ME01058B - Supstituisani derivati propenil piperazina kao novi inhibitori histonske deacetilaze - Google Patents

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju inhibitorsko delovanje protiv histonske deacetilaze (HDAC). Takođe, ovaj pronalazak se odnosi na procese za njihovu preparciju, na kompozicije koje ih sadrže, kao i na njihovu upotrebu u uslovima in vitro i in vivo, sa ciljem inhibiranja HDAC i kao lek za, na primer inhibiranje proliferativnih stanja, kao rak ili psorijaza.

Jedrini histoni su poznati kao integralne i dinamičke komponente mašinerije koja je odgovorna za regulisanje genske transkripcije i drugih procesa u kojima je molekul DNK kalup kao replikacija, popravak, rekombinacija i hromosomska segregacija. Oni su predmet post-translacijskih modifikovanja uključujući acetailaciju, fosforilaciju, metilaciju, ubikvitinaciju i ADP-ribozilaciju.

Histonska(e) deacetilaza(e), ovde označeni kao „HDAC“ su enzimi koji katalizuju odstranjivanje acetilske modifikacije sa lizinskih ostataka u belančevinama, uključujući centralne nukleosomalne histone H2A, H2B, H3 i H4. Zajedno sa histonskim acetiltransferazama, ovde označenima kao „HAT“, HDAC regulišu nivo acetilacije histona. Balans acetilacije nuklesomalnih histona ima važnu ulogu u transkripciji mnogih gena. Hipoacetilacija histona je povezana sa kondenzovanim hromatinskim strukturama, a koje dovodi do represije genske transkripcije, pri čemu se acetilovani histoni povezuju sa labavom hromosomskom strukturom i aktivacijom transkripcije.

Jedanaest strukturno povezanih HDAC je opisano, a podeljeni su i dve klase. Klasa I HDAC se sastoji od HDAC 1, 2, 3, 8 i 11 dok klasa II HDAC se sastoji od HDAC 4, 5, 6, 7, 9 i 10. Članovi treće klase HDAC strukturno nisu povezani sa klasom I i II HDAC. Klase I/II HDAC deluju uz pomoć mehanizama koji su zavisni o cinku, dok klasa III HDAC je zavisna o NAD.

Osim histona, druge belančevine su takođe supstrat za acetilaciju, tako na primer transkripcijski faktori kao p53, GATA-1 i E2F; jedrini receptori kao receptor glukokortikoida, tiroidni receptori, estrogeni receptori; belančevine koje regulišu ćelijski ciklus kao pRb. Acetilacija belančevina je povezana sa stabilizovanjem belančevina, na primer stabilizovanje p53, regrutovanje kofaktora i povećano vezanje na DNK. P53 je tumor supresor koji je uključen u zaustavljanju ćelijskog ciklusa ili apoptozi kao odgovor na brojne stresne signale, kao oštećenje na DNK. Glavni cilj p53 tokom indukovanja zaustavljanja ćelijskog ciklusa se čini da je gen p21. Osim aktivisanja s p53, p21 je identifikovan u asocijaciji sa ciklin/ciklin zavisnim kompleksima kinaza gde dovodi do zaustavljanje ćelijskog ciklusa u G1 i G2 faza, njegova povećana regulacija tokom starenja ćelija i njegova interakcija sa nuklearnim antigenom ćelija koje proliferiraju.

Ispitivanje inhibitora HDAC navodi da isti imaju važnu ulogu u zaustavljanju ćelijskog ciklusa, ćelijske diferencijacije, apoptoze i reverzije fenotipova transformiranosti.

Inhibitor Trihostatin A (TSA), na primer, dovodi do zaustavljanje ćelijskog ciklusa u fazama G1 i G2, uzrokuje reverziju fenotipa transformiranosti različitih ćelijskih linija i indukuje diferencijaciju ćelija Friend leukemije i dr. TSA (i suberoilanilid hidroksamična kiselina SAHA) inhibiraju rast ćelija, dovode do termalne diferencijacije i vrše prevenciju nastanka tumora u miševa (Finnin et al., Nature, 401: 188-193, 1999).

Trihostatin A je također koristan u tretmanu fibroze, na primer fibroze džigerice i hirhoze džigerice. (Geerts et al., European Patent Application EP 0 827 742, objavljeno 11 marta 1998).

Farmakofor za HDAC inhibitore se sastoji od domena za vezanje metala, koji reaguje sa aktivnim mestom HDAC koje sadrži cink, domena sa linkerom i domena za površinsko prepoznavanje ili region za kapovanje, koji reaguje sa ostatkom na rubu aktivnog mesta.

Inhibitori HDAC takođe indukuju ekspresiju gena p21. Transkripcijsko aktivisanje gena p21 od strane ovih inhibitora je ubrzano uz pomoć hromatinskog re-modelovanja, a posle toga sledi acetilacija histona H3 i H4 u regionu promotora gena p21. Aktivisanje p21 nastupa nezavisno o p53 pa su inhibitori HDAC aktivni u ćeliji u kojoj je mutiran gen p53, šta je oznaka mnogih tumora.

Dodatno, inhibitori HDAC mogu da imaju indirektne aktivnosti kao na primer povećanje imunog odgovora domaćina i inhibiranje tumorske angiogeneze pa tako mogu da suprimiraju rast primarnih tumora i uspore metastazu (Mai et al., Medical Research Reviews, 25: 261-309).

U vezi sa gore rečenim, inhibitori HDAC mogu da imaju veliki potencijal za tretman stanja u kojima dolazi do proliferacije ćelija, uključujući tumore sa mutiranim genom p53.

Patentna aplikacija EP1472216, publikovana 14 avgusta 2003 razotkriva bicikličke hidroksamate kao inhibitore histonskih deacetilaza.

Patentne aplikacije EP1485099, EP1485348, EP1485353, EP1485354, EP1485364, EP1485365, EP1485370, EP1485378, publikovane 18 septembra 2003, među ostalima, razotkrivaju supstituisane piperazinilpirimidinilhidroksamične kiseline kao inhibitore histonske deacetilaze, a dodatno EP1485365 razotkriva R306465.

Patentna aplikacija EP1492534 publikovana 9 oktobra 2003 razotkriva jedinjenja karbamične kiseline koja se sastoje od piperazinskog povezivanja, kao inhibitore HDAC.

Patentna aplikacija EP1495002 publikovana 23 oktobra 2003 razotkriva supstituisana jedinjenja piperazinil fenil benzamida, kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO04/009536 publikovana 29 januara 2004 razotkriva derivate koje sadrže alkilni linker među arilne grupe i hidroksamata, kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija EP1525199 publikovana 12 februara 2004 razotkriva (hetero)arilalkenil supstituisane bicikličke hidroksamate, kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO04/063146 publikovana 29 jula 2004 razotkriva derivate od derivata N-hidroksi-benzamida sa delovanjem protiv zapaljenja i tumora.

Patentna aplikacija WO04/063169 publikovana 29 jula 2004 razotkriva supstituisane derivate aril hidroksamata kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO04/072047 publikovana 26 avgusta 2004 razotkriva indole, benzimidazole i naftimidazole kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO04/082638 publikovana 30 septembra 2004 razotkriva hidroksamate vezane na ne-aromatski heterociklički prstenski sistem kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO04/092115 publikovana 28 oktobra 2004 razotkriva derivate hidroksamata kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO05/028447 publikovana 31 marta 2005 razotkriva benzimidazole kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentne aplikacije WO05/030704 i WO05/030705 publikovane 7 aprila 2005 razotkrivaju benzamide kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO05/040101 publikovana 6 maja 2005 razotkriva hidroksamate povezane na acilureu i povezane na sulfonilureu kao inhibitore histonske deacetilaze.

Patentna aplikacija WO05/040161 takođe publikovana 6 maja 2005 razotkriva hidroksamate vezane na biaril kao inhibitore histonske deacetilaze.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska se razlikuju od struktura prijašnje tehnike u svojoj farmakološkoj aktivnosti i/ili farmakološkog potencijala.

Problem koji treba da se reši je da se osiguraju inhibitori histonske deacetilaze sa visokom enzimskom i ćelijskom aktivnošću, koji imaju povećanu biodostupnost i/ili in vivo potencijal.

Nova jedinjenja iz ovoga pronalaska rešavaju gore pomenuti problem. Jedinjenja iz ovoga pronalaska pokazuju odličnu enzimsku i ćelijsku aktivnost u inhibiraju histonske deacetilaze. Isti imaju visoki kapacitet aktivisanja gena p21, na nivou ćelije i in vivo. Imaju poželjni farmakokinetički profil i niski afinitet za enzime P450, šta redukuje rizik od štetnih interakcija lek-lek i takođe dozvoljava šire sigurnosne margine.

Napredne karakteristike sadašnjih jedinjenja su metabolička stabilnost, rastvorivost i/ili kapacitet indukovanja p21. Detaljno, jedinjenja iz ovoga pronalaska imaju povećane polu-živote u hepatocitima pacova, povećanu rastvorivost/stabilnost u vodenim rastvorima i/ili imaju pojačani kapacitet indukovanja promotora p21 u uslovima in vivo.

Pronalazak se odnosi na jedinjenja sa formulom (I)

N-oksid forme, farmaceutski prihvatljive adicijske soli i njihove stereohemijske izomerne forme, gde

Svaki X je nezavisno N ili CH;

R1 je fenil, naftalenil ili heterociklil; gde

svaki od pomenutih fenila ili naftalenila ponekad je supstituisan sa jednim ili dva supstituenta

svaki nezavisno izabran među halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, polihaloC1-6alkila, arila, hidroksi, cijano, amino, C1-6alkilkarbonilamino, C1-6alkilsulfonilamino, hidroksikarbonila, C1-6alkiloksikarbonila, hidroksiC1-6alkila, C1-6alkiloksimetila, aminometila, C1-6alkilaminometila, C1-6alkilkarbonilaminometila, C1-6alkilsulfonilaminometila, aminosulfonila, C1-6alkilaminosulfonila ili heterociklila;

R2 je vodonik, -CH2-R5, trifulorometil, -C(=O)-R6 ili –CH2-NR7R8; gde svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkoksi,

C1-6akloksiC1-6alkoksi, C1-6alkilkarboniloksi, piperazinila, N-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ili triazolila;

svaki R6 je nezavisno izabran među hidroksi, C1-6alkiloksi, amino ili mono- ili di(C1-6alkil)amino, C1-6cikloalkilamino, hidroksiC1-6alkilamino, piperazinila, mono- ili di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino

N-metilpiperazinila, morfolinila ili tiomorfolinila;

Svaki R7 i R8 su nezavisno izabrani među vodonika, C1-6alkila, C1-6alkilkarbonila, C1-6alkilsulfonila ili mono- ili di(C1-4alkil)aminosulfonila;

R3 je vodonik, hidroksimetil, aminometil ili mono- ili di(C1-6alkil)aminometil;

R4 je vodonik ili C1-6alkil;

aril u gornjem fenilu ili naftalenilu; gde

svaki pomenuti fenil ili naftalenil je ponekad supstituisan sa jednim ili dva supstituenta

svaki neovisno izabran među halo, C1-6alkila, C1-6alkoksi, trifluorometila,

cijano ili hidroksikarbonila; i

gore pomenuti heterociklil je furanil, tienil, pirolil, pirolinil, pirolidinil, dioksolil, oksazolil, tiazolil, imidazolil, imidazolidinil, pirazolil, pirazolinil, pirazolidinil, izoksazolil, izotiazolil, oksadiazolil, triazolil, tiadiazolil, piranil, piridinil, piperidinil, dioksanil, morfolinil, ditianil, tiomorfolinil, piradizinil, pirimidinil, pirazinil, piperazinil, triazinil, tritianil, indolizinil, indolil, indolinil, benzofuranil, benzotifenil, indazolil, benzimidazolil, bentatiazolil, purinil, kinolizinil, kinolinil, cinolinil, ftlazinil, kinazolinil, kinoksalinil ili naftiridinil; gde

svaki pomenuti heterocikal je ponekad supstituisan sa jednim ili više supstituenata svaki

nezavisno izabran među halo, C1-6alkoksi, C1-6alkiloksi, cijano, amino, mono- ili di(C1-4alkil)amino.

Termin „inhibitor histonske deacetilaze“ se koristi da se identifikuje jedinjenje koje je sposobno da reaguje sa histonskom deacetilazom i da inhibira njenu aktivnost, detaljnije njenu enzimatsku aktivnost. Inhibiranje enzimatske aktivnosti histonske deacetilaze redukuje sposobnost histonske deacetilaze da odstranjuje acetilnu grupu sa histona. Poželjno, takva inhibicija je specifična, na primer inhibitor histonske deacetilaze redukuje sposobnost histonske deacetilaze da odstrani jednu acetilnu grupu sa histona pri koncentraciji koja je niža od koncentracije inhibitora koji je potreban da uzrokuje neki drugi, neočekivani biološki efekat.

Kako se koristi u ranijim definicijama i dalje u tekstu, halo je generičko ime za fluoro, hloro, bromo i jodo. C1-4alkil definiše prave i razgranate lance zasićenih ugljeno-vodoničnih radikala koji imaju 1 do 4 ugljena atoma kao, na primer metil, etil, propil, butil, 1-metiletil, 2-metilpropil i sl.; C1-6alkil označava C1-4alkil i njegove više homologe koji imaju 5 do 6 atoma ugljena kao, na primer pentil, 2-metil-butil, heksil, 2-metilpentil i sl.; polihaloC1-6alkil definiše C1-6alkil koji sadrži tri identična ili različita halo supstituenta, na primer trifluorometil; i C3-6cikloalkil uključuje cikličke ugljeno-vodonične grupe koje imaju 3 do 6 ugljena, kao ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil i sl.

Farmaceutski prihvatljive adicijske soli obuhvataju farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli i farmaceutski prihvatljive bazne adicijske soli. Farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli kao šta su pomenuti dalje u tekstu trebaju da obuhvataju terapeutski aktivne ne-toksične forme kiselih adicijskih soli, koje jedinjenja sa formulom (I) mogu da oforme. Jedinjenja sa formulom (I) koja imaju bazne karakteristike mogu da se konvertiraju u njihove farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli uz pomoć tretiranja pomenutih baznih formi sa odgovarajućom kiselinom. Odgovarajuće kiseline obuhvataju, na primer, anorganske kiseline kao vodoničnohalnih kiselina, na primer hloro-vodonična kiselina ili bromo-vodonična kiselina; sulfurna; nitratna; fosforna i sl. kiseline; ili organske kiseline kao na primer octena, trifluorooctena, propanoična, hidroksioctena, mlečna piruvična, oklasalna, malonska, sukcinska (na primer butandioična kiselina), maleična, fumarna, malična, tartarna, citrička, metansulfonska, etansulfonska, benzensulfonska, p-toluensulfonska, ciklamna, salicilna, p-amino-salicilna, pamoična i sl. kiseline.

Jedinjenja sa formulom (I) koja imaju kisele karakteristike mogu da se konvertiraju u njihove farmaceutski prihvatljive bazne adicijske soli uz pomoć tretmana pomenutih kiselina sa odgovarajućim organskim ili anorganskim bazama. Odgovarajući forme baznih soli obuhvataju, na primer, amonijumske soli, soli alkalnih ili zemno-alkalnih metala, na primer soli litijuma, natrijuma, kalijuma, magnezijuma, kalcijuma i sl., soli sa organskim bazama, na primer sa benzatinom, N-metil-D-glukamin, soli hidrabamina i soli sa amino kiselinama kao na primer sa argininom, lizinom i sl.

Termin „kisele i bazne adicijske soli“ takođe obuhvata hidrate i rastvorive adicijske forme koje su jedinjenja sa formulom (I) sposobna da oforme. Primeri takvih formi su na primer, hidrati, alkoholati i sl.

Termin „stereohemijski izomerne forme jedinjenja sa formulom (I)“, kako se ovde koristi definiše sva moguća jedinjenja koja su sastavljena od istih atoma vezanima istom sekvencom veza, ali koja imaju različite tri-dimenzionalne strukture, koje nisu međusobno izmjenjiva, a koje jedinjenja sa formulom (I) mogu da poseduju. Osim ako nije pomenuto drugačije, hemijska oznaka jedinjenja obuhvata mešavinu svih mogućih stereohemijskih izomernih formi, koje pomenuto jedinjenje može da poseduje. Pomenuta mešavina može da sadrži sve dijastereoizomere i/ili enantiomere osnovne molekularne strukture pomenutog jedinjenja. Sve stereohemijski izomerne forme jedinjenja sa formulom (I), u čistoj formi ili u međusobnoj mešavini su obuhvaćeni okvirima ovoga pronalaska.

N-oksidne forme jedinjenja sa formulom (I) trebaju da obuhvate ona jedinjenja sa formulom (I) gde jedan ili nekoliko azotnih atoma je oksidirano u takozvane N-okside, posebno one N-okside gde jedan ili više piperidin-piperazin ili piridazinil-azoti su N-oksidirani.

Neka od jedinjenja sa formulom (I) mogu da postoje u svojim tautomernim formama. Takve forme, mada nisu posebno navedene u gornjim formulama, treba da budu uključene u okvire ovoga pronalaska.

Bilo gde da se u daljnjem tekstu koristi, termin „jedinjenja sa formulom (I)“ uključuje takođe farmaceutski prihvatljive adicijske soli i sve stereoizomerne forme.

Kako se ovde koristi, termini „histonska deacetilaza“ i „HDAC“ trebaju da se odnose na bilo koju familiju enzima koji odstranjuju acetilne grupe sa ε-amino grupa u lizinskim ostacima na N-terminusu histona. Osim ako nije drugačije navedeno, termin „histon“ treba da se odnosi na bilo koju histonsku belančevinu, uključujući H1, H2A, H2B, H3, H4 i H5 iz bilo koje vrste. Humane HDAC belančevine ili genski produkti, uključuju, ali time nisu ograničeni HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-8, HDAC-9, HDAC-10 i HDAC-11. Histonska deacetilaza može takođe da se derivira iz protozoa i gljiva.

Prva grupa interesantnih jedinjenja se sastoji od jedinjenja sa formulom (I) za koju vrede jedno ili više od sledećih ograničenja:

a) R1 je fenil ili naftalenil; gde

svaki fenil ili naftalenil je supstituisan sa jednim ili dva supstituenta svaki nezavisno izabran iz C1-6alkilsulfonilamino, hidroksikarbonila, C1-6alkiloksimetila, C1-6alkilaminometila, C1-6alkilkarbonilaminometila, C1-6alkilsulfonilaminometila, aminosulfonila ili C1-6alkilaminosulfonila; ili

b) R2 je –CH2-R5, trifluorometil, -C(=O)-R6, ili –CH2-NR7R8;

c) R4 je C1-6alkil.

Druga grupa interesantnih jedinjenja se sastoji od ona jedinjenja sa formulom (I) za koju vrede jedno ili više od sledećih ograničenja:

a) R1 je fenil, naftalenil ili heterociklil; gde

svaki pomenuti fenil je supstituisan sa jednim ili dva supstituenata svaki nezavisno izabran među arila, hidroksi, amino, C1-6alkilkarbonilamino,

C1-6alkilsulfonilamino, C1-6alkiloksikarbonila, hidroksiC1-6alkila,

C1-6alkiloksimetila, aminometila, C1-6alkilaminometila,

C1-6alkilkarbonilaminometila, C1-6alkilsulfonilaminometila, aminosulfonila,

C1-6alkilaminosulfonila ili heterocikala; ili

b) R2 je –CH2-R5, trifluorometil, -C(=O)-R6 ili –CH2-NR7R8;

c) R4 je C1-6alkil.

Treća grupa interesantnih jedinjenja se sastoji od ona jedinjenja sa formulom (I) za koju vrede jedno ili više od sledećih ograničenja:

a) R1 je fenil, naftalenil ili heterociklil; gde

svaki pomenuti fenil ili naftalenil je supstituisan sa jednim ili dva supstituenata svaki nezavisno izabran među C1-6alkilsulfonilamino, C1-6alkiloksimetila,

aminometila, C1-6alkilaminometila, C1-6alkilkarbonilaminometila,

C1-6alkilsulfonilaminometila, aminosulfonila ili C1-6alkilaminosulfonila; ili

b) R2 je –CH2-R5, trifluorometil, -C(=O)-R6 ili –CH2-NR7R8;

c) R4 je C1-6alkil.

Četvrta grupa interesantnih jedinjenja se sastoji od ona jedinjenja sa formulom (I) za koju vrede jedno ili više od sledećih ograničenja:

a) svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi,

piperazinila, N-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ili triazolila;

b) svaki R6 je nezavisno izabran iz hidroksi, C1-6alkiloksi, amino ili mono- ili di(C1-6alikl)amino, C1-6cikloalkilamino, piperazinila,

N-metilpiperazinila, morfolinila ili tiomorfolinila;

c) R4 je vodonik.

Peta grupa interesantnih jedinjenja se sastoji od ona jedinjenja sa formulom (I) za koju vrede jedno ili više od sledećih ograničenja:

a) svaki X je N;

b) R1 je fenil ili fenil ponekad supstituisan sa halo, C1-6alkil, C1-6alikloksi, polihaloC1-6alkil ili aril;

c) R2 je –CH2-R5 ili –C(=O)-R6;

d) svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi,

C1-6alkiloksiC1-6alkiloksi, C1-6alkilkarboniloksi, N-metilpiperazinila, morfolinila ili imidazolila;

e) svaki R6 je nezavisno izabran iz C1-6alkilamino, C1-6cikloalkilamino,

hidroskiC1-6alkilamino, di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino ili morfolinila;

f) R3 je vodonik; ili

g) R4 je vodonik ili C1-6alkil.

Šesta grupa interesantnih jedinjenja se sastoji od jedinjenja iz pete grupe za koju vrede jedno ili više od sledećih ograničenja:

a) svaki R6 je nezavisno izabran iz C1-6alkilamino, C1-6cikloalkilamino,

di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino ili morfolinila.

Sedma grupa interesantnih jedinjenja se sastoji od ona jedinjenja sa formulom (I) za koju vrede jedno ili više od sledećih ograničenja:

a) svaki X je N;

b) R1 je fenil ili fenil ponekad supstituisan sa halo;

c) R2 je –CH2-R5;

d) svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi

ili C1-6alkilkarboniloksi;

e) R3 je vodonik;

f) R4 je vodonik.

Jedna grupa poželjnih jedinjenja se sastoji od onih jedinjenja sa formulom (I) gde svaki X je N; R1 je fenil ili fenil ponekad supstituisan sa halo, C1-6alkil, C1-6alkiloksi, polihaloC1-6alkil ili aril; R2 je –CH2-R5 ili –C(=O)-R6, svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi, C1-6alkiloksiC1-6alkiloksi, C1-6alkilkarboniloksi, N-metilpiperazinila, morfolinila ili imidazolila; svaki R6 je nezavisno izabran iz C1-6alkilamino, C1-6cikloalkilamino, hidroksiC1-6alkilamino, di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino ili

morfolinila; R3 je vodonik i R4 je vodonik ili C1-6alkil.

Druga grupa preferiranih jedinjenja se sastoji od onih jedinjenja sa formulom (I) gde R2 je –CH2-R5, trifluorometil, -C(=O)-R6 ili –CH2-NR7R8.

Jedna grupa preferiranih jedinjenja se sastoji od ona jedinjenja sa formulom (I) gde svaki X je N; R1 je fenil ili fenil supstituisan sa halo; R2 je –CH2-R5; svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi ili C1-6alkilkarboniloksi; R3 je vodonik, a R4 je vodonik.

Još je preferirano jedinjenje Br. 1, jedinjenje Br. 8, jedinjenje Br. 11, jedinjenje Br. 9, jedinjenje Br. 33, jedinjenje Br. 34 i jedinjenje nje Br. 7 i jedinjenje Br. 25.

Jedinjenje Br.1

Jedinjenje Br. 8

Jedinjenje Br. 11

Jedinjenje Br. 9

Jedinjenje Br. 33; .HCl; enantiomer A

Jedinjenje Br. 34; .HCl; enantiomer B

Jedinjenje Br. 7; C2HF3O2; (E)

Jedinjenje Br. 25; enantiomer A

Jedinjenja sa formulom (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli i N-oksidi i njihove stereohemijske izomerne forme mogu da se pripreme na konvencionalni način. Startni materijal i neki od intermedijera su poznata jedinjenja i mogu da se nabave komercijalno ili mogu da se prirede u skladu sa konvencionalnim reakcijama i procedurama koje su opšte poznate stanju tehnike.

Neki metodi preparacije će da budu objašnjeni u daljnjem tekstu detaljnije. Drugi metodi za dobijanje krajnjih jedinjenja sa formulom (I) su opisani u primerima.

a) Hidroksamične kiseline sa formulom (I) mogu da se prirede reakcijom intermedijera sa formulom (II) sa odgovarajućom kiselinom, kao na primer, trifluoro octenom kiselinom. Pomenuta reakcija se provodi u odgovarajućem rastvaraču, na primer, metanolu ili dihlorometanu.

b) Intermedijeri sa formulom (II) mogu da se pripreme reakcijom intermedijera sa formulom (III) sa intermedijerom sa formulom (IV) u prisutnosti odgovarajućih reagenasa kao N’-(etilkarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propandiamin, monohidrohlorid (EDC) i 1-hidroksi-1H-benzotriazol (HOBT). Reakcija može da se provede u prisutnosti baze kao trietilamin, u odgovarajućem rastvaraču, kao na primer, mešavini dihlorometana i tetrahidrofurana.

c) U alternativnom načinu, intermedijer sa formulom (II), gde R4 je vodonik, u daljnjem tekstu označeni kao intermedijeri sa formulom (II-a) može da se pripremi u jednom koraku reakcijom intermedijera sa formulom (XI) sa 1,4-dioksan-2,5-diola i odgovarajućom boroničnom kiselinom sa formulom (VII), gde R1 je definisan ranije, u odgovarajućem rastvaraču, na primer u alkoholu, kao na primer etanolu.

d) Intermedijeri sa formulom (III) mogu da se pripreme reakcijom intermedijera sa formulom (V) sa odgovarajućim kiselim rastvorom, na primer hloro-vodoničnom kiselinom ili baznim rastvorom, na primer vodoničnog bromida ili natrijum-hidroksida, u odgovarajućem rastvoru, na primer u alkoholu, kao na primer etanolu ili propanolu.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na jedinjenja sa formulom (V)

N-oksidnih formi, farmaceutski prihvatljivih adicijskih soli i njihove sterohemijske izomerne forme, gde

Svaki X je nezavisno N ili CH;

R1 je fenil, naftalenil ili heterociklil; gde

svaki pomenuti fenil ili naftalenil je ponekad supstituisan sa jednim ili dva supstituenta

svaki nezavisno izabran iz halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, polihaloC1-6alkila, arila, hidroksi, cijano, amino, C1-6alkilkarbonilamino, C1-6alkilsulfonilamino, hidroksikarbonila, C1-6alkoloksikarbonila, hidroksiC1-6alkila, C1-6alkiloksimetila, aminometila, C1-6alkilaminometila, C1-6alkilkarbonilaminometila, C1-6alkilsulfonilaminometila, aminosulfonila, C1-6alkilaminosulfonila ili heterociklila;

R2 je vodonik, -CH2-R5, trifluorometil, -C(=O)-R6 ili –CH2-NR7R8; gde svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi,

C1-6alkiloksiC1-6alkiloksi, C1-6alkilkarboniloksi, piperazinila,

N-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ili triazolila;

svaki R6 je nezavisno izabran iz vodonika, C1-6alkiloksi, amino ili mono- ili di(C1-6alkil)amino, C1-6cikloalkilamino, hidroksiC1-6alkilamino, piperazinila, mono- ili di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino

N-metilpiperazinila, morfolinila ili tiomorfolinila;

svaki R7 i R8 su nezavisno izabrani iz vodonika, C1-6alkila, C1-6alkilkarbonila, C1-6alkilsulfonila ili mono- ili di(C1-4alkil)aminosulfonila;

R3 je vodonik, hidroksimetil, aminometil ili mono- ili di(C1-6alkil)aminometil;

R4 je vodonik ili C1-6alkil;

gore pomenuti aril je fenil ili naftalenil; gde

svaki pomenuti fenil ili naftalenil je ponekad supstituisan sa jednim ili dva supstituenta

svaki nezavisno izabran iz halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, trifluorometila,

cijano ili hidroksikarbonila; i

gore pomenuti heterociklil je furanil, pirolil, pirolinil, pirolidinil, dioksolil,

oksazolil, tiazolil, imidazolil, imidazolinil, imidazolidinil, pirazolil,

pirazolinil, pirazolidinil, izoksazolil, izotiazolil, oksadiazolil, triazolil,

tiadiazolil, piranil, piridinil, piperidinil, dioksanil, morfolinil, diatianil, tiomorfolinil, piridazinil, pirimidinil, pirazinil, piperazinil, tiazinil, tritianil, indolizinil, indolil, indolinil, benzofuranil, benzotiofenil, imidazolil, benzoimidazolil, benztiazolil, purinil, kinolizinil, kinolinil, cinolinil, ftlazinil, kinazolil, kinaksolinil ili naftiridinil; gde

svaki pomenuti heterocikal ponekad je supstituisan a jednim ili dva supstituenta svaki

nezavisno izabran od halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, cijano, amino ili mono- di(C1-4alkil)amino.

Grupe interesantnih, poželjnih, još traženijih jedinjenja mogu da se definišu za jedinjenja sa formulom (V) u skladu sa grupom definisanom za jedinjenja sa formulom (I).

Novi intermedijeri sa formulom (V) mogu da se pripreme uz pomoć:

a) Konvertovanja intermedijera sa formulom (V), gde R2 je –CH2OH i R4 je vodonik, ovde označeni kao intermedijeri sa formulom (V-a), u intermedijere sa formulom (V) gde R2 je različit od –CH2OH, ovde označeni kao intermedijeri sa formulom (V-b), preko reakcije koja je poznata stanju tehnike ili transformisanja funkcionalnih grupa. Na primer alkoholi sa formulom (V-a) mogu da se konvertuju u amine, estere i etere. Amini mogu da se transformišu u odgovarajuće amine te primerni amini mogu da se konvertuju u sekundarne ili tercijarne amine.

b) Novi intermedijeri sa formulom (V-a) mogu da se prirede u jednom koraku reakcijom intermedijera sa formulom (VI) sa 1,4-dioksan-2,5-diolom te odgovarajućom boroničnom kiselinom (VII), gde R1 je definisan ranije, u prikladnom rastvaraču, na primer u alkoholu, kao etanolu.

c) Novi intermedijeri sa formulom (V-b) mogu da se prirede reakcijom intermedijera sa formulom (VI) sa odgovarajućim ketonom sa formulom (VIII) u prisutnosti odgovarajućeg reagensa, kao tetraks(etanolato)titanijum ili natrijum borohidrat u odgovarajućem rastvaraču, na primer 1,2-dihloroetanu.

d) Novi intermedijeri sa formulom (V), gde R2 je –COOH ovde označeni kao jedinjenja sa formulom (V-c) mogu da se prirede u jednom koraku uz pomoć reakcije intermedijera sa formulom (VI) sa 2-okso-propanoične kiseline i odgovarajuće boronične kiseline sa formulom (VII), gde R1 je definisan ranije, u odgovarajućem rastvaraču, na primer 1,2-diklorometanu.

Intermedijeri sa formulom (V-c), gde R2 je –COOH mogu da se konvertuju u intermedijere sa formulom (V), gde R2 je –C(=O)-R6, preko reakcija koje su poznate stanju tehnike ili transformisanjem funkcionalnih grupa, na primer konverzija u amine i amide.

Intermedijeri sa formulom (XI) mogu da se pripreme reakcijom intermedijera sa formulom (IX) sa piperidinom u odgovarajućem rastvaraču, na primer dihlorometanu.

Intermedijeri sa formulom (IX) mogu da se pripreme reakcijom odgovarajućeg intermedijera sa formulom (X) sa intermedijerom sa formulom (IV) u prisutnosti odgovarajućih reagenata kao N-(etilkarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propandiamin, monohidrohlorid (EDC) i 1-hidroksi-1H-benzotiazol (HOBT). Reakcija može da se izvede u prisutnosti baze kao trietilamina, u odgovarajućem rastvaraču, kao na primer, mješavine dihlorometana i tetrahidrofurana.

Intermedijeri sa formulom (X) mogu da se prirede reakcijom intermedijera sa formulom (VI) sa intermedijerom sa formulom (XII) u prisutnosti natrijum hidroksida u prikladnom rastvaraču, kao na primer tertahidrofuran, posle čega sledi neutralizovanje sa hloro-vodoničnom kiselinom i dodavanje natrijum karbonata.

Jedinjenja sa formulom (I) i neki intermedijeri mogu da imaju najmanje jedan stereogeni centar u svojoj strukturi. Ovaj stereogeni centar može da bude prisutan u R ili S konfiguraciji.

Jedinjenja sa formulom (I) kako su prezentovani u ovde opisanim procesima su opšte uzeto racemične smese enantiomera, koji mogu da budu odvojeni jedan od drugoga uz pomoć procedura koje su poznate stanju tehnike. Racemična jedinjenja sa formulom (I) mogu da budu konvertovana u odgovarajuće forme dijastereoizomernih soli uz pomoć reakcije sa odgovarajućom hiralnom kiselinom. Pomenute forme dijastereoizmernih soli se naknadno odvajaju, na primer, selektivno ili frakcionim kristalizovanjem, a enantiomeri su oslobođeni od njih uz pomoć alkalija. Alternativan način separiranja enentiomernih formi jedinjenja sa formulom (I) uključuje tekuću hromatografiju uz pomoć hiralne stacionarne faze. Pomenute čiste stereohemijski izomerne forme mogu takođe da se deriviraju iz odgovarajućih čistih stereohemijskih izomernih formi odgovarajućeg startnog materijala uz uslov da reakcija nastupa stereospecifično. Poželjno je da kada se derivira neki specifični stereoizomer, pomenuto jedinjenje da se sintetiše uz pomoć stereospecifičnih metoda pripreme. Ovi metodi uključuju enentiomerno čist početni materijal.

Jedinjenja sa formulom (I), farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli i njihove stereoizomerne forme imaju vredne farmakološke karakteristike u tome da poseduju inhibitorni efekat protiv histonske deacetilaze (HDAC).

Ovaj pronalazak osigurava metod za inhibiranje nenormalnog rasta ćelija, uključujući transformisanih ćelija uz pomoć davanja efektivne količine jedinjenja iz ovoga pronalaska. Nenormalan rast ćelija se odnosi na rast ćelija koji je nezavisan od normalnih regulatornih mehanizama (na primer, nestanak kontaktne inhibicije). Ovo uključuje inhibiciju rasta tumora direktno ili preko kočenja rasta, terminalne diferencijacije i/ili apoptoze tumorskih ćelija i indirektno preko inhibiranja neovaskulizacije tumora.

Ovaj pronalazak takođe donosi i metod za inhibiranje rasta tumora uz pomoć davanja efektivne količine jedinjenja iz ovoga pronalaska, subjektu, na primer sisaru (i posebnije čoveku) koji treba takav tretman. Posebno, ovaj pronalazak donosi metod za inhibiranje rasta tumora uz pomoć davanja efektivne količine jedinjenja iz ovoga pronalaska. Primeri tumora koji mogu da budu inhibirani, bez da se pronalazak ograničava samo na njih, su rak pluća (na primer, adenokarcinom i rak velikih ćelija pluća), rak pankreasa (na primer, rak pankreasa kao, na primer egzokrini karcinom pankreasa), rak debelog creva (na primer, kolorektalni karcinomi, kao na primer adenokarcinom debelog creva i adenom debelog creva), rak prostate uključujući napredne bolesti, hematopoetske tumore limfalne linije (na primer, limfocitna leukemija, limfom B-ćelija, Burkitov limfom), mijeloidne leukemije (na primer, akutna mielogena leukemija (AML)), tiroidni folikularni rak, mielodisplastični sindrom (MDS), tumori mezenhimalnih organa (na primer, fibrosarkomi i rabdomiosarkomi), melanomi, teratokarcinomi, neuroblastomi, gliomi, benigni tumor kože (na primer, keratokantomi), rak dojke (na primer, napredni rak dojke), karcinom bubrega, karcinom jajnika, karcinom bešike i epidermalni karcinom.

Jedinjenje u skladu sa pronalaskom može da se koristi za druge terapeutske svrhe, na primer:

a) senzitizacija tumora za radioterapiju uz pomoć davanja jedinjenja u skladu ovoga pronalaska, tokom ili posle zračenja tumora za tretiranje raka;

b) tretiranje artropatija i osteopatoloških stanja kao reumatoidnog artritisa, osteoartritisa, juvenilnog artritisa, giht, poliartritis, psorijazni artritis, ankilozni spondilitis i sistemski lupus eritematozis;

c) inhibiranje proliferiranja ćelija maznih mišića uključujući vaskularne proliferativne poremećaje, ateroskleroze i restenoze;

d) tretiranje stanja zapaljenja i dermalnih stanja kao ulcerativni kolitis, Kronovu bolest, alergijski rinitis, graft-naspram-host reakcije, konjuktivitisa, astme, ARDS, Beketova bolest, odbacivanje transplantata, urtikarija, alergijski dermatitis, alopecia areta, eksantem, ekcem, dermatomizitis, akne, dijabetes, sistemski lupus eritematosis, Kavasaki bolest, multipla skleroza, emfizem, cistička fibroza i hronični bronhitis;

e) tretiranje endometroze, uterine fibroze, disfunkcionalno uterino krvarenje i endometrijaske hiperplazije;

f) tretiranje okularnu vaskulizaciju uključujući vaskulopatiju koja delije na retinalne i horoidalne krvne sudove;

g) tretiranje kardijačnu disfunkciju;

h) inhibiranje imunosupresivnih stanja kao na primer tretman HIV infekcija;

i) tretiranje renalnu disfukciju;

j) supresiranje endokrinih poremećaja;

k) inhibiranje disfunkcije glukoneogeneze;

l) tretiranje neuropatologiju, na primer Parkinsonovu bolest ili neuropatologiju koja dovodi do kognitivne poremećaje, na primer Alchajmerova bolest ili neuronske bolesti koje su povezane sa poliglutaminom;

m) tretiranje psihijatrijskih poremećaja, na primer šizofreniju, bipolarni poremećaj, depresiju, napetost i psihozu;

n) inhibiranje neuromuskularne patologije, na primer, amilotropnu lateralnu sklerozu;

o) tretiranje spinalnu muskularnu atrofiju;

p) tretiranje drugih patogenih stanja prikladna za tretman uz pomoć pojačavanja ekspresije nekog gena;

q) pojačavanje genske terapije;

r) inhibiranje adipogeneze;

s) tretiranje parazitoze kao na primer malariju.

Tako, ovaj pronalazak razotkriva jedinjenja sa formulom (I) za upotrebu kao lek, a takođe i upotrebu ovih jedinjenja sa formulom (I) za proizvodnju leka za tretman jednoga ili više od pomenutih stanja.

Jedinjenja sa formulom (I), njihove farmaceutski prihvatljive kisele adicijske soli i stereoizmerne forme mogu da poseduju vredne dijagnostičke karakteristike u tome da isti mogu da se koriste za detektovanje ili identifikovanje HDAC u biološkom uzorku što obuhvata detektovanje ili merenje formiranja kompleksa među označenog jedinjenja i HDAC.

Metodi detektovanja ili identifikovanja mogu da koriste jedinjenja koja su označena sa agensima za označavanje kao na primer radioizotopima, enzimima, fluorscentnim supstancijama, luminoznim supstancijama i sl. Primeri za radioizotope uključuju 125I, 131I, 3H i 14C. Enzimi su obično detektabilni uz pomoć konjugacije odgovarajućeg supstrata koji tokom katalize stvara vidljivu reakciju. Takvi primeri uključuju, na primer, beta-galaktozidazu, beta-glukozidazu, alkalnu fosfatazu, peroksidazu i malat dehidrogenazu, poželjno peroksidazu iz hrena. Luminozne supstancije uključuju, na primer, luminol, derivate luminola, luciferin, aekvorin i lucifarazu.

Biološki primerci mogu da se definišu kao telesna tkiva ili telesne tečnosti. Primeri telesnih tečnosti su cerebrospinalna tečnost, krv, plazma, serum, urin, sputum, pljuvačka i sl.

U vezi sa njihovim korisnim farmakoloških karakteristika, pomenuta jedinjenja mogu da se formulišu u različite farmaceutske forme sa ciljem primene na pacijentu.

Da se pripreme farmakološke kompozicije iz ovoga pronalaska, efektivna količina pojedinog jedinjenja, u formi bazne ili kisele adicijske soli, kao aktivan sastojak treba da se kombinuje, u formi dobre mešavine, sa farmaceutski prihvatljivim kerijerom, koji može da bude zastupljen u mnogim formama u zavisnosti o formi preparata koji je poželjan za administraciju. Ove farmaceutske kompozicije su poželjne u unitarnim doznim formama, koje su prikladne, poželjno za oralnu administraciju, rektalnu, perkutanu ili uz pomoć parenteralne injekcije. Na primer, kod pripremanja kompozicija u formi oralnih doza, bilo koji od opštih farmaceutskih medijuma može da se primeni, kao na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično u slučaju oralnih tečnih preparata kao suspenzija, sirupa, eliksira i rastvora; ili tvrdih kerijera kao skrob, šećeri, kaolin, lubrikanti, binderi, agensi za raspadanje i slično u slučaju pripreme prahova, pilula, kapsula i tableta.

Zbog njihove primene u administraciji, tablete i kapsule predstavljaju naj-naprednije oralne dozne forme gde se upotrebljavaju tvrdi farmaceutski kerijeri. Za parenteralne kompozicije, kerijeri će obično da obuhvataju sterilnu vodu, najmanje u velikom dijelu, ali takođe mogu da budu upotrebljeni i drugi sastojci, kako bi se na primer dobila rastvorivost. Rastvori za injektiranje, na primer, mogu da se pripreme sa kerijerima koji sadrže slani rastvor, rastvor glikoze ili mešavine slanog rastvora i rastvora glikoze. Suspenzije za injektiranje mogu takođe da se pripreme, ali tada se koriste odgovarajući tečni kerijeri, agensi za suspendovanje i sl. U kompozicijama koje su pogodne za perkutanu administraciju, kerijer ponekad obuhvata agens za pojačavanje penetracije i/ili odgovarajući agens za navlaživanje, koji je ponekad kombinovan sa pogodnim aditivima bilo koje prirode u manjim količinama, a koji ne uzrokuju signifikantan negativni efekat za kožu. Pomenuti aditivi mogu da ubrzaju administraciju kroz kožu i/ili mogu da pomognu za pripremanje željenih kompozicija. Ove kompozicije mogu da se administriraju na različite načine, na primer kao transdermalni flaster, lokalni ili u obliku masti.

Posebno je korisno da se već pomenuta farmaceutska kompozicija formuliše u doznoj jedinici za jednostavnu administraciju i uniformnosti doze. Dozna jedinica kako se koristi u specifikaciji i zahtevima, odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za unitarno doziranje, a svaka jedinica sadrži već određenu količinu aktivnog sastojaka, izračunatu da produkuje željeni terapijski efekat, u asocijaciji sa potrebnim farmaceutskim kerijerom. Primeri takvih formi doznih jedinica su tablete (uključujući izračunate ili zamotane tablete), kapsule, pilule, pakete sa prahom, vafere, rastvori za injektiranje ili suspenzije, čajne kašike, kašike za supu i sl. i njihove manje količine.

Stručnjaci mogu jednostavno da odrede efektivnu količinu uz pomoć rezultata testova koji su ovde prezentovani. Opšte uzeto, smatra se da terapeutski efektivna količina iznosi od 0.005 mg/kg do 100 mg/kg od telesne težine, a posebno količina od 0.005 mg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Može da bude prikladno da se željena doza administrira na dva, tri ili više puta u manjim sub-dozama tokom odgovarajućih intervala tokom jednog dana. Pomenute sub-doze mogu da budu formulisane kao dozne jedinice, na primer koje sadrže 0.5 do 500 mg, a posebno od 10 mg do 500 mg aktivnog sastojaka po jedinične dozne forme.

Drugi aspekt ovoga pronalaska je kombinacija HDAC-inhibitor sa drugim agensom protiv raka, posebno za upotrebu kao lek, još specifičnije u tretmanu raka ili sličnih bolesti.

Za tretman već pomenutih stanja, jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da obuhvate kombinaciju s jednim ili više drugih medicinskih agenasa, posebno, sa drugim agensima protiv raka. Primeri agenasa protiv raka su:

- jedinjenja sa platinom, kao na primer cisplatina, karboplatina ili aksaloplatina;

- taksan jedinjenja, na primer paklitaksel ili docetaksel;

- inhibitore topoizmeraze I kao na primer kamptotecin jedinjenja , na primer irinitekan ili topotekan;

- inhibitore topoizmeraze II, kao na primer anti-tumor podofilotoksin derivate, na primer etoposid ili teniposid;

- anti-tumorski vinka alkaloidi, na primer vinblastin, vinkristin ili vinorelbin;

- anti-tumorski derivati nukleozida, na primer 5-fluorouracil, gemcitabin ili kapecitabin;

- alkilirajući agensi kao azotni senf ili nitrozourea, na primer ciklofosfamid, hlorambucil, karmustin ili lomustin;

- anti-tumorski derivati antraciklina, na primer daunorubicin, doksorubicin, idarubicin ili mitoksantron;

- HER2 antitela, na primer trastuzumab;

- antagonisti estrogenskog receptora ili modulatori selektivnog estrogenskog receptora, na primer tamoksifen, toremifen, droloksifen, faslodeks ili raloksifen;

- inhibitori aromataze, kao na primer eksemestan, anastrozol, letrazol i vorozol;

- agensi za diferenciranje kao na primer vitamin D i agensi blokatori metabolizma retinoične kiseline (RAMBA), na primer akutan;

- inhibitori DNK metil transferaza, na primer azacitidin;

- inhibitori kinaze, na primer flavoperidol, imatinib mesilat ili gefitinib;

- inhibitori farneziltransferaze;

- drugi HDAC inhibitori;

- inhibitori ubikvitin-proteosomskog puta, na primer Velkad; ili

- Jondelis.

Termin „platinsko jedinjenje“ ovde se koristi da se označi bilo kakvo inhibiranje rasta neke tumorske ćelije uz pomoć jedinjenja koje sadrži platinu u formi jona.

Termin „toksan jedinjenja“ indicira klasu jedinjenja koja imaju toksanski prsten i su povezana sa ili su derivirana iz ekstrakta nekih vrsta tise (Taxus).

Termin „inhibitori topoizmeraze“ se koristi da se označe enzimi koji su sposobni menjanja DNK topologiju u eukariotskim ćelijama. Oni su kritični za neke važne ćelijske funkcije i ćelijsku proliferaciju. Postoje dve klase topoizomeraza u eukariotskim ćelijama, pit I i tip II. Topoizomeraza I je monomerni enzim sa molekularnom masom od otprilike 100.000. Enzim se veže za DNK i uvodi prolazni jedno-lančani lom, odmotava dvostruku zavojnicu (ili dozvoljava da se ista odmota) i posle toga ponovno zatvara lom pre disociranja sa DNK lanca. Topoizmeraza II ima slični mehanizam delovanja koji uključuje uvođenje lomova u DNK lanac ili nastanak slobodnih radikala.

Termin „kamptotecin jedinjenja“ se koristi da se navedu jedinjenja koja su povezana sa ili su derivirana iz osnovnog jedinjenja kamptotecin koje je alkaloid koji ne može da se rastvori u vodi derivirano iz kineskog drveta Camptothecin acuminata i iz indijskog drveta Nothapodytes foetida.

Termin „podofilotoksin jedinjenja“ se koristi da se navedu jedinjenja koja su povezana sa ili su derivirana iz osnovnog jedinjenja podofilotoksina, koje je ekstrahovano iz mandragore.

Termin „anti-tumorski vinka alkaloidi“ se koristi da se navedu jedinjenja koja su povezana sa ili su derivirana iz ekstrakta iz biljke Vinca rosea.

Termin „alkilirajući agensi“ obuhvata šaroliku grupu hemikalija koje imaju zajedničku karakteristiku da imaju kapacitet dodavati, u fiziološkim uslovima, alkilne grupe biološkim vitalnim makro-molekulima kao šta je DNK. Kod najvećeg broja najvažnijih agenasa, kao na primer azotnog senfa i nitrozourea, aktivni alkilirajući ostaci se stvaraju in vivo nakon složenih degenerativnih reakcija, od kojih su neke enzimatske. Najvažnija farmakološka delovanja alkilirajućih agenasa su ona koja narušavaju fundamentalne mehanizme koje se odnose na ćelijsku proliferaciju, posebno na sintezu DNK i deobu ćelije. Kapacitet alkilirajućih agenasa da interferiraju sa funkcijom i integritetom DNK u tkivima koje brzo proliferiraju osigurava bazu za njihovu terapeutsku primenu i za mnogo od njihovih toksičnih karakteristika.

Termin „anti-tumor antraciklin jedinjenja“ obuhvata antibiotike koji su dobiveni iz gljive Strep. peuticus var. caesus i njihovih derivata, a karakteristika je da imaju tetraciklinski prsten sa neobičnim šećerom, daunosaminom, povezan sa glikozidnom vezom.

Amplifikovanje humanog receptora 2 za epidermalni faktor rasta (HER 2) u primarnim karcinomima dojke korelira sa slabom kliničkom prognozom nekih pacijenata. Trastuzumab je visoko purifikovano humanizirano monoklonsko IgG1 kapa antitelo dobiveno iz rekombinantne DNK koje se veže sa visokim afinitetom i je specifično za ekstracelularni domen HER 2 receptora.

Mnogu karcinomi dojke imaju estrogene receptore i rast ovih tumora može da bude stimulisan uz pomoć estrogena. Termini „antagonisti estrogenskih receptora“ i „selektivni modulatori estrogenih receptora“ se koriste da se navedu kompetetivni inhibitori estradiola koji se vežu na estrogene receptore (ER). Selektivni modulatori estrogenih receptora, kada su vezani na ER, dovode do promena u tri-dimenzionalnoj formi receptora, modulirajući njegovu sposobnost vezanja na estrogene responsivne elemente (ERE) na DNK.

Kod žena koje su prošle menopauzu, osnovni izvor estrogena je konverzija adrenalnih i ovarijskih androgena (androstenedion i testosteron) u estrogene (estron i estradiol) uz pomoć enzima aromataza u perifernim tkivima. Gubitak estrogena kroz inhibiciju aromataze ili inaktivaciju efektivnog ili selektivnog tretman kod nekih pacijentica koje su prošle menopauzu sa rakom dojke koji je ovisan o hormonima.

Termin „antiestrogen agens“ se koristi da se navedu ne samo antagonisti estrogenih receptora i selektivni modulatori estrogenih receptora već takođe i inhibitori aromataze kao šta je ranije diskutovano.

Termin „agensi za diferenciranje“ obuhvata jedinjenja koja, na različite načine, inhibiraju proliferaciju ćelija i dovode do diferencijacije. Vitamin D i retinoidi su poznati kao važni regulatori rasta i diferencijacije veoma širokog raspona normalnih ili malignih tipova ćelija. Agensi za blokiranje metabolizma retinoičke kiseline (RAMBA) povećavaju nivo endogene retinoičke kiseline uz pomoć inhibiranja katabolizma retinoičke kiseline koji se provodi preko citohroma P450.

Promene u metilaciji na DNK spadaju među najčešće abnormalnosti u humanim neoplazijama. Hipermetilacija u promotoru nekih gena obično je povezana sa inaktivacijom isti gena. Termin „inhibitori DNK metil transferaze“ se koristi da se navedu jedinjenja koja deluju kroz farmakološke inhibicije DNK metil transferaze i reaktivacije ekspresiju tumor-supresorskih gena.

Termin „inhibitori kinaze“ obuhvata potentne inhibitore kinaza koji su involvirani u progresiji ćelijskog ciklusa i programiranoj smrti ćelija (apoptoza).

Termin „inhibitori farneziltransferaze“ se koristi da se navedu jedinjenja koja su dizajnirana da spreče farnezilaciju Ras i drugih intercelularnih belančevina. Isti imaju efekat na proliferaciju malignih ćelija i na preživljavanje.

Termin „drugi inhibitori HDAC“ obuhvata, ali time nije ograničen:

- karboksilate, na primer butirat, cinamičnu kiselinu, 4-fenilbutirat ili valproičnu kiselinu;

- hidroksamične kiseline, na primer suberoilanilid hidroksamička kiselina (SAHA), analozi SAHA koji sadrže piperazin, biaril hidroksamat A-161906 i njihovi karbozolileter-, tetrahidropiridin- i tetralon- analozi, biciklički aril-N-hidroksikarboksamide, piroksamide, CG-1521, PXD-101, sulfonamid hidroksamična kiselina, LAQ-824, LBH-589, trihistatin A (TSA), okamflatin, skriptaid, triciklički molekuli koji su povezani sa skriptaidom, m-karboksi cinamična kiselina, bihidroksamična kiselina (CBHA), hidroksamične kiseline koje su slične CBHA, analog trapoksin-hidroksamične kiseline, R306465 i njemu slične benzolil- i heteroalril-hidroksamične kiseline, aminosuberati i malonildiamidi;

- ciklički tetrapeptidi, na primer trapoksin, apidicin, depsipeptid, jedinjenja povezana sa spiruhistatinom, RedFK-228, ciklički tetrapeptidi koji sadrže sulfhidril (SCOP), ciklički tetrapeptidi koji sadrže hidroksamičku kiselinu (CHAP), TAN-174 i azumamidi;

- bezamidi, na primer MS-275 ili CI-994, ili

- depudecin.

Termin „inhibitori ubikvitinskog-proteosomatskog puta“ se koristi da se navedu jedinjenja koja inhibiraju ciljno mjesto ćelijskih proteina u proteosomu, uključujući proteine regulatore ćelijskog ciklusa.

Za tretman raka, jedinjenja u skladu sa pronalaskom mogu da se administriraju pacijentu kako je ranije opisano, zajedno sa zračenjem. Zračenje znači jonizacijsko zračenje, a posebno gama zračenje, ono koje nastaje emisijom linearnih akceleratora ili radionuklida koji su u opštoj upotrebi danas. Zračenje tumora sa radionuklidima može da bude spoljno ili unutrašnje.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kombinacije, u skladu sa istim, anti-tumorskog agensa sa inhibitorom HDAC u skladu sa ovim pronalaskom.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kombinacije, u skladu sa istim, koje se koriste u medicinskoj terapiji, na primer za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na kombinacije, u skladu sa istim, koje se koriste za inhibiciju rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na metod za inhibiranje rasta tumorskih ćelija u humanom subjektu koji obuhvata administriranje pacijentu efektivnu količinu neke kombinacije u skladu sa pronalaskom.

Ovaj pronalazak dalje donosi metod za inhibiranje abnormalnog rasta ćelija, uključujući transformisanih ćelija, uz pomoć administriranja efektivne količine neke kombinacije u skladu sa pronalaskom.

Drugi medicinski agens i HDAC inhibitor mogu da budu administrirani simultano (na primer, u odvojenim ili unitarnim kompozicijama) ili jedan posle drugoga u bilo kojem redosledu. U poslednjem slučaju, dva jedinjenja će da budu administrirana tokom nekog perioda u količini i tako da ih je dovoljno da osiguraju da se postigne napredan ili sinergističan efekat. Treba da se razume da će poželjan metod i način administriranja i odgovarajuće dozne količine i režimi za svaku komponentu iz kombinacije da zavise o pojedinom drugom medicinskom agensu i inhibitoru HDAC koji se administrira, njihove rute administriranja, pojedinog tumora koji se tretira i pojedinom domaćinu koji se tretira. Optimalan metod i način administriranja i dozne količine mogu da se lako odrede od strane stručnjaka uz pomoć konvencionalnih metoda u skladu sa informacijama koje su ovde prezentovane.

Platinska jedinjenja se administriraju u dozi od 1 do 500 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, na primer 50 do 400 mg/m2, posebno za cisplatinu u dozama od oko 75 mg/m2, a za karboplatinu u dozama od oko 300 mg/m2 tokom tretmana.

Taksanska jedinjenja se administriraju u dozama od oko 50 do 400 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, na primer 75 do 250 mg/m2, posebno za paklitaksel u dozama od oko 175 do 250 mg/m2, a za docetaksel u dozama od oko 75 do 150 mg/m2 tokom tretmana.

Kamptotecinska jedinjenje se administrira u dozama od 0.1 do 400 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, na primer 1 do 300 mg/m2, posebno za irinotekan u dozama od oko 100 do 350 mg/m2 i za topotekan u dozama od oko 1 do 2 mg/m2 tokom tretmana.

Anti-tumorski derivati podofilotoksina se daju u dozama od 30 do 300 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, na primer od 50 do 250 mg/m2, posebno za etoposid u dozama od oko 35 do 100 mg/m2 i za teniposid u dozama od oko 50 do 250 mg/m2 tokom tretmana.

Anti-tumorski vinka alkaloidi se administriraju u dozama od 2 do 30 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, posebno za vinblastin u dozi od oko 3 do 12 mg/m2, za vinkristin u dozi od oko 1 do 2 mg/m2, a za vinorelbin u dozi od oko 10 do 30 mg/m2 tokom tretmana.

Anti-tumorski derivati nukleozida se administriraju u dozama od 200 do 2500 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, na primer 700 do 1500 mg/m2, posebno za 5-FU u dozi od 200 do 500 mg/m2, za gemcitabin u dozi od oko 800 do 1200 mg/m2, a za kapecitabin u dozi od oko 1000 do 2500 mg/m2 tokom tretmana.

Alkilirajući agensi kao na primer azotni senf ili nitrozourea se administriraju u dozama od 100 do 500 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, na primer 120 do 200 mg/m2, posebno za ciklofosfamid u dozi od oko 100 do 500 mg/m2, za hlorambucil u dozi od oko 0.1 do 0.2 mg/kg. Za karmustin u dozi od oko 150 do 200 mg/m2, a za lomustin u dozi od oko 100 do 150 mg/m2 tokom tretmana.

Anti-tumorski derivati antraciklina se administriraju u dozama od 10 do 75 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, na primer 15 do 60 mg/m2, posebno za doksirubicin u dozi od oko 40 do 75 mg/m2, za daunorubicin u dozi od oko 25 do 45 mg/m2, a za idarubicin u dozi od oko 10 do 15 mg/m2 tokom tretmana.

Trastuzumab se administrira u dozi od 1 do 5 mg po kvadratnom metru (mg/m2) telesne površine, posebno 2 do 4 mg/m2 tokom tretmana.

Antiestrogen agens se administrira u dozi od oko 1 do 100 mg po danu u zavisnosti o pojedinom agensu i stanju koje se tretira. Tamoksifen se administrira oralno u dozi od 5 do 50 mg, poželjno od 10 do 20 mg dva puta na dan, pod uslovom da se terapija nastavlja tokom dovoljno vremena da se postigne i održi terapeutski efekat. Toremifen se administrira oralno u dozama od oko 60 mg po danu, uz uslov da se terapija nastavlja tokom dovoljno vremena da se postigne i održi terapeutski efekat. Anastrozol se administrira oralno u dozama od oko 1 mg po danu. Doroloksifen se administrira oralno u dozama od oko 20-100 mg dva puta na dan. Raloksifen se administrira oralno u dozama od oko 60 mg jednom na dan. Eksemesten se administrira oralno u dozama od oko 25 mg po danu.

Ove doze mogu da se administriraju na primer jednom, dva puta ili više puta tokom tretmana, koji može da se ponovi na primer svakih 7, 14, 21 ili 28 dana.

Prema njihovim korisnim farmakološkim karakteristikama, jedinjenja iz kombinacija u skladu sa ovim pronalaskom, na primer drugi medicinski agens i inhibitor HDAC mogu da se formulišu u različite farmaceutske forme sa ciljem primene. Komponente mogu da se formulišu odvojeno u individualnim farmaceutskim kompozicijama ili u unitarnim farmaceutskim kompozicijama koje sadrže obe komponente.

Ovaj pronalazak zbog toga se takođe odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata drugi medicinski agens i inhibitor HDAC zajedno sa jednim ili više farmaceutskih kerijera.

Ovaj pronalazak također se odnosi na kombinaciju u skladu sa pronalaskom u formi farmaceutske kompozicije koja obuhvata anti-tumorski agens i inhibitor HDAC u skladu sa pronalaskom zajedno sa jednim ili više farmaceutskih kerijera.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu kombinacije u skladu sa pronalaskom u proizvodnji farmaceutske kompozicije za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na produkt koji sadrži kao prvi aktivni sastojak HDAC inhibitor u skladu sa pronalaskom, a kao drugi aktivni sastojak jedan anti-tumorski agens, kao kombinovana preparacija za simultano, odvojeno ili pojedinačno korišćenje u tretmanu pacijenta koji pati od raka.

Eksperimentalni deo

Sledeći primeri su osigurani sa ciljem ilustrovanja pronalaska.

U daljnjem tekstu, „EDC“ je definisan kao N’-(etilkarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propandiamin, monohidrohlorid, „DCM“ je definisan kao dihlorometan, „DIPE“ je definisan kao diizopropil eter, „DMF“ je definisan kao N,N-dimetilformamid, „EtOAc“ je definisan kao etil acetat, „EtOH“ je definisan kao etanol, „HOBT“ je definisan kao 1-hidroksi-1H-benzotriazol, „MeOH“ je definisan kao metanol, „TFA“ je definisan kao trifluorooctena kiselina i „THF“ je definisan kao tetrahidrofuran.

A. Preparacija intermedijernih jedinjenja

Primer A1

a) Preparacija intermedijera 1

Mešavina 2-(1-piperazinil)-5-pirimidinkarboksilne kiseline, eter estera (0.016 mol), (2-feniletenil)-boronične kiseline (0.016 mol) i 1,4-dioksan-2,5-diola (0.016 mol) u EtOH (250 ml) je mešana tokom 2 dana na sobnoj temperaturi, a tada je rastvarač isparen (vakuum). Ostatak je rastvoren u DCM i vodi, a organski sloj je separiran, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko silika gela (15-40 μm) (eluent: DCM/MeOH 97/1). Čiste frakcije su isparene, a to dovodi do nastanka 4 g (61 %) intermedijera 1, sa tačkom topljenja od 128º C.

Esteri, koji odgovaraju intermedijeru 1, mogu da se odvoje hiralnom hromatografijom.

b) Preparacija intermedijera 2

Mešavina intermedijera 1 (0.0007 mol) u natrijum hidroksidu 1 N (10 ml) i THF (20 ml) je mešana tokom 48 h na sobnoj temperaturi. Dodana je hloro-vodonična kiselina 1N (10 ml). Rastvarač je isparen. Precipitat je filtriran, opran sa vodom, a tada sa DIPE i sve je osušeno, a to dovodi do nastanka 0.2 g (72 %) intermedijera 2, sa tačkom topljenja od 232º C.

c) Preparacija intermedijera 3

Trietilamin (0.012 mol), N’-(etilkarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propandiamin (0.00593 mol), 1-hidroksi-1H-benzotriazol (0.00593 mol) i O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroksilamin (0.00593 mol) su dodani u mešavinu intermedijera 2 (0.00395 mol) u mešavini DMC (70 ml) i THF (70 ml), a tada reakcijska mešavina je mešana tokom 3 dana na sobnoj temperaturi. Dodana je H2O. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije (eluent gradienta: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1). Frakcije produkta su sakupljene, a organski rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 1.5 g (84 %) intermedijera 3.

Primer A2

a) Preparacija intermedijera 4

Mešavina 2-(1-piperazinil)-5-pirimidinkarboksilne kiseline, etil estera (0.0042 mol), 1,4-dioksan-2,5-diola (0.0042 mol) i (E) [2-(4-hlorofenil)etenil]-boronične kiseline (0.0042 mol) u EtOH (100 ml) je mešana tokom 72 h na sobnoj temperaturi, izlivena je u vodu i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je separiran, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (1.8 g) je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko silika gela (15-40 μm) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1). Dve frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.85 F1 (ulje) i 0.25 g F2 (ukupan prinos: 63%). F1 je kristalizovan iz 2-propanon/DIPE. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.6 g intermedijera 4, sa tačkom topljenja od 110º C.

b) Preparacija intermedijera 5

Metansulfonil hlorid (0.0012 mol) je dodan na 5º C u rastvor intermedijera 4 (0.0006 mol) i trietil amina (0.0024 mol) u THF (15 ml) u uslovima protoka N2. Mešavina je dovedena do sobne temperature, a tada je mešana tokom 1 h i izlivena u ledenu vodu. Mešavina je ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.3 g intermedijera 5. Ovaj produkt se koristi direktno u sledećem reakcijskom koraku.

c) Preparacija intermedijera 6

Mešavina intermedijera 5 (0.0006 mol), morfolina (0.0009 mol) i kalijum karbonata (0.0018 mol) u acetonitrilu (30 ml) je mešana na 80º C tokom 15 h, izlivena je u vodu i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (0.27 g) je purifikovan uz pomoć kolonskoj hromatografiji preko silika gela (5 μm) (eluent: DCM/MeOH 100/0 do 90/10). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.085 g (29%) intermedijera 6.

d) Preparacija intermedijera 7

Mešavina intermedijera 6 (0.0002 mol) u natrijum hidroksidu 1N (1.5 ml) i THF (3 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 72 h. Dodana je hloro-vodonična kiselina 1N (1.5 ml). Mešavina je isparena do suvoće, a to dovodi do nastanka intermedijera 7. Ovaj produkt se koristi direktno u sledećem reakcijskom koraku.

e) Preparacija intermedijera 8

Mešavina intermedijera 7 (0.0002 mol), O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroksilamina (0.0002 mmol), EDC (0.0002 mol), HOBT (0.0002 mol) i trietil amina (0.0002 mol) u DMC/THF (10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h, izlivena u vodu i ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (0.095 g) je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko silika gela (5 μm) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.04 g (41%) intermedijera 8.

Primer A3

a) Preparacija intermedijera 11

Titanijum etilat (0.0085 mol) je dodan na sobnoj temperaturi u rastvor 2-(1-piperazinil)-5-pirimidinkarboksilne kiseline, etil estera (0.0042 mol) i 4-fenil-3-buten-2-on (0.0051 mol) u 1,2-dihloro-etanu (45 ml) u uslovima protoka N2. Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h. Dodano je NaBH(OAc)3 (0.0085 mol). Mešavina je mešana tokom 5 h i izlivena u ledenu vodu. Dodan je DCM. Mešavina je filtrirana preko celita. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (1.16 g) je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko kromasila (5 μm) (eluent: DCM/MeOH 100/0 do 95/5). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.12 g (8%) intermedijera 11.

b) Preparacija intermedijera 12

.Na

Mešavina intermedijera 11 (0.0003 mol) i natrijum hidroksida (0.0013 mol) u EtOH (15 ml) je mešana i refluksirana tokom 3 h, a tada je ohlađena do sobne temperature i isparena do suvoće. Ostatak je rastvoren u dietil eteru. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do 0.12 g (100%) intermedijera 12, sa tačkom topljenja > 260º C.

c. Preparacija intermedijera 13

EDC (0.0006 mol) i HOBT (0.0006 mol) su dodani na sobnoj temperaturi u rastvor intermedijera 12 m(0.0003 mol) u THF (15 ml) i DCM (15 ml) u uslovima protoka N2. Mešavina je mešana tokom 15 min. Dodan je O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0006 mol). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h, izlivena u ledenu vodu i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (0.25 g) je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko kromasila (5 μm) (eluent: DCM/MeOH 100/0 do 95/5). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.1 g (70%) intermedijera 13.

Primer A4

a) Preparacija intermedijera 14

Mešavina 2-(1-piperazinila)-5-pirimidinkarboksilne kiseline, etil estera (0.059 mol) u THF (300 ml) i natrijum hidroksida 1N (300 ml) je ostavljena da stoji preko noći na sobnoj temperaturi, a tada je mešana. Dodana je hloro-vodonična kiselina 1N (300 ml), a mešavina je mešana tokom 10 min. Dodan je natrijum karbonat (0.178 mol), a nastala mešavina je mešana tokom 10 min na sobnoj temperaturi, a tada je u malim porcijama dodan 1-[[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]oksi]-2,5-pirolidindion (0.059 mol), a reakcijska mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Mešavina je acidifikovana sa koncentriranom HCl, a precipitat je filtriran i osušen (vakuum), a to dovodi do 22.5 g (90%) intermedijera 14, sa tačkom topljenja od 218.5-221.2º C.

b) Preparacija intermedijera 15

Trietilamin (0.069 mol), tada EDC (0.0303 mol) i HOBT (0.0303 mol), a tada O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidrokilamin (0.0303 mol) je dodano u mešavinu intermedijera 14 (0.0233 mol) u DCM/THF (500 ml), a reakcijska mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 18 h. mešavina je razređena sa DCM i oprana sa vodom. Organski sloj je odvojen i opran sa 10% rastvorom natrijum karbonata. Odvojeni organski sloj je osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak je purifikovan felš-kolonskom hromatografijom (eluent: DCM/MeOH 100/0 - > 97.5/2.5 tokom 10 min). Frakcije produkta se sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 8.4 g (68%) intermedijera 15.

c) Preparacija intermedijera 16

Mešavina intermedijera 15 (0.016 mol) u piridinu (0.040 mol) i DCM (200 ml) je mešana preko noći na sobnoj temperaturi, a reakcijska mešavina je ekstrahovana sa vodom, a tada je vodeni sloj koncentriran i ko-isparen sa acetonitrilom. Ostatak (3.5 g) je purifikovan uz pomoć fleš-kolonskom hromatografijom (eluent: DCM/MeOH/NH3) 95/5/0.5). Frakcije produkta se sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 2.5 g (50%) intermedijera 16, sa tačkom topljenja od 70.8-93.9º C.

d) Preparacija intermedijera 17

(E)

Mešavina intermedijera 16 (0.002 mol), (E) [2-(4-fluorofenil)etenil]-boronične kiseline (0.002 mol) i 1,4-dioksan-2,5-diol (0.002 mol) u EtOH (25 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 min i izlivena u ledenu vodu. Dodan je NaHCO3. Mešavina je ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (0.68 g) je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko kromasila (5 μm) (eluent: DCM/MeOH 100/0 do 90/10). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.27 g (29%) intermedijera 17, sa tačkom topljenja od 90º C.

Primer A5

a) Preparacija intermedijera 18

.HCl

2-Okso-propanoična kiselina (0.0169 mol), tada 2-(1-piperazinil)-5-pirimidinkarboksilna kiselina, etil ester (0.0169 mol) su dodani u rastvor [2-(4-fluorofenil)etenil]-boronične kiseline (0.0169 mol) u DCM (150 ml). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 h. Dodani su 2-okso-propanoična kiselina (0.4 ekv.) i [2-(4-fluorofenil)etenil]-boronična kiselina (0.1 ekv.). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 h. Organski sloj je opran sa vodom, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (7.7 g) je purifikovan kolonskom hromatografijom preko silika gela (15-40 μm) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 92/8/0.1). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen. Ovaj ostatak (6 g) je rastvoren u HCl 3N. Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Precipitat je filtriran, opran sa vodom (minimalna količina) i osušen, a to dovodi do nastanka 2.8 g (36%) intermedijera 18.

b) Prepracija intermedijera 19

HOBT (0.0022 mol), tada EDC (0.0022 mol) su dodani u rastvor intermedijera 18 (0.0015 mol), N-metil-metanamina (0.0022 mol) i trietilamina (0.0075 mol) u DCM/THF (40 ml). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h, izlivena je u vodu i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak je rastvoren u DIPE. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.58 g (85%) intermedijera 19, sa tačkom topljenja od 195º C.

c) Preparacija intermedijera 20

.HCl

Mešavina intermedijera 19 (0.0011 mol) i litijum-hidroksida (0.0023 mol) u THF (20 ml) i vode (10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 min. Dodana je HCl 3N. THF je isparen. Precipitat je filtriran, opran sa vodom, a tada sa dietil eterom i osušen, a to dovodi do nastanka 0.45 g (82%) intermedijera 20.

d) Preparacija intermedijera 21

HOBT (0.0014 mol), tada EDC (0.0014 mol) su dodani na sobnoj temperaturi u rastvor intermedijera 20 (0.0009 mol), O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroksilamina (0.0014 mol) i trietilamina (0.0043 mol) u DCM/THF (50/50) (75 ml). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h, izlivena u vodu i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (0.7 g) je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko silika gela (5 μm) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.1 do 94/6/0.6). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.38 g (75%) intermedijera 21.

Primer A6

a) Preparacija intermedijera 22

Natrijum hidrid 60% (0.0085 mol) je dodan deo po deo pri 5º C u rastvor intermedijera 1 (0.0065 mol) u THF (60 ml) u uslovima protoka N2. Mešavina je mešana na 5º C tokom 15 min. Dodan je rastvor jodometana (0.0078 mol) u THF (5 ml) kap po kap. Mešavina je mešana na 5º C tokom 1 h, a tada je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 h, sve je izliveno u ledenu vodu i ekstrahovano sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (1.75 g) je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije preko silika gela (15-40 μm) (eluent: DCM/MeOH 99/1). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.87 g (34%) intermedijera 22.

b) Preparacija intermedijera 23

.HCl

Mešavina intermedijera 22 (0.0027 mol) i litijum-hidroksid monohidrata (0.0055 mol) u THF (40 ml) i vode (20 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h, acidifikovana sa HCl 1N. THF je isparen. Precipitat je filtriran, opran sa minimalnom količinom vode i osušen, a to dovodi do nastanka 0.91 g (83%) intermedijera 23.

c) Preparacija intermedijera 24

HOBT (0.0033 mol), tada EDC (0.0033 mol) su dodani na sobnoj temperaturi u rastvor intermedijera 23 (0.0022 mol), O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroksilamina (0.0033 mol) i trietilamina (0.01 mol) u DCM/THF (90 ml) u uslovima protoka N2. Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h, izlivena u vodu i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (1.3 g) je purifikovan na kolonskoj hromatografiji preko silika gela (15-40 μm) (eluent: DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.93 g (89%) intermedijera 24.

Primer A7

a) Preparacija intermedijera 25

Mešavina 2-(1-piperazinil)-5-piridilkarboksilne kiseline, etil estera (0.0085 mol), 1,4-dioksan-2,5-diola (0.0093 mol) i (E)-[2-(4-fluorofenil)etenil]-boronične kiselina (0.0042 mol) u EtOH (200 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 h, a tada je filtrirana. Filtrat je isparen. Ostatak je rastvoren u EtOAc. Organski sloj je opran sa zasićenim NaCl, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak (3.3 g) je rastvoren u dietil eteru i acidifikovan dodavanjem na 5º C kap po kap HCl 5-6N u izopropanolu (2 ml). Precipitat je filtriran, opran sa dietil eterom i osušen. Ova frakcije je rastvorena u vodi, dodan je K2CO3, a mešavina je ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 2.7 g (79%) intermedijera 25.

b) Preparacija intermedijera 26

.HCl

Mešavina intermedijera 25 (0.002 mol), litijum hidroksida (0.004 mol) u vodi (20 ml) i THF (40 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 15 h. Mešavina je koncentrirana. Dodana je hloro-vodonična kiselina 3N. Precipitat je filtriran, opran sa vodom, a tada sa dietil eterom i osušen, a to dovodi do nastanka 0.52 g (63%) intermedijera 26.

c) Preparacija intermedijera 27

Trietil amin (0.0057 mol), N’-(etilkarbonimidoil)-N,N-dimetil-1,3-propandiamin (0.0019 mol), 1-hidroksi-1H-benzotriazol (0.0019 mol) i O-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-hidroksilamin (0.0019 mol) su dodani u mešavinu intermedijera 26 (0.0012 mol) u mešavini DCM (50 ml) i THF (50 ml). Reakcijska mešavina je mešana tokom 24 h na sobnoj temperaturi, a tada je izlivena u H2O i ekstrahovana sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak je purifikovan kolonskom hromatografijom preko silika gela (eluent gradijenta: DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.2). Frakcije produkta su sakupljene, a organski rastvarač je isparen, a to dovodi do nastanka 0.55 g (91%). Ovaj ostatak je rastvoren u dietil eteru, precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.5 g intermedijera 27, sa tačkom topljenja od 133º C.

Primer A8

Preparacija intermedijera 28 i 29

intermedijer 28: slobodna baza

intermedijer 29: C2H2O4 (1:1)

Octeni anhidrid (0.014 mol) je dodan kap po kap pri 5º C u mešavinu intermedijera 3 (0.0014 mol), 4-N-N-dimetilaminopiridina (0.0095 g) i piridina (2.5 ml) u DCM (14 ml). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24 h, koncentrirana, rastvorena u vodi i ekstrahirana sa etilacetatom. Organski sloj je osušen (MgSO4), filtriran, a rastvarač je isparen. Ostatak je purifikovan sa kolonskom hromatografijom preko silika gela (5 μm) (eluent gradijenta: DCM/MeOH 95/5). Čiste frakcije su sakupljene, a organski rastvarač je isparen što dovodi do nastanka 0.48 g (58%) intermedijera 28. Oksalatna so je pripremljena kao frakcija (0.05 g), a ista je kristalizovana iz 2-propanon/dietil etera. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.042 g intermedijera 29, sa tačkom topljenja od 154º C.

Tabela F-1 prikazuje intermedijere koji su bili pripremljeni u skladu sa jednim od prikazanih Primera.

Tabela F-1 (intermedijeri)

Interm. 1; Pr. [A1]; tt. 128° C

Interm. 9; Pr. [A1]

Interm. 4; Pr. [A1]; tt. 110.4° C

(E); Interm. 10; Pr. [A1]; tt. 139° C

Interm.11; Pr. [A3]

Interm. 19; Pr. [A5]; tt. 195° C

Interm. 30; Pr. [A5]

Interm 31; Pr. [A5]; tt. 196° C

Interm. 32; Pr. [A5]; tt. 221° C

Interm. 33; Pr. [A5]

Interm. 34; Pr. [A5]

Interm. 35; Pr. [A5]

Interm. 36; Pr. [A5]; tt. 144° C

Interm. 37; Pr. [A5]

Interm. 38; Pr. [A2]

Interm. 39; Pr. [A2]

Interm. 40; Pr. [A2]

Interm. 22; Pr. [A6]

Co. Br. 41; Pr. [A6]

Interm. 42; Pr. [A1] (enantiomer A)

Interm. 43; Pr. [A1]; tt. 146° C

(enantiomer B)

Interm. 44; Pr. [A1]; tt. 167° C

(enantiomer A)

Interm. 45; Pr. [A1] (enantiomer B)

Interm. 25; Pr. [A7]

Interm. 46; Pr. [A6]

B. Preparacija finalnih jedinjenja

Primer B1

Preparacija jedinjenja 1

Mešavina intermedijera 3 (0.00121 mol) u TFA (2.5 ml) i MeOH (50 ml) je mešana tokom 48 h, a tada je rastvarač isparen. Ostatak je purifikovan na kolonskoj hromatografiji preko silika gela LiChroprep® NH2 (25-40 μm) (eluent: DCM/MeOH/H2O 80/20/2). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen. Ostatak je rastvoren u dietileteru, a precipitat je tada filtriran i osušen (vaku.) na 50º C, a to dovodi do nastanka 0.26 g (64%) jedinjenja 1, sa tačkom topljenja od 187º C.

Primer B2

Preparacija jedinjenja 2

. H2O .C2HF3O2

Mešavina intermedijera 8 (0.00007 mol) u trifuorooctenoj kiselini (0.2 ml) i MeOH (4.5 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 96 h. Rastvarač je isparen do suvoće. Ostatak je kristalizovan iz dietil eter/2-propanona. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.025 g (57%) jedinjenja 2, sa tačkom topljenja 135º C.

Primer B3

Preparacija jedinjenja 7

(E) .C2HF3O2

Mešavina intermedijera 13 (0.0002 mol) u TFA (0.5 ml) i MeOH (10 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h, a tada je isparena do suvoće. Ostatak je kristalizovan iz dietil etera. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.044 g (44%) jedinjenja 7, sa tačkom topljenja od 161º C.

Primer B4

Preparacija jedinjenja 8

Mešavina intermedijera 17 (0.0005 mol) u TFA (1.2 ml) i MeOH (24 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 dana. Rastvarač je isparen do suvoće. Ostatak (0.26 g) je purifikovan na kolonskoj hromatografiji preko silika gela LiChroprep® NH2 (25-40 μm) (eluent: DCM/MeOH/H2O 70/30/3). Čiste frakcije su sakupljanje, a rastvarač je isparen. Ostatak (0.16 g) je kristalizovan iz dietil etera. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.13 g (66%) jedinjenja 8, sa tačkom topljenja od 180º C.

Primer B5

Preparacija jedinjenja 9

Mešavina jedinjenja 28 (0.0004 mol) u TFA (1 ml) i MeOH (20 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 96 h, a tada je isparena. Ostatak (0.23 g) je purifikovan sa kolonskom hromatografijom preko silika gela LiChroprep® NH2 (25-40 μm) (eluent: DCM/MeOH/H2O 80/20/2). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen. Ostatak (0.106 g) je kristalizovan iz eter/DIPE. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.067 g (34%) jedinjenja 9, sa tačkom topljenja od 161º C.

Primer B6

Preparacija jedinjenja 10

.C2HF3O2 . H2O

TFA (1.9 ml) je dodana kap po kap na 5º C u rastvor intermedijera 21 (0.0007 mol) u MeOH (38 ml). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h, a tada je isparena do suvoće. Ostatak je kristalizovan iz dietil eter/CH3CN. Precipitat je filtriran, opran sa dietil eterom i osušen, a to dovodi do nastanka 0.24 g (62%) jedinjenja 10, sa tačkom topljenja od 146º C.

Primer B7

Preparacija jedinjenja 11

Mešavina intermedijera 24 (0.0018 mol) u TFA (4.4 ml) i MeOH (87 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 dana, a tada je isparena do suvoće. Ostatak (1.05 g) je purifikovan sa kolonskom hromatografijom preko silika gela LiChroprep® NH2 (25-40 μm) (eluent: DCM/MeOH/H2O 80/20/2). Čiste frakcije su sakupljene, a rastvarač je isparen. Ova frakcija (0.634 g) je rastvorena u dietil eteru. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.43 g jedinjenja 11, sa tačkom topljenja od 212º C.

Primer B8

Preparacija jedinjenja 31

. H2O .C2HF3O2

Mešavina intermedijera 27 (0.0011 mol) u trifluorooctenoj kiselini (3 ml) i MeOH (60 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h. Rastvarač je isparen do suvoće. Ostatak je kristalizovan iz dietil etera. Precipitat je filtriran i osušen, a to dovodi do nastanka 0.515 g (89%) jedinjenja 31, sa tačkom topljenja 145º C.

Tabela F-2 prikazuje jedinjenja koja su bila pripremljena u skladu sa navedenim Primerima. Sledeće skraćenice su bile korištene u tabelama: C2HF3O2 označava trifluorooctenu so.

Tabela F-2 (finalna jedinjenja)

Co. Br. 1; Pr. [B1]; tt. 187° C

C2HF3O2 .H2O; Co. Br. 2; Pr. [B2]; tt. 135° C

(E).C2HF3O2 . H2O; Co. Br. 3; Pr. [B1]; tt. 160° C

(E) .C2HF3O2; Co. Br. 4; Pr. [B1]; tt. 156° C

C2HF3O2 .H2O; Co. Br. 5; Pr. [B1]; tt. 185° C

C2HF3O2 .H2O; Co. Br. 6; Pr. [B1]; tt. 160° C

C2HF3O2; (E); Co. Br. 7; Pr. [B3]; tt. 161° C

Co. Br. 8; Pr. [B4]; tt. 180° C

Co. Br. 9; Pr. [B5]; tt. 161° C

.C2HF3O2. H2O; Co. Br. 10; Pr. [B6]; tt. 146° C

Co. Br. 11; Pr. [B7]; tt. 212° C

.C2HF3O2 . H2O (E); Co. Br. 12; Pr. [B4]; tt. 128° C

Co. Br. 13; Pr. [B6]; tt. 130° C

.C2HF3O2 . H2O; Co. Br. 14; Pr. [B6]; tt. 134° C

.C2HF3O2 . H2O; Co. Br. 15; Pr. [B6]; tt. 159° C

.C2HF3O2; Co. Br. 16; Pr. [B6]; tt. 131° C

Co. Br. 17; Pr. [B6]; tt. 209° C

Co. Br. 18; Pr. [B6]; tt. 130° C

.C2HF3O2 . H2O; Co. Br. 19; Pr. [B6]; tt. 130° C

.C2HF3O2; Co. Br. 20; Pr. [B6]; tt. 128° C

Co. Br. 21; Pr. [B2]; tt. 110° C

(E); Co. Br. 22; Pr. [B2]; tt. 115° C

.C2HF3O2 . H2O; Co. Br. 23; Pr. [B2]; tt. 106° C

Co. Br. 24; Pr. [B7]; tt. 170° C

Co. Br. 25; Pr. [B1]; tt. 203° C; enantiomer A

Co. Br. 26; Pr. [B1]; tt. 207° C; enantiomer B

Co. Br. 27; Pr. [B1]; tt. 218° C; enantiomer A

Co. Br. 28; Pr. [B1]; tt. 214° C; enantiomer B

Co. Br. 29; Pr. [B1]; tt. 166° C

Co. Br. 30; Pr. [B1]; tt. 190° C

Co. Br. 31; Pr. [B8]; tt. 145° C

Co. Br. 32; Pr. [B7]; tt.217° C

.HCl; Co. Br. 33; Pr. [B1]; tt. 256° C; enantiomer A

.HCl; Co. Br. 34; Pr. [B1]; tt. 254° C; enantiomer B

(E); Co. Br. 35; Pr. [B3]; tt. 202° C

C. Farmakološki primer:

Test u uslovima in vivo za inhibiciju histonske deacetilaze (vidi primer C.1) meri inhibiciju HDAC enzimatske aktivnosti koja je postignuta asa jedinjenjem sa formulom (I).

Ćelijska aktivnost jedinjenja sa formulom (I) je determinisana na tumorskim ćelijama A2780 uz upotrebu kolorimetrijskog testa za ćelijsku toksičnost ili preživljenje (Mosmann Tim, Journal of Immunological Methods 65: 55-63, 1983) (vidi primer C.2)

Rastvorivost jedinjenja meri njegovu sposobnost da isto ostane u rastvoru. Kroz prvi metod je određena sposobnost jedinjenja da ostane u vodenom rastvoru posle razređivanja (vidi primer C.3.a). Osnovni DMSO rastvori su razređeni sa jednim vodenim puferskim rastvaračem tokom 3 koraka. Za svako razređivanje izmeren je turbiditet uz pomoć nefelometra.

U drugom metodu, rastvorivost nekog jedinjenja kod različitih pH može da se meri uz upotrebu hemiluminiscentnog azotnog detektora (vidi primer C.3.b).

Permeabilnost leka prikazuje njegovu sposobnost da se kreće od jednog u drugi ili kroz neki medijum. Specifično, to je njegova sposobnost da se kreće kroz crevne membrane u krvotok i/ili iz krvotoka u ciljno tkivo. Permeabilnost (vidi primer C.4) može da se izmeri kroz formiranja veštačke membrane, fosfolipidni bisloj koji je imobiliziran na filteru. U testu imobiliziranja veštačke membrane na filteru, nastaje „sendvič“ na mikro-pločici sa 96 rupica i filterskoj pločici sa takođe 96 rupica, tako da svaka rupica je podeljena u dve sobice sa donorskim rastvorom pri dnu i akceptorskim rastvorom pri vrhu, koji su odvojeni sa 125 μm mikro-filterskim diskom (pore su 0.45 μm), zamotan sa 2% (masa/volumen) dodekanskim rastvorom dioleoilfosfatidil-kolina, u uslovima gde multi-lamelarni bislojevi formiraju unutrašnje filterske kanale kada je sistem u kontaktu sa vodenim rastvorom pufera. Permeabilnost jedinjenja kroz ovu veštačku membranu se meri u cm/s. Cilj je da se otkrije zasićenje nekog leka u paralelnu veštačku membranu pri dve različite vrednosti pH: 4.0 i 7.4. Detekcija jedinjenja se provodi sa UV-spektrometrijom pri optimalnoj talasnoj dužini koja se kreće od 250 do 500 nm.

Metabolizam lekova znači da jedinjenje ksenobiotik ili endobiotik, koje je rastvorivo u lipidima bude enzimatski transformisano u polarno jedinjenje, rastvorivo u vodi i metabolit koji može da se izbaci. Glavni organ metabolizma lekova je džigerica. Metabolički produkti su često manje aktivni u uporedbi sa parenteralnim lekovima ili su neaktivni. Međutim, neki metaboliti mogu da poseduju pojačanu aktivnost ili toksične efekte. Tako, metabolizam lekova može da uključuje procese „detoksifikacije“ i „toksifikacije“. Jedan od glavnih enzimatskih sistema, koji determinišu sposobnost organizma da se spravi sa lekovima i hemikalijama, je predstavljen sa citohrom P450 monooksigenazama, koje su enzimi zavisni o NADPH. Metabolička stabilnost jedinjenja može da se determiniše u uslovima in vitro uz pomoć upotrebe sub-celularnog humanog tkiva (vidi primer C.5.a). Ovde metabolička stabilnost jedinjenja je izražena kao % lekova koji su metabolizovani posle 15 min inkubacije pomenutih jedinjenja u mukrosomima. Kvantifikovanje jedinjenja je određeno uz pomoć LC-MS analize. Metabolička stabilnost jedinjenja može da se takođe determiniše uz pomoć određivanja polu-života jedinjenja u hepatocitima pacova (vidi primer C.5.b).

Pokazano je da brojni anti-tumorski agensi aktivišu belančevinu p21, uključujući i agense koji oštećuju DNK i inhibitore histonske deacetilaze. Agensi koji oštećuju DNK aktivišu gen p21 kroz tumor supresor p53, dok inhibitori histonske deacetilaze aktivišu gen p21 transkripcijski preko transkripcijskog faktora Sp1. Tako, agensi koji oštećuju DNK aktivišu promotor p21 kroz p53 responsivni elemenat, a inhibitori histonske deacetilaze aktivišu p21 promotor kroz sp1 mesta (locirana u regionu od -60 pb do +40 pb u odnosu na TATA kutiju), a oba procesa dovode do povećanja ekspresije proteina p21. Kada se promotor p21 u ćeliji sastoji od promotorskog fragmenta od 1300 pb koji ne sadrži p53 responsivni elemenat, isti nije osetljiv na agense koji oštećuju DNK. Kapacitet jedinjenja da indukuju p21 može da se odredi na nekoliko načina. Prvi metod je da se tumorske ćelije tretiraju sa jedinjenjem od interesa, a posle lize ćelija indukcija p21 se analizuje uz pomoć p21 enzimskog imunosorbentnog testa (WAF1 ELISA od Onkogena). Test p21 je enzimatski imunotest tipa „sendvič“ koji koristi mišja monoklonalna antitela i zečja poliklonalna antitela. Zečje poliklonalno antitelo, koje je specifično za humanu belančevinu p21, imobilizovano je na površinu plastičnih rupica koje su deo kita za reakciju. Bilo koji p21 prisutan u uzorku koji treba da se analizuje će da se veže na antitelo. Biotinilirano detektorsko monoklonalno antitelo takođe prepoznaje ljudsku belančevinu p21 i može da se veže na nju kada je ova vezana na poliklonalno antitelo. Detektorsko antitelo, sa svoje strane je vezano za streptavidin koji je vezan za peroksidazu hrena. Peroksidaza hrena katalizuje konverziju hromogenog supstrata tetra-metilbenzidina, koji je bezbojan i koji sada prelazi u plavo (ili žuto posle dodavanja reagenta za stopiranje), a intenzitet bojenja je proporcionalan količinu belančevine p21 koja je vezana za pločicu. Produkt kolorne reakcije se kvantifikuje uz pomoć spektrofotometra. Kvantifikovanje se postiže crtanjem standardne krive uz pomoć poznatih koncentracija p21 (po mogućnosti liofilizovan). Ovaj test može da meri indukciju p21 kao posledica oštećenja DNK ili kao posledica inhibicije histonske deacetilaze (vidi primer C.6.a).

Drugi metod testira sposobnost jedinjenja da indukuje p21 kao posledica inhibicije HDAC na nivou ćelije. Ćelije mogu da se stabilno transformišu sa ekspresijskim vektorom koji sadrži promotorski fragment od 1300 pb sa p21, koji ne sadrži p53 responsivni elemenat i gde povećanje ekspresije reporter gena, u uporedbi sa kontrolnim nivoom, identifikuje jedinjenje kao takvo koje ima kapacitet indukovanja p21. Reporter gen je fluorescentna belančevina i njegova ekspresija se meri kao količina fluorescentnog svetla koje se emituje (vidi primer C.6.b). Zadnji metod je in vivo metod gde se koriste miševi za ispitivanje farmaceutske aktivnosti nekog jedinjenja. Već opisane stabilno transformisane ćelije mogu da budu administrirane u miša u količini koja je dovoljna da deluje na produkciju tumora. Nakon dovoljno vremena da tumorske ćelije formiraju tumor, potencijalno aktivno jedinjenje može da se administrira u životinje, a efekat pomenutog jedinjenja na tumorske ćelije se određuje merenjem ekspresije reporter gena. Inkubacija sa farmaceutski aktivnim jedinjenjima će da rezultira u povećanje ekspresije reporter gena u uporedbi sa kontrolnim nivoom (vidi primer C.6.c).

Specifični HDAC inhibitori ne trebaju da inhibiraju druge enzime kao na primer belančevine CYP P450. CYP P450 (eksprimiran u E. coli) belančevine 3A4, 2D6 i 2C9 konvertuju njihove supstrate u fluorescentne molekule. CYP3A4 belančevina konvertuje 7-benziloksi-trifluorometil kumarin (BFC) u 7-hidroksi-trifluorometil kumarin. CYP2D6 belančevina konvertuje 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamino)etil]-7-metoksi-4-metilkumarin (AMMC) u 3-[2-(N,N-dietilamino)etil]-7-hidroksi-4-metilkumarin hidrohlorid, a CYP2C9 belančevina konvertuje 7-Metoksi-4-trifluorometil kumarin (MFC) u 7-hidroksi-trifluorometil kumarin. Jedinjenja koja inhibiraju enzimatsku reakciju će da dovedu do pojačavanja fluorescentnog signala (vidi primer C.7).

Primer C.1: In vivo test za inhibiranje histonske deacetilaze:

Korišten je test za HDAC fluorescentnu aktivnost/Reakcijski kit za otkrivanje lekova od Biomola (kat. Br. AK-500-0001). Test za HDAC fluorescentnu aktivnost se zasniva na Fluor de Lys (Fluorogenic Histon de Acetylase Lysyl) supstratu i na kombinaciji za razvijanje. Fluor de Lys supstrat se sastoji od acetilovanog lizina u bočnom lancu. Deacetilacija supstrata dovodi do senzitiranja istoga tako da, u drugom koraku, tretman sa Fluor de Lys produktom za razvijanje dovodi do nastanka fluorofora.

HeLa nuklearni ekstrakti (proizvođač: Biomol) su inkubirani pri koncentraciji od 60 μg/ml sa 75 μM supstrata. Fluor de Lys supstrat je dodan u puferu koji sadrži 25 mM Tris, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl i 1 mM MgCl2x6H2O na pH 7.4. Posle 30 min, dodan je 1 volumen produkta za razvijanje. Fluorofor je pobuđen sa 355 nm svetla, a emitirano svetlo (450 nm) je detektovano na fluorescentnom čitaču.

Za svaki opit, paralelno su korišćene kontrole (HeLa nuklearni ekstrakti i pufer), slepa proba (pufer, ali bez HeLa nuklearnih ekstrakta) i primerci (jedinjenje rastvoreno u DMSO i dalje razređeno u puferu i HeLa nuklearni ekstrakti). U prvoj instanci, jedinjenja su testirana pri koncentraciji od 10-5 M. Kada je jedinjenje pokazalo aktivnost pri 10-5 M, napravljena je kriva koncentracija-odgovor gde su jedinjenja bila testirana pri koncentracijama među 10-5 M i 10-9 M. Svi primerci su testirani 4 puta. U svakom testu, slepa vrednost je oduzeta od vrednosti kontrole i od vrednosti uzorka. Kontrolni uzorak predstavlja 100% deacetilacije supstrata. Za svaki uzorak, fluorescencija je bila izražena kao procenat srednje vrednosti kontrole. Odgovarajuće IC50-vrednosti (koncentracija leka, koja je potrebna da smanji količinu metabolita za 50% u odnosu na kontrolu) su izračunate uz pomoć probit-analize za graduirane podatke. Ovde su efekti testiranih jedinjenja izraženi kao pIC50 (za negativnu log vrednost IC50-vrednosti) (vidi Tabelu F-3).

Primer C.2: Određivanje anti-proliferativne aktivnosti u A2780 ćelijama

Sva testirana jedinjenja su rastvorena u DMSO i dalje razređena u medijumu same kulture. Konačne DMSO koncentracije nikada nisu prevazišle 0.1% (v/v) u testu proliferacije ćelija. Kontrole su sadržavale A2780 ćelije i DMSO bez jedinjenja, a slepe probe su sadržavale DMSO, ali bez ćelija. MTT je rastvoren pri koncentraciji od 5 mg/ml u PBS. Pripremljen je glicinski pufer koji obuhvata 0.1 M glicina i 0.1 m NaCl puferiran do pH 10.5 sa NaOH (1N) (svi reagenti su bili od Merck).

Humane A2780 ćelije raka jajnika (ljubazan poklon od dr. T.C. Hamilton [Fox Chase Cancer Centre, Pennsylvania, USA] su kultivisane u RPM1 1640 medijumu koji je bio pojačan sa 2 mM L-glutaminom, 50 μg/ml gentamicinom i 10% fetalnim goveđim serumom.

Ćelije su rutinski držane kao monoslojne kulture na 37º C u važnoj atmosferi sa 5% CO2. Ćelije su pasažirane jednom nedeljno uz pomoć rastvora tripsin/EDTA u razmeru 1:40. Svi medijumi i suplementi su nabavljeni kod Life Technologies. Ćelije su oslobođene od kontaminacija mikoplazmama uz pomoć Gen-Probe-Mycoplasma Tissue Cultire Kit (proizvođač: BioMérieux).

Ćelije su sađene u NUNCTM pločicama za kulturu sa 96 rupica (proizvođač: Life Technologies) i ostavljene su da se adheriraju za plastiku preko noći. Gustoća koja je korištena za sađenje je bila 1500 ćelija po rupici u totalnom volumenu od 200 μl medijuma. Posle adheriranja ćelija za pločice, medijum je promenjen pa su dodani lekovi i/ili rastvorive materije u finalnom volumenu od 200 μl. Posle četiri dana inkubacije, medijum je zamenjen sa 200 μl svežeg medijuma, a gustoća ćelija i njihova vijabilnost su bili ispitani uz pomoć testa koji se bazira na MTT. U svaku rupicu je dodano 25 μl rastvora MTT, a ćelije su dodatno inkubirane tokom 2 h na 37º C. Medijum je tada pažljivo aspiriran, a plavi produkt MTT-formazan je rastvoren uz dodatak 25 μl glicinskog pufera, a posle toga i 100 μl DMSO. Mikropločice su potresene tokom 10 min na mešalici za mikropločice, a posle toga je određena apsorbancija pri 540 nm uz upotrebu Emax spektrofotometra sa 96 rupica (proizvođač: Sopachem).U jednom opitu, rezultati za sva eksperimentalna stanja su srednja vrednost 3 ponovljenih rupica. Za finalne svrhe ispitivanja, jedinjenja su testirana pri pojedinačnoj fiksnoj koncentraciji od 10-6 M. Za aktivna jedinjenja, opiti su ponovljeni da se ustvrde potpune krive koncentracija-odgovor. Za svaki opit, kontrole (koje ne sadrže lek) i slepe probe (koje ne sadrže ćelije niti lek) su provedene paralelno. Vrednost slepe probe je oduzeta od vrednosti kontrole i uzoraka. Za svaki uzorak, srednja vrednost za rast ćelija (u jedinicama apsorbancije) je izražena kao procenat srednje vrednosti rasta ćelija u kontroli. Kada je bilo prikladno, IC50-vrednosti (koncentracija leka koja je potrebna da smanji rast ćelija za 50% u odnosu na kontrolu) su određene uz upotrebu probit analize za graduirane podatke (Finney, D.J., Probit Analyses, 2 Izd. Poglavlje 10, Graded Responses, Cambridge University Press, Cambridge 1962). Ovde, efekti testirani jedinjenja su izraženi kao IC50 (negativna log vrednost IC50-vrednosti) (vidi Tabelu F-3).

Primer C.3: Rastvorivost/Stabilnost

C.3.a. Kinetička rastvorivost u vodenom medijumu

U prvom koraku razređivanja, 10 μl koncentriranog osnovnog rastvora aktivnog jedinjenja, stabilizovanog u DMSO (5 mM), je dodano u 100 μl fosfat citratnog pufera pH 7.4 i sve je mešano. U drugom koraku razređivanja, alikvot (20 μl) iz prvog koraka razređivanja je dodatno razređen u 100 μl fosfatno citratnog pufera pH 7.4 i sve je mešano. Konačno, u trećem koraku razređivanja, primerak (20 μl) iz drugog koraka razređivanja je dodatno razređen u 100 μl fosfatno citratnog pufera pH 7.4 i sve je mešano. Sva razređivanja su provedena u pločicama sa 96 rupica. Odmah posle poslednjeg koraka razređivanja, izmeren je turbiditet sva tri razređivanja uz pomoć nefelometra. Razređivanje je bilo provedeno tri puta za svako jedinjenje sa ciljem izbegavanja slučajnih grešaka. Na osnovu merenja turbiditeta, uporedba je provedena u tri klase. Jedinjenja sa visokom rastvorivošću imaju rezultat 3 i za ova jedinjenja prvo razređivanje je bistro. Jedinjenja sa srednjom rastvorivošću su dobila rezultata 2. Za ova jedinjenja prvo razređivanje nije bistro, a drugo je bistro. Jedinjenja sa niskom rastvorivošću su dobila rezultat 1 i za ova jedinjenja i prvo i drugo razređivanje nije bistro (vidi Tabelu F-3).

C.3.b. Rastvorivost

Rastvorivost nekog jedinjenja, pri različitim pH, može da se izmeri uz upotrebu hemiluminiscentnog azotnog detektora (vidi Tabelu F-3).

Primer C.4: Analiza permeabilnosti paralelne veštačke membrane

Osnovni primerci (alikvoti od 10 μl osnovnog rastvora od 5 mM u 100% DMSO) su razređeni u dubokim rupicama ili Pre-mix pločici koji su sadržali 2 ml vodenog puferskog sistema sa pH 4 ili pH 7.4 (PSR4 System Solution Concentrate (pION)).

Najpre primerci su dodani u referentnu pločicu, dodano je 150 μl pufera u rupice i započeto je slepo merenje sa UV. Posle toga, pufer je odbačen, a pločica je korišćena kao referentna pločica. Sva merenja su provedena u pločicama otpornima na UV (proizvođač: Costar ili Greiner).

Posle slepih merenja referentne pločice, dodano je 150 μl razređenih primeraka u referentnu pločicu i 200 μl razređenih primeraka u donorsku pločicu 1. Akceptorska filter pločica 1 (proizvođač: Millipore, tip: MAIP N45) je zamotana sa 4 μl rastvorom koji formira veštačku membranu (1,2-Dioleoil-sn-Glicer-3-Fosfokolin u dodekanu koji sadrži 0.1% 2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol i koji je postavljen na vrh donorske pločice 1 sa ciljem formiranja „sendviča“. Pufer (200 μl) je odložen u akceptorske rupice pri vrhu. Sendvič je pokriven sa poklopcem i ostavljen tokom 18 h na sobnoj temperaturi u tamnom.

Slepo merenje akceptorske pločice 2 je izvedeno kroz dodavanje 150 μl pufera u rupice, a posle toga je usledilo UV merenje. Posle slepog merenja akceptorske pločice 2, pufer je odstranjen, a 150 μl akceptorskog rastvora je preneto iz akceptorske filter pločice 1 u akceptorsku pločicu 2. Tada je akceptorska filter pločica 1 odstranjena od sendviča. Posle slepog merenja donorske pločice 2 (vidi ranije), 150 μl donorskog rastvora je bilo preneto sa donorske pločice 1 u donorsku pločicu 2. UV spektar rupica donorske pločice 2, akceptorske pločice 2 i referentne pločice je bio skeniran (sa SpectraMAX 190). Svi spektari su procesirani sa ciljem računanja permeabilnosti uz pomoć PSR4 Command Software. Sva jedinjenja su merena tri puta. Karbamezapin, griseofulvin, acikloguanizin, atenolol, furosemid i hlorotiazid su korišćeni kao standardi u svakom opitu. Jedinjenja su rangirana u 3 kategorije kao takva koja imaju nisku permeabilnost (srednja vrednost < 0.5 x 10-6 cm/s; rezultat 1), takva koja imaju srednju permeabilnost (1 x 10-6 cm/s > srednja vrednost $0.5 x 10-6 cm/s; rezultat 2) i takva sa visokom permeabilnosti ($ 1 x 10-6 cm/s; rezultat 3).

Primer C.5: Metabolička stabilnost

Primer C.5.a

Sub-celularne tkivne preparacije su bile pripremljene prema Gorrod et. Al. (Xenobiotica 5:453-462, 1975) uz pomoć centrifugalne separacije posle mehaničke homogenizacije tkiva. Tkivo džigerice je bilo isprano u ledenom rastvoru pufera 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4) sa ciljem pranja zaostale krvi. Tkivo je tada suvo blotovano, izvagano i grubo iseckano uz pomoć hirurških makaza. Parčići tkiva su homogenizovani u 3 volumena ledenog fosfatnog pufera koncentracije 0.1 M (pH 7.4) uz upotrebu Potter-S (Braun, Italija) koji je bio opremljen sa teflonskim maljem ili Sorvall Omni-Mix homogenizatora tokom 7 x 10 sec. U oba slučaja posuda je držana na ledu tokom procesa homogenizovanja.

Homogenati tkiva su centrifugirani na 9000 x g tokom 20 min pri 4º C uz upotrebu centrifugu Sorvall ili ultracentrifugu Beckman. Nastao supernatant je ostavljen na -80º C uz oznaku „S9“.

Frakcija S9 dalje može da bude centrifugirana na 100000 x g tokom 60 min (4º C) uz upotrebu ultracentrifugu Beckman. Nastao supernatant je bio pažljivo aspiriran, alikvotiran i označen „citosol“. Pelet je re-suspendovan u 0.1 M fosfatnom puferu (pH 7.4) u finalnom volumenu od 1 ml po 0.5 g originalne težine tkiva i označen kao „mikrosome“.

Sve sub-celularne frakcije su alikvotirane, odmah zamrznute u tečnom azotu i ostavljene na ‑80º C sve do upotrebe.

Za testiranje primeraka korištena je inkubacijska mešavina koja je sadržavala PBS (0.1 M), jedinjenje (5 μM), mikrosome (1 mg/ml) sistem za generisanje NADPH (0.8 mM glikoza-6-fosfat, 0.8 mM magnezijum hlorid i 0.8 jedinica glikoza-6-fosfat dehidrogenaze). Kontrolni primerci su sadržavale isti materijal, ali mikrosome su bile zamenjene mikrosomama koje su prethodno bile inaktivirane toplinom (10 min na 95º C). Oporavak jedinjenja u kontrolnim primercima je uvek bilo 100%.

Mešavine su preinkubirane tokom 5 min na 37º C. Reakcija je otpočeta u vremenu nula (t=0) uz dodavanje 0.8 mM NADP, a primerci su bili inkubirani tokom 15 min (t = 15). Reakcija je terminirana dodavanjem 2 volumena DMSO. Tada su primerci centrifugirani tokom 10 min na 900 x g, a supernatant je ostavljen na sobnoj temperaturi ne duže od 24 h pre same analize. Sve inkubacije su bile provedene dvostruko. Analize supernatanta su provedene uz pomoć LC-MS analize. Elucija primeraka je provedena na Xterra MS C18 (50 x 4.6 mm, 5 μm, Waters, USA). Korišten je HPLC sistem Alliance 2790 (proizvođač: Waters, USA). Elucija je provedena sa puferom A (25 mM aminoimunoacetat (pH 5.2) u H2O/acetonitril (95/5)), rastvarač B koji je acetonitril i rastvarač C metanol uz ratu protoka od 2.4 ml/min. Korišćeni gradijent je dobiven povećavanjem koncentracije organske faze od 0% preko 50% B i 50% C do najviše 100% B tokom 1 min na linearan način, a koncentracija organske faze je održavana stacionarnom tokom dodatnih 1.5 min. Totalni volumen injekcije primeraka je 25 μl.

Kao detektor je korišćen Quattro (proizvođač: Micromass, Manchester, UK) trostruki kvadropol maseni spektrometar koji je opskrbljen sa ESI izvorom. Izvor i temperatura rastvaranja su bili podešeni na 120 i 350º C, a azot je korišćen kao nebulizator i gas za sušenje. Podaci su bili dobiveni u pozitivnom režimu skeniranja (reakcija jednog jona). Voltaža čunja je podešena na 10 V, a vreme boravka je bilo 1 sekund.

Metabolička stabilnost je izražena kao % metabolizma jedinjenja posle 15 min inkubacije u prisutnosti aktivnih mikrosoma (E(akt)) (% metabolizam = 100 % - ((Totalan protok jona (TIC) za E(akt) u t = 15 / TIC za E(akt) u T = 0) x 100). Jedinjenja koja su pokazala procenat metabolizma manji od 20% su bila definisana kao visoko metabolički stabilna. Jedinjenja koja su imala procenat metabolizma među 20 i 70% su definisana kao intermedijarno stabilna, a jedinjenja koja su imala procenat metabolizma veći od 70% su definisana kao nisko metabolički stabilna. Tri referentna jedinjenja su uvek uključena kada se provodilo ispitivanje metaboličke stabilnosti. Verampil je uključen kao jedinjenje sa niskom metaboličkom stabilnošću (% metabolizam = 73 %). Cisapride je uključeno kao jedinjenje sa srednjom metaboličkom stabilnosti (% metabolizma 45 %) i propanol je uključen kao jedinjenje sa intermedijarnom do visokom metaboličkom stabilnosti (25 % metabolizma). Ova referentna jedinjenja su korišćena da se potvrdi test metaboličke stabilnosti.

C.5.b: Metabolička stabilnost sa kulturom hepatocita pacova

Hepatociti pacova su izolirani iz ženki pacova Sprague Dowley. Jedinjenja su rastvorena u 5 mM osnovni rastvor u 100% DMSO i inkubisana u finalnim koncentracijama od 5 μM od 0, 15, 30, 60 i 120 min sa kulturama hepatocita pacova (0.5 miliona vijabilnih ćelija/0.5 ml) uz upotrebu pločica sa 24 rupice.

Za LC-MS primerci su pripremljeni uz dodavanje dva volumena DMSO. Primerci su dobro potreseni i potom centrifugirani na 900 x g tokom 10 min (sobna temperatura). Svi opiti su provedeni trostruko. Od nastalog supernatanta, 50 μl je analizirano uz pomoć LC-MS.

Za LC-MS, elucija primeraka je provedena na Hypersil BDS C18 koloni (50 x 4.6 mm, 5 μm, Thermohypersil, UK). HPLC sistem je obuhvatao Surveyor sistem za dostavu (Surveyor Inc., San Jose, US) koji je bio opremljen sa Surveyor autosemplerom. Elucija je provedena sa puferom A (10 mM amonijumacetat (pH 6.) u H2O/Acetonitril (95:5)) i rastvaračem B (acetonitril) pri protoka od 1.2 ml/min. Primenjeni gradijent je bio 0.5 min rastvarača A kao početak, a nakon toga je sledilo povećanje koncentracije organske faze od 0% B do 95% B preko 2 min na linearan način. Ova faza je održavana tokom 2 min, a ponovno je smanjena do 0% B tokom 0.5 min.

Totalni volumen injekcije primeraka je bio 50 μL. Temperatura kolone je bila održavana na 40º C. Protok LC je podeljen za MS detekciju i za 0.1 ml je dozvoljeno za izvor. Kao detektor je korišćen trostruki četvoropolni maseni spektrometar TSQ Quantum (Thermofinningen, La Jolla, USA) koji je bio opremljen sa ESI izvorom. Voltaža izvora je bila podešena na 3800 volti, temperatura kapilara na 300º C. Maseni spektrometar je radio u pozitivnom jonskom režimu u SIM koji je bio podešen na masu od M+H sa širinom skena od 1Da sa ciljem kvantifikovanja. Kontrola instrumenta, sakupljanje podataka i procesiranje je provedeno uz upotrebu programa Xcalibur (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA). Metabolička stabilnost jedinjenja u hepatocitima pacova je izražena kao in vitro polu život.

Kao referenca je korišćeno jedinjenje R306465 (WO03/76422) (in vitro polu život: 8 min). Jedinjenje 4 iz ovoga pronalaska je testirano i isto je pokazalo in vitro polu život od 23 min.

Primer C.6: Kapacitet indukcije p21

Primer C.6.a: Test uz pomoć p21 enzima koji je povezan na imunosorbent

Sledeći protokol je bio primenjen da se odredi ekspresivni nivo belančevine p21 u humanim ćelijama A2780 karcinoma jajnika. Ćelije A2780 (20000 ćelija/180 μl) su nasađene na pločice sa 96 rupica u RPMI 1640 medijumu koji je bio pojačan sa 2 mM L-glutaminom, 50 μg/ml gentamicinom i 10 % goveđim fetalnim serumom. 24 h pre lize ćelija, jedinjenja su dodana u svojim finalnim koncentracijama od 10-5, 10-6, 10-7 i 10-8 M. Sva testirana jedinjenja su bila rastvorena u DMSO i dodatno razređena u medijumu kulture. 24 h nakon dodavanja jedinjenja, supernatanti su bili odvojeni od ćelija. Ćelije su bile isprane sa 200 μl ledenog PBS. Rupice su bile aspirirane i nakon toga je dodano 30 μl pufera za lizu (50 mM Tris.HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% Nonidet p40 i 10% glicerola). Pločice su bile inkubirane preko noći na -70º C.

Odgovarajući broj mikrotitarskih rupica je odstranjeno iz kesice i ostavljeno u praznom nosaču. Pripremljen je radni rastvor (1x) pufera za pranje (20 x koncentrat za pranje pločica: 100 ml 20 tupa koncentriran rastvor PBS i surfaktant. Sadrži 2 % hloroacetamid). Liofilizovani p21WAF standard je rastvoren u destilovanoj H2O i dalje je razređen sa razređivačem za primerke (koji se nalazi u reakcijskom kitu).

Primerci su bili pripremljeni uz pomoć razređivanja 1:4 u razređivaču za primerke. Primerci (100 μl) i p21WAF1 standardi (100 μl) su pipetirani u odgovarajuće rupice i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Rupice su oprane 3 puta sa 1x pufera za pranje, a tada je u svaku rupicu pipetirano po 100 μl reagenta sa detektorskim antitelom (rastvor biotiniliranog antitela protiv p21WAF1). Rupice su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 1 h, a tada su oprane 3 puta sa 1x pufera za pranje. 400x konjugat (konjugat peroksidaze streptavidin: 400-puta koncentriran rastvor) razređeno, a posle toga je dodano 100 μl 1x rastvora u rupice. Rupice su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 30 min, a tada su oprane 3 puta sa 1x pufera za pranje i 1 put sa destilovanom H2O. Rastvor supstrata (hromogenični rastvor) (100 μl) je dodan u rupice, a rupice su inkubirane tokom 30 min na tamnom na sobnoj temperaturi. Dodan je stop-rastvor u svaku rupicu u istom redosledu kao i pre dodani rastvor supstrata. Apsorbancija u svakoj rupici je merena uz upotrebu spektrofotometrijskog čitača pločica pri dvojnoj talasnoj dužini od 450/595 nm.

Za svaki opit, kontrole (koje nisu sadržavale lek) i slepe probe (koje nisu sadržavale ćelije niti lek) su provedene paralelno. Slepa vrednost je oduzeta od vrednosti kontrole i primerka. Za svaki primerak, vrednost za p21WAF1 indukcije (u jedinicama apsorbancije) je izražena kao procenat vrednosti za p21WAF1 koji je prisutan u kontroli. Procenat indukcije koji je veći od 130% je definisan kao signifikantna indukcija. Četiri jedinjenja su testirana i sva su pokazivala signifikantnu indukciju.

Primer C.6.b: Ćelijski metod

Ćelije A2780 (ATCC) su kultivisane u RPMI 1640 medijumu koji je bio pojačan sa 10 % FCS, 2 mM L-glutaminom i gentamicinom pri 37º C u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2. Svi rastvori kultura ćelija su dobiveni od Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Ostali materijali su dobiveni kod Nunc.

Genomska DNK je ekstrahovana iz ćelija A2780 koje proliferiraju i ista je korišćena kao matrica za izolaciju promotora p21 uz pomoć umetnuti PCR. Prva amplifikacija je provedena tokom 20 ciklusa pri temperaturi anilinga od 55º C uz upotrebu oligonukleotidnog para GAGGGCGCGGTGCTTGG i TGCCGCCGCTCTCTCACC sa genomskom DNK kao kalup. Nastao fragmenat od 4.5 kb koji sadrži fragmenat od -4551 do +88 u odnosu na TATA kutiju je bio ponovno amplifikovan sa oligonukletidima TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG i ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC tokom 20 ciklusa sa anilingom pri 88º C šta dovodi do pojave fragmenta od 4.5 kb, a posle toga sa oligonukleotidnim parom TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC i ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC tokom 20 ciklusa sa anilingom pri 88º C šta dovodi do pojave fragmenta od 1.3 kb koji sadrži fragment od -1300 do +88 pb u odnosu na TATA kutiju. Restrikcijska mesta Xho I i Kpn I, koja su prisutna u oligonukleotidima (podcrtana sekvenca) su korišćena za subkloniranje.

Luciferazni reporter je bio odstranjen iz pGL3-basic i zamenjen sa ZsGreen reporter (iz pZsGreen1-N1 plazmida) kod Kpn I i Xba I restrikcijskih mesta. pGL3-bacis-ZsGreen-1300 je bio konstruisan uz pomoć insercije pomenutog fragmenta od 1.3 kb humanog promotora p21 u pGL3-basic-ZsGreen kod Xho I i Kpn I mesta. Svi restrikcijski enzimi su nabavljeni kod Boehringer Manheim (Nemačka). Ćelije A2780 su nasađene na pločicama sa 6 rupica sa gustoćom od 2x105 ćelija, inkubirane su tokom 24 h, a tada su transkfektirane sa 2 μg pGL3-basic-ZsGreen-1300 i 0.2 μg pSV2neo vektora uz pomoć Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Brussels, Belgija) prema instrukcijama proizvođača. Transfektirane ćelije su selektirane tokom 10 dana sa G418 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), a na kraju su napravljene suspenzije kultura iz rasta jedne jedine ćelije. Nakon tri nedelje, dobiveni su pojedinačni klonovi.

Selektirani klonovi A2780 su ekspandirani i nasađeni pri gustoći od 10000 ćelija po rupici na pločicama sa 96 rupica. 24 h nakon sađenja, ćelije su tretirane tokom dodatnih 24 h sa jedinjenjima (koja deluju na sp1 mesta u proksimalnom promotorskom regionu p21). Posle toga, ćelije su fiksirane sa 4% PFA tokom 30 min i kontra bojane sa bojom Hoechst. Aktiviranje promotora p21 koja dovodi do produkciju ZsGreen i na taj način do fluorescencije je bila praćena uz pomoć Ascent Fluoroskan (Thermo Labsystems, Brussels, Belgija).

Za svaki opit, kontrole (koje ne sadrže lek) i slepe probe (koje ne sadrže ćelije niti lek) su provedene paralelno. Slepa proba je oduzeta od sve vrednosti kontrole i primeraka. Za svaki primerak, vrednost za indukciju p21 je izražena kao procenat vrednosti za p21 koji je prisutan u kontroli. Procenat indukcije koji je veći od 130% je definisan kao signifikantna indukcija.

Dvadeset šest jedinjenja su testirana i ista pokazuju signifikantnu indukciju.

Primer C.6.c: Metod in vitro

Selektirani klon je injektiran pod kožu (107 ćelija/200 μl) u bok golog miša, a kaliper merivi tumori su dobiveni posle 12 dana. Od dana 12, životinje su dozirane oralno ili intravenozno, jednom dnevno tokom 6 dana sa rastvorom i 20-40 mpk jedinjenja (4-10 životinje svako). Tumori su evaluirani na fluorescenciju uz pomoć domaćeg automatskog sistema slikanja celoga tela (Fluorescentni stereomikroskop tipa Olympus® SZX12 koji je bio opremljen sa GFP filterom i spojen na CCD kameru tipa JAI® CV-M90 kontroliranu uz pomoć programskog paketa koji se bazirao na IMAQ Vision Softwere od National Instruments®). Kao referenca je korišćeno jedinjenje R306465 (WO03/76422). Jedinjenja su rangirana kao inaktivna (nema merljive fluorescencije), slabija, identična ili bolja do R306465. Jedinjenje 1 je testirano i pokazalo se da je bolje od R306465 posle oralne administracije.

Primer C.7: P450 inhibitorski kapacitet

Sva testirana jedinjenja su bila razređena u DMSO (5 mM), a dodatno razređivanje do 5 x 10-4 M je bilo provedeno u acetonitrilu. Dodatna razređivanja su načinjena u puferu za testiranje (0.1 M NaK fosfatni pufer pH 7.4), a finalna koncentracija razređivača nikada nije bila veća od 2 %.

Test za CYP3A4 belančevinu obuhvata po jednoj rupici 15 pmol P450/mg belančevine (u 0.01 M NaKfosfatnom puferu + 1.15 % KCl), sistem za generisanje NADPH (3.3 mM glikoza-6-fosfata, 0.4 U/ml glikoza-6-fosfat dehidrogenaze, 1.3 mM NADP i 3.3 mM MgCl2x6H2O u puferu za test) i jedinjenje u totalnom volumenu za test od 100 μl. Posle 5 min pre-inkubacije na 37º C, enzimatska reakcija je započeta uz dodavanje 150 μM supstrata sa fluorescentnom probom BFC u puferu za test. Posle inkubacije od 30 min na sobnoj temperaturi, reakcija je bila zaustavljena uz dodavanje 2 volumena acetonitrila. Fluorescentne determinacije su provedene na ekscitacijskoj talasnoj dužini od 405 nm i emisijskoj talasnoj dužini od 535 nm. Ketokonozol (IC50-vrednost = 3 x 10-8 M) je uključen kao referentno jedinjenje.

Test za belančevinu CYP2D6 obuhvata po rupici 6 pmol P450/mg belančevine (u 0.01 M NaKfosfatnom puferu + 1.15% KCl), sustem za generisanje NADPH (0.41 mM glikoza-6-fosfat, 0.4 U/ml glikoza-6-fosfat dehidrogenaza, 0.0082 mM NADP o 0.41 mM MgCl2 x 6H2O u puferu za test) i jedinjenje u totalnom volumenu testa od 100 μl. Posle 5 min pre-inkubacije pri 37º C enzimatska reakcija je započeta uz dodavanje 3 μM supstrata sa fluorescentnom probom AMMC u puferu za test. Posle inkubacije tokom 45 min na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena sa 2 volumena acetonitrila. Fluorescentne determinacije su provedene pri ekscitacijskoj talasnoj dužini od 405 nm i emisijskoj talasnoj dužini od 460 nm. Kinitidin (IC50-vrednost < 5 x 10-8 M) je uključen kao referentno jedinjenje.

Test za belančevinu CYP2C9 obuhvata po rupici 15 pmol P450/mg belančevine (u 0.01 M NaKfosfatnom puferu + 1.15% KCl), sustem za generisanje NADPH (3.3 mM glikoza-6-fosfat, 0.4 U/ml glikoza-6-fosfat dehidrogenaza, 1.3 mM NADP i 3.3 mM MgCl2 x 6H2O u puferu za test) i jedinjenje u totalnom volumenu testa od 100 μl. Posle 5 min pre-inkubacije pri 37º C enzimatska reakcija je započeta uz dodavanje 200 μM supstrata sa fluorescentnom probom MFC u puferu za test. Posle inkubacije tokom 30 min na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena sa 2 volumena acetonitrila. Fluorescentne determinacije su provedene pri ekscitacijskoj talasnoj dužini od 405 nm i emisijskoj talasnoj dužini od 535 nm. Sulfafenazol (IC50-vrednost < 6.8 x 10-7 M) je uključen kao referentno jedinjenje.

U svrhu inicijalnog ispitivanja, jedinjenja su testirana pri jednoj fiksnoj koncentraciji od 1 x 10-5 M. Za aktivna jedinjenja, opiti su ponovljeni sa ciljem utvrđivanja pune krive koncentracija-odgovor. Za svaki opit, kontrole (ne sadrže lek) i slepe probe (ne sadrže enzim niti lek) su provedene paralelno. Sva jedinjenja su testirana četiri puta. Slepa vrednost je oduzeta od vrednosti svih kontrola i primeraka. Za svaki opit, srednja vrednost P450 aktivnosti primeraka (u relativnim jedinicama fluorescencije) je izražena kao procenat srednje vrednosti P450 aktivnosti kontrole. Procenat inhibicije je izražen kao 100% minus srednja vrednost P450 aktivnosti primerka. Kada je bilo prikladno, izračunate su i IC50-vrednosti (koncentracija leka koje je potrebna da se reducira P450 aktivnost do 50% aktivnosti kontrole).

Tabela F-3: Prikazuje rezultate jedinjenja koja su bila testirana u skladu sa primerom C.1, C.2, C.3.a. i C.3.b

Broj jedinjenja

Enzimatska aktivnost pIC50 C.1.

Ćelijska aktivnost pIC50 C.2.

Rastvorivost

C.3.b.

pH = 2.3 mg/ml

Rastvorivost C.3.a.

1

8.2

7.9

3

2

7.4

6.5

3

3

8.1

7.5

3

4

8.2

7.5

3

5

7.9

7.4

1

6

7.6

7.4

3

7

> 9

7.5

2.0

8

8.8

7.9

2.9

9

9.4

7.6

10

8.4

7.5

3.0

11

9.4

8.0

3.1

12

9.0

7.5

2.1

13

8.8

7.0

3.7

14

8.5

7.4

2.8

15

7.6

7.0

3

16

7.4

7.1

2.8

17

8.8

6.7

2.2

18

8.5

7.0

3.6

19

8.4

6.3

2.6

20

7.7

7.3

21

7.9

6.8

2.1

22

7.9

6.8

4.2

23

8.0

6.6

24

8.8

7.5

4.0

25

7.9

7.6

3.4

26

8.3

7.2

3.5

27

> 9

7.5

28

> 9

7.5

31

8.5

7.4

32

>9

>7.5

33

> 9

8.2

34

8.8

7.9

35

9.6

7.8

D. Primer kompozicije: Tablete zamotane sa filom

Preparacija srčike tablete

Mešavina 100 g jedinjenja sa formulom (I), 570 g laktoze i 200 g škroba se dobro meša i posle toga se vlaži sa rastvorom od 5 g natrijum dodecil sulfata i 10 g polivinil-pirolidona u oko 200 ml vode. Vlažna praškasta mešavina se seje, suši i ponovo seje. Tada se dodaje 100 g mikrokristalne celuloze i 15 g hidrogeniranog ulja. Cela mešavina je dobro meša i komprimira u tablete, pri čemu može da se dobije 10000 tableta, od kojih svaka obuhvata 10 mg jedinjenja sa formulom (I).

Premaz

Rastvor od 10 g metil celuloze u 75 ml denaturiranog etanola se dodaje u rastvor 5 g etil celuloze u 150 ml diklorometanu. Tada se dodaje 75 ml diklorometana i 2.5 ml 1,2,3-propantriola, a 10 g poolietilen glikola je stopljeno i rastvoreno u 75 ml diklorometana. Kasniji rastvor je dodan u prethodni, a tada je dodano 2.5 g magnezijum oktadekanoata, 5 g polivinil-pirolidona i 30 ml koncentrirane kolorne suspenzije i sve je homogenizovano. Srčike tableta su zamotane sa takvom mešavinom u aparatu za zamotanje.

Claims (12)

1.Jedinjenje sa formulom (I), N-oksidne forme, njegove farmaceutski prihvatljive adicijske soli i stereohemijske izomerne forme, naznačeno time, da svaki X je nezavisno N ili CH; R1 je fenil, naftalenil ili heterociklil; gde svaki od pomenutih fenila ili naftalenila ponekad je supstituisan sa jednim ili dva supstituenta svaki nezavisno izabran među halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, polihaloC1-6alkila, arila, hidroksi, cijano, amino, C1-6alkilkarbonilamino, C1-6alkilsulfonilamino, hidroksikarbonila, C1-6alkiloksikarbonila, hidroksiC1-6alkila, C1-6alkiloksimetila, aminometila, C1-6alkilaminometila, C1-6alkilkarbonilaminometila, C1-6alkilsulfonilaminometila, aminosulfonila, C1-6alkilaminosulfonila ili heterociklila; R2 je vodonik, -CH2-R5, trifulorometil, -C(=O)-R6 ili –CH2-NR7R8; gde svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkoksi, C1-6alkiloksiC1-6alkiloksi, C1-6alkilkarboniloksi, piperazinila, N-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ili triazolila; svaki R6 je nezavisno izabran među hidroksi, C1-6alkiloksi, amino ili mono- ili di(C1-6alkil)amino, C1-6cikloalkilamino, hidroksiC1-6alkilamino, piperazinila, mono- ili di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino N-metilpiperazinila, morfolinila ili tiomorfolinila; svaki R7 i R8 su nezavisno izabrani među vodonika, C1-6alkila, C1-6alkilkarbonila, C1-6alkilsulfonila ili mono- ili di(C1-4alkil)aminosulfonila; R3 je vodonik, hidroksimetil, aminometil ili mono- ili di(C1-6alkil)aminometil; R4 je vodonik ili C1-6alkil; aril u gornjem fenilu ili naftalenilu; gde svaki pomenuti fenil ili naftalenil je ponekad supstituisan sa jednim ili dva supstituenta svaki neovisno izabran među halo, C1-6alkila, C1-6alkoksi, trifluorometila, cijano ili hidroksikarbonila; i gore pomenuti heterociklil je furanil, tienil, pirolil, pirolinil, pirolidinil, dioksolil, oksazolil, tiazolil, imidazolil, imidazolidinil, pirazolil, pirazolinil, pirazolidinil, izoksazolil, izotiazolil, oksadiazolil, triazolil, tiadiazolil, piranil, piridinil, piperidinil, dioksanil, morfolinil, ditianil, tiomorfolinil, piradizinil, pirimidinil, pirazinil, piperazinil, triazinil, tritianil, indolizinil, indolil, indolinil, benzofuranil, benzotifenil, indazolil, benzimidazolil, bentatiazolil, purinil, kinolizinil, kinolinil, cinolinil, ftlazinil, kinazolinil, kinoksalinil ili naftiridinil; gde svaki pomenuti heterocikal je ponekad supstituisan sa jednim ili više supstituenata svaki nezavisno izabran među halo, C1-6alkila, C1-6alkoksi, C1-6alkiloksi, cijano, amino, mono- ili di(C1-4alkil)amino.

2.Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, da svaki X je N; R1 je fenil ili fenil ponekad supstituisan sa halo, C1-6alkil, C1-6alikloksi, polihaloC1-6alkil ili aril; R2 je –CH2-R5 ili –C(=O)-R6; svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi, C1-6alkiloksiC1-6alkiloksi, C1-6alkilkarboniloksi, N-metilpiperazinila, morfolinila ili imidazolila; svaki R6 je nezavisno izabran iz C1-6alkilamino, C1-6cikloalkilamino, hidroskiC1-6alkilamino, di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino ili morfolinila; R3 je vodonik i R4 je vodonik ili C1-6alkil.

3.Jedinjenje u skladu sa zahtevima 1 i 2, naznačeno time, da svaki X je N; R1 je fenil ili fenil ponekad supstituisan sa halo; R2 je –CH2-R5; svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi ili C1-6alkilkarboniloksi; R3 je vodonik i R4 je vodonik.

4.Jedinjenje u skladu sa zahtevima 1, 2 i 3, naznačeno time, da pomenuto jedinjenje je jedinjenje Br. 1, jedinjenje Br. 8, jedinjenje Br. 11, jedinjenje Br. 9, jedinjenje Br. 33, jedinjenje Br. 34, jedinjenje Br. 7 ili jedinjenje Br. 25.

5.Farmaceutska kompozicija, naznačena time, da obuhvata farmaceutski prihvatljive kerijere i jedan aktivni sastojak sa terapeutski efektivnom količinom jedinjenja prema zahtevima od 1 do 4.

6.Proces pripremanja farmaceutske kompozicije prema zahtevu 5, naznačen time, da su farmaceutski prihvatljivi kerijeri i jedinjenje prema zahtevima od 1 do 4 intimno pomešani.

7.Jedinjenje prema zahtevima od 1 do 4, naznačeno time, da se upotrebljava kao lek.

8.Upotreba jedinjenja prema zahtevima od 1 do 4, naznačena time, da se jedinjenje koristi u proizvodnji leka za tretman proliferativnih bolesti.

9.Kombinacija, naznačena time, da sadrži anti-tumorski agens i inhibitor HDAC prema zahtevima od 1 do 4.

10.Proces za pripremu jedinjenja prema zahtevu 1, naznačen time, da intermedijer sa formulom (II) reagira sa odgovarajućom kiselinom, a to dovodi do nastanka hidroksamične kiseline sa formulom (I).

11.Jedinjenje sa formulom (V) N-oksidne forme, njegove farmaceutski prihvatljive adicijske soli i stereohemijski izomeri, naznačeno time, da svaki X je nezavisno N ili CH; R1 je fenil, naftalenil ili heterociklil; gde svaki pomenuti fenil ili naftalenil je ponekad supstituisan sa jednim ili dva supstituenta svaki nezavisno izabran iz halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, polihaloC1-6alkila, arila, hidroksi, cijano, amino, C1-6alkilkarbonilamino, C1-6alkilsulfonilamino, hidroksikarbonila, C1-6alkiloksikarbonila, hidroksiC1-6alkila, C1-6alkiloksimetila, aminometila, C1-6alkilaminometila, C1-6alkilkarbonilaminometila, C1-6alkilsulfonilaminometila, aminosulfonila, C1-6alkilaminosulfonila ili heterociklila; R2 je vodonik, -CH2-R5, trifluorometil, -C(=O)-R6 ili –CH2-NR7R8; gde svaki R5 je nezavisno izabran iz vodonika, hidroksi, C1-6alkiloksi, C1-6alkiloksiC1-6alkiloksi, C1-6alkilkarboniloksi, piperazinila, N-metilpiperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, imidazolila ili triazolila; svaki R6 je nezavisno izabran iz vodonika, C1-6alkiloksi, amino ili mono- ili di(C1-6alkil)amino, C1-6cikloalkilamino, hidroksiC1-6alkilamino, piperazinila, mono- ili di(C1-6alkil)aminoC1-6alkilamino N-metilpiperazinila, morfolinila ili tiomorfolinila; svaki od R7 i R8 je nezavisno izabran od vodonika, C1-6alkila, C1-6alkilkarbonila, C1-6alkilsulfonila ili mono- ili di(C1-4alkil)aminosulfonila; R3 je vodonik, hidroksimetil, aminometil ili mono- ili di(C1-6alkil)aminometil; R4 je vodonik ili C1-6alkil; gore pomenuti aril je fenil ili naftalenil; gde svaki pomenuti fenil ili naftalenil je ponekad supstituisan sa jednim ili dva supstituenta svaki nezavisno izabran iz halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, trifluorometila, cijano ili hidroksikarbonila; i gore pomenuti heterociklil je furanil, pirolil, pirolinil, pirolidinil, dioksolil, oksazolil, tiazolil, imidazolil, imidazolinil, imidazolidinil, pirazolil, pirazolinil, pirazolidinil, izoksazolil, izotiazolil, oksadiazolil, triazolil, tiadiazolil, piranil, piridinil, piperidinil, dioksanil, morfolinil, diatianil, tiomorfolinil, piridazinil, pirimidinil, pirazinil, piperazinil, tiazinil, tritianil, indolizinil, indolil, indolinil, benzofuranil, benzotiofenil, imidazolil, benzoimidazolil, benztiazolil, purinil, kinolizinil, kinolinil, cinolinil, ftlazinil, kinazolil, kinaksolinil ili naftiridinil; gde svaki pomenuti heterocikal ponekad je supstituisan sa jednim ili dva supstituenta svaki nezavisno izabran iz halo, C1-6alkila, C1-6alkiloksi, cijano, amino ili mono- di(C1-4alkil)amino.

12.Proces za pripremanje jedinjenja prema zahtevu 11, naznačen time, da obuhvata a) Konvertovanje jedinjenja sa formulom (V), gde R2 je –CH2OH i R4 je vodonik, ovde označena kao jedinjenja sa formulom (V-a), u jedinjenja sa formulom (V) gde R2 je različit od –CH2OH, ovde označena kao jedinjenja (V-b), preko reakcije koja je poznata stanju tehnike ili transformisanja funkcionalnih grupa, i b) Pripremanje jedinjenja sa formulom (V-a) u jednom koraku uz pomoć reakcije intermedijera sa formulom (VI) sa 1,4-dioksan-2,5-diolom te odgovarajućom boroničnom kiselinom (VII), gde R1 je definisan ranije ili c) Pripremanje jedinjenja sa formulom (V-b) uz pomoć reakcije intermedijera sa formulom (VI) sa odgovarajućim ketonom sa formulom (VIII), gde R1 i R2 su definisani ranije. d) Pripremanje jedinjenja sa formulom (V), gde R2 je –COOH ovde označena kao jedinjenja sa formulom (V-c) u jednom koraku uz pomoć reakcije intermedijera sa formulom (VI) sa 2-okso-propanoičnom kiselinom i odgovarajućom boroničnom kiselinom sa formulom (VII), gde R1 je definisan ranije, u odgovarajućem rastvaraču uz dodatnu konverziju u intermedijere sa formulom (V) gde R2 je –C(=O)-R6, preko reakcija koje su poznate stanju tehnike ili transformisanjem funkcionalnih grupa