MD4685C1

MD4685C1 - Metodă de tratament al stărilor asociate cu activarea complementului dependentă de MASP-2

Info

Publication number: MD4685C1
Application number: MDA20180042A
Authority: MD
Inventors: Грегори А. ДЕМОПУЛОС; Томас Дадлер; Ганс-Вильгельм ШВАБЛЕ
Original assignee: Omeros Corporation; University Of Leicester
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2020-12-31
Also published as: MD4685B1; US20210047433A1; GEP20247583B; NZ742987A; AU2016354117A1; IL295200B1; SG10202011469UA; CN108472347B; CN117398458A; CN108472347A; KR20210090283A; JP6814802B2; CA3004753A1; MX2018005165A; PH12018501009A1; EP3373963A4; UA124094C2; IL259225B; IL295200B2; US20170137537A1

Abstract

Invenţia se referă la metode de inhibare a efectelor activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect uman, care suferă de microangiopatie trombotică (TMA) asociată cu transplantul de celule stem hematopoietice. Metodele includ etapa de administrare la subiectul, care are nevoie de aceasta, a unei cantităţi de agent inhibitor al MASP-2, care inhibă eficient activarea complementului dependentă de MASP-2.Revendicări: 10Figuri: 60Secvenţe: 71

Description

Sistemul complementului oferă în stadiul precoce un mecanism de iniţiere, amplificare şi dirijare al răspunsului imun la o infecţie microbiană şi alte leziuni acute (M.K. Liszewski and J.P. Atkinson. Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E. Paul, Raven Press, Ltd., 1993New York) la oameni şi la alte vertebrate. În timp ce activarea complementului oferă o primă apărare de primă linie împotriva agenţilor patogeni potenţiali, activităţile complementului, care promovează un răspuns imun protector, pot, de asemenea, să reprezinte o ameninţare potenţială pentru organismul-gazdă (K.R. Kalli et al., Springer Semin. Immunopathol. no 15, 1994, p. 417-431; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. no 24, 1994, p. 219-228). De exemplu, produsele proteolizei C3 şi C5 recrutează şi activează neutrofilele. Deşi sunt indispensabile pentru apărarea organismului-gazdă, neutrofilele activate sunt nediscriminatorii în eliberarea de enzime distrugătoare şi pot provoca leziuni ale organelor. În plus, activarea complementului poate determina depunerea componentelor litice ale complementului pe celulele organismului-gazdă din apropiere, precum şi pe ţintele microbiene, rezultând cu liza celulei gazdă.

Sistemul complementului a fost, de asemenea, implicat în patogeneza numeroaselor stări de boală acută şi cronică, incluzând: infarct miocardic, accident vascular cerebral, sindromul de insuficienţă acută respiratoare (ARDS), leziuni de reperfuzie, şoc septic, permeabilitatea crescută a capilarelor după arsuri termice, inflamaţie bypass postcardiopulmonară, respingerea transplantului, poliartrită reumatoidă, scleroza difuză, miastenia gravis şi boala Alzheimer. În aproape toate aceste stări, complementul nu este cauza apariţiei lor, ci este unul din multitudinea de factori implicaţi în patogeneză. Cu toate acestea, activarea complementului poate fi un mecanism patologic major şi reprezintă un punct eficient pentru controlul clinic în multe dintre aceste stări de boală. Recunoaşterea în ascensiune a importanţei leziunii tisulare mediate de complement într-o varietate de stări de boală subliniază necesitatea unor medicamente inhibitoare eficiente ale complementului. Până în prezent, Eculizumab (Solaris®), un anticorp împotriva C5, este singurul medicament care este direcţionat asupra complementului şi care a fost aprobat pentru uz uman. Mai mult decât atât, C5 este una dintre mai multe molecule efectoare, care acţionează în stadiile ulterioare în sistemul complementului, iar blocarea C5 nu inhibă activarea sistemului complementului. Prin urmare, un inhibitor al etapelor de iniţiere a activării complementului ar avea avantaje semnificative faţă de un inhibitor în etapele ulterioare ale reacţiei sistemului complement.

În prezent, este larg acceptat faptul, că sistemul complementului poate fi activat prin trei căi distincte: calea clasică, calea lectinei şi calea alternativă. Calea clasică este de obicei declanşată de un complex constituit din anticorpi ai organismului-gazdă legaţi la o particulă străină (adică un antigen) şi pentru generarea unui răspuns imun umoral specific este necesară o expunere prealabilă a unui antigen. Deoarece activarea căii clasice depinde un răspuns imun adaptiv anterior al organismului-gazdă, o astfel de cale clasică este parte a sistemul imunitar dobândit. În schimb, atât calea lectinei, cât şi calea alternativă sunt independente de imunitatea adaptivă şi sunt parte a sistemului imun congenital.

Activarea sistemului complementului conduce la activarea ulterioară a zimogenelor factorilor de serin protează. Prima etapă în activarea căii clasice este legarea unei molecule specifice de recunoaştere, C1q, cu antigenul, legat de moleculele IgG şi IgM. C1q este asociată cu proenzimele serin proteazei Clr şi Cls ca un complex notat Cl. După legarea moleculei C1q cu complexul imun, scindarea autoproteolitică a situsului Arg-Ile Clr este însoţită de scindarea şi activarea Cls mediată de Clr, care astfel dobândeşte capacitatea de a scinda C4 şi C2. C4 este scindat în două fragmente, desemnate C4a şi C4b, şi, în mod similar, C2 este scindat în C2a şi C2b. Fragmentele C4b sunt abile să formeze legături covalente cu grupe hidroxil sau amino adiacente şi să genereze C3 convertaza (C4b2a) prin interacţiune necovalentă cu fragmentul C2a al C2 activate. C3 convertaza (C4b2a) activează C3 prin scindare proteolitică în subcomponentele C3a şi C3b, conducând la generarea C5 convertazei (C4b2a3b), care, prin scindarea C5, conduce la formarea complexului de atac membranar (C5b combinat cu C6, C7, C8 şi C 9, denumit şi "MAC"), care poate perturba membranele celulare, conducând la liză celulară. Formele activate ale C3 şi C4 (C3b şi C4b) sunt depuse covalent pe suprafeţele ţintă străine, care sunt recunoscute de receptorii complementului pe multiple fagocite.

Indiferent de aceasta, prima etapă în activarea sistemului complement prin calea lectinei este, de asemenea, legarea moleculelor specifice de recunoaştere, care este urmată de activarea proenzimelor serin proteazelor asociate. Însă, în locul legării complexelor imune cu ajutorul C1q, moleculele de recunoaştere în calea lectinei cuprind un grup de proteine de legare a carbohidraţilor (lectină fixatoare de manan (MBL), H-ficolină, M-ficolină, L-ficolină şi lectină CL-11 de tip C), denumite colectiv lectine (J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572, 2002, p. 387- 400; Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol. no 21, 2003, p. 547, 578; Teh et al., Immunology, no 101, 2000, 225- 232; J. Luet et al., Biochim Biophys Acta, no 1572, 2002, p. 387-400; Holmskov et al., Annu Rev Immunol. no 21, 2003, p. 547-578; Teh et al., Immunology, no 101, 2000, p. 225-232; Hansen et al., J. Immunol, no 185 (10), 2010, p. 6096-6104).

Ikeda şi colab. primii au demonstrat că, analogic lui C1q, MBL poate activa sistemul complementului după legarea la eritrocitele acoperite cu manan de drojdie într-un mod dependent de C4 (Ikeda et al., J. Biol. Chem. no 262, 1987, p. 7451-7454). MBL, membru al familiei de proteine coleine, este o lectină dependentă de calciu, care se leagă cu carbohidraţii la grupele 3 şi 4-hidroxi orientate în planul ecuatorial al inelului de piranoză. De aceea liganzii principali pentru MBL sunt D manoza şi N-acetil-D-glucosamina, în timp ce carbohidraţii, care nu se potrivesc cu această cerinţă sterică, au o afinitate nedetectabilă pentru MBL (Weis et al., Nature, no 360, 1992, p. 127-134). Interacţiunea dintre MBL şi zaharurile monovalente este extrem de slabă, cu constante de disociere de obicei în interval milimolar de o singură cifră. MBL realizează o legătură strânsă specifică cu liganzii glicani prin aviditate, adică prin interacţiunea simultană cu reziduuri multiple de monozaharide situate în imediata vecinătate a celorlalte (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys. no 299, 1992, p. 129-136). MBL recunoaşte fragmentele de carbohidraţi, care decorează în mod obişnuit suprafeţele microorganismelor, cum ar fi bacteriile, drojdiile, paraziţii şi unele virusuri. Dimpotrivă, MBL nu recunoaşte D galactoza şi acidul sialic, penultimul şi ultimul zahar care decorează de obicei complexe de glicoconjugate "mature", prezente pe glicoproteinele plasmei şi suprafeţei celulare la mamifere. Această specificitate de legare este considerată a promova recunoaşterea suprafeţelor "străine" şi protejează de "autoactivare". Cu toate acestea, MBL nu se leagă cu afinitate mare la grupele "precursorilor" glicanilor cu conţinut înalt de manoză pe glicoproteinele şi glicolipidele N- legate, sechestrate în reticulul endoplasmatic şi în aparatul Golgi din celule de mamifere (Maynard et al., J. Biol. Chem. no 257, 1982, p. 3788-3794). Prin urmare, celulele deteriorate sunt ţinte potenţiale pentru activarea căii lectinei prin legarea cu MBL.

Ficolinele posedă un alt tip de domeniu de lectină, decât MBL, numit domeniu asemănător fibrinogenului. Ficolinele leagă resturile de zahăr într-un mod independent de Ca++. La om au fost identificate trei tipuri de ficoline (L-ficolină, M-ficolină şi H-ficolină). Cele două ficoline serice, L-ficolină şi H-ficolină, au în comun o specificitate pentru N-acetil-D-glucosamină; cu toate acestea, H-ficolina leagă, de asemenea, şi N-acetil-D-galactozamina. Diferenţa în specificitatea L-ficolinei, H-ficolinei, CL-11 şi MBL în raport cu zaharurile înseamnă, că diferite lectine pot fi complementare şi ţintite diferit, deşi şi glicoconjugate, care parţial se dublează. Acest concept este susţinut de raportul recent publicat că, din lectinele cunoscute participante în calea lectinei, numai L-ficolina se leagă în mod specific la acidul lipoteichoic, un glicoconjugat de membrană celulară, găsit pe toate bacteriile Gram pozitive (Lynch et al., J. Immunol. no 172, 2004, p. 1198-1202). Secvenţele aminoacide ale coleinelor (adică, MBL) şi ficolinelor nu prezintă nici o asemănare semnificativă. Cu toate acestea, cele două grupe de proteine au organizaţii de domeniu similare şi, în mod similar C1q, se asamblează în structuri oligomere, care maximizează abilitatea lor de legare în multisiteu.

Concentraţiile serice de MBL sunt extrem de variabile în populaţiile sănătoase şi acest lucru este controlat genetic prin polimorfisme/mutaţii atât în regiunile promotor, cât şi în cele care codifică gena MBL. Nivelul de expresie a MBL, ca o proteină de fază acută, este suplimentar reglată în creştere în procesul inflamaţiei. L-ficolina este prezentă în ser în concentraţii similare cu cele ale MBL. De aceea, eficienţa ramurii L-ficolinice a căii lectinei este potenţial comparabilă cu cea a ramurii MBL. MBL şi ficolinele pot funcţiona, de asemenea, ca opsonine, care permit fagocitelor să fie direcţionate asupra suprafeţelor decorate cu MBL şi ficolină (Jack et al., J. Leukoc. Biol., no 77(3), 2004, p. 328-336; Matsushita and Fujita, Immunobiology, no 205(4-5), 2002, p. 490-497; Aoyagi et al., J. Immunol., no. 174(1), 2005, p. 418-425). Această opsonizare necesită interacţiunea acestor proteine cu receptorii fagocitelor (Kuhlman et al., J. Exp Med., no 169, 1989, p. 1733; Matsushita et al., J. Biol.Chem., no 271, 1996, p. 2448-54), a căror identitate nu a fost stabilită.

MBL umană formează o interacţiune specifică şi cu afinitate înaltă prin domeniul său asemănător cu colagenul cu serin proteaze unice de tipul Clr/Cl, denumite serin proteaze asociate cu MBL (MASP). Până în prezent, au fost descrise trei MASP-uri. Mai întâi, a fost identificată şi caracterizată o singură enzimă "MASP", caracterizată ca enzima responsabilă pentru iniţierea cascadei reacţiilor complementului (adică, reacţiilor de scindare a C2 şi C4) (Matsushita et al., J. Exp. Med. no 176(6), 1992, p. 1497-1502; Ji et al., J. Immunol. no 150, 1993, p. 571-578). S-a determinat ulterior că activitatea MASP reprezintă, de fapt, activitatea unui amestec de două proteaze: MASP-1 şi MASP-2 [1]. Cu toate acestea, s-a demonstrat că un singur complex MBL-MASP-2 este suficient pentru activarea complementului [2]. Mai mult decât atât, numai MASP-2 a scindat C2 şi C4 cu un grad înalt de transformare [3]. Prin urmare, MASP-2 este o protează responsabilă de activarea C4 şi C2 pentru a genera C3 convertaza, C4b2a. Aceasta este o diferenţă semnificativă de complexul C1 al căii clasice, în care acţiunea coordonată a două serin proteaze specifice (C1r şi C1s) conduce la activarea sistemului complementului. Mai mult decât atât, a fost izolată a treia protează nouă, MASP-3 (Dahl, M. R. et al., Immunity, no 15, 2001, p. 127-135). MASP-1 şi MASP-3 reprezintă produse alternativ combinate ale unei şi aceleiaşi gene.

MASP conţin organizaţii de domeniu identice cu cele ale Clr şi Cls, componente enzimatice ale complexului Cl (Sim et al., Biochem.Soc Trans., no 28, 2000, p. 545). Aceste domenii includ un domeniu N-terminal Clr/Cls/factorului de creştere al endoteliului vaselor (VEGF) al ariciului de mare/proteinei morfogenetice osoase (CUB); un domeniu similar factorului de creştere epidermal; un al doilea domeniu CUB; un tandem al domeniilor proteinelor reglatoare ale complementului şi un domeniu de serin protează. Ca şi în proteazele C1, activarea MASP-2 se produce prin scindarea unei legături Arg-Ile adiacente domeniului serin proteazei, ceea ce conduce la scindarea enzimei în lanţurile A şi B legate cu disulfură, în care ultimul dintre aceste lanţuri constă din domeniul serin proteazei.

MBL se poate asocia, de asemenea, cu o formă alternativă combinată de MASP-2, cunoscută ca proteină asociată cu MBL de 19 kDa (MAp19) sau proteină mică asociată cu MBL (sMAP), care nu posedă activitatea catalitică a MASP2 (Stover, J. Immunol. no 162, 1999, p. 348190; Takahashi şi colab., Int. Immunol., no 11, 1999, p. 859-863). MAp19 cuprinde primele două domenii ale MASP-2, urmate de o secvenţă suplimentară din patru aminoacizi unici. Funcţia Map19 este neclară (Degn et al., J. Immunol. Metode, 2011). Genele MASP-1 şi MASP-2 sunt localizate pe cromozomii umani 3 şi, respectiv, 1 (Schwaeble et al., Immunobiology, no 205, 2002, p. 455-466).

Un şir de date obţinute atestă, că există diferite complexe MBL-MASP şi că fracţia cea mai mare din MASP din ser nu formează complexe cu MBL (Thiel et al., J. Immunol., no165, 2000, p. 878-887). Atât H, cât şi L-ficolina se leagă cu toate MASP-urile şi activează calea lectinei a complementului, la fel ca şi MBL (Dahl et al., Immunity, no 15, 2001, p. 127-135; Matsushita et al., J. Immunol., no 168, 2002, p. 3502-3506). Atât calea lectinei, cât şi calea clasică formează o C3 convertază comună (C4b2a) şi cele două căi converg în această etapă.

Calea lectinei este recunoscută ca având un rol major în apărarea gazdei împotriva infecţiei într-un organism-gazdă, care nu a fost supus infectării. Dovezi convingătoare privind implicarea MBL în protecţia organismului-gazdă sunt prezentate în investigaţiile pacienţilor cu niveluri serice reduse de MBL funcţional [4]. Aceşti pacienţi prezintă sensibilitate la infecţii bacteriene şi fungice recurente. Aceste simptome sunt, de obicei, evidente la vârste fragede, în timpul unei perioade distincte de rezistenţă redusă a organismului, pe măsura reducerii titrului anticorpilor materni, dar înainte de a se dezvolta un răspuns umoral cu formarea unui repertoriu complet al anticorpilor. Acest sindrom deseori rezultă din mutaţii în câteva situsuri din porţiunea colagenă a MBL, care interferează cu formarea corectă a oligomerilor MBL. Însă, deoarece MBL poate funcţiona ca o opsonină independent de complement, nu se ştie în ce măsură susceptibilitatea crescută la infecţie se datorează dereglării activării complementului.

Spre deosebire de căile clasice şi de lectină, nici unul din iniţiatorii căii alternative nu au demonstrat că realizează funcţiile de recunoaştere pe care le îndeplinesc C1q şi lectinele în celelalte două căi. În prezent, este acceptat faptul, că calea alternativă este supusă în mod spontan unei activări ciclice cu un nivel redus, care poate fi uşor amplificat pe suprafeţe străine sau pe alte suprafeţe anormale (bacterii, drojdii, celule infectate viral sau ţesuturi deteriorate), care sunt lipsite de elemente moleculare proprii, care controlează activarea spontană a complementului. Există patru proteine plasmatice implicate direct în activarea căii alternative: C3, factorii B şi D şi properdina.

Deşi există o multitudine de dovezi ale implicării atât a căii clasice, cât şi a căii lectinei de activare a complementului în patogeneza bolilor umane neinfecţioase, rolul căii lectinei numai urmează să fie elucidat. Studiile recente oferă dovezi, că activarea căii lectinei poate fi responsabilă de activarea complementului şi de inflamaţia asociată în leziunea ischemică/de reperfuzie. Collard et al. (2000) au relatat, că celulele endoteliale cultivate, supuse stresului oxidative, leagă MBL şi prezintă depunerea C3 la acţiunea asupra lor a serului uman (Collard et al., Am., J. Pathol., no 156, 2000, p. 1549-1556). În plus, tratarea serurilor umane cu anticorpi monoclonali blocanţi anti-MBL conduce la inhibarea legării MBL şi activării complementului. Aceste concluzii au fost precizate pe un model experimental cu şobolani cu reperfuzie ischemică miocardică, în care la şobolanii trataţi cu un anticorp de blocare îndreptat împotriva MBL de şobolan s-a înregistrat o reducere semnificativă a deteriorării miocardului după ocluzia unei artere coronare, comparative cu şobolanii trataţi cu un anticorp de control (Jordan et al., Circulation, no 104, 2001, p. 1413-1418). Mecanismul molecular al legării MBL cu endoteliul vascular după un stres oxidativ este încă neclar; dar un studiu recent sugerează că activarea căii lectinei după un stres oxidativ poate fi mediată prin legarea MBL cu citokeratinele endoteliului vascular şi nu cu glicoconjugate (Collard et al., Am., J. Pathol., no 159, 2001, p. 1045-1054). În alte studii a fost determinat rolul căii clasice şi căii alternative în patogeneza leziunii în ischemie/de reperfuzie, iar rolul căii lectinei în această boală rămâne controversat (Riedermann, N.C. et al., Am., J. Pathol., no 162, 2003, p. 363-367).

Un studiu recent a arătat, că MASP-1 (şi posibil, de asemenea, MASP-3) este necesară pentru a transforma enzima de activare a căii alternative, a factorului D, din forma sa de zimogen în forma sa activă enzimatic [5]. Importanţa fiziologică a acestui proces este subliniată de absenţa activităţii funcţionale a căii alternative în plasma şoarecilor cu deficit de MASP-1/3. Generarea proteolitică a C3b din C3 nativ este necesară pentru funcţionarea călii alternative. Deoarece C3 convertaza a căii alternative (C3bBb) conţine C3b ca o subunitate esenţială, întrebarea privind originea primului C3b prin calea alternativă prezintă o problemă neclară şi necesită cercetări ample.

C3 aparţine unei familii de proteine (împreună cu C4 şi α-2 macroglobulina), care conţin o modificare rară posttranslaţională, cunoscută ca legătură tioester. Grupa tioester este compusă dintr-o glutamine, a cărei grupă carbonil terminală formează o legătură tioester covalentă cu grupa sulfhidril a unei cisteine fără trei aminoacizi. Această legătură este instabilă, iar glutamil-tioesterul electrofil poate reacţiona cu fragmente nucleofile, cum ar fi grupele hidroxil sau amino, şi astfel formează o legătură covalentă cu alte molecule. Legătura tioesterului este relativ stabilă când se sechestrează într-un buzunar hidrofob al C3 intact. Cu toate acestea, scindarea proteolitică a C3 până la C3a şi C3b are drept rezultat expunerea legăturii tioestere foarte reactive pe C3b şi, în urma atacului nucleofil cu porţiuni adiacente conţinând grupele hidroxil sau amino, C3b devine legat covalent cu ţinta. Pe lângă rolul său bine documentat în ataşarea covalentă a C3b cu ţintele complementului, se consideră că tioesterul C3 are un rol esenţial în declanşarea căii alternative. Conform "teoriei activării în gol", acceptate pe larg, calea alternativă este iniţiată prin generarea convertazei în fază fluidă, iC3Bb, care este formată din C3 cu tioester hidrolizat (iC3, C3 (H2O)) şi factorul B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol., no 7, 1984, p. 143-162). C3b asemănător C3 (H2O) este generat din C3 nativ printr-o hidroliză spontană lentă a tioesterului intern, prezent în proteină (Pangburn, M. K. et al., J. Exp. Med., no 154, 1981, p. 856-867). Datorită activităţii C3(H2O)Bb convertazei, moleculele C3b sunt depuse pe suprafaţa ţintă, iniţiind astfel calea alternativă.

Foarte puţină informaţie este despre iniţiatorii activării căii alternative. Se consideră, că activatorii includ pereţi de celule de drojdie (zimosan), numeroase polizaharide pure, eritrocite de iepure, anumite imunoglobuline, virusuri, fungi, bacterii, celule tumorale de animale, paraziţi şi celule deteriorate. Singura caracteristică comună a acestor activatori este prezenţa carbohidraţilor, însă, datorită complexităţii şi varietăţii structurilor carbohidraţilor, este dificilă stabilirea determinantelor moleculare comune pentru recunoaştere. S-a acceptat opinia, că activarea căii alternative este reglată prin echilibrul fin între componentele inhibitoare ale acestei căi, cum ar fi Factorul H, Factorul I, DAF şi CR1 şi properdina, care este singurul regulator pozitiv al căii alternative (Schwaeble W.J. and Reid K.B., Immunol Today, no 20(1), 1999, p. 17-21).

Adiţional la mecanismul de activare aparent neregulat, descris mai sus, calea alternativă poate de asemenea asigura o amplificare de ansă puternică pentru C3 convertază (C4b2a) a căii lectinei/clasice, deoarece orice C3b generat poate participa împreună cu factorul B în formarea C3 convertazei adiţionale (C3bBb) a căii alternative. C3 convertază căii alternative este stabilizată prin legarea properdinei. Properdina prelungeşte perioada de înjumătăţire a C3 convertazei căii alternative de şase până la zece ori. Adăugarea C3b la C3 convertaza căii alternative conduce la formarea C5 convertazei căii alternative.

Se consideră, că toate cele trei căi (adică clasică, a lectinei şi alternativă) se converg în C5, la scindarea cărei se formează produse cu multiple efecte proinflamatorii. Calea convergentă a fost menţionată drept cale a produselor finale de activare a complementului. C5a reprezintă în exclusivitate o anafilatoxină puternică, care provoacă modificări ale tonusului muşchiului neted şi vaselor, precum şi ale permeabilităţii vasculare. Este, de asemenea, o chemotaxină şi un activator puternic al neutrofilelor şi monocitelor. Activarea celulară mediată de C5a poate amplifica în mod semnificativ răspunsurile inflamatorii prin inducerea eliberării mai multor mediatori inflamatorii suplimentari, incluzând citokine, enzime hidrolitice, metaboliţi ai acidului arahidonic şi forme active de oxigen. Scindarea C5 conduce la formarea C5b9, cunoscută şi ca complex de atac membranar (MAC). În prezent există dovezi convingătoare, că depunerea sublitică a MAC poate avea un rol important în procesul inflamaţii, adiţional la rolul său de complex de formare a porilor litici.

Adiţional la rolul său esenţial în apărarea imună, sistemul complementului contribuie la deteriorarea ţesuturilor în numeroase stări clinice. Astfel, există o necesitate stringentă de a elabora inhibitori ai complementului, terapeutic eficienţi pentru a preveni aceste efecte adverse.

Descrierea invenţiei este destinată pentru a face cunoştinţă cu alegerea conceptelor într-o formă simplificată, care sunt descrise în cele ce urmează în capitolul "Descrierea detaliată a invenţiei". Această descriere a esenţei invenţiei nu are drept scop nici identificarea semnelor cheie ale obiectului revendicat, nici utilizarea în calitate de informaţie auxiliară la determinarea volumului obiectului revendicat.

Într-un aspect, prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a leziunii celulelor endoteliale microvasculare şi/sau a formării trombilor la un subiect care suferă de microangiopatie trombotică (TMA), cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de anticorp inhibitor MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2. În unele variante de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei TMA, selectate din grupa constând din sindrom hemolitic uremic (aHUS), purpură trombotică trombocitopenică (TTP) şi sindrom hemolitic uremic atipic (HUS). În unele variante de realizare înainte de administrarea compoziţiei subiectul trebuie să prezinte unul sau mai multe simptome selectate din grupa constând din (i) anemie, (ii) trombocitopenie (iii) insuficienţă renală şi (iv) creşterea creatininei, şi compoziţia se administrează într-o cantitate eficientă şi timp de o perioadă suficientă pentru a îmbunătăţi unul sau mai multe dintre simptomele menţionate. În unele variante de realizare agentul inhibitor MASP-2 reprezintă un anticorp anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia. În unele variante de realizare agentul inhibitor MASP-2 este un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia, care se leagă specific la o porţiune din SECV ID NR: 6. În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă leziunea celulelor endoteliale microvasculare.

Într-un alt aspect invenţia prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect care suferă sau prezintă risc de a dezvolta sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS), cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de agent inhibitor de MASP-2 eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. Într-o variantă de realizare înainte de administrarea compoziţiei subiectul trebuie să prezinte unul sau mai multe simptome selectate din grupa constând din (i) anemie, (ii) trombocitopenie (iii) insuficienţă renală şi (iv) creşterea creatininei, şi compoziţia este administrată într-o cantitate eficientă şi timp de o perioadă suficientă pentru a îmbunătăţi unul sau mai multe dintre simptomele menţionate. Într-o variantă de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de a dezvolta aHUS, care nu depinde factorul H. Într-o variantă de realizare subiectul suferă de aHUS asociat cu factorul I, factorul B sau cofactorul de membrană CD46. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor MASP-2 este un anticorp anti-MASP-2 sau fragment al acestuia, cum ar fi un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia, care se leagă specific cu o porţiune din SECV ID NR: 6. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă leziunea celulelor endoteliale microvasculare. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombului.

Într-un alt aspect invenţia prevede o metodă de reducere a probabilităţii dezvoltării simptomelor clinice asociate cu aHUS la un subiect cu risc de instalare a sindromului hemolitic uremic atipic (aHUS). Metoda, conform acestui aspect al invenţiei, cuprinde (a) determinarea prezenţei unui marker genetic la subiectul cunoscut de a fi asociat cu aHUS; (b) monitorizarea periodică a subiectului pentru a determina prezenţa sau absenţa a cel puţin de unui simptom selectat din grupa constând din anemie, trombocitopenie, insuficienţă renală şi creşterea creatininei; şi (c) administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2 în cazul prezenţei a cel puţin de unui dintre următoarele simptome: anemie, trombocitopenie, insuficienţă renală sau creşterea creatininei, în care compoziţia este administrată într-o cantitate eficientă şi timp de o perioadă suficientă pentru a îmbunătăţi unul sau mai multe simptome. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor MASP-2 este un anticorp anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia, cum ar fi un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia, care se leagă specific cu o porţiune din SECV ID NR: 6. Într-o variantă de realizare a metodei etapa (a) cuprinde efectuarea unui test genetic de screening pe o probă prelevată de la subiect şi identificarea prezenţei a cel puţin de unui marker genetic asociat cu aHUS într-o genă selectată din grupa constând din factorul complementului H (CFH), factorul I al complementului (CFI), factorul B al complementului (CFB), cofactorul membranei CD46, C3, proteina asemănătoare cu factorul complementului H (CFHR1), trombodulina proteică anticoagulantă (THBD), proteina 3 asemănătoare cu factorul complementului H (CFHR3) şi proteina 4 asemănătoare cu factorul complementului H (CFHR4). Într-o variantă de realizare metoda prevede suplimentar monitorizarea subiectului pentru apariţia unui eveniment, despre care se ştie că este asociat cu declanşarea simptomelor clinice aHUS, şi administrarea la subiect a compoziţiei care cuprinde agentul inhibitor MASP-2 înainte, în timpul sau după apariţia evenimentului declanşator. Într-o variantă de realizare, evenimentul asociat cu declanşarea simptomelor clinice aHUS este selectat din grupa constând din expunerea de lungă durată la un medicament, o infecţie, o tumoare malignă, o leziune, un transplant de organe sau ţesut şi sarcină. Într-o variantă de realizare infecţia este o infecţie bacteriană. Într-o variantă de realizare compoziţia se administrează subcutanat. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă leziunea celulelor endoteliale microvasculare. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombului.

Într-un alt aspect, invenţia prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect care suferă sau prezintă risc de a dezvolta sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS) asociat unei infecţii, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2. Într-o variantă de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de a dezvolta aHUS ne-enteric asociat cu o infecţie cu S. pneumonia. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor MASP-2 este un anticorp anti-MASP-2 sau fragment al acestuia, cum ar fi un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia care se leagă specific la o porţiune din SECV ID NR: 6. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă leziunea celulelor endoteliale microvasculare. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombului.

Într-un alt aspect invenţia prevede o metodă de tratare a unui subiect care suferă de sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS), care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii care conţine o cantitate dintr-un agent inhibitor MASP-2 eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2, administrarea agentului inhibitor MASP-2 fiind realizată printr-un cateter intravenos sau printr-o altă metodă de administrare prin cateter. Într-o variantă de realizare metoda prevede adiţional tratarea pacientului cu plasmefereză. Într-o variantă de realizare compoziţia cu conţinut de agent inhibitor MASP-2 se administrează în absenţa plasmeferezei. Într-o variantă de realizare compoziţia cu conţinut de agent inhibitor MASP-2 se administrează printr-un cateter în prima perioadă de timp, cuprinzând în continuare administrarea compoziţiei cu conţinut de agent inhibitor MASP-2 în a doua perioadă de timp, în care compoziţia este administrată subcutanat. Într-o variantă de realizare metoda mai prevede determinarea periodică a nivelului cel puţin de un factor al complementului, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor al complementului, în comparaţie cu o valoare standard sau la un subiect sănătos, indică necesitatea de a continua tratamentul cu compoziţia. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 este un anticorp anti-MASP-2 sau fragment al acestuia, cum ar fi un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia, care se leagă specific la o porţiune din SECV ID NR: 6. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă leziunea celulelor endoteliale microvasculare. Într-o realizare, agentul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombului.

Intr-un alt aspect invenţia prevede o metodă de tratare a unui subiect care suferă de purpura trombotică trombocitopenică (PTT) sau care prezintă simptome, care indică un diagnostic de PTT, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii care conţine o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2 eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2, în care agentul inhibitor MASP-2 se administrează subiectului printr-un cateter intravenos sau prin altă metodă de administrare prin cateter. Într-o variantă de realizare subiectul prezintă cel puţin de unul sau mai multe simptome selectate din grupa constând din implicarea în procesul patologic a sistemului nervos central, trombocitopenie, afectare cardiacă severă, afectare pulmonară severă, infarct gastro-intestinal şi gangrenă. Într-o variantă de realizare subiectul este testat pozitiv pentru prezenţa unui inhibitor al ADAMTS13, iar metoda prevede adiţional administrarea unui imunosupresor. Într-o variantă de realizare compoziţia cuprinzând agentul inhibitor al MASP-2 se administrează în prima perioadă de timp în absenţa plasmeferezei. Într-un exemplu de realizare subiectul este testat pozitiv pentru prezenţa unui inhibitor al ADAMTS-13, iar metoda prevede suplimentar administrarea ADAMTS-13. Într-o variantă de realizare metoda prevede adiţional tratarea pacientului cu plasmefereză. Într-o variantă de realizare compoziţia cu conţinut de un agent inhibitor al MASP-2 se administrează în prezenţa plasmeferezei. Într-o variantă de realizare compoziţia cu conţinut de un agent inhibitor al MASP-2 se administrează printr-un cateter în prima perioadă de timp, cuprinzând în plus administrarea compoziţiei cu conţinut de un agent inhibitor al MASP-2 în a doua perioadă de timp, în care compoziţia se administrează subcutanat în perioada a doua de timp. Într-o variantă de realizare metoda mai prevede determinarea periodică a nivelului cel puţin de un factor al complementului, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor al complementului, în comparaţie cu o valoare standard sau un subiect sănătos, indică necesitatea de a continua tratamentul cu compoziţia. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 este un anticorp anti-MASP-2 sau fragment al acestuia, cum ar fi un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia, care se leagă specific la o porţiune din SECV ID NR: 6. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă leziunea celulelor endoteliale microvasculare. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombului.

Într-un alt aspect invenţia prevede o metodă de tratare a unui subiect care suferă de purpura trombotică trombocitopenică refractară (TTP) cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2. Într-o variantă de realizare compoziţia se administrează subcutanat. Într-o variantă de realizare metoda mai prevede determinarea periodică a nivelului cel puţin de un factor al complementului, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor al complementului, în comparaţie cu o valoare standard sau la un subiect sănătos, indică necesitatea de a continua tratamentul cu compoziţia. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 este un anticorp anti-MASP-2 sau fragment al acestuia, cum ar fi un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau un fragment al acestuia, care se leagă specific la o porţiune din SECV ID NR: 6. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă leziunea celulelor endoteliale microvasculare. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombului.

Într-un alt aspect prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei microangiopatii trombotice (TMA), în care TMA este cel puţin de una dintre (i) TMA asociate cancerului; (ii) TMA asociate chimioterapiei sau (iii) TMA asociate transplantului, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. În unele exemple de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei TMA asociate cancerului şi agentul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic subiectului într-o cantitate eficientă pentru a reduce riscul de dezvoltare a TMA sau pentru a reduce severitatea TMA. În unele variante de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a TMA asociate chimioterapiei şi agentul inhibitor MASP-2 se administrează sistemic subiectului înainte, în timpul sau după chimioterapie într-o cantitate eficientă pentru reducerea riscului de a dezvolta TMA sau reducerea severităţii TMA. În unele variante de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a TMA asociate transplantului şi agentul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic subiectului înainte, în timpul sau după procedura de transplant, într-o cantitate eficientă pentru a reduce riscul de dezvoltare a TMA sau a reduce severitatea TMA. În unele variante procedura de transplant este un transplant de celule stem hematopoietice alogene. În unele variante de realizare anterior sau în momentul dat subiectul administrează un tratament cu un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda cuprinde suplimentar administrarea la subiect a unui inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului, cum ar fi un anticorp anti-C5 umanizat sau un fragment al acestuia de legare a antigenului, cum ar fi eculizumab.

Într-un alt aspect invenţia prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect, care suferă sau prezintă risc de a dezvolta sindromul Upshaw-Schulman (USS), cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. În unele variante de realizare metoda prevede tratarea unui subiect cu risc de a dezvolta USS, în care metoda cuprinde administrarea unei cantităţi de un agent inhibitor al MASP-2 timp de o perioadă de timp eficientă pentru ameliorarea sau prevenirea unui sau a mai multor simptome clinice asociate cu TTP. În unele variante de realizare metoda prevede suplimentar monitorizarea periodică a subiectului privind prezenţa unui eveniment cunoscut de a fi asociat cu declanşarea simptomelor clinice ale TTP şi administrarea agentului inhibitor al MASP-2 după depistarea evenimentului. În unele variante de realizare metoda prevede suplimentar monitorizarea periodică a subiectului şi la determinarea prezenţei anemiei, trombocitopeniei sau creşterii creatinei se administrează un agent inhibitor al MASP-2. În unele variante de realizare anterior sau în momentul dat subiectul administrează un tratament cu un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda cuprinde suplimentar administrarea la subiect a unui inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului, cum ar fi un anticorp anti-C5 umanizat sau un fragment al acestuia de legare a antigenului, cum ar fi eculizumab.

Într-un alt aspect invenţia prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect care suferă de boala Degos, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP- 2. În unele variante de realizare anterior sau în momentul dat subiectul administrează un tratament cu un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda cuprinde suplimentar administrarea la subiect a unui inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului, cum ar fi un anticorp anti-C5 umanizat sau un fragment al acestuia de legare a antigenului, cum ar fi eculizumab.

Într-un alt aspect invenţia prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect care suferă de sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS), care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. În unele variante de realizare anterior sau în momentul dat subiectul administrează un tratament cu un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda cuprinde suplimentar administrarea la subiect a unui inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului, cum ar fi un anticorp anti-C5 umanizat sau un fragment al acestuia de legare a antigenului, cum ar fi eculizumab.

În unele exemple de realizare ale oricărei dintre metodele, conform prezentei invenţii, agentul inhibitor al MASP-2 este un anticorp inhibitor al MASP-2 sau un fragment al acestuia. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 are funcţia efectoare redusă. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 nu inhibă în mod semnificativ calea clasică. În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 este un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau fragment al acestuia, care se leagă specific la o porţiune din SECV ID NR: 6. În unele variante de realizare anticorpul anti-MASP-2 sau fragmentul acestuia este selectat din grupa constând dintr-un anticorp recombinant, un anticorp având funcţie efectoare redusă, un anticorp himeric, un anticorp umanizat şi un anticorp uman. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este un fragment de anticorp selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab)2 şi F(ab')2. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este o moleculă cu un singur lanţ. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor MASP-2 este selectat din grupa constând dintr-o moleculă IgG1, o moleculă IgG2 şi o moleculă IgG4. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este o moleculă IgG4 cuprinzând o mutaţie S228P. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 leagă MASP-2 umană cu o constantă de disociere KD de 10 nM sau mai mică. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă depunerea C3b într-o analiză in vitro în 1% ser uman cu IC50 de 10 nM sau mai puţin. În unele exemple de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă depunerea C3b în 90% ser uman cu IC50 de 30 nM sau mai puţin.

În unele variante de realizare ale oricărei dintre metodele, conform prezentei invenţii, anticorpul monoclonal inhibitor al MASP-2 sau fragmentul său de legare la antigen conţine: (a) o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi (b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 89-97 din SECV ID NR: 70. În unele variante de realizare anticorpul monoclonal inhibitor al MASP-2 cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu notată ca SEQ ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor notată ca SEQ ID NO: 70. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 sau fragmentul acestuia de legare la antigen recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop, recunoscut de un anticorp de referinţă, cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu , notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor , notată ca SECV ID NR: 70.

Într-un alt aspect al invenţiei sunt prevăzute metode pentru inhibarea formării trombilor la un subiect care suferă de sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS), care cuprinde administrarea la subiect a unei cantităţi dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare a antigenului, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul unui subiect care suferă de aHUS în cel puţin de 40%, comparativ cu serul subiectului netratat. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul unui subiect care suferă de aHUS la un nivel cel puţin de 20% mai înalt (de exemplu, cel puţin de 30% mai înalt, cel puţin de 40% mai înalt sau cel puţin de 50% mai înalt) decât efectul său inhibitor asupra depunerii C5b-9 în serul de la acelaşi subiect. În unele variante subiectul este în faza acută a aHUS. În unele variante subiectul este în faza de remisiune a aHUS. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor MASP-2 este un anticorp monoclonal sau fragment al acestuia, care se leagă specific la o porţiune din SECV ID NR: 6. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 sau fragmentul acestuia este selectat din grupa constând dintr-un anticorp recombinant, un anticorp având funcţie efectoare redusă, un anticorp himeric, un anticorp umanizat şi un anticorp uman. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este un fragment de anticorp selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab)2 şi F(ab')2. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor MASP-2 este o moleculă cu un singur lanţ. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor MASP-2 este selectat din grupa constând dintr-o moleculă IgG1, o moleculă IgG2 şi o moleculă IgG4. În unele variante de realizare, anticorpul inhibitor MASP-2 este o moleculă IgG4 cuprinzând o mutaţie S228P. În unele variante de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 leagă MASP-2 uman cu o constantă de disociere KD de 10 nM sau mai mică. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor de MASP-2 inhibă depunerea C3b într-o analiză in vitro în 1% ser uman la IC50 de 10 nM sau mai puţin. În unele exemple de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă depunerea C3b în 90% ser uman la IC50 de 30 nM sau mai puţin. În unele variante de realizare anticorpul monoclonal inhibitor al MASP-2 sau fragmentul său de legare a antigenului cuprinde: (a) o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi (b) o regiune variabilă a catenei uşoare cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul CDR-L3 uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 89-97 din SECV ID NR: 70. În unele variante de realizare anticorpul monoclonal inhibitor al MASP-2 cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu notată ca SEQ ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor notată ca SEQ ID NO: 70. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 sau fragmentul de legare la antigen al acestuia recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop, recunoscut de un anticorp de referinţă, cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu , notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor , notată ca SECV ID NR: 70.

Într-un alt aspect prezenta invenţie prevede o metodă de tratare a unui subiect care suferă de aHUS rezistent la terapia cu plasmă, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2. Într-o realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau fragmentul acestuia, care se leagă în mod specific la MASP-2 uman. Într-o realizare anticorpul sau fragmentul acestuia este selectat din grupa constând dintr-un anticorp recombinant, un anticorp având funcţie efectoare redusă, un anticorp himeric, un anticorp umanizat şi un anticorp uman. În unele variante de realizare anterior sau în momentul dat subiectul administrează un tratament cu un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului, în care inhibitorul activării componentelor terminale ale complementului este un anticorp uman anti-C5 sau fragment al acestuia de legare a antigenului . Într-o variantă de realizare metoda cuprinde în plus tratarea pacientului cu plasmefereză. Într-o realizare compoziţia, cuprinzând anticorpul inhibitor al MASP-2, se administrează în absenţa plasmeferezei.

Într-un alt aspect prezenta invenţie prevede o metodă de tratare a unui subiect care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2 . Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este un anticorp monoclonal anti-MASP-2 sau fragmentul acestuia, care se leagă în mod specific la MASP-2 uman. Într-o variantă de realizare anticorpul sau fragmentul acestuia este selectat din grupa constând dintr-un anticorp recombinant, un anticorp având funcţie efectoare redusă, un anticorp himeric, un anticorp umanizat şi un anticorp uman. Într-o variantă de realizare subiectul anterior sau în momentul dat administrează tratament cu un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei complementului C5. Într-o variantă de realizare subiectul suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, care este rezistentă la tratamentul cu o transfuzie de trombocite şi/sau rezistentă la tratamentul cu plasmefereză. Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează într-o cantitate eficientă pentru a îmbunătăţi cel puţin de unul sau mai mulţi parametri clinici asociaţi cu TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, cum ar fi creşterea numărului de trombocite (de exemplu, cel puţin de dublă, cel puţin de triplă, cel puţin de patru ori a numărului de trombocite înregistrat înainte de tratament), o creştere a haptoglobinei şi/sau o reducere a lactatdehidrogenazei.

Într-un alt aspect prezenta invenţie prevede o metodă de tratare a unui subiect uman, care suferă de TMA persistentă asociată cu transplant de celule stem hematopoietice (HSCT-TMA) cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu un conţinut de o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare a antigenului, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. Într-o variantă de realizare metoda cuprinde în continuare identificarea unui subiect cu TMA persistentă asociată cu transplant de celule stem hematopoietice înainte de etapa de administrare la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare a antigenului, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este un anticorp monoclonal sau fragment al acestuia, care se leagă în mod specific la MASP-2 uman. Într-o variantă de realizare anticorpul sau fragmentul acestuia de legare a antigenului este selectat din grupa constând dintr-un anticorp recombinant, un anticorp având funcţie efectoare redusă, un anticorp himeric, un anticorp umanizat şi un anticorp uman. Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 nu inhibă în mod semnificativ calea clasică. Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă depunerea C3b în 90% ser uman cu IC50 de 30 nM sau mai puţin. Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 sau fragmentul său de legare a antigenului cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 ale secvenţei de aminoacizi notată ca SEQ ID NR: 67 şi regiunea variabilă a lanţului uşor cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 ale secvenţei de aminoacizi notată ca SEQ ID NO: 70. Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează pacientului în absenţa plasmeferezei. Într-o variantă de realizare subiectul anterior sau în momentul dat administrează tratament cu un anticorp anti-C5 umanizat sau fragment al acestuia de legare a antigenului, astfel în acest caz inhibitorul activării componentelor terminale ale complementului este un anticorp anti-C5 umanizat sau fragment al acestuia de legare a antigenului. Într-un exemplu de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 este livrat subiectului sistemic. Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 sau fragmentul acestuia de legare a antigenului se administrează într-o cantitate eficientă pentru a îmbunătăţi cel puţin de unul sau mai mulţi dintre următorii parametri clinici asociaţi cu TMA persistentă asociată cu transplant de celule stem hematopoietice: (i) creşterea numărului de trombocite (de exemplu, cel puţin de dublă, cel puţin de triplă, cel puţin de patru ori a numărului de trombocite înregistrat înainte de tratament)); (ii) creşterea haptoglobinei; (iii) reducerea lactatdehidrogenazei (LDH) şi/sau (iv) reducerea creatininei.

Într-un alt aspect prezenta invenţie prevede compoziţii pentru inhibarea efectelor adverse ale activării complementului dependente de MASP2, care cuprinde o cantitate terapeutic eficientă dintr-un agent inhibitor al MASP2, cum ar fi un anticorp inhibitor al MASP-2 şi un purtător farmaceutic acceptabil. Sunt de asemenea prevăzute metode producere a unui medicament pentru utilizare pentru inhibarea efectelor adverse ale activării complementului dependente de MASP-2 la subiecţii vii, care au nevoie de aceasta, cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă dintr-un agent inhibitor al MASP-2 într-un purtător farmaceutic. Sunt prevăzute, de asemenea, metode fabricare a medicamentelor pentru utilizare pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2 pentru tratamentul fiecărei dintre stările, afecţiunile şi tulburările descrise în continuare.

Metodele, compoziţiile şi medicamentele din prezenta invenţie sunt utile pentru inhibarea efectelor adverse ale activării complementului dependente de MASP-2 in vivo la mamifere, incluzând oamenii, care suferă sau prezintă risc de a dezvolta microangiopatie trombotică (TMA), aşa cum se descrie în continuare.

Invenţia se explică prin desenele din fig. 1- fig. 60, care reprezintă:

fig. 1 - schema, care ilustrează structura genomică a MASP 2 umană;

fig. 2A - schema principială, care ilustrează structura domeniului proteinei MASP-2 umane;

fig. 2B - schema principială, care ilustrează structura domeniului proteinei MAp19 umane;

fig. 3 - schema, care ilustrează strategia de knock-out a MASP-2 murină;

fig. 4 - schema, care ilustrează construcţia minigenă a MASP-2 umană;

fig. 5A - rezultatele, care demonstrează că deficienţa MASP-2 conduce la pierderea activării C4 mediate de calea lectinei, măsurate prin lipsa depunerii de C4b pe manan, aşa cum se descrie în Exemplul 2;

fig. 5B - rezultatele, care demonstrează că deficienţa MASP-2 conduce la pierderea activării C4 mediate de calea lectinei, măsurate prin lipsa depunerii de C4b pe zimosan, aşa cum se descrie în Exemplul 2;

fig. 5C - rezultatele, care demonstrează nivelurile relative de activare ale C4 în probele serice obţinute din MASP-2+/-; MASP-2-/- şi tulpinile de tip sălbatic, măsurate prin depunerea de C4b pe manan şi pe zimosan, aşa cum se descrie în Exemplul 2;

fig. 6 - rezultatele, care demonstrează că adăugarea de MASP-2 recombinantă murină la probele de ser MASP-2-/- recuperează activarea C4 mediată de calea lectinei într-o manieră dependentă de concentraţia proteinei, măsurate prin depunerea C4b pe manan, aşa cum se descrie în Exemplul 2;

fig. 7 - rezultatele, care demonstrează că calea clasică este funcţională în tulpina MASP-2-/-, aşa cum se descrie în Exemplul 8;

fig. 8A - rezultatele, care demonstrează că fragmentul Fab2 al anticorpului #11 anti-MASP-2 inhibă formarea C3-convertazei, aşa cum se descrie în Exemplul 10;

fig. 8B - rezultatele, care demonstrează că fragmentul Fab2 al anticorpului # 11 anti-MASP-2 se leagă cu MASP-2 de şobolan nativă, aşa cum se descrie în Exemplul 10;

fig. 8C - rezultatele, care demonstrează că fragmentul Fab2 al anticorpului # 41 anti-MASP-2 inhibă scindarea C4, aşa cum se descrie în Exemplul 10;

fig. 9 - rezultatele, care demonstrează că toate fragmentele Fab2 testate ale anticorpilor anti-MASP-2, care au inhibat formarea de C3 convertază, de asemenea, inhibă scindarea C4, aşa cum se descrie în Exemplul 10;

fig. 10 - schema, care ilustrează polipeptidele recombinante derivate din MASP-2 de şobolan, care au fost utilizate pentru cartografierea epitopilor fragmentelor Fab2 care blochează anticorpii anti MASP-2, aşa cum se descrie în Exemplul 11;

fig. 11 - rezultatele, care demonstrează legarea fragmentului Fab2 al anticorpilor # 40 şi # 60 anti-MASP-2 cu polipeptidele MASP-2 de şobolan, cum se descrie în Exemplul 11;

fig. 12 - rezultatele, care demonstrează clearance-ul azotului de uree din sânge pentru şoareci fără mutaţii (+/+) şi MASP-2 (-/-) peste 24 şi 48 de ore după reperfuzie într-un model experimental de leziune ischemică/ de reperfuzie renală, cum se descrie în Exemplul 12;

fig. 13A - rezultatele, care prezintă nivelele iniţiale de proteină VEGF în complexul coroidian (RPE) izolat de la şoareci de tip sălbatic (+/+) şi MASP-2 (-/-), cum se descrie în Exemplul 13;

fig. 13B - rezultatele, care arată nivelele iniţiale de proteină VEGF în complexul coroidian (RPE) în ziua 3 la şoarecii de tip sălbatic (+/+) şi MASP-2 (-/-) după leziunea indusă de laser într-un model experimental de degenerare maculară, cum se descrie în Exemplul 13;

fig. 14 - rezultatele, care arată volumul mediu de neovascularizare coroidală (CNV) în ziua a şapte după leziunea indusă de laser la şoarecii de tip sălbatic (+/+) şi MASP-2 (-/-), cum se descrie în Exemplul 13;

fig. 15A şi 15B - curbele de răspuns la doză pentru inhibarea depunerii de C4b (fig. 15A) şi inhibarea activării trombinei (fig. 15B) după administrarea unui fragment Fab2 al anticorpului anti-MASP-2 în ser de şobolani sănătoşi, cum se descrie în Exemplul 14;

fig. 16A şi 16B - agregarea plachetară măsurată (exprimată ca suprafaţă de agregare) la şoarecii MASP-2 (-/-) (fig. 16B), comparativ cu agregarea plachetară la şoarecii de tip sălbatic netrataţi şi la şoarecii de tip sălbatic la care calea de activare a complementului este inhibată cu un agent depletor pe bază de factor din venin de cobră (CVF) şi un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului (antagonist al C5aR) (fig. 16A) într-un model experimental de reacţie Schwartzman localizată a coagulării intravasculare diseminate, cum se descrie în exemplul 15;

fig. 17 - ilustrarea grafică a nivelelor azotului de uree din sânge (BUN) măsurate fie la şobolanii recipienţi de transplant WT (+/+) (B6), sau MASP-2 (-/-) ai rinichilor de la donatori WT (+/+), cum se descrie în Exemplul 16;

fig. 18 - ilustrarea grafică a procentului supravieţuirii şoarecilor WT (+/+) şi MASP-2 (-/-) în funcţie de numărul de zile după infecţia microbiană în modelul experimental de ligare şi puncţie cecală (CLP), cum se descrie în Exemplul 17;

fig. 19 - ilustrarea grafică a numărului de bacterii, măsurate la şoarecii WT (+/+) şi MASP-2 (-/-) după infecţia microbiană în modelul experimental de ligare şi puncţie cecală (CLP), cum se descrie în Exemplul 17;

fig. 20 - graficul Kaplan-Mayer, care ilustrează procentul de supravieţuire a şoarecilor WT (+/+), MASP-2 (-/-) şi C3 (-/-) peste şase zile după provocarea cu administrare intranazală de Pseudomonas aeruginosa, cum se descrie în Exemplul 18;

fig. 21 - ilustrarea grafică a nivelul depunerii de C4b, măsurat ca procent de control, în probele prelevate la momente diferite după administrarea subcutanată a 0,3 mg/kg sau 1,0 mg/kg de anticorp monoclonal anti-MASP-2 murină la şoarecii WT, cum se descrie în Exemplul 19;

fig. 22 - ilustrarea grafică a nivelul depunerii de C4b, măsurat ca procent de control, în probele prelevate la momente diferite după administrarea intraperitonelă a 0,6 mg/kg de anticorp monoclonal anti-MASP-2 murină la şoarecii WT, cum se descrie în Exemplul 19;

fig. 23 - ilustrarea grafică a volumului mediu de neovascularizare coroidală (CNV) în ziua a şapte după leziunea indusă cu laser la şoarecii WT (+/+) pretrataţi cu o singură injecţie intraperitoneală de 0,3 mg/kg sau 1,0 mg/kg de anticorp monoclonal anti-MASP-2 murină, aşa cum se descrie în Exemplul 20;

fig. 24A - ilustrarea grafică a procentului supravieţuirii şoarecilor MASP-2 (-/-) şi WT (+/+) după infectare cu 5x108/100 µl UFC de N. meningitidis, cum se descrie în Exemplul 21;

fig. 24B - ilustrarea grafică a semnificaţiei log unităţii formatoare de colonii (UFC)/ml de N. meningitidis recuperate la momente diferite de timp în probele de sânge prelevate de la şoarecii MASP-2 KO (-/-) şi WT (+/+) infectaţi cu 5x108 UFC/100 µl N. meningitidis, cum se descrie în Exemplul 21;

fig. 25A - ilustrarea grafică a procentului supravieţuirii şoarecilor MASP-2 KO (-/-) şi WT (+/+) după infectare cu 2x108 UFC/100 µl N. meningitidis, aşa cum se descrie în Exemplul 21;

fig. 25B - ilustrarea grafică a semnificaţiei log UFC/ml de N. meningitidis recuperate la momente diferite de timp în probele de sânge prelevate de la şoarecii WT (+/+) infectaţi cu 2x108 UFC/100 µl N. meningitidis, cum se descrie în Exemplul 21;

fig. 25C - ilustrarea grafică a semnificaţiei log UFC/ml de N. meningitidis recuperate la momente diferite de timp în probele de sânge prelevate de la şoarecii MASP-2 KO (-/-)infectaţi cu 2x108 UFC/100 µl N. meningitidis, cum se descrie în Exemplul 21;

fig. 26A - ilustrarea grafică a rezultatelor testului de depunere C3b, care demonstrează că şoarecii MASP-2 (-/-) păstrează o cale clasică funcţională, cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 26B - ilustrarea grafică a rezultatelor testului de depunere C3b pe plăcile acoperite cu zimosan, demonstrând că şoarecii MASP-2 (-/-) păstrează o cale alternativă funcţională, cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 27A - ilustrarea grafică a pierderii tisulare induse de ischemia miocardică/leziunea de reperfuzie (MIRI) după ligarea ramificaţiei anterioare stângi a arterei coronare (LAD) şi reperfuziei la şoarecii C4 (-/-) (n = 6) şi pentru control la animalele WT unipare (n = 7), care prezintă zona de risc (AAR) şi mărimea infarctului (INF) cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 27B - ilustrarea grafică a dependenţei mărimii infarctului (INF) de zona de risc (AAR) la şoarecii C4 (-/-) şi WT, trataţi cum se descrie în fig. 42A, demonstrând că şoarecii C4 (-/-) sunt la fel de susceptibili la MIRI, ca şi şoarecii folosiţi pentru control WT (linie punctată), cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 28A - ilustrarea grafică a rezultatelor unui test de depunere a C3b utilizând serul de la şoareci WT, şoareci C4 (-/-) şi ser de la şoareci C4 (-/-) preincubaţi cu manan, cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 28B - ilustrarea grafică a rezultatelor unui test de depunere a C3b în ser de la şoareci WT, C4 (-/-) şi MASP-2 (-/-) amestecat cu diferite concentraţii de fragment mAb al anticorpului anti-MASP-2 murină (mAbM11), cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 28C - ilustrarea grafică a rezultatelor unui test de depunere a C3b în ser uman de la subiecţi WT (C4 suficienţi) şi ser cu deficienţă de C4 şi în ser de la subiecţii cu deficienţă de C4, preincubat cu manan, cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 28D - ilustrarea grafică a rezultatelor unui test de depunere a C3b în ser uman de la subiecţi WT (C4 suficienţi) şi C4 deficienţi amestecat cu fragment mAb al anticorpului uman anti-MASP-2 (mAbH3), cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 29A - ilustrarea grafică a analizei comparative a activităţii C3 convertazei în plasma de la diferite tulpini de şoareci cu deficit de complement, testate fie în condiţii de testare specifice pentru calea lectinei de activare, sau în condiţii de testare specifică pentru calea clasică de activare, cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 29B - ilustrarea grafică a cineticii rezolvării în timp a activităţii C3 convertazei în plasma de la diferite tulpini de şoareci cu deficit de complement, testate în condiţii specifice pentru calea lectinei de activare, cum se descrie în Exemplul 22;

fig. 30 - rezultatele Western blotingului, care demonstrează activarea C3 umană, arătată prin prezenţa lanţului a', prin substraturile de trombină FXIa şi FXa, cum se descrie în Exemplul 23;

fig. 31 - rezultatele testului de depunere a C3 în probele de ser obţinute de la şoarecii WT, MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11 (-/-)/C4(-/-) şi C4(-/-), aşa cum se descrie în Exemplul 23;

fig. 32A - graficul supravieţuirii Kaplain-Meier, care prezintă procentul supravieţuirii, în funcţie de timp după expunerea la o radiaţie de 7,0 Gy, a şoarecilor de control şi a şoarecilor trataţi cu anticorp anti-MASP-2 murină (mAbM11) sau cu anticorp anti-MASP-2 umană (mAbH6), cum se descrie în Exemplul 29;

fig. 32B - graficul supravieţuirii Kaplain-Meier, care prezintă procentul supravieţuirii, în funcţie de timp după expunerea la o radiaţie de 6,5 Gy, a şoarecilor de control şi a şoarecilor trataţi cu anticorp anti-MASP-2 murină (mAbM11) sau anticorp anti-MASP-2 umană (mAbH6), cum se descrie în Exemplul 29;

fig. 33 - graficul supravieţuirii Kaplain-Meier, care prezintă procentul supravieţuirii şoarecilor MASP-2 KO şi WT după administrarea unei doze infecţioase de 2,6 x 107 UFC de N. meningitidis serogrupa A Z2491, demonstrând că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi de mortalitatea indusă de N. meningitidis, aşa cum se descrie în Exemplul 30;

fig. 34 - graficul supravieţuirii Kaplain-Meier, care prezintă procentul supravieţuirii şoarecilor MASP-2 KO şi WT după administrarea unei doze infecţioase de 6 x 106 UFC de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58, demonstrând că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi de mortalitatea indusă de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58, aşa cum se descrie în Exemplul 30;

fig. 35 - ilustrarea grafică a semnificaţiei log UFC/ml de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58, recuperată la diferite momente de timp, în probele de sânge prelevate de la şoarecii MASP-2 KO şi WT după infectare intraperitoneală cu 6x106 UFC de N. meningitidis serogrupa B tulpină MC58 (n = 3 la momente diferite de timp pentru ambele grupe de şoareci, rezultatele sunt exprimate ca valoare medie ± SEM), demonstrând că, deşi şoarecii MOSP-2 KO au fost infectaţi cu aceeaşi doză de N. meningitidis serogrupa B tulpină MC58, ca şi şoareci WT, şoarecii MASP-2 KO au un clearance mai înalt al bacteremiei, comparativ cu şoarecii WT, cum se descrie în Exemplul 30;

fig. 36 - ilustrarea grafică a valorilor medii ale scorului morbidităţii la şoarecii MASP-2 şi WT peste 3, 6, 12 şi 24 de ore după infectare cu 6x106 UFC/100 µl de N. meningitidis serogrupa B tulpină MC58, demonstrând că şoarecii cu deficit de MASP-2 prezentă rezistenţa la infecţie, cu scoruri ale morbidităţii mult mai joase peste 6 ore, cum se descrie în Exemplul 30;

fig. 37 - graficul supravieţuirii Kaplain-Meier, care prezintă procentul supravieţuirii şoarecilor după administrarea unei doze infecţioase de 4 x 106 µl UFC de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58, urmate de administrarea peste 3 ore după infectare fie a anticorpului inhibitor al MASP-2 (1 mg/kg) sau a anticorpului izotip de control, demonstrând că anticorpul anti-MASP-2 este eficient pentru tratarea şi îmbunătăţirea supravieţuirii la subiecţii infectaţi cu N. meningitidis, cum se descrie în Exemplul 31;

fig. 38 - ilustrarea grafică a semnificaţiei log UFC/ml de culturi viabile de N. meningitidis serogrupa B-MC58, recuperate la diferite intervale de timp în concentraţie de 20% ser uman după infectare intraperitoneală cu 6,5x106 UFC/100 µl de tulpină N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58 peste 0, 30, 60 şi 90 de minute după incubare în prezenţa: (A) serului uman normal (NHS) plus anticorp anti-MASP-2 uman; (B) serului uman normal (NHS) plus anticorp izotip de control; (C) MBL -/- ser uman; (D) serului uman normal (NHS) şi (E) serului uman normal inactivat prin încălzire (NHS), care arată că uciderea dependentă de complement a N. meningitidis în serul uman este semnificativ mai manifestă la adiţia anticorpului anti-MASP-2 uman, cum se descrie în Exemplul 32;

fig. 39 - ilustrarea grafică a semnificaţiei log UFC/ml de culturi viabile de N. meningitidis serogrupa B-MC58, recuperate la diferite intervale de timp în probele de ser de şoarece, demonstrând că în serul şoarecilor MASP-2 -/- este prezent un nivel mai înalt de activitate bactericidă în ceea ce priveşte N. meningitidis, decât în serul şoarecilor WT, cum se descrie în Exemplul 32;

fig. 40 - graficul hemolizei (determinat prin eliberarea hemoglobinei din eritrocitele lizate de şoarece (Crry/C3 -/-) în supernatant, măsurată prin fotometrie) eritrocitelor murine acoperite cu manan sub acţiunea serului uman într-o varietate de concentraţii serice. Serurile testate includ: ser (HI) NHS inactivat termic, MBL -/-, NHS +anticorp anti-MASP-2 şi NHS pentru control, cum se descrie în Exemplul 33;

fig. 41 - graficul hemolizei (determinat prin eliberarea hemoglobinei din eritrocitele lizate de şoarece WT în supernatant, măsurată prin fotometrie) eritrocitelor murine neacoperite neacoperite cu manan sub acţiunea serului uman într-o varietate de concentraţii serice. Serurile testate includ: ser (HI) NHS inactivat termic, MBL -/-, NHS +anticorp anti-MASP-2 şi NHS pentru control, demonstrând că inhibarea MASP-2 inhibă liza mediată de complement a eritrocitelor murine WT nesensibilizate, cum se descrie în Exemplul 33;

fig. 42 - graficul hemolizei (determinat prin eliberarea hemoglobinei din eritrocitele lizate de şoarece (CD55/59 -/-) în supernatant, măsurată prin fotometrie) eritrocitelor murine neacoperite sub acţiunea serului uman într-o varietate de concentraţii serice. Serurile testate include: ser (HI) inactivat termic NHS, MBL -/-, NHS +anticorp anti-MASP-2 şi NHS pentru control, aşa cum se descrie în Exemplul 33;

fig. 43 - graficul procentului supravieţuiri în funcţie de timp (zile) după expunere la o radiaţie de 8 Gy la şoarecii de control şi la şoarecii trataţi cu anticorp MASP-2 anti-uman (mAbH6), cum se descrie în Exemplul 34;

fig. 44 - graficul timpului apariţiei ocluziunii microvasculare după injectarea lipopolizaharidei (LPS) la şoarecii MASP-2 -/- şi WT, arătând procentul şoarecilor cu formarea trombului, măsurat peste 60 de minute, demonstrând că formarea trombilor este detectată peste 15 minute la şoarecii WT, până la 80% din şoarecii WT demonstrând formarea de trombi peste 60 de minute; în contrast, niciunul dintre şoarecii MASP-2 -/- nu a prezentat formare de trombi în timp de 60 minute (criteriul log de rang: p = 0,0005), cum se descrie în Exemplul 35;

fig. 45 - graficul procentului supravieţuirii şoarecilor de control trataţi cu soluţie fiziologică (n = 5) şi a şoarecilor trataţi cu anticorpi anti-MASP-2 (n = 5) în modelul experimental de HUS indus cu STX/LPS în funcţie de timp (ore), demonstrând că toţi şoarecii de control au murit timp de 42 de ore, în timp ce, în contrast, 100% din şoarecii trataţi cu anticorpi anti-MASP-2 au supravieţuit pe tot parcursul experimentului, cum se descrie în Exemplul 36;

fig. 46 - graficul, în funcţie de timp după inducerea leziunii, al procentului şoarecilor cu ocluzie microvasculară în modelul experimental de iradiere UV fluoresceină izocianat/dextran (FITC/dextran UV) după tratamentul cu anticorp izotip de control sau cu anticorp mAbH6 uman anti-MASP-2 (10 mg/kg), administrat la 16 ore şi cu 1 oră înainte de injectarea FITC/Dextranului, cum se descrie în Exemplul 37;

fig. 47 - graficul timpului ocluziei în minute pentru şoarecii trataţi cu anticorpul anti-MASP-2 uman (mAbH6) şi anticorpul izotip de control, în care datele sunt raportate ca puncte de dispersare cu valori medii (bare orizontale) şi bare standard de eroare (bare verticale). Testul statistic, folosit pentru analiză, este t testul Student pentru o selecţie; în care simbolul "*" indică p = 0,0129, cum se descrie în Exemplul 37; şi

fig. 48 - graficul timpului până la ocluzie în minute pentru şoarecii de tip sălbatic, şoarecii MASP-2 KO şi şoarecii de tip sălbatic pretrataţi cu anticorp anti-MASP-2 umană (mAbH6) administrat intraperitoneal în cantitate de 10 mg/kg cu 16 ore înainte şi încă cu o oră înainte de inducerea trombozei într-un model de leziune a celulelor endoteliale, indusă cu FITC-dextran/lumină de intensitate joasă (800-1500), cum se descrie în Exemplul 37;

fig. 49 - graficul Kaplan-Meier, care prezintă procentul şoarecilor cu trombi în funcţie de timp în microangiopatia trombotică indusă cu FITC-Dextran la şoarecii trataţi cu doze crescânde anticorp inhibitor al MASP-2 uman (mAbH6) sau de anticorp izotip de control, cum se descrie în Exemplul 39;

fig. 50 - graficul timpului mediu până la debutul (minute) formării trombilor în funcţie de doza de mAbH6 (*p <0,01 comparativ cu controlul), cum se descrie în Exemplul 39;

fig. 51 - graficul Kaplan-Meier, care prezintă procentul de şoareci cu ocluzie microvasculară în funcţie de timp în microangiopatia trombotică indusă de FITC-Dextran la şoarecii trataţi cu doze crescânde anticorp inhibitor al MASP-2 uman (mAbH6) sau de anticorp izotip de control, cum se descrie în Exemplul 39;

fig. 52 - graficul timpului mediu până la ocluzia microvasculară în funcţie de doza de mAbH6 (* p <0,05 în comparaţie cu controlul), cum se descrie în Exemplul 39;

fig. 53A - graficul nivelului depunerii de MAC în prezenţa sau în absenţa anticorpului monoclonal (OMS646) uman anti-MASP-2 în condiţii de testare specifice pentru calea lectinei, demonstrând că OMS646 inhibă depunerea MAC, mediată de lectină, cu o valoare IC50 de aproximativ 1 nM, cum se descrie în Exemplul 40;

fig. 53B - graficul nivelului depunerii MAC în prezenţa sau în absenţa anticorpului monoclonal (OMS646) uman anti-MASP-2 în condiţii de testare specifice pentru calea clasică, demonstrând că OMS646 nu inhibă depunerea MAC, mediată de calea clasică, cum se descrie în Exemplul 40 ;

fig. 53C - graficul nivelului depunerii MAC în prezenţa sau în absenţa anticorpului monoclonal (OMS646) uman anti-MASP-2 în condiţii de testare specifice pentru calea alternativă, demonstrând că OMS646 nu inhibă depunerea MAC, mediată de calea alternativă, cum se descrie în Exemplul 40 ;

fig. 54 - graficul profilului farmacocinetic (PK) al anticorpului monoclonal (OMS646) uman anti-MASP-2 la şoareci, prezentând concentraţia de OMS646 (valoarea medie n=3 animale/grupe) în funcţie de timp după administrarea dozei indicate, cum se descrie în Exemplul 40;

fig. 55A - graficul răspunsului farmacodinamic (PD) al anticorpului monoclonal (OMS646) uman anti-MASP-2, măsurat ca o reducere a activităţii sistemice a căii lectinei la şoareci după administrare intravenoasă, cum se descrie în Exemplul 40;

fig. 55B - graficul răspunsului farmacodinamic (PD) al anticorpului monoclonal (OMS646) uman anti-MASP-2, măsurat ca o reducere a activităţii sistemice a căii lectinei la şoareci după administrare subcutanată, cum se descrie în Exemplul 40;

fig. 56 - graficul efectului inhibitor al anticorpului anti-MASP-2 (OMS646), comparativ cu sCR1 asupra depunerii C5b-9, indusă de serul aHUS pe celulele HMEC-1 ADP-activate, cum se descrie în Exemplul 41;

fig. 57 - graficul efectului inhibitor al anticorpului anti-MASP-2 (OMS646), comparativ cu sCR1 asupra formării trombului, indusă de serul aHUS pe celulele HMEC-1 ADP-activate, cum se descrie în Exemplul 42;

fig. 58 - graficul modificării medii a numărului de trombocite, în funcţie de momentul iniţial de timp (săptămâni) la subiecţii, care suferă de microangiopatie trombotică asociată cu transplant de celule stem hematopoietice (HSCT-TMA), după tratamentul cu anticorp (OMS646) inhibitor al MASP-2, cum se descrie în Exemplul 46;

fig. 59 - graficului modificării medii a lactatdehidrogenazei (LDH), în funcţie de momentul iniţial de timp (săptămâni) la subiecţii, care suferă de HSCT-TMA persistentă după tratamentul cu anticorp (OMS646) inhibitor al MASP-2, cum se descrie în Exemplul 46; şi

fig. 60 - graficul modificării medii a haptoglobinei în funcţie de momentul iniţial de timp (săptămâni) la subiecţii, care suferă de HSCT-TMA după tratamentul cu anticorp (OMS646) inhibitor al MASP-2, cum se descrie în Exemplul 46.

DESCRIEREA LISTEI SEcvENŢELOR

SEQ ID NO:1 ADNc al MAp19 umane

SEQ ID NO:2 proteina MAp19 umană (cu secvenţa lider)

SEQ ID NO:3 proteina MAp19 umană (matură)

SEQ ID NO:4 ADNc al MASP-2 umane

SEQ ID NO:5 proteina MASP-2 umană (cu secvenţa lider)

SEQ ID NO:6 proteina MASP-2 umană (matură)

SEQ ID NO:7 ADN genomic al MASP-2 umane (exonii 1-6)

ANTIGENE: (REFERITOARE LA PROTEINA MASP-2 MATURĂ)

SEQ ID NO:8 secvenţa domeniului CUBI (aa 1-121)

SEQ ID NO:9 secvenţa domeniului CUBEGF (aa 1-166)

SEQ ID NO:10 CUBEGFCUBII (aa 1-293)

SEQ ID NO:11 regiunea EGF (aa 122-166)

SEQ ID NO:12 domeniul serin-proteazei (aa 429 - 671)

SEQ ID NO:13 domeniul serin-proteazei inactivat (aa 610-625 cu mutaţia Ser618 în Ala)

SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL (peptide domeniului CUB1)

SEQ ID NO:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ (peptida domeniului CUBI)

SEQ ID NO:16 TFRSDYSN (nucleul regiunii, care leagă MBL)

SEQ ID NO:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF (nucleul regiunii, care leagă MBL)

SEQ ID NO:18 IDECQVAPG (PEPTIDA EGF)

SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV (nucleul, care leagă serin-proteaza)

INHIBITORI AI PEPTIDELOR:

SEQ ID NO:20 ADNc MBL cu lungime completă

SEQ ID NO:21 proteina MBL cu lungime completă

SEQ ID NO:22 OGK-X-GP (consensus de legare)

SEQ ID NO:23 OGKLG

SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G

SEQ ID NO:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO

SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG

SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO (H-ficolina umană)

SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO (ficolina p35 umană)

SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI (site de scindare C4)

INHIBITORII EXPRESIEI:

SEQ ID NO:30 ADNc al domeniului CUBI-EGF (nucleotidele 22-680 din SEQ ID NO:4)

SEQ ID NO:31

5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3' Nucleotidele 12-45 din SEQ ID NO:4 inclusiv site-ul de iniţiere a translării MASP-2 (sens)

SEQ ID NO:32

5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3' Nucleotidele 361-396 în SEQ ID NO:4, care codifică regiunea, care conţine siteul de legare a MASP-2 MBL (sens)

SEQ ID NO:33

5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3' Nucleotidele 610-642 în SEQ ID NO:4, care codifică regiunea, care conţine domeniul CUBII

PRIMERII DE CLONARE:

SEQ ID NO:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC (5' PCR pentru CUB)

SEQ ID NO:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA (3' PCR pentru CUB)

SEQ ID NO:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT (3' PCR pentru CUBIEGF)

SEQ ID NO:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT (3' PCR pentru CUBIEGFCUBII)

SEQ ID NOS:38-47 reprezintă primerii de clonare pentru anticorpii umanizaţi

SEQ ID NO:48 reprezintă o legătură peptide din 9 aminoacizi

VECTOR DE EXPRESIE:

SEQ ID NO:49 reprezintă o inserţie minigenă MASP-2

SEQ ID NO: 50 reprezintă ADNc MASP-2 murină

SEQ ID NO: 51 reprezintă o proteină MASP-2 murină (cu secvenţă lider)

SEQ ID NO: 52 reprezintă o proteină MASP-2 murină matură

SEQ ID NO: 53 reprezintă ADNc MASP-2 de şobolan

SEQ ID NO: 54 reprezintă o proteină MASP-2 de şobolan (cu secvenţă lider)

SEQ ID NO: 55 reprezintă o proteină MASP-2 de şobolan matură

SEQ ID NO: 56-59 reprezintă oligonucleotide pentru mutageneza site-direcţionată a MASP-2 murine, utilizate pentru generarea MASP-2A umane

SEQ ID NO: 60-63 reprezintă oligonucleotide pentru mutageneza site-direcţionată a MASP-2 murine, utilizate pentru generarea MASP-2A murine

SEQ ID NO: 64-65 reprezintă oligonucleotide pentru mutageneza site-direcţionată a MASP-2 de şobolan, utilizate pentru generarea MASP-2A de şobolan

SEQ ID NO: 66 AND, care codifică regiunea variabilă a lanţului greu (VH) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) (fără peptida de semnalizare)

SEQ ID NO: 67 polipeptida regiunii variabile (VH) a lanţului greu 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)

SEQ ID NO: 68 polipeptida regiunii variabile (VH) a lanţului greu 17N16mc

SEQ ID NO: 69: ADN, care codifică regiunea variabilă a lanţului uşor (VL) 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)

SEQ ID NO: 70: polipeptida regiunii variabile (VL) a lanţului uşor 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)

SEQ ID NO: 71: polipeptida regiunii variabile (VL) a lanţului uşor 17N16_dc17N9

Prezenta invenţie se bazează pe descoperirea surprinzătoare de către inventatorii prezentei invenţii a posibilităţii inhibării căii lectinei MASP-2 mediate, menţinând în acelaşi timp calea clasică intactă. Prezenta invenţie descrie, de asemenea, utilizarea MASP-2 în calitate de o ţintă terapeutică pentru inhibarea deteriorării celulare asociate cu activarea căii complementului mediate de lectină, menţinând intactă componenta căii clasice (dependentă de C1q) a sistemului imun.

I. DEFINIŢII

Cu excepţia cazului în care se defineşte în mod specific aici, toţi termenii utilizaţi aici au aceiaşi semnificaţie, înţeleasă de specialiştii în domeniul tehnicii prezentei invenţii. Următoarele definiţii sunt prezentate pentru a oferi claritate cu privire la termenii, aşa cum sunt utilizaţi în descriere şi revendicări pentru a descrie prezenta invenţie.

Aşa cum se utilizează aici, termenul "activarea complementului dependentă de MASP-2" cuprinde activarea dependentă de MASP-2 a căii lectinei, care se produce în condiţii fiziologice (adică, în prezenţa Ca ++), conducând la formarea C3 convertazei C4b2a a căii lectinei şi, după acumularea C3b, a produsului de scindare a C3, la formarea C5 convertazei C4b2a(C3b)n, care s-a constatat, că este prima cauză a opsonizării.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "cale alternativă" se referă la activarea complementului care este declanşată, de exemplu, de zimosanul din pereţii celulari ai fungilor şi de drojdie, lipopolizaharida (LPS) din membranele externe ale microbilor Gram negativi şi eritrocitele de iepure, precum şi de multe polizaharide pure, eritrocite de iepure, virusuri, bacterii, celule tumorale animale, paraziţi şi celule deteriorate şi care se crede în mod tradiţional că provin din generarea proteolitică spontană a C3b din factorul complementului C3.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "calea lectinei" se referă la activarea complementului, care se produce prin legarea specifică a proteinelor serice şi non-serice de legare a carbohidraţilor, incluzând lectina fixatoare de manoză (MBL), CL-11 şi ficolinele (H-ficolină, M-ficolină sau L-ficolină).

Aşa cum este utilizat aici, termenul "cale clasică" se referă la activarea complementului, care se declanşează de anticorpul legat la o particulă străină şi pentru care este necesară legarea moleculei de recunoaştere C1q.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "agent inhibitor al MASP-2" se referă la orice agent care se leagă sau direct interacţionează cu MASP-2 şi inhibă eficient activarea complementului dependentă de MASP2, incluzând anticorpi anti-MASP-2 şi fragmente de legare MASP-2 ale acestora, peptide naturale şi sintetice, compuşi micromoleculari, receptori MASP-2 solubili, inhibitori de expresie şi inhibitori naturali izolaţi şi includ, de asemenea, peptide care concurează cu MASP-2 pentru legarea la o altă moleculă de recunoaştere (de exemplu, MBL, H-ficolină, M-ficolină sau L-ficolină) în calea lectinei, dar nu cuprinde anticorpi care se leagă de astfel de alte molecule de recunoaştere. Agenţii inhibitori ai MASP-2, utili în metoda prezentei invenţii, pot reduce activarea complementului dependentă de MASP-2 mai mult de 20%, cum ar fi mai mult de 50%, cum ar fi mai mult de 90%. Într-o variantă de realizare agentul inhibitor MASP-2 reduce activarea complementului dependentă de MASP2 mai mult de 90% (adică rezultă cu activarea complementului MASP-2 de numai 10% sau mai puţin).

Aşa cum este utilizat aici, termenul "anticorp" cuprinde anticorpi şi fragmente de anticorpi ai acestora, derivate de la orice mamifer producător de anticorpi (de exemplu, şoarece, şobolan, iepure şi primat, incluzând omul) sau dintr-un hibridom, selecţie de fagi, expresie recombinantă sau animale transgenice (sau alte metode producere a anticorpilor sau a fragmentelor de anticorpi"), care se leagă în mod specific la o polipeptidă ţintă, cum ar fi, de exemplu, polipeptidele MASP-2 sau porţiuni ale acestora. Nu se intenţionează de a limita termenul "anticorp" în ceea ce priveşte sursa anticorpului sau modul în care acesta este produs (de exemplu, din hibridom, selecţie de fagi, expresie recombinantă, animal transgenic, sinteza peptidelor, etc.). Exemplele de anticorpi includ: anticorpi policlonali, monoclonali şi recombinanţi; anticorpi pan-specifici, multispecifici (de exemplu, anticorpi bispecifici, anticorpi trispecifici); anticorpi umanizaţi; anticorpi murini; chimerici, murini-umani, murini-primate, anticorpi monoclonali umani-primate şi anticorpi anti-idiotip şi poate fi orice anticorp intact sau fragment al acestuia. Aşa cum este utilizat aici, termenul "anticorp" cuprinde nu numai anticorpi policlonali sau monoclonali intacţi, ci şi fragmente ale acestora (cum ar fi dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), lanţuri unice (ScFv), variante sintetice ale acestora, variante prezente în mod natural, proteine de fuziune cuprinzând o porţiune de anticorp cu un fragment de legare a antigenului cu specificitate cerută, anticorpi umanizaţi, anticorpi himerici şi orice altă configuraţie modificată a moleculei de imunoglobulină, care cuprinde un situs sau un fragment de legare a antigenului (situs de recunoaştere a epitopului) cu specificitate cerută.

Un "anticorp monoclonal" se referă la o populaţie de anticorpi omogeni, în care anticorpul monoclonal este compus din aminoacizi (care apar natural şi non-natural) şi care sunt implicaţi în legarea selectivă a unui epitop. Anticorpii monoclonali sunt foarte specifici pentru antigenul ţintă. Termenul "anticorp monoclonal" cuprinde nu numai anticorpi monoclonali intacţi şi anticorpi monoclonali cu lungime completă, ci şi fragmente ale acestora (cum ar fi Fab, Fab', F(ab')2, Fv), lanţuri unice (ScFv), variante ale acestora, proteine de fuziune cuprinzând o porţiune de anticorp cu un fragment de legare a antigenului, anticorpi monoclonali umanizaţi, anticorpi monoclonali himerici şi orice altă configuraţie modificată a moleculei de imunoglobulină, care cuprinde un fragment de legare a antigenului (situs de recunoaştere a epitopului) cu specificitate cerută şi abilitate de a se lega de un epitop. Nu se intenţionează de a limita termenul "anticorp" în ceea ce priveşte sursa anticorpului sau modul în care acesta este produs (de exemplu, din hibridom, selecţie de fagi, expresie recombinantă, animale transgenice, etc.). Termenul include imunoglobuline complete, precum şi fragmente etc., descrise mai sus, sub definiţia "anticorp".

Aşa cum este utilizat aici, termenul "fragment de anticorp" se referă la o porţiune derivată sau care se referă la un anticorp cu lungime completă, cum ar fi, de exemplu, un anticorp anti-MASP2, care cuprinde, în general, regiunea care leagă antigenul sau regiunea variabilă a acestuia. Exemplele ilustrative de fragmente de anticorp includ: fragmentele Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 şi Fv, fragmentele scFv, diacorpi, anticorpi liniari, molecule de anticorpi cu un singur lanţ şi anticorpi multispecifici, formaţi din fragmente de anticorpi.

Aşa cum este utilizat aici, un fragment de anticorp "cu un singur lanţ Fv" sau "scFv" cuprinde domeniile VH şi VL ale unui anticorp, în care aceste domenii sunt prezente într-un singur lanţ polipeptidic. În general, polipeptida Fv cuprinde în plus un linker polipeptidic între domeniile VH şi VL, care permite scFv să formeze structura dezirabilă pentru legarea antigenului.

Aşa cum este utilizat aici, un "anticorp himeric" este o proteină recombinantă, care conţine domenii variabile şi regiuni de determinare a complementarităţii, derivată de la un anticorp de specie non-umană (de exemplu, rozătoare), în timp ce restul moleculei de anticorp derivă dintr-un anticorp uman.

Aşa cum este utilizat aici, un "anticorp umanizat" este un anticorp himeric care cuprinde o secvenţă minimă, care este conformă regiunilor de determinare a complementarităţii specifice, derivate dintr-o imunoglobulină non-umană transplantată într-un cadru de anticorp uman. Anticorpii umanizaţi sunt, de obicei, proteine recombinante în care numai regiunile, care determină complementaritatea anticorpului, sunt de origine non-umană.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "lectină fixatoare de manoză" ("MBL") este echivalent cu proteina fixatoare de manan ("MBP").

Aşa cum este utilizat aici, "complexul de atacare a membranei" ("MAC") se referă la un complex din cele cinci componente terminale ale complementului (C5b combinat cu C6, C7, C8 şi C9), care se inseră şi perturbă membranele (denumit de asemenea C5b-9).

Aşa cum este utilizat aici, "un subiect" include toate mamiferele, incluzând, fără a se limita la oameni, primate non-umane, câini, pisici, cai, oi, capre, vaci, iepuri, porci şi rozătoare.

Aşa cum se utilizează aici, reziduurile aminoacizilor sunt abreviate după cum urmează: alanină (Ala; A), asparagină (Asn; N), acid aspartic (Asp; D), arginină (Arg, R), cisteină (Cys; C), acid glutamic (Glu; E), glutamină (Gln; Q), histidină (His; H), izoleucină (Ile; I); leucină (Leu; L), lizină (Lys; K), metionină (Met; M), fenilalanină (Phe, F), prolină (Pro; P), serină (Ser; S), treonină (Thr; T), triptofan (Trp; W), tirozină (Tyr, Y) şi valină (Val; V).

În sensul cel mai larg, aminoacizii naturali pot fi împărţiţi în grupuri pe baza caracteristicilor chimice ale lanţului lateral al aminoacizilor respectivi. Prin aminoacid "hidrofob" se înţelege fie Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys sau Pro. Prin aminoacid "hidrofil" se înţelege fie Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg, sau His. Această grupare a aminoacizilor poate fi în continuare subclasată după cum urmează. Prin "aminoacid hidrofil neîncărcat" se înţelege fie Ser, Thr, Asn, sau Gln. Prin aminoacid "cu proprietăţi acide" se înţelege fie Glu, sau Asp. Prin aminoacid "cu proprietăţi bazice" se înţelege fie Lys, Arg, sau His.

Aşa cum este utilizat aici, termenul "substituţie conservativă aminoacidă" este ilustrat printr-o substituţie între aminoacizii din fiecare dintre următoarele grupe: (1) glicină, alanină, valină, leucină şi izoleucină, (2) fenilalanină, tirozină şi triptofan, (3) serină şi treonină, (4) aspartat şi glutamat, (5) glutamină şi asparagină şi (6) lizină, arginină şi histidină.

Termenul "oligonucleotidă", aşa cum este utilizat aici, se referă la un oligomer sau polimer al acidului ribonucleic (ARN) sau al acidului dezoxiribonucleic (ADN) sau al mimeticilor acestora. Acest termen cuprinde, de asemenea, acele oligonucleobaze compuse din nucleotide naturale, zaharuri şi legături covalente internucleozide (între lanţurile principale), precum şi oligonucleotidele cu modificări sintetice.

Aşa cum este utilizat aici, un "epitop" se referă la situsul pe o proteină (de exemplu, o proteină MASP-2 umană), care este legată cu un anticorp. "Epitopii suprapuşi" includ cel puţin de un (de exemplu, doi, trei, patru, cinci sau şase) reziduu de aminoacid obişnuit, incluzând epitopi liniari şi neliniari.

Aşa cum este utilizat aici, termenii "polipeptidă", "peptidă" şi "proteină" sunt utilizaţi interschimbabil şi înseamnă orice lanţ legat cu peptidă de aminoacizi, indiferent de lungimea sau modificarea post-translaţională. Proteina MASP-2, descrisă aici, poate conţine sau poate fi o proteină de tip sălbatic sau pot fi variante, care nu au mai mult de 50 (de exemplu, nu mai mult de una, două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 sau 50) substituţii conservative aminoacide. Substituţiile conservative includ de obicei substituţii în următoarele grupe: glicină şi alanină; valină, izoleucină şi leucină; acid aspartic şi acid glutamic; asparagină, glutamină, serină şi treonină; lizina, histidina şi arginina; şi fenilalanină şi tirozină.

În unele variante de realizare proteina MASP-2 umană poate avea o secvenţă de aminoacizi care este identică sau are o identitate ce depăşeşte 70% (de exemplu, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 sau 100%) cu proteina MASP-2 umană având secvenţa de aminoacizi prezentă în SECV ID NR: 5.

În unele exemple de realizare, fragmentele peptidice pot constitui cel puţin de 6 (de exemplu, cel puţin de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 sau 600 sau mai multe) reziduuri de aminoacizi în lungime (de exemplu, cel puţin de 6 reziduuri de aminoacizi substituenţi, descrise în SECV ID NR: 5). În unele variante de realizare un fragment peptidic antigenic al unei proteine MASP-2 umane poate avea o lungime mai mică de 500 (de exemplu mai mică de 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 sau 6) reziduuri de aminoacizi (de exemplu, mai mică de 500 de reziduuri de aminoacizi substituenţi, descrise în secvenţa SECV ID NR: 5).

Procentul (%) identităţii secvenţei de aminoacizi este definit ca procentul aminoacizilor dintr-o secvenţă candidat, care sunt identici cu aminoacizii dintr-o secvenţă de referinţă după alinierea secvenţelor şi, dacă este necesar, introducerea intervalelor, pentru a obţine procentul maxim al identităţii secvenţei. Alinierea în scopul determinării procentului de identitate a secvenţei poate fi realizată în moduri diferite, care sunt cunoscute unui specialist în domeniu, de exemplu, utilizând software de calculator disponibile în mod public, cum ar fi software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 sau Megalign (DNASTAR). Parametrii potriviţi pentru măsurarea alinierii, incluzând orice algoritmi necesari pentru realizarea alinierii maxime pe întreaga lungime a secvenţelor comparate, pot fi determinaţi prin metode cunoscute.

II. Descrierea generală a invenţiei

Lectinele (MBL, M-ficolina, H-ficolina, L-ficolina şi CL-11) sunt molecule specifice de recunoaştere, care declanşează sistemul complementului congenital, iar sistemul include calea lectinei de iniţiere şi bucla de amplificare a căii terminale asociată cu aceasta, care amplifică activarea iniţiată de lectină a moleculelor efectoare de terminale. C1q reprezintă o molecula specifică de recunoaştere, care iniţiază sistemul complementului dobândit şi acest sistem include calea clasică de iniţiere şi bucla de amplificare a căii terminale asociată cu aceasta, care amplifică activarea C1q iniţiată a moleculelor efectoare terminale. Aceste două sisteme majore de activare a complementului sunt denumite sistem al complementului dependent de lectină şi, respectiv, sistem al complementului dependent de C1q.

Adiţional la rolul său esenţial în apărarea imună, sistemul complementului contribuie la deteriorarea ţesuturilor în numeroase stări clinice. Astfel, există o necesitate stringentă de a elabora inhibitori ai complementului terapeutic eficienţi pentru a preveni aceste efecte adverse. Recunoscând faptul, că este posibilă inhibarea căii lectinei mediate de MASP-2, în timp ce calea clasică se menţine intactă, se constată că ar fi extrem de dezirabilă inhibarea specifică numai a sistemului de activare a complementului, care cauzează o patologie concretă fără sistarea completă a capacităţilor de apărare imună ale complementului. De exemplu, în stările de boală în care activarea complementului este mediată predominant de sistemul complementului dependent de lectină, ar fi avantajoasă inhibarea specifică numai a acestui sistem. Aceasta ar menţine intact sistemul de activare a complementului dependent de C1q, care reglează procesarea complexelor imune şi contribuie la apărarea organismului-gazdă de infecţii.

Componenta proteică, preferată pentru direcţionarea elaborării agenţilor terapeutici în vederea inhibării specifice a sistemului complementului dependent de lectină, este MASP-2. Dintre toate componentele proteice cunoscute ale sistemului complementului dependent de lectină (MBL, H-ficolină, M-ficolină, L-ficolină, MASP-2, C2-C9, Factorul B, Factorul D şi properdina) numai MASP-2 este atât unică pentru sistemul complementului dependent de lectină, cât şi pentru funcţionarea sistemului. Lectinele (MBL, H-ficolina, M-ficolina, L-ficolina şi CL-11) sunt, de asemenea, componente unice în sistemul complementului dependent de lectină. Cu toate acestea, pierderea oricărei dintre componentele lectinei nu necesar ar împiedica activarea sistemului datorită cantităţii excesive de lectină. Pentru a garanta inhibarea activării sistemului complementului dependente de lectină ar fi necesară inhibarea a tuturor celor cinci lectine. Mai mult decât atât, deoarece MBL şi ficolinele sunt, de asemenea, cunoscute ca având activitate opsonică independentă de complement, inhibarea funcţiei lectinei ar conduce la pierderea acestui mecanism benefic de protecţie a organismului-gazdă de infecţie. Dimpotrivă, această activitate opsonică a lectinei, dependentă de complement, va rămâne intactă în cazul, în care MASP-2 ar fi ţinta de inhibare a activării căii lectinei. Un avantaj suplimentar al MASP-2 ca ţinta terapeutică de inhibare a activării sistemului complementului dependentă de lectină este acela, că concentraţia plasmatică de MASP-2, comparativ cu orice alte proteine ale complementului, este cea mai joasă (≈ 500 ng/ml); prin urmare, pentru atingerea inhibării complete vor fi suficiente, respectiv, concentraţii joase de inhibitori cu afinitate înaltă ai MASP-2 (Moller Kristensen, M. şi colab., J. Immunol Metods 282: 159-167, 2003).

III. ROLUL MASP-2 ÎN MICROANGIOPATIILE TROMBOTICE ŞI METODELE TERAPEUTICE DE UTILIZARE A AGENŢILOR DE INHIBARE AI MASP-2

Microangiopatia trombotică (TMA) este o patologie caracterizată prin prezenţa cheaguri de sânge în vasele de sânge mici (Benz, K .; et al., Curr Opin Nephrol Hypertens 19 (3): 242-7 (2010)). Se consideră, că factorul principal este stresul sau leziunea endoteliului vascular. Tabloul clinic şi datele de laborator în TMA includ trombocitopenie, anemie, purpură şi insuficienţă renală. Exemplele de TMA clasice includ sindromul hemolitic uremic (HUS) şi purpura trombotică trombocitopenică (TTP). O particularitate patologică caracteristică a TMA este activarea plachetară şi formarea de microtrombi în arteriolele şi venulele mici. Activarea complementului iniţiată, cel puţin de parţial, de o leziune sau stres la nivelul endoteliului microvascular este implicată şi în alte TMA, incluzând sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS), boala Degos sistemică şi TMA asociată cancerului, chimioterapiei şi transplantului.

Dovada directă a rolului patologic al complementului într-o serie de nefrite se datorează studiilor efectuate la pacienţii cu deficienţe genetice în componentele specifice ale complementului. Un şir de rapoarte au evidenţiat asocierea leziunii renale cu deficienţe ale factorului H de reglare a complementului (Ault, BH, Nephrol., 14: 1045-1053, 2000; Levy, M. et al., Kidney Int. 30: 949-56, 1986; Pickering, M.C. et al., Nat Genet., 31: 424 8, 2002). Deficitul de factor H rezultă cu reducerea concentraţiilor plasmatice ale factorilor B şi C3 datorită consumului, asociat activării, al acestor componente. Nivelurile circulante de C5b9 sunt, de asemenea, înalte în serul acestor pacienţi, ceea ce indică indirect activarea complementului. Glomerulonefrita membranoproliferativă (MPGN) şi sindromul hemolitic uremic idiopatic (HUS) se asociază cu un deficit de factor H sau cu mutaţii ale factorului H. Porcinele cu deficit de factor H (Jansen, J.H. et al., Kidney Int. 53: 331-49, 1998) şi şoarecii cu knock-out al factorului H (Pickering, M.C., 2002) manifestă simptome asemănătoare MPGN, confirmând importanţa factorului H în reglarea complementului. Deficitul altor componente ale complementului se asociază cu boala renală, asociată dezvoltării lupusului eritematos sistemic (SLE) (Walport, M.J., Davies et al., Ann.NY.Acad.Sci.815: 267-81, 1997). Deficitul de C1q, C4 şi C2 predispune la dezvoltarea SLE prin mecanisme legate de eliberarea defectă a complexelor imune şi a materialului apoptotic. La mulţi dintre aceşti pacienţi cu SLE apare nefrită de lupus, caracterizată prin depunerea complexelor imune pe întreaga suprafaţă a glomerulului.

aHUS

Sindromul hemolitic uremic atipic (aHUS) face parte dintr-un grup de afecţiuni numite "microangiopatii trombotice". HUS (aHUS) în forma sa atipică este boala asociată cu reglarea defectuoasă a complementului şi poate fi sporadică sau familială. Cazurile familiale de aHUS sunt asociate cu mutaţii în genele, care codifică activarea complementului sau proteinele reglatoare ale complementului, incluzând factorul complementului H, factorul I, factorul B, cofactorul CD46 membranar, precum şi proteina 1 asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR1) şi proteină 3 asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR3). (Zipfel, P. F. et al., PloS Genetics 3 (3): e41 (2007)). Caracteristica unificatoare a acestei game variate de mutaţii genetice asociate cu aHUS este predispoziţia la activarea sporită a complementului pe suprafeţele celulare sau tisulare. De aceea, un aspect al prezentei invenţii cuprinde tratarea unui pacient, care suferă de aHUS asociat cu o deficienţă a factorului H, prin administrarea unei cantităţi eficiente dintr-un agent inhibitor al MASP-2. Un alt aspect al prezentei invenţii prevede tratarea unui pacient, care suferă de HUS asociat cu deficit de factor I, factor B, cofactor de membrană CD46, CFHR1 sau CFHR3, prin administrarea unei cantităţi eficiente de un agent inhibitor al MASP-2.

În prezent s-au înregistrat progrese semnificative în ceea ce priveşte înţelegerea fiziopatologiei moleculare, bazate pe activarea sporită a complementului în aHUS provocată de diverse seturi de factori mutanţi ai complementului. Acest mecanism este cel mai bine elucidat pentru mutaţiile factorului H. Factorul H reprezintă o proteină serică prezentă în exces, care conţine 20 de domenii scurte de repetări consens (SCR), care acţionează ca un regulator negativ al activării complementului, atât în soluţie, cât şi pe suprafeţele celulelor organismului-gazdă. El ţinteşte forma activată a C3 şi, împreună cu factorul I şi alţi cofactori, promovează inactivarea acesteia, împiedicând activarea ulterioară a complementului. Pentru un control eficient al activării complementului pe suprafeţele celulelor organismului gazdă, factorul H trebuie să interacţioneze cu celulele gazdă, interacţiune mediată de domeniile SCR 16-20. Toate mutaţiile factorului H asociate cu aHUS, descrise până în prezent, sunt grupate în regiunea C-terminală care cuprinde domeniile (SCR) 16-20. Aceste proteine mutante ale factorului H sunt complet funcţionale în controlul activării C3 în soluţie, dar nu pot interacţiona cu suprafeţele celulelor organismului gazdă şi, prin urmare, nu pot controla activarea C3 pe suprafeţele celulare (Exp Med 204 (6): 1249-56 (2007)). Astfel, anumite mutaţii ale factorului H se asociază cu aHUS, deoarece proteina mutant a factorului H nu reuşeşte să interacţioneze cu suprafeţele celulei organismului gazdă şi, astfel, nu poate modula eficient cu reducerea activări complementului pe suprafeţele celulelor organismului gazdă, incluzând şi pe endoteliul microvascular. În consecinţă, imediat ce se produce activarea iniţială a C3, la pacienţii cu mutaţii ale factorului H activarea ulterioară a complementului pe suprafeţele endoteliale microvasculare evoluează fără modificări. Această activare necontrolată a complementului conduce, în cele din urmă, la leziuni progresive ale endoteliului vascular, agregarea trombocitară şi coagularea microvasculară ulterioară şi hemoliza cauzată de stresul direct al pasajului hematiilor prin microvasele parţial ocluzionate. Astfel, manifestările bolii aHUS şi tabloul clinic şi datele de laborator sunt direct determinate de un defect în reglarea negativă a complementului pe suprafaţa endoteliului microvascular.

Analogic mutaţiei factorului H, mutaţiile cu pierderea funcţiei în modulatorul negativ ai complementului, factorul I şi proteina cofactorului membranos (CD46) sunt, de asemenea, legate de aHUS. Contrariul s-a observat pentru factorul B proteina C3, în cazurile în care s-a dovedit, că aHUS se asociază cu mutaţii cu dobândirea unor funcţii noi în aceste proteine (Pediatr Nephrol 25 (12): 2431-42 (2010)). Astfel, o serie de date convergente implică activarea complementului în patogeneza aHUS. Acest punct de vedere este susţinută în mod convingător de eficacitatea terapeutică a eculizumabului, un anticorp monoclonal care blochează proteina C5 terminală a complementului în tratamentul aHUS.

În timp ce rolul central al complementului ca mecanism efector în aHUS este larg acceptat, mecanismele declanşatoare, care iniţiază activarea complementului, şi căile moleculare implicate sunt neelucidate. Nu toţi indivizii, purtători ai mutaţiilor descrise mai sus, dezvoltă aHUS. De fapt, studiile familiale au sugerat, că frecvenţa manifestării genei aHUS constituie doar 50% (Ann Hum Genet 74 (1): 17-26 (2010)). Evoluţia bolii sugerează, că aHUS se dezvoltă mai frecvent după un eveniment iniţiator, cum ar fi un epizod infecţios sau o traumă. Se ştie, că agenţii infecţioşi activează sistemul complementului. În absenţa imunităţii adaptive preexistente, activarea complementului de către agenţii infecţioşi poate fi iniţiată în primul rând prin calea lectinei. Astfel, activarea căii lectinei, declanşată de o infecţie, poate reprezenta o iniţiere a declanşatorului pentru amplificarea patologică ulterioară a activării complementului la indivizii predispuşi aHUS, ceea ce poate conduce, în cele din urmă, la progresia bolii. În consecinţă, un alt aspect al prezentei invenţii prevede tratarea unui pacient, care suferă cu aHUS asociat unei infecţii, prin administrarea unei cantităţi eficiente de un agent inhibitor al MASP-2.

Alte forme de leziuni ale ţesutului organismului gazdă vor activa complementul prin calea lectinei, în special leziunile endoteliului vascular. Celulele endoteliale vasculare umane supuse stresului oxidativ răspund, de exemplu, la expresia fragmentelor de suprafaţă care leagă lectinele şi activează calea lectinei complementului (Am. Pathol 156 (6): 1549-56 (2000)). Leziunea vasculară după ischemie/reperfuzie, de asemenea, activează complementul prin calea lectinei in vivo (Scand J Immunol 61 (5): 426-34 (2005)). În acest context activarea căii lectinei are consecinţe patologice pentru organismul gazdă, iar inhibarea căii lectinei prin blocarea MASP-2 previne ulterior leziunea ţesutului organismului gazdă şi rezultatele adverse (Schwaeble PNAS 2011).

Astfel, se ştie că şi alte procese, care provoacă aHUS, activează calea lectinei a complementului. Prin urmare, e posibil că calea lectinei reprezintă mecanismul iniţial de activare a complementului, care este amplificat inadecvat într-o manieră dereglată la indivizi predispuşi genetic la aHUS, iniţiind astfel patogeneza aHUS. Prin inferenţă, agenţii care blochează activarea complementului prin calea lectinei, incluzând anticorpii anti-MASP-2, sunt de aşteptat să prevină progresia bolii sau să reducă exacerbările la indivizii susceptibili de aHUS.

În susţinerea acestui concept, studiile recente au identificat S. pneumonia ca agent etiologic important în cazurile pediatrice de aHUS. (Nefrologie (Carlton), 17: 48-52 (2012), Pediatr Infect Dis J. 30 (9): 736-9 (2011)). Această etiologie particulară pare să aibă un prognostic nefavorabil, cu o mortalitate şi o morbiditate semnificativă pe termen lung. În special, aceste cazuri au implicat infecţii non-enterice, care au condus la manifestări de microangiopatie, uremie şi hemoliză, fără a evidenţia mutaţii concomitente în genele complementului, cunoscute pentru predispunere la aHUS. Este important de remarcat faptul, că S. pneumonia este deosebit de eficientă în activarea complementului şi o face în mod predominant prin calea lectinei. Astfel, în cazurile de HUS ne-enteric, asociat cu o infecţie pneumococică, se aşteaptă ca manifestările microangiopatiei, uremiei şi hemolizei să fie determinate predominant de activarea căii lectinei şi se aşteaptă ca agenţii care blochează calea lectinei, inclusiv anticorpii anti-MASP-2, să prevină progresia aHUS sau să reducă severitatea bolii la aceşti pacienţi. În consecinţă, într-un alt aspect prezenta invenţie prevede tratarea unui pacient, care suferă de aHUS ne-enteric, asociat cu infecţie cu S. pneumonia, prin administrarea unei cantităţi eficiente de un agent inhibitor al MASP-2.

În contextul celor menţionate, în unele variante de realizare la depistarea unui subiect cu risc de dezvoltare a insuficienţei renale asociate cu aHUS, este prevăzută o metodă de reducere a probabilităţii de a dezvolta aHUS sau de a dezvolta insuficienţă renală asociată cu aHUS, cuprinzând administrarea unei cantităţi de agent inhibitor al MASP-2 pentru o perioadă de timp eficientă pentru ameliorarea sau prevenirea insuficienţei renale la subiect. În unele exemple de realizare, metoda mai prevede etapa de determinare a faptului dacă subiectul este expus riscului de a dezvolta aHUS înainte de debutul oricărui simptom asociat cu aHUS. În alte variante de realizare metoda prevede determinarea riscului de dezvoltare a aHUS în debutul cel puţin de a unuia sau mai multor simptome, care indică aHUS (de exemplu, prezenţa anemiei, trombocitopeniei şi/sau insuficienţei renale), şi/sau în prezenţa microangiopatiei trombotice într-o biopsie prelevată de la subiect. În cadrul determinării faptului că un subiect se expune riscului de a dezvolta aHUS, se determină prezenţa unei predispoziţii genetice pentru a dezvolta aHUS, care poate fi efectuată prin evaluarea informaţiilor genetice (de exemplu dintr-o bază de date, conţinând genotipul subiectului) sau prin realizarea cel puţin de a unui test genetic de selecţie pentru a determina prezenţa sau absenţa unui marker genetic asociat cu aHUS (adică determinarea prezenţei sau absenţei unei mutaţii genetice asociate cu aHUS în genele, care codifică factorul H al complementului (CFH), factorul I CFF), factorul B (CFB), cofactorul membranar CD46, C3, proteina 1 asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR1) sau THBD (proteina anticoagulantă codificatoare trombodulina) sau proteina 3 asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR3), sau proteina 4 asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR4)), fie prin secvenţierea genomului sau prin analiza genetică specifică (de exemplu, analiza PCR) şi/sau determinarea prezenţei la subiect a unui un istoric familial de aHUS. Metodele de screening genetic pentru prezenţa sau absenţa unei mutaţii genetice asociate cu aHUS sunt bine cunoscute, de exemplu, Noris M et al., "Atypical Hemolytic-Uremic Syndrome", 2007 Nov 16 [Updated 2011 Mar 10]. În: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews™, Seattle (WA): University of Washington, Seattle.

De exemplu, frecvenţa generală de manifestare a genei în boala, în care se produc mutaţii ale factorului H al complementului (CFH) constituie 48%, iar manifestarea genei pentru mutaţiile în CD46 constituie 53%, pentru mutaţiile în CFI - 50%, pentru mutaţiile în C3 - 56% şi pentru mutaţiile în THBD constituie 64% (Caprioli J. et al., Blood, 108: 1267-79 (2006), Noris et al., Clin J Am Soc Nephrol 5: 1844-59 (2010)). Cum se descrie în publicaţia Caprioli et al., (2006), menţionată anterior, la un număr semnificativ de indivizi cu o mutaţie în factorul H al complementului (CFH) nu dezvoltă niciodată aHUS şi se presupune, că activitatea suboptimală CFH la aceşti indivizi este suficientă pentru a proteja organismul gazdă de efectele activării complementului în condiţii fiziologice, totuşi activitatea suboptimală CFH nu este suficientă pentru a preveni depunerea C3b pe celulele endoteliale vasculare în cazul, în care expunerea la un agent, care activează complementul, produce cantităţi mai mari, decât cele normale, de C3b.

În consecinţă, într-o variantă de realizare se prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect, care suferă sau prezintă risc de a dezvolta sindrom hemolitic uremic atipic, care nu depinde factorul H, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii care conţine o cantitate de agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2. Într-o altă variantă de realizare se prevede o metodă de inhibare a activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect cu risc de a dezvolta sindromul hemolitic uremic atipic dependent de factorul H, cuprinzând monitorizarea periodică a subiectului pentru a determina prezenţa sau absenţa anemiei, trombocitopeniei sau creşterea creatininei şi tratarea cu un agent inhibitor al MASP-2 la determinarea prezenţei trombocitopeniei anemice sau creşterii creatininei. Într-o altă variantă de realizare se prevede o metodă de reducere a probabilităţii instalării simptomelor clinice asociate cu aHUS la un subiect cu risc de a dezvolta aHUS dependent de factorul H, cuprinzând administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 înainte sau în timpul sau după un eveniment (de exemplu, chimioterapie), infecţie (de exemplu, infecţie bacteriană), malignitate, leziune, transplant de organe sau ţesuturi sau sarcină.

Într-o variantă de realizare se prevede o metodă de reducere a probabilităţii instalării simptomelor clinice asociate cu aHUS la un subiect cu risc de a dezvolta aHUS, cuprinzând monitorizarea periodică a subiectului pentru a determina prezenţa sau absenţa anemiei, trombocitopeniei sau creşterea creatininei şi tratarea cu un agent inhibitor al MASP-2 la determinarea prezenţei anemiei, trombocitopeniei sau creşterea creatininei.

Într-o altă variantă de realizare se prevede o metodă de reducere a probabilităţii instalării simptomelor clinice asociate cu aHUS la un subiect cu risc de a dezvolta aHUS, care cuprinde administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 înainte sau în timpul sau după un eveniment cunoscut de a fi asociat cu (de exemplu, chimioterapie), infecţie (de exemplu, infecţie bacteriană), tumori maligne, leziuni, transplant de organe sau ţesuturi sau sarcină.

În unele exemple de realizare agentul inhibitor al MASP-2 se administrează timp o perioadă cel puţin de una, două, trei, patru zile sau mai multe, înainte, în timpul sau după evenimentul asociat cu declanşarea simptomelor clinice aHUS şi poate fi repetată la indicaţia medicului până când starea se rezolvă sau este controlată. Într-o setare pre-aHUS, agentul inhibitor al MASP-2 poate fi administrat sistemic, cum ar fi administrarea intraarterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, nazală, subcutanată sau altă administrare parenterală.

În unele variante de realizare la stabilirea diagnosticului iniţial de aHUS sau la un subiect care prezintă unul sau mai multe simptome, care corespund unui diagnostic de aHUS (de exemplu, prezenţa anemiei, trombocitopeniei şi/sau a insuficienţei renale), subiectul este tratat cu o cantitate eficientă de un agent inhibitor al MASP-2 (de exemplu un anticorp anti-MASP-2) în calitate de terapie de primă linie în absenţa plasmeferezei sau în combinaţie cu plasmefereză. Ca terapie de primă linie, agentul inhibitor al MASP-2 poate fi administrat subiectului sistemic, cum ar fi administrarea intraarterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, nazală, subcutanată sau altă administrare parenterală. În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 se administrează la un subiect ca terapie de primă linie în absenţa plasmaferezei pentru a evita complicaţiile posibile ale plasmaferezei, incluzând hemoragia, infecţia şi expunerea la tulburări şi/sau alergii inerente donatorului de plasmă, sau la un subiect cu contraindicaţii pentru plasmefereză sau într-un cadru unde plasmafereza nu este disponibilă.

În unele variante de realizare metoda cuprinde administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 la un subiect care suferă de aHUS printr-un cateter (de exemplu, intravenos) pentru o primă perioadă de timp (de exemplu, cel puţin de o zi până la o săptămână sau două săptămâni), urmată de administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 subcutanat pentru a doua perioadă de timp (de exemplu, timp de o perioadă mai îndelungată cel puţin de două săptămâni sau mai mult). În unele exemple de realizare administrarea în prima şi/sau în a doua perioadă de timp are loc în absenţa plasmeferezei. În unele variante de realizare metoda cuprinde suplimentar determinarea la subiect a nivelului cel puţin de un factor al complementului (de exemplu C3, C5) înainte de tratament şi opţional în timpul tratamentului, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor al complementului, comparativ cu o valoare standard sau cu nivelul la un subiect sănătos, indică necesitatea continuării tratamentului cu agent inhibitor al MASP-2.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp anti-MASP-2, la un subiect care suferă sau prezintă risc de a dezvolta aHUS, fie intravenos, intramuscular, fie, de preferinţă, subcutanat. Tratamentul poate fi de lungă durată şi se administrează zilnic, lunar, dar, de preferinţă, la fiecare două săptămâni. Anticorpul anti-MASP-2 poate fi administrat în calitate de monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizumab.

HUS

Ca şi HUS atipic, forma tipică de HUS se manifestă sub formă de tablou clinic şi date de laborator, caracteristice pentru o microangiopatie trombotică (TMA). HUS tipic, cu toate acestea, este frecvent o boală pediatrică şi de obicei nu are nici o componentă familială sau asociere directă cu mutaţii în genele complementului. Etiologia HUS tipic este strâns legată de infecţia cu anumiţi agenţi patogeni intestinali. Pacienţii prezintă de obicei insuficienţă renală acută, hemoglobinurie şi trombocitopenie, care de obicei însoţesc un episod de diaree sângeroasă. Starea este cauzată de o infecţie enterică cu Shigella dissenteria, Salmonella sau tulpini enterohemoragice, producătoare de toxina similară shiga, de E. coli, cum ar fi E. Coli O157:H7. Agenţii patogeni sunt achiziţionaţi din alimente contaminate sau din aprovizionarea cu apă. HUS este o urgenţă medicală şi are o mortalitate de 5-10%. O parte semnificativă a supravieţuitorilor dezvoltă boala renală cronică (Corrigan and Boineau, Pediatr Rev 22 (11): 365-9 (2011)) şi poate necesita transplant de rinichi.

Coagularea microvasculară în HUS tipic apare predominant, dar nu exclusiv, în microvasculatura renală. Fiziopatologia de bază este mediată de toxina Shiga (STX). Excretată de microbi enteropatici în lumenul intestinal, STX traversează bariera intestinală, pătrunde in fluxul sanguin şi se leagă cu celulele endoteliale vasculare prin receptorul globotriosil ceramidă CD77 (Boyd and Lingwood Nephron 51: 207 (1989)), care se exprimă în mod preferenţial pe endoteliul glomerular şi mediază efectul toxic al STX. După legarea cu endoteliul, STX induce o serie de evenimente care distrug endoteliul vascular, activează leucocitele şi pot cauza formarea de trombi vWF-dependentă (Forsyth et al., Lancet 2:. 411-414 (1989); Zoja et al., Kidney Int.. 62: 846-856 (2002), Zanchi et al., J. Immunol., 181: 1460-1469 (2008), Morigi et al., Blood 98: 1828-1835 (2001), Guessou et al., 73: 8306-8316 (2005)). Aceşti microtrombi obstrucţionează sau ocluzionează arteriolele şi capilarele rinichilor şi ale altor organe. Obstrucţia fluxului sanguin în arteriole şi capilare, prin microtrombi, măreşte forţa de deviere aplicată pe hematii la trecerea acestora prin vasele de sânge îngustate. Aceasta poate conduce la distrugerea hematiilor sub acţiunea forţei de deviere si la formarea de fragmente de hematii, numite schistocite. Prezenţa schistocitelor este o constatare caracteristică în HUS. Acest mecanism este cunoscut sub denumirea de hemoliza microangiopatică. În plus, obstrucţia fluxului sanguin are drept rezultat ischemia, iniţierea unui răspuns inflamator mediat de complement, care cauzează leziuni suplimentare organului afectat.

Calea lectinei a complementului contribuie la patogeneza HUS prin două mecanisme principale: 1) activare directă mediată de MASP-2 a cascadei de coagulare cauzate de leziuni endoteliale şi 2) activare ulterioară a complementului mediată de lectină, indusă de ischemia rezultată din blocarea iniţială a fluxului sanguin microvascular.

STX lezează celulele endoteliale microvasculare, iar celulele endoteliale lezate se ştie că activează sistemul complementului. Aşa cum se discută detaliat mai sus, activarea complementului după leziunea celulară endotelială este condusă predominant de calea lectinei. Celulele endoteliale vasculare umane supuse stresului oxidativ răspund prin exprimarea fragmentelor de suprafaţă, care leagă lectinele şi activează calea lectinei a complementului (Collard et al., Am J Pathol., 156 (5): 1549-56 (2000)). Leziunea vasculară după o ischemie/reperfuzie activează, de asemenea, complementul prin calea lectinei in vivo (Scand J Immunol 61 (5): 426-34 (2005)). Activarea căii lectinei în acest context are consecinţe patologice pentru organismul gazdă şi inhibarea căii lectinei prin blocarea MASP-2 previne ulterior leziunea ţesutului organismului gazdă şi rezultatele adverse (Schwaeble et al., PNAS (2011)). Adiţional la activarea complementului, s-a demonstrat că activarea dependentă de lectină a MASP-2 conduce la scindarea protrombinei cu formarea trombinei şi iniţierea coagulării. Astfel, activarea căii lectinei a complementului de către celulele endoteliale lezate poate activa direct sistemul de coagulare. Calea lectinei a complementului, în virtutea activării protrombinei, mediate de MASP-2, este probabil calea moleculară dominantă, care leagă leziunea endotelială iniţial, cauzată de STX, cu tromboza de coagulare şi microvasculară, care se produce în HUS. Prin urmare, este de aşteptat ca inhibitorii căii lectinei, incluzând, dar fără a se limita, anticorpii care blochează funcţia MASP-2, să prevină sau să atenueze coagularea microvasculară, tromboza şi hemoliza la pacienţii care suferă de HUS. Intr-adevăr, administrarea de anticorpi anti-MASP-2 protejează semnificativ şoarecii intr-un model experimental de HUS tipic. Cum se descrie în exemplul 36 şi se prezentă în fig. 45, toţi şoarecii de control expuşi acţiunii STX şi LPS, au dezvoltat HUS sever şi mureau sau au murit timp de 48 de ore. Pe de altă parte, după cum se arată în fig. 45, toţi şoarecii trataţi cu un anticorp anti-MASP-2 şi apoi expuşi acţiunii STX şi LPS au supravieţuit (criteriul exact Fisher p <0,01; N = 5). Astfel, terapia anti-MASP-2 protejează semnificativ şoarecii în acest model experimental de HUS. Este de aşteptat ca administrarea unui agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp anti-MASP-2, să fie eficientă în tratamentul pacienţilor cu HUS şi să asigure protecţia împotriva coagulării, trombozei şi hemolizei microvasculare, cauzate de infecţia cu E. coli enteropatici sau alţi agenţi patogeni producători de STX.

În timp ce aici este prezentat pentru HUS, cauzat de STX, se aşteaptă ca terapia anti-MASP-2 poate fi, de asemenea, benefică pentru sindroame asemănătoare HUS, provocate de leziuni endoteliale cauzate de alţi agenţi toxici. Aceştia includ aşa agenţi, cum ar fi mitomicina, ticlopidina, ciclatina, chinina, ciclosporina, bleomicina, precum şi alte medicamente pentru chimioterapie şi medicamente imunosupresive. Astfel, este de aşteptat ca terapia cu anticorpi anti-MASP-2 sau cu alte modalităţi care inhibă activitatea MASP-2 să prevină sau să limiteze în mod eficient coagularea, formarea trombilor şi distrugerea hematiilor şi să prevină instalarea insuficienţei renale în HUS şi în alte boli legate de TMA (de exemplu, aHUS şi TTP).

Pacienţii, care suferă de HUS, prezintă deseori diaree şi vărsături, numărul de trombocite la ei este de obicei redus (trombocitopenie), este redus şi numărul de hematii (anemie). O fază de diaree pre-HUS durează în mod obişnuit aproximativ patru zile, timp în care subiecţii cu risc pentru dezvoltarea HUS prezintă de obicei unul sau mai multe dintre următoarele simptome, adiţional la diareea severă: nivelul hematocritului sub 30%, cu semne de destrucţie intravasculară a eritrocitelor, trombocitopenie (număr de trombocite <150x103/mm3) şi/sau tulburarea funcţii renale (concentraţia serică de creatinină depăşind limita superioară a intervalului de referinţă pentru vârstă). Prezenţa oligoanuriei (cantitatea de urină eliminată ≤0,5 ml/kg/h timp de >1 zi) poate fi utilizată ca măsură pentru progresia evoluţiei HUS (C. Hickey et al., Arch Pediatr Adolesc Med 165 (10): 884-889 (2011)). Testarea se efectuează de obicei pentru depistarea infecţiei cu bacteria E. coli (E.coli O157:H7) sau cu specii Shigella sau Salmonella. La subiectul, care a fost testat pozitiv pentru infecţia cu E. coli enterogenic (de exemplu, E. coli 0157:H7), utilizarea antibioticelor este contraindicată, deoarece utilizarea antibioticelor poate creşte riscul de a dezvolta HUS prin creşterea producţiei de STX (Wong C. et al., N. Engl. J. Med. 342:1930-1936 (2000)). La subiecţii testaţi pozitiv pentru Shigella sau Salmonella, antibioticele se administrează de obicei pentru a elimina infecţia. Alte terapii de primă linie bine stabilite pentru HUS includ extinderea volumului, dializă şi plasmefereză.

În conformitate cu cele relatate mai sus, în unele variante de realizare la depistarea unui subiect care suferă de unul sau mai multe simptome, asociate cu o fază pre-HUS şi cu risc de dezvoltare a HUS (adică subiectul prezintă una sau mai multe dintre următoarele simptome: diaree, nivelul hematocritului sub 30%, cu determinarea destrucţiei intravasculare a eritrocitelor, trombocitopenie (numărul trombocitelor mai puţin de 150x103/mm3) şi/sau tulburarea funcţiei renale (concentraţia serică de creatinină depăşind limita superioară a intervalului de referinţă pentru vârstă)), se prevede o metodă de reducere a riscului de apariţie a HUS sau de reducere a probabilităţii instalării insuficienţei renale la subiect, care cuprinde administrarea unei cantităţi de un agent inhibitor al MASP-2 pentru o perioadă de timp eficientă pentru ameliorarea sau prevenirea deteriorării funcţiei renale. În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 se administrează timp cel puţin de una, două, trei, patru sau mai multe zile şi poate fi repetat, în conformitate cu indicaţiile unui medic, până la rezolvarea sau controlarea stării. Într-un pre-HUS stabilit agentul inhibitor al MASP-2 se poate administra sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, nazală, orală, subcutanată sau altă administrare parenterală.

Tratamentul infecţiei cu E. coli 0157: H7 cu antibiotice bactericide, în special cu β-lactame, s-a asociat cu un risc crescut de apariţie a HUS (Smith et al., Pediatr Infect Dis J 31 (1): 37-41 (2012)). În unele exemple de realizare la depistarea unui subiect, care suferă de simptome asociate cu o fază pre-HUS, şi se ştie că subiectul are o infecţie cu E. coli enterogenic, pentru care utilizarea antibioticelor este contraindicată (de exemplu, E coli 0157:H7), se prevede o metodă de reducere a riscului de apariţie a HUS sau de reducere a probabilităţii instalării insuficienţei renale prin administrarea unei cantităţi de un agent inhibitor al MASP-2 pentru o primă perioadă de timp, eficientă pentru a inhiba sau a preveni apariţia oligoanuriei la subiect (de exemplu, cel puţin de una, două, trei sau patru zile) şi administrarea agentului inhibitor al MASP-2 în prima perioadă de timp se realizează în absenţa unui antibiotic. În unele variante de realizare metoda cuprinde în continuare administrarea agentului inhibitor al MASP-2 în combinaţie cu un antibiotic pentru a doua perioadă de timp (cum ar fi timp cel puţin de una până la două săptămâni).

În alte exemple de realizare, în cazul unui subiect care suferă de simptome asociate cu o fază pre-HUS, în care subiectul este cunoscut că are o infecţie cu Shigella sau Salmonella, este prevăzută o metodă pentru reducerea riscului de dezvoltare a HUS sau pentru reducerea probabilităţii dezvoltării insuficienţei renale la subiect, care cuprinde administrarea unei cantităţi dintr-un agent inhibitor al MASP-2 şi pentru o perioadă de timp eficientă pentru inhibarea sau prevenirea prezenţei oligoanuriei la subiect, în care administrarea agentului inhibitor al MASP-2 este fie în prezenţa sau în absenţa unui antibiotic adecvat.

În unele exemple de realizare, la stabilirea unui diagnostic iniţial de HUS sau la un subiect care prezintă unul sau mai multe simptome, care indică un diagnostic de HUS (de exemplu, prezenţa insuficienţei renale sau anemiei hemolitice microangiopatice în absenţa nivelului redus de fibrinogen sau a trombocitopeniei), tratamentul prevede administrarea unei cantităţi eficiente de un agent inhibitor al MASP-2 (de exemplu, un anticorp anti-MASP-2), ca terapie de primă linie, în absenţa plasmeferezei sau în combinaţie cu plasmafereza. Ca terapie de primă linie, agentul inhibitor al MASP-2 se poate administra sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, nazală, subcutanată sau altă administrare parenterală. În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 se administrează ca terapie de primă linie în absenţa plasmeferezei pentru a evita complicaţiile plasmeferezei, cum ar fi hemoragia, infecţia şi expunerea la tulburări şi/sau alergii inerente donorului de plasmă, sau la un subiect care prezintă contraindicaţii pentru plasmafereză sau în condiţii în care plasmafereza nu este disponibilă.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 la un subiect care suferă de HUS printr-un cateter (de exemplu, intravenos) pentru o primă perioadă de timp (de exemplu, în faza acută care durează cel puţin de o zi până la o săptămână sau două săptămâni), urmată de administrarea subcutanată a unui agent inhibitor al MASP-2 pentru a doua perioadă de timp (de exemplu, pentru o perioadă îndelungată de timp cel puţin de două săptămâni sau mai mult). În unele exemple de realizare administrarea în prima şi/sau în a doua perioadă de timp se realizează în absenţa plasmeferezei. În unele variante de realizare metoda prevede suplimentar determinarea la subiect a nivelului cel puţin de un factor de complement (de exemplu, C3, C5) înainte de tratament şi opţional în timpul tratamentului, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor de complement, comparativ cu o valoare standard sau la un subiect sănătos, este o indicaţie a necesităţii unui tratament şi determinarea unui nivel normal este un indice de îmbunătăţire.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp anti-MASP-2, la un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a HUS, fie subcutanat, fie intravenos. Tratamentul preferabil se administrează zilnic, dar poate fi administrat şi mai rar: săptămânalul sau lunar. Tratamentul va continua cel puţin de la o săptămână până la 3 luni. Anticorpul anti-MASP-2 poate fi administrat în monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizumab.

TTP

Purpura trombocitopenică trombotică (TTP) este o tulburare a sistemului de coagulare a sângelui, care pune viaţa în pericol, cauzată de disfuncţii autoimune sau ereditare, care activează cascada de coagulare sau sistemul complementului (George, JN, N Engl J Med; 354:1927-35 (2006)). Aceasta rezultă cu numeroase cheaguri microscopice, sau trombi, în vasele de sânge mici în tot corpul. Hematiile din sânge sunt supuse stresului de deviere, care le distruge membranele, conducând la hemoliză intravasculară. Reducerea fluxului sanguin şi leziunile endoteliale formate determină afectarea organelor, inclusiv a creierului, inimii şi rinichilor. TTP se caracterizează clinic prin trombocitopenie, anemie hemolitică microangiopatică, modificări neurologice, insuficienţă renală şi febră. În perioada anterioară schimbului de plasmă, rata mortalităţii în timpul episoadelor acute constituia 90%. Chiar şi în cazul schimbului de plasmă, supravieţuirea în primele şase luni constituie aproximativ 80%.

TTP apare în rezultatul inhibării genetice sau dobândite a enzimei ADAMTS-13, o metaloprotează responsabilă de scindarea multimerilor mari ai factorului von Willebrand (vWF) în fragmente mai mici. Inhibarea sau deficitul ADAMTS-13 conduce în final la creşterea coagulării (Tsai, H.J. Am. Soc Nephrol 14: 1072-1081, (2003)). ADAMTS-13 reglează activitatea vWF; în absenţa acesteia, vWF formează multimeri mari, care sunt mai susceptibili să lege plachetele, la pacienţi manifestându-se prin agregarea plachetelor şi tromboză microvasculară.

Sindromul Upshaw-Schulman (USS, de asemenea, descris ca TTP congenitală) este o deficienţă congenitală a activităţii ADAMTS13, datorată mutaţiilor genei ADAMTS13 (Schulman et al., Blood, 16 (1): 943-57, 1960; Upshaw et al., Engl. J. Med., 298 (24): 1350-2, 1978). Numeroase mutaţii în ADAMTS13 au fost identificate la indivizi cu TTP congenitală (Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74: 101-108 (2001), Levy et al., Nature, 413 (6855): 488-494 (2001), Kakame et al., PNAS 99 (18): 11902-11907 (2002), Savasan et al., Blood, 101: 4449-4451 (2003), Matsumoto et al., Blood 103: 1305-1310 şi Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144: 742-754 (2008)). Subiecţii cu USS prezintă de obicei 5-10% din activitatea normală a ADAMTS13 (Kokame et al., PNAS 99 (18): 11902-11907, 2002). Deşi TTP şi USS dobândite au unele similitudini, USS prezintă unele diferenţe importante în caracteristicile clinice. USS se instalează, de obicei, în pruncie sau în copilărie şi se caracterizează prin hiperbilirubinemie severă cu testul Coombs negativ imediat după naştere, cu răspuns la perfuzia cu plasmă proaspătă şi recăderi frecvente (Savasan et al., Blood, 101: 4449-4451, 2003). În unele cazuri pacienţii cu această deficienţă ADAMTS13 congenitală au un fenotip slab la naştere şi dezvoltă simptome asociate cu TTP în situaţii clinice cu valori înalte ale factorului von Willebrand, cum ar fi infecţia sau sarcina. De exemplu, Fujimura et al., a comunicat despre 9 femei japoneze din 6 familii cu USS confirmat genetic, care au fost diagnosticate cu această tulburare în timpul primei sarcini. Trombocitopenia apărea în timpul celui de-al doilea până la al treilea trimestru în fiecare dintre cele 15 sarcini, adesea după TTP. Toate aceste femei s-au dovedit a fi cu deficienţă severă a activităţii ADAMTS13 (Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144: 742-754, 2008).

În conformitate cu cele menţionate, în unele variante de realizare la depistarea unui subiect cu sindrom Upshaw-Schulman (adică, se ştie că subiectul prezintă deficienţa activităţii ADAMTS13 şi/sau că subiectul are una sau mai multe mutaţii ale genei ADAMTS13, se propune o metodă de reducere a probabilităţii dezvoltării simptomelor clinice de TTP congenitală (de exemplu, trombocitopenie, anemie, febră şi/sau insuficienţă renală) prin administrarea unei cantităţi de agent inhibitor al MASP-2 (de exemplu, un anticorp MASP-2) pentru o perioadă de timp, eficientă pentru ameliorarea sau prevenirea unuia sau mai multor simptome clinice asociate cu TTP. În unele variante de realizare metoda cuprinde suplimentar etapa de determinare la acest subiect a riscului de dezvoltare a simptomelor asociate cu TTP congenitală înainte de debutul oricărui simptom asociat cu TTP sau la debutul a cel puţin de unuia sau mai multor simptome care indică TTP (de exemplu, prezenţa anemiei, trombocitopeniei şi/sau insuficienţei renale). Determinarea riscului de dezvoltare a simptomelor asociate cu TTP congenitală (adică, subiectul are USS) include depistarea mutaţiei în gena care codifică ADAMTS13 şi/sau a deficienţei activităţii ADAMTS13 şi/sau prezenţei unui istoric familial de USS. Metodele de screening genetic pentru depistarea prezenţei sau absenţei unei mutaţii genetice asociate cu USS sunt bine cunoscute, de exemplu, Kinoshita et al., International Journal of Hematology, 74: 101-108 (2001); Levy et al., Nature, 413 (6855): 488-494 (2001); Kokame et al., PNAS 99 (18): 11902-11907 (2002); Savasan et al., Blood, 101: 4449-4451 (2003); Matsumoto et al., Blood, 103: 1305-1310 (2004) şi Fujimura et al., Brit. J. Haemat 144: 742-754 (2008).

Într-o variantă de realizare la un subiect diagnosticat cu USS se prevede o metodă de reducere a probabilităţii dezvoltării simptomelor clinice asociate cu TTP, care cuprinde monitorizarea periodică a subiectului pentru a determina prezenţa sau absenţa anemiei, trombocitopeniei sau creşterii creatininei şi tratarea cu un agent de inhibare al MASP-2 (de exemplu, un anticorp MASP-2) la determinarea prezenţei anemiei, trombocitopeniei sau creşterii creatininei sau în prezenţa unui eveniment cunoscut de a fi asociat cu declanşarea simptomelor clinice ale TTP, de exemplu, acţiunea îndelungată a unui medicament (de exemplu, chimioterapie), infecţiei (de exemplu, infecţie bacteriană), o tumoare malignă, traumă, transplant sau sarcină.

Într-o altă variantă de realizare se prevede o metodă de tratare a unui subiect cu USS şi care prezintă simptome clinice asociate cu TTP, care cuprinde administrarea unei cantităţi de un agent inhibitor al MASP-2 (de exemplu un anticorp MASP-2) pentru o perioadă de timp, eficientă pentru ameliorarea sau prevenirea unui sau mai multe simptome clinice asociate cu TTP.

TTP poate fi cauzată, de asemenea, de un auto-anticorp împotriva ADAMTS-13. In plus, TTP se poate dezvolta in timpul cancerului mamar, cancerului tractului gastrointestinal sau de prostată (George JN., Oncology (Williston Park), sarcinii în al doilea trimestru sau postpartum), George JN., Curr Opin Hematol 10: 339-344 (2003)) sau este asociată cu boli, cum ar fi HIV sau boli autoimune, cum ar fi lupusul eritematos sistemic (Hamasaki K et al., Clin Rheumatol.22: 355-8 (2003)). TTP pot fi, de asemenea, cauzate de anumite terapii medicamentoase, inclusiv cu heparină, chinină, ingredient imuno-mediat, agenţi chimioterapeutici anticancer (bleomicină, cisplatină, citozină arabinozidă, daunomicină gemcitabină, mitomicină C şi tamoxifen), ciclosporină A, contraceptive orale, penicilină, rifampicină şi medicamente anti-plachetare, incluzând ticlopidină şi clopidogrel (Azarm, T. et al., J Res Med Sci., 16: 353-357 (2011)). Alţi factori sau stări asociate cu TTP sunt toxinele, cum ar fi veninurile de albine, sepsisul, splenectomia, transplantul, vasculita, chirurgia vasculară şi infecţiile, cum ar fi pneumonia streptococică şi citomegalovirusul (Moake JL., N Engl J Med., 347: 589-600 2002)). TTP, din cauza deficienţei funcţionale a ADAMTS-13, poate să apară ca o consecinţă a leziunii celulare endoteliale asociate cu infecţia cu S. pneumonia (Pediatr Nephrol., 26: 631-5 (2011)).

Schimbul de plasmă este tratamentul standard în TTP (Rock GA et al., N Engl J Med 325: 393-397 (1991)). Schimbul de plasmă restabileşte activitatea ADAMTS-13 la pacienţii cu defecte genetice şi elimină autoanticorpii ADAMTS-13 la pacienţi cu TTP autoimună dobândită (Tsai, H-M, Hematol Oncol Clin North Am., 21 (4): 609-v (2007)). În terapie de obicei se mai adaugă agenţi suplimentari, cum ar fi medicamente imunosupresoare (George, JN, N Engl J Med, 354: 1927-35 (2006)). Cu toate acestea, schimbul de plasmă este ineficient la aproximativ 20% dintre pacienţi, recidiva apare la mai mult de o treime dintre pacienţi, iar plasmafereza este costisitoare şi dificilă din punct de vedere tehnic. În plus, mulţi pacienţi nu tolerează schimbul de plasmă. În consecinţă, în TTP persistă o necesitate critică de tratamente suplimentare şi mai eficiente.

Deoarece TTP este o tulburare a cascadei de coagulare a sângelui, tratamentul cu antagonişti ai sistemului complementului poate contribui la stabilizarea şi corectarea bolii. Deşi activarea patologică a căii complementare alternative este legată de aHUS, rolul activării complementului în TTP este mai puţin elucidat. Deficienţa funcţională a ADAMTS13 este importantă pentru susceptibilitatea TTP, însă nu este suficientă pentru a provoca episoade acute. Factorii de mediu şi/sau alte variaţii genetice pot contribui la manifestarea TTP. De exemplu, genele care codifică proteinele implicate în reglarea cascadei de coagulare, vWF, funcţiei plachetare, componentelor suprafeţei vaselor endoteliale sau sistemului complementului pot fi implicate în dezvoltarea microangiopatiei trombotice acute (Galbusera, M. et al., Haematologica, 94: 166-170 (2009)). În particular, s-a demonstrat că activarea complementului joacă un rol critic; serul în microangiopatia trombotică asociată cu deficienţa ADAMTS-13 a determinat depunerea de C3 şi MAC şi activarea ulterioară a neutrofilelor, care ar putea fi lichidate prin inactivarea complementului (Ruiz-Torres MP et al., Thromb Haemost, 93: 443-52 (2005)). În plus, s-a demonstrat recent că în timpul episoadelor acute de TTP se înregistrează niveluri crescute de C4d, C3bBbP şi C3a (M. Réti et al., J Thromb Haemost, Feb. 28 (2012) doi: 10.1111/j.1538-7836.2012.04674.x. [în curând va apărea publicaţia electronică]), in concordanta cu activarea caii clasice/lectinei şi alternative. Această cantitate crescută de activare a complementului în episoadele acute poate iniţia calea de activare terminală şi poate fi responsabilă pentru o exacerbare suplimentară a TTP.

Rolul ADAMTS-13 şi vWF în TTP este cu certitudine responsabil de activarea şi agregarea trombocitelor şi implicarea ulterioară în stresul de deviere şi depunere în microangiopatii. Trombocitele activate interacţionează şi declanşează atât căile clasice, cât şi cele alternative ale complementului. Activarea complementului mediată de plachete creşte nivelul de mediatori inflamatorii C3a şi C5a (Peerschke E et al., Mol Immunol, 47: 2170-5 (2010)). Trombocitele pot servi, astfel, drept ţinte ale activării clasice a complementului în TTP ereditară sau autoimună.

Aşa cum s-a menţionat mai sus, calea lectinei a complementului, în virtutea activării protrombinei mediate de MASP-2, este calea moleculară dominantă care leagă leziunea endotelială cu coagularea şi tromboza microvasculară, care se produce în HUS. În mod similar, activarea căii lectinei a complementului poate dirija în mod direct sistemul de coagulare în TTP. Activarea căii lectinei poate fi iniţiată ca răspuns la leziunea iniţială a endoteliului, cauzată de deficienţa ADAMTS-13 în TTP. Prin urmare, este de aşteptat ca inhibitorii căii lectinei, incluzând, dar fără a se limita la anticorpi care blochează funcţia MASP-2, să atenueze microangiopatiile asociate cu coagularea microvasculară, tromboză şi hemoliza la pacienţii care suferă de TTP.

Pacienţii, care suferă de TTP, prezintă în camera de urgenţă, de obicei, unul sau mai multe dintre următoarele simptome: purpură, insuficienţă renală, nivel redus de trombocite, anemie şi/sau tromboză, inclusiv accident vascular cerebral. Standardul actual de asistenţă medicală în TTP implică administrarea prin cateter (de exemplu, intravenos sau o altă formă de cateter), apoi plasmafereza de substituţie timp de două săptămâni sau mai mult, de obicei de trei ori pe săptămână până la administrare zilnică. Dacă subiectul prezintă test pozitiv pentru prezenţa unui inhibitor al ADAMTS13 (adică, un anticorp endogen împotriva ADAMTS13), atunci plasmafereza poate fi realizată în combinaţie cu terapie imunosupresoare (de exemplu, corticosteroizi, rituxan sau ciclosporină). Subiecţii cu TTP refractar (aproximativ 20% din pacienţii cu TTP) nu răspund la un tratament cel puţin de două săptămâni cu plasmefereză.

În conformitate cu cele menţionate, într-o variantă de realizare la stabilirea diagnosticului iniţial de TTP sau la un subiect care prezintă unul sau mai multe simptome, care indică un diagnostic de TTP (de exemplu, implicarea sistemului nervos central, trombocitopenie severă (un număr de trombocite egal sau mai mic de 5000/µl, în cazul în care nu se administrează aspirină, mai mic sau egal cu 20.000/µl la administrarea aspirinei), implicare severă cardiacă, leziune pulmonară severă, infarct gastrointestinal sau gangrenă), este prevăzută o metodă de tratare a subiectului cu o cantitate eficientă de un agent inhibitor al MASP-2 (de exemplu, un anticorp anti-MASP-2) ca terapie de primă linie în absenţa plasmeferezei sau în combinaţie cu plasmafereza. Ca terapie de primă linie, agentul inhibitor MASP-2 poate fi administrat sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, nazală, subcutanată sau altă administrare parenterală. În unele variante de realizare, agentul inhibitor al MASP-2 se administrează ca terapie de primă linie în absenţa plasmeferezei pentru a evita complicaţiile posibile ale plasmeferezei, cum ar fi hemoragia, infecţia şi expunerea la tulburări şi/sau alergii inerente donatorului de plasmă sau la un subiect cu contraindicaţii pentru plasmefereză sau în condiţii în care plasmafereza nu este disponibilă. În unele variante de realizare, agentul inhibitor al MASP-2 se administrează subiectului care suferă de TTP în combinaţie (inclusiv administrarea concomitentă) cu un agent imunosupresor (de exemplu, corticosteroizi, rituxan sau ciclosporină) şi/sau în combinaţie cu ADAMTS-13 concentrat.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 la un subiect care suferă de TTP printr-un cateter (de exemplu, intravenos) în prima perioadă de timp (de exemplu, în faza acută, care durează cel puţin de o zi până la o săptămână sau două săptămâni), urmată de administrarea subcutanată a unui agent inhibitor al MASP-2 timp de a doua perioadă de timp (de exemplu, o perioadă îndelungată cel puţin de două săptămâni sau mai mult). În unele exemple de realizare administrarea în prima şi/sau în a doua perioadă de timp se realizează în absenţa plasmeferezei. În unele exemple de realizare metoda se utilizează pentru a menţine subiectul, pentru a preveni suferinţele subiectului de la unul sau mai multe simptome asociate cu TTP.

Într-o altă variantă de realizare se prevede o metodă de tratare a unui subiect care suferă de TTP refractar (adică a unui subiect, care nu a răspuns la cel puţin de două săptămâni de terapie cu plasmafereză) prin administrarea unei cantităţi de inhibitor al MASP-2 eficiente pentru a reduce unul sau mai multe simptome ale TTP. Într-o realizare inhibitorul MASP-2 (de exemplu, un anticorp anti-MASP-2) se administrează subcutanat sau pe altă cale parenterală unui subiect cu TTP refractar o perioadă îndelungată, cel puţin de două săptămâni sau mai mult. Administrarea poate fi repetată la indicaţia medicului, până când starea este rezolvată sau este controlată.

În unele variante de realizare metoda prevede suplimentar determinarea nivelului cel puţin de un factor al complementului (de exemplu, C3, C5) la subiect înainte de tratament şi opţional în timpul tratamentului, în care depistarea unui nivel redus cel puţin de un factor al complementului, comparativ cu o valoare standard sau cu un subiect sănătos, indică necesitatea continuării tratamentului cu agentul inhibitor al MASP-2.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi a unui anticorp anti-MASP-2, la un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a TTP, fie subcutanat, fie intravenos. Tratamentul se administrează, de preferinţă, zilnic, dar poate administrat mai rar, cum ar fi la două săptămâni. Tratamentul se continuă până când numărul de trombocite la subiect depăşeşte 150.000/ml timp cel puţin de două zile consecutive. Anticorpul anti-MASP-2 se poate administra sub formă de monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab.

Într-un exemplu de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 prezintă cel puţin de una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: anticorpul menţionat leagă MASP-2 uman cu KD de 10 nM sau mai mică, anticorpul menţionat leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2, anticorpul respectiv inhibă depunerea C3b într-un test in vitro în 1% ser uman la IC50 de 10 nM sau mai puţin, anticorp respectiv inhibă depunerea C3b în 90% ser uman la IC50 de 30 nM sau mai mică, în care anticorpul reprezintă un fragment de anticorp selectat din grupa constând din Fv, Fab,', F(ab)2 şi F(ab')2, în care anticorpul este o moleculă cu un singur lanţ, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG2, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG1, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG4, în care molecula IgG4 cuprinde o mutaţie S228P şi/sau în care anticorpul nu inhibă semnificativ calea clasică. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea alternativă. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea clasică sau calea alternativă (adică inhibă calea lectinei, lăsând intacte căile clasice şi alternative ale complementului).

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul subiectului, care suferă de TTP, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor de MASP-2 inhibă formarea trombilor în serul subiectului, care suferă de TTP, la un nivel ce depăşeşte cel puţin de 20% sau mai mult (cum ar fi cel puţin de 30%, cel puţin de 40%, cel puţin de 50%) efectul inhibitor asupra depunerii C5b-9 în ser.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul pacientului cu TTP cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează subiectului printr-un cateter intravenos sau prin altă metodă de administrare prin cateter.

Într-o variantă de realizare prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă de TTP, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) Lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) Lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) Lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acestuia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare la antigen, conţinând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi notată ca SEQ ID NR: 67 . În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare la antigen, conţinând o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi notată ca SECV ID NR: 70 .

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare la antigen, care recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop pe MASP-2 umană, recunoscută de anticorpul de referinţă OMS646, conţinând regiunea variabilă a lanţului greu , notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor, notată ca SECV ID NR: 70.

Boala Degos

Boala Degos, cunoscută şi sub denumirea de papuloză atrofică malignă, este o TMA foarte rară, care afectează endoteliul vaselor mici ale pielii, ale tractului gastro-intestinal şi ale SNC. Această vasculopatie cauzează ocluzia venulelor şi a arteriolelor, rezultând cu leziuni ale pielii, ischemie intestinală şi tulburări ale SNC, inclusiv accidente vasculare cerebrale, epilepsie şi tulburări cognitive. În piele, necroza ţesutului conjunctiv se datorează ocluziei trombotice a arterelor mici. Totuşi, cauza bolii Degos nu este cunoscută. Sunt implicate vasculitele, coagulopatia sau disfuncţia primară a celulelor endoteliale. Supravieţuirea în boala Degos constituie 50% de la doi până la trei ani. Deşi pentru ameliorarea simptomelor se utilizează medicamente antiplachetare, anticoagulante şi imunosupresoare, un tratament eficace pentru boala Degos nu există.

Deşi mecanismul bolii Degos nu este cunoscut, calea complementului este implicată. Margo şi colab. au identificat depuneri semnificative de C5b-9 în piele, în tractul gastro-intestinal şi în vasele cerebrale la patru pacienţi cu boală Degos în stadiul terminal (Margo et al., Am J Clin Pathol 135 (4): 599-610, 2011). Tratamentul experimental cu eculizumab iniţial s-a dovedit a fi eficient în tratamentul leziunilor cutanate şi intestinale, dar nu a prevenit progresia bolii sistemice (Garrett-Bakelman F. et al., "C5b-9 is a potential effector in the pathophysiology of Degos disease; a case report of treatment with eculizumab” (Abstract), Jerusalem: International Society of Hematology, 2010, Poster # 156 şi Polito J. et al., "Early detection of systemic Degos disease (DD) or malignant atrophic papulosis (MAP) may increase survival” (Abstract), San Antonio, TX: American College of Gastroenterology; 2010, Poster # 1205).

Mulţi pacienţi care suferă de boala Degos au defecte de coagulare a sângelui. Pentru această boală este caracteristică ocluzia trombotică a arterelor mici din piele. Deoarece în această boală este implicată calea complementului, aşa cum se descrie aici pentru alte TMA, este de aşteptat ca inhibitorii căii lectinei, incluzând, dar fără a se limita, anticorpi care blochează funcţia MASP-2, să fie benefici în tratarea pacienţilor, care suferă de boala Degos.

În conformitate cu aceasta, într-o altă variantă de realizare invenţia prevede metode tratare a bolii Degos prin administrarea la un subiect care suferă de boala Degos sau cu o stare care rezultă din boala Degos a unei compoziţii cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp MASP-2, într-un purtător farmaceutic. Subiectului, care suferă de boala Degos sau cu o stare care rezultă din boala Degos, agentul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, subcutanată sau altă administrare parenterală sau potenţial pentru agenţii non-peptiderici - prin administrare orală. Anticorpul anti-MASP-2 se poate administra sub formă de monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab.

Într-un exemplu de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 prezintă cel puţin de una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: anticorpul menţionat leagă MASP-2 uman cu KD de 10 nM sau mai mică, anticorpul menţionat leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2, anticorpul respectiv inhibă depunerea C3b într-un test in vitro în 1% ser uman la IC50 de 10 nM sau mai puţin, anticorpul respectiv inhibă depunerea C3b în 90% ser uman la IC50 de 30 nM sau mai mică, în care anticorpul reprezintă un fragment de anticorp selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab)2 şi F(ab')2, în care anticorpul este o moleculă cu un singur lanţ, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG2, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG1, în care anticorpul respective este o moleculă IgG4, în care molecula IgG4 cuprinde o mutaţie S228P şi/sau în care anticorpul nu inhibă semnificativ calea clasică. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea alternativă. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea clasică sau calea alternativă (adică inhibă calea lectinei, lăsând intacte căile clasice şi alternative ale complementului).

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul subiectului, care suferă de boala Degos, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor de MASP-2 inhibă formarea trombilor în serul subiectului, care suferă de boala Degos, la un nivel ce depăşeşte cel puţin de 20% sau mai mult (cum ar fi cel puţin de 30%, cel puţin de 40%, cel puţin de 50%) efectul inhibitor asupra depunerii C5b-9 în ser.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul pacientului cu boala Degos cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă de boala Degos, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare la antigen, conţinând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi notată ca SEQ ID NR: 67. În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare la antigen, conţinând o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi, notată ca SECV ID NR: 70 .

Sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS)

Sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS) este o variantă extremă a sindromului anticorpului antifosfolipidic (APLA). CAPS se caracterizează prin tromboză venoasă şi arterială datorată anticorpilor patogeni. CAPS este o TMA cu tromboză de multiple organe, ischemie şi insuficienţă de organe. Ca şi alte TMA, este caracteristică ocluzia vaselor mici în diferite organe. Rată mortalităţii în CAPS este înaltă, constituind aproximativ 50% şi deseori se asociază cu infecţii sau traume. Pacienţii au anticorpi antifosfolipidici, în general IgG.

Din punct de vedere clinic, CAPS implică cel puţin de trei organe sau ţesuturi cu dovezi histopatologice de ocluzie a vaselor mici. Tromboza periferică poate implica venele şi arterele din sistemul nervos central, cardiovascular, renal sau pulmonar. Pacienţii sunt trataţi cu antibiotice, anticoagulante, corticosteroizi, schimb de plasmă şi imunoglobulină intravenos. Cu toate acestea, moartea poate rezulta din insuficienţă funcţională multiplă de organe.

În CAPS este implicată calea complementului. De exemplu, studiile efectuate pe modele experimentale pe animale indică, că inhibarea complementului poate fi un mijloc eficient de prevenire a trombozei asociate cu CAPS (Shapira L. et al., Arthritis Rheum 64 (8): 2719-23, 2012). Mai mult decât atât, Shapira et al. au relatat în continuare că administrarea eculizumabului la un subiect, care suferă de CAPS, în doze care blochează calea complementului, a întrerupt evenimentele trombotice progresive acută şi a cauzat evoluţia inversă a trombocitopeniei (Lim W., Curr Opin Hematol 18(5): 361-5, 2011). Prin urmare, aşa cum se descrie aici pentru alte TMA, este de aşteptat ca inhibitorii căii lectinei, incluzând, dar fără a se limita, anticorpi care blochează funcţia MASP-2, să fie benefici în tratarea pacienţilor care suferă de CAPS.

În conformitate cu aceasta, într-o altă variantă de realizare invenţia prevede metode tratare a CAPS prin administrarea la un subiect care suferă de CAPS sau cu o stare care rezultă din CAPS a unei compoziţii cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp MASP-2, într-un purtător farmaceutic. Subiectului, care suferă de CAPS sau cu o stare care rezultă din CAPS, agentul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, subcutanată sau altă administrare parenterală sau potenţial pentru agenţii non-peptiderici - prin administrare orală. Anticorpul anti-MASP-2 se poate administra sub formă de monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab.

Într-un exemplu de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 prezintă cel puţin de una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: anticorpul menţionat leagă MASP-2 umană cu KD de 10 nM sau mai mică, anticorpul menţionat leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2, anticorpul respectiv inhibă depunerea C3b într-un test in vitro în 1% ser uman la IC50 de 10 nM sau mai puţin, anticorpul respectiv inhibă depunerea C3b în 90% ser uman la IC50 de 30 nM sau mai mică, în care anticorpul reprezintă un fragment de anticorp selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab)2 şi F(ab')2, în care anticorpul este o moleculă cu un singur lanţ, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG2, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG1, în care anticorpul respective este o moleculă IgG4, în care molecula IgG4 cuprinde o mutaţie S228P şi/sau în care anticorpul nu inhibă semnificativ calea clasică. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea alternativă. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea clasică sau calea alternativă (adică inhibă calea lectinei, lăsând intacte căile clasice şi alternative ale complementului).

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul subiectului, care suferă de CAPS, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat. În unele variante de realizare anticorpul inhibitor de MASP-2 inhibă formarea trombilor în serul subiectului, care suferă de CAPS, la un nivel ce depăşeşte cel puţin de 20% sau mai mult (cum ar fi cel puţin de 30%, cel puţin de 40%, cel puţin de 50%) efectul inhibitor asupra depunerii C5b-9 în ser.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul pacientului cu CAPS cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă de CAPS, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare la antigen, care recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop pe MASP-2 umană, recunoscută de anticorpul de referinţă OMS646, conţinând regiunea variabilă a lanţului greu , notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor , notată ca SECV ID NR: 70.

TMA asociată cancerului

Neoformaţiunile maligne sistemice de orice tip pot conduce la manifestări clinice şi patologice de TMA (Batts and Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40: 709-719, 2007). TMA asociată cancerului se depistează deseori în plămâni şi pare a fi asociată cu emboli tumorali (Francis KK et al., Commun Oncol 2:339-43, 2005). Embolii tumorali pot reduce fluxul sanguin şi, astfel, pot conduce la o stare de hipoperfuzie în arteriolele şi venulele afectate. Se presupune, ca stresul şi leziunile ţesutului rezultate vor activa calea lectinei complementului în mod localizat. Calea lectinei activată, la rândul ei, poate activa cascada de coagulare prin scindarea dependentă de MASP-2 a protrombinei în trombină, conducând la o stare protrombotică caracteristică pentru TMA. Inhibarea MASP-2, în acest context, este de aşteptat să reducă activarea localizată a trombinei şi, astfel, să atenueze starea protrombotică.

Prin urmare, aşa cum se descrie aici pentru alte TMA, este de aşteptat ca inhibitorii căii lectinei, incluzând, dar fără a se limita, anticorpi care blochează funcţia MASP-2, să fie benefici în tratarea pacienţilor care suferă de TMA asociată cancerului.

În conformitate cu aceasta, într-o altă variantă de realizare invenţia prevede metode tratare sau prevenire a TMA asociată cancerului prin administrarea la un subiect care suferă sau cu risc de dezvoltare a TMA asociată cancerului a unei compoziţii cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp MASP-2, într-un purtător farmaceutic. Subiectului, care suferă sau cu risc de dezvoltare a TMA asociată cancerului, agentul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, subcutanată sau altă administrare parenterală sau potenţial pentru agenţii non-peptiderici - prin administrare orală. Anticorpul anti-MASP-2 se poate administra sub formă de monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab.

Într-un exemplu de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 prezintă cel puţin de una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: anticorpul menţionat leagă MASP-2 uman cu KD de 10 nM sau mai mică, anticorpul menţionat leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2, anticorpul respectiv inhibă depunerea C3b într-un test in vitro în 1% ser uman la IC50 de 10 nM sau mai puţin, anticorp respective inhibă depunerea C3b în 90% ser uman la IC50 de 30 nM sau mai mică, în care anticorpul reprezintă un fragment de anticorp selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab)2 şi F(ab')2, în care anticorpul este o moleculă cu un singur lanţ, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG2, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG1, în care anticorpul respective este o moleculă IgG4, în care molecula IgG4 cuprinde o mutaţie S228P şi/sau în care anticorpul nu inhibă semnificativ calea clasică. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea alternativă. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi nu inhibă semnificativ calea clasică sau calea alternativă (adică inhibă calea lectinei, lăsând intacte căile clasice şi alternative ale complementului).

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul subiectului, care suferă de TMA asociată cancerului, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul pacientului, care suferă de TMA asociată cancerului, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă de TMA asociată cancerului, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare la antigen, care recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop pe MASP-2 umană recunoscută de anticorpul de referinţă OMS646, conţinând regiunea variabilă a lanţului greu , notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor , notată ca SECV ID NR: 70.

TMA asociate chimioterapiei cancerului

TMA asociată chimioterapiei este o stare, care implică trombocitopenie, anemie hemolitică microangiopatică şi disfuncţie renală, care se dezvoltă la 2-10% dintre pacienţii cu antecedente de neoplasme maligne tratate cu agenţi chimioterapeutici, cum ar fi gemcitabină, mitomicină, oxaliplatină, etc. TMA asociată cu chimioterapia este însoţită de rezultate clinice ineficiente cu mortalitate înaltă (Blake-Haskins et al., Clin Cancer Res 17 (18): 5858-5866, 2011).

Etiologia TMA asociate chimioterapiei se presupune că include o deteriorare nespecifică toxică a endoteliului microvascular. Într-un model experimental pe animale cu TMA indusă de mitomicină a fost demonstrată o leziune directă a celulelor endoteliale (Dlott J. et al., Ther Apher Dial 8: 102-11, 2004). S-a demonstrat, că lezarea celulelor endoteliale printr-o varietate de mecanisme activează calea lectinei complementului. De exemplu, Stahl et al. au relatat, că celulele endoteliale, expuse la stresul oxidativ, activează calea lectinei complementului atât in vitro, cât şi in vivo (Collard et al., Am J Pathol., 156 (5): 1549-56, 2000; La Bonte et al., J. Immunol. 15; 188 (2): 885-91, 2012). In vivo, acest proces conduce la tromboză şi s-a demonstrat, că inhibarea căii lectinei previne tromboza (La Bonte et al., J Immunol., 15, 188 (2): 885-91, 2012). Mai mult decât atât, aşa cum se demonstrează în Exemplele 37-39 din prezenta descriere, în modelul experimental murin cu TMA, în care fotoexcitarea localizată FITC-Dex s-a utilizat pentru a induce leziuni localizate ale microvasculaturii, cu dezvoltarea ulterioară a unui răspuns TMA, s-a relevat că inhibarea MASP-2 poate preveni TMA. Astfel, leziunea microvasculară a endoteliului cu agenţi chimioterapeutici poate activa calea lectinei a complementului, care apoi creează o stare protrombotică localizată şi promovează un răspuns TMA. Deoarece activarea căii lectinei şi crearea unei stări protrombotice este dependentă de MASP-2, este de aşteptat ca inhibitorii MASP-2, incluzând, dar fără a se limita, anticorpi care blochează funcţia MASP-2, să atenueze răspunsul TMA si sa reducă riscul de TMA asociate chimioterapiei cancerului.

În conformitate cu aceasta, într-o altă variantă de realizare invenţia prevede metode tratare sau prevenire a TMA asociată chimioterapiei cancerului prin administrarea la un subiect care suferă sau cu risc de dezvoltare a TMA asociată chimioterapiei cancerului a unei compoziţii cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp MASP-2, într-un purtător farmaceutic. Subiectului, care a suportat, suportă sau va suporta chimioterapie, agentul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, subcutanată sau altă administrare parenterală sau potenţial pentru agenţii non-peptiderici - prin administrare orală. Anticorpul anti-MASP-2 se poate administra sub formă de monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul subiectului, care suferă de TMA asociată chimioterapiei cancerului, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul pacientului, care suferă de TMA asociată chimioterapiei cancerului, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă de TMA asociată chimioterapiei cancerului, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR:67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare la antigen, care recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop pe MASP-2 uman recunoscut de anticorpul de referinţă OMS646, conţinând regiunea variabilă a lanţului greu , notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor, notată ca SECV ID NR: 70.

TMA asociată transplantului

TMA asociată transplantului (TA-TMA) este un sindrom devastator, care poate apărea la pacienţii cu transplant, cum ar fi recipienţii de transplant de celule stem hematopoietice alogene (de exemplu, Batts and Lazarus, Bone Marrow Transplantation 40: 709-719, 2007). Patogeneza acestei stări este puţin elucidată, dar probabil implică o confluenţă a răspunsurilor, care culminează cu leziune celulară endotelială (Laskin B.L. et al., Blood 118 (6): 1452-62, 2011). Aşa cum s-a discutat mai sus, leziunea celulară endotelială este un stimulent prototip pentru activarea căii lectinei şi generarea unui mediu protrombotic.

Datele recente susţin în continuare rolul activării complementului prin calea lectinei în patogeneza TA-TMA. Laskin et al. au demonstrat că depunerea C4d în arteriolele renale este mult mai frecventă la subiecţii cu TA-TMA histologică (75%), comparativ cu martorii (8%) (Laskin B.L. et al., Transplantation, 27; 96(2):217-23, 2013). Astfel, C4d poate fi un marker al patologiei TA-TMA, implicând fixarea localizată a activării complementului prin calea lectinei sau clasică.

Deoarece activarea căii lectinei şi crearea unei stări protrombotice este dependentă de MASP-2, este de aşteptat ca inhibitorii MASP-2, incluzând, dar fără a se limita, anticorpi care blochează funcţia MASP-2, să atenueze răspunsul TMA şi să reducă riscul de TMA asociat transplantului (TA-TMA).

În conformitate cu aceasta, într-o altă variantă de realizare invenţia prevede metode tratare sau de prevenire a TMA asociată transplantului prin administrarea la un subiect care suferă sau cu risc de dezvoltare a TMA asociată transplantului a unei compoziţii cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp anti-MASP-2, într-un purtător farmaceutic. Subiectului, care a suportat, suportă sau va suporta o procedură de transplant, agentul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic, cum ar fi administrarea intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie, subcutanată sau altă administrare parenterală sau potenţial pentru agenţii non-peptiderici - prin administrare orală. Anticorpul anti-MASP-2 se poate administra sub formă de monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab. Într-o altă variantă de realizare invenţia prevede metode tratare sau prevenire a TMA asociată transplantului de celule stem alogene la un subiect până la, în timpul sau după transplant de celule stem alogene prin administrarea unei compoziţii cuprinzând o cantitate de un agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp anti-MASP-2

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul subiectului, care suferă de TMA asociată transplantului, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul pacientului, care suferă de TMA asociată transplantului, cel puţin de 30%, cum ar fi cel puţin de 40%, cum ar fi cel puţin de 50%, cum ar fi cel puţin de 60%, cum ar fi cel puţin de 70%, cum ar fi cel puţin de 80%, cum ar fi cel puţin de 85%, cum ar fi cel puţin de 90%, cum ar fi cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat.

Într-o variantă de realizare prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă de TMA asociată transplantului, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR:67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare la antigen, care recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop pe MASP-2 uman recunoscut de anticorpul de referinţă OMS646, conţinând regiunea variabilă a lanţului greu , notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor , notată ca SECV ID NR: 70.

IV. ROLUL MASP-2 ÎN ALTE BOLI ŞI STĂRI ŞI METODE TERAPEUTICE,ÎN CARE SE UTILIZEAZĂ AGENŢI DE INHIBARE AI MASP-2

PATOLOGII RENALE

Activarea sistemului complementului este implicată în patogeneza unei mari varietăţi de boli renale; inclusiv în glomerulonefrita mezangioproliferativă (nefropatia IgA, boala lui Berger) (Endo, M. et al., Clin Nephrology 55: 185-191, 2001), glomerulonefrita membranoasă (Kerjashki D., Arch B Cell Pathol 58: 253-71, 1990, Brenchley, P.E. et al., Kidney Int., 41: 933-7, 1992; Salant, D.J. et al., Kidney Int. 35: 976-84, 1989), glomerulonefrita membranoproliferativă (glomerulonefrita mezangiocapilară) (Bartlow, B.G. et al., Kidney Int. 15: 294-300, 1979; Meri, S. et al., J. Exp Med., 175: 939-50, 1992), glomerulonefrita postinfecţioasă acută (glomerulonefrita poststreptococică), glomerulonefrita crioglobulinemică (Ohsawa, I., et al., Clin Immunol 101: 59-66, 2001), nefrită lupică (Gatenby, P.A., Autoimmunity 11:61-6,1991) şi nefrită în purpura Henoch-Schonlein (Endo M. et al., Am. J. Kidney Dis 35: 401-407, 2000). Implicarea complementului într-o boală renală a fost determinată de mai multe decenii, dar persistă încă discuţii ample cu privire la rolul său exact în debutul, dezvoltarea şi faza de rezolvare a bolii renale. În condiţii normale contribuţia complementului este benefică pentru organismul gazdă, dar activarea necorespunzătoare şi depunerea complementului pot contribui la afectarea ţesutului.

Există dovezi semnificative că glomerulonefrita, inflamaţia glomerulelor, este adesea iniţiată prin depunerea complexelor imune pe structurile glomerulare sau tubulare, declanşând activarea complementului, inflamaţia şi deteriorarea ţesutului. Kahn şi Sinniah au demonstrat o depunere crescută a C5b9 în membranele bazale tubulare în biopsiile prelevate de la pacienţii cu diferite forme de glomerulonefrită (Kahn, T. N. et al., Histopath., 26: 351-6, 1995). Într-un studiu al pacienţilor cu nefrologie IgA (Alexopoulos, A. et al., Nephrol. Dial Transplant 10: 1166-1172, 1995) depunerea C5b9 în structurile tubulare epiteliale/membranei bazale a corelat cu nivelurile plasmatice ale creatininei. Într-un alt studiu al nefropatiei membranoase s-a demonstrat o relaţie între rezultatul clinic şi nivelurile urinare de sC5b-9 (Kon, S. P. et al., Kidney Int. 48: 1953-58, 1995). S-a constatat o corelaţie pozitivă între nivelurile crescute de sC5b-9 cu prognostic nefavorabil. Lehto et al., au determinat niveluri crescute de CD5-9, un factor de reglare al complementului care inhibă complexul de atac membranar din membranele plasmatice, precum şi de C5b-9 în urina de la pacienţii cu glomerulonefrită membranoasă (Lehto, T. et al., Kidney Int. 47: 1403-11, 1995). Analiza histopatologică a probelor de biopsie, prelevate de la aceiaşi pacienţi, a demonstrat depunerea proteinelor C3 şi C9 în glomerul, în timp ce exprimarea CD5-9 în aceste ţesuturi a fost diminuată, comparativ cu cea din ţesutul renal normal. Aceste studii diferite sugerează, că glomerulonefrita îndelungată mediată de complement conduce la excreţia urinară a proteinelor complementului, care corelează cu gradul de afectare a ţesutului şi pronosticul bolii.

Inhibarea activării complementului în diferite modele experimentale pe animale cu glomerulonefrită a demonstrat, de asemenea, importanţa activării complementului în etiologia bolii. Într-un model de glomerulonefrită membranoproliferativă (MPGN), perfuzarea antiserului anti-Thy1 la şobolanii cu deficit de C6 (care nu pot sintetiza C5b9) conducea la o proliferare celulară glomerulară cu 90% mai mică, o reducere de 80% a infiltraţiei plachetare şi macrofagale (un marker de extindere a matricei mezangiale) şi cu o proteinurie mai redusă cu 50%, comparativ cu şoarecii fără mutaţii (Brandt, J. et al., Kidney Int. 49: 335-343, 1996). Aceste rezultate indică, că C5b-9 are rol de mediator major al leziunii tisulare cu complement, în acest model de ser anti-timocitar pe şobolani. Într-un alt model de glomerulonefrită, infuzia de doze crescânde membrană bazală glomerulară de iepure anti-şobolan a produs o migraţie a leucocitelor polimorfonucleare (PMN) dependentă de doză, care a fost atenuat prin tratamentul anterior cu factor de venin de cobră (pentru a consuma complementul) (Scandrett, A.L. et al., Am. J. Physiol., 268: F256-F265, 1995). Şobolanii, care au fost trataţi cu factor de venin de cobră au prezentat, de asemenea, histopatologie diminuată, reducerea proteinuriei îndelungate şi niveluri scăzute de creatinină, comparativ cu şobolanii de control. Utilizând trei modele de glomerulonefrită (GN) la şobolani (ser antitimocitar, Concavalin A, anti-Concavalin A şi nefrită pasivă Heymann), Couser et al., au demonstrat eficacitatea terapeutică potenţială a abordărilor de inhibare a complementului prin utilizarea proteinei recombinante sCR1 (Couser, W.G., et al., J. Am., Soc Nephrol 5: 1888-94, 1995). Şobolanii trataţi cu sCR1 au prezentat o reducere semnificativă a migraţiei leucocitelor polimorfonucleare, trombocitelor şi macrofagelor, reducerea mezangiolizei şi proteinuriei, comparativ cu şobolanii de control. Dovezi suplimentare privind importanţa activării complementului în glomerulonefrită au fost furnizate prin utilizarea unui MoAb anti-C5 în modelul cu şoareci NZB/W F1. MoAb anti-C5 inhibă scindarea C5, blocând generarea de C5a şi C5b-9. Terapia continuă cu MoAb anti-C5 timp de 6 luni a condus la ameliorarea semnificativă a evoluţiei glomerulonefritei. Un anticorp monoclonal uman MoAb anti-C5 (5G1.1), care împiedică scindarea componentei complementului uman C5 în componentele sale pro-inflamatorii, este în curs de elaborare de către Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, ca tratament potenţial pentru glomerulonefrită.

Dovezi directe privind rolul patologic al complementului în leziunile renale sunt furnizate de studiile pacienţilor cu deficienţe genetice ale componentelor specifice ale complementului. O serie de publicaţii au evidenţiat o asociere a bolii renale cu deficienţe ale factorului H de reglare al complementului (Ault, B.H., Nephrol., 14: 1045-1053, 2000; Levy, M. et al., Kidney Int. 30: 949-56, 1986, Pickering, M.C. et al., Nat Genet., 31: 424-8, 2002). Deficitul de factor H conduce la reducerea concentraţiilor plasmatice ale factorului B şi C3 şi la consumul de C5b-9. Atât glomerulonefrita membranoproliferativă atipică (MPGN), cât şi sindromul hemolitic uremic idiopatic (HUS) se asociază cu deficienţa factorului H. Porcii cu deficitul factorului H (Jansen, J.H. et al., Kidney Int. 53: 331-49, 1998) şi şoareci cu knockout factorului H (Pickering, M.C., 2002) prezintă simptome asemănătoare MPGN, confirmând importanţa factorului H în reglarea complementului. Deficienţele altor componente ale complementului se asociază cu boala renală pe fondul evoluţiei lupusului eritematos sistemic (SLE) (Walport, M.J., Davies et al., Ann.NY.Acad.Sci.815: 267-81, 1997). Deficitul de C1q, C4 şi C2 predispune la dezvoltarea SLE prin mecanisme legate dereglarea eliminării complexelor imune şi al materialului apoptotic. La mulţi dintre aceşti pacienţi cu SLE apare nefrită lupică, caracterizată prin depunerea complexelor imune în întregul glomerul.

Dovezi suplimentare, care leagă activarea complementului şi patologia renală, au fost furnizate prin identificarea la pacienţi a autoanticorpilor direcţionaţi împotriva componentelor complementului, dintre care unele au fost direct legate de patologia renală (Trouw, L.A. et al., Mol Immunol., 38: 199-206, 2001). Un număr de astfel de autoanticorpi prezintă un grad atât de înalt de corelare cu patologia renală, încât pentru a indica această activitate a fost introdus termenul de factor nefritic (NeF). În studiile clinice aproximativ 50% dintre pacienţii, la care sunt prezenţi factorii nefritici, au dezvoltat MPGN (Spitzer, R. E. et al., Clin Immunol., Immunopathol., 64: 177-83). C3NeF este un autoanticorp direcţionat împotriva C3 convertazei căii alternative (C3bBb) şi stabilizează această conversie, promovând, astfel, activarea căii alternative (Daha, M. R. et al., J. Immunol., 116: 17, 1976). De asemenea, autoanticorpul cu o specificitate pentru C3 convertaza căii clasice (C4b2a), numit C4NeF, stabilizează această conversie şi, astfel, promovează activarea căii clasice (Daha, M.R. et al., J. Immunol., 125: 2051-2054, 1980; Halbwachs, L ., et al., J. Clin Invest., 65: 1249-56, 1980). Anticorpii anti-C1q au fost descrişi ca fiind legaţi de nefrită la pacienţii cu SLE (Hovath, L. et al., Clin Exp., Rheumatol., 19: 667-72, 2001, Siegert, C. et al., J.Rheumatol. 18, 230-34, 1991, Siegert, C. et al., Clin Exp., Rheumatol, 10:19-23, 1992) şi o creştere a titrului acestor autoanticorpi anti-C1q se consideră ca prezicând o instalare a nefritei (Coremans, I.E. et al., Am. J. Kidney Dis., 26: 595-601, 1995). Depozitele imune, prelevate din rinichi postmortem de la pacienţi cu SLE, au prezentat acumularea în rinichi a acestor autoanticorpi anti-C1q (Mannick, M. et al., Arthritis Rheumatol., 40: 1504-11, 1997). Toate aceste fapte indică rolul patologic al acestor autoanticorpi. Cu toate acestea, nu toţi pacienţii cu autoanticorpi anti-C1q dezvoltă o patologie renală şi, de asemenea, unii indivizi sănătoşi au titre reduse de autoanticorpi anti-C1q. (Siegert, C.E., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 67:204-9, 1993).

Adiţional la căile alternative şi clasice de activare a complementului, calea lectinei poate avea, de asemenea, un rol patologic important în patologia renală. Nivelurile înalte de MBL, serin-protează asociată cu MBL şi produse de activare a complementului au fost detectate prin tehnici imunohistochimice în materialul biopsic renal, prelevat de la pacienţi diagnosticaţi cu diferite afecţiuni renale, inclusiv cu nefrită în purpura Henoch Schonlein (Endo, M. et al., Am. J. Kidney Dis 35: 401-407, 2000), glomerulonefrită crioglobulinemică (Ohsawa, I. et al., Clin Immunol 101: 59-66, 2001) şi neuropatie IgA (Endo M. et al., Nephrology 55: 185-191, 2001). Prin urmare, în pofida faptului, că o asociere între bolile renale şi complement este cunoscută de câteva decenii, datele despre modul în care complementul influenţează exact aceste boli renale sunt departe de a fi complete.

TULBURĂRI SANGVINE

Sepsisul este cauzat de o reacţie generalizată a pacientului la invazia microorganismelor. O funcţie majoră a sistemului de complement este de a dirija răspunsul inflamator la invaziile bacteriene şi de alţi agenţi patogeni. În concordanţă cu acest rol fiziologic, activarea complementului a fost demonstrată în numeroase studii ca având un rol major în patogeneza sepsisului (Bone, R. C., Annals, Intern Med., 115: 457-469, 1991). Definirea manifestărilor clinice ale sepsisului este în continuă evoluţie. Sepsisul este, de obicei, definit ca răspuns sistemic al organismului gazdă la o infecţie. Totuşi, în multiple situaţii, la pacienţii cu simptome septice nu există semne clinice evidente pentru infecţie (de exemplu, culturi bacteriene pozitive în sânge). Această discrepanţă a fost mai întâi luată în considerare la o conferinţă pentru atingerea consensului în a. 1992, când a fost introdus termenul de "sindrom de răspuns inflamator sistemic" (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) şi pentru care nu este necesară prezenţa definitivată a infecţiei bacteriene (Bone, R.C. et al., Crit. Care Med 20: 724-726, 1992). În prezent există o opinie generală, că sepsisul şi SIRS sunt însoţite de incapacitatea de a regla răspunsul inflamator. În contextul acestei revizuiri scurte, vom lua în considerare definiţia clinică a sepsisului, care include, de asemenea, septicemia severă, şocul septic şi SIRS.

Sursa predominantă de infecţie la pacienţii septici înainte de sfârşitul anilor 1980 era bacteria gram negativă. Se ştie că lipopolizaharida (LPS), componenta principala a peretelui celular al bacteriilor gram negative, stimulează eliberarea mediatorilor inflamatori din diferite tipuri de celule şi induce simptome infecţioase acute atunci când este injectată la animale (Haeney, M.R. et al., Antimicrobial Chemotherapy 41 Suppl A): 41-6, 1998). Este interesant, că spectrul microorganismelor responsabile de dezvoltarea afecţiunii pare să fi trecut de la bacterii predominant gram negative la sfârşitul anilor 1970 şi 1980 la bacterii predominant gram pozitive în prezent, din motive care în prezent sunt neclare (Martin, G.S. et al., N. Eng. Med 348: 1546-54, 2003).

Numeroase studii au arătat importanţa activării complementului în medierea inflamaţiei şi contribuţia la caracteristicile şocului, în special ale şocului septic şi hemoragic. Atât organismele gram negative, cât şi cele gram pozitive provoacă şocul septic. LPS este un activator potenţial al complementului, predominant prin calea alternativă, deşi apare şi o activare a căii clasice mediate de anticorpi (Fearon, D.T., et al., N. Engl., J. Med., 292: 937-400, 1975). Componentele principale ale peretelui celular al bacteriilor gram pozitive sunt peptidoglicanul şi acidul lipoteichoic, ambele componente fiind activatori puternici ai căii alternative a complementului, deşi în prezenţa anticorpilor specifici pot activa şi calea clasică a complementului (Joiner, K.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 2:461-2, 1984).

Sistemul complementului a fost iniţial implicat în patogeneza sepsisului, când cercetătorii au observat că anafilatoxinele C3a şi C5a mediază o diversitate de reacţii inflamatorii, care pot apărea şi în timpul sepsisului. Aceste anafilatoxine induc vasodilataţie şi o creştere a permeabilităţii microvasculare, evenimente care joacă un rol central în şocul septic (Schumacher, W. A. et al., Agents Actions 34: 345-349, 1991). În plus, anafilatoxinele induc bronhospasm, eliberarea histaminei din celulele mastocite şi agregarea trombocitelor. Mai mult decât atât, ele exercită numeroase efecte asupra granulocitelor, cum ar fi chemotaxia, agregarea, adeziunea, eliberarea enzimelor lizosomale, generarea de anioni toxici de superoxid şi formarea leucotrienelor (Shin, H.S. et al., Science 162: 361-363, 1968; Vogt, W., Complement 3: 177-86, 1986). Se consideră, că aceste efecte biologice joacă un anumit rol în dezvoltarea complicaţiilor sepsisului, cum ar fi şocul sau sindromul de insuficienţă respiratoare acută (ARDS) (Hammerschmidt, D.E. et al., Lancet 1: 947-949, 1980; Slotman, G.T. et al., Surgery 99: 744-50, 1986). Mai mult decât atât, nivelurile înalte de anafilatoxină C3a se asociază cu un rezultat fatal în sepsis (Hack, C.E., et al., Am., Med., 86:20-26). În unele modele experimentale de şoc la animale, anumite tulpini cu deficit de complement (de exemplu, cele cu deficit de C5) sunt mai rezistente la acţiunea infuziilor cu LPS (Hseuh, W., et al., Immunol. 70:309-14, 1990).

S-a constatat, că blocarea generării C5a cu anticorpi în timpul debutului sepsisului la rozătoare, îmbunătăţeşte foarte mult supravieţuirea (Czermak, B.J., et al., Nat. Med., 5: 788-792, 1999). Constatări similare au fost făcute şi atunci când receptorul C5a (C5aR) a fost blocat fie cu anticorpi, fie cu un inhibitor micromolecular (Huber-Lang, M.S. et al., FASEB J. 16: 1567-74, 2002; Riedemann, N.C. et al., J. Clin Invest. 110: 101-8, 2002). Studiile experimentale anterioare la maimuţe au sugerat, că blocarea cu anticorpi a C5a atenuează şocul septic indus de E. coli şi sindromul de insuficienţă respiratoare la adulţi (Hangen, D.H. et al., J. Surg.Res.46: 195-9, 1989; Stevens, J.H., et al., J. Clin Invest., 77: 1812-16, 1986). La persoanele, care suferă de sepsis, nivelul de C5a s-a dovedit a fi crescut şi se asocia cu rate de supravieţuire semnificativ reduse, împreună cu o insuficienţă multiorganică, comparativ cu cel al pacienţilor cu sepsis mai puţin sever şi la supravieţuitori (Nakae, H. et al., Res. Cun. Chem. Pathol. Pharmacol 84: 189-95, 1994; Nakae et al., Surg., 26, 225-99, 1996; Bengtson, A. et al., Arch Surg 123: 645-649, 1988). Mecanismele prin care C5a îşi exercită efectele nocive în timpul sepsisului trebuie încă investigate mai detaliat, dar datele recente sugerează că generarea de C5a în timpul sepsisului compromite în mod semnificativ funcţiile imune congenitale ale neutrofilelor sanguine (Huber-Lang, M.S. et al., J. Immunol. 169: 3223-31, 2002), capacitatea lor de a exprima o insuficienţă respiratorie şi capacitatea lor de a genera citokine (Riedemann, N.C. et al., Immunity 19: 193-202, 2003). În plus, generarea C5a în timpul sepsisului pare să aibă efecte procoagulante (Laudes, I.J., et al., Am., J. Pathol., 160: 1867-75, 2002). Proteina CI INH modulatoare de compliment a demonstrat, de asemenea, eficacitate în modelele experimentale pe animale cu sepsis şi ARDS (Dickneite, G., Behring Ins. Mitt. 93:299-305, 1993).

Calea lectinei poate avea, de asemenea, un anumit rol în patogeneza sepsisului. S-a demonstrat, că MBL se poate lega cu o serie de microorganisme importante din punct de vedere clinic, incluzând atât bacterii gram negative, cât şi gram pozitive, şi pentru a activa calea lectinei (Neth, O., et al., Infect Immun 68: 688, 2000). Acidul lipoteichoic (LTA) este din ce în ce mai mult considerat în calitate de analog gram pozitiv al LPS. El este un imunostimulator puternic, care induce eliberarea de citokine din fagocitele mononucleare şi din sângele integral (Morath, S. et al., J. Exp. Med., 195: 1635, 2002; Morath, S. et al., Infect. Immun. 70: 938, 2002). Recent s-a demonstrat, că L-ficolina se leagă în mod specific cu LTA, izolat din numeroase specii de bacterii gram pozitive, incluzând Staphylococcus Aureus, şi activează calea lectinei (Lynch, N.J., et al., J. Immunol.172: 1198-02, 2004). De asemenea, s-a arătat că MBL se leagă cu LTA din Enterococcus Spp în care lanţul poliglicerofosfat este substituit cu grupe glicozil, dar nu cu LTA de la alte nouă specii, inclusiv S. Aureus (Polotsky, V.Y. et al., Infect. Immun. 64: 380, 1996).

Într-un aspect al invenţiei se prevede, astfel, o metodă de tratare a sepsisului sau a unei stări care rezultă din sepsis, prin administrarea unei compoziţii cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2 într-un purtător farmaceutic la un subiect care suferă de sepsis sau de o afecţiune care rezultă din sepsis incluzând, fără limitare, sepsisul sever, şocul septic, sindromul de insuficienţă respiratoare acută, care rezultă din sepsis, şi sindromul de răspuns inflamator sistemic. Metodele asociate sunt prevăzute pentru tratamentul altor afecţiuni ale sângelui, inclusiv al şocului hemoragic, anemiei hemolitice, purpurii trombotice trombocitopenice autoimune (TTP), sindromului hemolitic uremic (HUS), sindromului hemolitic uremic atipic (aHUS) sau al altor afecţiuni distructive ale măduvei osoase/sângelui, prin administrarea unei compoziţii cuprinzând o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2 într-un purtător farmaceutic la un subiect care suferă de o astfel de afecţiune. Agentul inhibitor al MASP-2 se administrează subiectului sistemic, cum ar fi prin administrare intra-arterială, intravenoasă, intramusculară, inhalatorie (în special în cazul ARDS), administrare subcutanată sau altă administrare parenterală sau potenţial prin administrare orală pentru agenţii nepeptidici. Compoziţia de agent inhibitor al MASP-2 poate fi combinată cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari pentru combaterea sechelelor de sepsis şi/sau şocului. Pentru septicemia avansată sau şoc, sau starea de stres care rezultă din aceasta, compoziţia inhibitoare a MASP-2 se poate administra în mod adecvat într-o formă de dozare cu acţiune rapidă, cum ar fi prin administrarea intravenoasă sau intraarterială a unui bolus de soluţie conţinând compoziţia de agent inhibitor al MASP-2. Administrarea repetată poate fi efectuată la indicaţia unui medic până la rezolvarea situaţiei.

COAGULOPATII

Au fost relevate dovezi privind rolul sistemului complementului în coagularea intravasculară diseminată (DIC), cum ar fi DIC secundară în traumatismele majore corporale.

Studiile anterioare au arătat, că şoarecii C4-/- nu sunt protejaţi împotriva leziunilor de reperfuzie renale. (Zhou, W. et al., "Predominant role for C5b-9 în renal ischemia/reperfusion inujury", J Clin Invest 105: 1363-1371 (2000)). Pentru a investiga abilitatea şoarecilor C4-/- de a activa complementul fie prin calea clasică, fie prin calea lectinei, a fost măsurată trecerea C3 în C4-/- în plasmă în teste specifice fie pentru calea clasică, fie pentru calea de activare a lectinei. Deşi nu s-a observat scindarea C3, când s-a declanşat activarea prin calea clasică, s-a observat o activare dependentă de calea lectinei foarte eficientă a C3 în serul deficient de C4 (fig. 30). Se poate observa că depunerea C3b pe manan şi zimosan este sever compromisă la şoarecii MASP-2-/-, chiar şi în condiţii experimentale, ceea ce, conform numeroaselor lucrări publicate anterior despre activarea căii alternative, ar trebui să fie permisivă pentru toate cele trei căi. Atunci când se utilizează acelaşi ser în godeurile acoperite cu complecşi de imunoglobulină în loc de manan sau zimosan, depunerile de C3b şi scindarea factorului B se observă în serurile de la şoareci MASP-2+/+ şi în serurile de la şoarecii MASP-2-/-, dar nu în seruri cu depleţia C1q. Aceasta indică că activarea căii alternative este facilitată în serul MASP-2-/-, când C3b iniţial este furnizat prin activitate clasică. Fig. 30C ilustrează constatarea surprinzătoare, că C3 în plasmă cu deficit de C4 poate fi activat în mod eficient într-o manieră dependentă de calea lectinei.

Această "cale de ocolire a activării C4" este eliminată prin inhibarea activării căii lectinei prin preincubarea plasmei cu manan sau manoză solubilă.

Activarea aberantă, non-imună, a sistemului complementului este potenţial periculoasă pentru om şi poate juca, de asemenea, un rol important în activarea căii hematologice, în special, în situaţii de traumatism sever, în care se activează atât căile inflamatorii, cât şi cele hematologice. În condiţii normale de sănătate, conversia C3 constituie <5% din proteina C3 totală plasmatică. În cazul unei infecţiei severe răspândite, inclusiv în septicemie şi boala complexului imun, conversia C3 se restabileşte până la aproximativ 30%, nivelurile complementului fiind frecvent mai reduse, decât în mod obişnuit, datorită creşterii utilizării şi modificărilor în distribuţia rezervelor. Activarea imediată a căii C3, depăşind 30%, generează de obicei dovezi clinice evidente privind vasodilataţia şi pierderea lichidelor în ţesuturi. La o conversie C3 depăşind 30% mecanismele de iniţiere sunt predominant neimune şi manifestările clinice rezultate sunt nocive pentru pacient. Nivelurile de complement C5 în starea de sănătate şi în boala controlată apar mult mai stabile, decât C3. Reduceri semnificative ale nivelurilor şi/sau de conversie a C5 se asociază cu răspunsul pacientului la politrauma atipică (de exemplu, accidentele de trafic rutier) şi dezvoltarea probabilă a sindroamelor de plămân de şoc. Astfel, orice dovezi de activare a complementului C3 peste 30% din rezervele vasculare sau de orice implicare a C5 sau a ambelor pot fi considerate a fi probabil un predicator al unei modificări patologice nocive la pacient.

Ambele C3 şi C5 eliberează anafilatoxine (C3a şi C5a), care acţionează asupra celulelor mastocite şi bazofilelor, care eliberează substanţe chimice vasodilatatoare. S-au stabilit gradienţi chemotactici pentru ghidarea celulelor polimorfonucleare (PMN) in centrul tulburărilor imunologice (un răspuns benefic), dar aici se deosebesc deoarece C5a are un efect specific de aglomerare (agregare) asupra acestor celule fagocitare, prevenind deplasarea lor aleatorie departe de locul de reacţie. Într-un control normal al infecţiei, C3 activează C5. Cu toate acestea, în politraumă C5 pare a fi activat semnificativ, generând anafilatoxine C5a sistemic. Această activitate necontrolată determină ca polimorfele să se acumuleze în sistemul vascular, iar aceste aglomerări sunt apoi introduse în capilarele plămânilor, pe care le blochează şi ca urmare a eliberării superoxidului generează efecte locale dăunătoare. Deşi, nu se doreşte limitarea prin teorie, mecanismul probabil este important în patogeneza sindromului de insuficienţă respiratoare acută (ARDS), deşi această opinie a fost recent exprimată. Anafilatoxinele C3a in vitro s-au dovedit a fi agenţi puternici de agregare parchetară, dar implicarea lor in vivo este mai puţin definită, iar eliberarea substanţelor plachetare şi plasminei în reparaţia plăgii poate implica numai secundar complementul C3. Este posibil ca elevarea prelungită a activării C3 să fie necesară pentru a genera DIC.

Adiţional la efectele celulare şi vasculare ale componentei complementului activat, descris mai sus, care ar putea explica legătura dintre traumă şi DIC, descoperirile ştiinţifice emergente au identificat legături moleculare directe şi interacţiuni funcţionale între complement şi sistemele de coagulare. Datele de susţinere au fost obţinute pe baza studiilor efectuate la şoarecii cu deficit de C3. Deoarece C3 este componenta generală pentru fiecare dintre căile complementului, se presupune că şoarecii cu deficit de C3 nu au toate funcţiile complementului. Surprinzător, totuşi, şoarecii cu deficit de C3 sunt perfect capabili să activeze componentele terminale ale complementului. (Huber-Lang, M. et al., " Generation of C5a in the absence of C3: a new complement activation pathway", Nat. Med 12: 682-687 (2006)). Studiile aprofundate au arătat că activarea independentă de C3 a componentelor terminale ale complementului este mediată de trombină, enzima care limitează viteza cascadei de coagulare. (Huber et al., 2006) Componentele moleculare, care mediază activarea trombinei în urma activării complementului iniţial, rămân imperceptibile.

Prezenta invenţie a elucidat ceea ce se crede a fi baza moleculară a interacţiunii între cascadele complementului şi de coagulare şi a identificat MASP-2 ca punct de control central, care leagă cele două sisteme. Studiile biochimice privind specificitatea substratului MASP-2 au identificat protrombina ca un posibil substrat, adiţional la bine cunoscutele proteine complementare C2 şi C4. MASP-2 scindează în mod specific protrombina în locurile relevante funcţional, generând trombină, enzima care limitează viteza cascadei de coagulare. (Krarup, A. et al., "Simultaneous Activation of Complement and Coagulation by MBL-Associated Serine Protease 2" PLoS. ONE. 2: e623 (2007)) Trombina, generată de MASP-2, este abilă să promoveze depunerea fibrinei într-un anumit sistem reconstituit in vitro, care demonstrează relevanţa funcţională a scindării MASP-2. (Krarup et al., 2007). Cum se discută în exemplele prezentate în continuare, inventatorii au confirmat în continuare semnificaţia fiziologică a acestei descoperiri prin documentarea activării trombinei în serul normal de rozătoare după activarea căii lectinei şi au demonstrat că acest proces este blocat prin neutralizarea MASP-2 cu anticorpi monoclonali.

MASP-2 poate reprezenta un punct de ramificaţie central în calea lectinei, abil să promoveze activarea atât a sistemului complementului, cât şi a sistemelor de coagulare. Deoarece activarea căii lectinei este un răspuns fiziologic la multe tipuri de leziuni traumatice, inventatorii consideră că inflamaţia sistemică concurentă (mediată de componentele complementului) şi coagularea diseminată (mediată prin calea de coagulare) poate fi explicată prin capacitatea MASP-2 de a activa ambele căi. Aceste descoperiri sugerează în mod clar rolul MASP-2 în generarea DIC şi beneficiul terapeutic al inhibării MASP-2 în tratarea sau prevenirea DIC. MASP-2 poate asigura legătura moleculară între complement şi sistemul de coagulare şi activarea căii lectinei, în condiţiile unui traumatism poate iniţia direct activarea sistemului de coagulare prin axa MASP-2-trombină, asigurând mecanismul de legătură între traumatism şi DIC. În conformitate cu un aspect al prezentei invenţii, inhibarea MASP-2 ar inhiba activarea căii lectinei şi ar reduce generarea ambelor anafilatoxine C3a şi C5a. Pentru a genera DIC se crede că este necesară amplificarea de lungă durată a activării C3.

Coagularea microcirculatorie (trombi în capilare şi în vasele mici de sânge) are loc în aşa stări, cum ar fi şocul septic. S-a constatat rolul căii lectinei în şocul septic, evidenţiat cu fenotipul protejat în modelele experimentale de sepsis cu şoareci MASP-2 (-/-), descrise în Exemplul 17 şi fig. 18 şi 19. Mai mult decât atât, cum s-a demonstrat în exemplul 15 şi fig. 16A şi 16B, şoarecii MASP-2 (-/-) sunt protejaţi în modelul experimental de reacţie Schwartzman localizată de coagulare intravasculară diseminată (DIC), un model de coagulare microvasculară localizată.

V. AGENŢI INHIBITORI AI MASP-2

Într-un aspect prezenta invenţie prevede metode inhibare a activării complementului dependente de MASP2 la un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei microangiopatii trombotice. Agenţii inhibitori ai MASP-2 se administrează într-o cantitate eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2 la un subiect viu. În practica acestui aspect al invenţiei, agenţii inhibitori ai MASP 2 includ: molecule care inhibă activitatea biologică a MASP-2 (cum ar fi inhibitori micromoleculari, anticorpi anti-MASP-2 sau peptide blocante, care interacţionează cu MASP-2 sau care interferează cu o interacţiune proteină-proteină) şi molecule care reduc expresia MASP-2 (cum ar fi moleculele de acid nucleic MASP-2 antisens, moleculele de ARNi specifice MASP-2 şi ribozimele MASP-2), prevenind, astfel, activarea căii lectinei a complementului de către MASP-2. Agenţii inhibitori ai MASP-2 pot fi utilizaţi sub formă de monoterapie ca terapie primară sau în combinaţie cu alte terapii, cum ar fi terapia adjuvantă, pentru a spori beneficiile terapeutice ale altor tratamente medicale.

Inhibarea activării complementului dependente de MASP 2 se caracterizează prin cel puţin de una din următoarele modificări într-o componentă a sistemului complementului, care apare ca urmare a administrării unui agent inhibitor al MASP-2 în conformitate cu metodele prezentei invenţii: inhibarea generării sau producerii produselor sistemului de activare a complementului dependentă de MASP-2: C4b, C3a, C5a şi/sau C5b9 (MAC) (măsurate, de exemplu, cum se descrie în Exemplul 2), reducerea activării complementului evaluată într-un test hemolitic utilizând hematii nesensibilizate de iepure şi cobai (măsurată, de exemplu, cum se descrie în Exemplul 33), reducerea scindării C4 şi a depunerii C4b (măsurată, de exemplu, cum se descrie în Exemplul 2) sau reducerea scindării C3 şi depunerii C3b (măsurată, de exemplu, cum se descrie în Exemplul 2).

Conform prezentei invenţii, se utilizează agenţi inhibitori ai MASP-2, eficienţi în inhibarea sistemului de activare a complementului dependentă de MASP-2. Agenţii inhibitori ai MASP-2, utili în practica acestui aspect al invenţiei, includ, de exemplu, anticorpi anti-MASP-2 şi fragmente ale acestora, peptide inhibitoare a MASP-2, substanţe micromoleculeculare, receptori solubili pentru MASP-2 şi inhibitori de expresie. Agenţii inhibitori ai MASP-2 pot inhiba sistemul de activare a complementului dependentă de MASP-2 prin blocarea funcţiei biologice a MASP-2. De exemplu, un agent inhibitor poate bloca eficient interacţiunile proteină-proteină MASP-2, interfera cu dimerizarea sau asamblarea MASP-2, blochează legarea Ca2+, interferează cu situsul activ al serin proteazei MASP-2 sau poate reduce expresia proteinei MASP-2.

În unele variante de realizare agenţii inhibitori ai MASP 2 inhibă selectiv activarea complementului de MASP-2, menţinând sistemul de activare a complementului dependent de C1q funcţional intact.

Într-o variantă de realizare un agent inhibitor al MASP-2, util în metodele prezentei invenţii, este un agent inhibitor specific al MASP-2, care se leagă specific la o polipeptidă cuprinzând SECV ID NR: 6 cu o afinitate cel puţin de zece ori mai mare, decât la alte antigene din sistem complementului. Într-o altă variantă de realizare un agent inhibitor al MASP-2 se leagă în mod specific la o polipeptidă cuprinzând SECV ID NR: 6 cu o afinitate de legare cel puţin de 100 ori mai mare, decât la alte antigene din sistemul complementului. Afinitatea de legare a agentului inhibitor al MASP-2 poate fi determinată utilizând un test de legare potrivit.

Polipeptida MASP-2 reprezintă o structură moleculară similară cu MASP-1, MASP-3 şi C1r şi C1s proteazelor sistemului complementului C1. Molecula de ADNc, prezentă în SECV ID NR: 4, codifică un exemplu reprezentativ de MASP-2 (care constă din secvenţa de aminoacizi prezentă în SECV ID NR: 5) şi furnizează polipeptidă MASP-2 umană cu o secvenţă lider (aa 15), care este scindată după secreţie, rezultând cu forma matură de MASP-2 umană (SECV ID NR: 6). După cum se arată în fig. 2, gena MASP-2 umană cuprinde doisprezece exoni. ADNc MASP-2 uman este codificat de exonii B, C, D, F, G, H, I, J, K şi L. O îmbinare alternativă are drept rezultat o proteină de 20 kDa denumită proteină 19 asociată cu MBL ("MAp19" referindu-se, de asemenea, la "sMAP") (SECV ID NR: 2), codificată de SECV ID NR: 1, care rezultă din exonii B, C, D şi E, cum se arată în fig. 2. Molecula de ADNc, descrisă în SECV ID NR: 50, codifică MASP-2 murină (constând din secvenţa de aminoacizi prezentă în SECV ID NR: 51) şi furnizează polipeptida MASP-2 murină cu o secvenţă lider, care este scindată după secreţie, rezultând cu forma matură a MASP-2 murină (SECV ID NR: 52). Molecula de ADNc, descrisă în SECV ID NR: 53, codifică MASP-2 de şobolan (constând din secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 54) şi furnizează polipeptida MASP-2 de şobolan cu o secvenţă lider, care este scindată după secreţie, rezultând cu forma matură a MASP-2 de şobolan (SECV ID NR: 55).

Specialiştii în domeniu vor recunoaşte, că secvenţele descrise în SECV ID NR: 4, SECV ID NR: 50 şi SECV ID NR: 53 reprezintă alele singulare ale MASP-2 umană, murină şi de şobolan, respectiv, şi că se aşteaptă să apară variaţia alelică şi splicingul alternativ. Variantele alele ale secvenţelor nucleotide, arătate în SECV ID NR: 4, SECV ID NR: 50 şi SECV ID NR: 53, incluzând cele care conţin mutaţii silenţioase şi cele în care mutaţiile duc la modificări ale secvenţei de aminoacizi, se includ în scopul prezentei invenţii. Variantele alelice ale secvenţei MASP-2 pot fi clonate cu ADNc de sondare sau din bibliotecile genomice de la indivizi diferiţi, conform procedurilor standard.

Domeniile proteinei MASP-2 umane (SECV ID NR: 6) sunt prezentate în fig. 1 şi 2A şi includ un domeniu N terminal C1r/C1s/factorului de creştere al endoteliului vaselor (Vegf) al ariciului de mare/proteinei morfogenogene osoase (CUBI) (aa1-121 din SECV ID NR: 6), un domeniu asemănător factorului de creştere epidermal (aa 122-166), un domeniu CUBI secund (aa 167-293), precum şi un tandem al domeniilor proteinei de control al activităţii complementului şi domeniului serin proteazei. Splicingul alternativ al genei MASP-2 rezultă cu MAp19, prezentată în fig. 1. MAp19 este o proteină neenzimatică, care conţine regiunea N terminală CUB1-EGF a MASP-2 cu patru reziduuri adiţionale (EQSL), derivate din exonul E, cum se arată în fig. 1.

S-A ARĂTAT CĂ MAI MULTE PROTEINE SE LEAGĂ SAU INTERACŢIONEAZĂ CU MASP-2 PRIN INTERACŢIUNILE DINTRE PROTEINĂ ŞI PROTEINĂ. DE EXEMPLU, ESTE CUNOSCUT FAPTUL CĂ MASP-2 SE LEAGĂ, FORMND COMPLEXE DEPENDENTE DE CA2+, CU PROTEINELE LECTINEI MBL, H-FICOLINĂ ŞI L-FICOLINĂ. S-A DEMONSTRAT, CĂ FIECARE COMPLEX MASP-2/LECTINĂ ACTIVEAZĂ COMPLEMENTUL PRIN SCINDAREA DEPENDENTĂ DE MASP-2 A PROTEINELOR C4 ŞI C2 (IKEDA, K. ET AL., J. BIOL CHEM., 262: 7451-7454, 1987; MATSUSHITA, M., ET AL., J. EXP., MED., 176: 1497-2284, 2000; MATSUSHITA, M. ET AL., J. IMMUNOL., 168: 3502-3506, 2002). STUDIILE AU ARĂTAT, CĂ DOMENIILE CUB1-EGF ALE MASP-2 SUNT ESENŢIALE PENTRU ASOCIEREA MASP-2 CU MBL (THIELENS, N. M. ET AL., J. IMMUNOL., 166: 5068, 2001). S-A DEMONSTRAT, DE ASEMENEA, CĂ DOMENIILE CUB1EGFCUBII MEDIAZĂ DIMERIZAREA MASP-2, CARE ESTE NECESARĂ PENTRU FORMAREA UNUI COMPLEX MBL ACTIV (WALLIS, R. ET AL., J. BIOL.CHEM., 275: 30962-30969, 2000). PRIN URMARE, POT FI IDENTIFICAŢI AGENŢI INHIBITORI AI MASP-2, CARE SE LEAGĂ SAU INTERFEREAZĂ CU REGIUNILE ŢINTĂ ALE MASP-2, CUNOSCUTE A FI IMPORTANTE PENTRU ACTIVAREA COMPLEMENTULUI DEPENDENTĂ DE MASP-2.

AntiCORPII Anti-MASP-2

În unele variante de realizare ale acestui aspect al invenţiei agentul inhibitor al MASP-2 cuprinde un anticorp anti-MASP-2, care inhibă sistemul de activare a complementului dependentă de MASP-2. Anticorpii anti-MASP-2, utili în acest aspect al invenţiei, includ anticorpi policlonali, monoclonali sau recombinanţi, derivaţi de la orice mamifer producător de anticorpi şi pot fi anticorpi multispecifici, himerici, umanizaţi, anti-idiotip şi fragmente de anticorpi. Fragmentele de anticorpi includ: Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, fragmente Fv, fragmente scFv şi anticorpi cu un singur lanţ, cum se descriu în continuare.

În literatura de specialitate au fost descrişi mai mulţi anticorpi anti-MASP-2, dintre care unii sunt enumeraţi în continuare în Tabelul 1. Aceşti anticorpi anti-MASP-2, descrişi anterior, pot fi analizaţi pentru abilitatea lor de a inhiba sistemul de activare a complementului dependentă de MASP-2, folosind testele descrise aici. De exemplu, au fost identificaţi anticorpi Fab2 anti-MASP-2 de şobolan, care blochează activarea completă a complementului dependentă de MASP-2, cum este descris mai detaliat în Exemplele 10 şi 11 în continuare. După ce un anticorp anti-MASP-2 este identificat ca funcţionând ca agent inhibitor al MASP-2, el poate fi utilizat pentru a produce anticorpi anti-idiotip şi pentru a identifica alte molecule de legare MASP-2, cum se descrie în continuare.

Tabelul 1: ANTICORPI SPECIFICI MASP-2,

DESCRIŞI ÎN LITERATURA DE SPECIALITATE

ANTIGEN TIPUL DE ANTICORP REFERINŢĂ Recombinant MASP-2 Policlonal de şobolan Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 37:803-811, 2000 Recombinant uman CCP1/2-SP fragment (MoAb 8B5) MoAb de şobolan (subclasa IgG1) Moller-Kristensen, M., et al., J. of Immunol. Metode 282:159-167, 2003 Recombinant uman MAp19 (MoAb 6G12) (reacţii încrucişate cu MASP-2) MoAb de şobolan (subclasa IgG1) Moller-Kristensen, M., et al., J. of Immunol. Metode 282:159-167, 2003 hMASP-2 MoAb (S/P) murin MoAb (N-term) murin Peterson, S.V., et al., Mol. Immunol. 35:409, April 1998 hMASP-2 (domeniul CCP1-CCP2-SP MoAb murin: Nimoab101, produs de celulele liniei de hibridom 03050904 (ECACC) WO 2004/106384 hMASP-2 (în lungime completă-marcat cu histidină) MoAbs murin: NimoAb104, produs de celulele liniei de hibridom M0545YM035 (DSMZ) NimoAb108, produs de celulele liniei de hibridom M0545YM029 (DSMZ) NimoAb109 produs de celulele liniei de hibridom M0545YM046 (DSMZ) NimoAb110 produs de celulele liniei de hibridom M0545YM048 (DSMZ) WO 2004/106384

ANTICORPI ANTI-MASP-2 CU FUNCŢIE EFECTOARE REDUSĂ

În unele variante ale acestui aspect al invenţiei anticorpii anti-MASP-2 au funcţie efectoare redusă în ceea ce priveşte reducerea inflamaţiei, care poate să apară din activarea complementului pe calea clasică. Abilitatea moleculelor IgG de a declanşa calea clasică a complementului s-a dovedit a fi localizată în porţiunea internă Fc a moleculei (Duncan, A. R. et al., Nature 332: 738-740 1988). Moleculele IgG, în care porţiunea Fc a moleculei a fost îndepărtată prin scindare enzimatică, sunt lipsite de această funcţie efectoare (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). În consecinţă, anticorpii cu funcţie efectoare redusă pot fi generaţi ca urmare a lipsei porţiunii Fc a moleculei, datorită prezenţei secvenţei Fc construite genetic, care minimizează funcţia efectoare sau care este fie izotip IgG2, sau IgG4 uman.

Anticorpii cu funcţie efectoare redusă pot fi produşi prin manipularea biologică moleculară standard a porţiunii Fc a lanţurilor grele IgG, cum se descrie în Exemplul 9 din prezenta descriere şi, de asemenea, cum descriu Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10: 241-250, 1993 şi Rodrigues et al., J. Immunol. 151: 6954-6961, 1998. Anticorpii cu funcţie efectoare redusă includ, de asemenea, izotipurile IgG2 şi IgG4 umane, care au o abilitate redusă de a activa complementul şi/sau de a interacţiona cu receptorii Fc (Ravetch, J.V. et al., Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492, 1991; Isaacs, J.D. et al., J. Immunol., 148: 3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G. et al., Immunol., Today 14: 215-221, 1993). Anticorpii umanizaţi sau complet umani specifici pentru MASP-2 umană, conţinând izotipuri IgG2 sau IgG4, pot fi produşi prin una sau mai multe metode cunoscute unui specialist în domeniu, cum se descrie de Vaughan, T.J. et al., Nature Biotechnical 16: 535-539, 1998.

PRODUCEREA ANTICORPILOR ANTI-MASP-2

Anticorpii anti-Masp-2 pot fi produşi folosind polipeptide Masp-2 (de exemplu, Masp-2 cu lungime completă) sau folosind peptide antigenice purtătoare de epitop Masp-2 (de exemplu, o porţiune a polipeptidei MASP-2). Peptidele imunogene pot avea dimensiuni în limitele a cinci reziduuri de aminoacizi. De exemplu, polipeptida MASP-2, incluzând întreaga secvenţă de aminoacizi a SEQ ID NO: 6, poate fi folosită pentru a induce anticorpi anti-Masp-2, utili în metoda prezentei invenţii. Domeniile Masp-2 concrete, cunoscute a fi implicate în interacţiunile proteină-proteină, cum ar fi domeniile CUBI şi CUBIEGF, precum şi regiunea care cuprinde situsul activ de serin protează, pot fi exprimate ca polipeptide recombinante, cum se descrie în Exemplul 3 şi utilizate ca antigene. În plus, peptidele care cuprind o porţiune cel puţin de 6 aminoacizi ai polipeptidei MASP-2 (SEQ ID NO: 6) sunt, de asemenea, utile pentru a induce anticorpi MASP-2. Exemple suplimentare de antigene derivate MASP-2, utile pentru a induce anticorpi MASP-2, sunt prezentate în continuare în Tabelul 2. Peptidele şi polipeptidele MASP-2, utilizate pentru a produce anticorpi, pot fi izolate ca polipeptide naturale sau peptide recombinante sau sintetice şi polipeptide recombinante catalitic inactive, cum ar fi MASP-2A, cum se descrie în continuare în Exemplele 5, 7. În unele variante de realizare ale acestui aspect al invenţiei anticorpii anti-MASP-2 se obţin utilizând o tulpină de şoarece transgenic, cum se descrie în Exemplele 8 şi 9 şi sunt prezentate în continuare.

Antigenele utile pentru producerea anticorpilor anti-MASP-2 includ, de asemenea, polipeptide recombinante, cum ar fi recombinante MASP-2 sau o porţiune a acestora cu o polipeptidă de imunoglobulină sau cu o proteină fixatoare de maltoză. Imunogenul polipeptidic poate fi o moleculă cu lungime completă sau o porţiune din aceasta. Dacă porţiunea de polipeptidă este asemănătoare cu o haptenă, o astfel de porţiune poate fi în mod avantajos cuplată sau legată de un purtător macromolecular (cum ar fi hemocianina limfatică (KLH), albumina serică bovină (BSA) sau toxina tetanică) pentru imunizare.

Tabelul 2: ANTIGENE DERIVATE DIN MASP-2

SEQ ID NO: Secvenţa Amino Acidă SEQ ID NO:6 Proteina MASP-2 umană SEQ ID NO:51 Proteina MASP-2 murină SEQ ID NO:8 Domeniul CUBI al MASP-2 umană (aa 1-121 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:9 Domeniile CUBIEGF ale MASP-2 umană (aa 1-166 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:10 Domeniile CUBIEGFCUBII ale MASP-2 umană (aa 1-293 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:11 Domeniul EGF al MASP-2 uman (aa 122-166 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:12 Domeniul serin-proteazei al MASP-2 umană (aa 429-671 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:13 GKDSCRGDAGGALVFL forma mutantă inactivată de serin-protează (aa 610-625 din SEQ ID NO:6 cu mutaţia Ser 618) SEQ ID NO:14 TPLGPKWPEPVFGRL peptida CUBI umană SEQ ID NO:15: TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ peptida CUBI umană SEQ ID NO:16: TFRSDYSN MBL regiunea de legare în domeniul CUBI uman SEQ ID NO:17: FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF MBL regiunea de legare în domeniul CUBI uman SEQ ID NO:18 IDECQVAPG EGF peptidă SEQ ID NO:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV peptida din situsul serin-proteazei active

ANTICORPI POLICLONALI

Anticorpii policlonali împotriva MASP-2 se pot prepara prin imunizarea unui animal cu polipeptidă MASP-2 sau cu o porţiune imunogenă utilizând metode bine cunoscute specialiştilor în domeniu. De exemplu, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pagina 105 şi cum se descrie în continuare în Exemplul 6. Imunogenitatea unei polipeptide MASP-2 poate fi crescută prin utilizarea unui adjuvant, incluzând geluri minerale, cum ar fi hidroxidul de aluminiu sau adjuvantul Freund (complet sau incomplet), substanţe active de suprafaţă, cum ar fi lizolecitină, polioli polietilenpolipropilenoxid, polianioni, emulsii uleioase, hemocianină de melci şi dinitrofenol. Nivelurile de anticorpii policlonali sunt, de obicei, mai înalte la animale, cum ar fi cai, vaci, câini, pui, şobolani, şoareci, iepuri, porci de guineea, capre sau oi. În mod alternativ, un anticorp anti-MASP-2, util în prezenta invenţie, poate fi, de asemenea, derivat de la un primat subuman. Tehnicile generale pentru creşterea anticorpilor folositori în scopuri diagnostice şi terapeutice la babuini sunt descrise, de exemplu, de Goldenberg et al., WO 91/11465 şi de Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Serurile, care conţin anticorpi imunologic activi, sunt apoi produse din sângele animalelor astfel imunizate, folosind proceduri standard bine cunoscute în domeniu.

ANTICORPI MONOCLONALI

În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 este un anticorp monoclonal anti-MASP-2. Anticorpii monoclonali anti-MASP-2 sunt foarte specifici, fiind îndreptaţi împotriva unui singur epitop MASP-2. Aşa cum este utilizat aici termenul „monoclonal“ indică caracterul anticorpului, ca fiind obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi şi nu trebuie interpretat ca necesitând producţie de anticorpi prin orice metodă particulară. Anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi utilizând orice tehnică, care asigură producerea de molecule de anticorpi pe linii celulare continue în cultură, cum ar fi metoda hibridomului, descrisă de Kohler, G., et al., Nature 256 : 495, 1975, sau pot fi realizate prin metode ADN recombinant (de exemplu, US 4816567, Cabilly). Anticorpii monoclonali pot fi, de asemenea, izolaţi din bibliotecile de anticorpi de fagi, folosind tehnicile descrise de Clackson, T., et al., Nature 352: 624- 628, 1991, şi Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991. Astfel de anticorpi pot fi din orice clasă de imunoglobuline, incluzând IgG, IgM, IgE, IgA, IgD şi orice subclasă a acestora.

De exemplu, anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi prin injectarea la un mamifer potrivit (de exemplu, un şoarece BALB/c) a unei compoziţii, care conţine o polipeptidă MASP-2 sau o porţiune a acesteia. După o perioadă predeterminată de timp, de la şoarece se prelevă splenocitele şi se suspendă într-un mediu de cultură celulară. Splenocitele apoi se hibridizează cu o linie de celule imortalizate pentru a forma un hibridom. Hibridoamele formate sunt crescute în culturi de celule şi se testează abilitatea lor de a produce un anticorp monoclonal împotriva MASP-2. Un exemplu, care descrie în continuare producerea de anticorpi monoclonali anti-MASP-2 este prezentat în Exemplul 7. (A se vedea, de asemenea, şi Current Protocols in Immunology, vol. 1., John Wiley & Sons, paginile 2.5.1-2.6.7, 1991.)

Anticorpii monoclonali umani se pot obţine prin utilizarea şoarecilor transgenici, proiectaţi pentru a produce anticorpi umani specifici ca răspuns la provocarea antigenică. In această tehnică elementele locilor lanţului uşor şi greu de imunoglobulină umană se introduc în tulpini de şoareci, derivate de la liniile de celule stem embrionare, care conţin perturbări ţintate ale locilor lanţului greu şi lanţului uşor de imunoglobulină endogenă. Şoarecii transgenici pot sintetiza anticorpi umani specifici pentru antigene umane, cum ar fi antigene MASP-2, descrise aici, şi şoarecii pot fi utilizaţi pentru a produce anticorpul MASP-2 uman secretor de hibridoame prin hibridizarea celulelor B de la aceste animale cu liniile de celule de mielom potrivite folosind tehnologia Kohler-Milstein, ca cea descrisă în continuare în Exemplul 7. Şoarecii transgenici cu un genom de imunoglobulină umană sunt comercial disponibili (de exemplu, de la Abgenix, Inc., Fremont, CA şi Medarex, Inc., Annandale, N.J.). Metode obţinere a anticorpilor umani de la şoareci transgenici sunt descrise, de exemplu, de Green, L. L., et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N. et al., Nature 368: 856, 1994 şi Taylor, L. D. et al., Int. Immun. 6: 579,1994.

Anticorpii monoclonali pot fi izolaţi şi purificaţi din culturile de hibridom printr-o varietate de tehnici bine stabilite. Astfel de tehnici de izolare includ cromatografia de afinitate cu proteină A pe Sefaroză, cromatografia cu excludere dimensională şi cromatografia de schimb ionic (de exemplu, Coligan la paginile 2.7.1-2.7.12 şi paginile 2.9.1-2.9.3; Baines et al, „Purification of Immunoglobulin G (IgG)„ în Metode in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol. 10, pag. 79-104, 1992).

După obţinere anticorpii policlonali, monoclonali sau anticorpii derivaţi din fagi sunt mai întâi testaţi pentru legarea specifică cu MASP-2. O diversitate de teste, cunoscute specialiştilor în domeniu, se pot utiliza pentru detectarea anticorpilor, care se leagă în mod specific cu MASP-2. Exemplele de teste includ Western blot sau analiza de imunoprecipitare prin metode standard (de exemplu, cum se descrie de Ausubel al.), imunoelectroforeza, testele de imunosorbţie cu marcare enzimică, dot blot, testele de inhibare sau de concurenţă şi testele de tip sandwich (cum se descrie de Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). După identificarea anticorpilor, care se leagă în mod specific cu MASP-2, se testează abilitatea anticorpilor anti-MASP-2 de a funcţiona ca agent inhibitor al MASP-2 într-unul dintre multitudinea testelor, cum ar fi, de exemplu, testul de scindare C4 lectin-specifică (descris în Exemplul 2) şi testul de depunere a C3b (descris în Exemplul 2) sau un test de depunere a C4b (descris în Exemplul 2).

Afinitatea anticorpilor monoclonali anti-MASP-2 poate fi determinată de un specialist în domeniu (de exemplu, Scatchard, A., NY Acad., Sci., 51: 660-672, 1949). Într-o variantă de realizare anticorpii monoclonali anti-MASP-2, utili în metodele prezentei invenţii, se leagă cu MASP-2 cu o afinitate de legare <100 nM, de preferinţă <10 nM şi cel mai preferabil <2 nM. În unele variante de realizare anticorpul monoclonal inhibitor al MASP-2, util în metodele prezentei invenţii, este un anticorp monoclonal inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare a antigenului, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) Lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR:67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

ANTICORPI HIMERICI/UMANIZAŢI

Anticorpii monoclonali, utili în metoda prezentei invenţii, includ anticorpi himerici în care o porţiune din lanţul greu şi/sau uşor este identică sau omoloagă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi dintr-o specie particulară sau dintr-o anumită clasă sau subclasă de anticorpi, în timp ce restul lanţului (lanţurilor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi dintr-o altă specie sau dintr-o altă clasă sau subclasă de anticorpi, precum şi fragmente de astfel de anticorpi (US 4816567, Cabilly; Morrison, S.L. et al., Proc., Nat'l Acad. Sci., USA 81: 6851-6855, 1984).

O formă de anticorp himeric, util în prezenta invenţie, este un anticorp monoclonal umanizat anti-MASP-2. Formele umanizate de anticorpi non-umani (de exemplu, murini) reprezintă anticorpi himerici, care conţin secvenţe minime derivate din imunoglobulină non-umană. Anticorpii monoclonali umanizaţi se produc prin transferarea regiunilor determinante de complementaritate non-umane (de exemplu, de şoarece) din domeniile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare ale imunoglobulinei murine într-un domeniu variabil uman. De obicei, reziduurile de anticorpi umani sunt apoi substituite în regiunile cadru ale omologilor non-umani. Mai mult decât atât, anticorpii umanizaţi pot conţine reziduuri, care nu se găsesc în anticorpul receptor sau în anticorpul donator. În general, anticorpul umanizat va cuprinde în esenţă toate, cel puţin, unul şi, de obicei, două domenii variabile, în care toate sau practic toate fragmentele hipervariabile de ansă corespund fragmentelor hipervariabile de ansă ale unei imunoglobuline non-umane şi toate sau aproape toate regiunile de cadru Fv sunt regiuni de cadru Fv ale secvenţei de imunoglobulină umană. Anticorpul umanizat opţional va conţine, de asemenea, cel puţin de o porţiune dintr-o regiune constantă de imunoglobulină (Fc), care de regulă este parte a imunoglobulinei umană. Pentru mai multe detalii - Jones, P.T., et al., Nature 321: 522-525, 1986; Reichmann, L. et al., Nature 332: 323-329, 1988 şi Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.

Anticorpii umanizaţi, utili în prezenta invenţie, includ anticorpi monoclonali umani incluzând cel puţin de o regiune CDR3 care leagă MASP-2. În plus, porţiunile Fc pot fi înlocuite astfel încât să producă IgA sau IgM, precum şi anticorpi IgG umani. Astfel de anticorpi umanizaţi vor avea o utilitate clinică deosebită deoarece vor recunoaşte în mod specific MASP-2 umană, dar nu vor evoca un răspuns imun la oameni împotriva anticorpului în sine. În consecinţă, ele sunt mai potriviţi pentru administrarea in vivo la oameni, în special atunci când este necesară administrarea repetată sau pe termen lung.

Un exemplu de generare a unui anticorp umanizat anti-MASP-2 dintr-un anticorp monoclonal anti-MASP-2 murin este prezentat aici în Exemplul 6. Tehnicile de producere a anticorpilor monoclonali umanizaţi sunt, de asemenea, descrise în literatura de specialitate, de exemplu, Jones, P.T. et al., Nature 321: 522, 1986; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285,1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992; Singer, I.I., et al., J. Immun. 150: 2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", în Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pag. 399-434, 1996 şi US 5,693,762, Queen, 1997. În plus, există entităţi comerciale care pot sintetiza anticorpi umanizaţi din regiuni specifice de anticorpi murini, cum ar fi Protein Design Labs (Mountain View, CA).

ANTICORPI RECOMBINANŢI

Anticorpii anti-MASP-2 pot fi, de asemenea, obţinuţi folosind metode recombinante. De exemplu, anticorpii umani pot fi obţinuţi utilizând biblioteci de secvenţe exprimate ale imunoglobulinelor umane (disponibile, de exemplu, de la Stratagene, Corp., La Jolla, CA), pentru a produce fragmente de anticorpi umani (VH, VL, Fv, Fd, Fab sau F(ab')2). Aceste fragmente sunt apoi folosite pentru a construi anticorpi umani în general, folosind tehnici similare cu cele pentru producerea anticorpilor himerici.

ANTICORPI ANTI-IDIOTIP

După identificarea anticorpilor anti-MASP-2 cu activitate inhibitoare dorită, aceşti anticorpi pot fi utilizaţi pentru a genera anticorpi anti-idiotip, asemănători cu o porţiune din MASP-2, utilizând tehnici bine cunoscute în domeniu. De exemplu, Greenspan, N.S. et al., FASEB J. 7: 437, 1993. De exemplu, anticorpii care se leagă cu MASP-2 şi inhibă competitiv o interacţiune a proteinei MASP-2, necesară activării complementului, pot fi utilizaţi pentru a genera anti-idiotip, care se aseamănă cu situsul de legare MBL pe proteina MASP-2 şi, prin urmare, leagă şi neutralizează un ligand de legare al MASP-2 cum ar fi, de exemplu, MBL

FRAGMENTE DE IMUNOGLOBULINĂ

Agenţii inhibitori ai MASP-2, utili în metoda prezentei invenţii, cuprind nu numai molecule de imunoglobulină intactă, dar şi fragmentele bine cunoscute, incluzând fragmentele Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 şi Fv, fragmentele scFv, diacorpi, anticorpi liniari, molecule de anticorpi cu un singur lanţ şi anticorpi multispecifici formaţi din fragmente de anticorpi.

Este bine cunoscut, că doar o mică parte dintr-o moleculă de anticorp, paratop, este implicată în legarea anticorpului cu epitopul său (de exemplu, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc, NY, 1986). Regiunile pFc' şi Fc ale anticorpului sunt efectori ai căii clasice a complementului, dar nu sunt implicate în legarea antigenului. Un anticorp, din care regiunea pFc' a fost scindată enzimatic, sau care a fost produs fără regiunea pFc' este desemnat ca fragment F(ab')2 şi el păstrează ambele situsuri de legare a antigenului ale unui anticorp intact. Un fragment izolat F(ab')2 este examinat ca un fragment monoclonal bivalent din cauza celor două situsuri de legare a antigenului. În mod similar, un anticorp, din care regiunea Fc a fost scindată enzimatic, sau care a fost produs fără regiunea Fc este desemnat ca fragment Fab şi el păstrează unul dintre situsurile de legare a antigenului ale unei molecule de anticorp intact.

Fragmentele de anticorpi pot fi obţinute prin hidroliză proteolitică, cum ar fi prin digestie cu pepsină sau papaină a anticorpilor întregi prin metode uzuale. De exemplu, fragmentele de anticorpi pot fi produse prin scindarea enzimatică a anticorpilor cu pepsină pentru a obţine un fragment 5S, denumit F(ab')2. Acest fragment poate fi scindat în continuare utilizând un agent de reducere a tiolului pentru a produce fragmente monovalente de 3.5S Fab'. Opţional, reacţia de clivaj poate fi efectuată utilizând un grup de blocare pentru grupele sulfhidril, care rezultă din scindarea legăturilor disulfurice. Ca o alternativă, o scindare enzimatică cu utilizarea pepsinei produce în mod direct două fragmente Fab monovalente şi un fragment Fc. Aceste metode sunt descrise în literatura de specialitate, de exemplu, US 4331647, Goldenberg; Nisonoff, A. et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J. 73: 119,1959; Edelman et al., în Metode in Enzymology 1: 422, Academic Press, 1967 şi de Coligan la paginile 2.8.1-2.8.10 şi 2.10.- 2.10.4.

În unele variante de realizare utilizarea fragmentelor de anticorpi, lipsite de regiunea Fc, este preferată pentru a evita activarea căii clasice a complementului, care este iniţiată după legarea Fc cu receptorul FcΓ. Există mai multe metode prin care se poate produce un MoAb, care evită interacţiunile receptorului FcΓ. De exemplu, regiunea Fc a unui anticorp monoclonal poate fi îndepărtată chimic utilizând scindarea parţială cu enzime proteolitice (cum ar fi digestia cu ficină), generând astfel, de exemplu, fragmente de anticorp care leagă antigenul, cum ar fi fragmentele Fab sau F(ab)2 (Mariani, M. et al., Mol Immunol., 28: 69-71, 1991). În mod alternativ, izotipul Γ4 IgG uman, care nu leagă receptorii FcΓ, poate fi utilizat în timpul construirii unui anticorp umanizat aşa cum se descrie aici. Anticorpii, anticorpii cu un singur lanţ şi domeniile de legare a antigenului, lipsite de domeniul Fc, pot fi, de asemenea, proiectate folosind tehnicile recombinante descrise aici.

FRAGMENTE DE ANTICORP CU UN SINGUR LANŢ

În mod alternativ, se poate crea o peptide cu un singur lanţ, care leagă moleculele, specifice pentru MASP-2, în care sunt asociate regiunile Fv ale lanţului greu şi uşor. Fragmentele Fv pot fi legate printr-un linker peptidic pentru a forma o proteină de legare a antigenului cu un singur lanţ (scFv). Aceste proteine de legare a antigenului cu un singur lanţ se preparată prin construirea unei gene structurale conţinând secvenţe de ADN, care codifică domeniile VH şi VL, care sunt legate printr-o oligonucleotidă. Gena structurală este inserată într-un vector de expresie, care este introdus ulterior într-o celulă-gazdă, cum ar fi E. coli. Celulele gazdă recombinante sintetizează o polipeptidă cu un singur lanţ cu o peptidă linker, care uneşte cele două domenii V. Metodele de producere a scFv sunt descrise în literatura de specialitate, de exemplu, Whitlow, et al., "Metode: A Companion to Metode in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et al., Science 242:423, 1988; U.S. Patent No. 4,946,778, to Ladner; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, 1993.

În calitate de exemplu ilustrativ, scFv specific MASP-2 se poate obţine prin expunerea limfocitelor la polipeptidă MASP-2 in vitro şi selectarea vizualizatorului bibliotecii de anticorpi în fagi sau în vectori similari (de exemplu, prin utilizarea proteinei sau a peptidei MASP-2 imobilizate sau marcate). Genele, care codifică polipeptidele, având domenii potenţiale de legare a polipeptidei MASP-2, se pot obţine prin screeningul bibliotecilor randomizate ale peptidelor pe vizualizatorul fagului sau pe vizualizatorul bacteriei, cum ar fi E. coli. Aceste biblioteci randomizate de vizualizare a peptidelor se pot utiliza pentru a screeningul peptidelor, care interacţionează cu MASP-2. Tehnicile pentru crearea şi screeningul unor astfel de biblioteci randomizate de vizualizare a peptidelor sunt bine cunoscute în domeniu (US 5223409, Lardner; US 4.946.778, Ladner; US 5403484, Lardner; US 5.571.698, Lardner şi Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) şi bibliotecile randomizate de vizualizare a peptidelor şi kiturile pentru screeningul unor astfel de biblioteci sunt comercial disponibile, de exemplu, de la CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, California), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.) şi Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ).

O altă formă a unui fragment de anticorp MASP-2, utilă în acest aspect al invenţiei, este o peptidă care codifică o singură regiune hipervariabilă (CDR), care se leagă cu un epitop pe un antigen MASP-2 şi inhibă activarea complementului dependentă de MASP-2. Peptidele CDR ("unităţi de recunoaştere minime") se pot obţine prin construirea genelor care codifică CDR ale unui anticorp corespunzător. Astfel de gene se prepară, de exemplu, prin utilizarea reacţiei în lanţ a polimerazei pentru a sintetiza regiunea variabilă din ARN al anticorpului, producător de celule (de exemplu, Larrick et al., Metode: A Companion to Metode in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pag. 166, Cambridge University Press, 1995 şi Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995).

Anticorpii MASP-2, descrişi aici, se administrează la un subiect, care are nevoie de aceasta, pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2. În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 este un anticorp monoclonal anti-MASP-2 umană sau umanizat cu afinitate înaltă cu funcţie efectoare redusă.

INHIBITORII PEPTIDELOR

În unele variante de realizare ale acestui aspect al invenţiei agentul inhibitor al MASP-2 conţine inhibitori ai peptidei MASP-2 izolaţi, incluzând inhibitori peptidici naturali izolaţi şi inhibitori peptidici sintetici, care inhibă sistemul de activare a complementului dependentă de MASP-2. Aşa cum se utilizează aici, termenul "inhibitori ai peptidei MASP-2 izolaţi" se referă la peptide care inhibă activarea complementului dependentă de MASP-2 prin legare, concurând cu MASP-2, pentru legarea cu o altă moleculă de recunoaştere (de exemplu, MBL, H ficolină, M ficolină sau L ficolină) în calea lectinei şi/sau interacţionează direct cu MASP-2 pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2, care sunt în esenţă pure şi nu conţin în esenţă alte substanţe, cu care ele pot fi găsite în natură, într-o aşa măsură, încât să fie potrivite şi adecvate pentru utilizarea lor posibilă.

Inhibitorii peptidici au fost utilizaţi cu succes in vivo pentru a preveni interacţiunile proteină-proteină şi efectele negative asupra situsurilor catalitice. De exemplu, peptidele, inhibitori ai moleculelor de adeziune, structural apropiate de LFA 1, au fost recent aprobate pentru utilizare în practica clinică în tratamentul coagulopatiilor (Ohman, E. M. et al., European Heart J. 16:50-55). Au fost descrise peptide liniare scurte (<30 aminoacizi), care previn sau care acţionează negative asupra adeziunii dependente de integrină (Murayama, O., et al., J. Biochem., 120: 445-51). Peptidele mai lungi, cu lungime între 25 şi 200 reziduuri de aminoacizi, au fost, de asemenea, utilizate cu succes pentru blocarea adeziunii dependente de integrină (Zhang, L. et al., J. Biol Chem 271 (47): 29953-57, 1996). În general, inhibitorii peptidici mai lungi au afinităţi mai mari şi/sau viteze de disociere mai lente, decât peptidele scurte şi, prin urmare, pot fi inhibitori mai activi. S-a demonstrat că inhibitorii peptidici ciclici sunt inhibitori eficienţi ai integrinelor in vivo pentru tratamentul bolilor inflamatorii umane (Jackson, D.Y., et al., J.Med.Chem., 40: 3359-68, 1997). O metodă de producere a peptidelor ciclice implică sinteza peptidelor, în care aminoacizii terminali ai peptidei sunt cisteine, permiţând astfel peptidei să existe într-o formă ciclică prin legătura disulfurică dintre aminoacizii terminali, care s-a dovedit că ameliorează afinitatea şi timpul de înjumătăţire in vivo pentru tratamentul neoplasmelor hematopoietice (de exemplu, U.S. Patent No. 6,649,592, Larson).

INHIBITORII SINTETICI AI PEPTIDEI MASP-2

Peptidele inhibitoare ale MASP-2, utile în metodele acestui aspect al invenţiei, sunt exemplificate de secvenţele de aminoacizi, care imită regiunile ţintă importante pentru funcţionarea MASP-2. Peptidele inhibitoare, utile în practica metodelor prezentei invenţii, variază în dimensiuni de la aproximativ 5 aminoacizi până la aproximativ 300 de aminoacizi. Tabelul 3 prezintă o listă cu exemple de peptide inhibitoare, care pot fi utile în acest aspect al prezentei invenţii. O peptidă inhibitoare a MASP-2 poate fi testată pentru abilitatea de a funcţiona ca agent inhibitor al MASP-2 într-unul din mai multe teste, incluzând, de exemplu, un test de clivaj C4 specific pentru lectină (descris în Exemplul 2) şi un test de depunere C3b în Exemplul 2).

În unele variante de realizare, peptidele inhibitoare ale MASP-2 sunt derivate din polipeptidele MASP-2 şi sunt selectate dintre proteina MASP-2 matură completă (SECV ID NR: 6) sau dintr-un domeniu particular al proteinei MASP-2 cum ar fi, de exemplu, domeniul CUBI (SECV ID NR: 8), domeniul CUBIEGF (SECV ID NR: 9), domeniul EGF (SECV ID NR: 11) şi domeniul serin proteazei (SECV ID NR: 12). Aşa cum s-a descris anterior, regiunile CUBEGFCUBII s-au dovedit a fi necesare pentru dimerizare şi legare cu MBL (Thielens et al., Supra). În particular, într-un studiu în care s-a identificat prezenţa la o persoană a unei mutaţii homozigote Asp105 în Gly105, rezultând cu pierderea MASP-2 din complexul MBL, s-a relatat că secvenţa peptidică TFRSDYN (SECV ID NR: 16) în domeniul CUBI al MASP-2 este implicată în legarea cu MBL (Stengaard-Pedersen, K., et al., New England J. Med. 349:554-560, 2003).

În unele variante de realizare peptidele inhibitoare ale MASP-2 sunt derivate din proteinele lectinei, care se leagă cu MASP-2 şi sunt implicate în calea lectinei a complementului. S-au identificat mai multe lectine diferite implicate în această cale, incluzând lectina fixatoare de manan (MBL), L-ficolina, M-ficolina şi H-ficolina. (Ikeda, K. et al., J. Biol Chem., 262: 7451-7454, 1987; Matsushita, M. et al., J. Exp. Med., 176: 1497-2284, 2000; Matsushita, et al., J. Immunol., 168: 3502-3506, 2002). Aceste lectine sunt prezente în ser ca oligomere ale subunităţilor omotrimerice, fiecare având fibre de colagen N terminale cu domenii de recunoaştere a carbohidraţilor. Aceste lectine diferite s-au dovedit a se lega cu MASP-2, iar complexul lectină/MASP-2 activează complementul prin scindarea proteinelor C4 şi C2. H-ficolina are o regiune amino terminală din 24 aminoacizi, un domeniu asemănător cu colagenul cu 11 repetiţii Gly-Xaa-Yaa, un domeniu de gât din 12 aminoacizi şi un domeniu asemănător fibrinogenului din 207 aminoacizi (Matsushita, M. et al., J. Immunol. 168: 3502-3506, 2002). H-ficolina se leagă cu GlcNAc şi aglutinează eritrocitele umane acoperite cu LPS derivat din S. typhimurium, S. minnesota şi E. coli. H-ficolina s-a dovedit a fi asociată cu MASP-2 şi MAp19 şi activează calea lectinei. L-ficolina/P35, de asemenea, se leagă cu GlcNAc şi s-a dovedit a fi asociată cu MASP-2 şi MAp19 în serul uman şi s-a demonstrate, că acest complex activează calea lectinei (Matsushita, M. et al., J. Immunol., 164: 2281, 2000). În consecinţă, peptidele inhibitoare ale MASP-2, utile în prezenta invenţie, pot cuprinde o regiune din cel puţin de 5 aminoacizi selectaţi dintre proteina MBL (SECV ID NR: 21), proteina H-ficolinei (numărul de acces Genbank NM_173452), proteina M-ficolinei (numărul de acces Genbank O00602) şi proteina L-ficolinei (numărul de acces Genbank NM_015838).

Mai precis, oamenii de ştiinţă au identificat că situsul de legare a MASP-2 pe MBL se încadrează în cele 12 Gly-X-Y triplete "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS" (SECV ID NR: 26) între articulaţie şi gât în porţiunea C terminală a domeniului de tip colagen al MBP (Wallis, R. et al., J. Biol., Chem., 279: 14065, 2004). Această regiune a situsului de legare a MASP-2 este, de asemenea, foarte conservativă în H-ficolina umană şi L-ficolina umană. A fost descris un situs de legare consens, care este prezent în toate cele trei proteine ale lectinei, cuprinzând secvenţa de aminoacizi "OGK-X-GP" (SECV ID NR: 22), în care litera "O" reprezintă hidroxiprolina şi litera "X" este un reziduu hidrofob (Wallis et al., 2004, supra). În consecinţă, în unele variante de realizare peptidele inhibitoare ale MASP-2, utile în acest aspect al prezentei invenţii, conţin cel puţin de 6 aminoacizi în lungime şi cuprind SECV ID NR: 22. S-a dovedit că peptidele, derivate din MBL, care includ secvenţa de aminoacizi "GLR GLQ GPO GKL GPO G" (SECV ID NR: 24) leagă MASP-2 in vitro (Wallis, et al., 2004, supra). Pentru a amplifica legarea cu MASP-2 peptidele pot fi sintetizate flancate cu două triplete GPO la fiecare capăt pentru a spori formarea helicelor triple, cum se determină în proteina MBL nativă (Wallis, R. et al., J. Biol.Chem., 279: 14065, 2004).

Peptidele inhibitoare ale MPSP-2 pot fi, de asemenea, derivate din H-ficolina umană, care include secvenţa "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO" (SECV ID NR: 27) din regiunea de legare consens a MASP-2 din H-ficolină. Sunt incluse, de asemenea, peptidele derivate din L-ficolina umană, care includ secvenţa "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO" (SEQ ID NO:28) din regiunea de legare consens a MASP-2 în L-ficolină.

Peptidele inhibitoare ale MPSP-2 pot fi, de asemenea, derivate din situsul de scindare C4, cum ar fi "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI" (SECV ID NR: 29), care este situsul de scindare C4, legat cu porţiunea terminală C a antitrombinei III (Glover, G.I., et al., Mol. Immunol. 25:1261 (1988)).

Tabelul 3: EXEMPLE DE PEPTIDE INHIBITOARE ALE MASP-2

SEQ ID NO Sursa SEQ ID NO:6 Proteina MASP-2 umană SEQ ID NO:8 Domeniul CUBI al MASP-2 (aa 1-121 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:9 Domeniile CUBIEGF ale MASP-2 (aa 1-166 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:10 Domeniile CUBIEGFCUBII ale MASP-2 (aa 1-293 din SEQ ID NO:6) SEQ ID NO:11 Domeniul EGF al MASP-2 (aa 122-166) SEQ ID NO:12 Domeniul serin-proteazei al MASP-2 (aa 429-671) SEQ ID NO:16 Regiunea de legare a MBL în MASP-2 SEQ ID NO:3 MAp19 uman SEQ ID NO:21 Proteina MBL umană SEQ ID NO:22 OGK-X-GP, în care "O" = hidroxiprolină şi "X" reprezintă un reziduu aminoacid hidrofob Situsul de legare consens a peptide sintetice din MBL uman şi ficolinele umane SEQ ID NO:23 OGKLG Situsul principal de legare a MBL uman SEQ ID NO:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G Tripletele 6-10- ale MBP umane demonstrează legare cu MASP-2 SEQ ID NO:25 GPOGPOGLRGLQGPOGKLGPOGGPOGPO Tripletele MBP umane cu GPO adăugate pentru a amplifica formarea helicelor triple SEQ ID NO:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOGNOGPSGSOGPKGQKGDOGKS Tripletele 1-17 ale MBP umane SEQ ID NO:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO H-Ficolina umană (Hataka) SEQ ID NO:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO L-Ficolina umană P35 SEQ ID NO:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI Situsul de scindare a C4 umane

Notă: Litera "O" reprezintă hidroxiprolină. Litera "X" reprezintă un reziduu hidrofob.

Peptidele, derivate din situsul de scindare a C4, precum şi alte peptide care inhibă situsul serin proteazei MASP-2, pot fi modificate chimic astfel încât ele devin inhibitori ireversibili ai proteazei. De exemplu, modificările adecvate pot include, dar nu sunt neapărat limitate la, halometil cetonele (Br, CI, I, F) la C terminal, Asp sau Glu, sau ataşate la catenele laterale funcţionale; grupele haloacetil (sau alte grupe α-haloacetil) pe grupe amino sau pe alte catene laterale funcţionale; grupe epoxide sau cu conţinut de imine pe grupe amino sau carboxil terminale sau pe catene laterale funcţionale; sau esteri imidaţi pe grupe amino sau carboxil terminale sau pe catene laterale funcţionale. Astfel de modificări ar permite avantajul de a inhiba permanent enzima prin ataşarea covalentă a peptidei. Aceasta ar putea rezulta cu doze eficiente mai mici şi/sau cu necesitatea unei administrări mai puţin frecvente a inhibitorului peptidei.

Adiţional la peptidele inhibitoare descrise mai sus, peptidele inhibitoare ale MASP-2, utile în metoda prezentei invenţii, includ peptide conţinând regiunea CDR3 care leagă MASP-2 la MoAb anti-MASP-2, obţinută cum se descrie aici. Secvenţa regiunilor CDR, utilizată pentru sinteza peptidelor, poate fi determinată prin metode cunoscute în domeniu. Regiunea variabilă a lanţului greu este o peptidă care, în general, variază de la 100 până la 150 de aminoacizi în lungime. Regiunea variabilă a lanţului uşor este o peptidă care, în general, variază de la 80 la 130 de aminoacizi în lungime. Secvenţele CDR din regiunile variabile ale lanţului greu şi uşor includ numai aproximativ 3-25 de secvenţe aminoacide, care pot fi uşor secvenţiate de un specialist în domeniu.

Specialiştii în domeniu vor recunoaşte, că variaţiile în esenţă omoloage ale peptidelor inhibitoare ale MASP-2, descrise mai sus, vor prezenta, de asemenea, activitate inhibitoare a MASP2. Exemplele de variaţii includ, dar nu sunt neapărat limitate la, peptide care au inserţii, deleţii, înlocuiri şi/sau aminoacizi suplimentari pe porţiunile carboxil terminale sau amino-terminale ale peptidelor şi amestecurile acestora. În consecinţă, acele peptide omoloage cu activitate inhibitoare a MASP-2 sunt considerate a fi utile în metodele prezentei invenţii. Peptidele descrise pot include, de asemenea, motive de duplicare şi alte modificări cu substituţii conservative. Variantele conservative sunt descrise în altă parte aici şi includ schimbul unui aminoacid cu un altul cu o sarcină, dimensiune sau hidrofobie asemănătoare şi altele asemenea.

Peptidele inhibitoare ale MASP-2 pot fi modificate pentru a creşte solubilitatea şi/sau pentru a maximiza sarcina pozitivă sau negativă pentru a se asemăna mai mult cu segmentul din proteina intactă. Atât timp cât derivatul menţine funcţional proprietatea dezirabilă de inhibare a MASP-2, derivatul poate avea sau poate să nu aibă structura aminoacidă primară exactă a unei peptide descrise aici. Modificările pot include substituţia aminoacidului cu unul din cei douăzeci de aminoacizi cunoscuţi sau cu un alt aminoacid, cu un aminoacid derivatizat sau substituit cu caracteristici dezirabile auxiliare, cum ar fi rezistenţa la degradarea enzimatică sau cu un aminoacid D sau substituirea cu o altă molecula sau compus, cum ar fi un carbohidrat, care imită confirmaţia şi funcţia naturală a aminoacidului, a aminoacizilor sau a peptidei; deleţia aminoacidului; inserţia aminoacidului cu unul din cei douăzeci de aminoacizi cunoscuţi sau cu un alt aminoacid, cu un aminoacid derivatizat sau substituit cu caracteristici dezirabile auxiliare, cum ar fi rezistenţa la degradarea enzimatică sau cu un aminoacid D sau substituirea cu o altă moleculă sau compus, cum ar fi un carbohidrat, care imită confirmaţia şi funcţia naturală a aminoacidului, a aminoacizilor sau a peptidei; sau substituţie cu o altă moleculă sau compus, cum ar fi un carbohidrat sau acid nucleic monomer, care imită conformaţia naturală, distribuţia sarcinii şi funcţia peptidei parentale. Peptidele pot fi, de asemenea, modificate prin acetilare sau amidare.

Sinteza peptidelor inhibitoare derivate se poate baza pe tehnici cunoscute de biosinteză a peptidelor, biosinteză a carbohidraţilor şi altele asemenea. Ca punct de plecare, specialistul se poate baza pe un program de calculator potrivit pentru a determina conformaţia unei peptide interes. După ce conformaţia peptidei, dezvăluite aici, devine cunoscută, specialistul poate determina într-un mod raţional designul substituţiilor care pot fi efectuate la unul sau mai multe situsuri pentru a realiza un derivat, care menţine conformaţia de bază şi distribuţia sarcinii peptidei iniţiale, dar care poate avea caracteristici care lipsesc sau sunt îmbunătăţite, comparativ cu cele găsite în peptida parentală. După identificarea moleculelor derivate candidate, derivaţii pot fi testaţi pentru a determina dacă acţionează ca agenţi inhibitori ai MASP 2 folosind testele descrise aici.

SCREENINGUL PEPTIDELOR, CARE INHIBĂ MASP-2

Pentru a genera şi examina peptidele, care imită structurile moleculare ale regiunilor de legare cheie ale MASP-2 şi inhibă activităţile complementului dependente de MASP-2, se poate utiliza, de asemenea, modelarea moleculară şi proiectarea moleculară raţională. Structurile moleculare utilizate pentru modelare includ regiunile CDR ale anticorpilor monoclonali anti-MASP-2, precum şi regiunile ţintă cunoscute a fi importante pentru funcţia MASP-2, inclusiv regiunea necesară pentru dimerizare, regiunea implicată în legarea cu MBL şi situsul activ al serin proteazei, cum se descrie anterior. Metodele de identificare ale peptidelor, care se leagă la o anumită ţintă, sunt bine cunoscute în domeniu. De exemplu, imprimarea moleculară poate fi utilizată pentru construcţia de novo a structurilor macromoleculare, cum ar fi peptidele care se leagă la o anumită moleculă. (De exemplu, Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties," TRIP 2(5) 1994).

Drept exemplu ilustrativ, o metodă de preparare a imitatorilor peptidelor, care leagă MASP-2, este prezentată în continuare. Sunt polimerizaţi monomerii funcţionali ai unei peptide cunoscute de legare a MASP-2 sau regiunii de legare a unui anticorp anti-MASP-2, care efectuează inhibarea MASP-2 (matriţa). Apoi se îndepărtează matriţa, urmând polimerizarea clasei secunde monomeri în golul lăsat de matriţă, pentru a furniza o nouă moleculă, care prezintă una sau mai multe proprietăţi dezirabile, similare cu matriţa. Adiţional la prepararea peptidelor în acest mod, se pot prepara şi alte molecule de legare MASP-2, care sunt agenţi inhibitori ai MASP2, cum ar fi polizaharide, nucleozide, medicamente, nucleoproteine, lipoproteine, carbohidraţi, glicoproteine, steroizi, lipide şi alte materiale biologic active. Această metodă este utilă pentru proiectarea unei game largi de mimetice biologice, care sunt mai stabile decât omologii lor naturali, deoarece acestea sunt în mod obişnuit preparate prin polimerizarea radicalilor liberi ai monomerilor funcţionali, rezultând un compus cu catena principală nebiodegradabilă.

SINTEZA PEPTIDELOR

Peptidele inhibitoare MASP-2 pot fi preparate folosind tehnici bine cunoscute în domeniu, cum ar fi tehnica de sinteză în fază solidă descrisă iniţial de Merrifield, în J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149 2154, 1963. Sinteza automată poate fi realizată, de exemplu, utilizând Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Foster City, California), în conformitate cu instrucţiunile furnizate de producător. Alte tehnici sunt descrise, de exemplu, de Bodanszky, M. et al., Peptide Synthesis, ediţia a doua, John Wiley & Sons, 1976, precum şi în alte lucrări de referinţă cunoscute specialiştilor în domeniu.

Peptidele pot fi, de asemenea, preparate utilizând tehnici de inginerie genetică standarde cunoscute specialiştilor în domeniu. De exemplu, peptida poate fi produsă în mod enzimatic prin introducerea acidului nucleic, care codifică peptide, într-un vector de expresie, exprimând ADN şi translând ADN în peptidă în prezenţa aminoacizilor necesari. Peptida este apoi purificată, folosind tehnici cromatografice sau electroforetice sau cu o proteină-transportoare, care poate fi fuzionată şi apoi scindată cu peptidă prin inserarea în vectorul de expresie în fază cu secvenţa de codificare a peptidei a unui secvenţe de acid nucleic care codifică proteina transportoare. Peptida proteinei de fuziune poate fi izolată folosind tehnici cromatografice, electroforetice sau imunologice (cum ar fi legarea cu o răşină prin intermediul unui anticorp la proteina transportoare). Peptida poate fi scindată folosind metodă chimică sau enzimatic, de exemplu, cu hidrolaze.

Peptidele inhibitoare ale MASP-2, utile în metoda prezentei invenţii, pot fi, de asemenea, produse în celulele gazdă recombinante, urmând tehnicile uzuale. Pentru a exprima o secvenţă care codifică peptida inhibitoare a MASP-2, o moleculă de acid nucleic, care codifică peptide, trebuie să fie legată în mod operabil cu secvenţele de reglare, care controlează expresia transcripţională, într-un vector de expresie şi apoi introduse într-o celulă gazdă. Adiţional la secvenţele reglatoare transcripţionale, cum ar fi promotorii şi amplificatorii, vectorii de expresie pot include secvenţe reglatoare de translaţie şi o genă marker, care sunt potrivite pentru selectarea celulelor, care poartă vectorul de expresie.

Moleculele de acid nucleic, care codifică o peptidă inhibitoare a MASP-2, pot fi sintetizate cu "maşini genetice" folosind protocoale, cum ar fi metoda fosforamiditului. Dacă este necesar un ADN dublu catenar sintetizat chimic pentru o aplicaţie, cum ar fi sinteza unei gene sau a unui fragment de genă, fiecare catenă complementară se construieşte separat. Producţia de gene scurte (60 până la 80 perechi de baze) este tehnic simplă şi poate fi realizată prin sintetizarea filamentelor complementare şi apoi hibridarea lor. Pentru producerea de gene mai lungi, genele sintetice (dublu catenare) sunt asamblate în formă modulară din fragmente monocatenare, care au lungimea între 20 şi 100 nucleotide. (De exemplu, Glick and Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press, 1994; Itakura, K., et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; and Climie, S., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633, 1990).

INHIBITORI MICROMOLECULARI

în unele variante de realizare agenţii inhibitori ai MASP-2 sunt inhibitori micromoleculari, incluzând substanţe naturale şi sintetice, care au o greutate moleculară mică, cum ar fi, de exemplu, peptide, peptidomimetice şi inhibitori nepeptidici (inclusiv oligonucleotide şi compuşi organici). Inhibitorii micromoleculari ai MASP-2 pot fi generaţi pe baza structurii moleculare a regiunilor variabile ale anticorpilor anti-MASP-2.

Inhibitorii micromoleculari pot fi, de asemenea, proiectaţi şi generaţi pe baza structurii cristaline a MASP-2 utilizând un design computaţional al medicamentului (Kuntz I. D. et al., Science 257: 1078, 1992). Structura cristalină a MASP-2 de şobolan a fost descrisă (Feinberg, H. et al., EMBO J. 22: 2348-2359, 2003). Utilizând metoda descrisă de Kuntz et al., coordonatele structurii cristaline a MASP-2 sunt utilizate ca intrări pentru un program de calculator, cum ar fi DOCK, care furnizează o listă de structuri micromoleculare, care se aşteaptă să se lege cu MASP-2. Utilizarea unui astfel program de calculator este bine cunoscută unui specialist în domeniu. De exemplu, structura cristalină a inhibitorului proteazei HIV-1 a fost utilizată pentru a identifica liganzi unici nepeptidici, care sunt inhibitori ai proteazei HIV-1 prin evaluarea potrivirii compuşilor, găsiţi în baza de date Cambridge Crystallographic, la locul de legare al enzimei utilizând programul DOCK (Kuntz, I.D. et al., J. Mol. Biol., 161: 269-288, 1982; DesJarlais, R.L. et al., PNAS 87: 6644-6648, 1990).

Lista structurilor micromoleculare, identificate printr-o metodă computaţională ca inhibitori potenţiali ai MASP-2, sunt analizate utilizând un test de legare a MASP-2, cum se descrie în Exemplul 10. Compuşii micromoleculari, determinaţi că se leagă cu MASP-2, sunt apoi analizaţi printr-un test funcţional, cum se descrie în Exemplul 2, pentru a determina dacă acestea inhibă activarea complementului dependentă de MASP2.

RECEPTORII SOLUBILI AI MASP-2

Alţi agenţi inhibitori potriviţi ai MASP-2 se consideră că includ receptori solubili ai MASP-2, care pot fi produşi utilizând tehnici cunoscute specialiştilor în domeniu.

INHIBITORI DE EXPRESIE AI MASP-2

Într-o altă variantă de realizare a acestui aspect al invenţiei, agentul inhibitor al MASP-2 este un inhibitor de expresie al MASP2, abil să inhibe activarea complementului dependentă de MASP-2. În practica acestui aspect al invenţiei inhibitorii de expresie ai MASP-2 reprezentativi includ molecule de acid nucleic al MASP- 2 antisens (cum ar fi ARNm antisens, ADN antisens sau oligonucleotide antisens), ribozime MASP-2 şi molecule ARNi MASP-2.

Moleculele ARN şi ADN anti-sens acţionează pentru a bloca direct translaţia ARNm MASP-2 prin hibridizarea cu ARNm MASP-2 şi prevenirea translaţiei proteinei MASP-2. O moleculă de acid nucleic antisens poate fi construită în mai multe moduri diferite, cu condiţia ca aceasta să fie abilă să interfereze cu exprimarea MASP-2. De exemplu, o moleculă de acid nucleic anti-sens poate fi construită prin inversarea regiunii de codificare (sau a unei porţiuni a acesteia) din ADNc MASP-2 (SECV ID NR: 4), în raport cu orientarea ei normală, pentru transcripţie, ceea ce permite transcrierea complementului său.

Molecula de acid nucleic antisens este de obicei în esenţă identică cel puţin de o porţiune din gena ţintă sau genele ţintă. Totuşi, pentru inhibarea expresiei acidul nucleic nu trebuie să fie perfect identic. În general, o omologie mai mare poate fi utilizată pentru a compensa utilizarea unei molecule de acid nucleic antisens mai scurte. Identitatea procentuală minimă constituie de obicei nu mai mult de 65%, dar o identitate procentuală mai mare poate exercita o reprimare mai eficientă a expresiei secvenţei endogene. Se preferă în esenţă o identitate procentuală ce depăşeşte semnificativ 80%, deşi identitatea de la 95% până la identitatea absolută este de obicei cea mai preferată.

Molecula de acid nucleic antisens nu trebuie să aibă acelaşi tip de intron sau exon ca şi gena ţintă, iar segmentele ne-codificatoare ale genei ţintă pot fi la fel de eficiente în obţinerea suprimării antisens a expresiei genelor ţintă ca şi segmentele de codificare. O secvenţă ADN cel puţin de circa 8 nucleotide poate fi utilizată ca moleculă de acid nucleic antisens, deşi este preferată o secvenţă mai lungă. În prezenta invenţie un exemplu reprezentativ de un agent inhibitor util al MASP-2 este o moleculă de acid nucleic MASP-2 antisens, care este în cel puţin de nouăzeci la sută identică cu ADNc MASP-2 complementar, constând din secvenţa de acid nucleic prezentată în SECV ID NO: 4. Secvenţa de acid nucleic prezentată în SECV ID NR: 4 codifică proteina MASP-2, constând din secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 5.

Direcţionarea oligonucleotidelor antisens pentru legarea cu ARNm MASP-2 este un alt mecanism, care poate fi utilizat pentru a reduce nivelul de sinteză al proteinelor MASP-2. De exemplu, sinteza poligalacturonazei şi a receptorului pentru acetilcolină de tip 2 muscarinic este inhibată de oligonucleotidele antisens direcţionate către secvenţele lor ARNm respective (US 5,739,119, Cheng şi US 5,759,829, Shewmaker). Mai mult decât atât, au fost demonstrate exemple de inhibiţie antisens cu ciclina proteinei nucleare, gena de rezistenţă la multiple medicamente (MDG1), ICAM-1, E-selectina, STK-1, receptorul pentru GABAA striatal şi EGF uman (de exemplu, US 5,801,154, Baracchini; US 5,789,573, Baker; US 5,718,709, Considine şi US 5,610,288, Reubenstein).

S-a descris un sistem, care permite unui specialist în domeniu, să determine oligonucleotidele utile în prezenta invenţie, care implică sondarea pentru situsuri potrivite în ARNm ţintă utilizând scindarea Rnazei H ca indicator pentru accesibilitatea secvenţelor din transcripturi. (Scherr, M., et al., Nucleic Acids Res. 26: 5079-5085, 1998; Lloyd et al., Nucleic Acids Res. 29: 3665-3673, 2001). Un amestec de oligonucleotide antisens, complementare la anumite regiuni ale transcripţiei MASP-2, se adaugă la extractele celulare, care exprimă MASP-2, cum ar fi hepatocitele, şi le hibridizează pentru a crea un sit receptiv la ribonucleaza H. Această metodă poate fi combinată cu selecţia de secvenţe, asistată de calculator, care poate prezice selectarea optimă a secvenţei pentru compoziţiile antisens, pe baza abilităţii lor relative de a forma dimeri, «agrafe» sau alte structuri secundare, care ar reduce sau ar preveni legarea specifică cu ARNm ţintă într-o celulă gazdă. Analizele acestor structuri secundare şi recomandări de selectare a situsului ţintă pot fi realizate utilizând software de analiză a primerului OLIGO (Rychlik, I., 1997) şi algoritmul BLASTN 2.0.5 (Altschul, S.F. et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Compuşii antisens direcţionaţi către secvenţa ţintă, de preferinţă, cuprind de la aproximativ 8 până la aproximativ 50 nucleotide în lungime. Oligonucleotidele antisens, cuprinzând aproximativ 9 până la aproximativ 35 de nucleotide, sunt deosebit de preferate. Inventatorii presupun, că toate compoziţiile de oligonucleotide în intervalul de la 9 până la 35 nucleotide (adică cele de la 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 sau 35 sau ceva aproximativ în lungime) sunt extrem de preferate pentru practica metodelor bazate pe oligonucleotide antisens ale invenţiei. Regiunile ţintă foarte preferate ale ARNm MASP-2 sunt acele amplasate în apropierea nemijlocită de codonul de iniţiere a translaţiei AUG şi acele secvenţe care sunt în esenţă complementare cu regiunile 5' ale ARNm, de exemplu, între regiunile -10 şi +10 ale secvenţei nucleotide a genei MASP-2 (SECV ID NR: 4). Exemple de inhibitori ai expresiei MASP-2 sunt prezentate în Tabelul 4.

Tabelul 4: EXEMPLE DE INHIBITORI AI EXPRESIEI MASP-2

SEQ ID NO:30 (nucleotidele 22-680 din SEQ ID NO:4) Secvenţa acidului nucleic al ADNc MASP-2 (SECV ID NR: 4), care codifică CUBIEGF SEQ ID NO:31 5'CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC3 Nucleotidele 12-45 din SEQ ID NO:4 inclusiv situsul de iniţiere al translaţiei MASP-2 (sens) SEQ ID NO:32 5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3' Nucleotidele 361-396 din SEQ ID NO:4, care codifică regiunea care conţine situsul de legare MBL MASP-2 (sens) SEQ ID NO:33 5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3' Nucleotidele 610-642 din SEQ ID NO:4, care codifică regiunea care conţine domeniul CUBII

Aşa cum s-a menţionat mai sus, termenul "oligonucleotidă", aşa cum este utilizat în prezenta descriere, se referă la un oligomer sau polimer al acidului ribonucleic (ARN) sau al acidului dezoxiribonucleic (ADN) sau al mimeticilor acestuia. Acest termen cuprinde, de asemenea, acele baze oligonucleotide compuse din nucleotidele naturale, zaharuri şi legăturile covalente internucleozide (de schelet), precum şi oligonucleotidele cu modificări, care nu apar în mod natural. Aceste modificări permit să se introducă anumite proprietăţi dorite, care nu sunt oferite de oligonucleotidele naturale, cum ar fi proprietăţile toxice reduse, stabilitate crescută împotriva degradării nucleazei şi absorbţie celulară îmbunătăţită. În exemplele de realizare ilustrative, compuşii antisens ai prezentei invenţii diferă de ADN nativ prin modificarea scheletului fosfodiesteric pentru a prelungi durata de viaţă a oligonucleotidei antisens, în care substituenţii fosfat sunt înlocuiţi cu fosforotioaţi. În mod similar, unul sau ambele capete ale oligonucleotidei pot fi substituite cu unul sau mai mulţi derivaţi de acridină, care se intercalează între perechile de nucleotide adiacente din interiorul unei catene de acid nucleic.

O altă alternativă la antisens este folosirea "ARN de interferenţă " (ARNi). ARN dublu catenari (dsARN) pot provoca silenţierea genei la mamifere in vivo. Funcţia naturală a ARNi şi cosupresia se pare a fi protecţia genomului împotriva invaziei cu elemente genetice mobile, cum ar fi retrotranspozonele şi virusurile, care produc ARN aberant sau dsARN în celula gazdă, când acestea devin active (de exemplu, Jensen, J., et al., Nat Genet 21: 209-12, 1999). Moleculele de ARN dublu catenar se pot prepara prin sinteza a două filamente de ARN, abile să formeze o moleculă de ARN dublu catenar, fiecare având o lungime de la aproximativ 19 până la 25 nucleotide (de exemplu, 19-23 nucleotide). De exemplu, o moleculă de dsARN, utilă în metodele prezentei invenţii, poate conţine ARN corespunzător unei secvenţe şi complementului ei, enumerate în Tabelul 4. De preferinţă, cel puţin de o catenă de ARN are 3' terminal «adeziv» de 1-5 nucleotide. Lanţurile ARN sintetizate se combină în condiţii care formează o moleculă dublu catenară. Secvenţa ARN poate conţine cel puţin de o porţiune de 8 nucleotide din SECV ID NR: 4 cu o lungime totală de 25 nucleotide sau mai mică. Proiectarea secvenţelor siARN pentru o anumită ţintă este o practică obişnuită pentru un specialist în domeniu. Sunt disponibile servicii comerciale, care construiesc secvenţe siRNA şi garantează cel puţin de 70% de reducere a expresiei (Qiagen, Valencia, Calif).

DsARN poate fi administrat sub formă de o compoziţie farmaceutică şi se obţine prin metode cunoscute, în care un acid nucleic se introduce într-o celulă ţintă dorită. Metodele utilizate frecvent pentru transferul genei includ fosfatul de calciu, DEAE-dextran, electroporarea, microinjecţia şi metodele virale. Astfel de metode sunt descrise de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993.

Ribozimele pot fi, de asemenea, utilizate pentru a reduce cantitatea şi/sau activitatea biologică a MASP-2, cum ar fi ribozimele care ţintesc ARNm MASP-2. Ribozimele sunt molecule de ARN catalitice, care pot scinda moleculele de acid nucleic cu o secvenţă, care este complet sau parţial omoloagă cu secvenţa ribozimei. Este posibilă proiectarea transgenelor ribozimei, care codifică ribozimele ARN care se cuplează în mod specific cu un ARN ţintă şi scindează scheletul fosfodiesterului într-o locaţie specifică, inactivând, astfel, funcţia ARN ţintă. În realizarea acestei scindări, ribozima înseşi nu este modificată şi astfel este capabilă să recicleze şi să scindeze alte molecule. Incluziunea secvenţelor de ribozime în ARN antisens conferă ARN activitate de scindare a acestora, crescând astfel activitatea constructelor antisens.

Ribozimele, utile în practica invenţiei, conţin de obicei o regiune de hibridizare cel puţin de aproximativ nouă nucleotide care este complementară în secvenţa de nucleotide la cel puţin de o parte a ARNm MASP-2 ţintă şi o regiune catalitică care este adaptată pentru a scinda ARNm MASP-2 ţintă (EPA nr. 0 321 201; W0 88/04300; Haseloff, J. et al., Nature 334: 585-591, 1988; Fedor, M.J. et al., Proc Natl Acad. 87: 1668-1672, 1990; Cech, T.R. et al., Ann. Rev. Biochem., 55: 599-629, 1986).

Ribozimele pot fi direcţionate nemijlocit asupra celulei sub formă de oligonucleotide ARN, care încorporează secvenţe de ARN sau sunt introduse în celulă ca vector de expresie, care codifică ARN ribozimal necesar. Ribozimele pot fi utilizate şi aplicate în mod similar celui descris pentru polinucleotidele antisens.

ARN şi AND antisens, ribozimele şi molecule de ARNi, utile în metodele prezentei invenţii, pot fi preparate prin orice metodă cunoscută în domeniu de sinteză a moleculelor de ADN şi ARN. Acestea includ tehnici de sintetizare chimică a oligodeoxiribonucleotidelor şi oligoribonucleotidelor bine cunoscute în domeniu, cum ar fi, de exemplu, sinteza chimică a fosforamiditei în fază solidă. În mod alternativ, moleculele de ARN pot fi generate prin transcripţia in vitro şi in vivo a secvenţelor de ADN, care codifică molecula de ARN antisens. Astfel de secvenţe de ADN pot fi încorporate într-o mare varietate de vectori, care încorporează promotorii polimerazei ARN potriviţii, cum ar fi promotorii polimerazei T7 sau SP6. În mod alternativ, constructele ADNc antisens, care sintetizează ARN antisens constitutiv sau inducibil, în funcţie de promotorul utilizat, pot fi introduse în mod stabil în liniile celulare.

Diferite modificări bine cunoscute ale moleculelor de ADN pot fi introduse ca un mijloc de creştere a stabilităţii şi a timpului de înjumătăţire. Modificările utile includ, dar nu se limitează la acestea, adiţia secvenţelor de flancare ale ribonucleotidelor sau deoxiribonucleotidelor la capetele 5' şi/sau 3' ale moleculei sau utilizarea fosforotioatului sau 2' O-metil, înlocuind legăturile fosfodiesterice cu scheletul oligodeoxiribonucleotidic.

VI. COMPOZIŢII FARMACEUTICE ŞI METODE DE LIVRARE. DOZAREA

Într-un alt aspect invenţia prevede compoziţii pentru inhibarea efectelor adverse ale activării complementului dependente de MASP-2 la un subiect care suferă de o boală sau o stare descrisă aici, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate terapeutic eficientă de un agent inhibitor al MASP-2 şi un purtător farmaceutic acceptabil. Agenţii inhibitori ai MASP-2 se pot administra unui subiect, care are nevoie de acesta, în doze eficiente din punct de vedere terapeutic, pentru tratarea sau ameliorarea stărilor asociate cu activarea complementului dependentă de MASP-2. O doză terapeutic eficientă se referă la o cantitate de agent inhibitor al MASP-2 suficientă pentru a conduce la ameliorarea simptomelor asociate cu boala sau cu starea.

Toxicitatea şi eficienţa terapeutică a agenţilor inhibitori ai MASP 2 pot fi determinate prin proceduri farmaceutice standard utilizând modele cu animale experimentale pe animale, cum ar fi modelul MASP-2 -/- murin cu şoareci, care exprimă transgena MASP-2 umană, descrisă în Exemplul 1. Utilizând astfel de modele experimentale pe animale, pot fi determinate utilizând metode standard nivelul absenţei efectelor adverse (NOAEL) şi doza minimă eficientă (MED). Raportul dozelor, prin care se caracterizează NOAEL şi MED, reprezintă un indice terapeutic, care este exprimat ca raportul NOAEL/MED. Agenţii inhibitori ai MASP-2, care prezintă indicatori terapeutici mari, sunt cei mai preferaţi. Datele, obţinute în testele de cultură celulară şi studiile pe animale, pot fi utilizate pentru determinarea diapazonului dozelor pentru administrare umană. Doza de agent inhibitor al MASP-2 se situează, de preferinţă, într-un interval de concentraţii circulante, care includ MED cu toxicitate joasă sau fără toxicitate. Doza poate varia în acest interval, în funcţie de forma medicamentoasă şi de calea de administrare utilizată.

Pentru orice formulare a unui compus doza terapeutic eficientă poate fi estimată utilizând modele experimentale pe animale. De exemplu, într-un model experimental pe animale poate fi determinată doza pentru a obţine un interval de concentraţie plasmatică circular, care include MED. Nivelurile cantitative de agent inhibitor al MASP-2 în plasmă pot fi, de asemenea, măsurate, de exemplu, prin cromatografie lichidelor de înaltă performanţă.

Adiţional la studiile de toxicitate, doza eficientă poate fi, de asemenea, estimată pe baza cantităţii de proteină MASP-2 prezentă la un subiect viu şi a afinităţii de legare a agentului inhibitor al MASP-2. S-a relevat, că niveluri de MASP-2 sunt prezente în serul persoanelor sănătoase în cantităţi nu prea mari în limite de 500 ng/ml şi nivelurile de MASP-2 la un anumit subiect pot fi determinate folosind un test cantitativ pentru MASP-2, descris de Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Metods 282: 159-167, 2003.

În general, doza de compoziţii administrate cu conţinut de agenţi inhibitori ai MASP-2 variază în funcţie de aşa factori, cum ar fi vârsta, greutatea, înălţimea, sexul, starea generală a pacientului şi istoricul medical anterior. În calitate de ilustrare, agenţii inhibitori ai MASP-2, cum ar fi anticorpii anti-MASP-2, pot fi administraţi în doze variind de la circa 0,010 până la 10,0 mg/kg, de preferinţă 0,010 până la 1,0 mg/kg, mai preferabil de 0,010 până la 0,1 mg/kg de masă corporală a subiectului. În unele variante compoziţia conţine o combinaţie de anticorpi anti-MASP-2 şi peptide inhibitoare ale MASP-2.

Eficacitatea terapeutică a compoziţiilor inhibitoare ale MASP-2 şi a metodelor din prezenta invenţie la un subiect dat şi dozele adecvate pot fi determinate în conformitate cu testele de complement bine cunoscute specialiştilor în domeniu. Complementul generează numeroase produse specifice. În ultimul deceniu au fost elaborate teste sensibile şi specifice, care sunt comercial disponibile pentru majoritatea acestor produse de activare, incluzând fragmentele mici de activare C3a, C4a şi C5a şi fragmentele mari de activare iC3b, C4d, Bb şi sC5b-9. Majoritatea dintre aceste analize utilizează anticorpi monoclonali, care reacţionează cu noi antigeni (neoantigeni) expuşi pe fragment, dar nu pe proteinele native din care s-au format, făcând aceste teste foarte simple şi specifice. Cele mai multe se bazează pe tehnologia ELISA, deşi radioimunoanaliza încă este folosită uneori pentru C3a şi C5a. Aceste ultime teste măsoară atât fragmentele neprocesate, cât şi fragmentele lor "desArg", care sunt formele principale prezente în circulaţie. Fragmentele neprocesate şi C5adesArg sunt eliminate rapid prin legarea cu receptorii de suprafaţă celulară şi sunt, prin urmare, prezente în concentraţii foarte reduse, în timp ce C3adesArg nu se leagă cu celulele şi se acumulează în plasmă. Măsurarea C3a este un indicator sensibil, independent de calea de activare a complementului, al activării complementului. Calea alternativă de activare a complementului poate fi evaluată prin măsurarea fragmentului Bb. Detectarea produsului fazei lichide a activării căii de atac a membranei, sC5b-9, atestă că complementul este activat complet. Deoarece atât calea lectinei, cât şi calea clasică generează aceleaşi produse de activare, C4a şi C4d, măsurarea acestor două fragmente nu oferă nici o informaţie referitor la aceea, în care din aceste două căi au fost generate produsele de activare.

Inhibarea activării complementului dependente de MASP-2 este caracterizată prin cel puţin de una din următoarele modificări într-o componentă a sistemului complementului, care apare ca urmare a administrării unui agent inhibitor al MASP-2 în conformitate cu metodele prezentei invenţii: inhibarea generării sau producerii produselor sistemului de activare a complementului dependentă de MASP-2: C4b, C3a, C5a şi/sau C5b-9 (MAC) (măsurate, de exemplu, aşa cum se descrie în Exemplul 2, reducerea scindării C4 şi depunerii C4b (măsurată, de exemplu, cum se descrie în Exemplul 10) sau reducerea scindării C3 şi depunerii C3b (măsurate, de exemplu, cum se descrie în exemplul 10).

AGENTI ADIŢIONALI

Compoziţiile şi metodele, care conţin agenţi inhibitori ai MASP-2, pot cuprinde opţional unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari, care pot amplifica activitatea agentului inhibitor al MASP-2 sau care asigură funcţii terapeutice conexe într-un mod aditiv sau sinergic. De exemplu, în contextul tratării unui subiect care suferă de TTP, în care subiectul este pozitiv pentru un inhibitor al ADAM-TS13, pot fi administraţi unul sau mai mulţi agenţi inhibitori ai MASP-2 în combinaţie (incluzând, administrarea concomitentă) cu unul sau mai mulţi agenţi imunosupresori. Agenţii imunosupresori adecvaţi includ: corticosteroizi, rituxan, ciclosporină, etc. În contextul tratării unui subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a HUS sau aHUS, unul sau mai mulţi agenţi inhibitori ai MASP-2 pot fi administraţi în combinaţie (incluzând administrarea concomitentă) cu un antibiotic potrivit. În contextul tratării unui subiect care suferă sau prezintă risc de a dezvolta aHUS, unul sau mai mulţi agenţi inhibitori ai MASP-2 pot fi administraţi în combinaţie (incluzând administrarea concomitentă) cu alţi agenţi inhibitori ai complementului, cum ar fi eculizumab (Soliris), TT- 30, anticorp la factorul B sau alţi agenţi, care inhibă componentele terminale ale complementului sau amplificarea căii alternative.

Includerea şi selecţia agentului (agenţilor) suplimentar (i) va fi determinată pentru a obţine un rezultat terapeutic dezirabil. În unele variante de realizare agentul inhibitor al MASP-2 poate fi administrat în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi antiinflamatori şi/sau analgezici. Agenţii antiinflamatori şi/sau analgezici potriviţi includ: antagonişti ai receptorilor de serotonină; agonişti ai receptorilor serotoninici; antagonişti ai receptorului histaminic; antagonişti ai receptorului pentru bradikinină; inhibitori de kallikreină; antagonişti ai receptorilor de tahichinină, incluzând antagonişti ai subtipului receptorului neurokininei 1 şi neurokininei 2; antagonişti ai receptorului peptidei genei calcitoninei (CGRP); antagonişti ai receptorilor de interleukină; inhibitori de enzime activi în calea sintetică de activare a metaboliţilor acidului arachidonic, incluzând inhibitori ai fosfolipazei, inclusiv inhibitorii izoformei PLA2 şi inhibitorii izoformei PLCΓ, inhibitori ai ciclooxigenazei (COX) (care pot fi inhibitori ai COX-1, COX-2 sau inhibitori neselectivi ai COX-1 şi -2), inhibitori ai lipooxigenazei; antagonişti ai receptorului de prostanoid, incluzând antagoniştii subtipului receptorului de eicosanoid EP-1 şi EP-4 şi antagoniştii subtipului receptorului de tromboxan; antagonişti ai receptorilor de leucotrienă, incluzând antagonişti ai subtipului receptorului de leucotrienă B4 şi antagonişti ai subtipului receptorului de leucotrienă D4; agonişti ai receptorilor opioizi, incluzând agoniştii subtipului receptorului µ-opioid, δ-opioid şi agoniştii subtipului receptorului κ-opioid; agoniştii şi antagoniştii receptorului purinergic, incluzând antagoniştii receptorului P2X şi agoniştii receptorului P2Y; substanţe sensibile la adenozintrifosfat (ATP); substanţe, care deschid canalele de potasiu; inhibitori ai MAP kinazei; inhibitori ai acetilcolinei colinomimetice şi agonişti ai receptorilor alfa-adrenergici (incluzând agonişti alfa-1, alfa-2 şi alfa-1 şi 2 neselectivi).

Agenţii inhibitori ai MASP 2 din prezenta invenţie pot fi, de asemenea, administraţi în combinaţie cu unul sau mai mulţi inhibitori ai complement, cum ar fi inhibitorul C5. Până în prezent, Eculizumab (Solaris®), un anticorp împotriva C5, este singurul medicament, direcţionat asupra complementului, care a fost aprobat pentru uz uman. Cu toate acestea, s-a demonstrat că anumiţi agenţi farmacologici blochează complementul in vivo. K76COOH şi mesilatul de nafamstat sunt doi agenţi, care au demonstrat o anumită eficacitate în modelele experimentale de transplant pe animale (Miyagawa, S. et al., Transplant Proc. 24: 483-484, 1992). S-a demonstrat că heparinele micromoleculare sunt eficiente în reglarea activităţii complementului (Edens, R. E. et al., Complement Today, pp. 96-120, Basel: Karger, 1993). Se crede că aceşti inhibitori micromoleculari pot fi utili ca agenţi pentru utilizare în combinaţie cu agenţii inhibitori ai MASP-2 din prezenta invenţie.

Alţi inhibitori ai complementului, care apar în mod natural, pot fi utili în combinaţie cu agenţii inhibitori ai MASP-2 din prezenta invenţie. Inhibitorii biologici ai complementului includ factorul 1 solubil al complementului (sCR1). Acesta este un inhibitor natural, care poate fi găsit pe membrana exterioară a celulelor umane. Alţi inhibitori ai membranei includ DAF, MCP şi CD59. Formele recombinante au fost testate pentru activitatea lor anticomplementară in vitro şi in vivo. SCR1 s-a dovedit a fi eficient în xenotransplant, în care sistemul complementului (atât calea alternativă, cât şi clasică) asigură declanşarea unui sindrom de respingere hiperactivă în câteva minute de perfuzare a sângelui prin noul organ transplantat (Platt, J.L. et al., Immunol. 11: 450-6, 1990; Marino, I.R. et al., Transplant Proc., 1071: 6, 1990; Johnstone, P.S. et al., Transplantation 54: 573-6, 1992). Utilizarea sCR1 protejează şi prelungeşte timpul de supravieţuire al organului transplantat, implicând calea de activare a complementului în patogeneza supravieţuirii organelor (Leventhal, J.R. et al., Transplantation 55: 857-66, 1993; Pruitt, S.K. et al., Transplantation 57: 363-70, 1994).

Inhibitorii complementului adiţionali potriviţi pentru utilizare în combinaţie cu compoziţiile din prezenta invenţie includ, de exemplu, MoAb, cum ar fi un anticorp anti-C5 (de exemplu, eculizumab), care este elaborat de Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, Connecticut, şi MoAbs anti-properdină.

PURTĂTORI FARMACEUTICI ŞI SISTEME DE LIVRARE

În general, compoziţiile de agent inhibitor al MASP-2 din prezenta invenţie, combinate cu oricare alţi agenţi terapeutici selectaţi, se conţin în mod adecvat într-un purtător farmaceutic acceptabil. Purtătorul este netoxic, biocompatibil şi este selectat astfel încât să nu afecteze negativ activitatea biologică a agentului inhibitor al MASP-2 (şi a oricărui alt agent terapeutic combinat cu acesta). Exemplele de purtători farmaceutic acceptabili pentru peptide sunt descrise în US 5,211,657, Yamada. Anticorpii anti-MASP2 şi peptidele inhibitoare, utile în prezenta invenţie, pot fi formulate în preparate în forme solide, semi-solide, gel, lichide sau gazoase, cum ar fi tablete, capsule, pulbere, granule, unguente, soluţii, supozitoare, forme pentru inhalare şi injecţii, care să permită administrarea orală, parenterală sau chirurgicală. Invenţia se referă, de asemenea, la administrarea locală a compoziţiilor prin aplicarea unui înveliş din medicament pe dispozitive medicale şi alte instrumente asemănătoare.

Purtătorii potriviţi pentru administrare parenterală prin injecţie, perfuzare sau irigare şi livrare topică include: apă distilată, soluţie salină tamponată cu fosfat fiziologic, soluţii Ringer normale sau lactate, soluţie de dextroză, soluţia Hank sau propandiol. În plus, uleiurile sterile nevolatile pot fi utilizate ca solvent sau ca mediu de suspendare. Pentru acest scop se poate utiliza orice ulei biocompatibil, inclusiv mono- sau digliceridele sintetice. În plus, acizii graşi, cum ar fi acidul oleic, se folosesc pentru prepararea preparatelor injectabile. Purtătorul şi agentul pot fi compuşi sub formă de gel, suspensie, gel polimerizabil sau nepolimerizabil, pastă sau cremă.

Purtătorul poate cuprinde, de asemenea, un vehicul de livrare pentru susţinerea regimului de eliberare (adică, prolongat, întârziat sau reglat) al agentului (agenţilor) sau pentru a intensifica eliberarea, absorbţia, stabilitatea sau farmacocinetica agentului (agenţilor) terapeutic(i). Un astfel de vehicul de livrare poate include, de exemplu, microparticule, microsfere, nanosfere sau nanoparticule compuse din proteine, lipozomi, carbohidraţi, compuşi organici sintetici, compuşi anorganici, hidrogeluri polimerice sau copolimerice şi micele polimerice. Sistemele potrivite de hidrogel şi micelare includ: copolimerii PEO:PHB:PEO şi complexele copolimer/ciclodextrină (WO 2004/009664 A2) şi PEO şi complexele PEO/ciclodextrină (US nr. 2002/0019369 A1). Astfel de hidrogeluri pot fi injectate local în locul acţiunii intenţionate sau subcutanat, sau intramuscular pentru a forma un depozit cu eliberare susţinută.

Pentru administrare intraarticulară agentul inhibitor al MASP-2 poate fi transportat în purtători lichizi sau geluri, descrişi mai sus, care sunt injectabili, vehicule de eliberare susţinută descrise mai sus, care sunt injectabile, sau cu un derivat de acid hialuronic sau acid hialuronic.

Pentru administrarea orală a agenţilor nepeptidergici agentul inhibitor al MASP-2 poate fi transportat într-o umplutură sau un diluant inert, cum ar fi zaharoza, amidonul de porumb sau celuloza.

Pentru administrare topică agentul inhibitor al MASP-2 poate fi transportat în unguent, loţiune, cremă, gel, picături, supozitoare, spray, lichid sau pulbere sau în sisteme de gel sau microcapsulare de livrare printr-un plasture transdermal.

Diferite sisteme de administrare nazală şi pulmonară, incluzând aerosoli, inhalatoare cu doză măsurată, inhalatoare cu pulbere uscată şi nebulizatoare, sunt elaborate şi pot fi adaptate în mod adecvat pentru livrarea compoziţiilor prezentei invenţii într-un vehicul de eliberare în aerosol, prin inhalare sau nebulizat.

Pentru administrare intratecală (IT) sau intracerebroventriculară (ICV) a compoziţiilor prezentei invenţii pot fi utilizate sisteme potrivite pentru administrare sterilă (de exemplu, lichide, geluri, suspensii, etc.).

Compoziţiile, conform prezentei invenţii, pot include, de asemenea, excipienţi biocompatibili, cum ar fi agenţi de dispersare sau de umectare, agenţi de suspendare, diluanţi, tampoane, agenţi de stimulare a penetrării, emulsifianţi, lianţi, agenţi de îngroşare, agenţi de aromatizare (pentru administrare orală).

PURTĂTORI FARMACEUTICI PENTRU ANTICORPI ŞI PEPTIDE

Mai concret, în ceea ce priveşte anticorpii anti-MASP-2 şi peptidele inhibitoare, formulările care le conţin pot fi administrate parenteral ca doze injectabile de soluţii sau suspensii ale compusului într-un diluant fiziologic acceptabil cu un purtător farmaceutic care poate fi un lichid steril, cum ar fi apă, soluţie fiziologică, glicerol sau etanol. În plus, în compoziţiile cu conţinut de anticorpi anti-MASP-2 şi peptide inhibitoare pot fi prezente substanţe auxiliare, cum ar fi agenţi de umectare sau emulsifiere, agenţi tensioactivi, substanţe tampon, etc. Componentele suplimentare ale compoziţiilor farmaceutice includ uleiuri (cum ar fi de origine animală, vegetală sau sintetică), de exemplu, ulei de soia şi ulei mineral. În general, glicolii, cum ar fi propilenglicolul sau polietilenglicolul, sunt purtători lichizi preferaţi pentru soluţiile injectabile.

Anticorpii anti-MASP-2 şi peptidele inhibitoare pot fi, de asemenea, administrate sub forma unei injecţii depozit sau a unui preparat implant, care pot fi formulate în aşa mod încât să permită eliberarea susţinută sau pulsatilă a agenţilor activi.

PURTĂTORI FARMACEUTIC ACCEPTABILI PENTRU INHIBITORII EXPRESIEI

Mai concret, inhibitorii de expresie, utili în metodele invenţiei, sunt furnizaţi în compoziţii care conţin un inhibitor de expresie, cum s-a descris mai sus, şi un purtător sau diluant farmaceutic acceptabil. Compoziţia poate conţine adiţional un sistem de dispersie coloidală.

Compoziţiile farmaceutice cu conţinut de inhibitori de expresie pot include, dar nu se limitează la, soluţii, emulsii şi formulări care conţin lipozomi. Aceste compoziţii pot fi preparate dintr-o varietate de componente care includ, dar nu se limitează la, lichide preformate, componente solide auto-emulsifiante şi semisolide auto-emulsifiante. Prepararea unor astfel de compoziţii implică de obicei combinarea inhibitorului de expresie cu unul sau mai mulţi dintre următoarele substanţe: tampoane, antioxidanţi, polipeptide micromoleculare, proteine, aminoacizi, carbohidraţi, incluzând glucoză, zaharoză sau dextrină; agenţi de chelare, cum ar fi EDTA, glutation şi alţi stabilizatori şi excipienţi. Soluţia fiziologică tamponată neutră sau soluţia fiziologică, amestecate cu albumină serică nespecifică, sunt exemple de diluanţi potriviţi.

În unele variante de realizare compoziţiile pot fi preparate şi formulate ca emulsii, care de obicei reprezintă sisteme eterogene dintr-un lichid dispersat în altul sub formă de picături (Idson, în Pharmaceutical Dosage Forms, vol.1, Rieger and Banker (eds.), Marcek Dekker, Inc., NY, 1988). Exemplele de emulgatori naturali utilizaţi în formulările de emulsie includ acacia, ceara de albine, lanolină, lecitină şi fosfatide.

Într-o variantă de realizare compoziţiile, care includ acizi nucleici, pot fi formulate ca microemulsii. O microemulsie, aşa cum se utilizează aici, se referă la un sistem de apă, ulei şi de substanţă amfifilă, care reprezintă o soluţie lichidă simplă optic izotropă şi termodinamic stabilă (Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms, voi 1). Metoda, conform invenţiei, poate, de asemenea, să utilizeze lipozomi pentru transferul şi eliberarea oligonucleotidelor antisens la locul necesar.

Compoziţiile farmaceutice şi formulările inhibitorilor de expresie pentru administrare topică pot include plasturi transdermali, unguente, loţiuni, creme, geluri, picături, supozitoare, spray-uri, lichide şi pulberi. Se pot utiliza purtători farmaceutici uzuali, precum baze apoase, pulverulente sau uleioase şi agenţi de îngroşare, etc.

MODURI DE ADMINISTRARE

Compoziţiile farmaceutice cu conţinut de agenţi inhibitori ai MASP-2 pot fi administrate în diferite moduri, în funcţie de care mod de administrare, local sau sistemic, este cel mai potrivit pentru afecţiunea care se tratează. În plus, aşa cum s-a descris mai sus, în legătură cu procedurile de reperfuzie extracorporală, agenţii inhibitori ai MASP-2 pot fi administraţi prin introducerea compoziţiilor prezentei invenţii în sângele sau plasma circulantă. Adiţional, compoziţiile prezentei invenţii pot fi eliberate prin aplicarea unui înveliş pe dispozitivul medical implantabil sau prin introducerea compoziţiei în interiorul dispozitivului medical implantabil.

LIVRAREA SISTEMICĂ

Aşa cum se utilizează aici termenii "livrare sistemică" şi "administrare sistemică" intenţionează să includă, dar nu se limitează, căile orale şi parenterale, incluzând căile intramusculare (IM), subcutanate, intravenoase (IV), intraarteriale, inhalatorii, topice, transdermale, nazale, rectale, vaginale şi alte căi de administrare, care conduc în mod eficient la dispersarea agentului eliberat într-un singur sau în mai multe situsuri de acţiune terapeutică intenţionată. Căile preferate de livrare sistemică pentru compoziţiile prezentei invenţii includ: intravenoasă, intramusculară, subcutanată şi inhalatoare. Se va înţelege, că calea exactă de administrare sistemică pentru agenţii selectaţi, utilizaţi în compoziţiile particulare ale prezentei invenţii, va fi determinate, inclusive, având în vedere susceptibilitatea agentului la căile de transformare metabolică, asociate cu calea de administrare dată. De exemplu, agenţii peptidici pot fi administraţi cel mai adecvat pe alte căi, decât pe cale orală.

Anticorpii şi polipeptidele inhibitoare ale MASP-2 pot fi administrate la un subiect, care are nevoie de acesta, prin orice metode potrivite. Metodele de administrare ale anticorpilor şi polipeptidelor MASP-2 includ administrarea orală, pulmonară, parenterală (de exemplu intramusculară, intraperitoneală, intravenoasă (IV) sau prin injectare subcutanată), inhalatorie (cum ar fi pentru o formulare de pulbere fină), transdermală, rectală sau sublinguală în forme de dozare potrivite pentru fiecare cale de administrare.

Cu titlul de exemplu reprezentativ anticorpii şi peptidele inhibitoare ale MASP-2 pot fi introduse într-un corp viu prin aplicarea pe o membrană a organismului, capabilă să absoarbă polipeptidele, de exemplu, pe membranele nazale, gastrointestinale şi rectale. De obicei polipeptidele se aplică pe membrana absorbantă în combinaţie cu un amplificator de permeabilitate. (de exemplu, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Sys. 5:69, 1988; Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13: 213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13:241, 1990). De exemplu, STDHF este un derivat sintetic al acidului fusidic, un surfactant steroidic, care are o structură similară cu sărurile biliare, şi a fost utilizat ca un potenţator de permeabilitate pentru administrare nazală. (Lee, W.A., Biopharm., 22, Nov./Dec.1990).

Anticorpii şi polipeptidele inhibitoare ale MASP-2 pot fi introduse în asociere cu o altă moleculă, cum ar fi o lipidă, pentru a proteja polipeptidele de degradare enzimatică. De exemplu, ataşarea covalentă a polimerilor, în special a polietilenglicolului (PEG), a fost utilizată pentru a proteja anumite proteine de hidroliza enzimatică în organism şi pentru a prelungi astfel timpul de înjumătăţire (Fuertges, F. et al., J. Controlled Release 11: 139, 1990). S-a relatat despre existenţa mai multor sisteme de polimeri pentru administrarea proteinelor (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, 1989; Hori, R., et al., Pharm. Res. 6:813, 1989; Yamakawa, I., et al., J. Pharm. Sci. 79:505, 1990; Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, 1989; Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, 1989; Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, 1989; Makino, K., J. Controlled Release 12:235, 1990; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:117, 1989; Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78:219, 1989).

Recent au fost elaboraţi lipozomi cu stabilitate serică şi circulantă îmbunătăţită de odată şi jumătate de ori (de exemplu, US 5.741.516, Webb). În plus, au fost revizuite diferite metode preparare a lipozomilor şi a substanţelor similare lipozomilor ca purtători potenţiali de medicament (de exemplu, US 5.567.434, Szoka; US 5.552.157, Yagi; US 5 565 213, Nakamori; US 5.738.868, Shinkarenko şi US 5.795.587, Gao).

Pentru aplicaţiile transdermale anticorpii şi polipeptidele inhibitoare ale MASP-2 pot fi combinate cu alţi ingredienţi adecvaţi, cum ar fi purtători şi/sau adjuvanţi. Nu există nici o limitare a naturii acestor alte ingrediente, cu excepţia faptului că acestea trebuie să fie farmaceutic acceptabile pentru administrarea necesară şi să nu degradeze activitatea ingredienţilor activi ai compoziţiei. Exemplele de medii potrivite includ unguente, creme, geluri sau suspensii, cu sau fără colagen purificat. Anticorpii şi polipeptidele inhibitoare ale MASP-2 pot fi, de asemenea, impregnate în plasturi transdermali, plasturi şi în bandaje, de preferinţă, în formă lichidă sau semi-lichidă.

Compoziţiile prezentei invenţii pot fi administrate sistemic periodic la intervale determinate pentru a menţine un nivel dezirabil al efectului terapeutic. De exemplu, compoziţiile pot fi administrate, cum ar fi prin injecţie subcutanată, la fiecare două până la patru săptămâni sau la intervale mai puţin frecvente. Regimul de dozare va fi determinat de către medic, având în vedere diverşi factori care pot influenţa acţiunea combinaţiei de agenţi. Aceşti factori vor include evoluţia stării, care urmează a fi tratată, vârsta, sexul şi greutatea corporală a pacientului şi alţi factori clinici. Doza de fiecare agent individual va varia în funcţie de agentul inhibitor al MASP-2, inclus în compoziţie, precum şi de prezenţa şi originea oricărui vehicul de eliberare a medicamentului (de exemplu, un vehicul cu eliberare prelungită). În plus, doza poate fi ajustată în funcţie de variaţia frecvenţei de administrare şi a comportamentului farmacocinetic al agentului (agenţilor) livrat (livraţi).

LIVRAREA LOCALĂ

Aşa cum este utilizat aici, termenul "local" cuprinde aplicarea unui medicament pe sau în jurul unui loc de acţiune intenţionată şi poate include, de exemplu, administrarea topică pe piele sau pe alte ţesuturi afectate, administrarea oftalmică, intratecală (IT), intracerebroventriculară (ICV), administrare intraarticulară, intracavitară, intracraniană sau intraveziculară, plasare sau irigare. Administrarea locală poate fi preferată pentru administrarea unei doze mai mici, pentru a evita efectele secundare sistemice şi pentru un control mai precis al timpului de livrare şi de concentrare a agenţilor activi în locul de livrare locală. Administrarea locală furnizează o concentraţie cunoscută în locul ţintă, indiferent de variabilitatea metabolismului, fluxului sanguin, etc., la diferiţi pacienţi. Controlul îmbunătăţit al dozării este, de asemenea, asigurat de modul direct de livrare.

Administrarea locală a unui agent inhibitor al MASP-2 poate fi realizată în contextul metodelor chirurgicale pentru tratarea unei boli sau stări, cum ar fi, de exemplu, în timpul intervenţiilor, cum ar fi chirurgia by-pass arterială, aterectomia, procedurile cu laser, procedurile ultrasonice, angioplastia cu balon şi plasarea unui stent. De exemplu, un inhibitor al MASP-2 poate fi administrat unui subiect împreună cu o procedură de angioplastie cu balon. O procedură de angioplastie cu balon implică introducerea unui cateter, având un balon deflatat într-o arteră. Balonul deflat este poziţionat în imediata apropiere a plăcii aterosclerotice şi este umflat astfel încât placa este comprimată spre peretele vascular. Ca urmare, suprafaţa balonului este în contact cu stratul de celule endoteliale vasculare de pe suprafaţa vasului de sânge. Agentul inhibitor al MASP-2 poate fi ataşat la cateterul de angioplastie cu balon într-o modalitate, care permite eliberarea agentului pe locul aflării plăcii aterosclerotice. Agentul poate fi ataşat la cateterul cu balon în conformitate cu procedurile standard cunoscute în domeniu. De exemplu, agentul poate fi depozitat într-un compartiment al cateterului balonului până când balonul este umflat, moment în care este eliberat în mediul local. În mod alternativ, agentul poate fi impregnat pe suprafaţa balonului, astfel încât să intre în contact cu celulele peretelui arterial pe măsură ce balonul este umflat. Agentul poate fi, de asemenea, administrat într-un cateter cu balon perforat, cum ar fi cele descrise de Flugelman, M.Y. et al., Circulation 85: 1110-1117, 1992. A vedea, de asemenea, WO 95/23161 pentru un exemplu de procedură pentru ataşarea unei proteine terapeutice la un cateter de angioplastie cu balon. De asemenea, agentul inhibitor al MASP-2 poate fi inclus într-un strat de gel sau într-o acoperire polimerică aplicată pe un stent sau poate fi încorporat în materialul stentului, astfel încât stentul să elibereze agentul inhibitor al MASP-2 după plasarea lui vasculară.

Compoziţiile inhibitoare ale MASP-2, utilizate în tratamentul artritelor şi al altor tulburări musculoscheletale, pot fi administrate local prin injecţie intra-articulară. Astfel de compoziţii pot include în mod adecvat un vehicul cu eliberare susţinută. Ca un alt exemplu de caz, în care poate fi dorită eliberarea locală, compoziţiile inhibitoare ale MASP-2, utilizate în tratamentul stărilor urogenitale, pot fi instilate intravezical sau în alte structuri urogenitale.

ÎNVELIŞURI PE UN DISPOZITIV MEDICAL

Agenţii inhibitori ai MASP-2, cum ar fi anticorpii şi peptidele inhibitoare pot fi imobilizate pe o suprafaţă (sau în interiorul) unui dispozitiv medical implantabil sau ataşabil. Suprafaţa modificată va fi de obicei în contact cu ţesutul viu după implantare într-un corp al animalului. Prin "dispozitiv medical implantabil sau ataşabil" se înţelege orice dispozitiv, care este implantat sau ataşat ţesutului unui organism animal pe perioada funcţionării normale a dispozitivului (de exemplu, stenturi şi dispozitive implantabile de livrare a medicamentelor). Astfel de dispozitive medicale implantabile sau ataşabile pot fi fabricate, de exemplu, din nitroceluloză, diazoceluloză, sticlă, polistiren, polivinilclorură, polipropilenă, polietilenă, dextran, sefaroză, agar, amidon, nailon, oţel inoxidabil, titan şi polimeri biodegradabili şi/sau biocompatibili. Legarea proteinei cu un dispozitiv poate fi realizată prin orice tehnică, care nu distruge activitatea biologică a proteinei legate, de exemplu prin ataşarea la dispozitiv a unuia sau a ambelor reziduuri N- C-terminale ale proteinei. De asemenea, ataşarea poate fi făcută la una sau mai multe zone interne ale proteinei. Se pot folosi, de asemenea, multiple ataşamente (atât interne, cât şi capete ale proteinei). O suprafaţă a unui dispozitiv medical implantabil sau ataşabil poate fi modificată pentru a include grupe funcţionale (de exemplu carboxil, amidă, amino, eter, hidroxil, ciano, nitril, sulfanamido, acetilinică, epoxid, silanică, anhidrică, succinimică, azido) pentru imobilizarea proteinei pe aceasta. Metodele de interacţiune chimică includ, dar nu se limitează, formarea derivaţilor de esteri, eteri, amide, azido şi sulfanamido, cianat şi altor legături cu grupele funcţionale disponibile pe anticorpii sau pe peptidele inhibitoare ale MASP-2. Anticorpii sau fragmentele inhibitoare ale MASP-2 pot fi, de asemenea, ataşate necovalent prin adiţia la proteina secvenţei unui marcaj afin, cum ar fi GST (D.B. Smith and K.S. Johnson, Gene 67:31, 1988), polihistidine (E. Hochuli et al., J. Chromatog., 411: 77, 1987) sau biotină. Astfel de marcaje afine pot fi utilizate pentru ataşarea reversibilă a proteinei la un dispozitiv.

Proteinele pot fi, de asemenea, ataşate covalent la suprafaţa unui corp de dispozitiv, de exemplu, prin activarea covalentă a suprafeţei dispozitivului medical. Cu titlu de exemplu reprezentativ, proteinele matricelulare pot fi ataşate la corpul dispozitivului prin oricare dintre următoarele perechi de grupe reactive (un membru al perechii fiind prezent pe suprafaţa corpului dispozitivului şi celălalt membru al perechii fiind prezent pe proteinele matricelulare): grupa hidroxil/grupa acidului carboxilic pentru a produce o legătură esterică; grupa hidroxil/grupa de anhidridă pentru a produce o legătură esterică; grupa hidroxil/grupa izocianat pentru a produce o legătură uretanică. O suprafaţă a unui corp de dispozitiv, care nu posedă grupe reactive potrivite poate fi prelucrată prin tratarea plasmei cu o sarcină de frecvenţă înaltă (RFGD) pentru a genera grupe reactive pentru a permite depunerea proteinelor matricelulare (de exemplu, tratarea plasmei cu oxigen pentru introducerea grupelor cu conţinut de oxigen; tratarea cu plasmă propil-amino pentru introducerea grupelor amino).

Agenţii inhibitori ai MASP-2 cu conţinut de molecule de acid nucleic, cum ar fi ARNi sau ADN antisens, codificatori ai inhibitorilor peptidei, pot fi încorporaţi în matrice poroase ataşate la un corp de dispozitiv. Matricele poroase reprezentative, utile pentru realizarea stratului de suprafaţă, sunt cele preparate din colagenul tendonului sau pielii, disponibile dintr-o varietate de surse comerciale (de exemplu, Sigma and Collagen Corporation) sau matricele de colagen, preparate cum este descrie în US 4.394.370, Jefferies şi US 4,975,527, Koezuka. Un material colagenos este denumit UltraFiberTM şi este disponibil de la Norian Corp. (Mountain View, California).

Anumite matrice polimerice pot fi, de asemenea, utilizate, dacă se doreşte, şi includ polimeri de ester acrilic şi polimeri ai acidului lactic (US 4.526.909 şi US 4.563.489, Urist. Exemplele particulare de polimeri utili sunt polimerii ortoesterilor, anhidridelor, propilen cofumaratelor sau un polimer al unuia sau al mai multor monomeri ai acidului α-hidroxicarboxilic (de exemplu, acidul α-hidroxiacetic (acidul glicolic) şi/sau acidul α-hidroxipropionic (acidul lactic) ).

SCHEME DE TRATMENT

În aplicaţiile profilactice compoziţiile farmaceutice se administrează la un subiect susceptibil sau cu risc de o afecţiune asociată cu activarea complementului dependentă de MASP-2 într-o cantitate suficientă pentru a elimina sau a reduce riscul de apariţie a simptomelor afecţiunii. În aplicaţiile terapeutice compoziţiile farmaceutice se administrează la un subiect suspectat sau deja suferind de o afecţiune asociată cu activarea complementului dependentă de MASP-2 într-o cantitate terapeutic eficientă, suficientă pentru a ameliora sau cel puţin de a reduce parţial simptomele afecţiunii. În ambele scheme de tratament: profilactic şi terapeutic, compoziţiile cu conţinut de agenţi inhibitori ai MASP-2 pot fi administrate în câteva doze până la subiect se obţine un rezultat terapeutic suficient. Aplicarea compoziţiilor inhibitoare ale MASP-2 din prezenta invenţie poate fi realizată printr-o singură administrare a compoziţiei sau administrări de un număr limitat de repetări pentru tratamentul unei stări acute, de exemplu, al leziunilor de reperfuzie sau altor leziuni traumatice. În mod alternativ, compoziţia poate fi administrată la intervale periodice pentru o perioadă îndelungată de timp în tratamentul stărilor cronice, de exemplu, al artritelor sau psoriazisului.

Metodele şi compoziţiile prezentei invenţii pot fi utilizate pentru a inhiba inflamaţia şi procesele conexe, care rezultă în mod obişnuit din procedurile medicale şi chirurgicale de diagnosticare şi terapeutice. Pentru a inhiba astfel de procese, compoziţia inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi aplicată periprocedural. Aşa cum este utilizat aici termenul "periprocedural" se referă la administrarea compoziţiei inhibitoare preprocedural şi/sau intraprocedural şi/sau postprocedural, adică înainte de procedura, înainte şi în timpul procedurii, înainte şi după procedură, înainte, în timpul şi după procedură, în timpul procedurii, în timpul şi după procedură sau după procedură. Aplicarea periprocedurală poate fi realizată prin administrarea locală a compoziţiei pe locul chirurgical sau procedural, cum ar fi prin injecţie sau irigarea continuă sau intermitentă a locului sau prin administrare sistemică. Metodele potrivite de administrare locală perioperatorie a soluţiilor de agent inhibitor al MASP-2 sunt descrise în US 6.420.432, Demopulos şi US 6.645.168, Demopulos. Metodele adecvate de administrare locală a compoziţiilor condroprotectoare, inclusiv a agentului (agenţilor) inhibitor(i) ai MASP-2 sunt dezvăluiţi în WO 01/07067 A2. Metodele şi compoziţiile adecvate pentru administrarea sistemică direcţionată a compoziţiilor condroprotectoare, inclusiv a agentului (agenţilor) inhibitor(i) ai MASP-2 sunt dezvăluiţi în WO 03/063799 A2.

Într-un aspect al invenţiei compoziţiile farmaceutice se administrează unui subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei microangiopatii trombotice (TMA). Într-o variantă de realizare TMA este selectat din grupa constând din sindrom hemolitic uremic (HUS), purpură trombotică trombocitopenică (TTP) şi sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS). Într-o variantă de realizare TMA este aHUS. Într-o variantă de realizare compoziţia se administrează unui pacient cu aHUS în timpul fazei acute a bolii. Într-o variantă de realizare compoziţia se administrează unui pacient cu aHUS în timpul fazei de remisiune (adică, la un subiect care a fost recuperat sau parţial recuperat dintr-un epizod de fază acută aHUS, o astfel de remisiune se manifestă, de exemplu, prin creşterea numărului de trombocite şi/sau concentraţii serice reduse de LDH (de exemplu, Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, încorporat aici ca referinţă). Într-o variantă de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei TMA, care este (i) o TMA asociată cancerului; (ii) o TMA asociată chimioterapiei; sau (iii) o TMA asociată transplantului (de exemplu, transplantului de organe, cum ar fi transplantul de rinichi sau transplantul de celule stem hematopoietice alogene). Într-o variantă de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a sindromului Upshaw-Schulman (USS). Într-o variantă de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a bolii Degos. Într-o variantă de realizare subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a sindromului antifosfolipidic catastrofal (CAPS). În aplicaţiile terapeutice compoziţiile farmaceutice se administrează la un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei TMA într-o cantitate terapeutic eficientă, suficientă pentru a inhiba formarea trombilor, a elimina sau a reduce cel puţin de parţial simptomele afecţiunii.

Atât în regimul profilactic, cât şi în cel terapeutic compoziţiile, care conţin agenţi inhibitori ai MASP-2, pot fi administrate în mai multe doze până la subiect se obţine un rezultat terapeutic suficient. Într-o realizare a invenţiei agentul inhibitor al MASP-2 conţine un anticorp anti-MASP-2, care poate fi administrat în mod adecvat unui pacient adult (de exemplu, o greutate corporală medie a adulţilor de 70 kg) în doză de la 0,1 mg până la 10.000 mg, mai potrivită fiind de la 1.0 mg până la 5.000 mg, mai potrivită de la 10.0 mg până la 2.000 mg, mai potrivită de la 10.0 mg până la 1.000 mg şi încă mai potrivită de la 50.0 mg până la 500 mg. Pentru pacienţii pediatrici doza poate fi ajustată proporţional cu greutatea pacientului. Pentru tratamentul TMA aplicarea compoziţiilor inhibitoare ale MASP-2 din prezenta invenţie poate fi realizată printr-o singură administrare a compoziţiei sau un număr limitat de administrări consecutive. În mod alternativ, pentru tratamentul TMA compoziţia se poate administra la intervale periodice, cum ar fi zilnic, de două ori pe săptămână, săptămânal, o dată la două săptămâni, lunar sau bilunar pentru o perioadă îndelungată de timp.

În unele variante de realizare la un subiect, care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei TMA, anterior sau la momentul dat s-a tratat sau se tratează cu un inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii, conform invenţiei, cuprinzând un inhibitor al MASP-2 şi administrarea suplimentară la subiect a unui inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare inhibitorul componentelor terminale ale complementului este un anticorp uman anti-C5 sau un fragment al acestuia de legare a antigenului. În unele variante de realizare inhibitorul activării componentelor terminale ale complementului este eculizumab.

Într-un aspect al invenţiei compoziţiile farmaceutice sunt administrate la un subiect susceptibil sau cu risc de dezvoltare aHUS într-o cantitate suficientă pentru a elimina sau a reduce riscul de apariţie a simptomelor afecţiunii. În aplicaţiile terapeutice compoziţiile farmaceutice sunt administrate la un subiect suspectat sau deja suferind de aHUS într-o cantitate terapeutic eficientă, suficientă pentru a uşura, sau cel puţin de parţial, pentru a reduce simptomele afecţiunii. Într-un aspect al invenţiei înainte de administrare subiectul poate fi examinat pentru a determina dacă prezintă unul sau mai multe simptome ale aHUS, incluzând (i) anemie, (ii) trombocitopenie (iii) insuficienţă renală şi (iv) creşterea creatininei, iar compoziţia din prezenta invenţie este apoi administrată într-o cantitate eficientă şi pentru o perioadă de timp suficientă pentru a îmbunătăţi aceste simptome.

Într-un alt aspect al invenţiei compoziţiile inhibitoare ale MASP-2 ale prezentei invenţii pot fi utilizate pentru a trata profilactic un subiect cu risc crescut de a dezvolta aHUS şi astfel de a reduce probabilitatea instalării aHUS la subiect. Prezenţa la subiect a unui marcher genetic, cunoscut de a fi asociat cu aHUS, este determinată mai întâi prin efectuarea unui test genetic de screening pe o probă, prelevată de la subiect şi prin identificarea prezenţei a cel puţin de unui marcher genetic, asociat cu aHUS, a factorului H al complementului (CFH), a factorului I (CFI), a factorului B (CFB), cofactorului membranei CD46, C3, proteinei asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR1), trombodulinei proteice anticoagulante (THBD), proteinei 3 asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR3) sau a proteinei 4 asemănătoare cu factorul H al complementului (CFHR4). Subiectul este apoi monitorizat periodic (de exemplu, lunar, trimestrial, de două ori pe an sau anual) pentru a determina prezenţa sau absenţa a cel puţin de unui simptom al aHUS, cum ar fi anemia, trombocitopenia, insuficienţa renală şi creşterea creatininei. La determinarea prezenţei a cel puţin de unuia din aceste simptome, subiectului i se poate administra o cantitate dintr-un agent inhibitor al MASP-2 eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2, într-o cantitate eficientă şi pentru o perioadă de timp suficientă pentru a îmbunătăţi unul sau mai multe simptome. Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect cu risc crescut de a dezvolta aHUS, datorită faptului că a fost testat şi determinat să aibă unul dintre marcherii genetici asociaţi cu aHUS, poate fi monitorizat pentru apariţia unui eveniment asociat cu declanşarea simptomelor clinice ale aHUS, inclusiv acţiunea îndelungată a unui medicament, infecţie (de exemplu, infecţie bacteriană), neoformaţiune malignă, traumă, transplant de organe sau ţesuturi şi sarcină.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie, care conţine o cantitate de un agent inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependente de MASP-2 poate fi administrată la un pacient care suferă sau prezintă risc de a dezvolta sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS) asociat unei infecţii. De exemplu, un pacient care suferă sau prezintă risc de a dezvolta aHUS ne-enteric asociat cu o infecţie S. pneumonia poate fi tratat cu compoziţiile prezentei invenţii.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care suferă de aHUS poate fi iniţial tratat cu o compoziţie inhibitoare MASP-2 din prezenta invenţie, care este administrată prin linia cateterului, cum ar fi linia cateterului intravenos sau linia cateterului subcutanat, pentru prima perioadă de timp, cum ar fi o oră, douăsprezece ore, o zi, două zile sau trei zile. Subiectul poate fi apoi tratat pentru a doua perioadă de timp cu compoziţia inhibitoare a MASP-2, care se administrează prin injecţii subcutanate obişnuite, cum ar fi injecţii zilnice, de două ori pe săptămână, săptămânale, o dată la două săptămâni, lunar sau bilunar.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 poate fi administrată la un subiect care suferă de aHUS în absenţa plasmeferezei (adică un subiect al cărui simptome aHUS nu au fost tratate cu plasmefereză şi care nu au fost trataţi cu plasmefereză în timpul tratamentului cu compoziţia inhibitoare a MASP-2), pentru a evita complicaţiile posibile ale plasmaferezei, incluzând hemoragia, infecţia şi expunerea la tulburări şi/sau alergii inerente donatorului de plasmă sau la un subiect căruia îi este contraindicată plasmafereza sau în condiţii în care plasmafereza nu este disponibilă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi administrată la un subiect care suferă de aHUS concomitent cu tratarea pacientului cu plasmefereză. De exemplu, la un subiect care primeşte tratament cu plasmefereză poate fi apoi administrată compoziţia inhibitoare a MASP-2 urmând sau alternând cu schimbul de plasmă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care suferă sau prezintă risc de a dezvolta aHUS şi care este tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi monitorizat prin determinare periodică, cum ar fi la fiecare douăsprezece ore sau zilnic, a cel puţin de unui factor de complement, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor de complement, comparativ cu o valoare standard sau cu un subiect sănătos, indică necesitatea continuării tratamentului cu această compoziţie.

Atât în regimul profilactic, cât şi în cel terapeutic, compoziţiile care conţin agenţi inhibitori ai MASP-2, pot fi administrate în mai multe doze până la subiect se obţine un rezultat terapeutic suficient. Într-o realizare a invenţiei agentul inhibitor al MASP-2 cuprinde un anticorp anti-MASP-2, care poate fi administrat în mod adecvat unui pacient adult (de exemplu, cu o greutate corporală medie a adulţilor de 70 kg) într-o doză de la 0,1 mg până la 10.000 mg, mai potrivită fiind de la 1.0 mg până la 5.000 mg, mai potrivită de la 10.0 mg până la 2.000 mg, mai potrivită de la 10.0 mg până la 1.000 mg şi încă mai potrivită de la 50.0 mg până la 500 mg. Pentru pacienţii copii şi adolescenţi doza poate fi ajustată proporţional cu greutatea corporală a pacientului. Pentru tratamentul aHUS aplicarea compoziţiilor inhibitoare ale MASP-2, conform prezentei invenţii, poate fi realizată printr-o singură administrare a compoziţiei sau printr-un număr limitat de administrări consecvente. În mod alternativ, pentru tratamentul aHUS compoziţia poate fi administrată la intervale periodice, cum ar fi zilnic, de două ori pe săptămână, săptămânal, o dată la două săptămâni, lunar sau de două ori pe lună, pentru o perioadă îndelungată de timp.

În unele variante de realizare subiectului, care suferă de aHUS, i-a fost administrat anterior sau este administrat la momentul dat un tratament cu un inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii, conform invenţiei, cuprinzând un inhibitor al MASP-2 şi administrarea suplimentară la subiect a unui inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare inhibitorul componentelor terminale ale complementului este un anticorp uman anti-C5 sau un fragment al acestuia de legare a antigenului. În unele variante de realizare inhibitorul componentelor terminale ale complementului este eculizumab.

Într-un aspect al invenţiei compoziţiile farmaceutice sunt administrate la un subiect susceptibil sau cu risc de dezvoltare a HUS într-o cantitate suficientă pentru a elimina sau pentru a reduce riscul de apariţie a simptomelor afecţiunii. În aplicaţii terapeutice compoziţiile farmaceutice sunt administrate la un subiect suspectat sau deja suferind de HUS într-o cantitate terapeutic eficientă, suficientă pentru a ameliora, sau cel puţin, pentru a reduce parţial simptomele afecţiunii.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii probabilitatea tulburării funcţiei renale la un subiect cu risc de dezvoltare a HUS poate fi redusă prin administrarea unei compoziţii inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii, într-o cantitate eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2. De exemplu, un subiect cu risc de dezvoltare a HUS şi care urmează a fi tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii, poate prezenta unul sau mai multe simptome asociate cu HUS, incluzând diaree, nivelul hematocritului mai mic de 30% cu distrugerea intravasculară a eritrocitelor, trombocitopenie şi niveluri înalte de creatinină. Cu titlul de exemplu, un subiect cu risc de dezvoltare a HUS şi care urmează să fie tratat cu compoziţiile inhibitoare ale MASP-2, conform prezentei invenţii, poate fi infectat cu E. coli, shigella sau salmonella. Astfel de subiecţi infectaţi cu E. coli, shigella sau salmonella pot fi trataţi cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii, concomitent cu tratamentul cu antibiotice sau, alternativ, pot fi trataţi cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2 fără tratament concomitent cu un antibiotic, în particular pentru infecţia cu E. coli enterogenic tratamentul cu antibiotic este contraindicat. Un subiect, infectat cu E. coli enterogenic, care a fost tratat cu un antibiotic poate avea un risc crescut de a dezvolta HUS şi poate fi tratat în mod adecvat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii, pentru a reduce acest risc. Un subiect, infectat cu E. coli enterogenic, poate fi tratat pentru o primă perioadă de timp cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie în absenţa unui antibiotic şi apoi pentru a doua perioadă de timp, atât cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii, cât şi cu un antibiotic.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect, care suferă de HUS, poate fi iniţial tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii, care este administrată prin linia cateterului, cum ar fi linia cateterului intravenos sau linia cateterului subcutanat, pentru o primă perioadă de timp, cum ar fi o oră, douăsprezece ore, o zi, două zile sau trei zile. Subiectul poate fi apoi tratat pentru a doua perioadă de timp cu compoziţia inhibitoare a MASP-2, administrată prin injecţii subcutanate obişnuite, cum ar fi injecţii zilnice, o dată la două săptămâni, săptămânale, la fiecare două săptămâni, lunar sau bilunar.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi administrată unui subiect, care suferă de HUS, în absenţa plasmeferezei (adică, un subiect al cărui simptome HUS nu au fost tratate cu plasmefereză şi care nu au fost trataţi cu plasmefereză în momentul tratamentului cu compoziţia inhibitoare a MASP-2), pentru a evita complicaţiile posibile ale plasmaferezei, incluzând hemoragia, infecţia şi expunerea la tulburări şi/sau alergii inerente donatorului de plasmă sau la un subiect căruia îi este contraindicată plasmafereza sau în cazul în care plasmafereza nu este disponibilă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi administrată la un subiect, care suferă de HUS, concomitent cu tratarea pacientului cu plasmefereză. De exemplu, la un subiect care primeşte tratament cu plasmefereză poate fi apoi administrată compoziţia inhibitoare a MASP-2 urmând sau alternând cu schimbul de plasmă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care suferă de HUS poate fi iniţial tratat cu o compoziţie inhibitoare MASP-2 din prezenta invenţie, care este administrată prin linia cateterului, cum ar fi linia cateterului intravenos sau linia cateterului subcutanat, pentru prima perioadă de timp, cum ar fi o oră, douăsprezece ore, o zi, două zile sau trei zile. Subiectul poate fi apoi tratat pentru a doua perioadă de timp cu compoziţia inhibitoare a MASP-2, care se administrează prin injecţii subcutanate obişnuite, cum ar fi injecţii zilnice, de două ori pe săptămână, săptămânale, o dată la două săptămâni, lunar sau bilunar.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 poate fi administrată la un subiect care suferă de HUS în absenţa plasmeferezei (adică un subiect al cărui simptome HUS nu au fost tratate cu plasmefereză şi care nu au fost trataţi cu plasmefereză în timpul tratamentului cu compoziţia inhibitoare a MASP-2), pentru a evita complicaţiile posibile ale plasmaferezei, incluzând hemoragia, infecţia şi expunerea la tulburări şi/sau alergii inerente donatorului de plasmă sau la un subiect căruia îi este contraindicată plasmafereza sau în cazul în care plasmafereza nu este disponibilă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi administrată la un subiect care suferă de HUS concomitent cu tratarea pacientului cu plasmefereză. De exemplu, la un subiect care primeşte tratament cu plasmefereză poate fi apoi administrată compoziţia inhibitoare a MASP-2 urmând sau alternând cu schimbul de plasmă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care suferă sau prezintă risc de a dezvolta HUS şi care este tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi monitorizat prin determinare periodică, cum ar fi la fiecare douăsprezece ore sau zilnic, a cel puţin de unui factor de complement, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor de complement, comparativ cu o valoare standard sau cu un subiect sănătos, indică necesitatea continuării tratamentului cu această compoziţie.

Atât în regimul profilactic, cât şi în cel terapeutic, compoziţiile care conţin agenţi inhibitori ai MASP-2 pot fi administrate în mai multe doze până la subiect se obţine un rezultat terapeutic suficient. Într-o realizare a invenţiei agentul inhibitor al MASP-2 cuprinde un anticorp anti-MASP-2, care poate fi administrat în mod adecvat unui pacient adult (de exemplu, cu o greutate corporală medie a adulţilor de 70 kg) într-o doză de la 0,1 mg până la 10,000 mg, mai potrivită fiind de la 1,0 mg până la 5,000 mg, mai potrivită de la 10,0 mg până la 2,000 mg, mai potrivită de la 10,0 mg până la 1,000 mg şi încă mai potrivită de la 50,0 mg până la 500 mg. Pentru pacienţii pediatrici doza poate fi ajustată proporţional cu greutatea corporală a pacientului. Pentru tratamentul HUS aplicarea compoziţiilor inhibitoare ale MASP-2, conform prezentei invenţii, poate fi realizată printr-o singură administrare a compoziţiei sau printr-un număr limitat de administrări consecvente. În mod alternativ, pentru tratamentul aHUS compoziţia poate fi administrată la intervale periodice, cum ar fi zilnic, de două ori pe săptămână, săptămânal, o dată la două săptămâni, lunar sau de două ori pe lună, pentru o perioadă îndelungată de timp.

În unele variante de realizare subiectului, care suferă de HUS, i-a fost administrat anterior sau este administrat la momentul dat un tratament cu un inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii, conform invenţiei, cuprinzând un inhibitor al MASP-2 şi administrarea suplimentară la subiect a unui inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare inhibitorul componentelor terminale ale complementului este un anticorp uman anti-C5 sau un fragment al acestuia de legare a antigenului. În unele variante de realizare inhibitorul componentelor terminale ale complementului este eculizumab.

Într-un aspect al invenţiei, compoziţiile farmaceutice sunt administrate la un subiect susceptibil sau cu risc de dezvoltare a TTP într-o cantitate suficientă pentru a elimina sau a reduce riscul de apariţie a simptomelor afecţiunii. În aplicaţiile terapeutice compoziţiile farmaceutice sunt administrate la un subiect suspectat sau deja suferind de TTP într-o cantitate terapeutic eficientă, suficientă pentru a ameliora, sau cel puţin, pentru a reduce parţial simptomele afecţiunii.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect, care prezintă unul sau mai multe dintre simptomele TTP, incluzând implicarea sistemului nervos central, trombocitopenia, implicarea cardiacă severă, afectarea pulmonară severă, infarctul gastro-intestinal şi gangrene, poate fi tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii. Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect cu un nivel redus de ADAMTS13 şi, de asemenea, testat pozitiv pentru prezenţa unui inhibitor al ADAMTS13 (adică un anticorp), poate fi tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii. Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care este testat pozitiv pentru prezenţa unui inhibitor al ADAMTS13 poate fi tratat cu un imunosupresor (de exemplu, corticosteroizi, rituxan sau ciclosporină) concomitent cu tratamentul cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie. Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect cu un nivel redus de ADAMTS13 şi care este testat pozitiv pentru prezenţa unui inhibitor al ADAMTS13 poate fi tratat cu ADAMTS13 concomitent cu tratamentul cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2, conform prezentei invenţii.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care suferă de TTP poate fi iniţial tratat cu o compoziţie inhibitoare MASP-2 din prezenta invenţie, care este administrată prin linia cateterului, cum ar fi linia cateterului intravenos sau linia cateterului subcutanat, pentru prima perioadă de timp, cum ar fi o oră, douăsprezece ore, o zi, două zile sau trei zile. Subiectul poate fi apoi tratat pentru a doua perioadă de timp cu compoziţia inhibitoare a MASP-2, care se administrează prin injecţii subcutanate obişnuite, cum ar fi injecţii zilnice, de două ori pe săptămână, săptămânale, o dată la două săptămâni, lunar sau bilunar.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 poate fi administrată la un subiect care suferă de TTP în absenţa plasmeferezei (adică un subiect al cărui simptome TTP nu au fost tratate cu plasmefereză şi care nu au fost trataţi cu plasmefereză în timpul tratamentului cu compoziţia inhibitoare a MASP-2), pentru a evita complicaţiile posibile ale plasmaferezei, incluzând hemoragia, infecţia şi expunerea la tulburări şi/sau alergii inerente donatorului de plasmă sau la un subiect căruia îi este contraindicată plasmafereza sau în cazul în care plasmafereza nu este disponibilă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi administrată la un subiect care suferă de TTP concomitent cu tratarea pacientului cu plasmefereză. De exemplu, la un subiect care primeşte tratament cu plasmefereză poate fi apoi administrată compoziţia inhibitoare a MASP-2 urmând sau alternând cu schimbul de plasmă.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care suferă de TTP refractară, adică cu simptome de TTP, care nu răspund adecvat la alt tratament; cum ar fi plasmafereza, poate fi tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie cu sau fără plasmafereză adiţională.

Într-un alt aspect al prezentei invenţii un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a TTP şi urmează a fi tratat cu o compoziţie inhibitoare a MASP-2 din prezenta invenţie poate fi monitorizat prin determinare periodică, cum ar fi la fiecare douăsprezece ore sau zilnic, a cel puţin de unui factor de complement, în care determinarea unui nivel redus cel puţin de un factor de complement, comparativ cu o valoare standard sau cu un subiect sănătos, indică necesitatea continuării tratamentului cu această compoziţie.

Atât în regimul profilactic, cât şi în cel terapeutic, compoziţiile care conţin agenţi inhibitori ai MASP-2 pot fi administrate în mai multe doze până la subiect se obţine un rezultat terapeutic suficient. Într-o realizare a invenţiei agentul inhibitor al MASP-2 cuprinde un anticorp anti-MASP-2, care poate fi administrat în mod adecvat unui pacient adult (de exemplu, cu o greutate corporală medie a adulţilor de 70 kg) într-o doză de la 0,1 mg până la 10.000 mg, mai potrivită fiind de la 1.0 mg până la 5.000 mg, mai potrivită de la 10.0 mg până la 2.000 mg, mai potrivită de la 10.0 mg până la 1.000 mg şi încă mai potrivită de la 50.0 mg până la 500 mg. Pentru pacienţii pediatrici doza poate fi ajustată proporţional cu greutatea corporală a pacientului. Pentru tratamentul TTP aplicarea compoziţiilor inhibitoare ale MASP-2, conform prezentei invenţii, poate fi realizată printr-o singură administrare a compoziţiei sau printr-un număr limitat de administrări consecvente. În mod alternativ, pentru tratamentul aHUS compoziţia poate fi administrată la intervale periodice, cum ar fi zilnic, de două ori pe săptămână, săptămânal, o dată la două săptămâni, lunar sau de două ori pe lună, pentru o perioadă îndelungată de timp.

În unele variante de realizare subiectului, care suferă de TTP, i-a fost administrat anterior sau este administrat la momentul dat un tratament cu un inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii, conform invenţiei, cuprinzând un inhibitor al MASP-2 şi administrarea suplimentară la subiect a unui inhibitor al componentelor terminale ale complementului, care inhibă scindarea proteinei C5 a complementului. În unele variante de realizare inhibitorul componentelor terminale ale complementului este un anticorp uman anti-C5 sau un fragment al acestuia de legare a antigenului. În unele variante de realizare inhibitorul componentelor terminale ale complementului este eculizumab.

VI. EXEMPLE

Exemplele care urmează ilustrează cel mai bun regim, examinat în prezent pentru aplicarea practică a invenţiei, dar ele nu trebuie examinate ca limitând volumul invenţiei. Toate citările din literatura de specialitate sunt incluse în mod expres prin referinţă.

EXEMPLUL 1

Acest exemplu descrie generarea unei tulpini de şoareci cu deficit de MASP-2 (MASP-2-/-), dar suficientă pentru MAp19 (MAp19+/+).

Materiale şi metode: Vectorul de direcţionare pKO-NTKV 1901 a fost conceput pentru a perturba cele trei exone, care codifică C-terminal al MASP-2 murină, incluzând exonul care codifică domeniul serin proteazei, aşa cum se arată în fig. 3. PKO-NTKV 1901 s-a utilizat pentru a transfecta linia de celule E14.1a (SV129 Ola) embrionare murine ES. S-au selectat clone rezistente la neomicină şi sensibile la timidin kinază. 600 de clone ES s-au scanat şi din acestea s-au identificat patru clone diferite, care s-au verificat prin southern blot pentru conţinutul evenimentului de ţintire şi recombinare selectivă dezirabil, aşa cum se arată în fig. 3. Himerele au fost generate din aceste patru clone pozitive prin transferul de embrioni. Himerele au fost apoi reîncrucişate în fondul genetic C57/BL6 cu crearea masculilor transgenici. Masculii transgenici au fost încrucişaţi cu femele pentru a genera F1s cu 50% din descendenţi manifestând heterozigozitate pentru gena MASP-2 întreruptă. Şoarecii heterozigoţi au fost interîncrucişaţi pentru a genera descendenţi cu deficienţa MASP-2 homozigotă, rezultând cu şoareci heterozigoţi şi sălbatici în raport de 1:2:1, respectiv.

Rezultate şi fenotip: S-a constat că şoarecii homozigoţi MASP-2-/- deficienţi obţinuţi s-au dovedit a fi viabili şi fertili şi MASP-2 deficienţa a fost verificată prin southern blot pentru a confirma evenimentul de ţintire corectă, prin Northern blot pentru a confirma absenţa ARNm MASP-2 şi pentru a confirmă absenţa proteinei MASP-2 (datele nu sunt prezentate). Prezenţa ARNm MAp19 şi absenţa ARNm MASP-2 au fost confirmate în continuare folosind reacţia de polimerază în lanţ cu transcriere inversă (RT-PCR) în regim de timp real folosind un dispozitiv LightCycler. Şoarecii MASP-2-/- continuau să exprime MAp19, MASP-1 şi ARNm şi proteină MASP-3, aşa cum s-a aşteptat (datele nu sunt prezentate). Prezenţa şi abundenţa ARNm la şoarecii MASP-2-/- pentru Properdină, Factorul B, Factorul D, C4, C2 şi C3 au fost evaluate prin analiza LightCycler şi s-a constatat că sunt identice cu cele de la animalele unipare de tip sălbatic de control (datele nu sunt prezentate) . Plasma de la şoarecii MASP-2-/- homozigoţi este total deficitară de activarea complementului mediată de calea lectinei, aşa cum este descris în continuare în Exemplul 2.

Generarea unei tulpini MASP-2-/- pe descendenţi genetic puri C57BL6. Şoarecii MASP-2-/- au fost încrucişaţi invers cu o linie pură C57BL6 timp de nouă generaţii înainte de utilizarea tulpinii MASP-2-/- în calitate de model experimental pe animale.

O tulpină transgenică de şoarece, care este MASP-2-/-, MAp19+/+ murină şi care exprimă o transgenă umană MASP-2 (MASP-2 murină cnocaut sau MASP-2 umană cnoc-in) a fost de asemenea generată după cum urmează:

Materiale şi metode: O minigenă, care codifică MASP-2 umană, numită "mini hMASP-2" (SECV ID NR: 49), aşa cum se arată în fig. 4, a fost construită, incluzând regiunea promotor a genei MASP-2 umane, conţinând primii 3 exoni (exonul 1 - exonul 3) urmată de secvenţa ADNc, care reprezintă secvenţa de codificare a următorilor 8 exoni, codificând astfel proteina MASP-2 cu lungime completă, condusă de promotorul său endogen. Constructul mini hMASP-2 s-a injectat în ovulele fertilizate ale şoarecilor MASP-2-/- pentru a înlocui gena MASP-2 murină deficitară prin MASP-2 umană exprimată transgenic.

EXEMPLUL 2

Acest exemplu demonstrează, că MASP-2 este necesară pentru activarea complementului prin calea lectinei.

Metode şi materiale:

Testul de scindare C4 specific pentru calea lectinei de activare a complementului. Un test de scindare C4 a fost descris de Petersen et al., J. Immunol. Metode 257: 107 (2001), în care se măsoară activarea căii lectinei, cauzată de acidul lipoteicoic (LTA) de la S. aureus, care leagă L-ficolina. Analiza, descrisă de Petersen et al., (2001), a fost adaptată pentru a măsura activarea căii lectinei cu MBL prin acoperirea plăcii cu LPS şi manan sau zimosan înainte de adiţia serului de la şoarecii MASP-2-/-, aşa cum este descris în continuare. Analiza a fost, de asemenea, modificată pentru a elimina posibilitatea scindării C4 prin calea clasică. Aceasta s-a realizat prin utilizarea unui tampon de diluţie a probei conţinând 1 M NaCI, care permite legarea cu afinitate înaltă a componentelor de recunoaştere ale căii lectinei cu liganzii lor, dar previne activarea C4 endogenă, excluzând astfel participarea căii clasice în disocierea complexului C1. Succint, în studiul modificat probele de ser (diluate în tampon cu conţinut înalt de sare (1M NaCI)) se adaugă pe plăcile acoperite cu un strat de ligand, urmată de adiţia unei cantităţi constante de C4 purificat într-un tampon cu o concentraţie fiziologică de sare. Complexe de recunoaştere legate, care conţin MASP-2, scindează C4, rezultând cu depunerea C4b.

Metode de cercetare:

1) Plăcile de microtitrare Nunc Maxisorb (Maxisorb, Nunc, Cat. No. 442404, Fisher Scientific) se acoperă cu un strat de 1 µg/ml manan (M7504 Sigma) sau cu orice alt ligand (de exemplu, cum ar fi cele enumerate în continuare) diluat în tampon de înveliş (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6).

În studiu s-au utilizat reactivele următoare:

a) manan (1 µg/godeu manan (M7504 Sigma) în 100 µl de tampon de înveliş):

b) zimosan (1 µg/godeu zimosan (Sigma) în 100 µl de tampon de înveliş);

c) LTA (1µg/godeu în 100 µl de tampon de înveliş sau 2 µg/godeu în 20 µl

metanol)

d) 1 µg de H-ficolină specifică pentru Mab 4H5 în tampon de înveliş

e) PSA din Aerococcus viridans (2 µg/godeu în 100 µl de tampon de înveliş)

f) 100 µl/godeu de S. aureus DSM20233 fixat în formalină (OD550=0.5) în

tampon de înveliş.

2) Plăcile se incubează peste noapte la 4°C.

3) După incubarea peste noapte, situsurile de legare a proteinei reziduale se saturează prin incubarea plăcilor cu 0.1% HSA-TBS tampon de blocare (0.1% (w/v) HSA in 10 mM Tris-CL, 140 mM NaCl, 1.5 mM NaN3, pH 7.4) pentru 1-3 ore, apoi plăcile se spală de 3 ori cu TBS/tween/Ca2+ (TBS cu 0.05% Tween 20 şi 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4).

4) Probele de ser, care urmează a fi testate, se diluează în MBL-tampon de legare (1 M NaCl) şi probele diluate se adaugă pe plăci şi se incubează peste noapte la 4°C. Godeurile numai cu tampon se utilizează în calitate de control negativ.

5) După incubarea peste noapte la 4°C, plăcile se spală de 3 ori cu TBS/tween/Ca2+. C4 uman (100 µl/godeu de 1 µg/ml diluat în BBS (4 mM barbital, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4)) se adaugă apoi pe plăci şi se incubează pentru 90 minute la 37°C. Plăcile se spală repetat de 3 ori cu TBS/tween/Ca2+.

6) Depunerea C4b se detectează cu anticorp de pui anti-C4c uman conjugat cu fosfatază alcalină (diluat 1:1000 în TBS/tween/Ca2+), care se adaugă pe plăci şi se incubează pentru 90 minute la temperatura camerei. Plăcile apoi se spală repetat de 3 ori cu TBS/tween/Ca2+.

7) Fosfataza alcalină se detectează prin adiţia 100 µl de soluţie de substrat de p-nitrofenil fosfat, se incubează la temperatura camerei pentru 20 minute şi se citeşte OD405 într-un cititor de plăci de microtitrare.

Rezultate: Fig. 5A-B prezintă cantitatea de C4b depus pe manan (fig.5A) şi pe zimosan (fig.5B) în diluţii ale serului de la şoareci MASP-2+/+ (cruciliţi), MASP-2+/- (cercuri umbrite) şi MASP-2-/- (triunghiuri umbrite). Fig. 5C arată activitatea relativă a C4 convertazei pe plăcile acoperite cu un strat de zimosan (bare albe) sau manan (bare haşurate) de la şoareci MASP-2-/+ (n = 5) şi şoareci MASP-2-/- (n = 4) în raport cu şoarecii de tip sălbatic (n=5), obţinută prin măsurarea cantităţii de C4b depus normalizată la serul şoarecilor de tip sălbatic. Barele de eroare reprezintă deviaţia standard. Aşa cum se arată în fig.5A C, plasma de la şoarecii MASP-2-/- este complet deficientă în activarea complementului, mediată de calea lectinei, pe plăcile acoperite cu un strat de manan şi zimosan. Aceste rezultate demonstrează clar, că MASP-2 este o componentă efectoare a căii lectinei.

MASP-2 recombinant reconstituie activarea C4 dependentă de calea lectinei în serul de la şoareci MASP-2-/-

Pentru a stabili, că absenţa MASP-2 este cauza directă a pierderii activării C4 dependentă de calea lectinei la şoarecii MASP-2-/-, efectul adiţiei proteinei MASP-2 recombinante în probele de ser a fost examinat în testul de scindare C4, descris mai sus. Se obţin proteinele recombinante ale MASP-2 murine funcţional active şi MASP-2A murine catalitic inactive (în care reziduul de serină din domeniul serin proteazei a fost substituit cu reziduul de alanină) şi se purifică, aşa cum se descrie în continuare în Exemplul 3. Serul combinat de la 4 şoareci MASP-2-/- a fost preincubat cu concentraţii crescânde proteină MASP-2 murină recombinantă sau MASP-2A murină recombinantă inactivă şi activitatea convertazei C4 a fost analizată aşa cum s-a descris mai sus.

Rezultate: După cum se arată în fig. 6, adiţia proteinei MASP-2 recombinante murine funcţional active (prezentată cu triunghiuri deschise) la serul obţinut de la şoarecii MASP-2-/- restabileşte activarea C4 dependentă de calea lectinei, în timp ce proteina MASP-2A murină catalitic inactivă (prezentată cu steluţe) nu a restabilit activarea C4. Rezultatele prezentate în fig. 6 sunt normalizate la activarea C4 observată în serul şoarecilor de tip sălbatic (prezentat cu o linie punctată).

EXEMPLUL 3

Acest exemplu descrie expresia recombinantă şi producţia de proteină a MASP-2 umană, de şobolan şi murină recombinantă cu lungime completă, a polipeptidelor derivate din MASP-2 şi a formelor mutante catalitic inactivate ale MASP-2

Expresia MASP-2 umană, murină şi de şobolan cu lungime completă:

Secvenţa ADNc cu lungime completă a MASP-2 umană (SECV ID NR: 4) a fost, de asemenea, subclonată în vectorul de expresie mamifer pCI Neo (Promega), care conduce exprimarea eucariotă sub controlul regiunii CMV amplificatoare/promotoare (Kaufman R.J. et al., Nucleic Acids Research 19: 448-590, 1991; Kaufman, Metode in Enzymology, 185: 537-66 (1991)). ADNc de şoarece cu lungime completă (SECV ID NR: 50) şi ADNc MASP-2 de şobolan (SECV ID NR: 53) au fost fiecare subclonate în vectorul de expresie pED. Vectorii de expresie MASP-2 au fost apoi transfectaţi în linia de celule adezive DXB1 ovariene de hamster chinezesc, folosind procedura de transfecţie standard cu fosfat de calciu, descrisă de Maniatis et al., 1989. Celulele transfectate cu aceste constructe cresc foarte încet, ceea ce înseamnă că proteaza codificată este citotoxică.

Într-o altă abordare, constructul de minigenă (SECV ID NR: 49), care conţine ADNc uman al MASP-2, condus cu promotorul său endogen este transfectat tranzitoriu în celule ovariene de hamster chinezesc (CHO). Proteina MASP-2 umană este secretată în mediul de cultură şi izolată aşa cum se descrie în continuare.

Expresia MASP-2 catalitic inactivă cu lungime completă:

Actualitate: MASP-2 este activată prin scindare autocatalitică după ce subcomponentele de recunoaştere MBL sau ficoline (fie L- ficolina, H-ficolina sau M-ficolina) se leagă cu modelul lor carbohidrat respectiv. Scindarea autocatalitică, care are drept rezultat activarea MASP-2, deseori apare în timpul procedurii de izolare a MASP-2 din ser sau în timpul purificării după expresia recombinantă. Pentru a obţine un preparat proteic mai stabil pentru utilizare ca antigen, a fost creată o formă catalitic inactivă de MASP-2, proiectată ca MASP-2A, creată prin înlocuirea reziduului de serină, care este prezent în triada catalitică a domeniului proteazei, cu un reziduu de alanină la şobolan (SECV ID NR: 55 Ser617 pe Ala617); la şoarece (SECV ID NR: 52 Ser617 pe Ala617); sau la om (SECV ID NR: 3 Ser618 pe Ala618).

Pentru a genera proteine MASP-2A umane şi murine catalitic inactive, s-a efectuat mutageneza direcţionată pe situs folosind oligonucleotidele prezentate în Tabelul 5.

Oligonucleotidele din tabelul 5 au fost proiectate pentru unirea cu regiunea ADNc umană şi murină, care codifică serina enzimatic activă şi oligonucleotida conţine o nepotrivire pentru a transforma codonul serinei în codonul alaninei. De exemplu, s-a utilizat PCR a oligonucleotidelor SEQ ID NOS: 56-59 în combinaţie cu ADNc MASP-2 uman (SECV ID NR: 4) pentru a amplifica regiunea de la codonul de start până la serina enzimatic activă şi de la serină până la codonul de terminare pentru a genera citirea completă deschisă din MASP-2A mutantă, care conţine mutaţia Ser618 în Ala618. După electroforeză pe gel de agaroză, produsele PCR s-au purificat şi s-a generat preparatul discului cromozomilor şi suprapuneri adenozine unice, folosind o procedură standard de creştere. Apoi MASP-2A cu adenozină la capăt a fost clonată în vectorul simplu pGEM-T, transformat în E. coli.

O proteină MASP-2A de şobolan catalitic inactivă a fost generată prin kinazarea şi renaturarea SECV ID NR: 64 şi SECV ID NR: 65 prin combinarea acestor două oligonucleotide în cantităţi molare egale, încălzind la 100°C timp de 2 minute şi răcind lent până la temperatura camerei. Fragmentul, rezultat din renaturare, conţinea capete compatibile cu Pst1 şi Xba1 şi era inserat în locul fragmentului Pst1-Xba1 al ADNc MASP-2 de şobolan de tip sălbatic (SECV ID NR: 53) pentru a genera MASP-2A de şobolan.

5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (SEQ ID NO:64)

5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (SEQ ID NO:65)

MASP-2A umană, murină şi de şobolan au fost subclonate în continuare în oricare dintre vectorii de expresie de mamifere pED sau pCI Neo şi transfectaţi în linia de celule DXB1ovariene de hamster chinezesc, aşa cum este descris în continuare.

Într-o altă abordare, o formă catalitic inactivă a MASP-2 este construită utilizând metoda descrisă de Chen et al., J. Biol. Chem., 276 (28): 25894-25902, 2001. Succint, plasmida care conţine ADNc MASP-2 uman de lungime completă (descrisă de Thiel et al., Nature 386: 506, 1997) este tăiată cu Xho1 şi EcoR1 şi ADNc MASP2 (descris aici ca SECV ID NR: 4) este clonat în situsurile de restricţie corespunzătoare ale vectorului de transfer al pFastBac1 de baculovirus (Life Technologies, NY). Situsul activ de serin protează MASP-2 în Ser618 este apoi înlocuit cu Ala618 prin substituirea oligonucleotidelor dublu catenare, care codifică regiunea peptidă de la aminoacidul 610 până la 625 (SECV ID NR: 13) cu aminoacizii 610 până la 625 ai regiunii native pentru a crea polipeptida MASP-2 cu lungime completă cu un domeniu al proteazei inactiv.

Construcţia plasmidelor de expresie, care conţin regiunile de polipeptidă derivate din MASP-2 umană.

Următoarele constructe sunt produse utilizând peptida de semnalizare MASP-2 (reziduurile 1-5 din SECV ID NR: 5) pentru a secreta diferite domenii ale MASP-2. Un construct, care exprimă domeniul CUBI al MASP-2 umane (SECV ID NR: 8) se obţine prin metoda de amplificare prin PCR a regiunii, care codifică reziduurile 1-121 ale MASP-2 (SECV ID NR: 6) (corespunzător domeniului CUB1 N-terminal). Un construct, care exprimă domeniul CUBIEGF al MASP-2 umane (SECV ID NR: 9) se obţine prin metoda de amplificare prin PCR a regiunii, care codifică reziduurile 1-166 ale MASP-2 (SECV ID NR: 6) (corespunzător domeniului CUB1EGF N-terminal). Un construct, care exprimă domeniul CUBIEGFCUBII al MASP-2 umane (SECV ID NR: 10) se obţine prin metoda de amplificare prin PCR a regiunii, care codifică reziduurile 1-293 ale MASP-2 (SECV ID NR: 6) (corespunzător domeniului CUBIEGFCUBII N-terminal). Domeniile, menţionate mai sus, sunt amplificate prin PCR utilizând VentR polimerazei şi pBS MASP-2 ca şablon, conform metodelor PCR stabilite. Secvenţa primerului 5' a primerului sens (5' CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' SECV ID NR: 34) introduce un situs de restricţie BamHI (subliniat) la capătul 5' al produselor PCR. Primerii antisens pentru fiecare dintre domeniile MASP-2, prezentate în continuare în Tabelul 5, sunt concepute pentru a introduce un codon terminal (caractere aldine) urmat de un situs EcoRI (subliniat) la sfârşitul fiecărui produs PCR. După amplificare fragmentele de ADN sunt digerate cu restrictazele BamHI şi EcoRI şi se clonează în situsurile corespunzătoare ale vectorului pFastBac1. Constructele obţinute sunt caracterizate prin cartografierea restricţiilor şi confirmate prin secvenţierea dsADN.

Tabelul 5: PRIMERII MASP-2 PENTRU PCR

Domeniul MASP-2 Primerul 5' PCR Primerul 3' PCR SEQ ID NO:8 CUBI (aa 1-121 din SEQ ID NO:6) 5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34) 5'GGAATTCCTAGGCTGCATA (SEQ ID NO:35) SEQ ID NO:9 CUBIEGF (aa 1-166 din SEQ ID NO:6) 5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34) 5'GGAATTCCTACAGGGCGCT-3' (SEQ ID NO:36) SEQ ID NO:10 CUBIEGFCUBII (aa 1-293 din SEQ ID NO:6) 5'CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' (SEQ ID NO:34) 5'GGAATTCCTAGTAGTGGAT 3' (SEQ ID NO:37) SEQ ID NO:4 MASP-2 umană 5'ATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTC 3' (SEQ ID NO: 56) hMASP-2_direct 5'TTAAAATCACTAATTATGTTCTCGATC 3' (SEQ ID NO: 59) hMASP-2_invers SEQ ID NO:4 ADNc MASP-2 uman 5'CAGAGGTGACGCAGGAGGGGCAC 3' (SEQ ID NO: 58) hMASP-2_ala_direct 5'GTGCCCCTCCTGCGTCACCTCTG 3' (SEQ ID NO: 57) hMASP-2_ala_invers SEQ ID NO:50 ADNc MASP-2 murin 5'ATGAGGCTACTCATCTTCCTGG3' (SEQ ID NO: 60) mMASP-2_direct 5'TTAGAAATTACTTATTATGTTCTCAATCC3' (SEQ ID NO: 63) mMASP-2_invers SEQ ID NO:50 ADNc MASP-2 murin 5'CCCCCCCTGCGTCACCTCTGCAG3' (SEQ ID NO: 62) mMASP-2_ala_direct 5'CTGCAGAGGTGACGCAGGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 61) mMASP-2_ala_invers

Expresia eucariotă a MASP-2 recombinantă şi obţinerea proteinelor MASP-2A de şoarece, de şobolan şi umană enzimatic inactivă.

Constructele de expresie a MASP-2 şi MASP-2A, descrise mai sus, au fost transfectate în celulele DXB1, utilizând procedura de transfecţie standard cu fosfat de calciu (Maniatis et al., 1989). MASP-2A s-a obţinut într-un mediu fără ser pentru a exclude contaminarea preparatelor cu alte proteine serice. Mediile de cultură au fost recoltate din celulele confluente fiecare a doua zi (de patru ori în total). Nivelul de MASP-2A recombinantă constituia 1,5 mg/litru de mediu de cultură pentru fiecare dintre cele trei specii.

Purificarea proteinei MASP-2A: MASP-2A (forma mutantă Ser-Ala descrisă mai sus) a fost purificată prin cromatografie de afinitate pe coloane cu MBP-A-agaroză. Această strategie a permis o purificare rapidă fără utilizarea unor marcher străini. MASP-2A (100-200 ml de mediu de cultură diluat cu un volum egal de tampon de încărcare (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, conţinând 150 mM NaCI şi CaCI2 25 mM) s-a încărcat pe o coloană pentru cromatografie de afinitate pe MBP-agaroză (4 ml) preechilibrată cu 10 ml de tampon de încărcare. După spălare cu încă 10 ml tampon de încărcare, proteina a fost eluată în 1 ml fracţii cu 50 mM Tris Cl, pH 7,5, conţinând 1,25 M NaCI şi 10 mM EDTA. Fracţiile, conţinând MASP-2A, au fost identificate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezenţa dodecilsulfatului de sodiu. Dacă este necesar, MASP-2A a fost purificată în continuare prin cromatografie cu schimb de ioni pe o coloană MonoQ (HR 5/5). Proteina a fost dializată cu 50 mM Tris Cl pH 7,5, conţinând 50 mM NaCI şi încărcată pe coloana echilibrată cu acelaşi tampon. După spălare MASP-2A legată a fost eluată cu o soluţie cu un gradient de 0,05-1 M NaCI în 10 ml.

Rezultate: Randamentul proteinei MASP-2A a constituit 0.25-0.5 mg în 200 ml de mediu de cultură. Masa moleculară, determinată spectrometria de masă cu desorbţia cu laser cu matriţă activate/ionizare (MALDI MS) constituia 77,5 kDa, fiind mai mare, decât valoarea calculată a polipeptidei nemodificate (73,5 kDa), datorită glicozilării. Creşterea masei observate se explică prin ataşarea glicanilor la fiecare dintre situsurile de N-glicozilare. MASP-2A migrează sub formă de bandă unică pe geluri de poliacrilamidă în prezenţa dodecilsulfatului de sodiu, ceea ce atestă că în timpul biosintezei nu este procesată proteolitic. Masa moleculară medie, determinată prin ultracentrifugare de echilibru, este în concordanţă cu valoarea calculată pentru homodimerii polipeptidei glicozilate.

PRODUCEREA POLIPEPETILOR MASP-2 UMANE RECOMBINANTE

O altă metodă de producere a polipeptidelor derivate din MASP-2 şi MASP-2A recombinante este descrisă în Thielens, N. M. et al., J. Immunol. 166. 5068-5077, 2001. Succint, celulele de insecte Spodoptera Frugiperda (celulele Ready Plaque Sf9 obţinute de la Novagen, Madison, WI) sunt cultivate şi menţinute în mediu de cultură fără ser SF900II (Life Technologies) suplimentat cu 50 UI/ml de penicilină şi 50 mg/ml de streptomicină (Life Technologies). Celulele de insectă Trichoplusia ni (High Five) (furnizate de Jadwiga Chroboczek, Institutul de Biologie Structurală, Grenoble, Franţa) sunt menţinute în mediul de cultură TC100 (Life Technologies) conţinând 10% FCS (Dominique Dutscher, Brumath, Franţa) suplimentat cu 50 UI/ml de penicilină şi 50 mg/ml de streptomicină. Baculovirusurile recombinante sunt generate folosind sistemul Bac-to-Bac (Life Technologies). ADN de bacmid este purificat, utilizând sistemul de purificare Qiagen midiprep (Qiagen) şi este utilizat pentru transfecţia celulelor de insectă SF9, utilizând celfectină în mediul de cultură SF900 II SFM (Life Technologies), aşa cum este descris în protocolul producătorului. Particulele de virus recombinant sunt colectate peste 4 zile, apoi titrate cu un test virusologic de formare a plăcilor şi se amplifică, aşa cum este descris de King and Possee, in The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp. 111-114, 1992.

Celulele High Five (1,75 x 107 celule într-un balon cu volumul de 175 cm2 pentru cultivarea culturilor tisulare) sunt infectate cu virusurile recombinante care conţin polipeptide MASP-2 la o multiplicitate de infectare 2 în mediu SF900 II SFM la 28°C timp de 96 de ore. Supernatantele s-au colectat prin centrifugare şi s-a adăugat diizopropil fosforfluoridat până la o concentraţie finală de 1 mM.

Polipeptidele MASP-2 sunt secretate în mediul de cultură. Supernatantele de cultură sunt dializate împotriva 50 mM NaCI, 1 mM CaCI2, 50 mM clorhidrat de trietanolamină, pH 8,1 şi încărcate cu un consum de 1,5 ml/min pe o coloană Q-Sepharose cu flux rapid (Amersham Pharmacia Biotech) (2,8 x 12 cm), echilibrată cu acelaşi tampon. Eluarea se efectuează cu 1,2 litri de acelaşi tampon cu un gradient liniar până la 350 mM NaCI. Fracţiile, conţinând polipeptidele MASP-2 recombinante, sunt identificate prin analiză Western blot, precipitate prin adăugarea (NH4)2S04 până la 60% (g/v) şi lăsate peste noapte la 4°C. Peletele sunt resuspendate în 145 mM NaCI, 1 mM CaCI2, 50 mM clorhidrat de trietanolamină, pH 7,4 şi se aplică pe o coloană TSK G3000 SWG (7,5 x 600 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, PA), echilibrată cu acelaşi tampon. Polipeptidele purificate sunt apoi concentrate până la 0,3 mg/ml prin ultrafiltrare pe microconcentratori Microsep (masa moleculară exclusă = 10,000) (Filtron, Karlstein, Germania).

EXEMPLUL 4

În acest exemplu se descrie o metodă de producere a anticorpilor policlonali împotriva polipeptidelor MASP-2.

Materiale and metode:

Antigene MASP-2: Antiserul anti-MASP-2 umană policlonal se produce prin imunizarea iepurilor cu următoarele polipeptide izolate MASP-2: MASP-2 umană (SECV ID NR: 6) izolată din ser; MASP-2 umană recombinantă (SECV ID NR: 6), MASP-2A conţinând domeniul proteazei inactive (SECV ID NR: 13), aşa cum se descrie în Exemplul 3; şi CUBI (SECV ID NR: 8), CUBEGFI (SECV ID NR: 9) şi CUBEGFCUBII recombinante (SECV ID NR: 10), exprimate cum se descrie mai sus în Exemplul 3.

Anticorpi policlonali: Şobolani în vârstă de şase săptămâni, vaccinaţi cu BCG (vaccinul cu bacil Calmette Guerin) se imunizează prin injectarea a 100 µg de polipeptidă MASP-2 în 100 µg/ml în soluţie fiziologică sterilă. Injecţiile se efectuează la fiecare 4 săptămâni, titrul de anticorpi fiind monitorizat prin testul ELISA, cum se descrie în Exemplul 5. Supernatantele culturii se colectează pentru purificarea anticorpului prin cromatografie de afinitate cu proteina A.

EXEMPLUL 5

În acest exemplu se descrie o metodă de producere a anticorpilor monoclonali murini împotriva polipeptidelor MASP-2 de şobolan sau umane.

Materiale şi metode:

La şoarecii masculi A/J (Harlan, Houston, Texas), cu vârstă de 8 săptămâni, se injectează subcutanat 100 µg de polipeptide rMASP-2 sau rMASP-2A umane sau de şobolan (realizate cum se descrie în Exemplul 3) în adjuvant Freund complet (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) în 200 µl de soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS), pH 7,4. La intervale de două săptămâni la şoareci se injectează de două ori subcutanat 50 µg de polipeptidă rMASP-2 sau rMASP-2A umană sau de şobolan în adjuvant Freund incomplet. În a patra săptămână la şoareci se injectează 50 µg de polipeptidă rMASP-2 sau rMASP-2A umană sau de şobolan în PBS şi peste 4 zile şoarecii se asociază.

Pentru fiecare fuziune se prepară suspensii de celule singulare din splina unui şoarece imunizat şi se utilizează pentru fuziunea cu celule de mielom Sp2/0. 5x108 de Sp2/0 şi 5x108 celulele splenice se fuzionează într-un mediu cu conţinut de 50% polietilenglicol (M.W. 1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) şi 5% dimetilsulfoxid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Celulele se ajustează apoi până la o concentraţie de 1,5x105 celule splenice în 200 µl suspensie în mediu Iscove (Gibco, Grand Island, NY), suplimentat cu 10% ser fetal bovin, 100 unităţi/ml de penicilină, 100 µg/ml de streptomicină, 0,1 mM hipoxantină, 0,4 µM aminopterină şi 16 µM timidină. Două sute de microlitri de suspensie de celule se adăugă în fiecare godeu din aproximativ douăzeci de godeuri din plăcile de microcultură cu 96 de godeuri. După aproximativ zece zile, supernatantele de cultură se extrag pentru screening pentru interacţiune cu factorul purificat MASP-2 într-un test ELISA.

Testul ELISA: În godeurile din plăcile ultrasubţiri Immunol 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) se acoperă prin adiţia a 50 µl de hMASP-2 purificată cu o concentraţie de 50 µg/ml sau rMASP-2 de şobolan (sau rMASP-2A) peste noapte la temperatura camerei. Concentraţia joasă de MASP-2 pentru acoperire permite selectarea anticorpilor cu afinitate înaltă. După aplicarea învelişului, soluţia se îndepărtează prin mişcarea plăcii, în fiecare godeu timp de o oră se adaugă 200 µl de BLOTTO (lapte uscat degresat) în PBS pentru a bloca situsurile nespecifice. Peste o oră godeurile se spală cu tampon PBST (PBS conţinând 0,05% Tween 20). Cincizeci de microlitri de supernatant de cultură din fiecare godeu de fuziune se colectează şi se amestecă cu 50 µl de BLOTTO şi apoi se adaugă în godeurile individuale ale plăcilor de microtestare. După o oră de incubare, godeurile se spală cu PBST. Anticorpii murini legaţi se detectează apoi prin reacţia cu peroxidaza de hrean (HRP) conjugată cu IgG anti-şoarece de capră (Fc specific) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.) şi se diluează până la 1:2000 în BLOTTO. Soluţia de substrat de peroxidază conţinând 0,1% 3,3,5,5 tetrametil benzidină (Sigma, St. Louis, Mo.) şi 0,0003% peroxid de hidrogen (Sigma) se adaugă în godeuri pentru apariţia culorii timp de 30 de minute. Reacţia se stopează prin adiţia a 50 µl de 2M H2S04 per godeu. Densitatea optică la 450 nm a amestecului de reacţie se citeşte cu un cititor BioTek ELISA (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Testul de legare a MASP-2:

Supranatantele de cultură, testate pozitiv în testul ELISA MASP-2 descris mai sus, pot fi analizate într-un test de legare pentru a determina afinitatea de legare a agenţilor inhibitori ai MASP-2, pe care aceştia o posedă pentru MASP-2. Un test similar se poate, de asemenea, utiliza pentru a determina dacă agenţii inhibitori se pot lega cu alte antigene în sistemul complementului.

Godeurile de pe plăcile de microtitrare din polistiren (plăci de legare medie cu 96 de godeuri, Corning Costar, Cambridge, MA) se acoperă cu MASP-2 (20 ng/100 µl/godeu, Advanced Research Technology, San Diego, CA) în soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) peste noapte la 4ºC. După aspirarea soluţiei de MASP-2, godeurile se blochează cu PBS conţinând 1% albumină serică de bovină (BSA, Sigma Chemical) timp de 2 ore la temperatura camerei. Godeurile neacoperite cu MASP-2 servesc drept control. În godeuri la soluţia de blocare se adaugă alicote de supernatant de hibridom sau MoAb anti-MASP-2 purificaţi de diferite concentraţii. După o incubare timp de 2 ore la temperatura camerei, godeurile se spală intens cu PBS. MASP-2 legat cu MoAb anti-MASP-2 se detectează prin adiţia IgG de capră anti-şoarece conjugate cu peroxidază (Sigma Chemical) în soluţie de blocare şi se incubează timp de 1 oră la temperatura camerei. Placa se spală din nou minuţios cu PBS şi se adaugă 100 µl de substrat de 3,3',5,5'-tetrametil benzidină (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Reacţia TMB se stinge prin adiţia a 100 µl de 1M acid fosforic şi placa se citeşte la o lungime de undă de 450 nm într-un cititor de microplăci (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Supernatantele de cultură din godeurile pozitive se testează apoi pentru abilitatea de a inhiba activarea complementului într-un test funcţional, cum ar fi testul de scindare C4, descris în Exemplul 2. Celulele din godeurile pozitive se clonează apoi prin diluare limitativă. MoAb se testează din nou pentru interacţiune cu hMASP-2 într-un test ELISA, aşa cum se descrie mai sus. Hibridoamele selectate se cultivă în baloane rotative şi supernatantul de cultură uzat se colectează pentru purificarea anticorpului prin cromatografie de afinitate cu proteină A.

EXEMPLUL 6

Acest exemplu descrie generarea şi producţia anticorpilor anti-MASP-2 murini umanizaţi şi fragmentelor de anticorpi.

Anticorpul monoclonal anti-MASP-2 murină se generează la şoareci masculi A/J, aşa cum se descrie în exemplul 5. Anticorpul murin apoi se umanizează, aşa cum este descris mai jos, pentru a reduce imunogenitatea sa prin înlocuirea regiunilor constante murine cu omologii lor umani pentru a genera IgG himerică şi fragmentul Fab al anticorpului, care sunt utili pentru inhibarea efectelor adverse ale activării complementului dependente de MASP-2 la subiecţii umani, în conformitate cu prezenta invenţie.

1. Clonarea genelor regiunii variabile anti-MASP-2 din celulele de hibridom murin. ARN total se izolează din celulele hibridomului, care secretă MoAb anti-MASP2 (obţinut cum se descrie în Exemplul 7), folosind RNAzol urmând protocolul producătorului (Biotech, Houston, Texas). Prima catenă a ADNc se sintetizează din ARN total utilizând în calitate de primer oligodezoxiribonucleotid (oligo-dT). PCR se realizează utilizând primerii 3', derivaţi din regiunea C constantă a imunoglobulinei şi seturile de primeri degeneraţi, derivaţi din peptida lider sau prima regiune cadru a genelor VH sau VK murine în calitate de primeri 5'. PCR de ancoră se efectuează aşa cum descrie Chen şi Platsucas (Chen, P.F., Scand., J. Immunol., 35: 539-549, 1992). Pentru clonarea genei VK, ADNc dublu catenar se prepară folosind un primer Notl-MAK1 (5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' SECV ID NR: 38). Adaptorii renaturaţi AD1 (5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' SECV ID NR: 39) şi AD2 (5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' SECV ID NR: 40) sunt ligaţi la ambele 5 'şi 3' terminale ale ADNc dublu catenar. Adaptorii la capetele 3' se îndepărtează prin digestia Notl. Produsul digerat se utilizează apoi ca şablon în PCR cu oligonucleotida AD1 ca primer 5' şi MAK2 (5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' SECV ID NR: 41) ca primer 3'. Fragmentele de ADN cu aproximativ 500 bp se clonează în vectorul pUC19. Se selectează mai multe clone pentru analiza secvenţei pentru a verifica dacă secvenţa clonată cuprinde regiunea constantă a imunoglobulinei murine. Oligonucleotidele Not1-MAK1 şi MAK2 derivă din regiunea VK şi ele se află pe a 182 şi 84 bp, respectiv, în aval de prima pereche de baze a genei kappa C. Se selectează clonele care includ VK completă şi peptida lider.

Pentru clonarea genei VH, ADNc dublu catenar se prepară utilizând primerul Not1 MAG1 (5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' SECV ID NR: 42). Adaptorii renaturaţi AD1 şi AD2 sunt ligate la ambele capete 5' şi 3' ale ADNc dublu catenar. Adaptorii la capetele 3' se îndepărtează prin digestia Notl. Produsul digerat se utilizează ca şablon în PCR cu oligonucleotidă AD1 şi MAG2 (5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' SECV ID NR: 43) ca primeri. Fragmentele de ADN de la 500 până la 600 bp în lungime se clonează în pUC19. Oligonucleotidele Notl-MAG1 şi MAG2 derivă din regiunea CΓ.7.1 murină şi se află pe 180 şi 93 bp, respectiv, în aval de prima pereche de baze a genei CΓ.7.1 murine. Se selectează clonele, care conţin VH completă şi peptida lider.

2. Proiectarea vectorilor de expresie pentru IgG şi Fab a MASP-2 himerice. Genele VH şi VK clonate, descrise mai sus, se utilizează ca şabloane în reacţia PCR pentru adiţia secvenţei consens Kozak la capătul 5'şi donatorul de fragment de legătură la capătul 3' al secvenţei nucleotide. După analiza secvenţelor pentru confirmarea absenţei erorilor PCR, genele VH şi VK se inseră în casetele vectorului de expresie conţinând CΓ1 şi C. kappa uman, respectiv, pentru a obţine pSV2neoVH-huCΓ1 şi pSV2neoV-huCΓ. Plasmidele ADN vectorilor lanţului greu şi lanţului uşor, purificate în gradient de CsC1, se utilizează pentru a transfecta celulele COS prin electroporare. Peste 48 de ore supernatantul de cultură se testează prin ELISA pentru a confirma prezenţa a aproximativ 200 ng/ml de IgG himeric. Celulele se recoltează şi se prepară ARN total. Primul filament de ADNc se sintetizează din ARN total, utilizând oligo dT în calitate de primer. Acest ADNc se utilizează ca şablon în PCR pentru a genera fragmente de Fd şi kappa ale ADN. Pentru gena Fd, realizează PCR folosind 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3' (SECV ID NR: 44) în calitate de primer 5' şi primer 3', derivat din CH1 (5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' SECV ID NR: 45). Se confirmă că secvenţa ADN conţine domeniul VH complet şi domeniul CH1 al IgG1 umane. După digestia cu enzimele adecvate, fragmentele Fd ADN se inseră în situsurile de restricţie Hindlll şi BamHI ale casetei vectorului de expresie pSV2dhfr-TUS pentru a obţine pSV2dhfrFd. Plasmida pSV2 este comercial disponibilă şi constă din segmente ADN din diverse surse: pBR322ADN (linie subţire) conţine plasmida pBR322 a iniţierii replicării ADN (pBR ori) şi gena rezistenţei ampicilinei la lactamază (Amp); SV40 ADN, reprezentată prin haşurare mai largă şi marcată, conţine plasmida SV40 iniţierii replicării ADN (SV40 ori), promotorul precoce (de la 5' la dhfr şi neogene) şi semnalul de poliadenilare (de la 3' la dhfr şi neogene). Semnalul de poliadenilare derivat din SV40 (pA) se plasează, de asemenea, la capătul 3' al genei Fd.

Pentru gena kappa, PCR se conduce folosind 5'-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3' (SECV ID NR: 46) ca primer 5' şi primer 3' (5-'CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' SECV ID NR: 47), derivat din CK. Se confirmă, că secvenţa ADN conţine regiunile complete VK şi CK umane. După digestia cu enzime de restricţie adecvate, fragmentele kappa de ADN se inseră în situsurile de restricţie Hindlll şi BamHI ale casetei vectorului de expresie pSV2neo-TUS pentru a obţine pSV2neoK. Expresia genelor Fd şi kappa se conduce de amplificatorul, derivat din HCMV, şi de elementele promotorului. Deoarece gena Fd nu include reziduul aminoacidului cisteină, implicat în formarea legăturii disulfurice între lanţuri, acest Fab himeric recombinant conţine lanţuri grele şi lanţuri uşoare legate necovalent. Acest Fab himeric este desemnat ca cFab.

Pentru a obţine Fab recombinant cu o legătură disulfidică între lanţul greu şi lanţul uşor, gena Fd de mai sus poate fi extinsă pentru a include secvenţa de codificare pentru 9 aminoacizi adiţionali (EPKSCDKTH SECV ID NR: 48) din regiunea articulată a IgG1 umane. Segmentul ADN BstEII-BamHI, care codifică 30 de aminoacizi la capătul 3' al genei Fd poate fi înlocuit cu segmente AND, care codifică Fd extins, rezultând pSV2dhfrFd/9aa.

3. Expresia şi purificarea IgG anti-MASP-2 himerice

Pentru a genera linii celulare, care secretă IgG anti MASP-2 himerice, celulele NSO se transfectă cu ADN pSV2neoVH-huC.Γ1 şi pSV2neoV-huC kappa plasmidic purificat prin electroporare. Celulele transfectate se selectează în prezenţa a 0,7 mg/ml G418. Celulele se cultivă într-un balon de 250 ml pe un mediu de cultură, care conţine ser.

Supernatantul de cultură din eprubeta centrifugată cu un volum de 100 ml de cultură se încarcă pe o coloană PROSEP-A (Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.) cu volum de 10 ml. Coloana se spală cu un volum de PBS, egal cu 10 volume de strat de coloană. Anticorpul legat se eludează cu 50 mM tampon citrat, pH 3,0. La fracţia care conţine anticorpul purificat se adaugă un volum egal de 1 M Hepes, pH 8,0 pentru a ajusta pH până la 7,0. Sărurile reziduale se elimină prin schimb de tampon cu PBS prin ultrafiltrare printr-o membrană Millipore (masa moleculară separată: 3.000). Concentraţia de proteină a anticorpului purificat se determină prin metoda BCA (Pierce).

4. Expresia şi purificarea Fab anti-MASP-2 himerice

Pentru a genera linii celulare, care secretă Fab anti-MASP-2 himeric, celulele CHO se transfectă cu ADN pSV2dhfrFd (sau pSV2dhfrFd/9aa) şi pSV2neokappa plasmidic purificat prin electroporare. Celulele transfectate se selectează în prezenţa G418 şi metotrexatului. Liniile celulare selectate se amplifică în concentraţii crescânde metotrexat. Celulele reprezintă o singură celulă, subclonată prin diluare limitată. Liniile celulare cu productivitate înaltă, subclonate din celule solitare, se cultivă apoi într-o eprubetă, care se roteşte, cu volum de 100 ml în mediu de cultură fără ser.

Fab anti-MASP-2 himeric se purifică prin cromatografie de afinitate utilizând MoAb anti-idiotip de şoarece pentru MoAb MASP-2. MoAb MASP-2 anti-idiotip se poate obţine prin imunizarea şoarecilor cu MoAb anti-MASP-2 murin conjugat cu hemocianină de limfă de melc (KLH) şi apoi screeningul pentru legarea specifică cu MoAb, care poate concura cu MASP-2 umană. Pentru purificare, 100 ml de supernatant din culturi de celule CHO, care produc cFab sau cFab/9aa, se încarcă pe coloana de afinitate cuplată cu MoAb MASP-2 anti-idiotip. Coloana se spală apoi minuţios cu PBS înainte de eluarea Fab legat cu 50 mM dietilamină, pH 11,5. Sărurile reziduale se elimină prin înlocuirea tamponului, aşa cum se descrie mai sus. Concentraţia de proteină a Fab purificat se determină prin metoda BCA (Pierce).

Abilitatea IgG MASP-2 himerice, cFab şi cFAb/9aa de a inhiba căile de activare a complimentului dependente de MASP-2 se poate determina utilizând testul de inhibare descris în Exemplul 2 sau în Exemplul 7.

EXEMPLUL 7

Acest exemplu descrie un test in vitro de scindare C4, utilizat în calitate de screening funcţional pentru identificarea agenţilor inhibitori ai MASP-2, abili să blocheze activarea complementului dependentă de MASP-2 prin L-ficolină/P35, H-ficolină, M-ficolină sau manan.

Testul de scindare C4: Un test de scindare C4 este descris de Petersen, S. V. et al., J. Immunol. Metode 257: 107, 2001, în care se măsoară activarea căii lectinei, cauzată de acidul lipoteicoic (LTA) din S. aureus care leagă L-ficolina.

Reagenţi: S. aureus fixat în formalină (DSM20233) se prepară după cum urmează: bacteria se cultivă peste noapte la 37°C în mediu de cultură pe bază de agar de sânge-soia-tripton, se spală de trei ori cu PBS, apoi se fixează timp de 1 oră la temperatura camerei în PBS/0,5% formalină şi se spală suplimentar de trei ori cu PBS, apoi se resuspendează în tampon de înveliş (15 mM Na2C03, 35 mM NaHC03, pH 9,6).

Testul: Godeurile unei plăci de microtitrare Nunc MaxiSorb (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) se acoperă cu: 100 µl de S. aureus fixat cu formalină DSM20233 (OD550 = 0,5) în tampon de acoperire cu 1 µg L-ficolină în tampon de acoperire. După incubare peste noapte, godeurile se blochează cu 0,1% albumină serică umană (HSA) în TBS (10 mM Tris HCI, 140 mM NaCI, pH 7,4), apoi se spală cu TBS conţinând 0,05% Tween 20 şi 5 mM CaCI2 . Probele de ser uman se diluează în 20 mM Tris HCI, 1 M NaCI, 10 mM CaCI2, 0,05% Triton X-100, 0,1% HSA, pH 7,4, care previne activarea endogenă a C4 şi disociază complexul C1 (constituit din C1q, C1r şi C1s). Agenţi inhibitori ai MASP 2, incluzând MoAb anti-MASP-2 şi peptide inhibitoare, se adaugă la probele de ser în diferite concentraţii. Probele diluate se adaugă pe placă şi se incubează peste noapte la 4°C. Peste 24 de ore plăcile se spală bine cu tampon de spălare, apoi în fiecare godeu se adaugă 0,1 µg de C4 umană purificată (obţinută aşa cum descrie Dodds, A.W. în Metode Enzymol., 223: 46,1993) în 100 µl de 4 mM barbital, 145 mM NaCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, pH 7,4. Peste 1,5 ore de expunere la 37°C plăcile se spală repetat şi depunerea de C4b se detectează utilizând C4c anti-umană de pui conjugată cu fosfatază alcalină (disponibil de la Immunsystem, Uppsala, Suedia) şi se măsoară utilizând substratul colorimetric de p-nitrofenil fosfat.

Testul pentru C4 pe manan: Analiza descrisă mai sus se adaptează pentru măsurarea activării căii lectinei cu MBL prin aplicarea pe placă a unui strat de LSP şi manan înainte de adiţia serului amestecat cu diferiţi agenţi inhibitori ai MASP-2.

Testul pentru C4 pe H-ficolină (antigenul Hakata): Analiza descrisă mai sus se adaptează pentru măsurarea activării căii lectinei cu H-ficolină prin aplicarea pe placă a unui strat de LSP şi H-ficolină înainte de adiţia serului amestecat cu diferiţi agenţi inhibitori ai MASP-2.

EXEMPLUL 8

Următorul test demonstrează prezenţa căii clasice de activare la şoarecii de tip sălbatic şi şoarecii MASP-2-/-.

Metode: Complexele imune se generează in situ prin acoperirea plăcilor de microtitrare (Maxisorb, Nunc, cat. nr. 442404, Fisher Scientific) cu 0,1% albumină serică umană în 10 mM Tris, 140 mM NaCI, pH 7,4 timp de 1 oră la temperatura camerei, urmată de incubare peste noapte la 4°C cu antiser de oaie împotriva serului integral (Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland) diluat 1:1000 în TBS/tween/Ca2+. Probele de ser se obţin de la şoareci de tip sălbatic şi de la şoareci MASP-2-/- şi se adaugă pe plăcile acoperite. Se prepară probe de control, care conţin probe de ser de la şoareci de tip sălbatic şi de la şoareci MASP-2-/- cu nivel semnificativ redus de C1q. Serul de şoarece cu nivel redus semnificativ de C1q se prepară utilizând proteina A cuplată cu particule de magnet Dynabeads (Dynal Biotech, Oslo, Norvegia) acoperite cu C1q IgG anti-umane de iepure (Dako, Glostrup, Danemarca), conform instrucţiunilor producătorului. Plăcile se incubează pentru 90 minute la 37°C. C3b legat se detectează cu un anticorp policlonal anti-C3c uman (Dako A 062) diluat în TBS/tw/Ca++ până la 1:1000. Anticorpul secundar reprezintă IgG anti-iepure de capră.

Rezultate: Fig. 7 prezintă nivelurile relative de depozite C3b pe plăci acoperite cu IgG în ser de la şoareci de tip sălbatic, ser de la şoareci MASP-2-/-, ser de la şoareci tip sălbatic cu nivel redus semnificativ de C1q şi ser de la şoareci MASP-2-/- cu nivel redus semnificativ de C1q. Aceste rezultate demonstrează că la şoarecii MASP-2-/- calea clasică este intactă.

EXEMPLUL 9

Următoarea analiză se utilizează pentru a testa abilitatea unui agent inhibitor al MASP-2 de a bloca calea clasică prin studierea efectului unui agent inhibitor al MASP-2 în condiţii, în care calea clasică este iniţiată de complexe imune.

Metode: Pentru a testa efectul unui agent inhibitor al MASP-2 asupra condiţiilor de activare a complementului, în cazul în care calea clasică este iniţiată de complexe imune, trei exemplare de ser câte 50 µl conţinând 90% NHS se incubează la 37°C în prezenţa 10 µg/ml de complex imun (IC) sau PBS şi, paralel, în timpul incubării la 37°C se include şi cele trei probe (+/-IC), care conţin 200 nM anticorp monoclonal anti-properdină. După incubare timp de două ore la 37°C, la toate probele se adaugă 13 mM EDTA pentru a stopa activarea ulterioară a complementului, apoi probele se răcesc imediat până la 5°C. Probele apoi se depozitează la -70ºC până în momentul utilizării lor în analiza produselor de activare a complementului (C3a şi sC5b9) utilizând kituri ELISA (Quidel, catalogul nr. A015 şi A009), conform instrucţiunilor producătorului.

EXEMPLUL 10

Acest exemplu descrie identificarea fragmentelor de anticorp Fab2 anti-MASP-2 cu afinitate înaltă, care blochează activitatea MAS-2.

Fundal şi actualitate: MASP-2 este o proteină complexă cu multe domenii funcţionale separate, incluzând: situsul (locurile) de legare pentru MBL şi ficoline, un situs catalitic de serin protează, un situs de legare pentru substratul proteolitic C2, un situs de legare pentru substratul proteolitic C4, un situs de scindare a MASP-2 pentru autoactivarea zimogenului MASP-2 şi două situsuri de legare a Ca++. S-au identificat fragmente de anticorp Fab2, care se leagă cu afinitate înaltă la MASP 2 şi fragmentele Fab2 identificate se testează într-un test funcţional pentru a determina abilitatea lor de bloca activitatea funcţională a MASP-2.

Pentru a bloca activitatea funcţională a MASP-2 un anticorp sau un fragment de anticorp Fab2 trebuie să se lege şi să interfereze cu un epitop structural pe MASP-2, care este necesar pentru activitatea funcţională a MASP-2. Prin urmare, multe sau toate Fab2- anti-MASP-2 de legătură cu afinitate înaltă nu pot inhiba activitatea funcţională a MASP-2 dacă nu se leagă la epitopii structurali pe MASP-2, care sunt implicaţi direct în activitatea funcţională a MASP-2.

Un test funcţional, în care se măsoară inhibarea formării convertazei C3 a căii lectinei, se utilizează pentru a evalua "activitatea de blocare" a fragmentului Fab2 anti-MASP-2. Se ştie că rolul fiziologic primar al MASP-2 în calea lectinei este de a genera următoarea componentă funcţională a căii complementare mediate de lectină, şi anume a convertazei C3 a căii lectinei. Convertază C3 a căii lectinei este un complex enzimatic deosebit de important (C4bC2a), care scindează proteolitic C3 în C3a şi C3b. MASP-2 nu este o componentă structurală a convertazei C3 a căii lectinei (C4bC2a); totuşi, activitatea funcţională a MASP-2 este necesară pentru a genera cele două componente proteice (C4b, C2a), care conţin convertaza C3 a căii lectinei. Mai mult decât atât, toate activităţile funcţionale separate ale MASP-2, enumerate mai sus, par să fie necesare pentru ca MASP-2 să genereze convertază C3 a căii lectinei. Din aceste motive, testul preferat utilizat în evaluarea "activităţii de blocare" a fragmentului Fab2 anti-MASP-2 este considerat a fi testul funcţional, în care se măsoară inhibarea formării convertazei C3 a căii lectinei.

Generarea fragmentelor Fab2 cu afinitate înaltă: Pentru a genera fragmente Fab2 cu afinitate înaltă la proteina MASP-2 de şobolan (SECV ID NR: 55) se utilizează un display de fagi al unei biblioteci de secvenţe ale lanţurilor uşoare şi lanţurilor grele ale anticorpilor umani şi metoda automată de selectare a anticorpilor pentru identificarea Fab2, care interacţionează cu liganzii selectaţi de interes. Pentru screening-ul anticorpilor se utilizează o cantitate cunoscută de proteină de MASP-2 de şobolan (~ 1 mg, >85% puritate). Pentru selectarea anticorpilor cu cea mai bună afinitate se utilizează trei runde amplificare. Pentru screening prin metoda ELISA se selectează aproximativ 250 de secvenţe diferite, care exprimă fragmente de anticorpi. Secvenţele cu afinitate înaltă ulterior se secvenţiază pentru a determina unicitatea anticorpilor diferiţi.

Cincizeci de anticorpi unici anti-MASP-2 se purifică şi se utilizează 250 µg de fiecare anticorp Fab2 purificat pentru caracterizarea afinităţii de legare a MASP-2 şi pentru testarea funcţională a căii de activare a complementului, aşa cum se descrie detaliat în continuare.

Analizele utilizate pentru evaluarea activităţii inhibitoare (de blocare) a fragmentelor Fab2 anti-MASP-2.

1. Testul de măsurare a inhibării formării convertazei C3 a căii lectinei:

Fundal: Convertaza C3 a căii lectinei este un complex enzimatic (C4bC2a), care scindează proteolitic C3 în cele două fragmente proinflamatorii puternice, anafilatoxină C3a şi opsonină C3b. Probabil, formarea convertazei C3 este o etapă cheie în calea lectinei în ceea ce priveşte medierea inflamaţiei. MASP-2 nu este o componentă structurală a convertazei C3 a căii lectinei (C4bC2a); prin urmare anticorpii anti-MASP-2 (sau Fab2) nu vor inhiba direct activitatea convertazei C3 preexistente. Cu toate acestea, activitatea serin proteazei MASP-2 este necesară pentru a genera cele două componente proteice (C4b, C2a), care conţin convertaza C3 a căii lectinei. De aceea, fragmentul Fab2 al anticorpului anti-MASP-2, care inhibă activitatea funcţională a MASP-2 (adică blocarea Fab2 anti-MASP-2) va inhiba de novo formarea convertazei C3 a căii lectinei. C3 conţine o grupă tioester neobişnuită şi foarte reactivă, ca parte a structurii sale. După scindarea convertazei C3 în acest test, grupa tioester în C3b poate forma o legătură covalentă cu grupele hidroxil sau amino ale macromoleculelor, imobilizate pe fundul godeurilor plastic, cu ajutorul legăturilor de ester sau amidă, facilitând astfel detectarea C3b prin metoda ELISA.

Mananul de drojdie este un activator cunoscut al căii lectinei. În următoarea metodă pentru măsurarea formării convertazei C3, godeurile din plastic, acoperite cu manan, se incubează timp de 30 de minute la 37°C cu ser diluat de şobolan pentru a activa calea lectinei. Godeurile apoi se spală şi se testează pentru C3b, imobilizată în godeuri, utilizând metodele ELISA standard. Cantitatea de C3b generată în această analiză este o reflectare directă a formării de novo a convertazei C3 a căii lectinei. În această analiză fragmentele Fab2 ale anticorpilor anti-MASP-2 în concentraţiile selectate se testează pentru abilitatea lor de a inhiba formarea convertazei C3 şi generarea consecutivă a C3b.

Metode:

Plăcile de legare Costar Medium cu 96 de godeuri se incubează peste noapte la 5°C cu manan, diluat în 50 mM tampon carbonat, pH 9,5 la 1 µg/50 mM/godeu. După incubarea peste noapte, fiecare godeu se spală de trei ori cu 200 µl PBS. apoi godeurile se blochează cu 100 µl/godeu de 1% albumină serică de bovină în PBS şi se incubează timp de o oră la temperatura camerei cu amestecare uşoară. Fiecare godeu apoi se spală de trei ori cu 200 µl de PBS. Probele de Fab2 anti-MASP-2 se diluează până la concentraţii selectate în tampon GVB conţinând Ca++ şi Mg++ (4,0 mM barbital, 141 mM NaCI, 1,0 mM MgCI2, 2,0 mM CaCI2, 0,1% gelatină, pH 7,4) la 5°C. La probele de mai sus la 5°C se adaugă 0,5% ser de şobolan şi se transferă câte 100 µl în fiecare godeu. Plăcile se acoperă cu capace şi se incubează timp de 30 de minute într-o baie de apă la 37°C pentru a permite activarea complementului. Reacţia se stopează prin transferarea plăcilor din baia de apă cu 37°C într-un recipient conţinând un amestec de apă şi gheaţă. Fiecare godeu se spală de cinci ori cu 200 µl soluţie PBS-Tween 20 (0,05% Tween 20 în PBS), apoi se spală de două ori cu 200 µl PBS. Soluţia de anticorpi primari în diluţie 1:10 000 (de iepure anti-C3 umană, DAKO A0062) în volum de 100 µl/godeu se adaugă în PBS, care conţine 2,0 mg/ml albumină serică de bovină şi se incubează pentru 1 h la temperatura camerei cu amestecare uşoară. Fiecare godeu se spală de 5 ori cu 200 µl PBS. Soluţia de anticorpi secundari în diluţie 1:10 000 (IgG de capră anti-iepure conjugată cu peroxidază, American Qualex A102PU) în volum de 100 µl/godeu se adaugă în PBS, care conţine 2,0 mg/ml albumină serică de bovină şi se incubează pentru 1 h la temperatura camerei cu amestecare uşoară pe un dispozitiv de agitare. Fiecare godeu se spală de cinci ori cu 200 µl PBS. Se adaugă 100 µl /godeu de substrat de peroxidază TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) şi se incubează la temperatura camerei timp de 10 minute. Reacţia cu peroxidază se stopează prin adiţia a 100 µl /godeu de 1,0 M H3P04 şi se măsoară OD450.

2. Testul de măsurare a inhibării scindării C4 dependente de MASP-2

Fundal: Activitatea serin proteazei MASP-2 este foarte specifică şi au fost identificate doar două substraturi proteice pentru MASP-2: C2 şi C4. Scindarea C4 generează C4a şi C4b. Fab2 anti-MASP-2 se poate lega cu epitopii structurali pe MASP-2, care sunt implicaţi direct în scindarea C4 (de exemplu, situsul de legare a MASP-2 pentru C4; situsul catalitic de serin protează a MASP-2) şi prin aceasta inhibă activitatea funcţională a MASP-2 de scindare a C4.

Mananul de drojdie este un activator cunoscut al căii lectinei. În următoarea metodă pentru măsurarea activităţii MASP-2 de scindare a C4, godeurile din plastic acoperite cu manan se incubează timp de 30 de minute la 37°C cu ser diluat de şobolan pentru a activa calea lectinei. Deoarece anticorpul primar, utilizat în acest test ELISA, recunoaşte numai C4 uman, serul diluat de şobolan se suplimentează şi cu C4 uman (1,0 µg/ml). Godeurile apoi se spală şi se testează pentru C4b umană, imobilizată în godeuri, utilizând metodele ELISA standard. Cantitatea de C4b, generată în această analiză, este măsura activităţii MASP-2 dependente de scindarea C4. În această analiză se testează abilitatea fragmentelor Fab2 anti-MASP-2 în concentraţiile selectate de a inhiba scindarea C4.

Metode: Plăcile de legare Costar Medium cu 96 de godeuri se incubează peste noapte la 5°C cu manan, diluat în 50 mM tampon carbonat, pH 9,5 la 1 µg/50 mM/godeu. Fiecare godeu se spală de trei ori cu 200 µl PBS. Apoi godeurile se blochează cu 100 µl/godeu de 1% albumină serică de bovină în PBS şi se incubează timp de o oră la temperatura camerei cu amestecare uşoară. Fiecare godeu apoi se spală de trei ori cu 200 µl de PBS. Probele de Fab2 anti-MASP-2 se diluează până la concentraţii selectate în tampon GVB conţinând Ca++ şi Mg++ (4,0 mM barbital, 141 mM NaCI, 1,0 mM MgCI2, 2,0 mM CaCI2, 0,1% gelatină, pH 7,4) la 5°C. În aceste probe se introduce, de asemenea, 1,0 µg/ml de C4 umană. (Quidel). La probele de mai sus la 5°C se adaugă 0,5% ser de şobolan şi se transferă câte 100 µl în fiecare godeu. Plăcile se acoperă cu capace şi se incubează timp de 30 de min într-o baie de apă la 37°C pentru a permite activarea complementului. Reacţia se stopează prin transferarea plăcilor din baia de apă cu 37°C într-un recipient conţinând un amestec de apă şi gheaţă. Fiecare godeu se spală de cinci ori cu 200 µl soluţie PBS-Tween 20 (0,05% Tween 20 în PBS), apoi se spală de două ori cu 200 µl PBS. Soluţia conjugate cu biotină de pui anti-C4 umană (Immunsystem AB, Uppsala, Suedia) în diluţie 1:700 în volum de 100 µl/godeu se adaugă în PBS, care conţine 2,0 mg/ml albumină serică de bovină şi se incubează pentru 1 h la temperatura camerei cu amestecare uşoară. Fiecare godeu se spală de 5 ori cu 200 µl PBS. În fiecare godeu se adaugă câte 100µl streptavidină conjugate cu peroxidază în concentraţie de 0,1 µg/ml (Pierce Chemical #21126) în PBS cu conţinut de 2,0 mg/ml BSA şi se incubează timp de 1 h la temperatura camerei cu amestecare uşoară pe un dispozitiv de agitare. Fiecare godeu se spală de cinci ori cu 200 µl PBS. Se adaugă 100 µl /godeu de substrat de peroxidază TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) şi se incubează la temperatura camerei timp de 16 minute. Reacţia cu peroxidază se stopează prin adiţia a 100 µl /godeu de 1,0 M H3P04 şi se măsoară OD450.

3. Testul de legare a fragmentului Fab2 al anticorpului de şobolan anti-MASP-2 cu MASP-2 de şobolan 'Nativă'

Fundal: MASP-2 este prezent, de obicei, în plasmă sub formă de un complex dimeric MASP-2, care include şi molecule specifice de lectină (proteină fixatoare de manoză (MBL) şi ficoline). Prin urmare, dacă apare interes pentru studierea legării fragmentului Fab2 al anticorpului anti-MASP-2 cu forma relevantă din punct de vedere fiziologic a MASP-2, este important să se elaboreze un test de legare, în care se utilizează interacţiunea în plasma dintre Fab2 şi MASP-2 "nativă", dar nu cu MASP-2 recombinată purificată. În acest test de legare, mai întâi se imobilizează complexul MASP-2-MBL "nativ" din 10% ser de şobolan în godeurile acoperite cu manan. Apoi, se studiază afinitatea de legare a diferitor fragmente Fab2 ale anticorpilor anti-MASP-2 cu MASP-2 "nativă" imobilizată folosind o metodă ELISA standard.

Metode: Plăcile de legare Costar Medium cu 96 de godeuri se incubează peste noapte la 5°C cu manan diluat în 50 mM tampon carbonat, pH 9,5 la 1 µg/50 µI/godeu. Fiecare godeu se spală de trei ori cu 200 µI PBS. Godeurile apoi se blochează cu 100 µI/godeu de 0,5% lapte praf degresat în PBST (PBS cu 0,05% Tween 20) şi se incubează timp de o oră la temperatura camerei cu amestecare uşoară. Fiecare godeu apoi se spală de trei ori cu 200 µI de TBS/Tween/tampon de spălare Ca++ (soluţie fiziologică Tris-tamponată, 0,05% Tween 20 conţinând 5,0 mM CaCl2, pH 7,4. Se prepară pe gheaţă 10% ser de şobolan în tampon de legare cu conţinut înalt de sare (20 mM Tris, 1,0 M NaCI, 10 mM CaCI2, 0,05% Triton-X100, 0,1% (g/v) albumină serică de bovină, pH 7,4). Se adaugă câte 100 µI/godeu şi se incubează peste noapte la 5°C. Godeurile se spală de trei ori cu 200 µl TBS/Tween/Tampon de spălare Ca ++. Apoi godeurile se spală de două ori cu 200 µI PBS. Se adaugă câte 100 µI/godeu de fragment Fab2 al anticorpului anti-MASP-2 de concentraţie selectată, diluate în tampon GVB conţinând Ca++ şi Mg++ (4,0 mM barbital, 141 mM NaCI, 1,0 mM MgCI2, 2,0 mM CaCI2, 0,1% gelatină, pH 7,4) şi se incubează pentru o oră la temperatura camerei cu amestecare lentă. Fiecare godeu se spală de cinci ori cu 200 µI PBS. Se adaugă 100 µI/godeu de fragment Fab2 de anticorp de capră HRP-conjugată (Biogenesis cat. nr. 0500-0099), diluat 1:5000 în 2,0 mg/ml albumină serică de bovină în PBS şi se incubează pentru 1 h la temperatura camerei cu amestecare uşoară. Fiecare godeu se spală de 5 ori cu 200 µI PBS. Se adaugă 100 µI/godeu de substrat de peroxidază TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) şi se incubează la temperatura camerei timp de 70 minute. Reacţia cu peroxidază se stopează prin adiţia a 100 µI/godeu de 1,0 M H3P04 şi se măsoară OD450.

REZULTATE:

Aproximativ 250 de fragmente diferite Fab2, care au reacţionat cu afinitate înaltă cu proteina MASP-2 de şobolan au fost selectate pentru screening prin metoda ELISA. Aceste fragmente Fab2 cu afinitate înaltă au fost secvenţiate pentru a determina unicitatea diferitor anticorpi şi 50 de anticorpi unici anti-MASP-2 au fost purificaţi pentru analiză ulterioară. 250 µg din fiecare fragment Fab2 de anticorp purificat s-a utilizat pentru caracterizarea afinităţii de legare a MASP-2 şi testarea funcţională a căii complementului. Rezultatele acestei analize sunt prezentate în continuare în tabelul 6.

Tabelul 6: FRAGMENTE FAB2 ALE ANTICORPILOR ANTI-MASP-2, CARE BLOCHEAZĂ CĂLEA LECTINEI DE ACTIVARE A COMPLEMENTULUI

fragmentul Fab2 al anticorpului # Convertaza C3 (IC50 (nM) Kd Scindarea C4 IC50 (nM) 88 0.32 4.1 nu s-a determinat 41 0.35 0.30 0.81 11 0.46 0.86 <2 nM 86 0.53 1.4 nu s-a determinat 81 0.54 2.0 nu s-a determinat 66 0.92 4.5 nu s-a determinat 57 0.95 3.6 <2 nM 40 1.1 7.2 0.68 58 1.3 2.6 nu s-a determinat 60 1.6 3.1 nu s-a determinat 52 1.6 5.8 <2 nM 63 2.0 6.6 nu s-a determinat 49 2.8 8.5 <2 nM 89 3.0 2.5 nu s-a determinat 71 3.0 10.5 nu s-a determinat 87 6.0 2.5 nu s-a determinat 67 10.0 7.7 nu s-a determinat

Din datele prezentate în Tabelul 6 se relevă, că din cele 50 fragmente Fab ale anticorpilor anti-MASP-2 testate, şaptesprezece Fab2 s-au identificat ca Fab2, care blochează MASP-2, care potenţial inhibă formarea convertazei C3 cu IC50 egală sau mai mică de 10 nM Fab2 (o rată de succes pozitivă de 34%). Opt din cele şaptesprezece Fab2 identificate au IC50 într-un interval subnanomolar. În plus, toate cele şaptesprezece Fab2 blocante ale MASP-2, prezentate în Tabelul 6, asigură practic inhibarea completă a formării convertazei C3 în testul cu convertaza C3 a căii lectinei. Fig. 8A ilustrează grafic rezultatele testului de formare a convertazei C3 pentru fragmentul Fab2 al anticorpului # 11, care este reprezentativ pentru celelalte fragmente Fab2 ale anticorpilor testaşi, rezultatele pentru care sunt prezentate în Tabelul 6. Acesta este un aspect important, deoarece teoretic este posibil ca un fragment Fab2 "blocant" poate inhiba doar parţial funcţia MASP-2 chiar şi atunci, când fiecare moleculă de MASP-2 este legată cu Fab2.

Deşi mananul este un activator cunoscut al căii lectinei, teoretic este posibil ca prezenţa anticorpilor anti-manan în serul de şobolan să activeze, de asemenea, calea clasică şi să genereze C3b prin intermediul convertazei C3 a căii clasice. Cu toate acestea, fiecare dintre cele şaptesprezece fragmente Fab2 ale anticorpilor anti-MASP-2 blocante, enumerate în acest exemplu, potential inhibă generarea C3b (> 95%), demonstrând, astfel, specificitatea acestui test pentru convertaza C3 a căii lectinei.

Testele de legare au fost, de asemenea, realizate cu toate cele şaptesprezece Fab2 blocante pentru a calcula Kd aparent pentru fiecare. Rezultatele testelor de legare a fragmentelor Fab2 ale anticorpilor de şobolan anti-MASP-2 cu MASP-2 de şobolan nativă pentru şase Fab2 blocante sunt, de asemenea, prezentate în Tabelul 6. Fig. 8B ilustrează grafic rezultatele testului de legare cu fragmentul Fab2 al anticorpului # 11. Testări de legare similare s-au efectuat, de asemenea, pentru celelalte Fab2, ale căror rezultate sunt prezentate în Tabelul 6. În general, valorile Kd, obţinute pentru legarea fiecăruia dintre cele şase Fab2 cu MASP-2 "nativă" corespunde în mod rezonabil cu IC50 pentru Fab2 în testul funcţional pentru convertaza C3. Există dovezi, că MASP-2 suferă o schimbare conformaţională de la forma "inactivă" până la una "activă" după iniţierea activităţii sale de protează (Feinberg et al., EMBO J 22: 2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol.Chem 280: 33435-44 (2005)). În plasma normală de şobolan, utilizată în testul de formare a convertazei C3, MASP-2 este prezentă în primul rând în formă de conformaţie "inactivă" a zimogenului. În contrast, în testul de legare, MASP-2 este prezentă ca parte a unui complex cu MBL, legat cu manan imobilizat; prin urmare, MASP-2 ar fi în conformaţia "activă" (Petersen et al., J. Immunol Methods 257: 107-16, 2001). În consecinţă, nu se aşteaptă neapărat o corespundere exactă între IC50 şi Kd pentru fiecare dintre cele şaptesprezece Fab2 blocante, testate în aceste două teste funcţionale, deoarece în fiecare analiză Fab2 putea lega diferite forme conformaţionale de MASP-2. Cu toate acestea, cu excepţia Fab2 # 88, pare să existe o corespondenţă relativ apropiată între IC50 şi Kd aparent pentru fiecare din celelalte şaisprezece Fab2, testate în cele două teste (Tabelul 6).

Mai multe Fab2 blocante au fost evaluate pentru inhibarea scindării C4, mediate de MASP-2. Fig. 8C ilustrează grafic rezultatele testului de scindare C4, care prezintă inhibarea cu Fab2 # 41, cu IC50 = 0,81 nM (Tabelul 6). După cum se relevă din fig. 9 toate Fab2 testate inhibă scindarea C4 cu IC50 similare cu cele obţinute în testul pentru convertaza C3 (Tabelul 6).

Deşi mananul este un activator cunoscut al căii lectinei, teoretic este posibil ca prezenţa anticorpilor anti-manan în serul de şobolan să activeze, de asemenea, calea clasică şi, astfel, să genereze C4b prin scindarea C4 mediată de C1s. Cu toate acestea, s-au identificat mai multe fragmente Fab2 ale anticorpilor anti-MASP-2, care inhibă potenţial generarea C4b (> 95%), demonstrând, astfel, specificitatea acestei analize pentru scindarea C4 mediată de MASP-2. C4, asemenea C3, conţine o grupă tioester neobişnuită şi foarte reactivă ca parte a structurii sale. După scindarea C4 cu MASP-2 în acest test, grupa tioester în C4b poate forma o legătură covalentă cu grupele hidroxil sau amino pe macromoleculele imobilizate pe fundul godeurilor plastice prin legături de ester sau amide, facilitând astfel detectarea C4b în testul ELISA.

Aceste studii demonstrează în mod clar crearea FAB2 cu afinitate înaltă la proteina MASP-2 de şobolan, care blochează funcţional atât activitatea convertazei C4, cât şi a convertazei C3, împiedicând astfel activarea căii lectinei.

EXEMPLUL 11

Acest exemplu descrie cartografierea epitopilor unor fragmente Fab2 ale anticorpilor de şobolan anti-MASP-2 blocante, care au fost generate cum se descrie în Exemplul 10.

Metode:

După cum se arată în fig. 10, următoarele proteine, toate cu marcaje N-terminale 6X His, se exprimă în celule CHO, utilizând vectorul pED4:

MASP-2A de şobolan, o proteină MASP-2 cu lungime completă, inactivată prin înlocuirea serinei în centrul activ cu alanină (S613A);

MASP-2K de şobolan, o proteină MASP-2 cu lungime completă, modificată pentru a reduce autoactivarea (R424K);

CUBI-II, un fragment N-terminal al MASP-2 de şobolan, care conţine numai domeniile CUBI, EGF-asemănător şi CUBII; şi

CUBI/EGF asemănător, un fragment N-terminal al MASP-2 de şobolan, care conţine doar domeniile de tip CUBI şi EGF.

Aceste proteine se purifică din supernatante de cultură prin cromatografie de afinitate cu nichel, aşa cum s-a descris anterior (Chen et al., J. Biol.Chem., 276: 25894-02 (2001)).

O polipeptidă C-terminală (CCPII SP), care conţine CCPII şi domeniul serin proteazei MASP-2 de şobolan, se exprimă în E. coli ca proteină de fuziune cu tioredoxină utilizând pTrxFus (Invitrogen). Proteina se purifică din lizatele celulare folosind răşină de afinitate Thiobond. Partenerul de fuziune cu tioredoxină se exprimă din pTrxFus gol în calitate de control negativ.

Toate proteinele recombinante se dializează în tampon TBS şi concentraţiile lor se determină prin măsurarea OD la 280 nm.

ANALIZA DOT BLOT:

Diluţiile în serie ale celor cinci polipeptide MASP-2 recombinante, descrise mai sus şi prezentate în fig. 10 (şi polipeptida tioredoxină ca martor negativ pentru polipeptida CCPII serin-proteazei) se aplică pe o membrană de nitroceluloză sub formă de pete. Cantitatea de proteine aplicate sub formă de pete se modifica între 100 ng şi 6,4 pg la fiecare diluţie următoare de cinci ori. În experimentele ulterioare cantitatea de proteină aplicată sub formă de pete varia de la 50 ng până la 16 pg, de asemenea, la fiecare diluţie următoare de cinci ori. Membranele se blochează cu 5% lapte praf degresat în TBS (tampon de blocare), apoi se incubează cu 1,0 µg/ml de fragment Fab2 al anticorpului anti-MASP-2 în tampon de blocare (conţinând 5,0 mM Ca2+). Fragmentele Fab2 legate se detectează folosind fragmentul Fab al anticorpului uman conjugat cu HRP (AbD/Serotec; diluat 1/10000) şi un kit de detecţie ECL (Amersham). O membrană se incubează cu un anticorp policlonal de iepure anti-MASP-2 umană (descris de Stover et al., J Immunol 163: 6848-59 (1999)) în calitate de control pozitiv. În acest caz, anticorpul legat se detectează utilizând anticorp de capră conjugat cu HRP anti-IgG de iepure (Dako; diluat 1/2000).

Testul de legare a MASP-2

Plăcile pentru ELISA se acoperă cu un strat de MASP-2A recombinantă sau polipeptidă CUBI II în tampon carbonat (pH 9,0) în cantitate de 1,0 µg/godeu peste noapte la 4°C. Godeurile se blochează cu 1% BSA în TBS, apoi se adaugă diluţiile în serie de fragmente Fab2 ale anticorpilor anti-MASP-2 în TBS, conţinând 5,0 nM Ca2+. Plăcile se incubează timp de o oră la temperatura camerei. După spălarea de trei ori cu TBS/tween/Ca2+ se adaugă fragment Fab de anticorp uman conjugat cu HRP (AbD/Serotec) diluat 1/10.000 în TBS/Ca2+ şi plăcile se incubează încă o oră la temperatura camerei. Anticorpul legat se detectează folosind un kit cu substrat de peroxidază TMB (Biorad).

REZULTATE:

Rezultatele analizei dot blot, care demonstrează reactivitatea Fab2 la interacţiunea cu diferite polipeptide MASP-2 sunt prezentate în continuare în Tabelul 7. Valorile numerice, prezentate în tabelul 7, indică cantitatea de proteină aplicată sub formă de pete, necesară pentru a obţine aproximativ jumătate din puterea maximă a semnalului. Aşa cum se arată, toate polipeptidele (cu excepţia numai a celulelor fuzionate de tioredoxină) sunt recunoscute cu anticorpul controlului pozitiv (anticorpul policlonal seric anti-MASP-2 umană, produsă în iepuri).

Tabelul 7: REACTIVITATEA CU DIFERITE POLIPEPTIDE ALE MASP-2 RECOMBINANTE DE ŞOBOLAN ÎN ANALIZA DOT BLOT

Fab2 al anticorpului # MASP-2A CUBI-II CUBI/EGF similar CCPII-SP Tioredoxină 40 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 41 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 11 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 49 0.16 ng NR NR >20 ng NR 52 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 57 0.032 ng NR NR NR NR 58 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 60 0.4 ng 0.4 ng NR NR NR 63 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 66 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 67 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 71 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 81 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 86 0.4 ng NR NR 10 ng NR 87 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR Control pozitiv <0.032 ng 0.16 ng 0.16 ng <0.032 ng NR

S-a înregistrat activitatea căii lectinei în cea de-a doua şi a treia săptămână, cu restaurarea completă a căii lectinei la şoareci în a 17 zi după administrarea anticorpului monoclonal anti-MASP-2. NR=absenţa reacţiei. Anticorpul pentru control pozitiv reprezintă anticorpul policlonal seric anti-MASP-2 umană, produs în iepuri.

Toate fragmentele Fab2 interacţionează cu MASP-2A, precum şi cu MASP-2K (datele nu sunt prezentate). Majoritatea fragmentelor Fab2 recunosc polipeptida CCPII-SP, dar nu şi fragmentele N-terminale. Cele două excepţii sunt Fab2 # 60 şi Fab2 # 57. Fab2 # 60 recunoaşte MASP-2A şi fragmentul CUBI-II, dar nu şi polipeptida CUBI/EGF similară sau polipeptida CCPII-SP, sugerând că se leagă cu un epitop în CUBII sau acoperă domeniul CUBII şi EGF similar. Fab2 # 57 recunoaşte MASP-2A, dar nu şi oricare dintre fragmentele MASP-2 testate, indicând că acest fragmente Fab2 recunoaşte epitopul în CCP1. Fab2 # 40 şi # 49 se leagă numai cu MASP-2A completă. În testul de legare ELISA, prezentat în fig. 11, Fab2 # 60, de asemenea, se leagă cu polipeptida CUBI-II, deşi cu o afinitate aparent inferioară.

Aceste rezultate demonstrează identificarea unor fragmente Fab2 blocante unice, care acţionează în multiple regiuni ale proteinei MASP-2

EXEMPLUL 12

Acest exemplu descrie analiza şoarecilor MASP-2-/- în model experimental de ischemie /reperfuzie renală la şoareci.

Fundal/actualitate: Riscul de leziuni de ischemie/reperfuzie (I/R) la nivelul rinichiului la temperatura corpului este relevantă în mai multe stări clinice, incluzând şocul hipovolemic, ocluzia arterei renale şi procedurile de fixare transversală.

Leziunile în ischemie-reperfuzie renală (I/R) este o cauză importantă a insuficienţei renale acute, asociate cu o rată a mortalităţii de până la 50% (Levy et al., JAMA 275: 1489-94, 1996; Thadhani et al., N. Engl. J. Med. 334: 1448-60, 1996). Insuficienţa renală post-transplant este o complicaţie generală şi periculoasă după un transplant renal (Nicholson et al., Kidney Int. 58: 2585-91, 2000). În prezent nu există un tratament eficient al leziunilor renale în I/R şi hemodializa este singurul tratament disponibil. Fiziopatologia leziunilor renale în I/R este complicată. Studiile recente atestă, că calea lectinei de activare a complementului poate avea un rol important în patogeneza leziunii renale în I/R (deVries et al., Am. J. Path. 165:1677-88, 2004).

Metode:

Un şoarece MASP-2(-/-) se generează cum s-a descrie în Exemplul 1 şi se încrucişează invers pentru cel puţin de 10 generaţii cu şoareci din linia C57Bl/6. La şase şoareci masculi MASP-2(-/-) şi la şase şoareci de tip sălbatic (+/+), cântărind între 22 şi 25 g, se administrează o injecţie intraperitoneală de Hipnovel (6,64 mg/kg; Roche products Ltd. Welwyn Garden City, UK) şi ulterior se anesteziază prin inhalare cu isofluran (Abbott Laboratories Ltd., Kent, UK). Isofluranul se selectează deoarece este un anestezic uşor inhalator cu toxicitate hepatică minimă; concentraţiile se realizează cu exactitate şi animalul se recuperează rapid, chiar şi după o anestezie prelungită. Hipnovel se administrează pentru că produce o stare de neuroleptanalgezie la animal, ceea ce înseamnă necesitatea administrării unei cantităţi mai mici de izofluran. Pentru a menţine o temperatură constantă a corpului sub animal se plasează un aşternut cald. Apoi se efectuează o incizie abdominală mediană, iar cavitatea corpului se deschide utilizând o pereche de retractoare. Ţesutul conjunctiv se elimină deasupra şi dedesubtul venei renale şi arterelor atât ale rinichiului drept, cât şi celui stâng, iar pediculul renal se clampează prin aplicarea clemelor de microaneurism pentru o perioadă de 55 de minute. Această perioadă de ischemie se bazează pe un studiu anterior, efectuat în acest laborator (Zhou et al., J. Clin Invest., 105: 1363-71 (2000)). În plus, se selectează o perioadă ischemică standard de 55 de minute după studierea ischemiei prin metoda de titrare şi s-a constatat că 55 de minute provoacă o leziune stabilă, care este, de asemenea, reversibilă, cu o mortalitate redusă sub 5%. După ocluzie, 0,4 ml de soluţie fiziologică caldă (37°C) se introduce în cavitatea abdominală şi apoi abdomenul se închide pentru perioada de ischemie. După îndepărtarea clemelor de microaneurism, rinichii sunt supravegheaţi până la schimbarea culorii, o indicaţie a restabilirii fluxului sanguin în rinichi. O altă cantitate de 0,4 ml de soluţie fiziologică caldă se introduce în cavitatea abdominală, iar deschiderea se suturează, după care animalele se returnează în cuştile lor. Probele de sânge caudal se prelevă peste 24 de ore după îndepărtarea clemelor şi peste 48 de ore şoarecii se sacrifică şi se colectează o probă suplimentară de sânge.

Evaluarea leziunilor renale: Funcţia renală se evaluează peste 24 şi 48 de ore după reperfuzare la şase şoareci masculi MASP-2(-/-) şi şase şoareci WT (+/+). Măsurările creatininei în sânge se efectuează prin spectrometria de masă, care asigură un indice reproductibil al funcţiei renale (sensibilitate <1,0 µmol/l). Fig. 12 ilustrează graficul clearance-ului azotului ureei pentru grupa de control cu şoareci de tip sălbatic din linia C57Bl/6 şi pentru grupa şoarecilor MASP-2(-/-) peste 24 ore şi 48 de ore după reperfuzie. După cum se arată în fig. 12, şoarecii MASP-2(-/-) prezintă o reducere semnificativă a cantităţii de uree din sânge peste 24 şi 48 de ore, comparativ cu şoarecii de control de tip sălbatic, indicând un efect funcţional de protecţie de la leziunile renale în modelul de leziune în ischemia de reperfuzie.

În general, creşterea ureei în sânge se observa atât la şoarecii WT (+/+), cât şi la şoarecii MASP-2(-/-) peste 24 şi 48 de ore după procedura chirurgicală şi insultele ischemice. Nivelurile de uree din sânge la un animal chirurgical non-ischemic WT (+/+) se determină separat ca constituind 5,8 mmol/l. Adiţional la datele prezentate în fig. 12, un animal MASP-2(-/-) prezentă o protecţie aproape completă faţă de insultele ischemice, cu valori de 6,8 şi 9,6 mmol/l peste 24 şi 48 de ore, respectiv. Acest animal se exclude din analiza grupei ca o potenţială depăşire, în care nu a putut fi prezentă nici o leziune ischemică. Prin urmare, analiza finală, prezentată în fig. 12, include 5 şoareci MASP-2(-/-) şi şase şoareci WT (+/+) şi o reducere statistic semnificativă a ureei în sânge se observă peste 24 şi 48 de ore la şoarecii MASP-2(-/-) (criteriul t-Student p <0,05). Se poate presupune, că aceste rezultate indică, că inhibarea activităţii MASP-2 exercită un efect protector sau terapeutic în leziunile renale cauzate de ischemie.

EXEMPLUL 13

Acest exemplu descrie rezultatele, obţinute într-un studiu realizat pe model experimental de degenerescenţă maculară pe şoareci MASP-2-/- .

Fundal/actualitate: Degenerescenţa maculară legată de vârstă (AMD) este principala cauză a orbirii după vârsta de 55 de ani în lumea industrializată. AMD se manifestă în două forme majore: AMD neovasculară (umedă sau exudativă) şi AMD atrofică (uscată sau nonexudativă). Forma neovasculară (umedă) reprezintă 90% din pierderea vizuală severă asociată cu AMD, chiar dacă doar 20% dintre persoanele cu AMD dezvoltă forma umedă. Semnele clinice ale AMD includ multiplele depozite hipertrofice (drusen), atrofia geografică şi neovascularizarea coroidală (CNV). În decembrie 2004 FDA a aprobat Macugen (pegaptanib), o nouă clasă de medicamente oftalmice care ţintesc în mod specific şi blochează efectele factorului de creştere al endoteliului vascular (VEGF), pentru tratamentul formei umede (neovasculare) a AMD (Ng et al., Nat Rev. Drug Discov 5: 123-32 (2006)). Deşi Macugen reprezintă o nouă opţiune terapeutică promiţătoare pentru un subgrup de pacienţi cu AMD, persistă o necesitate stringentă de elaborare a unor tratamente suplimentare pentru această boală complexă. Liniile independente, multiple de investigare implică un rol central activării complementului în patogeneza AMD. Patogenia neovascularizării coroidale (CNV), celei mai grave forme de AMD, poate implica activarea căilor complementului.

În urmă cu douăzeci şi cinci de ani Ryan a descris un model de leziune în CNV, indusă cu laser, la animale (Ryan, S.J., Tr. Am., Opth. Soc., LXXVII: 707-745, 1979). Modelul a fost iniţial dezvoltat folosind maimuţe rezus, totuşi, aceeaşi tehnologie a fost folosită în continuare pentru a dezvolta modele similare de CNV la o varietate de animale de cercetare, inclusiv la şoareci (Tobe et al., Am., J. Pathol., 1998). În acest model fotocoagularea cu laser se foloseşte pentru a rupe membrana Bruch, o acţiune care rezultă cu formarea de membrane asemănătoare CNV. Modelul, indus cu laser, acumulează multe dintre caracteristicile importante ale stării la om (Ambati et al., Survey Ophthalmology 48: 257-293, 2003). Modelul murin, indus cu laser, este acum bine stabilit şi se utilizează ca bază experimentală într-un număr mare, aflat în creştere, de proiecte de cercetare. Este în general acceptat faptul, că modelul indus cu laser are o similitudine biologică suficientă cu CNV la om, deoarece studiile preclinice privind patogeneza şi inhibarea medicamentului, utilizând acest model, sunt relevante pentru CNV la om.

Metode:

Se generează un şoarece MASP-2-/-, cum se descrie în Exemplul 1, şi se încrucişează reciproc timp de 10 generaţii cu şoareci din linia C57Bl/6. În acest studiu se compară rezultatele obţinute la şoarecii masculi MASP-2(-/-) şi şoarecii MASP-2(+/+) evaluaţi în procesul CNV, induse cu laser, într-un model accelerat de AMD neovasculară, focusându-se asupra volumului CNV, induse de laser, prin metoda de microscopie confocală de scanare cu laser ca măsură a leziunilor tisulare şi pentru determinarea nivelurilor de VEGF, unui factor angiogen puternic implicat în CNV, în epiteliul pigmentar retinian (RPE)/coroidă prin ELISA după leziunea cu laser.

Inducerea neovascularizării coroide (CNV): La ambii ochi ai fiecărui animal în ziua zero se efectuează fotocoagularea cu laser (532 nm, 200 mW, 100 ms, 75 µm, Oculight GL, Iridex, Mountain View, CA) de un singur colaborator, care nu ştie în care grupă de animale a fost indicată administrarea medicamentelor. Petele cu laser se aplică într-un mod standardizat în jurul nervului optic, utilizând un sistem de instalare a lămpilor cu fantă şi o lamelă în calitate de lentilă de contact. Punctul final morfologic al leziunii cu laser se consideră apariţia unui bule de cavitaţie, un semn considerat a corela cu deteriorarea membranei Bruch. Detalierea metodei şi aprecierea rezultatelor finale sunt descrise în continuare.

Angiografia cu fluoresceină: Angiografia cu fluoresceină se efectuează cu un aparat fotografic şi un sistem de imagistică (cameră TRC 50 1A, sistemul ImageNet 2.01, Topcon, Paramus, NJ) peste o săptămână după fotocoagularea cu laser. Fotografiile se efectuează cu un obiectiv cu lentile 20 D, care contactează cu lentilele camerei de fund, după injectarea intraperitoneală a 0,1 ml de 2,5% fluoresceină sodică. Un specialist în retina oculară, care nu este implicat în fotocoagularea cu laser sau în angiografie, a evaluat angiogramele cu fluoresceină într-o singură şedinţă, neavând informative cu privire la manipulaţiile anterioare cu animalele.

Volumul neovascularizării coroide (CNV): Peste o săptămână după leziunea cu laser, ochii se enucleează şi se fixează cu 4% paraformaldehidă timp de 30 minute la 4°C. Cupele oculare se obţin prin îndepărtarea segmentelor anterioare şi se spală de trei ori în PBS, urmată de deshidratare şi rehidratare printr-o serie de metanol. După blocarea de două ori cu tampon (PBS conţinând 1% albumină serică de bovină şi 0,5% Triton X 100) timp de 30 de minute la temperatura camerei, cupele oculare se incubează peste noapte la 4°C cu 0,5% FITC izolectină B4 (Vector laboratories, Burlingame, CA), diluat cu PBS conţinând 0,2% BSA şi 0,1% Triton X-100, care leagă reziduurile terminale ale β-D-galactozei pe suprafaţa celulelor endoteliale şi marchează selectiv reţeaua vasculară murină. După două spălări cu PBS conţinând 0,1% Triton X-100, partea neurosensorială a retinei se detaşează uşor şi se separă de nervul optic. Se realizează patru incizii radiale relaxante şi complexul scleră-coroid-RPE restant se montează într-un mediu, care împiedică decolorarea preparatului (Immu-Mount Vectashield Mounting Medium, Vector Laboratories) şi se îndepărtează lamela.

Probele, incluse în mediu, se examinau cu un microscop confocal de scanare cu laser (TCS SP, Leica, Heidelberg, Germania). Vasele se vizualizează prin excitarea cu lungimea de undă a regiunii albastre a spectrului vizibil al argonului (488 nm) şi captarea emisiei între 515 şi 545 nm. Pentru toate studiile de imagistică se utilizează un obiectiv de imersie în ulei 40X. Secţiunile optice orizontale (pasul 1 µm) se obţin de pe suprafaţa complexului scleră-coroid-RPE. Cel mai adânc plan focal, în care se identifică reţeaua vasculară coroidală din jur, care are legătură cu leziunea, se consideră a fi fundul focarului leziunii. Orice vas din zona ţintită cu laser şi aflat pe suprafaţa regiunii, indicate mai sus, se consideră CNV. Imaginile din fiecare secţiune se stochează digital. Zona fluorescenţei legate de CNV se măsoară prin analiza computerizată a imaginii cu software, ataşat la microscop (TCS SP; Leica). Sumarea întregii zone fluorescente în fiecare secţiune orizontală se utilizează ca un indice, care caracterizează volumul CNV. Obţinerea imaginilor se realizează de către un operator, care nu ştie, cărei grupe de animale i-a fost indicată administrarea medicamentelor.

Deoarece probabilitatea ca fiecare leziune cu laser, care conduce la dezvoltarea CNV, să fie influenţată de apartenenţa la una sau altă grupă (şoarece, ochi şi pată cu laser), se compară volumele medii ale leziunilor, folosind un model mixt liniar, cu sectoare divizate cu măsurări repetate. Factorul complet al sectorului este grupa genetică din care face parte animalul, în timp ce factorul de sector divizat este ochiul. Semnificaţia statistică se determină la nivel de 0,05. Se construiesc comparaţii aposterioare ale valorilor medii cu o ajustare Bonferroni pentru comparaţii multiple.

Analiza factorului creşterii endoteliului vaselor (VEGF) prin metoda ELISA. Peste trei zile după leziune cu 12 pete de laser, complexul coroidian RPE se distruge cu ultrasunet în tampon de liză (20 mM imidazol·HCI, 10 mM KCI, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 1% Triton X 100, 10 mM NaF, 1 mM molibdat de sodiu şi 1 mM EDTA cu inhibitor de protează) pe gheaţă timp de 15 minute. Nivelurile de proteine VEGF din supernatant se determină cu un kit ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN), care recunoaşte toate variantele de îmbinare, la lungime de undă de la 450 până la 570 nm (Emax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) şi normalizat la valoarea proteinei totale. Măsurătorile duplicate se efectuează de către un operator, care nu a participat la efectuarea fotocoagulării, obţinerea imaginilor sau realizarea angiografiei. Cantitatea VEGF este reprezentată ca valoare medie+/-SEM din cel puţin de trei experimente independente şi se compară utilizând criteriul U Mann-Whitney. Ipoteza nulă se respinge la P <0,05.

REZULTATE:

Evaluarea nivelurilor VEGF:

Fig. 13A ilustrează grafic nivelurile de proteină VEGF din complexul coroidian RPE izolat de la şoarecii de tip sălbatic din linia C57B16 şi de la şoarecii MASP-2(-/-) în ziua zero. După cum se arată în fig. 13A, evaluarea nivelurilor VEGF indică o reducere a nivelelor de bază pentru VEGF la şoarecii MASP-2(-/-), comparativ cu şoarecii de control de tip sălbatic din linia C57bl. Fig. 13B ilustrează grafic nivelurile de proteină VEGF, măsurate în ziua a treia după leziunea indusă cu laser. După cum se arată în fig. 13B nivelurile VEGF cresc semnificativ la şoarecii de tip sălbatic (+/+) peste trei zile după leziunea indusă cu laser, conform studiilor publicate (Nozaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 2328-33 (2006)). Cu toate acestea, la şoarecii MASP-2(-/-) se observă niveluri surprinzător de joase de VEGF.

Evaluarea neovascularizării coroidale (CNV):

Adiţional la reducerea nivelurilor VEGF după degenerescenţa maculară, indusă de laser, se determină suprafaţa CNV până la şi după leziunea cu laser. Fig. 14 ilustrează grafic volumul CNV, măsurate la şoarecii de tip sălbatic din linia C57bl şi la şoarecii MASP-2(-/-) în ziua a şapte după leziunea, indusă de laser. După cum se arată în fig. 14, în ziua a şaptea după leziunea indusă de laser şoarecii MASP-2(-/-) prezintă o reducere de aproximativ 30% a zonei CNV, comparativ cu şoarecii de control de tip sălbatic.

Aceste date indică o reducere a VEGF şi a CNV, observată la şoarecii MASP-2(-/-), comparativ cu şoarecii de control de tip sălbatic (+/+), precum şi că blocarea MASP-2 cu un inhibitor poate avea un efect preventiv sau terapeutic în tratamentul degenerescenţei maculare.

EXEMPLUL 14

Acest exemplu demonstrează, că activarea trombinei poate apărea în urma activării căii lectinei în condiţii fiziologice şi se caracterizează gradul implicării MASP-2 în procesul patologic. În serul de şobolan sănătos, activarea căii lectinei conduce la activarea trombinei (evaluată după depunerea trombinei) concomitent cu activarea complementului (evaluată după depunerea C4). Aşa cum se poate vedea în fig. 15A şi 15B, activarea trombinei în acest sistem este inhibată de un anticorp de blocare a MASP-2 (în format Fab2), care se caracterizează printr-o curbă a concentraţiei-efect de inhibarea activării trombinei (fig.15B), care este paralelă cu curba concentraţiei-efect de inhibare a activării complementului (fig. 15A). Aceste date sugerează, că activarea căii lectinei, aşa cum se produce în traumă, trebuie să conducă la activarea atât a sistemului complementului, cât şi a sistemelor de coagulare într-un proces care depinde în întregime de MASP-2. Prin inferenţă, anticorpii blocatori ai MASP-2, se pot dovedi a fi eficienţi în reducerea cazurilor de coagulare sistemică excesivă, de exemplu coagularea intravasculară diseminată, care este unul dintre semnele distinctive care conduc la mortalitate în cazurile de traumatism major.

EXEMPLUL 15

Acest exemplu prezintă rezultatele obţinute folosind un model localizat de reacţie Schwartzman de coagulare intravasculară diseminată ("DIC") la şoarecii MASP-2-/- deficitari şi şoarecii MASP-2+/+ suficienţi pentru a evalua rolul căii lectinei în DIC.

Fundal/actualitate:

Aşa cum se descrie mai sus, blocarea MASP-2 inhibă activarea căii lectinei şi reduce generarea ambelor anafilatoxine: C3a şi C5a. Anafilatoxinele C3a s-au dovedit a fi agenţi de agregare puternici ai trombocitelor in vitro, dar implicarea lor in vivo este mai puţin bine definită, iar eliberarea de substanţe trombocitare şi plasmină în reparaţia plăgii poate implica doar secundar complementul C3. În acest exemplu rolul căii lectinei se analizează la şoarecii MASP-2(-/-) şi la şoarecii WT (+/+) pentru a se constata necesitatea creşterii îndelungate a activării C3 pentru a genera coagularea intravasculară diseminată.

Metode:

Şoarecii MASP-2 (-/-) utilizaţi în acest studiu se generează cum se descrie în Exemplul 1 şi se încrucişează reciproc timp cel puţin de 10 generaţii cu C57Bl/6.

În acest experiment se utilizează modelul de reacţie localizat Schwartzman. Reacţia Schwartzman localizată (LSR) este un răspuns indus de lipopolizaharidă (LPS), cu contribuţii bine caracterizate de elementele celulare şi umorale ale sistemului imun congenital. Dependenţa LSR de complement este bine stabilită (Polak, L. et al., Nature 223: 738-739 (1969); Fong J. S. et al., J Exp Med 134: 642-655 (1971)). În modelul LSR, şoarecii se vaccinează timp de 4 ore cu TNF alfa (500 ng, intrascrotal), apoi şoarecii se anesteziază şi se preparară pentru microscopia intravitală a muşchiului cremaster. Pentru observare se selectează reţelele de venule postcapilare (cu diametrul de 15-60 µm) cu flux sanguin bun (1-4 mm/s). Animalele se tratează cu anticorpi fluorescenţi pentru marcarea selectivă a neutrofilelor sau trombocitelor. Reţeaua de vase se scanează secvenţial şi imaginile tuturor vaselor din analizele ulterioare se înregistrează digital. După înregistrarea stării bazale a microcirculaţiei, şoarecilor se administrează o singură injecţie intravenoasă de LPS (100 µg), fie singură, fie cu agenţii enumeraţi în continuare. Aceeaşi reţea de vase se scanează la fiecare 10 minute timp de 1 oră. Acumularea specifică de fluorofori se identifică prin reducerea fluorescenţei de fundal şi amplificarea imaginii de prag. Intensitatea reacţiilor se măsoară în imaginile înregistrate. Măsura primară a reacţiilor Schwartzman sunt datele agregate.

În studii se compară şoarecii de tip MASP-2 +/+ suficienţi sau şoarecii de tip sălbatic expuşi la un agent de diminuare a activării căii complementului cunoscut, la factorul din venin de cobră (CVF) sau la un inhibitor al activării componentelor terminale ale complementului (antagonistul C5aR). Rezultatele (fig.16A) demonstrează, că atât CVF, cât şi antagonistul C5aR împiedică apariţia agregatelor în reţeaua de vase. În plus, şoarecii MASP-2 -/- deficienţi (fig.16B) se caracterizează, de asemenea, prin inhibarea completă a reacţiei Schwartzman localizate, susţinând implicarea căii lectinei. Aceste rezultate demonstrează clar rolul MASP-2 în generarea DIC şi susţin utilizarea inhibitorilor MASP-2 pentru tratamentul şi prevenirea DIC.

EXEMPLUL 16

Acest exemplu descrie analiza şoarecilor MASP-2 (-/-) într-un model experimental de transplant renal murin.

Fundal/actualitate:

Rolul MASP-2 în rezultatul funcţional al transplantului de rinichi se evaluează utilizând un model experimental murin.

Metode:

Rezultatul funcţional al transplantului de rinichi se evaluează utilizând o singură izogrefă de rinichi la şoarecii recipienţi uninefrectomizaţi, cu şase şoareci recipienţi de transplant WT (+/+) (B6) şi şase şoareci recipienţi de transplant MASP-2 (-/-). Pentru a evalua funcţia rinichiului transplantat, rinichiul nativ rămas se îndepărtează de la recipient peste 5 zile după transplant şi funcţia renală se evaluează 24 de ore mai târziu prin măsurarea nivelelor de azot ureic din sânge (BUN).

Rezultate:

Fig. 17 ilustrează grafic nivelurile de azot ureic în sânge (BUN) ale rinichiului la 6 zile după transplantul de rinichi la şoarecii recipienţi WT (+/+) şi la şoarecii recipienţi MASP-2 (-/-). După cum se arată în fig. 17, la recipienţii cu transplant WT (+/+) (B6) se observă valori înalte ale BUN (nivelurile normale de BUN la şoareci constituie <5 mM), indicând insuficienţă renală. În contrast, şoarecii MASP-2 (-/-) recipienţi de izogrefă prezentau niveluri semnificativ mai reduse de BUN, ceea ce sugerează ameliorarea funcţiei renale. Se remarcă faptul, că aceste rezultate se obţin utilizând grefe de la donatorii de rinichi WT (+/+), sugerând că absenţa numai a căi lectinei funcţionale la recipientul transplantului este suficientă pentru a obţine un beneficiu terapeutic.

Luate împreună, aceste rezultate indică faptul, că inhibarea tranzitorie a căii lectinei prin inhibarea MASP-2 reprezintă o metodă de reducere a morbidităţii şi a funcţiei de grefă întârziată în transplantul renal şi că această abordare este, probabil, utilă în alte cazuri de transplant.

EXEMPLUL 17

Acest exemplu demonstrează că şoarecii MASP-2 (-/-) sunt rezistenţi la şocul septic într-un model experimental de peritonită septică polimicrobiană murină.

Fundal/actualitate:

Pentru a evalua efectele potenţiale ale MASP-2 (-/-) în infecţie, se evaluează modelul de peritonită septică polimicrobiană pe un model de ligare şi puncţie cecală (CLP). Acesta se consideră a fi cel mai precis model, care imită evoluţia peritonitei septice umane. Modelul de ligare şi puncţie cecală (CLP) este un model în care cecul este ligat şi perforat cu un ac, conducând la pătrunderea continuă a bacteriilor în cavitatea abdominală, care ajung în sânge prin drenaj limfatic şi apoi se distribuie în toate organele abdominale, conducând la insuficienţă multiorganică şi şoc septic (Eskandari et al., J Immunol 148 (9): 2724-2730 (1992)). Modelul CLP mimează evoluţia sepsisului, observat la pacienţi, şi induce un răspuns hiperinflamator precoce, urmat de o fază hipoinflamatoare pronunţată. În această fază, animalele sunt foarte sensibile la provocările bacteriene (Wichterman et al., J. Surg. Res. 29(2):189-201 (1980)).

Metode: Mortalitatea în infecţia polimicrobiană utilizând modelul de ligare şi puncţie cecală (CLP) se măsoară la şoarecii WT (+/+) (n = 18) şi la şoarecii MASP-2 (-/-) (n = 16). Succint, şoarecii MASP-2 deficienţi şi şoarecii unipari de tip sălbatic se anesteziază şi cecul se exteriorizează şi se leagă cu 30% mai sus de capătul distal. După aceea, cecul se perforează o dată cu un ac cu diametru de 0,4 mm. Cecul apoi se introduce în cavitatea abdominală şi pielea se prinde cu cleme. Supravieţuirea şoarecilor supuşi CLP se monitorizează timp de o perioadă de 14 zile după CLP. Peste 16 ore după CLP se colectează un lavaj peritoneal pentru a măsura încărcătura bacteriană. Se prepară diluţii în serie de lavaj peritoneal în PBS şi se inoculează pe plăci Mueller-Hinton cu incubare ulterioară la 37°C în condiţii anaerobe timp de 24 ore după care se determină încărcarea bacteriană.

Peste 16 ore după CLP la şoarecii WT (+/+) şi la şoarecii MASP-2 (-/-) se măsoară, de asemenea, răspunsul citokinelor al factorului necrozei tumorii alfa (TNF-alfa) la infecţia bacteriană în plămâni şi în splină prin reacţia cantitativă de polimerizare în lanţ în timp real (qRT-PCR ). Nivelul seric de TNF-alfa peste 16 ore după CLP la şoarecii WT (+/+) şi şoarecii MASP-2 (-/-) se cuantifică, de asemenea, prin ELISA sandwich.

Rezultate: Fig. 18 ilustrează grafic procentul supravieţuirii animalelor tratate cu CLP în funcţie de numărul de zile după procedura CLP. După cum se arată în fig. 18, deficienţa căii lectinei la şoarecii MASP-2 (-/-) nu sporeşte mortalitatea şoarecilor după infecţia polimicrobiană în modelul de ligare şi puncţie cecală, comparativ cu şoarecii WT (+/+). Cu toate acestea, aşa cum se arată în fig. 19, şoarecii MASP-2 (-/-) prezintă o încărcătură bacteriană semnificativ mai mare (aproximativ o creştere de 1000 de ori a numărului de bacterii) în lavajul peritoneal după CLP, comparativ cu animalele unipare de tip WT (+/+). Aceste rezultate atestă, că şoarecii MASP-2 (-/-) deficienţi sunt rezistenţi la şocul septic. Eliminarea redusă a bacteriilor la şoarecii MASP-2 deficienţi în acest model se datorează unei fagocitoze mediate de C3b, deoarece s-a demonstrat că depunerea C3 este dependentă de MASP-2.

S-a determinat, că răspunsul citokinelor TNF-alfa la infecţia bacteriană nu creşte la şoarecii MASP-2 (-/-), comparativ cu şoarecii de control WT (+/+) (datele nu sunt prezentate). De asemenea, s-a constatat, că există o concentraţie serică semnificativ mai mare de TNF-alfa la şoarecii WT (+/+) peste 16 ore după CLP, în contrast cu şoarecii MASP-2 (-/-), la care nivelul seric de TNF-alfa rămâne aproape neschimbat. Aceste rezultate sugerează, că răspunsul inflamator intens la starea septică este diminuat la şoareci MASP-2 (-/-) ce permite animalelor să supravieţuiască în prezenţa unui număr mai mare de bacterii.

Luate împreună, aceste rezultate demonstrează efectele potenţial dăunătoare ale influenţei calea lectinei de activare a complementului în cazul septicemiei şi creşterea mortalităţii la pacienţii cu sepsis generalizat. Aceste rezultate demonstrează în continuare că deficienţa MASP-2 modulează răspunsul imun inflamator şi reduce nivelurile de expresie ale mediatorilor inflamatori în timpul sepsisului. Prin urmare, se consideră, că inhibarea MASP-2 (-/-) prin administrarea anticorpilor monoclonali inhibitori împotriva MASP-2 ar fi eficientă pentru a reduce răspunsul inflamator la un subiect care suferă de şoc septic.

EXEMPLUL 18

Acest exemplu descrie analiza şoarecilor MASP-2 (-/-) într-un model experimental de infecţie intranazală murină.

Fundal/actualitate:

Pseudomonas aeruginosa este un patogen bacterian uman gram-negativ, care provoacă o gamă largă de infecţii, în special la persoanele cu sistemul imun compromis. Este o sursă majoră de infecţii nosocomiale dobândite, în special de pneumonie intraspitalicească. De asemenea, este responsabilă pentru morbiditatea şi mortalitatea semnificativă la pacienţii cu fibroză chistică (CF). Infecţia pulmonară cu P. aeruginosa se caracterizează printr-o recrutare neutrofilă puternică şi inflamaţie pulmonară semnificativă, care rezultă cu o leziune tisulară extensivă (Palanki M. S. et al., J. Med., Chem 51: 1546-1559 (2008)).

În acest exemplu se efectuează un studiu pentru a determina dacă eliminarea căii lectinei la şoarecii MASP-2 (-/-) măreşte susceptibilitatea şoarecilor la infecţii bacteriene.

Metode: Douăzeci şi doi de şoareci WT (+/+), douăzeci şi doi de şoareci MASP-2 (-/-) şi unsprezece şoareci C3 (-/-) se provoacă prin administrare intranazală de tulpină bacteriană P. aeruginosa. Şoarecii se monitorizează în cele şase zile post-infecţie şi se construiesc diagramele Kaplan-Mayer, care arată procentul supravieţuirii.

Rezultate:

Fig. 20 este o diagramă a procentului de supravieţuire Kaplan-Mayer a şoarecilor WT (+/+), şoarecilor MASP-2 (-/-) sau şoarecilor C3 (-/-) peste şase zile după infecţie. După cum se arată în fig. 20, nu se observă diferenţe între şoarecii MASP-2 (-/-) şi şoarecii WT (+/+). Cu toate acestea, îndepărtarea căii clasice (C1q) la şoarecii C3 (-/-) conduce la o susceptibilitate severă la infecţiile bacteriene. Aceste rezultate demonstrează, că inhibarea MASP-2 nu creşte susceptibilitatea la infecţii bacteriene, indicând că este posibilă reducerea complicaţiilor inflamatorii indezirabile la pacienţii cu traumă prin inhibarea MASP-2 fără a compromite capacitatea pacientului de a lupta împotriva infecţiilor utilizând calea clasică a complementului.

EXEMPLUL 19

Acest exemplu descrie analiza farmacodinamică pentru fragmentele Fab2 de anticorpi anti-MASP-2 reprezentativi cu afinitate înaltă, identificaţi cum se descrie în Exemplul 10.

Fundal/actualitate:

Cum se descrie în Exemplul 10, în scopul de a identifica anticorpi cu afinitate înaltă, care blochează calea lectinei la şobolani, se utilizează proteina MASP-2 de şobolan pentru căutarea într-un display de fagi al bibliotecii anticorpilor. Această bibliotecă este concepută pentru a asigura o diversitate imunologică mare, fiind construită utilizând numai secvenţe genice de imunoglobină umană. Cum se descrie în exemplul 10, în rezultatul screeningului prin metoda ELISA se identifică aproximativ 250 de clone individuale de fagi, care se leagă cu afinitate înaltă cu proteina MASP-2 de şobolan. Secvenarea acestor clone a permis identificarea a 50 de fagi unici, care codifică anticorpul MASP-2. Din aceste clone se exprimă proteina Fab2, se purifică şi se analizează pentru afinitatea de legare MASP-2 şi inhibarea funcţională a căii lectinei a complementului.

Aşa cum se arată în Tabelul 6 din Exemplul 10, în rezultatul acestei analize se identifică 17 fragmente Fab2 de anticorpi anti-MASP-2 cu activitate de blocare funcţională (cu un coeficient de eficienţă al căutării anticorpilor blocanţi de 34%). Inhibarea funcţională a căii lectinei a complementului cu Fab2 se detectează după nivelul depunerii C4, care este un indicator direct al scindării C4 la acţiunea MASP-2. Foarte important, este că inhibarea în aceeaşi măsură se confirmă şi la evaluarea activităţii convertazei C3, ceea ce demonstra blocarea funcţională a căii lectinei a complementului. Cele 17 Fab2, care blochează MASP-2, identificate, cum se descrie în Exemplul 10, inhibă puternic formarea convertazei C3 cu valori IC50 egale sau mai mici de 10 nM. Opt din cele 17 Fab2 identificate au valori IC50 în domeniul sub-nanomolar. Mai mult decât atât, toate cele 17 Fab2s, care blochează MASP-2, manifestă inhibarea în esenţă completă a formării convertazei C3 în testul de convertază C3 în calea lectinei, aşa cum se arată în fig.8A-C şi rezumate în Tabelul 6 din Exemplul 10. Mai mult decât atât, fiecare din 17 Fab2 de blocare anti-MASP-2, prezentate în Tabelul 6, inhibă puternic generarea de C3b (> 95%), demonstrând astfel specificitatea acestui test pentru convertaza C3 a căii lectinei.

Variante IgG2c de şobolan şi izotip de anticorp cu lungime completă IgG2a de şoarece derivă din Fab2 # 11. Acest exemplu descrie caracterizarea parametrilor farmacodinamici in vivo ale acestor izotipuri.

Metode:

Cum se descrie în exemplul 10, proteina MASP-2 de şobolan se utilizează pentru căutarea Fab în display-ul de fagi din biblioteca anticorpilor, din care se identifică Fab2 # 11. Din Fab2 # 11 se obţin variantele de IgG2c de şobolan şi variantele IgG2a de şoarece ale izotipurilor de anticorp cu lungime completă. Atât la izotipurile de anticorpi cu lungime completă IgG2c de şobolan, cât şi la IgG2a de şoarece s-au determinat caracteristicile pentru parametrii farmacodinamici in vivo după cum urmează.

Studiul in vivo la şoareci:

Pentru a studia efectul dozării anticorpilor anti-MASP-2 asupra activităţii căii lectinei în plasma in vivo s-a efectuat un studiu farmacodinamic la şoareci. În acest studiu depunerea C4 se măsoară ex vivo într-o analiză a căii lectinei la diferite intervale de timp după administrarea subcutanată (sc) şi intraperitoneală (ip) a 0,3 mg/kg sau 1,0 mg/kg de MoAb anti MASP-2 de şoarece (izotip de anticorp cu lungime completă IgG2a de şoarece, derivat din Fab2 # 11).

FIG. 21 ilustrează grafic depunerea C4b specifică în calea lectinei, măsurată ex vivo în probele de ser nediluat prelevate de la şoareci (n = 3 şoareci/grup) la intervale diferite de timp după administrarea subcutanată a 0,3 mg/kg sau 1,0 mg/kg de MoAb anti-MASP-2. Probele de ser, colectate de la şoareci înainte de administrarea anticorpului, au servit ca martori negativi (activitate 100%), în timp ce serul suplimentat in vitro cu 100 nM de acelaşi anticorp blocant anti MASP-2 a fost utilizat drept control pozitiv (activitate 0%).

Rezultatele prezentate în FIG. 21 demonstrează o inhibare rapidă şi completă a depunerii de C4b după administrarea subcutanată a dozei de 1,0 mg/kg de MoAb anti-MASP-2 de şoarece. O inhibare parţială a depunerii de C4b se observă după administrarea subcutanată a dozei de 0,3 mg/kg de MoAb anti-MASP-2 de şoarece.

Recuperarea căii lectinei continue timp de trei săptămâni după o singură administrare la şoareci a 0,6 mg/kg de MoAb anti-MASP-2. După cum se arată în fig. 22, o scădere semnificativă a activităţii căii lectinei apare după administrarea anticorpilor, urmând, apoi, inhibarea completă a căii lectinei, care durează aproximativ 7 zile după administrarea intraperitoneală. Restabilirea lentă a căii lectinei se observă în timpul săptămânii a doua şi a treia cu restabilirea completă a căii lectinei la şoareci peste 17 zile după administrarea anticorpului monoclonal murin (MoAb) anti-MASP-2.

Aceste rezultate demonstrează, că Moab anti-MASP-2 de şoarece, derivat din Fab2 # 11, când se administrează sistemic inhibă calea lectinei la şoareci într-o manieră dependentă de doză.

EXEMPLUL 20

Acest exemplu descrie analiza eficienţei Moab anti-MASP-2 de şoarece, derivat din Fab2 # 11, într-un model experimental pe şoareci cu degenerescenţă maculară legată de vârstă.

Fundal/actualitate:

Cum se descrie în exemplul 10, proteina MASP-2 de şobolan se utilizează pentru a căuta în display-ul de fagi din biblioteca anticorpilor, din care a fost identificat Fab2 # 11 ca fiind un anticorp activ funcţional. Din Fab2 # 11 se generează izotipuri ai anticorpilor IgG2c de şobolan şi IgG2a de şoarece cu lungime completă. Parametrii farmacodinamici ai izotipului anticorpului cu lungime completă anti-MASP-2 de IgG2a murină se caracterizează cum se descrie în Exemplul 19. În acest exemplu, anticorpul cu lungime completă anti-MASP-2, derivat din Fab2 # 11, se analizează într-un model experimental pe şoareci de degenerescenţă maculară asociată vârstei (AMD), descris de Bora P.S. et al, J Immunol 174:491-497 (2005).

Metode: Izotipul anticorpului cu lungime completă IgG2a de şoarece, derivat din Fab2 # 11, cum se descrie în Exemplul 19, se testează într-un model experimental murin cu degenerescenţă maculară legată de vârstă (AMD), aşa cum se descrie în Exemplul 13 cu următoarele modificări .

Administrarea MoAb anti-MASP-2 de şoarece

Două doze diferite (0,3 mg/kg şi 1,0 mg/kg) de MoAb anti-MASP-2 de şoarece, în asociere cu tratarea cu MoAb pentru controlul de izotip, se administrează intraperitoneal la şoareci WT (+/+) cu 16 ore înainte de inducerea CNV

Inducerea neovascularizării coroide (CNV)

Inducerea neovascularizării coroidale (CNV) şi măsurarea volumului CNV se realizează utilizând fotocoagularea cu laser, cum se descrie în Exemplul 13.

Rezultate:

Fig. 23 ilustrează grafic suprafaţa CNV, măsurată peste 7 zile după leziunea cu laser, la şoarecii trataţi fie cu MoAb pentru controlul de izotip, sau cu MoAb anti-MASP-2 de şoarece (0,3 mg/kg şi 1,0 mg/kg). După cum se relevă din fig. 23, la şoarecii pre-trataţi cu 1,0 mg/kg MoAb anti-MASP-2, peste şapte zile după tratamentul cu laser se observă o reducere statistic semnificativă (p <0,01) de aproximativ 50% a CNV. După cum se arată în continuare în fig. 23, se observă că doza de 0,3 mg/kg de MoAb anti-MASP-2 nu este eficientă în reducerea CNV. Este de notat faptul, că doza de 0,3 mg/kg de MoAb anti-MASP-2 cauzează o inhibare parţială şi tranzitorie a depunerii de C4b, ca urmare a administrării subcutanate, aşa cum se descrie în exemplul 19 şi se prezintă în fig. 21.

Rezultatele descrise în acest exemplu demonstrează, că blocarea MASP-2 cu un inhibitor, cum ar fi MoAb anti-MASP-2, are un efect preventiv şi/sau terapeutic în tratamentul degenerescenţei maculare. Se constată, că aceste rezultate sunt în concordanţă cu rezultatele observate în studiul efectuat la şoarecii MASP-2 (-/-), descris în exemplul 13, în care peste 7 zile după tratamentul cu laser se observă o reducere de 30% a CNV la şoarecii MASP-2 (-/-), comparativ cu şoarecii de control de tip sălbatic. Mai mult decât atât, rezultatele din acest exemplu demonstrează în continuare că anticorpul anti-MASP-2 furnizat sistemic oferă un beneficiu terapeutic local în ochi, evidenţiind astfel eficienţa metodei sistemice de administrare pentru tratamentul pacienţilor cu AMD. Astfel, aceste rezultate sunt o dovadă a posibilităţii utilizării MoAb anti-MASP-2 în tratamentul AMD.

EXEMPLUL 21

Acest exemplu demonstrează, că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi de mortalitatea indusă de Neisseria meningitidis după infecţie cu N. meningitidis şi au un clearance crescut al bacteremiei, în comparaţie cu şoarecii de control de tip sălbatic.

Actualitate: Neisseria meningitidis este o bacterie diplococică gram-negativă heterotrofică cunoscută pentru rolul ei în meningită şi în alte forme de boală meningococică, cum ar fi meningococcemia. N. meningitidis este o cauză majoră de morbiditate şi mortalitate în perioada copilăriei. Complicaţiile severe includ septicemia, sindromul Waterhouse-Friderichsen, insuficienţa suprarenală şi coagularea intravasculară diseminată (DIC). (de exemplu, Rintala E. et al., Critical Care Medicine 28 (7): 2373-2378 (2000). În acest exemplu rolul căii lectinei se analizează la şoarecii MASP-2 (-/-) şi WT (+/+) pentru a vedea dacă şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt sensibili la mortalitatea indusă de N. meningitidis.

Metode: Şoarecii cu knock-out MASP-2 se generează cum se descrie în Exemplul 1 şi se încrucişează reciproc timp cel puţin de 10 generaţii cu şoarecii din linia C57Bl/6. La şoarecii MASP-2 KO (n = 10) şi la şoarecii de tip sălbatic C57/B6 (n = 10) de zece săptămâni se inoculează prin administrare intravenoasă o doză de 5x108 UFC/100 µl, 2x108 UFC/100 µl sau 3x107 UFC/100 µl de Neisseria meningitidis serogrupa A Z2491 în 400 mg/kg dextran de fier. Supravieţuirea şoarecilor după infecţie se monitorizează timp de 72 de ore. Probele de sânge se colectează de la şoareci la intervale de o oră după infectare şi se analizează pentru a determina nivelul seric (log UFC/ml) de N. meningitidis pentru a confirma infectarea şi a pentru a determina rata de eliminare a bacteriilor din ser.

Rezultate:

Fig. 24A ilustrează grafic procentul de supravieţuire al şoarecilor MASP-2 KO şi WT după administrarea unei doze infecţioase de 5x108 UFC/100 µl N. meningitidis. După cum se arată în fig. 24A, după infectarea cu doza cea mai mare de 5x108 UFC/100 µl de N. meningitidis 100% din şoarecii MASP-2 KO au supravieţuit timp de 72 de ore după infectare. Dimpotrivă, numai 20% din şoarecii WT erau încă în viaţă peste 24 de ore după infectare. Aceste rezultate demonstrează, că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi împotriva mortalităţii induse de N. meningitidis.

Fig. 24B ilustrează grafic log UFC/ml de N. meningitidis înregistrat la diferite intervale de timp în probele de sânge prelevate de la şoareci MASP-2 KO şi WT infectaţi cu 5x108 UFC/100 µl N. meningitidis. După cum se arată în fig. 24B, la şoarecii WT nivelul de N. meningitidis din sânge atinge un vârf de aproximativ 6,5 log UFC/ml peste 24 de ore după infectare şi coboară până la zero peste 48 de ore după infectare. În contrast, la şoarecii MASP-2 KO, nivelul de N. meningitidis atinge un vârf de aproximativ 3,5 log UFC/ml peste 6 ore după infectare şi coboară până la zero peste 36 de ore după infectare.

Fig. 25A ilustrează grafic procentul supravieţuiri şoarecilor MASP-2 KO şi WT după infectarea cu 2x108 UFC/100 µl de N. meningitidis. După cum se arată în fig. 25A, după infectare cu o doza de 2x108 UFC/100 µl de N. meningitidis, 100% din şoarecii MOSP-2 KO au supravieţuit pe toată perioada de 72 de ore după infectare. Dimpotrivă, numai 80% din şoarecii WT erau încă în viaţă peste 24 de ore după infectare. Rezultatele prezentate în fig. 24A demonstrează în continuare, că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi împotriva mortalităţii induse de N. meningitidis.

FIG. 25B ilustrează grafic log UFC/ml de N. meningitidis înregistrat la diferite intervale de timp în probele de sânge prelevate de la şoarecii WT infectaţi cu 2x108 UFC/100 µl N. meningitidis. După cum se arată în fig. 25B, nivelul de N. meningitidis din sângele şoarecilor WT infectaţi cu 2x108 UFC atinge un vârf de aproximativ 4 log UFC/ml peste 12 ore după infectare şi coboară până la zero peste 24 de ore după infectare. Fig. 25C ilustrează grafic log UFC/ml de N. meningitidis înregistrat la diferite intervale de timp în probele de sânge prelevate de la şoarecii MOSP-2 KO infectaţi cu 2x108 UFC/100 µl N. meningitidis. După cum se arată în fig. 25C, nivelul de N. meningitidis din sângele şoarecilor MOSP-2 KO infectaţi cu 2x108 UFC atinge un nivel de vârf de aproximativ 3,5 log UFC/ml peste 2 ore după infectare şi coboară până la zero peste 3 ore după infectare. Rezultatele prezentate în fig. 24B demonstrează că, deşi şoarecii MASP-2 KO au fost infectaţi cu aceeaşi doză de N. meningitides, ca şi şoarecii WT, şoarecii MOSP-2 KO au avut o îmbunătăţire a clearance-ului bacteremiei, comparativ cu şoarecii WT.

Procentul de supravieţuire al şoarecilor MASP-2 KO şi WT după infectarea cu cea mai mică doză de 3x107 UFC/100 µl N. meningitidis constituie 100% peste 72 de ore (datele nu sunt prezentate).

Discuţii

Aceste rezultate atestă, că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi împotriva mortalităţii induse de N. meningitidis şi au un clearance îmbunătăţit al bacteremiei, comparativ cu şoarecii WT. Prin urmare, având în vedere aceste rezultate, este de aşteptat ca aplicarea terapeutică a inhibitorilor MASP-2, cum ar fi MoAb anti-MASP-2, să fie eficientă pentru tratarea, prevenirea sau atenuarea efectelor infecţiei cu bacterii N. meningitides (adică, sepsis şi DIC). Mai mult decât atât, aceste rezultate arată, că aplicarea terapeutică a inhibitorilor MASP-2, cum ar fi MoAb anti-MASP-2, nu predispune subiectul la un risc crescut de a dezvolta infecţii cu N. meningitidis.

EXEMPLUL 22

Acest exemplu descrie descoperirea unei noi căi a lectinei, căii alternative mediate şi dependente de MASP-2 de activare a C4 a complementului C3.

Actualitate:

Beneficiul terapeutic principal din utilizarea inhibitorilor activării complementului pentru a limita leziunea miocardului în rezultatul ischemiei/reperfuziei (MIRI) s-a demonstrat în mod convingător într-un model experimental de infarct miocardic la şobolani în urmă cu două decenii. sCR1 recombinant, un derivat trunchiat solubil al receptorului complementului de suprafaţă celulară de tip 1 (CR1), s-a administrat intravenos, efectul fiind evaluat pe un model experimental in vivo la şobolanii cu MIRI. Tratamentul cu sCR1 a redus volumul infarctului cu mai mult de 40% (Weisman, H.F., et al, Science 249: 146-151 (1990)). Potenţialul terapeutic al acestui inhibitor recombinant a fost ulterior demonstrat într-un studiu clinic, care arată ca administrarea sCR1 la pacienţii cu MI previne insuficienţa contractilă în cordul post-ischemic (Shandelya, S., et al., Circulation 87: 536-546 (1993)). Mecanismul principal, care conduce la activarea complementului în ţesutul ischemic, cu toate acestea, nu a fost elucidat complet, în mare parte din cauza lipsei unor modele experimentale adecvate, înţelegerea limitată a proceselor moleculare, care conduc la activarea complementului în celulele lipsite de oxigen şi influenţiei reciproce şi sinergismului dintre diferite căi de activare a complementului.

În calitate de component fundamental al răspunsului imun, sistemul complementului asigură protecţie împotriva microorganismelor invadatoare prin ambele mecanisme: dependent şi independent de anticorpi. El dirijează multiple interacţiuni celulare şi umorale în răspunsul imun, inclusiv chemotaxia, fagocitoza, adeziunea celulară şi diferenţierea celulelor B. Trei căi diferite iniţiază cascada complementului: calea clasică, calea alternativă şi calea lectinei. C1q subcomponenta de recunoaştere a căii clasice se leagă cu o varietate de ţinte - complexe imune mai importante - pentru a iniţia activarea etapizată a serin proteazelor asociate, C1r şi C1s, asigurând mecanismul principal de eliminare a patogenului şi complexului imun după iniţierea acţiunii sistemului imun adaptiv. Legarea C1q cu complexele imune transformă dimerul zimogenului C1r în forma sa activă pentru a scinda şi, prin aceasta, a activa C1s. C1s translează legarea în activarea complementului C1q în două etape de scindare: se transformă mai întâi C4 în C4a şi C4b şi apoi scindează C2 legat cu C4b cu formarea convertazei C3 - C4b2a. Acest complex transformă componentul C3, prezent în exces în plasma, în C3a şi C3b. Acumularea de C3b în imediata apropiere a complexului C4b2a modifică specificitatea substratului pentru C3 pe C5 cu formarea convertazei C5 C4b2a (C3b)n. Complexele convertazei C3 şi C5, generate prin activarea căii clasice, sunt identice cu complexele, generate în rezultatul activării căii lectinei. In calea alternativă hidroliza spontană cu nivel redus al componentei C3 rezultă cu depunerea fragmentelor de proteine pe suprafeţele celulelor, iniţiind activarea complementului pe celulele străine, în timp ce proteinele de reglatoare legate cu celulele pe ţesuturile organismului gazdă previn activarea, prevenind astfel auto-deteriorarea. Asemenea căii alternative, calea lectinei poate fi activată în absenţa complexelor imune. Activarea este iniţiată prin legarea complexului multimolecular de activare a căii lectinei cu modele moleculare patogen-asociate (PAMP), în general, cu structuri de carbohidraţi, prezente pe agenţii patogeni bacterieni, fungici sau virali sau cu modele de glicozilare aberante pe celulele apoptotice, necrotice, maligne sau lipsite de oxigen (Collard, C.D., et al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556 (2000); Walport, M.J., N. Engl. J. Med. 344:1058-1066 (2001); Schwaeble, W., et al., Immunobiology 205:455-466 (2002); and Fujita, T., Nat. Rev. Immunol. 2:346-353 (2002)).

Lectina fixatoare de manan (MBL) a fost primul subcomponent de recunoaştere a carbohidraţilor, care a format complexe cu o grupă de serin proteaze noi, denumite serin proteaze asociate-MBL (MASP) şi numerotate în funcţie de ordinea de descoperire a acestora (adică MASP-1, MASP-2 şi MASP-3). La om, complexele de activare a căii lectinei pot fi formate cu patru subcomponente alternative de recunoaştere a carbohidraţilor cu specificităţi diferite de legare a carbohidraţilor, adică cu MBL 2 şi cu trei reprezentanţi diferiţi ai familiei ficolinelor, şi anume L-Ficolină, H-ficolină şi M-ficolină şi MASP. Două forme de MBL, MBL A şi MBL C, şi ficolina-A formează complexe de activare a căii lectinei cu MASP în plasma de şoarece şi şobolan. Anterior a fost clonat şi caracterizat MASP-2 şi un produs suplimentar trunchiat al genei MASP-2 cu masa de 19 kDa, denumit MAp19 sau sMAP, la om, şoarece şi şobolan (Thiel, S. Et al., Nature 386: 506-510 (1997), Stover, C.M., et al., J. Immunol 162: 3481-3490 (1999), Takahashi, M. Et al., Int. Immunol 11: 859-863 (1999) şi Stover, C.M., et al., J. Immunol., 163: 6848-6859 (1999)). MAp19/sMAP este lipsit de activitate de protează, dar poate regla activarea căii lectinei prin concurenţă pentru legarea MASP cu complexele de recunoaştere a carbohidraţilor (Iwaki, D. et al., J. Immunol. 177:8626-8632 (2006)).

Există dovezi care sugerează că, din cele trei MASP, numai MASP-2 este necesară pentru a transla legarea complexelor de recunoaştere a căii lectinei în activarea complementului (Thiel, S. Et al., 1997); Vorup-Jensen, T. Et al., J. Immunol., 165: 2093-2100 (2000); Thiel, S. Et al., J. Immunol., 165: 878-887 (2000), Rossi, V. Et al., J. Biol. Chem., 276: 40880-40887 (2001)). Această concluzie este confirmată de fenotipul unei tulpini de şoarece, descrise cel mai recent, cu deficienţă de MASP-1 şi MASP-3. În afară de o întârziere în declanşarea activării complementului, mediate de calea lectinei, in vitro, şoarecii cu deficit de MASP-1/3 menţin activitatea funcţională a căii lectinei. Reconstituirea serului cu deficit de MASP-1 şi MASP-3 cu MASP-1 recombinant permite de a depăşi această întârziere la activarea căii lectinei, ceea ce înseamnă că MASP-1 poate facilita activarea MASP-2 (Takahashi, M. Et al., J. Immunol. 6132-6138 (2008)). Un studiu recent a arătat, că MASP-1 (şi, probabil, şi MASP-3) este necesar pentru a transforma factorul D de transformare a enzimei de activare a căii alternative din forma sa zimogenă în forma sa activă enzimatic (Takahashi, M. Et al., J. Exp Med 207: 29-37 (2010)). Importanţa fiziologică a acestui proces este subliniată de absenţa activităţii funcţionale a căii alternative în plasma şoarecilor cu deficit de MASP-1/3.

Tulpinile de şoarece, generate recent, cu deficienţe combinate ţintite ale subcomponentelor de recunoaştere a carbohidraţilor căii lectinei MBL A şi MBL C mai pot încă iniţia activarea căii lectinei prin subcomponentul restant de recunoaştere a ficolinei A a căii lectinei murine - (Takahashi, K., et al., Microbes Infect. 4: 773-784 (2002)). Absenţa oricărei activităţi funcţionale reziduale a căii lectinei la şoarecii cu deficit de MASP-2 permite de a crea un model concludent pentru a studia rolul acestui grup efector al imunităţii umorale înnăscute în sănătate şi în boală.

Disponibilitatea tulpinilor de şoareci cu deficit de C4 şi MASP-2 a permis de a defini o cale a lectinei nouă specifică, dar dependentă de MASP-2, calea alternativă de activare a C4 a complementului C3. Contribuţia esenţială a acestei noi căi a lectinei, mediate de activarea alternative a C4, în pierderea post-ischemică a ţesutului este confirmată de fenotipul protectiv proeminent al deficienţei MASP-2 în MIRI, în timp ce şoarecii cu deficit de C4, testaţi în acelaşi model, nu prezintă protecţie.

În acest exemplu, se descrie o nouă cale a lectinei, mediată şi dependentă de MASP-2, o cale alternativă de activare a C4 a complementului C3. Relevanţa fiziologică a acestei noi căi de activare este stabilită în baza fenotipului de protecţie al deficienţei MASP-2 într-un model experimental de leziune a miocardului în rezultatul ischemiei/reperfuziei (MIRI), în care animalele cu deficit de C4 nu au fost protejate.

Metode:

Şoarecii cu deficit de MASP-2 nu prezintă anomalii majore. Şoarecii cu deficit de MASP-2 se generează cum se descrie în Exemplul 1. Atât şoarecii heterozigoţi (+/-), cât şi homozigoţi (-/-) cu deficit de MASP-2 sunt sănătoşi şi fertili şi nu prezintă anomalii majore. Speranţa lor de viaţă este similară cu cea a animalelor unipare WT (> 18 luni). Înainte de a studia fenotipul acestor şoareci în modele experimentale de boală, şoarecii din linia MASP-2 -/- se încrucişează reciproc timp de unsprezece generaţii cu şoareci din linia C57BL/6. Absenţa totală de ARNm MASP-2 se confirmă prin Northern blot-ul preparatelor ARN hepatic selectate de poli A+, în timp ce ARNm de 1,2kb, care codifică MAp19 sau sMAP (un produs alternativ trunchiat al splicingului genei MASP2) este exprimat în exces.

Analiza prin metoda cantitativă a reacţiei de polimerază în lanţ (qRT-PCR), utilizând perechi de primer specifici fie pentru secvenţa de codificare pentru domeniul serin proteazei al MASP-2 (lanţul B), fie pentru restul secvenţei de codificare pentru lanţul A, relevă că nu este detectabil nici un ARNm care codifică lanţul B în MASP-2 -/-, în timp ce excesul lanţului A perturbat al transcriptului ARNm a crescut semnificativ. În mod similar, excesul de MAp19/sMAP, ARNm codificator, creşte la şoareci MASP-2 +/- şi şoarecii MASP-2 -/-. Nivelurile plasmatice de MASP-2, determinate prin metoda ELISA pentru 5 animale din fiecare genotip, constituie 300 ng/ml pentru controlurile WT (interval 260-330 ng/ml), 360 ng/ml pentru şoareci heterozigoţi (interval 330-395 ng/ml) şi nedetectabile la şoarecii MASP-2 -/-. Folosind qRT-PCR s-au stabilit profiluri de expresie ARNm, demonstrând că şoarecii MASP-2 -/- exprima ARNm pentru MBL A, MBL C, ficolină A, MASP-1, MASP-3, C1q, C1rA, C1sA, Factorul B, Factorul D, C4 şi C3 într-un exces asemănător cu cel la animalele unipare cu MASP-2 suficient (datele nu sunt prezentate).

Nivelurile de C3 în plasmă la animalele unipare MASP-2-/- (n=8) şi MASP-2+/+ (n=7) se măsoară utilizând kitul C3 ELISA murin comercial disponibil (Kamiya, Biomedical, Seattle, WA). Nivelurile de C3 la şoarecii cu deficit de MASP-2 (valoarea medie de 0,84 mg/ml, ± 0,34) sunt similare cu cele înregistrate la şoarecii WT de control (valoarea medie 0,92, ± 0,37).

Rezultate.

MASP-2 este esenţial pentru activitatea funcţională a căii lectinei.

Cum se descrie în exemplul 2 şi se arată în fig. 5, analizele in vitro ale plasmei MASP-2 -/- relevă o absenţă totală a activităţii funcţionale a căii lectinei pe suprafeţele activate acoperite cu manan şi zimosan pentru activarea C4. De asemenea, în plasma MASP-2 -/- pe suprafeţele acoperite cu N-acetilglucozamină, care se leagă şi declanşează activarea prin MBL A, MBL C şi ficolină A (nu sunt prezentate datele), nu se detectează nici o scindare a C4 sau aC3 dependentă de calea lectinei.

Analizele serului şi ale plasmei şoarecilor MASP-2 -/- demonstrează clar, că MASP-2 este necesar în mod esenţial pentru activarea complementului prin calea lectinei. Deficitul total al activităţii funcţionale a căii lectinei, totuşi, lasă celelalte căi de activare a complementului intacte. Plasma MASP-2 -/- poate încă activa complementul prin calea clasică (fig.26A) şi calea alternativă (fig.26B). În fig. 26A şi 26B, simbolul "*" indică ser de la şoareci WT (MASP-2 (+/+)); simbolul "●" indică ser de la şoareci WT (C1q epuizat); simbolul "□" indică ser de la şoareci MASP-2 (-/-) şi simbolul "δ" indică ser de la MASP-2 (-/-) (C1q epuizat).

Fig. 26A ilustrează grafic, că şoarecii MASP-2 -/- păstrează o cale clasică funcţională. Depunerea C3b s-a testat pe plăci de microtitrare acoperite cu complexe imune (generate in situ prin acoperire cu BSA, apoi adăugând IgG de capră anti-BSA). Fig. 26B ilustrează grafic, că şoarecii cu deficit de MASP-2 păstrează o cale alternativă funcţională. Depunerea C3b s-a testat pe plăci de microtitrare acoperite cu Zimosan în condiţii, care permit numai activarea căii alternative (tampon conţinând Mg2+ şi EGTA). Rezultatele, prezentate în fig. 26A şi fig. 26B, sunt valori medii din două măsurări şi, de obicei, sunt obţinute din trei experimente independente. Aceleaşi simboluri pentru datele pentru plasmă s-au utilizat în toate figurile. Aceste rezultate arată, că la şoarecii cu deficit de MASP-2 este prezentă o cale alternativă funcţională, despre care atestă rezultatele prezentate în fig. 26B în condiţii experimentale concepute pentru declanşarea directă a căii alternative, în timp ce atât calea clasică, cât şi calea lectinei sunt inactivate.

Calea lectinei de activare a complementului contribuie semnificativ la pierderea ţesutului în inflamaţie în cadrul leziunii miocardului în rezultatul ischemiei/reperfuziei (MIRI).

Pentru a studia contribuţia activităţii funcţionale a căii lectinei în MIRI, se compară şoarecii MASP-2 -/- şi animalele unipare WT de control într-un model de MIRI cauzat de ligarea tranzitorie şi reperfuzia ramificaţiei descendente anterioare stângi a arterei coronare (LAD). Prezenţa sau absenţa complementului C4 nu are nici un impact asupra gradului de pierdere a ţesutului ischemic în MIRI. S-a evaluat impactul deficienţei C4 asupra dimensiunilor infarctului după MIRI experimental. După cum se arată în fig. 27A şi fig. 27B, se observă dimensiuni de infarct identice atât la şoareci cu deficit de C4, cât şi la animalele unipare WT. Fig. 27A ilustrează grafic pierderea de ţesut indusă de MIRI după ligarea şi reperfuzia LAD la şoarecii C4 -/- (n = 6) şi la şoarecii unipari de control WT (n = 7). Fig. 27B ilustrează grafic dependenţa suprafeţei infarctului (INF) de suprafaţa zonei de risc (AAR), demonstrând în mod clar că şoarecii C4 -/- sunt la fel de susceptibili la MIRI ca şi şoarecii de control WT (linia întreruptă).

Aceste rezultate demonstrează că şoarecii cu deficit de C4 nu sunt protejaţi de MIRI. Acest rezultat a fost neaşteptat, deoarece este în conflict cu opinia larg acceptată că fragmentul principal de activare a C4, C4b, este o componentă esenţială a căii clasice şi lectinei a convertazei C3 - C4b2a. Prin urmare, s-a evaluat posibilitatea depistării activării specifice reziduale a căii lectinei a complementului C3 în plasmă murină şi umană cu deficit de C4.

Calea lectinei poate activa complementul C3 în absenţa C4 prin intermediul unei noi căi alternative de activare a C4 dependentă de MASP-2.

Bazându-se pe rezultatele cercetărilor ştiinţifice din anii precedent, care indică existenţa unei căi alternative de activare a C4 în serul de cobai cu deficit de C4 (May, J.E. şi M. Frank, J. Immunol. 111: 1671-1677 (1973)), s-a studiat prezenţa la şoarecii cu deficienţă de C4 a activităţii funcţionale reziduale a căii clasice sau a lectinei şi s-a monitorizat activarea C3 în condiţii de testare specifice ale căii, care exclud contribuţiile căii alternative.

Depunerea de C3b s-a analizat pe plăci de microtitrare acoperite cu Manan, utilizând plasmă decalcificată la concentraţii plasmatice, care împiedică activarea căii alternative (1,25% şi mai jos). Deşi nu s-a detectat nici o scindare a C3 în plasmă cu deficit de C4, testată pentru activarea căii clasice (date nereprezentate), se observă o activitate reziduală puternică de scindare a C3 în plasma şoarecilor cu deficit de C4 când se iniţiază activarea complementului prin calea lectinei. Dependenţa de calea lectinei se demonstrează prin inhibarea competitivă a scindării C3 după preincubarea diluţiilor plasmei cu deficit de C4 cu Manan solubil (fig.28A). După cum se arată în fig. 28A-D, activarea C3 dependentă de MASP-2 se observă în absenţa C4. Fig. 28A ilustrează grafic depunerea de C3b sub influenţa C4 +/+ (cruci) şi C4 -/- (cercuri necolorate) din plasmă de şoarece. Preincubarea plasmei C4 -/- cu exces de manan în fază lichidă (1 µg/ml) înainte de testare inhibă complet depunerea C3 (cercuri colorate). Rezultatele sunt obţinute în 3 experimente independente. Fig. 28B ilustrează grafic rezultatele experimentului, în care se amestecă plasmă de la şoareci (1%) de tip sălbatic, şoareci cu deficit de MASP-2 (pătrate necolorate) şi C4 -/- cu diferite concentraţii de mAbM11 anti-MASP-2 şobolan (axa absciselor) şi depunerea C3b se testează pe plăci acoperite cu Manan. Rezultatele reprezintă valorile medii (± SD) din 4 teste (câte 2 experimente paralele pentru fiecare tip de plasmă). Fig. 28C ilustrează grafic rezultatele unui experiment în care plasmă umană, combinată cu NHS (cruci), plasmă C4 -/- (cercuri necolorate) şi plasmă C4 -/- se preincubează cu 1 µg/ml Manan (cercuri colorate). Rezultatele reprezintă trei experimente independente. Fig. 28D ilustrează grafic inhibarea depunerii de C3b în plasmă umană cu C4 suficient şi cu deficit de C4 (1%) cu mAbH3 anti-MASP-2 umană (valoarea medie ± SD din trei experimente paralele). După cum se arată în fig. 28B, nu se detectează nici o activare C3 dependentă de calea lectinei în plasma MASP-2 -/-, testată în paralel, ceea ce înseamnă că această cale de activare alternativă a C3 cu C4 este dependentă de MASP-2.

Pentru a confirma în continuare aceste constatări, s-a creat o serie de mAb inhibitori recombinanţi, izolaţi din display-ul de fagi din bibliotecile de anticorpi prin screeningul afinităţii faţă de MASP-2A recombinantă umană şi de şobolan (în cazul în care reziduul de serină al domeniului proteazic activ se înlocuieşte cu un reziduu de alanină prin mutageneză de site-direcţionată pentru a preveni degradarea autolitică a antigenului). Anticorpii recombinanţi împotriva MASP-2 (AbH3 şi AbM11) se izolează din Biblioteci de combinaţii de anticorpi (Knappik, A. et al., J. Mol.Biol., 296: 57-86 (2000)), folosind MASP- 2A recombinantă umană şi de şobolan în calitate de antigene (Chen, C.B. şi Wallis, J. Biol.Chem., 276: 25894-25902 (2001)). Un fragment Fab2 anti-şobolan, care inhibă puternic activarea mediată de calea lectinei a C4 şi C3 în plasmă de şoarece (IC50 ~ 1 nM) se transformă într-un anticorp IgG2a cu lungime completă. Antiserul policlonal anti-MASP-2A murină se induce în şobolani. Aceste instrumente au permis confirmarea dependenţei de MASP-2 a acestei căi noi a lectinei, specifice pentru calea alternativă de activare a C3 cu C4, aşa cum se descrie în continuare.

După cum se arată în fig. 28B, M211, un anticorp monoclonal inhibitor care se leagă selectiv cu MASP-2 de şoarece şi de şobolan inhibă activarea alternativă cu C4 a C3 la şoareci cu deficit de C4, precum şi activarea C3 în plasma şoarecilor WT prin calea lectinei într-o manieră dependentă de concentraţie cu valori IC50 similare. Toate testele se efectuează cu diluţii plasmatice înalte, ceea ce a determinat disfuncţionalitatea căii alternative de activare (concentraţia plasmatică maximă fiind de 1,25%).

În scopul investigării prezenţei unei căi similare căii lectinei, specifice pentru activarea alternativă a C3 cu C4 la om, s-a analizat plasma unui donator cu o deficienţă congenitală de ambele gene C4 umane (adică, C4A şi C4B), rezultând cu absenţa totală a C4 (Yang, Y. et al., J. Immunol., 173: 2803-2814 (2004)). Fig. 28C arată, că plasma acestui pacient activează în mod eficient C3 în diluţii plasmatice înalte (ceea ce face calea de activare alternativă disfuncţională). Modul specific pentru calea lectinei de activare a C3 pe plăcile acoperite cu Manan se demonstrează în plasma murină cu deficit de C4 (fig.28A) şi plasmă umană cu deficit de C4 (figura 28C) prin adiţia concentraţiilor în exces de manan în fază lichidă. Dependenţa de MASP-2 a acestui mecanism de activare a C3 în plasmă umană cu deficit de C4 se evaluează utilizând AbH3, un anticorp monoclonal care se leagă în mod specific cu MASP-2 umană şi suprimă activitatea funcţională a MASP-2. După cum se arată în fig. 28D, AbH3 inhibă depunerea C3b (şi C3dg) atât în plasma umană deficientă de C4, cât şi în cea cu C4 suficient, cu activitate comparabilă.

Pentru a evalua rolul posibil al altor componente ale complementului în activarea alternativă a C3 cu C4, se testează plasma de la şoareci MASP-1/3 -/- şi Bf/C2 -/- concomitent cu plasmă MASP-2 -/-, C4 -/- şi C1q -/- (în calitate de control) atât în condiţii specifice pentru calea lectinei, cât şi pentru calea clasică. Cantitatea relativă de scindare C3 este reprezentată în raport cu cantitatea de C3 depusă la utilizarea plasmei şoarecilor WT.

Fig. 29A ilustrează grafic o analiză comparativă a activităţii convertazei C3 în plasma de la diferite tulpini de şoareci cu deficit de complement, testate în condiţii specifice atât activării căii lectinei, cât şi activării căii clasice. Probele de plasmă diluate (1%) de la şoareci WT (n = 6), şoareci MASP-2 -/- (n=4), şoareci MASP-1/3 -/- (n = 8), şoarecii C4 -/- (n=8), şoareci C4/MASP-1/3 -/- (n = 8), şoareci Bf/C2 -/- (n = 2)şi C1q -/- (n=2) se testează în paralel. Reconstituirea plasmei Bf/C2 -/- cu 2,5 µg/ml de C2 recombinant de şobolan (Bf/C2 -/- + C2) permite restabilirea depunerii C3b. Rezultatele reprezintă valorile medii (± SD). ** p <0,01 (comparativ cu plasma de la şoareci WT). După cum se arată în fig. 29A, se observă o depunere C3 semnificativă în plasmă C4 -/-, testată în condiţii de testare specifice pentru calea lectinei, dar nu în condiţii specifice pentru calea clasică. Din nou, nu se observă nici o depunere a C3 în plasma cu deficit de MASP-2 prin calea de activare a căii lectinei, în timp ce în aceeaşi plasmă se înregistrează depunerea C3 prin calea clasică. În plasma MASP-1/3 -/- depunerea C3 apare atât în condiţii de testare specifice pentru calea lectinei, cât şi în condiţii de testare specific pentru calea clasică. Nu se observă depunerea C3 în plasma cu o deficienţă combinată de C4 şi MASP-1/3, fie utilizând condiţii specific pentru calea lectinei, fie utilizând condiţii specifice pentru calea clasică. Nici o depunere a C3 nu se detectează în plasmă C2/Bf -/- nici prin calea lectinei, nici prin calea clasică. Reconstituirea plasmei de şoarece C2/Bf -/- cu C2 recombinant, totuşi, restabileşte scindarea C3, mediată atât prin calea lectinei, cât şi prin calea clasică. Condiţiile de testare au fost validate, utilizând plasma C1q -/-.

Fig. 29B ilustrează grafic datele studiului cinetic cu rezolvarea în timp a activităţii convertazei C3 în plasma de la diferite tulpini de şoareci cu deficit de complement: şoareci WT, fB-/-, C4-/-, MASP-1/3 -/- şi MASP-2 -/- în condiţii de testare specifice pentru calea lectinei de activare (1% plasmă, rezultatele se obţin de obicei din trei experimente independente). După cum se arată în fig. 29B, în timp ce nu se observă nici o scindare a C3 în plasma MASP-2 -/-, plasma fB -/- scinda C3 cu cinetică similară cineticii din plasma şoarecilor WT. O întârziere semnificativă în conversia C3 în C3b (şi C3dg), dependentă de calea lectinei, se observă în plasma C4 -/-, precum şi în plasmă cu deficit de MASP-1/3. Această întârziere a activării C3 în plasma MASP-1/3 -/- recent s-a demonstrat a fi dependentă de MASP-1, şi nu de MASP-3 (Takahashi, M., et al., J. Immunol. 180:6132-6138 (2008)).

Discuţii.

Rezultatele, descrise în acest exemplu, sugerează că activitatea funcţională a MASP-2 este esenţială pentru activarea C3 prin calea lectinei atât în prezenţa, cât şi în absenţa C4. Mai mult decât atât, C2 şi MASP-1 sunt necesare pentru funcţionarea acestei căi noi alternative, specifice pentru calea lectinei de activare a C3 cu C4. Analiza comparativă a activităţii funcţionale a căii lectinei în plasma MASP-2 -/-, precum şi în plasma C4 -/- a evidenţiat existenţa unei căi nerecunoscute anterior independente de C4, dar dependentă de MASP-2, de activare a complementului C3, şi a arătat, că C3 poate fi activat într-un mod dependent de calea lectinei în absenţa totală a C4. În timp ce compoziţiile moleculare detaliate şi secvenţa evenimentelor de activare a acestei noi convertaze C3, dependente de MASP-2, persistă neclarificate, rezultatele prezentate atestă, că această cale alternative de activare a C4 necesită suplimentar prezenţa complementului C2, precum şi a MASP-1. Pierderea activităţii de scindare a C3, mediată de calea lectinei, în plasma şoarecilor cu deficienţă combinată de C4 şi MASP-1/3 poate fi explicată prin rolul, descris recent, al MASP-1 de a amplifica activarea complementului dependentă de MASP-2 prin scindarea şi activarea directă a MASP-2 (Takahashi, M. et al., J. Immunol., 180: 6132-6138 (2008)). De asemenea, MASP-1 poate amplifica activitatea funcţională a MASP-2 prin abilitatea sa de a scinda C2 (Moller-Kristensen, et al., Int. Immunol., 19: 141-149 (2007)). Ambele activităţi pot explicate prin viteza redusă cu care plasma MASP-1/3 deficientă scindează C3 prin activarea pe calea lectinei şi prin necesitatea MASP-1 pentru susţinerea conversiei C3 prin calea alternativă de activare a C4.

Incapacitatea plasmei C2/fB -/- de a activa C3 prin calea lectinei s-a dovedit a fi dependentă de C2, deoarece adiţia C2 recombinant de şobolan în plasma C2/fB -/- a restabilit abilitatea plasmei reconstituite de a activa C3 pe plăcile acoperite cu manan.

Constatarea faptului, că deficienţa de C4 perturbează în mod specific calea clasică de activare a complementului, în timp ce calea lectinei menţine un nivel fiziologic foarte important al activităţii convertazei C3 prin calea alternativă de activare cu C4 dependentă de MASP-2, necesită o reevaluare a rolului căii lectinei în diferite modele experimentale de boli, incluzând modelul experimental de infecţie cu S. pneumoniae (Brown, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 16969-16974 (2002), Experimental Allergic Encephalomyelitis (Boos, L.A. et al., Glia 49: 158-160 (2005) şi modelele de regenerare a ficatului murin dependentă de C3 (Clark, A. et al., Mol. Immunol. 45: 3125-3132 (2008)).

Ultima grupă menţionată demonstrează, că şoarecii cu deficit de C4 pot activa C3 într-un mod independent pe cale alternativă, deoarece inhibarea in vivo a căii alternative prin reducerea mediată de anticorp a activităţii funcţionale a factorului B nu cauza regenerarea ficatului dependentă de scindarea C3 la şoarecii C4 -/- .(Clark, A. et al., (2008)). Această cale alternativă de activare a C3 cu C4, mediată cu calea lectinei, poate explica, de asemenea, pierderea unui fenotip de protecţie a deficienţei C4 în modelul de MIRI, precum şi într-un model, descris anterior, de respingere a alogrefei renale (Lin, T. et al., Am., J. Pathol., 168: 1241-1248 (2006)). Spre deosebire de aceasta, rezultatele recente au demonstrat independent un fenotip semnificativ de protecţie la şoarecii MASP-2 -/- în modele de transplant renal (Farrar, C. A. et al., Mol. Immunol. 46: 2832 (2009)).

Astfel, rezultatele acestui exemplu confirmă punctual de vedere, că activarea C3 cu C4 pe calea alternativă, dependentă de MASP-2, este un mecanism relevant fiziologic, care poate fi important în condiţiile în care disponibilitatea C4 este limitată de activarea C3.

EXEMPLUL 23

Acest exemplu descrie activarea C3 cu substrat de trombină şi depunerea C3 pe manan la şoarecii WT (+/+), MASP-2 (-/-), F11 (-/-), F11/C4 (-/-) şi C4 (-/-).

Actualitate:

Cum se descrie în Exemplul 14, s-a constatat că activarea trombinei poate să apară în urma activării căii lectinei în condiţii fiziologice, demonstrând extinderea implicării MASP-2 în procesul patologic. C3 joacă un rol central în activarea sistemului complementului. Activarea C3 este necesară pentru activarea complementului atât pe calea clasică, cât şi pe calea alternativă. Pentru a determina dacă C3 este activat de substraturile de trombină s-a efectuat un experiment.

Metode.

Activarea C3 cu substraturi de trombină.

Activarea C3 se măsoară în prezenţa următoarelor forme activate de substraturi de trombină; FCXIa uman, FVIIa uman, FXa de bovină, FXa uman, proteina C activată umană şi trombina umană. C3 se incubează cu diferite substraturi de trombină, apoi se separă în condiţii de reducere pe 10% geluri SDS-poliacrilamidă. După transferul electroforetic, utilizând membrană de celuloză, membrana se incubează cu anti-C3 murină de şobolan monoclonal combinat cu biotină, detectat cu un kit de HRP- streptavidină şi dezvoltat utilizând reactivul ECL.

Rezultate.

Activarea C3 implică scindarea lanţului a intact în lanţul a' trunchiat şi C3a solubil (nereprezentat în fig. 30). În fig. 30 sunt prezentate rezultatele unei analize Western blot privind activarea C3 uman cu substraturi de trombină, în care lanţul C3 alfa nescindat şi produsul lanţului a' de activare sunt arătate prin săgeţi. După cum se arată în fig. 30, incubarea C3 cu formele activate de factor XI şi de factor X de coagulare umană, precum şi de factor X de coagulare activat de bovine, poate scinda C3 in vitro în absenţa oricăror proteaze ale complementului.

Depunerea C3 pe manan.

Testele de depunere a C3 se efectuează pe probe serice obţinute de la şoarecii WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11 (-/-)/C4(-/-) şi C4(-/-). F11 este gena care codifică factorul de coagulare XI. Pentru măsurarea activării C3, plăcile de microtitrare se acoperă cu manan (1 µg/godeu), apoi se adaugă ser de anti-HSA de ovine (2 µg/ml) în TBS/tween/Ca2+. Plăcile se blochează cu 0,1% HSA în TBS şi se spală ca mai sus. Probele de plasmă se diluează în 4 mM barbital, 145 mM NaCI, 2 mM CaCI2, 1 mM MgCI2, pH 7.4, se adaugă pe plăci şi se incubează pentru 1,5 ore la 37°C. După spălare, C3b legat se detectează utilizând anticorp de iepure anti-C3c uman (Dako), urmat de anticorp de capră anti-IgG de iepure conjugat cu fosfatază alcalină şi pNPP.

Rezultate.

Fig. 31 prezintă rezultatele testului de depunere a C3 pe probele de ser, obţinute de la şoareci WT, MASP-2 (-/-), F11(-/-), F11(-/-)/C4(-/-) şi C4 (-/-). După cum se arată în fig. 31, există o cale funcţională a lectinei chiar şi în absenţa completă a C4. După cum se arată în continuare în fig. 31, această activare a complementului, dependentă de noua cale a lectinei, necesită factorul de coagulare XI.

Discuţii.

Anterior rezultatelor obţinute în acest experiment, s-a crezut de către specialiştii din domeniu, că pentru activarea C4 este necesară calea lectinei de activare a complementului. În consecinţă, datele de la şoarecii cu knockout C4 (şi cei cu deficit de C4) au fost interpretate cu presupunerea, că astfel de organisme sunt cu calea lectinei deficitară (adiţional la deficienţa căii clasice). Rezultatele prezente demonstrează, că această opinie este eronată. Astfel, de exemplu, pot fi eronate concluziile studiilor anterioare, care presupuneau, că calea lectinei nu este importantă în anumite situaţii de boli bazate pe fenotipul animalelor cu deficit de C4. Datele descrise în acest exemplu atestă, de asemenea, că în contextul fiziologic de ser integru, calea lectinei poate activa componentele cascadei de coagulare. Astfel, se demonstrează, că există o relaţie reciprocă între complement şi coagularea cu implicarea MASP-2.

EXEMPLUL 24

Acest exemplu descrie metode evaluare a efectului unui anticorp anti-MASP-2 asupra lizării hematiilor în probele de sânge de la pacienţii cu hemoglobinurie nocturnă paroxistică (PNH).

Fundal/actualitate.

Hemoglobinuria nocturnă paroxistică (PNH), denumită şi sindromul Marchiafava-Micheli, este o boală a sângelui, care poate pune viaţa în pericol, caracterizată prin anemie hemolitică intravasculară indusă de complement. Semnul distinctiv al PNH este hemoliza cronică intravasculară, care este o consecinţă a activării necontrolate a complementului prin cale alternativă. (Lindorfer, M. A. et al., Blood 115 (11) (2010)). Anemia în PNH se datorează distrugerii hematiilor în fluxul de sânge. Simptomele PNH includ: urină roşie, datorită apariţiei hemoglobinei în urină, şi tromboză. PNH poate evolua ca atare, denumită în acest caz PNH primară sau în contextul altor afecţiuni ale măduvei osoase, cum ar fi anemia aplastică, denumită PNH secundară. Tratamentul PNH include transfuzia de sânge în cazul anemiei, anticoagularea în cazul trombozei şi utilizarea anticorpului monoclonal eculizumab (Soliris), care protejează celulele sanguine împotriva distrugerii imune prin inhibarea sistemului complementului (Hillmen P. et al., N. Engl. Med. 350 (6): 552-9 (2004)). Cu toate acestea, la o parte semnificativă din pacienţii cu PNH, trataţi cu eculizumab persistă anemia hemolitică mediată imun, deoarece anticorpul nu blochează activarea complementului prin calea alternativă.

Acest exemplu descrie metodele de evaluare a efectului unui anticorp anti-MASP-2 asupra lizării hematiilor din probele de sânge obţinute de la pacienţii cu PNH (care nu au fost trataţi cu Soliris), incubate cu ser normal uman acidulat omogenizat, care coincide după grupa de sânge.

Metode.

Reactive: Eritrocitele de la donatori sănătoşi şi de la pacienţii care suferă de PNH (netrataţi cu Soliris) se obţin prin venipunctură şi se prepară cum se descrie în Wilcox, L. A. et al., Blood 78: 820-829 (1991). Anticorpii anti-MASP-2 cu activitate de blocare funcţională a căii lectinei se generează cum se descrie în Exemplul 10.

Analiza hemolizei.

Metoda de determinare a efectului anticorpilor anti-MASP-2 asupra abilităţii de blocare a hemolizei eritrocitelor de la pacienţii cu PNH se realizează utilizând metoda descrisă de Lindorfer, M.A. et al., Blood 15 (11): 2283-91 (2010) şi Wilcox, L.A. et al., Blood 78: 820-829 (1991), ambele surse fiind incluse aici ca referinţă. Cum descrie Lindorfer et al., eritrocitele din probele de la pacientul cu PNH se centrifughează, supernatantul leuco-trombocitar se aspiră şi celulele se spală în tampon de veronal-gelatină (GVB) înainte de fiecare experiment. Eritrocitele se testează pentru susceptibilitate la liza mediată de APC după cum urmează. Serul de la om sănătos, compatibil după grupa de sânge, se diluează cu GVB conţinând 0,15 mM CaCl2 şi 0,5 mM MgCl2 (GVB+2) şi se acidulează până la pH 6,4 (NHS acidulat, aNHS) şi se utilizează pentru reconstituirea eritrocitelor până la un hematocrit de 1,6% în 50% aNHS. Amestecurile se incubează apoi la 37°C şi peste 1 oră eritrocitele se peletizează prin centrifugare. Densitatea optică a unei părţi din supernatantul recuperat se măsoară la 405 nM şi se utilizează pentru a calcula procentul lizei. Probele reconstituite în ser-EDTA acidulat se prelucrează în mod similar şi se utilizează pentru a determina liza, care nu este mediată de complement (de obicei sub 3%). Liza completă (100%) se determină după incubarea eritrocitelor în apă distilată.

Pentru a determina efectul anticorpilor anti-MASP-2 asupra hemolizei eritrocitelor PNH, eritrocitele de la pacienţii cu PNH se incubează în aNHS în prezenţa concentraţiilor incrementale de anticorpi anti-MASP-2 şi prezenţa/cantitatea de hemoliză se cuantifică ulterior.

Având în vedere faptul, că anticorpii anti-MASP-2 blochează activarea ulterioară a complementului pe calea alternativă, este de aşteptat ca anticorpii anti-MASP-2 să fie eficienţi în blocarea hemolizei eritrocitelor în PNH, mediată de calea alternativă, a şi vor fi utili ca mijloc terapeutic pentru tratarea pacienţilor suferinzi de PNH.

EXEMPLUL 25

Acest exemplu descrie metode evaluare a efectului unui anticorp blocant anti-MASP-2 asupra activării complementului cu crioglobuline în probe de sânge, obţinute de la pacienţi care suferă de crioglobulinemie.

Fundal/actualitate: Crioglobulinemia se caracterizează prin prezenţa de crioglobuline în ser. Crioglobulinele reprezintă imunoglobuline simple sau mixte (de obicei anticorpi IgM), care la temperaturi joase se supun agregării reversibile. Agregarea conduce la activarea căii clasice a complementului şi la inflamaţie în reţeaua vasculară, în special, la periferie. Manifestările clinice ale crioglobulinemiei includ vasculită şi glomerulonefrită.

Crioglobulinemia poate fi clasificată pe baza compoziţiei crioglobulinei după cum urmează: crioglobulinemia de tip I sau crioglobulinemia simplă este rezultat al unei imunoglobuline monoclonale, de obicei imunoglobulina M (IgM); crioglobulinemia de tip II şi III (crioglobulinemie mixtă), care conţine factori reumatoizi (RF), fiind, de obicei, IgM în complexe cu porţiunea Fc a IgG policlonale.

Stările asociate cu crioglobulinemia includ: infecţia cu virusul hepatitei C, tulburările limfoproliferative şi alte boli autoimune. Complexele imune cu conţinut de complex de crioglobulină provoacă un sindrom clinic de inflamaţie sistemică, posibil datorită abilităţii lor de a activa complementul. În timp ce complexele imune IgG activează în mod normal calea clasică a complementului, complexele care conţin IgM pot activa, de asemenea, complementul prin calea lectinei (Zhang, M. et al., Mol Immunol 44(1-3): 103-110 (2007) şi Zhang, M., et al., J. Immunol., 177 (7): 4727-34 (2006)).

Studiile imunohistochimice au demonstrat în continuare că complexele imune de crioglobulină conţin componente ale căii lectinei, iar biopsiile de la pacienţii cu glomerulonefrită crioglobulinemică au prezentat dovezi imunohistochimice ale activării căii lectinei in situ (Ohsawa, I. et al., Clin Immunol 101 (1): 59-66 (2001)). Aceste rezultate sugerează, că în bolile crioglobulinemice calea lectinei poate contribui la inflamaţii şi la rezultate nefavorabile.

Metode.

Metoda de determinare a efectului anticorpilor anti-MASP-2 asupra abilităţii de a bloca efectele adverse ale crioglobulinemiei se efectuează utilizând analiza de conversie a C3 în fază lichidă, cum descrie Ng Y.C. et al., Arthritis and Rheumatism 31 (1): 99-107 (1988), încorporată aici ca referinţă. După cum descrie Ng et al., În crioglobulinemia mixtă esenţială (EMC) factorul reumatoid monoclonal (mRF), de obicei IgM, se complexează cu IgG policlonală cu formarea unui crioprecipitat caracteristic de complexe imune (IC) (crioglobulină de tip II). S-a constatat, că imunoglobulinele şi C3 sunt prezente pe pereţii vaselor în ţesuturile afectate, cum ar fi în piele, nervi şi rinichi. După cum descrie Ng et al., mRF marcat cu 125I se adaugă la ser (ser uman normal şi ser obţinut de la pacienţii suferinzi de crioglobulinemie), se incubează la 37°C şi se măsoară legarea cu eritrocite.

Conversia C3 în fază lichidă se determină în ser (ser normal uman şi ser obţinut de la pacienţii suferinzi de crioglobulinemie) în prezenţa sau în absenţa următoarelor IC: BSA-anti BSA, mRF, mRF plus IgG sau crioglobuline, în prezenţa sau în absenţa anticorpilor anti-MASP-2. Fixarea C3 şi C4 cu IC se măsoară utilizând un test de coprecipitare cu F(ab')2 anti-C3 şi F(ab')2 anti-C4.

Având în vedere faptul că, s-a arătat că anticorpii anti-MASP-2 blochează activarea căii lectinei, este de aşteptat ca anticorpii anti-MASP-2 să fie eficienţi în blocarea efectelor adverse mediate de complement, asociate cu crioglobulinemia, şi vor fi utili ca medicament terapeutic pentru tratarea pacienţilor suferinzi de crioglobulinemie.

EXEMPLUL 26

Acest exemplu descrie metode evaluare a efectului unui anticorp anti-MASP-2 asupra probelor de sânge obţinute de la pacienţii cu boală de aglutinină rece, care se manifestă sub formă de anemie.

Fundal/actualitate: Boala de aglutinină rece (CAD), este un tip de anemie hemolitică autoimună. Anticorpii aglutininelor la rece (de obicei, IgM) sunt activate de temperaturi joase şi leagă şi agreghează cu celulele roşii din sânge. Anticorpii de aglutinină rece se combină cu complementul şi atacă antigenul pe suprafaţa celulelor roşii din sânge. Aceasta conduce la oponsonizarea celulelor roşii din sânge (hemoliză), care declanşează eliminarea acestora prin sistemul reticuloendotelial. Temperatura, la care se produce aglutinarea, variază de la pacient la pacient. CAD se manifestă sub formă de anemie. Când rata de distrugere a hematiilor din sânge depăşeşte capacitatea măduvei osoase de a produce un număr adecvat de celule care transportă oxigen, apare anemia. CAD poate fi cauzată de o boală sau de o tulburare, denumită "CAD secundară", cum ar fi o boală infecţioasă (pneumonie cu micoplasmă, oreion, mononucleoză), boală limfoproliferativă (limfom, leucemie limfocitară cronică) sau tulburări ale ţesutului conjunctiv. Pacienţii cu CAD primară sunt consideraţi a avea o afecţiune limfoproliferativă a măduvei osoase de grad redus. Atât CAD primară, cât şi secundară sunt stări dobândite.

Metode.

Reactive.

Eritirocitele de la donatori sănătoşi şi de la pacienţii care suferă de CAD se obţin prin venipunctură. Anticorpii anti-MASP-2 cu activitate de blocare funcţională a căii lectinei se generează aşa cum se descrie în Exemplul 10.

Efectul anticorpilor anti-MASP-2 de a bloca activarea căii lectinei, mediată de aglutinine reci, poate fi determinată după cum urmează. Eritrocitele de la pacienţii cu grupă sanguină I cu factorul rezus pozitiv sunt sensibilizaţi cu aglutinine reci (adică, cu anticorpi IgM) în prezenţa sau absenţa anticorpilor anti-MASP-2. Eritrocitele se testează apoi pentru abilitatea de a activa calea lectinei prin măsurarea legării C3.

Având în vedere, că s-a constatat că anticorpii anti-MASP-2 blochează activarea căii lectinei, este de aşteptat ca anticorpii anti-MASP-2 să fie eficienţi în blocarea efectelor adverse mediate de complement, asociate cu boala de aglutinină la rece şi, astfel, să fie utili ca remediu terapeutic pentru tratarea pacienţilor care suferă de boală de aglutinină la rece.

EXEMPLUL 27

Acest exemplu descrie metode evaluare a efectului unui anticorp anti-MASP-2 asupra lizării hematiilor din sânge în probele de sânge obţinute de la şoareci cu sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS)

Fundal/actualitate: Sindromul hemolitic uremic atipic (aHUS) se caracterizează prin anemie hemolitică, trombocitopenie şi insuficienţă renală, cauzată de trombii plachetari în microcirculaţia rinichilor şi a altor organe. aHUS se asociază cu reglarea defectuoasă a complementului şi poate fi sporadic sau ereditar. aHUS se asociază cu mutaţii în genele care codifică activarea complementului, incluzând factorul H al complementului, cofactorul B şi factorul I, precum şi factorul H-1 asociat al complementului (CFHR1) şi proteina 3 legată cu factorul H al complementului (CFHR3). Zipfel, P. F. et al., PloS Genetics 3 (3): e41 (2007). Acest exemplu descrie metodele de evaluare a efectului unui anticorp anti-MASP-2 asupra lizei celulelor roşii din sânge în probele de sânge obţinute de la şoareci cu aHUS.

Metode.

Efectul anticorpilor anti-MASP-2 în tratamentul aHUS se poate determina într-un model experimental pe şoareci cu această boală, la care gena fH endogenă de şoarece se înlocuieşte cu un omolog uman, care codifică o formă mutantă de fH, frecvent depistată la pacienţii cu aHUS. (Pickering M.C., et al., J. Exp. Med. 204 (6): 1249-1256 (2007), încorporat aici prin referinţă). După cum descrie Pickering et al., astfel de şoareci dezvoltă o patologie asemănătoare aHUS. Pentru a evalua efectul unui anticorp anti-MASP-2 în tratamentul aHUS, anticorpii anti-MASP-2 se administrează şoarecilor mutanţi cu aHUS şi se compară liza hematiilor din sânge, care apare la şoarecii trataţi cu anticorpi anti-MASP-2, cu liza eritrocitelor la şoarecii de control netrataţi. Având în vedere faptul, că s-a constatat că anticorpii anti-MASP-2 blochează activarea căii lectinei, este de aşteptat ca anticorpii anti-MASP-2 să fie eficienţi în blocarea lizei celulelor roşii din sânge la mamiferele, care suferă de aHUS.

EXEMPLUL 28

Acest exemplu descrie metode evaluare a efectului unui anticorp anti-MASP-2 în tratament glaucomului.

Fundal/actualitate: S-a demonstrat că activarea necontrolată a complementului contribuie la progresia leziunilor degenerative ale celulelor ganglionare retiniene (RGC), ale sinapselor şi axonilor lor în glaucom. (Tezel G. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 51: 5071-5082 (2010)). De exemplu, studiile histopatologice ale ţesuturilor umane şi studiile in vivo, utilizând diferite modele experimentale pe animale, au demonstrat că în retina glaucomatoasă se sintetizează componentele complementului, inclusiv C1q şi C3, şi se formează complexul terminal al complementului (Stasi K. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 47: 1024-1029 (2006); Kuehn M.H. et al., Exp Eye Res 83: 620-628 (2006)). Aşa cum se descrie în continuare în Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87: 89-95 (2008), sinteza şi depunerea complementului se induce cu ischemia/reperfuzia retiniană şi întreruperea cascadei complementului întârzie degenerarea RGC. În acest studiu la şoarecii, purtători de întrerupere ţintă a componentei C3 a complementului, se determina întârzierea leziunilor degenerative celulelor ganglionare retiniene (RGC) după ischemia/reperfuzia tranzitorie a retinei, în comparaţie cu animalele normale.

Metode.

Metoda de determinare a efectului anticorpilor anti-MASP-2 asupra degenerării RGC se efectuează pe un model experimental de ischemie/reperfuzie a retinei pe animale, aşa cum se descrie în Kuehn M.H. et al., Experimental Eye Research 87: 89-95 (2008), încorporat aici ca referinţă. Aşa cum descrie Kuehn et al., ischemia retinei se induce prin anestezia animalelor, apoi inserarea unui ac de calibru 30 conectat la un rezervor, care conţine soluţie fiziologică tamponată cu fosfat, prin cornee în camera anterioară a ochiului. Rezervorul cu soluţie fiziologică se ridică apoi pentru a produce o presiune intraoculară de 104 mmHg, suficientă pentru a întreruperea completă a circulaţiei prin reţeaua de vase retiniene. Creşterea ischemiei intraoculare se confirmă prin albirea irisului şi retinei şi ischemia se menţine timp de 45 de minute doar la ochiul stâng; ochiul drept serveşte drept control şi în el nu se efectuează cateterizarea. Şoarecii apoi se eutanasiază peste 1 sau 3 săptămâni după insultele ischemice. Anticorpii anti-MASP-2 se administrează la şoareci fie local în ochi, fie sistemic pentru a elimina efectul unui anticorp anti-MASP administrat înainte de insultul ischemic.

Imunohistochimia ochilor se efectuează folosind anticorpi împotriva C1q şi C3 pentru a detecta depunerea complementului. Leziunea nervului optic poate fi, de asemenea, evaluată utilizând metoda standard de microscopie electronică. Cuantificarea RGC retiniene la supravieţuitori se efectuează utilizând marcarea cu gamma sinucleină.

Rezultate.

Aşa cum descrie Kuehn et al., la şoarecii de control normali ischemia retiniană tranzitorie rezultă cu modificări degenerative ale nervului optic şi depozitele C1q şi C3 retiniene sunt detectabile prin imunohistochimie. În contrast, şoarecii cu deficit de C3 prezintă o reducere semnificativă a degenerării axonale, prezentând doar niveluri minore ale leziunilor nervului optic la o săptămână după inducţie. Pe baza acestor rezultate, se aşteaptă ca rezultate similare să se observe atunci când această analiză se efectuează la şoareci cu knock-out MASP-2 şi atunci când anticorpii anti-MASP-2 se administrează unui şoarece normal înainte de insultul ischemic.

EXEMPLUL 29

Acest exemplu demonstrează că un inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp anti-MASP-2, este eficace în tratamentul stărilor după iradiere şi/sau în tratamentul, ameliorarea sau prevenirea sindromului acut de iradiere.

Actualitate.

Expunerea la doze mari de iradiaţii ionizante cauzează moarte prin două mecanisme principale: toxicitatea pentru măduva osoasă şi declanşarea sindromului gastrointestinal. Toxicitatea pentru măduva osoasă rezultă printr-o reducere a tuturor celulelor hematologice, predispunând organismul la moarte prin infecţie şi hemoragie. Sindromul gastrointestinal este o formă mai severă şi este cauzată de o pierdere a funcţiei de barieră intestinală datorată dezintegrării stratului epitelial intestinal şi a pierderii funcţiei endocrine intestinale. Aceasta conduce la septicemie şi la sindromul de răspuns inflamator sistemic asociat, care rezultă cu deces.

Calea lectinei a complementului este un mecanism imun congenital, care iniţiază inflamaţia ca răspuns la leziunea tisulară şi expunerea la suprafeţe străine (adică bacterii). Blocarea acestei căi conduce la îmbunătăţirea rezultatelor tratamentului şoarecilor în modele cu leziuni tisulare intestinale ischemice sau cu şoc septic. Se presupune că calea lectinei poate declanşa inflamaţie excesivă şi dăunătoare ca răspuns la leziunea tisulară indusă de radiaţii. Blocarea căii lectinei poate reduce, astfel, leziunea secundară şi creşte supravieţuirea după expunerea la radiaţii acute.

Obiectivul studiului efectuat, aşa cum se descrie în acest exemplu, a fost de a evalua efectul blocării căii lectinei asupra supravieţuirii şoarecilor într-un model experimental de leziuni prin radiaţie la administrarea anticorpilor anti-MASP-2 murină.

Metode şi materiale.

Materiale.

Materialele de testare utilizate în acest studiu sunt: (i) un anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină cu afinitate înaltă şi (ii) un anticorp (mAbH6) anti-MASP-2 umană cu afinitate înaltă, care blochează componenta proteică a MASP-2 a căii lectinei a complementului, produsă în celulele de mamifere transfectate. Concentraţiile de dozare constituie 1 mg/kg de anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină, 5 mg/kg de anticorp (mAbH6) anti-MASP-2 umană sau soluţie fiziologică sterilă. Pentru fiecare sesiune de dozare, se prepară un volum adecvat de soluţii proaspete de dozare.

Animale.

Şoarecii masculi tineri mature din linia Swiss-Webster au fost furnizaţi de Harlan Laboratories (Houston, TX). Animalele au fost adăpostite în cuşti cu fund tare, cu aşternut Alpha-Dri şi erau asiguraţi cu hrană certificate pentru rozătoare PMI 5002 (Animal Specialties, Inc., Hubbard OR) şi cu apă ad libitum. În cuştile pentru animale se monitoriza permanent temperatura, şi se instala un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore/12 ore.

Iradierea.

După o aclimatizare de 2 săptămâni în încăpere specială, şoarecii au fost iradiaţi cu 6,5 şi 7,0 Gy prin expunerea întregului corp în grupe de câte 10 animale cu o intensitate a dozei de 0,78 Gy/min, utilizând un sistem Therapax X-RAD 320 echipat cu un generator de raze X de înaltă stabilitate de 320 kV, tub de raze X din metaloceramică, colimator cu raze X variabile şi filtru (Precision X-ray Incorporated, East Haven, CT). Nivelurile dozei s-au selectat pe baza studiilor anterioare, efectuate cu aceeaşi specie de şoareci, indicând că LD50/30 a fost cuprinsă între 6,5 şi 7,0 Gy (datele nu sunt prezentate).

Prepararea şi administrarea medicamentelor.

În conformitate cu protocolul, un anumit volum de soluţii iniţiale concentrate s-a diluat cu soluţie fiziologică răcită pe gheaţă cu obţinerea soluţiilor cu doze de 0,2 mg/ml de anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină sau 0,5 mg/ml de anticorp (mAbH6) anti-MASP-2 umană. Administrarea anticorpilor mAbM11şi mAbH6 anti-MASP-2 s-a realizat prin injecţie intraperitoneală, utilizând un ac de calibrul 25, în funcţie de greutatea animalului, pentru a elibera 1 mg/kg de mAbM11, 5 mg/kg de mAbH6 sau de soluţie fiziologică în calitate de placebo.

Protocolul studiului.

Şoarecii au fost repartizaţi aleatoriu în grupe, aşa cum se descrie în Tabelul 8. Greutatea şi temperatura corpului au fost măsurate şi înregistrate zilnic. Şoarecii din grupele 7, 11 şi 13 au fost sacrificaţi în ziua 7 post-iradiere şi sângele s-a colectat prin puncţie cardiacă sub anestezie profundă. Animalele supravieţuitoare în ziua 30 după iradiere au fost sacrificate în acelaşi mod şi s-a colectat sângele. Plasma s-a preparat din probele de sânge colectate, în conformitate cu protocolul şi a fost returnată sponsorului pentru efectuarea analizei.

Tabelul 8. Grupele de studiu

Nr. grupei Nr. de şoareci în grupă Nivelul de iradiere (Gy) Tratamentul Programul de dozare 1 20 6.5 Placebo 18 ore înainte de iradiere, 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 2 20 6.5 anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină 18 ore înainte de iradiere 3 20 6.5 anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină 18 ore înainte de iradiere, 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 4 20 6.5 anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 5 20 6.5 anticorp (mAbH6) anti-MASP-2 umană 18 ore înainte de iradiere, 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 6 20 7.0 Placebo 18 ore înainte de iradiere, 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 7 5 7.0 Placebo 2 ore după iradiere 8 20 7.0 anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină 18 ore înainte de iradiere 9 20 7.0 anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină 18 ore înainte de iradiere, 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 10 20 7.0 anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 11 5 7.0 anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină 2 ore după iradiere 12 20 7.0 anticorp (mAbH6) anti-MASP-2 umană 18 ore înainte de iradiere, 2 ore după iradiere, rapel săptămânal 13 5 Nu Nu Nu

Analiza statistică.

Curbele de supravieţuire Kaplan-Meier au fost generate şi utilizate pentru a compara timpul mediu de supravieţuire în grupele de tratament utilizând criteriul de rang logaritmic şi criteriul Wilcoxon. Sunt prezentate valorile medii cu deviaţiile standard sau valorile medii cu valoarea erorii standard de la medie. Comparaţiile statistice s-au realizat utilizând criteriul bilateral Student unipar între animalele iradiate de control şi grupele de tratament individual.

Rezultate.

Curbele de supravieţuire Kaplan-Meier pentru grupele iradiate cu doze de 7,0 şi 6,5 Gy sunt prezentate în fig. 32A şi 32B, respectiv, şi sunt rezumate mai jos în Tabelul 9. În general, tratamentul înainte de iradiere cu anticorp (mAbM11) anti-MASP-2 murină creşte supravieţuirea şoarecilor iradiaţi, în comparaţie cu animalele de control iradiate tratate cu placebo la niveluri de expunere de 6,5 (creştere cu 20%), cât şi de 7,0 Gy (creştere cu 30%). La nivelul de expunere de 6,5 Gy tratamentul post-iradiere cu anticorp anti-MASP-2 murină rezultă cu o creştere modestă a supravieţuirii (cu 15%), în comparaţie cu animalele iradiate de control tratate cu placebo.

Pentru comparaţie, toate animalele tratate cu un nivel de expunere de 7,0 Gy au arătat creşterea supravieţuirii, comparativ cu animalele de control iradiate tratate cu placebo. Cea mai mare schimbare în supravieţuire s-a înregistrat la animalele care au administrat mAbH6, şi anume o creştere a supravieţuirii cu 45%, comparativ cu animalele de control. În plus, la nivelul de expunere de 7,0 Gy, primele cazuri de mortalitate în grupa tratată cu mAbH6 s-au constatat în ziua 15 post-iradiere, comparativ cu ziua 8 post-iradiere pentru animalele de control iradiate şi tratate cu placebo, adică supravieţuirea în grupa de animale tratate depăşea cu 7 zile supravieţuirea animalelor de control. La nivelul de expunere de 7,0 Gy timpul mediu până la mortalitate pentru şoarecii, la care s-a administrat mAbH6 (27,3 ± 1,3 zile), a fost semnificativ mai mare (p = 0,0087), comparativ cu animalele de control (20,7 ± 2,0 zile) la acelaşi nivel de expunere.

Procentul modificării greutăţii corporale, în comparaţie cu greutatea corporală cu 1 zi înainte de iradiere (ziua -1), a fost înregistrat pe tot parcursul studiului. O pierdere tranzitorie de greutate s-a constatat la toate animalele iradiate, fără evidenţierea unor modificări diferenţiale datorate tratamentului cu mAbM11 sau mAbH6, comparativ cu controlul (datele nu au fost prezentate). La sfârşitul studiului toate animalele supravieţuitoare au prezentat o creştere a greutăţii corporale, comparative cu greutatea corporală iniţială (ziua -1).

Ratele de supravieţuire la animalele testate expuse iradierii

Tabelul 9

Grupele de testare Nivelul de expunere Supravieţuirea (%) Timpul până la moarte (Media ± SEM, Zile) Numărul de zile până la primul caz de deces/ultimul caz de moarte Iradiere de control 6.5 Gy 65 % 24.0 ± 2.0 9/16 Administrarea mAbM11 pre-expunere 6.5 Gy 85 % 27.7 ± 1.5 13/17 Administrarea mAbM11 pre + post-expunere 6.5 Gy 65 % 24.0 ± 2.0 9/15 Administrarea mAbM11 post-expunere 6.5 Gy 80 % 26.3 ± 1.9 9/13 Administrarea mAbH6 pre+post-expunere 6.5 Gy 65 % 24.6 ± 1.9 9/19 iradiere de control 7.0 Gy 35 % 20.7 ± 2.0 8/17 Administrarea mAbM11 pre-expunere 7.0 Gy 65 % 23.0 ± 2.3 7/13 Administrarea mAbM11 pre + post-expunere 7.0 Gy 55 % 21.6 ± 2.2 7/16 Administrarea mAbM11 post-expunere 7.0 Gy 70 % 24.3 ± 2.1 9/14 Administrarea mAbH6 pre+post-expunere 7.0 Gy 80 % 27.3 ± 1.3* 15/20

*p = 0.0087 conform criteriului bilateral Student unipar pentru animalele iradiate de control şi grupele de animale iradiate şi tratate cu una şi aceeaşi doză de iradiere.

Discuţii.

Sindromul acut de iradiere constă din trei subsindroame definite: hematopoietic, gastrointestinal şi cerebrovascular. Sindromul observat depinde doza de iradiere, totodată efectele hematopoietice se observă la om la expuneri semnificative la iradiere parţială sau completă a suprafeţei corpului în doză, care depăşeşte 1 Gy. Sindromul hematopoietic se caracterizează prin depresie severă a funcţiei măduvei osoase, care conduce la pancitopenie cu modificări ale numărului elementelor de sânge, hematiilor şi leucocitelor, precum şi a trombocitelor, care apar concomitent cu afectarea sistemului imun. În acest caz, cel puţin, se observă un număr redus de neutrofile şi trombocite în sângele periferic, neutropenie, febră, şi, drept complicaţii, sepsisului şi hemoragia necontrolabilă, care conduc la deces.

În studiul prezent, s-a constatat că administrarea mAbH6 conduce la creşterea supravieţuirii şoarecilor masculi din linia Swiss-Webster, iradiaţi cu raze X a întregului corp la un nivel de 7,0 Gy. În mod special, la nivelul de expunere de 7,0 Gy, 80% dintre animalele care au administrat mAbH6 au supravieţuit până la 30 de zile, comparativ cu 35% dintre animalele iradiate de control tratate cu placebo. Este important de menţionat, că primul caz de deces al animalelor din această grupă s-a înregistrat numai în ziua 15 după iradiere, adică cu 7 zile mai târziu, decât la animalele iradiate de control tratate cu placebo. Curios, că la expunerea la raze X la un nivel mai mic (6,5 Gy), administrarea mAbH6 nu influenţa asupra supravieţuirii sau întârzierii apariţiei cazurilor de deces, în comparaţie cu animalele iradiate de control tratate cu placebo. Pot exista mai multe motive pentru această diferenţă în răspunsul la nivelurile de expunere, deşi verificarea oricărei ipoteze poate necesita studii suplimentare, inclusiv colectarea prealabilă a probelor pentru analiza culturilor microbiologice şi pentru estimarea parametrilor hematologici. O explicaţie poate fi pur şi simplu aceea, că numărul de animale repartizate în grupuri poate împiedica vizualizarea diferenţelor subtile legate de tratament. De exemplu, în grupele conţinând n = 20, diferenţa de supravieţuire între 65% (mAbH6 la expunere la 6,5 Gy) şi 80% (mAbH6 la expunere la 7,0 Gy) este de 3 animale. Pe de altă parte, diferenţa dintre 35% (placebo în calitate de control la expunere la 7,0 Gy) şi 80% (mAbH6 la expunere la 7,0 Gy) este de 9 animale şi oferă dovezi convingătoare despre diferenţa rezultatelor, existentă în grupele de animale tratate.

Aceste rezultate demonstrează, că anticorpii anti-MASP-2 sunt eficienţi în tratarea unui mamifer, care prezintă risc sau suferă de efectele dăunătoare ale sindromului acut de iradiere.

EXEMPLUL 30

Acest exemplu demonstrează, că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi de mortalitatea indusă de Neisseria meningitidis după infectare sau cu N. meningitidis serogroupa A, sau cu Neisseria meningitidis serogroupa B.

Metode.

Şoarecii cu knock-out MASP-2 (şoareci MASP-2 KO) se generează aşa cum se descrie în Exemplul 1. La şoarecii MASP-2 KO cu vârstă de 10 săptămâni (n = 10) şi la şoarecii de tip sălbatic din linia C57/BL6 (WT) (n=10) se inoculează prin injectare intraperitoneală (ip) o doză de 2,6 x 107 CFU de Neisseria meningitides serogrupa Z2491 în volum de 100 µl. Doza infecţioasă se administrează şoarecilor împreună cu dextran de fier într-o concentraţie finală de 400 mg/kg. Supravieţuirea şoarecilor după infecţie se monitorizează timp de 72 de ore.

Într-un experiment separat, la şoarecii MASP-2 KO de 10 săptămâni (n = 10) şi la şoarecii de tip sălbatic din linia C57/BL6 (n = 10) se inoculează prin injectare i.p. o doză de 6 x 106 CFU de Neisseria meningitidis serogrupa B tulpina MC58 într-un volum de 100 µl. Doza infecţioasă se administrează la şoareci împreună cu dextran de fier într-o doză finală de 400 mg/kg. Supravieţuirea şoarecilor după infecţie se monitorizează timp de 72 de ore. De asemenea se determină un scor de boală pentru şoarecii WT şi MASP-2 KO timp de 72 de ore după infecţie, care se bazează pe parametrii de manifestare a bolii, descrişi în continuare în tabelul 10, în conformitate cu schema lui Fransen et al. (2010) cu mici modificări.

Estimarea evoluţiei bolii asociate cu semnele clinice la şoarecii infectaţi

Tabelul 10

Semne Scorul Normal 0 Blana puţin ciufulită 1 Blană ciufulită, privire lentă şi ochi umezi 2 Blană ciufulită, letargie şi ochi închişi 3 Stare depresivă şi fără mişcare după stimulare 4 Mort 5

Probele de sânge se prelevă de la şoareci la intervale de 1 oră după infectare şi se determină nivelul seric (log UFC/ml) de N. meningitidis pentru a confirmarea prezenţei infecţiei şi a determina rata de eliminare a bacteriilor din ser.

Rezultate.

Fig. 33 reprezintă o diagramă Kaplan-Meyer, care ilustrează grafic procentul supravieţuirii şoarecilor MASP-2 KO şi WT după administrarea unei doze infecţioase de 2,6 x 107 UFC de N. meningitidis serogrupa A Z2491. După cum se arată în fig. 33, 100% din şoarecii MASP-2 KO au supravieţuit pe tot parcursul perioadei de 72 de ore după infecţie. Dimpotrivă, numai 80% din şoarecii WT (p = 0,012) erau încă în viaţă peste 24 de ore după infectare şi numai 50% din şoarecii WT erau încă în viaţă peste 72 de ore după infectare. Aceste rezultate demonstrează, că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi de mortalitatea indusă de N. meningitidis serogrupa A Z2491.

Fig. 34 reprezintă o diagramă Kaplan-Meyer, care ilustrează grafic procentul supravieţuirii şoarecilor MASP-2 KO şi WT după administrarea unei doze infecţioase de 6 x 106 UFC de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58. După cum se arată în fig. 34, 90% din şoarecii KO MASP-2 au supravieţuit pe toată perioada de 72 de ore după infecţie. În contrast, numai 20% din şoarecii WT (p = 0,0022) au rămas încă în viaţă peste 24 de ore după infectare. Aceste rezultate demonstrează, că şoarecii cu deficienţă de MASP-2 sunt protejaţi de mortalitatea indusă de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58.

Fig. 35 ilustrează grafic valoarea log UFC/ml de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58, determinată la momente diferite de timp în probele de sânge prelevate de la şoarecii MOSP-2 KO şi WT după infectare i.p. cu 6x106 UFC de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58 (n = 3 la momente de timp diferite pentru ambele grupe de şoareci). Rezultatele sunt exprimate ca valori medii ± SEM. După cum se arată în fig. 35, la şoarecii WT nivelul de N. meningitidis din sânge a atins un vârf de aproximativ 6,0 log UFC/ml la 24 de ore după infectare şi s-a redus până la aproximativ 4,0 log UFC/ml la 36 de ore după infecţie. În contrast, la şoarecii MASP-2 KO, nivelul de N. meningitidis a atins un vârf de aproximativ 4,0 log UFC/ml la 12 ore după infectare şi s-a redus până la aproximativ 1,0 log UFC/ml la 36 de ore după infectare (simbolul "*" indică p <0,05; simbolul "**" indică p = 0,0043). Aceste rezultate demonstrează că, deşi şoarecii MOSP-2 KO au fost infectaţi cu aceeaşi doză de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58 ca şi şoarecii WT, şoarecii MOSP-2 KO au un clearance mai înalt al bacteremiei, în comparaţie cu şoarecii WT.

Fig. 36 ilustrează grafic scorul mediu al bolii la şoareci MASP-2 KO şi WT la 3, 6, 12 şi 24 de ore după infectare cu 6x106 UFC de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58. După cum se arată în fig. 36, şoarecii cu deficit de MASP-2 au prezentat o rezistenţă înaltă la infecţie, cu scoruri de boală mult mai mici peste 6 ore (simbolul "*" indică p=0,0411), 12 ore (simbolul "**" indică p = 0,0049) şi 24 ore (simbolul "***" indică p=0,0049) după infectare, comparativ cu şoarecii WT. Rezultatele din fig. 36 sunt exprimate ca valori medii ± SEM.

Astfel, rezultatele din acest exemplu demonstrează, că şoarecii cu deficit de MASP-2 sunt protejaţi de mortalitatea indusă de Neisseria meningitidis după infectare sau cu N. meningitidis serogroupa A, sau cu N. meningitidis serogroupa B.

EXEMPLUL 31

Acest exemplu demonstrează, că administrarea anticorpului anti-MASP-2 după infectare cu N. meningitidis creşte supravieţuirea şoarecilor infectaţi cu N. meningitidis.

Fundal/actualitate.

Cum se descrie în exemplul 10, proteina MASP-2 de şobolan a fost utilizată pentru selectarea Fab din display-ul de fagi al bibliotecii, din care a fost identificat Fab2 # 11 în calitate de anticorp activ funcţional. Din Fab2 # 11 au fost generaţi anticorpii cu lungime completă împotriva izotipurilor IgG2c de şobolan şi IgG2a de şoarece. Au fost caracterizaţi parametrii farmacodinamici ai anticorpului anti-MASP-2 cu lungime completă a izotipului IgG2a de şoarece (aşa cum se descrie în Exemplul 19).

În acest exemplu, anticorpul anti-MASP-2 de şoarece cu lungime completă, derivat din Fab2 # 11, s-a analizat într-un model experimental pe şoareci cu infecţie cu N. meningitidis.

Metode.

Izotipul IgG2a al anticorpului cu lungime completă anti-MASP-2 murină, derivat din Fab2 # 11, generat aşa cum s-a descris mai sus, se testează pe un model experimental cu şoareci infectaţi cu N. meningitidis după cum urmează.

Administrarea anticorpilor monoclonali (MoAb) anti-MASP-2 murină după infectare

Şoarecii din linia C57/BL6 Charles River de nouă săptămâni se tratează cu anticorp inhibitor al MASP-2 de şoarece (1,0 mg/kg) (n = 12) sau cu izotip de control al anticorpului (n = 10) peste 3 ore după injectarea i.p. a unei doze mari (4x106 UFC) de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58.

Rezultate.

Fig. 37 reprezintă o diagramă Kaplan-Meyer, care ilustrează grafic supravieţuirea şoarecilor după administrarea unei doze infecţioase de 4x106 UFC de N. meningitidis serogrupa B tulpina MC58, urmată de administrarea la 3 ore după infectare fie a unui anticorp inhibitor al MASP-2 (1,0 mg/kg), sau a anticorpului izotipului - în calitate de control. După cum se arată în fig. 37, 90% din şoarecii trataţi cu anticorpi anti-MASP-2 au supravieţuit pe toată perioada de 72 de ore după infectare. Dimpotrivă, numai 50% din şoarecii trataţi cu anticorpul izotip în calitate de control au supravieţuit pe toată perioada de 72 de ore după infectare. Simbolul "*" indică p = 0,0301, determinat prin compararea celor două curbe de supravieţuire.

Aceste rezultate demonstrează, că administrarea anticorpului anti-MASP-2 este eficientă pentru tratarea şi îmbunătăţirea supravieţuirii la subiecţii infectaţi cu N. meningitidis.

Aşa cum s-a demonstrat aici, utilizarea anticorpului anti-MASP-2 în tratamentul unui subiect infectat cu N. meningitidis este eficientă când acesta se administrează în decurs de 3 ore după infectare şi se aşteaptă să fie eficient timp de la 24 ore până la 48 de ore după infectare. Boala meningococică (fie meningococcemia sau meningita) este o urgenţă medicală, iar terapia se va iniţia imediat ce se suspectează o boală meningococică (adică înainte ca N. meningitidis să fie identificat pozitiv ca agent etiologic).

În baza rezultatelor pentru şoarecii MASP-2 KO, prezentate în Exemplul 30, se consideră, că administrarea anticorpului anti-MASP-2 înainte de infectarea cu N. meningitidis ar fi, de asemenea, eficientă pentru a preveni sau ameliora severitatea infecţiei.

EXEMPLUL 32

Acest exemplu demonstrează, că administrarea anticorpului anti-MASP-2 este eficientă pentru tratarea infecţiei cu N. meningitidis în serul uman.

Actualitate.

Pacienţii cu niveluri serice reduse de MBL funcţională se caracterizează prin susceptibilitate înaltă la infecţii bacteriene şi fungice recurente (Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572: 401-413 (2002)). Se ştie că N. meningitidis este recunoscut de MBL şi s-a arătat că serurile cu deficit de MBL nu lizează Neisseria.

În baza rezultatelor, descrise în Exemplele 30 şi 31, s-au efectuat o serie de experimente pentru a determina eficacitatea administrării anticorpului anti-MASP-2 pentru tratarea infecţiei cu N. meningitidis în seruri umane cu deficit de complement şi în seruri de control. Experimentele s-au efectuat într-o concentraţie înaltă de ser (20%) pentru a păstra calea de activare a complementului.

Metode.

1. Activitatea bactericidă serică în diferite seruri umane cu deficit de complement şi în seruri umane tratate cu anticorp anti-MASP-2 uman

În acest experiment s-au utilizat următoarele seruri umane cu deficit de complement şi seruri umane de control:

Probe de seruri umane testate (arătate în fig. 38)

Tabelul 11

Proba Tipul de ser A Ser normal uman (NHS) + anticorp (Ab) anti-MASP-2 umană B NHS + Ab izotip de control C MBL -/- ser uman D NHS E NHS (HI) termoinactivat

Un anticorp recombinant anti-MASP-2 uman se izolează dintr-o Bibliotecă de combinaţii de anticorpi (Knappik, A. et al., J. Mol.Biol., 296: 57-86 (2000)), folosind MASP-2A umană recombinantă ca antigen (Chen, C.B. and Wallis, J. Biol.Chem., 276: 25894-25902 (2001)). Se identifică un fragment scFv de anticorp uman cu un singur lanţ, care inhibă puternic activarea a C4 şi C3, mediată de calea lectinei, în plasma umană (IC50 ~ 20 nM) şi a fost transformat într-un anticorp anti-IgG4 umană cu lungime completă.

N. meningitidis serogrupa B-MC58 se incubează cu diferite seruri, prezentate în tabelul 11, fiecare într-o concentraţie serică de 20% cu sau fără adiţia anticorpului inhibitor al MASP-2 umană (3 µg în 100 µl de volum total) la 37°C cu agitare. Probele se prelevă la următoarele intervale de timp: la 0, 30, 60 şi 90 de min, se plachează şi apoi se determină numărul de microorganisme viabile. Serul uman termoinactivat se utilizează în calitate de control negativ.

Rezultate.

Fig. 38 ilustrează grafic valoarea log UFC/ml al numărului de N. meningitidis serogroupa B-MC58 viabile, recoltate la diferite intervale de timp din serul uman, şi prezentate în tabelul 11. Tabelul 12 prezintă rezultatele utilizării criteriului t Student parametric pentru datele, prezentate în fig. 38.

Rezultatele utilizării criteriului t Student parametric pentru datele, prezentate în fig. 38 (timpul 60 min)

Tabelul 12

Dif. medie (Log) Statistic concludentă? P<0.05? Suma valorilor P A vs B -0.3678 Da ***(0.0002) A vs C -1.1053 Da ***(p<0.0001) A vs D -0.2111 Da **(0.0012) C vs D 1.9 Da ***(p<0.0001)

După cum se arată în fig. 38 şi în tabelul 12, uciderea dependentă de complement a N. meningitidis în 20% ser uman creşte semnificativ la adiţia anticorpului inhibitor al MASP-2 umană.

2. Determinarea uciderii N. meningitidis dependente de complement în 20% (v/v) ser de la şoarecii cu deficit de MASP-2.

În acest experiment s-au utilizat următoarele seruri de şoareci cu deficit de complement şi seruri de şoarece în calitate de control.

Probele de ser murin testate (prezentate în fig. 39)

Tabelul 13

Probele Tipul serului A WT B MASP-2 -/- C MBL A/C -/- D (HIS) termoinactivat WT

N. meningitidis serogrupa A B-MC58 se incubează cu diferite seruri murine cu deficienţă de complement, fiecare într-o concentraţie a serului de 20%, la 37°C cu agitare. Probele se colectează la intervale de timp de 0-, 15-, 30-, 60-, 90- şi 120, se plachează şi apoi se determină numărul de microorganisme viabile. Serul uman termoinactivat se utilizează în calitate de control negativ.

Rezultate.

Fig. 39 ilustrează grafic valoarea log UFC/ml al numărului de N. meningitidis serogrupa B-MC58 viabile, determinat la diferite intervale de timp în probele de ser de la şoareci şi prezentate în Tabelul 13. După cum se arată în fig. 39, serurile şoarecilor MASP-2 -/- prezintă un nivel mai înalt de activitate bactericidă pentru N. meningitidis, comparativ cu serurile de la şoarecii WT. Simbolul "**" indică p = 0,0058, simbolul "***" indică p = 0,001. Tabelul 14 prezintă rezultatele utilizării criteriului t Student parametric pentru datele, prezentate în fig. 39.

Rezultatele utilizării criteriului t Student parametric pentru datele, prezentate în fig. 39.

Tabelul 14

Comparaţie Intervalul de timp Diferenţa medie (LOG) Statistic concludentă? (p<0.05)? Suma valorilor P A vs. B 60 min. 0.39 da ** (0.0058) A vs. B 90 min. 0.6741 da *** (0.001)

Astfel, rezultatele din acest exemplu demonstrează, că serul MASP-2 -/- are un nivel mai înalt de activitate bactericidă pentru N. meningitides, decât serul de la şoarecii WT.

EXEMPLUL 33

Acest exemplu demonstrează efectul inhibitor al deficienţei MASP-2 asupra lizării celulelor roşii din sânge în probele de sânge obţinute într-un model experimental de hemoglobinurie paroxistică nocturnă (PNH).

Fundal/actualitate.

Hemoglobinuria paroxistică nocturnă (PNH), denumită şi sindromul Marchiafava-Micheli, este o boală a sângelui, care poate pune viaţa în pericol, caracterizată prin anemie hemolitică intravasculară indusă de complement. Semnul distinctiv al PNH este hemoliza intravasculară cronică, mediată de complement, care este o consecinţă a activării neregulate a căii alternative a complementului datorită absenţei regulatoarelor complementare CD55 şi CD59 pe eritrocitele PNH, cu hemoglobinurie şi anemie ulterioare. (Lindorfer, M. A. et al., Blood 115 (11) (2010); Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11: 528-535 (2011)). Anemia în PNH se datorează distrugerii hematiilor din sânge. Simptomele PNH includ: urină roşie, datorită apariţiei hemoglobinei în urină, dureri de spate, oboseală, dispnee şi tromboză. PNH se poate dezvolta ca atare, denumită PNH primară sau în contextul altor afecţiuni ale măduvei osoase, cum ar fi anemia aplastică, denumită PNH secundară. Tratamentul PNH include transfuzia de sânge în cazul anemiei, anticoagulante în cazul trombozei şi utilizarea anticorpului monoclonal eculizumab (Soliris®), care protejează celulele sanguine împotriva distrugerii imune prin inhibarea sistemului complementului (Hillmen P. et al., N. Engl. Med. 350 (6): 552-9 (2004)). Eculizumab (Soliris®) este un anticorp monoclonal umanizat, care ţinteşte componenta complementară C5, blocând scindarea acesteia cu convertazele C5, împiedicând astfel producerea de C5a şi asamblarea MAC. Tratamentul pacienţilor cu PNH cu eculizumab rezultă cu o reducere a hemolizei intravasculare, măsurată cu lactatdehidrogenază (LDH), ceea ce conduce la stabilizarea hemoglobinei şi independent de transfuzie la aproximativ jumătate dintre pacienţi (Hillmen P. et al., Mini-Reviews in Medicinal Chimie, vol. 11 (6) (2011)). În timp ce aproape toţi pacienţii aflaţi în tratament cu eculizumab ating niveluri normale sau aproape normale de LDH (datorită controlului hemolizei intravasculare), doar aproximativ o treime dintre pacienţi ating o valoare a hemoglobinei care depăşeşte 11 g/dl, iar pacienţii trataţi în continuare cu eculizumab continuă să manifeste o anemie moderată până la severă (adică, dependentă de transfuzie) în proporţii aproximativ egale (Risitano A.M. et al., Blood 113: 4094-100 (2009)). Aşa cum s-a menţionat în literatura de specialitate (Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11: 528-535 (2011), s-a demonstrat că pacienţii cu PNH trataţi cu eculizumab conţin fragmente C3 legate cu o parte semnificativă din eritrocitele lor (în timp ce pacienţii netrataţi nu le conţin), conducând la concluzia că fragmentele de C3 legate cu membrana funcţionează ca opsonine pe eritrocite în PNH, rezultând cu entraparea lor în celulele reticuloendoteliale prin receptorii C3 specifici şi prin hemoliza extravasculară ulterioară. Prin urmare, strategiile terapeutice, adiţional la utilizarea eculizumabului, sunt necesare pentru acei pacienţi, care dezvoltă hemoliză extravasculară mediată de fragmentul C3, deoarece aceştia necesită în continuare transfuzii de hematii.

Acest exemplu descrie metode evaluare a efectului serului cu deficienţă de MASP-2 şi al serului tratat cu agent inhibitor al MASP-2 asupra lizării hematiilor din sângele colectat într-un model experimental de PNH la şoareci şi demonstrează eficacitatea inhibării MASP-2 la subiecţii trataţi, care suferă de PNH, şi sprijină, de asemenea, utilizarea inhibitorilor MASP-2 pentru ameliorarea efectelor hemolizei extravasculare, mediate de fragmentul C3, la subiecţii cu PNH trataţi cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizumab.

Metode.

Modelul experimental de PNH la animale.

Probele de sânge se colectează de la şoareci cu gene targhetate cu deficienţe de Crry şi C3 (Crry/C3-/-) şi de la şoareci cu deficienţă de CD55/CD59. La aceşti şoareci lipsesc regulatorii respectivi ai suprafeţei complementului, iar eritrocitele lor sunt, prin urmare, susceptibile la autoliza spontană a complementului, ca şi celulele sanguine din sângele omului cu PNH.

Pentru a sensibiliza aceste eritrocite şi mai mult, aceste celule se utilizează cu şi fără acoperire cu manan şi apoi se testează pentru hemoliză în plasma WT C56/BL6, plasma nulă MBL, plasma MASP-2 -/-, NHS umană, plasma MBL -/- umană şi NHS tratată cu anticorp anti-MASP-2 umană.

1. Testul de hemoliza a eritrocitelor murine dublu-deficitare de Crry/C3 şi CD55/CD59 în serurile cu depleţie/deficienţă de MASP-2 şi în serurile de control.

Ziua 1. Prepararea hematiilor murine (± aplicarea învelişului de manan)

Materialele includ: sânge proaspăt murin, BBS/Mg2+/Ca2+ (448 mM acid barbituric, 1,8 mM barbiton de sodiu, 145 mM NaCI, pH 7,4; 5 mM Mg2+, 5 mM Ca2+), clorură de crom, CrCI3·6H20 (0,5 mg/ml în BBS/Mg2+/Ca2+) şi manan, 100 µg/ml în BBS/Mg2+/Ca2+.

Sângele integral (2 ml) se centrifughează timp de 1-2 minute la 2000xg într-o centrifugă refrigerată la 4°C. Plasma şi pelicula leucocitară se aspiră. Proba se spală apoi de trei ori cu resuspendarea peletei de hematii în 2 ml BBS/gelatină/Mg2+/Ca2+ răcit cu gheaţă şi se repetă etapa de centrifugare. După a treia spălare, peleta se resuspendează în 4 ml BBS/Mg2+/Ca2+. O alicotă de 2 ml de hematii se separă în calitate control neacoperit. La restul de 2 ml se adaugă 2 ml CrCI3 şi 2 ml manan şi proba se incubează cu amestecare uşoară la temperatura camerei timp de 5 minute. Reacţia se finalizează prin adiţia a 7,5 ml de BBS/gelatină/Mg2+/Ca2+. Proba se centrifughează ca mai sus, se resuspendează în 2 ml BBS/gelatină/Mg2+/Ca2+ şi se spală încă de două ori ca mai sus, apoi se depozitează la 4°C.

Ziua 2. Testul de hemoliză.

Materialele includ: BBS/gelatină/Mg2+/Ca2+ (ca mai sus), seruri de testare, plăci cu fund rotund şi cu fund plat cu 96 de godeuri şi un spectrofotometru care citeşte plăci cu 96 de godeuri la 410…414 nm.

În primul rând se determină concentraţia de hematii şi concentraţia de celule se ajustează până la 109/ml şi se stochează la această concentraţie. Înainte de utilizare, tamponul de testare se diluează până 108/ml şi apoi se folosesc 100 µl per godeu. Hemoliza se măsoară la 410…414 nm (constatând sensibilitate mai mare, decât la 541 nm). Diluţiile serurilor de testare se prepară în BBS/gelatină/Mg2+/Ca2+ rece ca gheaţa. 100 µl din fiecare diluţie serică se pipetează în godeurile din plăcile cu fund rotund (vezi planul plăcii). Se adaugă 100 µl de preparat de hematii diluat în mod corespunzător (adică, 108/ml) (vezi planul plăcii), se incubează la 37°C timp de aproximativ 1 oră şi se observă liza. (Plăcile se pot fotografia în acest moment). Placa se centrifughează apoi la viteză maximă timp de 5 minute. Se aspiră 100 µl din faza lichidă, se transferă pe plăcile cu fund plat şi se înregistrează densitatea optică (OD) la 410…414 nm. Peletele de hematii se păstrează (acestea ulterior se lizează cu apă pentru a obţine un rezultat invers).

Experimentul #1.

Sângele proaspăt se colectează de la şoareci cu deficit dublu de CD55/CD59 şi sângele de la şoareci cu deficit dublu de Crry/C3 şi eritrocitele se prepară aşa cum s-a descris în detaliu în protocolul de mai sus. Celulele se împart şi pe jumătate din celule se aplică un strat de manan, iar cealaltă jumătate se lasă netratată, ajustând concentraţia finală până la 1x108 per ml, din care 100 µl se utilizează în testul de hemoliză, care se efectuează aşa cum se descrie mai sus.

Rezultatele Experimentului #1: Calea lectinei este implicată în liza eritrocitelor în modelul experimental de PNH pe animale.

Într-un experiment iniţial s-a constatat, că eritrocitele neacoperite cu manan de la şoareci WT nu au fost lizate în nici un ser de şoarece. De asemenea, s-a relevat, că eritrocitele acoperite cu manan de la şoarecii Crry -/- au fost lizate lent (mai mult de 3 ore la 37 de grade) în serul de şoareci WT, dar ele nu au fost lizate în serul MBL nul. (Datele nu sunt arătate).

S-a constatat, că eritrocitele de la şoareci Crry -/- acoperite cu manan au fost rapid lizate în serul uman, dar nu în NHS inactivat termic. Foarte important, eritrocitele acoperite cu manan de la şoareci Crry -/- au fost lizate în NHS diluat până la 1/640 (adică liza s-a produs în toate diluţiile 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 şi 1/640). (Datele nu sunt afişate). În această diluţie, calea alternativă nu funcţionează (activitatea funcţională a căii alternative este redusă semnificativ în concentraţie serică sub 8%).

Concluzii din Experimentul #1.

Eritrocitele acoperite cu manan de la şoarecii Crry -/- sunt foarte bine lizate în ser uman foarte diluat cu MBL, dar nu şi în cel fără MBL. Liza eficientă în fiecare concentraţie serică testată atestă, că calea alternativă nu este implicată sau necesară pentru această liză. Incapacitatea serului de la şoarecii cu deficit de MBL şi a serului uman de a liza eritrocitele acoperite cu manan de la şoarecii Crry -/- indică, că calea clasică, de asemenea, nu are implicaţii în liza observată. Deoarece sunt necesare molecule de recunoaştere ale căii lectinei (adică, MBL), această liză este mediată de calea lectinei.

Experimentul #2.

Sângele proaspăt se colectează de la şoarecii cu deficit dublu Crry/C3 şi CD55/CD59 şi eritrocitele acoperite cu manan de la şoareci Crry -/- se analizează în testul de hemoliză, aşa cum se descrie mai sus, în prezenţa următorului ser uman: MBL nul; WT; NHS pretratat cu anticorp anti-MASP-2 umană; şi NHS inactivat termic în calitate de control.

Rezultatele Experimentului #2: inhibitorii MASP-2 preîntâmpină liza eritrocitelor într-un model experimental de PNH la animale.

Serul de la om sănătos (NHS) cu eritrocitele acoperite cu manan de la şoareci Crry -/-, NHS se incubează în diluţii descendente până la 1/640 (adică 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 şi 1/640) de ser MBL uman -/-, NHS pretratat cu anticorp monoclonal (mAb) anti-MASP-2 şi NHS inactivat termic în calitate de control.

Placa de microtitrare ELISA se centrifughează şi eritrocitele nelizate se colectează de pe fundul plăcii cu fund rotund. Supernatantul fiecărui godeu se colectează şi cantitatea de hemoglobină, eliberată din eritrocitele lizate, se măsoară prin citirea OD la 415 nm într-un cititor ELISA.

În NHS inactivat termic de control (control negativ), aşa cum era de aşteptat, nu se observă nici o liză. Eritrocitele de şoarece acoperite cu manan sunt lizate în ser MBL -/- uman la diluţii de 1/8 şi 1/16. Eritrocitele acoperite cu manan de şoarece sunt lizate în NHS pretratat cu anticorp anti-MASP-2 la diluţii de 1/8 şi 1/16, în timp ce eritrocitele acoperite cu manan sunt lizate în ser uman WT până la diluţii de 1/32.

FIG. 40 grafic ilustrează hemoliza (măsurată prin eliberarea hemoglobinei din eritrocitele de şoarece lizate (Cryy/C3 -/-) în supernatant prin fotometrie) eritrocitelor murine acoperite cu manan cu serul uman într-o gamă de diferite concentraţii de ser inactivat termic (HI) NHS, MBL -/-, NHS pretreat cu anticorpi anti-MASP-2 şi NHS control.

Rezultatele prezentate în fig. 40 atestă, că inhibarea MASP-2 cu anticorp anti-MASP-2 modifică în mod semnificativ CH50 şi inhibă liza mediată de complement a eritrocitelor sensibilizate cu protecţie deficitară faţă de activarea complementului autolog.

Experimentul #3.

Sângele proaspăt se colectează de la şoarecii cu deficit dublu Crry/C3 şi CD55/CD59 şi eritrocitele acoperite cu manan de la şoarecii Crry -/- se analizează în testul de hemoliză, aşa cum se descrie mai sus, în prezenţa următorului ser: MBL -/-; ser WT; NHS pretratat cu anticorp uman anti-MASP-2; şi NHS inactivat termic în calitate de control.

Rezultate.

Fig. 41 ilustrează grafic hemoliza (măsurată prin eliberarea hemoglobinei eritrocitelor murine WT lizate în supernatant prin fotometrie) eritrocitelor murine neacoperite cu ser uman într-o gamă de diferite concentraţii de ser (HI) NHS inactivat termic, MBL-/-, NHS pre-tratat cu anticorp anti-MASP-2, si NHS în calitate de control. După cum se arată în fig. 41, inhibarea MASP-2 rezultă cu inhibarea lizei mediate de complement a eritrocitelor nesensibilizate de la şoarecii WT.

FIG. 42 ilustrează grafic hemoliza (măsurată prin eliberarea hemoglobinei eritrocitelor murine (CD55/59 -/-) lizate în supernatant prin fotometrie) eritrocitelor murine neacoperite cu ser uman într-o gamă de diferite concentraţii de ser (H1) NHS inactivat termic, MBL-/-, NHS pre-tratat cu anticorp anti-MASP-2, si NHS în calitate de control.

Valorile CH50 în funcţie de concentraţiile serice

Tabelul 12

Ser WT CD55/59 -/- NHS inactivat termic Fără liză Fără liză Donator MBL AO/XX (MBL deficient) 7.2% 2.1% NHS + anticorp anti-MASP-2 5.4% 1.5% NHS 3.1% 0.73%

Notă: “CH50” reprezintă valoarea, la care hemoliza, mediată de complement, atinge 50%.

Astfel, rezultatele din acest exemplu demonstrează, că inhibarea MASP-2 conduce la inhibarea lizei, mediate de complement, a eritrocitelor sensibilizate şi nesensibilizate cu protecţie deficitară faţă de activarea complementului autolog. De aceea, inhibitorii MASP-2 pot fi utilizaţi pentru a trata pacienţi care suferă de PNH şi pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru ameliorarea (inhibarea, prevenirea sau reducerea severităţii) hemolizei extravasculare la pacienţii cu PNH aflaţi sub tratament cu un inhibitor de C5, cum ar fi eculizumab (Soliris®).

EXEMPLUL 34

Acest exemplu descrie un studiu adiţional la studiului descris mai sus în exemplul 29, furnizând dovezi suplimentare, care confirmă că un inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp anti-MASP-2, este eficient în tratamentul expunerii la radiaţie şi/sau pentru tratamentul, ameliorarea sau prevenirea sindromului acut de iradiere.

Actualitate: În studiul iniţial, descris în exemplul 29, s-a demonstrat că tratamentul pre-iradiere al şoarecilor cu un anticorp anti-MASP-2 a îmbunătăţit supravieţuirea şoarecilor iradiaţi, comparativ cu animalele de control iradiate şi tratate cu placebo, la ambele niveluri de expunere de 6.5 Gy şi 7.0 Gy. În exemplul 29 s-a demonstrat în continuare, că la nivelul expunerii de 6,5 Gy tratamentul post-iradiere cu anticorp anti-MASP-2 a condus la o creştere modestă a supravieţuirii, comparativ cu animalele iradiate de control tratate cu placebo. Acest exemplu descrie un al doilea studiu cu iradiere, care s-a efectuat pentru a confirma rezultatele primului studiu.

Metode.

Proiectarea studiului A.

Şoarecii din linia Swiss Webster (n = 50) se expun la radiaţii ionizante (8,0 Gy). Se evaluează efectul asupra mortalităţii a terapiei cu anticorpi anti-MASP-2 (mAbH6 5 mg/kg), administraţi cu 18 ore până la şi 2 ore după expunerea la radiaţii şi săptămânal după aceea.

Rezultatele studiului A.

După cum se arată în fig. 43, administrarea anticorpului mAbH6 anti-MASP-2 creşte supravieţuirea şoarecilor expuşi la 8,0 Gy, cu o rată de supravieţuire medie ajustată crescând de la 4 până la 6 zile, comparativ cu şoarecii de control care au administrat placebo şi o reducere a mortalităţii cu 12%, comparativ cu şoarecii de control, care au administrat placebo (criteriul de rang logaritmic, p = 0,040).

Proiectarea studiului B.

Şoarecii din linia Swiss Webster (n = 50) se expun la radiaţii ionizante (8,0 Gy) în grupele următoare de control (I: cu placebo) soluţie fiziologică în calitate de control; (II: cu doză joasă) anticorp mAbH6 anti-MASP-2 (5 mg/kg) administrat cu 18 ore înainte de iradiere şi peste 2 ore după iradiere; (III: cu doză înaltă) mAbH6 (10 mg/kg) administrat cu 18 ore înainte de iradiere şi peste 2 ore după iradiere; şi (IV: cu doză înaltă post-iradiere) mAbH6 (10 mg/kg) administrat peste 2 ore după iradiere.

Rezultatele studiului B.

Administrarea pre- şi post-iradiere a anticorpilor anti-MASP-2 a ajustat supravieţuirea medie de la 4 până la 5 zile, comparativ cu animalele de control, care au administrat placebo. Mortalitatea la şoarecii trataţi cu anticorpi anti-MASP-2 este mai joasă cu 6-12%, comparativ cu animalele de control, care au administrat placebo. Se observă, de asemenea, absenţa efectelor nocive semnificative în cadrul tratamentului (datele nu sunt prezentate).

Astfel, rezultatele prezentate în acest exemplu sunt în concordanţă cu rezultatele prezentate în exemplul 29 şi demonstrează adiţional, că anticorpii anti-MASP-2 sunt eficienţi în tratarea unui mamifer, care prezintă risc sau suferă de efectele dăunătoare ale sindromului acut de iradiere.

EXEMPLUL 35

Acest studiu investighează efectul deficienţei MASP-2 într-un model experimental de tromboză indusă cu LPS (lipopolizaharidă) la şoareci.

Actualitate.

Sindromul uremic hemolitic (HUS), care este cauzat de infecţia cu E. coli producătoare de toxine Shiga, este principala cauză a insuficienţei renale acute la copii. În acest exemplu, s-a utilizat un model experimental Schwartzman de tromboză indusă cu LPS (coagulare microvasculară) la şoarecii MASP-2 -/- (KO) pentru a determina eficienţa inhibării MASP-2 pentru inhibarea sau prevenirea formării trombilor intravasculari.

Metode.

Şoarecii MASP-2 -/- (n = 9) şi WT (n = 10) se analizează într-un model experimental Schwarztman de tromboză indusă cu LPS (coagulare microvasculară). La şoareci se administrează LPS Serratia, iar formarea de trombi se monitorizează în timp. Se efectuează o comparaţie a incidenţei microtrombilor şi a coagulării microvasculare induse cu LPS.

Rezultate.

Este necesar de subliniat, că la toţi şoarecii MASP-2 -/- testaţi (9/9) după administrarea LPS Serratia nu s-au format trombi intravasculari. În contrast, microtrombii s-au detectat la 7 din 10 şoareci WT, testaţi în paralel (p = 0,0031, testul exact Fischer). După cum se arată în fig. 44, timpul de apariţie a ocluziunii microvasculare după infecţia cu LPS s-a măsurat la şoareci MASP-2 -/- şi WT, arătând procentul şoarecilor WT cu formarea trombilor, măsurată timp de 60 de minute, cu formarea trombilor detectată deja aproximativ peste 15 minute. Până la 80% din şoarecii WT peste 60 de minute au prezentat formare de trombi. În contrast, aşa cum se arată în fig. 44, peste 60 de minute la nici unul dintre şoarecii MASP-2 -/- nu s-a detectat formare de trombi (criteriul de rang logaritmic: p = 0,0005).

Aceste rezultate demonstrează, că inhibarea MASP-2 este protectivă împotriva formării de trombi intravasculari într-un model HUS.

EXEMPLUL 36

Acest exemplu descrie efectul anticorpilor anti-MASP-2 într-un model experimental de HUS la şoareci cu utilizarea injectării intraperitoneale a toxinei Shiga 2 purificate (STX2) şi LPS.

Fundal.

S-a elaborat un model experimental de şoareci cu HUS utilizând injectarea intraperitoneală a toxinei Shiga 2 purificate (STX2) şi LPS. Analiza biochimică şi a microcipurilor rinichilor şoarecilor a relevat, că acţiunea STX2 plus LPS diferă de efectele fiecărui agent solitar. Analiza sângelui şi serului acestor şoareci a evidenţiat neutrofilie, trombocitopenie, hemoliza hematiilor şi creşterea nivelului de creatinină serică şi a azotului din uree. Mai mult decât atât, analiza histologică şi microscopia electronică a rinichilor de şoarece atestă depunerea fibrinei în glomerul, congestia hematiilor, formarea microtrombilor şi modificări ultrastructurale glomerulare. S-a constatat, că acest model experimental de HUS la animale induce toate simptomele clinice ale patologiei HUS uman la şoarecii din linia C57BL/6, incluzând trombocitopenie, anemie hemolitică şi insuficienţă renală, care definesc boala umană. (J. Immunol. 187 (1): 172-80 (2011)).

Metode.

Şoarecii femele din linia C57BL/6 cu masa între 18 şi 20 g, achiziţionaţi de la Charles River Laboratories, au fost împărţiţi în 2 grupe (câte 5 şoareci în fiecare grupă). O grupă de şoareci se pretratează prin injecţie intraperitoneală (ip) cu anticorp recombinant mAbM11 anti-MASP-2 (100 µg per şoarece, corespunzând unei concentraţii finale de 5 mg/kg greutate corporală), diluat într-un volum total de 150 µl soluţie fiziologică. În grupa de control se administrează soluţie fiziologică fără nici un anticorp. Peste şase ore după injectarea i.p a anticorpului mAbM11 anti-MASP-2, la toţi şoarecii se administrează o combinaţie de injecţie i.p. de o doză subletală (3 µg/animal, corespunzătoare la 150 µg/kg de greutate corporală) de LPS de Serratia marcescens (L6136, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) şi o doză de 4,5 µg/animal (corespunzând la 225 µg/kg greutate corporală) de STX2 (de două depăşind LD50) într-un volum total de 150 µl. Injectarea soluţiei fiziologice se utilizează pentru control.

Supravieţuirea şoarecilor se monitorizează la fiecare 6 ore după administrare. Şoarecii se sacrifică de îndată ce ajung în stadiul letargic al patologiei HUS. Peste 36 de ore toţi şoarecii se sacrifică şi ambii rinichi se prelevă pentru analiza imunohistochimică şi scanare cu microscopie electronică. Probele de sânge se prelevă la sfârşitul experimentului prin puncţie cardiacă. Serul se separă şi păstrează congelat la -80°C pentru măsurarea nivelurilor de BUN şi de creatinină serică atât în grupul tratat, cât şi în cel de control.

Analiza imunohistochimică.

O treime din fiecare rinichi de şoarece s-a fixat în 4% paraformaldehidă timp de 24 ore, s-a prelucrat şi s-a înglobat în parafină. Secţiunile cu grosimea de 3 microni s-au tăiat şi s-au plasat pe lamele pregătite pentru colorarea ulterioară cu hematoxilină şi eozină.

Microscopia electronică.

Secţiunea mijlocie a rinichilor s-a tăiat în blocuri de aproximativ 1 până la 2 mm3 şi s-a fixat peste noapte la 4°C în 2,5% glutaraldehidă în 1 x PBS. Ţesutul fixat ulterior s-a prelucrat la Facultatea de Microscopie Electronică din cadrul Universităţii din Leicester

Secţiuni de criostat.

Cealaltă treime din rinichi s-a tăiat în blocuri de aproximativ 1 până la 2 mm3 şi s-a congelat în azot lichid şi s-a menţinut la -80°C pentru secţiunile de criostat şi analiza ARNm.

Rezultate.

Fig. 45 ilustrează grafic procentul supravieţuirii şoarecilor trataţi cu soluţie fiziologică (n = 5) şi a şoarecilor trataţi cu anticorpi anti-MASP-2 (n = 5) în modelul indus cu STX/LPS în timp (ore). În mod deosebit se cere menţionat, că, aşa cum se arată în fig. 45, toţi şoarecii de control au murit peste 42 de ore. În contrast, 100% dintre şoarecii trataţi cu anticorpi anti-MASP-2 au supravieţuit pe tot parcursul experimentului. În concordanţă cu rezultatele prezentate în FIG. 45, s-a observat că toţi şoarecii netrataţi, care au murit, sau care au trebuit să fie trataţi cu semne de boală severă au avut leziuni glomerulare semnificative, în timp ce glomerulul tuturor şoarecilor trataţi cu anti-MASP-2 se prezenta normal (datele nu sunt prezentate). Aceste rezultate demonstrează, că inhibitorii MASP-2, cum ar fi anticorpii anti-MASP-2, pot fi utilizaţi pentru a trata subiecţii care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei microangiopatii trombotice (TMA), cum ar fi sindromul hemolitic uremic (HUS) (aHUS) sau purpura trombocitopenică trombotică (TTP).

EXEMPLUL 37

Acest exemplu descrie efectul deficienţei MASP-2 şi inhibării MASP-2 într-un model experimental murin de tromboză în rezultatul leziunilor celulelor endoteliale induse de FITC-dextran/lumină.

Fundal/Actualitate: Aşa cum s-a demonstrat în exemplele 35 şi 36, deficienţa de MASP-2 (MASP-2 KO) şi inhibarea MASP-2 (prin administrarea unui anticorp MASP-2 inhibitor) protejează şoarecii într-un model de HUS tipic, în care şoarecii de control expuşi acţiunii STX şi LPS au dezvoltat HUS sever şi începeau a agoniza sau au murit timp de 48 de ore. De exemplu, aşa cum se arată în fig. 54, toţi şoarecii trataţi cu un anticorp inhibitor MASP-2 şi apoi expuşi la STX şi LPS au supravieţuit (criteriul exact Fisher p <0,01; N = 5). Astfel, terapia anti-MASP-2 protejează şoarecii în acest model de HUS.

Următoarele experimente s-au efectuat pentru a analiza efectul deficienţei MASP-2 şi a inhibării MASP-2 într-un model experimental de microangiopatie trombotică (TMA) la şoareci în rezultatul leziunilor celulelor endoteliale, indusă cu izotiocianat de fluoresceină (FITC)-dextran, pentru a demonstra în continuare beneficiul inhibitorilor MASP-2 în tratamentul HUS, aHUS, TTP şi TMA de alte etiologii.

Metode.

Microscopie intravitală.

Şoarecii se prepară pentru microscopie intravitală aşa cum descrie Frommhold et al., BMC Immunology 12: 56-68, 2011. Succint, şoarecii se anesteziază cu injecţie intraperitoneală (ip) de chetamină (125 mg/kg greutate corporală, Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Germania) şi xilazină (12,5 mg/kg greutate corporală, Rompun, Bayer, Leverkusen, Germania) şi se plasează pe un aşternut cu încălzire pentru a menţine temperatura corpului la 37°C. Microscopia intravitală se realizează cu un microscop vertical (Leica, Wetzlar, Germania) cu un obiectiv de imersie (soluţie fiziologică) (cu mărire 40/0,75 apertură numerică SW 40/0,75, Zeiss, Jena, Germania). Pentru a facilita respiraţia şoarecii se intubează utilizând tubul PE 90 (Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA). Artera carotidă stângă se canulează cu tubul PE10 (Becton Dickson şi Company, Sparks, MD, USA) pentru colectarea probelor de sânge şi administrarea sistemică a anticorpului monoclonal (mAb).

Prepararea muşchiului cremaster.

Prepararea chirurgicală a muşchiului cremaster pentru microscopia intravitală se realizează aşa cum descrie Sperandio et al., Blood, 97: 3812-3819, 2001. Succint, scrotul se deschide şi muşchiul cremaster se mobilizează. După incizia longitudinală şi extinderea muşchiului pe o sticlă de acoperire, epididimul şi testiculul se mişcă lateral şi se fixează, oferind acces microscopic complet la microcirculaţia muşchiului cremaster. Venulele muşchiului cremaster se înregistrează cu o cameră CCD (CF8/1; Kappa, Gleichen, Germania) pe un aparat de înregistrare Panasonic S-VHS. Muşchiul cremaster se perfuzează cu soluţie fiziologică tamponată cu bicarbonat termoreglată (35°C), aşa cum descrie anterior Frommhold et al., BMC Immunology 12: 56-68, 2011.

Fotoexcitarea modelului de leziune cauzat de FITC-dextran.

O leziune vasculară controlată, dependentă de doza luminii, a endoteliului din venulele şi arteriolele muşchiului cremaster se induce prin excitare fototoxică cu (FITC)-dextran (cat. nr. FD150S, Sigma Aldrich, Poole, U.K.). Această procedură iniţiază tromboza localizată. În calitate de reactiv fototoxic, se injectează 60 µl de 10% m/v soluţie de FITC-dextran prin accesul arterei carotide stângi şi se lasă să se răspândească omogen în întregul sânge circulant timp de 10 min. După selectarea unui venule bine perfuzate, lumina cu halogen de intensitate medie (800-1500) se concentrează asupra vasului studiat pentru a induce fluorescenţă FITC-dextran şi fototoxicitate de la uşoară până la moderată pentru suprafaţa endotelială pentru a stimula tromboza într-un mod reproductibil, controlat. Intensitatea fototoxică a luminii necesară pentru excitarea FITC-dextranului se generează utilizând o lampă cu halogen (12V, 100W, Zeiss, Oberkochen, Germania). Fototoxicitatea, rezultată din excitarea indusă de lumină a fluorocromului, depinde pragul de intensitate al fluxului de lumină şi/sau de durata de iluminare şi este cauzată fie de încălzirea directă a suprafeţei endoteliale, fie de generarea de radicali reactivi de oxigen, aşa cum descrie Steinbauer et al., Langenbecks Arch Surg 385: 290 - 298, 2000.

Intensitatea luminii, aplicată pe fiecare vas, se măsoară utilizând un detector cu diode care modifică lungimea de undă pentru măsurători de putere redusă (Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, SUA). Analiza off-line a scanărilor video se realizează cu un sistem de analiză a microcirculaţiei asistată de calculator (CAMAS, Dr. Zeintl, Heidelberg) şi viteza hematiilor se măsoară aşa cum descrie Zeintl et al., Int J Microcirc Clin Exp. 3): 293-302, 2000.

Aplicarea anticorpului monoclonal (mAbH6) inhibitor al MASP-2 umană şi controlul cu placebo înainte de inducerea trombozei.

Folosind o schemă de studiu orb, la şoarecii masculi WT din linia C57BL/6 de vârstă de 9 săptămâni s-a administrat i.p. în injecţii fie anticorpul monoclonal recombinant (mAbH6) anti-MASP-2 umană, un inhibitor al activităţii funcţionale a MASP-2 (administrat într-o concentraţie finală de 10 mg/kg greutate corporală), sau aceeaşi cantitate dintr-un anticorp izotip în calitate de control (fără activitate inhibitoare asupra MASP- 2) cu 16 ore înainte de inducerea fototoxică a trombozei în modelul experimental de microscopie intravitală a muşchiului cremaster. Cu o oră înainte de inducerea trombozei, s-a administrat a doua doză fie de mAbH6, sau de anticorp de control. Şoarecii cu MASP-2 knockout (KO) au fost, de asemenea, evaluaţi în acest model.

Anticorpul monoclonal mAbH6 (creat împotriva MASP-2 umană recombinantă) este un inhibitor puternic al activităţii funcţionale a MASP-2 umane, care reacţionează încrucişat, se leagă cu MASP-2 şi inhibă MASP-2 murină, dar cu o afinitate mai redusă datorită specificităţii sale de specie (datele nu sunt prezentate). Pentru a compensa afinitatea joasă a mAbH6 la MASP-2 de şoarece, mAbH6 s-a luat într-o concentraţie mare (10 mg/kg greutate corporală) pentru a depăşi variaţia specificităţii de specie şi o afinitate mai redusă pentru MASP-2 de şoarece şi pentru a asigura blocarea eficientă a activităţii funcţionale a MASP-2 murine in vivo.

În acest studiu orb s-a înregistrat timpul necesar pentru o ocluzie completă a fiecărei venule testate (criteriile de selecţie: diametre şi velocitatea fluxului sangvin comparabile).

Procentul şoarecilor cu ocluzie microvasculară, timpul de debut şi durata până la apariţia ocluziei s-a evaluat timp de 60 de min de observaţie, utilizând înregistrări video cu microscopie intravitală.

Rezultate.

Fig. 46 ilustrează grafic, în funcţie de timpul după inducerea leziunii, procentul şoarecilor cu ocluzie microvasculară în modelul FITC/Dextran UV după tratamentul cu anticorp de control izotip sau cu anticorpul mAbH6 anti-MASP-2 umană (10 mg/kg) dozat la 16 ore şi 1 ora înainte de injectarea FITC/Dextran. După cum se arată în fig. 46, la 85% dintre şoarecii de tip sălbatic, care au primit anticorpul de control izotip, ocluzia se instalează în decurs de 30 de minute sau mai puţin, în timp ce numai la 19% dintre şoarecii de tip sălbatic pre-trataţi cu anticorpul (mAbH6) anti-MASP-2 umană ocluzia s-a constatat în aceiaşi perioadă de timp, iar timpul de ocluzie a întârziat la şoarecii din grupa, în care în cele din urmă ocluzia s-a instalat, tratată cu anticorp anti-MASP-2 umană. Mai mult decât atât, s-a constatat, că la trei dintre şoarecii trataţi cu mAbH6 anti-MASP-2 nu s-a observat ocluzie în perioada de observaţie de 60 de min (adică au fost protejaţi împotriva ocluziei trombotice).

Fig. 47 ilustrează grafic timpul de ocluzie în minute pentru şoarecii trataţi cu anticorpul (mAbH6) anti-MASP-2 umană şi cu anticorpul de control izotip. Datele sunt prezentate sub formă de puncte de dispersie cu valori medii (linii orizontale) şi linii ale erorilor standard (linii verticale). În această figură se arată timpul de ocluzie la şoarecii, la care ocluzia a fost observată. Astfel, cei trei şoareci trataţi cu anticorp MASP-2, la care ocluzia nu s-a instalat în perioada de observaţie de 60 de min, nu au fost incluşi în această analiză (nu a existat nici un şoarece tratat cu control, la care să nu se observe ocluzie). În calitate de criteriu statistic, folosit pentru analiză, s-a utilizat criteriul Stufent impar; în care simbolul "*" indică p = 0,0129. După cum se arată în fig. 47, la cei şase şoareci trataţi cu anticorpi (mAbH6) anti-MASP-2, la care s-a observat ocluzie, tratamentul cu anticorp anti-MASP-2 prelungea semnificativ timpul de ocluzie venoasă în modelul de tromboză, indusă de leziuni ale celulelor endoteliale cu FITC-dextran/lumină cu o intensitate joasă a luminii (800…1500), în comparaţie cu şoarecii trataţi cu anticorp de control izotip. Timpul mediu de ocluzie completă pentru anticorpul de controlul izotip a constituit 19,75 min, în timp ce timpul mediu de ocluzie completă în grupa de şoareci, trataţi cu anticorp anti-MASP-2 a constituit 32,5 min.

Fig. 48 ilustrează grafic timpul până la ocluzie în minute la şoarecii de tip sălbatic, şoarecii MASP-2 KO şi şoarecii de tip sălbatic pre-trataţi cu anticorp (mAbH6) MASP-2 uman administrat i.p. în doză de 10 mg/kg cu 16 ore înainte şi apoi administrat repetat i.v. cu 1 oră înainte de inducerea trombozei în modelul de tromboză indusă de leziuni ale celulelor endoteliale cu FITC-dextran/lumină cu o intensitate joasă a luminii (800…1500). În fig. 48 au fost incluse numai animalele, la care s-a constatat ocluzie; n = 2 pentru şoarecii de tip sălbatic, care au administrat anticorp de control izotip; n = 2 pentru MASP-2 KO şi n = 4 pentru şoarecii de tip sălbatic, care au administrat anticorp (mAbH6) MASP-2 uman. Simbolul "*" indică p <0,01. După cum se arată în fig. 48, deficitul de MASP-2 şi inhibarea MASP-2 (mAbH6 la 10 mg/kg) au prelungit timpul de instalare a ocluziei venoase în modelul de tromboză indusă de leziuni ale celulelor endoteliale cu FITC-dextran/lumină cu o intensitate joasă a luminii (800…1500).

Concluzii.

Rezultatele din acest exemplu demonstrează în continuare, că într-un model murin de TMA un agent inhibitor al MASP-2, care blochează calea lectinei (de exemplu anticorpii care blochează funcţia MASP-2), inhibă coagularea şi tromboza microvasculară, semnele distinctive ale tulburărilor microangiopatice multiple. Prin urmare, este de aşteptat ca administrarea unui agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp inhibitor al MASP-2, să fie o terapie eficientă la pacienţii care suferă de HUS, aHUS, TTP sau alte tulburări microangiopatice şi asigură protecţie împotriva coagulării microvasculare şi trombozei.

EXEMPLUL 38

Acest exemplu descrie un studiu, care demonstrează că anticorpul (mAbH6) inhibitor al MASP-2 umană nu influenţează asupra funcţiei trombocitare în plasmă umană bogată în trombocite.

Fundal/Actualitate.

Cum se descrie în Exemplul 37, s-a demonstrat că inhibarea MASP-2 cu anticorpul (mAbH6) inhibitor al MASP-2 umană prelungeşte timpul de instalare a ocluziei venoase în modelul experimental de tromboză indusă de leziuni ale celulelor endoteliale cu FITC-dextran/lumină. Următorul experiment s-a realizat pentru a determina influenţa anticorpului (mAbH6) inhibitor al MASP-2 asupra funcţiei plachetare.

Metode: Influenţa anticorpului mAbH6 anti-MASP-2 umană se testează pe agregarea trombocitelor indusă cu ADP după cum urmează. Soluţia de anticorp mAbH6 anti-MASP-2 umană într-o concentraţie de 1 µg/ml sau 0,1 µg/ml se adăugă în 40 µl până la 360 µl soluţie de plasmă umană bogată în trombocite proaspăt preparată. Un anticorp de control izotip se utilizează în calitate de control negativ. După adiţia anticorpilor la plasmă, activarea plachetară se induce prin adăugarea ADP într-o concentraţie finală de 2 µM. Analiza se iniţiază prin agitarea soluţiilor cu un magnet mic într-o cuva cu un volum de 1 ml. Agregarea plachetară se măsoară într-un agregometru plachetar Model 700 Chrono-log cu două canale optic luminescent pentru trombocite din sânge integral.

Rezultate.

Procentul agregării in soluţii se măsoară timp de cinci minute. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 13.

Agregarea plachetară timp de 5 min

Tabelul 13

Anticorpul Amplitudinea (procentul agregării) Unghiul de înclinaţie a curbei (procentul agregării în funcţie de timp) Anticorpul (mAbH6) anti-MASP-2 (1 µg/ml) 46% 59 Anticorpul de control izotip (1 µg/ml) 49% 64 Anticorpul (mAbH6) anti-MASP-2 (0.1 µg/ml) 52% 63 Anticorpul de control izotip (0.1 µg/ml) 46% 59

Aşa cum se observă din Tabelul 13, nu se atestă o diferenţă semnificativă între agregarea trombocitelor induse de ADP, tratate cu anticorpul de control sau cu anticorpul mAbH6 anti-MASP-2. Aceste rezultate demonstrează, că anticorpul (mAbH6) anti-MASP-2 umană nu exercită nici un efect asupra funcţiei plachetare. Prin urmare, rezultatele descrise în exemplul 37, care demonstrează că inhibarea MASP-2 cu anticorp (mAbH6) inhibitor al MASP-2 umane prelungeşte timpul de instalare a ocluziei venoase în modelul de tromboză, indusă de leziuni ale celulelor endoteliale cu FITC-dextran/lumină, dar nu exercită efect asupra funcţiei plachetare. Astfel, inhibarea MASP-2 previne tromboza fără a afecta direct funcţia plachetară, dezvăluind un mecanism terapeutic, care este diferit de cel exercitat de agenţii antitrombotici existenţi.

EXEMPLUL 39

Acest exemplu descrie influenţa inhibării MASP-2 asupra formării trombilor şi ocluziei vaselor într-un model experimental murin de TMA.

Fundal/actualitate.

Calea lectinei joacă un rol dominant în activarea sistemului complementului în condiţii de stres sau de leziuni ale celulelor endoteliale. Această activare este amplificată rapid prin calea alternativă, care este disregulată la mulţi pacienţi care prezintă aHUS. Prevenirea activării MASP-2 şi a căii lectinei este, astfel, de aşteptat să oprească consecutivitatea reacţiilor enzimatice, care conduc la formarea complexului de atac al membranei, activarea trombocitelor şi recrutarea leucocitelor. Acest efect limitează deteriorarea ţesuturilor.

Adiţional, MASP-2 are activitate asemănătoare cu factorul Xa şi scindează protrombina cu formarea de trombină. Această activare de către MASP-2 a sistemului de coagulare poate dezechilibra hemostaza şi rezulta cu patologia TMA. Astfel, se aşteaptă ca inhibarea MASP-2, utilizând un inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp inhibitor al MASP-2 care blochează activarea complementului şi a sistemelor de coagulare, să îmbunătăţească rezultatele în aHUS şi în alte stări legate de TMA.

Cum s-a descris în Exemplul 37, s-a demonstrat că inhibarea MASP-2 cu anticorp (mAbH6) inhibitor al MASP-2 umană prelungeşte timpul de instalare a ocluziei venoase în modelul de tromboză indusă de leziuni ale celulelor endoteliale cu FITC-dextran/lumină. În acest model de TMA, şoarecii au fost sensibilizaţi prin injectarea intravenoasă de FITC-dextran, urmată de fotoactivarea localizată a FITC-dextranului în microvascularizaţia muşchiului cremaster la şoarece (Thorlacius H et al., Eur J Clin Invest 30 9): 804-10, 2000; Agero et al., Toxicon 50 (5): 698-706, 2007).

Următorul experiment s-a realizat pentru a determina efectul doză-răspuns al anticorpului (mAbH6) inhibitor al MASP-2 asupra formării trombilor şi ocluziei vasculare într-un model experimental murin de TMA.

Metode: Tromboza localizată se induce prin fotoactivarea dextranului marcat cu fluoresceină-izotiocianat (FITC-dextran) în microvascularizaţia muşchiului cremaster la şoarecii din linia C57 Bl/6 şi microscopia intravitală se utilizează pentru a măsura debutul formării trombilor şi ocluziei vasului, utilizând metodele descrise în Exemplul 37 cu următoarele modificări. La şoarecii din grupe se administrează mAbH6 (2 mg/kg, 10 mg/kg sau 20 mg/kg) sau anticorp de control izotip (20 mg/kg) prin injecţie intravenoasă (iv) cu o oră înainte de inducerea TMA. Se înregistrează timpul până la debutul formării trombilor şi timpul până la ocluzia completă a vaselor. Analiza redării video a imaginilor microscopice intravitale, înregistrate timp de 30 până la 60 de minute se utilizează pentru a evalua dimensiunea vasului, velocitatea fluxului sanguin, intensitatea luminii, viteza începutului formării trombilor ca echivalent al adeziunii plachetelor, timpul până la începutul formării trombilor, viteza ocluziei complete a vasului şi timpul până la ocluzia completă a vaselor. Analiza statistică se realizează utilizând SigmaPlot v12.0.

Rezultate.

Iniţierea formării trombilor.

Fig. 49 este un grafic Kaplan-Meier, care prezintă procentul şoarecilor cu trombi în funcţie de timp în microangiopatia trombotică indusă de FITC-Dextran la şoarecii trataţi cu doze crescânde anticorp inhibitor al MASP-2 umană (mAbH6 în doză de 2 mg/kg, 10 mg/kg sau 20 mg/kg) sau de anticorp de control izotip. După cum se arată în fig. 49, iniţierea formării trombilor întârzie la şoarecii trataţi cu mAbH6 într-o manieră dependentă de doză, comparativ cu şoarecii trataţi cu control.

Fig. 50 ilustrează grafic timpul mediu (în minute) până la începutul formării trombilor în funcţie de doza de mAbH6 (* p <0,01, comparativ cu controlul). După cum se arată în fig. 50, timpul mediu până la debutul formării trombului creşte în funcţie de majorarea dozei de mAbH6 de la 6,8 minute în grupa de control până la 17,7 minute în grupa tratată cu mAbH6 în doză de 20 mg/kg (p <0,01). Datele experimentale de bază şi analiza statistică sunt prezentate în tabelele 14 şi 15.

Timpul până la debutul formării trombilor la unii şoareci aparte, înregistrat în baza evaluării înregistrărilor video, este detaliat în continuare în Tabelul 14.

Timpul până la debutul formării trombului după leziune indusă cu colorant şi lumină

Tabelul 14

Administrarea anticorpului de control Administrarea anticorpului mAbH6 Timpul până la iniţierea formării trombului (min) Control 2 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 6.07 5.93 12.75 10.00 1.07 6.95 2.53 10.33 8.00 8.92 14.00 21.00 2.40 11.92 3.05 11.50 8.48 12.75 8.00 19.00 4.00 12.53 8.17 10.37 4.00 15.83 22.65 7.83 11.70 16.37 6.83 50.67 21.75* 15.00 32.25* 15.67

*în vase nu s-a detectat începutul formării trombilor în timpul perioadei de observaţie indicate

Analiza statistică, care compară timpul până la debutul ocluziei la animalele, la care s-a administrat anticorp de control şi anticorp mAbH6, este prezentată în continuare în Tabelul 15.

Timpul până la apariţia ocluziei. Datele studiului dependenţei doză-efect la inducerea cu FITC-dextroză

Tabelul 15

Statistică Control mAbH6 (2 mg/kg) mAbH6 (10 mg/kg) mAbH6 (20 mg/kg) Numărul evenimentelor/numărul animalelor (%) 11/11 (100%) 6/6 (100%) 9/9 (100%) 8/10 (80,0%) Timpul mediu (min) (95% CI) 6,8 (2,4; 8,5) 10,4 (5,9; 12,8) 11,7 (2,5; 15,8) 17,7 (10,0; 22,7) Criteriul Wilcoxon valoarea p* 0,2364 0,1963 0,0016 Eveniment = timpul până la debut observat Timpul mediu (minute) şi IC 95% se bazează pe estimarea Kaplan-Meier NE = inestimabil * valorile p au fost calculate folosind criteriul de comparaţie Dunnett-Hsu

Ocluzie microvasculară.

Fig. 51 este un grafic Kaplan-Meier, care arată procentul de şoareci cu ocluzie microvasculară în funcţie de timp în microangiopatia trombotică indusă cu FITC-Dextran la şoarecii trataţi cu doze crescătoare de anticorp inhibitor al MASP-2 umană (mAbH6 la 2 mg/kg, 10 mg/kg sau 20 mg/kg) sau un anticorp de control izotip. După cum se arată în fig. 51, ocluzia microvasculară completă întârzia în grupele tratate cu mAbH6, comparativ cu şoarecii de control.

Fig. 52 ilustrează grafic timpul mediu până la ocluzia microvasculară în funcţie de doza de mAbH6 (*p <0,05 comparativ cu controlul). După cum se arată în fig. 52, timpul mediu pentru apariţia ocluziei microvasculare complete a crescut de la 23,3 min în grupa de control până la 38,6 minute în grupa, în care s-a administrat mAbH6 de 2 mg/kg (p <0,05). Dozele de 10 mg/kg sau 20 mg/kg de mAbH6 au exercitat acelaşi efect (timpul mediu pentru ocluzia microvasculară completă constituia 40,3 şi, respectiv, 38 de min) ca şi în grupa, în care s-au administrat 2 mg/kg de mAbH6. Datele experimentale de bază şi analiza statistică sunt prezentate în tabelele 16 şi 17.

Timpul apariţiei ocluziei vaselor la unii şoareci aparte, înregistraţi pe baza evaluării primare a înregistrărilor video este detaliat în continuare în Tabelul 16.

Timpul apariţiei ocluziei după leziunea, indusă la acţiunea luminii şi colorantului

Tabelul 16

Administrarea anticorpului de control Administrarea anticorpului mAbH6 Timpul până la iniţierea ocluziei (minute) Control 2 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 37,50 42,3 30,92 38,00 29,07 21,91 17,53 28,00 27,12 24,4 51,38 40,58 19,38 31,38 36,88 33,00 19,55 61,17* 26,83 39,10 18,00 61,55* 40,28 32,03 16,50 55,83 38,53 23,33 71,93* 21,75* 14,83 98,22* 32,25* 30* 33,17* 61,8*

*în vase nu s-a produs ocluzia completă în timpul perioadei de observaţie indicate

Analiza statistică, care compară timpul până la ocluzia completă la animalele, la care s-a administrat anticorp de control şi anticorp mAbH6, este prezentată în continuare în Tabelul 17.

Timpul până la apariţia ocluziei microvasculare. Datele studiului dependenţei doză-efect la inducerea cu FITC-dextroză

Tabelul 17

Statistică Control mAbH6 (2 mg/kg) mAbH6 (10 mg/kg) mAbH6 (20 mg/kg) Numărul evenimentelor/numărul animalelor (%) 9/11 (81.8%) 4/6 (66.7%) 7/9 (77.8%) 7/10 (70.0%) Timpul mediu (minute) (95% CI) 23.3 (16.5, 37.5) 36.8 (21.9, NE) 40.3 (17.5, NE) 38.0 (28.0, 40.6) Criteriul Wilcoxon valoarea p* 0.0456 0.0285 0.0260 Eveniment = timpul până la începutul ocluziei Timpul mediu (minute) şi IC 95% se bazează pe estimarea Kaplan-Meier NE = inestimabil * valorile p au fost calculate folosind criteriul de comparaţie Dunnett-Hsu

Concluzii.

Aşa cum s-a rezumat în tabelul 18, iniţierea formării trombilor a fost întârziată la şoarecii, la care s-a administrat anticorp mAbH6, într-o manieră dependentă de doză, comparativ cu şoarecii, la care s-a administrat anticorp de control (timpul mediu până la apariţia trombozei de la 10,4 până la 17,7 min, faţă de 6,8 min). Timpul mediu de apariţie a ocluziei complete se caracteriza printr-o întârziere în toate grupele, în care s-a administrat mAbH6, comparativ cu grupele în care s-a administrat anticorpul de control (Tabelul 18).

Timpul până la apariţia formării trombilor şi ocluziei complete

Tabelul 18

Control mAbH6 (2 mg/kg) mAbH6 (10 mg/kg) mAbH6 (20 mg/kg) Timpul mediu# până la începerea formării trombilor (min) 6,8 10,4 11,7 17,7* Timpul mediu# până la apariţia ocluziei microvasculare complete (min) 23,3 36,8* 40,3* 38,0*

#Valorile medii se bazează pe estimarea Kaplan-Meier

*p<0.05 comparativ cu controlul (criteriul Wilcoson, ajustat utilizând criteriul Dunnett-Hsu pentru comparaţii multiple)

Aceste rezultate demonstrează, că mAbH6, un anticorp monoclonal uman, care se leagă cu MASP-2 şi blochează calea lectinei a sistemului complement, reduce tromboza microvasculară într-o manieră dependentă de doză într-un model experimental de TMA pe şoareci. Prin urmare, este de aşteptat ca administrarea unui agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp inhibitor al MASP-2, să fie o terapie eficientă la pacienţii care suferă de HUS, aHUS, TTP sau alte tulburări microangiopatice, cum ar fi alte forme de TMA, inclusiv sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS), boala sistemică Degos şi TMA asociată cancerului, chimioterapiei şi transplantului, asigurând protecţia împotriva coagulării microvasculare şi trombozei.

EXEMPLUL 40

Acest exemplu descrie identificarea, folosind un display de fagi al unei biblioteci de anticorpi scFv complet umani, care se leagă cu MASP-2 şi inhibă activarea complementului mediată de lectină, lăsând în acelaşi timp intacte calea clasică (dependentă de C1q) şi componentele căii alternative ale sistemului imun.

Prezentare generală.

Au fost identificaţi anticorpi umani anti-MASP-2 cu afinitate înaltă prin screening-ul unui display de fagi al unei biblioteci. Fragmentele variabile ale lanţului uşor şi greu al fragmentelor de anticorpi au fost izolate atât în format scFv, cât şi într-un format IgG cu lungime completă. Anticorpii umani anti-MASP-2 sunt utili pentru inhibarea leziunilor celulare asociate cu activarea căii alternative a complementului, mediată de calea lectinei, lăsând în acelaşi timp intactă componenta căii clasice (dependente de C1q) a sistemului imun. În unele variante de realizare, anticorpii inhibitori ai MASP-2 testaţi au următoarele caracteristici: (a) afinitate înaltă pentru MASP-2 umană (de exemplu, un KD de 10 nM sau mai mică) şi (b) inhibarea activării complementului dependentă de MASP-2 în 90% ser uman cu IC50 de 30 nM sau mai mică.

Metode.

Expresia MASP-2 catalitic inactive cu dimensiune completă.

Secvenţa de ADNc de lungime completă a MASP-2 umane (SECV ID NR: 4), care codifică polipeptidă MASP-2 umană cu secvenţa lider (SECV ID NR: 5) a fost subclonată în vectorul de expresie mamifer pCI Neo (Promega), care iniţiază exprimarea eucariotă sub controlul regiunii CMV amplificator/promotor (descrisă de Kaufman RJ et al., Nucleic Acids Research 19: 448590, 1991; Kaufman, Method in Enzymology, 185: 53766 (1991)).

Pentru generarea proteinei MASP-2A umane catalitic inactive, s-a efectuat mutageneza direcţionată pe situs, aşa cum se descrie în US2007/0172483, încorporat aici ca referinţă. După electroforeză pe gel de agaroză, produsele PCR s-au purificat şi s-a generat prepararea discului de cromozomi şi suprapuneri de adenozină unică, folosind o procedură standard de creştere. MASP-2A obţinută cu adenozină terminală a fost apoi clonată în vectorul simplu pGEM-T, transformat în E. coli. MASP-2A umană a fost subclonată suplimentar în oricare dintre vectorii de expresie de mamifere pED sau pCI-Neo.

Construcţia de expresie MASP-2A, descrisă mai sus, a fost transfectată în celule DXB1, utilizând procedura de transfecţie standard cu fosfat de calciu (Maniatis et al., 1989). MASP-2A a fost produsă într-un mediu fără ser pentru a se asigura că preparatele nu au fost contaminate cu alte proteine serice. Mediile au fost colectate din celulele confluente la fiecare a doua zi (de patru ori în total). Nivelul de MASP-2A recombinantă constituia aproximativ 1,5 mg /l de mediu de cultură. MASP-2A (mutantul Ser-Ala, descris mai sus) a fost purificat prin cromatografie de afinitate pe coloane MBP-A-agaroză

Analiza MASP-2A prin metoda ELISA pe clonele ScFv de interes, identificate prin panning/conversia scFv şi screening-ul de filtrare.

Un display de fagi al unei biblioteci de secvenţe ale regiunii variabile a lanţului greu şi lanţului uşor a imunoglobulinei umane a fost supus panningului antigenic cu screening-ul automat ulterior şi selecţia anticorpilor pentru identificarea anticorpilor scFv cu afinitate înaltă la proteina MASP-2 umană. Au fost realizate trei runde panning a bibliotecii de fagi scFv anti-MASP-2A marcată cu HIS sau cu biotină. Cea de-a treia rundă de panning a fost eluată mai întâi cu MBL şi apoi cu TEA (alcalin). Pentru a monitoriza îmbogăţirea specifică a fagilor, care prezintă fragmente scFv anti-MASP-2A ţintă, s-a efectuat analiza fagului policlonal anti-MASP-2A imobilizată prin metoda ELISA. Genele scFv din runda 3 de pannning au fost donate într-un vector de expresie pHOG şi s-a realizat un screening de filtrare la scară mică pentru căutarea clonelor specifice anti-MASP-2A.

Coloniile bacteriene, care conţin plasmide, care codifică fragmentele scFv din a treia rundă de panning au fost colectate, amplasate pe membrane de nitroceluloză şi crescute peste noapte pe mediu neinducător pentru a produce matrice. În general s-au colectat şi analizat 18.000 de colonii din a treia rundă de panning, jumătate din eluarea competitivă şi jumătate din eluarea ulterioară cu TEA. Panningul bibliotecii de fagemid scFv împotriva MASP-2A urmat de conversia scFv şi screening-ul filtrant a dat 137 de clone pozitive. Clonele 108/137 au dat rezultat pozitiv într-o analiză de legare a MASP-2 prin metoda ELISA (datele nu sunt prezentate), dintre care 45 de clone au fost analizate în continuare pentru capacitatea de a bloca activitatea MASP2 în ser normal uman.

Studiul de măsurare a inhibării formării convertazei C3 a căii lectinei.

Un test funcţional, în care se măsoară inhibarea formării convertazei C3 a căii lectinei, s-a utilizat pentru a evalua "activitatea de blocare" a clonelor candidate scFv MASP-2. Activitatea serin proteazei MASP-2 este necesară pentru a genera cele două componente proteice (C4b, C2a), care conţin convertaza C3 a căii lectinei. Prin urmare, fragmentul Fab2 al anticorpului anti-MASP-2, care inhibă activitatea funcţională a MASP-2 (adică, MASP-2 care blochează scFv), va inhiba de novo formarea convertazei C3 a căii lectinei. C3 conţine ca parte a structurii sale o grupă tioester neobişnuit şi foarte reactiv. După scindarea C3 cu convertaza C3, grupa tioesterică în C3b poate forma o legătură covalentă cu grupele hidroxi sau amino ale macromoleculelor, imobilizate pe fundul godeurilor de masă plastic, cu ajutorul legăturilor de ester sau amidă, facilitând, astfel, detectarea C3b la utilizarea metodei ELISA.

Mananul de drojdie este un activator cunoscut al căii lectinei. În metoda, descrisă în continuare, de măsurare a formării convertazei C3, godeurile din plastic acoperite cu manan au fost incubate cu ser uman diluat pentru a activa calea lectinei. Godeurile au fost apoi spălate şi testate pentru C3b, imobilizat în godeuri, utilizând metoda ELISA standard. Cantitatea de C3b, generată în această analiză, este o reflectare directă a formării de novo a convertazei C3 a căii lectinei. În acest studio, au fost testate clonele fragmentelor scFv anti-MASP-2 în concentraţii selectate pentru capacitatea lor de a inhiba formarea convertazei C3 şi generarea ulterioară a C3b.

Metode.

Cele 45 de clone candidate identificate, aşa cum s-a descris mai sus, au fost exprimate, purificate şi diluate până la una şi aceeaşi concentraţie iniţială, care a fost din nou diluată în tampon GVB conţinând Ca++ şi Mg++ (4,0 mM barbital, 141 mM NaCI, 1,0 mM MgCI2, 2,0 mM CaCI2, 0,1% gelatină, pH 7,4) pentru a asigura, că toate clonele au aceeaşi cantitate de tampon. Fiecare din clonele scFv au fost testate de trei ori în concentraţie de 2 µg/ml. În calitate de control pozitiv s-a utilizat OMS100 Fab2, care a fost testat în concentraţie de 0,4 µg/ml. Formarea C3c a fost monitorizată permanent în prezenţa şi în absenţa clonei scFv/IgG.

Manan-ul a fost diluat până la o concentraţie de 20 µg/ml (1 µg/godeu) în 50 mM tampon carbonat (15 mM Na2C03 + 35 mM NaHC03 + 1,5 mM NaN3), pH 9,5 şi s-a aplicat pe o placă ELISA peste noapte la 4°C. A doua zi, plăcile acoperite cu manan au fost spălate de 3 ori cu 200 µl PBS. S-au adăugat apoi în godeuri 100 µl de 1% soluţie de blocare şi s-au incubat timp de 1 oră la temperatura camerei. Plăcile au fost spălate de 3 ori cu 200 µl PBS şi depozitate pe gheaţă cu 200 µl PBS până la adăugarea probelor.

Serul uman normal a fost diluat până la 0,5% în tampon CaMgGVB şi clonele scFv sau controlul pozitiv Fab2 OMS100 au fost adăugate în trei exemplare în acest tampon în concentraţii de 0,01 µg/ml; 1 µg/ml (numai control OMS100) şi 10 µg/ml şi preincubate timp de 45 de minute pe gheaţă înainte de adăugarea la placa ELISA blocată. Reacţia s-a iniţiat prin incubare timp de o oră la 37°C şi a fost oprită prin transferarea plăcilor pe o baie de gheaţă. Depunerea C3b a fost detectată cu un anticorp de iepure anti-C3c α-murin, după care urma adiţia HRP de capră α-iepure. Control negativ servea tamponul fără anticorpi (fără anticorp = depunere C3b maximă), iar controlul pozitiv a fost tamponul cu EDTA (fără depunerea C3b). Fundalul s-a determinat prin efectuarea aceluiaşi test cu excepţia faptului, că godeurile nu conţineau manan. Semnalul de fond al plăcilor fără manan s-a scăzut din semnalele din godeurile care conţineau manan. În calitate de criteriu de prag a fost stabilită jumătate din activitatea unei clone scFv irelevante (VZV) şi a unui tampon solitar.

Rezultate: Pe baza criteriului de prag, s-a constatat, că 13 clone au blocat activitatea MASP-2. Toate cele 13 clone, care produc o supresiune > 50% a căii, au fost selectate şi secvenţiate, producând 10 clone unice. S-a constat, că toate cele zece clone au una şi aceeaşi subclasă de lanţ uşor, λ3, dar trei subclase diferite de lanţ greu: VH2, VH3 şi VH6. În testul funcţional, cinci din cele zece clone candidate scFv s-au caracterizat prin valori IC50 mai mici, decât criteriile ţintă cele 25 nM, folosind 0,5% ser uman.

Pentru a identifica anticorpi cu activitate sporită, cele trei clone scFv materne, identificate aşa cum s-a descris mai sus, au fost supuse la amestecare a lanţului uşor. Acest proces includea generarea unei biblioteci combinatoriale, formată din VH a fiecăreia dintre clonele materne, asociate în pereche cu o bibliotecă de lanţuri uşoare lambda (VL) umane, derivate de la şase donatori sănătoşi. Această bibliotecă a fost apoi testată pentru clone scFv cu afinitate şi/sau funcţionalitate de legare înaltă.

Compararea activităţii funcţionale după valoarea IC50 (nM) a clonelor-fiică principale şi a clonelor-mamă corespunzătoare lor (toate în formatul scFv)

Tabelul 19

Clona scFv Studierea C3 în 1% ser uman (IC50 nM) Studierea C3 în 90% ser uman (IC50 nM) Studierea C4 în 90% ser uman (IC50 nM) 17D20mc 38 nd nd 17D20m_d3521N11 26 >1000 140 17N16mc 68 nd nd 17N16m_d17N9 48 15 230

În continuare sunt prezentate secvenţele regiunilor variabile ale lanţurilor grele (VH) pentru clonele-mamă şi clonele-fiică, menţionate în Tabelul 19.

Sectoarele hipervariabile (CDR) Kabat (31-35 (H1), 50-65 (H2) şi 95-107 (H3)) sunt evidenţiate cu caractere aldine, iar sectoarele hipervariabile (CDR) Chothia (26-32 (H1), 52-56 (H2) şi 95-101 (H3)) sunt subliniate.

17D20_35VH-21N11VL regiunea variabilă a lanţului greu (VH) (SEQ ID NO:67, codificată cu SEQ ID NO:66)

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSS

d17N9 regiunea variabilă a lanţului greu (VH) (SEQ ID NO:68)

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPFGVPFDIWGQGTMVTVSS

În continuare sunt prezentate secvenţele regiunilor variabile ale lanţului uşor (VL) pentru clonele-fiică şi clonele-mamă.

Sectoarele hipervariabile (CDR) Kabat (24-34 (L1); 50-56 (L2); şi 89-97 (L3) sunt evidenţiate cu caractere aldine, iar sectoarele hipervariabile (CDR) Chothia (24-34 (L1); 50-56 (L2) şi 89-97 (L3) sunt subliniate. Aceste sectoare sunt identice, indiferent de aceea că sunt numerotate după sistemul Kabat sau Chothia.

17D20m_d3521N11 regiunea variabilă a lanţului uşor(VL) (SEQ ID NO:70, codificată cu SEQ ID NO:69)

QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL

17N16m_d17N9 regiunea variabilă a lanţului uşor(VL) (SEQ ID NO:71)

SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYQQRPGQAPVLVIYDDSDRPSGIPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIATDHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE

Anticorpii OMS100 şi MoAb_d3521N11VL anti-MASP-2, (cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu, notată ca SEQ ID NO: 67 şi o regiune variabilă a unui lanţ uşor, notată ca SECV ID NR: 70, denumite de asemenea "OMS646" şi "mAbH6"), referitor la care s-a demonstrat, că se leagă cu MASP-2 umană cu afinitate înaltă şi au capacitatea de a bloca activitatea funcţională a complementului, au fost analizate cu privire la legarea epitopilor prin analiza dot-blot. Rezultatele arată, că anticorpii OMS646 şi OMS100 sunt foarte specifici pentru MASP-2 şi nu se leagă cu MASP-1/3. Anticorpul nu s-a legat nici cu MAp19 şi nici cu fragmentele MASP-2, care nu conţineau domeniul CCP1 al MASP-2, conducând la concluzia că situsurile de legare includ CCP1.

S-a determinat, că anticorpul OMS646 anti-MASP-2 se leagă active cu MASP-2 recombinant (Kd 60-250 µM) cu o selectivitate de 5000 ori mai mare, comparativ cu C1s, C1r sau MASP-1 (tabelul 20):

Afinitatea şi specificitatea anticorpilor OMS646 anti-MASP-2 la interacţiunea cu MASP-2, estimate prin metoda ELISA în fază solidă

Tabelul 20

Antigen KD (µM) MASP-1 >500,000 MASP-2 62±23* MASP-3 >500,000 C1r uman purificat >500,000 C1s uman purificat ~500,000

*Valoarea medie±SD; n=12

OMS646 blochează specific activarea componentelor terminale ale complementului, dependentă de calea lectinei

Metode.

Efectul OMS646 asupra depunerii complexului de atac membranar (MAC) a fost analizat utilizând condiţii specifice pentru calea lectinei, calea clasică şi calea alternativă. În acest scop s-a folosit kitul pentru screening-ului complementului Wieslab Comp300 (Wieslab, Lund, Suedia) în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

Rezultate.

Fig. 53A ilustrează grafic nivelul depunerii MAC în prezenţa sau absenţa anticorpului anti-MASP-2 (OMS646) în condiţii de testare specifice pentru calea lectinei. Fig. 53B ilustrează grafic nivelul depunerii MAC în prezenţa sau absenţa anticorpului anti-MASP-2 (OMS646) în condiţii de testare specifice pentru calea clasică. Fig. 53C ilustrează grafic nivelul depunerii MAC în prezenţa sau absenţa anticorpului anti-MASP-2 (OMS646) în condiţii de testare specifice pentru calea alternativă.

După cum se arată în fig. 53A, anticorpul OMS646 blochează activarea mediată de calea lectinei de depunere a MAC cu o valoare IC50 de aproximativ 1 nM. Cu toate acestea, OMS646 nu a influenţat asupra depunerii MAC, generată de activarea mediată de calea clasică (Fig.53B) sau de activarea mediată de calea alternativă (Fig.53C).

Studierea farmacocineticii şi farmacodinamicii anticorpului OMS646 după administrarea intravenoasă (IV) sau subcutanată (SC) a acestuia la şoareci.

Farmacocinetica (PK) şi farmacodinamica (PD) anticorpului OMS646 au fost evaluate la şoareci după administrarea anticorpului în doză unică timp de 28 zile. Pentru studiu s-au folosit dozele de 5 mg/kg şi 15 mg/kg de OMS646 administrate subcutanat (SC), precum şi doză de 5 mg/kg de OMS646 administrată intravenos (IV).

În ceea ce priveşte profilul farmacocinetic al OMS646, fig. 54 ilustrează grafic dependenţa concentraţiei de OMS646 (în medie n = 3 animale/grupă) de timpul după administrarea OMS646 în doza menţionată. După cum se arată în fig. 54, într-o doză de 5 mg/kg, administrate subcutant, OMS646 atingea concentraţia plasmatică maximă de 5-6 µg/ml aproximativ peste 1-2 zile după administrare. Biodisponibilitatea OMS646 în doză de 5 mg/kg SC constituia aproximativ 60%. După cum se arată în continuare în fig. 54, într-o doză de 15 mg/kg SC, OMS646 atinge concentraţia plasmatică maximă de 10-12 µg/ml aproximativ peste 1-2 zile după administrare. Pentru toate grupele, OMS646 a fost eliminat lent din circulaţia sistemică, cu un timp de înjumătăţire terminal de aproximativ 8-10 zile. Profilul OMS646 este tipic pentru administrarea anticorpului uman la şoareci.

Activitatea farmacodinamică a OMS646 este ilustrată grafic în fig.55A şi 55B. Fig. 55A şi 55B prezintă răspunsul farmacodinamic (reducerea activităţii sistemice a căii lectinei) pentru fiecare şoarece în grupele cu doză de 5 mg/kg, administrate intravenos (fig. 55A) şi de 5 mg/kg, administrate subcutanat (fig. 55B). Linia întreruptă indică nivelul iniţial în studiu (inhibare maximă; serul unui şoarece intact, la care înainte de testare s-a introdus in vitro un exces de OMS646). După cum se arată în fig. 55A, după administrarea intravenoasă a 5 mg/kg de OMS646, activitatea sistemică a căii lectinei s-a redus imediat până la nivele aproape nedetectabile, iar activitatea căii lectinei se caracteriza doar printr-o restabilire moderată timp de 28 de zile de observaţie. După cum se arată în fig. 55B, la şoarecii la care s-a administrat o doză de 5 mg/kg de OMS646 subcutanat, s-a observat o inhibare a activităţii căii lectinei dependentă de timp. Activitatea căii lectinei s-a redus până la niveluri aproape nedetectabile timp de 24 de ore după administrarea medicamentului şi s-a menţinut la niveluri joase timp cel puţin de 7 zile. Activitatea căii lectinei a crescut treptat odată cu trecerea timpului, dar timp de 28 de zile de observaţie nu a revenit la nivelul de până la dozare. Profilul activităţii căii lectinei în funcţie de timp, observat după administrarea dozei de 15 mg/kg subcutanat, a fost similar profilului în doza de 5 mg/kg subcutanat (datele nu sunt prezentate), indicând atingerea efectului farmacodinamic maximal posibil. Mai mult decât atât, aceste date atestă, că administrarea intravenoasă şi subcutanată o singură data în săptămână a dozei de 5 mg/kg de OMS646, este suficientă pentru a asigura suprimarea continuă a activităţii sistemice a căii lectinei la şoareci.

EXEMPLUL 41

Acest exemplu demonstrează, că anticorpul inhibitor al MASP-2 (OMS646) inhibă depunerea C5b-9, indusă de serul aHUS, pe suprafaţa celulelor endoteliale microvasculare umane activate (HMEC-1) după acţiunea serului, obţinut de la pacienţi cu sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS), colectat în timpul fazei acute şi fazei de remisiune a bolii.

Fundal/actualitate: Studiul următor s-a efectuat pentru a analiza depunerea C5b-9, indusă cu ser aHUS, pe suprafaţa celulelor HMEC-1 activate după influenţa serului pacientului cu aHUS colectat (1) în timpul fazei acute şi (2) în timpul fazei de remisiune a bolii în prezenţa sau absenţa OMS646, un anticorp anti-MASP-2, care se leagă în mod specific cu MASP-2 şi inhibă activarea căii lectinei.

Metode.

Pacienţi: Pentru acest studiu au fost selectaţi patru pacienţi cu aHUS, examinaţi atât în faza acută a bolii, cât şi în remisiune, printre acei incluşi în Registrul Internaţional al HUS/TTP (International Registry of HUS/TTP) şi genotipaţi în Laboratorul de Imunologie şi Genetică al Transplantului şi Bolilor Rare al Institutului Mario Negri (Laboratory of Immunology and Genetics of Transplantation and Rare Diseases of the Mario Negri Institute). Un pacient cu aHUS a prezentat o mutaţie heterozigotă p.R121°C cu factorul H al complementului (CFH) şi unul a prezentat autoanticorpi anti-CFH, în timp ce la ceilalţi doi pacienţi nu s-au depistat mutaţii sau anticorpi anti-CFH.

În tabelele 21 şi 22 sunt prezentate rezultatele screening-ului mutaţiilor genei complementului şi autoanticorpilor anti-CFH la patru pacienţi cu aHUS, analizaţi în acest studiu deopotrivă cu datele clinice şi biochimice, obţinute în timpul fazei acute, sau în remisiune.

Parametrii clinici la patru pacienţi cu aHUS din acest studiu

Tabelul 21

Cazul nr. Mutaţie sau Ab anti-CFH Faza bolii trombocite (150…400*103/µl) LDH (266…500 UI/l) Hemoglobină (14…18g/dl) s-creatinină (0,55…1,25mg/dl) #1 fără mutaţii, Ab anti-CFH lipsesc acută 31,000 1396 12,9 2,37 remisiune 267,000 n.a. 11,5 3,76 #2 CFH-R1210C acută 46,000 1962 7 5,7 remisiune 268,000 440 13,4 7,24 #3 Ab anti-CFH acută 40,000 3362 9,5 1,77 remisiune 271,000 338 8,8 0,84 #4 fără mutaţii, Ab anti-CFH lipsesc acută 83,000 1219 7,8 6,8 remisiune 222,000 495 12,2 13

Notă: n.a. = datele lipsesc

Parametrii complementului la patru pacienţi cu aHUS din acest studiu

Tabelul 22

Cazul nr. Mutaţia sau Ab anti-CFH Faza bolii Serul C3 (83-180 mg/dl) Plasma SC5b-9 (127-400 ng/ml) #1 fără mutaţii, Ab anti-CFH lipsesc acută 51 69 remisiune n.a. 117 #2 CFH-R1210C acută 79 421 remisiune 119 233 #3 Ab anti-CFH acută 58 653 remisiune 149 591 #4 fără mutaţii, Ab anti-CFH lipsesc acută 108 n.a. remisiune n.a. n.a.

Metode experimentale: Celulele dintr-o linie celulară endotelială microvasculară umană (HMEC-1) de origine dermică s-au placat pe lamele şi s-au folosit după confluent lor. Celulele HMEC-1 confluente au fost activate cu 10 µM ADP (adenozindifosfat) timp de 10 min şi apoi au fost incubate timp de patru ore cu ser de la cei patru pacienţi cu aHUS, descrişi mai sus în tabelele 23 şi 24, colectat în faza acută a bolii sau în remisiune, sau de la 4 subiecţi sănătoşi, utilizat în calitate de control. Serul s-a diluat 1: 2 cu mediu de testare (HBSS cu 0,5% BSA) în prezenţa sau în absenţa unui anticorp inhibitor al MASP-2, OMS646 (100 µg/ml), generat aşa cum se descrie mai sus în Exemplul 40, sau în prezenţa receptorului solubil de complement 1 (sCR1) (150 µg/ml), în calitate de control pozitiv al inhibării complementului. La sfârşitul etapei de incubare, celulele HMEC-1 au fost tratate cu anticorp de iepure anti-complement uman C5b-9, urmat de anticorp secundar conjugat cu FITC. În fiecare experiment, serul de la un subiect sănătos de controla fost testat în paralel cu serul pacientului cu aHUS (în fază acută şi remisiune). Pentru înregistrarea colorării fluorescente pe suprafaţa celulelor endoteliale s-a utilizat un microscop laser confocal inversat. S-au înregistrat cincisprezece câmpuri în fiecare probă, şi s-a evaluat suprafaţa de colorare fluorescent, utilizând funcţiile specifice încorporate ale software Image J şi rezultatele au fost exprimate ca pixel2 pe câmp analizat. Câmpurile, caracterizate prin cele mai mici şi cele mai mari valori au fost excluse din calcul.

Pentru analiza statistică (analiza cu dispersie monofactorială ANOVA cu testarea ulterioară pe criteriul Tukey pentru comparaţii multiple) au fost utilizate rezultatele în pixel2 pentru 13 câmpuri, obţinute pentru fiecare pacient şi subiect de control în fiecare condiţie a experimentului.

Rezultate.

Rezultatele analizei depunerii complementului cu serul de la cei patru pacienţi cu aHUS sunt prezentate în continuare în tabelul 23A, iar rezultatele cu serul de la patru subiecţi sănătoşi sunt prezentate în continuare în Tabelul 23B.

Influenţa inhibitorilor complementului asupra depozitării C5b-9 pe celulele HMEC-1 activate cu ADP, indusă cu serul pacienţilor cu aHUS

Tabelul 23A

Pacientul cu aHUS # Faza acuta aHUS Faza de remisie aHUS netratat +sCR1 +OMS646 netratat +sCR1 +OMS646 Pacientul #1 (fără mutaţie, ab anti-CFH lipseşte) 5076 ± 562º 551 ± 80* 3312 ± 422** 4507 ± 533º 598 ± 101 1650 ± 223 Pacientul #2 (CFH-R1210C) 5103 ± 648º 497 ± 67* 2435 ± 394* 3705 ± 570º 420 ± 65 2151 ± 250 Pacientul #3 (ab anti-CFH) 3322 ± 421º 353 ± 64* 2582 ± 479 6790 ± 901º 660 ± 83 2077 ± 353 Pacientul #4 (fără mutaţie, ab anti-CFH lipseşte) 4267 ± 488º 205 ± 34* 2369 ± 265** 5032 ± 594º 182 ± 29 3290 ± 552

Influenţa inhibitorilor complementului asupra depozitării C5b-9 pe celulele HMEC-1 activate cu ADP, indusă cu serul subiecţilor sănătoşi de control

(fără aHUS)

Tabelul 23B

Subiectul sănătos de control # netratat +sCR1 +OMS646 Subiectul de control #1 (examinat paralel cu pacientul cu aHUS #1) 481 ± 66 375 ± 43 213 ± 57 Subiectul de control #2 (examinat paralel cu pacientul cu aHUS #2) 651 ± 61 240 ± 33 490 ± 69 Subiectul de control #3 (examinat paralel cu pacientul cu aHUS #3) 602 ± 83 234 ± 35 717 ± 109 Subiectul de control #4 (examinat paralel cu pacientul cu aHUS #4) 370 ± 53 144 ± 20 313 ± 36

Pentru tabelele 23A şi 23B: Datele sunt valori medii ± SE. °p<0,001 în raport cu controlul; *p <0,001, **p <0,01 în raport cu faza acută aHUS netratată; p<0,001, p<0,01, p<0,05 în raport cu faza de remisiune aHUS netratată.

Fig. 56 ilustrează grafic efectul inhibitor al anticorpului anti-MASP-2 (OMS646) şi sCR1 asupra depunerii C5b-9, indusă de ser aHUS, pe celulele HMEC-1 activate cu ADP. În fig. 56, datele sunt valori medii ± SE. °p<0,001 în raport cu controlul; *p <0,0001 în raport cu faza acută aHUS; ^p<0,0001 în raport cu faza acută aHUS+sCR1; p<0,0001 în raport cu faza de remisiune aHUS netratată şi #p<0,0001 în raport cu faza de remisiune aHUS+sCR1.

Aşa cum se arată în tabelele 23A, 23B şi în fig. 56, celulele HMEC-1, activate cu ADP, care au fost expuse influenţei serului de la pacienţii cu aHUS (colectat în faza acută, sau în stare de remisiune) timp de patru ore în condiţii statice, s-au caracterizat printr-o depunere intensă a C5b-9 pe suprafaţa celulară, detectată prin microscopie confocală. La măsurarea suprafeţei, acoperite cu C5b-9, s-a observat o cantitate semnificativ mai mare C5b-9 depus pe celulele, care au fost expuse influenţei serului de la pacienţii cu aHUS, decât pe celule care au fost expuse influenţei serului de la subiecţi sănătoşi de control, indiferent dacă serul aHUS a fost colectat în faza acută sau in timpul remisiunei. Nu s-a observat nici o diferenţă în depozitele endoteliale de C5b-9 induse de serul colectat în faza acută şi în faza de remisiune aHUS.

Mai mult decât atât, cum este prezentat în tabelele 23A, 23B şi fig. 56, adiţia anticorpului OMS646 anti-MASP-2 la serul aHUS (colectat de la pacienţi în timpul fazei acute sau în faza de remisiune) conduce la o reducere semnificativă a depunerii C5b-9 pe suprafaţa celulelor endoteliale, comparativ cu serul aHUS netratat. Însă, efectul inhibitor al OMS646 asupra depunerii C5b-9 a fost mai puţin profund, decât efectul exercitat de inhibitorul complementului cu acţiune largă sCR1. Într-adevăr, s-a observat o diferenţă statistic concludentă între depozitele de C5b-9 induse de ser aHUS în prezenţa OMS646, comparativ cu prezenţa sCR1 (fig. 56 şi tabelele 23A şi 23B).

Când se calculează valoarea medie pentru cei patru pacienţi cu aHUS, procentele de reducere a depozitelor de C5b-9 în prezenţa inhibitorilor complementului (comparativ cu depozitele de C5b-9, induse de serul netratat de la aceiaşi pacienţi, luaţi ca 100%) au fost după cum urmează.

Faza acută.

sCR1 (150 µg/ml): reducere cu 91% a depozitelor de C5b-9

OMS646 (100 µg/ml): reducere cu 40% a depozitelor de C5b-9

Faza de remisie.

sCR1 (150 µg/ml): reducere cu 91% a depozitelor de C5b-9

OMS646 (100 µg/ml): reducere cu 54% a depozitelor de C5b-9

Concluzii.

Rezultatele, prezentate în acest exemplu, demonstrează că calea lectinei a complementului este stimulată de celulele endoteliale microvasculare activate şi că această stimulare este un semnal important pentru activarea excesivă a complementului drept răspuns, caracteristic pentru aHUS. Se demonstrat, de asemenea, că această stimulare a căii lectinei şi, drept consecinţă, reacţia de activare excesivă a complementului, apare atât în faza acută, cât şi în faza de remisiune clinică aHUS. Mai mult decât atât, probabil, această constatare nu pare a fi limitată numai la un defect concret al complementului, asociat cu aHUS. Aşa cum s-a demonstrat în continuare în acest exemplu, inhibarea selectivă a căii lectinei cu un anticorp inhibitor al MASP-2, cum ar fi OMS646, reduce depunerea complementului la pacienţii cu aHUS de diverse etiologii.

EXEMPLUL 42

Acest exemplu demonstrează, că un anticorp inhibitor al MASP-2 (OMS646) inhibă agregarea trombocitelor, indusă de serul aHUS, şi formarea de trombi pe suprafaţa celulelor endoteliale microvasculare umane activate (HMEC-1) după influenţa serului pacientului aHUS, colectat în timpul (1) fazei acute şi (2) fazei de remisiune aHUS.

Metode.

Pacienţi.

Au fost examinaţi trei pacienţi (pacienţii # 1, # 2 şi # 4, descrişi în tabelele 21, 22, 23A şi 23B din exemplul 41) cu aHUS (un pacient a avut o mutaţie heterozigotă p.R121°C CFH, la ceilalţi doi pacienţi a fost detectată o mutaţie şi anticorpi anti-CFH) atât în faza acută a bolii, cât şi în faza de remisiune. Pentru acest studiu au fost selectaţi patru pacienţii printre cei incluşi în incluşi în Registrul Internaţional al HUS/TTP (International Registry of HUS/TTP) şi genotipaţi în Laboratorul de Imunologie şi Genetică al Transplantului şi Bolilor Rare al Institutului Mario Negri (Laboratory of Immunology and Genetics of Transplantation and Rare Diseases of the Mario Negri Institute). Cinci subiecţi sănătoşi au fost, de asemenea, selectaţi ca donatori de sânge pentru experimente de perfuzie.

Metode.

Celulele HMEC-1 confluente au fost activate cu 10 µM ADP timp de 10 min şi apoi au fost incubate timp de trei ore cu seruri de la trei pacienţi cu aHUS (pacienţii # 1, #2 şi #4, descrişi în Exemplul 41), colectate în timpul fazei acute a bolii sau de la aceiaşi pacienţi în faza de remisiune sau cu seruri de control de la subiecţi sănătoşi. Serul a fost diluat 1: 2 cu mediu de testare (HBSS cu 0,5% BSA), în prezenţa sau în absenţa unui anticorp inhibitor al MASP-2, OMS646 (100 µg/ml), cum se descrie în Exemplul 40; sau în prezenţa sCR1 (150 µg/ml), în calitate de control pozitiv al inhibării complementului. Pentru pacienţii # 1 şi # 2, godeuri suplimentare au fost incubate cu seruri (din faza acută şi de remisiune) diluate 1: 2 cu mediu de testare, care conţine 100 µg/ml anticorp de control izotip irelevant sau cu 20 µg/ml OMS646 (pentru ultimul, cazul pacientului # 1 testările s-au realizat numai în faza de remisiune, iar în cazul # 2 - atât în timpul fazei acute cât şi în faza de remisiune.

La sfârşitul etapei de incubare, celulele HMEC-1 au fost perfuzate într-o cameră de flux cu sânge integral heparinizat (10 UI/ml), colectat de la subiecţi sănătoşi (conţinând colorantul fluorescent mecacrin, care marchează trombocitele) cu o deviere de tensiune, caracteristică pentru microcirculaţie (60 din/cm2, 3 minute). După trei minute de perfuzie, monostraturile celulelor endoteliale au fost fixate în acetonă. S-au înregistrat cincisprezece imagini pentru fiecare probă de tromb trombocitar pe suprafaţa celulelor endoteliale cu un microscop laser confocal inversat, şi au fost evaluate zonele ocupate de trombi, utilizând software Image J. Câmpurile, caracterizate prin cele mai mici şi cele mai mari valori, au fost excluse din calcul.

Pentru analiza statistică (analiza de dispersie monofactorială ANOVA, urmată de testul pentru criteriul Tukey pentru comparaţii multiple) s-au utilizat rezultatele în pixel2 pentru 13 câmpuri, obţinute pentru fiecare pacient şi subiect de control în fiecare condiţie a experimentului.

Rezultate.

Rezultatele experimentelor de formare a trombilor cu serurile de la cei trei pacienţi cu aHUS sunt prezentate în continuare în Tabelul 24A, iar rezultatele cu serurile de la cinci subiecţi sănătoşi sunt prezentate în continuare în Tabelul 24B.

Efectul inhibitorilor complementului asupra formării trombilor (pixel2±SE), indusă cu ser aHUS, pe celulele HMEC-1, activate cu ADP

Tabelul 24A

Condiţiile experimentului Faza bolii Cazul #1 aHUS formarea trombilor (pixel2±SE) (fără mutaţie, ab anti-CFH lipsesc) Cazul #2 aHUS formarea trombilor (pixel2±SE) (CFH-R1210C) Cazul #4 aHUS formarea trombilor (pixel2±SE) (fără mutaţie, ab anti-CFH lipsesc) netratat acută 5499 ± 600 22320 ± 1273º 10291 ± 1362º remisiune 6468 ± 1012º 3387 ± 443º 17676 ± 1106º +sCR1 (150 µg/ml) acută 4311 ± 676 5539 ± 578* 5336 ± 1214*** remisiune 573 ± 316 977 ± 102 2544 ± 498 +OMS646 (20 µg/ml) acută nedeterminat 6974 ± 556* Nu s-a determinat remisiune 832 ± 150 1224 ± 252 Nu s-a determinat +OMS646 (100 µg/ml) acută 3705 ± 777 9913 ± 984* 2836 ±509* remisiune 3321 ± 945 733 ± 102 1700 ± 321 + anticorp de control izotip irelevant (100 µg/ml) acută 5995 ± 725 18655 ± 1699 Nu s-a determinat remisiune 10885 ± 1380 2711 ± 371 Nu s-a determinat

Efectul inhibitorilor complementului asupra serurilor de la cinci subiecţi sănătoşi (care nu suferă de HUS) în studiul cu formarea trombilor (pixel2±SE) pe celulele HMEC-1, activate cu ADP

Tabelul 24B

Condiţiile experimentului Controlul #1 formarea trombilor (pixel2±SE) Controlul #2 formarea trombilor (pixel2±SE) Controlul #3 formarea trombilor (pixel2±SE) Controlul #4 formarea trombilor (pixel2±SE) Controlul #5 formarea trombilor (pixel2±SE) netratat 2880±510 1046 ± 172 1144 ± 193 735 ± 124 2811 ± 609 +sCR1 (150 µg/ml) 5192 ± 637 1527 ± 153 1198 ± 138 2239 ± 243 2384 ± 410 +OMS646 (100 µg/ml) 7637 ± 888 1036 ± 175 731 ± 203 2000 ± 356 7177 ± 1477 + anticorp de control izotip irelevant (100 µg/ml) 6325 ± 697 1024 ± 235 399 ± 82 45269 Nu s-a determinat Studiu în paralel cu ser de la subiect cu aHUS #1 (ser din faza acută) #1 (ser din faza de remisiune) #2 (ser din faza acută) #2 (ser din faza de remisiune) #5 (ser din faza acută şi din faza de remisiune)

Pentru tabelele 24A şi 24B: Datele sunt valori medii ± SE. °P<0.001 vs control; *P<0.001, ***P<0.05 vs aHUS faza acută netratată; p<0.001, p<0.05 vs aHUS faza de remisiune netratată.

Fig. 57 ilustrează grafic efectul anticorpilor anti-MASP-2 (OMS646) şi sCR1 asupra formării trombilor, indusă cu ser aHUS, pe celulele HMEC-1activate cu ADP. Datele prezentate în Fig. 57 sunt valorile medii ± SE. °P<0.0001, °°P<0.01 vs control; *P<0.0001, **P<0.01 vs aHUS faza acută netratată; p<0.0001 vs aHUS faza de remisiune netratată.

Aşa cum se arată în Tabelul 24A şi Fig.57, o creştere marcantă a zonei acoperite de trombi a fost observată pe celulele HMEC-1, tratate cu ser aHUS, colectat fie în timpul fazei acute, fie în faza de remisiune, comparativ cu celulele expuse la ser de la subiecţi sănătoşi de control (tabelul 24B şi fig. 57). Aşa cum se arată în fig. 57 şi în tabelul 24A, anticorpul OMS646 (atât la 100 µg/ml, cât şi la 20 µg/ml) exercita o inhibare parţială a formării trombilor pe celulele preexpuse la serul aHUS, colectat în timpul fazei acute. Efectul anti-trombogen este comparabil pentru cele două doze diferite de OMS646 şi nu se deosebeşte de efectul sCR1 (Fig. 57 şi Tabelul 24A). Adăugarea anticorpului de control izotip irelevant nu exercita efect inhibitor asupra formării trombilor, induse de serul aHUS.

Aşa cum este prezentat în continuare în fig. 57 şi tabelul 24A, efectul inhibitor al OMS646 a fost şi mai evident în cazul serului aHUS, colectat în timpul fazei de remisie. Într-adevăr, adăugarea OMS646, atât la doză de 100 µg/ml, cât şi în doză de 20 µg/ml, la serul pacientului aHUS, colectat în faza de remisiune a avut ca rezultat o inhibare aproape completă a formării trombilor, similară inhibării observate la adăugarea sCR1. Anticorpul de control izotip irelevant nu a exercitat efect inhibitor semnificativ.

Când se calculează valoare medie pentru trei pacienţi cu aHUS, procentele de reducere a suprafeţei celulelor HMEC-1, acoperite cu depozite de trombi (comparativ cu zona, acoperită de depuneri de trombi, indusă de serurile netratate de la aceiaşi pacienţi, luată drept 100%), înregistrate în prezenţa inhibitorilor complementului au fost după cum urmează:

Faza acută.

sCR1 (150 µg/ml): reducere de 60%

OMS646 (100 µg/ml): reducere de 57%

OMS646 (20 µg/ml): reducere de 45%

Faza de remisiune.

sCR1 (150 µg/ml): reducere de 85%

OMS646 (100 µg/ml): reducere de 79%

OMS646 (20 µg/ml): reducere de 89%

Discutarea rezultatelor.

Rezultatele din acest exemplu demonstrează, că un anticorp inhibitor MASP-2, cum ar fi OMS646 (generat cum se descrie în Exemplul 40), are un efect inhibitor puternic asupra formării trombului, indusă de serul aHUS, pe celulele HMEC-1. În mod surprinzător, efectul inhibitor al OMS646 asupra formării trombilor depăşea efectul său asupra depunerilor de C5b-9, induse pe HMEC-1 (cum se descrie în Exemplul 41). De asemenea, este surprinzător că adăugarea OMS646, atât în doză de 100 µg/ml, cât şi în doză de 20 µg/ml, la serul pacientului cu aHUS, colectat în faza de remisiune, a condus la o inhibare practice completă a formării trombilor. O altă constatare surprinzătoare este observarea faptului, că OMS646, atât în faza acută cât şi în remisiune, a fost la fel de eficient ca şi controlul pozitiv sCR1, care este un inhibitor cu acţiune largă şi un inhibitor aproape complet al sistemului complementului (Weisman H. et al., Science 249: 146-151, 1990, Lazar H. et al., Circulation 100: 1438-1442, 1999).

Este necesar de remarcat, că serul de control de la subiecţii sănătoşi a indus, de asemenea, o formare moderată a trombilor pe celulele HMEC-1. Nu s-a observat efect inhibitor consecvent asupra formării trombilor, indusă de serul de control, nici în cazul OMS646, nici în cazul sCR1. Deşi nu se doreşte legarea de o anumită teorie, se poate presupune, că trombi, induşi cu ser de control, nu depind de complement, fapt confirmat de nivelurile foarte reduse de depuneri C5b-9, depistate pe celulele HMEC-1, incubate cu ser de control (vezi exemplul 41).

Concluzie.

În concluzie este necesar de menţionat, că efectul anti-trombotic observat al unui anticorp inhibitor al MASP-2, cum ar fi OMS646, pare substanţial mai mare, decât s-ar fi aşteptat pe baza efectului inhibitor al OMS646 asupra depunerii de C5b-9, observată în acest sistem experimental (cum se descrie în exemplul 41 şi se prezintă în fig. 56). De exemplu, Gastoldi et al., Immunobiology 217: 1129-1222 Abstract 48 (2012) în publicaţia intitulată "Interacţiunea C5a/C5aR mediază activarea complementului şi tromboza pe celulele endoteliale în sindromul hemolitic uremic atipic (aHUS)" a constat, că adăugarea anticorpului anti-C5, care inhibă depunerea de C5b-9 (reducere de 60%), limita formarea trombilor pe celulele HMEC-1 într-o măsură comparabilă (reducere de 60%). În contrast, anticorpul inhibitor al MASP-2 (OMS646 în doză de 100 µg/ml) a inhibat depunerile de C5b-9 cu valori suficient de medii (fază acută = reducere de 40%, fază de remisiune = reducere de 54%) şi inhibarea formării trombilor la un procent semnificativ mai mare (faza acută = reducere de 57%, fază de remisiune = reducere de 79%). Pentru comparaţie, anticorpul OMS646 a inhibat depunerea complementului cu un procent mai mic, decât inhibitorul complementului pentru un control pozitiv (sCR1 la 150 µg/ml, inhibarea depunerii C5b-9 în faza acută = reducere de 91%, în faza de remisiune = 91% reducere), dar el, de asemenea, era eficient ca şi controlul sCR1 pozitiv în inhibarea formării trombilor (sCR1 la 150 pg/ml, fază acută = reducere de 60%, fază de remisiune = reducere de 85%). Aceste rezultate demonstrează, că un anticorp inhibitor al MASP-2 (de exemplu, OMS646) este surprinzător de eficient la inhibarea formării trombilor în serul, colectat de la subiecţii cu aHUS atât în faza acută, cât şi în faza de remisiune.

În conformitate cu cele menţionate, într-o variantă de realizare, invenţia prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a microangiopatiei trombotice (TMA), care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii care conţine o cantitate de anticorpi inhibitori ai MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2. Într-o variantă de realizare, TMA se selectează din grupa, care constă din sindromul hemolitic uremic (HUS), purpură trombocitopenică trombotică (TTP) şi sindromul hemolitic uremic atipic (aHUS). Într-o formă de realizare, TMA este aHUS. Într-o variantă de realizare, compoziţia este administrată la un pacient cu aHUS în timpul fazei acute a bolii. Într-o variantă de realizare, compoziţia se administrează la un pacient cu aHUS în timpul fazei de remisiune (adică, la un subiect care s-a recuperat sau parţial s-a recuperate după un episod de fază acută aHUS, o astfel de remisiune este confirmată, de exemplu, printr-o creştere a numărului de trombocite şi/sau o reducere a concentraţiilor de lactat dehidrogenază (LDH) în ser, de exemplu, aşa cum descrie Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, al cărui conţinut este încorporat aici prin referinţă).

Într-o variantă de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 se caracterizează prin cel puţin de una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: anticorpul menţionat leagă MASP-2 umană cu valoarea KD de 10 nM sau mai mică, anticorp menţionat se leagă la un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2, anticorpul menţionat inhibă depunerea C3b in studiul in vitro în 1% ser uman cu o valoare IC50 de 10 nM sau mai mică, anticorpul menţionat inhibă depunerea C3b în 90% ser uman cu o valoare IC50 de 30 nM sau mai mică, în care anticorpul reprezintă un fragment de anticorp, selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab) 2 şi F (ab') 2, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă monocatenară, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă de IgG2, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă de IgG1, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă de IgG4, în care molecula de IgG4 cuprinde o mutaţie S228P şi/sau în care anticorpul practic nu inhibă calea clasică. Într-o variantă de realizare, anticorpul se leagă cu MASP-2 si in mod selectiv inhibă calea lectinei şi practic nu inhibă calea alternativă. Într-o variantă de realizare, anticorpul se leagă cu MASP-2 si in mod selectiv inhiba calea lectinei şi practic nu inhibă calea clasică sau calea alternativă (adică, inhibă calea lectinei, lăsând intacte calea clasică şi calea alternativă a complementului).

Într-o variantă de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul sanguin al unui subiect, care suferă de TMA, cum ar fi aHUS (în faza acută sau în faza de remisiune) cel puţin de 30%, de exemplu, cel puţin de 40%, de exemplu, cel puţin de 50%, de exemplu, cel puţin de 60%, de exemplu, cel puţin de 70%, de exemplu, cel puţin de 80%, de exemplu, cel puţin de 85%, de exemplu, cel puţin de 90% şi până la 99%, comparativ cu serul netratat. In unele variante de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul sanguin al unui subiect suferind de aHUS, la un nivel cel puţin de 20 de procente sau mai mult (de exemplu, cel puţin de 30%, cel puţin de 40%, cel puţin de 50%), depăşind efectul inhibitor asupra depunerii de C5b-9 în ser.

Într-o variantă de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombilor în serul pacientului cu aHUS in faza de remisiune cel puţin de 30%, de exemplu, cel puţin de 40%, de exemplu, cel puţin de 50%, de exemplu, cel puţin de 60%, de exemplu, cel puţin de 70%, de exemplu, cel puţin de 80%, de exemplu, cel puţin de 85%, de exemplu, cel puţin de 90%, de exemplu, cel puţin de 95% şi până la 99%, comparativ cu serul netratat cu anticorp. În unele variante de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea trombilor în serul pacientului cu aHUS în faza la remisiune cel puţin de 20 de procente sau mai mult (de exemplu, cel puţin de 30%, cel puţin de 40 %, în aparenţă, cu 50%) depăşind efectul inhibitor asupra depunerii de C5b-9 în ser.

Într-o variantă de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează la un subiect printr-un cateter intravenos sau prin alte metode livrare prin cateter.

Într-o realizare, invenţia prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect care suferă de TMA, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii care conţine o cantitate de anticorp inhibitor al MASP-2 sau de un fragment de legare la antigen al acestuia care include (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi (b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 89-97 din SECV ID NR: 70 sau varianta (II) a acestuia, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

Într-o variantă de realizare, TMA se selectează din grupa constând din sindromul hemolitic uremic atipic (aHUS) (sau în faza acută sau în faza de remisiune), HUS şi TTP. Într-o variantă de realizare, subiectul este în faza acută a aHUS. Într-o variantă de realizare, subiectul este în faza de remisiune al aHUS.

In unele variante de realizare, metoda cuprinde administrarea la un subiect a unei compoziţii care conţine o cantitate de anticorp inhibitor al MASP-2 sau de un fragment de legare la antigen al acestuia, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o secvenţă de aminoacizi notată ca secvenţă SEQ ID NO: 67. In unele variante de realizare, metoda cuprinde administrarea la un subiect a unei compoziţii care conţine o cantitate de anticorp inhibitor al MASP-2 sau de un fragment de legare la antigen al acestuia, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor cu secvenţa de aminoacizi notată ca secvenţă SEQ ID NO: 70.

In unele variante de realizare, metoda cuprinde administrarea la un subiect a unei compoziţii care conţine un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de un fragment de legare la antigen al acestuia, care recunosc în mod specific cel puţin de o parte din epitop pe MASP-2 umană, recunoscut de anticorpul de control OMS646, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu, notată ca secvenţă SEQ ID NO: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor, denumită secvenţă SEQ ID NO: 70. Competiţia dintre participanţii la legare poate fi uşor studiată in vitro, de exemplu, folosind metoda de analiză ELISA şi/sau prin introducerea unui marcaj sub formă de grupă reporter specifică în unul din participanţii la legare, care poate fi detectat in prezenţa altui participant (participanţi) nemarcat (nemarcaţi) la legare, pentru a asigura posibilitatea identificării participanţilor specifici la legare, care se leagă cu unul şi acelaşi epitop sau cu un epitop suprapus. Astfel, prezenta invenţie prevede un anticorp specific sau un fragment de legare la antigen al acestuia, incluzând site-ul de legare la antigen al anticorpului uman, care concurează cu anticorpul de control OMS646 la legarea cu MASP-2 umană.

EXEMPLUL 43

Acest exemplu demonstrează, că anticorpul inhibitor al MASP-2 umană (OMS646) este abil să inhibe la pacienţii cu TMA inducerea apoptozei, mediate cu plasma, în celulele endoteliale microvasculare primare umane (MVEC) de origine dermică.

Fundal/actualitate.

Se ştie, că fiziopatologia TMA include leziunea celulelor endoteliale, indusă de diferiţii factori, după care urmează ocluzii ale vaselor mici (de exemplu, ale arteriolelor mici şi capilarelor) cu dopuri de trombocite şi/sau trombi de fibrină (Hirt-Minkowsk P. et al., Nefron Clin Pract 114: C219-C235, 2010; Goldberg RJ et al, Am J Kidney Dis 56 (6): 1168-1174, 2010). S-a demonstrat, că celulele endoteliale microvasculare (MVEC) sunt expuse unei leziuni apoptice la influenţa in vitro asupra lor a plasmei pacienţilor cu tulburări asociate cu TMA (Stefanescu et al, Voi Blood 112 (2): 340-349, 2008; Mitra D. et al., Blood .. 89: 1224-1234, 1997). Leziunea apoptică asociată cu TMA a fost depistată în celulele endoteliale microvasculare (MVEC), obţinute din bioptate tisulare (piele, oase, măduvă osoasă, splină, rinichi, ileon) ale unor astfel de pacienţi. S-a relatat, de asemenea, că leziunile apoptice ale MVEC reduc nivelurile de proteine reglatoare ale complementului, legate cu membrane, în MVEC (de exemplu, Mold & Morris, Immunology 102: 359-364, 2001; Christmas et al., Immunology 119: 522, 2006).

Se consideră, că un ciclu de legătură inversă, care include componentele terminale ale complementului, este implicat în patofiziologia TMA, incluzând sindromul hemolitic-uremic atipic (aHUS), şi TMA asociate cu sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS), boala Degos şi TMA asociate cu cancer, chimioterapie anticanceroasă, reacţii autoimune şi transplant, fiecare dintre aceste condiţii fiind cunoscute sau considerate a fi receptive la terapia anti-C5 cu utilizarea anticorpului monoclonal (mAb) eculizumab (Chapin J. et al., Brit J. Hematol 157: 772-774, 2012; Tsai et al., Br J Haematol 162 (4): 558-559, 2013); Magro C.M. et al., Journal of Rare Diseases 8: 185, 2013).

Următorul experiment a fost efectuat pentru a analiza abilitatea anticorpului inhibitor al MASP-2 umană (OMS646) de a bloca, la pacienţii suferinzi de TMA, inducerea, mediată de plasma, a apoptozei în MVEC umane dermale în probele de plasmă obţinute de la pacienţi, care suferă de aHUS, de purpură trombocitopenică trombotică (TTP) asociată cu deficitul de ADAMTS13, de sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS) şi boala sistemică Degos, precum şi de TMA asociate cu cancer, transplant, boli autoimune si chimioterapie.

Metode.

S-a efectuat un studiu in vitro pentru a analiza eficacitatea unui anticorp inhibitor al MASP-2 (OMS646) de a bloca la pacienţii cu TMA inducerea, mediată cu plasmă, a apoptozei în MVEC umane primare de origine dermică aşa cum descrie Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008, care este încorporat aici ca referinţă. Probele de plasma, utilizate în acest test, au fost obţinute dintr-o colecţie de plasma de la subiecţi sănătoşi de control şi de la pacienţi cu microangiopatii trombotice în faza acută, sau în faza de convalescenţă. Prezenţa microangiopatiei la pacienţii cu TMA s-a evaluat prin depistarea schistocitelor într-un frotiu de sânge periferic. Mai mult decât atât, purpura trombocitopenică trombotică (TTP) s-a diagnosticat aşa cum se descrie în publicaţia Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008.

Cultura celulelor endoteliale (EC).

Cum se descrie în publicaţia Stefanescu et al., celulele endoteliale microvasculare umane primare (MVEC) umane primare de origine dermică au fost furnizate de ScienCell Research Labs (San Diego, CA). MVEC s-au exprimat cu CD34 utilizând pasajele 5 şi 6 (Blood 89: 1224-1234, 1997). MVEC au fost menţinute în flacoane de polistiren, acoperite cu 0,1% gelatină în apă, în mediu ECM1001 (ScienCell Research Labs), care conţin supliment pentru creşterea celulelor endoteliale, penicilină, streptomicină şi 15% ser bovin fetal. Toate MVEC au fost utilizate în pasajul 2 până la 6. Pasajele au inclus o expunere de 5 până la 10 minute acţiunii 0,25% tripsină-EDTA.

Testarea apoptozei.

Celulele endoteliale microvasculare tipice (MVEC) umane primare de origine dermică, cunoscute a fi susceptibile la apoptoza, indusă cu plasma TTP/HUS, au fost spălate cu soluţie fiziologică tamponată cu fosfat (PBS) şi placate pe plăci cu 12 godeuri, acoperite cu 0,1% gelatină în apă la 0.15x106 celule viabile/ml. Celulele MVEC placate au fost menţinute într-un mediu complet timp de 24 de ore, apoi erau expuse la diferite concentraţii (2% până la 20% v/v) de probe de plasma de la pacienţii cu TMA sau de plasmă de la donatori sănătoşi timp de 18 ore în prezenţa sau absenţa anticorpului monoclonal (mAb) anti-MASP-2 (OMS646) (150 µg / ml) şi celulele au fost apoi colectate prin tratate cu tripsină. Fiecare probă de plasma de la pacient cu TMA a fost examinată în două experimente paralele. Gradul de apoptoză, mediată de plasmă, s-a evaluat prin colorare cu iodură de propidiu (PI), analiza >5 x103 celule analizate într-un citofluorograf şi după vârfurile A0, determinate cu software de calculator (MCycle Av, Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). S-a efectuat cuantificarea fragmentelor de ADN în lizatul de celule, legate cu histonul citoplasmatic, prin metoda ELISA, conform instrucţiunilor producătorului (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania).

Rezultate.

Rezultatele studiului apoptozei celulelor endoteliale microvasculare (MVEC), induse cu plasma de la pacientul cu TMA, în prezenţa anticorpului monoclonal (mAb) anti-MASP-2 (OMS646) sunt prezentate în tabelul 25.

Plasma pacientului cu TMA, expusă pe MVEC umane primare de origine dermică în prezenţa anticorpului monoclonal (mAb) anti-MASP-2 (OMS646)

Tabelul 25

Subiectul # Vârstă/sex Diagnosticul clinic (TMA) şi alte stări MASP-2 ng/ml Diagnosticul pe bază de Cre/LDH C5a sC5-b9 Activitatea ADAMS Diagnosticul pe bază de activitate a ADAMS Protecţia cu OMS646 #2 41/f TTP 174 TTP 34.42 772 30% aHUS efect #3 52/f TTP 150 TTP 48,32 1399 70% aHUS fără efect #4 20/m TTP 224 TTP 36,9 1187 <10% TTP efect #10 60/f TTP 175,4 TTP 49,5 4406 64% aHUS fără efect #11 59/f TTP 144,9 TTP 40,3 1352 <10% TTP fără efect #13 49/f HUS, Cancer, TTP 142,8 TTP 48,6 3843 86% aHUS fără efect #42 27/m TTP 341,5 TTP 100,0 5332 <5% TTP fără efect #46 25/f TTP, Degos, SLE 225,11 TTP 53,9 3426 ND ND efect #48 53/f TTP, SLE, nefrită post-transplant renal 788,5 aHUS 31,2 1066 66% aHUS efect #49 64/f TTP, APLAs, CVA 494,5 35,4 2100 ND ND efect #51 25/f aHUS, APLAs 313,1 TTP 26,8 1595 23% aHUS efect #52 56/f aHUS, SLE 333,1 TTP 18,9 1103 97% aHUS fără efect #53 56/f aHUS remisiune 189,9 TTP remisiune 28,69 344 74% aHUS fără efect

Abrevieri utilizate în tabelul 25:

“APLAs” = anticorpi antifosfolidici, asociaţi cu sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS).

“SLE” = lupus eritematos sistemic

“CVA” = accident cerebrovascular (insult)

In conformitate cu rezultatele, prezentate în publicaţia Stefanescu R. et al, Blood Vol 112 (2). 340-349, 2008, se observa apoptoză semnificativă în MVEC primare de origine dermică în prezenţa a treisprezece probe de plasmă de la pacienţi cu TMA în absenţa anticorpului anti-MASP-2. În verificările, realizate în paralel, ale probelor de plasmă de la oameni sănătoşi s-a constatat absenţa apoptozei în MVEC (datele nu sunt prezentate). După cum se arată în Tabelul 25, anticorpul monoclonal (mAb) inhibitor al MASP-2 (OMS646) a inhibat apoptoza în MVEC primare, mediată de plasma de la pacienţii cu TMA ("Efect" în Tabelul 25) în 6 din cele 13 probe de plasmă de la pacienţi testate (46%). În particular, este necesar de menţionat, că anticorpul monoclonal (mAb) inhibitor al MASP-2 (OMS646) a inhibat apoptoza în plasma, obţinută de la pacienţii care suferă de aHUS, TTP, boala Degos, LES, transplant şi APLAs (CAPS). Având în vedere, că în şapte probe de plasmă de la pacienţii, examinaţi în acest studiu, anticorpul monoclonal (mAb) anti-MASP-2 nu a blocat apoptoza („fără efect“ în Tabelul 25), se cere menţionat, că apoptoza poate fi indusă prin mai multe căi, nu toate din care sunt dependente de complement. De exemplu, aşa cum se menţionează în publicaţia Stefanescu R. et al., Blood Vol 112 (2): 340-349, 2008, apoptoza într-un test cu celule endoteliale (EC) depinde starea bazală a activării EC, asupra cărora influenţează factorii plasmatici, care pot avea un oarecare rol în determinarea nivelului de deteriorare, necesar pentru inducerea apoptozei. Aşa cum s-a menţionat în continuare de către Stefanescu R. et al., în plasma pacienţilor cu TMA pot fi prezenţa factori adiţionali, abili să moduleze apoptoza, cum ar fi citokinele şi diverse componente ale sistemului complementului. Prin urmare, datorită acestor factori care complică, nu este surprinzător acel fapt, că anticorpul anti-MASP-2 nu exercită efect de blocare în toate probele de plasma, care au prezentat apoptoză, indusă de plasma de la pacienţii cu TMA.

În plus, în această privinţă, se poate menţiona faptul, că s-a realizat o cercetare similară a apoptozei, induse de plasma de la pacienţi cu TMA, în prezenţa anticorpului antiC5 - eculizumab, şi s-au obţinut rezultate foarte asemănătoare ( Chapin et al, Blood (ASH Annual Meeting Abstracts): Abstract # 3342, 120: 2012). Eficacitatea clinică a eculizumabului, unui produs comercial de mare succes, s-a dovedit a fi mai mare, decât eficacitatea prezentată în acest model, ceea ce permite de a presupune, că în acest model in vitro poate fi subapreciată eficienţa medicamentelor, care inhibă complementul.

Aceste rezultate demonstrează, că un anticorp inhibitor al MASP-2, cum ar fi OMS646, eficient inhibă apoptoza, indusă de plasma de la pacienţi care suferă de o TMA, cum ar fi aHUS, TTP, boala Degos, LES, transplant şi APLAs (CAPS). Este cunoscut faptul, că leziuni endoteliale şi apoptoza joacă un rol-cheie în patologia TMA, cum ar fi TTP idiopatică şi HUS sporadic (Kim et al, Microvascular Research vol 62 (2): 83-93, 2001). Aşa cum se descrie în publicaţia Dang et al., Blood 93 (4) :. 1264-1270, 1999, apoptoza se depistează în pulpa roşie splenică a pacienţilor cu TTP, dar nu la subiecţii sănătoşi de control. Dovada apoptozei se depista, de asemenea, în celulele glomerulare renale de origine MVEC la un pacient cu HUS (Arends M. J. et al., Hum Pathol 20:89, 1989). Prin urmare, se poate presupune, ca administrarea unui agent inhibitor al MASP-2, cum ar fi un anticorp inhibitor al MASP-2 (de exemplu, OMS646), va fi o terapie eficace pentru pacienţii care suferă de TMA, cum ar fi aHUS, TTP, sau alte tulburări microangiopatice, cum ar fi o altă formă de TMA, inclusiv CAPS, boala sistemică Degos şi TMA asociată cu cancer; TMA asociată cu chimioterapie sau TMA asociată transplantului.

În acest context, într-o variantă de realizare, invenţia prevede o metodă de inhibare a leziunii celulelor endoteliale şi/sau a apoptozei celulelor endoteliale şi/sau a formării trombilor la un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a microangiopatiei trombotice (TMA), cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii conţinând o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 eficientă pentru inhibarea activării complementului dependentă de MASP-2. Într-o variantă de realizare, TMA se selectează din grupa constând din sindrom hemolitic uremic atipic (aHUS), purpură trombocitopenică trombotică (TTP) şi sindrom hemolitic uremic (HUS). Într-o variantă de realizare, TMA este aHUS. Într-o variantă de realizare, compoziţia se administrează unui pacient cu aHUS în timpul fazei acute a bolii. Într-o variantă de realizare, compoziţia se administrează la un pacient cu aHUS în timpul fazei de remisiune (adică la un subiect, care a fost recuperat sau parţial recuperat după un episod de fază acută aHUS, o astfel de remisiune confirmată, de exemplu, prin creşterea numărului de trombocite şi/sau reducerea conţinutului de LDH în ser (Loirat C et al., Orphanet Journal of Rare Diseases 6:60, 2011, încorporat aici ca referinţă).

Într-o variantă de realizare, subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a unei TMA care este (i) TMA asociată cu cancerul; (ii) TMA asociată cu chimioterapia sau (iii) TMA asociată cu transplant (de exemplu, transplant de organe, cum ar fi transplant de rinichi sau transplant de celule stem hematopoietice alogene). Într-o variantă de realizare, subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a sindromului Upshaw-Schulman (USS). Într-o variantă de realizare, subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a bolii Degos. Într-o variantă de realizare, subiectul suferă sau prezintă risc de dezvoltare a sindromului antifosfolipidic catastrofal (CAPS).

În conformitate cu oricare dintre variantele de realizare prezentate aici, anticorpul inhibitor al MASP-2 prezintă cel puţin de una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: anticorpul menţionat leagă MASP-2 umană cu KD de 10 nM sau mai mică, anticorp menţionat leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2, anticorpul inhibă depunerea C3b într-un test in vitro în 1% ser uman cu o valoare IC50 de 10 nM sau mai mică, anticorpul menţionat inhibă depunerea C3b în 90% ser uman cu o valoare IC50 de 30 nM sau mai mică, în care anticorpul reprezintă un fragment de anticorp, selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab) 2 şi F (ab') 2, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă monocatenară, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă de IgG2, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă de IgG1, în care anticorpul menţionat reprezintă o moleculă de IgG4, în care molecula de IgG4 cuprinde o mutaţie S228P şi/sau în care anticorpul practic nu inhibă calea clasică. Într-o variantă de realizare, anticorpul se leagă cu MASP-2 si in mod selectiv inhibă calea lectinei şi practic nu inhibă calea alternativă. Într-o variantă de realizare, anticorpul se leagă cu MASP-2 si in mod selectiv inhiba calea lectinei şi practic nu inhibă calea clasică (adică, inhibă calea lectinei, lăsând intactă calea clasică).

Într-o variantă de realizare, anticorpul inhibitor MASP-2 inhibă apoptoza celulelor endoteliale microvasculare (MVEC), indusă de plasma, în serul de la un subiect care suferă de TMA, cum ar fi aHUS (în faza acută sau în faza de remisiune), sindromul hemolitic uremic (HUS), purpura trombocitopenică trombotică (TTP), TMA asociată cu cancerul; TMA asociată cu chimioterapia; TMA asociată cu transplant (de exemplu, transplant de organe, cum ar fi transplant de rinichi sau transplant de celule stem hematopoietice alogene sau în serul de la un subiect care suferă de sindromul Upshaw-Schulman (USS) sau în serul de la un subiect care suferă de boala Degos, sau în serul subiectului care suferă de sindrom antifosfolipidic catastrofal (CAPS), în care apoptoza MVEC, indusă de plasma, este inhibată cel puţin de 5%, de exemplu, cel puţin de 10%, de exemplu, cel puţin de 20%, de exemplu, cel puţin de 30%, de exemplu, cel puţin de 40%, de exemplu, cel puţin de 50%, de exemplu, cel puţin de 60%, de exemplu, cel puţin de 70%, de exemplu, cel puţin de 80%, de exemplu, cel puţin de 85%, de exemplu, cel puţin de 90%, de exemplu, cel puţin de 95% până la 99%, comparativ cu serul netratat cu anticorp. În unele variante de realizare, anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă formarea de trombi în serul de la un subiect care suferă de TMA (de exemplu, cum ar fi aHUS (în faza acută sau în faza de remisiune), sindromul hemolitic uremic (HUS), purpura trombocitopenică trombotică, TMA asociată cu cancerul; TMA asociată cu chimioterapia; TMA asociată cu transplant (de exemplu, transplant de organe, cum ar fi transplant de rinichi sau transplant de celule stem hematopoietice alogene sau în serul de la un subiect care suferă de sindromul Upshaw-Schulman (USS) sau în serul de la un subiect care suferă de boala Degos, sau în serul subiectului care suferă de sindrom antifosfolipidic catastrofal (CAPS) la un nivel cel puţin de 20% mai înalt (de exemplu, cel puţin de 30% mai înalt, cel puţin de 40% mai înalt sau cel puţin de 50% mai înalt) decât efectul său inhibitor asupra depunerii C5b-9 în serul sangvin.

Într-o variantă de realizare anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează subiectului printr-un cateter intravenos sau printr-o altă metodă de livrare prin cateter.

Într-o variantă de realizare, prezenta invenţie prevede o metodă de inhibare a formării trombilor la un subiect, care suferă de TMA (de exemplu, aHUS (în faza acută sau în faza de remisiune), sindromul hemolitic uremic (HUS), purpura trombocitopenică trombotică (TTP), TMA asociată cancerului; TMA asociată chimioterapiei; TMA asociată transplantului (de exemplu, transplantului de organe, cum ar fi transplantul de rinichi sau transplantul de celule stem hematopoietice alogene, sau în serul de la un subiect care suferă de sindromul Upshaw-Schulman (USS) sau în serul de la un subiect care suferă de boala Degos, sau în serul subiectului care suferă de sindrom antifosfolipidic catastrofal (CAPS), care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii, care conţine o cantitate de anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment de legare la antigen al acestuia, care include (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi (b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 89-97 din SECV ID NR: 70 sau varianta (II) a acestuia, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

Într-o variantă de realizare, subiectul suferind de TMA se selectează din grupa constând din TMA asociată cancerului; TMA asociată chimioterapiei; TMA asociată transplantului (de exemplu, transplantului de organe (cum ar fi transplantul de rinichi sau transplantul de celule stem hematopoietice alogene), sindromul Upshaw-Schulman (USS), boala Degos sau sindromul antifosfolipidic catastrofal (CAPS).

In unele variante de realizare, metoda cuprinde administrarea la un subiect a unei compoziţii care conţine un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de un fragment de legare la antigen al acestuia, care recunosc în mod specific cel puţin de o parte din epitop pe MASP-2 umană, recunoscut de anticorpul de control OMS646, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu, notată ca secvenţă SEQ ID NO: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor, denumită secvenţă SEQ ID NO: 70.

EXEMPLUL 44

Acest exemplu descrie rezultatele iniţiale ale unui studiu clinic în faza 2 în scopul de a evalua inofensivitatea şi eficienţa anticorpului monoclonal complet uman, care inhibă MASP-2 la pacienţii adulţi cu microangiopatii trombotice (TMA).

Fundal.

TMA sunt o familie de tulburări rare, extenuante şi care pun viaţa în pericol, caracterizate prin formare excesivă de trombi (cheagurilor) - agregate plachetare - în microcirculaţia organelor corpului, de obicei în rinichi şi în creier.

Metode.

Prima etapă a unui studiu clinic deschis a fazei 2 s-a efectuat la pacienţii cu sindrom hemolitic uremic primar atipic (aHUS), cu aHUS rezistent la terapia cu plasmă şi cu purpură trombocitopenică trombotică (TTP). În acest studiu clinic al fazei 2 nu s-a folosit placebo, având în vedere caracterul bolii periculos pentru viaţă.

S-a aplicat screeningul la subiecţii de vârstă ≥18, fiind incluşi în acest studiu doar acei subiecţi, la care a fost diagnosticată una din TMA următoare:

1) aHUS primar, diagnosticat clinic şi având activitatea ADAMTS13 > 10% în plasmă. Potriviţi sunt pacienţii cu sau fără o mutaţie documentată în complement sau cu prezenţa anticorpilor anti-CFH. Pacienţii sunt clasificaţi în funcţie de răspunsul lor la terapia cu plasmă (schimb de plasmă sau perfuzie cu plasmă):

· pacienţii cu rezistenţă la terapie cu plasmă, în scopul acestui studiu, satisfac toate condiţiile următoare:

(a) screening-ul numărului de trombocite <150,000/µl, în pofida faptului, că până la screening s-au realizat patru proceduri de terapie cu plasmă;

(b) confirmarea hemolizei microangiopatice (prezenţa schistocitelor, conţinutul de lactatdehidrogenază (LDH) în ser depăşind limita superioară a normei (ULN), haptoglobina <LLN); şi

(c) conţinutul de creatinină > ULN.

· pacienţii cu aHUS, care au răspuns la terapia îndelungată cu plasmă (sensibili la terapia cu plasmă), care pot avea nevoie, cel puţin de o dată pe săptămână, de terapie cu plasmă timp de patru săptămâni înainte de administrarea primei doze de OMS646 în prezenţa unui conţinut de creatinină serică > ULN.

2) TTP sunt definite ca având toate caracteristicile următoare:

· numărul de trombocite <150000/µl;

· confirmarea hemolizei microangiopatice (prezenţa schistocitelor, conţinutul de lactatdehidrogenază (LDH) în ser depăşind limita superioară a normei (ULN), haptoglobina <LLN);

· activitatea ADAMTS13 ± 10% în timpul episodului actual de TTP sau permanent.

Notă: subiecţii erau excluşi din studiu dacă au administrat tratament cu eculizumab timp de trei luni înainte de screening. Criteriile pentru un pacient, clasificat ca rezistent la terapia cu plasma, au fost folosite în scopul determinării posibilităţii participării lui în acest studiu. În alte aspecte ale invenţiei, un pacient rezistent la terapia cu plasma, care urma să fie tratat cu un inhibitor al MASP-2, era tratat anterior cu terapie cu plasmă cel puţin de o dată şi după un asemenea tratament cu terapie cu plasmă la el se detecta unul sau mai mulţi marcheri clinici ai aHUS, care nu s-au redus adecvat sau nu au fost eliminaţi în rezultatul unei astfel de terapii cu plasmă.

Anticorpul monoclonal, utilizat în acest studiu, OMS646, este un anticorp monoclonal complet uman IgG4 anti-MASP-2 umană. Aşa cum s-a demonstrat în exemplul 40, OMS646 se leagă avid cu MASP-2 recombinantă (cu constanta de disociere aparentă de echilibru în intervalul de 100 µM) şi prezintă o selectivitate de 5000 de ori mai înaltă, comparative cu legarea cu proteinele omoloage C1s, C1r şi MASP-1. În studiile funcţionale, OMS646 inhibă calea lectinei la om cu o activitate în concentraţii cu interval nanomolar (concentraţie, care conduce la 50% inhibare [IC50] de aproximativ 3 nM), dar nu are nici un efect semnificativ asupra căii clasice. Administrarea intravenoasă (IV) sau subcutanată (SC) a OMS646 la şoareci, la primate şi la oameni a condus la concentraţii plasmatice înalte, care au fost asociate cu suprimarea activării căii lectinei într-un test ex vivo. Aşa cum se descrie suplimentar în exemplul 42, administrarea OMS646 a redus depunerea C5b-9 şi formarea trombilor în modelele experimentale de TMA şi de formare a trombilor in vitro pe şoareci, demonstrând astfel posibilitatea utilizării terapeutice a OMS646.

În acest studiu, substanţa medicamentoasă OMS646 s-a preparat în concentraţie de 100 mg / ml, care apoi a fost diluată în cazul administrării intravenoase. Volumul calculat corespunzător de soluţie OMS646 100 mg / ml pentru injecţii se extrăgea din flacon cu o seringă pentru prepararea dozei. Sacul de perfuzie se folosea timp de patru ore după preparare.

În etapa 1 a studiului, OMS646 s-a administrat în doze crescânde în grupe, fiecare din care conţinea trei pacienţe. Fiecare subiect în Etapa 1 a primit patru doze de OMS646, câte o doză în fiecare săptămână, după cum se arată în Tabelul 26.

Schema de dozare în Etapa 1

Tabelul 26

Etapa 1, grupa Numărul subiecţilor Doza de OMS646 (mg/kg) 1, Grupa 1 3 0.675, o data pe săptămână x 4 1, Grupa 2 3 2.0, o data pe săptămână x 4 1, Grupa 3 3 4.0, o data pe săptămână x 4

Etapa 1 Schema designului studiului

Substanţa medicamentoasă diluată testată s-a administrat intravenos timp de 30 min.

Punctele finale iniţiale.

Puncte finale primare adiţionale au fost:

· inofensivitatea, care se apreciază după efectele adverse (AE), indicatorii principali ai stării organismului, ECG şi rezultatele examenului clinic şi de laborator

· activitatea clinică, determinate după modificarea numărului de trombocite

Punctele finale secundare

Punctele finale secundare au fost:

· activitatea clinică a TMA

- LDH serică

- haptoglobina serică

- hemoglobina

- creatinina serică

- simptomele asociate TMA

- necesitatea terapiei cu plasmă (de substituire a plasmei sau perfuzii de plasmă)

- necesitatea dializei.

Terapii concomitente permise

· aHUS rezistent la terapia cu plasmă - terapia cu plasma în cadrul terapiei cu OMS646 se permitea în cazul, în care investigatorul considera, că este indicată din punct de vedere medical.

· aHUS susceptibil la terapia îndelungată cu plasma - investigatorilor le-a fost recomandat de a continua terapia cu plasmă până când nu vor apărea semne de ameliorare a TMA, de exemplu, creşterea numărului de trombocite, reducerea LDH, creşterea haptoglobinei, creşterea hemoglobinei, reducerea creatininei, după care investigatorului i-a fost recomandat să examineze posibilitatea sistării terapiei cu plasma şi să monitorizeze permanent parametrii TMA pentru evaluarea posibilităţii suspendării terapiei cu plasmă.

·TTP - utilizarea terapiei cu plasma era permisă în cazul, în care investigatorul considera, că este indicată din punct de vedere medical,

· investigatorilor le-a fost recomandată utilizarea hemodializei în conformitate cu standardul tratamentului,

· eculizumab în timpul studiului nu s-a administrat.

Rezultate.

Prima grupă de subiecţi a constat din trei pacienţi cu aHUS, trataţi cu cea mai mică doză de OMS646. S-au observat îmbunătăţiri în marcherii TMA la toţi pacienţii din această grupă de studiu. În calitate de marcheri ai activităţii bolii s-a determinat cantitatea de trombocite, conţinutul de lactatdehidrogenază serică (LDH) şi de haptoglobină serică. În comparaţie cu nivelurile iniţiale, numărul de trombocite s-a îmbunătăţit la toţi pacienţii. Nivelurile de LDH serică au rămas normale la un pacient, s-au redus semnificativ până la aproape de intervalul normal la un alt pacient şi au rămas ridicate la al treilea pacient. Haptoglobina s-a îmbunătăţit la doi pacienţi, normalizându-se la un singur pacient. Nivelurile de creatinină la un singur pacient cu funcţie renală independent, de asemenea, s-au îmbunătăţit.

Conform schemei studiului, trei pacienţi din a doua grupă a acestui studiu clinic au fost trataţi cu o doză medie. Doi pacienţi cu aHUS şi un pacient cu purpură trombocitopenică trombotică (TTP) prezentau rezistenţă la terapia cu plasmă. La ambii pacienţi cu aHUS s-a aplicat dializă renală până la şi în cadrul studiului. În grupa a doua sau în grupa cu doză medie pacienţii cu aHUS cu rezistenţă la terapia cu plasmă s-au caracterizat prin:

· creşterea cu 47% a numărului mediu de trombocite, ceea ce a condus la aceea, că ambii pacienţi aveau un număr de trombocite în intervalul valorilor normale

· reducerea cu 86% a numărului mediu de schizocite, cu dispariţia schistocitelor la un pacient

· creşterea cu 71% a nivelului mediu de haptoglobină, la doi pacienţi atingând intervalul normal în timpul tratamentului, la un pacient o coborâre puţin sub nivelul normal la o săptămână după administrarea ultimei doze

· reducerea cu 5% a nivelurilor medii de LDH, nivelurile la doi pacienţi rămânând uşor ridicate peste intervalul normal.

Pacientul cu TTP din grupa cu doză medie a necesitat repetarea perfuziei cu plasmă înainte de intrarea în studiu. Parametrii de laborator nu au prezentat o îmbunătăţire consecventă, dar în timpul tratamentului cu OMS646, precum şi la momentul finalizării tratamentului, pacientul nu a necesitat utilizarea terapiei cu plasmă.

Medicamentul a fost bine tolerat de toţi pacienţii pe toată perioada tratamentului. Pe baza datelor pozitive din grupa a doua sau grupa cu doză medie, a fost iniţiat studiul în a treia grupă sau grupa cu doză mare, iar examenul pacientului cu aHUS au fost deja finalizate. Datele, care se referă la toţi pacienţii, includ măsurări timp de o săptămână după administrarea ultimei doze.

S-a finalizat, de asemenea, tratamentul cu OMS646 al primului pacient din grupa a treia (în grupa cu doză mare), al pacientului cu aHUS rezistent la terapia cu plasmă, cu complicaţii suplimentare, incluzând hepatita C, crioglobulinemia şi limfomul. Până la tratamentul cu OMS646 pacientul avea nevoie de dializă repetată. În timpul tratamentul şi după finalizarea tratamentului cu OMS646 şi până în prezent pacientul nu a necesitat dializă. Parametrii hematologici şi renali au arătat:

· îmbunătăţire cu 63% a numărului de trombocite, revenind la niveluri normale,

· reducerea cu 100% a shistocitelor,

· haptoglobina a crescut de la un nivel nedetectabil şi s-a normalizat,

· reducerea cu 43% a LDH, rezultând cu un nivel puţin mai mare, decât cel normal,

· reducerea cu 24% a nivelului creatininei.

Atât în prima, cât şi în a doua grupă medicamentul a fost bine tolerat.

Primul punct final în acest studiu clinic deschis al fazei 2 a fost modificarea numărului de trombocite. Numărul de trombocite la toţi trei pacienţi cu aHUS în grupele cu doză medie şi mare (doi pacienţi în grupa cu doză medie şi un pacient în grupa cu doză mare) a revenit la normal, cu o creştere medie statistic concludentă, faţă de valoarea iniţială, de aproximativ 68000 trombocite/ml (p = 0,0055).

Astfel, datele obţinute înainte de faza 2 a acestui studiu clinic, demonstrează eficienţa OMS646 la pacienţii cu aHUS primar aHUS, la pacienţii cu aHUS rezistent la terapia cu plasma, şi la pacienţii cu TTP.

În conformitate cu cele de mai sus, într-o variantă de realizare, invenţia propune o metodă de tratare a unui subiect, care suferă de aHUS rezistent la terapia cu plasma, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii, care conţine o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependent de MASP-2. În unele variante de realizare, metoda cuprinde suplimentar în etapă identificarea subiectului, care suferă de aHUS rezistent la terapia cu plasmă, înainte de administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând un anticorp inhibitor al MASP-2.

În conformitate cu oricare dintre variantele de realizare prezentate aici, anticorpul inhibitor al MASP-2 prezintă cel puţin de una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: anticorpul menţionat leagă MASP-2 uman cu KD de 10 nM sau mai mică, anticorpul menţionat leagă un epitop în domeniul CCP1 al MASP-2, anticorpul respectiv inhibă depunerea C3b într-un test in vitro în 1% ser uman la IC50 de 10 nM sau mai puţin, anticorp respectiv inhibă depunerea C3b în 90% ser uman la IC50 de 30 nM sau mai mică, în care anticorpul reprezintă un fragment de anticorp selectat din grupa constând din Fv, Fab, Fab', F(ab)2 şi F(ab')2, în care anticorpul este o moleculă cu un singur lanţ, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG2, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG1, în care anticorpul respectiv este o moleculă IgG4, în care molecula IgG4 cuprinde o mutaţie S228P. Într-o variantă de realizare anticorpul se leagă cu MASP-2 şi inhibă selectiv calea lectinei şi practic nu inhibă calea clasică (adică inhibă calea lectinei, lăsând intactă calea clasică a complementului).

Într-o variantă de realizare a invenţiei anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează într-o cantitate eficientă pentru ameliorarea, cel puţin de a unui sau mai multor parametri clinici, asociaţi cu aHUS, cum ar fi creşterea numărului de trombocite, reducerea nivelului de LDH, creşterea haptoglobinei, creşterea hemoglobinei şi/sau reducerea creatininei.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 la un subiect care suferă de aHUS, rezistent la terapia cu plasma, printr-un cateter (de exemplu, intravenos) pentru o primă perioadă de timp (de exemplu, în faza acută care durează cel puţin de o zi până la o săptămână sau două săptămâni), urmată de administrarea subcutanată a unui agent inhibitor al MASP-2 pentru a doua perioadă de timp (de exemplu, pentru o perioadă îndelungată de timp cel puţin de două săptămâni sau mai mult). În unele exemple de realizare administrarea în prima şi/sau în a doua perioadă de timp se realizează în absenţa plasmeferezei. În unele variante de realizare administrarea în prima şi/sau în a doua perioadă de timp se realizează în prezenţa plasmeferezei

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 la un subiect care suferă de aHUS, rezistent la terapia cu plasmă, fie intravenos, intramuscular, fie, preponderant, subcutanat. Tratamentul poate fi de lungă durată şi se poate administra de la o data pe zi până la o data pe lună, dar, preponderant, se administrează o data la două săptămâni. Anticorpul anti-MASP-2 poate fi administrat în monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab.

Într-o variantă de realizare metoda include tratarea unui subiect care suferă de aHUS, rezistent la terapia cu plasmă, care cuprinde administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare la antigen, conţinând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând secvenţa de aminoacizi notată ca SEQ ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând secvenţa de aminoacizi notată ca SECV ID NR: 70.

EXEMPLUL 45

Acest exemplu descrie rezultatele adiţionale ale studiului clinic realizat în faza 2 în scopul evaluării inofensivităţii şi eficienţei clinice a anticorpului monoclonal uman complet inhibitor al MASP-2 la pacienţii adulţi cu microangiopatii trombotice (TMA), descrise în Exemplul 44.

Fundal.

Cum se descrie în Exemplul 44, TMA sunt o familie de tulburări rare, extenuante şi care pun viaţa în pericol, caracterizate prin formare excesivă de trombi (cheagurilor) - agregate plachetare - în microcirculaţia organelor corpului, de obicei în rinichi şi în creier. Aşa cum se descrie aici, TMA asociate transplantului (TA-TMA) reprezintă un sindrom foarte periculos, care poate să apară la pacienţii cu transplant, cum ar fi transplantul de celule stem hematopoietice (HSCT).

Acest exemplu descrie rezultatele iniţiale ale studiului clinic al fazei 2 pentru a evalua inofensivitatea şi eficienţa clinică a unui anticorp monoclonal uman complet inhibitor al MASP-2 la un pacient, care suferă de TMA asociate cu transplant de celule stem hematopoietice.

Metode.

Cum se descrie în exemplul 44, studiul TMA în faza 2 constă din etapa de trei niveluri de dozare, urmată de o etapă de dozare fixă a anticorpului inhibitor al MASP-2 - OMS646. Aşa cum se descrie adiţional în exemplul 44, rezultate pozitive şi stabile au fost obţinute în cazul pacienţilor cu aHUS şi la un pacient cu TTP. La fel, ca şi în grupa cu doză mică, OMS646 a fost bine tolerat de toţi pacienţii din grupele cu doze medii şi mari pe toată perioada de tratament. Studiile preclinice ale toxicităţii au fost finalizate şi nu s-au demonstrat oarecare probleme privind inofensivitatea utilizării acestui anticorp, ceea ce a permis o administrare de lungă durată în cadrul studiilor clinice.

Cum se descrie în Exemplul 44, au fost obţinute date unui studiu clinic al fazei 2 OMS646 în cazul TMA pentru pacienţii cu aHUS şi TTP. S-a finalizat dozarea pentru un pacient cu TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice în grupa cu doză mare, folosind metodele, descrise în exemplul 44. Acest pacient avea un istoric de limfom, pentru care a suferit un transplant de celule stem hematopoietice. Evoluţia post-transplant a fost agravată de o serie de tulburări, care ameninţau viaţa, inclusiv şi TMA, care necesita transfuzie de trombocite. În pofida transfuziilor, persista TMA asociată cu transplantul de celule stem şi pacientul a fost inclus în studiul în fază 2 a anticorpului OMS646.

Rezultate.

După o perioadă de dozare de patru săptămâni (grupa cu doză mare), cum se descrie în Exemplul 44, pacientul cu TMA asociată cu transplant de celule stem se caracteriza prin:

· creşterea numărului de trombocite de patru ori, rezultând cu un număr de trombocite depăşind 100.000;

· creşterea dublă a nivelului de haptoglobină şi s-a normalizat;

· reducerea nivelului de lactatdehidrogenază plasmatică, un indicator al leziunilor în vasele sangvine, cu 35%, dar depăşind încă nivelul normal;

· depistarea doar a unor şistocite solitare.

În toată perioada de dozare a OMS646 şi după finalizarea tratamentului cu OMS646, pacientul nu a necesitat transfuzii de trombocite sau aplicarea plasmeferezei.

Astfel, datele, obţinute în faza 2 a acestui studiu clinic (cum se descrie în Exemplul 44 şi în acest exemplu), demonstrează eficienţa OMS646 la pacienţii cu aHUS primar, la pacienţii cu aHUS, rezistenţi la terapia cu plasmă, la pacienţii cu TTP şi la un pacient cu TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice.

În conformitate cu cele menţionate, într-o variantă de realizare, invenţia propune o metodă de tratare a unui subiect uman, care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii conţinând o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependentă de MASP-2. Într-o variantă de realizare, subiectul suferă de TMA asociată transplantului de celule stem hematopoietice, rezistentă la tratamentul cu transfuzii de trombocite şi/sau plasmefereză. Într-o variantă de realizare, metoda prevede în continuare identificarea unui subiect uman, care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, care este rezistentă la tratamentul cu transfuzii de trombocite şi/sau plasmefereză până la etapa de administrare la subiect a unei compoziţii conţinând o cantitate de anticorp inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependentă de MASP-2.

Într-o variantă de realizare a invenţiei anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează într-o cantitate eficientă pentru ameliorarea, cel puţin de a unui sau mai multor parametri clinici în TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice,, cum ar fi creşterea numărului de trombocite (de exemplu, cel puţin de două ori, cel puţin de trei ori, cel puţin de patru ori, comparative cu numărul de trombocite până la tratament), creşterea haptoglobinei şi/sau reducerea nivelului de LDH.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 la un subiect care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice printr-un cateter (de exemplu, intravenos) pentru o primă perioadă de timp (de exemplu, în faza acută care durează cel puţin de o zi până la o săptămână sau două săptămâni), urmată de administrarea subcutanată a unui agent inhibitor al MASP-2 pentru a doua perioadă de timp (de exemplu, pentru o perioadă îndelungată de timp cel puţin de două săptămâni sau mai mult). În unele exemple de realizare administrarea în prima şi/sau în a doua perioadă de timp se realizează în absenţa plasmeferezei. În unele variante de realizare administrarea în prima şi/sau în a doua perioadă de timp se realizează în prezenţa plasmeferezei.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea unui agent inhibitor al MASP-2 la un subiect, care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, fie intravenos, intramuscular, fie, preponderant, subcutanat. Tratamentul poate fi de lungă durată şi se poate administra de la o data pe zi până la o data pe lună, dar, preponderant, se administrează o data la două săptămâni. Anticorpul anti-MASP-2 poate fi administrat în monoterapie sau în asociere cu un inhibitor C5, cum ar fi eculizamab.

Într-o variantă de realizare metoda include tratarea unui subiect, care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând (I) (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare metoda prevede administrarea la subiect a unei compoziţii cuprinzând un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare la antigen, care recunoaşte în mod specific cel puţin de o parte dintr-un epitop pe MASP-2 umană recunoscută de anticorpul de referinţă OMS646, conţinând regiunea variabilă a lanţului greu, notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor, notată ca SECV ID NR: 70.

EXEMPLUL 46

Acest exemplu descrie rezultatele adiţionale ale studiului clinic realizat în faza 2 în scopul evaluării inofensivităţii şi eficienţei clinice a anticorpului monoclonal uman complet inhibitor al MASP-2 la pacienţii adulţi cu microangiopatii trombotice (TMA), descrise în Exemplul 44 şi 45.

Fundal: Cum se descrie în Exemplul 45, TMA (TA-TMA) asociate transplantului reprezintă un sindrom foarte periculos, care poate să apară la pacienţii cu transplant, cum ar fi recipienţii transplantului de celule stem hematopoietice (HSCT). TMA asociată transplantului de celule stem hematopoietice (HSCT-TMA), reprezintă o complicaţie care pune viaţa în pericol şi care este declanşată de leziunile endoteliale. Rinichiul este organul cel mai frecvent afectat, deşi HSCT-TMA poate reprezenta o boală sistemică, în care se afectează, de asemenea, plămânii, intestinul, inima şi creier. Apariţia chiar a unei TMA uşoare se asociază cu insuficienţă renală îndelungată. Dezvoltarea TMA asociate cu HSCT post-alogene diferă după frecvenţa apariţiei, în funcţie de diferite criterii de diagnosticare şi scheme de prevenire a respingerii transplantului în organismul gazdă, totodată inhibitorii de calcineurină fiind mai frecvent implicate în apariţia TMA asociate cu HSCT (Ho VT et al., Biol Blood Marrow Transplant, 11 (8): 571-5, 2005). Modificarea regimului de dozare a inhibitorului imunosupresiv al calcineurinei poate avea ca rezultat îmbunătăţirea TMA la unii pacienţi în decurs de câteva săptămâni de la sistarea sau suspendarea administrării inhibitorului de calcineurină.

TMA este o complicaţie, care poate pune viaţa în pericol prin complicaţii în HSCT şi în prezent tactica tratamentului se bazează, în mare măsură, pe reducerea acţiunii factorilor de inducere, incluzând excluderea administrării agenţilor imunosupresori (de exemplu, inhibitorilor calcineurinei) şi tratamentul infecţiilor în curs de desfăşurare, precum şi tratamentul de susţinere, cum ar fi hemodializa. Deşi mulţi pacienţi cu HSCT-TMA răspund bine la reducerea sau întreruperea administrării agenţilor imunosupresori, există un subgrup de pacienţi cu HSCT-TMA persistentă, în pofida metodelor conservative de tratament (adică TMA nu a răspuns la reducerea sau la întreruperea administrării imunosupresivelor). Pacienţii, care nu răspund la aceste metode conservative de tratament au prognostic nefavorabil. Schimbul de plasmă nu a demonstrat eficacitate şi nici o altă terapie nu a fost aprobată.

Exemplul 45 descrie rezultatele pozitive iniţiale ale studiului clinic în fază 2 pentru a evalua inofensivitatea şi eficienţa clinică a unui anticorp monoclonal uman complet inhibitor al MASP-2 (OMS646) la un pacient, care suferă de TMA persistente asociate cu transplant de celule stem hematopoietice (HSCT-TMA). Acest exemplu descrie rezultatele suplimentare ale studiului clinic în faza 2 în curs de desfăşurare pentru a evalua inofensivitatea şi eficienţa clinică a OMS646 la trei subiecţi suplimentari, care suferă de HSCT-TMA persistentă, rezistenţi la măsurile de tratament conservative.

Metode.

Cum se descrie în exemplul 44, studiul TMA în faza 2 constă din etapa de trei niveluri de dozare, urmată de o etapă de dozare fixă a anticorpului inhibitor al MASP-2 - OMS646. OMS646 a fost bine tolerat de toţi pacienţii din grupele cu doze mici, medii şi mari pe toată perioada de tratament. Studiile preclinice ale toxicităţii au fost finalizate şi nu s-au demonstrat oarecare probleme privind inofensivitatea utilizării acestui anticorp, ceea ce a permis o administrare de lungă durată în cadrul studiilor clinice.

În studiul TMA în faza 2 au luat parte subiecţii, care suferă de TMA persistentă asociată cu HSCT, rezistenţi la măsurile de tratament conservative, care este definită în scopurile acestui studiu, ca având toţi parametrii, prezentaţi în continuare, cel puţin de peste două săptămâni după sistarea sau întreruperea tratamentului cu agent imunosupresor (de exemplu, un inhibitor de calcineurină) sau cel puţin de peste 30 de zile după transplant:

- trombocitopenie (numărul trombocitelor <150,000/µl); şi

- dovezi ale anemiei hemolitice microangiopatice (prezenţa schistocitelor, lactatdehidrogenază (LDH) serică > limita superioară a normei (ULN) sau haptoglobina < limita inferioară a normei (LLN).

Terapia concomitentă permisă în TMA asociate cu HSTC:

· terapia cu plasma în cadrul terapiei cu OMS646 se permitea în cazul, în care investigatorul considera, că este indicată din punct de vedere medical. La pacienţii la care se aplica terapia cu plasma, se puteau administra jumătăţi de doză suplimentare de OMS646;

· investigatorilor le-a fost recomandată utilizarea hemodializei în conformitate cu standardul tratamentului;

· eculizumab nu s-a administrat în timpul studiului.

În acest studiu al TMA au fost incluşi subiecţii, care suferă de HSCT-TMA persistentă, care este rezistent la metodele de tratament standard (adică, TMA persistentă, cel puţin de peste două săptămâni după sistarea sau întreruperea tratamentului cu inhibitor de calcineurină).

Cum se descrie în Exemplul 45, s-a finalizat dozarea pentru un pacient, care suferă de HSCT-TMA persistentă (pacientul # 1) în grupa cu doză mare (4 mg/kg de OMS646, administrat intravenos o dată pe săptămână timp de patru săptămâni) cu utilizarea metodei, descrise în Exemplul 44.

A fost finalizată dozarea pentru alţi 4 pacienţi suplimentari, care suferă de HSCT-TMA persistentă, cum se descrie în continuare.

Pacientul # 1 (descris în exemplul 44) a administrat OMS646 timp de patru săptămâni (4 mg/kg intravenos o dată pe săptămână);

Pacienţii # 2 şi # 3 au fost trataţi timp de opt săptămâni cu OMS646 (4 mg/kg intravenos o dată pe săptămână);

Pacienţii 4 şi 5 au fost trataţi cu OMS646 (4 mg/kg intravenos o dată pe săptămână) timp de două şi, respectiv, trei săptămâni. Pacienţii # 4 şi # 5, excluşi din studiu peste două şi trei săptămâni, respectiv, nu au răspuns la tratament şi starea lor s-a agravat. Este necesar de remarcat, că la unul dintre aceşti pacienţi s-a determinat nivel înalt de creatinină până la includerea în studiu.

Rezultate.

În acest studiu au participat cinci pacienţi cu HSCT-TMA persistentă. Toţi subiecţii au fost adulţi şi au primit transplant de celule stem hematopoietice (HSCT) pentru prezenţa la ei a unor tumori maligne hematologice. Fig. 58, 59 şi 60 prezintă modificarea de la linia de bază a variabilelor pentru TMA după tratamentul cu anticorp inhibitor al MASP-2 (OMS646. În aceste figuri sunt prezentate datele privind toţi cei cinci pacienţi, dintre care doi au întrerupt studiul peste 2-3 săptămâni, unul ulterior a recidivat, celălalt pacient a primit îngrijiri paliative. După cum se observă din fig. 58, 59 şi 60, ultima administrare a anticorpului putea fi posibilă în săptămâna 7.

Fig. 58 reprezintă graficul modificării medii a numărului de trombocite, în funcţie de momentul iniţial de timp (săptămâni) la subiecţii, care suferă de microangiopatie trombotică asociată cu transplant de celule stem hematopoietice (HSCT-TMA), după administrarea anticorpului (OMS646) inhibitor al MASP-2.

Fig. 59 reprezintă graficului modificării medii a lactatdehidrogenazei (LDH), în funcţie de momentul iniţial de timp (săptămâni) la subiecţii, care suferă de HSCT-TMA persistentă după tratamentul cu anticorp (OMS646) inhibitor al MASP-2.

Fig. 60 reprezintă graficul modificării medii a haptoglobinei în funcţie de momentul iniţial de timp (săptămâni) la subiecţii, care suferă de HSCT-TMA persistentă după administrarea anticorpului (OMS646) inhibitor al MASP-2.

După cum se arată în fig. 55 şi fig. 60, în timpul tratamentului s-a observat o îmbunătăţire statistic concludentă a indicatorilor LDH şi a haptoglobinei. După cum se arată în fig. 58, numărul de trombocite s-a îmbunătăţit, dar nu a atins semnificaţie statistică din cauza unui număr mic de pacienţi. Dintre cei trei pacienţi, care au terminat tratamentul, la unul nu s-a ameliorat indicatorul creatininei, dar el administra concomitent medicamente nefrotoxice. Indicatorul creatininei s-a îmbunătăţit sau a rămas normal la ceilalţi doi pacienţi. La urmărirea ulterioară îndelungată, un pacient a prezentat o insuficienţă de grefă şi aştepta un al doilea transplant. Ceilalţi doi pacienţi rămâneau stabili.

În pofida posibilităţii suprapunerii efectelor medicamentelor asociate cu supresia măduvei osoase şi nefrotoxicitate la doi dintre subiecţi, s-au observat efecte terapeutice benefice cu OMS646 la trei dintre subiecţii, care sufereau de HSCT-TMA persistentă (unul dintre aceştia fiind descris în exemplul 45) şi care suplimentar sunt descrişi în continuare. Este necesar de remarcat, că primele rezultate pozitive ale tratamentului la fiecare dintre cei trei pacienţi s-au observat peste aproximativ trei săptămâni de tratament cu OMS646.

Pacientul # 1 (tratat timp de 4 săptămâni, cum se descrie în exemplul 45). Rezumând succint, numărul de trombocite a crescut de patru ori, rezultând un număr de trombocite mai mare de 100.000/µl; nivelul haptoglobinei s-a dublat şi a fost normal; nivelul de lactatdehidrogenază plasmatică s-a redus cu 35%, dar totuşi încă depăşea nivelul normal; şi se depista doar un singur şistocit.

Pacientul # 2 (tratat timp de 8 săptămâni). Tratamentul nu a influenţat asupra numărului de trombocite, deşi pacientul suferea, de asemenea, de supresia măduvei osoase pe fondul tratamentului concomitent cu valganciclovir şi ulterior s-a produs respingerea grefei; nivelul de lactatdehidrogenază plasmatică s-a redus de la 712 U/l până la 256 U/l; nivelul de haptoglobină a crescut de la niveluri nedetectabile până la 250 mg/dl.

Pacientul # 3 (tratat timp de 8 săptămâni): numărul de trombocite a crescut de la 13.500/µl până la 133.000/µl; nivelul de lactatdehidrogenază plasmatică s-a redus de la 537 până la 225 U/l, nivelul de haptoglobină a crescut de la niveluri nedetectabile până la 181 mg/dl.

Expunerea succintă a rezultatelor.

În cazul celor trei pacienţi, suferinzi de TMA asociată cu HSCT persistentă, la care s-a finalizat dozarea cu OMS646, datele demonstrează un efect puternic şi stabil. În timpul tratamentului s-au observat îmbunătăţiri statistic concludente ale indicatorilor LDH şi haptoglobinei. Numărul de trombocite a crescut, dar nu a atins nivel statistic concludent la acest număr mic de pacienţi. Dintre trei pacienţi, care au finalizat tratamentul, la unul nu s-a înregistrat ameliorarea indicatorului creatininei, dar el a administrat concomitent medicamente nefrotoxice. Indicatorul creatininei s-a îmbunătăţit sau a rămas normal la ceilalţi doi pacienţi.

Concluzii.

Anticorpul OMS646 a îmbunătăţit marcherii TMA la pacienţii suferinzi de HSCT-TMA persistentă, care nu au răspuns la măsurile de tratament conservative. Pacienţii cu HSCT-TMA, trataţi cu OMS646, erau unii din cei mai dificili de tratat, totodată anticorpul OMS646 a demonstrat efecte terapeutice pozitive la pacienţii cu risc major de HSCT-TMA persistentă, în pofida măsurilor de tratament conservative.

În conformitate cu cele menţionate, într-o variantă de realizare, invenţia prevede o metodă de tratare a unui subiect uman, care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii conţinând o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activări complementului dependentă de MASP-2. Într-o variantă de realizare, subiectul suferă de TMA persistentă asociată cu transplantul de celule stem hematopoietice, care este rezistentă la măsuri de tratament conservative. Într-o variantă de realizare, metoda cuprinde în continuare identificarea unui subiect uman, care suferă de TMA persistentă asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, care este rezistentă la măsuri de tratament conservative până la etapa de administrare la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependentă de MASP-2.

Într-o variantă de realizare metoda include tratarea unui subiect, care suferă de TMA asociată cu transplant de celule stem hematopoietice, cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii cu conţinut de o cantitate de un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment de legare a acestuia la antigen, cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu care conţine CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 conţinând secvenţa de aminoacizi, notată ca SEQ ID NO: 67, şi o regiune variabilă a lanţului uşor care conţine CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 conţinând secvenţa de aminoacizi, notată ca SEQ ID NO: 70. În unele variante de realizare, compoziţia include anticorpul inhibitor al MASP-2, cuprinzând (a) o regiune variabilă a lanţului greu care conţine: i) lanţul greu CDR-H1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 31-35 din SECV ID NR: 67 şi ii) lanţul greu CDR-H2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 50-65 din SECV ID NR: 67 şi iii) lanţul greu CDR-H3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi de la 95-102 din SECV ID NR: 67 şi b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând: i) lanţul uşor CDR-L1 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 24-34 din SECV ID NR: 70 şi ii) lanţul uşor CDR-L2 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 50-56 din SECV ID NR: 70 şi iii) lanţul uşor CDR-L3 cuprinzând secvenţa de aminoacizi 89-97 din SECV ID NR: 70 sau (II) o variantă a acesteia cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cu identitate cel puţin de 90% cu SECV ID NR : 67 (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 67) şi o regiune variabilă a lanţului uşor cu o identitate cel puţin de 90% (de exemplu, cu identitate cel puţin de 91%, cel puţin de 92%, cel puţin de 93%, cel puţin de 94%, cel puţin de 95%, cel puţin de 96%, cel puţin de 97%, cel puţin de 98%, cel puţin de 99% cu SECV ID NR: 70.

În unele variante de realizare, metoda cuprinde administrarea la un subiect care suferă sau prezintă risc de dezvoltare a TMA asociată cu HSCT, incluzând un subiect care suferă de TMA persistentă asociată cu transplantul de celule stem hematopoietice, care este rezistentă la măsuri de tratament conservative, a unei compoziţii conţinând un anticorp inhibitor al MASP -2 sau un fragment al acestuia de legare a antigenului, cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu, care include secvenţa de aminoacizi, notată ca SEQ ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor, care include secvenţa de aminoacizi, notată ca SECV ID NR: 70 în doză de la 1 mg / kg până la 10 mg / kg (adică 1 mg / kg, 2 mg / kg, 3 mg / kg, 4 mg / kg, 5 mg / kg, 6 mg / kg, , 8 mg / kg, 9 mg / kg sau 10 mg / kg) cel puţin de o dată pe săptămână (de exemplu, cel puţin de două ori pe săptămână sau de cel puţin de trei ori pe săptămână) timp de cel puţin de 3 săptămâni sau timp de cel puţin de 4 săptămâni, sau timp de cel puţin de 5 săptămâni sau cel puţin de 6 săptămâni sau cel puţin de 7 săptămâni sau timp de cel puţin de 8 săptămâni.

Deşi în invenţie au fost descrise şi ilustrate variantele de realizare, care nu sunt restrictive, este evident, că în invenţie pot fi introduse diferite modificări fără a devia de la esenţa şi volumul invenţiei.

1. Thiel et al. Nature, no. 386, 1997, p. 506-510

2. Vorup Jensen et al. J. Immunol., no 165, 2000, p. 2093-2100

3. Ambrus et al. J. Immunol., no 170, 2003, p. 1374-1382

4. Kilpatrick. Biochim., Biophys, Acta, no 1572, 2002, p. 401-413

5. Takahashi M. et al. J. Exp. Med., no 207 (1), 2010, p. 29-37

Claims

1. Metodă de tratament al unui subiect uman, care suferă de microangiopatie trombotică persistentă (TMA) asociată cu transplant de celule stem hematopoietice (HSCT-TMA), cuprinzând administrarea la subiect a unei compoziţii, care conţine o cantitate dintr-un anticorp inhibitor al MASP-2 sau fragment al acestuia de legare a antigenului, eficientă pentru a inhiba activarea complementului dependentă de MASP-2.

2. Metodă, conform revendicării 1, în care anticorpul inhibitor al MASP-2 reprezintă un anticorp monoclonal sau fragment al acestuia care se leagă în mod specific la MASP-2 umană.

3. Metodă, conform revendicării 1, în care anticorpul sau fragmentul acestuia se selectează din grupul constând dintr-un anticorp recombinant, un anticorp având funcţie efectoare redusă, un anticorp himeric, un anticorp umanizat şi un anticorp uman.

4. Metodă, conform revendicării 1, în care anticorpul inhibitor al MASP-2 practic nu inhibă calea clasică.

5. Metodă, conform revendicării 1, în care anticorpul inhibitor al MASP-2 inhibă depunerea C3b în 90% ser uman cu valoarea IC50 de 30 nM sau mai mică.

6. Metodă, conform revendicării 1, în care anticorpul inhibitor al MASP-2 se administrează sistemic unui subiect.

7. Metodă, conform revendicării 1, în care metoda prevede suplimentar identificarea unui subiect uman cu TMA persistentă asociată cu transplant de celule stem hematopoietice (HSCT-TMA) până la etapa de administrare la subiect a unei compoziţii cuprinzând o cantitate de anticorp inhibitor al MASP-2 sau de fragment al acestuia de legare la antigen, eficientă pentru inhibarea activării complementului dependentă de MASP-2.

8. Metodă, conform revendicării 1, în care subiectul a fost anterior supus sau este supus la momentul dat tratamentului cu un anticorp anti-C5 umanizat sau cu un fragment al acestuia de legare la antigen.

9. Metodă, conform revendicării 1, în care anticorpul inhibitor al MASP-2 sau fragmentul acestuia de legare la antigen se administrează într-o cantitate eficientă pentru a îmbunătăţi cel puţin de unul sau mai mulţi dintre următorii parametri clinici asociaţi cu TMA persistentă asociată cu transplant de celule stem hematopoietice: (i) o creştere a numărului de trombocite (de exemplu, cel puţin de două, cel puţin de trei, cel puţin de patru ori), comparativ cu numărul de trombocite până la tratament; (ii) o creştere a haptoglobinei; (iii) o reducere a lactatdehidrogenazei (LDH) şi/sau (iv) o reducere a creatininei.

10. Metodă, conform revendicării 1, în care anticorpul inhibitor al MASP-2 sau fragmentul acestuia de legare la antigen cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu conţinând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 ale secvenţei de aminoacizi, notată ca SECV ID NR: 67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor conţinând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 ale secvenţei de aminoacizi, notată ca SECV ID NR: 70.