ME00550B - Korišćenje il-18 inhibitora za lećenje ili prevenciju povreda cns - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda centralnog nervnog sistema a pre svega traumatske povrede glave. Ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za pripremu  medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda centralnog nervnog sistema a pre svega  traumatske povrede glave.

Description

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak je na polju patoloških stanja mozga. Još specifičnije, on se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za lečenje i/ili prevenciju povreda centralnog nervnog sistema (CNS) , pre svega traumatskih povreda mozga.

STANJE TEHNIKE

Godine 1989, opisana je aktivnost seruma izazvana endotoksinom koju je izazvao interferon-y (IFN-γ) dobijen iz slezine miša (Nakamura et al., 1989). Ova serumska aktivnost je funkcionisala ne kao direktna indukcija IFN-γ, već pre kao ko -stimulant zajedno sa IL-2 ili mitogenima. Pokušaj da se purifikuje aktivacija iz post-endotoksinskog mišjeg seruma otkrio je naizgled homogeni 50-55 kDa protein. Budući da drugi citokini mogu da deluju kao ko-stimulanti za produkciju IFN-γ, neuspeh da se neutralizuju antitela na IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, ili TNF da se neutralizuje serumska aktivnost ukazuje da je to bio nedvosmisleni faktor. Godine 1995, isti naučnici su pokazali da je endotoksinom-indukovani ko-stimulant za produkciju IFN-γ prisutan u ekstraktima jetre miševa prethodno kondicioniranih sa P. acnes (Okamura et al., 1995). U ovom modelu, populacija makrofaga jetre (Kupfferove ćelije) su se širile, pa kod tih miševa niska doza bakterijskog lipopolisaharida (LPS), koja kod prethodno kondicioniranih miševa nije smrtonosna, postaje smrtonosna. Ovaj faktor, nazvan faktor kojhi indukuje IFN-γ (IGIF) i kasnije prepoznat kao interleukin-18 (IL-18), pročišćen je do homogenosti od 1.200 grama jetre miševa tretiranih sa P. acnes. Degenerisani oligonukleotidi izvedeni iz aminokiselinskih sekvenci prečišćene IL-18 korišćeni su za kloniranje mišje IL-18 cDNK. IL-18 je jedan 18-19 kDa protein od 157 amino kiselina, koja nema očiglednih sličnosti sa ma kojim peptidom u bazama podataka. Glasnička RNK za IL-18 i interleukin-12 (IL-12) već su detektovane u Kupfferovim ćelijama i aktiviranim makrofagima. Rekombinantni IL-18 indukuje IFN-gama jače od IL-12, očigledno potpuno odvojenim putem (Micallef et al., 1996). Slično endotoksinom-indukovanoj serumskoj aktivnosti, IL-18 ne indukuje IFN-γ po sebi, već prvenstveno deluje kao ko-stimulant sa mitogenima ili IL-2. IL-18 pojačava proliferaciju T ćelija, očigledno preko puta koji je zavisan od IL-2, i pokačava produkciju Th1 citokina in vitro i ispšoljava sinergiju kada se kombinuje sa IL-12 u smislu pojačane produkcije IFN-7 (Maliszewski et al., 1990).

Pošto je kloniran mišji oblik, godine 1996 zabeležena je i humana cDNK za IL-18 (Ushio et al., 1996).

Kloniranjem IL-18 Iz zahvaćenih tkiva i ispitivanjem IL-18 genske ekspresije, utvrđena je tesna veza ovog citokina sa autoimunim bolestima. Negojazni dijabetični miševi (NOD) spontano razvijaju autoimuni insulitis i dijabetes, što se može ubrzati i sinhronizovati samo jednom injekcijom ciklofosfamida. IL-18 mRNK je pokazana pomoću PCR reverzne transkriptase kod pankreasa NOD miša tokom rane faze insulitisa. Nivoi IL-18 mRNK povećavaju se brzo posle tretmana ciklofosfamidom i prethode porastu IFN-7 mRNK, i potom dijabetesu. Zanimljivo je da ova kinetika podražava kinetiku IL-12-p40 mRNK, što dovodi do bliske korelacije individualnih nivoa mRNK. Kloniranje IL-18 cDNK iz pankreasne RNK praćeno sekvenciranjem otkriva identičnost sa IL-18 sekvencom kloniranom iz Kupfferovih ćelija i in vivo prethodno aktiviranih makrofaga. Isto tako, makrofagi NOD miša su reagovali na ciklofosfamid IL-18 genskom ekspresijom dok makrofagi Balb/c miševa paralelno nisu. Prema tome, IL-18 ekspresija je abnormalno regulisana kod autoimunih NOD miševa i tesno povezana sa razvojem dijabetesa (Rothe et al., 1997).

IL-18 igra potencijalnu ulogu u imunoregulaciji ili inflamaciji povećavanjem funkcionalne aktivnost Fas liganda na Th1 ćelije (Conti et al., 1997). IL-18 je takođe eksprimiran u adrenalnom korteksu pa stoga može sekretovati neuro-imunomodulator, koji igra važnu ulogu u orkestraciji imunološkog sistema po stresogenom iskustvu (Chater, 1986).

In vivo, IL-18 se formira cepanjem pro-IL-18, i njegova endogena aktivnost izgleda objašnjava produkciju IFN-7 u P. acnes i smrti posredovanoj LPS-om. Zreli IL-18 se proizvodi od svoga prekursora IL-1 p konvertujućeg enzima (IL-1beta-konvertujući enzim, ICE, kaspaze-1).

IL-18 receptor se sastoji od najmanje dve komponente, koje sarađuju u vezivanju liganda. Mesta vezivanja visokog i niskog afiniteta za IL-18 nađena su u mišjim IL-12 stimulisanim T ćelijama (Yoshimoto et al., 1998), ukazuje na multipli lančani receptorski kompleks. Do sada su identifikovane dve receptorske podjedinice gde obe pripadaju porodici IL-1 receptora (Parnet et al., 1996). Transdukcija signala IL-18 uključuje aktivaciju NF-kB (DiDonato et al., 1997).

Nedavno je iz urina čoveka izolovan jedan rastovrljivi protein koji ima visoki afinitet za IL-18, pa su opisane humane i mišje cDNK (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Ovaj protein je nazvan IL-18 vezijućim proteinom (IL-18BP).

IL-18BP nije vanćelijski domen jednog od poznatih IL18 receptora, već sekretovani protein koji je u prirodnoj cirkulaciji. On pripada novoj porodici sekretovanih proteina. Ova porodica dalje uključuje Poksvirus-enkodirane proteine koji imaju visoku homologiju sa IL-18BP (Novick et al., 1999). IL-18BP je konstitutivno eksprimiran u slezini, pripada superporodici imunoglobulina, i ima ograničenu homologiju sa IL-1 tip II receptorom. Njegov gen je lokalizovan na humanom hromozomu 11 q 13, i nije nađeno eksonsko kodiranje za transmembranski domen u 8.3 kb genomskoj sekvenci (Novick et al., 1999).

Humani i dva mišja izoforma IL-18BP, koji nastaju od nadovezivanja mRNK koji su nađeni u mnogim bibliotekama cDNK su i eksprimirani i prečišćeni, i procenjeno je njihovo vezivanje i neutralizacija IL-18 bioloških aktivnosti (Kim et al., 2000). Humani IL-18BP izoform (IL-18BPa) ispoljio je najveći afinitet za IL-18 sa brzom "on-rate", i sporom "off-rate'', i konstantom disocijacije (K(d)) od 399 pM. IL-18BPc ima zajednički Ig domen sa IL-18BPa osim za 29 C-terminalne amino kiseline; K(d) IL-18BPc je dest puta manja (2.94 nM). Ipak, IL-18BPa i IL-18BPc neutralizuju IL-18 >95% pri molarnom višku od dva. IL-18BPb i IL-18BPd izoformi nemaju kompletan Ig domen i nemaju sposobnost da vezuju ili neutralizuju IL-18. Mišji IL-18BPc i IL-18BPd izoformi, koji imaju identičan Ig domen, takođe neutralizuju >95% mišje IL-18 pri molarnom višku od dva. Međutim, mišji IL-18BPd, koji ima zajednički C-terminalni motiv sa humanim IL-18BPa, takođe neutralizuje humani IL-18. Molekularno modelovanje identifikovalo je jedno veliko elektrostatsko i hidrofobno mesto vezivanja u Ig domenu IL-18BP, što bi moglo da obajsni njegov visoki afinitet vezivanja za ligand (Kim et al., 2000).

Traumatka povreda mozga (TBI), koja se jednostavno naziva i povredom glave, ili zatvorenom povredom glave (CHI), odnosi se na povredu centralnog nervnog sistema tamo gde postoji oštećenje mozga izazvano udarcem u glavu nanetom spolja. Ovo se najčešće dešava tokom saobraćanih udesa sa autom ili biciklom, ali može da bude posledica i pretećeg davljenja, srčanog udara i infekcija. Ovaj tip traumatske povrede mozga bi obično bio posledica nedostatka kiseonika ili dovoda krvi u mozak, i može se stoga nazivati i "anoksičnom povredom".

Zatvorena povreda glave nastaje kada dođe do udara u glavu, recimo pri saobraćajnom udesu ili pri padu. U tom slučaju, lobanja udara u stacionarni predmet a mozak, koji je unutar lobanje se okreće i uvrće po svojoj osi (moždano stablo), što dovodi do lokalizovanog ili široko rasprostranjenog oštećenja. Isto tako, mozak, meka masa okružena tečnošću koja mu omogućuje da "pluta" što može da dovede do odbijanja o lobanju i dodatnog oštećenja.

Neposredno po traumi može da nastupi period bez svesti, a taj period može da traje nekoliko minuta, nedelja ili meseci. Zbog uvrtanja i odbijanja, pacijent sa traumatski oštećenim mozgom obično prima oštećenje ili podliv u mnoge delove mozga. Ovo se naziva difuznom povredom mozga, ili “ne-projektilske povrede” mozga. Tipovi oštećenja koji nastaju kod povreda koje nisu projektilske mogu se klasifikovati kao primarne ili sekundarne.

Primarna povreda mozga nastaje u trenutku samog povređivanja, uglavnom na mestu udara, pogotovu kada postoji i deo lobanje. Velike kontuzije mogu biti povezane sa intracerebralnom hemoragijom ili praćene kortikalnim laceracijama. Difuzne aksonske povrede nastaju kao rezultat uvrtanja i tenzilnih sila u neuronalnim procesima koji se proizvode rotacionim kretanjem mozga u lobanji. Mogu postojati manje hemoragijske lezije ili difuzno oštećenje aksona, koji se mogu detektovati samo mikroskopski.

Sekundarno oštećenje mozga nastaje kao rezultat komplikacija koje se razvijaju posle samog povređivanja. Ovde spadaju intrakranijalna hemoragija, traumatsko oštećenje ekstracerebranih arterija, intrakranijalna hernijacija, hipoksično oštećenje mozga ili meningitis.

Otvorena povreda glave je vidljivi udar glave i može da bude posledica rane od vatrenog oružja, udesa ili predmeta koji kroz lobanju ulazi u mozak (“povreda projektilom”). Ovakva vrsta povrede glave će verovatnije oštetiti specifični deo mozga.

Takozvane blage povrede mozga mogu da nastanu bez gubitka svesti i verovatno samo sa kraćom konfuzijom, lako zdravstvena nega koja se primenjuje može biti minimalna, lica sa povrednom mozga bez kome mogu osetiti simptome i probleme slične onima koji prežive povredu praćenu komom.

Kao odgovor na traumu, dolazi do promena u mozgu koje iziskuju praćenje da se spreči dalje oštećenje. Po većim povredama mozga, mozak se povećava. To se naziva otokom mozga i nastaje kada u mozak dolazi više krvi. Kasnije tokom bolesti, može doći do nagomilavanja vode u mozgu i to se naziva edemom mozga. I otok i edem mozga dovode do povećanja pritiska u mozgu što se naziva intrakranijalnim pritiskom ("ICP").

Koma je produženi period bez svesti koji neposredno prati traumatsku povredu

glave.

Postoji nekoliko nivoa kome. Koma se može meriti progresijom odgovora lica koje se povređeno u glavu. U akutnoj fazi povrede glave koristimo "Glazgovsku skalu kome". Kako se stanje pacijenta poboljšava ili stabilizuje, koristi se “Rančo Los Amigos skala” koja meri nivoe kognitivnog (razumevanja i rezonovanja) mišljenja.

Povreda mozga često dovodi do trajne slabosti kao što je post-traumatska epilepsija, perzistentno vegetativno stanje, ili post-traumatska demencija.

Na povrede kičmene moždine otpada većina bolničkih prijema radi paraplegije i tetraplegije. Više od 80% su posledica saobraćajnih udesa. Klinički se prepoznaju dve glavne grupe: otvorene i zatvorene povrede.

Otvorene povrede dovode do direktne traume kičmene moždine i nervnih korenova. Perforativne povrede mogu da dovedu do ekstenzivnog pucanja i hemoragije. Na zatvorene povrede otpada najveći deo povreda moždine i obično su povezane sa prelomom/dislokacijom kičmenog stuba, što se obično radiološki pokazuje. Oštećenje moždine zavisi od obima koštanih povreda i razmatra se u dva glavna stadijuma: primarno oštećenje kao što su kontuzije, transekcije nervnih vlakana i hemoragijska nekroza i sekundarna povreda, kao što su ekstradurani hematomi, infarkti i edemi.

U pozna dejstva oštećenja moždine spadaju: uzlazna i nizlazna anterograda degeneracija oštećenih nervnih vlakana, post-traumatska siringomelija, i sistemska dejstva paraplegije kao što su infekcije urinarnog trakta i grudnog koša, dekubitusi i propadanje mišića.

Patologija traumatiske povrede mozga je veom složena i još se nedovoljno razume. Istraživački napori iz prethodne decenije su naglasili važnu ulogu citokina koji se oslobađaju sistemski i lokalno unutar intratekalnog odeljka po povredi mozga, a dvojno dejstvo pro-inflamatornih citokina, kao što su TNF, IL-6, ili IL-8, je pretpostavljeno na osnovu nalaza o vremenski zavisnim korisnim i neželjenim dejstvima ovih medijatora (Morganti-Kossmann et al., 1997; Kossmann et al., 1997; Shohami et al., 1999, Scherbel et al., 1999; VVhalen et al., 2000). Kao što je gore opisano, nedavno otkriveni citokin porodice IL-1 je IL-18. Novija ispitivanja su pokazala da je IL-18 konstitutivno eksprimiran u CNS miša, pacova i ljudi in vivo (Culhane et al., 1998;

Jander i Stoll, 1998; Prinz et al., 1999; Fassbender et al., 1999; VVheeler et al., 2000), kao i u primarnim kulturama astrocita i microglije, ali ne neurona, in vitro (Conti et al., 1999). Povećani nivoi IL-18 otkriveni su u cerebrospinalnij tečnosti (CSF) pacijenata sa zapaljenskim bolestima CNS, kao što je bakterijski meningitis i virusni meningoencefalitis, ali ne i u CSF pacijenata od multiple sklerozee (MS) (Fassbender et al., 1999). Nasuprot nalaza generalno niskih intratekalnih nivoa IL-18 kod pacijenata od MS, povećana ekspresija IL-18 mRNK pokazana je u kičmenim moždinama Luisovih pacova sa eksperimentalnim autoimunim encefalomijelitisom (EAE), životinjskom modelu MS (Jander i Stoll, 1998). Ova ekspresija i funkcionalni značaj IL-18 u neurotraumi do sada nisu bili ispitivani.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na patofizioiološku ulogu IL-18 u CNS bolestima. Zasniva se na nalazu da tretman miševa sa inhibitorima IL-18, bilo jedan sat ili tri dana po eksperimentalnoj zatvorenoj povredi glave (CHI), dolazi do poboljšanog oporavka i ublaženi obim oštećenja mozga u poređenju sa kontrolnim životinjama. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju povreda centralnog nervnog sistema (CNS), i pre svega traumatske povreda mozga.

Korišćenje kombinacije IL-18 inhibitora sa interferonom i/ili TNF i/ili inhibitorima inflamacije i/ili antioksidantima je takođe obuhvaćeno ovim pronalaskom. Da bi se primenio genski terapisjki pristup da se IL-18 inhibitor dopremi do obolelih tkiva ili ćelija, dodatni aspekti ovog pronalaska odnose se na korišćenje molekula nukleinske kiselinee koji obuhvataju sekvence kodiranja IL-18 inhibitora za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS. Ovaj pronalazak se odnosi i na korišćenje ćelije povrgnute genetskom inženjeringu da se eksprimiraju IL-18 inhibitori za prevenciju i/ili tretman povreda CNS.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1 pokazuje histogram koji opisuje serumske nivoe intracerebralnog IL-18 (ng/ml) u ćelom mozgu (šrafirano), u levoj hemisferi (crno) ili u desnoj hemisferi (sivo) pod različitim uslovima.

Slika 2 pokazuje razvoj NSS (skor neurološke težine) meren 1 sat (h), 24h, 72h iii 168h posle traume, bilo sa 50 µg IL-18BP dato i.p. 1 h posle trauma (kvadratići), ili samo injekcijom nosača (placebo) (kontrola, kružići).

Slika 3 pokazuje ΔNSS mereno 24h, 72h ili 168h posle traume, bilo sa 50 jug IL-18BP dato i.p. 1h posle traume (kvadratići), ili samo injekcijom nosača (placebo) (kontrola, kružići).

Slika 4 pokazuje ΔNSS mereno 1h, 24h, 3 dana (d), 7d ili 14d posle traume, bilo sa 50 µg IL-18BP datog i.p. bilo u vidu pojedinačne doze 3d posle traume (rombovi), ili sa dvostrukom dozom 1 h i 3d posle traume (kvadrati) ili injekcijom samo nosača (placebo) (kontrol, trouglovi).

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se bazira na nalazu statistički signifikantnog korisnog dejstva IL-18 inhibitora na oporavak od povrede mozga na mišjem modelu zatvorene povrede glave. U skladu sa ovim pronalaskom, dalje je utvrđeno daje IL-18 ushodno regulisan u mozgu i u cerebrospinalnoj tečnosti posle traumatske povrede mozga, što govori da ovaj pro-inflamatorni citokin igra važnu ulogu u patogenezi povrede mozga.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje IL-18 inhibitora za proizvodnju leka/medikamenta for lečenje i/ili prevenciju povreda centralnog nervnog sistema (CNS).

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje IL-18 inhibitora za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju komplikacija i poznih dejstava povrede.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, povreda CNSa jeste traumatska povreda mozga ili zatvorena povreda glave.

U još jednom preporučenom obliku, povreda CNSa jeste i povreda kičmene moždine.

U još jednom preporučenom oblikuovog pronalaska, the povreda mozga je vaskularnog porekla.

U kontekstu ovog pronalaska, izraz “sistemska povreda centralnog nervnog sistema” ili “povreda CNS-a” odnosi se na svaku povredu mozga ili kičmene moždine, nezavisno od uzrasta subjekta koji je povređen, ili uzročnika u osnovi. Osnovni uzročnik može, na pr. da bude mehanički, ili pak infekcija. Povreda CNS-a i njeni klinički simptomi i implikacije opisani su detaljno u “Oblasti tehnike". Povreda CNS isključuje i na pr. traumu, ili ma koje drugo oštećenje mozga ili kičmene moždine i može se takođe, nazvati neurotrauma.

Povreda mozga može, na primer, da uključi ili dovede do ma koje od sledećih pojava, izolovano ili u kombinaciji: 1. poremećaj pažnje; 2. poremećaj kognicije; 3. slabljenje jezičkih sposobnosti; 4. slabljenje pamćenja ; 5. poremećaj ponašanja; 6. motorni poremećaji; 6. ma koje druge neurološke disfunkcije.

Povreda kičmene moždine može na primer da dovede do paraplegije ili tetraplegije.

Komplikacije ili pozna dejstva povreda CNS-a mogu se takože lečiti ii/ili prevenirati u skladu sa ovim pronalaskom. Komplikacije i pozna dejstva povreda mozga opisani su gore pod “Polje tehnike". Oni uključuju, ali se ne ograničavaju na komu, meningitis, post-traumatsku epilepsiju, post-traumatsku demenciju, degeneraciju nervnih vlakana, ili post-traumatsku siringomijeliju, ili hemoragiju, na primer.

Ovaj pronalazak se odnosi i na korišćenje IL-18 inhibitora za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju svake povrede mozga koja je vaskularnog porekla, kao što je hipoksično oštećenje mozga sa cerebralnim infarktom, ishemija, cerebrovaskularni akcident ili moždani udar. ' '

Izrazi “lečenje" i “prevencija”, u smislu u kome se ovde koristi, treba razumeti kao delimično ili potpuno sprečavanje inhibiciju, ublažavanje, poboljšanje ili reverziju jednog ili više simptoma ili uzročnika povreda CNS-a, kao i simptoma, bolesti ili komplikacija koji prate povrede CNS-a. Kada se “leči” povreda CNS-a, supstance u skladu-, sa ovim pronalaskom se daju po početku bolesti, “prevencija” se odnosi na davanje supstanci pre pojave znakova bolest na samom pacijentu.

Lečenje povreda CNS-a se preporučuje u skladu sa ovim pronalaskom. Po mogućstvu, da bi se lečila povreda CNS-a, IL-18 inhibitor se daje najbrže moguće po nastanku povrede CNS-a, na pr. u toku prvog sata po nsatanku povrede. Međutim, kao što je pokazano u primerima dole, jedan IL-18 inhibitor je pokazao da ima povoljno dejstvo na povredu mozga čak i kada se daje čak tri dana posle zadobijanja povrede mozga. Prema tome, da bismo lečiti povrede CNS-a, preporučuje se da dajemo IL-18 inhibitor u roku od tri dana po nastanku povrede.

Izraz “inhibitor IL-18" u kontekstu ovog pronalaska, odnosi se na svaki molekul koji modulira IL-18 produkciju i/ili delovanje tako da IL-18 produkcija i/ili delovanje bude ublaženo, smanjeno ili delimično, supstancijalno ili poptuno sprečeno ili blokirano. Izraz “IL-18 inhibitor” se koristi tako da obuhvati inhibitore produkcije IL-18, kao i inhibitore dejstva IL-18.

Inhibitor produkcije može biti svaki molekul koji negativno utiče na sintezu, procesovanje ili maturaciju IL-18. Inhibitori koji su uzeti u obzir u skaldu sa ovim pronalaskom mogu biti, na primer, supresori genske ekspresije interleukina IL-18, antisens mRNKs koja smanjuje ili prevenira transkripciju IL-18 mRNK ili dovodi do degradacije mRNK, proteina koji slabe ispravno preklapanje, ili delimično ili supstancijalno preveniraju sekreciju IL-18, proteaze koja degradira IL-18, kada se ova jednom sintetizuje, inhibitora proteaza koji cepaju pro-IL-18 da bi se generisali zreli IL-18, kao što su inhibitori kaspaze-1, i slično.

Jedan inhibitor delovanja IL-18 može, na primer, biti antagonist IL-18. Antagonisti mogu da se vezuju ili da sekvestriraju sam molekul IL-18 sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću da se delimično ili supstancijalno neutralizuju mesta vezivanja IL-18 ili IL-18 odgovorna za vezivanje IL-18 za svoje ligande (kao, na pr. za svoje receptore). Jedan antagonist može takođe da inhibira signalni put IL-18, koji se aktivira u ćeliji po vezivanju IL-18 za svoj receptor.

Inhibitori dejstva IL-18 mogu biti solubilni IL-18 receptori ili molekuli koji podražavaju receptore, ili agente koji blokiraju IL-18 receptore, ili IL-18 antitela, kao što su poliklonska ili monoklonska antitela, ili ma koji drugi agens ili molekul koji sprečava vezivanje IL-18 za svoje ciljeve, smanjujući ili sprečevajući pokretanje intra- ili vanćelijskih reakcija posredovanih preko IL-18.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se selektuje preko inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitela usmerenog protiv IL-18, antitela usmerenog protiv ma koga od of IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 signalnog puta, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18, ili se vezuju za, i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, fuzirane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili cirkularno permutovane derivate, ili njihove soli.

Izraz “IL-18 vezujući proteini” ovde se koristi kao sinonim za “IL18BP". On obuhvata IL-18 vezujući proteini kako je definisan u WO 99/09063 ili u Novick et al., 1999, uključujući varijante sa nadovezivanjem i/ili izoforme IL-18 vezujućih proteina, kako su definisani u Kim et al., 2000. Pre svega, humani izoformi a i c IL-18BP su korisni u skladu sa ovim pronalaskom. Proteini koji su korisni u skladu sa ovim pronalaskom mogu biti glikozilirani ili ne-glikozilirani, mogu biti izvedeni iz prirodnih izvora, kao što je urin, ili ili se mogu, po želji, proizvoditi rekombinantno. Rekombinantni ekspresija se može sprovesti u prokariotskim sistemima ekspresije kao što je E. coli, ili u eukariotskim, i po mogućstvu u sistemima ekspresije sisara. Ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) je ćelijska linija koja je posebno pogodna za IL-18 inhibitore ovog pronalaskal.

Rekombinantna produkcija IL-18 inhibitora, tamo gde je rekombinantno eksprimiran u ćelijama sisara ili ćelijskim linijama može, po mogućstvu da se sprovede u medijumu ćelijske kulture bez sadržaja seruma.

U smislu u kome se ovde koristi, izraz "muteini" odnosi se na analoge jednog IL-18BP, ili analoge virusnog IL-18BP, u kome jedna ili više amino kiselinskih reziduuma prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP biva zamenjeno različitim amino kiselinskim reziduumima, ili se uklanjaju, ili se jedan ili više amino kiselinskih reziduuma dodaje prirodnoj sekvenci IL-18BP, ili virusni IL-18BP, ne smanjujući znatnije aktivnost rezultujućih proizvoda u poređenju sa IL-18BP divljeg tipa ili virusnim IL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikama mutageneze usmerenim na jedno mesto, ili ma kojim drugim tehnikama koje su podesne za ove namene.

Svaki takav mutein po mogićstvu ima sekvencu amino kiselina dovoljno duplikativnu za IL-18BP, ili dovoljno duplikativnu za virusni IL-18BP, kao što su da ima supstancijalno slične aktivnosti kao i IL-18BP. Jedna aktivnost IL-18BP je njena sposobnost vezivanja za IL-18. Sve dok ovaj mutein ima dovoljnu vezujuću aktivnost za IL-18, može se koristiti za purifikaciju IL-18, kao na primer uz pomoć afinitetne hromatografije, i i tako se može smatrati da ima supstancijalno istu aktivnost kao i IL-18BP. Prema tome, može se odredtiti da li ma koji dati mutein ima aktivnost supstancijalno istu kao i IL-18BP uz pomoć rutinskih eksperimenata koji obuhvataju podvrgavanje takvih muteina, na pr., jednostavnom eseju sendvič kompeticije da se odredi da li ili ne se on vezuje za propisno obeleženi IL-18, kao što su radioimunoesej ili ELISA esej. Jednostavni funkcionalni eseji za procenu biološke aktivnosti IL-18BP detaljno su opisani u WO 99/09063, na pr. u primerima 2 (vezivanje za IL-18 procenjeno unakrsnim vezivanjem) ili 5 (inhibicija IL-18 indukovana INF-gama indukcijom u mononuklearnim krvnim ćelijama).

U preporučenom obliku, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnosti ili homologije sa sekvencom bilo IL-18BP ili virusno-enkodiranih IL-18BP homologa. Još bolje, ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili, još bolje, najmanje 90% identičnosti ili homoloije sa njim.

Muteini IL-18BP polipeptida ili muteini virusni IL-18BP, što se može koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, ili kodiranje nukleinske kiseline za njih, uključuju konačni skup supstancijalno korespondirajućih sekvenci kao supstitucije peptida ili polinukleotida koji se mogu ritinski dobiti od strane stručnjaka za ovu oblast, bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu uputstava i smernica koji su sadržani ovde.

Muteini u skladu sa ovim pronalaskom uključuju proteine enkodirane nukleinskom kiselinom, kao što su DNA ili RNK, koji se hibridizuju u DNK ili RNK, koji enkodira IL-18 inhibitor, u skladu sa ovim pronalaskom, pod umereno ili veoma strogim uslovima. Izraz "strogi uslovi" odnosi se na hibridizaciju i posle toga uslove pranja, koje stručnjaci za ovu oblast uglavnom nazivaju konvencionalno "strogim". Vidi Ausubel et al., Tekući protokoli u molekularnoj biologiji(Current Protocols in Molecular Biology), supra, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992), i Sambrook et al.(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., i Maniatis, T. (1989) Molekulsko kloniranje: Laboratorijski priručnik (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Bez ograničenja, u primere strogih ulsova spadaju uslovi pranja 12-20°C ispod izračunate Trn hibrida koji se ispituje u, na pr., 2 x SSC i 0.5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0.1% SDS tokom 15 minuta; 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 37°C tokom 30-60 minuta i potom, 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 68°C tokom 30-60 minuta. Oni koji su stručni za ovu oblast razumeju da strogost uslova takođe zavisi od dužine DNK sekvenci, oligonukleotidnih proba (kao što su 10-40 baza) ili mešanih oligonukleotidnih proba. Ako se koriste mešane probe, preporučuje se korišćenje tetrametil amonijum hlorida (TMAC) umesto SSC. Vidi Ausubel, supra.

U preporučenom obliku, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnosti ili homologije sa sekvencom SEQ ID NO: 1, 2 ili 3 spiska sekvenci koji je u prilogu. Još bolje, ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% i najbolje ima, najmanje 90% identičnosti ili homologije sa njima.

Identičnost oslikava odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, što je određeno poređenjem tih sekvenci. Generalno, identičnost se odnosi na tačnu korespodenciju nukleotida prema nukleotidu ili amino kiseline prema amino kiselini kada se radi o dva polinukleotida ili dve polipeptidne sekvence, kada se radi o celoj dužini sekvenci koje se porede.

Za sekvence gde nemamo tačne korespodencije, može da se odredi "% identičnosti". Generalno govoreći, dve sekvence koje se porede se stave jedna prema drugoj da se dobije maksimalna korelacija između tih sekvenci. Ovo može da podrazumeva inserciju "praznina" u jednu ili u obe sekvence, da se pojača stepen poklapanja. Procenat (%) identičnosti se može odrediti ćelom dužinom svake od sekvenci koja se poredi (tzv. globalni redosled), koji je posebno pogodan za sekvence of iste ili veoma slične dužine, ili kraće, ali definisane dužine (takozvani lokalni raspored), koji je pogodniji za sekvence nejednake dužine.

Metode za poređenje identičnosti i homologije dve ili više sekvenci su dobro poznate u struci. Tako na primer, programi koji postoje u paketu za analiziranje koji se zove VVisconsin Sekvenca Analysis Package, verzija 9.1 (Devereux J et al., 1984), na primer programi BESTFIT i GAP, mogu da se koriste da se odredi % identičnosti između dva polinukleotida i % identičnosti i % homologije između dve polipeptidne sekvence. BESTFIT koristi algoritam "lokalne homologije" Smith i VVaterman (1981) i nalazi najbolji pojedinačni region sličnosti između dve sekvence. Ostali programi za određivanje identičnosti i/ili sličnosti između sekvenci takođe su poznati u struci, na primer porodica programa BLAST (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, koji se mogu dobiti sa sajtova na sledećoj adresi NCBI at www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Preporučene promene za muteine u skladu sa ovim pronalaskom su ono što se prepoznaje kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne amino kiselinske zamene IL-18BP polipeptida ili proteina ili virusni IL-18BPs, mogu da uključuju sinonimne amino kiseline u okviru grupe koja ima dovoljno slična farmakokinetička svojstva da će zamena između članova grupe da očuva biološku funkciju molekula (Grantham, 1974). Jasno je da insercije i delecije amino kiselina mogu takođe da se naprave sa gore pomenutim sekvencama bez izmene njihove funkcije, posebno ako insercije ili delecije uključuju samo nekoliko amino kiselina, na pr., manje od trideset, i po mogućstvu manje od deset, i ne uklanjaju ili ne pomeraju amino kiseline koje su kritične za funkcionalnu konformaciju, na pr., cisteinski reziduumi. Proteini i muteini koji se proizvedu takvim delecijama i/ili insercijama spadaju takođe u okvire ovog pronalaska.

Po mogućstvu, ove sinonimne grupe amino kiselina su one definisane na Tabeli 1. Još bolje, sinonimne grupe amino kiselina su one definisane na Tabeli 2; i najbolje, sinonimne grupe amino kiselina su one definisane na Tabeli 3.

TABELA 1

Preporučene grupe sinonimnih amino kiselina

TABELA 3

Najpreporučenije grupe sinonimnih amino kiselina

Primeri produkcije amino kiselinskih zamena u proteinima koji se mogu koristiti za dobijanje muteina IL-18BP polipeptida ili proteina, ili muteina virusnog IL-18BPs, za korišćenje ovog pronalaska uključuju poznate metode i njihove faze kako je prikazano u US patentima 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, autora Mark et al; 5,116,943 autora Koths et al., 4,965,195 autora Namen et al; 4,879,111 autora Chong et al; i 5,017,691 autora Lee et al; i lizinom supstituisane proteine prikazane u US patentu No. 4,904,584 (Shaw et al).

Izraz "fuzirani protein" odnosi se na polipeptid koji obuhvata IL-18BP, ili virusni IL-18BP, ili mutein ili njihov fragment, fuziran sa drugim proteinom, koji, na pr., ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. Jedan IL-18BP ili virusni IL-18BP, na taj način može da se fuzira sa drugim proteinom, polipeptidom ili slično, na pr., imunoglobulinom ili njihovim fragmentom.

"Funkcionalni derivati" u smislu u kome se ovde koristi obuhvataju derivate IL-18BPs ili virusnog IL-18BP, i njihove muteine i fuzirane proteine, koji se mogu pripremati iz funkcionalnih grupa koje nastaju na bočnim lancima na reziduumima ili N- ili C-terminalnim grupama, uz pomoć metoda poznatih u struci, i uključeni su u ovaj pronalazak sve dotle dok ostaju farmaceutski prihvatljivi, t.j. ne uništavaju aktivnost proteina koji je supstancijaino sličan aktivnosti IL-18BP, ili virusnog IL-18BPS, i ne donosi toksična svojstva sastavu koji ga sadrži.

Ovi derivati mogu, na primer, da uključe polietilen glikolne bočne lance koji mogu da maskiraju antigenska mesta i da produže boravak IL-18BP ili virusnog IL-18BP u telesnim tečnostima. Ostali derivati uključuju alifatične estre karboksilnih grupa, amide karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili sa primarnim ili sekundarnim aminima, N-acil derivatima slobodnih of free amino grupa amino kiselinskih ostataka koji se formiraju sa acilnim delovima (na pr. alkanoil ili karbociklične aroil grupe) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer serilnih ili treonilnih ostataka) koji se formiraju sa acilnim delovima.

Po pojmom "aktivne frakcije" IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, muteina i fuziranih proteins, ovaj pronalazak pokriva sve fragmente ili prekursore polipeptidnog lanca samog proteinskog molekula ili u zajednici sa pratećim molekulima ili ostacima vezanim za njih, na pr., šećerni ili fosfatni ostaci, ili agregati proteinskog molekula ili šećerni ostaci po sebi, pod uslovom da pomenuta frakcija ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP.

Izraz "soli" se ovde odnosi i na soli karboksilnih grupa i na kiseli dodatak soli amino grupa IL-18 inhibitorskog molekula, ili njegove analoge. Soli karboksilne grupe mogu se formirati načinima poznatim u struci i uključuju neorganske soli, na primer, soli natrijuma, kalciuma, amonijuma, gvožđa ili cinkai soli sa organskim bazama kao one koje se formiraju, na primer, sa aminima, kao što su trietanolamin, arginin ili lizin, piperidin, prokain i slično. U soli sa dodatkom kiselina spadaju, na primer, soli sa mineralnim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična kiselina ili sumporna kiselina, i soli sa organskim kiselinama, kao što su, na primer, sirćetna kiselina ili oksalična kiselina. Naravno, svaka ot takvih soli mora da zadrži biološku aktivnost OPN relevantnu za ovaj pronalazak, t.j., da vrši proliferativno dejstvo na oligodendrocite.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 jeste jedno IL-18 antitelo. Anti-IL-18 antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska, himerska, humanizovana, ili čak potpuno humana. Rekombinantna antitela i njihovi fragmenti se odlikuju vezivanjem visokog afiniteta za IL-18 in vivo i niskom toksičnošću. Ova antitela koja se mogu koristiti za ovaj pronalazak odlikuju se svojom sposobnošću da mogu da tretiraju paciejnte tokom dovoljno dugog perioda da se postigne odlična regresija ili ublažavanje patogenog stanja ili svakog simptoma ili grupe simptoma koji se odnose na to patogeno stanje, i niskom toksičnošću.

Neutralizujuća antitela se brzo priizvode kod životinja kao što su zečevi, koze ili miševi imunizacijom pomoću IL-18. Imunizovani miševi su posebno pogodni za obezbeđivanje izvora B ćelijs za proizvodnju hibridoma, koji, za uzvrat, se razvijaju u kulturi da proizvedu velike količine anti-IL-18 monoklonskih antitela.

Himerska antitela su molekuli imunoglobulina koji se odlikuju sa dva ili više segmenata ili delova izvedenih iz različitih životinjeskih vrsta. Generalno, promenljivi region himerskog antitela izvodi se iz ne-humanog sisarskog antitela, kao što je mišje monoklonsko antitelo, a imunoglobulinski konstantni region se izvodi iz humanog imunoglobulinskog molekula. Po mogućstvu, oba regiona i njihova kombinacija imaju nisku imunogenost koja se rutinski određuje (Elliott et al., 1994). Humanizovana antitela su imunoglobulinski molekuli stvoreni tehnikama genetskog inženjeringa u kojima konstantni mišji regioni bivaju zamenjeni njihovim humanim odgovarajućim delovima dok zadržavaju regione vezivanja mišjeg antigena. Rezultujuće mišje-humano himersko antitelo po mogućstvu ima sniženu imunogenost i poboljšanu farmakokinetiku kod ljudi (Knight et at., 1993).

Prema tome, u još jednom preporučenom obliku, IL-18 antitelo je jedno humanizovano IL-18 antitelo. Preporučeni primeri humanizovanog anti-IL-18 antitela su opisani u Evropskoj patenttnoj prijavi EP 0 974 600, na primer.

U još jednom preporučenom obliku, IL-18 antitelo je potpuno humano. Tehnologija za proizvodnju humanih antitela je detaljno opisana u na pr. VVO00/76310, VVO99/53049, US 6,162,963 ili AU5336100. Potpuno humana antitela su, po mogućstvu rekombinantna antitela, proizvedena u transgenim životinjama, na pr. ksenomišu, koji obuhvata sve ili delove funkcionalnih humanih Ig lokusa.

U visoko preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je jedan IL-18BP, ili izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili njihov cirkularno permutatovani derivat. Ovi izoformi, muteini, fuzirani proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18, i po mogućstvu imaju esencijalno najmanje jednu aktivnost sličnu IL-18BP. Idealno, takvi proteini imaju biološku aktivnost koja je čak povećana u odnosu na nemodifikovani IL-18BP. Preporučene aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja od aktivnosti IL-18BP, ili koje imaju druge prednosti, kao što je bolja stabilnost ili niža toksičnost ili imunogenost, ili ih je lakše proizvesti u većim količinama, ili ih je lakše prečistiti.

Sekvence IL-18BP i i njene nastavljene varijante/izoformi mogu da se preuzmu iz WO 99/09063 ili iz Novick et al., 1999kao i iz Kim et al., 2000.

Funkcionalni derivati IL-18BP mogu da se konjuguju u polimere da bi se poboljšali proteini, kao što su stabilnost, poluživot, biološka raspoloživost, tolerancija u teiu čoveka ili imunogenost. Da se postigne ovaj cilj, funkcionalni derivati mogu da obuhvate najmanje jedan deo spojen za jednu ili više funkcionalnih grupa, koje nastaju kao jedna ili više bočnih lanaca na amino kiselinskim reziduumima. Ovakva funkcionalna grupa može na pr. da bude Polietilenglikol (PEG). PEGilacija može da se obavlja poznatim metodama, opisanim u WO 92/13095, na primer.

Prema tome, u preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitori IL-18, i pre svega IL-18BP su PEGilirani.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 jeste jedan fuzirani protein koji obuhvata sve ili jedan deo IL-18 vezujućeg proteina, koji je fuziran za sve ili za deo jednog imunoglobulina. Stručnjkak za ovu oblast će razumeti da rezultujući fuzioni protein zadržava biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18. Ova fuzija može biti direktna, ili preko kratkog vezujućeg peptida koji može da bude i veoma kratak, samo 1 do 3 amino kiselinskih ostataka dužine ili duži, na primer, 13 amino kiselinskih ostataka dužine. Pomenuti linker- veznik može da bude jedan tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili jedna 13-amino kiselinska linkerska, vezna sekvenca koja obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met uvedena između IL-18BP sekvence i imunoglobulinske sekvence. Rezultantni fuzioni protein ima poboljšana svojstva, kao što su produženo vreme boravka u telesnim tečnostima (polu-život), povećanu specifičnu aktivnost, povećani nivo ekspresije, ili je olakšano prečićavanje fuzionog proteina.

U preporučenom obliku, IL-18BP se fuzira za konstantni region Ig molekula. Po mogućstvu se fuzira za regione teških lanaca, kao što su CH2 i CH3 domeni humanog IgG 1, na primer. Generisanje specifičnih fuzionih proteina koji obuhvataju IL-18BP i deo jednog imunoglobulina opisani su u primeru 11 WO 99/09063, na primer. Ostali izoformi Ig molekula su takođe pogodni generisanje fuzionih proteina u skladu sa ovim pronalaskom, kao što su izoformi lgG2 ili lgG4, ili druge klase Ig, kao IgM ili Ig A, na primer. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

Interferoni su predominantno poznati po svom inhibitornom dejstvu na virusnu replikaciju i ćelijsku proliferaciju. lnterferon-y, na primer, igra važnu ulogu u promociji imunih i inflamatornih odgovora. Smatra se da Interferon p (IFN-p, interferon tipa I), igra anti-inflamatornu ulogu.

Ovaj pronalazak se, prema tome, odnosi i na korišćenje kombinacije jednog inhibitora IL-18 i interferona za proizvodnju medikamenta za lečenje povreda CNS-a.

Interferoni mogu i da se konjuguju sa polimerima da bi se poboljšala stabilnost proteina. Konjugat između Interferona p i poliol Polietilenglikola (PEG) opisan je, na primer u VV099/55377.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, ovaj interferon je lnterferon-p (IFN-P), i još bolje IFN-p 1a.

Ovaj inhibitor IL-18 produkcije i/ili delovanje po mogućstvu se koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od interferona.

Faktor tumorske nekroze (TNF) je opisan u literaturi kao faktor koji poseduje i zaštitno i toksično dejstvo na povredu mozga (Shohami et al., 1999). U Primeru 1 dole, injekcija TNF miševima po teškoj moždanoj traumi ima za posledicu signifikantni pad nivoa IL-18 u mozgu, što govori da TNF može da ima korisno dejstvo na oporavak po traumatskoj povredi mozga. Prema tome, u preporučenom obliku ovog pronalaska obuhvata se i korišćenje inhibitora IL-18 u kombinaciji sa TNF za pripremu medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda mozga, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

U skladu sa ovim pronalaskom prednost se daje kombinaciji IL-18 inhibitora sa TNF alfa.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, ovaj medikament dalje obnuhvata jedan anti-inflamatorni agens, kao što su NSAIL (nesteroidni anti-/'nflamatorni tekovi). U preporučenom obliku, jedan COX-inhibitor, i najbolje COX-2 inhibitor, koristi se u kombinaciji sa IL-18 inhibitorom. COX-inhibitori su poznati u struci. Specifični COX-2 inhibitori su opisani u WO 01/00229, na primer. Aktivne komponente mogu da se koriste istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.

Opisano je da oksidativni stres, pre svega reaktivne kiseoničke vrste (ROS), igraju ulogu u patofiziologiji oštećenja mozga (Shohami et al., 1997).

Prema tome, u preporučenom obliku ovog pronalaska, ovaj medikament dodatno obuhvata jedan antioksidant, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu. Mnogi antioksidanti su poznati u struci, kao što su vitamini A, C ili E, ili 5-aminosalicilna kiselina, ili superoksid dizmutaza.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaskak, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.001 do 100 mg/kg telesne težine, ili oko 0.01 to 10 mg/kg telesne težine ili oko 0.1 to 3 mg/kg telesne težine ili oko 1 to 2 mg/kg telesne težine.

U još jednom preporučenom obliku, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.1 do 1000 µg/kg telesne težine ili 1 do 100 µg/kg telesne težine ili oko 10 do 50 µg/kg telesne težine.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje jednog molekula nukleinske kiseline koja će da obuhvati sekvencu kodiranja za jedan IL-18 inhibitor, mutein, funkcionalni derivat, ili njihove aktivne frakcije, za pripremu medikamenta za prevenciju i/ili tretman povreda CNS-a.

Po mogućstvu, ovaj molekul nukleinske kiseline daje obuhvata jednu sekvencu vektora ekspresije, na pr. da koristi gensku terapiju za davanje IL-18 inhibitora iz ovog pronalaska.

Po mogućstvu, ovaj molekul nukleinske kiseline daje se intramuskularno.

Da bi se lečila i/ili prevenirala povreda CNS-a, vektor genske terapije koji obuhvata sekvencu inhibitora IL-18 produkcije i/ili delovanja može da se injicira direktno u obolelo tkivo, na primer, na taj način izbegavajući problemer uključene u sistemsko davanje vektora genske terapije i diluciju ovih vektora, sa dostizanjem i viljanjem ciljnih ćelija ili tkiva, kao i neželjenih dejstava.

Korišćenje vektora za indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji koja je normalno inertna na ekspresiju IL-18 inhibitora, ili koja eksprimira količine inhibitora koje nisu dovoljne, takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a. Ovaj vektor može da obuhvati regulatorne elemente funkcionalne u ćeliji za koju želimo da eksprimira inhibitor ili IL-18. Ovakve regulatorne sekvence ili elementi mogu biti promoteri ili enhanceri, na primer. Ova regulatorna sekvenca može onda da se uvede u pravi lokus genoma homolognom rekombinacijom, i na taj način operativno poveže regulatornu sekvencu sa genom, čiju ekspresiju je potrebno indukovati ili pojačati. Ova tehnologija se najčešće naziva “Endogenom Genskom Aktivacijom” (EGA), i opisana je u na pr. WO 91/09955.

Stručnjaku za ovu oblast će biti jasno da je moguće i da se direktno zatvori IL-18 ekspresija bez korišćenja inhibitora IL-18, istom tehnikom. Da bismo to uradili, negativni regulacioni element, kao na pr. element za utišavanje, može da se uvede u genski lokus IL-18, i da na taj način dovede do nishodne regulacije ili prevencije IL-18 ekspresije. Stručnjaku za ovu oblast će biti jasno da ovakvo nishodno regulisanje ili utišavanje IL-18 ekspresije ima isto dejstvo kao i korišćenje IL-18 inhibitora da bi se sprečila i/ili lečila bolest.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana da produkuje inhibitor IL-18 ua proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav, posebno koristan za prevenciju i/ili tretman zapaljenskih povreda CNS-a, koje obuhvataju terapijski efikasnu količinu inhibitora IL-18 i/ili terapijski efikasnu količinu interferona i/ili farmaceutski efikasnu količinu TNF i/ili farmaceutski efikasnu količinu anti-inflamatornog agensa i/ili farmaceutski efikasnu količinu anti-oksidativnog agensa.

Kao inhibitor IL-18, ovaj sastav može da obuhvati kaspaze-1 inhibitore, antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje od IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitore IL-18 signalnog puta, antagoniste IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, fuzirane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili njihove cirkularno permutovane derivate koji imaju istu aktivnost.

IL-18BP i njegovi izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularlno permutovani derivati kako su gore opisani, predstavljaju preporučene aktivne sastojke ovih farmaceutskih sastava.

Interferon uključen u taj farmaceutski sastav je, po mogućstvu, IFN-beta ili IFN-

alfa.

U još jednom preporučenom obliku, taj farmaceutski sastav obuhvata terapijski efikasne količine TNF alfa. Ovaj farmaceutski sastav u skladu sa pronalaskom, može dodatno da obuhvati i jedan ili više COX-inhibitora.

Definicija “farmaceutski prihvatljiv" treba da obuhvati svaki nosač, koji utiče na delotvornost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i koji nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu administraciju, ovi aktivni protein(i) mogu da se formulišu u jedinici doziranja za injekciju u nosaču kao što je fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Aktivni sastojci ovog farmaceutskog sastava u skladu sa ovim pronalaskom mogu se davati subjektima na različite načine. U načine davanja spadaju intradermalni, transdermalni (na pr. u formulacijama sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, supkutani, oralni, intrakranijalni, epiduralni, rektalni, topički, i intranazalni načini. Može se koristiti i svaki drugi terapijski delotvoran način davanja, na primer absorpcija kroz epitelijalno ili endotelijalno tkivo ili genskom terapijom naznačeno time da DNK molekul koji enkodira aktivni agens bude dat pacijentu (na pr. preko vektora), čime se dovodi do toga da aktivni agens bude eksprimiran i sekretovan in vivo. Uz to, protein(i) u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju zajedno sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, ekscipijenti, nosači, razblaživači i slično.

Za parenteralnu (na pr. intravensku, supkutanu, intramuskularnu) primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu u vidu rastvora, suspenzije, emulzije ili liofilizovanog praha u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem (na pr. voda, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i aditiva koji održavaju izotonicitet (na pr. manitol) ili hemijsku stabilnost (na pr. konzervansi i puferi). Ova formulacija se sterilizuje uobičajenim tehnikama.

Biološka raspoloživost aktivnih proteina u skladu sa ovim pronalaskom može da se poboljša korišćenjem procedura konjugacije koje povećavaju polu-život ovog molekula u telu čoveka, na primer povezivanje molekula za polietilenglikol, kako je opisano u patentnoj prijavi PCT WO 92/13095.

Terapijski efikasne količine aktivnih proteina biće u funkciji mnogih promenljivih, uključujući i tip antagonista, afinitet tog antagonista za IL-18, svaku rezidualnu citotoksičnu aktivnost koju ispoljavaju ti antagonisti, način davanja, kliničko stanje pacijenta (uključujući i poželjnost održavanja ne-toksičnih nivoa endogene IL-18 aktivnosti).

"Terapijski efikasna količina" je ona koja kada se da IL-18 inhibitor dolazi do inhibicije biološke aktivnosti IL-18. Primenjena doza u vidu pojedinačne ili multiplih doza, svakom pojedincu, zavisiće od čitavog niza faktora, uključujući farmakokinetička svojstva IL-18 inhibitora, način davanja, stanje pacijenta i njegove osobine (pol, godine starosti, telesnu težinu, zdravlje, veličinu), obim simptoma, prateću paralelnu terapiju, učestalost terapije i željeni efekat. Podešavanja i manipulacije utvrđenog raspona doziranja nalazi se sasvim u okviru sposobnosti stručnjaka za ovu oblast, kao i in vitro i in vivo metoda određivanja inhibicije IL-18 kod pojedinačnog pacijenta.

U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.0001 do 100 mg/kg ili oko 0.01 do 10 mg/kg ili telesne težine, ili oko O.d 5 mg/kg telesne težine ili oko 1 do 3 mg/kg telesne težine ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine. Alternativno, IL-18 inhibitori se mogu davati u količini od oko 0.1 do 1000 µg/kg telesne težine ili oko 1 do 100 µg/kg telesne težine ili oko 10 do 50 µg/kg telesne težine

Način davanja, koji se preporučuje u skladu sa ovim pronalaskom je davanje supkutanim putem. Intramuskularna administracija se takođe preporučuje u skladu sa ovim pronalaskom. Da bi se IL-18 inhibitor dao direktno na mesto delovanja, preporučuje se i da se daje intrakranijalnim ili intratekalnim putem. Intrakranijalni put se posebno preporučuje u kombinaciji sa otvorenim povredama glave (projektilske povrede mozga).

U dalje preporučenim oblicima, inhibitor IL-18 se daje svakodnevno ili svaki drugi

dan.

Dnevne doze se obično daju u podeljenim dozama ili u oblicima sa kontrolisanim oslobađanjem koje su u stanju da postignu željene rezulate. Druga ili naredna davanja mogu se nastaviti u istim dozama, manjim ili većim od inicijalne ili prethodne doze koja je data pojedincu. Druga ili naredna davanja mogu se nastaviti tokom ili pre početka bolesti.

U skladu sa ovim pronalaskom, IL-18 inhibitor može da se daje profilaktički ili terapijski pojedincima pre, istovremeno sa ili sekvencijalno sa drugim terapijskim režimima ili agensima (na pr. režim sa multiplom terapijom - odnosno sa više lekova), u terapijski efikasnim količinama, pre svega sa interferonom i/ili TNF i/ili drugim anti-inflamatornim agensom, kao što su COX inhibitor i/ili neki antioksidant. Zavisno od povreda mozga, paralelno davanje TNF-antagonista umesto samog TNF takođe dolazi u obzir (Shohami et al., 1999). Aktivni agensi koji se daju istovremeno sa drugim terapijskim agensima mogu da se daju u istom ili u različitim sastavima.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu za pripremu farmaceutskog sastava koji obuhvata mešavinu efikasne količine IL-18 inhibitora i/ili interferona i/ili TNF antagonista i/ili COX inhibitora sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja povreda CNS-a, obuhvata davanje farmaceutski efikasne količine IL-18 inhibitora pacijentu kome je to potrebno.

Sve ovde citirane reference, uključujući članke ili apstrakte iz časopisa, objavljene ili neobjavljene U.S. ili inostrane patentne prijave, izdate U.S. ili inostrane patente ili sve druge reference, potpuno su uključene samim pozivanjem na njih, uključujući sve podatke, tabele, slike i tekst prikazane u citiranim referencama. Uz to, celokupni sadržaj referenci u okviru citiranih referenci takođe je obuhvaćen pozivom na njih.

Pozivanje na poznate metode i njihove faze, korake poznatih metoda, poznate metode ili konvencionalne metode ni na koji načon ne predstavlja priznanje da je ma koji aspekt, opis ili oblik ovog pronalaska otkriven, predložen ili preporučen u relevantnoj tehnici.

Navedeni opisi specifičnih oblika će tako u potpunosti da otkriju opštu prirodu ovog pronalaska koji drugi mogu, primenjujući znanja u okvirima struke (uključujući sadržaj ovde citiranih referenci), lako da modifikuju i/ili prilagode za različite primene, kao što su specifični oblici, bez nepotrebnog eksperimentisanja, i ne udaljavajući se od opšteg koncepta ovog pronalaska. Prema tome, ovakve adaptacije i modifikacije su obuhvaćene smislom raspona ekvivalenata otkrivenih oblika, zasnovano na znanjima i smernicama koje su ovde iznete. Podrazumeva se da frazeologija ili terminologija koji su ovde korišćeni služi za svrhe opisa, a ne za ograničavanje, tako da ti izrazi ili fraze koji se koriste u ovoj specifikaciji treba da se tumače od strane stručnjaka za ovu oblast u svetlu znanja i smernica koji su ovde prikazani, u kombinaciji sa znanjem stručnjaka za ovu oblast.

Pošto smo sada opisali ovaj pronalazak, lakše će se razumeti pozivanjem na ove primere, koji služe samo za ilustraciju, i ni na koji način ne ograničavaju obim samog pronalaska.

PR1MERI

Materijali i metode

Model traume

Miševi koje smo koristili za ovaj eksperiment bili su muškog pola starosti 8-16 nedelja i težine 30-35 g. Gajeni su u specifičnom okruženju bez patogena, i čuvani u standardnim uslovima temperature i svetla u kavezima sa po 4-6 životinja, i dobijali su vodu i hranu ad libitum. Ispitivanje je obavljeno u skladu sa smernicama Komiteta za institucionalnu zaštitu životinja Hebrejskog univerziteta u Jerusalemu, Izrael. Eksperimentalna CHI načinjena je korišćenjem prethodno osmišljene naprave koja pada pod težinom (Chen et al. 1996). Ukratko, posle indukcije eterske anestezije, načinjen je longitudinalni rez po sredini, koža je retrahovana i otkrivena je lobanja. Leva prednja frontalna oblast je indetifikovana i postavljen je teflonski konus ~1mm lateralno od srednje linije, u srednjoj koronalnoj ravni. Glava je fiksirana i težina od 75 g bačena je u ovaj konus sa visine od 18 cm, što je dovelo do fokalne povrede leve hemisfere. Posle traume, miševi su dobijali potpornu oksigenaciju sa 100% 02 ne duže od 2 min, i onda su vraćeni u svoje kaveze.

Procena nivoa IL-18 u mozgovima miševa

Za kvantifikaciju intrakranijalnih nivoa IL-18, miševi soja C57BL/6 (B6) (ukupni broj n=62) raspoređeni su u šest odvojenih grupa: (1) "normalne kontrole”; ne tretirani miševi B6 (n=10). (2) "eterska anestezija"; miševi su anestezirani eterom tokom 10 minuta i dekapitirani posle 24h (n=10) ili 7 dana (n=10). (3) "lažna operacija”; ovi miševi su povrgnuti anesteziji i urađen im je longitudinalni rez na lobanji, pa su žrtvovani posle 24h (n=15) ili 7 dana. (4) "trauma grupa”; eksperimentalni CHI urađen je kako je gore opisano, i životinje su žrtvovane u eterskoj anesteziji posle 4h (n=7), 24h (n=7), i 7 dana (n=7) posle traume. (5) "TNF injekcija”; za procenu eventualne uloge TNF za regulisanje intracerebralnog IL-18, miševima je data eterska anestezija, i intra-cerebro-ventrikularno (i.c.v.) ubrizgano im je 200 ng mišjeg rekombinantnog TNF (R&D Systems, Abingdon, UK) u 10 pil sterilnog fosfatom-puferovanog fiziološkog rastvora (PBS) i žrtvovani posle 24h (n=10). (6) "Lažna injekcija”; ovim životinjama ubrizgan je i.c.v. samo placebo

(nosač) (10 |xl sterilnog PBS) i žrtvovane su posle 24h (n=6), kao kontrolna grupa životinjama kojima je ubrizgan TNF. Kod svih miševa, mozgovi su odmah uklonjeni posle dekapitacije, brzo zamirznuti u tečnom azotu i čuvani na -70°C do analize. Mozgovi iz trauma grupe odvojeni u u leve (ipsilateralne) i desne (kontralateralne) hemisfere, da bi se omogućilo poređenje nivoa IL-18 u povređenim u poređenju sa nepovređenim hemisferama. Homogenizacija tkiva obavljena je sa Politron (Kinematica, Kriens, Svvitzerland) korišćenjem razblaženja od 1:4 u ledeno hladnom ekstrakcionom puferu (W/W) sa sadržajem Tris 50 mM (pH 7.2), NaCI 150 mM, Triton-X-100 1% (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Svvitzerland), i koktelom inhibitora proteaze (Boehringer Mannheim). Ovaj homogenat je mućkan na ledu tokom 90 min i onda centrifugiran 15 min na 3,000 g i 4°C. Supernatanti su podeljeni u alikvote i čuvani na-70°C do analize. Koncentracije ukupnih proteina u ekstratkima mozgova merene su Bradford esejem (Bio Rad Laboratories, Munich, Germany) pa je utvrđeno da su veoma ujednačene i konstantne u svim ispitivanim miševima (12.1 ± 2.1 mg/ml; srednja vrednost ± SD). Kvantifikacije intracerebralnih nivoa citokina obavljna je ELISA testom specifično za mišji IL-18, u skladu sa uputstvima proizvođača (R&D Systems, Abingdon, UK). Osetljivost ovog testa bila je 5 pg/ml. Za poređenje intracerebralnih nivoa IL-18 između različitih životinjskih grupa, svim koncentracijama ispod nivoa detekcije od 5 pg/ml dodeljena je vrednost od 4.9 pg/ml. Uzroci su ispitivani nerazblaženi u duplikatnim udubljenjima, pa je finalna koncentracija izračunavana iz srednje vrednosti OD duplikatnih uzoraka. OD je određivan spektrofotometrom (Dynatech Laboratories Ine., Chantilly, VA) na talasnoj dužini ekstinkcije od 405 nm.

Protokol za IL-18BP tretman

Mužjaci Sabra miševa soja sa Hebrejskog univerziteta (n=40) korišćeni su za ova ispitivanja IL-18BP. Anestezija i eksperimentalni CHI obavljeni su kako je gore opisano. Po protokolu za tretman, životinje su podeljene u dve grupe: u grupi A ("kontrolna grupa”, n=16), miševi su podvrgnuti eksperimentalnoj CHI, ubrizgan im je samo nosač (placebo) (PBS) posle jedan sat, i posmatrani su tokom 7 dana u cilju neurološke procene (vidi dole). U grupi B ("ispitivana grupa”, n=18), miševima je ubrizgano i.p. 50 jug IL-18BP neposredno po određivanju neurološkog skora 1 sat (t=1h) posle CHI. Budući da je permeabilnost krvno moždane barijere povećana 5-6 puta u vremenu 1-4h posle CHI, kako je prethodno utvrđeno u istom eksperimentalnom modelu (Chen et al. 1996), IL-18BP je u ovim uslovima dostupan u mozgu. Dve dodatne grupe miševa tretirane su u skladu sa grupama A i B (grupa C: "kontrolna grupa”; grupa D: "ispitivana grupa”) i dekapitirane posle 48h, posle čega je urađena disekcija mozga u cilju procene posttraumatskog edema, kako je dole opisano.

Procena neurološkog oštećenja

U cilju procene posttraumatskog neurološkog oštećenja, prethodno je razvijen i procenjen skor neurološkog oštećenja (Neurological Severity Score - NSS) (Stahel et al., 2000).

Ovaj skor se sastoji od 10 pojedinačnih kliničkih zadataka vezanih za motornu funkciju, budnost i fiziološko ponašanje, gde se jedan poen daje za neuspeh da se zadatak obavi, a nula ako se zadatak uspešno obavi (Tabela 4). Maksimalni skor NSS od 10 poena označava tešku neurološku disfunkciju, gde nijedan zadatak nije uspešno obavljen, dok su skor nula imali zdravi, nepovređeni miševi. NSS 1 sat posle traume oslikava inicijalnu težinu povrede i visoko je korelisan sa kliničkim ishodom (Beni-Adani et al. 2001). Procenu izvršenja zadataka obavljala su dva istraživača koja nisu znala koje su ispitivane grupe, i to je izraženo u sledećim vremenskim tačkama: 1 h, 24h, 72h, i 7 dana posle eksperimentalne CHI. Vrednost ΔNSS, izračunata kao razlika između NSS u tačci t=1h i NSS u bilo kojoj tačci posle toga, predstavlja parameter koji oslikava stepen spontanog oporavka posle povrede mozga, kako je već opisano ranije (Chen et al. 1996).

Tabela 4: Skor težine neurološkog oštećenja (NSS) za miševe sa povredom glave.

Procena edema mozga

Obim cerebralnog edema procenjivan je određivanjem sadržaja vode u moždanom tkivu u povređenoj hemisferi, kako je već opisano (Chen et al. 1996). Ukratko, miševi su anestezirani kako je gore opisano 48h posle traume, što odgovara vremenskoj tačci u kojoj je edem još uvek signifikantan u sistemu ovog modela (Chen et al. 1996). Posle dekapitacije, cerebelum i moždano stablo su uklonjeni, a pripremljeni su preparati sa kortikalnog segmenta od oko ~20mg, i iz oblasti u blizini mesta traume kao i sa kontralateralne hemisfere. Desna (nepovređena) hemisfere korišćena je kao interna kontrola. Odsečci tkiva su mereni i sušeni 24h na 95°C. Posle merenja "sušenih” odsečaka, procenat sadržaja vode u mozgu izračunavan je na sledeći način:

%H20 = [(mokra težina - suva težina) x 100] / mokra težina.

Pacijenti sa povredom mozga

Deset pacijenata sa izolovanom tačkom CHI (srednja starost ± SD: 37 ± 10 godina; raspon 24-57 godina; 9 muškaraca i jedna žena), koji su primljeni u Trauma centar Univerzitetske bolnice u Cirihu uključeni su u ovo ispitivanje. Svi pacijenti su imali Glazgov koma skor (GCS) score < 8 posle kardiopulmonarne reanimacije (Teasdale i Jennett, 1974). Pošto ime je uražen CT, svi pacijenti su dobili intraventrikularni kateter za terapijsku drenažu likvora (CSF) kad god je intrakranijalni pritisak (ICP) prelazio vrednost od 15 mmHg. Nijedan bolesnik nije primao steroide. Pacijenti sa multiplim povredama koji su iziskivali terapiju zbog paralelnih torakalnih, abdominalnih, pelvičnih, spinalnih povreda ili preloma dugih kostiju nisu bili uključeni u ovo ispitivanje. Individualni ishod procenjivan je korišćenjem Glazgov koma skora (GOS) (Jennett i Bond, 1975). Protokol za CSF i uzorke seruma odobrio je Komitet za etička pitanja Univerzitetske bolnice u Cirihu.

Uzimanje uzoraka i analiza IL-18

Likvor (CSF) i usklađevvni uzorci seruma pacijenata sa CHI (n=10) prikupljani su svakodnevno u tačno utvrđeno vreme. Kontrolni CSF dobijani su od pacijenta kojima je rađena dijagnostička punkcija sa uzimanjem uzorka likvora (n=5). Ovi pacijenti nisu imali znakova inflamatorne bolesti CNS, na osnovu normalnih vrednosti proteina, glukoze, i broja ćelija u CSF (podaci nisu prikazani). U grupi sa CHI, uzimanje uzoraka obavljano je 10 dana posle traume, osim ako ventrikularni kateter nije uklanjan ranije, na pr. u slučajevima u kojima je ICP ostajao u normalnom rasponu (< 15 mmHg) duže od 24 sata. Ukupno 106 usklađenih uzoraka CSF i seruma prikupljeno je kod traumatizovanih pacijenata i analizirano u ovom ispitivanju. Svi uzorci su centrifugirani odmah po uzorkovanju, podeljeni u alikvote i zamrznuti na -70°C do analize. Kvantifikacija nivoa IL-18 u CSF i serumu rađena je ELISA testom specifično za humani IL-18 korišćenjem komercijalno dostupnih kompleta za određivanje (R&D Systems, Abingdon, UK). Kao i za test sa miševima, osetljivost ELISA testa iznosila je 5 pg/ml, i finalne IL-18 koncentracije izračunavane su iz srednje vrednosti OD određene u duplikatnim uzorcima na talasnoj dužini ekstinkcije od 405 nm. Za poređene nivoa IL-18 u CSF ozmeđu pacijenata sa CHI i kontrola, svim koncentracijama ispod nivoa detekcije od 5 pg/ml pripisana je vrednost od 4.9 pg/ml.

Analiza podataka

Statistička analiza podataka obavljena je komercijalno dostupnim programskim paketom (SPSS 9.0 for VVindovvs™). Neparametrijski Mann-Whitney-U test korišćen je za analizu podataka koji nisu normalno distribuirani, kao što su neurološki skorovi (NSS i ΔNSS). Nespareni Student t-test korišćen je za poređenje intracerebralnih koncentracija IL-18 u različitim grupama miševa i za analizu razlika sadržaja vode u mozgumiševa tretiranih sa IL-18BP u poređenju sa onima koji su dobijali placebo (nosač). Poređenje nivoa IL-18 kod ljudi, bilo u uzorcima likvora (CSF) uzimanim svakodnevno u poređenju sa kontrolnim uzorcima CSF ili u traumatizovanim u poređenju sa kontrolnim CSF određivani su korišćenjem generalnog linearnog modela za ponovljena merenja ANOVA. Vrednost p od < 0.05 smatrala se statistički značajnom.

Rezultati

PRIMER 1: intracerebralni nivoi IL-18 kod miševa

Kao što je pokazano na Slici 1, IL-18 je bio merljiv korišćenjem ELISA u homogenatima mozga netretiranih ("normalnih”) kontrolnih miševa soja B6 (n=10), sa srednjim nivoom od 27.7 ± 1.7 [± SEMI ng/ml. U eksperimentalnim grupama, indukcija eterske anestezije sama ili u kombinaciji sa "lažnom" operacijom (t.j. eterska anestezija i longitudinalni rez na skalpu) doveli su do signifikantno povišenog intrakranijalnog nivoa IL-18 od 48.9 ± 1.1 ng/ml ("eterska” grupa, n=8) i 54.3 ± 2.7 ng/ml ("lažna” grupa, n=13), (p<0.01 vs. "normalni” miševi, nespareni Student t-test; Slika 1). Razlika između životinja koje su označene kao "eterska” i "lažna" grupa nije bila statistički značajna

(p=0.16).

U trauma grupi (n=21), indukcija CHI dovela je do povišenih nivoa IL-18 i u povređenim i u kontralateralnim hemisferama u roku od 4h (60.6 ± 3.3 i 59.8 ± 5.0 ng/ml, istim redosledom) do 24h (56.9 ± 2.1 i 56.3 ± 3.7 ng/ml, istim redosledom) posle traume, međutim, nivoi nisu bili signifikantno veći u poređenju sa”eterskim” ili "lažnim” grupama (p>0.05).

Za razliku od ovoga, do 7 dana posle CHI, značajan porast intracerebralnih nivoa IL-18 otkriven je u povređenoj hemisferi, u poređenju sa etrom anesteziranim ili lažno operisanim životinjama (67.6 ± 5.1 ng/ml vs. 42.2 ± 0.8 i 45.2 ± 0.5 ng/ml, istim redosledom; p<0.01), gde nivoi IL-18 u kontralateralnoj hemisferi nisu bili signifikantno povišeni u odnosu na dve kontrolne grupe (63.2 ± 6.0 ng/ml; p=0.06).

Da bi se procenila uloga TNF, ključni medijator inflamacije u ovom modelu traume (Shohami et al. 1999), kada se radi o regulisanju intracerebralnih nivoa IL-18, na dodatnoj grupi miševa B6 (n=10) ubrizgano je i.c.v. 200 ng mišjeg rekombinantnog TNF u 10 |il sterilnog PBS i žrtvovani su posle 24h. kao Što je pokazano na Slici 1, "lažna” injekcija samo sa placebom (nosačem) (n=6) dovela je do signifikantne ushodne regulacije intracerebralnog IL-18 u roku od 24h, u poređenju sa netretiranim normalnim B6 miševima (53.6 ± 3.9 vs. 27.7 ± 1.7 ng/ml; p<0.001).

Injekcija TNF dovela je do značajnog smanjenja nivoa IL-18 u intrakranijalnom odeljku u roku od 24h (22.1 ± 6.9 ng/ml; n=10), u poređenju sa kontrolnom grupom koja je dobila "lažnu" injekciju u roku od 24h (53.6 ± 3.9 ng/ml; p<0.001). Nivoi IL-18 u “TNF grupi" bili su još niži nego kod netretiranih normalnih miševa (27.7 ± 1.7 ng/ml), iako u ovom slučaju razlika nije bila statistički signifikantna (p=0.45).

PR1MER 2: Deistvo tretmana IL-18BP na neurološki oporavak posle traume

Da bi se ispitala hipoteza da inhibicija IL-18 može da olakša oporavak posle povrede mozga, poređen je oporavak u različitim vremenskim taškama posle pojedinačne injekcije IL-18BP. Već je ranije pokazano da skor težine neurološke povrede (Neurological Severity Score - NSS) 1h posle traume najtačnije oslikava težinu traume i i nalazi se u korelaciji za zapreminom povređenog tkiva koje se vidi na MRI snimku i histološki.

Da bi se dobile grupe životinja sa uporedivom traumom, miševi su podeljene u različite terapijske grupe pošto im je inicijalni NSS skor procenjen u tačci f=1h. Kao što je pokazano na Slici 2 (NSS u IL-18BP (kvadrati) vs. kontrola (kružići) u obe grupe imali su slični inicijalni NSS(1h) (7.69 . ± 0.3023 i 7.44 ± 0.3627 kontrola i IL-18BP istim redosledom) što govori o uporedivoj težini povrede.

Procena NSS u kasnijim vremenskim taškama (1-7 dana) otkrila je da životinje koje su tretirane intraperitonealno (i.p.) sa IL-18BP pokazuju značajno manje neurološko oštećenje, što je pokazano vrednostima NSS, koje dostižu nivo značajnosti 7 dana posle traume (p=0.045).

Izračunata je brzina oporavka, izražena kao ΔNSS (t) = NSS (1 h) - NSS (t). Veća vrednost ΔNSS oslikava bolji oporavak dok nulta ili negativna vrednost ΔNSS ukazuju na odsustvo oporavka ili pogoršanje. Na Slici 3 prikazane su vrednosti ΔNSS za dve grupe. U dve vremenske tačke, i posle 24h i posle 7d razlika između prosečnih vrednosti ΔNSS dostiže nivo statističke značajnosti.

Obavljen je još jedan eksperiment da se pokaže da li tretman sa IL-18BP, kada se da 3 dana po povređivanju može da bude delotvoran. Pitanje vremena u kome se daje terapija je kritično, i do sada je pokazano da terapija biva efikasna samo kada se daje u roku od nekoliko sati po povređivanju. Budući da je utvrđeno da same vrednosti IL-18 rastu 7d posle traume, i tretman sa IL-18BP kada se da 1h posle traume doveo je do najboljeg efekta posle 7 dana, pa je odlučeno da se miševi tretiraju i 3 dana posle povređivanja. U cilju poređenja, druga grupa dobila je IL-18BP 1 h i 3d posle povređivanja . Kontrolna grupa tretirana je samo placebom (nosač).

Rezultati ovog eksperimenta prikazani su na Slici 4, iz koje je jasno je da pojedinačni tretman trećeg dana efikasan kao i tretman koji se daje jedan sat posle CHI i opet trećeg dana.

Ovaj eksperiment pokazuje dramatično korisno dejstvo jednokratne primene IL-18BP, bilo 1 h ili 3 dana posle zatvorene povrede glave, na oporavak posle traumatske povrede glave u eksperimentalnom mišjem modelu.

PRIMER 3: Povišeni nivoi IL-18 u likvoru (CSF) čoveka posle povrede mozga Nivoi IL-18 procenjivani su u uzorcima CSF i seruma 10 pacijenata sa teškom CHI do 10 dana posle traume. Demografski i klinički podaci ovih pacijenata prikazani su na Tabeli 5.

Tabela 5: Demografski i klinički podaci pacijenata sa teškom CHIa

Kao što je prikazano na Tabeli 5, intratekalni nivoi IL-18 bili su signifikantno povišeni u 9/10 CHI pacijenata, u poređenju sa kontrolnim CSF od 5 pacijenata bez traume ili inflamatorne neurološke bolesti (p<0.05; ponovljena merenja ANOVA). Samo jedan pacijent (#10) imao je nivoe IL-18 u CSF, koji nisu bili signifikantno povišeni u poređenju sa kontrolnim CSF (p=0.31). Srednji nivoi i individualni rasponi IL-18 u CSF i serumu prikazani su na Tabeli 5.

Primetno je bilo da su maksimalne koncentracije IL-18 u CSF (966 ng/ml) bile i do 200-puta veće od pacijenata s povredom glave nego kod kontrole. Intracerebralne vrednosti IL-18 bile su merljive uz pomoć ELISA u 90% svih uzoraka CSF grupi sa traumom, dok je samo 40% kontrolnih CSF uzoraka imalo merljive intracerebralne nivoe IL-18 (t.j. > 4.9 ng/ml). Kod 8/10 CHI pacijenata, srednje koncentracije IL-18 bile su signifikantno više u CSF nego u serumu (p<0.05; ponovljena merenja ANOVA). Međutim, kod dva pacijenta (#9,10) srednji nivoi IL-18 u serumu bili su veći od odgovarajućih koncentracija u CSF, kao što je pokazano na Tabeli 5.

Ovi rezultati pokazuju da postoje značajno povišeni nivoi IL-18 u cerebrospinalnoj tečnosti (likvoru) pacijenata sa traumatskom povredom glave. Dodatak IL-18BP može da smanji ove povišene nivoe, i na taj način može da vrši povoljno dejstvo na oporavak od zatvorene povrede glave, kao što je prikazano u Primeru 2 gore.

REFERENCE

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997

2. Chater, K. F. et al., in "Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology", Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54).

3. Chen, Y., S. Constantini, V. Trembovler, M. VVeinstock, and E. Shohami. 1996. An experimental model of closed head injury In miče: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. J. Neurotrauma 13:557-68

4. Conti, C.B., N.Y. Calingasan, Y. Kim, H. kim, Y. Bae, E. Gibson, and T.H. Joh. 1999. Cultures of astrocytes and microglia express interleukin-18. Mol. Brain Res. 67:46-52

5. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma induoing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272:2035-2037.

6. Culhane, A.C, M.D. Hali, N.J. Rothvvell, and G.N. Luheshi. 1998. Cloning of rat brain interleukin-18 cDNA. Mol. Psychiatry 3:362-6

a. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

7. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Nature 388, 16514-16517.

8. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

9. Fassbender, K., O. Mielke, T. Bertsch, F. Muehlhauser, M. Hennerici, M. Kurimoto, and S. Rossol. 1999. lnterferon-Y-inducing factor (IL-18) and interferon-y in inflammatory CNS diseases. Neurology 53:1104-6

10. Jander, S., and G. Stoll. 1998. Differential induction of interleukin-12, interleukin-18, and interleukin-1 (3 coverting enzyme mRNA in experimental autoimmune encephalomyelitis of the Lewis rat. J. Neuroimmunol. 91:93-9

11. Lancet 1975 Mar 1 ;1 (7905):480-4. Jennett B, Bond M.

12. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742).

13. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinareilo CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:1190-1195.

14. Kossmann, T., P.F. Stahel, P.M. Lenzlinger, H. Redi, R.W. Dubs, O. Trentz, G. Schlag, and M.C. Morganti-Kossmann. 1997. lnterleukin-8 released into the cerebrospinal fluid after brain injury is associated with blood brain-barrier dysfunction and nerve growth factor production. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17:280-9

15. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53

16. Maliszevvski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dovver, J. Slack, M. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol. 144:3028-3033.

17. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism vvith interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-lmmunol 26:1647-51 issn: 0014-2980.

18. Morganti-Kossmann, M.C., P.M. Lenzlinger, V. Plans, P. Stahel, E. Csuka, E. Ammann, R. Stocker, O. Trentz, and T. Kossmann. 1997. Production of cytokines follovving brain injury: beneficial and deleterious for the damaged tissue. Mol. Psychiatry 2:133-6

19. Nakamura K, Okamura H, Wada M, Nagata K, Tamura T. Infect Immun 1989 Feb;57(2):590-5

20. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

21. Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tanimoto T, Nukata Y, Tanabe F, Akita K, Torigoe K, Okura T, Fukuda S, et al. Infect Immun 1995 Oct;63(10):3966-72

22. Pamet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dovver, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271,3967-3970.

a. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990

b. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 24442448,1988

23. Prinz, M., and U.K. Planisch. 1999. Murine microglial cells produce and respond to interleukin-18. J. Neurochem. 72:2215-8

24. J Clin Invest 1997 Feb 1 ;99(3):469-74 Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, Kolb H.

25. Scherbel, U., R. Raghupathi, M. Nakamura, K.E. Saatman, J.Q. Trojanovvski, E. Neugebauer, M.W. Marino, and T.K. Mclntosh. 1999. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient miče to experimental brain injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8721-6

26. Shohami, E., I. Ginis, and J.M. Hallenbeck. 1999. Dual role of tumor necrosis factor alpha in brain injury. Cytokine Grovvth Factor Rev. 10:119-30

27. Shohami, E; Beit-Yannai E., Horowitz M; Kohen R (1997): J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 1007-1019.

28. Teasdale G, Jennett B. Lancet 1974 Jul 13;2(7872):81-4

29. Stahel PF, Shohami E, Younis FM, Kariya K, Otto VI, Lenzlinger PM, Grosjean MB, Eugster HP, Trentz O, Kossmann T, Morganti-Kossmann MC.J Cereb Blood Flow Metab 2000 Feb;20(2):369-80

30. Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K, Micallef M, Fujii M, Torigoe K, Tanimoto T, Fukuda S, Ikeda M, Okamura H, Kurimoto M. J Immunol 1996 Jun 1 ;156(11):4274-9

31. VVheeler, R.D., A.C. Culhane, M.D. Hali, S. Pickering-Brovvn, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi. 2000. Detection of the interleukin-18 family in rat brain by RT-PCR. Mol. Brain Res. 77:290-3

32. VVhalen, M.J., T.M. Carlos, P.M. Kochanek, S.R. Wisniewski, M.J. Bell, R.S. Clark, S.T. DeKosky, D.W. Marion, and P.D. Adelson. 2000. lnterleukin-8 is increased in cerebrospinal fluid of children with severe head injury. Crit. Care Med. 28:929-34

33. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashivvamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161, 3400-3407.

PATENTNI ZAHTEVI

1. Korišćenje IL-18 inhibitora za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda centralnog nervnog sistema (CNS).

2. Korišćenje IL-18 inhibitora za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju komplikacija i poznih dejstava povreda CNS-a.

3. Upotreba u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time da je povreda CNS-a traumatska povreda mozga.

4. Upotreba u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da je ta povreda CNS-a zatvorena povreda glave.

5. Upotreba u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time da je ta povreda CNS-a povreda kičmene moždine.

6. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da je ta povreda CNS-a vaskularnog porekla.

7. Upotreba u skladu zahtevima od 1 do 6, naznačeno time da je inhibitor IL-18 odabran iz inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje od IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 signalnog puta, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, fuzirane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili cirkularno permutovane derivate, ili njihove soli.

8. Upotreba u skladu sa zahtevom 7, naznačeno time da je inhibitor IL-18 jedno IL-18 antitelo.

9. Upotreba u skladu sa zahtevom 8, naznačeno time da je to IL-18 antitelo jedno humanizovano IL-18 antitelo.

10. Upotreba u skladu sa zahtevom 8 ili 9, naznačeno time da je to IL-18 antitelo jedno humano IL-18 antitelo.

11. Upotreba u skladu sa zahtevom 7, naznačeno time da je taj inhibitor of IL-18 jedan IL-18 vezujući protein, ili so, izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutatovani derivat istih.

12. Upotreba u skladu zahtevima od 7 do 11, naznačeno time da je inhibitor IL-18 glikoziliran ne jednom ili na više mesta.

13. Upotreba u skladu zahtevima od 7 do 12, naznačeno time da taj fuzirani protein obuhvata jednu imunoglobulinsku (Ig) fuziju.

14. Upotreba u skladu zahtevima od 7 do 13, naznačeno time da taj funkcionalni derivat obuhvata najmanje jedan deo pripojen zajednu ili više funkcionalnih grupa, koje nastaju kao jedan ili više bočnih lanaca na amino kiselinskim reziduumima.

15. Upotreba u skladu sa zahtevom 14, naznačeno time daje taj deo polietilene glikolni (PEG) deo.

16. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da taj

medikament dalje obuhvata interferon, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

17. Upotreba u skladu sa zahtevom 15, naznačeno time da je taj interferon jedan interferon-a ili interferon-p.

18. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da taj

medikament dalje obuhvata faktor tumorske nekroze (Tumor Necrosis Faktor -TNF), za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

19. Upotreba u skladu sa zahtevom 18, naznačeno time da je taj TNF jedan TNF alpha.

20. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da tak medikament dalje obuhvata i jedan anti-inflamatorni agens, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

21. Upotreba u skladu sa zahtevom 20, naznačeno time da je taj anti-inflamatorni agens jedan COX-inhibitor, a posebno jedan COX-2 inhibitor.

22. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da taj medikament dalje ubuhvata jedan antioksidant, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

23. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj inhibitor IL-18 koristi u količini od oko 0.001 to 100 mg/kg telesne težine, ili oko 0.01 to 10 mg/kg telesne težine ili oko 0.1 to 5 mg/kg telesne težine ili oko 1 to 3 mg/kg telesne težine.

24. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj IL-18 inhibitor primenjuje supkutano.

25. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj IL-18 inhibitor primenjuje svakodnevno.

26. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj IL-18 inhibitor primenjuje svaki drugi dan.

27. Korišćenje jednog molekula nukleinske kiseline koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS.

28. Upotreba u skladu sa zahtevom 27, naznačeno time da taj molekul nukleinske kiseline dalje obuhvata sekvencu vektora ekspresija.

29. Upotreba u skladu sa zahtevom 27 ili 28, naznačeno time da se taj molekul nukleinske kiseline daje intramuskularno.

30. Korišćenje jednog vektora za indukciju i/ili pojačavanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a.

31. Korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana da proizvede jedan inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a.

32. Metoda za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a koja obuhvata davanje delotvorne inhibirajuće količine IL-18 inhibitora licima kojima je to potrebno.

Claims (32)

1.    Korišćenje IL-18 inhibitora za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda centralnog nervnog sistema (CNS).

2.    Korišćenje IL-18 inhibitora za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju komplikacija i poznih dejstava povreda CNS-a.

3.    Upotreba u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time da je povreda CNS-a traumatska povreda mozga.

4.    Upotreba u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da je ta povreda CNS-a zatvorena povreda glave.

5.    Upotreba u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time da je ta povreda CNS-a povreda kičmene moždine.

6.    Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da je ta povreda CNS-a vaskularnog porekla.

7.    Upotreba u skladu zahtevima od 1 do 6, naznačeno time da je inhibitor IL-18 odabran iz inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje od IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 signalnog puta, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, fuzirane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili cirkularno permutovane derivate, ili njihove soli.

8.    Upotreba u skladu sa zahtevom 7, naznačeno time da je inhibitor IL-18 jedno IL-18 antitelo.

9.    Upotreba u skladu sa zahtevom 8, naznačeno time da je to IL-18 antitelo jedno humanizovano IL-18 antitelo.

10.    Upotreba u skladu sa zahtevom 8 ili 9, naznačeno time da je to IL-18 antitelo jedno humano IL-18 antitelo.

11.    Upotreba u skladu sa zahtevom 7, naznačeno time da je taj inhibitor of IL-18 jedan IL-18 vezujući protein, ili so, izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutatovani derivat istih.

12.    Upotreba u skladu zahtevima od 7 do 11, naznačeno time da je inhibitor IL-18 glikoziliran ne jednom ili na više mesta.

13.    Upotreba u skladu zahtevima od 7 do 12, naznačeno time da taj fuzirani protein obuhvata jednu imunoglobulinsku (Ig) fuziju.

14.    Upotreba u skladu zahtevima od 7 do 13, naznačeno time da taj funkcionalni derivat obuhvata najmanje jedan deo pripojen zajednu ili više funkcionalnih grupa, koje nastaju kao jedan ili više bočnih lanaca na amino kiselinskim reziduumima.

15.    Upotreba u skladu sa zahtevom 14, naznačeno time daje taj deo polietilene glikolni (PEG) deo.

16.    Upotreba    u    skladu    sa svim prethodnim    zahtevima, naznačeno time    da taj medikament dalje obuhvata interferon, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

17.    Upotreba u skladu sa zahtevom 15, naznačeno time da je taj interferon jedan interferon-a ili interferon-p.

18.    Upotreba    u    skladu    sa svim prethodnim    zahtevima, naznačeno time    da taj medikament dalje obuhvata faktor tumorske nekroze (Tumor Necrosis Faktor -TNF), za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

19. Upotreba u skladu sa zahtevom 18, naznačeno time da je taj TNF jedan TNF alpha.

20. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da tak medikament dalje obuhvata i jedan anti-inflamatorni agens, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

21.    Upotreba u skladu sa zahtevom 20, naznačeno time da je taj anti-inflamatorni agens jedan COX-inhibitor, a posebno jedan COX-2 inhibitor.

22. Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da taj medikament dalje ubuhvata jedan antioksidant, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

23.    Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj inhibitor IL-18 koristi u količini od oko 0.001 to 100 mg/kg telesne težine, ili oko 0.01 to 10 mg/kg telesne težine ili oko 0.1 to 5 mg/kg telesne težine ili oko 1 to 3 mg/kg telesne težine.

24.    Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj IL-18 inhibitor primenjuje supkutano.

25.    Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj IL-18 inhibitor primenjuje svakodnevno.

26.    Upotreba u skladu sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se taj IL-18 inhibitor primenjuje svaki drugi dan.

27.    Korišćenje jednog molekula nukleinske kiseline koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS.

28.    Upotreba u skladu sa zahtevom 27, naznačeno time da taj molekul nukleinske kiseline dalje obuhvata sekvencu vektora ekspresija.

29.    Upotreba u skladu sa zahtevom 27 ili 28, naznačeno time da se taj molekul nukleinske kiseline daje intramuskularno.

30.    Korišćenje jednog vektora za indukciju i/ili pojačavanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a.

31.    Korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana da proizvede jedan inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a.

32.    Metoda za lečenje i/ili prevenciju povreda CNS-a koja obuhvata davanje delotvorne inhibirajuće količine IL-18 inhibitora licima kojima je to potrebno.