10 mg progesterona (4124 + P4). Tumori koji su se povećali u području poprečnog presjeka za bar 33% u toku 28-dnevnog perioda inspekcije, smatrani su rastućim tumorima (crna polja) Za tumore koji su se u istom periodu smanjili za 33% smatra se da se povlače (bijela polja). Ostali se tumori smatraju statičnim (siva polja). Ovdje je prikazan procenat za svaki tip obrasca izraslina za svaku grupu podvrgnutu tretmanu u kojoj se javljaju tumori. Slika 2 je grafikon koji prikazuje efekat CDB-4124 u koncentracijama 1 µM, 2 µM, 3 µM, 4 µM i 5 µM na T47D (rak dojke kod ljudi) ćelije konstruisane da izražavaju visoke nivoe aromataze (T47Darom ćelije). Za kontrolu su korištene ćelije koje nisu bile izložene tretmanu. Ovaj grafikon pokazuje daje tretman s CDB-4124 inhibirao proliferaciju T47Darom ćelija u zavisnosti od doze koja je data.

Slika 3 je grafikon koji prikazuje efekat DL-aminoglutetimida (AGM): 50 µM, 75 µM, 100 µM, ili 150 µM na T47Darom ćelije u prisustvu 1 nM testosterona. Slika 4 je grafikon koji prikazuje efekat (1) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 1 µM CDB-4124; (2) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 2 µM CDB-4124; (3) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 3 µM CDB-4124; ili (4) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 4 µM CDB-4124 na T47Darom ćelije u prisustvu 1 nM testosterona. Grafikon prikazuje singergistički efekat kombinacije AGM-a i CDB-4124 u inhibiranju proliferacije ćelija raka dojke koje izražavaju aromatazu. Gotovo 70% inhibicija proliferacije ćelija primjećeno je kod kombinacije od 4 µM

CDB-4124 i 100 µM AGM u poređenju s manje od 30% inhibicija zabilježenih kod istih jedinjenja u istim koncentracijama, pojedinačno.

DETALJAN OPIS IZUMA

Izraz "efikasno doziranje" označava količinu aktivne komponente jedinjenja koja je dovoljna za liječenje pojedinih stanja.

Izraz "selektivni modulatori receptora progesterona"znači jedinjenje koje utječe na funkcije receptora progesterona na način specifičan za tkivo. Kod nekih tkiva, jedinjenja reaguju kao antagonisti receptora progesterona (na primjer, kod tkiva dojke), a kao agonisti receptora progesterona kod drugih tkiva (na primjer, kod tkiva materice).

Izrazi "liječenje" ili "liječiti" ili "tretman" koji se ovdje koriste, označavaju svako liječenje poremećaja ili bolesti koji se dovode u vezu s neuspjehom zaustavljanja izrasline, apoptozom ili proliferativnim starenjem, i uključuje, između ostalog, inhibiranje poremećaja ili oboljenja zaustavljanjem razvitka poremećaja ili oboljenja; olakšavanjem poremećaja ili oboljenja, na primjer, izazivajući povlačenje poremećaja ili oboljenja; ili olakšanjem stanja uzrokovanog poremećajem ili oboljenjem, olakšavajući simptome poremećaja ili oboljenja.

Izraz "spriječiti", "sprječavanje" ili "prevencija" u vezi s poremećajem ili oboljenjem koja se dovode u vezu s neuspjehom zaustavljanja izrasline, apoptozom ili proliferativnim starenjem, znači sprječavanje započinjanja razvitka poremećaja ili oboljenja ukoliko se nijedno nije pojavilo, ili sprječavanje daljeg razvitka poremećaja ili oboljenja ukoliko su poremećaj ili oboljenje već prisutni. Na primjer, jedinjenja ovog izuma mogu biti korištena za sprječavanje povratka tumora. Do povratka tumora može doći zbog rezidualnih mikroskopskih grupa ili legla ćelija tumora koje se zatim šire u tumore koji se klinički mogu otkriti.

Izraz "agonist progesterona" znači jedinjenje koje vezuje receptor progesterona i oponaša aktivnosti prirodnog hormona.

Izraz "antagonist progesterona" znači jedinjenje koje se vezuje za receptor progesterona i spriječava efekt progesterona.

Izraz "potisnuti" ili "potiskuje" ili "potiskivanje" koji se koristi u vezi proliferacije tkiva dojke, znači daje mitotska proliferacija endometrijskog tkiva potisnuta nakon davanja antagonista progesterona, u odnosu na neliječeno endometrijsko tkivo pod identičnim uslovima i trebalo bi ga razlikovati od izumiranja ćelija putem, npr. apoptoze. Aktivnost antagonista progesterona u potiskivanju endometrijske mitotičke proliferacije može se testirati, npr. u ćelijskim linijama dojke, upoređujući npr. sjedinjavanje bromodeoksiuridina (BrdU) u ćelijama liječenim antagonistom progesterona u cilju kontrole (neliječenih) ćelija.

Izraz "neznatno smanjen"korišten kao dalje u tekstu u vezi hormonskih nivoa kod žena, znači da se tokom davanja jedinjenja iz ovog izuma nivoi hormona održavaju u normalnim okvirima. Znači, smatra se da smije doći do izvjesnih smanjenja nivoa hormona sve dok se hormonski nivoi nalaze u okviru normale.

[00024] Izraz "neznatno povišen" koji se koristi u daljem tekstu za hormonske nivoe kod žene, znači da su tokom davanja jedinjenja iz ovog izuma hormonski nivoi održani u okviru normale. Znači, smatra se da smije doći do izvjesnog povišenja nivoa hormona ukoliko hormonski nivo ostane u okviru normale.

Ovaj se izum odnosi na postupke liječenja raka dojke davanjem jedinjenja koje podrazumijeva jedan ili više antiprogestina u količini koja je efikasna u potiskivanju proliferacije tkiva raka dojke. Postupci su nastali iz neočekivanih otkrića da su neki antiprogesteroni efikasni i kod izazivanja apoptoze u tkivu raka dojke i kod potiskivanja proliferacije tkiva raka dojke, praveći tako razliku između ovih jedinjenja i drugih antiprogestina poput RU 486 koji mogu izazvati apoptozu tkiva raka dojke, ali nisu u mogućnosti da potisnu proliferaciju istog tkiva. Znači, antiprogestini ovog izuma iznenađujuće su efikasni u smanjivanju rasta pošto jećih tumora i u sprečavanju pojave novih tumora u tkivu dojke. Antiprogestin može biti čist antiprogestin ili specifični modulatori receptora progesterona (SPRM), sve dok antiprogestini imaju nisku aktivnost glukortikoida. Po mogućstvu, antiprogestin mora imati nisku estrogensku/antiestrogensku aktivnost tako da nivoi seruma estrogena budu znatno očuvani kod pacijenata kod davanja antiprogestina.

U jednom obliku izuma, jedinjenje ovog izuma podrazumijeva davanje efikasne količine jednog ili više antiprogestina pacijentu s rakom dojke u cilju liječenja raka dojke. Količina antiprogestina je dovoljna za potiskivanje proliferacije tkiva raka dojke.

U sličnom obliku, izum omogućava upotrebu antiprogestina za potiskivanje proliferacije ćelija raka dojke. Ćelija raka dojke može biti ćelija mamalnog raka dojke poput ljudske ćelije raka dojke. Ćelija raka dojke može biti i otporna na antiestrogen poput tamoksifena.

U drugom obliku izuma, jedinjenje ovog izuma koje podrazumijeva davanje efikasne količine jednog ili više antiprogestina pacijentu s rakom dojke koji ima i jedan ili više tumora otpornih na tretman antiestrogenom, u cilju liječenja raka dojke. Jedinjenja ovog izuma mogu, na primjer, biti posebno korisna za liječenje pacijenata s rakom dojke otpornim na tamoksifen.

U drugom obliku izuma, jedinjenje ovog izuma koje podrazumijeva izvjesnu količinu jednog ili više antiprogestina koja je efikasna za potiskivanje proliferacije tkiva raka dojke, daje se kao jedna komponenta kombinovanog terapijskog režima za liječenje raka dojke. U vezi s time, jedinjenja ovog izuma mogu se dati prije, tokom ili poslije davanja bilo kojeg terapeutskog agensa namjenjenog liječenju raka dojke. Na primjer, antiprogestini iz ovog izuma mogu biti korišteni u kombinaciji s antiestrogenom, antiandrogenom, selektivnim modulatorom receptora estrogena poput tamoksifena, inhibitorem aromataze kao što su anastrozol, letrozol, eksemestan ili DL-aminoglutetimid, hemoterapijski agensi kao što su antraciklini, taksani, alkilativni agensi, metotreksat, vinblastin, vinkristin, cisplatin ili bilo koja njihova kombinacija. Jedinjenja ovog izuma mogu reagovati sinergistično s drugim aktivnim agensima kao što su antiestrogeni, antiandrogeni, inhibitori armomataze, u cilju inhibiranja proliferacije ćelije raka dojke kod pacijenta. U svom prioritetnom obliku, jedinjenja ovog izuma daju se istovremeno s jednim ili više inhibitora aromataze u cilju liječenja raka dojke ženskih pacijenata. U ovom su izumu zabilježena jedinjenja koja podrazumijevaju efikasnu količinu antiprogestina i inhibitora aromataze. Prioritetni oblik jedinjenja podrazumijeva CDB-4124 i inhibitor aromataze izabrane u grupi koja se sastoji od anastrozola, letrozola, eksemestana i

DL-aminoglutetimida.

U drugom obliku izuma, jedinjenje ovog izuma koje podrazumijeva izvjesnu količinu jednog ili više antiprogestina koja je efikasna za potiskivanje proliferacije tkiva raka dojke, daje se ženi koja je podvrgnuta hormonskoj terapiji kako bi se spriječio razvitak raka dojke. Jedinjenja ovog izuma mogu se, na primjer, davati ženi koja je podvrgnuta hormonskoj zamjenskoj terapiji kako bi se spriječio razvitak raka dojke. Jedinjenja ovog izuma mogu se, takođe, davati ženi koja je podvrgnuta estrogenskoj terapiji kako bi se spriječio razvitak raka dojke.

Jedinjenja iz ovog izuma pogodna su za produženu upotrebu koja je neophodna za pacijente koji imaju rak dojke i podvrgnuti su tretmanu koji blokira hormone, zato što jedinjenja imaju nisku aktivnost vezivanja receptora glukokortikoida te stoga jedinjenja ne utječu na funkcije receptora glukokortikoida. Znači, primjena jedinjenja može imati manja neželjena dejstva, poput promjene raspoloženja, zamora i gubitka tjelesne težine, koji su tipični u slučaju kada se koriste antiprogesteroni s visokim afinitetom za glukokortikoidni receptor. Ukoliko je moguće, jedinjenja iz ovog izuma imaju takođe slabe ili gotovo nikakve estrogenske, anti-estrogenske ili anti-androgenske aktivnosti. U tom su pogledu prioritetni antiprogestini CDB-4124 i CDB-4059, i svaki od njih ima nisku antiglukokortikoidnu aktivnost, a ustanovljeno je da zadržavaju nivo estrogena u normali kod žena u toku perioda davanja jedinjenja tokom bar šest mjeseci.

Bilo koji postupak ovog izuma može podrazumijevati davanje jedinjenja uključujući količinu antiprogestina, koja je dovoljna za potiskivanje proliferacije tkiva raka dojke, tokom perioda davanja jedinjenja u trajanju od najmanje: 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,

29, 30, 31 ili više dana. Jedinjenje može biti davano tokom perioda od najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili više mjeseci. Jedinjenja se takođe mogu davati tokom perioda od najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više godina. Tokom perioda dok se jedinjenje daje, to se može vršiti svakodnevno ili periodično, na primjer svakog drugog dana, svakog drugog mjeseca, i slično. Jedinjenje se takođe može davati s prekidima. Na primjer, jedinjenje se može davati tokom jednog perioda od 1, 2, 3, 4, 5 ili više mjeseci praćeno periodom prekida, a zatim bi se nastavilo davanje tokom 1, 2, 3, 4, 5 ili više mjeseci, i tako dalje.

Svaki poznati antagonist progesterona s karakteristikama jedinjenja koja su gore opisana, može biti korišten od strane stručnjaka koji primjenjuje ovaj izum. Posebno su korisna jedinjenja poput jedinjenja objelodanjenih u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 861, 415, koji se kao cjelokupan dokument nalazi u prilogu radi reference, a to su 21-substituisani 19-norpregnani opšte formule:

pri čemu:

X može biti, na primjer, alkil, alkenil, alkinil, hidrogen, halo, monoalkilamin ili dialkilamin amin poput N, N-dimetilamina;

R1 može, na primjer, predstavljati O, NOH ili NO-metil;

R2 može, na primjer, predstavljati hidrogen ili acetil; i

R3 može, na primjer, predstavljati metiloksi, formiloksi, acetoksi, aciloksi, S-alkoksi, acetilteonil, glicimat, vinilski eter, acetiloksimetil, metil karbonat, halogene, metil, hidroksi i etiloksi.

Primjeri 21-substituisanog 19-norpregnana uključuju, između ostalog, i sljedećih 24 jedinjenja koja su prikazana niže:

1. CDB-4247 (21-propioniloksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-

norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

2. CDB-4361 (21-vinilski eter-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

3. CDB-4059 (21-acetoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

4. CDB-4124 (21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

6. CDB-3876 (21-hlor-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-

4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

7. CDB-4058 (21-flour-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-

4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

8. CDB-4030 (21-metil-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-

4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

9. CDB-4152 (21-hidroksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

11. CDB-4101 (21-metoksitio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-

19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

12. CDB-4110 (21-acetonid-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-

13. CDB-4111 (21-BMD-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

14. CDB-4125 (21-(Cyp*-hidroksi)-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19- ;*Cyp = 3-Ciklopentilpropioniloksi-

15. CDB-4205 (3-hidroksiamin-21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-

dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

16. CDB-4206 (3-hidroksiamin-21-acetoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-formulom:

17. CDB-4226 (3-hidroksiamin-21-etiloksi-17α-acetoksi-l lp-(4 N, N-

dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

18. CDB-4262 (3-metoksiamin-21-etiloksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-

dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

19. CDB-4223 (21-metilthio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

20. CDB-4119 (4-benzoin-21-acetiltio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

21. CDB-4239 (4-benzoin-21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom stmktumom formulom:

22. CDB-4306 (21-glicinat-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

23. CDB-4352 (21-cianotio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19 norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

24. CDB-4362 (21-metoksiacetil-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

11 (3-monodemetilizovani derivativi 24 gore navedena jedinjenja (tj.

jedinjenja u kojima je X N-metilamino) takođe su posebno korisna u primjeni ovog izuma. U vezi toga, za CDB-4453 (21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4-N-metilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion), monodemetilski derivat CDB-4124-a, pokazalo se da posjeduje čak i nižu anti-glukokortikoidnu aktivnost nego njegov srodnik. Attardi et al., 2002., Mol. Cei. Endokrin. 188: 111-123, čija sadržina je priložena u dodatku radi reference.

Mada se daje prednost jedinjenjima opšte, gore navedene, formule i njihovim monodemetilskim derivatima, u primjeni se ovog izuma može koristiti bilo koji antiprogestin zbog svog antagonističkog dejstva na receptor progesterona, ukoliko je antiprogestin u stanju da inhibira proliferaciju tkiva raka dojke. Antiprogestin ima, po mogućstvu, nisku antiglukokortikoidnu aktivnost.

Antiprogestin ima, po mogućstvu, minimalnu estrogensku i antiestrogensku aktivnost. Antiprogestini koji mogu biti korisni za ovaj izum uključuju, između ostalog, asoprisnil (benzaldehid, 4-[(11β, 17β)-17-metoksi-17-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-l l-il]-l-(E)-oksim; J867), njegov metabolit J912 (4-[17β-hidroksi-17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-( 1 E)-oksim), i ostala jedinjenja opisana u DE 43 32 283 i DE 43 32 284; CDB-2914 (17α-acetoksi-1 l|3-(4-N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) i druga jedinjenj a opisana u Stratton-u et al., 2000., Hu. Reprod. 15: 1092-1099; JNJ-1250132 i ostala jedinjenja opisana u Allan et al., 2006., Steroidi 71: 949-954; 5-Aril-l, 2-dihidrohromen[3, 4-f]kinolini, opisano u Zhi et al., 1998., J. Med. Hem. 41: 291-302; l, 4-dihidro-benzo[d][l, 3]oksazin-2-oni, opisano u američkom patentu U. S. Patent br.: 6, 509, 334, 6, 566, 358 i 6, 713, 478 u Zhang et al.; l, 3-dihidro-indol-2-oni opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 391, 907 u Fensome et al; 2, 3-dihidro-lH-indoli opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 417, 214 u Ulrich et al.; benzimidazoloni i njihova analogna jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 380, 235 u Zhang et al.; 2, 1-benzisotiazolin 2, 2-dioksidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 339, 098 u Collins et al.; ciklokarbamati i ciklo-amidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br.: 6, 306, 851 i 6, 441, 019 u Santilli et al.; ciklična urea i ciklični derivati amida opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 369, 056 u Zhang et al.; i derivati kinazolinona i benzoksazina opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 358, 948 u Zhang et al.

Drugi antiprogestini koji se mogu koristiti u izumu podrazumijevaju, između ostalog, (6a, 11β, 17β)-l l-(4-dimetilaminofenil)-6-metil-4’, 5’-dihidrospiro[estra-4, 9-dien-17, 2’(3’H)-furan]-3-on (ORG-31710) i ostala jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 871, 724; (1 ip, 17α)-l l-(4-acetilfenil)-17, 23-epoksi-19, 24-dinorkola-4, 9, 20-trien-3-one (ORG-33628); (7β, 11β, 17β)-11 -(4-dimetilaminofenil-7-metil]-4,, 5’-dihidrospiro[estra-4, 9-dien-17, 2’(3’H)-furan]-3-on (ORG-31806) i druga jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br.

4, 921, 845; ZK-112993 i druga jedinjenja opisana u Michna et al, 1992, J. Steroid Biohem. Molek. Biol. 41: 339-348; ORG-31376; ORG-33245; ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753; LG120830; LG1447; LG121046; CGP-19984A; RTI-3021-012; RTI-3021-022; RTI-3021-020; RWJ-25333; ZK-136796; ZK-114043; ZK-230211; ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734; i ZK-137316.

U izumu mogu biti korisni i drugi antiprogestini uključujući, između ostalog, i jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br.: 4, 386, 085, 4, 447, 424, 4, 519, 946 i 4, 634, 695; sa sadržanim fosforom 17β-sporedni lanac analognih mifepristona kao što je opisano u Jiang et al, 2006., Steroidi 71: 949-954; onapriston (1 l(3-[p-(dimetilamin)fenil]-17α-hidroksi-17-(3-hidroksipropil)-13a-estra-4, 9-dien-3-on) i druga jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 780, 461; lilopriston (((Z)-11β-[(4-dimetilamin)fenil]-17β-hidroksi-17α—(3-hidroksi-l-propenil)estra-4, 9-dien-3-on) i ostala jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 609, 651; 17β- substituisanih 19-norsteroida poput 11β-(4-metoksifenil)-17β-hidroksi-17α-etinil-4, 9-estradien-3-on opisano u Belagner et al.,

1981., Steroidi 37: 361-382; 11β-aril-4-estrena poput (Z)-11β-[(4-dimetilamino)fenil)]-17β-hidroksi-17α-(3-hidroksi-l-propenil)estr-4-en-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 728, 689; derivati 11β-aril-estrena opisani u američkom patentu U. S. Patent br.: 5, 843, 933 i 5, 843, 931; derivati 11-benzaldoksim-estra-diene poput 4-[17β-metoksi-17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-l-(E)-oksim opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 693, 628;

1 l-benzaldoksim-17β-metoksi-17α-metoksimetil-estradien derivativi poput 4-[17β-metoksi- 17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-1 -(E)-[0-(etilamin)karbonil]oksim opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 576, 310; S-substitut za 11β-benzadoksim-estra-4, 9-diene-tiolestre karbonične kiseline poput 4-[ 17β-metoksi-17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-1 -(E)-[0-(etiltio)karbonil]oksim, opisano u WO 99/45023; esteri steroida poput (Z)-6’-(4-cianofenil)- 9, 11α-dihidro-17β-hidroksi-17α -[4-(l-okso-3-metilbutoksi)-l-butenil]4’H-nafto[3’, 2’, r; 10, 9, l l]estr-4-en-3-on opisani u DE 19652408, DE 4434488, DE 4216003, DE 4216004 i WO 98/24803; fluorisani steroidi 17α-alkilnog lanca poput 11β-(4-acetilfenil)-17β-hidroksi-17α (l, l, 2, 2, 2-pentafluoroetil)estra-4, 9-dien-3-on opisano u WO 98/34947; 17-spirofuran-3’-iliden steroidi poput 1 lbeta-(4-Acetilfenil)-19, 24-dinor-17, 23-epoksi-17alfa-kola-4, 9, 20-trien-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 292, 878; (Z)-l 1 beta, 19-[4-(3-piridinil)-o-fenilen]-17beta-hidroksi-17α-[3-hidroksi-1 -propenil]-4-androsten-3-on i druga jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 439, 913; gonani 13-alkil-11-beta-fenil poput 1 lbeta-[4-(l-metiletenil)phenil]-17α-hidroksi-17beta-(3-hidroksipropil)-13a-estra-4, 9-dien-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 446, 036; 11-arilsteroida poput 4’, 5’-Dihidro-l lbeta-[4-(dimetilamino)fenil]-6beta-metilspiro[estra-4, 9-dien-17beta, 2’(3’H)-furan]-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 921, 845; 11-beta-aril-estradieni opisani u U. S Patent br.: 4, 829, 060, 4, 814, 327 i 5, 089, 488; 11 -beta-aril-4, 9 gonadini i 11-beta-aril-13-alkil-4, 9-gonadini opisani u U. S. Patent br.: 5, 739, 125, 5, 407, 928 i 5, 273, 971;; steroidi 11 -beta-aril-6-alkil (ili alkenil ili alkinil) opisani u EP 289073; 10-beta, l 1-beta premošteni steroidi, opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 093, 507; 1 l-beta-aril-14-beta-steroidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 244, 886; 19, 11-beta-premošteni steroidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br: 5, 095, 129, 5, 446, 178, 5, 478, 956 i 5, 232, 915; 1-arilsulfonil, arilkarbonil i l-arilfosfonil-3-fenil-l, 4, 5, 6-tetrahidropiridazini opisani u američkom patentu U. S. Patnet br. 5, 684, 151; 1-arilsulfonil, arilkarbonil i ariltiokarbonil piridazino derivati opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 753, 655; derivati l, 2-dihidro-[l, 2-g]kinolin i derivati 1, 2-dihidro-hromeno-[3, 4-f]kinolin opisani u američkom patentu U. S. Patent br.

5. 688. 808., 5, 693, 646, 5, 693, 647, 5, 696, 127, 5, 696, 130 i 5, 696, 133; oksa-steroidi 6 dobijeni od (8S, 13S, 14R)-7-oksa-estra-4, 9-dien-3, 17-dion 1 opisano u Kang et al.,

2007., Bioorg.: Med. Hem. Slo. 15: 907-910; i 7-oksa-steroidi 4 opisani u Kang et al.,

2007., Bioorg. Hem. Slo. 17: 2531-2534.

U svom prioritetnom obliku, antiprogestin je CDB-4059 (21-metoksi-17α-acetoksi-17β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion).

U svom posebno prioritetnom obliku, antiprogestin je CDB-4124 (21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion).

Antiprogestin, po mogućstvu, smanjuje broj proliferirativnih ćelija na svakih sto ćelija u ćelijskoj liniji raka dojke za najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Ćelijska linija raka dojke može biti osjetljiva na tamoksifen kao što MCF-7 ili otporna na tamoksifen poput LY-2.

U svom drugom obliku ovaj izum pokazuje postupke koji se mogu koristiti za identifikovanje jedinjenja koja posjeduju selektivnu aktivnost vezivanja receptora progesterona. Ti postupci podrazumijevaju vezivanje receptora i in vivo bioloških proba poput anti-McGinty, anti-Clauberg, glukokortikoidne, estrogene, androgene, anti-glukokortikoidne (AG), anti-estrogene, i anti-androgene aktivnosti kao i post-koitalne i anti-ovulacijske aktivnosti, koje se koriste u vodećim jedinjenjima ovog izuma kao referenca.

U drugim svojim oblicima, ovaj izum pokazuje da se takođe mogu analizirati potencijalni antiprogesteroni za transkripcionu aktivnost u ljudskim ćelijama. Kada se antiprogestini objelodanjeni u ovom izumu koriste kao referenca, ova analiza može pružiti informacije o (1) interakciji probnog jedinjenja s receptorom progesterona, (2) interakciji aktiviranog receptora progesterona s drugim transkripcijskim faktorima i (3) aktivnosti transkripcijskog kompleksa u elementu reakcije progesterona (PRE). U tim opitima, može doći do ko-transfekcije plasmida koji izražava ljudsku izoformu PR-B-a (hPR-B) s bilo kojim prenosiocem koji je svakom iskusnom stručnjaku poznat kao PRE-zavistan promoter u HeLa, HepG2 ili T47D ćelijama. Ti prenosioci podrazumijevaju, između ostalog, luciferazu, beta-galaktosidazu, zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein ili žuti fluorescentni protein. Nakon transfekcije, ćelije se tretiraju ili probnim jedinjenjem ili jednim od antiprogestina koji su objelodanjeni u ovoj primjeni, što se koristi kao pozitivna kontrola. Nakon tretmana, ćelije se testiraju za ekspresiju prenosioca.

U svom drugom obliku, ovaj izum pokazuje da se budući antiprogestini mogu testirati na sposobnost da spriječe deksametazonom izazvanu smrt ćelija u ljudskoj limfocitnoj ćelijskoj liniji CEM-7 i porediti s efektima antiprogestina objelodanjenih u ovoj specifikaciji. U tim se ogledima može dodati koncetracija deksametazona, koja može dovesti do smrti ćelije. Te se ćelije zatim tretiraju ili s RU486, jednim od antiprogestina ovog izuma ili probnim jedinjenjem čija koncentracija treba biti između 10-6 i 10-8 M.

Jedinjenja antiprogestina koja mogu da se koriste u skladu s ovim izumom, mogu biti sintetizovana uz pomoć sintetičke hemijske tehnike koja je stručnjacima poznata kao tehnika objelodanjena u U. S. Patent br. 6, 861, 415. Treba razumijeti da izvjesne funkcionalne grupe mogu imati interference s drugim reaktantima ili reagensima pod uslovima koji omogućuju reakciju, te im je možda potrebna privremena zaštita. Upotreba zaštitnih grupa opisana je u "Zaštitnim grupama organske sinteze" (Protective Groups in Organic Synthesis), 2. izdanje T. W. Greene & P. G. M. Wutz, Wiley-Interscience (1991. ).

U jednom obliku, jedinjenja izuma podrazumijevaju jedan ili više antiprogestina ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Zavisno od uslova za razvoj, jedinjenje soli koje je dobijeno može biti u neutralnom ili u slanom obliku. Oblici soli podrazumijevaju hidrate i druge rastvore kao i kristalne polimorfe. U skladu s ovim izumom, mogu se koristiti i baza u slobodnom obliku i soli ovih krajnjih proizvoda.

Soli jakih kiselina mogu same po sebi da se promjene u slobodnu bazu, koristeći osnovne agense poput alkala ili razmjenom jona. Dobijena slobodna baza može takođe formirati i soli s organskim ili neorganiskim kiselinima.

Prilikom pripreme soli jakih kiselina, koriste se po mogućstvu takve kiseline koje stvaraju odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli. Primjeri takvih kiselina su sljedeće kiseline: hlorovodonična, sumporna, fosforska, azotna, alifatična, aliciklično karboksilne ili sulfonske, kao što su mravlja kiselina, sirćetna, propionska, sukcinatna, glikolna, mlečna, malična, vinska, limunska, askorbinska, glukoronska, fumama, maleinska, hidroksi-maleinska, pirovinska, aspartična, glutaminska, p-hidroksibenzoinska, embonska, etansko-sulfonska, hidroksi-etano-sulfonska, fenil-sirćetna, bademova, alogen-bensen-sulfonska, toluensko-sulfonska, galaktarična, galakturonična ili naftalinsko-sulfonska kiselina. U skladu s ovim izumom, mogu se koristiti svi kristalni polimorfi.

|00049] U skladu s ovim izumom mogu se koristiti i soli jakih baza i mogu biti pripremljene spajajući kiselinu u slobodnom obliku s dovoljnom količinom željene baze kako bi se proizvela so na konvencionalni način. Kiselina u slobodnom obliku može se regenerisati spajanjem oblika soli s kiselinom i izolovanjem slobodne kiseline na konvencionalni način. Farmaceutski prihvatljive soli jakih baza stvaraju se s metalima ili aminima, poput alkala i zemno alkalnih metala ili organskih amina. Primjeri metala koji se koriste kao kationi jesu natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum i slični. Primjeri odgovarajućih amina jesu amino kiseline poput lizina, holina, dietanolamina, etilenediamina, N-metilglukamina i slično.

Jedinjenja iz ovog izuma mogu biti pripremljena u obliku doze ili doza pogodnih za oralnu, parenteralnu, transdermalnu, rektalnu, transmukozalnu ili topikalnu primjenu. Parenteralno uzimanje jedinjenja podrazumijeva, između ostalog, intravenozno, intraarterijsko, intraperitonealno, potkožno, intramuskulamo, intratekalno i intraartikulamo.

Izrazi "oralno davanje" ili "isporučivo oralno" ovdje u tekstu uključuju svaki oblik davanja terapeutskog agensa ili njegovog jedinjenja osobi kada se agens ili jedinjenje stavljaju u usta te osobe, bez obzira da li se agens ili jedinjenje moraju progutati ili ne. Znači, "oralna primjena" podrazumijeva davanje kroz usta, pod jezik ili u jednjak (npr. inhalacijom).

U nekim drugim oblicima, jedinjenja ovog izuma formulisana su kao rektalni supozitoriji, koji mogu sadržavati supozitorijske osnove, uključujući, između ostalog, kakao maslac ili gliceride.

Jedinjenja ovog izuma mogu biti formulisana i za inhalaciju, koja može biti, između ostalog, i u sljedećim oblicima: rastvor, suspenzija ili emulzija, čije davanje može biti i u obliku suvog praška ili u obliku aerosola koji koristi pokretače poput dihlorofluorometana ili trihlorofluorometana.

|00054] Jedinjenja ovog izuma mogu takođe biti formulisana za transdermalnu primjenu, na primjer kao krema, mast, losion, pasta, gel, flaster s lijekom, flaster ili membrana. Takva jedinjenja mogu podrazumijevati bilo koje odgovarajuće vezivno sredstvo, na primjer, pojačivače penetracije i slično.

Jedinjenja ovog izuma mogu takođe biti formulisana za parenteralno davanje, uključujući, između ostalog, injekcije ili neprekidnu infuziju. Formulacije za injekciju mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljanim ili vodenim transporterima. Takva jedinjenja mogu takođe postojati u obliku praška za ponovno sastavljanje uz pomoć odgovarajućeg transportera uključujući, između ostalog, sterilnu vodu bez pirogena, WFI i slično.

[00056] Jedinjenja ovog izuma mogu takođe biti formulisana kao priprema baze, koja se može davati putem implanta ili intramusculamom injekcijom. Takva jedinjenja mogu biti formulisana uz pomoć odgovarajućih polimeričnih ili

hidrofobičnih materijala (kao što je emulzija u prihvatljivom ulju, na primjer), jonski izmejivači (joniti), ili kao teško rastvorljivi derivati (kao što je na primjer teško rastvoriva so).

Jedinjenja ovog izuma mogu se takođe formulisati kao preparat lipozoma. Preparati lipozoma mogu podrazumijevati lipozome koji ulaze u značajne ćelije ili stratum comeum i spajaju se s membranom ćelije što dovodi do isporučivanja sadržine lipozoma u ćeliju. Mogu se na primjer, koristiti lipoozomi kao što su lipozomi opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 077, 211 za Yarosh, U. S. Patent br. 4, 621, 023 za Redziniak et al., ili U. S. Patent br. 4, 508, 703 za Redziniak et al.

[00058] Jedinjenje ovog izuma može biti u obliku čvrstih jedinica doza, poput tableta, (npr. tablete suspenzija, tablete suspenzija za grickanje, tablete s brzom disperzijom, tablete za žvakanje, šumeće tablete, tablete u dva sloja, itd), ovalne tablete, kapsule (npr., a mekana ili čvrsta želatinska kapsula), prašak (npr. upakovani prašak, prašak koji se može pripremiti ili prašak koji se otapa u vodi), pastile, vrećice, beskvasna kapsula, okrugle pilule, pelete, granule, mikrogranule, mikrogranule u kapsuli, praškaste aerosolne formule, ili bilo koja druga doza čvrstog oblika srazmjemo prilagođena za davanje pacijentu.

Tablete mogu biti pripremljene u skladu s bilo kojom relevantnom, poznatom farmaceutskom tehnologijom. U jednom od oblika, tablete ili druge doze čvrstog oblika, mogu biti pripremljene kroz procese koji koriste jedan postupak ili kombinaciju postupaka, uključujući, između ostalog, i (1) suvo mješanje, (2) direktno kompresovanje, (3) mljevenje, (4) suvu granulaciju ili bez vode, (5) vlažnu granulaciju, ili (6) stapanje.

|00060) Pojedinačne etape u procesu vlažne granulacije pripremanja tablete, obično podrazumijevaju mljevenje i prosijavanje sastojaka, mješanje suvog praška, vlažno spajanje, granulaciju i krajnje mljevenje. Suva granulacija podrazumijeva kompresovanje praskaste mješavine u grubu tabletu ili "smjesu" na teškoj rotirajućoj presi za tablete. Smjese se zatim lome u čestice granulata mljevenjem, obično prolaskom kroz oscilacijski granulator. Pojedinačne etape podrazumijevaju mješanje prašaka, kompresovanje (u smjesu) i mljevenje (usitnjavanje smjese ili granulacija). Obično nema ni vlažnog veziva ni vlaženja u bilo kojoj etapi.

U drugim oblicima, doze u čvrstom obliku mogu biti pripremljene mješanjem antiprogestina s jednim ili više farmaceutskih vezivnih sredstava kako bi oformili u osnovi homogenu preformulisanu mješavinu. Ta se preformulisana mješavina može podjeliti i eventualno dalje preraditi (npr. kompresovati, staviti u kapsule, spakovati, raširiti itd.) u bilo koji željeni oblik doze.

Kompresovane tablete mogu se pripremiti zbijanjem jedinjenja iz ovog izuma u prahu ili granulama. Izraz "kompresovana tableta" obično se odnosi na obične, neobložene tablete pogodne za oralnu upotrebu, pripremljene jednom kompresijom ili uvodnom fazom zbijanja praćenom krajnjim kompresovanjem. Tablete iz ovog izuma mogu biti obložene ili drugačije sastavljene kako bi osigurale oblik doze koji pruža prednosti poboljšanih karakteristika rukovanja ili pohranjivanja. U jednom obliku, biće izabrano bilo koje takvo oblaganje kako se ne bi znatno odgodio početak terapeutskog efekta jedinjenja ovog izuma nakon davanja tog jedinjenja pacijentu. Izraz "tableta suspenzije" se ovdje koristi u vezi s kompresovanom tabletom koja se brzo rastvara kada se stavi u vodu.

Odgovarajuća doza jedinjenja ovog izuma u tečnom obliku, podrazumijeva rastvore, vodene ili uljane suspenzije, eliksire, sirupe, emulzije, tečne formule aerosola, gelove, kreme, masti itd. Takva jedinjenja mogu takođe da budu u obliku suvog proizvoda koji se treba spojiti s vodom ili drugim odgovarajućim transporterom prije upotrebe.

U jednom obliku, tečna ili polučvrsta jedinjenja, nakon pohranjivanja u zatvorenom pakovanju i čuvanja na sobnoj temperaturi, u frižideru (npr. oko 5-10 °C), ili na temperaturi zamrzavanja tokom perioda od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 mjeseci, ispoljavaju prisustvo najmanje oko 90%, najmanje oko 92, 5%, najmanje oko 95%, odnosno najmanje oko 97, 5% originalnog jedinjenja antiprogestina.

Jedinjenja iz izuma mogu, ukoliko se to želi, uključivati jedno ili više farmaceutski prihvatljivih vezivnih sredstava. Izraz "vezivno sredstvo" u ovom tekstu označava bilo koju supstancu, koja nije sama po sebi terapeutski agens, a koja se koristi kao nosilac ili transporter za davanje terapeutskog agensa pacijentu ili supstancu koja se dodaje farmaceutskom jedinjenju kako bi se poboljšale njegove osobine pohranjivanja ili rukovanja ili kako bi se omogućilo ili olakšalo stvaranje jedinice doze jedinjenja. Vezivna sredstva podrazumijevaju, ilustracije radi, između ostalog, razblaživače, razlagače, vezivne agense, adhezive, agense vlaženja, lubrikante, glidante, agense za modifikovanje površine ili površinski aktivna sredstva, arome, agense za otapanje, emulzivne agense, nevodena sredstva, konzervanse, antioksidante, adhezive, agense za podešavanje pH i osmolamosti (npr. puferi), konzervanse, agense zgušnjavanja, agense zaslađivanja, agense ukusa, agense maskiranja ukusa, dodatke za boju, pojačivače penetracije i supstance koje se dodaju za poboljšanje izgleda jedinjenja.

Vezivna sredstva koja se eventualno koriste u jedinjenjima izuma mogu biti čvrsta, polučvrsta, tečna ili kombinacije istih. Jedinjenja izuma koja sadrže vezivna sredstva mogu biti pripremljena bilo kojom poznatom farmaceutskom tehnikom koja uključuje mješanje vezivnog sredstva i lijeka ili terapeutskog agensa.

Jedinjenja izuma mogu podrazumijevati jedno ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača kao vezivnih sredstava. Odgovarajući razblaživači uključuju, ili pojedinačno ili u kombinaciji, laktozu, uključujući anhidroznu laktozu i laktozu monohidrata; škrobove, uključujući škrob podoban za direktnu kompresiju i hidrolizovani škrob (npr., Celutab™ i Emdex™); manitol; sorbitol; ksilitol; đekstrozu (; npr. Cerelose™ 2000) i monohidrat dekstroze; dvobazni dihidrat kalcijum-fosfata; razblaživače na bazi saharoze; poslastičarski šećer; monobazni monohidrat kalcijum sulfata; dihidrat kalcijum sulfata; granulami kalcijum laktat trihidrat; dekstrate; inozitol; hidrolizovane čvrste supstance iz ceralija; amilozu; celuloze uključujući i mikrokristalnu celulozu, prehrambene izvorea - i amorfne celuloze - i amorfnu celulozu (npr. Rexcel™) i celulozu u prahu; kalcijum karbonat; glicin; bentonit; polivinilpirolidon; i slično. Takvi razblaživači, ukoliko su prisutni, čine ukupno 5% do ukupno 99%, tj. oko 10% do oko 85%, odnosno oko 20% do oko 80% ukupne težine jedinjenja. Svaki odabrani razblaživač ili razblaživači ispoljavaju odgovarajuća tečna svojstva i, tamo gdje su potrebne tablete, kompresivnost.

Moguće je korišćenje ekstragranulame mikrokristalne celuloze (tj. mikrokristalne celuloze dodate vlažnom jedinjenju u granularnom obliku nakon faze sušenja) kako bi se poboljšala čvrstoća (tableta) i/ili vrijeme razlaganja.

Jedinjenja ovog izuma mogu eventualno podrazumijevati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razlagača u ulozi vezivnih sredstava, posebno za tablete, kapsule ili druge čvrste formule. Odgovarajući razlagači podrazumijevaju ili pojedinačno ili u kombinaciji, škrobove, uključujući natrijum-skrob glikolat (npr. Explotab™ ili PenWest) i preželatinirane kukuruzne škrobove (npr. National™ 1551, National™ 1550, i Colocorn™ 1500), gline (npr., Veegum™ HV), celuloze poput pročišćene celuloze, mikrokristalne celuloze, metilceluloze, karboksimetilceluloze i natrijum karboksimetilceluloze, natrijum umrežene karmeloze (npr. Ac-Di-Sol™ ili FMC), alginate, unakrsni povidon i gume poput agara, guara, ksantana, rogača, karaja, pektina i tragakant guma.

Razlagači mogu biti dodati u bilo kojoj odgovarajućoj fazi tokom pripreme jedinjenja, posebno prije faze granulacije ili tokom faze lubrikacije prije kompresovanja. Takvi razlagači, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 2% do ukupno 30%, tj. oko 0, 2% do oko 10%, odnosno 0, 2% do oko 5% ukupne težine jedinjenja.

Jedinjenja iz ovog izuma mogu podrazumijevati i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih veznih agenasa ili adheziva u ulozi vezivnih sredstava, posebno za formule tableta. Takvi vezni agensi i adhezivi bi trebali pružati dovoljno kohezije prašku koji se koristi za tablete kako bi omogućili normalne operacije postupka poput davanja veličine, lubrikacije, kompresovanja i pakovanja, ali da istovremeno omoguće da se tableta razloži i da jedinjenje bude apsorbovano nakon gutanja. Odgovarajući vezni agensi i adhezivi podrazumijevaju ili pojedinačno ili u kombinaciji, akaciju, tragakant, saharozu; želatin; glukozu; škrobove poput, između ostalog, preželatiniranih škrobova (npr. National™ 1511 i National™ 1500); celuloze poput, između ostalog, metilceluloze i natrijum karmeloze (npr. Tylose™); alginsku kiselinu i soli alginske kiseline; magnezijum i aluminijum silikat; PEG; guar gumu; polisaharidnu kiselinu; bentonit; povidon, na primjer povidon K-15, K-30 i K-29/32; polimetakrilate; HµMC; hidroksipropilcelulozu (npr. Klucel™); i etilcelulozu (npr. Ethocel™). Takvi vezni agensi i/ili adhezivi, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 5% do ukupno 25%, tj. oko 0, 75% do oko 15%, odnosno 1% do oko 10% ukupne težine jedinjenja.

Jedinjenja izuma mogu podrazumijevati jedno ili više farmaceutski prihvatljivih agensa vlaženja u ulozi veznih sredstava. Neki od primjera surfaktanata koji se mogu koristiti kao agensi vlaženja ujedinjenjima ovog izuma podrazumijevaju jedinjenja kvartemi amonijaka, na primjer benzalkonium hlorid, benzetonijum hlorid i cetilpiridinijum hlorid, dioktil natrijum sulfosukcinat, polioksietilen alkilfenil eter, na primjer nonoksinol 9, nonoksinol 10, i oktoksinol 9, poloksamere (polioksietilen i poliokspropilen blok kopolimere), polioksietilenske gliceride masne kiseline i ulja, na primjer polioksietilen (8) kaprilik/kaprik mono- i digliceridi (npr. Labrasol™ od Gattefosse), polioksietien (35) ricinusovo ulje i polioksietilen (40) hidrogenizovano ricinusovo ulje; polioksietilen alkil eteri, na primjer polioksietilen (20) cetostearil eter, estere polioksietilenske masne kiseline, na primjer polioksietilen (40) stearate, estere polioksietilena sorbitana, na primjer polisorbat 20 i polisorbat 80 (npr. Tween™ 80 od ICI), propilen glikol esteri masne kiseline, na primjer propilen glikol laurat (npr. Lauroglycol™ od Gattefosse), natrijum lauril sulfat, masne kiseline i njihove soli, na primjer oleinska kiselina natrijum oleat i trietanolamin oleat, esteri gliceril masne kiseline, na primjer gliceril monostearat, sorbitan esteri, na primjer sorbitan monolaurat, sorbitan monooleat, sorbitan monopalmitat i sorbitan monostearat, tiloksapol, i njihove mješavine. Takvi agensi vlaženja, ukoliko ih ima, sačinjavaju ukupno oko 0, 25% do 15%, tj. 0, 4% do oko 10%, odnosno 0, 5% do oko 5% od ukupne težine jedinjenja.

Jedinjenja izuma mogu podrazumijevati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih lubrikanata (uključujući i antiadhezive i/ili glidanate) u ulozi veznih sredstava. Odgovarajući lubrikanti uključuju, pojedinačno ili u kombinaciji, gliceril behapat (npr. Compritol™ 888); stearičnu kiselinu i njene soli, uključujući magnezijum (magnezijum stearat), sterate kalcijuma i natrijuma; hidrirana biljna ulja {npr. Sterotex™); koloidni silicijum; talk; voskove; bornu kiselinu; natrijum benzoat; natrijum acetat; natrijum fumarat; natrijum hlorid; DL-leucin; PEG (npr. Carbowax™ 4000 i Carbowax™ 6000); natrijum oleat; natrijum lauril sulfat; i magnezijum lauril sulfat. Takvi lubrikanti, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 1% do oko 10%, oko 0, 2% do oko 8%, odnosno 0, 25% do oko 5%, ukupne težine jedinjenja.

Pogodna antiadhezivi podrazumijevaju talk, kukuruzni škrob, DL-leucin, natrijum lauril sulfat i metalne stearate.. Talk je antiadheziv ili glidant koji se koristi, na primjer, da umanji ljepljivost formulacije za površinu opreme i da umanji statičnost u mješavini. Jedan ili više antiadheziva, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 1% do oko 10%, oko 0, 25% do oko 5%, odnosno oko 0, 5% do oko 2%, ukupne težine jedinjenja.

Glidanti se mogu koristiti za podsticanje protoka praška u čvrstoj formuli. Pogodni glidanti podrazumijevaju koloidalni silikonski dioksid, škrob, talk, trobazni kalcijum-fosfat, praškastu celulozu i magnezijum trisilikat. Posebna se prednost daje koloidalnom silikonskom dioksidu.

Jedinjenja ovog izuma mogu uključivati jedan ili više agenasa protiv pjenušanja. Simetikon je ilustrativni primjer agensa protiv pjenušanja. Takvi agensi protiv pjenušanja, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 001% do oko 5%, oko 0, 001% do oko 2%, odnosno oko 0, 001% do oko 1%, ukupne težine jedinjenja.

Ilustrativni antioksidanti za korišćenje u ovom izumu podrazumijevaju, između ostalog, butilovani hidroksitoluen, butilovani hidroksianizol, kalijum metabisulfit, i slično. Po želji, ujedinjenju ovog izuma prisutni su jedan ili više antioksidanata u količini od oko 0, 01% do oko 2, 5%, na primjer oko 0, 01%, oko 0, 05%, oko 0, 1%, oko 0, 5%, oko 1%, oko 1, 5%, oko 1, 75%, oko 2%, oko 2, 25%, odnosno oko 2, 5% težine.

U raznim oblicima, jedinjenja izuma mogu podrazumijevati konzervanse. Pogodni konzervansi podrazumijevaju, između ostalog, benzalkonijum hlorid, metil, etil, propil ili butilparaben, benzil alkohol, benzetonijum, metil ili propil p-hidroksibenzoat i sorbičnu kiselinu ili njihove kombinacije. Fakultativni konzervans je obično prisutan u količini od oko 0, 01% do oko 0, 5% ili oko 0, 01% do oko 2, 5% težine.

U jednom obliku, jedinjenja izuma mogu podrazumijevati pufer. Puferi podrazumijevaju agense koji smanjuju pH promjene. Ilustrativne kategorije pufera za upotrebu u raznim oblicima ovog izuma podrazumijevaju soli iz Grupe IA uključujući metale, na primjer, soli bikarbonata Grupe IA metala, soli karbonata Grupe IA metala, alkalinski ili alkalni pufer zemnog metala, alunimijumski pufer, kalcijumov pufer, natrijumov pufer ili magnezijski pufer. Pogodni puferi podrazumijevaju karbonate, fosfate, bikarbonate, citrate, borate, acetate, ftalate, tartrate, sukcinate bilo kojeg od gore navedenih, na primjer natrijum ili kalijum fosfata, citrata, borata, acetata, bikarbonata ili karbonata.

Neki od primjera pogodnih pufera podrazumijevaju aluminijum, magnezijum hidroksid, aluminum glicinat, kalcijum acetat, kalcijum bikarbonat, kalcijum borat, kalcijum karbonat, kalcijum citrat, kalcijum glukonat, kalcijum glicerofosfat, kalcijum hidroksid, kalcijum laktat, kalcijum ftalat, kalcijum fosfat, kalcijum sukcinat, kalcijum tartrat, dvobazni natrijum fosfat, dikalijum vodonik fosfat, dikalijum fosfat, dinatrijum vodonik fosfat, dinatrijum sukcinat, suvi gel aluminijum hidroksida, magnezijum acetat, magnezijum aluminat, magnezijum borat, magnezijum bikarbonat, magnezijum karbonat, magnezijum citrat, magnezijum glukonat, magnezijum hidroksid, magnezijum laktat, magnezijum metasilikat aluminat, magnezijum oksid, magnezijum ftalat, magnezijum fosfat, magnezijum silikat, magnezijum sukcinat, magnezijum tartrat, kalijum acetat, kalijum karbonat, kalijum bikarbonat, kalijum borat, kalijum citrat, kalijum metafosfat, kalijum ftalat, kalijum fosfat, kalijum polifosfat, kalijum pirofosfat, kalijum sukcinat, kalijum tartrat, natrijum acetat, natrijum bikarbonat, natrijum borat, natrijum karbonat, natrijum citrat, natrijum glukonat, natrijum vodonik fosfat, natrijum hidroksid, natrijum laktat, natrijum ftalat, natrijum fosfat, natrijum polifosfat, natrijum pirofosfat, natrijum seskvikarbonat, natrijum sukcinat, natrijum tartrat, natrijum tripolifosfat, sintetički hidrotalcit, tetrakarbonat pirofosfat, tetranatrijum pirofosfat, trikalijum fosfat, trinatrijum fosfat, i trometamol. (Djelimično se zasniva na spisku koji se može naći u The Merck Index, Merck & Co. Rahway, N. J. (2001. )). Osim toga, kombinacije ili mješavine bilo koja dva ili više gorespomenuta pufera, mogu se koristiti u farmaceutskim jedinjenjima koja su ovdje opisana. Ukoliko to neko želi, puferi se mogu nalaziti ujedinjenjima izuma i u količinama od oko 0, 01% do oko 5% ili oko 0, 01% do oko 3% težine.

[00081] U svojim raznim oblicima, jedinjenja ovog izuma mogu podrazumijevati jedan ili više agenasa koji povećavaju viskoznost. Ilustrativni primjer agenasa koji povećavaju viskoznost uključuju, između ostalog, i metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, etilcelulozu, karagen, kabopol i/ili njihove kombinacije. Po želji, ujedinjenjima izuma mogu se nalaziti jedan ili više agenasa koji povećavaju viskoznost i to u količinama od oko 0, 1% do oko 10% ili oko 0, 1% do oko 5% težine.

U raznim svojim oblicima, jedinjenja ovog izuma podrazumijevaju "organoleptični agens" kako bi poboljšali organoleptična svojstva jedinjenja. Izraz "organoleptični agens" u daljem tekstu odnosi se na bilo koje vezno sredstvo koje može poboljšati ukus ili miris ili mogu pomoći da se prikrije neprijatan ukus ili miris jedinjenja ovog izuma. Takvi agensi podrazumijevaju zaslađivače, agense arome i/ili agense za prikrivanje ukusa. Pogodni zaslađivači i/ili agensi arome podrazumijevaju bilo koji agens koji zalađuje ili daje ukus farmakološkom jedinjenju. Organoleptični agensi su fakultativno obično prisutni ujedinjenjima izuma u količini od oko 0, 1 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 0, 5 mg/ml do 5 mg/ml ili oko 1 mg/ml.

Ilustrativni zaslađivači ili agensi arome podrazumijevaju, između ostalog: bagremov sirup, anetol, anisovo ulje, aromatični eliksir, benzaldehid, benzaldehid eliksir, ciklodekstrine, kim, kimovo ulje, kardamomovo ulje, kardamomovo sjeme, kardamomov alkohol, kardamomova tinkturu, sok od trešnje, sirup od trešnje, cimet, cimetovo ulje, cimetovu vodu, limunsku kiselinu, sirup limunske kiseline, ulje klinčića, kakao, kakao sirup, korijanderovo ulje, dekstrozu, eriodiktion, eriodiktion ekstrakt tečnosti, eriodiktion sirup, aromat, etilacetat, etil vanile, komoračevo ulje, đumbir, ekstrakt tečnosti đumbira, đumbirovu aromatičnu smolu ili oleoresin, dekstrozu, glukozu, šećer, maltodekstrin, glicerin, sladić, sladićev eliksir, sladićev ekstrakt, čist ekstrakt sladića, tečni ekstrakt sladića, sirup sladića, med, izo-alkoholni eliksir, lavandino ulje, limunovo ulje, limunsku tinkturu, manitol, metil salicilati, oraščićevo ulje, narančina gorčina, eliksir, narančina gorčina, ulje, ulje cvjeta naranče, vodu narančinog cvjeta, narančino ulje, kora naranče, gorko, slatku koru naranče, tinkturu, alkohol naranče, sirup naranče, pitomu nanu, ulje od pitome nane, alkohol od pitome nane, naninu vodu, feniletil alkohol, sok od maline, sirup od maline, ruzmarinovo ulje, ružino ulje, ružinu vodu, pojačivač, saharin, saharin kalcijum, saharin natrijum, sirup saparine, sarsaparila, rastvor sorbitola, nanu 'mentha spicata', ulje nane 'mentha spicata', saharozu, sukralozu, sirup, ulje od majčine dušice, toluanski balzam, sirup toluanskog balzama, vanilu, vanilinu tinkturu, vanilin, sirup divlje trešnje, ili njihove kombinacije.

Ilustrativni agensi maskiranja ukusa uključuju između ostalog, ciklodekstrine, ciklodesktrinske emulzije, ciklodekstrinske čestice, ciklodekstrinske komplekse ili njihove kombinacije.

Ilustrativni agensi a otapanje podrazumijevaju, između ostalog, sorbitol sirup, metil celulozu, glukozu/šećer u sirupu, želatin, hidroksietilcelulozu, karboksimetil celulozu, aluminijumski stearat i hidrogenirane jestive masnoće. Ilustrativni emulzijski agenasi podrazumijevaju, između ostalog, lecitin, sorbitan monooleat i akaciju. Bezvodni transporteri podrazumijevaju, između ostalog, jestiva ulja, bademovo ulje, frakcionisano kokosovo ulje, uljane estere, propilen glikol i etil alkohol.

Gore opisana vezna sredstva mogu imati višestruke uloge što je već poznato struci. Na primjer, škrob može služiti kao filter i kao razlagač. Klasifikacije gorenavedenih veznih sredstava ne smiju ni u kom slučaju biti tumačene kao ograničavajuće.

Jedinjenja ovog izuma mogu biti davana na bilo koji način, uključujući, između ostalog, i oralnu, parenteralnu, sublingvalnu, transdermalnu i rektalnu primjenu, preko sluznice, topikalnu, putem inhalacije, preko usta ili njihove kombinacije. Parenteralno uzimanje jedinjenja podrazumijeva, između ostalog, intravenozno, intraarterijsko, intraperitonealno, potkožno, intramuskulamo, intratekalno, intraartikulamo, intracistemalno i intraventrikulamo.

Količina jedinjenja s terepeutskim efektom koju treba davati tokom terapije, varira, između ostalog, u odnosu na potrebnu dužinu aktivnosti i godine i stanje pacijenta koji će se liječiti, pored drugih faktora i na kraju je određuje liječnik. Međutim, uopšteno gledano, doze koje se koriste za liječenje ljudi tipično se kreću od oko 0, 001 mg/kg do oko 500 mg/kg po danu, na primjer oko 1 pg/'kg do oko 1 mg/kg po danu ili oko 1 pg/kg do oko 100 pg/kg po danu. Za gotovo sve krupne sisare,

ukupna dnevna doza kreće se od oko 1 do 100 mg, a najbolje bi bilo od oko 2 do 80 mg. Režim doziranja može se podesiti tako da obezbjeđuje optimalne terapeutske reakcije. Poželjna doza može biti propisana u jednoj dozi ili u nekoliko doza datih u odgovarajućim intervalima, na primjer u dvije, tri, četiri ili više manjih doza na dan. Ilustracije radi, jedinjenje ovog izuma može biti dato pacijentu kako bi mu se obezbjedio antiprogesterin u količini od oko 1 pg/kg do oko 1 mg/kg tjelesne težine., na primjer oko 1 µg/kg, oko 25 µg/kg, oko 50 µg/kg, oko 75 µg/kg, oko 100 µg/kg, oko 125 µg/kg, oko 150 µg/kg, oko 175 µg/kg, oko 200 µg/kg, oko

225 µg/kg, oko 250 µg/kg, oko 275 µg/kg, oko 300 µg/kg, oko 325 µg/kg, oko

350 µg/kg, oko 375 µg/kg, oko 400 µg/kg, oko 425 µg/kg, oko 450 µg/kg, oko

475 µg/kg, oko 500 µg/kg, oko 525 µg/kg, oko 550 µg/kg, oko 575 µg/kg, oko

600 µg/kg, oko 625 µg/kg, oko 650 µg/kg, oko 675 µg/kg, oko 700 µg/kg, oko

725 µg/kg, oko 750 µg/kg, oko 775 µg/kg, oko 800 µg/kg, oko 825 µg/kg, oko

850 µg/kg, oko 875 µg/kg, oko 900 µg/kg, oko 925 µg/kg, oko 950 µg/kg, oko

975 µg/kg ili oko 1 mg/kg tjelesne težine.

Pacijenti podvrgnuti liječenju jedinjenjima iz ovog izuma trebaju biti pod rutinskim nadzorom kako bi se kontrolisao njihovi nivoi estrogen seruma i glukokortikoida.

[00092] Sljedeći primjeri su samo neki od pošto jećih i navedeni su kako bi pomogli u razumijevanju pouke ovog izuma.

Primjer 1. Formula ovog izuma može se pripremiti kao tableta.

Kako bi se dobile tablete za primjenu ovog izuma, treba spojiti kompresovanjem u presi sljedeće sastojke:

10. 0 mg CDB-4124

140. 5 mg laktoze

69. 5 mg kukuruznog škroba

2. 5 mg poli-N-vinilpirolidona

2. 0 mg aerosila

0, 5 mg magnezijum stearata

Kako bi se dobile tablete za primjenu ovog izuma, treba spojiti kompresovanjem u presi sljedeće sastojke:

20. 0 mg tamoksifena

50. 0 mg CDB-4124

105. 0 mg laktoze

40. 0 mg kukuruznog škroba

2. 5 mg poli-N-vinilpirolidona 25

2. 0 mg aerosila

0, 5 mg magnezijum stearata

Kako bi se dobile tablete koje sadrže antiestrogen za primjenu ovog izuma, treba, na primjer, spojiti kompresovanjem u presi sljedeće sastojke:

10. 0 mg Raloksifena

30. 0 mg CDB-4124

125. 0 mg laktoze

50. 0 mg kukuruznog škroba

2, 5 mg poli-N-vinilpirolidona 25

2. 0 mg aerosila

0, 5 mg magnezijum stearata

Kako bi se dobili uljani preparati za primjenu ovog izuma, treba, na primjer, izmješati sljedeće sastojke i sipati ih u ampule:

100. 0 mg CDB-4124

343, 4 mg ricinusa

608, 6 mg benzil benzoata

Primjer 2. Jedinjenja ovog izuma imaju samo slabu aktivnost vezivanja receptora antiglukokortikoida.

Neki antiprogesterini ispitani su na probama vezivanja receptora kako bi se provjerila njihova sposobnost da vežu receptor progesterona kunića (rbPR) i receptor glukokortikoida (rbGR). Ukratko, citozol koji sadrži PR i GR pripremljen je u TEGMD puferu (10 mM Tris, pH 7, 2; 1, 5 mM EDTA, 0, 2 mM natrijum molibdat, 10% glicerol, 1 mM DTT) iz materice odnosno timusa nezrelih kunića pod estradiolom. Za vezivanje PR-a, citozol je bio inkubiran sa 6 nM 1, 2-[3H] progesteronom (50, 0 Ci/mmole) i dodani su konkurenti u koncetracijama od 2 do 100

nM. Za vezivanje za GR, citozol je bio inkubiran sa 6 nM 6, 7-[3H] deksametazonom (40 Ci/mmole) i dodana su opitna jedinjenja u koncetracijama od 20 do 100 nM. Nakon prekonoćnog inkubiranja na 4 °C, vezani i slobodni [3H] steroidi razdvojeni su dodavanjem ugljena obloženog dekstranom i centrifugiranjem na 2100 x g tokom 15 min na 4° C. Supstance koje su isplivale i koje sadrže [3H]-komplekse receptora steroida pretočene su u bočice sadržine 4 ml Optifluora (Packard Instrument Co. ), uvrtene su, ujednačene uz pomoć sintilatnog likvidnog čitača tokom 30 minuta a onda su prebrojavane tokom 2 minuta. EC50 (Efikasna koncentracija) za svaku standardnu krivulju i za svaku od krivulja jedinjenja određenje unošenjem podataka za čitanje u četveroparametarski sigmoidalni računarski program (RiaSmart® Immunoassay Data Reduction Program (Program smanjenja podatka imuno-opita)), Packard Instrument Co., Meriden, Conn. ). Relativni afinitet ka vezivanju (RBA) za svako jedinjenje računa se uz pomoć sljedeće jednačine: EC50 standardnog /EC50 opitnog jedinjenja x 100. Standardi za PR i GR opite bili su neobilježeni progesteron odnosno deksametazon. Rezultati tih eksperimenata sažeti su u Tabeli 1, kao proporcije relativnih afiniteta ka vezivanju svakog jedinjenja za receptore rbPR i rbGR (rbPR/rbGR). Taj diferencijal odražava relativnu aktivnost jedinjenja u ćeliji ili tkivu koje posjeduje ta dva receptora i neophodne transkripcijske kofaktore.

U Tabeli su takođe prikazane relativne biološke aktivnosti istih jedinjenja u materici kunića kroz ispitivanja anti-McGinty i anti-Clauberg. Jedinjenje CDB-2914 (lizlistano na kraju Tabele) korišteno je kao kontrolno ili referentno jedinjenje (biološka aktivnost kunića = 1, 00) za ove eksperimente zato što su rezultati eksperimenata gdje se koristi CDB-2914 već bili objavljeni ranije (Hild-Petito et ah,

1996.; Passaro et ai, 1997.; Reel et ah, 1998.; Lamer et al., 2000. ). Za ispitivanje anti-McGinty, nesazrele ženke kunića dobile su potkožno injekcije s 5pg estradiola u 10% etanol/susamovom ulju, svakog dana tokom 6 uzastopnih dana. Sedmog dana, životinje su bile podvrgnute abdominalnoj hirurgiji sterilizacije kako bi se vezalo 3-4 cm segmenta oba roga materice. Opitno jedinjenje u odgovarajućem rastvoru, ubrizgano je intraluminalno u vezani segment roga materice i samo se prebacilo u drugi. Svakom kuniću je potkožno je ubrizgana stimulativna doza progesterona (267 pg/dan) na svakodnevnoj osnovi tokom naredna tri dana kako bi se izazvala endometrijska proliferacija. Sve životinje su žrtvovane 10. dana za uklanjanje materice pri čemu je uklonjen segment u centru ligatura i štavljenje u 10% neutralni puferovani formalin i predat za izvršenje histološke procedure. Pet mikronskih sekcija bojenih hematoksilinom i kozinom mikroskopski je ispitano kako bi se provjerio stepen endometrijske proliferacije žlijezda. Procenat inhibicije endometrijske proliferacije računat je za svakog kunića i zabilježen je prosjek grupe od pet životinja. Za ispitivanje anti-Clauberg, nerazvijene ženke kunića dobijale su potkožno injekcije s 5 pg estradiola u 10% etanol/susamovom ulju, svakog dana tokom 6 uzastopnih dana. Sedmog dana, životinje su dobile potkožno progesteronske injekcije (160 pg/dan), a opitno jedinjenje oralno u odgovarajućem transporteru oralno ili potkožno, tokom pet uzastopnih dana. Jedna grupa kunića dobila je samo progesteron. Dvadeset četiri sata nakon posljednje doze, sve životinje su žrtvovane za uklanjanje materice koja je očišćena od svih masnoća i vezivnih tkiva, težine gotovo 0, 2 mg i stavljena je u 10% neutralni puferovani formalin za narednu histološku obradu. Pet mikronskih sekcija bojenih hematoksilinom i eozinom, mikroskopski je ispitano kako bi se

provjerio stepen endometrijske proliferacije žlijezda. Procenat inhibicije endometrijske proliferacije kod svakog nivoa doziranja opitnog jedinjenja, izveden je upoređivanjem samo sa životinjama koje su bile stimulisane progesteronom. Podaci prikazani u Tabeli 1 (biloška aktivnost kunića) odražavaju prosječne rezultate dobivene za svako jedinjenje putem ispitivanja anti-McGinty i anti-Clauberg koja se odnose na CDB-2914.

Ispitani antiprogestini rangirani su na osnovu selektivnosti svakog jedinjenja za PR-a kunića preko GR-a kunića, kao što se može vidjeti u Tabeli 1. Antiprogesterini su takođe rangirani na osnovu biološke aktivnosti materice kunića. Podaci prikazani u Tabeli 1 pokazuju daje afinitet vodećih jedinjenja za receptore progesterona bio barem 1, 5 puta veći nego njihov afinitet za receptore glukokortikoida.

[000100] Rezultati ovih istraživanja su pokazali su takođe da dva vodeća jedinjenja CDB-4124 i CDB-4059 imaju visoku aktivnost antiprogestina u materici kunića u poređenju s RU 486 i CDB-2914. Ijednom i drugom jedinjenj u nedostaju estrogene, androgene, anti-estrogene i anti-androgene aktivnosti. Oba jedinjenja posjeduju minimalnu aktivnost receptora anti-glukokortikoida, karakteristika koja ih razdvaja od RU 486 i CDB-2914 koji su umjereno aktivni u vezivanju receptora glukokortikoida. U tim je ispitivanjima, CDB-4124 pokazao malo bolje rezultate od CDB-4059.

TABELA 1. -VEZIVANJE RECEPTORA I BIOLOŠKE AKTIVNOSTI ANTIPROGESTINA

Primjer 3. Indukcija tumora i latentna pojava tumora.

U cilju indukcije tumora, ženkama pacova Sprague-Dawley data je doza DMBA od 10 mg/kg tjelesne težine kada su bile stare 50 dana. Jedna grupa od 14 pacova (Grupa 2) dobila je umjesto DMBA - susamovo ulje kada su bile stare 50 dana i to je trebalo poslužiti kao kontrola bez DMBA. Životinje su mjerene i opipavane jednom sedmično uz mliječnu liniju kako bi se uočio bilo koji znak lezija ili otoka. Čvorovi tumora bilježeni su i mjereni jednom sedmično i to u dvije dimenzije uz pomoć kalibarskog šestara. Kada je tumor porastao do veličine 10-12 mm u bilo kojoj dimenziji, pojedinačne životinje bi bile nasumice stavljane u jednu od 14 grupa. Tumori su se pojavili već 39 dana nakon oralnog kljukanja i najkasnije 194 dana (te kasnije pojedinačne životinje nisu uključene u ispitivanje). Prosječni latentni period za pojavljivanje tumora bio je 106 + 30 dana. Nije bilo razlike između grupa koje su dobijala DMBA u smislu latentnosti (p = 0, 545, Kruskal-Wallis test).

[000102] Životinje su bile podvrgnute tretmanu tokom 28 dana po sljedećem rasporedu. Grupa 1 dobijala je dnevne doze potkožnim (s. c) injekcijama transportera (10% etanola u susamovom ulju). Grupa 2 (kontrolna grupa bez DMBA - nisu očekivani tumori) dobijala je transporter po rasporedu o kojem je bilo odlučeno unaprijed kako bi se simulirao početak tromjesečnog tretmana. Grupe 3 i 4 dobijale su dnevne potkožne injekcije RU 486 odnosno mikronizovanog progesterona u dozi od 10 mg/kg tjelesne težine. Grupe 5 do 9 dobijale su 20 mg/kg, 10 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg odnosno 0, 1 mg/kg CDB-4124. Grupe 10 do 14 odražavale su tretman koji su dobijale grupe 5 do 9 samo što je 10 mg/kg mikronizovanog progesterona bilo dodato kao komponenta jedinjenja za injekcije.

Nivo progesterona je ocjenjivan kod životinja tri puta: u početku kada su trebali početi tretman; drugi put poslije 21 dana tretmana; i konačno poslije tretmana u toku žrtvovanja što je bilo 2-4 dana poslije posljednje potkožne injekcije. Svi uzorci krvi uzimani su putem punkcije srca; serum je pripreman i čuvan zamrznut na -40°C. Uz pomoć ELISA-e određivani su nivoi hormona steroida progesterona, kortizola i kortikosterona.

[000104] Analiza je vršena uz pomoć Statgraphics Plus. Razlika među grupama bila je određena uz pomoć ANOVA-e ukoliko su sredstva grupe bila dobro raspoređena.

U suprotnom, korišćen je Kruskal-Wallis test. Razlike u sredstvima procjenjivane su uz pomoć Studentskog testa, ukoliko su grupe ispunile kriterijum koji je podrazumijeva da nisu ni spljoštene ni asimetrične. U suprotnom, korišćen je neparametrični test Mann-Whitney-Wilcoxin. U slučaju da se radila uzastopna ocjena istih pacova, korištenje upareni t-test. U slučaju da su podaci mogli da se stave po grupama radi poređenja, korišćen je Fisherov test preciznosti.

Primjer 5. Broj i tip tumora u momentu autopsije.

Životinje su žrtvovane 3-5 dana poslije kraja 28-dnevnog tretmana, vađena je krv, tumori su uklanjani, mjerena im je težina i dužina, vršena je inspekcija, zamrzavani su komadi i/ili stavljani su u 10% fosfatni puferovani formalin za histopatologiju. Uzorci tkiva rezani su i bojeni su hematoksilinom i eosinom i procjenjivani su za histopatološku klasifikaciju.

Histološki su identifikovana četiri tipa tumora (Tabela 2): adenokarcinomi (ACAs), papilami karcinomi (PCAs), fibrosarkomi, i fibroadenomi ili adenofibromi (FA ili AF), za ove posljednje tipove tumora nije smatrano da predstavljaju direktnu malignost. Minimalni broj tumora za otpočinjanje tretmana bio je >1 s obzirom daje najveći ("glavni") tumor mogao biti praćen jednim ili nekolicinom manjim tumora koji nisu dosegli minimalnu veličinu. U Tabeli 2 sažeti su rezultati ovih eksperimenata. Broj AC A plus PC A kod pacova tretiranim samo transporterom bio je 2, 7 tumora po pacovu u vrijeme žrtvovanja (kolona ACA + PCA nije uvijek dodatak koloni ACA i PCA po pacovu pošto bi tumori mogli biti mješanih tipova)

Kao što je navedeno u Tabeli 2, Grupa 2 (kojoj nije dat karcinogen DMBA) nije imala tumore. Pacovi podvrgnuti tretmanu sa samo DMBA-om imali su u prosjeku 2, 67 tumora po pacovu. Dodavanje progesterona povećavalo je prosječan broj tumora po pacovu na skoro 5 tumora. Liječenje uz pomoć CDB-4124 imalo je velikog uticaja na smanjivanje broja tumora. Prosječan broj u četiri najviše grupe

podvrgnute tretmanu s najvećim učinkom (tj, 20, 10, 2, 1 mg/kg/danu) bio je 1, 58 tumora po pacovu. To smanjivanje broja tumora pokazuje da CDB-4124 ne samo da smanjuje rast pošto jećih tumora, već i spriječava pojavu novih tumora kod tih životinja, jer svaka životinja koja je učestvovala u tretmanu bila je odabrana slučajno na osnovu pronađenog jednog tumora date veličine

Tabela 2 - Efekat tretmana na tip tumora i broj tumora.

Primjer 6. Efekti antiprogestina na napredovanje tumora.

Kako bi se procjenili efekti CDB-4124, RU486 i progesterona na razvoj tumora i na njegovo napredovanje, tokom tretmana posmatrani su kinetika rasta i veličina tumora. Pojedinačni tumori životinja s tumorima u ispitivanju, mjereni su sedmično i to u dvije dimenzije uz pomoć kalibarskog šestara. Rezultati tih ispitivanja sažeti su na Slici 1. Podaci su ispravljeni kako bi isključili FA/AF tipove tumora koji nisu maligni. Tumori koji su se povećali u području poprečnog presjeka za bar 33% u toku 28-dnevnog perioda inspekcije, smatrani su rastućim tumorima (Slika 1, crna polja) Za tumore koji su se smanjili za oko 33% smatralo se da se povlače (Slika 1, bijela polja). Ostali se tumori smatraju statičnim (Slika 1, siva polja). Kao što se vidi na Slici 1, tretman progesteronom povećao je broj rastućih tumora dojke.

Mada je razmjera tumora koji su se povlačili u grupi kojoj je dat progesteron (8%) bila statistički ista kao i kod kontrolne grupe, razmjera rastućih tumora (80%) bila je znatno veća (p<0, 004, Fisherov test preciznosti). Tretman pomoću RU 486 doveo je do očiglednog rasta razmjere tumora koji su se povlačili u poređenju s kontrolnom grupom, iako to nije bilo statistički značajno.

1000110] Za razliku od progesterona, tretman pomoću CDB-4124 u dozama od 10 mg/kg tjelesne težine smanjuje razmjeru rastućih tumora (p<0, 013) i povećava razmjeru tumora koji se povlače (p<0, 003). Rezultati su pokazali da se 70% tumora povlačilo nakon tretmana pomoću CDB-4124. Postojala je očigledna vezanost za dozu i samo je najniža doza CDB-4124 bila bez efekta. Efekti CDB-4124 bili su poništeni kada su životinje tretirane dodatnim progesteronom u razmjeri koja je bila petostruka ili više. Progesteron koji je dat u nižoj razmjeri nije mogao poništiti efekte CDB-4124. Kada je u pitanju stopa rasta, doza od 10 mg/kg CDB-4124 bila je

efikasnija u poređenju sa 20 mg/kg, što je ukazivalo na to da bi CDB-4124 u visokim dozama mogao imati neku aktivnost agonista progesterona iako se efekti doze od 20 mg/kg preparata CDB-4124 na rast tumora nisu uspjeli približiti efektima progesterona (p=0, 0008, Fisherov test preciznosti, dvosmjerni). Međutim, doza od 20 mg/kg (ali ne i niže doze) takođe znatno povećava nivo protočnih progesterona, a efekti su zavisili od visine doze. Znači, CDB-4124 može potisnuti rast tumora izazvanih DMBA-om u mliječnoj žlijezdi pacova i to potiskivanje podrazumijeva smanjenje veličine i broja mamamih tumora. Činjenica da se sam progesteron pokazao kao proliferativan i pojačivač tumora, ilustruje važnost potiskivanja progesterona kod životinja s utvrđenim tumorom ili tumorom u nastajanju u mliječnim žlijezdama. Rezultati za CDB-4059 bili su slični gore objelodanjenima za CDB-4124 Znači, aktivnost preparata CDB-4059 koja potiskuje tumor slična je aktivnosti preparata CDB-4124 i oba jedinjenja imaju jaču potiskujuću aktivnost u odnosu na tumore nego što je to slučaj s RU 486. Kada se CDB-4124 daje samo i u umjerenoj koncentraciji ili preko progesterona, njegovi efekti su jači i podstiču povlačenje tumora. Međutim, kada se daje čist progesteron ili preko CDB-4124, efekti progesterona su rastući i pojačavajući.

Primjer 7. Broj tumora, njegova veličina i težina kod autopsije.

U Tabeli 3 vide se efekti progesterona, RU486 i CDB-4124 na tumor srednje veličine i prosječna ukupna težina tumora po životinji (težina tumora). Rezultati iz Tabele 3 su rezultati ACA, PCA i mješavine ACA/PCA, ali tumori FA ili AF su isključeni.

Progesteron očigledno povećava težinu tumora i prosječnu veličinu tumora. Međutim, vrijednosti nisu statistički značajne u poređenju s vrijednostima kontrole (p>0, 4, Mann-Whitney-Wilcoxin test). Podaci o progesteronu su u oštrom kontrastu s podacima antiprogestina. RU486 i CDB-4124 smanjuju težinu tumora i veličinu prosječnog tumora, petostruko u slučaju RU486 (p<0, 01) i desetostruko za CDB-4124 (p<0, 001). Smanjenje težine i veličine tumora kod drugih grupa bilo je dosljedno s CDB-4124-om koji je utjecao na veličinu tumora u dozama od 10, 2 i 1 mg/kg. CDB-4124 je bio neuspješan u najnižim nivoima tretmana, a najviša doza CDB-4124 (20 mg/kg) nije bila tako efikasna kao što je to bio slučaj s dozom od 10

mg/kg. Treba obratiti pažnju na to da su se neki tumori u potpunosti povukli i više se nisu mogli napipati. Među 11 tumora tog tipa, koji su praćeni tokom tretmana, na obdukciji smo našli strukture koje su bile cistične s hemoragijskom supstancom što je ukazivalo na povlačenje. Te strukture su nađene samo kod grupa podvrgnutih tretmanu RU486 (n=2), kod grupa podvrgnutih tretmanu CDB-4124 u dozi od 20, 10, 2 ili 1 mg/kg (n=7), ili u grupama podvrgnutim tretmanu u dozama od 20 mg/kg CDB-4124 plus 10 mg/kg progesterona (n=2). Pošto nisu mogli biti histološki procjenjeni, njihov identitet nije mogao biti potvrđen. Pa ipak, ti rezultati ukazuju na to da antiprogestini mogu u potpunosti da povuku tumore.

Primjer 8. Težina životinja tokom ispitivanja.

Težina kontrolnih životinja bila je poređena s težinom životinja koje su dobijale hormonske tretmane kako bi se bolje procjenila toksičnost, posebno toksičnost jedinjenja CDB-4124. Životinje su mjerene sedmično tokom 27 sedmica ispitivanja. Na kraju eksperimenta nije utvrđena velika razlika mjerenih životinja koje su bile podvrgnute terapiji u odnosu na kontrolne životinje, što ukazuje na to da CDB-4124 nije toksičan čak i u većim dozama.

Primjer 9. Proliferacija tumora i apoptoza.

Kako bi se procjenili efekti progestina i antiprogestina na proliferaciju ćelija, ispitani su uzorci tkiva izvađeni iz 46 pojedinačnih tumora pacova kod životinja koje su bile podvrgnute tretmanu i uzorci kontrolnih životinja tako što je mjerena ekspresija markera proliferacije Ki-67 uz upotrebu antitjela Ki-67

(NeoMarkeri, Fremont, CA) i imunohistohemije. Uprkos smanjenju veličine brojnih tumora iz Grupa 3 i 6 nakon tretmana u Grupama 3 i 6, zbog čega su postali premali za resekciju, 7-12 ACAs iz Grupa 1, 3, 4, 6 i 11 bili su podvrgnuti resekciji. Rezultati eksperimenta proliferacije, u kojima je proliferacija mjerena u procentima ćelija koje su pokazivale markere Ki-67, prikazani su u Tabeli 4:

Tabela 4, Ćelije tumora proliferovane putem Ki-67

Progesteron je povećao procenat ćelija u proliferaciji u poređenju s kontrolnim i životinjama podvrgnutim tretmanu sa CDB-4124. Progesteron je doveo do najviše proliferacije ćelija i taj je rast bio izvan svega što se moglo vidjeti u kontrolnoj grupi, RU486 ili CDB-4124 plus grupama s progesteronom. Tretman uz pomoć čistog CDB-4124 doveo je do smanjenog broja ćelija pozitivnih na Ki-67 nego bilo koji drugi tretman i razmjera je bila daleko manja nego što se moglo vidjeti kod kontrolne grupe. Uzorci tkiva pacova pod tretmanom CDB-4124 pokazivali su manju proliferaciju (manje ćelija pozitivnih na Ki-67) nego uzorci tkiva pacova pod

tretmanom RU 486 (p = 0, 021, t-test). Znači, CDB-4124 je jačeg dejstva nego RU 486 kada je riječ o sprječavanju proliferacije tkiva dojke (p = 0, 011, jednosmjerni t-test). Efekti CDB-4124 takođe su se razlikovali od CDB-4124 + P4 (p=0, 048, t-test). Osim toga, tretman uz pomoć CDB-4124 plus P4 doveo je do manjeg broja ćelija s proliferacijom nego sam P4 (p=0, 030, t-test). Proliferacija je opadala u grupama, sljedećim redom: progesteron (najviša proliferacija) > kontrola = RU486 = CDB-4124 + progesteron > čist CDB-4124. Znači, CDB-4124 smanjuje proliferaciju ćelija čak i u prisustvu jednake količine dodatog progesterona.

Procjenjena je apoptoza u istim tumorima uz pomoć seta za hibridizaciju apoptoze (Oncor, Gaithersburg, MD). Ćelije u apoptozi bile su procjenjene u perifernim područjima tumora i deleko od nekroze. Procijenjeno je najmanje 1. 000 ćelija po sekciji tumora. U Tabeli 5 je pokazana jasna razlika među tretiranim grupama u odnosu na kontrolne netretirane životinje:

Tabela 5. Apoptoza (% ćelija tumora u programiranoj smrti ćelija

Naknadna analiza uz pomoć testa s višestrukim dometom (Multiple Range Test) ukazuje na to daje CDB-4124 plus progesteron doveo do veće apoptoze nego što je to slučaj sa kontrolnim životinjama ili životinjama tretiranim progesteronom. Osim toga, RU486, CDB-4124 i CDB4124 plus progesteron, doveli su do veće apoptičke smrti ćelija nego što je to slučaj s kontrolnim tumorima. Efekti tretmana pomoću CDB-4124 nisu se razlikovali od onih pomoću RU486 (p=0, 73, t-test).

Slično tome, efekti CDB-4124 su bili isti kao i kod CDB-4124 + P4 (p=0, 98, t-test). Ovi rezultati sugerišu da u prisustvu otprilike istih količina progesterona tumori reaguju na antiprogestin CDB4124 s apoptozom. Nasuprot tome, CDB-4124 vodi do povećane apoptoze u poređenju s P4 (p=0, 020, t-test). Nema očiglednog sinergizma između CDB-4124 i progesterona. Sposobnost CDB-4124 da smanji proliferaciju je važna za aktivnost potiskivanja tumora CDB-4124 jer je jedna od velikih razlika između CDB-4124 i RU 486 to što CDB-4124 je smanjio proliferaciju efikasnije nego RU 486. Prekid ili potiskivanje jakog proliferativnog efekta progesterona je vjerodostojan mehanizam pomoću kojeg CDB-4124 može smanjiti proliferaciju.

Primjer 10. Ekspresija receptora estrogena i progesterona (ER-ova i PR-ova) u

tkiva tumora.

Tumori kod kojih je procjenjena proliferacija i apoptoza, kod njih je takođe ispitana i ekspresija receptora estrogena i progesterona pomoću imunohistohemije (IHC). Određenje i analiziranje procenat ćelija pozitivnih na ER ili PR. Tumori su bili grupisani u četiri različite kategorije: tumori s 0% ćelija koje su izražavale ER, tumori s 10% ćelija koje su izražavale ER, tumori s 15 do 30% ćelija

koje su izražavale ER i tumori s 30-50% ćelija koje su izražavale ER. U načelu, netretirani tumori dosljedno su izražavali ER. Od 12 analiziranih tumora, svih 12 je izražavalo ER. Četiri od tih 12 tumora sadržavalo je 30-50% ćelija pozitivnih na ER. Nasuprot netretiranim kontrolnim tumorima, 3 od 7 analiziranih tumora tretiranih uz pomoć CDB-4124 nije sadržavalo ćelije koje su izražavale ER, nijedna nije sadržavala 30-50% ćelija koje izražavaju ER i samo je jedan uzorak sadržavao 15-30 procenata ćelija pozitivnih na ER. Znači, tretman s RU 486 ili CDB-4124 smanjuje broj ćelija koje izražavaju ER-ove.

[000119] Tretman progesteronom je kao rezultat imao povećanje broja ćelija koje izražavaju ER u poređenju s uzorcima životinja tretiranih sa CDB-4124 ili RU 486. Kombinacija CDB-4124 i progesterona imala je tendenciju stvaranja obrasca sličinijem obrascu tretmana čistim CDB-4124. Taj je rezultat u skladu sa zaključcima daje kombinacija doza od 10 mg/kg CDB-4124 + 10 mg/kg progesterona imala efekt potiskivanja tumora, uključujući i smanjenje broja tumora, inhibiciju rasta tumora i smanjenje težine tumora. U načelu, dugoročni tretman antiprogestinom ima tendenciju spuštanja nivoa ER u tumorima, dok progesteron ima tendenciju da ide u suprotnom pravcu.

Primjer 11. Ekspresija receptora progesterona (PR) u tumorima.

Netretirani tumori dosljedno su izražavah PR (12/12 tumora). U načelu, netretirani tumori izražavaju oba receptora, i ER i PR, stoga je moguće da mnogi maligni tumori izražavaju ova dva transkripcijska faktora. Tretman sa RU 486 izgleda da djeluje neutralno na PR, a CDB-4124 je smanjio nivo ekspresije PR-a.

Interesantno je daje kod tri tumora, RU 486 doveo do gubitka ER-a, ali su zadržani niski pozitivni nivoi PR-a. Progesteron ima tendenciju da podiže ekspresiju PR-a. Kombinacija CDB-4124 i progesterona ima tendenciju da stvara obrazac sličniji onime čistog CDB-4124; što je u skladu s efektima kombinacije doze od 10 mg/kg CDB-4124 + 10 mg/kg progesterona na broj tumora, obrazac rasta i težinu tumora. U načelu, dugoročni tretman s CDB-4124 ima tendenciju spuštanja nivoa PR u tumorima, dok progesteron ima tendenciju da ide u suprotnom pravcu. Znači, tumori zadržavaju reakcije na progesteron u prisustvu progesterona.

Primjer 12. Ispitivanje efekata antiprogestina na nivoe hormona u serumu.

Koncentracije hormona steroida određene su tri puta tokom ispitivanja: prije početka tretmana, nakon 21 dana tretmana i konačno poslije tretmana na žrtvovanju, što je bilo oko 2-4 dana nakon posljednje potkožne injekcije. Svi uzorci su uzeti punkcijom srca. Dobijen je serum i držan je zamrznut na -40 °C. Nivoi hormona steroida određeni su uz pomoć ELISA-e.

Rezultati mjerenja progesterona kod pacova prikazani su u Tabeli 6: Tabela 6: Uticai tretmana na serum progesterona _

Nije primjećena razlika u nivoima serum progesterona između grupa prije tretmana (p=0, 49, ANOVA) ili nakon tretmana (p=0, 35, ANOVA), ali su otkrivene znatne promjene s tretmanom (p=0, 000, ANOVA). Mnogi režimi su podigli progesteron u poređenju s kontrolama, posebno u grupama koje su dobijale najviše količine RU486 i CDB-4124 (Tabela 6). Znatne razlike koje su nastale među gmpama tretiranim tokom 21 dana bile su specifične za sljedeće grupe (p = 7 x 10-6, Kruskal-Wallis test): RU 486, najviše tri doze CDB-4124 jedinjenja i najviše dvije doze CDB-4124 plus progesteron. CDB-4059 nije doveo po povišenih nivoa seruma progesterona u odnosu na nivo prije tretmana na testiranoj dozi od 10 mg/kg. Serum progesterona se vratio na nivo nultog dana za sve grupe osim za grupu koja je dobijala CDB-4124 u dozama od 20 mg/kg plus progesteron, koja nije uspjela pokazati pad seruma progesterona kada je došlo do obustave tretmana (p=0, 004, upareni t-test, jednosmjerni). Neuspješnost čistog progesterona da podigne sopstvenu koncentraciju seruma bila je zbunjujuća, ali je moguće daje izazvana činjenicom da je visoko egzogeni progesteron potisnuo endogenu proizvodnju. Egzogeni

progesteron je takođe mogao biti metabolizovan između potkožne injekcije i vađenja krvi koje je izvršeno 20-24 sata kasnije. Nedostatak efekta jedinjenja CDB-4059 u koncentracijama od 10 mg/kg na nivoe endogenog progesterona kod žena, može imati prednost u odnosu na CDB-4124 u takvoj koncentraciji.

Primjer 13. Mjerenje kortizola.

Nekoliko različitih eksperimentalnih sistema idu u prilog zaključku da RU 486 povećava kortizol jer RU 486 kod ljudi i primata ima jaka anti-glukokortikoidna svojstva.

Međutim, pacovi koji su liječeni pomoću RU 486 u dozi od 10 mg/kg nisu pokazali značajne razlike u nivoima kortizola. Suprotno tome, pacovi koji su liječeni bilo jedinjenjem CDB-4124 ili jedinjenjem CDB-4059 u istim dozama, pokazali su znatno više nivoe kortizola seruma nego pacovi iz kontrolne grupe.

Ti viši nivoi kretali su se od 3-4 ug/dl (30-40 ng/ml). Efekti su zavisili od doze u smislu daje veća doza CDB-4124 vodila do povećanog kortizola.

Ta razlika u uticajima RU 486 naspram CDB-4124 ili CDB-4059 na nivoe kortizola, može se objasniti ako se pretpostavi daje nakon 21 dana stalnog doziranja, jetra pacova mogla da metabolizuje bolje RU 486 nego bilo koje od ova dva CDB jedinjenja.

Primjer 14. Mjerenje kortikosterona.

Kortikosteron je najobilniji glukokortikoid kod pacova. Uticaji SPRM-ova na kortizol mogu biti sekundarni u odnosu na jake efekte po kortikosteron. Kako bi se

ovaj fenomen mogao bolje ispitati, nivoi kortikosterona mjereni su u grupama, što je pokazalo najveće promjene u nivoima kortizola, kao što su grupe podvrgnute tretmanu pomoću CDB-4124 u dozama od 20 mg/kg ili 10 mg/kg. Poređenja radi, sljedeće grupe bile su takođe podvrgnute ispitivanju: grupa koja je dobila 20 mg/kg CDB-4124 plus 10 mg/kg progesterona, grupa koja je dobila 10 mg/kg CDB-4124 plus 10 mg/kg progesterona, grupa koja je dobila 10 mg/kg RU 486, grupa koja je dobila 10 mg/kg čistog progesterona, kontrolna grupa i grupa koja nije dobila DMBA i koja nije imala tumore. Nivoi kortikosterona bili su 10-40 puta viši nego nivoi kortizola. Međutim, gotovo da nije primjećena razlika među grupama kada su u pitanju prosječni nivoi kortikosterona. Nije bilo razlike među 8 grupa prije tretmana (p = 0, 43, ispitivanje Kruskal-Wallis), 21 dan nakon tretmana (p = 0, 57, ispitivanje Kruskal-Wallis), ili 28 dana poslije tretmana i kod žrtvovanja (p = 0, 061, ispitivanje Kruskal-Wallis). Nije bilo statističke razlike u nivoima kortikosterona među životinjama s tumorima i bez tumora, ni na 21 dan (p = 0, 94, t-test, dvosmjerni) ni kod žrtvovanja (p = 0, 37, t-test, dvosmjerni).

Kako bi se mjerili efekti egzogenog progesterona na serumu kortikosterona, poređeni su nivoi kortikosterona u 3 uparene grupe koje su se razlikovale po tome da li su dobile egzogeni progesteron (npr. poređenja kontrolne naspram progesterona ili CDB-4124 u dozi od 20 mg/kg naspram CDB-4124 u dozi od 20 mg/kg plus progesteron, ili CDB-4124 u dozi od 10 mg/kg naspram CDB-4124 u dozi od 10 mg/kg plus progesteron). Uočena je statistički značajna razlika: nivoi kortikosterona bili su sniženi kod životinja koje su bile izložene tretmanu progesteronom posle 21 dana tretmana (p = 0, 029, test Mann-Whitney Wilcoxon,

dvosmjerni). Taj efekt nije provjeren na uzorcima krvi kod žrtvovanja. Nije uočena razlika u serumu kortikosterona između grupe s progesteronom i grupa CDB-4124, grupa s progesteronom i RU-486, ili grupa RU-486 i CDB-4124.

Ispitan je i odnos između seruma kortizola i seruma kortikosterona u svakoj ispitanoj grupi. Postojala je jaka pozitivna linearna korelacija između njih za CDB-4124 sa 20 mg/kg (r2 = 0, 78), za CDB-4124 sa 10 mg/kg (r2 = 0, 82), i za RU 486 (r2 = 0, 85). Dodavanje progesterona u prve dvije grupe CDB-4124 daleko je oslabilo odnos (r2 = 0, 34 za grupu 10 i r2 = 0, 37 za grupu 11). Sam progesteron nije pokazao takav pozitivan odnos (r2 = -1, 0). Kontrolna grupa nije pokazala odnos između ta dva glukokortikoida (r = 0, 064). Znači, povišeni nivoi kortizola u grupama koja su dobijale CDB-4124 u korelaciji su s nivoima kortikosterona, vjerovatno zbog konverzije iz kortikosterona koji se na neki način povećao. To je dosljedno efektu jedinjenja CDB-4124 koje se može vidjeti iz gorenavedenog: uticaj na metaboličke enzime odgovorne za nivoe progesterona i kortizola.

Iako nije pronađen jak uticaj CDB-4124 na primami glukokortikoid pacova, ipak bi pacijent koji je dobio CDB-4124 ili CDB-4059, iz sigurnosnih razloga, trebao biti praćen u Fazi I kliničkih ispitivanja zbog mogućih anti-glukokortikoidnih efekata uključujući i moguće povećanje u serumu kortizola, kortikosterona ili ACTH.

Primjer 15. Ispitivanje antiproliferativnih efekata SPRM-ova u ćelijama raka dojke

otpornim na tamoksifen.

Korištene su dvije ćelijske linije: MCF-7 (ćelijska linija osjetljiva na antiestrogen, tamoksifen) i LY-2 (varijanta MCF-7 otpornog na tamoksifen). Proliferacija je mjerena u 96 bunarčića mikrotitar ploča. 5X103 ćelije dodate su svakom bunarčiću. Bunarčićima s Perkin Elmer Cetus PRO/PETTE dodaje se hranljivi medijum i rastvori lijekova. Hranljivi medijum je IMEM kojem je dodato 5% fetalnog goveđeg seruma. Ispitano je osam koncentracija lijekova, u duplikatu, od 0, 078 µM do 10 µM. Uzorci uključuju sam tamoksifen, svako od jedinjenja ove specifikacije i kombinacije tamoksifena.

Nakon četvorodnevne inkubacije, medijum se zamjenjuje svježim medijumom koji sadrži lijek, a nakon ukupno sedam dana, monoslojevi ćelije učvršćeni su trihlor-sirćetnom kiselinom i bojeni su sulforodaminskom bojom. Apsorbovanje (492 nm) ekstraktovanih rastvora boje mjeri se uz pomoć Titertek Multiscan čitača ploče. Izrađene su krivulje reakcija doza (procenat kontrolnih apsorpcija nasuprot koncentracijama lijekova) kako bi se procjenile IC50 vrijednosti defmisane kao koncentracije lijekova (mikromolame) koje su inhibirale 50% proliferacije. IC50 vrijednosti u korelaciji su s potencijalom ispitanog lijeka kada je riječ o inhibiranju ćelijske proliferacije i stoga daju informacije koje su potrebne za identifikovanje jedinjenja pogodnih za sprječavanje hiperproliferacije ćelija raka dojke otpornih na tamoksifen.

Primjer 16. Antiproliferativni efekt jedinjenja CDB-4124 i inhibitora aromataze DL-aminoglutetimida u ćelijama raka dojke T47D s pretjeranom ekspresijom

aromataze.

Inhibicija aromataze je postala prva linija tretmana za pacijente s rakom dojke pozitivne na receptor steroida. Određivanje efikasnosti inhibitora aromataze in vitro pokazalo se teškim pošto su poznate ćelije raka dojke pokazale veoma slabu aktivnost aromataze. Znači daje ćelijska linija T47D s pretjeranom ekspresijom aromataze bila stvorena kloniranjem gena aromataze (hCYP19Al) iz ljudskog placentalnog cDNK u vektor mamalne ekspresije pcDNK3. 1 i stabilnim transficiranjem ćelije raka dojke T47D zadržavajući prazan vektor kao kontrolu. Redosljedni podaci ponovnog kombinovanjapcDNK3. 1 koji nosi hCYP19Al pokazali su 100% Blast hit (Eksplozivni udarac) u područja hCYP19Al ORF. Ćelije transficirane aromatazom bile su analizirane i odabrane za prekomjernu ekspresiju aktivnih proteina aromataze. Ekspresiju aromataze jednoćelijskog klona (T47Darom) potvrdio je RT-PCR, Westem blot, Estrone ELISA, i ispitivanja proliferacije ćelija. RT-PCR je pokazao oko 32-struko višu ekspresiju aromataze mRNK u T47Darom u odnosu na roditeljske ćelije T47D, pokazujući visoku ekspresiju aromataze mRNK sa ili bez indukcije testosterona. Ekspresija proteina aromataze 58 kD potvrđena je analizom Western blot, koristeći mišja monoklonalna antitjela antiaromataze. U kontrolnim ćelijama T47D nije otkrivena ekspresija aromataze. Jaka aktivnost aromataze u ćelijama T47Darom, potvrđena je uz pomoć seta Estrone ELISA. Ukratko, u poređenju sa kontrobiim ćelijama T47D, otkriveni su visoki nivoi estrona kod tretmana sa 10 nM androstendiona tokom perioda od 24 sata. Estron ELISA pokazuje manju apsorpciju kod 450nM za T47Darom ćelije u poređenju s T47D kontrolnim ćelijama.

T47Darom ćelije postavljene su na ploče s 24 bunarčića sa po 10. 000 ćelija po bunarčiću, zatim su bile dva dana u inkubaciji, nakon čega su bile podvrgnute tretmanu sa CDB-4124 u koncentraciji od 1 µM, 2 µM, 3 µM, 4 µM i 5 µM tokom perioda od 4 dana u normalnim uslovima kulture (10% FBS lišen ugljena/srednji MEM bez fenola). Za kontrolu su korištene ćelije koje nisu bile izložene tretmanu. Za mjerenje ćelijske proliferacije korišteno je ispitivanje s kristal violetom. Boja u ovom ispitivanju, kristal violet, ostavlja markere na DNK. Nakon solubizacije, količina boje koju su ćelije primile može se kvantifikovati na spektrofotometru. Tretman s CDB-4124 inhibirao proliferaciju T47Darom ćelija u zavisnosti od doze koja je data. Vidi Sliku 2.

T47Darom ćelije postavljene su na ploče s 24 bunarčića sa po 10. 000 ćelija po bunarčiću, zatim su bile dva dana u inkubaciji, nakon čega su bile podvrgnute tretmanu sa 50 µM, 75 µM, 100 µM, ili 150 µM DL-aminoglutetimida (AGM) u prisustvu 1 nM testosterona tokom perioda od 4 dana u normalnim uslovima kulture i mjereni su efekti na ćelijsku proliferaciju. Rezultati su prikazani na Slici 3.

T47Darom ćelije postavljene su na ploče s 24 bunarčića sa po 10. 000 ćelija po bunarčiću, zatim su bile dva dana u inkubaciji, nakon čega su bile podvrgnute tretmanu sa: (1) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 1 µM CDB-4124; (2) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 2 µM CDB-4124; (3) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 3 µM CDB-4124; ili (4) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 4µM CDB-4124, tokom perioda od 4 dana u normalnim uslovima kulture u prisustvu 1 nM testosterona i mjereni su efekti na ćelijsku proliferaciju. Rezultati su prikazani na Slici 4. Inhibicija ćelijske proliferacije tokom tretmana kombinacijom

AGM-a i CDB-4124, zavisila je od doze koja je data. Iznenađujući je singergistički efekt kombinacije AGM-a i CDB-4124 u inhibiranju ćelijske proliferacije raka dojke koje izražavaju aromatazu. Na Slici 4 vidi se daje gotovo 70% inhibicija ćelijske proliferacije primijećeno kod kombinacije od 4 µM CDB-4124 i AGM-a u poređenju s manje od 30% inhibicija zabilježenih kod istih jedinjenja u istim koncentracijama, pojedinačno. Drugim riječima, inhibicija proliferacije ćelija koja je primijećena tokom tretmana kombinacijom AGM-a i CDB-4124, bila je veća nego što se moglo očekivati s obzirom na inhibicije primjećene kod primjene samog AGM-a ili CDB-4124.

Ovi rezultati pokazuju da CDB-4124 u visokim dozama, zajedno s inhibicijom aromataze ukazuje na sinergistično poboljšane hemoterapijske efekte kod tretmana raka dojke. Slični sinergistični efekti na ćelijsku proliferaciju mogli bi se očekivati kada se primjenjuje kombinacija CDB-4124 s drugim inhibitorima aromataze.

Claims (14)

1.    CDB-4247 (21-propioniloksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

2. CDB-4361 (21-vinilski eter-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

3. CDB-4059 (21-acetoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:

4. CDB-4124 (21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 6.    CDB-3876 (21-hlor-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna- 4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 7. CDB-4058 (21-flour-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna- 4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 8. CDB-4030 (21-metil-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna- 4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 9. CDB-4152 (21-hidroksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 11.    CDB-4101 (21-metoksitio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)- 19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 12. CDB-4110 (21-acetonid-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19- 13. CDB-4111 (21-BMD-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 14. CDB-4125 (21-(Cyp*-hidroksi)-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19- *Cyp = 3-Ciklopentilpropioniloksi- 15.    CDB-4205 (3-hidroksiamin-21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N- dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 16. CDB-4206 (3-hidroksiamin-21-acetoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-formulom: 17.    CDB-4226 (3-hidroksiamin-21-etiloksi-17α-acetoksi-l lp-(4 N, N- dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 18.    CDB-4262 (3-metoksiamin-21-etiloksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N- dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 19. CDB-4223 (21-metilthio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 20. CDB-4119 (4-benzoin-21-acetiltio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 21. CDB-4239 (4-benzoin-21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom stmktumom formulom: 22. CDB-4306 (21-glicinat-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 23. CDB-4352 (21-cianotio-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19 norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom: 24. CDB-4362 (21-metoksiacetil-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) sa sljedećom strukturnom formulom:    11 (3-monodemetilizovani derivativi 24 gore navedena jedinjenja (tj. jedinjenja u kojima je X N-metilamino) takođe su posebno korisna u primjeni ovog izuma. U vezi toga, za CDB-4453 (21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4-N-metilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion), monodemetilski derivat CDB-4124-a, pokazalo se da posjeduje čak i nižu anti-glukokortikoidnu aktivnost nego njegov srodnik. Attardi et al., 2002., Mol. Cei. Endokrin. 188: 111-123, čija sadržina je priložena u dodatku radi reference. Mada se daje prednost jedinjenjima opšte, gore navedene, formule i njihovim monodemetilskim derivatima, u primjeni se ovog izuma može koristiti bilo koji antiprogestin zbog svog antagonističkog dejstva na receptor progesterona, ukoliko je antiprogestin u stanju da inhibira proliferaciju tkiva raka dojke. Antiprogestin ima, po mogućstvu, nisku antiglukokortikoidnu aktivnost. Antiprogestin ima, po mogućstvu, minimalnu estrogensku i antiestrogensku aktivnost. Antiprogestini koji mogu biti korisni za ovaj izum uključuju, između ostalog, asoprisnil (benzaldehid, 4-[(11β, 17β)-17-metoksi-17-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-l l-il]-l-(E)-oksim; J867), njegov metabolit J912 (4-[17β-hidroksi-17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-( 1 E)-oksim), i ostala jedinjenja opisana u DE 43 32 283 i DE 43 32 284; CDB-2914 (17α-acetoksi-1 l|3-(4-N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion) i druga jedinjenj a opisana u Stratton-u et al., 2000., Hu. Reprod. 15: 1092-1099; JNJ-1250132 i ostala jedinjenja opisana u Allan et al., 2006., Steroidi 71: 949-954; 5-Aril-l, 2-dihidrohromen[3, 4-f]kinolini, opisano u Zhi et al., 1998., J. Med. Hem. 41: 291-302; l, 4-dihidro-benzo[d][l, 3]oksazin-2-oni, opisano u američkom patentu U. S. Patent br.: 6, 509, 334, 6, 566, 358 i 6, 713, 478 u Zhang et al.; l, 3-dihidro-indol-2-oni opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 391, 907 u Fensome et al; 2, 3-dihidro-lH-indoli opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 417, 214 u Ulrich et al.; benzimidazoloni i njihova analogna jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 380, 235 u Zhang et al.; 2, 1-benzisotiazolin 2, 2-dioksidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 339, 098 u Collins et al.; ciklokarbamati i ciklo-amidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br.: 6, 306, 851 i 6, 441, 019 u Santilli et al.; ciklična urea i ciklični derivati amida opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 369, 056 u Zhang et al.; i derivati kinazolinona i benzoksazina opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 6, 358, 948 u Zhang et al. Drugi antiprogestini koji se mogu koristiti u izumu podrazumijevaju, između ostalog, (6a, 11β, 17β)-l l-(4-dimetilaminofenil)-6-metil-4’, 5’-dihidrospiro[estra-4, 9-dien-17, 2’(3’H)-furan]-3-on (ORG-31710) i ostala jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 871, 724; (1 ip, 17α)-l l-(4-acetilfenil)-17, 23-epoksi-19, 24-dinorkola-4, 9, 20-trien-3-one (ORG-33628); (7β, 11β, 17β)-11 -(4-dimetilaminofenil-7-metil]-4,, 5’-dihidrospiro[estra-4, 9-dien-17, 2’(3’H)-furan]-3-on (ORG-31806) i druga jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 921, 845; ZK-112993 i druga jedinjenja opisana u Michna et al, 1992, J. Steroid Biohem. Molek. Biol. 41: 339-348; ORG-31376; ORG-33245; ORG-31167; ORG-31343; RU-2992; RU-1479; RU-25056; RU-49295; RU-46556; RU-26819; LG1127; LG120753; LG120830; LG1447; LG121046; CGP-19984A; RTI-3021-012; RTI-3021-022; RTI-3021-020; RWJ-25333; ZK-136796; ZK-114043; ZK-230211; ZK-136798; ZK-98229; ZK-98734; i ZK-137316. U izumu mogu biti korisni i drugi antiprogestini uključujući, između ostalog, i jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br.: 4, 386, 085, 4, 447, 424, 4, 519, 946 i 4, 634, 695; sa sadržanim fosforom 17β-sporedni lanac analognih mifepristona kao što je opisano u Jiang et al, 2006., Steroidi 71: 949-954; onapriston (1 l(3-[p-(dimetilamin)fenil]-17α-hidroksi-17-(3-hidroksipropil)-13a-estra-4, 9-dien-3-on) i druga jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 780, 461; lilopriston (((Z)-11β-[(4-dimetilamin)fenil]-17β-hidroksi-17α—(3-hidroksi-l-propenil)estra-4, 9-dien-3-on) i ostala jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 609, 651; 17β- substituisanih 19-norsteroida poput 11β-(4-metoksifenil)-17β-hidroksi-17α-etinil-4, 9-estradien-3-on opisano u Belagner et al., 1981., Steroidi 37: 361-382; 11β-aril-4-estrena poput (Z)-11β-[(4-dimetilamino)fenil)]-17β-hidroksi-17α-(3-hidroksi-l-propenil)estr-4-en-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 728, 689; derivati 11β-aril-estrena opisani u američkom patentu U. S. Patent br.: 5, 843, 933 i 5, 843, 931; derivati 11-benzaldoksim-estra-diene poput 4-[17β-metoksi-17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-l-(E)-oksim opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 693, 628; 1 l-benzaldoksim-17β-metoksi-17α-metoksimetil-estradien derivativi poput 4-[17β-metoksi- 17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-1 -(E)-[0-(etilamin)karbonil]oksim opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 576, 310; S-substitut za 11β-benzadoksim-estra-4, 9-diene-tiolestre karbonične kiseline poput 4-[ 17β-metoksi-17α-(metoksimetil)-3-oksoestra-4, 9-dien-11β-il]benzaldehid-1 -(E)-[0-(etiltio)karbonil]oksim, opisano u WO 99/45023; esteri steroida poput (Z)-6’-(4-cianofenil)- 9, 11α-dihidro-17β-hidroksi-17α -[4-(l-okso-3-metilbutoksi)-l-butenil]4’H-nafto[3’, 2’, r; 10, 9, l l]estr-4-en-3-on opisani u DE 19652408, DE 4434488, DE 4216003, DE 4216004 i WO 98/24803; fluorisani steroidi 17α-alkilnog lanca poput 11β-(4-acetilfenil)-17β-hidroksi-17α (l, l, 2, 2, 2-pentafluoroetil)estra-4, 9-dien-3-on opisano u WO 98/34947; 17-spirofuran-3’-iliden steroidi poput 1 lbeta-(4-Acetilfenil)-19, 24-dinor-17, 23-epoksi-17alfa-kola-4, 9, 20-trien-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 292, 878; (Z)-l 1 beta, 19-[4-(3-piridinil)-o-fenilen]-17beta-hidroksi-17α-[3-hidroksi-1 -propenil]-4-androsten-3-on i druga jedinjenja opisana u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 439, 913; gonani 13-alkil-11-beta-fenil poput 1 lbeta-[4-(l-metiletenil)phenil]-17α-hidroksi-17beta-(3-hidroksipropil)-13a-estra-4, 9-dien-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 446, 036; 11-arilsteroida poput 4’, 5’-Dihidro-l lbeta-[4-(dimetilamino)fenil]-6beta-metilspiro[estra-4, 9-dien-17beta, 2’(3’H)-furan]-3-on opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 4, 921, 845; 11-beta-aril-estradieni opisani u U. S Patent br.: 4, 829, 060, 4, 814, 327 i 5, 089, 488; 11 -beta-aril-4, 9 gonadini i 11-beta-aril-13-alkil-4, 9-gonadini opisani u U. S. Patent br.: 5, 739, 125, 5, 407, 928 i 5, 273, 971;; steroidi 11 -beta-aril-6-alkil (ili alkenil ili alkinil) opisani u EP 289073; 10-beta, l 1-beta premošteni steroidi, opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 093, 507; 1 l-beta-aril-14-beta-steroidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 244, 886; 19, 11-beta-premošteni steroidi opisani u američkom patentu U. S. Patent br: 5, 095, 129, 5, 446, 178, 5, 478, 956 i 5, 232, 915; 1-arilsulfonil, arilkarbonil i l-arilfosfonil-3-fenil-l, 4, 5, 6-tetrahidropiridazini opisani u američkom patentu U. S. Patnet br. 5, 684, 151; 1-arilsulfonil, arilkarbonil i ariltiokarbonil piridazino derivati opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 753, 655; derivati l, 2-dihidro-[l, 2-g]kinolin i derivati 1, 2-dihidro-hromeno-[3, 4-f]kinolin opisani u američkom patentu U. S. Patent br.

5. 688. 808.,    5, 693, 646, 5, 693, 647, 5, 696, 127, 5, 696, 130 i 5, 696, 133; oksa-steroidi 6 dobijeni od (8S, 13S, 14R)-7-oksa-estra-4, 9-dien-3, 17-dion 1 opisano u Kang et al., 2007.,    Bioorg.: Med. Hem. Slo. 15: 907-910; i 7-oksa-steroidi 4 opisani u Kang et al., 2007.,    Bioorg. Hem. Slo. 17: 2531-2534. U svom prioritetnom obliku, antiprogestin je CDB-4059 (21-metoksi-17α-acetoksi-17β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion). U svom posebno prioritetnom obliku, antiprogestin je CDB-4124 (21-metoksi-17α-acetoksi-11β-(4 N, N-dimetilaminofenil)-19-norpregna-4, 9-dien-3, 20-dion). Antiprogestin, po mogućstvu, smanjuje broj proliferirativnih ćelija na svakih sto ćelija u ćelijskoj liniji raka dojke za najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Ćelijska linija raka dojke može biti osjetljiva na tamoksifen kao što MCF-7 ili otporna na tamoksifen poput LY-2. U svom drugom obliku ovaj izum pokazuje postupke koji se mogu koristiti za identifikovanje jedinjenja koja posjeduju selektivnu aktivnost vezivanja receptora progesterona. Ti postupci podrazumijevaju vezivanje receptora i in vivo bioloških proba poput anti-McGinty, anti-Clauberg, glukokortikoidne, estrogene, androgene, anti-glukokortikoidne (AG), anti-estrogene, i anti-androgene aktivnosti kao i post-koitalne i anti-ovulacijske aktivnosti, koje se koriste u vodećim jedinjenjima ovog izuma kao referenca. U drugim svojim oblicima, ovaj izum pokazuje da se takođe mogu analizirati potencijalni antiprogesteroni za transkripcionu aktivnost u ljudskim ćelijama. Kada se antiprogestini objelodanjeni u ovom izumu koriste kao referenca, ova analiza može pružiti informacije o (1) interakciji probnog jedinjenja s receptorom progesterona, (2) interakciji aktiviranog receptora progesterona s drugim transkripcijskim faktorima i (3) aktivnosti transkripcijskog kompleksa u elementu reakcije progesterona (PRE). U tim opitima, može doći do ko-transfekcije plasmida koji izražava ljudsku izoformu PR-B-a (hPR-B) s bilo kojim prenosiocem koji je svakom iskusnom stručnjaku poznat kao PRE-zavistan promoter u HeLa, HepG2 ili T47D ćelijama. Ti prenosioci podrazumijevaju, između ostalog, luciferazu, beta-galaktosidazu, zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein ili žuti fluorescentni protein. Nakon transfekcije, ćelije se tretiraju ili probnim jedinjenjem ili jednim od antiprogestina koji su objelodanjeni u ovoj primjeni, što se koristi kao pozitivna kontrola. Nakon tretmana, ćelije se testiraju za ekspresiju prenosioca. U svom drugom obliku, ovaj izum pokazuje da se budući antiprogestini mogu testirati na sposobnost da spriječe deksametazonom izazvanu smrt ćelija u ljudskoj limfocitnoj ćelijskoj liniji CEM-7 i porediti s efektima antiprogestina objelodanjenih u ovoj specifikaciji. U tim se ogledima može dodati koncetracija deksametazona, koja može dovesti do smrti ćelije. Te se ćelije zatim tretiraju ili s RU486, jednim od antiprogestina ovog izuma ili probnim jedinjenjem čija koncentracija treba biti između 10-6 i 10-8 M.    Jedinjenja antiprogestina koja mogu da se koriste u skladu s ovim izumom, mogu biti sintetizovana uz pomoć sintetičke hemijske tehnike koja je stručnjacima poznata kao tehnika objelodanjena u U. S. Patent br. 6, 861, 415. Treba razumijeti da izvjesne funkcionalne grupe mogu imati interference s drugim reaktantima ili reagensima pod uslovima koji omogućuju reakciju, te im je možda potrebna privremena zaštita. Upotreba zaštitnih grupa opisana je u "Zaštitnim grupama organske sinteze" (Protective Groups in Organic Synthesis), 2. izdanje T. W. Greene & P. G. M. Wutz, Wiley-Interscience (1991. ).    U jednom obliku, jedinjenja izuma podrazumijevaju jedan ili više antiprogestina ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Zavisno od uslova za razvoj, jedinjenje soli koje je dobijeno može biti u neutralnom ili u slanom obliku. Oblici soli podrazumijevaju hidrate i druge rastvore kao i kristalne polimorfe. U skladu s ovim izumom, mogu se koristiti i baza u slobodnom obliku i soli ovih krajnjih proizvoda.    Soli jakih kiselina mogu same po sebi da se promjene u slobodnu bazu, koristeći osnovne agense poput alkala ili razmjenom jona. Dobijena slobodna baza može takođe formirati i soli s organskim ili neorganiskim kiselinima. Prilikom pripreme soli jakih kiselina, koriste se po mogućstvu takve kiseline koje stvaraju odgovarajuće farmaceutski prihvatljive soli. Primjeri takvih kiselina su sljedeće kiseline: hlorovodonična, sumporna, fosforska, azotna, alifatična, aliciklično karboksilne ili sulfonske, kao što su mravlja kiselina, sirćetna, propionska, sukcinatna, glikolna, mlečna, malična, vinska, limunska, askorbinska, glukoronska, fumama, maleinska, hidroksi-maleinska, pirovinska, aspartična, glutaminska, p-hidroksibenzoinska, embonska, etansko-sulfonska, hidroksi-etano-sulfonska, fenil-sirćetna, bademova, alogen-bensen-sulfonska, toluensko-sulfonska, galaktarična, galakturonična ili naftalinsko-sulfonska kiselina. U skladu s ovim izumom, mogu se koristiti svi kristalni polimorfi. |00049] U skladu s ovim izumom mogu se koristiti i soli jakih baza i mogu biti pripremljene spajajući kiselinu u slobodnom obliku s dovoljnom količinom željene baze kako bi se proizvela so na konvencionalni način. Kiselina u slobodnom obliku može se regenerisati spajanjem oblika soli s kiselinom i izolovanjem slobodne kiseline na konvencionalni način. Farmaceutski prihvatljive soli jakih baza stvaraju se s metalima ili aminima, poput alkala i zemno alkalnih metala ili organskih amina. Primjeri metala koji se koriste kao kationi jesu natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum i slični. Primjeri odgovarajućih amina jesu amino kiseline poput lizina, holina, dietanolamina, etilenediamina, N-metilglukamina i slično. Jedinjenja iz ovog izuma mogu biti pripremljena u obliku doze ili doza pogodnih za oralnu, parenteralnu, transdermalnu, rektalnu, transmukozalnu ili topikalnu primjenu. Parenteralno uzimanje jedinjenja podrazumijeva, između ostalog, intravenozno, intraarterijsko, intraperitonealno, potkožno, intramuskulamo, intratekalno i intraartikulamo. Izrazi "oralno davanje" ili "isporučivo oralno" ovdje u tekstu uključuju svaki oblik davanja terapeutskog agensa ili njegovog jedinjenja osobi kada se agens ili jedinjenje stavljaju u usta te osobe, bez obzira da li se agens ili jedinjenje moraju progutati ili ne. Znači, "oralna primjena" podrazumijeva davanje kroz usta, pod jezik ili u jednjak (npr. inhalacijom). U nekim drugim oblicima, jedinjenja ovog izuma formulisana su kao rektalni supozitoriji, koji mogu sadržavati supozitorijske osnove, uključujući, između ostalog, kakao maslac ili gliceride. Jedinjenja ovog izuma mogu biti formulisana i za inhalaciju, koja može biti, između ostalog, i u sljedećim oblicima: rastvor, suspenzija ili emulzija, čije davanje može biti i u obliku suvog praška ili u obliku aerosola koji koristi pokretače poput dihlorofluorometana ili trihlorofluorometana. |00054] Jedinjenja ovog izuma mogu takođe biti formulisana za transdermalnu primjenu, na primjer kao krema, mast, losion, pasta, gel, flaster s lijekom, flaster ili membrana. Takva jedinjenja mogu podrazumijevati bilo koje odgovarajuće vezivno sredstvo, na primjer, pojačivače penetracije i slično.    Jedinjenja ovog izuma mogu takođe biti formulisana za parenteralno davanje, uključujući, između ostalog, injekcije ili neprekidnu infuziju. Formulacije za injekciju mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljanim ili vodenim transporterima. Takva jedinjenja mogu takođe postojati u obliku praška za ponovno sastavljanje uz pomoć odgovarajućeg transportera uključujući, između ostalog, sterilnu vodu bez pirogena, WFI i slično. [00056]    Jedinjenja ovog izuma mogu takođe biti formulisana kao priprema baze, koja se može davati putem implanta ili intramusculamom injekcijom. Takva jedinjenja mogu biti formulisana uz pomoć odgovarajućih polimeričnih ili hidrofobičnih materijala (kao što je emulzija u prihvatljivom ulju, na primjer), jonski izmejivači (joniti), ili kao teško rastvorljivi derivati (kao što je na primjer teško rastvoriva so).    Jedinjenja ovog izuma mogu se takođe formulisati kao preparat lipozoma. Preparati lipozoma mogu podrazumijevati lipozome koji ulaze u značajne ćelije ili stratum comeum i spajaju se s membranom ćelije što dovodi do isporučivanja sadržine lipozoma u ćeliju. Mogu se na primjer, koristiti lipoozomi kao što su lipozomi opisani u američkom patentu U. S. Patent br. 5, 077, 211 za Yarosh, U. S. Patent br. 4, 621, 023 za Redziniak et al., ili U. S. Patent br. 4, 508, 703 za Redziniak et al. [00058]    Jedinjenje ovog izuma može biti u obliku čvrstih jedinica doza, poput tableta, (npr. tablete suspenzija, tablete suspenzija za grickanje, tablete s brzom disperzijom, tablete za žvakanje, šumeće tablete, tablete u dva sloja, itd), ovalne tablete, kapsule (npr., a mekana ili čvrsta želatinska kapsula), prašak (npr. upakovani prašak, prašak koji se može pripremiti ili prašak koji se otapa u vodi), pastile, vrećice, beskvasna kapsula, okrugle pilule, pelete, granule, mikrogranule, mikrogranule u kapsuli, praškaste aerosolne formule, ili bilo koja druga doza čvrstog oblika srazmjemo prilagođena za davanje pacijentu. Tablete mogu biti pripremljene u skladu s bilo kojom relevantnom, poznatom farmaceutskom tehnologijom. U jednom od oblika, tablete ili druge doze čvrstog oblika, mogu biti pripremljene kroz procese koji koriste jedan postupak ili kombinaciju postupaka, uključujući, između ostalog, i (1) suvo mješanje, (2) direktno kompresovanje, (3) mljevenje, (4) suvu granulaciju ili bez vode, (5) vlažnu granulaciju, ili (6) stapanje. |00060) Pojedinačne etape u procesu vlažne granulacije pripremanja tablete, obično podrazumijevaju mljevenje i prosijavanje sastojaka, mješanje suvog praška, vlažno spajanje, granulaciju i krajnje mljevenje. Suva granulacija podrazumijeva kompresovanje praskaste mješavine u grubu tabletu ili "smjesu" na teškoj rotirajućoj presi za tablete. Smjese se zatim lome u čestice granulata mljevenjem, obično prolaskom kroz oscilacijski granulator. Pojedinačne etape podrazumijevaju mješanje prašaka, kompresovanje (u smjesu) i mljevenje (usitnjavanje smjese ili granulacija). Obično nema ni vlažnog veziva ni vlaženja u bilo kojoj etapi. U drugim oblicima, doze u čvrstom obliku mogu biti pripremljene mješanjem antiprogestina s jednim ili više farmaceutskih vezivnih sredstava kako bi oformili u osnovi homogenu preformulisanu mješavinu. Ta se preformulisana mješavina može podjeliti i eventualno dalje preraditi (npr. kompresovati, staviti u kapsule, spakovati, raširiti itd.) u bilo koji željeni oblik doze. Kompresovane tablete mogu se pripremiti zbijanjem jedinjenja iz ovog izuma u prahu ili granulama. Izraz "kompresovana tableta" obično se odnosi na obične, neobložene tablete pogodne za oralnu upotrebu, pripremljene jednom kompresijom ili uvodnom fazom zbijanja praćenom krajnjim kompresovanjem. Tablete iz ovog izuma mogu biti obložene ili drugačije sastavljene kako bi osigurale oblik doze koji pruža prednosti poboljšanih karakteristika rukovanja ili pohranjivanja. U jednom obliku, biće izabrano bilo koje takvo oblaganje kako se ne bi znatno odgodio početak terapeutskog efekta jedinjenja ovog izuma nakon davanja tog jedinjenja pacijentu. Izraz "tableta suspenzije" se ovdje koristi u vezi s kompresovanom tabletom koja se brzo rastvara kada se stavi u vodu.    Odgovarajuća doza jedinjenja ovog izuma u tečnom obliku, podrazumijeva rastvore, vodene ili uljane suspenzije, eliksire, sirupe, emulzije, tečne formule aerosola, gelove, kreme, masti itd. Takva jedinjenja mogu takođe da budu u obliku suvog proizvoda koji se treba spojiti s vodom ili drugim odgovarajućim transporterom prije upotrebe.    U jednom obliku, tečna ili polučvrsta jedinjenja, nakon pohranjivanja u zatvorenom pakovanju i čuvanja na sobnoj temperaturi, u frižideru (npr. oko 5-10 °C), ili na temperaturi zamrzavanja tokom perioda od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 mjeseci, ispoljavaju prisustvo najmanje oko 90%, najmanje oko 92, 5%, najmanje oko 95%, odnosno najmanje oko 97, 5% originalnog jedinjenja antiprogestina.    Jedinjenja iz izuma mogu, ukoliko se to želi, uključivati jedno ili više farmaceutski prihvatljivih vezivnih sredstava. Izraz "vezivno sredstvo" u ovom tekstu označava bilo koju supstancu, koja nije sama po sebi terapeutski agens, a koja se koristi kao nosilac ili transporter za davanje terapeutskog agensa pacijentu ili supstancu koja se dodaje farmaceutskom jedinjenju kako bi se poboljšale njegove osobine pohranjivanja ili rukovanja ili kako bi se omogućilo ili olakšalo stvaranje jedinice doze jedinjenja. Vezivna sredstva podrazumijevaju, ilustracije radi, između ostalog, razblaživače, razlagače, vezivne agense, adhezive, agense vlaženja, lubrikante, glidante, agense za modifikovanje površine ili površinski aktivna sredstva, arome, agense za otapanje, emulzivne agense, nevodena sredstva, konzervanse, antioksidante, adhezive, agense za podešavanje pH i osmolamosti (npr. puferi), konzervanse, agense zgušnjavanja, agense zaslađivanja, agense ukusa, agense maskiranja ukusa, dodatke za boju, pojačivače penetracije i supstance koje se dodaju za poboljšanje izgleda jedinjenja. Vezivna sredstva koja se eventualno koriste u jedinjenjima izuma mogu biti čvrsta, polučvrsta, tečna ili kombinacije istih. Jedinjenja izuma koja sadrže vezivna sredstva mogu biti pripremljena bilo kojom poznatom farmaceutskom tehnikom koja uključuje mješanje vezivnog sredstva i lijeka ili terapeutskog agensa. Jedinjenja izuma mogu podrazumijevati jedno ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača kao vezivnih sredstava. Odgovarajući razblaživači uključuju, ili pojedinačno ili u kombinaciji, laktozu, uključujući anhidroznu laktozu i laktozu monohidrata; škrobove, uključujući škrob podoban za direktnu kompresiju i hidrolizovani škrob (npr., Celutab™ i Emdex™); manitol; sorbitol; ksilitol; đekstrozu (; npr. Cerelose™ 2000) i monohidrat dekstroze; dvobazni dihidrat kalcijum-fosfata; razblaživače na bazi saharoze; poslastičarski šećer; monobazni monohidrat kalcijum sulfata; dihidrat kalcijum sulfata; granulami kalcijum laktat trihidrat; dekstrate; inozitol; hidrolizovane čvrste supstance iz ceralija; amilozu; celuloze uključujući i mikrokristalnu celulozu, prehrambene izvorea - i amorfne celuloze - i amorfnu celulozu (npr. Rexcel™) i celulozu u prahu; kalcijum karbonat; glicin; bentonit; polivinilpirolidon; i slično. Takvi razblaživači, ukoliko su prisutni, čine ukupno 5% do ukupno 99%, tj. oko 10% do oko 85%, odnosno oko 20% do oko 80% ukupne težine jedinjenja. Svaki odabrani razblaživač ili razblaživači ispoljavaju odgovarajuća tečna svojstva i, tamo gdje su potrebne tablete, kompresivnost.    Moguće je korišćenje ekstragranulame mikrokristalne celuloze (tj. mikrokristalne celuloze dodate vlažnom jedinjenju u granularnom obliku nakon faze sušenja) kako bi se poboljšala čvrstoća (tableta) i/ili vrijeme razlaganja.    Jedinjenja ovog izuma mogu eventualno podrazumijevati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razlagača u ulozi vezivnih sredstava, posebno za tablete, kapsule ili druge čvrste formule. Odgovarajući razlagači podrazumijevaju ili pojedinačno ili u kombinaciji, škrobove, uključujući natrijum-skrob glikolat (npr. Explotab™ ili PenWest) i preželatinirane kukuruzne škrobove (npr. National™ 1551, National™ 1550, i Colocorn™ 1500), gline (npr., Veegum™ HV), celuloze poput pročišćene celuloze, mikrokristalne celuloze, metilceluloze, karboksimetilceluloze i natrijum karboksimetilceluloze, natrijum umrežene karmeloze (npr. Ac-Di-Sol™ ili FMC), alginate, unakrsni povidon i gume poput agara, guara, ksantana, rogača, karaja, pektina i tragakant guma.    Razlagači mogu biti dodati u bilo kojoj odgovarajućoj fazi tokom pripreme jedinjenja, posebno prije faze granulacije ili tokom faze lubrikacije prije kompresovanja. Takvi razlagači, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 2% do ukupno 30%, tj. oko 0, 2% do oko 10%, odnosno 0, 2% do oko 5% ukupne težine jedinjenja.    Jedinjenja iz ovog izuma mogu podrazumijevati i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih veznih agenasa ili adheziva u ulozi vezivnih sredstava, posebno za formule tableta. Takvi vezni agensi i adhezivi bi trebali pružati dovoljno kohezije prašku koji se koristi za tablete kako bi omogućili normalne operacije postupka poput davanja veličine, lubrikacije, kompresovanja i pakovanja, ali da istovremeno omoguće da se tableta razloži i da jedinjenje bude apsorbovano nakon gutanja. Odgovarajući vezni agensi i adhezivi podrazumijevaju ili pojedinačno ili u kombinaciji, akaciju, tragakant, saharozu; želatin; glukozu; škrobove poput, između ostalog, preželatiniranih škrobova (npr. National™ 1511 i National™ 1500); celuloze poput, između ostalog, metilceluloze i natrijum karmeloze (npr. Tylose™); alginsku kiselinu i soli alginske kiseline; magnezijum i aluminijum silikat; PEG; guar gumu; polisaharidnu kiselinu; bentonit; povidon, na primjer povidon K-15, K-30 i K-29/32; polimetakrilate; HµMC; hidroksipropilcelulozu (npr. Klucel™); i etilcelulozu (npr. Ethocel™). Takvi vezni agensi i/ili adhezivi, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 5% do ukupno 25%, tj. oko 0, 75% do oko 15%, odnosno 1% do oko 10% ukupne težine jedinjenja. Jedinjenja izuma mogu podrazumijevati jedno ili više farmaceutski prihvatljivih agensa vlaženja u ulozi veznih sredstava. Neki od primjera surfaktanata koji se mogu koristiti kao agensi vlaženja ujedinjenjima ovog izuma podrazumijevaju jedinjenja kvartemi amonijaka, na primjer benzalkonium hlorid, benzetonijum hlorid i cetilpiridinijum hlorid, dioktil natrijum sulfosukcinat, polioksietilen alkilfenil eter, na primjer nonoksinol 9, nonoksinol 10, i oktoksinol 9, poloksamere (polioksietilen i poliokspropilen blok kopolimere), polioksietilenske gliceride masne kiseline i ulja, na primjer polioksietilen (8) kaprilik/kaprik mono- i digliceridi (npr. Labrasol™ od Gattefosse), polioksietien (35) ricinusovo ulje i polioksietilen (40) hidrogenizovano ricinusovo ulje; polioksietilen alkil eteri, na primjer polioksietilen (20) cetostearil eter, estere polioksietilenske masne kiseline, na primjer polioksietilen (40) stearate, estere polioksietilena sorbitana, na primjer polisorbat 20 i polisorbat 80 (npr. Tween™ 80 od ICI), propilen glikol esteri masne kiseline, na primjer propilen glikol laurat (npr. Lauroglycol™ od Gattefosse), natrijum lauril sulfat, masne kiseline i njihove soli, na primjer oleinska kiselina natrijum oleat i trietanolamin oleat, esteri gliceril masne kiseline, na primjer gliceril monostearat, sorbitan esteri, na primjer sorbitan monolaurat, sorbitan monooleat, sorbitan monopalmitat i sorbitan monostearat, tiloksapol, i njihove mješavine. Takvi agensi vlaženja, ukoliko ih ima, sačinjavaju ukupno oko 0, 25% do 15%, tj. 0, 4% do oko 10%, odnosno 0, 5% do oko 5% od ukupne težine jedinjenja. Jedinjenja izuma mogu podrazumijevati jedan ili više farmaceutski prihvatljivih lubrikanata (uključujući i antiadhezive i/ili glidanate) u ulozi veznih sredstava. Odgovarajući lubrikanti uključuju, pojedinačno ili u kombinaciji, gliceril behapat (npr. Compritol™ 888); stearičnu kiselinu i njene soli, uključujući magnezijum (magnezijum stearat), sterate kalcijuma i natrijuma; hidrirana biljna ulja {npr. Sterotex™); koloidni silicijum; talk; voskove; bornu kiselinu; natrijum benzoat; natrijum acetat; natrijum fumarat; natrijum hlorid; DL-leucin; PEG (npr. Carbowax™ 4000 i Carbowax™ 6000); natrijum oleat; natrijum lauril sulfat; i magnezijum lauril sulfat. Takvi lubrikanti, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 1% do oko 10%, oko 0, 2% do oko 8%, odnosno 0, 25% do oko 5%, ukupne težine jedinjenja. Pogodna antiadhezivi podrazumijevaju talk, kukuruzni škrob, DL-leucin, natrijum lauril sulfat i metalne stearate.. Talk je antiadheziv ili glidant koji se koristi, na primjer, da umanji ljepljivost formulacije za površinu opreme i da umanji statičnost u mješavini. Jedan ili više antiadheziva, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 1% do oko 10%, oko 0, 25% do oko 5%, odnosno oko 0, 5% do oko 2%, ukupne težine jedinjenja. Glidanti se mogu koristiti za podsticanje protoka praška u čvrstoj formuli. Pogodni glidanti podrazumijevaju koloidalni silikonski dioksid, škrob, talk, trobazni kalcijum-fosfat, praškastu celulozu i magnezijum trisilikat. Posebna se prednost daje koloidalnom silikonskom dioksidu.    Jedinjenja ovog izuma mogu uključivati jedan ili više agenasa protiv pjenušanja. Simetikon je ilustrativni primjer agensa protiv pjenušanja. Takvi agensi protiv pjenušanja, ukoliko ih ima, čine ukupno oko 0, 001% do oko 5%, oko 0, 001% do oko 2%, odnosno oko 0, 001% do oko 1%, ukupne težine jedinjenja.    Ilustrativni antioksidanti za korišćenje u ovom izumu podrazumijevaju, između ostalog, butilovani hidroksitoluen, butilovani hidroksianizol, kalijum metabisulfit, i slično. Po želji, ujedinjenju ovog izuma prisutni su jedan ili više antioksidanata u količini od oko 0, 01% do oko 2, 5%, na primjer oko 0, 01%, oko 0, 05%, oko 0, 1%, oko 0, 5%, oko 1%, oko 1, 5%, oko 1, 75%, oko 2%, oko 2, 25%, odnosno oko 2, 5% težine.    U raznim oblicima, jedinjenja izuma mogu podrazumijevati konzervanse. Pogodni konzervansi podrazumijevaju, između ostalog, benzalkonijum hlorid, metil, etil, propil ili butilparaben, benzil alkohol, benzetonijum, metil ili propil p-hidroksibenzoat i sorbičnu kiselinu ili njihove kombinacije. Fakultativni konzervans je obično prisutan u količini od oko 0, 01% do oko 0, 5% ili oko 0, 01% do oko 2, 5% težine.    U jednom obliku, jedinjenja izuma mogu podrazumijevati pufer. Puferi podrazumijevaju agense koji smanjuju pH promjene. Ilustrativne kategorije pufera za upotrebu u raznim oblicima ovog izuma podrazumijevaju soli iz Grupe IA uključujući metale, na primjer, soli bikarbonata Grupe IA metala, soli karbonata Grupe IA metala, alkalinski ili alkalni pufer zemnog metala, alunimijumski pufer, kalcijumov pufer, natrijumov pufer ili magnezijski pufer. Pogodni puferi podrazumijevaju karbonate, fosfate, bikarbonate, citrate, borate, acetate, ftalate, tartrate, sukcinate bilo kojeg od gore navedenih, na primjer natrijum ili kalijum fosfata, citrata, borata, acetata, bikarbonata ili karbonata. Neki od primjera pogodnih pufera podrazumijevaju aluminijum, magnezijum hidroksid, aluminum glicinat, kalcijum acetat, kalcijum bikarbonat, kalcijum borat, kalcijum karbonat, kalcijum citrat, kalcijum glukonat, kalcijum glicerofosfat, kalcijum hidroksid, kalcijum laktat, kalcijum ftalat, kalcijum fosfat, kalcijum sukcinat, kalcijum tartrat, dvobazni natrijum fosfat, dikalijum vodonik fosfat, dikalijum fosfat, dinatrijum vodonik fosfat, dinatrijum sukcinat, suvi gel aluminijum hidroksida, magnezijum acetat, magnezijum aluminat, magnezijum borat, magnezijum bikarbonat, magnezijum karbonat, magnezijum citrat, magnezijum glukonat, magnezijum hidroksid, magnezijum laktat, magnezijum metasilikat aluminat, magnezijum oksid, magnezijum ftalat, magnezijum fosfat, magnezijum silikat, magnezijum sukcinat, magnezijum tartrat, kalijum acetat, kalijum karbonat, kalijum bikarbonat, kalijum borat, kalijum citrat, kalijum metafosfat, kalijum ftalat, kalijum fosfat, kalijum polifosfat, kalijum pirofosfat, kalijum sukcinat, kalijum tartrat, natrijum acetat, natrijum bikarbonat, natrijum borat, natrijum karbonat, natrijum citrat, natrijum glukonat, natrijum vodonik fosfat, natrijum hidroksid, natrijum laktat, natrijum ftalat, natrijum fosfat, natrijum polifosfat, natrijum pirofosfat, natrijum seskvikarbonat, natrijum sukcinat, natrijum tartrat, natrijum tripolifosfat, sintetički hidrotalcit, tetrakarbonat pirofosfat, tetranatrijum pirofosfat, trikalijum fosfat, trinatrijum fosfat, i trometamol. (Djelimično se zasniva na spisku koji se može naći u The Merck Index, Merck & Co. Rahway, N. J. (2001. )). Osim toga, kombinacije ili mješavine bilo koja dva ili više gorespomenuta pufera, mogu se koristiti u farmaceutskim jedinjenjima koja su ovdje opisana. Ukoliko to neko želi, puferi se mogu nalaziti ujedinjenjima izuma i u količinama od oko 0, 01% do oko 5% ili oko 0, 01% do oko 3% težine. [00081]    U svojim raznim oblicima, jedinjenja ovog izuma mogu podrazumijevati jedan ili više agenasa koji povećavaju viskoznost. Ilustrativni primjer agenasa koji povećavaju viskoznost uključuju, između ostalog, i metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, etilcelulozu, karagen, kabopol i/ili njihove kombinacije. Po želji, ujedinjenjima izuma mogu se nalaziti jedan ili više agenasa koji povećavaju viskoznost i to u količinama od oko 0, 1% do oko 10% ili oko 0, 1% do oko 5% težine.    U raznim svojim oblicima, jedinjenja ovog izuma podrazumijevaju "organoleptični agens" kako bi poboljšali organoleptična svojstva jedinjenja. Izraz "organoleptični agens" u daljem tekstu odnosi se na bilo koje vezno sredstvo koje može poboljšati ukus ili miris ili mogu pomoći da se prikrije neprijatan ukus ili miris jedinjenja ovog izuma. Takvi agensi podrazumijevaju zaslađivače, agense arome i/ili agense za prikrivanje ukusa. Pogodni zaslađivači i/ili agensi arome podrazumijevaju bilo koji agens koji zalađuje ili daje ukus farmakološkom jedinjenju. Organoleptični agensi su fakultativno obično prisutni ujedinjenjima izuma u količini od oko 0, 1 mg/ml do oko 10 mg/ml, oko 0, 5 mg/ml do 5 mg/ml ili oko 1 mg/ml. Ilustrativni zaslađivači ili agensi arome podrazumijevaju, između ostalog: bagremov sirup, anetol, anisovo ulje, aromatični eliksir, benzaldehid, benzaldehid eliksir, ciklodekstrine, kim, kimovo ulje, kardamomovo ulje, kardamomovo sjeme, kardamomov alkohol, kardamomova tinkturu, sok od trešnje, sirup od trešnje, cimet, cimetovo ulje, cimetovu vodu, limunsku kiselinu, sirup limunske kiseline, ulje klinčića, kakao, kakao sirup, korijanderovo ulje, dekstrozu, eriodiktion, eriodiktion ekstrakt tečnosti, eriodiktion sirup, aromat, etilacetat, etil vanile, komoračevo ulje, đumbir, ekstrakt tečnosti đumbira, đumbirovu aromatičnu smolu ili oleoresin, dekstrozu, glukozu, šećer, maltodekstrin, glicerin, sladić, sladićev eliksir, sladićev ekstrakt, čist ekstrakt sladića, tečni ekstrakt sladića, sirup sladića, med, izo-alkoholni eliksir, lavandino ulje, limunovo ulje, limunsku tinkturu, manitol, metil salicilati, oraščićevo ulje, narančina gorčina, eliksir, narančina gorčina, ulje, ulje cvjeta naranče, vodu narančinog cvjeta, narančino ulje, kora naranče, gorko, slatku koru naranče, tinkturu, alkohol naranče, sirup naranče, pitomu nanu, ulje od pitome nane, alkohol od pitome nane, naninu vodu, feniletil alkohol, sok od maline, sirup od maline, ruzmarinovo ulje, ružino ulje, ružinu vodu, pojačivač, saharin, saharin kalcijum, saharin natrijum, sirup saparine, sarsaparila, rastvor sorbitola, nanu 'mentha spicata', ulje nane 'mentha spicata', saharozu, sukralozu, sirup, ulje od majčine dušice, toluanski balzam, sirup toluanskog balzama, vanilu, vanilinu tinkturu, vanilin, sirup divlje trešnje, ili njihove kombinacije. Ilustrativni agensi maskiranja ukusa uključuju između ostalog, ciklodekstrine, ciklodesktrinske emulzije, ciklodekstrinske čestice, ciklodekstrinske komplekse ili njihove kombinacije. Ilustrativni agensi a otapanje podrazumijevaju, između ostalog, sorbitol sirup, metil celulozu, glukozu/šećer u sirupu, želatin, hidroksietilcelulozu, karboksimetil celulozu, aluminijumski stearat i hidrogenirane jestive masnoće.  Ilustrativni emulzijski agenasi podrazumijevaju, između ostalog, lecitin, sorbitan monooleat i akaciju. Bezvodni transporteri podrazumijevaju, između ostalog, jestiva ulja, bademovo ulje, frakcionisano kokosovo ulje, uljane estere, propilen glikol i etil alkohol. Gore opisana vezna sredstva mogu imati višestruke uloge što je već poznato struci. Na primjer, škrob može služiti kao filter i kao razlagač. Klasifikacije gorenavedenih veznih sredstava ne smiju ni u kom slučaju biti tumačene kao ograničavajuće. Jedinjenja ovog izuma mogu biti davana na bilo koji način, uključujući, između ostalog, i oralnu, parenteralnu, sublingvalnu, transdermalnu i rektalnu primjenu, preko sluznice, topikalnu, putem inhalacije, preko usta ili njihove kombinacije. Parenteralno uzimanje jedinjenja podrazumijeva, između ostalog, intravenozno, intraarterijsko, intraperitonealno, potkožno, intramuskulamo, intratekalno, intraartikulamo, intracistemalno i intraventrikulamo. Količina jedinjenja s terepeutskim efektom koju treba davati tokom terapije, varira, između ostalog, u odnosu na potrebnu dužinu aktivnosti i godine i stanje pacijenta koji će se liječiti, pored drugih faktora i na kraju je određuje liječnik. Međutim, uopšteno gledano, doze koje se koriste za liječenje ljudi tipično se kreću od oko 0, 001 mg/kg do oko 500 mg/kg po danu, na primjer oko 1 pg/'kg do oko 1 mg/kg po danu ili oko 1 pg/kg do oko 100 pg/kg po danu. Za gotovo sve krupne sisare, ukupna dnevna doza kreće se od oko 1 do 100 mg, a najbolje bi bilo od oko 2 do 80 mg. Režim doziranja može se podesiti tako da obezbjeđuje optimalne terapeutske reakcije. Poželjna doza može biti propisana u jednoj dozi ili u nekoliko doza datih u odgovarajućim intervalima, na primjer u dvije, tri, četiri ili više manjih doza na dan.  Ilustracije radi, jedinjenje ovog izuma može biti dato pacijentu kako bi mu se obezbjedio antiprogesterin u količini od oko 1 pg/kg do oko 1 mg/kg tjelesne težine., na primjer oko 1 µg/kg, oko 25 µg/kg, oko 50 µg/kg, oko 75 µg/kg, oko 100 µg/kg, oko 125    µg/kg, oko    150    µg/kg,     oko    175 µg/kg,     oko 200 µg/kg, oko 225 µg/kg, oko 250    µg/kg, oko    275    µg/kg,     oko    300 µg/kg,     oko 325 µg/kg, oko 350 µg/kg, oko 375    µg/kg, oko    400    µg/kg,     oko    425 µg/kg,     oko 450 µg/kg, oko 475 µg/kg, oko 500    µg/kg, oko    525    µg/kg,     oko    550 µg/kg,     oko 575 µg/kg, oko 600 µg/kg, oko 625    µg/kg, oko    650    µg/kg,     oko    675 µg/kg,     oko 700 µg/kg, oko 725 µg/kg, oko 750    µg/kg, oko    775    µg/kg,     oko    800 µg/kg,     oko 825 µg/kg, oko 850 µg/kg, oko 875    µg/kg, oko    900    µg/kg,     oko    925 µg/kg,     oko 950 µg/kg, oko 975 µg/kg ili oko 1 mg/kg tjelesne težine. Pacijenti podvrgnuti liječenju jedinjenjima iz ovog izuma trebaju biti pod rutinskim nadzorom kako bi se kontrolisao njihovi nivoi estrogen seruma i glukokortikoida. [00092] Sljedeći primjeri su samo neki od pošto jećih i navedeni su kako bi pomogli u razumijevanju pouke ovog izuma. Primjer 1. Formula ovog izuma može se pripremiti kao tableta. Kako bi se dobile tablete za primjenu ovog izuma, treba spojiti kompresovanjem u presi sljedeće sastojke: 10. 0    mg CDB-4124 140. 5    mg    laktoze 69. 5 mg    kukuruznog škroba 2. 5 mg    poli-N-vinilpirolidona 2. 0 mg    aerosila 0, 5 mg    magnezijum stearata Kako bi se dobile tablete za primjenu ovog izuma, treba spojiti kompresovanjem u presi sljedeće sastojke: 20. 0    mg    tamoksifena 50. 0    mg    CDB-4124 105. 0    mg    laktoze 40. 0    mg    kukuruznog    škroba 2. 5    mg    poli-N-vinilpirolidona 25 2. 0    mg    aerosila 0, 5 mg    magnezijum    stearata Kako bi se dobile tablete koje sadrže antiestrogen za primjenu ovog izuma, treba, na primjer, spojiti kompresovanjem u presi sljedeće sastojke: 10. 0    mg    Raloksifena 30. 0    mg    CDB-4124 125. 0    mg    laktoze 50. 0    mg    kukuruznog škroba 2, 5 mg    poli-N-vinilpirolidona    25 2. 0    mg    aerosila 0, 5 mg    magnezijum stearata    Kako bi se dobili uljani preparati za primjenu ovog izuma, treba, na primjer, izmješati sljedeće sastojke i sipati ih u ampule: 100. 0 mg    CDB-4124 343, 4 mg    ricinusa 608, 6 mg benzil benzoata Primjer 2. Jedinjenja ovog izuma imaju samo slabu aktivnost vezivanja receptora antiglukokortikoida.    Neki antiprogesterini ispitani su na probama vezivanja receptora kako bi se provjerila njihova sposobnost da vežu receptor progesterona kunića (rbPR) i receptor glukokortikoida (rbGR). Ukratko, citozol koji sadrži PR i GR pripremljen je u TEGMD puferu (10 mM Tris, pH 7, 2; 1, 5 mM EDTA, 0, 2 mM natrijum molibdat, 10% glicerol, 1 mM DTT) iz materice odnosno timusa nezrelih kunića pod estradiolom. Za vezivanje PR-a, citozol je bio inkubiran sa 6 nM 1, 2-[3H] progesteronom (50, 0 Ci/mmole) i dodani su konkurenti u koncetracijama od 2 do 100 nM. Za vezivanje za GR, citozol je bio inkubiran sa 6 nM 6, 7-[3H] deksametazonom (40 Ci/mmole) i dodana su opitna jedinjenja u koncetracijama od 20 do 100 nM. Nakon prekonoćnog inkubiranja na 4 °C, vezani i slobodni [3H] steroidi razdvojeni su dodavanjem ugljena obloženog dekstranom i centrifugiranjem na 2100 x g tokom 15 min na 4° C. Supstance koje su isplivale i koje sadrže [3H]-komplekse receptora steroida pretočene su u bočice sadržine 4 ml Optifluora (Packard Instrument Co. ), uvrtene su, ujednačene uz pomoć sintilatnog likvidnog čitača tokom 30 minuta a onda su prebrojavane tokom 2 minuta. EC50 (Efikasna koncentracija) za svaku standardnu krivulju i za svaku od krivulja jedinjenja određenje unošenjem podataka za čitanje u četveroparametarski sigmoidalni računarski program (RiaSmart® Immunoassay Data Reduction Program (Program smanjenja podatka imuno-opita)), Packard Instrument Co., Meriden, Conn. ). Relativni afinitet ka vezivanju (RBA) za svako jedinjenje računa se uz pomoć sljedeće jednačine: EC50 standardnog /EC50 opitnog jedinjenja x 100. Standardi za PR i GR opite bili su neobilježeni progesteron odnosno deksametazon. Rezultati tih eksperimenata sažeti su u Tabeli 1, kao proporcije relativnih afiniteta ka vezivanju svakog jedinjenja za receptore rbPR i rbGR (rbPR/rbGR). Taj diferencijal odražava relativnu aktivnost jedinjenja u ćeliji ili tkivu koje posjeduje ta dva receptora i neophodne transkripcijske kofaktore. U Tabeli su takođe prikazane relativne biološke aktivnosti istih jedinjenja u materici kunića kroz ispitivanja anti-McGinty i anti-Clauberg. Jedinjenje CDB-2914 (lizlistano na kraju Tabele) korišteno je kao kontrolno ili referentno jedinjenje (biološka aktivnost kunića = 1, 00) za ove eksperimente zato što su rezultati eksperimenata gdje se koristi CDB-2914 već bili objavljeni ranije (Hild-Petito et ah, 1996.; Passaro et ai, 1997.; Reel et ah, 1998.; Lamer et al., 2000. ). Za ispitivanje anti-McGinty, nesazrele ženke kunića dobile su potkožno injekcije s 5pg estradiola u 10% etanol/susamovom ulju, svakog dana tokom 6 uzastopnih dana. Sedmog dana, životinje su bile podvrgnute abdominalnoj hirurgiji sterilizacije kako bi se vezalo 3-4 cm segmenta oba roga materice. Opitno jedinjenje u odgovarajućem rastvoru, ubrizgano je intraluminalno u vezani segment roga materice i samo se prebacilo u drugi. Svakom kuniću je potkožno je ubrizgana stimulativna doza progesterona (267 pg/dan) na svakodnevnoj osnovi tokom naredna tri dana kako bi se izazvala endometrijska proliferacija. Sve životinje su žrtvovane 10. dana za uklanjanje materice pri čemu je uklonjen segment u centru ligatura i štavljenje u 10% neutralni puferovani formalin i predat za izvršenje histološke procedure. Pet mikronskih sekcija bojenih hematoksilinom i kozinom mikroskopski je ispitano kako bi se provjerio stepen endometrijske proliferacije žlijezda. Procenat inhibicije endometrijske proliferacije računat je za svakog kunića i zabilježen je prosjek grupe od pet životinja. Za ispitivanje anti-Clauberg, nerazvijene ženke kunića dobijale su potkožno injekcije s 5 pg estradiola u 10% etanol/susamovom ulju, svakog dana tokom 6 uzastopnih dana. Sedmog dana, životinje su dobile potkožno progesteronske injekcije (160 pg/dan), a opitno jedinjenje oralno u odgovarajućem transporteru oralno ili potkožno, tokom pet uzastopnih dana. Jedna grupa kunića dobila je samo progesteron. Dvadeset četiri sata nakon posljednje doze, sve životinje su žrtvovane za uklanjanje materice koja je očišćena od svih masnoća i vezivnih tkiva, težine gotovo 0, 2 mg i stavljena je u 10% neutralni puferovani formalin za narednu histološku obradu. Pet mikronskih sekcija bojenih hematoksilinom i eozinom, mikroskopski je ispitano kako bi se provjerio stepen endometrijske proliferacije žlijezda. Procenat inhibicije endometrijske proliferacije kod svakog nivoa doziranja opitnog jedinjenja, izveden je upoređivanjem samo sa životinjama koje su bile stimulisane progesteronom. Podaci prikazani u Tabeli 1 (biloška aktivnost kunića) odražavaju prosječne rezultate dobivene za svako jedinjenje putem ispitivanja anti-McGinty i anti-Clauberg koja se odnose na CDB-2914.    Ispitani antiprogestini rangirani su na osnovu selektivnosti svakog jedinjenja za PR-a kunića preko GR-a kunića, kao što se može vidjeti u Tabeli 1. Antiprogesterini su takođe rangirani na osnovu biološke aktivnosti materice kunića. Podaci prikazani u Tabeli 1 pokazuju daje afinitet vodećih jedinjenja za receptore progesterona bio barem 1, 5 puta veći nego njihov afinitet za receptore glukokortikoida. [000100]    Rezultati ovih istraživanja su pokazali su takođe da dva vodeća jedinjenja CDB-4124 i CDB-4059 imaju visoku aktivnost antiprogestina u materici kunića u poređenju s RU 486 i CDB-2914. Ijednom i drugom jedinjenj u nedostaju estrogene, androgene, anti-estrogene i anti-androgene aktivnosti. Oba jedinjenja posjeduju minimalnu aktivnost receptora anti-glukokortikoida, karakteristika koja ih razdvaja od RU 486 i CDB-2914 koji su umjereno aktivni u vezivanju receptora glukokortikoida. U tim je ispitivanjima, CDB-4124 pokazao malo bolje rezultate od CDB-4059. TABELA 1. -VEZIVANJE RECEPTORA I BIOLOŠKE AKTIVNOSTI ANTIPROGESTINA Primjer 3. Indukcija tumora i latentna pojava tumora. U cilju indukcije tumora, ženkama pacova Sprague-Dawley data je doza DMBA od 10 mg/kg tjelesne težine kada su bile stare 50 dana. Jedna grupa od 14 pacova (Grupa 2) dobila je umjesto DMBA - susamovo ulje kada su bile stare 50 dana i to je trebalo poslužiti kao kontrola bez DMBA. Životinje su mjerene i opipavane jednom sedmično uz mliječnu liniju kako bi se uočio bilo koji znak lezija ili otoka. Čvorovi tumora bilježeni su i mjereni jednom sedmično i to u dvije dimenzije uz pomoć kalibarskog šestara. Kada je tumor porastao do veličine 10-12 mm u bilo kojoj dimenziji, pojedinačne životinje bi bile nasumice stavljane u jednu od 14 grupa. Tumori su se pojavili već 39 dana nakon oralnog kljukanja i najkasnije 194 dana (te kasnije pojedinačne životinje nisu uključene u ispitivanje). Prosječni latentni period za pojavljivanje tumora bio je 106 + 30 dana. Nije bilo razlike između grupa koje su dobijala DMBA u smislu latentnosti (p = 0, 545, Kruskal-Wallis test). [000102]    Životinje su bile podvrgnute tretmanu tokom 28 dana po sljedećem rasporedu. Grupa 1 dobijala je dnevne doze potkožnim (s. c) injekcijama transportera (10% etanola u susamovom ulju). Grupa 2 (kontrolna grupa bez DMBA - nisu očekivani tumori) dobijala je transporter po rasporedu o kojem je bilo odlučeno unaprijed kako bi se simulirao početak tromjesečnog tretmana. Grupe 3 i 4 dobijale su dnevne potkožne injekcije RU 486 odnosno mikronizovanog progesterona u dozi od 10 mg/kg tjelesne težine. Grupe 5 do 9 dobijale su 20 mg/kg, 10 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg odnosno 0, 1 mg/kg CDB-4124. Grupe 10 do 14 odražavale su tretman koji su dobijale grupe 5 do 9 samo što je 10 mg/kg mikronizovanog progesterona bilo dodato kao komponenta jedinjenja za injekcije.    Nivo progesterona je ocjenjivan kod životinja tri puta: u početku kada su trebali početi tretman; drugi put poslije 21 dana tretmana; i konačno poslije tretmana u toku žrtvovanja što je bilo 2-4 dana poslije posljednje potkožne injekcije. Svi uzorci krvi uzimani su putem punkcije srca; serum je pripreman i čuvan zamrznut na -40°C. Uz pomoć ELISA-e određivani su nivoi hormona steroida progesterona, kortizola i kortikosterona. [000104]    Analiza je vršena uz pomoć Statgraphics Plus. Razlika među grupama bila je određena uz pomoć ANOVA-e ukoliko su sredstva grupe bila dobro raspoređena. U suprotnom, korišćen je Kruskal-Wallis test. Razlike u sredstvima procjenjivane su uz pomoć Studentskog testa, ukoliko su grupe ispunile kriterijum koji je podrazumijeva da nisu ni spljoštene ni asimetrične. U suprotnom, korišćen je neparametrični test Mann-Whitney-Wilcoxin. U slučaju da se radila uzastopna ocjena istih pacova, korištenje upareni t-test. U slučaju da su podaci mogli da se stave po grupama radi poređenja, korišćen je Fisherov test preciznosti. Primjer 5. Broj i tip tumora u momentu autopsije. Životinje su žrtvovane 3-5 dana poslije kraja 28-dnevnog tretmana, vađena je krv, tumori su uklanjani, mjerena im je težina i dužina, vršena je inspekcija, zamrzavani su komadi i/ili stavljani su u 10% fosfatni puferovani formalin za histopatologiju. Uzorci tkiva rezani su i bojeni su hematoksilinom i eosinom i procjenjivani su za histopatološku klasifikaciju. Histološki su identifikovana četiri tipa tumora (Tabela 2): adenokarcinomi (ACAs), papilami karcinomi (PCAs), fibrosarkomi, i fibroadenomi ili adenofibromi (FA ili AF), za ove posljednje tipove tumora nije smatrano da predstavljaju direktnu malignost. Minimalni broj tumora za otpočinjanje tretmana bio je >1 s obzirom daje najveći ("glavni") tumor mogao biti praćen jednim ili nekolicinom manjim tumora koji nisu dosegli minimalnu veličinu. U Tabeli 2 sažeti su rezultati ovih eksperimenata. Broj AC A plus PC A kod pacova tretiranim samo transporterom bio je 2, 7 tumora po pacovu u vrijeme žrtvovanja (kolona ACA + PCA nije uvijek dodatak koloni ACA i PCA po pacovu pošto bi tumori mogli biti mješanih tipova) Kao što je navedeno u Tabeli 2, Grupa 2 (kojoj nije dat karcinogen DMBA) nije imala tumore. Pacovi podvrgnuti tretmanu sa samo DMBA-om imali su u prosjeku 2, 67 tumora po pacovu. Dodavanje progesterona povećavalo je prosječan broj tumora po pacovu na skoro 5 tumora. Liječenje uz pomoć CDB-4124 imalo je velikog uticaja na smanjivanje broja tumora. Prosječan broj u četiri najviše grupe podvrgnute tretmanu s najvećim učinkom (tj, 20, 10, 2, 1 mg/kg/danu) bio je 1, 58 tumora po pacovu. To smanjivanje broja tumora pokazuje da CDB-4124 ne samo da smanjuje rast pošto jećih tumora, već i spriječava pojavu novih tumora kod tih životinja, jer svaka životinja koja je učestvovala u tretmanu bila je odabrana slučajno na osnovu pronađenog jednog tumora date veličine Tabela 2 - Efekat tretmana na tip tumora i broj tumora. Primjer 6. Efekti antiprogestina na napredovanje tumora. Kako bi se procjenili efekti CDB-4124, RU486 i progesterona na razvoj tumora i na njegovo napredovanje, tokom tretmana posmatrani su kinetika rasta i veličina tumora. Pojedinačni tumori životinja s tumorima u ispitivanju, mjereni su sedmično i to u dvije dimenzije uz pomoć kalibarskog šestara. Rezultati tih ispitivanja sažeti su na Slici 1. Podaci su ispravljeni kako bi isključili FA/AF tipove tumora koji nisu maligni. Tumori koji su se povećali u području poprečnog presjeka za bar 33% u toku 28-dnevnog perioda inspekcije, smatrani su rastućim tumorima (Slika 1, crna polja) Za tumore koji su se smanjili za oko 33% smatralo se da se povlače (Slika 1, bijela polja). Ostali se tumori smatraju statičnim (Slika 1, siva polja). Kao što se vidi na Slici 1, tretman progesteronom povećao je broj rastućih tumora dojke. Mada je razmjera tumora koji su se povlačili u grupi kojoj je dat progesteron (8%) bila statistički ista kao i kod kontrolne grupe, razmjera rastućih tumora (80%) bila je znatno veća (p<0, 004, Fisherov test preciznosti). Tretman pomoću RU 486 doveo je do očiglednog rasta razmjere tumora koji su se povlačili u poređenju s kontrolnom grupom, iako to nije bilo statistički značajno. 1000110] Za razliku od progesterona, tretman pomoću CDB-4124 u dozama od 10 mg/kg tjelesne težine smanjuje razmjeru rastućih tumora (p<0, 013) i povećava razmjeru tumora koji se povlače (p<0, 003). Rezultati su pokazali da se 70% tumora povlačilo nakon tretmana pomoću CDB-4124. Postojala je očigledna vezanost za dozu i samo je najniža doza CDB-4124 bila bez efekta. Efekti CDB-4124 bili su poništeni kada su životinje tretirane dodatnim progesteronom u razmjeri koja je bila petostruka ili više. Progesteron koji je dat u nižoj razmjeri nije mogao poništiti efekte CDB-4124. Kada je u pitanju stopa rasta, doza od 10 mg/kg CDB-4124 bila je efikasnija u poređenju sa 20 mg/kg, što je ukazivalo na to da bi CDB-4124 u visokim dozama mogao imati neku aktivnost agonista progesterona iako se efekti doze od 20 mg/kg preparata CDB-4124 na rast tumora nisu uspjeli približiti efektima progesterona (p=0, 0008, Fisherov test preciznosti, dvosmjerni). Međutim, doza od 20 mg/kg (ali ne i niže doze) takođe znatno povećava nivo protočnih progesterona, a efekti su zavisili od visine doze. Znači, CDB-4124 može potisnuti rast tumora izazvanih DMBA-om u mliječnoj žlijezdi pacova i to potiskivanje podrazumijeva smanjenje veličine i broja mamamih tumora. Činjenica da se sam progesteron pokazao kao proliferativan i pojačivač tumora, ilustruje važnost potiskivanja progesterona kod životinja s utvrđenim tumorom ili tumorom u nastajanju u mliječnim žlijezdama. Rezultati za CDB-4059 bili su slični gore objelodanjenima za CDB-4124 Znači, aktivnost preparata CDB-4059 koja potiskuje tumor slična je aktivnosti preparata CDB-4124 i oba jedinjenja imaju jaču potiskujuću aktivnost u odnosu na tumore nego što je to slučaj s RU 486. Kada se CDB-4124 daje samo i u umjerenoj koncentraciji ili preko progesterona, njegovi efekti su jači i podstiču povlačenje tumora. Međutim, kada se daje čist progesteron ili preko CDB-4124, efekti progesterona su rastući i pojačavajući. Primjer 7. Broj tumora, njegova veličina i težina kod autopsije. U Tabeli 3 vide se efekti progesterona, RU486 i CDB-4124 na tumor srednje veličine i prosječna ukupna težina tumora po životinji (težina tumora). Rezultati iz Tabele 3 su rezultati ACA, PCA i mješavine ACA/PCA, ali tumori FA ili AF su isključeni. Progesteron očigledno povećava težinu tumora i prosječnu veličinu tumora. Međutim, vrijednosti nisu statistički značajne u poređenju s vrijednostima kontrole (p>0, 4, Mann-Whitney-Wilcoxin test). Podaci o progesteronu su u oštrom kontrastu s podacima antiprogestina. RU486 i CDB-4124 smanjuju težinu tumora i veličinu prosječnog tumora, petostruko u slučaju RU486 (p<0, 01) i desetostruko za CDB-4124 (p<0, 001). Smanjenje težine i veličine tumora kod drugih grupa bilo je dosljedno s CDB-4124-om koji je utjecao na veličinu tumora u dozama od 10, 2 i 1 mg/kg. CDB-4124 je bio neuspješan u najnižim nivoima tretmana, a najviša doza CDB-4124 (20 mg/kg) nije bila tako efikasna kao što je to bio slučaj s dozom od 10 mg/kg. Treba obratiti pažnju na to da su se neki tumori u potpunosti povukli i više se nisu mogli napipati. Među 11 tumora tog tipa, koji su praćeni tokom tretmana, na obdukciji smo našli strukture koje su bile cistične s hemoragijskom supstancom što je ukazivalo na povlačenje. Te strukture su nađene samo kod grupa podvrgnutih tretmanu RU486 (n=2), kod grupa podvrgnutih tretmanu CDB-4124 u dozi od 20, 10, 2 ili 1 mg/kg (n=7), ili u grupama podvrgnutim tretmanu u dozama od 20 mg/kg CDB-4124 plus 10 mg/kg progesterona (n=2). Pošto nisu mogli biti histološki procjenjeni, njihov identitet nije mogao biti potvrđen. Pa ipak, ti rezultati ukazuju na to da antiprogestini mogu u potpunosti da povuku tumore. Primjer 8. Težina životinja tokom ispitivanja.    Težina kontrolnih životinja bila je poređena s težinom životinja koje su dobijale hormonske tretmane kako bi se bolje procjenila toksičnost, posebno toksičnost jedinjenja CDB-4124. Životinje su mjerene sedmično tokom 27 sedmica ispitivanja. Na kraju eksperimenta nije utvrđena velika razlika mjerenih životinja koje su bile podvrgnute terapiji u odnosu na kontrolne životinje, što ukazuje na to da CDB-4124 nije toksičan čak i u većim dozama. Primjer 9. Proliferacija tumora i apoptoza.    Kako bi se procjenili efekti progestina i antiprogestina na proliferaciju ćelija, ispitani su uzorci tkiva izvađeni iz 46 pojedinačnih tumora pacova kod životinja koje su bile podvrgnute tretmanu i uzorci kontrolnih životinja tako što je mjerena ekspresija markera proliferacije Ki-67 uz upotrebu antitjela Ki-67 (NeoMarkeri, Fremont, CA) i imunohistohemije. Uprkos smanjenju veličine brojnih tumora iz Grupa 3 i 6 nakon tretmana u Grupama 3 i 6, zbog čega su postali premali za resekciju, 7-12 ACAs iz Grupa 1, 3, 4, 6 i 11 bili su podvrgnuti resekciji. Rezultati eksperimenta proliferacije, u kojima je proliferacija mjerena u procentima ćelija koje su pokazivale markere Ki-67, prikazani su u Tabeli 4: Tabela 4, Ćelije tumora proliferovane putem Ki-67 Progesteron je povećao procenat ćelija u proliferaciji u poređenju s kontrolnim i životinjama podvrgnutim tretmanu sa CDB-4124. Progesteron je doveo do najviše proliferacije ćelija i taj je rast bio izvan svega što se moglo vidjeti u kontrolnoj grupi, RU486 ili CDB-4124 plus grupama s progesteronom. Tretman uz pomoć čistog CDB-4124 doveo je do smanjenog broja ćelija pozitivnih na Ki-67 nego bilo koji drugi tretman i razmjera je bila daleko manja nego što se moglo vidjeti kod kontrolne grupe. Uzorci tkiva pacova pod tretmanom CDB-4124 pokazivali su manju proliferaciju (manje ćelija pozitivnih na Ki-67) nego uzorci tkiva pacova pod tretmanom RU 486 (p = 0, 021, t-test). Znači, CDB-4124 je jačeg dejstva nego RU 486 kada je riječ o sprječavanju proliferacije tkiva dojke (p = 0, 011, jednosmjerni t-test). Efekti CDB-4124 takođe su se razlikovali od CDB-4124 + P4 (p=0, 048, t-test). Osim toga, tretman uz pomoć CDB-4124 plus P4 doveo je do manjeg broja ćelija s proliferacijom nego sam P4 (p=0, 030, t-test). Proliferacija je opadala u grupama, sljedećim redom: progesteron (najviša proliferacija) > kontrola = RU486 = CDB-4124 + progesteron > čist CDB-4124. Znači, CDB-4124 smanjuje proliferaciju ćelija čak i u prisustvu jednake količine dodatog progesterona. Procjenjena je apoptoza u istim tumorima uz pomoć seta za hibridizaciju apoptoze (Oncor, Gaithersburg, MD). Ćelije u apoptozi bile su procjenjene u perifernim područjima tumora i deleko od nekroze. Procijenjeno je najmanje 1. 000 ćelija po sekciji tumora. U Tabeli 5 je pokazana jasna razlika među tretiranim grupama u odnosu na kontrolne netretirane životinje: Tabela 5. Apoptoza (% ćelija tumora u programiranoj smrti ćelija Naknadna analiza uz pomoć testa s višestrukim dometom (Multiple Range Test) ukazuje na to daje CDB-4124 plus progesteron doveo do veće apoptoze nego što je to slučaj sa kontrolnim životinjama ili životinjama tretiranim progesteronom. Osim toga, RU486, CDB-4124 i CDB4124 plus progesteron, doveli su do veće apoptičke smrti ćelija nego što je to slučaj s kontrolnim tumorima. Efekti tretmana pomoću CDB-4124 nisu se razlikovali od onih pomoću RU486 (p=0, 73, t-test). Slično tome, efekti CDB-4124 su bili isti kao i kod CDB-4124 + P4 (p=0, 98, t-test). Ovi rezultati sugerišu da u prisustvu otprilike istih količina progesterona tumori reaguju na antiprogestin CDB4124 s apoptozom. Nasuprot tome, CDB-4124 vodi do povećane apoptoze u poređenju s P4 (p=0, 020, t-test). Nema očiglednog sinergizma između CDB-4124 i progesterona. Sposobnost CDB-4124 da smanji proliferaciju je važna za aktivnost potiskivanja tumora CDB-4124 jer je jedna od velikih razlika između CDB-4124 i RU 486 to što CDB-4124 je smanjio proliferaciju efikasnije nego RU 486. Prekid ili potiskivanje jakog proliferativnog efekta progesterona je vjerodostojan mehanizam pomoću kojeg CDB-4124 može smanjiti proliferaciju. Primjer 10. Ekspresija receptora estrogena i progesterona (ER-ova i PR-ova) u tkiva tumora. Tumori kod kojih je procjenjena proliferacija i apoptoza, kod njih je takođe ispitana i ekspresija receptora estrogena i progesterona pomoću imunohistohemije (IHC). Određenje i analiziranje procenat ćelija pozitivnih na ER ili PR. Tumori su bili grupisani u četiri različite kategorije: tumori s 0% ćelija koje su izražavale ER, tumori s 10% ćelija koje su izražavale ER, tumori s 15 do 30% ćelija koje su izražavale ER i tumori s 30-50% ćelija koje su izražavale ER. U načelu, netretirani tumori dosljedno su izražavali ER. Od 12 analiziranih tumora, svih 12 je izražavalo ER. Četiri od tih 12 tumora sadržavalo je 30-50% ćelija pozitivnih na ER. Nasuprot netretiranim kontrolnim tumorima, 3 od 7 analiziranih tumora tretiranih uz pomoć CDB-4124 nije sadržavalo ćelije koje su izražavale ER, nijedna nije sadržavala 30-50% ćelija koje izražavaju ER i samo je jedan uzorak sadržavao 15-30 procenata ćelija pozitivnih na ER. Znači, tretman s RU 486 ili CDB-4124 smanjuje broj ćelija koje izražavaju ER-ove. [000119] Tretman progesteronom je kao rezultat imao povećanje broja ćelija koje izražavaju ER u poređenju s uzorcima životinja tretiranih sa CDB-4124 ili RU 486. Kombinacija CDB-4124 i progesterona imala je tendenciju stvaranja obrasca sličinijem obrascu tretmana čistim CDB-4124. Taj je rezultat u skladu sa zaključcima daje kombinacija doza od 10 mg/kg CDB-4124 + 10 mg/kg progesterona imala efekt potiskivanja tumora, uključujući i smanjenje broja tumora, inhibiciju rasta tumora i smanjenje težine tumora. U načelu, dugoročni tretman antiprogestinom ima tendenciju spuštanja nivoa ER u tumorima, dok progesteron ima tendenciju da ide u suprotnom pravcu. Primjer 11. Ekspresija receptora progesterona (PR) u tumorima. Netretirani tumori dosljedno su izražavah PR (12/12 tumora). U načelu, netretirani tumori izražavaju oba receptora, i ER i PR, stoga je moguće da mnogi maligni tumori izražavaju ova dva transkripcijska faktora. Tretman sa RU 486 izgleda da djeluje neutralno na PR, a CDB-4124 je smanjio nivo ekspresije PR-a. Interesantno je daje kod tri tumora, RU 486 doveo do gubitka ER-a, ali su zadržani niski pozitivni nivoi PR-a. Progesteron ima tendenciju da podiže ekspresiju PR-a. Kombinacija CDB-4124 i progesterona ima tendenciju da stvara obrazac sličniji onime čistog CDB-4124; što je u skladu s efektima kombinacije doze od 10 mg/kg CDB-4124 + 10 mg/kg progesterona na broj tumora, obrazac rasta i težinu tumora. U načelu, dugoročni tretman s CDB-4124 ima tendenciju spuštanja nivoa PR u tumorima, dok progesteron ima tendenciju da ide u suprotnom pravcu. Znači, tumori zadržavaju reakcije na progesteron u prisustvu progesterona. Primjer 12. Ispitivanje efekata antiprogestina na nivoe hormona u serumu. Koncentracije hormona steroida određene su tri puta tokom ispitivanja: prije početka tretmana, nakon 21 dana tretmana i konačno poslije tretmana na žrtvovanju, što je bilo oko 2-4 dana nakon posljednje potkožne injekcije. Svi uzorci su uzeti punkcijom srca. Dobijen je serum i držan je zamrznut na -40 °C. Nivoi hormona steroida određeni su uz pomoć ELISA-e. Rezultati mjerenja progesterona kod pacova prikazani su u Tabeli 6: Tabela 6: Uticai tretmana na serum progesterona _ Nije primjećena razlika u nivoima serum progesterona između grupa prije tretmana (p=0, 49, ANOVA) ili nakon tretmana (p=0, 35, ANOVA), ali su otkrivene znatne promjene s tretmanom (p=0, 000, ANOVA). Mnogi režimi su podigli progesteron u poređenju s kontrolama, posebno u grupama koje su dobijale najviše količine RU486 i CDB-4124 (Tabela 6). Znatne razlike koje su nastale među gmpama tretiranim tokom 21 dana bile su specifične za sljedeće grupe (p = 7 x 10-6, Kruskal-Wallis test): RU 486, najviše tri doze CDB-4124 jedinjenja i najviše dvije doze CDB-4124 plus progesteron. CDB-4059 nije doveo po povišenih nivoa seruma progesterona u odnosu na nivo prije tretmana na testiranoj dozi od 10 mg/kg. Serum progesterona se vratio na nivo nultog dana za sve grupe osim za grupu koja je dobijala CDB-4124 u dozama od 20 mg/kg plus progesteron, koja nije uspjela pokazati pad seruma progesterona kada je došlo do obustave tretmana (p=0, 004, upareni t-test, jednosmjerni). Neuspješnost čistog progesterona da podigne sopstvenu koncentraciju seruma bila je zbunjujuća, ali je moguće daje izazvana činjenicom da je visoko egzogeni progesteron potisnuo endogenu proizvodnju. Egzogeni progesteron je takođe mogao biti metabolizovan između potkožne injekcije i vađenja krvi koje je izvršeno 20-24 sata kasnije. Nedostatak efekta jedinjenja CDB-4059 u koncentracijama od 10 mg/kg na nivoe endogenog progesterona kod žena, može imati prednost u odnosu na CDB-4124 u takvoj koncentraciji. Primjer 13. Mjerenje kortizola.    Nekoliko različitih eksperimentalnih sistema idu u prilog zaključku da RU 486 povećava kortizol jer RU 486 kod ljudi i primata ima jaka anti-glukokortikoidna svojstva.    Međutim, pacovi koji su liječeni pomoću RU 486 u dozi od 10 mg/kg nisu pokazali značajne razlike u nivoima kortizola. Suprotno tome, pacovi koji su liječeni bilo jedinjenjem CDB-4124 ili jedinjenjem CDB-4059 u istim dozama, pokazali su znatno više nivoe kortizola seruma nego pacovi iz kontrolne grupe.    Ti viši nivoi kretali su se od 3-4 ug/dl (30-40 ng/ml). Efekti su zavisili od doze u smislu daje veća doza CDB-4124 vodila do povećanog kortizola.    Ta razlika u uticajima RU 486 naspram CDB-4124 ili CDB-4059 na nivoe kortizola, može se objasniti ako se pretpostavi daje nakon 21 dana stalnog doziranja, jetra pacova mogla da metabolizuje bolje RU 486 nego bilo koje od ova dva CDB jedinjenja. Primjer 14. Mjerenje kortikosterona. Kortikosteron je najobilniji glukokortikoid kod pacova. Uticaji SPRM-ova na kortizol mogu biti sekundarni u odnosu na jake efekte po kortikosteron. Kako bi se ovaj fenomen mogao bolje ispitati, nivoi kortikosterona mjereni su u grupama, što je pokazalo najveće promjene u nivoima kortizola, kao što su grupe podvrgnute tretmanu pomoću CDB-4124 u dozama od 20 mg/kg ili 10 mg/kg. Poređenja radi, sljedeće grupe bile su takođe podvrgnute ispitivanju: grupa koja je dobila 20 mg/kg CDB-4124 plus 10 mg/kg progesterona, grupa koja je dobila 10 mg/kg CDB-4124 plus 10 mg/kg progesterona, grupa koja je dobila 10 mg/kg RU 486, grupa koja je dobila 10 mg/kg čistog progesterona, kontrolna grupa i grupa koja nije dobila DMBA i koja nije imala tumore. Nivoi kortikosterona bili su 10-40 puta viši nego nivoi kortizola. Međutim, gotovo da nije primjećena razlika među grupama kada su u pitanju prosječni nivoi kortikosterona. Nije bilo razlike među 8 grupa prije tretmana (p = 0, 43, ispitivanje Kruskal-Wallis), 21 dan nakon tretmana (p = 0, 57, ispitivanje Kruskal-Wallis), ili 28 dana poslije tretmana i kod žrtvovanja (p = 0, 061, ispitivanje Kruskal-Wallis). Nije bilo statističke razlike u nivoima kortikosterona među životinjama s tumorima i bez tumora, ni na 21 dan (p = 0, 94, t-test, dvosmjerni) ni kod žrtvovanja (p = 0, 37, t-test, dvosmjerni). Kako bi se mjerili efekti egzogenog progesterona na serumu kortikosterona, poređeni su nivoi kortikosterona u 3 uparene grupe koje su se razlikovale po tome da li su dobile egzogeni progesteron (npr. poređenja kontrolne naspram progesterona ili CDB-4124 u dozi od 20 mg/kg naspram CDB-4124 u dozi od 20 mg/kg plus progesteron, ili CDB-4124 u dozi od 10 mg/kg naspram CDB-4124 u dozi od 10 mg/kg plus progesteron). Uočena je statistički značajna razlika: nivoi kortikosterona bili su sniženi kod životinja koje su bile izložene tretmanu progesteronom posle 21 dana tretmana (p = 0, 029, test Mann-Whitney Wilcoxon, dvosmjerni). Taj efekt nije provjeren na uzorcima krvi kod žrtvovanja. Nije uočena razlika u serumu kortikosterona između grupe s progesteronom i grupa CDB-4124, grupa s progesteronom i RU-486, ili grupa RU-486 i CDB-4124. Ispitan je i odnos između seruma kortizola i seruma kortikosterona u svakoj ispitanoj grupi. Postojala je jaka pozitivna linearna korelacija između njih za CDB-4124 sa 20 mg/kg (r2 = 0, 78), za CDB-4124 sa 10 mg/kg (r2 = 0, 82), i za RU 486 (r2 = 0, 85). Dodavanje progesterona u prve dvije grupe CDB-4124 daleko je oslabilo odnos (r2 = 0, 34 za grupu 10 i r2 = 0, 37 za grupu 11). Sam progesteron nije pokazao takav pozitivan odnos (r2 = -1, 0). Kontrolna grupa nije pokazala odnos između ta dva glukokortikoida (r = 0, 064). Znači, povišeni nivoi kortizola u grupama koja su dobijale CDB-4124 u korelaciji su s nivoima kortikosterona, vjerovatno zbog konverzije iz kortikosterona koji se na neki način povećao. To je dosljedno efektu jedinjenja CDB-4124 koje se može vidjeti iz gorenavedenog: uticaj na metaboličke enzime odgovorne za nivoe progesterona i kortizola. Iako nije pronađen jak uticaj CDB-4124 na primami glukokortikoid pacova, ipak bi pacijent koji je dobio CDB-4124 ili CDB-4059, iz sigurnosnih razloga, trebao biti praćen u Fazi I kliničkih ispitivanja zbog mogućih anti-glukokortikoidnih efekata uključujući i moguće povećanje u serumu kortizola, kortikosterona ili ACTH. Primjer 15. Ispitivanje antiproliferativnih efekata SPRM-ova u ćelijama raka dojke otpornim na tamoksifen. Korištene su dvije ćelijske linije: MCF-7 (ćelijska linija osjetljiva na antiestrogen, tamoksifen) i LY-2 (varijanta MCF-7 otpornog na tamoksifen). Proliferacija je mjerena u 96 bunarčića mikrotitar ploča. 5X103 ćelije dodate su svakom bunarčiću. Bunarčićima s Perkin Elmer Cetus PRO/PETTE dodaje se hranljivi medijum i rastvori lijekova. Hranljivi medijum je IMEM kojem je dodato 5% fetalnog goveđeg seruma. Ispitano je osam koncentracija lijekova, u duplikatu, od 0, 078 µM do 10 µM. Uzorci uključuju sam tamoksifen, svako od jedinjenja ove specifikacije i kombinacije tamoksifena. Nakon četvorodnevne inkubacije, medijum se zamjenjuje svježim medijumom koji sadrži lijek, a nakon ukupno sedam dana, monoslojevi ćelije učvršćeni su trihlor-sirćetnom kiselinom i bojeni su sulforodaminskom bojom. Apsorbovanje (492 nm) ekstraktovanih rastvora boje mjeri se uz pomoć Titertek Multiscan čitača ploče. Izrađene su krivulje reakcija doza (procenat kontrolnih apsorpcija nasuprot koncentracijama lijekova) kako bi se procjenile IC50 vrijednosti defmisane kao koncentracije lijekova (mikromolame) koje su inhibirale 50% proliferacije. IC50 vrijednosti u korelaciji su s potencijalom ispitanog lijeka kada je riječ o inhibiranju ćelijske proliferacije i stoga daju informacije koje su potrebne za identifikovanje jedinjenja pogodnih za sprječavanje hiperproliferacije ćelija raka dojke otpornih na tamoksifen. Primjer 16. Antiproliferativni efekt jedinjenja CDB-4124 i inhibitora aromataze DL-aminoglutetimida u ćelijama raka dojke T47D s pretjeranom ekspresijom aromataze. Inhibicija aromataze je postala prva linija tretmana za pacijente s rakom dojke pozitivne na receptor steroida. Određivanje efikasnosti inhibitora aromataze in vitro pokazalo se teškim pošto su poznate ćelije raka dojke pokazale veoma slabu aktivnost aromataze. Znači daje ćelijska linija T47D s pretjeranom ekspresijom aromataze bila stvorena kloniranjem gena aromataze (hCYP19Al) iz ljudskog placentalnog cDNK u vektor mamalne ekspresije pcDNK3. 1 i stabilnim transficiranjem ćelije raka dojke T47D zadržavajući prazan vektor kao kontrolu. Redosljedni podaci ponovnog kombinovanjapcDNK3. 1 koji nosi hCYP19Al pokazali su 100% Blast hit (Eksplozivni udarac) u područja hCYP19Al ORF. Ćelije transficirane aromatazom bile su analizirane i odabrane za prekomjernu ekspresiju aktivnih proteina aromataze. Ekspresiju aromataze jednoćelijskog klona (T47Darom) potvrdio je RT-PCR, Westem blot, Estrone ELISA, i ispitivanja proliferacije ćelija. RT-PCR je pokazao oko 32-struko višu ekspresiju aromataze mRNK u T47Darom u odnosu na roditeljske ćelije T47D, pokazujući visoku ekspresiju aromataze mRNK sa ili bez indukcije testosterona. Ekspresija proteina aromataze 58 kD potvrđena je analizom Western blot, koristeći mišja monoklonalna antitjela antiaromataze. U kontrolnim ćelijama T47D nije otkrivena ekspresija aromataze. Jaka aktivnost aromataze u ćelijama T47Darom, potvrđena je uz pomoć seta Estrone ELISA. Ukratko, u poređenju sa kontrobiim ćelijama T47D, otkriveni su visoki nivoi estrona kod tretmana sa 10 nM androstendiona tokom perioda od 24 sata. Estron ELISA pokazuje manju apsorpciju kod 450nM za T47Darom ćelije u poređenju s T47D kontrolnim ćelijama. T47Darom ćelije postavljene su na ploče s 24 bunarčića sa po 10. 000 ćelija po bunarčiću, zatim su bile dva dana u inkubaciji, nakon čega su bile podvrgnute tretmanu sa CDB-4124 u koncentraciji od 1 µM, 2 µM, 3 µM, 4 µM i 5 µM tokom perioda od 4 dana u normalnim uslovima kulture (10% FBS lišen ugljena/srednji MEM bez fenola). Za kontrolu su korištene ćelije koje nisu bile izložene tretmanu. Za mjerenje ćelijske proliferacije korišteno je ispitivanje s kristal violetom. Boja u ovom ispitivanju, kristal violet, ostavlja markere na DNK. Nakon solubizacije, količina boje koju su ćelije primile može se kvantifikovati na spektrofotometru. Tretman s CDB-4124 inhibirao proliferaciju T47Darom ćelija u zavisnosti od doze koja je data. Vidi Sliku 2. T47Darom ćelije postavljene su na ploče s 24 bunarčića sa po 10. 000 ćelija po bunarčiću, zatim su bile dva dana u inkubaciji, nakon čega su bile podvrgnute tretmanu sa 50 µM, 75 µM, 100 µM, ili 150 µM DL-aminoglutetimida (AGM) u prisustvu 1 nM testosterona tokom perioda od 4 dana u normalnim uslovima kulture i mjereni su efekti na ćelijsku proliferaciju. Rezultati su prikazani na Slici 3. T47Darom ćelije postavljene su na ploče s 24 bunarčića sa po 10. 000 ćelija po bunarčiću, zatim su bile dva dana u inkubaciji, nakon čega su bile podvrgnute tretmanu sa: (1) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 1 µM CDB-4124; (2) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 2 µM CDB-4124; (3) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 3 µM CDB-4124; ili (4) 100 µM DL-aminoglutetimida (AGM) + 4µM CDB-4124, tokom perioda od 4 dana u normalnim uslovima kulture u prisustvu 1 nM testosterona i mjereni su efekti na ćelijsku proliferaciju. Rezultati su prikazani na Slici 4. Inhibicija ćelijske proliferacije tokom tretmana kombinacijom AGM-a i CDB-4124, zavisila je od doze koja je data. Iznenađujući je singergistički efekt kombinacije AGM-a i CDB-4124 u inhibiranju ćelijske proliferacije raka dojke koje izražavaju aromatazu. Na Slici 4 vidi se daje gotovo 70% inhibicija ćelijske proliferacije primijećeno kod kombinacije od 4 µM CDB-4124 i AGM-a u poređenju s manje od 30% inhibicija zabilježenih kod istih jedinjenja u istim koncentracijama, pojedinačno. Drugim riječima, inhibicija proliferacije ćelija koja je primijećena tokom tretmana kombinacijom AGM-a i CDB-4124, bila je veća nego što se moglo očekivati s obzirom na inhibicije primjećene kod primjene samog AGM-a ili CDB-4124. Ovi rezultati pokazuju da CDB-4124 u visokim dozama, zajedno s inhibicijom aromataze ukazuje na sinergistično poboljšane hemoterapijske efekte kod tretmana raka dojke. Slični sinergistični efekti na ćelijsku proliferaciju mogli bi se očekivati kada se primjenjuje kombinacija CDB-4124 s drugim inhibitorima aromataze. 1.    Postupak za liječenje raka dojke, uključujući davanje jedinjenja opšte formule u dozi koja potiskuje proliferaciju tkiva raka dojke, ženama kojima je to potrebno: ili farmaceutski prihvatljive soli, hidrata ili njihovih rastvora pri čemu: X predstavlja alkil, alkenil, alkinil, hidrogen, halo, mono-alkilamin, dialkilamin ili amin N, N-dimetilamin; R1 predstavlja O, NOH ili NO-metil; R2 predstavlja hidrogen ili acetil; i R3 predstavlja metiloksi, formiloksi, acetoksi, aciloksi, S-alkoksi, acetilteonil, glicimat, vinil eter, acetiloksimetil, metil karbonat, halogene, metil, hidroksi ili etiloksi i efikasnu količinu inhibitora aromataze. 2.    Postupak iz zahtjeva br. 1, gdje je gorenavedeno jedinjenje: CDB-4124 i CDB-4059. 3.    Postupak iz zahtjeva br. 2, gdje je gorenavedeno jedinjenje: CDB-4124. 4.    Postpak iz zahtjeva 2, gdje se gorenavedeno jedinjenje daje u dozama od 0, 5 mg/kg do 500 mg/kg. 5.    Postupak iz zahtjeva 1, gdje je sklonost vezivanja gorenavedenog jedinjenja za receptor progesterona bar 1, 5 puta veća nego sklonost vezivanja gorenavedenog jedinjenja za receptor glukokortikoida.

6.    Postupak iz zahtjeva 1, gdje gorenavedeno jedinjenje smanjuje broj ćelija koje se šire za sto ćelija u liniji ćelije raka dojke, za najmanje 20 procenata.

7.    Postupak iz zahtjeva 1, gdje nivoi progesterona kod žene nisu znatno povišeni.

8.    Postupak iz zahtjeva 2, gdje je hormonska zamjenska terapija primjenjena na dotičnoj ženi kojoj je ta terapija neophodna.

9.    Postupak iz zahtjeva 2, gdje je estrogenska terapija primjenjena na dotičnoj ženi kojoj je ta terapija neophodna.

10.    Postupak iz zahtjeva 1, gdje je inhibitor aromataze izabran iz grupe koju sačinjavaju anastrozol, letrozol, eksemestan i DL-aminoglutetimid.

11.    Postupak iz zahtjeva 1, gdje se istovremeno daju gorenavedeno jedinjenje i inhibitor aromataze.

12.    Postupak za inhibiranje proliferacije tkiva raka dojke, uključujući fazu istovremenog kontakta gorenavedenog tkiva raka dojke i inhibitora aromataze i količine jedinjenja opšte formule koja potiskuje proliferaciju: ili farmaceutski prihvatljive soli, hidrata ili njihovih rastvora pri čemu: X predstavlja alkil, alkenil, alkinil, hidrogen, halo, mono-alkilamin, dialkilamin ili amin N, N-dimetilamin; R1 predstavlja O, NOH ili NO-metil; R2 predstavlja hidrogen ili acetil; i R3 predstavlja metiloksi, formiloksi, acetoksi, aciloksi, S-alkoksi, acetilteonil, glicimat, vinil eter, acetiloksimetil, metil karbonat, halogene, metil, hidroksi ili etiloksi.

13.    Postupak iz zahtjeva 12, gdje je gorenavedeno jedinjenje: CDB-4124 i CDB-4059.

14. Postupak iz zahtjeva 12, gdje je inhibitor aromataze izabran iz grupe koju sačinjavaju anastrozol, letrozol, eksemestan i DL-aminoglutetimid.